CZ123699A3 - Rekombinantní oslabený mikrobiální patogen obsahující alespoň jednu molekulu nukleové kyseliny kódující antigen pocházející z mikroorganizmu Helicobacter - Google Patents

Rekombinantní oslabený mikrobiální patogen obsahující alespoň jednu molekulu nukleové kyseliny kódující antigen pocházející z mikroorganizmu Helicobacter Download PDF

Info

Publication number
CZ123699A3
CZ123699A3 CZ19991236A CZ123699A CZ123699A3 CZ 123699 A3 CZ123699 A3 CZ 123699A3 CZ 19991236 A CZ19991236 A CZ 19991236A CZ 123699 A CZ123699 A CZ 123699A CZ 123699 A3 CZ123699 A3 CZ 123699A3
Authority
CZ
Czechia
Prior art keywords
pathogen
asn
helicobacter
gly
nucleic acid
Prior art date
Application number
CZ19991236A
Other languages
English (en)
Inventor
Thomas F. Meyer
Rainer Haas
Yan Zhengxin
Oscar Gomez-Duarte
Bernadette Lucas
Original Assignee
Max-Planck-Gesellschaft zur Förderung der Wissenschaften e. V.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Max-Planck-Gesellschaft zur Förderung der Wissenschaften e. V. filed Critical Max-Planck-Gesellschaft zur Förderung der Wissenschaften e. V.
Priority to CZ19991236A priority Critical patent/CZ123699A3/cs
Publication of CZ123699A3 publication Critical patent/CZ123699A3/cs

Links

Classifications

    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Landscapes

  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)

Abstract

Rekombinantní oslabený mikrobiální patogen obsahující alespoňjednu molekulu nukleové kyseliny kódující antigen pocházející z mikroorganizmu Helicobacter, kde tento patogen je schopen exprimoval zmíněnou molekulu nukleové kyseliny neboje schopen vyvolat expresi zmíněné molekuly nukleové kyseliny v cílové buňce. Oslabený rekombinantní patogen není sámo sobě patogenní. Je schopen indukovat účinnou imunilogickou ochranu proti skutečnýmpatogenům.

Description

Oblast techniky
Do rozsahu vynálezu spadají nové rekombinantní živé vakcíny, které propůjčují ochrannou imunitu proti infekci vyvolané mikroorganizmem Helicobacter pylori. Vynález rovněž popisuje způsoby screeningu antigenů H. pylori pro optimalizaci vakcín.
Dosavadní stav techniky
Helicobacter je Gram-negativní bakteriální patogen spojovaný s výskytem gastritidy, žaludečních vředů a karcinomu žaludku. Žaludek je kolonizován několika zástupci rodu Helicobacter, a to především druhy H. pylori, H. heilmanii a H. felis. Ačkoliv je H. pylori mikroorganizmem nej častěji spojovaným s infekcemi člověka, bylo zjištěno, že H. heilmanii a H. felis člověka rovněž infikují. V zemích Třetího světa, ale i v průmyslově vyspělých zemích, je pozorována vysoká prevalence infekcí vyvolaných H. pylori. Je známo, že ze všech virulentních faktorů popsaných u H. pylori je ke kolonizaci gnobiotických vepřů a nahých myší (nudě mouše) naprosto nepostradatelná ureáza. Ureáza je enzymem složeným ze dvou strukturních podjednotek (UreA a UreB). Dřívější studie naznačovaly, že orální imunizace za použití rekombinantní UreB spolu s toxinem cholery byly u myší schopny zabránit kolonizaci žaludku mikroorganizmy H. felis a H. pylori (Michetti a další, Gastroenterology, 107:1002 až 1011, 1994) . Orální aplikací rekombinantních antigenů UreB však bylo v několika případech dosaženo pouze částečné ochrany. Dalšími antigeny H. pylori, které poskytují částeč1
nou ochranu proti kolonizaci žaludku, jsou 87 kDa vakuolární cytotoxin VacA (Cover a Blaser, J. Biol. Chem., 267:10570, 1992; Marchetti a další, Science, 267:1655, 1995) a 13 kDa a 58 kDa heat shock proteiny HspA a HspB (Ferrero a další,
Proč. Nati. Acad. Sci. USA, 92:6499, 1995).
Je známo, že oslabení patogenové, například baktérie jako například Salmonella, slouží jako účinné živé vakcíny. První náznaky účinnosti oslabených baktérií Salmonella jako dobrých vakcín v humánní medicíně se objevují ve studiích využívajících chemicky mutovaný kmen Salmonella typhi Ty21a (Germanier a Furer, J. Infect. Dis., 141:553 až 558, 1975). Tyto vakcíny byly úspěšně testovány na dospělých dobrovolnících (Gilman a další, J. Infect. Dis., 136:717 až 723, 1977) a později na dětech v rozsáhlém terénním pokusu v Egyptě (Whadan a další, J. Infect. Dis., 145:292 až 295, 1982). Orálně podávaná vakcína Ty21a byla účinná při ochraně 96% egyptských dětí vakcinovaných během tříletého pozorování. Od té doby byly vyvinuty nové vakcíny založené na oslabených živých baktériích Salmonella (Hone a další, Vaccine, 9:810 až 816, 1991), u nichž je důsledkem dobře definovaných mutací v chromozomu vznik nevirulentních kmenů schopných po orální aplikaci indukovat silnou imunitní odpověď (Tacket a další, Vaccine, 10:443 až 446, 1992; a Tacket a další, Infect. Immun., 60:536 až 541, 1992). Mezi další výhody vakcín založených na oslabených živých baktériích Salmonella patří, ve srovnání s dříve masově používanými tyfovými vakcínami (Levine a další, Typhoid Fever Vaccines, v publikaci Vaccines, editoři Plotkin S. A. a Mortimer E. A., jun., Philadelphia: WB Saunders, strany 333 až 361, 1988), jejich bezpečnost, snadná aplikace, dlouhodobá ochrana a neexistence nežádoucích reakcí.
i · · · · ·
Podstata vynálezu
Vzhledem k možnosti používání myší jako živočišného modelu, u kterého se předpokládá, že mimikuje infekci lidí patogenem S. typhi, byly k aplikaci antigenů ve velké míře používány mutantní kmeny S. typhimurium. Nej častěji používaným způsobem oslabení S. typhimurium je cílená mutageneze genů ovlivňujících syntézu aromatických aminokyselin. Tyto kmeny, označované jako mutanty aro, vykazují zanedbatelnou patogenicitu, což bylo za použití těchto konstruktů prokázáno na živočišných modelech a při klinickém testování na lidech (Hoiseth a Stocker, Nátuře, 291:238 až 239, 1981; Tacket a další, viz. výše). Silná imunogenicita vakcín založených na živých bakteriích Salmonella byla s výhodou využita k aplikaci heterologních antigenů. Exprese specifických antigenů v oslabených bakteriích Salmonella vyvolala u myší imunitu vůči několika bakteriálním patogenům. Použití rekombinantních živých vakcín, které jsou schopny exprimovat antigeny pocházející z Helicobacter a chránit tak vakcinovaného živočicha, nebyla dosud popsána. Použití oslabených živých vakcín za účelem léčby infekce vyvolané mikroorganizmy Helicobacter rovněž nebyla zveřejněna. Důvodem je skutečnost, že v průběhu infekce mikroorganizmem Helicobacter je indukována silná imunitní odpověď, která nicméně nevede k vytvoření ochranné imunity. Je tudíž velmi překvapivé, že ochranné imunitní reakce je dosaženo použitím oslabených rekombinantních bakteriálních buněk sloužících jako nosiče antigenů a schopných exprimovat molekulu DNA kódující nějaký antigen pocházející z Helicobacter. Oslabené rekombinantní bakteriální buňky exprimující nějaký antigen pocházející z Helicobacter jsou zřejmě schopny vyvolat vůči tomuto heterolognímu antigenů mikroorganizmu Helicobacter kvalitativně odlišnou imunitní reakci ve srovnání s imunitní reakcí vůči homolognímu antigenů Helicobacter,. Neochranná imunitní • ·
odpověď je tudíž překvapivě transformována na imunitní reakci chránící organizmus proti infekci mikroorganizmy Helicobacter. Toto neočekávané zjištění umožňuje využití oslabených rekombinantních patogenů, například bakteriálních buněk, zejména pak zástupců rodu Salmonella, jako nosičů pro screening (testování) antigenů vyvolávajících ochrannou imunitní reakci, dále pak použití antigenů vyvolávajících ochrannou imunitní reakci (identifikovaných způsobem popsaným výše) v jakékoliv vakcíně proti infekcím způsobeným zástupci rodu Helicobacter a použití oslabených rekombinantních baktérií jako nosičů antigenů vyvolávajících ochrannou imunitní reakci k imunizaci proti infekcím způsobeným mikroorganizmy Helicobacter u lidí a jiných savců.
Do rozsahu vynálezu tudíž spadá oslabený rekombinantní patogen, který obsahuje alespoň jednu heterologní molekulu nukleové kyseliny kódující nějaký antigen pocházející z Helicobacter, kde zmíněný patogen je schopen exprimovat uvedenou molekulu nukleové kyseliny nebo je schopen vyvolat expresi této nukleové kyseliny v cílové buňce. Ve výhodném provedení je zmíněnou molekulou nukleové kyseliny molekula DNA.
Oslabeným patogenem je kmen mikroorganizmu, který je schopen způsobit infekci a ve výhodném provedení indukovat účinnou imunologickou ochranu proti skutečnému patogenů, nicméně tento oslabený patogen není sám o sobě patogenní. Oslabeným patogenem může být nějaká baktérie, virus, houba nebo parazit. Ve výhodném provedení se jedná o nějakou baktérii, například Salmonella jako například S. typhimurium nebo S. typhi, Vibrio cholerae (Mekalanos a další, Nátuře, 306:551 až 557, 1983), Shingella jako například S. flexneri (Sizemore a další, Science, 270:299 až 302, 1995; Mounier a další, EMBO J., 11:1991 až 1999, 1992), Listeria jako například L. monocytogenes (Milon a Cossart, Trends in Microbio4 logy, 3:451 až 453, 1995), Escherichia coli, Streptococcus jako například S. gordonii (Medaglini a další, Proč. Nati. Acad. Sci. USA, 92:6868 až 6872, 1995) nebo Mycobacterium jako například bacil Calmette-Guerinové (Flynn, Cell. Mol. Biol., 40, Suppl. 1, 31 až 34, 1994). Ve výhodném provedení je zmíněným patogenem oslabená enterobaktérie jako například Vibrio cholerae, Shingella flexneri, Escherichia coli nebo Salmonella. Nejvýhodněji použitým oslabeným patogenem je nějaký zástupce rodu Salmonella, například mutant aro Salmonelly. Oslabeným patogenem může být nicméně i nějaký virus, například oslabený virus vaccinia, adenovirus nebo poxvirus.
Molekula nukleové kyseliny vnesená do daného patogena kóduje antigen pocházející z Helicobacter, ve výhodném provedení nějaký antigen H. felis, H. heilmanii nebo H. pylori, výhodněji pak antigen H. pylori. Tento antigen pocházející z Helicobacter může být nativní polypeptid odvozený z Helicobacter, imunologicky reaktivní fragment takového polypeptidu nebo imunologicky reaktivní varianta nativního polypeptidu nebo jeho fragmentu. Antigenem pocházejícím z Helicobacter může být rovněž ochranný sacharid nebo peptidový mimotop napodobující trojrozměrnou strukturu nativního antigenu odvozeného z Helicobacter. Peptidové mimotopy mohou být získány z peptidových knihoven exprimovaných na povrchu bakteriálních buněk (PCT/EP96/01130). Transformované buňky mohou samozřejmě rovněž obsahovat několik molekul DNA kódujících rozdílné antigeny odvozené z Helicobacter.
Molekuly nukleových kyselin kódující antigeny pocházející z Helicobacter mohou být umístěny na mimochromozomálním vektoru, například nějakém plazmidu, nebo mohou být integrovány do buněčného chromozomu daného patogena. Je-li daný patogen použit jako vakcína, je obvykle upřednostňována chromozomální lokalizace.
• ·
Oslabené baktérie mohou být použity k transkripci a translaci zmíněné molekuly nukleové kyseliny přímo v této bakteriální buňce nebo mohou být využity k přenesení zmíněné molekuly nukleové kyseliny do infikované cílové buňky, a daná molekula DNA je tudíž transkribována a/nebo translatována v cílové eukaryotické buňce. Tento postup nepřímé bakteriální vakcinace, v této přihlášce označovaný jako genetická vakcinace, byl úspěšně aplikován s využitím mikroorganizmu Shingella jako vektoru (Sizemore D. R., Branstrom A.
A. a Sadoff J. C., Attenuated Shingella as a DNA delivery vehicle for DNA-mediated immunization. Science, 270:299 až 302, 1995).
Ve výhodném provedení vynálezu je antigenem pocházejícím z Helicobacter ureáza, podjednotka ureázy nebo jejich imunologicky reaktivní varianta nebo fragment nebo peptidový mimotop. V jiném výhodném provedení vynálezu je antigenem pocházejícím z Helicobacter nějaký polypeptid sekretovaný z Helicobacter, jeho imunologicky reaktivní varianta nebo fragment nebo peptidový mimotop. Způsob identifikace genů Helicobacter kódujících tyto sekretované polypeptidy a zvláště pak adheziny byl popsán v mezinárodní patentové přihlášce PCT/EP/02544, která je zde uvedena záměnou za přenesení jejího celého obsahu do popisu tohoto vynálezu. Tento způsob zahrnuje:
(a) vytvoření genové banky DNA z H. pylori v hostitelském organizmu nesoucím inducibilní transpozon spojený nějakým markérem sekreční aktivity, (b) inzerci zmíněného transpozonu do DNA z H. pylori a (c) využití daného markéru k selekci klonů obsahujících gen kódující sekretovaný protein, dále pak s možností (d) provedení opětovné transformace H. pylori s využitím DNA z klonů obsahujících geny vykazující sekreční aktivitu, kde výsledkem této opětovné transfekce je vytvo6
ření izogenních mutantních klonů H. pylori tím, že dojde k integraci příslušné DNA do chromozomu a (e) selekce detekující mutantní kmeny H. pylori deficientní v adhezi.
Vhodnými příklady antigenů, které mohou být získány postupem popsaným výše, jsou antigeny vybrané ze skupiny zahrnující antigeny AlpA, AlpB, jejich imunologicky reaktivní varianty, fragmenty nebo peptidové mimotopy. Nukleotidová a aminokyselinová sekvence antigenů AlpA a AlpB byla popsána v mezinárodních patentových přihláškách PCT/EP96/02545 a PCT/EP96/04124, které jsou zde uvedeny záměnou za přenesení jejich celého popisu do rozsahu tohoto vynálezu. Nukleotidová a aminokyselinová sekvence AlpB jsou navíc zobrazeny jako SEK. ID. Č.: 1 a 2, a nukleotidová a aminokyselinová sekvence AlpA pak jako SEK. ID. Č.: 3 a 4.
Je nicméně rovněž představitelné, že je použit intracelulární antigen, který může být prezentován na povrchu buňky například autokatalytickým štěpením, kde tento antigen přispívá k imunologické ochraně.
Prezentace (vystavení na povrchu buňky) antigenů pocházejících z Helicobacter v rekombinantních patogenech podle vynálezu může být dosaženo různými způsoby. Příslušný antigen nebo antigeny mohou být v rekombinantních patogenech syntetizovány konstitutivně, inducibilně nebo může být jejich syntéza závislá na fázi životního cyklu patogena. Při konstitutivní nebo inducibilní expresi antigenů pocházejících z Helicobacter mohou být použití známé expresívní systémy popsané například v publikaci Sambrook a další, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989.
Ve výhodném provedení jsou antigeny exprimovány s využitím expresívního systému ovlivněného fází životního
cyklu patogena. Takové expresívní systémy sloužící k produkci a prezentaci cizích antigenů v hybridních živých vakcínách jsou popsány v přihlášce EP-B-0565548, která je zde uvedena záměnou za přenesení jejího celého obsahu do popisu tohoto vynálezu. V těchto expresívních systémech ovlivněných fází životního cyklu patogena se molekula nukleové kyseliny kódující antigen pocházející z Helicobacter nalézá pod kontrolou signální sekvence, která je v patogenu v podstatě neaktivní, a která může být aktivována spontánním přemístěním nějaké nukleové kyseliny, například reorganizací DNA v patogenu, například procesem inverze určité DNA, procesem delece určité DNA, procesem replikace určité DNA nebo mechanizmem specific slipped strand mispairng (specifické nesprávné párování opakujících se sekvencí při replikaci DNA) .
Rekombinantní buňky obsahující expresívní systém ovlivněný fází životního cyklu patogena jsou schopny -vytvářet dvě subpopulace, A a Β. K rozdělení do těchto dvou subpopulací dochází spontánní reorganizací v rekombinantní nukleové kyselině, přičemž subpopulace A je sama o sobě infekční a vyvolává imunologickou reakci, zatímco subpopulace B, která je regenerovaná ze subpopulace A, produkuje alespoň jeden heterologní antigen odvozený z Helicobacter a v kontextu s tímto heterologním antigenem vyvolává příslušnou imunologickou reakci.
Aktivace promotorové sekvence řídící expresi antigenů odvozeného z Helicobacter může být dosaženo přímo reorganizací příslušné nukleové kyseliny nebo nepřímo aktivací genu kódujícího protein, který řídí expresi genu kódujícího antigen odvozený z Helicobacter. Tato nepřímá aktivace je reprezentována systémem, který umožňuje produkci antigenů pocházejícího z Helicobacter prostřednictvím kaskádové reakce, která může být uskutečněna například tak, že gen přímo říze8
ný reorganizací DNA kóduje RNA polymerázu, která specificky rozpoznává promotor řídící expresi genu odvozeného z Helicobacter, nebo gen přímo řízený reorganizací DNA kóduje nějaký regulátor, který nějakým odlišným, nicméně specifickým mechanizmem indukuje expresi daného genu odvozeného z Helicobacter. Ve výhodném provedení vynálezu je promotorovou sekvencí řídící expresi antigenu odvozeného z Helicobacter promotor odvozený z bakteriofága, například promotor T3, T7 nebo SP6, a aktivace promotorové sekvence je dosaženo reorganizací nukleové kyseliny, jejímž důsledkem je produkce příslušné bakteriofágové RNA polymerázy v patogenu.
Expresívní systémy ovlivněné fází životního cyklu patogena mohou být upraveny tak, aby umožňovaly produkci antigenu pocházejícího z Helicobacter v předem stanoveném množství. Této skutečnosti může být například dosaženo modifikací nukleové sekvence promotoru řídícího expresi, který je aktivován mechanizmem reorganizace příslušné nukleové kyseliny, a/nebo vložením dalších regulačních prvků.
Antigeny pocházející z Helicobacter mohou být v patogenu podle vynálezu produkovány intracelulárně, jakož i extracelulárně. Jako extracelulární sekreční systém mohou být například použity autotransportérové systémy jako například systém IgA-proteáza (například EP-A-0254090) nebo systém využívající adhezin AIDA-1 v E. coli (Benz a další, Mol. Microbiol., 6:strana 1539, 1992). Jinými vhodnými systémy pro transport přes vnější membránu jsou transportéry využívající toxin RTX, například transportní systém využívající hemolysin v E. coli (Hess a další, Proč. Nati. Acad. Sci. USA, 93:11458 až 11463, 1996).
Patogen podle vynálezu může, mimo molekuly nukleové kyseliny kódující antigen pocházející z Helicobacter, nést i nějakou jinou heterologní nukleovou kyselinu, například molekulu DNA kódující imunomodulační polypeptid kvantitativ9 • · · · · · ·· ·· • ·· · · · · · · » · · • 4 · · · έ · · ně nebo kvalitativně ovlivňující imunitní reakci. Příkladem takových imunomodulačních polypeptidů jsou imunostimulační peptidy, cytokiny jako například IL-2, IL-6 nebo IL-12, chemokiny, toxiny jako například cholerový toxin B nebo adheziny.
Do rozsahu vynálezu rovněž spadají farmaceutické přípravky zahrnující jako aktivní složku nějaký oslabený rekombinantní patogen popsaný výše, spolu s (nepovinně) farmaceuticky přijatelnými rozpouštědly, nosiči a adjuvans. Ve výhodném provedení je zmíněným přípravkem živá vakcína. Způsob vakcinace je závislý na volbě vektoru použitého pro vakcinaci. Vakcinace může být provedena ve formě jedné dávky nebo opakovanou aplikací. Vhodné dávkování závisí na různých parametrech jako například charakteru vektoru použitého k vakcinaci nebo na způsobu aplikace. Jedna vakcinační dávka obvykle obsahuje přibližně 106 až 1012 buněk (CFU - colony forming unit), ve výhodném provedení přibližně 10® až 101θ buněk (CFU). Může být zvolena aplikace na povrch sliznice (například aplikace oční, intranazální, orální, rektální, vaginální, na sliznici žaludku, střev nebo močových cest) nebo parenterální podání (například subkutánní, intradermální, intramuskulární, intravenózní nebo intraperitoneální). Způsob přípravy živých vakcín zahrnuje formulaci oslabeného patogena ve farmaceuticky účinném množství spolu s farmaceuticky přijatelnými rozpouštědly, nosiči a/nebo adjuvans.
Farmaceutický přípravek podle vynálezu může být formulován v jakékoliv formě, například jako suspenze ve vhodném kapalném nosiči jako například vodě nebo mléce, jako tobolka nebo tableta a podobně. Ve výhodném provedení vynálezu je přípravkem lyofilizovaný produkt, který je před použitím rozsuspendován v kapalném nosiči.
• · ·
Do rozsahu vynálezu dále spadá způsob přípravy oslabeného rekombinantního patogena popsaného výše, kde tento způsob zahrnuje kroky: a) vložení molekuly nukleové kyseliny kódující antigen pocházející z Helicobacter do oslabeného patogena, čímž dojde k vytvoření rekombinantního patogena, například transformované bakteriální buňky, který je schopen exprimovat výše zmíněnou molekulu nukleové kyseliny nebo je schopen vyvolat expresi výše zmíněné molekuly nukleové kyseliny v cílové buňce; a b) kultivaci výše zmíněného oslabeného rekombinantního patogena za vhodných podmínek. Je-li patogenem nějaká bakteriální buňka, může být molekula nukleové kyseliny kódující antigen pocházející z Helicobacter umístěna na mimochromozomálním plazmidu. Je nicméně rovněž možné vložit příslušnou molekulu nukleové kyseliny do chromozomu patogena.
Do rozsahu vynálezu dále spadá způsob identifikace antigenů pocházejících z Helicobacter, které v savčím hostiteli vyvolávají ochrannou imunitní reakci. Tento způsob identifikace zahrnuje následující kroky: a) expresi genetického materiálu pocházejícího z Helicobacter v oslabeném patogenu; a b) testování schopnosti vyvolat v savčím hostiteli ochrannou imunitu proti infekci Helicobacter u takto vytvořených klonů. Ve výhodném provedení je tento proces identifikace prováděn v expresívním systému ovlivněném fází životního cyklu patogena, který umožňuje stabilní expresi všech antigenů pocházejících z Helicobacter. Rekombinantní klony mohou být následně aplikovány společně ve směsi za účelem orální imunizace pokusných živočichů, jako například myší. Potenciál těchto klonů účinkovat jako ochranné antigeny je následně stanovován infikací mikroorganizmem Helicobacter, například kmenem H. pylori adaptovaným k infekci myší. Existuje tudíž možnost přímé selekce optimalizovaných vakcín vůči H. pylori .
Popis obrázků na výkresech
Vynález je dále ilustrován následujícími obrázky a seznamem sekvencí.
Obrázek 1 je schématickým znázorněním vektoru pYZ97 pro expresi ureázy. V tomto vektoru jsou geny kódující podjednotky UreA a UreB ureázy umístěny pod transkripční kontrolou promotoru T7 φΐΟ. Mezi promotorem T7 a geny kódujícími ureázu se nachází místo odpovědné za vazbu na ribozom (RBS ribosome binding sítě). Plazmid dále obsahuje počátek replikace (ori), gen kódující β-laktamázu (bia; selekční markér) v čtyři terminátory T7 v řadě za sebou.
Mimo exprese řízené promotorem T7 může být rovněž, prostřednictvím kryptického promotoru umístěného na plazmidu pYZ97 proti směru transkripce od promotoru T7, vyvolána (s nízkou intenzitou) konstitutivní exprese podjednotek UreA a UreB.
Na obrázku 2 je znázorněna nukleotidová sekvence oblasti regulace transkripce exprese ureázy a začátek aminokyselinové sekvence podjednotky A ureázy na plazmidu pYZ97.
Obrázek 3 je schématickým znázorněním expresívních kazet pYZ88, pYZ84 a pYZ114 RNA polymerázy T7 (T7RNAP), které mohou být integrovány do chromozomů baktérií.
V kazetě pYZ88 s vysokou hladinou exprese je promotor lambda PL umístěn v opačné orientaci proti směru transkripce od genu T7RNAP. Gen kódující teplotně senzitivní represor cl 857 (cl) je řízen právě tímto promotorem. Terminátor z bakteriofága fd (fdT) je situován proti směru transkripce od genu cl. Gen gin (Mertens, EMBO J., 3:2415 až 2421, 1984) kóduje enzym řídící mechanizmus reorganizace DNA. Sekvence DNA kódující tRNA Arg je umístěna po směru transkripce od genu gin.
Ve fázi A je promotor PL odpovědný za expresi genu T7RNAP řízen ve směru genu cI857 a genu gin. Důsledkem toho
je skutečnost, že při permisivní teplotě 28°C je produkován aktivní represor a je snížena intenzita transkripce genů řízených promotorem PL. Při vyšší teplotě je intenzita transkripce genů řízených promotorem PL zvýšena, protože při takovém vnějším vlivu je represor alespoň částečně inaktivován. Zmíněné teplotně závislé zvýšení intenzity rovněž vede k odpovídajícímu zvýšení exprese genu gin, který jako řídící enzym katalýzuje inverzi promotoru PL a přechod do fáze B, ve které je exprimován gen T7RNAP.
V systému pYZ88 s vysokou hladinou exprese je terminátor transkripce fdT umístěn mezi genem pro rezistenci vůči kanamycinu (km) a promotorem zmíněného genu. V tomto uspořádání je potlačena syntéza antisense RNA orientované obráceně vzhledem ke genu T7RNAP, která za normálních okolností připívá ke snížení intenzity exprese T7RNAP. Důsledkem je vysoká exprese T7RNAP.
V systému pYZ84 se střední hladinou exprese je terminátor transkripce fdT umístěn mezi promotorem PL a počátkem genu T7RNAP. V tomto uspořádání je potlačena exprese mRNA pro T7RNAP. Navíc je translace mRNA pro T7RNAP ovlivněna antisense RNA. Důsledkem je dosažení pouze mírné exprese.
V systému pYZ114 s nízkou hladinou exprese je do promotoru PL navíc zavedena delece o délce 100 párů baží (APL).
V tomto uspořádání je aktivita promotoru PL podstatně snížena, což vede k nižší expresi T7RNAP a tudíž k potlačení exprese genu UreA/B. U tohoto konstruktu je již pozorován vliv kryptického promotoru pYZ97.
Na obrázku 4 jsou znázorněny výsledky testu ELISA detekujícího protilátky proti H. pylori přítomné v intestinální tekutině imunizovaných myší. Prázdný sloupec - neimunizovaná a neinfikovaná kontrolní skupina; šrafovaný sloupec(1) kontrolní skupina PBS; šrafovaný sloupec (2) - kontrolní skupina Salmonella; šrafovaný sloupec (3) - SL3261(pYZ97).
Na obrázku 5 jsou znázorněny výsledky testu ELISA detekujícího protilátky proti H. pylori přítomné v séru imunizovaných myší. Prázdný sloupec - neimunizovaná a neinfikovaná kontrolní skupina; šrafováný sloupec(1) - kontrolní skupina PBS; šrafováný sloupec (2) - kontrolní skupina Salmonella. Panel A: jako testovací antigen byl použit H. pylori, kmen PÍ (ureáza+) . Panel B: jako testovací antigen byl použit H. pylori, kmen Pil (ureáza') .
Obrázek 6 znázorňuje ureázovou aktivitu v žaludeční tkáni imunizovaných myší po infikaci prostřednictvím H. pylori.
SEK. ID. Č: 1 a 2 znázorňují nukleotidovou sekvenci genu AlpB pro adhezin z H. pylori (SEK. ID. Č: 1) a odpovídající aminokyselinovou sekvenci (SEK. ID. Č: 2) kódovanou tímto genem.
SEK. ID. Č: 3 a 4 znázorňují nukleotidovou sekvenci genu AlpA pro adhezin z H. pylori (SEK. ID. Č: 3) a odpovídající aminokyselinovou sekvenci (SEK. ID. Č: 4) kódovanou tímto genem.
SEK. ID. Č: 5 a 6 znázorňují nukleotidovou sekvenci oblasti regulující transkripci genu pro ureázu a počátek aminokyselinové sekvence podjednotky A ureázy v plazmidu pYZ97.
Příklady provedení vynálezu
Příklad 1
Klonování genů ureA a ureB
Strukturní geny ureA a ureB kódující ureázu byly klonovány z chromozomální DNA klinického izolátu PÍ (dříve 69A) izolovaného na University of Amsterdam a poskytnutého Dr. Jos van Puttenem. Tyto geny byly izolovány metodou PCR s využitím dvojice primerů YZ019 (5'GGAATTCCATATGAAACTGACTCCCAAAGAG-3) a RH132 (5'CTGCAGTCGACTAGAAAATGCTAAAGAG). Sekvence zmíněných primerů byla odvozena ze sekvencí v databázi GenBank (přístupová čísla M60398, X57132). Nukleotidová sekvence primerů YZ019 zahrnuje nukleotidy 2659 až 2679 z publikované sekvence a dále obsahuje regulační sekvenci translace (down stream box; Sprengart M. L. a další, Nuc. Acid. Res., 18:1719 až 1723, 1990) a restrikční místo Ndel. Nukleotidová sekvence primerů RH132 zahrnuje nukleotidy 5071 až 5088 z publikované sekvence a dále pak restrikční místo Sáli. Produkt amplifikační reakce měl velikost 2,4 kbp (2400 párů baží), což zahrnuje celou kódující oblast genů ureA a ureB z chromozomu Helicobacter, vyjma počátku transkripce a terminačních sekvencí. Přečištěný fragment vzniklý PCR reakcí byl štěpen restrikčními enzymy Ndel a Sáli a vložen do odpovídajících klonovacích míst plazmidu pYZ57 (s promotorem T7), čímž byl vytvořen plazmid pYZ97.
pYZ57 byl původně odvozen z plazmidu pT7-7, který je popsán Táborem (Current Protocols in Molecular Biology, 16.2.1 až 16.2.11, Greene Publishing and Wiley-Interscience, New York, 1990). Do kostry plazmidu pT7-7 byly následující strategií zavedeny v různých místech dva terminátory transkripce: (1) Tandemové terminátory T7. Restrikčními enzymy EcoRI/HindlII byl z plazmidu pEP12 (Brunschwig a Darzins, Gene, 111:35 až 41, 1992) vyštěpen fragment o velikosti 2,2 kbp a tento přečištěný fragment byl zaligován do vektoru pBA (Mauer J. a další, J. Bacteriol., 179:794 až 804, 1997). Produkt ligační reakce byl rozštěpen enzymy HindlII a Clal. Vzniklý fragment HindlII/Clal o velikosti 2,2 kbp byl následně vložen do předem štěpeného plazmidu pT7-7. (2)
Z plazmidu pDS3EcoRV (poskytnul Dr. H Bujard; ZMBH, Heildelberg) byl pomocí Hpal/Ndel vyštěpen fragment o velikosti 220 bp. Následně byly pomocí polymerázy Klenow oba konce tohoto fragmentu zatupeny. Purifikovaný fragment rrnBTl byl vložen do výše zmíněného plazmidu odvozeného z pT7-7, který byl nejprve štěpen pomocí BglII a vzniklé konce byly následně zatupeny polymerázou Klenow. Na obrázku 1 je znázorněn celý vektor pYZ97 použitý k expresi genů kódujících podjednotky UreA a UreB ureázy v S. typhimurium. Jak je naznačeno na obrázku 1, geny kódující ureázu se nacházejí pod kontrolou promotoru T7 fága φΐΟ. Místo pro vazbu na ribozom (RBS) je umístěno mezi promotorem T7 a geny pro ureázu. Tento plazmid dále obsahuje počátek replikace (ori) a gen kódující βlaktamázu (bia; rezistence vůči ampicilinu).
Na rozdíl od exprese řízené promotorem T7 nedochází ke konstitutivní expresi (se střední intenzitou) podjednotek A a B ureázy řízené promotorem pro RNA polymerázu ze Salmonelly. Tento promotor je na plazmidu pYZ97 umístěn proti směru transkripce od promotoru T7. Za účelem provedení detailní molekulové analýzy byl purifikovaný fragment BglII/HindlII z plazmidu pYZ97 klonován do pCR-Script™ SK(+) (Amersham) a sekvenován. Sekvenační data potvrdila přítomnost jednotlivých prvků a jejich úplnost (viz. obrázek 2 a SEK. ID. Č: 5 a 6):část genu ureA, regulační sekvenci translace, RBS, promotor T7 a terminátor TI (rrnBTl). Sekvenční analýza rovněž odhalila oblast mezi terminátorem TI a promotorem T7, kde je lokalizován promotor RNA polymerázy ze Salmonella. Sekvenační data naznačují, že tento konstitutivní promotor, jehož motiv byl odhadnut na základě strukturních predikcí, je umístěn mezi nukleotidy 222 a 245 (Lisser a Margalit,
Nuc. Acid. Res., 21:1507 až 1516, 1993).
Příklad 2
Imunologická ochrana prostřednictvím podání živé vakcíny
Materiál a metody
Bakteriální kmeny: Jako recipient plazmidových konstruktů obsahujících ureázu pocházející z H. pylori byla použita živá vakcína S. typhimurium kmen SL3261. S. typhimurium • · · · · · ♦»···* • · · · · ·
SL3261 je aroA mutant odvozený z divokého kmene S. typhimurium SL3261. S. typhimurium SL3261 je nevirulentní kmen, který po orální aplikaci poskytuje myším ochranu proti infekci vyvolané S. typhimurium divokého typu (Hoiseth a Stocker, 1981, viz. výše) . S. typhimurium SL3261 a kmeny z něj odvozené obsahující expresívní plazmid pYZ97 pro ureázu (mimochromozomální) a expresívní kazety T7RNAP pYZ88, pYZ84 nebo pYZ114 (integrované do chromozomu) jsou popsány v tabulce 1. Pro kultivaci bakterií při 28°C byl použit Luria Broth (LB, živný bujón) nebo LB agar. K infikaci byl použit kmen H. pylori divokého typu kultivovaný při 37°C na miskách se sérem.
Imunizace myší: Myši Balb/c ve stáří 4 týdny, zakoupené od společnosti Interfauna (Tuttlingen, Německo), byly před použitím k experimentům dva týdny adaptovány na podmínky zvěřince. Předimunizační sérum bylo získáno retroorbitálním odběrem 150 μΐ krve z každého jedince. Jeden a tři týdny po imunizaci byly retroorbitální odběry u všech pokusných zvířat opakovány.
Při této studii bylo použito osm skupin po pěti jedincích včetně kontrol (tabulka 2). Skupina A - kontrolní skupina, nebyla ani imunizována Salmonellou ani infikována H. pylori divokého typu. Všechny zbylé skupiny byly imunizovány orálně. Skupina B, negativní kontrolní skupina, nebyla imunizována Salmonellou, ale byla infikována H. pylori divokého typu. Myši ze skupin C až G byly imunizovány vakcínami Salmonelly a infikovány H. pylori. Poslední skupina H byla imunizována rekombinantní ureázou B v kombinaci s toxinem cholery a byla rovněž infikována.
Před imunizací byly myši ponechány přes noc bez pevné potravy a 4 hodiny bez vody. Za účelem neutralizace pH v žaludku bylo myším prostřednictvím nerezového ocelového katetru orálně aplikováno 100 μΐ 3% roztoku hydrogenuhliči17 tanu sodného. Následně bylo myším ze skupiny B podáno 100 μΐ PBS a myším ze skupin C až G 1,0 x 106 CFU (colony forming unit) mikroorganizmů Salmonella v celkovém objemu 100 μΐ. Myším ve skupině H bylo celkem čtyřikrát v jednotýdenních intervalech aplikováno 100 μΐ směsi rekombinantní ureázy B z H. pylori spolu s toxinem cholery. Po každé imunizaci byla myším vrácena voda i potrava.
Infikace prostřednictvím H. pylori: Čtyři týdny po první orální imunizaci byly myši ze skupin B až H infikovány H. pylori. Před vlastním infikací byly myši ponechány přes noc bez pevné potravy a 4 hodiny bez vody. Prostřednictvím nerezového ocelového katetru bylo myším orálně aplikováno 100 μΐ 3% roztoku hydrogenuhličitanu sodného a následně pak dávka 5,0 x 109 CFU mikroorganizmů Helicobacter pylori. Po infikaci byla myším vrácena voda i potrava.
Odebírání krve a tkáně myším: Dvanáct týdnů po první imunizaci byly myši ponechány přes noc bez pevné potravy a následně usmrceny za účelem analýzy stupně ochrany a imunitní reakce. Finální odebrání krve přímo ze srdce a usmrcení zlomením vazu bylo prováděno v narkóze navozené podáním methoxyfluoranu. Za aseptických podmínek byly každé myši opatrně odejmuty slezina a žaludek a tyto orgány byly až do dalšího zpracování umístěny na led do jednotlivých sterilních nádob. Za účelem izolace intestinální tekutiny byly myším odebrány tenké a tlusté střevo.
Zpracování žaludku a měření ureázové aktivity: Stupeň kolonizace myšího žaludku H. pylori byl stanovován na základě přítomnosti aktivní ureázy v této tkáni. K tomuto účelu byl použit Jatrox-test (Rohm-Pharma GmbH, Weiterstadt, Německo) . Žaludeční sliznice byla exponována a promyta PBS a polovina antrální části žaludku byla okamžitě umístěna do mikrozkumavky Eppendorf obsahující substrát pro měření ureázové aktivity. Po 4 hodinové inkubaci při pokojové teplotě • « ·· φφ • · φ » • · ř
ΦΦΦ * « b »· * ΦΦΦ
Φ Φ • Φ < * byla změřena absorbance při vlnové délce 550 nm. Zbytek žaludeční tkáně byl před dalšími experimenty skladován při 20°C. Hodnoty ureázové aktivity získané ze žaludků myší, které nebyly imunizovány ani infikovány H. pylori, byly použity ke stanovení referenční hladiny označující absenci infekce H. pylori a tudíž ochranu živočichů.
Tabulka 1
Kmeny vakcíny na bázi S. typhimurium exprimující UreA a
UreB
Kmeny Exprese ureázy Zdroj
S. typhimurium SL3261 negativní Hoiseth a Stocker
S. typhimurium SL3261 pYZ97 Konstitutivní Nízká tato studie
S. typhimurium SL3261::pYZ88pYZ97 Vysoká hladina exprese indukovaná T7 tato studie
S. typhimurium SL3261::pYZ84pYZ97 Střední hladina exprese indukovaná T7 tato studie
S. typhimurium SL3261::pYZ114pYZ97 Nízká hladina exprese indukovaná T7 tato studie
Tabulka 2
Skupiny myší použitých k imunizaci
Skupina Imunogen Počet orálních imunizací
A Žádný 0
B orální imunizace PBS 1
c S. typhimurium SL3261 1
D S. typhimurium SL3261 pYZ97 1
E S. typhimurium SL3261::pYZ88pYZ97 1
F S. typhimurium SL3261::pYZ84pYZ97 1
G S. typhimurium SL3261::pYZ114pYZ97 1
H Ureáza B spolu s toxinem cholery 4
·· • tt * · ·· ·· • tttt· ·· · · · · β » • · · tt » ' · · • · β · tt ···>»··· * tt » * tttt • etttt ···· tttttt tttt tttt
Výsledky:
U 100% myší z kontrolních skupin (skupiny B a C) byla pozorována infekce H. pylori. U myší imunizovaných rekombinantními oslabenými patogeny (skupiny D, E, F, G) byla pozo rována infekce v intervalu 0% až 60% případů (100% až 40% ochrana). Imunologická ochrana nekorelovala s humorální odpovědí proti UreA a UreB což naznačuje, že mimo humorální imunity je k ochraně proti infekci H. pylori nezbytná buněč ná imunita. Získané výsledky naznačují, že orální imunizace myší prostřednictvím UreA a UreB aplikovaných oslabeným kmenem S. typhimurium je účinná při indukci intenzívní ochranné reakce proti kolonizaci žaludku H. pylori.
U myší imunizovaných rekombinantní ureázou B spolu s toxinem cholery byla za výše uvedených experimentálních podmínek pozorována podstatně vyšší ureázová aktivita, než tomu bylo při aplikaci oslabených rekombinantních patogenů podle vynálezu.
Výsledky testování ureázové aktivity jsou uvedeny v tabulce 3.
Tabulka 3
Skupina Myš E 550nnb
A 1 0,085
A 2 0,091
A 3 0,116
A 4 0,099
A 5 0,101
Kontrola 0.107
B 1 0,394
B 2 0,464
B 3 0,329
B · 4 0,527
B 5 0,462
Kontrola 0,102 c 1 0.248
C 2 0,369
C 3 0,209
C 4 0,219
C 5 0,24
Kontrola 0103
D 1 0,143
D 2 0,156
D 3 0,142
D 4 0,114
D 5 0,133
Kontrola 0,141
E · 1 0,127
E 2 0,094
E 3 0,099
E 4 0,161
E 5 0,198
Kontrola q j
F 1 0,166
F 2 0,145
F 3 0.166
F 4 0,154
F 5 0.301
Kontrola 0,141
G 1 0,084
G 2 0,067
G 3 0,269
G 4 0,085
G 5 0,092
Kontrola 0,103
H 1 0.638
H 2 0,282
H 3 0,141
H 4 0,135
H 5 0,171
Kontrola 0,107 ·· 9 9 9 9·· • 9
9 9 9 9 9 9 9 · ·
^kontrolní ^kor. J Redenr
-0,022 -0,066 200μΙ+400μ!
-0,016 -0,048 200μΙ+400μ!
0,009 0,027 200μΜ00μ!
-0,008 -0,024 200μΙ+400μΙ
-0,006 -0,018 200μΙ+400μΙ
0 0 200μΙ+400μΙ
0,292 0,876 200μΙ+400μΙ
0,362 1,085 200μΙ+400μΙ
0,227 0,681 200μΙ+400μΙ
0,425 1,275 200μΙ+400μΙ
0,36 1,08 200μΙ+400μ!
0 0 200μ!+400μΙ
0,145 0,435 200μΙ+400μΙ
0,266 0,798 200μΙ+400μΙ
0,106 0,318 200μΙ+400μ1
0,116 0,348 200μ1+400μ!
0,137 0,411 200μ(+400μΙ
0 0 200μΙ+400μΙ
0,002 0,004 300μΙ+300μΙ
0,015 0,03 300μ!+300μ1
0,001 0,002 300μΙ+300μΙ
-0,027 -0,054 300μΙ+300μΙ
-0,008 -0,016 300μ!+300μ!
0 0 300μ1+300μ1
0,027 0,081 200μΙ+400μΙ
-0,006 -0,018 200μΐ+400μ|
•0,001 -0,003 200μΙ+400μΙ
0,061 0,183 200μ!+400μΙ
0,098 0,294 200μΐ+400μ|
0 0 200μΙ+400μ!
0,025 0,05 300μΙ+300μΙ
0,004 0,008 300μΙ+300μΙ
0,025 0,05 300μΙ+300μ1
0,013 0,026 300μΙ+300μΙ
0,16 0,32 300μΙ+300μΙ
0 0 300μ!+300μΙ
-0,019 -0,057 200μΙ+400μΙ
-0,016 -0,048 200μ!+400μΙ
0,166 0,493 200μΙ+400μΙ
-0,018 -0,054 200μ!+400μ1
-0,011 -0,033 200μΙ+400μΙ
0 0 200μΙ+400μΙ
0,531 1,593 200μΙ+400μΙ
0,175 0,525 200μΙ+400μΙ
0,034 0,102 200μΙ+400μΙ
0,028 0,084 200μΙ+400μΙ
0,064 0,192 200μΙ+400μΙ
0 0 200μΜ00μΙ
• ·
Příklad 3
Konstrukce a molekulová analýza různých rekombinantních kmenů S. typhimurium exprimujících podjednotky UreA/UreB.
Popis kmenů S. typhimurium použitých při imunizacích.
S. typhimurium SL3261(pYZ97) (konstrukt A): Jako příjemce plazmidového konstruktu obsahujícího rekombinantní ureázu (pYZ97) byl použit vektor živé vakcíny kmene S. typhimurium SL3261.
S. typhimurium SL3261: :série YZ (pYZ97) (konstrukt B): Tyto kmeny použité jako vektory jsou odvozeny z kmene S. typhimurium SL3261, který byl doplněn o expresívní kazety RNA polymerázy T7 (T7RNAP) schématicky znázorněné na obrázku 3. Tyto expresívní kazety kódují gen pro T7RNAP, který je exprimován ve dvoufázovém režimu (zapnuto/vypnuto), jak je popsáno v patentové přihlášce Yan a další (Two phase systém for the production and presentation of foreign antigens in hybrid live vaccines, PCT/EP91/02478). Použitá kazeta může být integrována do chromozomu baktérie a této buňce může tedy v režimu zapnuto dodávat optimální množství T7RNAP pro aktivaci expresívních plazmidů závislých na T7RNAP (jako například pYZ97).
Principem kazety YZ84 je přítomnost promotoru PL fága lambda umístěného na fragmentu, který může být invertován invertázou Gin fága Mu (Yan a Meyer, J. Biotechnol., 44:197 až 201, 1996) . V závislosti na orientaci promotoru PL je bud' exprimován gen gin (režim vypnuto) nebo gen pro T7RNAP (režim zapnuto). V plazmidů YZ84 jsou obsaženy následující regulační prvky: (1) Teplotně senzitivní represor fága lambda clts (cl), který při teplotě 28°C blokuje promotor PL, a který při 37°C tento promotor blokovat přestává; (2) Terminátor fd (fdT) snižující expresi genu gin tak, aby bylo dosaženo mírné úrovně inverze promotoru PL na fragmentu, který může být invertován.
• ·
Dvoufázový expresívní systém umožňuje vysokou hladinu exprese cizorodých antigenů, jako například podjednotek A a B ureázy. Je dobře známo, že vysoká úroveň exprese cizorodých antigenů snižuje životaschopnost vektoru Salmonella a potlačuje tudíž imunitní reakci a z toho důvodu i ochranný potenciál vakcíny. Bylo prokázáno, že zmíněný dvoufázový systém má přirozenou schopnost zvýšit životaschopnost rekombinantních Salmonell exprimujících velké množství cizorodého antigenů. V konstruktu B je exprese genů ureA a ureB řízena především silným promotorem T7, což má za následek vysokou hladinu exprese těchto podjednotek ureázy. Je-li expresívní kazeta pro T7RNAP v pozici vypnuto a není-li tedy přítomna žádná T7RNAP, jsou geny ureA a ureB konstitutivně exprimovány v menších množstvích a tato exprese je řízena promotorem Salmonelly.
Analýza podjednotek UreA/Β produkovaných různými kmeny S. typhimurium použitými k imunizačním experimentům.
Konstrukty A a B S. typhimurium byly nejprve analyzovány na SDS-polyakrylamidových gelech za účelem zjištění, zda-li exprimují podjednotky UreA a UreB. Rekombinantní kmeny byly při 37°C kultivovány v kapalném LB médiu (zaočkovaném z kultury pěstované přes noc) doplněném ampicilinem na koncentraci 100 gg/ml. V exponenciální fázi růstu byly bakterie zcentrifugovány, získaná buněčná peleta byla rozsuspendována v pufru 10 mM Tris-HCl a 10 mM EDTA (pH 8,0) a hustota buněk byla ve všech případech upravena na hodnotu A590 = 1. Takto získaná bakteriální suspenze byla smíchána se stejným objemem vzorkového pufru (Sambrook J. a další, Molecular Cloning: a Laboratory Manual, 2. vydání, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989) a povařena po dobu 5 minut. 20 μΐ této suspenze bylo naneseno na dva 10% SDS-polyakrylamidové gely; jeden gel byl barven modří
Coomassie a proteiny z druhého gelu byly elektroforeticky přeneseny na nitrocelulózovou membránu a dále zpracovány metodou Western blot. Nitrocelulózová membrána s přenesenými proteiny byla 45 minut při pokojové teplotě blokována v 10% (w/v) roztoku odtučněného mléka ve fyziologickém roztoku pufrovaném Tris-HCl (TBS; 100 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl, pH 7,2) . Po třech promytích v TBS-0,05 % (v/v) Tween-20 byla nitrocelulózová membrána inkubována přes noc při 4°C s králičí protilátkou proti UreB (AK201) v ředění 1:2000 v 5% (v/w) roztoku odtučněného mléka v TBS. Použité sérum bylo získáno k králíka imunizovaného rekombinantní podjednotkou B ureázy přečištěnou afinitní chromatografii. Membrána byla třikrát po dobu 10 minut promývána roztokem 0,05 % (v/v) Tween-20 v PBS a následně po dobu 45 minut při pokojové teplotě inkubována s kozí protilátkou proti králičím IgG konjugovanou s křenovou peroxidázou v 5% (w/v) roztoku odtučněného mléka v TBS. Po třech promytích roztokem 0,2% (v/v) Tween-20 (za podmínek popsaných výše) byla membrána obarvena za použití soupravy ECL (Amersham, Německo) postupem doporučeným výrobcem.
Konstrukt A: Na gelu barveném Coomassie byly v celkovém buněčném lyzátu konstruktu A (S. typhimurium kmen SL3261(pYZ97)) pozorovány proužky proteinů o velikosti 67 kDa a 30 kDa; tyto molekulové hmotnosti odpovídají podjednotce UreB, respektive UreA. V kontrolních drahách obsahujících celkový lyzát ze S. typhimurium kmen SL3261 nebyly tyto proteiny pozorovány. Analýza stejných proteinových vzorků metodou Western blot za použití králičí protilátky proti UreB potvrdila, že proužek o velikosti 67 kDa pozorovaný na gelu barveném Coomassie je skutečně UreB. Exprese UreB prostřednictvím S. typhimurium kmene SL3261(pYZ97) byla rovněž stanovována v různých fázích růstu kultivací po dobu 2, 6a 11 hodin při 37°C. Ve všech fázích růstu, včetně stacionární • · · · ·«······ • * · · · · ········ · · · · ·· ·· · · fáze, byla pozorována exprese UreB. V časných fázích růstu byla tato exprese nicméně vyšší. Výsledky získané z experimentů s kmenem SL3261(pYZ97) naznačují, že proteiny UreA a UreB jsou pro Salmonelly ne toxické a při 37 °C mohou být exprimovány v jakékoliv fázi bakteriálního růstu.
Konstrukt B: Podobná analýza byla provedena i u konstruktu B. Srovnání obou konstruktů analýzou SDS-PAGE odhalilo, že konstrukt B produkuje vysoké hladiny UreA a UreB, zatímco konstrukt A se vyznačuje nepříliš velkou expresí těchto proteinů. V průběhu růstu konstruktu B je v delším časovém úseku exprese UreA a UreB konstantně vysoká, a to i bez selekce antibiotiky. Tato skutečnost potvrzuje výjimečnou produktivitu konstruktu B ve srovnání s konstruktem A.
V souhrnu získaná data naznačují, že polypeptidy UreA a UreB pocházející z H. pylori mohou být exprimovány v S. typhimurium, aniž by na tyto producenty měly negativní vliv a jsou tudíž, jsou-li aplikovány prostřednictvím vektorů Salmonella, vhodné pro experimenty zkoumající imunologickou ochranu živočichů.
Stabilita plazmidů
Stabilita plazmidů je nezbytná k zajištění stabilní exprese antigenů kódovaných geny, které byly do těchto plazmi dů klonovány.
Stabilita plazmidů in vitro: Jako indikátor stability plazmidů byl využit markér rezistence vůči ampicilinu přítomný na plazmidů pYZ97 a nevyskytující se v baktériích S. typhimurium SL3261, které tento plazmid neobsahují. S. typhimurium kmen SL3261 byl kultivován při teplotě 28°C v kapalném LB médiu a to až do 100 generace (viz. dřívější publikace Summers D. K. a Sherrat D. J. , Cell, 36:1097 až 1103, 1984). Každou desátou generaci byl stanovován počet CFU (colony forming unit; počet bakterií schopných vytvořit kolonii na LB agaru) rezistentních vůči ampicilinu vzhledem k celkovému počtu CFU. Zmíněné stanovení bylo prováděno vysetím mikroorganizmů Salmonella ve stejných ředěních na misky s LB agarem bez ampicilinu a na misky s LB agarem doplněným ampicilinem na koncentraci 100 ^g/ml.
Stabilita plazmidů in vivo: Stabilita plazmidů in vivo byla analyzována určením celkového počtu CFU a počtu CFU rezistentních vůči ampicilinu ze slezin myší, a to druhý a sedmý den po orální infikaci těchto myší prostřednictvím S. typhimurium SL3261(pYZ97) v množství 5,0 χ 109 CFU. Myši byly Salmonellou infikovány orální cestou postupem popsaným výše. Druhý a sedmý den po infikaci byly myši v narkóze navozené methoxyfluoranem usmrceny a za účelem dalšího zpracování jim byla sterilně odebrána slezina. Sleziny byly následně v Petriho miskách rozřezány na malé kousky, smíchány s 1 ml ledově studené deionizované vody a slezinné buňky byly rozsuspendovány několikanásobným protažením přes jehlu o průměru 1 mm. Získaná buněčná suspenze byla poté vyseta na misky s LB agarem s nebo bez ampicilinu v koncentraci 100 gg/ml. Misky byly přes noc inkubovány při 37°C a následující den byl stanoven počet kolonií.
Stabilita plazmidů in vivo byla analyzována po infikaci myší jednou orální dávkou S. typhimurium SL3261(pYZ97) v množství 5,0 χ 109 CFU. Druhý a sedmý den po infikaci byly myším odebrány sleziny a slezinné buňky byly za účelem kvantifikace celkového počtu CFU a CFU rezistentních vůči ampicilinu vysety na misky s LB agarem. Ze slezin odebraných po 48 hodinách bylo izolováno 2,0 χ 104 CFU rezistentních vůči ampicilinu (tabulka 4). Sedmý den po imunizaci se počet CFU snížil na 56, nicméně všechny byly opět rezistentní vůči ampicilinu. Získaná data naznačují, že plazmid pYZ97 je v mikroorganizmu Salmonella stabilní jak za podmínek in vitro tak in vivo, a je tudíž vhodný k charakterizaci pod26 » · · · · · jednotek ureázy coby ochranných antigenů vůči kolonizaci žaludku myši prostřednictvím H. pylori. Malý počet kolonií kmene Salmonella SL3261 získaný sedmý den po infikaci potvrzuje, že tento kmen je oslabený, což umožňuje jeho bezpečné použití k aplikaci ureázy do organizmu myší.
Tabulka 4
Počet kolonií kmene S. typhimurium SL3261pYZ97 ze slezin myší a hodnocení stability plazmidu pYZ97 in vivo.
Doba po infikaci Celkový počet CFU14 Procento Ampx CFUb
2 dny 2,0 χ 107 100
7 dní 56 100
a Počet CFU S. typhimurium (ze slezin myší dva a sedm dní po orální aplikaci 5,0 χ 109 CFU S. typhimurium SL3261pYZ97) izolovaných z misek s LB agarem bez přídavku antibiotika.
b Procentuální zastoupení CFU rezistentních vůči ampicilinu v celkovém počtu CFU izolovaných ze slezin myší.
Tabulka 5
Stanovení ureázové aktivity a počtu H. pylori rezistentních vůči streptomycinu v žaludku myší imunizovaných Salmonellou exprimující UreA a UreB
Skupina myší Počet Ureázová aktivita3 CFUb
Neinfikovaná kont- rolní skupina 5 0,058 + 0,004 0 + 0
Kontrolní skupina PBS 5 0,427 ± 0,059 2,7 χ 103 ± 1,0 χ 103
SL3261pYZ97c 5 0,057 ± 0,006 62,6 ± 97,3
** Ureázová aktivita je uvedena ve tvaru průměr ± směrodatná odchylka.
b Stanovení CFU kmene H. pylori P76 rezistentních vůči streptomycinu bylo provedeno vysetím části žaludku na misky ze sérem s přídavkem streptomycinu v koncentraci 200 gg/ml. H. pylori byly identifikovány na základě morfologie kolonií ureázové aktivity a pozorováním světelným mikroskopem. Hodnoty jsou uvedeny ve tvaru CFU + standardní odchylka.
c Myši imunizované kmenem S. typhimurium SL3261pYZ97 exprimujícím UreA a UreB pocházející z H. pylori (jak je popsáno v oddíle Materiál a Metody).
Příklad 4
Experimenty stanovující na myším modelu míru ochrany proti infekci H. pylori, a to s využitím různých rekombinantních kmenů S. typhimurium exprimujících podjednotky UreA/UreB.
Popis kmenů Helicobacter pylori použitých při experimen těch.
Kmen H. pylori Pil deficientní v ureázové aktivitě je odvozen z kmene PÍ mutagenezí využívající minitranspozon TnMax5 (transposon shluttle mutagesis), postupem popsaným v přihlášce autorů Haas a další (Verfahren zur Identifizie rung sekretorisher Gene aus Helicobacter pylori; PCT/EP96/02544) . Inzerce minitranspozonu TnMax5 na 3-konec genu UreA měla za následek defektní expresi genů ureA a ureB, a to vzhledem k jejich propojené transkripci.
Kmen H. pylori P4 9 adaptovaný na organizmus myší byl pů vodně vytvořen Dr. J. G. Foxem (MIT, Boston, MA) z izolátu získaného z koček. Kmen H. pylori P76 je kmen rezistentní vůči streptomycinu, odvozený z kmene P49 metodou homologní rekombinace s chromozomální DNA kmene H. pylori NCTC11637 rezistentního vůči streptomycinu, popsaného v publikaci autora P. Nedenskov-Sorensen (J. Infect. Dis., 161:365 až 366, 1990) .
Všechny kmeny H. pylori byly kultivovány při 37°C v mikroaerobní atmosféře (5% 02, 85% N2 a 10% CO2) na miskách se sérem (Odenbreit S. a další, J. Bacteriol., 178:6960 až 6967, 1996) doplněným (tam kde to bylo žádoucí) streptomycinem v koncentraci 200 gg/ml.
Profylaktická imunizace myší.
Imunizační experimenty byly prováděny za účelem testování schopnosti UreA a UreB aplikovaných ve vektoru Salmonella ochránit myši před kolonizací žaludku mikroorganizmy H. pylori. Celkem bylo provedeno pět nezávislých imunizačních experimentů. Při každém experimentu bylo použito pět skupin myší o pěti jedincích: (1) neinfikovanou kontrolní skupinou byly myši, které nebyly ani imunizovány Salmonellami, ani infikovány H. pylori P49 divokého typu nebo odvozeným kmenem P76 rezistentním vůči streptomycinu; (2) kontrolní skupinu PBS tvořily myši, které nebyly imunizovány (byl jim aplikován PBS), a které byly orálně infikovány H. pylori; (3) kontrolní skupinu Salmonella tvořily myši, které byly imunizovány oslabeným kmenem S. typhimurium SL3261 a infikovány H. pylori; a (5) imunizovanou skupinou Salmonella byly myši imunizované odpovídajícím rekombinantním konstruktem S. typhimurium (A + B) exprimujícím UreA a UreB a následně infikované H. pylori.
Před imunizací byly myši ponechány přes noc bez pevné potravy a 4 hodiny bez vody. Za účelem neutralizace pH v žaludku bylo myším prostřednictvím nerezového ocelového katetru orálně aplikováno 100 μΐ 3% roztoku hydrogenuhličitanu sodného. Okamžitě po neutralizaci žaludku bylo myším z kontrolní skupiny PBS aplikováno 100 μΐ PBS a myším z kontrolní skupiny Salmonella bylo aplikováno 5,0 x 109 CFU S. typhimurium kmene SL3261 a myším z imunizované skupiny Salmonella bylo aplikováno 5,0 x 109 CFU jednotlivých rekom29
binantních konstruktů v celkovém objemu 100 μΐ. Po imunizaci byl myším opět obnoven přísun potravy a vody.
Čtyři týdny po imunizaci byly myši z kontrolní skupiny PBS, z kontrolní skupiny Salmonella a myši z imunizované skupiny Salmonella infikovány 1,0 χ 109 CFU H. pylori. Před infikací byly myši ponechány přes noc bez pevné potravy a 4 hodiny bez vody. Po orální aplikaci 1,0 χ 109 CFU H. pylori kmene P49 nebo P76 bylo myším podáno prostřednictvím nerezového ocelového katetru orálně 100 μΐ 3% roztoku hydrogenuhličitanu sodného. Po infikaci byl myším opět obnoven přísun potravy a vody.
Příklad 5
Imunologické analýzy profylaktické imunizace prováděné s využitím různých rekombinantních kmenů S. typhimurium exprimujících podjednotky ureA/ureB na myším modelu.
Odběr krve a intestinální tekutiny myší za účelem sérologických analýz.
U všech myší byla ve vzorcích krve a intestinální tekutiny stanovována intenzita protilátkové reakce. Před imunizací a tři týdny po imunizaci (před infikací prostřednictvím Helicobacter) bylo myším retroorbitálně odebráno 150 μΐ krve. Poslední odběr byl proveden 11 týdnů po imunizaci Salmonellou (6 týdnů po infikaci) nabodnutím srdečního svalu za anestézie metoxyfluoranem. Na konci experimentu byla myším odebrána tenká střeva a tato dále (s menšími úpravami) zpracována postupem popsaným dříve (Elson C. O. a další, J. Immunol. Meth., 67:101 až 108, 1984). Stručně vzato, obsah střev byl odstraněn promytím 2 ml roztoku 50 mM EDTA (Riedel), pH 7,5 obsahujícího inhibitor trypsinu ze sójových bobů (Sigma) v koncentraci 0,1 mg/ml. Celkový objem byl pomocí 0,15 M NaCl upraven na 5 ml. Vzorky byly intenzívně vortexovány, centrifugovány 10 minut při 2500 otáčkách za
minutu (Heraeus, Německo) a k supernatantům bylo přidáno 50 μΐ 100 mM fenylmethylsulfonylfluoridu (PMSF; Serva) v 95% ethanolu. Poté následovala centrifugace při 13000 otáčkách za minutu po dobu 10 minut při teplotě 4°C (Hermes). K takto získaným supernatantům bylo přidáno 50 μΐ 100 mM PMSF a 50 μΐ 2% azidu sodného (Merck) a tyto vzorky byly před přídavkem 250 μΐ 7% bovinního sérového albuminu (Biomol) ponechány 15 minut na ledu. Poté byly vzorky až do dalšího použití uskladněny při -20°C.
Analýza protilátek z myšího séra a střevní mukózy namířených proti ureáze prováděná metodou ELISA.
Je známo, že orální imunizace Salmonellou vyvolává protilátkovou odpověď s imunoglobuliny typu IgA. Reakce typu IgA vůči podjednotkám ureázy byla stanovována metodou ELISA, a to u myší imunizovaných S. typhimurium (konstrukty A + B) a u kontrolní skupiny myší. Rozpustné extrakty H. pylori Pl a odvozeného mutantního kmene Pil deficientního v ureázové aktivitě byly připraveny sonikací (Branson, Danbury, Conn.) ve fyziologickém roztoku pufrovaném fosforečnanovým pufrem pětkrát v 5 sekundových intervalech (35% pulsů) po dobu 45 sekund. Získaná suspenze byla po dobu 10 minut centrifugována (Heraeus, Německo) při 13000 otáčkách za minutu a teplotě 4°C, čímž byly odstraněny nerozbité buňky. Po stanovení obsahu proteinů soupravou BioRad byl získaný supernatant použit jako antigen. 96-jamkové mikrotitrační destičky (Nunc, Německo) byly potaženy 50 μΐ antigenů v koncentraci 50 μg/ml v uhličitanovém pufru, pH 9,6, a inkubovány přes noc při teplotě 4°C. Jamky byly po dobu 45 minut při pokojové teplotě blokovány 1,0% (w/v) odtučněným mlékem ve fyziologickém roztoku pufrovaném Trisem (TBS) a následně třikrát promyty v TBS-0,05% Tween 20. Při stanovení (prováděném v triplikátech) bylo 50 μΐ séra (v ředění 1:100) nebo výplachu střev (v ředění 1:2) v 0,5% (w/v) odtučněném mléku-TBS
umístěno do jamek a ponecháno přes noc při 4°C. Následně byly jamky třikrát promyty v TBS-0,05% Tween 20 a do všech jamek byla přidána kozí protilátka konjugovaná s křenovou peroxidázou (Sigma, ředění 1:3000) namířená proti myším IgA. Inkubace probíhala přes noc při 4°C. Barevná reakce probíhala při 37°C po dobu 30 minut a jako substrát byl použit orthofenylendiamin spolu s peroxidem vodíku v pufru octanu sodného. Reakce byla zastavena přídavkem 10 N H2SO4 a na čtečce destiček (Digiscan, Asys Hitech GmbH, Rakousko) byla stanovena absorbance při vlnové délce 492 nm.
Slizniční protilátky: (Konstrukt A) Z každé myši usmrcené na konci experimentu byla odebrána intestinální tekutina (šest týdnů po infikaci H. pylori) a za použití celkových buněčných extraktů H. pylori divokého typu (Pl) a mutantního kmene H. pylori deficientního v ureázové aktivitě (Pil) byla tato intestinální tekutina testována na přítomnost protilátek namířených proti ureáze. Jak ukazuje obrázek 4, protilátková odpověď typu IgA proti extraktu H. pylori divokého typu byla u imunizovaných myší 10-ti násobně vyšší než u myší neimunizovaných nebo u myší, které nebyly infikovány. Slizniční protilátková odpověď IgA vůči mutantnímu kmeni H. pylori deficientnímu v ureázové aktivitě byla u všech myší velmi nízká což naznačuje, že většina protilátkové odpovědi typu IgA ve střevě imunizovaných myší byla namířena proti ureáze.
Sérové protilátky: (Konstrukt A) Hladina sérových protilátek typu IgA namířených proti H. pylori divokého typu a kmenu H. pylori deficientnímu v ureázové aktivitě byla stanovena před imunizací, tři týdny po imunizaci (před infikací) a 10 týdnů po imunizaci (6 týdnů po infikaci H. pylori). Jak lze vidět z obrázku 5 (panel A), u myší imunizovaných S. typhimurium (konstrukt A) exprimujícím ureázu (konstrukt A) byla koncentrace protilátek proti H. pylori divokého typu tři týdny po imunizaci 20-ti násobně a 10 týdnů po imunizaci 34-násobně vyšší než v séru před imunizací. Protilátková odpověď typu IgA (v séru) vůči kmenu H. pylori deficientnímu v ureázové aktivitě byla ve třetím a 10 týdnu u všech skupin myší, včetně myší imunizovaných konstruktem A S. typhimurium, nízká (obrázek 5, panel Β), což naznačuje, že převážná část protilátkové odpovědi typu IgA je u imunizovaných myší namířena proti podjednotkám ureázy. Nízké hladiny sérových protilátek namířených proti H. pylori divokého typu byly rovněž pozorovány u neimunizovaných myší v desátém týdnu což naznačuje, že infikace prostřednictvím H. pylori provedená tři týdny dříve byla dostačující k indukci specifické protilátkové odpovědi u těchto myší. Odpověď typu IgA vůči H. pylori divokého typu byla ve třetím týdnu po imunizaci prostřednictvím S. typhimurium SL3261 (kontrolní skupina Salmonella) mírně zvýšená. Tato skutečnost může být vysvětlena přítomností antigenů u zástupců Salmonella, jež jsou schopny indukovat produkci protilátek křížově reagujících s H. pylori. Naproti tomu protilátková reakce vůči kmenu H. pylori deficientnímu v ureázové aktivitě byla u imunizovaných myší stejně nízká jako u myší neimunizovaných (obrázek 5, panel B). Tento výsledek naznačuje, že protilátková odpověď pozorovaná u imunizovaných myší je převážně namířena vůči ureáze. V séru myší kontrolní skupiny PBS nebo myší imunizovaných S. typhimurium SL3261 byla v 10. týdnu pozorována nízká intenzita protilátkové odpovědi proti mutantu H. pylori deficientnímu v ureázové aktivitě což naznačuje, že pozorovaná protilátková reakce je specifickou imunitní odpovědí vůči antigenům H. pylori aplikovaným těmto myším při infikaci provedené o tři týdny dříve. Slabá protilátková reakce proti kmenu H. pylori deficientnímu v ureázové aktivitě byla ve třetím týdnu pozorována u myší imunizovaných Salmonellou exprimující ureázu i u myší imunizovaných Salmonellou ureázu neexprimující, ale nebyla pozorována u myší z kontrolní skupiny PBS. Tato skutečnost potvrzuje přítomnost křížově reagujících epitopů v proteinech pocházejících ze Salmonelly a H. pylori. (Konstrukt B): Při sérologických analýzách myší imunizovaných sérií konstruktů B bylo dosaženo podobných výsledků což naznačuje, že větší produkce antigenů rekombinantními zástupci Salmonella výrazně nezesiluje protilátkovou odpověď.
Analýza myších sérových protilátek proti ureáze metodou imunoblotu.
Byla analyzována exprese UreA a UreB v S. typhimurium nezbytná k indukci specifické imunitní odpovědi u myší. Identifikace in vivo exprese UreA a UreB byla provedena sledováním protilátek proti UreA a UreB v séru myší imunizovaných Salmonellou (konstrukt A) a myší z kontrolních skupin. Antigeny z celých buněk H. pylori byly připraveny z H. pylori kmene PÍ divokého typu. Baktérie byly sebrány ze tří misek se sérem, rozsuspendovány v PBS a centrifugovány při 5000xg po dobu 10 minut. Získaná buněčná peleta byla rozsuspendována v pufru o složení 10 mM Tris-HCl, 10 mM EDTA, pH8,5, a ve všech případech byla buněčná hustota upravena na standardní hodnotu A590=l,0. Tato bakteriální suspenze byla smíchána se stejným objemem vzorkového pufru s SDS (Sambrook, 1989) a vařena po dobu 5 minut. Na 10% SDSpolyakrylamidový gel bylo naneseno 20 μΐ takto připraveného vzorku. Následně byly proteiny přeblotovány (elektropřenos) na nitrocelulózovou membránu a tato byla rozřezána na proužky, které byly po dobu 45 minut při pokojové teplotě blokovány v 10% (w/v) odtučněném mléce v TBS (100 mM Tris-HCl,
150 mM NaCl, pH7,2). Po trojnásobném promytí roztokem TBS0,05% (v/v) Tween-20 bylo k proužkům membrány přidáno, v ředění 1:80, myší sérum v 5% (w/v) odtučněném mléce v TBS a inkubace probíhala přes noc při 4°C. Séra byla získána z neimunizovaných myší a myší imunizovaných Salmonellou. Po třech promytích byly proužky nitrocelulózové membrány inkubovány s kozí protilátkou konjugovanou s křenovou peroxidázou namířenou proti myším IgG (Sigma) v ředění 1:3000 v 5% (w/v) odtučněném mléce v TBS. K obarvení byla, postupem doporučeným výrobcem, použita chemiluminiscenční souprava ECL (Amersham, Německo).
Séra z imunizovaných a neimunizovaných myší byla získána 3 týdny po imunizaci (před infikací H. pylori) a tato séra byla testována s využitím buněčných lyzátů kmene PÍ H. pylori divokého typu exprimujícího UreA a UreB. Při použití séra myší imunizovaných konstruktem A byly identifikovány proteiny o velikosti 67 kDa a 30 kDa, což odpovídá podjednotkám UreB (67 kDa) a UreA (3 0 kDa) . Zmíněné proužky nebyly pozorovány na membránách inkubovaných se sérem z neimunizovaných myší nebo myší imunizovaných pouze Salmonellou což naznačuje, že ureáza exprimovaná kmenem Salmonella použitým k vakcinaci byla schopna indukovat specifickou protilátkovou odpověď vůči UreA i UreB pocházející z kmene H. pylori divokého typu. Obdobné výsledky byly získány za použití konstruktu B.
Příklad 6
Stanovení kolonizace žaludku mikroorganizmem H. pylori u myší imunizovaných různými rekombinantními kmeny S. typhimurium exprimujícími podjednotky ureA/ureB na myším modelu H. pylori.
Zpracování žaludků a měření ureázové aktivity.
Testování ureázové aktivity: Analýza stupně ochrany vůči kolonizaci žaludku mikroorganizmem H. pylori byla prováděna měřením ureázové aktivity v antrální části žaludku myší. Měření ureázové aktivity je velmi spolehlivou, citlivou a specifickou metodou ke stanovení infekce mikroorganizmem H.
pylori (Konzervativní vývoj Helicobacter pylori při onemocnění žaludečními vředy. 1994. Helicobacter pylori při onemocnění žaludečními vředy. JAMA, 272 .-strana 65) a je rutinně používáno při klinických stanoveních (Kawanishi M. S. a další, J. Gastroenterol., 30:16 až 22, 1995; Kamija S. a další, Eur. J. Epidemiol., 9:450 až 452, 1993; Conti-Nibali S. a další, Am. J. Gastroenterol., 85:1573 až 1575, 1990) a při výzkumu prováděném na zvířatech (Gottfried M. R. a další, Am. J. Gastroenterol., 85:813 až 818, 1990). Jatrox-test (Rhon-Pharma GmbH, Weiterstadt, Německo) byl použit v souladu s doporučením výrobce. Jedenáct týdnů po imunizaci Salmonellou byly myši usmrceny a za aseptických podmínek jim byly opatrně odejmuty žaludky. Každý žaludek byl umístěn do ledového PBS ve sterilní nádobě a řezem podél malého zakřivení provedeného sterilním ostřím byla obnažena sliznice. Za účelem odstranění zbytků potravy byl žaludek propláchnut PBS a rozříznut tak, aby byla oddělena antrální část od těla žaludku. Polovina antrální části žaludku byla okamžitě umístěna do mikrozkumavky Eppendorf obsahující 500 μΐ substrátu pro ureázu z Jatrox-testu. Vzorky byly inkubovány 4 hodiny při pokojové teplotě a následně byla stanovena absorbance při vlnové délce 550 nm (A550) . Ke stanovení referenční hladiny byly použity hodnoty ureázové aktivity získané z žaludků myší, které nebyly ani imunizovány ani infikovány. Referenční hladina odpovídá průměrné hodnotě ureázové aktivity v žaludcích 5 testovaných neimunizovaných a neinfikovaných myší plus hodnota dvojnásobku standardní odchylky. Hodnoty ureázové aktivity vyšší než referenční hladina byly považovány za signál kolonizace žaludku mikroorganizmem H. pylori, zatímco hodnoty nižší než referenční hladina byly považovány jako negativní (nepřítomnost H. pylori v žaludku).
Kultivace: Levá část antrální části žaludků získaných z myší infikovaných kmenem P76 H. pylori rezistentním vůči ampicilinu byla umístěna na misky se sérem doplněným streptomycinem na koncentraci 200 ^g/ml. Inkubace probíhala za standardních podmínek. Po třech dnech byly narostlé baktérie, na základě morfologie kolonií, pozorování pod mikroskopem a stanovením ureázové aktivity, identifikovány jako H. pylori. U každého vzorku myšího žaludku byl na každé misce stanoven počet H. pylori schopných tvořit kolonie (CFU).
Ureázová aktivita (konstrukt A versus konstrukt B): Myši imunizované prostřednictvím přibližně 5,0 x 109 CFU Salmonella a infikované pomocí přibližně 1,0 x 109 CFU H. pylori kmene P4 9, jakož i myši z kontrolní skupiny, byly usmrceny v narkóze a v antrální části žaludků byla stanovována ureázová aktivita. Z obrázku 6 vyplývá, že 100% myší imunizovaných pomocí UreA a UreB aplikovaných prostřednictvím konstruktu A Salmonelly mělo ureázovou aktivitu nižší než referenční hladina což naznačuje absenci kolonizace žaludku mikroorganizmem H. pylori. Naproti tomu 100% neimunizovaných myší (PBS) a myší imunizovaných pouze kmenem SL3261 S. typhimurium mělo hodnoty ureázové aktivity daleko převyšující referenční hladinu což naznačuje, že v těchto případech je žaludek kolonizován mikroorganizmem H. pylori. Ke stanovení referenční hladiny ureázové aktivity byla použita skupina myší, které nebyly imunizovány ani infikovány.
U myší imunizovaných konstruktem B Salmonelly byly zjištěny hodnoty ureázové aktivity převyšující referenční hladinu což naznačuje kolonizaci žaludku těchto myší mikroorganizmem H. pylori použitým k infikaci. Zjištěné hodnoty ureázové aktivity jsou u této skupiny nicméně nižší než je tomu u kontrolní skupiny což naznačuje, že u myší imunizovaných konstruktem B Salmonelly bylo dosaženo částečné ochrany (obrázek 6). Konstrukty A a B Salmonelly indukují podobnou • «
protilátkovou odpověď, ale liší se v expresi podjednotek ureA a ureB. Z této skutečnosti vyvozujeme, že množství exprimovaného antigenu ureázy je důležité pro získání optimální ochrany.
Konstrukt A: Za účelem korelace mezi kolonizací žaludku mikroorganizmem H. pylori a ureázovou aktivitou byl proveden další imunizační experiment, při němž byly myši orálně imunizovány konstruktem A Salmonelly a následně infikovány kmenem H. pylori P76 rezistentním vůči ampicilinu. Hodnoty ureázové aktivity korelovaly s počtem identifikovaných CFU H. pylori. U dvou z pěti myší imunizovaných konstruktem Salmonelly exprimujícím ureázu nebyly detekovány žádné CFU H. pylori. Průměrný počet CFU u všech imunizovaných myší byl pouze 62. Naproti tomu, průměrný počet CFU u neimunizovaných myší byl 2737, což odpovídá 44-násobně vyšší kolonizaci. Získaná data naznačují, že u myší imunizovaných konstruktem Salmonelly exprimujícím ureázu byla eliminována nebo podstatně potlačena kolonizace žaludku mikroorganizmem H. pylori .
• ·
SEZNAM SEKVENCÍ (1) OBECNÉ INFORMACE:
(i) PŘIHLAŠOVATEL:
(A) JMÉNO: Max-Planck-Gesellschaft zur Foerdung der Wissenschaften e.V. Berlin (B) ULICE: Hofgartenstr. 2 (C) MĚSTO: Mnichov (E) STÁT: Německo (F) PSČ: 80539 (ii) NÁZEV VYNÁLEZU: Rekombinantní oslabený mikrobiální patogen obsahující alespoň jednu molekulu nukleové kyseliny kódující antigen pocházející z mikroorganizmu Helicobacter.
(iii) POČET SEKVENCÍ: 6 (iv) ADRESA PRO KORESPONDENCI:
(A) ADRESÁT: ČERMÁK-HOŘEJŠ-VRBA, Advokátní a patentová kancelář (B) ULICE: Národní 32 (C) MĚSTO: Praha 1 (D) STÁT: Česká Republika (E) PSČ: 116 66 (v) STROJNĚ ČITELNÁ FORMA:
(A) TYP MÉDIA: Floppy disk (B) POČÍTAČ: IBM PC kompatibilní • · (C) OPERAČNÍ SYSTEM: PC-DOS/MS-DOS (D) SOFTWARE: Patentln Release č. 1.0, Verze č.
1.30 (2) INFORMACE O SEK. ID. Č.:l:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 1557 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET ŘETĚZCŮ: jeden (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: DNA (genomová) (vi) PŮVODNÍ ZDROJ:
(A) ORGANIZMUS: Helicobacter pylori (vii) BEZPROSTŘEDNÍ ZDROJ:
(B) KLON: alpB (ix) CHARAKTERISTICKÝ ZNAK:
(A) NÁZEV/KLÍČ: CDS (B) UMÍSTĚNÍ: 1..1554
(xi) POPIS SEKVENCE : SEK . ID. Č. :1
ATG ACA CAA TCT CAA AAA GTA AGA TTC TTA GCC CCT TTA AGC CTA GCG
Met 1 48 Thr Gin Ser Gin 5 Lys Val Arg Phe Leu 10 Ala Pro Leu Ser Leu 15 Ala
TTA AGC TTG AGC TTC AAT CCA GTG GGC GCT GAA GAA GAT GGG GGC TTT
Leu Ser Leu Ser 20 Phe Asn Pro Val Gly 25 Ala Glu Glu Asp Gly 30 Gly Phe
ATG ACC 144 TTT GGG TAT GAA TTA GGT CAG GTG GTC CAA CAA GTG AAA AAC
Met Thr Phe 35 Gly Tyr Glu Leu Gly 40 Gin Val Val Gin Gin 45 Val Lys Asn
CCG GGT AAA ATC AAA GCC GAA GAA TTA GCC GGC TTG TTA AAC TCT ACC
192
Pro Gly 50 Lys Ile Lys Ala Glu 55 Glu Leu Ala Gly Leu 60 Leu Asn Ser Thr
ACA ACA 240 AAC AAC ACC AAT ATC AAT ATT GCA GGC ACA GGA GGC AAT GTC
Thr Thr 65 Asn Asn Thr Asn 70 Ile Asn Ile Ala Gly 75 Thr Gly Gly Asn Val 80
GCC GGG ACT TTG GGC AAC CTT TTT ATG AAC CAA TTA GGC AAT TTG ATT
288
Ala Gly Thr Leu Gly 85 Asn Leu Phe Met Asn 90 Gin Leu Gly Asn Leu 95 Ile
GAT TTG 336 TAT CCC ACT TTG AAC ACT AGT AAT ATC ACA CAA TGT GGC ACT
Asp Leu Tyr Pro 100 Thr Leu Asn Thr Ser 105 Asn Ile Thr Gin Cys 110 Gly Thr
ACT AAT AGT GGT AGT AGT AGT AGT GGT GGT GGT GCG GCC ACA GCC GCT
384
Thr Asn Ser Gly 115 Ser Ser Ser Ser 120 Gly Gly Gly Ala Ala Thr 125 Ala Ala
GCT ACT ACT AGC AAT AAG CCT TGT TTC CAA GGT AAC CTG GAT CTT TAT
432
Ala Thr Thr Ser Asn Lys Pro Cys Phe Gin Gly Asn Leu Asp Leu Tyr
130 135 140
AGA AAA ATG GTT GAC TCT ATC AAA ACT TTG AGT CAA AAC ATC AGC AAG
480
Arg Lys Met Val Asp Ser Ile Lys Thr Leu Ser Gin Asn Ile Ser Lys
145 150 155 160
AAT ATC TTT CAA GGC AAC AAC AAC ACC ACG AGC CAA AAT CTC TCC AAC
528
Asn Ile Phe Gin Gly Asn Asn Asn Thr Thr Ser Gin Asn Leu Ser Asn
165 170 175
CAG CTC AGT GAG CTT AAC ACC GCT AGC GTT TAT TTG ACT TAC ATG AAC
576
Gin Leu Ser Glu Leu Asn Thr Ala Ser Val Tyr Leu Thr Tyr Met Asn
180 185 190
TCG TTC TTA AAC GCC AAT AAC CAA 624
Ser Phe Leu 195 Asn Ala Asn Asn Gin 200
ACT AAT 672 CAA GCT TAT GGA AAT GGG
Thr Asn 210 Gin Ala Tyr Gly Asn 215 Gly
ATC CTA AAG CAA GCT TCA ATC ACT
720
Ile 225 Leu Lys Gin Ala Ser 230 Ile Thr
GCT < GCC 768 GCA GCG TTT TTG GAT GCC
Ala Ala Ala Ala Phe 245 Leu Asp Ala
TCC GCT AAC GCC GGG AAC GAT TTG
816
Ser Ala Asn Ala 260 Gly Asn Asp Leu
GTG 1 CAA B64 AAT ATC GTC AAT AAT TCT
Val Gin Asn 275 Ile Val Asn Asn Ser 280
AAC GCT AAC ATC AGC AAT TCA ACA·
912
Asn Ala 290 Asn Ile Ser Asn Ser 295 Thr
AAT ATT GAT CAA GCG CGA TCT AČC
960
Asn Ile 305 Asp Gin Ala Arg 310 Ser Thr
ACT TTG GCT AAA GTT AGC GCT TTG
1008
Thr Leu Ala Lys Val 325 Ser Ala Leu
TGG CTT GGG AAT TTT GCC GCC GGT
1056
Trp Leu Gly Asn 340 Phe Ala Ala Gly
AAC GGG TTT ATC ACT AAA ATC GGT
1104
Asn Gly Phe 355 Ile Thr Lys Ile Gly 360
• · • ·
• • • • • · « * • * · ř · • « · • » · • * · • » · » • * · • « ·
GCG GGT GGG ATT TTT CAA AAC AAC
Ala Gly Gly Ile Phe 205 Gin Asn Asn
GTT ACC GCT CAA CAA ATC GCT TAT
Val Thr Ala Gin 220 Gin Ile Ala Tyr
ATG GGG CCA AGC GGT GAT AGC GGT
Met Gly Pro 235 Ser Gly Asp Ser Gly 240
GCT TTA GCG CAA CAT GTT TTC AAC
Ala Leu 250 Ala Gin His Val Phe 255 Asn
AGC GCT AAG GAA TTC ACT AGC TTG
Ser 265 Ala Lys Glu Phe Thr 270 Ser Leu
CAA AAC GCT TTA ACG CTA GCC AAC
Gin Asn Ala Leu Thr 285 Leu Ala Asn
GGC TAT CAA GTG AGC TAT GGC GGG
Gly Tyr Gin Val 300 Ser Tyr Gly Gly
CAA CTA TTA AAC AAC ACC ACA AAC
Gin Leu Leu 315 Asn Asn Thr Thr Asn 320
AAT AAC GAG CTT AAA GCT AAC CCA
Asn Asn 330 Glu Leu Lys Ala Asn 335 Pro
AAC AGC TCT CAA GTG AAT GCG TTT
Asn 345 Ser Ser Gin Val Asn 350 Ala Phe
TAC AAG CAA TTC TTT GGG GAA AAC
Tyr Lys Gin Phe Phe 365 Gly Glu Asn
•1 ·· » « « ·· » * r »« • « ti.
• · · * * • * * f • · B fc ·
AAG AAT GTG 1152 GGC TTA CGC TAC Tyr 375 TAC GGC TTC TTC AGC TAT AAC GGC GCG
Gly Leu Arg Tyr Gly Phe Phe Ser Tyr Asn Gly Ala 380
Lys Asn 370 Val
GGC GTG GGT AAT GGC CCT ACT TAC AAT CAA GTC AAT TTG CTC ACT TAT
1200 Gly Val Gly Asn Gly Pro Thr Tyr Asn Gin Val Asn Leu Leu Thr Tyr
385 390 395 400
GGG GTG GGG ACT GAT GTG CTT TAC AAT GTG TTT AGC CGC TCT TTT GGT
1248 Gly Val Gly Thr Asp Val Leu Tyr Asn Val Phe Ser Arg Ser Phe Gly
405 410 415
AGT AGG AGT CTT AAT GCG GGC TTC TTT GGG GGG ATC CAA CTC GCA GGG
1296
Ser Arg Ser Leu Asn Ala Gly Phe Phe Gly Gly Ile Gin Leu Ala Gly
420 425 430
GAT ACT TAC ATC AGC ACG CTA AGA AAC AGC TCT CAG CTT GCG AGC AGA
1344 Asp Thr Tyr Ile Ser Thr Leu Arg Asn Ser Ser Gin Leu Ala Ser Arg
435 440 445
CCT ACA GCG ACG AAA TTC CAA TTC TTG TTT GAT GTG GGC TTA CGC ATG
1392 Pro Thr Ala Thr Lys Phe Gin Phe Leu Phe Asp Val Gly Leu Arg Met
450 455 460
AAC TTT GGT ATC TTG 'AAA AAA GAC TTG AAA AGC CAT AAC CAG CAT TCT
1440
Asn Phe Gly Ile Leu Lys Lys Asp Leu Lys Ser His Asn Gin His Ser
465 470 475 480
ATA GAA ATC GGT GTG CAA ATC CCT ACG ATT TAC AAC ACT TAC TAT AAA
1488 Ile Glu Ile Gly Val Gin Ile Pro Thr Ile Tyr Asn Thr Tyr Tyr Lys
485 490 495
GCT GGC GGT GCT GAA GTG AAA TAC TTC CGC CCT TAT AGC GTG TAT TGG
1536
Ala Gly Gly Ala Glu Val Lys Tyr Phe Arg Pro Tyr Ser Val Tyr Trp
500 505 510
GTC TAT GGC TAC GCC TTC TAA
1557
Val Tyr Gly Tyr Ala Phe
515
• · r • 9 0 ‘ · · e ' »»*>
*1! fe # ·· 0999 999 999 90 99 (2) INFORMACE O SEK. ID. Č.:2:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 518 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: protein
(xi) POPIS SEKVENCE: SEK. ID. Č. :2:
Met 1 Thr Gin Ser Gin Lys 5 Val Arg Phe Leu Ala Pro Leu Ser Leu Ala 10 15
Leu Ser Leu Ser 20 Phe Asn Pro Val Gly Ala Glu Glu Asp Gly Gly Phe 25 30
Met Thr Phe Gly 35 Tyr Glu Leu Gly 40 Gin Val Val Gin Gin Val Lys Asn 45
Pro Gly Lys Ile 50 Lys Ala Glu 55 Glu Leu Ala Gly Leu Leu Asn Ser Thr 60
Thr 65 Thr Asn Asn Thr Asn 70 Ile Asn Ile Ala Gly Thr Gly Gly Asn Val 75 80
Ala Gly Thr Leu Gly Asn 85 Leu Phe Met Asn Gin Leu Gly Asn Leu Ile 90 95
Asp Leu Tyr Pro 100 Thr Leu Asn Thr Ser Asn Ile Thr Gin Cys Gly Thr 105 110
Thr Asn Ser Gly 115 Ser Ser Ser Ser 120 Gly Gly Gly Ala Ala Thr Ala Ala 125
Ala Thr Thr Ser 130 Asn Lys Pro 135 Cys Phe Gin Gly Asn Leu Asp Leu Tyr 140
Arg 145 Lys Met Val Asp Ser 150 Ile Lys Thr Leu Ser Gin Asn Ile Ser Lys 155 160
Asn Ile Phe Gin Gly Asn 165 Asn Asn Thr Thr Ser Gin Asn Leu Ser Asn 170 175
Gin Leu Ser Glu 180 Leu Asn Thr Ala Ser Val Tyr Leu Thr Tyr Met Asn 185 190
Ser Phe Leu Asn 195 Ala Asn Asn Gin 200 Ala Gly Gly Ile Phe Gin Asn Asn 205
Thr Asn Gin Ala 210 Tyr Gly Asn 215 Gly Val Thr Ala Gin Gin Ile Ala Tyr 220
Ile 225 Leu Lys Gin Ala Ser 230 Ile Thr Met Gly Pro Ser Gly Asp Ser Gly 235 240
Ala Ala Ala Ala Phe Leu 245 Asp Ala Ala Leu Ala Gin His Val Phe Asn 250 255
• · • · · · · · · · • ·· · ········ • · · · · ······ · · · ··· · · ··
Ser Ala Asn Ala 260 Gly Asn Asp Leu Ser 265 Ala Lys Glu Phe Thr 270 Ser Leu
Val Gin Asn 275 Ile Val Asn Asn Ser 280 Gin Asn Ala Leu Thr 285 Leu Ala Asn
Asn Ala 290 Asn Ile Ser Asn Ser 295 Thr Gly Tyr Gin Val 300 Ser Tyr Gly Gly
Asn 305 Ile Asp Gin Ala Arg 310 Ser Thr Gin Leu Leu 315 Asn Asn Thr Thr Asn 320
Thr Leu Ala Lys Val 325 Ser Ala Leu Asn Asn 330 Glu Leu Lys Ala Asn 335 Pro
Trp Leu Gly Asn 340 Phe Ala Ala Gly Asn 345 Ser Ser Gin Val Asn 350 Ala Phe
Asn Gly Phe 355 Ile Thr Lys Ile Gly 360 Tyr Lys Gin Phe Phe 365 Gly Glu Asn
Lys Asn 370 Val Gly Leu Arg Tyr 375 Tyr Gly Phe Phe Ser 380 Tyr Asn Gly Ala
Gly 385 Val Gly Asn Gly Pro 390 Thr Tyr Asn Gin Val 395 Asn Leu Leu Thr Tyr 400
Gly Val Gly Thr Asp 405 Val Leu Tyr Asn Val 410 Phe Ser Arg Ser Phe 415 Gly
Ser Arg Ser Leu 420 Asn Ala Gly Phe Phe 425 Gly Gly Ile Gin Leu 430 Ala Gly
Asp Thr Tyr 435 Ile Ser Thr Leu Arg 440 Asn Ser Ser Gin Leu 445 Ala Ser Arg
Pro Thr 450 Ala Thr Lys Phe Gin 455 Phe Leu Phe Asp Val 460 Gly Leu Arg Met
Asn 465 Phe Gly Ile Leu Lys 470 Lys Asp Leu Lys Ser 475 His Asn Gin His Ser 480
Ile Glu Ile Gly Val 485 Gin Ile Pro Thr Ile 490 Tyr Asn Thr Tyr Tyr 495 Lys
Ala Gly Gly Ala 500 Glu Val Lys Tyr Phe 505 Arg Pro Tyr Ser Val 510 Tyr Trp
Val Tyr Gly Tyr Ala Phe 515 • · • ·
(2) INFORMACE O SEK. ID. Č.:3:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 1557 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET ŘETĚZCŮ: dva (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: DNA (genomová) (vi) PŮVODNÍ ZDROJ:
(A) ORGANIZMUS: Helicobacter pylori (vii) BEZPROSTŘEDNÍ ZDROJ:
(B) KLON: alpB (ix) CHARAKTERISTICKÝ ZNAK:
(A) NÁZEV/KLÍČ: CDS (B) UMÍSTĚNÍ: 1..1554 (xi) POPIS SEKVENCE: SEK. ID. Č.:3:
ATG ATA 48 Ile 520 AAA AAG AAT AGA ACG CTG TTT CTT AGT CTA GCC CTT TGC GCT
Met Lys Lys Asn Arg Thr 525 Leu Phe Leu Ser Leu 530 Ala Leu Cys Ala
AGC ATA 96 AGT TAT GCC GAA GAT GAT GGA GGG TTT TTC ACC GTC GGT TAT
Ser 535 Ile Ser Tyr Ala Glu 540 Asp Asp Gly Gly Phe 545 Phe Thr Val Gly Tyr 550
CAG CTC GGG CAA GTC ATG CAA GAT GTC CAA AAC CCA GGC GGC GCT AAA
144
Gin Leu Gly Gin Val Met Gin Asp Val Gin Asn Pro Gly Gly Ala Lys
555 560 565
AGC GAC GAA CTC GCC AGA GAG CTT AAC GCT GAT GTA ACG AAC AAC ATT
192
Ser Asp Glu Leu Ala Arg Glu Leu Asn Ala Asp Val Thr Asn Asn Ile
570 575 580
TTA AAC AAC AAC ACC GGA GGC AAC ATC GCA GGG GCG TTG AGT AAC GCT
240
Leu Asn Asn Asn Thr Gly Gly Asn Ile Ala Gly Ala Leu Ser Asn Ala
585 590 595
TTC TCC CAA TAC CTT TAT TCG CTT TTA GGG GCT TAC CCC ACA AAA CTC
288
Phe Ser Gin Tyr Leu Tyr Ser Leu Leu Gly Ala Tyr Pro Thr Lys Leu
600 605 610
AAT GGT AGC GAT GTG TCT GCG AAC GCT CTT TTA AGT GGT GCG GTA GGC
336
Asn Gly Ser Asp Val Ser Ala Asn Ala Leu Leu Ser Gly Ala Val Gly
615 620 625 630
• · · · • • • · • · · • · • · · · • • • •
• • · • •
TCT GGG ACT TGT GCG GCT GCA GGG ACG GCT GGT GGC ACT TCT CTT AAC
384
Ser Gly Thr Cys Ala Ala Ala Gly Thr Ala Gly Gly Thr Ser Leu Asn
635 640 645
ACT CAA AGC ACT TGC ACC GTT GCG GGC TAT TAC TGG CTC CCT AGC TTG
432
Thr Gin Ser Thr Cys Thr Val Ala Gly Tyr Tyr Trp Leu Pro Ser Leu
650 655 660
ACT GAC AGG ATT TTA AGC ACG ATC GGC AGC CAG ACT AAC TAC GGC ACG
480
Thr Asp Arg Ile Leu Ser Thr Ile Gly Ser Gin Thr Asn Tyr Gly Thr
665 670 675
AAC ACC AAT TTC CCC AAC ATG CAA CAA CAG CTC ACC TAC TTG AAT GCG
528
Asn Thr Asn Phe Pro Asn Met Gin Gin Gin Leu Thr Tyr Leu Asn Ala
680 685 690
GGG AAT GTG TTT TTT AAT GCG ATG AAT AAG GCT TTA GAG AAT AAG AAT
576
Gly Asn Val Phe Phe Asn Ala Met Asn Lys Ala Leu Glu Asn Lys Asn
695 700 705 710
GGA ACT AGT AGT GCT AGT GGA ACT AGT GGT GCG ACT GGT TCA GAT GGT
624
Gly Thr Ser Ser Ala Ser Gly Thr Ser Gly Ala Thr Gly Ser Asp Gly
715 720 725
CAA ACT TAC TCC ACA CAA GCT ATC CAA TAC CTT CAA GGC CAA CAA AAT
672
Gin Thr Tyr Ser Thr Gin Ala Ile Gin Tyr Leu Gin Gly Gin Gin Asn
730 735 740
ATC TTA AAT AAC GCA GCG AAC TTG CTC AAG CAA GAT GAA TTG CTC TTA
720
Ile Leu Asn Asn Ala Ala Asn Leu Leu Lys Gin Asp Glu Leu Leu Leu
745 750 755
GAA GCT TTC AAC TCT GCC GTA GCC GCC AAC ATT GGG AAT AAG GAA TTC
768
Glu Ala Phe Asn Ser Ala Val Ala Ala Asn Ile Gly Asn Lys Glu Phe
760 765 770
AAT TCA GCC GCT TTT ACA GGT TTG GTG CAA GGC ATT ATT GAT CAA TCT
816
Asn Ser Ala Ala Phe Thr Gly Leu Val Gin Gly Ile Ile Asp Gin Ser
775 780 785 790
CAA GCG GTT TAT AAC GAG CTC ACT AAA AAC ACC ATT AGC GGG AGT GCG
364
Gin Ala Val Tyr Asn Glu Leu Thr Lys Asn Thr Ile Ser Gly Ser Ala
795 800 805
4Ί • ·
• · • • • • · · · • · · • · · · • · · • · • · • · · · • « · • · • · • · · • * «
GTT ATT AGC GCT GGG ATA AAC TCC AAC CAA GCT AAC GCT GTG CAA GGG
912
Val Ile Ser Ala Gly Ile Asn Ser Asn Gin Ala Asn Ala Val Gin Gly
810 815 820
CGC GCT AGT CAG CTC CCT AAC GCT CTT TAT AAC GCG CAA GTA ACT TTG
960
Arg Ala Ser Gin Leu Pro Asn Ala Leu Tyr Asn Ala Gin Val Thr Leu
825 830 835
GAT AAA ATC AAT GCG CTC AAT AAT CAA GTG AGA AGC ATG CCT TAC TTG
1008
Asp Lys Ile Asn Ala Leu Asn Asn Gin Val Arg Ser Met Pro Tyr Leu
840 845 850
CCC CAA TTC AGA GCC GGG AAC AGC CGT TCA ACG AAT ATT TTA AAC GGG
1056 Pro Gin Phe Arg Ala Gly Asn Ser Arg Ser Thr Asn Ile Leu Asn Gly
855 860 865 870
TTT TAC ACC AAA ATA GGC TAT AAG CAA TTC TTC GGG AAG AAA AGG AAT
1104
Phe Tyr Thr Lys Ile Gly Tyr Lys Gin Phe Phe Gly Lys Lys Arg Asn
875 880 885
ATC GGT TTG CGC TAT TAT GGT TTC TTT TCT TAT AAC GGA GCG AGC GTG
1152
Ile Gly Leu Arg Tyr Tyr Gly Phe Phe Ser Tyr Asn Gly Ala Ser Val
890 895 900
GGC TTT AGA TCC ACT CAA AAT AAT GTA GGG TTA TAC ACT TAT GGG GTG
1200
Gly Phe Arg Ser Thr Gin Asn Asn Val Gly Leu Tyr Thr Tyr Gly Val
905 910 915
GGG ACT GAT GTG TTG TAT AAC ATC TTT AGC CGC TCC TAT CAA AAC CGC
1248
Gly Thr Asp Val Leu Tyr Asn Ile Phe Ser Arg Ser Tyr Gin Asn Arg
920 925 • 930
TCT GTG GAT ATG GGC TTT TTT AGC GGT ATC CAA TTA GCC GGT GAG ACC
1296 Ser Val Asp Met Gly Phe Phe Ser Gly Ile Gin Leu Ala Gly Glu Thr
935 940 945 950
TTC CAA TCC ACG CTC AGA GAT GAC CCC AAT GTG AAA TTG CAT GGG AAA
1344 Phe Gin Ser Thr Leu Arg Asp Asp Pro Asn Val Lys Leu His Gly Lys
955 960 965
ATC AAT AAC ACG CAC TTC CAG TTC CTC TTT GAC TTC GGT ATG AGG ATG
1392 Ile Asn Asn Thr His Phe Gin Phe Leu Phe Asp Phe Gly Met Arg Met
970 975 980
AAC TTC GGT AAG TTG GAC GGG AAA TCC AAC CGC CAC AAC CAG CAC ACG
1440
Asn Phe Gly Lys Leu Asp Gly Lys Ser Asn Arg His Asn Gin His Thr 985 990 995
GTG GAA TTT GGC GTA GTG GTG CCT ACG ATT TAT AAC ACT TAT TAC AAA 1488
Val Glu Phe Gly Val Val Val Pro Thr Ilě Tyr Asn Thr Tyr Tyr Lys 1000 1005 1010
TCA GCA GGG ACT ACC GTG AAG TAT TTC CGT CCT TAT AGC GTT TAT TGG 1536
Ser Ala Gly Thr Thr Val Lys Tyr Phe Arg Pro Tyr Ser Val Tyr Trp 1015 1020 1025 1030
TCT TAT GGG TAT TCA TTC TAA 1557
Ser Tyr Gly Tyr Ser Phe 1035 (2) INFORMACE O SEK. ID. Č.:4:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 518 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: protein (xi) POPIS SEKVENCE: SEK. ID. Č.:4:
Met 1 Ile Lys Lys Asn 5 Arg Thr Leu Phe Leu 10 Ser Leu Ala Leu Cys 15 Ala
Ser Ile Ser Tyr 20 Ala Glu Asp Asp Gly 25 Gly Phe Phe Thr Val 30 Gly Tyr
Gin Leu Gly 35 Gin Val Met Gin Asp 40 Val Gin Asn Pro Gly 45 Gly Ala Lys
Ser Asd 50 Glu Leu Ala Arg Glu 55 Leu Asn Ala Asp Val 60 Thr Asn Asn Ile
Leu 65 Asn Asn Asn Thr Gly 70 Gly Asn Ile Ala Gly 75 Ala Leu Ser Asn Ala 80
Phe Ser Gin Tyr Leu 85 Tyr Ser Leu Leu Gly 90 Ala Tyr Pro Thr Lys 95 Leu
Asn Gly Ser Asp 100 Val Ser Ala Asn Ala 105 Leu Leu Ser Gly Ala 110 Val Gly
Ser Gly Thr 115 Cys Ala Ala Ala Gly 120 Thr Ala Gly Gly Thr 125 Ser Leu Asn
Thr Gin Ser Thr Cys 130 Thr Val Ala Gly Tyr Tyr Trp Leu Pro Ser Leu
135 140
Thr Asp Arg Ile Leu Ser Thr Ile Gly Ser Gin Thr Asn Tyr Gly Thr
145 150 155 160
Asn Thr Asn Phe Pro Asn Met Gin Gin Gin Leu Thr Tyr Leu Asn Ala
165 170 175
Gly Asn Val Phe Phe Asn Ala Met Asn Lys Ala Leu Glu Asn Lys Asn
180 185 190
Gly Thr Ser Ser Ala Ser Gly Thr Ser Gly Ala Thr Gly Ser Asp Gly
195 200 205
Gin Thr Tyr Ser Thr Gin Ala Ile Gin Tyr Leu Gin Gly Gin Gin Asn
210 215 220
Ile Leu Asn Asn Ala Ala Asn Leu Leu Lys Gin Asp Glu Leu Leu Leu
225 230 235 240
Glu Ala Phe Asn Ser Ala Val Ala Ala Asn Ile Gly Asn Lys Glu Phe
245 250 255
Asn Ser Ala Ala Phe Thr Gly Leu Val Gin Gly Ile Ile Asp Gin Ser
260 265 270
Gin Ala Val Tyr Asn Glu Leu Thr Lys Asn Thr Ile Ser Gly Ser Ala
275 280 285
Val Ile Ser Ala Gly Ile Asn Ser Asn Gin Ala Asn Ala Val Gin Gly
290 295 300
Arg Ala Ser Gin Leu Pro Asn Ala Leu Tyr Asn Ala Gin Val Thr Leu
305 310 315 320
Ásp Lys Ile Asn Ala Leu Asn Asn Gin Val Arg Ser Met Pro Tyr Leu
325 330 335
Pro Gin Phe Arg Ala Gly Asn Ser Arg Ser Thr Asn Ile Leu Asn Gly
340 345 350
Phe Tyr Thr Lys Ile Gly Tyr Lys Gin Phe Phe Gly Lys Lys Arg Asn
355 360 365
Ile Gly Leu Arg Tyr Tyr Gly Phe Phe Ser Tyř Asn Gly Ala Ser Val
370 375 380
Gly Phe Arg Ser Thr Gin Asn Asn Val Gly Leu Tyr Thr Tyr Gly Val
385 390 395 400
Gly Thr Asp Val Leu Tyr Asn Ile Phe Ser Arg Ser Tyr Gin Asn Arg
405 410 415
Ser Val Asp Met Gly Phe Phe Ser Gly Ile Gin Leu Ala Gly Glu Thr
420 425 430
Phe Gin Ser Thr Leu Arg Asp Asp Pro Asn Val Lys Leu His Gly Lys
435 440 445
Ile Asn Asn Thr His Phe Gin Phe Leu Phe Asp Phe Gly Met Arg Met
450 455 460
Asn Phe Gly Lys Leu Asp Gly Lys Ser Asn Arg His Asn Gin His Thr
465 470 475 480
Val Glu Phe Gly Val Val Val Pro Thr Ile Tyr Asn Thr Tyr Tyr Lys
485 490 495
Ser Ala Gly Thr Thr Val Lys Tyr Phe Arg Pro Tyr Ser Val Tyr Trp
500 505 510
Ser Tyr Gly Tyr Ser Phe
515 (2) INFORMACE O SEK. ID. Č.:5:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 656 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET ŘETĚZCŮ: dva (D) TOPOLOGIE: lineární (ix) CHARAKTERISTICKÝ ZNAK:
(A) NÁZEV/KLÍČ: CDS (B) UMÍSTĚNÍ: 567..656 (xi) POPIS SEKVENCE: SEK. ID. Č.:5:
AGATCTATGA ATCTATGATA TCAACACTCT TTTTGATAAA TTTTCTCGAG GTACCGAGCT 60
TGAGGCATCA AATAAAACGA AAGGCTCAGT CGAAAGACTG GGCCTTTCGT TTTATCTGTT 120
GTTTGTCGGT GAACGCTCTC CTGAGTAGGA CAAATCCGCC GGGAGCGGAT TTGAACGTTG 180
CGAAGCAACG GCCCGGAGGG TGGCGGGCAG GACGCCCGCC ATAAACTGCC ACAAGCTCGG 240
TACCGTTGAT CTTCCTATGG TGCACTCTCA GTACAATCTG CTCTGATGCG CTACGTGACT 300
GGGTCATGGC TGCGCCCCGA CACCCGCCAA CACCCGCTGA CGCGCCCTGA CGGGCTTGTC 360
TGCTCCCGGC
420
GGTTTTCACC
480
CGAAATTAAT
540
ATCCGCTTAC
GTCATCACCG
ACGACTCACT
AGACAAGCTG
AAACGCGCGA
ATAGGGAGAC
TGACCGTCTC
GGCCCAGCGC
CACAACGGTT
CGGGAGCTGC
TTCGAACTTC
TCCCTCTAGA
ATGTGTCAGA
TGATAGACTT
AATAATTTTG
TTTAACTTTA AGAAGGAGAT ATACAT ATG AAA CTG ACT CCC AAA GAG TTA GAC 593
Met Lys Leu Thr Pro Lys Glu Leu Asp
520
525
AAG TTG ATG CTC CAC TAC GCT GGA GAA TTG GCT AAA AAA CGC AAA GAA
641
Lys Leu Met Leu His Tyr Ala Gly Glu Leu Ala Lys Lys Arg Lys Glu
530 535 540
AAA GGC ATT AAG CTT
656
Lys Gly Ile Lys Leu
545
(2) INFORMACE O SEK. ID. Č. :6
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 30 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: protein (xi) POPIS SEKVENCE: SEK. ID. Č. :6:
Met 1 Lys Leu Thr Pro 5 Lys Glu Leu Asp Lys Leu 10 Met Leu His Tyr Ala 15
Gly Glu Leu Ala 20 Lys Lys Arg Lys Glu 25 Lys Gly Ile Lys Leu 30

Claims (16)

  1. NÁROKY
    PíZ
    PATENTOVÉ
    1. Rekombinantní oslabený mikrobiální patogen obsahující alespoň jednu molekulu nukleové kyseliny kódující antigen pocházející z mikroorganizmu Helicobacter, kde tento patogen je schopen exprimovat zmíněnou molekulu nukleové kyseliny nebo je schopen vyvolat expresi zmíněné molekuly nukleové kyseliny v cílové buňce.
  2. 2. Patogen podle nároku 1, kde tímto patogenem je nějaká enterobaktérie, zvláště pak buňka Salmonelly.
  3. 3. Patogen podle nároků 1 nebo 2, kde tímto patogenem je mutant aro Salmonelly.
  4. 4. Patogen podle jakéhokoliv z nároků 1 až 3, kde zmíněným antigenem pocházející z Helicobacter je ureáza, podjednotka ureázy, jejich imunologicky reaktivní fragment nebo peptidový mimotop.
  5. 5. Patogen podle jakéhokoliv z nároků 1 až 3, kde zmíněným antigenem pocházející z Helicobacter je polypeptid sekretovaný z Helicobacter, jeho imunologicky reaktivní fragment nebo peptidový mimotop.
  6. 6. Patogen podle jakéhokoliv z nároků 1 až 3 a 5, kde zmíněný antigen pocházející z Helicobacter je vybrán ze skupiny zahrnující antigeny AlpA, AlpB, jejich imunologicky reaktivní fragmenty nebo peptidový mimotop.
  7. 7. Patogen podle jakéhokoliv z nároků 1 až 6, kde zmíněná molekula nukleové kyseliny kódující antigen pocházející z Helicobacter může být exprimována v závislosti na fázi životního cyklu.
  8. 8. Patogen podle nároku 7, kde zmíněná molekula nukleové kyseliny kódující antigen pocházející z Helicobacter je pod kontrolou expresívního signálu, který je v patogenu v podstatě neaktivní, a který může být aktivován reorganizací nukleové kyseliny vyvolané mechanizmem reorganizace nukleové kyseliny v tomto patogenu.
  9. 9. Patogen podle nároku 8, kde tímto expresívním signálem je promotor bakteriofága a aktivace je dosaženo reorganizací DNA, která má za následek produkci odpovídající RNA polymerázy bakteriofága v daném patogenu.
  10. 10. Patogen podle jakéhokoliv z nároků 1 až 9, kde tento patogen dále zahrnuje alespoň jednu další (druhou) molekulu nukleové kyseliny kódující nějaký imunomodulační polypeptid, a kde zmíněný patogen je schopen exprimovat uvedenou druhou molekulu nukleové kyseliny.
  11. 11. Farmaceutický přípravek vyznačující se tím, že tento přípravek zahrnuje jako aktivní složku rekombinantního patogena podle jakéhokoliv z nároků 1 až 10 spolu s (volitelně) farmaceuticky přijatelnými rozpouštědly, nosiči a adjuvans.
  12. 12. Přípravek podle nároku 11 vyznačující se tím, že tímto přípravkem je živá vakcína, která je vhodná pro parenterální aplikaci nebo aplikaci na slizniční povrchy.
  13. 13. Způsob přípravy živé vakcíny vyznačuj ící se tím, že tento způsob zahrnuje formulaci farma54 «
    ceuticky účinného množství oslabeného patogena podle jakéhokoliv z nároků 1 až 10 spolu s farmaceuticky přijatelnými rozpouštědly, nosiči a/nebo adjuvans.
  14. 14. Způsob přípravy rekombinantního oslabeného patogena podle jakéhokoliv z nároků 1 až 10 vyznačující se tím, že tento způsob zahrnuje kroky:
    a) vložení molekuly nukleové kyseliny kódující antigen pocházející z Helicobacter do oslabeného patogena, čímž je vytvořen rekombinantní oslabený patogen, který je schopen exprimovat zmíněnou molekulu nukleové kyseliny nebo je schopen vyvolat expresi této molekuly nukleové kyseliny v cílové buňce; a
    b) kultivaci zmíněného rekombinantního oslabeného patogena za vhodných podmínek.
  15. 15. Způsob podle nároku 14 vyznačující se tím, že zmíněná molekula nukleové kyseliny kódující antigen pocházející z Helicobacter je umístěna na mimochromozomálním plazmidu nebo je vložena do chromozomu.
  16. 16. Způsob použitelný k identifikaci antigenů pocházejících z Helicobacter schopných indukovat ochrannou imunitní reakci v savčím hostiteli vyznačující se tím, že tento způsob zahrnuje kroky:
    a) vytvoření expresívní genové banky mikroorganizmu Helicobacter v oslabeném patogenu a
    b) screening klonů z této genové banky za účelem identi55 fikace klonů schopným indukovat v savčím hostiteli ochrannou imunitní reakci proti infekci mikroorganizmem Helicobacter.
    IV
    Obr. 1
    Obr. 2
    1 AG A7C TAT GAA TCT ATG ATA TCA ACA CTC TTT TTG ΑΤΑ AAT TTT CTC GAG GTA CCG AGC BglII EcoRV Xhol rrnB T1
    60 TTG AGG CAT CAA ATA AAA CGA AAG GCT CAG TCG AAA GAC TGG GCC TTT CGT TTT ATC TGT 120 TGT TTG TCG GTG AAC GCT CTC CTG AGT AGG ACA AAT CCG CCG GGA GCG -35 GAT TTG AAC GTT 180 GCG AAG CAA CGG CCC GGA GGG -10 TGG CGG GCA GGA CGC CCG CCA TAA ACT GCC ACA AGC TCG 240 GTA CCG TTG ATC TTC CTA TGG TGC ACT CTC AGT ACA ATC TGC TCT GAT GCG CTA CGT GAC 300 TGG GTC ATG GCT GCG CCC CGA CAC CCG CCA ACA CCC GCT GAC GCG CCC TGA CGG GCT TGT 360 CTG CTC CCG GCA TCC GCT TAC AGA CAA GCT GTG ACC GTC TCC GGG AGC TGC ATG TGT CAG 420 AGG TTT TCA CCG TCA TCA CCG AAA CGC GCG AGG CCC AGC GCT TCG AAC TTC TGA TAG ACT
    PT7
    4S0 TCG AAA TTA ATA CGA CTC RBS ACT ATA GGG AGA CCA CAA CGG TTT CCC TCT AGA AAT AAT TTT YZ019 down stream box Xbal 540 GTT TAA CTT TAA GAA GGA GAT ATA CAT ATG AAA CTG ACT CCC'AAA GAG TTA GAC AAG TTG Met Lys Leu Thr Pro Lys Glu Leu Asp Lys Leu
    600 ATG CTC CAC TAC GCT GGA GAA TTG GCT AAA AAA CGC AAA GAA AAA GGC ATT AAG CTT Met Leu His Tyr Ala Gly Glu Leu Ala Lys Lys Arg Lys Glu Lys Gly Xle Lys Leu
    5// • · pí/ 4W- au
    Obr. 3 tRNA(Arg) 9in cl Pl _ T7RNAP Km *>φ·^ R
    IdT pYZ88 (vysoká exprese) gin fdT cl Pl T7RNAP Km .-OpYZ84 (střední exprese)
    L . gin fďT cl APL _!°3 77RNAP Km R
    pYZ114 (nízká exprese) • · • · · ·
    Obr. 4
    Absorbance (492 (ureáza*) (ureáza')
    Testovaný antigen a
    • · ·
    Obr. 5 • · ·· ·· • · * «
    99 · 9 • * I • * · 4
    9 · · * · · « • a
    99 ·· říz
    0,6
    Optická hustota (A.
    0,0
    Obr. 6
    0,5
    0/ op
    0,2
    0,1
    • • · • • • • · ·· • • • • • · • · ..··· ··· . • • ·
    Neimunizovaná a neinfikovaná kontrolní skupina
    Kontrolní skupina
    PBS
    Kontrolní SL3261 skupina (pYZ97)
    Salmonella
    SL3261::YZ88 SL3261::YZ84 (pYZ97) (pYZ97)
CZ19991236A 1997-09-01 1997-09-01 Rekombinantní oslabený mikrobiální patogen obsahující alespoň jednu molekulu nukleové kyseliny kódující antigen pocházející z mikroorganizmu Helicobacter CZ123699A3 (cs)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CZ19991236A CZ123699A3 (cs) 1997-09-01 1997-09-01 Rekombinantní oslabený mikrobiální patogen obsahující alespoň jednu molekulu nukleové kyseliny kódující antigen pocházející z mikroorganizmu Helicobacter

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CZ19991236A CZ123699A3 (cs) 1997-09-01 1997-09-01 Rekombinantní oslabený mikrobiální patogen obsahující alespoň jednu molekulu nukleové kyseliny kódující antigen pocházející z mikroorganizmu Helicobacter

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CZ123699A3 true CZ123699A3 (cs) 2000-04-12

Family

ID=5462976

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CZ19991236A CZ123699A3 (cs) 1997-09-01 1997-09-01 Rekombinantní oslabený mikrobiální patogen obsahující alespoň jednu molekulu nukleové kyseliny kódující antigen pocházející z mikroorganizmu Helicobacter

Country Status (1)

Country Link
CZ (1) CZ123699A3 (cs)

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP3380559B2 (ja) ヘリコバクター・ピロリ抗原及びワクチン組成物
Jin et al. JlpA, a novel surface‐exposed lipoprotein specific to Campylobacter jejuni, mediates adherence to host epithelial cells
Chevalier et al. Essential role of Helicobacter pyloriγ‐glutamyltranspeptidase for the colonization of the gastric mucosa of mice
JP3722834B2 (ja) 細菌輸出タンパク質及びそれらをベースとする無菌体ワクチン
US6537558B2 (en) Methods of producing and using virulence attenuated poxR mutant bacteria
JPH07507688A (ja) ジフテリア毒素ワクチン
US6630582B1 (en) Treatment and prevention of helicobacter infection
Ferrero et al. Cloning, expression and sequencing of Helicobacter felis urease genes
JPH04504204A (ja) 病原性のないｐｈｏＰ型微生物を含有するワクチン
EP0618813A1 (en) Antigen of hybrid m protein and carrier for group a streptococcal vaccine
JPH08509873A (ja) ヘリコバクター感染に対する免疫組成物、該組成物に用いられるポリペプチドおよび該ポリペプチドをコードする核酸配列
KR102071743B1 (ko) 신규의 약독화된 시겔라 생백신
AU734635B2 (en) Helicobacter pylori live vaccine
JP2000125889A (ja) アクチノバチルス・プレウロニウモニアからのタンパク質
JP3905128B2 (ja) アクチノバシラス・プリゥロニュウモニエｒｔｘ毒素ａｐｘに対する免疫
EP0770138B1 (fr) Vecteurs de criblage et/ou d&#39;expression fonctionnels chez les mycobacteries
JP2004229667A (ja) ローソニア・イントラセルラリスタンパク質、および関連の方法および材料
US20020161192A1 (en) Helicobacter pylori live vaccine
CN101611143B (zh) 将肽递送入胃粘膜的方法和装置
KR100563218B1 (ko) 비브리오 패혈증균의 접촉 세포독성과 동물 치사작용에 관여하는 독력인자 ｒｔｘ와 연관 유전자들
CZ123699A3 (cs) Rekombinantní oslabený mikrobiální patogen obsahující alespoň jednu molekulu nukleové kyseliny kódující antigen pocházející z mikroorganizmu Helicobacter
KR20030084904A (ko) 헬리코박터 단백질, 핵산 및 그의 용도
JPH1075774A (ja) パスツレラ科の弱毒化ｒｔｘ産生細菌
JP3793889B2 (ja) マイコプラズマ・ハイオニューモニエ抗原を発現する豚丹毒菌および該菌による免疫化方法
WO2000001825A1 (en) HELICOBACTER ANTIGEN (η-GLUTAMYLTRANSPEPTIDASE) AND SEQUENCES ENCODING THE SAME

Legal Events

Date Code Title Description
PD00 Pending as of 2000-06-30 in czech republic