CS259230B1 - Myší lymfocytámy hybridóm produkujúci monoklonálne protilátky proti virusu Newcastleskej choroby - Google Patents

Abstract

Očelom riešenia je příprava izotypovo a idiotypovo homogénnej protilátky o vysokej čistotě. Uvedeného účelu sa dosiahne použitím myšieho lymfooytárneho hybridómu NDV-NTP-1, produkujúeeho monoklonálnu protilátku viažucu virus Newcastleskej choroby. Myší lymfooytárny hybridóm má použitie vo veterinárnej medicíně.

Description

Vynález sa týká myšieho lymfocytárneho hybridomú produktujúceho monoklonálne protilátky proti virusu Newcastleskej choroby.

Doposial sa protilátky proti virusu Newcastleskej choroby pripravujú tak, že virus sa injikuje pokusným zvieratám, najmS králikom a ovčiam. Vzhladom na to, že nestačí jedna dávka virusu pre vyvolanie dostatočne vysokej protilátkovej odpovede, je potřebné ho injikovať viackrát opakované v různých dávkách a časových intervaloch. Sérum takto imunizovaných zvierat slúži ako zdroj protilátok najmS pri diagnostickom vyšetřovaní chovov hydiny. Zmienený postup imunizácie má niekolko nevýhod. Získává sa heterogénna zmes protilátok, ktorej rozloženie sa v organizme producenta mění, je velmi různorodé, kvalitativně a kvantitativné kolíše od jedného odběru po druhý a je neopakovatelné.

Okrem toho sérum obsahuje vela protilátok proti nežiadúcim prímesiam, ktoré sa nachádzajú vo vírusovom materiáli použitom pre imunizáciu. V důsledku toho je potřebné séra upravovat zložitými postupmi, čím získáváme heterogénne a neštandardné preparáty. Využivatelnost takto připraveného diagnostického séra je znížená aj tým, že jeho Specifické polyklonálne protilátky sú z hladiska interakcie s vírusom velmi různorodé. Naviac přípravu virusu pre imunizačné účely je nákladná.

Hybridom NDV-NTP-1 bol připravený známým spůsobom, klonováním skupiny hybridómov v mSkkom agare, vzniklých fúziou buniek myšej 2-amíno-6-hydroxy-8-azapurín /8-azagua'nín/ rezistentněj myelómovej linie označenej NSO a slezinových buniek inbrednej linie myší BALB/c, imunizovaných purifikovaným vírusom NDV, kmeň L Kansas /G. Kůhler, C. Milstein, G. W. Butcher, J. C. Howard: Nátuře 286, 550 /1977//.

Uvedené nevýhody v podstatnéj miere odstraňuje vynález, ktorého podstata spočívá v myšom lymfocytárnom hybridóme NDV-NTP-1, produkujúcom monoklonálnu protilátku podtriedy IgGl, kappa, viažucu virus Newcastleskej choroby. Tento hybridom je uložený vo Virologickom ústave SAV, Mlýnská dolina 1, 817 03 Bratislava.

Výhodou hybridomú je, že produkuje izotypovo a idiotypovo homogénnu protilátku, tzv. monoklonálnu protilátku, ktorá Specificky sa viaže s vírusom Newcastleskej choroby a tým je ho možné použit na jeho identifikáciu vo vyšetřovaných vzorkách z různých chovov hydiny.

Jednobunkový lymfocytárny hybridom NDV-NTP-1 rastie in vivo v peritoneálnej dutině BALB/c myší za súčasnej tvorby ascites. Rastie aj in vitro v kultivačných médiach vhodných pre živočišné buňky. Taktiež po zmrazení a uložení v tekutom dusíku a po opStovnom rozmražení si zachovává svoju schopnoť produkovat monoklonálnu protilátku viažucu virus Newcastleskej choroby. Neobsahuje na rozdiel od konvenčných antisér nevhodné, balastné protilátky.

Příklad 1

Pre přípravu hybridnej bunkovej linie sa použije 2.10⁷ buniek myšej 2-amino-6-hydroxy-8-azapurín /8-azaguanin/ rezistentnej myelómovej bunkovej linie, ktoré sa pomocou 1 ml p

% hirot. polyetylénglykolu spoja s 1.10 slezinových lymfoidných buniek myši imunizovanej 10 jig virusu. V priebehu 14 dní vyrastú pod selektívnym tlakom kyseliny 4-amino-pteroylglutámovej /aminopterinu/ hybridně buňkové linie, ktoré produkujú monoklonálne protilátky proti virusu Newcastleskej choroby, ktoré sa s nim viažu, ale neovplyvňujú jeho biologickú aktivitu.

Tieto buňky sa potom klónujú tka, že sa zmieša 0,5 % hmot. agaru s 5.10® až 10.10® myších slezinových buniek v médiu RPMI 1 640, ktoré obsahuje 100 mg.ml^-1 tetrahydrátu dusičnanu — 1 —1 —1 vápenatého, 2 000 mg.ml D-glukózy, 100 mg.ml heptahydrátu síranu hořečnatého, 400 mg.ml chloridu draselného, 1 512 mg.ml^-1 hydrogenfosforečnanu sodného, 6 000 mg.ml^-1 monohydrátu dihydrogenfosforečnanu sodného, 100 mg.ml^-1 kyseliny 2-amino-5-guanidínovalérovej /arginínu/, mg.ml^-1 kyseliny 2-aminosukcínamovej /asparagínu/, 20 mg.ml“¹ kyseliny 2-aminojantárovej /kyseliny asparágovej/, 50 mg.ml kyseliny 3* , 3'-ditiobis/2-aminopropánovej/ /cystínu/, mg.ml^-! kyseliny 2-aminoglutárovej /kyseliny glutamovej/, 300 mg.ml^-·¹ kyseliny 2-aminoglutarámove j /glutamínu/, 1 mg.ml ¹ kyseliny 2-aminoglutaraminyl-2-merkaptopropionyl-aminooctovéj /glutationu t j . glutaminyl-cysteinyl-glycínu/, 10 mg.ml^-''’ kyseliny aminooctovej /glycínu/, 15 mg.ml ¹ kyseliny alfa-amino-l-imidazol-4-propiónovej /histidínu/, 50 mg.ml^-! kyseliny 2-amino-3-metylvalérovej /izoleucínu/, 50 mg.ml^-! kyseliny 2-amino-4-metylvalérove j /leucínu/, 40 mg.ml ¹ kyseliny 2,6-diaminohexánovej /lyzínu/, 15 mg.ml^-1 kyseliny 2-amino-4-/metyltio/-máslovéj /metioninu/, 15 mg.ml ¹ kyseliny 2-amino-3-fenylpropiónovej /fenylalanínu/, 20 mg.ml ^x kyseliny 2-pyrolidínkarboxylovej /prolinu/, 30 mg.ml^-''' kyseliny 2-amino-3-hydroxypropiónovej /serínu/, 20 mg.ml^-''' kyseliny 2-amino-3-hydroxymaslovej /treonínu/,

-1 -1 5 mg.ml kyseliny 2-amino-3/3-indolyl/propionovej /tryptofánu/, 20 mg.ml kyseliny 2-amino-3-/4-hydroxyfenyl/-propiónovej /tyrozínu/, 20 mg.ml * kyseliny 2-amino-3-metylmaslovej /valínu/, 0,2 mg.ml^-''' kyseliny 5-/2-oxoimidazolidíno/4,5-c/tiol-2-yl/pentánovej /biotínu/,

0,005 mg.ml^-! kobalt alfa/afla-/5,6-dimetylbenzimidazolyl//-kobalt-beta-kyanokobamid Vitamínu Bjj/, 0,250 mg.ml^-! D-N-/2,4-dihydroxy-3,3-dimetylbutyryl/-beta-2-aminopropionát vápenatý /pantotenát vápenatý/, 3 mg.ml^-1 2-hydroxyetyltrimetylamóniumchlorid /cholínchlorid/, mg.ml ! kyseliny N-/2-amino-4-hydroxypteridín-6-ylmetyl/-p-aminobenzoovej /kyseliny

-1 -1 listovej/, 35 mg.ml /1,2,3,5/4,6/cyklohexándexol/ /myoinozitolu/, 1 mg.ml pyridin-3-karboxyamidu /nikotínamidu/, 1 mg.ml ! kyseliny 4-aminobenzoovej /kyseliny p-aminobenzoovej/, mg.ml^-! 3_hyj(roxy-4,5-bis/hydroxymetyl/2-metylpyridínchloridu /pyridoxínchloridu/,

0,2 mg.ml^-! 7/g_aímetyl-10-/l'-D-ribityl/izoaloxazínu /riboflavinu/, 1 mg.ml^-! 3_/4_ami_no_2_ -metyl-pyrimidyl-5-metyl/-5-/2-hydroxyetyl/-4-metyltiazolu /tiamínchloridu/, 2 000 mg.ml ¹ hydrogenuhličitanu sodného doplnenom s 2 mmol kyseliny 2-aminoglutarámovej /glutamínu/,

5.10^-5 mol 2-merkaptoetanolu, 100 jug.ml^-! 0-alfa-L-2-deoxy-2-/metylamino/-glukopyranozyl-/l-2/-0-alfa-L-deoxy-3-C-formyllyxofuranozyl-/1-4/-1,3-deoxy-l,3-diguanidoscyloinozitsulfátu /streptomycínsulfátu/, 100 jednotiek na mililiter kyseliny 6-/N-fenylacetoamido/-penicilánovej /penicilínu G/, 1 mmol kyseliny N-2-hydroxyetylpiperazín-N'-2-etán sulfónovej /Hepesu/ sa rozpustí v trikrát redestilovanej vodě a doplní trikrát redestilovanou vodou na objem 900 ml roztoku, ktorý sa doplní 100 ml normálneho inaktivovaného koňského séra.

Výsledné pH takto připraveného kultivačného média je 7,2. Po zatuhnutí agaru sa na vrstvu 0,5 % hmot. agaru nanesie 100 hybridných buniek v 0,25 % hmot. agare. Po 10 dňoch vyrastú kolonie, ktoré sa pomnožia v médiu RPMI 1 640 doplnenom s 2 mmol kyseliny 2-aminoglutarámove j /glutamínu/, 5.10^-® mol 2-merkaptoetanolu, 100 jug.ml ! 0-alfa-L-2-deoxy-2-/metylamino/-glukopyranozy1-/1-2/-0-afla-L-deoxy-3-C-formyllyxofuranozy1-/1-4/-1,3-deoxy-l,3-diguanidoscyloinozitsulfátu /streptomycínsulfátu/, 100 jednotiek na mililiter kyseliny 6-/N-fenylacetamido/-penicilánovej /penicilinu G/, 1 mmol kyseliny N-2-hydroxyetylpiperazín-N'-2-etánsulfónovej /Hepesu/ sa rozpustí v trikrát redestilovanej vodě a doplní třikrát redestilovanou vodou na objem 900 ml roztoku, ktorý sa doplní 100 ml normálneho inaktivovaného koňského séra.

Výsledné pH takto připraveného kultivačného média je 7,2. V 1 ml kultivačného média sa nachádza 350 až 700 tisíc hybridómov NDV-NTP-1 produkujúcich 10 až 100 jug monoklonálnej IgGl, kappa, protilátky.

Příklad 2

Postupuje sa ako v příklade 1 s tým rozdielom, že sa v kultivačnom médiu použije nepredtestované běžné telacie fetálne sérum,. Do takto připraveného kultivačného prostredia přenesené buňky po fúzii nie sú schopné rást a produkovat monoklonálne protilátky.

Myší lymfocytárny hybridóm NDV-NTP-1 sa kultivuje pri teplote 37 °C. Stredný generačný čas je 22,4 h, modálny počet chromozómov je 24 mesiacov po fúzii 73 chromozómov. Produkovaná monoklonálna protilátka je myší imunoglobulín triedy IgGl, kappa.

Monoklonálna protilátka produkovaná myším lymfooytárnym hybridómom NDV-NTP-1 móže byt použitá vo veterinátnej praxi pre zisťovanie virusu Newcastleskej choroby v chovoch hydiny.

Claims (1)

1. PREDMET VYNÁLEZU

   Myší lymfocytárny. hybridóm NDV-NTP-1, produkujúci monoklonálne protilátky proti virusu Newcastleskej choroby, podtriedy IgGl, kappa.