CS261508B1 - Myší lymíocytárny liybridóm produkujúci monoklonálnu protilátku pro specifickému nádorovému antigénu bunkovej linie MSB1 - Google Patents

Abstract

Účelom riešenia je příprava izotypovo a idiotypovo homegénnej protilátky o vysokej čistotě. Uvedeného účelu sa dosiahne použitím myšieho lymíocytárneho hybridomu MSB—NTP—1, produkujúceho monoklonálnu protilátku rozpoznávajúcu specifický nádorový antigen lymfoblastoidnej bunkovej linie, označenej skratkou MSB1. Myší lymfocyíárny hybridům má použitie vo veterinárnej medicíně.

Description

Vynález sa týká myšieho lymfqcytá^ijféhq i hybridomů produkujúqehf?/ ffn^SOkldnťilÁu protilátku, rozpoznávajúcu špecif.ický nádorový antigén lymfohlastoidnéj bunkoVej·' linie označenej skratkou MSB1.

Doposial' sa protilátky proti lymfoblastoidnej bunkovej linii MSB1, ktorá nesie na svojom povrchu diagnostický antigén „MATSA“ připravovali tak, že sa pokusným zvie- , rátám (králík, ovcaj aplikovali živé MSB1 buňky. Vzhíadom na to, že nestačí jedna dávka buniek pre vyvolanie dostatočne vysokej protilátkovej odpovede, je potřebné ich injikovať viackrát opakované v různých dávkách a časových intervaloch. Sérum takto imunizovaných zvierat slúži ako zdroj protilátek, najma pri diagnostickom vyšetřovaní chovov hydiny. Zmienený postup imunizácie má niekolko nevýhod. Získává sa heterogénna zmes protilátok, ktorých rozloženie sa v organizme producenta mění, je velmi různorodé, kvalitativně a kvantitativné kolíše od jedného odběru po druhý a je neopakovatelné. Okrem toho· sérum obsahuje hlavně·, nežiadúce protilátky proti . povrchovým antigénom, ktoré sa vyskytujú aj na normálnych buňkách.

V důsledku toho je potřebné séra upravovat zložitými postupmi vysýtenia pomocou normálnych slezinových buniek tak, aby sérum obsahovalo protilátky len proti specifickému nádorovému antigénu. Touto úpravou dochádza k velkým stratám na sere a výraznému zníženiu titra specifických protilátok. Pochopitelné proces vysýtenia nie je možné standardizovat, v důsledku čoho sa i tak vysoká heterogenita konvenčných sér ešte prehíbi. Okrem toho využitelnost takto připravených diagnostických sér je znížená aj tým, že ich specifické polyklonálne protilátky sú z híadiska interakcie s povrchovými buňkovými antigénmi velmi různorodé. Naviac příprava dostatočného množstva lymfoblastoidných buniek MSB1 pre imunizačné účely je náročná na technické vybavenie pracoviska, kvalifikovaný personál a finančně prostriedky.

Hybridům MSB-NTP-1 bol připravený známým spĎsobom, klonováním skupiny hybridómov v mákkom agare, vzniklých fúziou buniek myšej 2-amíno-hydroxy-8-azapurín (8-azaguanín) rezistentnej myelómovej linie označenej NSO a slezinových buniek inbrednej linie myší BALB/c, imunizovaných lymfoblastoidnou buňkovou líniou MSB1 (G. Kůhler, C. Milstein, G. W. Butecher, J. C. Howard: Nátuře 286, 550 (1977]].

Uvedené nevýhody v podstatnej miere odstraňuje vynález, ktorého podstata spočívá v myšom lymfocytárnom hybridóme MSB-NTP-1, produkujúcom monoklonálnu protilátku podtriedy IgGl, kappa, rozpoznávajúcu specifický nádorový antigén lymfoblastoidnej bunkovej linie označenej skratkou MSB1. Tento hybridom je uložený vo Virologickom ústave SAV, Mlýnská dolina 1, 817 03 Bratislava.

Výhodou hybridomů ^je, že produkuje izotypovo homogenmi^protilátku, tzv. menoklonálnu protilátku, ktorá rozpoznává specifický; jjnádůřovy antigén lymfohlastoidnéj bunkovej linie označenej skratkou MSB1 a tým je ju možné použit na ídentifikáciu specifického nádorového antigénu pri diferenciálnej diagnostike nádorových ochorcní hydiny. Jednobunkový lymfocytárny hybridům MSB-NTP-1 rastie in vivo v peritoneálnej dutině BALB/c myší za súčasnej tvorby ascites. Rastie aj in vitro v kultivačných médiách vhodných pre živočišné buňky. Taktiež po zmrazení a uložení v tekutom dusíku a po opatovnom rozmražení si zachovává svoju schopnosť produkovat monoklonálnu protilátku rozpoznávajúcu specifický nádorový antigén lyrnfoblastoidnej bunkovej linie označenej skratkou MSB1. Neobsahuje na rozdiel od konvenčných antisér nevhodné, nespecifické, balastné protilátky.

Příklad 1

Pre přípravu hybridnej bunkovej linie sa použije 2.10⁷ buniek myšej 2-amíno>-hydroxy-8-azapurín (8-azaguanin) rezistentnej bunkovej linie, ktorá sa pomocou 1 ml 50 pere. hmot. polyetylénglykolu spoja s 1.10⁸ slezinových lymfoidných buniek myši imunizované] 3.10⁸ MSB1 lymfoblastoidných buniek. V priebehu 14 dní vyrastú pod selektívnym tlakom kyseliny 4-amíno pteroylglutámovej (amínopterínuj hybridně buňkové linie, ktoré produkujú monoklonálne protilátky rozpoznávajúce specifický nádorový antigén lymfoblastoidnej bunkovej linie označenej skratkou MSB1. Tieto buňky sa potom klónujú tak, že sa zmieša 0,5 % hmot. agaru s 5 .10^e až 10.10⁶ myších slezinových buniek v médiu RPMI 1 640, ktoré obsahuje

100 mg. ml^-1 tetrahydrátu dusičnatu vápenatého,

000 mg . ml¹ D-glukózy,

100 mg. ml^-1 heptahydrátu síranu horečnatého,

400 mg . ml^-1 chloridu draselného,

1512 mg.ml~^J hydrogenfosforečnanu sodného,

000 mg . ml¹ monohydrátu dihydrogenfosforečnanu sodného,

100 mg . ml¹ kyseliny 2-amíno-5-guanidínovalérovej (argininu), mg. ml^-1 kyseliny 2-amínosukcinamovej (asparagínu), mg . ml ¹ kyseliny 2-ainínojantárovej (kyseliny asparágovej),

5 15 3 mg.ml“¹ kyseliny 3‘,3‘-ditiobis(2-aim'nopropánovej) (cystínu), mg.ml“¹ kyseliny 2-amínoglutárovej (kyseliny glutamovej),

300 mg. ml¹ kyseliny 2-amínoglutarámovej (glutamínu), mg. ml^-1 kyseliny 2-amínogIutaraminyl 2-merkaptopropionyl-aroínooctovej (glutationu t. j. glutamínyl-cysteinyl-glycínu), mg. ml“¹ kyseliny amínooctovej (glycínu), mg.ml“¹ kyseliny -amíno-l-iroidaz:l-4-propiónovej (histidínu), mg. ml“¹ kyseliny 2-amíno-3-metylvalérovej (izoleucínu), mg.ml“¹ kyseliny 2-amíno-4-metylvaIérovej (leucínu), mg .ml“¹ kyseliny 2,6-diamínohexánovej (lyzínu), mg.ml“¹ kyseliny 2-amíno-4-(metyltio)maslovej (metionínu), mg .ml“¹ kyseliny 2-amíno-3-fenylpropiónovej (fenylalanínu), mg.ml^-1 kyseliny 2-pyrolidínkarboxylovej (prolinu), mg.ml“¹ kyseliny 2-amíno-3-hydroxypropiónovej (serínu), mg.ml“¹ kyseliny 2-amíno-3-hydroxymaslovej (treonínu), mg.ml“¹ kyseliny 2-amíno-3-hydroxypropiónovej (serínu), mg.ml“¹ kyseliny 2-amíno-3-hydroxymaslovej (treonínu), mg.ml“¹ kyseliny 2-amíno-3-(3-indolyl)propiónovej (tryptofánu), mg.ml“¹ kyseliny 2-amíno-3-(4-hydroxyfenyl) -propiónovej (týrozínu), mg. ml“¹ kyseliny 2-ammo-3-metylmaslovej (valínu),

0,2 mg.ml“¹ kyseliny 5-(2-oxoimidazolidíno/4,5-c/tioI-2-yl)pentánovej (biotínu),

0,005 mg.ml“¹ kobalt[-(5,6-dimetylbenzimidazolyl) ]-kobalt-kyanokobamid vitamínu Bl2>

0,250 mg.ml“¹ D-N-(2,4-dlhydroxy-3,3-diine8 tylbutyryl) -2-amínopropionát vápenatý (pantotenát vápenatý), mg . ml¹ 2-hydroxyetyl tidmetylaroóriimnchl orici (cholínchlorid ], mm, ml“¹ kyseliny N-(2-aniíno-4-hydroxypterídín-6-./Imetyl) -p amínotenzoovej (kyseliny Oslovo)), mg . ml“¹ (1,2.3,5,/4,6/cyklohexóndex.d) (myonozítolu), mg.ml¹ pyridin-3-karhoxyamidu (uihotínamidu), mg.ml¹ kyseliny 4-amínobenzoovej (kyseliny p-amínohenzoovej), mg .ml”¹ 3-hydroxy-4,5-bis(hydroxymetyl)-2-metylpyridinehloridu (pyridoxínchloridu),

0,2 mg.ml“’ 7,8-dimetyl-10-(l‘-D-ribityl/izoaloxažínu) (riboí lavinu), mg . rol“¹ 3-(4-amíno-2-metyl-pyrimidyl-5-metyl )-5-( 2-hydroxyetyl) -4-metyltiazolu (tiamínchloridu),

000 mg.ml'¹ hydrogeouhličitunu sodného doplnenom s 2 mmólmi kyseliny 2-amíno>glutarámovej (glutamínu),

5.10“5 mólov 2-merkaptoetanolu,

100 gg.ml“¹ O-L-2-deoxy-2-(metylanúno)-glukopyranozyl- (1-2)-0 -L-deoxy-3-C-f ormyllyxof uranozyl- (1-4-) -l,3-deoxy-l,3-diguanidoscyloinozytsulfátu (streptomycínsulřátu),

100 jednotiek na milimeter kyseliny x-(N-ifinylacetaamido)-penicilánovej (penicilínu Gj, mmól kyseliny N-2-hydroxyetylpiperazín-N‘-2-etán sulfónovej (Hepesu) sa rozpustí v třikrát redestilovenej vodě a doplní třikrát redestilovanou vodou na objem 900 ml roztoku, ktorý sa doplní 100 ml normálného neaktivovaného koňského séra.

Výsledné pH takto připraveného kultivačného média je 7,2. Po zatuhnutí agaru sa na vrstvu 0,5 % hmot. agaru nanesie 100 hybridných buniek v 0,25 % hmot. agare. Po 10 dňoch vyrastú kolonie, ktoré sa pomnožia v médie RPMI 1 640 doplnenom s 2 mmólmi kyseliny 2-amínoglutarámovej (glutamínuj, 5.10“⁵ mólov 2-merkaptoetanolu, 100 ,ug . ml“¹ O- -L-2-deoxy-2-(metylamíno)-glukopyranozyl-(l-2)-O- -L-deoxy-3-C-formyllyxofuranozyl- (1-4-1,3-deoxy-l,4-diguanidoscyloinozitsulfátu (streptomycínsulfátu), 100

81 π a π jednotiek na milimeter kyseliny 6-(n-fenylacetamidoj-penicilánovej (penicilínu G), 1 mmol kyseliny N-2-hydroxyetylpiperazín-N‘-2-etánsulfonovej (Hepesu) sa rozpustí v trikrát redestilovanej vodě a doplní třikrát redestilovanou vodou na objem 900 ml roztoku, ktorý sa doplní 100 ml normálného inaktivovanébo koňského séra. Výsledné pH takto připraveného kultivačného média je 7,2. V 1 ml kultivačného média sa nachádza 3C0 až 700 tisíc hybridómov MSB-NTP-1 produkujúcich 10 až 100 /rg monoklonálnej IgGl, kappa, protilátky rozpoznávajúcej specifický nádorový antigén lymfoblastoidnej bunkovej linie označeuej skratkou MSB1.

Příklad 2

Postupuje sa ako v příklade 1 s tým rozdielom, že sa v kultivačnom médiu použije nepredtestované běžné tefacie fetálne sérum. Do takto připraveného' kultivačného prostredia přenesené buňky po fúzii nie sú schopné rásť a produkovat monoklonálne protilátky.

Myší lymfocytárny hybridom MSB-NTP-1 sa kultivuje pri teplote 37 °C. Stredný generacný oas jc 22 hodin, modálny počet chromozómov je 24 mesiacov po fúzii 70 chromoizómov. Produkovaná protilátka je myší imunoglobulín rozpoznávajúci špecifický nádorový antigén lymfoblastoidnej buňkové] linie označonej skratkou MSB1, triedy IgCl_, kajipa.

Monoklonálna protilátka produkovaná myším lymfocytárnym hybridómom MSB-NTP-1 može byť použitá vo veterinárnej praxi pri vyšetřovaní a diferenciálnej diagnostike nádorových ochorení hydiny.

Claims (1)

1. PREDMET

   Myší lymfocytárny hybridům MSB-NTP-1, produkujúci monoklonálnu protilátku proti

   VYNALEZU specifickému nádorovému antigenu bunkovej linie MSB1, podtriedy IgGl, kappa.