JP2000515381A

JP2000515381A - 麦芽種子を用いるアルコール飲料の製造のための改善されたプロセス

Info

Publication number: JP2000515381A
Application number: JP10507549A
Authority: JP
Inventors: スップ，ジェローム; ベデケル，ロベルト，フランシスクス
Original assignee: モーヘンインターナショナルエヌ．ブイ．; ヒスト―ブロカデスエヌ．ブイ．
Priority date: 1996-08-05
Filing date: 1997-07-23
Publication date: 2000-11-21
Also published as: PL331493A1; AU4116197A; CZ37899A3; US6361808B1; EP0915985A1; CA2262436A1; MXPA99001239A; PL191456B1; BG103199A; US20050095315A1; US20020164399A1; WO1998005788A1; AU720139B2; BR9711620A; CN1230225A; CZ296732B6; US6699515B2; BG64681B1

Abstract

(57)【要約】本発明は、エンド-β(1,4)-キシラナーゼ、アラビノフラノシダーゼ、αアミラーゼ、エンドペプチダーゼ、およびβ-(1,3;1,4)-グルカナーゼ、ならびに必要に応じて糖化アミラーゼおよび/またはエキソペプチダーゼを含む酵素の混合物を用いる、ビールまたはウイスキーのようなアルコール飲料の製造のためのプロセスに関する。醸造プロセスに必要である酵素がトランスジェニック種子によって提供される混合物が好ましい。少量の麦芽のみが、風味および色のために必要であり得る。

Description

【発明の詳細な説明】麦芽種子を用いるアルコール飲料の製造のための改善されたプロセス発明の分野本発明は、アルコール飲料（特に、ビールおよびウイスキー）の製造のためのプロセスに関する。発明の背景ビールのようなアルコール飲料は、麦芽化(malted)オオムギ粒および/または麦芽除去(unmalted)オオムギ粒から製造され得る。麦芽は、酵母に加えて、ビールの風味および色に寄与する。さらに、麦芽は、発酵可能な糖および酵素の供給源として機能する。麦芽が醸造プロセスにおいて使用されるか否かは、ビールのタイプおよびビールが製造される国に依存する。アフリカの国々においては、例えば麦芽を用いる伝統はない。麦芽製造および醸造の一般的なプロセスは、最近R.C．Hoseney（Cereal Foods World，39(9)，675-679，1994）によって記載されている。麦芽製造は、その後にオオムギ粒の制御された乾燥工程が続く、制御された発芽のプロセスである。穀粒は、浸漬、発芽、成長、および乾燥（火力乾燥）の連続的な工程によって麦芽に変換される。この点に関して、発芽工程は、胚乳の改変を可能にする一連の酵素の発現を得るために重要である。この改変は、発酵可能な炭水化物を産生する。麦芽製造プロセスの引き続く乾燥/加熱工程は、非酵素的褐変（メイラード）反応に起因して風味および色を生成する。麦芽製造のプロセスは、ビール製造プロセスの非常に複雑でかつ費用のかかる部分である。麦芽製造プロセスのいくつかの不利益が言及され得る： −麦芽の酵素レベルは、可変であり、結果を予測し得ないものにする、 −発芽の間に、全ての望ましい酵素活性が形成されたり、または十分な量で形成されるわけではなく、このため酵素の補充が必要になる、 −高風味および色に都合の良い条件が、麦芽の酵素活性に対して有害であり得る、 −このプロセスは、高価である、 −幼根（これらは、麦芽の洗浄の間に除去される）の呼吸および成長に起因して、重量の10〜20％の損失が、発芽の間に起こる、 −好適でない気候条件のため、任意の所望の場所での麦芽の製造が不可能である、 −オオムギに存在するプロテアーゼによるタンパク質の可溶化のため、麦芽の使用は、コロイドの不安定性を導き得る、 −生体アミンの形成が起こり得（J．Food Science 59(5)，1104-1107，1994)、これは例えば、ヒスタミン中毒を導き得る。伝統的に、麦芽は、発酵可能な炭水化物および酵素の唯一の供給源であった。そして多くの国々で未だにそうである。しかし、現在までに、麦芽および/またはオオムギ以外の他の炭水化物供給源（すなわち、実質的に任意のデンプン供給源または液化/分解デンプン）、いわゆる添加剤を用いて益々多くのビールが製造されている。麦芽は、発酵可能な炭水化物の供給源として機能するのみでなく、酵素の供給源としてもまた機能するので、約50％より多い麦芽を麦芽除去オオムギおよび/または添加剤で置換する場合には、代替の酵素供給源が提供されなければならない。さらに、麦芽はビールに風味および色を与える。麦芽の産生において、風味と色と酵素活性との間には交換（trade-off）が存在する。高風味および濃い色を提供する麦芽は、比較的高温でのより重点的な乾燥の後にのみ産生され得る。これらは、酵素活性にとって有害な条件である。従って、外因性供給源からの酵素の補充が、いくつかの観点から必要である。この点に関して、微生物酵素の使用が、これまでの間、一般的に実施されてきた。例えば、ビールの醸造のために、穀粒および/または麦芽粒が、発酵可能な糖を生成するために液化され、そして糖化される。液化工程は、例えば、US 4,285,975 またはUS 5,180,669に記載される熱安定なαアミラーゼを使用することによって改善され得る。また、プロテアーゼが使用されて、発酵を改善するための麦汁中の自由に利用可能な窒素の量を増大させる。デンプン以外に、例えば、β-グルカンのような他のポリサッカライドが穀物粒中に存在する（Henry，R．J.ら、J．Sci．Food Agric．36，1243-1253，1985 ）。麦芽中に存在するβグルカナーゼは、醸造プロセスの間に活性であるほど十分に熱安定でない。これらのβグルカンは、高度に粘性であり、そして麦汁およびビールに濾過の問題を生じさせる。このため、微生物βグルカナーゼが、醸造プロセスにおいて広範に使用される。非デンプン性ポリサッカライドはまた、ペントサンを含み、この構造は、最近広範に研究されている（Gruppen，H．ら、Carbohydr．Res．233，45-64，1992）。特に、オオムギおよび麦芽のペントサンが研究されている（Vietor，R．J.ら、Carbohydr．Res．254，245-255，1994）。Penicillium emersonii由来のペントサナーゼは、醸造における発酵可能な糖の産生および抽出を改善すると言われている（GB 2,150,933）。麦汁品質を改善するためのキシラナーゼＢの使用はまた、WO94/14965に言及されている。この分野でなされた進歩にもかかわらず、そこで使用するための酵素調製物を用いるビール醸造の方法に対する必要性が未だ存在する。発明の要旨本発明は、ビールのようなアルコール飲料の製造のためのプロセスであって、そのアルコール飲料に酵素の混合物が添加され、その混合物は、少なくともエンド-β(1,4)-キシラナーゼ、アラビノフラノシダーゼ、α-アミラーゼ、エンドプロテアーゼ、およびβ-(1,3:1,4)-グルカナーゼを含み、また必要に応じて糖化アミラーゼおよび/またはエキソペプチダーゼを含む、プロセスを開示する。好ましくは、ビール製造プロセスに必要な酵素は、トランスジェニック種子によって提供される。本発明はさらに、ビール製造プロセスにおいて必要な酵素を発現するトランスジェニック種子を開示する。発明の説明本発明者らは、現在、驚くべきことに、醸造プロセスが、最少量の麦芽とともに、請求の範囲に記載される酵素の混合物の存在下で行われ得ることを見出した。このプロセスは、古典的麦芽ビールを製造するために行われているが、酵素活性を提供するために麦芽が用いられる任意のプロセスにおいて同等に充分に行われ得る。用いられる酵素は、醸造プロセスに必要である酵素群から選択される。これらは、デンプン分解酵素群、セルロース分解酵素群、ヘミセルロース分解酵素群、およびタンパク質分解酵素群より選択される酵素を含む。デンプン分解酵素は、α-アミラーゼ、糖化アミラーゼ、アミログルコシダーゼ、エキソ-アミラーゼ、プルラナーゼのような酵素を含む。セルロース分解酵素は、β-1,4-エンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、β-グルコシダーゼのような酵素を含む。ヘミセルロース分解酵素は、β-1,3-1,4-グルカナーゼ、キシラナーゼ、エンドアラビナナーゼ、アラビノフラノシダーゼ、アラビノキシラナーゼ、アラビノガラクタナーゼ、フェルラ酸エステラーゼのような酵素を含む。タンパク質分解酵素は、エキソペプチダーゼおよびエンドペプチダーゼ（プロテアーゼ（プロテイナーゼ）とも呼ぶ）のような酵素を含む。この局面では、特定のデンプン分解酵素、セルロース分解酵素、ヘミセルロース分解酵素、またはタンパク質分解酵素についての選択は、酵素の選択が、酵素の特性（例えば、pH範囲および温度範囲）が醸造プロセスの特定の環境に適合性であるようなものであるべきなことを除いては、本発明には重要ではない。デンプン分解酵素、セルロース分解酵素、ヘミセルロース分解酵素、およびタンパク質分解酵素をコードする多数の遺伝子は、当業者に利用可能である。目的の酵素をコードする遺伝子は、任意の供給源、植物、動物、または微生物から入手可能であり得る。好ましくは、遺伝子は、微生物供給源から入手可能である。エンド-β-(1,4)-キシラナーゼは、Aspergillus niger（EP 0 463 706）の培養物から入手され得る。アラビノフラノシダーゼは、Aspergillus nigerの培養物からのイソ酵素Ａもしくはイソ酵素Ｂ（EP 0 506 190）またはアラビノキシランヒドロラーゼ（EP 0 730653）として利用可能である。熱安定性アミラーゼは、Bacillus licheniformis（WO91/14772，WO92/05259）に由来し得、そして例えば、商品名Brewers Amyliq Thermostable（B.A.T.S.）の下で市販される。熱安定性アミラーゼの活性は、TAU単位で表される。エンドプロテアーゼは、Bacillus am yloliquefaciensに由来し得、そしてまた商品名Brewersプロテアーゼ（＋）の下で市販され、そしてその活性は、PC単位で表される。同じ細菌からまた、β-(1, 3;1,4)-グルカナーゼが由来し得（Hofemeisterら，Gene 49，177，1986）、これはまた商品名Filtrase L3000（＋）の下で市販される。グルカナーゼの活性は、 BGLU単位で表される。任意の糖化アミラーゼもまた、市販の供給源から入手され得るが（活性がFAU単位で表される、商品名Brewers Fermexの下のAspergillus o ryzae由来のアミラーゼ）、これはまた、Penicillum emersoniiの純粋培養物から入手し得る（ATCC（アメリカンタイプカルチャーコレクション）で番号ATCC16 479の下で利用可能）。任意のエキソペプチダーゼは、Centraal Bureau for Sch immelcultures（CBS），Oosterstraat 1，Baarn，The Netherlandsに番号CBS 20 9.96（1996年２月12日、A.sojac（DS 8351））の下で寄託されているような、As pergillus sojaeの純粋培養物に由来し得る。ビール生産のために必要であることが現在公知である酵素活性は、胚乳のデンプンを発酵可能な糖に変換するためのα−アミラーゼおよびβ−アミラーゼ、タンパク質を酵母栄養分として機能し得る可溶性窒素化合物に分解するためのプロテアーゼ、ならびにオオムギβ-1,3-1,4-グルカンおよびキシランを、それぞれ、粘度の低減および濾過性の改善をもたらすオリゴサッカライドに加水分解するためのβ-グルカナーゼおよびキシラナーゼである。従って、外的供給源（すなわち、微生物供給源）から全ての必要な酵素を提供するために、少なくとも５種類の異なる酵素の添加が要求される。１つの微生物が全ての酵素の産生のために用いられ得るが、異なる発酵条件が、全ての酵素の最適な産生のために要求される。微生物供給源由来の酵素を用いることにより、先に言及した麦芽製造プロセスのいくつかの欠点が克服され得る。しかし、酵素の供給源としての微生物の使用はまた、以下のその欠点を有する： −少なくとも１つの微生物の一連の異なる発酵が、充分量の各酵素を得るために要求される、 −酵素調製物は、望ましくない副活性を含み得る、 −消費者は、植物材料、水、および酵母以外の添加を好まない、 −室温での保存の間の酵素調製物の制限された安定性。増強量の酵素を含むトランスジェニック種子の工業的酵素触媒プロセスでの一般的な使用は、国際特許出願WO91/14772に記載される。工業プロセスでの酵素含有種子の直接使用は、最初に酵素を抽出および／または単離する必要性を回避する。種子は、安定かつ扱い易い貯蔵形態の酵素として機能し得る。１つの単一の酵素、β-1,3-1,4-グルカナーゼについては、オオムギ種子における発現が外的添加の代替手段として言及されている。東独特許出願DD 275704は、オオムギにおけるBacillus β-1,3-1,4-グルカナーゼの種子特異的発現を可能にする発現ベクターの構築を開示する。しかし、この当時は、オオムギの有効な形質転換は未だ知られていなかった。Bacillus β- グルカナーゼを発現する種子を用いて、深刻な濾過の問題を生じることなく、より多量の穀粒で、麦芽を置換し得る。しかし、ビール醸造プロセスに必要である他の酵素活性は、依然として、麦芽から得られるか、または外部から補充されなければならない。 Mannonenら（1993）は、オオムギ種子における真菌β-1,3-1,4-グルカナーゼの取り込みを示唆する。このようにして、醸造プロセスは、内因性のオオムギ酵素よりも高い熱安定性を有するβ-1,3-1,4-グルカナーゼの種子での発現により改善される。しかし、この場合、意図は、種子を通常の麦芽製造プロセスに通すことである。さらに、この場合もまた、ビール醸造プロセスにおいて必要である他の酵素活性は、依然として、麦芽から得られるか、または外部から補充されなければならない。本発明の好ましいプロセスでは、醸造プロセスに必要である酵素は、トランスジェニック種子において発現される。この必要な酵素を発現する、このようにして産生されたトランスジェニック種子は、次いで、ビール醸造プロセスにおいて用いられる。このようにして、麦芽の使用は低減し、一方、外的微生物酵素の添加は回避される。ビール醸造プロセスに必要である酵素を発現するトランスジェニック種子は、一般名MaltSeed(麦芽種子)によりカバーされる。その種子で目的の酵素を産生し得る植物の属は、穀粒または穀粒からの産物がビール醸造における使用の歴史を有する種を含む。しかし、通常はビール醸造には使用されない植物種もまた、特に、ほんの微量のこのトランスジェニック種子が醸造プロセスに添加される場合、目的の酵素を発現するトランスジェニック種子の供給源として使用され得る。これらの基準に適格である植物の属は、例えば、オオムギ、トウモロコシ、イネ、コムギ、モロコシ(sorghum)、キビ、エンバク、キャッサバなどである。目的の酵素をコードする遺伝子は、植物体または植物種子において機能的な調節配列を用いて、植物種子において発現される。このような調節配列は、プロモーター列、ターミネーター列、および必要に応じて転写エンハンサー列を含む。植物全体で遺伝子の構成的発現を導くプロモーター配列が用いられ得る。さもなければ、植物種子へ遺伝子の発現を指向するのに活性であるプロモーター配列が用いられ得る。さらに、目的の酵素の発現は、特定の細胞区画（例えば、細胞質ゾル、小胞体、液胞、タンパク質粒）または細胞外腔のいずれかに、特異的な標的化配列を用いて指向され得る。特定の細胞区画または細胞外腔についての選択は、目的の酵素の特性に依存し、そして酵素に最適の環境が作られるようにされるべきである。例えば、目的の酵素は、種子成熟の間にタンパク質の最適な安定性を可能にする環境に存在するべきである。さらに、目的の酵素は、酵素の発現が必須の植物代謝プロセスを阻害しないか、または植物もしくは種子の生存能力に有害な影響をもたらさない環境に存在するべきである。植物細胞において発現され得るために、えり抜きの酵素をコードするDNA配列は、通常、宿主の生化学的機構によりそれが認識されるのを可能にし、そしてオープンリーディングフレームが宿主において転写および翻訳されるのを可能にする調節エレメントとともに提供される。DNA配列は、通常、植物細胞において発現され得る任意の遺伝子から適切に誘導され得る転写開始領域、ならびにリボソーム認識および結合のための翻訳開始領域を含む。真核生物植物細胞では、このような発現カセットは、通常、さらに、このオープンリーディングフレームの下流に位置する転写終結領域を含む。転写終結領域は、転写が終結し、そして一次転写産物のポリアデニル化が生じるのを可能にする。さらに、コドン使用頻度が、えり抜きの宿主植物の容認されたコドン使用頻度に適応され得る。植物細胞においてDNA構築物の発現を支配する原理は、通常、当業者に理解され、そして発現可能なキメラDNA構築物の構築は現在日常的である。特別型のレプリコンは、それ自体またはその一部が別の宿主細胞（例えば、植物細胞）に移入し得、それにより本発明による酵素をコードするオープンリーディングフレームをこの植物細胞に同時移入するレプリコンである。このような能力を有するレプリコンは、本明細書中でベクターといわれる。このようなベクターの例は、適切な宿主（例えば、Agrobacterium tumefaciens）中に存在する場合に、その一部、いわゆるＴ領域を植物細胞に移入し得るTiプラスミドベクターである。異なる型のTiプラスミドベクター（EP 0 116 718 B1を見よ）は、現在、キメラDNA配列を植物細胞またはプロトプラスト中に移入するために日常的に用いられ、この細胞またはプロトプラストから、それらのゲノムにこのキメラDN Aを安定に取り込む新規な植物が作製され得る。特に好ましい形態のTiプラスミドベクターは、（EP 0 120 516 B1およびUS 4,940,838）に請求されるような、いわゆるバイナリーベクターである。本発明に従ってDNAを植物宿主に導入するために用いられ得る他の適切なベクターは、ウイルスベクター、例えば、非組込み型植物ウイルスベクター（例えば、二本鎖植物ウイルス（例えば、CaMV）および一本鎖ウイルス、ジェミニウイルスなどから誘導可能なベクター）から選択され得る。このようなベクターの使用は、特に、例えば、木本種、特に、高木および蔓植物の場合のように、植物宿主を安定に形質転換することが困難である場合には、有利であり得る。表現「それらのゲノム中に本発明によるキメラDNA配列を組み込む宿主細胞」は、そのキメラDNAをそれらのゲノム中に安定に組み込み、それによってキメラD NAを維持し、そして好ましくはそのようなキメラDNAのコピーを子孫細胞に伝達する（有糸分裂または減数分裂を介して）、細胞、およびそのような細胞を含む、または本質的にそのような細胞からなる多細胞生物を含むことを意味する。本発明の好ましい実施態様によれば、それらのゲノム中に１つ以上のコピーのそのキメラDNAを組み込む細胞から本質的になり、そしてコピー（単数または複数）をそれらの子孫に、好ましくはメンデルの様式で伝達し得る植物が提供される。本発明によるキメラDNAの転写および翻訳によって、それらの細胞は酵素を産生する。植物細胞においてDNAの転写を支配する原理は常には理解されていないが、発現され得るキメラDNAの作製は今や日常的である。構成的方法での形質転換されるポリヌクレオチドの発現のために日常的に使用される転写開始領域は、カリフラワーモザイクウイルスから取得可能なプロモーター、とりわけ35S RNAおよび19S RNA転写産物プロモーター、ならびにAgrobacterium tumefaciensのいわゆるT-DNAプロモーターである。特に、言及するべきものは、ノパリンシンターゼプロモーター、オクトピンシンターゼプロモーター（EP 0 122 791 B1において開示される）、およびマンノピン（mannopine）シンターゼプロモーターである。さらに、イネアクチン遺伝子プロモーターのような、実質的に構成的であり得る植物プロモーターが使用され得る。種子特異的発現のためには、目的のcDNAの遺伝子は、植物種子において特異的に発現される遺伝子起源のプロモーターの後ろに挿入され得る。これらのプロモーターは、Brassica napusクルシフエリン（ cruciferin）プロモーター、Phaseolus vulgarisファゼオリンプロモーター、Or yza sativa由来のグルテリンプロモーター、Zea maysのゼインプロモーター、およびHordeum vulgareのホルデイン（hordein）プロモーターのような種子貯蔵タンパク質をコードする遺伝子のプロモーターを含む。特定のエレメント（いわゆるエンハンサー）の複製が、その支配下のDNAの発現レベルをかなり増強し得ることがさらに知られている（例えば、以下を参照のこと：Kay R.ら、(1987)，Sc ience 236，1299-1302：CaMV 35Sプロモーターの-343と-90との間の配列の複製はそのプロモーターの活性を増大させる）。構成性35Sプロモーターに加えて、１倍または２倍増強される、高レベルのプロモーターの例は、光誘導性リブロースビスリン酸カルボキシラーゼ小サブユニット（rbcSSU）プロモーターおよびクロロフィルa/b結合タンパク質（Cab）プロモーターである。物理的に連結された異なるプロモーター領域のエレメントを含むハイブリッドプロモーターもまた、本発明によって意図される。その周知の例は、いわゆるCaMV増強マンノピンシンターゼプロモーター（米国特許第5,106,739号）であり、これは、CaMVエンハンサーに連結されたマンノピンシンターゼプロモーターのエレメントを含む。特に単子葉植物の形質転換について、プロモーターと選択マーカー遺伝子との間のイントロンの使用は、発現を増強させる。従って用語「プロモーター」は、構造遺伝子の上流にあり、そして転写を開始するためのRNAポリメラーゼおよびその他のタンパク質の認識および結合に関与するDNAの領域をいう。「植物プロモーター」は、植物細胞において転写を開始し得るプロモーターである。「構成性プロモーター」は、大部分の環境条件および発達または細胞分化の状態の下で活性であるプロモーターである。転写ターミネーター領域の必要性に関しては、一般に、そのような領域が、植物細胞における転写の信頼性および効率を増強すると考えられている。それゆえ、その使用は、本発明に関して、強く好ましい。本発明のいくつかの実施態様は現時点で実施可能ではないかもしれないが（例えば、いくつかの植物種は今のところ遺伝子形質転換を受け入れないので）、そのような植物種における本発明の実施は、単に時間の問題であり、そして原理の問題ではない。なぜなら、そのような遺伝子形質転換に対する受容可能性は、本発明の基礎をなす実施態様に関連しないからである。植物種の形質転換は、感銘的な数の植物種（双子葉類および単子葉類を含む）について今や日常的である。原則的に、任意の形質転換法が、本発明によるキメラDNAを適切な先祖細胞中に導入するために使用され得る。方法は、プロトプラストのためのカルシウム／ポリエチレングリコール法（Krens，F.A.ら、1982，N ature 296，72-74;Negrutiu I.ら、1987年６月、Plant Mol．Biol．8，363-373 ）、プロトプラストのエレクトロポレーション（Shillito R.D.ら、1985 Bio/Te chnol．3，1099-1102）、植物材料中へのマイクロインジェクション（CrosswayA .ら、1986，Mol．Gen．Genet．202，179-185）、種々の植物材料の（DNAまたはR NAコート）粒子ボンバードメント（KleinT.M.ら、1987，Nature 327，70）、（非組み込み）ウイルスでの感染、成体植物の浸潤または成熟花粉もしくは小胞子の形質転換による植物内（in planta）Agrobacterium tumefaciens媒介性遺伝子移入（EP 0 301 316）などから適切に選択され得る。本発明による好ましい方法は、Agrobacterium媒介性DNA移入を含む。EP A 120 516および米国特許第4,94 0,838号に開示されるようないわゆるバイナリーベクター技術の使用が特に好ましい。遺伝子形質転換をいくらかより受け入れにくいとは考えられるが、単子葉植物は形質転換を受容可能であり、そして稔性のトランスジェニック植物が形質転換された細胞もしくは胚またはその他の植物材料から再生され得る。現在、単子葉植物の形質転換のための好ましい方法は、胚、外植片、または懸濁細胞のマイクロプロジェクタイルボンバードメント、および直接DNA取り込みまたは（組織）エレクトロポレーションである（Shimamotoら、1989，Nature 338，274-276）。トランスジェニックトウモロコシ植物が、ホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼ（phosphinothricin acetyltransferase）（除草剤ホスフィノトリシンを不活化する酵素）をコードするStreptomyces hygroscopicus bar遺伝子を、トウモロコシ懸濁培養物の胚形成性細胞中へ、マイクロプロジェクタイルボンバードメントによって導入することにより得られた（Gordon-Kamm，1990，Plant C ell，2，603-618）。遺伝物質の他の単子葉作物（例えば、コムギおよびオオムギ）の糊粉プロトプラスト中への導入が報告されている（Lee，1989，Plant Mol .Biol．13，21-30）。コムギ植物が、胚形成性カルスを胚形成性懸濁培養物の樹立について選択することによって、胚形成性懸濁培養物から再生された（Vasil, 1990 Bio/Technol．8，429-434）。これらの作物のための形質転換系の組み合わせは、本発明の単子葉植物への適用を可能にする。単子葉植物（イネおよびトウモロコシのような商業的に重要な作物を含む）はまた、Agrobacterium株によるDNA移入を受容する（WO94/00977；EP 0 159 418B1 ；Gould J，Michael D，Hasegawa O，Ulian EC，Peterson G，Smith RH，（1991 ）Plant．Physiol．95，426-434を参照のこと）。オオムギについては、好ましい形質転換法は、Tingay，S.ら（The Plant J．11(6)，1369-1376，1997）に記載されている。１つより多いキメラ遺伝子を構成的に発現し得るトランスジェニック植物を得るために、以下を含む多数の代替物が利用可能である：Ａ．第２の選択マーカー遺伝子に物理的に結合された多数の改変遺伝子を有する DNA（例えば、バイナリープラスミド上のT-DNA）の使用。この方法の利点は、キメラ遺伝子が物理的に結合されており、それゆえ単一のメンデル遺伝子座として移動することである。Ｂ．好ましくは選択マーカー遺伝子に結合された、各々が既に１つ以上のキメラ遺伝子を発現し得るトランスジェニック植物の、別の選択マーカーに結合された１つ以上のキメラ遺伝子を含むトランスジェニック植物由来の花粉との他家受粉。その後、種子（これはこの交配によって得られる）は、２つの選択マーカーの存在に基づいて、またはキメラ遺伝子自体の存在に基づいて選択され得る。選択された種子から得られる植物は、その後さらなる交配のために使用され得る。原則的に、キメラ遺伝子は単一の遺伝子座上には存在せず、それゆえ遺伝子は独立した遺伝子座として分離し得る。Ｃ．各々が１つ以上のキメラ遺伝子および選択マーカーを有する多数の複数のキメラDNA分子（例えば、プラスミド）の使用。同時形質転換の頻度が高い場合は、１つのみのマーカーに基づく選択で十分である。他の場合においては、１つより多いマーカーに基づく選択が好ましい。Ｄ．第１、第２、（など）、のキメラ遺伝子を既に含むトランスジェニック植物の、必要に応じて選択マーカー遺伝子を含む、新たなキメラDNAでの連続的な形質転換。方法Ｂにおけるように、キメラ遺伝子は原則的に単一の遺伝子座上には存在せず、それゆえキメラ遺伝子は独立した遺伝子座として分離し得る。Ｅ．上記のストラテジーの組み合わせ。実際のストラテジーは、親系統の目的（直接的成長、育種プログラムにおける使用、ハイブリッドを作製するための使用）のようないくつかの考慮に依存し得るが、それは記載される発明に関して重要ではない。事実上全ての植物が、培養細胞または組織から再生され得ることが知られている。再生のための手段は植物の種によって変化するが、一般に、形質転換されたプロトプラストの懸濁液または形質転換された外植片を含むペトリ皿がまず提供される。シュートは、カルスから、器官形成または胚形成を介して、直接的または間接的に誘導され得、次いで根付かされ得る。選択マーカーに次いで、培養培地は一般に、種々のアミノ酸およびホルモン（例えば、オーキシンおよびサイトカイニン）を含む。グルタミン酸およびプロリンを培地に添加することもまた有利である。効率的な再生は、培地、遺伝子型、および培養物の経歴に依存する。これら３つの変数が制御される場合、再生は通常再現可能および反復可能である。形質転換遺伝子配列のトランスジェニック植物中への安定な組み込み後、それらによって与えられた特性は、有性交配によって他の植物に移入され得る。交配されるべき種に依存して、任意の多数の標準的育種技術が使用され得る。本発明の１つの実施態様において、１つの個々の酵素を産生し、所望される全ての酵素活性比率を有する酵素混合物の自在な産生を可能にするように操作されるトランスジェニック種子が使用される。別の実施態様において、１つより多い酵素活性が、個々のトランスジェニック植物系統の種子中に含まれ得る。目的の酵素を含むトランスジェニック種子は、醸造プロセスの所望の段階で一緒に添加され得る。あるいは、目的の酵素を含むトランスジェニック種子は、各々がプロセスの所望の時点で独立して添加され得る。本発明のプロセスは、麦芽の酵素活性を扱わなければならないことなしに、高レベルの風味および色を有する麦芽の開発を可能にする。本発明のプロセスにおいて、麦芽の使用はたいてい回避される。少量の麦芽のみが、ビールに風味および色を提供するためになお必要であり得る。所望の酵素を含有するトランスジェニック種子が、穀粒と最適な比で利用され得、そして必要に応じて、風味および色彩のために充分な量の麦芽とともに利用され得る。トランスジェニック種子は、穀粒および麦芽と事前に混合され得る。あるいは、各化合物、穀粒、トランスジェニック種子、および麦芽は、ビールの醸造プロセスの別々の段階で添加され得る。好ましくは、個々の化合物、トランスジェニック種子、穀粒および麦芽、またはトランスジェニック種子、穀粒、および麦芽の混合物が、醸造プロセスへの添加の前に粉砕される。トランスジェニック種子は、種子の重量当たり0.001〜2.5％、好ましくは0.01 〜1.0％、より好ましくは0.05〜0.25％の範囲の平均レベルで所望の酵素を含む。種子中での発現のレベルに依存して、醸造プロセスで通常使用される種子の一部のみまたは全てが、トランスジェニック種子と置き換えられ得る。高レベルの発現が達成される場合、醸造混合物を大幅に変更することなく、醸造プロセスでは通常は使用されない他の植物属のトランスジェニック種子を添加することもまた可能である。麦芽の場合、好ましくは、麦芽の一部が、従来の麦芽と比較して特別な処理を受ける。ここで麦芽は、着色化合物および風味化合物の産生を最大にするために、火力乾燥の間に加熱されている。残存している酵素活性は、この処置後はごくわずかである。本発明で開示されるように、種子中での酵素の発現は、醸造プロセスへの外因性微生物酵素の添加の回避の可能性を提供する。酵素を含有するトランスジェニック種子の産生のコストは、発酵プロセスによる酵素の産生のコストよりもはるかに低い。さらに、トランスジエニック種子はより便利に使用される。なぜなら、それらは、酵素の安定でそして管理しやすい貯蔵形態を提供し、そして取り扱いが容易であるからである。トランスジェニック種子の使用と併用される用途のコストの削減および便利さは、本発明のプロセスに特に関連する。なぜなら、ビールの醸造プロセスにおけるいくつかの微生物発酵によっていくつかの異なる酵素を供給する必要性が、回避されるからである。本発明のプロセスの過程は、酵素の供給源として麦芽を使用するプロセスの過程よりもはるかにより予想可能である。なぜなら、トランスジェニック種子は、導入された遺伝子によって発現される酵素のレベルよりも高いレベルで、他の酵素活性を含まないからである。さらに、本発明のプロセスの過程は、微生物酵素を使用するプロセスの過程よりもはるかに予想可能である。なぜなら、微生物酵素の調製は、未同定の、および変化する追加の活性のレベルを示すからである。それが特に使用され得る地域の１つは、麦芽の輸入が禁止されているアフリカの国々である。その場合、酵素は、モロコシで発現され、次いでこれが醸造プロセスで添加され得る。アルコール飲料の醸造における適用に次いで、他の適用もまた予想され得、そこで、MaltSeedで麦芽化穀粒を置き換え得る。麦芽化大麦および／または麦芽化小麦は、小麦粉の糖化粉末を規格化するために、製粉業者によって使用される。ヘミセルラーゼ（例えば、キシラナーゼ）もまた、小麦粉から作られるパン生地の気体保持能力を改善するために、小麦粉に添加される。小麦粉中での酵素の添加または使用は、MaltSeedを使用することによって置き換えられ得、これは非常に適切である。なぜなら、酵素は、どのように使用されても、穀粒の形態で添加され得るからである。ベーキングプロセスにおいてもまた同一に、酵素は、多くのパン生地中に存在する麦芽の代わりとして添加され得る。ベーキングプロセスを改善する酵素は、キシラナーゼ、アミラーゼ、アラビノフラノシダーゼ、エキソペプチダーゼである。Aspergillus niger 由来のグルコースオキシダーゼもまた、製パンの目的のために種子中で発現され得る。実施例１エンド-β-1,4-キシラナーゼの活性測定エンドキシラナーゼを、滅菌タンクおよび培地中のAspergillus nigerの純粋な培養物から得る。培養培地は、無機塩としてのみ、適切な炭素および窒素源を含む。発酵を、30℃〜40℃の間の一定の温度で行い、そしてpHを３〜５の範囲内で維持する。酵素の活性を、１Ｍのグリシン緩衝液（pH2.75）中に懸濁されたカラス麦のスペルト小麦由来のキシラン（35g/l）の加水分解によって測定する。この溶液の粘性は、キャピラリー粘度計（Ubbelhode型）を使用することによって47℃で決定する。液体の上部のメニスカス（meniscus）が２つの参照点の間に落ちるのに必要とする時間dtを、時間Ｔ内で測定する。Ｔ対１／dtのプロットの傾きは、見かけの速度論的定数を生じる。１Lyx単位は、その速度論的定数が１分^-1の値に到達するために必要とされる酵素の量である。実施例２エキソペプチダーゼの活性測定 Aspergillus sojae（DS 8351）の生産株を培養する。エキソペプチダーゼ活性を、ロイシンアミノペプチダーゼ単位（Leu-A）として示す：１Leu-Aは、pH7.2 および20℃で、L-ロイシン-p-ニトロアニリンから１分当たり１μｍｏｌのp-ニトロアニリンの産生に必要とされる酵素の量である。試験を以下のように行う：ロイシンパラニトロアニリド（SIGMA）を9mMの濃度で水中に溶解する。１mlの溶液を、1.5mlの0.1Mのリン酸緩衝液（pH7.2）と混合する。t＝0で、0.5mlの酵素を導入し、そして反応のために20℃で放置する。15分後、１mlの１N HClを添加して反応を停止する。１N HClをt＝0で導入して、ブランクを実行する。光学密度を400nmで、ブランク(OD_ブランク）について、およびアッセイ（OD_アッセイ）について決定する。活性を、以下のように計算する：実施例３アラビノフラノシダーゼの活性測定イソ酵素Ａまたはイソ酵素Ｂまたはアラビノキシルアンヒドラーゼを、Asperg illus nigerまたはAspergillus nidulans株の培養物から得た。イソ酵素ＡおよびＢの活性を、p-ニトロフェニル-α-L-アラビノフラノシドの加水分解によって測定する。１ARF単位は、Gunata Z.ら（J．Agric．Food Chem．38，772，1989）に記載される試験条件下で、１分当たり１μｍｏｌのp-ニトロフェノールを遊離するために必要とされる酵素の量である。実施例４糖化アミラーゼの活性測定糖化アミラーゼは、滅菌のタンクおよび培地中でのPenicillium emersoniiの純粋な培養物から得る。これは、適切な炭素および窒素原を無機塩としてのみ含む。発酵の開始後に、タンクに、マルトデキストリンを10〜30時間（好ましくは、24時間）供給する。温度を、40〜50℃の範囲（好ましくは、45℃）に維持し、そしてpHを4.5〜5.5の範囲（好ましくは、5.0）に維持する。発酵を、開始から4 0〜55時間（好ましくは、48時間）で停止する。糖化アミラーゼ活性を、BETAMYL 試験（MEGAZYME，Irelandから市販されている）に従って測定する。１BTUは、pH 6.2および40℃で、Megazymeの市販の基質から１μｍｏｌのp-ニトロフェノールを生じるために必要とされる酵素の量である。実施例５微生物酵素を使用する麦汁の調製麦汁を、粗大麦穀粒である品種(variety)PLAISANTから調製した。大麦を、フィルタープレス型粒度分析機に到達させるために、EBC MIAG粉砕機で粉にした。得られた粉砕した大麦の57gを、以下を含有する300mlの温水（50℃）中に懸濁した： 650Lyx単位のエンド-β-(1,4)-キシラナーゼ 850ARF単位のアラビノフラノシダーゼ 18mgのB.A.T.S（熱安定性アミラーゼ）６mgの醸造用プロテアーゼ（エンドプロテアーゼ）１mgのフィルトラーゼL3000（+）（β-(1,3;1,4)-グルカナーゼ）。温度を50℃で30分間維持し、次いで63℃に上げる（速度１℃／分）；温度をさらに63℃で30分間維持し、次いで72℃に上げ（速度１℃／分）、そして30分間その温度で維持する。温度を最終的に76℃まで加熱し（速度１℃／分）、そして５分間その温度で維持する。水を、水分の蒸発を補うために添加する。次いで、マッシュを、Schleicher and Schullペーパーフィルターを備えた漏斗に注いだ。濾過した麦汁の濃度から、収量を、いくつかの醸造所で行われるように決定した；粘度および遊離のアミノ酸（FAA）レベルを、標準的なEBR手順に従って決定した。収量は71.5％であり、粘度は2.52mPa.sであり、そして66mg/lの遊離のアミノ酸を測定した。実施例６糖化アミラーゼの比較麦汁を、粗大麦穀粒である品種PLAISANTから調製した。大麦を、フィルタープレス型粒度分析機に到達させるために、EBC MIAG粉砕機で粉にした。得られた粉砕した大麦の57gを、以下を含有する300mlの温水（50℃）中に懸濁した： 650Lyx単位のエンド-β-(1,4)-キシラナーゼ 850ARF単位のアラビノフラノシダーゼ 18mgのB.A.T.S（熱安定性アミラーゼ）６mgの醸造用プロテアーゼ（エンドプロテアーゼ） 100Leu-A単位のエキソペプチダーゼ１mgのフィルトラーゼL3000（+）（β-(1,3;1,4)-グルカナーゼ）。表１に従って、糖化酵素を醸造混合物に添加した。表１．糖化酵素の用量温度を30分間50℃に維持し、次いで63℃にまで上昇させた（１℃／分）；この温度をさらに30分間63℃に維持し、次いで72℃にまで上昇させ（１℃／分）、そしてその温度に30分間維持した。最終的に76℃まで加熱し（１℃／分）、その温度に５分間維持した。水分蒸発を補填するために、水を添加した。次いで、マッシュを、Schleicher and Schull濾紙を入れた漏斗に注いだ。濾過された麦汁の密度から、任意の醸造で行ったように、収率を決定した；また、粘度および遊離アミノ酸（FAA）レベルを標準EBC手順に従って決定した。表２中に示された測定された収率、粘度およびFAAの結果は、Brewers Permex の代用としてのPenicillium emersoniiの糖化酵素の効果を示すが、両酵素の使用からは真の相乗作用は全く予期され得ない。特に驚くべきことは、FAA増大および粘度減少に対するPenicillium emersoniiのアミラーセの全くポジティブな効果である。表２．結果実施例７種子特異的発現カセットを含むバイナリーベクターの構築発現構築物を、種子特異的発現が得られるように、Oryza sativa L.グルテリン貯蔵タンパク質の配列（Zhengら、Plant Physiol（1995）109:77-786）を用いて構築する。これらの配列は、類似の種子特異的遺伝子由来の配列によって、本発明の目的と同じ目標を達成するために置換され得る。種子特異的発現の発現構築物の構築のために、Oryza sativa L.のグルテリン（Gt1）遺伝子由来のプロモーターおよびターミネーターの配列を、テンプレートとしてゲノムクローンGt1（Okitaら、J．Biol．Chem．264，12573-12581，198 9）と共にPCR技術を用いて合成する。この遺伝子は種子特異的発現を示し、そしてそのコード配列および隣接配列を決定した（EMBL．Genbank Nucleotide Seque nce Database accession number D00584）。２セットのオリゴヌクレオチドを合成する。一方は、XhoI/SphIフラグメントとしてGt1の5'隣接領域コーディングを含む2.4kbフラグメントの増幅を可能にする：他方は、BamHI/EcoRIフラグメント（725bp）として3'隣接配列の増幅を可能にする：オリゴを、それらの末端に適切な制限部位を含むように設計し、フラグメントの制限酵素での消化後に発現構築物の直接的な組立を可能にする。本発明による混合物中の酵素の遺伝子は、エンドキシラナーゼ（Mol．Microbiol．12，479-49 0，1994）、アラビノフラノシダーゼイソ酵素Ａおよびイソ酵素Ｂ（EP 0 506 19 0）、Bacillus licheniformis由来アミラーゼ（EP 0 449 376）、Bacillus amyl oliquefaciens由来プロテアーゼ（J．Bact．159，811-819）およびBacillus amy loliquefaciens由来グルカナーゼ（Gene 49，177-187，1986）についての文献から得られ得る。Penicillium由来糖化アミラーゼおよびAspergillus sojae由来エキソペプチダーゼの遺伝子は、説明に示された培養物から得られ得る純粋酵素から、当業者に容易に解明され得る。種子において発現されるべき酵素をコードする遺伝子のコドン使用は、単子葉種子における発現について至適化される。これを行うために、完全な遺伝子を台成で作製し、共にクローン化目的のために、Bs pHI部位をATG開始コドンに導入し、そしてBamHI部位をTAA停止コドンの下流に導入する。Gt1の5'隣接領域を含む2.4kbのPCR産物をXhoI/SphIで消化し、そしてXh oI/SphIで線状化したベクターpSL1l80にクローン化する。得られたベクターを、 SphI/BamHIで線状化し、そして合成酵素コード遺伝子、および必要に応じて標的化シグナルをコードするオリゴヌクレオチド二重鎖と三元連結でのベクターとして使用する。標的化は、液胞、アポプラスト、アミロプラストまたは（例えば、 KDEL保持シグナルと共に）小胞体に対して達成され得る。このベクターから、Gt1グルテリンプロモーター、選択(optional)シグナル配列、および合成遺伝子の融合物を含むフラグメントを単離する。このフラグメントを、（1990年１月29日に受託番号CBS 101.90でCentraal Bureau voor Schimme lculturesに寄託したE．coli K-12株DH5-αにおける）バイナリーベクターpMOG2 2中にBamHI/EcoRIで消化したGt1の3'ターミネーター配列を含む725bpのPCR産物と三元連結でクローン化する。実施例８種子特異的発現カセットにおけるエンドキシラナーゼ遣伝子を含むバイナリーベクターの構築 Aspergillus niger由来のエンドキシラナーゼ遺伝子を用いて、オオムギにおけるコドン使用について至適化する。得られたDNA配列を配列番号１に示す。エンドキシラナーゼ遺伝子の発現のために、細胞外標的化は、タバコPR-Sタンパク質のシグナルペプチドをコードするオリゴヌクレオチド二重鎖により行い、そして三元連結のために、BspHI/BamHIで消化した合成キシラナーゼ遺伝子を用いる。このベクターから、Gt1グルテリンプロモーター、PR-Sシグナル配列、および合成キシラナーゼ遺伝子の融合物を含む3.1kb XhoI/BamHIフラグメントを単離する。このフラグメントを、バイナリーベクターpMOG22中にBamHI/EcoRIで消化したGt1の3'ターミネーター配列を含む725bpのPCR産物と三元連結でクローン化する。得られたベクターをpMOG1265と称する。実施例９オオムギ形質転換 Agrobacterium tumefaciensを用いるHordeum vulgare cv．Golden Promiseの未熟胚の形質転換について用いた方法は、一般に、Tingay，S.ら、The Plant J.11 (6)，1369-1376，1997に記載の通りである。手短には、プロトコルは以下の通りである：出発材料のための供与植物を、10,000〜30,000ルクスおよび50〜95％RHの16時間明期で、10〜20℃で、フィトトロン中で生育させる。未熟種子を、受粉後10〜 15日で採取し、そして20〜40分間漂白液中で滅菌する。未熟胚を、若穎花から切り取り、胚軸を小刀の刃を用いて取り出す。外植片を、カルス誘導培地上に胚盤が上になるように配置し、そして16時間から７日までの範囲の期間暗所で24℃でインキュベートする。胚をAgrobacterium懸濁液（約0.1〜10×10⁹細菌／ml、ここでAgrobacteriumは、選択した酵素をコードするDNAを含む構築物を含む）中に、５〜20分間浸漬し、次いでカルス誘導培地に移す。その後、胚を暗所に24℃で２または３日間インキュベートする。共培養後、胚を、選択剤と直接合わせて、Agrobacteriumを殺傷するための抗生物質を含むカルス誘導培地に移し、トランスジェニック細胞の選択プロセスを開始させる。選択プロセスは、８週間までの間に起こる。抵抗性胚形成カルス系統を再生培地に移し、そして24℃で、16時間明期で、増大中の光強度（500〜3000ルクス）でインキュベートする。再生幼植物を、選択剤を添加するかまたは添加せずに、ホルモン非含有または高サイトカイニン含有カルス誘導培地に移す。根系の発達後、幼植物を鉢上げし、成熟するまで生育させて自家受粉させる。実施例１０３つの完全パイロット醸造試行を実施した。２つのテスト醸造物はかなり減少した量の麦芽（原料の20％）を用いて行い、そしてコントロールは通常量の麦芽を用いて行った（表３を参照のこと）。２つのテスト醸造物は、粉砕(milling) および濾過技術が異なった（表３を参照のこと）。すべての醸造についての醸造ダイアグラムを図１に示す。表３：原料組成、濾過および粉砕コントロール混合物から、８％麦芽をトウモロコシ細粒と共に穀物クッカーで使用し、残りの67％麦芽を変換容器に添加した。テスト醸造物から、８％麦芽除去オオムギをトウモロコシ細粒と共に穀物クッカーで使用し、他の47％麦芽除去オオムギを麦芽と共に変換容器に添加した。表４：酵素コードおよび100kg原料当たり添加される量酵素１、２、４、５および７は変換容器に添加したが、一方、酵素３は穀物クッカーに添加した（酵素コードおよび添加量については表４を参照のこと）。麦汁加工結果（マッシュ化および麦汁濾過(lautering)）は、テスト醸造物およびコントロールについて類似していた。２つのテスト醸造物は、醸造所で同様に行った。テスト醸造物は、同じ麦汁を大まかに与えた。このことは、濾過および粉砕における差異は本質的ではないことを示す。テストビールおよびコントロールビールの味覚比較から、３つの全てのビールは非常に類似したプロフィルを有すると結論された。テスト醸造物について、コントロールと比較して、より強い口当たりが認められた。このことは、麦汁の分析で見出された、より高いデキストランレベルに起因し得る。麦汁中のアミノ酸レベルは、許容できるものであったが、テスト醸造物ではコントロールと比較して低かった。アミノ酸レベルは、エキソペプチダーゼの添加によって増大され得る（実施例１１を参照のこと）。テスト醸造ビールは、良好なピルスナービールとして試飲パネラーによって分類された。このことは、麦芽を酵素混合物によって部分的に置換することが、醸造業において通常用いられる麦芽の量で製造されたビールに匹敵するビールを生じることを示す。実施例１１２つの完全パイロット醸造試行を実施した。テスト醸造物は減少した量の麦芽を用いて行い、そしてコントロールは通常量の麦芽を用いて行った（表５を参照のこと）。濾過はLautertunで行った。テスト醸造物１およびコントロールの醸造ダイアグラムについては、図２を参照のこと。表５：原料組成コントロール混合物から、８％麦芽をトウモロコシ細粒と共に穀物クッカーで使用し、他の67％麦芽を変換容器に添加した。テスト醸造物から、８％麦芽除去オオムギをトウモロコシ細粒と共に穀物クッカーで使用し、他の47％麦芽除去オオムギを麦芽と共に変換容器に添加した。テスト醸造物において、酵素１〜７を変換容器に添加し、一方、酵素３を同様に穀物クッカーの内容物に添加した（酵素コードおよび使用した酵素の量については表６を参照のこと）。麦汁加工結果（マッシュ化および麦汁濾過）は、テスト醸造物およびコントロールについて類似していた。麦汁における遊離アミノ酸窒素含量は、テスト醸造物およびコントロールについて類似していた。テスト醸造物は、試飲により、コントロールと非常に類似したプロフィルを有すると考えられるビールを生じた。テスト醸造ビールは、良好なピルスナービールとして試飲パネルによって分類された。このことは、麦芽を酵素混合物によって部分的に置換することが、醸造業において通常用いられる麦芽の量で製造されたビールに匹敵するビールを生じることを示す。表６：テスト醸造物における酵素コードおよび100kg原料当たり添加される量実施例１２７つの系統由来のトランスジェニックオオムギ粒（各々、表９に示す酵素の１つを発現する）を、得られたMaltSeedが、粗オオムギの10％として混合されたときに表９に示されるような酵素活性を提供するような量で混合する。MaltSeed調製物を非トランスジェニックオオムギと共に混合し、破砕する。これらは、テスト醸造物において、一緒になって原料の55％を占める。テスト醸造物についての穀物クッカーおよび変換容器中の原料組成を表８に示す。コントロールについては、８％の麦芽をトウモロコシ細粒と共に穀物クッカー中に用いた。原料の残りを変換容器中で用いた。MaltSeedの分配は、変換容器および穀物クッカー中で表１０に示されるような酵素活性を与える。２つの醸造試行を行った。テスト醸造物は減少した量の麦芽を用いて行い、そしてコントロールは通常量の麦芽を用いて行った（表７を参照のこと）。テスト醸造物については、より高い糖化温度を使用した（表７を参照のこと）。濾過は、Lautertunで行った。コントロールおよびテスト醸造物の醸造ダイアグラムについては、図２を参照のこと。表７：原料組成表８：テスト醸造物における100kg総量当たりの原料組成麦汁加工結果（マッシュ化および麦汁濾過）は、テスト醸造物およびコントロールについて類似していた。テスト醸造物は、試飲により、コントロールと類似のプロフィルを有すると考えられるビールを生じた。テスト醸造物は、試飲によって従来の麦芽ビールとして分類された。このことは、麦芽は、これらを発現するトランスジェニック種子によって提供された酵素によって（部分的に）置換され得ることを示す。表９：テスト醸造物１においてMaltSeedの添加により添加される酵素活性量（10 0kg原料当たり単位）

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ｃ１２Ｎ 9/32 Ｃ１２Ｎ 9/50 9/50 15/00 ＺＮＡＡ 15/09 ＺＮＡ 5/00 Ｃ (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＵ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＣＡ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＥＥ，ＧＥ，ＧＨ，ＨＵ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＰ，ＫＲ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＴ，ＬＶ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＲＯ，ＳＤ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ (72)発明者ベデケル，ロベルト，フランシスクスオランダ国エヌエル―2635 カーセーデンホールン，ボームクヴェケライ 31

Claims

【特許請求の範囲】１．アルコール飲料の製造のためのプロセスであって、該アルコール飲料に酵素の混合物が添加され、該混合物は、少なくともエンド−β(1,4)-キシラナーゼ、アラビノフラノシダーゼ、α-アミラーゼ、エンドプロテアーゼ、およびβ-(1,3 :1,4)-グルカナーゼを含む、プロセス。２．前記混合物が、糖化アミラーゼもまた含む、請求項１に記載のプロセス。３．前記混合物が、エキソペプチダーゼもまた含む、請求項１または２に記載のプロセス。４．前記アルコール飲料がビールであることによって特徴づけられる、請求項１〜３のいずれかに記載のプロセス。５．前記酵素の各々が、個々のトランスジェニック植物系統の種子によって提供されることによって特徴づけられる、請求項１〜４のいずれかに記載のプロセス。６．１つより多くの酵素が、個々のトランスジェニック植物系統の種子によって提供されることによって特徴づけられる、請求項１〜４のいずれかに記載のプロセス。７．少なくとも１つの酵素が、個々の植物系統の種子によって提供されることによって特徴づけられる、請求項１〜６のいずれかに記載のプロセス。８．前記トランスジェニック植物系統が、オオムギ植物系統である、請求項５〜７のいずれかに記載のプロセス。