CS260264B1 - Myší lymfocytárny hybridom produkujúci monoklonálne protilátky neutralitujúce virus Newcastleskej choroby - Google Patents

Abstract

Očelom riešenia je příprava izotypovo a idiotypovo homogénnej protilátky o vysokej Čistotě. Uvedeného účelu sa dosiahne použitím myšieho lymfocytárneho hybridómu NDV-NTP-2, produkujúceho monoklonálmu protilátku neutralizujúcu virus Newcastleskej choroby. Myší lymfocytárny hybridóm má použitie vo veterinárnej medicíně.

Description

Vynález sa týká myšieho lymfocytárneho hybridómu produkujúceho roonoklonálne protilátky neutralizujúce virus Newcastleskej choroby.

Doposiaí sa protilátky proti virusu Newcastleskej choroby pripravujú tak, že virus sa injikuje pokusným zvieratám, najmá králikom a ovciam. Vzhladom na to, že nestačí jedna dávka virusu pre vyvolanie dostatečné vysokej protilátkovej odpovede, je potřebné ho injikovať viackrát opakované v různých dávkách a časových intervalech. Sérum takto imunizovaných zvierat slúži ako zdroj protilátok najmá pri diagnostickom vyšetřovaní chovov hydiny. Zmienený postup imunizácie má niekolko nevýhod. (Získává sa heterogénna zmes protilátok, ktorej rozloženie sa v. organizme producenta mění, je velmi různorodé, kvalitativně a kvantitativné kolíše od jedného odběru po druhý a je neopakovatelné. Okrem toho sérum obsahuje vel'a protilátok proti nežiadúcim prímesiam, ktoré sa nachádzajú vo vírusovom materiáli použitom pre imunizá· fciu. V důsledku toho je potřebné séra upravovat zložitými postupmi, čím získáváme heterogénne a nestandardně preparáty. Využitelnost takto připraveného diagnostického séra je znížená aj tým, že jeho specifické polyklonálne protilátky sú z hlediska interakcie s vírusom velmi různorodé. Naviac příprava virusu pre imunizačné účely je nákladná.

Hybridom NDV-N'I’P-2 bol připravený známým spůsobom, klonováním skupiny hybridómov v makkom agare, vzniklých fúziou buniek myšej 2-amíno-6-hydroxy-8-azapurín '(8-azaguanín) rezistentněj myelómovej linie ©značenej NSO a slezinových buniek inbredinej linie myší BALB/c, imunizovaných purifikovaným vírusom NDV, kmen L Kansas [G. Kohler, C. Milstein, G. W. Butcher, J. C. Howard: Nátuře 286, 550 (1977]].

Uvedené nevýhody v podstatnej miere odstraňuje vynález, ktorého podstata spočívá v myšom lymfocytárnom hybridóme NDV-NTP-2, produkujúcom monoklonálnu protilátku triedy IgM, kappa, neutralizujúcu virus Newcastleskej choroby. Tento hybridům je uložený vo Virologickom ústave SAV, (Mlýnská dolina 1, 817 03 Bratislava.

Výhodou hybridómu je, že produkuje izotypovo a idiotypovo homogénnu špecifickú protilátku, tzv. monoklonálnu protilátku, ktorá specificky neutralizuje virus Newcastleskej choroby a tým je ho možné použit nie len pre diagnostické účely, ale aj perspektivné pre preventivné a liečebné ciele. jednobunkový lymfocytárny hybridům NDV-NTP-2 rastie in vivo v peritoneálnej dutině BALB/c myší za súčasnej tvorby ascites. Rastie aj in vitro v kultivačných médiach vhodných pre živočišné buňky. Taktiež po zmrazení a uložení v tekutom dusíku a po opattovnom rozmražení si zachovává svoju schopnost produkovat monoklanálnu protilátku neutralizujúcu virus Newcastleskej choroby. Neobsahuje na rozdiel od konvenčných antisér nevhodné, balastné protilátky.

Příklad 1

Pre přípravu hybridnej bunkovej linie sa použije 2. IQ⁷ buniek myšej 2-amíno-8-hydroxy-8-azapurín (8-azaguanin) rezistentnej myelómovej bunkovej linie, ktoré sa pomocou 1 ml 50 % hmot. polyetylénglykolu spoja s 1. 10® slezinových lymfoidných buniek myši imunizovanej 10 ug virusu. V priebehu 14 dní vyrastú pod selektívnym tlakom kyseliny 4-amíno-pteroylglutámove] (amínopterínu] hybridně buňkové linie, ktoré produkuji! monoklonálne protilátky proti virusu Newcastleskej choroby, ktoré sa s ním vlažu a ovplyvňujú jeho biologická aktivitu. Tieto buňky sa potom klónujú tak, že sa tzmieša 0,5 % hmot. agaru s 5 .10® až 10. . 10® myších slezinových buniek v médiu ,RPMI 1 640, ktoré obsahuje

100. mg . ml'¹ tetrahydrátu dusičnanu vápenatého,

000 mg . ml¹ D-glukózy,

100 mg. ml^-1 heptahydrátu síranu horečnatého,

400 mg . ml¹ chloridu draselného, il 512 mg . ml¹ hydrogenfosforečnanu sodného,

Θ 000 mg . ml¹ monohydrátu dihydrogeníesforečnanu sodného,

100 mg . ml¹ kyseliny 2-amíno-5-guanidínovalérovej (arginínu), mg . ml¹ kyseliny 2-amínosukcínovej (asparagínu), mg..ml^-1 kyseliny 2-a.mínojant^rovej (kyseliny asparágovej), mg. ml¹ kyseliny 3‘,3‘-ditiobis(2-amínopropánovej) (cystínu), mg . ml¹ kyseliny 2-amínoglutárovej (kyseliny glutárovej),

300 mg . ml¹ kyseliny 2-amínoglutárovej (glutamínu), '1 mg . ml¹ kyseliny 2-amínoglutaraminyl-2-merkaptopropionyl-amínooctovej (glutationu, t. j. glutaminyl-cystelnyl-glycínu), mg. ml¹ kyseliny amínooctovej (glycinu),

260284 mg. ml^-1 kyseliny a-amíno-l-imidazol-á-propiónovej (hlstidínu), m;.ml^_1 kyseliny 2-amíno-3-metylvalérovej (Ízoleucínu), mg . ml¹ kyseliny 2-amíno-4-metylvalérovej (Leucínu), mg. ml-¹ kyseliny 2,6-diamínohexánovej (lyzínu), '15 mg . mr¹ kyseliny 2-amíno-4-(metyltio)-maslove) (metionínu), mg. ml^-1 kyseliny 2-amíno-3-fenylpropiónove) (fenylalanínu), mg . ml”¹ kyseliny 2-pyřolidínkarboxylovej (prolinu), mg. ml¹ kyseliny 2-iamíno-3-hydroxyproplónovej (serínu), mg. ml“¹ kyseliny 2-amíno-3-hydroxymaslovej (treonínu), mg . ml“¹ kyseliny 2-amíno-3-(3-hydroxymaslovej (treonínu), mg . ml¹ kyseliny 2-amíno-3-(3-indolyl)propiónove) (tryptofánu), '20 mg. ml¹ kyseliny 2-amino-3-(4-hydroxyfenylj-propiónovej (tyrozínu), mg . ml^-1 kyseliny 2-amíno-3-methylmaslove) (valínu),

0,2 mg. ml¹ kyseliny 5-(2-oxoimidazolíno(4,5-c) tiol-2-yl )pentánovej (biotínu),

0,005 mg. ml¹ kobalt a[a-(5,6-dimotylbenzimidazol))-kobalt /l-kyanokoibamid vitamínu B12),

0,250 mg. ml¹ D-N-(2,4-dihydroxy-3,3-dimetylbutyryl)-/3-2-amínopropionát vápenatý (pantotenát vápenatý), ⁱ3 mg . ml^-1 2-hydroxyetyltrimetylamóniumchlorld (cholínchlorid), mg. ml^-1 kyseliny N-(2-iamíno-4-hydroxypter idín-6-ylmetyl) -p-amínobenzoove j (kyseliny listovej), mg . ml¹ (1,2.3,5/4,6/cyklohexándexol) (myoinozltolu), mg. ml¹ pyridin-3-karboxyamidu (nikotínamidu), mg. ml”¹ kyseliny 4-amínobenzoovej kyseliny p-amínobenzoove]), 1 mg. ml¹

3-hydroxy-4,5-bis( hydroxymetyl )-2-metylpyridínchloridu (pyridoxínchloridu),

0,2 mg . ml¹ 7,8-dimetyl-10-(l‘-D-ribytyl)izoaloxazínu (riboflavínu), mg . ml¹ 3-(4-amíno-2-metyl-pyrimi'dyl-5-metyl) -5- (2-hydroxyetyl) -4-metyltiazolu (tiamínchloridu),

000 mg . ml”¹ hydrogenuhličitanu sodného doplnenom s 2 mmol kyseliny 2-amínoglutarámovej (glutamínu), .10⁵ mol 2-merkaptoetanolu,

100 jUg . ml¹ 0-a-L-2-deoxy-i2-(metylamíno) -glutapyranozyl (1-2) -O-a-L-deoxy-3-C-f ormyllyxof uranozyl- (1-4) -1,3-deoxy-l,3-diguanidoscyloinozitsulfátu (streptomyeínsulfátuf,

100 jednotlek na mililiter kyseliny 6-(N-fenylacetoamidoj-penicilánovej (penicilínu mmol kyseliny N-2-hydroxyetylplperazín-N‘-2-etán sulfónovej (Hepesu) sa rozpustí v třikrát redestilovane) vodě a doplní třikrát redestilovanou vodou na objem 900 ml roztoku, ktorý sa doplní 100 normálneho inaktivovaného koňského séra. Výsledné pH takto připraveného kultivačného média je 7,2. Po zatuhnutí agaru sa na vrstvu 0,5 % hmot. agaru nanesie 100 hybridných buniek v 0,25 % hmot. agare. Po 10 dňoch vyrastú kolónie, ktoré sa pomnožia v médiu RPMI 1 640 doplnenom s 2 mmol kyselinami 2-amínoglutarámovej (glutamínu), .10⁵ mol 2-merkaptoetanolu,

100 ^g . ml¹ O-a-L-2-deoxy-2-(imetylamíno)-glukopyranozyl- (1-2) -O-a-L-deoxy-3-C-f ormyllyxof uranozyl- (1-4) -1,3-deoxy1,3-diguanidoscyloinozitsulfátu (streptomycínsulfátu),

100 jednotiek na mililiter kyseliny 6-(n-fenylacetamldo)-penicilánovej (penicilínu G), mmol kyseliny N-2-hydroxyetylpiperazín-N‘2-etánsulfónovej (Hepesu) sa rozpustí v trikrát redestilovane) vodě a doplní třikrát redestilovanou vodou na objem 900 mililitrov roztoku, ktorý sa doplní 100 ml normálneho inaktivovaného koňského séra.

Výsledné pH takto připraveného kultivačného média je 7,2. V 1 ml kultivačného média sa nachádza 350 až 700 tisíc hybridómov NDV-NTP-2 produkujúcich 10 až 100 ,ug monoklonálneho IgM, kappa protilátky.

Přiklad 2

Postupuje sa ako v příklade i s tým rozdielom, že sa v kultivačnom médiu použije nepredtestované běžné telacie fetálne sérum. Do takto připraveného kultivačného prostredia přenesené buňky po fúzii nie sú schopné rásť a produkovat monoklonálne protilátky.

Myší lymfocytárny hybridóm NDV-NTP-2 sa kultivuje pri teplote 37° C. Stredný generačný čas je 22,4 h, modálny počet chromozómoví je 24 mesiacov po fúzii 75 chromozómov. Produkovaná monoklonálna protilátka je myší imunoglobulín 'triedy IgM, kappa.

Monoklonálna protilátka produkovaná myším lymfocytárnym hybridómom NDV-NTP-2 může byť použitá vo veterinárnej praxi pre zlsťovanie virusu v chovočh hydiny a perspektivné pre preventivné a terapeutické účely.

Claims (1)

1. Myší lymfocytárny hybridóm NDV-NTP-2 produkujúci monoklonálnu protilátku, neuvynalezu tralizujúcu virus Newcastleskej choroby, triedy IgM, kappa.