CS260749B1 - Myši iymfocytáraí hyliridom produkující protilátku proti lidskému erytrocytárnítnu skupinovému antigenu B - Google Patents

Abstract

(Řešení se týká myšího lymfocytárního hybridomu, produkujícího protilátku píoťi lidskému erytrocytárhímu 'skupinovému antigenu B, uloženého ve sbírce hybridomů Ústavu molekulární genetiky ČSAV pod označením HEB-27. Monoklonální protilátka hybridomu HEB-27 je vhodná jako součást diagnostického panelu obsahujícího také monoklonální protilátky HE-10, HE-14 a HEB-20 k upřesnění patologicko anatomické diagnózy nádorových onemocnění tenkého a tlustého střeva.

Description

.Vynález se týká nového hybridomu, to je hybridního jednobuněčného organismu, sestrojeného, fúzí buňky myší myelomové linie Sp 2/0 a myší slezinné lymfoldní buňky produkující protilátku proti lidskému eryirocytárnímu skupinovému antigenu B.

Diagnostická séra proti lidskému erytrocytárnímu skupinovému antigenu B (zkráceně diagnostická séra anti-B) jsou základní složkou souborů diagnostických sér sloužících k určení skupinové příslušnosti lidských erytrocytň v systému ABO. Vyšetřování skupinové příslušnosti v systému ABO je základním a nejčastějším sérologickým vyšetřením v humánní, hematologické a transfúzní praxi. Provádí se například jako základní součást úplného předtransfúzního vyšetření, kontroly krevní skupiny a lůžka při začátku krevní transfúze, sérologických vyšetřování rodiček a vyšetřování novorozenců.

Výskyt antigenu krevně skupinového systému ABO není omezen pouze na srytrocy-. tární membrány. Ve formě glykoproteinů se nacházejí například v sekretech žlázových buněk gastrointestinálního, genitálního a respiračního traktu. Antigenní sacharidové struktury jsou rovněž součástí buněčných membrán epiteliální tkáně, přičemž pozornost se soustřeďuje na změny v expresi těchto antigenu v souvislosti s vývojovými, diferenciálními a zejména nádorovými procesy. Značný počet imunohistocheimických studií prokázal, že například u karcinomů plic, žaludku, prostaty a močového měchýře dofchází ke ztrátě A a B isoantigenů, které jsou normálně přítomny ve zdravé epiteliální tkáni.

Krevně skupinové antigeny A a B jsou přítomny také v epiteliálních buňkách sliznice tlustého střeva lidského plodu. Po narození zůstávají zachovány v proximální části, rychle však mizí v distální části tračníku. Krevně skupinové antigeny se znovu objevují u distálně lokalizovaných karcinomů — například v esovité kličce a rektu — — a stávají se významným diagnostickým znakem rozvoje nádoru.

Diagnostická séra anti-B se dosud většinou připravují z lidské krve vybraných dárců, u nichž byly předem prokázány přirozené vysoké hodnoty aglutininů anti-B nebo z krve dobrovolných dárců záměrně imunizovaných slinami vylučovatelů skupinově specifické substance B, případně substancí B připravenou z lidských slin nebo· zvířecího materiálu — např. žaludeční mukózy prasat či koní.

Substance užívané k imunizaci lidských dobrovolníků je nezbytné podrobit státní kontrole sterility, neškodnosti a účinnosti. Protože koncentrace žádaných protilátek v séru klesá po· imunizaci s časem, je nutné provádět imunizaci opakovaně. Imunizace dobrovolníků izolovanými substancemi mohou být provázeny nepříznivými projevy, jimž lze předcházet pouze desenzibilizací imunizovaných jedinců. Dosud užívaný způsob přípravy diagnostických sér anti-B klade tedy značné nároky na materiální, kádrové, metodické i organizační zajištění výrobního procesu.

Vedle žádaných protilátek anti-B se v séru každého záměrně imunizovaného i neimunizovaného dárce, vyskytují v heterogenní — složením vždy jedinečné a neopakovatelné směsi — mnohé další protilátky, z nichž některé přímo ovlivňují reakci séra s erytrocyty a znehodnocují diagnostickou účinnost získaného séra. Takové protilátky je nezbytné ze séra odstranit. Standardizace jednotlivých šarží diagnostických sér je při stávajícím způsobu přípravy obtížná a vždy neúplná, neboť z vlastní podstaty dosavadní přípravy sér vyplývá nemožnost získat dvě výrobní šarže stejných vlastností. Nepříznivým rysem dosavadního, způsobu přípravy diagnostických sér anti-B je spotřeba velkých množství lidské krve.

Mnohé z uvedených problémů dosud používaného postupu přípravy diagnostických lidských sér anti-B a řadu obtíží vyplývajících z nepříznivých vlastností současných diagnostických sér je možné odstranit zavedením přípravy myších monoklonálních protilátek anti-B, produkovaných lymfocytárními hybridomy.

Podobné hybridomy produkující protilátky byly připraveny v řadě zemí a v některých z nich jsou již komerčně dostupné a začínají se používat v klinické sérologické praxi.

Jde například o výrobky firem:

Serotec (Anglie),

Immunotech (Francie),

Biotest-Diagnostice (NSR),

Diagnostice Pasteur (Francie),

Celtech (Anglie).

Nabízené protilátky v zahraničí jsou určeny pro sérologické vyšetření krevních skupin. Žádná z uvedených zahraničních firem neuvádí možnost využití nabízených protilátek v imunohistochemii.

Uvedené nevýhody odstraňuje nový hybridom, uložený ve sbírce hyhridomů Ústavu molekulární genetiky ČSAV v Praze 4, Vídeňská ul. 1083 ipod označením IMG HEB-27, který je zdrojem monoklonální protilátky proti lidskému erytrocytárnímu skupinovému antigenu B.

Uvedený hybridom byl získán způsobem známým z odborné literatury (Fazekas de St. Groth, S., Scheidigger, O.: Production of monoclonal antibodies: Stratégy and tactics, J. Immunol. Meth.: 35: 1, 1980; Galfré, G., Howe, S. S., Milstein, C., Butcher, G. W., Howard, j. C.: Antibodies to major histocompatibility antigens produced by hybrid cell lineš, Nátuře, 266: 550, 1977] klonováním souboru hybridních buněk, vzniklých fúzí buněk myší myelomové linie S_;p 2/0 a buněk, získaných ze sleziny myší Fi (BALB/c X B 10.A), imunizovaných erytrocyty skupiny B.

Lymfocytární hybridom HEB-27 produkuje zcela homogenní protilátku, tzv. protilátku monoklonální, specificky reagující s lidskými typovými erytrocyty B, AiB -a A2B a která nereaguje s erytrocyty Ai, Až a O. Hybridom HEB-27 je možné kultivovat v podmínkách in vitro- v kultivačních médiích vhodných pro živočišné buňky nebo v podmínkách in vivo v -peritoneální dutině myší Fi (BALB/c X Β 10.A). Hybridom HEB-27 je možné dlouhodobě uchovávat v konzervách uložených v kapalném dusíku. Produkci protilátky je možné zahájit po rozmražení buněčné konzervy, aniž by bylo třeba dalšího antigenu. Monoklonální protilátka produkovaná hyforidomem HEB-27 je specifická pro lidský erytrocytární skupinový antigen B a je prostá jakýchkoliv balastních protilátek.

Příklad

Za účelem pomnožení buněk hybridomu HEB-27 v podmínkách in vitro bylo vpraveno 1 X 10® hybridomových buněk do kultivační láhve Legroux obsahující 20 ml kompletního kultivačního -média RPMI s fetálním telecím sérem (10%). Po třech dnech růstu kultury hybridomových buněk bylo z láhve získáno kultivační médium obohacené o monoklonální protilátku HEB-27 uvolňovanou do média hybridomovými buňkami. Účinnost monoklonální protilátky HEB-27 byla testována postupným dvojnásobným ředěním kultivačního média obsahujícího- monokíc-nální protilátku v prostředí izotonického roztoku chloridu sodného v -aglutinačních zkumavkách podle oborové normy ON 84 3225. Kultivační médium aglutinovalo na + (podle ON 84 3225) erytrocyty B v ředění 1 : 16, erytrocyty AiB v ř&dění 1: 16, erytrocyty AžB v ředění 1 : 8. S erytrocyty Al, Až a O kultivační médium obsahující monoklonální protilátku HEB-27 nereagovalo.

-Pro testování reaktivity protilátky HEB-27 na tkáňových řezech byly bioptické vzorky odebírány z několika míst tlustého střeva-, fixovány ve formaldehydu a zality do parafinu. Po odparafinování řezů byla aplikována protilátka- HEB-27 (naředěný supernatant) a její vazba na terčové struktury byla sledována po-mocí prasečí protilátky proti myšímu imunoglobulinu značená křenovo-u peroxldázou (Ústav sér a očkovacích látelk, Praha). Protilátka HEB-27 výrazně barvila na řezech z normální tkáně difúzne mucinózní -buňky krypt s maximem v proxi-mální části tlustého střeva a vymizením pozitivity v- oblasti eso-vité kličky -a konečníku. Pozitivní reakce se projevila v oblasti distálního tračníku pouze ve vzorcích z nádorové tkáně (adenokarcinom sigmoidea), Silná pozitivní reakce byla též pozorována s přítomnými erytrocyty. Výsledky srovnání reaktivity jednotlivých monoklonálních protilátek jsou shrnuty v tabulce.

Tabulka

Reaktivita monoklonálních protilátek v tkáňových řezech¹ pacientů s krevní skupinou B

Monoklonální protilátka Cílový antigen

HEB-27 B

HEB-20 B

HE-10 A

HE-14 A

Tračník Distální Adenokarcitračník nom distálního tračníku í - í+

Poznámka:

¹ fixace formo-lem, zalití do parafinu

V podobě odebraných a zpracovaných vzorcích plicní tkáně byla pozitivní reakce, na rozdíl od protilátky HEB-20, zjištěna ve všech vrstvách epitelu bronchů, v sekretu a ve většině buněk bronchiálních žlázek. Protilátka HEB-27 též značila přítomné eytrocyty.

Buňky hybridomu HEB-27 -mají ultrastrukturální obraz typických myelo-mových buněk, kde převažující organelou jsou volné a na membrány vázané polyribosony. V podmínkách in vitro rostou v pcdobě polosuspenz-ních kultur. Základními kultivačními médii jsou RPMI nebo Eaglovo- esenciální médium s Hanksovou solnou směsí, doplněná o- neesenciální -aminokyseliny. L-glutamin (3mM) a pyruvát sodný (lmM) médium označované jako- H-MEM-d, (Ústav molekulární genetiky ČSAV). Média jsou pro kultivaci hybridomu HEB-27 doplněna penicilinem, streptomycinem, 2-merkaptoetanolem (5 X ΙΟ“⁵ M), pufrem HEPES (2 — 4 X 10³ M) -a inaktivov-aným bovinním sérem pro TK (Bioveta n.p., Ivanovice na Hané, 10%). Pro získávání kultivačního média obohaceného o monoklonální protilátku HEB-27 (supernatantu kultury hybridomových buněk) k diagnostickým účelům je v kultivačním médiu nahrazeno inaktivované bovinní sérum fetálníím telecím sérem.

80749

Hybridom HEB-27 je kultivován při 37 °C.^: Střední generační čas je 16,4 hodin; molární počet chromosomů 40 měsíců po sestrojení (fúzi) je 81 chromosomů. Produkovaná monoklonální protilátka je myší ímunoglobdlin třídy IgM, kappa.

Monoklonální protilátka produkovaná myším lymfocytárním hybridomem HEB-27 může být využita ve zdravotnické ipraxi jako součást diagnostického panelu obsahujícího' také monoklonální protilátky HE-10, ΗΕ^14 a HEB-20 k upřesnění patologicko anatomické diagnózy nádorových onemocnění tenkého· a tlustého střeva. '

Claims (1)

1. Myší lymfocytární hybridom IMG CZAS HEB-27, produkující monoklonální protilátku

   VYNÁLEZU proti lidskému erytrocytárnímu skupinovému antigenu B třídy IgM.

   Severografia, n. p. závod 7, Most

   Cena 2,40 Kčs