JPH04504204A

JPH04504204A - 病原性のないｐｈｏＰ型微生物を含有するワクチン

Info

Publication number: JPH04504204A
Application number: JP2505536A
Authority: JP
Inventors: カーティス　ザ　サード，ロイ; ギャラン，ジョージ
Original assignee: ワシントンユニバーシティー
Priority date: 1989-03-31
Filing date: 1990-03-23
Publication date: 1992-07-30
Anticipated expiration: 2015-01-31
Also published as: DE69027313D1; AU5356090A; WO1990011687A1; EP0465560A4; EP0465560B1; DK0465560T3; DE69027313T2; ATE138784T1; CA2013573A1; AU645489B2; ES2090129T3; JP3004049B2; CA2013573C; EP0465560A1; US5424065A

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】

ａ）ベーターアスパラギン酸セミアルデヒドデヒドロゲナーゼ（ａｓｄ）をコードする天然の機能性染色体遺伝子を欠き；ｂ）機能性出ポリペプチドをコードする組換え遺伝子を有し、該遺伝子が天然の染色体ニ変異を補足するが、欠失した染色体遺伝子を組換えにより置換することができず；Ｃ）機能性Ａｓｄポリペプチドをコードする組換え遺伝子と免疫原性抗原との間に物理的な結合を有し、機能性Ａｓｄの欠失により細胞の溶解が起こるような環境に細胞が置かれたときに、機能性Ａｓｄポリペプチドをコードする組換え遺伝子の欠失により細胞を溶解させる；７、ヒについての変異体であるサルモネラの単離株であって、該細胞に対して致死性の変異を有し、該致死性の変異を補い、平衡化された宿主−ベクターシステムを構築する、ベクター中の組換え遺伝子により、該変異が平衡化されている、サルモネラの単離株。８、匡についての変異体であり、またデルタ−史デルタ〜近である、サルモネラの単離法。９、　ＡＴＣＣＮｏ、５３８６４．ＡＴＣＣＮｏ、５３８６５．ＡＴＣＣＮｏ、５３８６６、それらの誘導体、およびそれらの変異体でなる群から選択される、サルモネラの単離法。１０、サルモネラによりひき起こされる疾病に対して個体を免疫する方法であって、請求項１のワクチンを該個体に免疫学的に有効な量で投与することを包含する、方法。１１、サルモネラによりひき起こされる疾病に対して個体を免疫する方法であって、請求項２のワクチンを該個体に免疫学的に有効な量で投与することを包含する、方法。１２、サルモネラによりひき起こされる疾病に対して個体を免疫する方法であって、請求項３のワクチンを該個体に免疫学的に有効な量で投与することを包含する、方法。１３、病原性微生物によりひき起こされる病状に対して個体を免疫する方法であって、請求項４のワクチンを該個体に免疫学的に有効な量で投与することを包含する、方法。１４、病原性微生物によりひき起こされる病状に対して個体を免疫する方法であって、請求項５のワクチンを該個体に免疫学的に有効な量で投与することを包含する、方法。１５、病原性微生物によりひき起こされる病状に対して個体を免疫する方法であって、請求項６のワクチンを該個体に免疫学的に有効な量で投与することを包含する、方法。明細書性のないｈｏＰ刑微　を　るワクチン１亙立旦本発明は、ワクチンおよび組換えＤＮＡ発現生産物を調製するための材料および方法に関し、特にワクチン、および抗原を運搬するためのベクターとして有用な遺伝子的に操作された微生物に関する。ｍ獣Ａｍａｎｎ　ｉ、７（ｘＢｒｏｓｉｕｓ　（１９８５）、　Ｇｅｎｅ　４０：１９３゜Ａｓｈｃｒｏｆｔ、　Ｍ、Ｔ、ｆ７　（１９６７）、　Ｌａｎｃｅｔ　ｉｉ：１０５６−１０５７　。Ｂａｃｏｎ、　Ｇ、Ａ、Ｉ、　（１９５１）、　Ｂｒ１ｔ、　Ｊ、　ＥＸｐ、　Ｐａｔｈｏｌ。Ｂｉｒｎｂｏｉｍ、　Ｈ，Ｃ，（１９８３）、　Ｍｅｔｈｏｄｓ　Ｅｎｚｙｍｏｌ、１００＝２４３−２５５゜（以下余白）Ｂｏｃｈｎｅｒ、Ｂ、Ｒ，ら　（１９８３）、Ｊ、Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ。１４３：９２６−９３３゜Ｂｒｏｗｎ、ｋ、ｒ　ら　（１９８７）、　去巨旦（１）　：８６８６−９２Ｂｒｏ、　Ｒ，Ｆ、、　５ｔｏｃｋｅｒ、　Ｂ、Ａ、Ｄ、、　（１９８７）、　Ｉｎｆｅｃ。Ｉｍｍｕｎ、且（４）　：　８９２−８９８　。Ｃｈｉｋａｕｎｉ、　Ｇ、に、’：）　（１９８５）、工ｎｆｅｃｔ、　Ｉｍｍｕｎ。５０：４２０−４２４゜Ｃ１ａｒｋ、　Ｒ，Ｃ，ｔ　Ｇｙｌｅｓ、　Ｃ，Ｌ、、　（１９８７）、　Ｃａｎ、　Ｊ、　Ｖｅｔ。Ｒ＠ｔｓ、、　５５（１）：３２−３８゜Ｃｌｅｍｅｎｔｓ、　Ｊ、Ｄ、　ｙｌｖＭｏｒｓＭｄｙ、　Ｓ、　（１９８４）、　Ｉｎｆｅｃｔ。Ｉｍｍｕｎ、４６：５６４〜５６９゜Ｃｏ１１ｉｎｓ、　Ｆ、Ｍ、　（１９７４）、　３Ｂ＋３７１−４０２゜Ｃｏ１１ｉｎｓ、Ｆ、Ｍ、　ら　（１９６６）、Ｊ、Ｅｘｐ、Ｍｅｄ。１２４＋６０１−６１９゜Ｃａｒｄｉｎｅａｕ　ＨＪＩ／Ｃｕｒｔｉｓｓ　（１９８））、Ｊ、Ｂｉｏ、Ｃｈｅｍ。Ｃｕｒｔｉｓｓ、Ｒ，Ｉ工：ｆ　’Ｊ＞’ＦびＫｅｌｌｙ、Ｓ、Ｍ、（１９８７）、Ｉｎｆｅｃｔ。Ｃｕｒｔｉｓｓ、　Ｒ，Ｉエエｌ；（１９ｅｅｂ）、　ｉｎ　ｖ工ＲＵＬＥＮＣＥＭＥＣ！（ＡＮ工ＳＭＳ　ＯＦ　ＢＡＣＴＥＲＩＡＬ　ＰＡＴＨＯＧＥＮＳ　（Ｒｏｔｈ、　Ｊ、、　’ｍ　、　ＡｍｅｒｉｃａｎＳｏｃｉｅｔｙ　ｆｏｒ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ、　Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ　ｏ、ｃ、）　ｐｐ、　３１１−３２８゜ＤＮＡ　ＣＬＯＮＩＮＧ、Ｖｏｌｕｍｅｓ　Ｉ　ろ７１１工　（Ｄ、Ｎ、ＧＩＯＶｅｒ＋　ＩＪＩ　＋Ｌ９［３５）　。Ｄａｖｉｓ、Ｒ，Ｗ、、Ｂｏｔｓｔｅｉｎ、Ｄ、、７，７ゾＲｏｔｈ、Ｊ、只。ＡＤＶＡＮＣＥＤ　ＢＡＣＴＥＲ工ＡＬ　ＧＥＮＥＴ工Ｃ３，Ａ　ＭＡＮｔＪＡＬ　ＦＯＲＧＥＮＥＴ工ＣＥＮＧ工ＮＥＥＲＩＮＧ、　（Ｃｏｌｄ　ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、　Ｃｏ１ｄ　ＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ、　Ｎ、Ｙ、、１９８０）。Ｄｏｕｇａｎ、　Ｇ、、１７　、　（１９８７）、　Ｍｏ１．　Ｇｅｎ、　Ｇｅｎｅｔ。％）７（２−３）　：４０２−４０５゜Ｅｄｗａｒｄｓ、　Ｍ、Ｆ’、、　Ｓセｏｃｋｅｒ、　Ｂ、Ａ、Ｄ、（１９８８）、　Ｊ。Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、１７０（９）＝３９９１−３９９５゜Ｆｉｅｌｄｓ、　Ｐ、工、Ｃ７，（１９Ｂ９）、　５ｃｉｅｎｃｓ　２４３：１０５９−１０６１゜Ｆｉｅｌｄｓ、　Ｐ、１．、　Ｓｗａｎｓｏｎ、　Ｒ，Ｖ、（１９８６）、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ。Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ、　８３（１４）：５１８９−５１９３Ｆｏｒｍａｌｚ　Ｓ、Ｂ、９　、　（１９８１）、　Ｉｎｆｅｃｔ、　工ｍｍｕｎ。３４ニア４６−７５０゜Ｆｕｋａｓａｗａ、　Ｔ、　％＞Ｊ　Ｎ１ｋａｉｄｏ、　Ｈ，（１９５９）、　ＮａｔｕｒｅｌＥ１４：１１６７−１１６９゜Ｇｅｒｍａｎｉｅｒ、　Ｒ，Ｈ＞ｔ、ｐ’Ｆｕｒｅｒ、　Ｅ、　（１９７５）、　Ｊ、　Ｉｎｆｅｃｔ。ｄｉｓ、１３１：５５３−５５８゜Ｇｕｌｉｇ、　Ｐ、Ａ、　７．−４Ｔｊ’Ｃｕｒｔｉｓｓ、　Ｒ，ＩＪＩ（１９８７）、　Ｋｎｆｅｃｔ。Ｉｍｍｕｎ、５５：８９１−９０！。ＨＡＮＤＢＯＯＫ　ＯＦ　ＥＸＰＥＲ工ＩＱ：ＮＴＡＬ　ＩＫＭＵＮＯＬＯＧＹ、Ｖｏｌｕｍｅｓ　工−工Ｖ　（Ｄ、Ｍ、　Ｗｅｉｒ　７ｙ・Ｐｖ”Ｃ，Ｃ，Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ　Ｑ　１９８６．　ＢｌａｃｋｗｅｌｌＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ　Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ）。ＨｉｔｃｈｃｏｃｋｌＰ−Ｊ−７５Ｊｐ’　Ｂｒｏｗｎ、　Ｔ−Ｍ、（１９Ｂ３）　／　Ｊ　−Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、１５４＋２６９−２７７゜Ｈｏ１ｓｅｔｈ、Ｓ−’Ｊ”４ｙ’５ｔＯＣｋｅｒ、Ｂ、Ａ、Ｄ、（１９８１）、Ｎａｔｕｒｅ２４１：２３８−２３９゜Ｈｏｎｅ、　Ｄ、、　’７　（１９８７）、　Ｊ、　Ｉｎｆｅｃｔ、　Ｄｉｓ、。ｙ但（１）：１６７−１７４゜Ｋａｈｎ　Ｃ，（１９７９）、Ｍｅｔｈ、Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ　６旦？２６Ｂ。Ｋｌｅｃｋｎｅｒ　Ｃ，（１９７７）、　Ｊ、　Ｍｏ１．　Ｂｉｏｌ、　１１６：１２５゜Ｌａｅｍｍｌｊ　肌に、　（１９７０）、Ｎａｔｕｒｅ　２２７：６８０−６８５゜Ｌｉ５ｓｎｅｒ、　Ｃ，Ｒ，ｃ）（１９８３）、　Ｊ、　Ｉｍｍｕｎｏｌ。１３１：３００６−３０１３゜Ｌｅｎｎｏｘ、　Ｅ、Ｓ、　（１９５５）、　Ｖｉｒｏｌｏｇｙ　１：１９０− ２０６゜工ＮＧ：　Ａ　ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ　ＭＡＮＵＭ、　（Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ。１９８２）　。ＭＥＴＨＯＤＳ　ＸＮ　ＥＮＺＹＭＯＬＯＧＹ　（Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ、　工ｎｃ、）；Ｍａｎｏｉｌ、　Ｃ，、Ｑ’ＦゾＢｅｃｋｗｉｔｈ、　Ｊ、　（１９８５）、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ。Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ　８２：８１２９−８１３３゜Ｍａｓｋｅｌｌ、　Ｄ、Ｊ、　ｔ、　（１９８７）、　Ｍｉｃｒｏｂ、　Ｐａｔｈｏｇｅｎ。２＝２１１−２２１゜ＭｃＦａｒｌａｎｄ、Ｗ、Ｃ，Ｌｔｄ”ｓヒｏｃｋｅｒ、Ｂ、Ａ、Ｄ、（１９８７）。Ｍｉｃｒｏｂ、　Ｐａｔｈｏｇｅｎ、　３：１２９−１４１゜Ｍｉｌｌｅｒ、　Ｊ、Ｆ、　９　（１９８９）、　５ｃｉｅｎｃｅ　２４３：９１６−９２２゜Ｍｉｌｌｅｒ、　Ｖ、Ｌ、　’Ｆｙ’ＦゲＭｅｋａｌａｎｏｓ、　Ｊ、Ｊ、　（１９８４）、　Ｐｒｏｃ。Ｎａｔｌ、　Ａｃａｃｉ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ且：　３４７１−３４７５゜Ｍｉｌｌｅｒ、　ＥＸＰＥＲ工ＫＥＮＴＳ　ＩＮ　ＭＯＬＥＣＵＬＡＪＬ　ＧＥＮＥＴＸＣ５（１９７２＋Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）　。Ｍｉｙａｋａ　１７　（１９７２）、　Ｊ、　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、　１１２：９５０゜Ｍｏｒｒｉｓ、　Ｈ，Ａ、Ｃ，（１９１３５）、　Ｌａｎｃｅｔ　ｉ＝　１４７２−１４７４゜Ｍｕｋｋｕｒ、　Ｔ、に、Ｓ、　（、（１９８７）、　Ｊ、　Ｍｅｄ、　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ。２４　：１ｌ−１９゜Ｎａｋａｙａｍａ　ｌ、　（１９８８）、　Ｂｉｏｔｅｃｈ、　６＋６９３゜Ｎｅ１ｈａｒｄｔ、　Ｆ、Ｃ０う　（１９７４）、　Ｊ、　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ。１１９ニア３６−７４７゜ＮＵＣＬＥＩＣＡＣＩＤ　ＨＹＢＲよりＩＺＡτ工ＯＮ　（Ｂ、Ｄ、　Ｈａｍｅｓ＃７ｇＳ、Ｊ。Ｈｉｇｇｉｎｓ　＃ｋｔ　１９８４）。０’Ｃａｌｌａｇｈａｎ、　Ｄ、　Ｌ）（１９８８）、　Ｉｎｆｅｃｔ、　Ｉｍｍｕｎ。５６：４１９−４２３゜０ｈｔａ、　Ｍ、、　Ｉ；　（１９８７）、　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、　Ｉｍｍｕｎｏｌ、。３１（１２Ｊ：Ｌ２５ター１２６５゜ｏＬＩＣｏＮＵｃＬｚｏｒｘｏＥｓｙｎＴ！（Ｅｓｒｓ　（Ｍ、Ｊ、　Ｇａ１ｔ　Ｒ１９８４）。０’Ｃａｌｌａｇｈａｎ、　Ｄ、に（１９８日）、　Ｉｎｆｅｃｔ、　Ｉｍｍｕｎ。５６：４１９−４２３゜Ｐｅｒｂａｌ、Ａ　ＰＲＡＣＴ工ＣＡＬＧＵよりＥ　Ｔｏ　ＭＯＬＥＣＵＬＡＲＣＬＯＮＩＮＧ（１９８４）。ＲＯｂｅｒｔＳＯｎ、　Ｊ、Ａ、９　（１９８３）、　ＩｎｆｅＣｔ、　Ｉｍｍｕｎ。４１ニア４２−７５０゜５ａｎｄｅｒｓｏｎｈ″ｔび°Ｒｏｔｈ　ｉｎ　ＧＥＮＥＴ工ＣＫＡＰＳ　１９８７　（Ｓ、Ｊ。０’Ｂｒ１ｅｎ　Ｂ　、Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　１（ａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）　ｐｐ、　１５５−１７７゜Ｓｃｈｍｅｉｇｅｒ、　）（、（１９７２１，Ｍｏ１．　Ｇｅｎ、　Ｇｅｎｅｔ、１１９ニア５−８８゜５ｃｈｎｅｉｄｅｒ、Ｈ，Ａ、Ｊ５Ｆ９’Ｚｉｎｇｅｒｍ、Ｎ、Ｄ、　（ユ９５６）、Ｊ。Ｅｘｐ、　Ｍｅｄ、１０３：２０７−２２３゜５ｔｅｖｅｎｓｏｎ、　Ｇ、　Ｔ＞ＪｔＪ’Ｍａｎｎｉｎｇ、　Ｐ、Ａ、（１９８５）、　ＦＥＭＳＭｉｃｒｏｂｉｏ、Ｌｅｔｔｅｒｓ　２８：３１７−３２１゜Ｔｏｈ−Ｅ、　Ａ、＋７　（１９７３）、　Ｊ、　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、　１１３ニア２７−７３８゜Ｔｓａｉ、　Ｃ，Ｍ、ち・ｔｄ’Ｆｒａｓｃｈ、　Ｃ，Ｅ、　（１９８２）、　Ａｎａｌ。Ｂｉｏｃｈｅｍ、１１９：１１５−１１９゜ＶＥＣＴＯＲ５：　Ａ　５ＵＲＶＥＹ　ＯＦ　ＭＯＬＥＣＵＬＡＲＣＬＯＮＩＮＧ　ＶＥＣＴＯＲ９ＡＮＤ　ＴＨＥ工ＲＵＳＥＳ　（Ｒ，Ｌ、　Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚ３４ｔ）’Ｄ、Ｔ、　Ｄｅｎｈａｒｄｔ　％　。１９８７、Ｂｕｔｔｅｒｗｏｒｔｈｓ）；Ｗｉｌｓｏｎ、Ａ、Ｄ、、５ｔｏｃｋｅｒ、Ｂ、Ａ、Ｄ、、ＡＮＮＵＡＬルＥＴ工ＮＧ　ＯＦτＨＥ　ＡＭＥＲ工ＣＡＮ　ＳＯＣ工ＥＴＹ　ＦＯＲＭ工ＣＲＯＢＩＯＬＯＧＹ、Ｍｉａｍｉ　Ｂｅａｃｈ。Ｆｌｏｒｉｄａ、Ｍａｙ　８−１３．１９８８゜Ａｂｓｔｒ、Ａｎｎｕ、Ｍｅｅｔ、Ａｍ、Ｓｏｃ、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、５８（ｏ）。ＣＩ、′々下ネー）！見従来から使用されてきた感染病に対するワクチンは、一般に次の４つに分類される：（Ｉ）無処置の抗原、その断片、あるいは天然抗原またはエピトープの合成アナログを含む病原体からの特異的な成分、（１１）抗イデイオタイプ抗体、Ｃ１１Ｉ）全死病原体、または（ｒｖ）生ワクチンとしての病原体の無毒性（弱毒性）誘導体。弱毒性ワクチンは、免疫に対するその効力に関して、天然の感染と同様に作用するという利点を有している。弱毒性ワクチンは、宿主中で増殖し、免疫原性である場合には、抗体の長期にわたる生産を刺激し、細胞性応答を誘導し、侵入口において抗体の生産と抵抗を誘導する。潜在的に病原性の菌株へ変異を導入することによって、無毒性菌株を発育させることが可能であるが、その結果、変異株の、宿主中に生存する能力が低下する。弱毒性微生物の使用原理は、Ｓａ１ｍｏｎｅｌｌａシステムを参照すると例示されているが、この原理は、広範囲に適用され得る。弱毒化が、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａの無毒性（病原性のない）ｍ株の発達に関して価値があった理由は２つある。［例えば、無毒性菌株の発達に関しては、Ｂａｃｏｎら、（１９５１）、Ｃｕｒｔ　ｊｓｓおよびＫｅｆｌｙ　（１９８７）、ＧｅｒｍａｎｉｅｒおよびＦｕｒｅｒ　（１９７５）、およびＨｏ１ｓｅｔｈおよび５ｔｏｃｋｅｒ　（１９１１１）を参照のことコ。第１に、ヒトおよび動物において、異なる種のＳａｌｍｏｎｅｌ　ｌａ感染に対する防御的免疫応答を誘導することを含めて、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａの生きた弱毒性菌株の方が、死菌またはサブユニットワクチンよりもより効果的であるという証拠が多数存在することである。［Ｈｏ１ｓｅｔｈおよび５ｔｏｃｋｅｒ　（１９８１）ＨＡｓｈｃｒｏｆｔら、（１９８７）、Ｃｏ１１ｉｎｓ　（１９７４）；　Ｃｏ１１ｉｎｓら、（１９６６）　；Ｍｕｋｋｕｒら、（１９８７）　、およびＲｏｂｅｒｔｓＯｎら、（１９８３）］　ｃ＋第２に、侵騒性を有するＳａｌｍｏｎｅｌ　Ｉａ属に属するもの、例えば、Ｌ■貼山門ユ岨およびＳ、　ｕ刀江は、経口摂取後組織に付着、侵入し、腸管付属リンパ組織（ＧＡＬＴ、バイエル板）の細胞中で増殖することにより組織深部に入る。［例えば、ＣａｒｔｅｒおよびＣｏ１１ｉｎｓ　（１９７４）を参照のことコ。斗。江蝕］！■姐の無毒性株は、これらの抗原に対する分泌性、細胞性および体液性免疫応答を刺激する手段として、この部位に異種の抗原を運搬するのに使用されている。［ＣｌｅｍｅｎｔｓおよびＥｌ−Ｍｏｒｓｈｉｄｙ　（１９８４）：　Ｃｕｒｔｉｓｓら、（１９８６）；　Ｃｕｒｔｉｓｓ。（１９８８ａ）；　Ｃｕｒｔｉｓｓ、　（１９８８ｂ）；　Ｆｏｒ＋ｎａｌら　（１９８１）：　およびＭａｓｋａｌｌら（１９８７）］。５ａｌＩＩｌｏｎｅｌｌａを無毒性にするために、様々な異なる方法が使用されている。これらの方法には、ａｒｏＡ　［Ｈｏ１ｓｅｔｈおよびＳｔ。ｅｋｅｒ　（１９８１）］、ａｓｄまたはｔ！ＬＬ［Ｃｕｒｔｉｓｓら（１９８５）］、またはプリン生合成において欠陥を有する株のような栄養要求性変異株［ＭｃＦａｒｌａｎｄおよび５ｔｏｃｋｅｒ　（１９８７）：　Ｏ’ＣａｌＩａｇｈａｎら、（１９８８）］、■且［Ｇ　ｅ　ｒ　ｍ　ａ　ｎ　ｉ　ｅ　ｒおよびＦｕｒｅｒ　１９７５；　ＦｕｋａｓａｖａおよびＮ１ｋａｉｄ。（１９５９）：　５ｔｅｖｅｎｓｏｎおよびＭａｎｎｉｎｇ　（１９８５）］のような炭水化物の使用または合成において変化された変異株、温度感受性変異株（Ｍｏｒｒｉｓら、（１９８５）］およびｃＬ！Ｌ口上［ＣｕｒｔｉｓｓおよびＫｅｌｌｙ（１９８７）１のような全体的な遺伝子発現において変化された変異株が含まれる。これらの変異株は試験され、使用されて、宿主、細菌種および免疫法の経路に応じて異なる程度の成果を挙げるという驚くべき結果が得られている。［ＣｌｅｍｅｎｔｓおよびＥｌ−Ｍｏｒｓｈｉｄｙ　（１９８４）ＨＣｕｒｔｉｓｓら、（１９８８ａ）；　Ｃｕｒｔｉｓｓら、（１９８８ｂ）、　ＯｏＣａｌｌａｇｈａｎら、（１９８８）］。ｌ豆旦笠丞サルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌ　ｌａ）の病原性の高い菌株由来の−Ｐ変異株は、野生型親株のしＤ５Ｉｌ投与量よりも１桁以上多い投与量でも無毒性であり、ＧＡＬＴに限定された感染のみを示したが、これらの変異株は、免疫原性であり、野生型株の感染を高いレベルで防御した。本発明の様々な実施態様は、Ｓａ　１ｍ＋坦ｅＪＪ３−における匡変異株または他のタイプの微生物における吐吐型変異に相等する変異株の無毒性および免疫原性の特徴を利用している。従って、本発明の１つの実施態様は、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａによって引き起こされる個体の病状を処置するためのワクチンであり、このワクチンは、免疫原性を有する吐堕変異株である、病原性のないＳａｌｍｏｎｅｌｌａ、および薬学上受容可能な賦形剤を含有する。本発明の他の実施態様は、上記のワクチンであり、ここで、病原性のない、ａｎ匹虹口は、それが由来するところの野生型本発明のさらに他の実施態様は、病原性微生物によって引き起こされる個体の病状を処置するためのワクチンであり、ここで１．ワクチンは、免疫原性を有する病原性のない吐旺変異株であるキャリアＳａ１ｍｏｎｅｌｌａ細胞を含み、キャリア細胞は、該病原性微生物の免疫原性抗原をコードする組換え発現ベクターで形質転換される。また、この実施態様で意図されるのは、キャリアＳａ１ｍｏｎｅｌｌａ細胞が、この細胞に対して致死性の変異を含み、その致死性変異を補って平衡を保つ致死性宿主−ベクターシステムを成立させるベクター中の組換え遺伝子によって平衡を保たれる、ワクチンである。本発明の他の実施態様は、吐旺における変異株であり、細胞に対して致死性の変異を含み、致死性の変異を補って平衡を保つ致死性宿主−ベクターシステムを構成するベクター中の組換え遺伝子によって該変異が平衡を保たれる、Ｓａｌｍｏｎｅｌ胎、の単離された菌株である。本発明のさらに他の実施態様は、二における変異株であり、ｄｅＨａ−史ｄｅｌｔａ−虹２でもある、Ｓａｌｍｏｎｅｌ　ｌａの単離された菌株である。本発明のさらに他の実施態様は、ＡＴＣＣＮｏ、　５３８６４、ＡＴＣＣＮｏ、　５３８６５、ＡＴＣＣＮｏ、　５３８６６、その誘導体およびその変異株からなる群から選択される、Ｓａｌｍｏｎｅｌ　ｌａの単離された菌株である。本発明の他の実施態様は、個体を免疫化する方法を含む。これらの方法は、Ｓａｌｍｏｎｅｌ　ｌａによって引き起こされる疾病に対して個体を免疫する方法を包含し、該方法は、該個体に、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａによって引き起こされる病状を有する個体を処置するためのワクチンを免疫学的に有効な量で投与することを包含し、このワクチンは吐吐変異体であり免疫原性を有する病原性のないｈ−姐虹ｎを含有する。これらの方法はまた、上記のワクチンを免疫学上有効な投与量で個体に投与することによりＳａｌｍｏｎｅｌｌａによって引き起こされる病気に対して個体を免疫することを含み、ここで、病原性のないＳａｌｍｏｎｅｌｌａは、それが由来するところの野生型のＳａｌｍｏｎｅｌｌａの病原性を低下させる少なくとも１つの他の変異を有する。本発明には、Ｓａｌｍｏｎｅｌ　Ｉａによって引き起こされる病気に対して個体を免疫化する方法もまた含まれ、この方法は、病原性微生物によって引き起こされる個体の病状を処置するためのワクチンを該個体に投与して免疫することを含み、ここで該ワクチンは、病原性のない免疫原性匝吐変異株であるキャリア江ｍ並吐ム細胞を含み、このキャリア細胞は、該病原性微生物由来の免疫原性抗原をコードする組換え発現ベクターで形質転換されている。また、この実施態様で意図されるのは、キャリア■組坦１ｎ細胞が、この細胞に対して致死性の変異を含み、致死性の変異を補って平衡を保つ致死性宿主−ベクターシステムを構成するベクター中の組換え遺伝子によって平衡が保たれる、ワクチンである。免疫は、免疫学上有効な投与量で行図１は、Ｃｈｉ３６８？已株およびＣｈｉＨ８１野生型株を接種した後のマウスのバイエル板から得られたＣＦＵを示す。図２は、Ｃｈｉ３６８７区株およびＣｈｉ３１８１野生型株を接種した後のマウスの膵臓から得られたＣＦＵを示す。日を　るための乏熊Ａ０区豆「組換え宿主細胞」、「宿主細胞」、「細胞」および微生物を示すその他の用語は、互換的に使用され、組み替えベクターまたは他の移入されたＤＮＡの受容体として使用され得、または使用されている細胞のことをさしており、トランスフェクトされたオリジナル細胞の子孫を含む。単一親細胞の子孫は、偶発的または意図的な変異のために、ゲノムまたは全ての補完的ＤＮＡにおいて、オリジナルの親細胞と全く同一である必要はない。例えば、ビにおける変異から生じる病原性の消失を含む親細胞の特性に関連する特性によって特徴つけられる、親細胞に十分に類似した親細胞の子孫が含まれる。「制御配列」は、それが連結するコード配列を発現させるのに必要なりＮＡ配列をさしていう。一般に、このような制御配列ニハ、プロモーターおよびリポソーム結合部位が含まレル。用語「制御配列」は、少なくとも、その存在が発現に必要なすべての成分を含むものとし、その存在が有利である他の成分、例えばオペレーターをも含み得る。「作動可能に結合された」は、上記の成分を、目的とする方法で機能させ得る関係にある、並列する位置をさしていう。フード配列に「作動可能に結合された」制御配列は、コード配列の発現が制御配列に適合する条件下で成し遂げられるように、連結される。「レプリコン」は、すべての遺伝子要素であり、例えば、細胞内でポリヌクレオチド複製の自立的単位として機能する、すなわち、それ自身の制御下で複製することが可能な、プラスミド、染色体およびウィルスのことである。「ベクター」は、他のポリヌクレオチドセグメントが付加されて、付加セグメントの複製および／または発現を引き起こすレプリコンのことである。「コード配列」は、適切な制御配列の制御下に置かれると、ｍＲＮＡに転写および／またはポリペプチドに翻訳されるポリヌクレオチド配列のことである。コード配列の境界は、５′末端の翻訳開始コドンおよび３′末端の翻訳停止コドンによって決定される。コード配列は、ｃＤＮＡを含むがそれだけに限定されず、組換えポリヌクレオチド配列を含み得る。本願で使用される用語「発現ベクター」は、目的とするコード配列が作動可能に制御配列に結合されているベクターを「グラム陰性細菌」は、球菌、非腸内桿菌および腸内桿菌を含む。グラム陰性細菌の属は、例えば、Ｎｅ１ｓｓｅｒｉａ、　１二ｄｅｓ、　Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ、　江瓜ム旦区、　Ａ　ｒｏｂａｃｔｅ　ｊｕｍ、　ロ」回１ハ虹、陣工己上１ａ、５ｅｒｒａｔｉａ、Ｖｉｂｒｉｏ、Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ、以匡ト■彊ユ。「グラム陽性細菌」は、球菌、非胞子形成桿菌および胞子形成桿菌を含む。グラム陽性細菌の属は、例えば、紅旦匹肚皿１１ジ二姐である。「ミコバクテリア」は、特有の着色特性、すなわち、酸性化有機溶剤による脱色に対する抵抗に基づいて、および長鎖（およそ６０個の炭素）ミコール酸の存在によって定義される。「通性細胞内病原菌」は、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ、　Ｙｅｒｓｉｎｉａ、　Ｐａ５ｔｅｕ「処置」は、防御免疫応答をする個体にワクチンを投与することをさしており、予防処置法および／または療法を含む。「天然の染色体遺伝子」は、野生型生物体の染色体中に発生するものであり、例えば、ｇ、　ｃｏｌｉまたはＳａｌｍｏｎｅｌｌａにおけるアスパラギンセミアルデヒドデヒドロゲナーゼ（匹）をコードする遺伝子、アラニンラセマーゼをコードする遺伝子およびＤ−アラニル−Ｄ−アラニンリガーゼをコードする遺伝子である。天然の遺伝子の他の例は、以下に記載されている。本願で使用される、「組換え遺伝子」は、天然では、太きなポリヌクレオチド分子と共に見いだされない、この分子内のポリヌクレオチドの同定可能なセグメントとして定義される。組換え遺伝子は、ゲノム、ｃ　Ｄ　Ｎ　Ａ　ｓ半合成または合成起源であり得る。ＤＮＡ構築物の「異種（非相同、ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓ）　Ｊ領域は、他のＤＮＡ分子内またはＤＮＡ分子に付加された同定可能なりＮＡのセグメントであり、天然においては、該他の分子と共には見いだされない。従って、異種領域が、細菌遺伝子をコードする場合には、この遺伝子の側面には、通常、細菌源のゲノム内の細菌遺伝子に隣接しないＤＮＡが接する。異種コード配列の他の例は、コード配列自身が天然で発見されない、構築物（例えば、天然の遺伝子とは異なるコドンを有する合成配列）である。対立遺伝子変異または天然に発生する変異は、本願で使用されるような、ＤＮＡの異種領域を提供しない。本願で使用される、ｒＤＡＰＪは、ジアミノピメリン酸の両方の立体異性体およびその塩、すなわち、特に記載されなければ、ＬＬ−およびｍｅｓｏ−形態である。本願で使用される変異菌株の遺伝子記号は、Ｂａｃｈ＋ｏａｒ＋ｎ　（１９８７）および５ａｎｄｅｒｓｏｎおよびＲｏｔｈ　（１９８７）によって記載されるものである。トランスポゾン、特にＴｎｌＯに使用される記号は、Ｂｕｋｈａｒｉら（１９７７）に記載される慣例に従う。本発明のワクチンで処理された「個体」は、例えば、家畜およびヒトを含む哺乳類、飼い鳥を含む様々な種類の鳥類、特に農業上重要なもののような、すべてのを椎動物を含むものとして本願では定義されている。さらに、軟体動物およびある種の他の無を椎動物は、原始免疫システムを有しており、「個体」として含まれる。本願で使用される、「形質転換」は、挿入の方法、例えば、直接的な取り込み、電気搾孔、形質導入または接合に関係なく、宿主細胞に外因性ポリヌクレオチドを挿入することをさしていう。外因性ポリヌクレオチドは、プラスミドとして維持され得、あるいは、ポリヌクレオチドの全体または部分が、宿主ゲノム内に統合され得る。本願で使用される、「並記遺伝子またはその等価物」は、他の遺伝子の発現を制御する生産物をコードし、病原性の特質（例えば、コロニー形成の促進、侵語性、感染した個体に対する損傷および遺伝防御ネットワークにおけるマクロファージまたは細胞内での生存）をコードする遺伝子座、およびホスファターゼをコードする遺伝子、例えばＳａｌｍｏｎｅｌｌａにおける吐吐を含む、遺伝子をさしていう。「ビ遺伝子またはその等価物」を含み得る生物体は、腸内細菌の科のすべて（例えば、旦、　ｃａｌｆ、　Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ、ヒ立罰ｕｓ、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ、　５ｅｒｒａｔｉａ、　Ｐｒｏｖｉｄｅｎｃｉａ、　Ｃ１ｔｒｏｂａｃｔｅｒ、　Ｅｄｖａｒｄｓｉｅｌｌａ、　ＨａｆｎｉａおよびＥｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ）　、他の細菌の属（例えば、Ｓｔａ　ｈ　ｏｃｏｃｃｕｓ、　Ｒ１１ｎ坦庄ｕｍ、　Ｍ　ｃｏｂａｃｔｅｒ’ｕｍ、　Ａｅｒ。ｂａｃｔｅｒ、　Ａｌｃａｌｉ　ｅｎｅｓおよびＢａｃｉｌｌｕｓ、およびいくつかのＣａｎｄｉｄａ橿）を含む。ビ生産物は、酸性ホスファターゼの調節因子である［Ｉ［ｉｅｒら、（１９７９）］。本願で使用される、「病原性微生物」は、病原に関連した病状を引き起こす。「病原性のない（病原性を消失した、ａｖｉｒｕｌｅｎｔ）微生物」は、感染個体内でのコロニー形成および複製能力を有しているが、同一種の病原性（ｖｉｒｕｌｅｎｔ）菌株に関連する病状を引き起こさないものである。病原性がないということ（ａｖｉｒｕｌｅｎｔ）は、その属また種の微生物が、病原（ｐａｔｈｏｇａｎ）として全く機能し得ないことを意味するのではなく、使用される特定の微生物が、処置される特定の動物に対して病原性がないことを意味する。微生物は、通常、病原性である属または種に属し得るが、病原性のない菌株に属さなければならない。病原性消失（ａｖｉｒｕｌｅｎｔ）菌株は、その病原性を消失していない（ｖｉｒｕｌｅｎｔ）菌株に関連する病状のすべてを導入することはできない。微生物の病原性消失菌株は、変異によって病原性菌株から得られ得る。本願で使用される、用語「微生物」は、細菌、原虫類および単細胞真菌類を含む。「キャリア」微生物は、上記のように定義された病原性消失微生物であって、目的のタンパク質をコードする組換え遺伝子を含み発現する。本願で使用されるように、「キャリア微生物」は、組換え宿主細胞の形態である。「抗原」は、宿主の免疫システムを刺激し、分泌、体液性および／または細胞性の抗原特異性免疫応答を引き起こす、１つまたはそれ以上のエピトープを含む分子をさしていう。この用語はまた、「免疫原」と互換的に使用される。「ハブテン」は、それ自身では宿主免疫システムを刺激して分泌性、体液性または細胞性免疫応答をさせない、１つまたはそれ以上のエピトープを含む分子をさしていう。用語「エピトープ」は、抗原またはハブテン上の部位をさしており、この部位において特異的な抗体がこの抗原またはハブテンに結合する。エピトープは、エピトープに特有の配座内に３個のアミノ酸を含み、通常、エピトープは、少なくとも５個のこのようなアミノ酸、さらに一般には、少なくと６８から１０個のこのようなアミノ酸から構成される。この用語はまた、「抗原決定基」または「抗原決定部位」と交代で使用される。組成物またはワクチンに対する「免疫応答」は、目的とする組成物またはワクチンに対する細胞および／または抗体媒介の免疫応答が宿主内で起こることである。通常、このような応答は、組成物またはワクチンに含まれる１つまたはそれ以上の抗原に特異的な抗体を産生ずるもの、Ｂ細胞、ヘルパーＴ細胞、サプレッサーＴ細胞および／または細胞障害性Ｔ細胞からなる。「ワクチン組成物」は、将来の損害が防御されるように、生きた生物体の免疫システムを刺激するために使用される薬剤を意味する。「免疫化」は、１９２８球が、病原体を殺すか、および／または他の細胞（たとえば食細胞）を活性化させ得る、高いレベルで持続する抗体および／または細胞性免疫応答を引き起こす方法をさしており、この免疫化は、生物体が以前にさらされた病原体または抗原に対して行われる。用語「免疫システム」は、例えば、インターフェロンの生産のような、異物の存在に対する単細胞生物体の応答を含み得るが、本出願では、この用語は、解剖学上の形態を持つものおよび、多細胞生物体がその細胞または細胞外液に侵入する抗原物質に対する抗体を生産する機構に限定される。このようにして生産された抗体は、イムノグロブリンＡ、Ｄ、Ｅ。ＧまたはＭのような免疫学上のどのクラスにも属し得る。特に関心のあるのは、イムノグロブリンＡ（ＩｇＡ）の生産を刺激するワクチンである。なぜなら、このワクチンは、温血動物の分泌システムによって生産される主要なイムノグロブリンであるからである。抗原に対する免疫応答に関しては、充分に研究され、広範囲に報告されている。免疫学の調査は、Ｂａｒｒｅｔｔ％Ｊａｍｅｓ　Ｔ、、　Ｔｅｘｔｂｏｏｋ　ｏｆ　組肚匹島肛：第４版、Ｃ，Ｖ。Ｍｏ５ｂｙ　Ｃｏ、、　Ｓｔ、　Ｌｏｕｔｓ、　ＭＯ（１９８３）に記載されている。「を椎動物」は、セグメントされた骨質または軟骨性を柱によって特徴つけられる、魚類、両性類、は生類、鳥類および哺乳類を含む、を索動物量の第１部門であるを椎動物亜門のすべてである。すべてのを椎動物は、機能的な免疫システムを有し、抗体を生産することによって抗原に応答する。用語「タンパク質」は、本願では、天然に発生するポリペプチドをさすものとして使用される。用語「ポリペプチド」は、その最も広い意味で、すなわち、ペプチド結合を介して結合されるアミノ酸（ジペプチドまたはそれ以上）のすべてのポリマーに使用される。従って、用語「ポリペプチド」は、タンパク質、オリゴペプチド、タンパク質断片、アナログ、変異タンパク質、融合タンパク等を含む。（以下余白）Ｂ、二ｍ吸本発明の実施にあたっては、特に指示が無い限り、通常の細胞培養、分子生物学、微生物学、組み換えＤＮＡ、および免疫学の技術を使用するが、これら当業者の技術範囲内である。このような技術は文献に十分に説明されている。例えば次にあげる文献を参照のことｏ　Ｄａｖｉｓ、　Ｒ，Ｗ、、　Ｂｏｔｓｔｅｉｎ、　Ｄ、、およびＲｏｔｈ、　Ｊ、Ｒ，ＡＤＶＡＮＣＥＤ　ＢＡＣＴＥＲＩＡＬ　ＧＥＮＥＴＩＣＳ：　Ａ　ＭＡＮＵＡＬ　ＦＯＲＧＥＮＥＴＩＣＥＮＧＩＮＥＥＲＩＮＧ、　（Ｃｏｌｄ　ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ。Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ、　Ｎ、Ｙ、、　１９８０）、　Ｍａｎｉａｔｉｓ、　Ｆｒ１ｔｓｃｈおよびＳａｍｂｒｏｏｋ、　ＭＯＬＥＣＵＬＡＲＣＬＯＮＩＮＧ：　Ａ　ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ　ＭＡＮＵＡＬ（１９８２）；　ＤＮＡ　ＣＬＯＮＩＮＧ、　Ｖｏｌｕ＋ｎｅｓ　Ｉ　ａｎｄ　ＩＩ　（Ｄ、Ｎ、　Ｇｌｏｖｅｒ編。１９８５）；　０ＬＩＧＯＮＵＣＬＥＯＴＩＤＥ　５ＹＮＴＨＥＳＩＳ　（Ｍ、Ｊ、Ｇａ１ｔ編、１９８４）　；　Ｎ０ＣＬＥＩＣＡＣＩＤ　ＨＹＢＲＩＤＩＺＡＴＩＯＮ　（Ｂ、Ｄ、ＨａｍｅｓおよびＳ、Ｊ、　ＨｉｇｇｆｎＳ編、１９８４）：　Ｂ、　Ｐｅｒｂａｌ、　Ａ　ＰＲＡＣＴＩＣＡＬ　ＧＵＩＤＥ　Ｔｏ　ＭＯＬＥＣＵＬＡＲＣＬＯＮＩＮＧ　（１９８４）；　ｔｈｅ　５ｅｒｉｅｓ、　ＭＥＴＨＯＤＳ　ＩＮ　ＥＮＺＹＭＯＬＯＧＹ　（Ａｃａｄｅ＋ｘｉ＊　Ｐｒｅｓｓ、Ｉｎｃ、）：　ＶＥＣＴＯＲＳ：　Ａ　５ＵＲＶＥＹ　ＯＦ　ＭＯＬＥＣＵＬＡＲＣＬＯＮＩＮＧ　ＶＥＣＴＯＲＳ　ＡＮＤ　ＴＨＥＩＲＵＳＥＳ　（Ｒ，Ｌ、　Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚおよびり、Ｔ、　Ｄｅｎｈａｒｄｔ編、　１９８７．　Ｂｕｔｔｅｒｗｏｒｔｈｓ）；　ａｎｄ　Ｊ、Ｈ，Ｍｉｌｌｅｒ、　ＥＸＰＥＲＩＭＥＮＴＳ　ＩＮ　ＭＯＬＥＣＵＬＡＲＧＥＮＥＴＩＣＳ　（１９７２，Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）、およびＨＡＮＤＢＯＯＫ　ＯＦ　ＥＸＰＥＲＩＭＥＮＴＡＬ　ＩＭＭＵＮＯＬＯＧＹ、　Ｖｏｌｕ＋ａｅｓ　Ｉ−ＩＶ　（Ｄ、Ｍ、　ＷｅｉｒおよびＣ，Ｃ，Ｂｌａｃｋｖｅｌｌ編、　１９８６．　Ｂｌａｃｋｖｅｌｌ　５ｃｉｅｎｔｉｆｉｃ　Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ）。ここで述べられている全ての特許、特許出願、および公報は、上記あるいは下記のものすべて参考のため、ここに引用されている。本発明の中心的特性は、全面的にせよ部分的にせよ、吐旺遺伝子又はこれに相当するものの変異の結果として病原性をなくしてはいるが、その免疫原性を保持している微生物である。本発明の細胞は、生ワクチンの成分に適している。ワクチンは、病原性のない菌株が誘導される微生物系で、その病原菌株が原因で起きる個体の病気の予防処置に用いられ、例えばＳａｌｍｏｎｅｌ　ｌａの場合には、病原性のない菌株は免疫原性である。他型のワクチンの場合、ビ型微生物は異種のポリペプチドをコードする組み換え遺伝子変異を含むキャリア微生物であるため、異種のポリペプチド抗原が、ワクチンで処理した個体のコロニー形成部位に輸送される。吐旺遺伝子およびこれに相当する遺伝子は、“病原性の全面的な制御”を示すタイプ、即ち細菌の病原性因子をコードする遺伝子を含む多数の遺伝子を統合的に制御するタイプである。これは、Ｖｉｂｒｉｏ　ｃｈｏｌｅｒａｅの皿又はＢｏｒｔａｄｅｌｌａ　ｅｒｔｕｓｓｉｓの士と類似の方法で、毒性の遺伝子の発現を制御する。ｔｏｘＲ遺伝子は、ＭｉｌｌｅｒおよびＭｅｋａｌａｎｏｓ　（１９８４）およびＴａｙｌｏｒら　＜１９８７）が検討しており、全遺伝子は、５ｔｉｂｉｔｚら　（１９８８）が検討している。このことは、二の生成物は、病原性微生物が、マクロファージの中で生存することを可能にする遺伝子の発現を制御し、殺菌活性を有するマクロファージの陽イオン蛋白ディフェンシン（ｄｅｆ　ｅｎｓ　１ｎｓ）に対して不感性になるというＦｉｅｌｄら　（１９８９）の考えと一致しているｏ　Ｆｉｅｌｄら　（１９８９）；　Ｍｉｌｌｅｒら　（１９８９）　、　Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａの場合には、ビ遺伝子産物はまた、吐旺遺伝子由来の非特異的酸性ホスファターゼの発現も制御する。二型変異株の特徴の一部は、Σ、■蝕］ｌユｕの免疫原性ビ変異株によって例示される。これらの病原性のない変異株は、免疫反応を起こすのに十分な期間、経口感染した動物のバイエル板の感染を確立することができるが、膵臓に到達するには全く不十分である。ｐｊｙ２ｉ変異株は、菌株の病原性の指標である組織培養細胞に付着および侵襲するという、病原性の親株と同様の能力を示す。これらの指標細胞の同定は、当業者に公知である。例えば、Ｓ、　ｔ　ｈｉｍｕｒｉｕｍを包含する鋤。１ｍｏｎｅｌｌａの病原性菌株は、Ｈｅｎ１ｅ　４０７、Ｒｅ１ａｘ　Ｈｅｐ− ２、ＣＨＯ１ＭＤＣＸ細胞のような様々な培養細胞を侵襲する。さらに、Ｓａｌｍ。凹上ｌ変異株は親株の運動性、１型線毛を維持しており、親株と類似したリボ多糖体（ＬＰＳ）組成を有している。その上、変異株の表現型は安定している。後者の特性を決定する方法は、当業者に周知である。しかしながら、ビが変異した菌株が、ヱ遺伝子以外の他の遺伝子がさらに変異して変化した発現型を有し得ることも考えられる。ビ変異に加えて変異を有する菌株が考えられ、これらも本発明の範囲内にある。ビ変異株の、さらなる、そして有意な特性は、例えば江１ｍｏｎｅｌｌａにおける非特異的酸性ホスファターゼのような、ホスファターゼの構造遺伝子の已による制御の結果生じる。Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａで例示したように、一般に、二型変異株には非特異的酸性ホスファターゼ活性が欠如している。しかしながら、このホスファターゼ活性の欠如は、たぶんビ型遺伝子のホスファターゼの構造遺伝子の発現に対する制御を除く第２の変異によって、克服され得る。このように、病原性を欠く状態は維持しているが、表現型ではＰｈｏ”で、しかもホスファターゼを産生ずる区の変異株を得ることができる。したがって、ホスファターゼを産生できないこと自体は、配録変異株に病原性がないことの原因ではない。 ■吐又はこれに相当する遺伝子が変異した菌株、特に望ましい欠失変異株は、トランスポゾンを用いる技法でできる。多くのポイントで細胞の染色体にトランスポゾンが加えられる。トランスポゾン挿入および欠失の特徴は、Ｋｌｅｃｋｎｅｒ　（１９７７）に総説されている。例えば旦、刈且および辷肋旦ｈｉｍｕｉｒｕｉｓ　Ｓ、　ｔｘｍ＝、Ｓ、　ｅｎｔｅｒｉｔｉｓ、　Ｓ、　ｄｕｂｌｉｎ、　Ｓ、　ｌｌｉｎａｒｉｕｍ、Ｓ、　 ■オニ肥、Ｓ、　ａｒｉｚｏｎａ、およびＳ、　ｅｈｏｌｅｒａｅｓｕｉｓのような様々なＳａｌｍｏｎｅｌ　ｌａを包含する多様な細菌種の配録変異株を作製するのに、テトラサイクリン耐性（およびフザリン酸感受性）を与えるトランスポゾンＴｎｌＯ９が使用され得る。直配遺伝子に相当する遺伝子に欠失変異が存在する他の生物の変異株の単離は、病原性菌株に欠失を起こす、トランスポゾン（例えば、Ｔｎｉ、ＴｎｌＯ，Ｔｎ９１３Ｌ、　Ｔｎ９１７．または当該分野で知られているトランスポゾンを使用して）、そして、非特異的／酸性ホスファターゼの基質（例えば、４−ブロモ−３−クロロ−２−インドリルホスフェートまたはα−ナフチルホスフェート）を用いてＰｈｏ−表現型をスクリーニングすることにより達成され得る。妨げまたはこれに相当する遺伝子に制御されないホスファターゼが微生物に存在するという場合には、これらのホスファターゼを失活させる変異がトランスポゾン変異誘発開始菌株に含まれていなければならない。直配変異株を作製する１つの方法を、下記の実施例に記述する。その他の方法も可能である。ある方法においては、Ｌ■ａＤｌ此阻ＬＴ−２の配録変異に、形質導入を行う性質のあるファージｐ２２ＨＴ　ｉｎｔを、ＬＴ−２Ｘ３０００１１株（米国特許出願Ｎｏ、　２５１．３０４参照）のＴｎｌＯ，ライブラリー上で増殖させて、直配遺伝子に隣接するＴｎｌＯを挿入する方法を選択し、１２単位／ｍｌのテトラサイクリンと４０μｇ／＋１の５−ブロモ−４−クロロ−２−インドリルホスフェート（ＢＣＩＰ）を唯一のリン酸源として含むＮｅ１ｄｈａｒｄｔ培地で選択した。増殖する稀な被形質導入体には、たぶん野生型Ｐｈｏ’遺伝子に密接に連鎖したＴｎ■が存在する。デルタ−Ｒ匝変異を標準法で他の菌株に移動させるのに、ＴｎｌＯ挿入部分のＤＮＡの欠失を都合よく使用することができるほどＴｎｌＯが■通こ近い場合には、多数のＴｎｌＯ形質導入体からのフザリン酸耐性誘導体の選別および、ＢＣＩＰを含有する培地での平板培養で、デルタ−直配変異が証明される。（Ｋｌｅｃｋｎｅｒ　１９７７、および米国特許出願Ｎｏ、　２５１．３０４、これは譲受人が所持しており、またここに引用として加える）。配録変異を生み出す別法では、辷」五函工旺ｎ直配遺伝子に密接に連鎖する栄養素要求性変異を使用する。匹ユ遺伝子はそのような性質を有する。上述のようにＰ２２　ＨＴ　ｉｎｔをＴｎｌＯｎｌグライブラリ−上させて得られた溶解産物を用いて匹１Ｓ、　止吐組旺ｎＬＴ−２変異株にｐｕｒＢ”を形質導入し、Ｔｃ ’　Ｐｈ。ｐ−ＰｕｒＢ”被形質導入体を、アデニンを含まずテトラサイクリンおよびＢＣＩＰを含むＮｅ１ｄｈａｒｄｔ培地で選択、同定する。直配遺伝子の中に挿入されたＴｎｌＯが存在する（即ち、吐吐：：ＴｎｌＯ）変異が望ましい。フザリン酸耐性を選別すれば、テトラサイクリン感受性デルタ−区変異が作製される。Ｓ、帥公力凹ユ■ＬＴ−２で分離１．たデルタービ変異は、デルタ−匣：　：ＴｎｌＯに結合

【、たＴｎ旦、挿入体を使用して、他の鎧士阻凹上匡株に形質導入することができる。どちらの場合にも、形質導入体はテトラサイクリン耐性で選別される。ビ変異の導入により病原性をなくすべく望んでいる毒性の高いＳａ１ｍｏｎｅｌｌａ菌株がＰ２２感受性ならば、結合したＴｎｌＯを持つデルタ−２臣菌株またはｐｈｏＰ：：ＴｎｌＯ変異株の何れかで、Ｐ２２　ＨＴ　ｔｎｔを増殖させることができ、その溶解産物を使用して病原性の銃１ｍｏｎｅｌｌａにテトラサイクリン耐性の形質を導入し得る。フザリン酸耐性を選別することにより、デルタ−配録変異に隣接した、またはｐｈｏＰに挿入されたＴｎｌＯ変異を除去し得る。ヒ：：ＴｎｌＯ変異株の場合には、デルタ−ｐｈｏＰ変異が創られる。直配変異の導入により病原性をなくすべく望んでいる病原性の高い５ａＩＩｌＯｎ蛙江菌株がＰ２２耐性であれば、ラフ型のＳａ１ｍｏｎｅｌｌａ株にのみ効率よく感染する、ＰＩＬ４のような他の形質導入ファージを使用することができる。この場合には、形質導入又は２−デオキシガラクトース耐性株を選別することにより、Ｓ−立刀江ｍｕｒｉｕｍ　ＬＴ−２デルタ−妨げ又はビニ：Ｔｎ朋、変異株に一変異を導入することができる（米国特許出願Ｎｏ、　２５１．３０４）。ガラクトースの不存在下で、己変異株を増殖すると、これはラフ型およびｐｌＬ４感受性となって、形質導入を行うための溶解産物の増殖を許す。病原性３ａ１ｍＯ１１ｅ１１ａ■■変異受容菌株も、２−デオキシガラクトースを使用して選別される。連結したＴｎｌ主を有する■■デルタービ上あるいは１１３ｊ５　ｐｈｏＰ：：ＴｎｌＯ株上で増殖したＰｌ、Ｌ４を使用する、これらの直受容株への形質導入は、テトラサイクリンを含み、さらに■Ｐ−を同定するためにＢＣＩＰを含んでいる培地で形質導入体を平板培養することにより達成され得る。フザリン耐性株を選別すると、ＴｎｌＯが排除され、吐此＋：ＴｎｉＯ変異株の場合にはデルタービ変異が生じる。■」以外の遺伝子の変異のためラフ型である■」シ辷１■工訪ｕｒｉｕｉＩＬＴ−２株上で増殖したＰＩＬ４を使用する、Ｐ　Ｉ　Ｌ　４介在形質導入により、次に註匡変異が除去できる。このような変異株は当該分野に精通している人々には周知である（Ｓａｎｄｅｒｓｏｎ　ａｎｄ　Ｒｏｔ、ｂ参照）０組み換えＤＡＮ技法が様々な病原性細菌の吐吐変異を起こす場合にも使われることは明白である。これは、遺伝子クローニングおよびＤＮＡハイブリダイゼーシクン工学、制限酵素部位のマフピング、クローン化された区配列を制限酵素で切断することによる欠失の作製、および選別された細菌病原体にデルタ−直配欠陥を導入する対立形質置換組み換えによって、達成され得る。これを達成する方法は、技術を学んだ人々には周知である（上記参考文献参照）。本発明の最初の実施態様では、ワクチンは病原微生物を原因とする疾病の治療用である。本ワクチンは、欠失変異が望ましいが、ビ又はこれに相当する遺伝子の変異を含む、病原性のない免疫原性微生物および薬学上適当な賦形剤を包含する。好適な実施態様では、ＳａｌｍＯｎｅｌｌａのこの病原性株、中でも農業上重要な動物（例えば、ニワトリ、ウシ、ウマの類、ヒツジ、ブタ、またはｃａｐｒａ属を含む）、スポーツ様の動物およびベット様の動物、およびヒトに病気を引き起こす菌株により引き起こされる疾病の治療用である。これらのワクチンは、免疫原性のＳａｌｍｏｎｅｌ　ｌａの病原性のない配録型変異株を含有し、疾病の原因となる病原性菌株に対する防御を提供する。もう１つの実施態様では、ワクチンは直配又はこれに相当する遺伝子が変異している微生物を含有し、ワクチン、キャリア微生物、および／または所望のポリペプチド産生源として細胞を使用する場合に望ましい特性を与える、他の変異も１つ以上含んでいる。弱毒ワクチン株は理想的には多くの特徴を持っているべきである。まず第１に、完全に病原性がなく、高い免疫原性を有さねばならない。このことは、特に免疫化された母集団の遺伝子が多様であり、食餌や衛生に個体差があるため、通常は達成が難しいバランスを必要とする。第２に、少なくとも病原性のないＳａｌｍｏｎｅｌｌａに関しては、病気又は正常な宿主の生理や成長に障害を起こさずに、腸や腸関連リンパ組織にコロニー形成する能力を保持しなければならない。農業上重要な動物を免疫化する場合には、一時的な成長の停止も発育阻害も経済的に不都合な結果となるため、前者の特性が特に重要である。第３に、復帰変異又は遺伝子転移による特性の欠損を妨害する欠失変異が望ましいが、２つ以上の病原性を低下させる変異がなければならない。この前者の特徴は、低病原性ワクチンの安全性を高め、ヒトのワクチンの場合には特に考慮すべき用件であり、動物の免疫化に使用するワクチンの菌株の場合、その中には食物連鎖を経てヒトに伝えられる可能性もある。第４に、低病原性化する表現型は、食餌中の何者にも、また動物宿主にも影響されてはならない。免疫化する微生物がキャリア微生物として使用される場合には、その系は免疫された個体にクローン化遺伝子の安定した（しかも高水準が望ましい）発現をさせなければならない。このように、本発明の実施態様の１つの型では、ワクチンは通常の細胞内寄生生物である微生物を含み、この微生物は、好ましくは、少なくとも２つの変異のあるＳａｌｍｏｎｅｌ　ｌａであり、その変異の１つは区遺伝子にあって、他の１つは微生物の病原性を低めるように作用し、匡遺伝子に復帰変異が起きた場合には、微生物が野生型の病原性に復帰しない可能性を有意に高める遺伝子にある。これらの変異は、例えば、変異又は欠失した場合、病原性を失わせる遺伝子（たとえばプラスミド保存株）、栄養素要求性にする遺伝子、炭水化物の利用又は合成に変化をもたらす遺伝子、あるいは全体的な遺伝子発現に欠陥がある遺伝子に存在し得る。後者の例としては、ＣｕｒｔｉｓｓおよびＫｅｌｌｙ　（１９８７）が記述している１ｆｆｌ変異株がある。微生物が病原性を有せず、免疫原性を維持している限り、微生物、特に上述した型の変異を２つ以上含んでいる鋒１ｍｏｎｅｌｌａは、本実施態様の範囲内に含まれる。已変異と合併して導入され得るＳａｌｍｏｎｅｌｌａの変異例を表１に示す。（以下余白）紅Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａの病原性を失わせる変異遺伝子　変異体表現型　参考文献Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａの病原性を失わせる変異（続き）遺伝子　変異体表現型　参考文献（Ｌ人王泳白）本発明の別の実施態様では、ワクチンはビまたはこれに等価の遺伝子に変異のある微生物を含み、その微生物は異種のポリペプチドをコードする組み換え遺伝子を含む“キャリア”であって、ワクチンで処置された個体内のコロニー形成部位に、組み換え遺伝子の発現産物がワクチンとともに送り届けられる。キャリア微生物の組み換え遺伝子は、真菌類、細菌、寄生生物、またはウィルス性病原体の抗原、あるいはアレルゲンをフードすると考えられる。局所免疫が重要な場合には、生ワクチンは特に有用であり、最も優れた防御とも言える。キャリア微生物が病原性をもたないという必要条件は、微生物のｍ変異によって満たされる。しかしながら、微生物、特に微生物が野生型の毒性に復帰変異する可能性を本実施態様の範囲内と考えられる。この型の変異のタイプは上述しである。キャリア微生物の場合には、異種の組み換え型ポリペプチドが発現しないと微生物が死んでしまう、′平衡化された致死性”となるように、ＰｈｏＰ−型微生物を遺伝子操作することも望ましい。このタイプの“平衡化された致死性”変異株は、細胞の生存に不可欠な酵素をコードする天然の染色体遺伝子の機能が欠如しているという特徴がある。上記酵素は好ましくは、欠くことのできない細胞壁構造の成分を生合成する工程を触媒する酵素であり、さらに好ましくは、β−アスパラギン酸セミアルデヒドデヒドロゲナーゼ（ａｓｄ）をフードする遺伝子である。この変異株は天然の酵素の機能性代替物である酵素をコードする第１の組み換え遺伝子を含んでおり、この第１の組み換え遺伝子は欠損した染色体遺伝子を置換することができない。第１の組み換え遺伝子は、所望の生成物をコードする第２の組み換え遺伝子に構造的に結合している。第１の組み換え遺伝子の発現による生成物が存在しない環境下に細胞が存在する時、ａｓｄが欠如している場合には、第１の組み換え遺伝子が欠損していると、溶解によって細胞が死に至る。このタイプの“平衡化された致死性 ”変異株を調製する方法は、１９８８年１０月３日に出願された米国特許出願Ｎｏ、　２５１．３０４に開示されていて、本願の譲受人が所有しており、ここに参考文献として組み入れられている。直配型遺伝子または直配の変異に起因する病原性のない“平衡化された致死性”変異株は、所望の生産物の商品製造に有用であり、環境の中へ放出することも可能である。本発明の実施態様では、ここでキャリア細胞と称される病原性微生物の病原性をもたない誘導体も、ＧＡＬＴ、例えば回腸バイエル板に、選択された抗原を送り出すのに使用することができる。Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａなど、ある属の細菌はバイエル板に帰ることが公知である（　Ｃａｒｔｅｒ、　Ｐ、　Ｂ、　およびＦ、Ｍ、　Ｃｏｆｆ１ｎｓ、　Ｊ、　ＥＸ＋）、　Ｍｅｄ、　１３９：　１１８９　（１９７４））　。Ｓ、　江助］門ユｕｍ−Ｅ、　ｃｏ１１ハイブリッドも、マウスのバイエル板をコロニー化することが明らかにされている（　Ｈｏｈｍａｎｎ、　Ａ、　Ｗ、ら、Ｉｎｆｅｃｔ、　ａｎｄ　Ｉｎ５ｕｎ、　２２　：　７６３　（１９’１８））。これらのキャリア細菌に病原性の微生物由来の遺伝子が含まれていて発現するのであれば、病原体から産生された抗原性遺伝子産物に対する抗体が誘導される。組み換えＤＮＡ技法の出現に伴って、今日では、病因となる病原体そのものによるのではな（、その抗原の遺伝子を発現できる別の細菌宿主株によって、特異的な抗原が産生される総体的に独特なワクチンの開発が可能になってきた。抗原が哺乳類宿主の抗原と交差反応し、それゆえ自己免疫の誘導を増大するとき、影響を及ぼす交差反応性抗原決定基が産生されないように、組み換えＤＮＡ技法を用いて遺伝子を変化させることも可能である。このように、組み換えＤＮＡ技法は、を椎動物宿主抗原と交差反応し得るかまたは自己免疫状態を誘発し得る物質を何も持っていないワクチンの開発にも使用できる。局所的な免疫が重要で、最も優れた防御と言える場合には、細菌、真菌類、寄生生物またはウィルス性疾患病原体に対する有効なワクチンの開発に、本発明が広く応用できることは明らかである。そのいくつかの例は、Ｙｅｒｓｉｎｉａ　ＰｉＬｕｉによる肝斑、Ｎｅ１ｓｓｅｒｉａ　ｏｎｏｒｒｈｏｅａｅによる淋病、ｋ朋ｍ遥ｕｐ３ｊ４ユ鏡による梅毒、および匹ｎシ１担ｔｒａｃｏ■ａｔｉｓによる性病および眼の感染のコントロールのためのワクチンである。咽喉炎または心疾患を起こすような種の、Ａ群およびＢ群由来の■■且包μ匹劇４．　Ｎｅ１ｓｓｅｒｉａ　ｍｅｎｆｎ　１ｔｉｄｉｓ　肛蜆吐ｕｕ肚μ旦ｕｉａｅ、肚肚吐旦ｕｓ　１ｎｆｌｕｅｎｚａ　Ｂｏｒｄａｔｅｌｌａ　■ム」ｊ↓社μ止ａｃｔｅｒｉｕｍ　ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ、Ｍ　ｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　肋上り狙、Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌ鮎玉劇１」は、遺伝子を得ることができる本発明の範囲内の細菌のさらなる例である。インフルエンザウィルスに対して産生されたもののような、ウィルスのワクチンも本発明に含まれる。ＤＮＡウィルス或はＲＮＡウィルスのどちらであっても、その他のウィルスに対するワクチンを作ることができる。分類による例をあげると、Ｐａｐｏｖｉｒｕｓ、　Ａｄｅｒ＋ｏｖｉｒｕｓ、　Ｈｅｒｐｅｓｖｉｒｕｓ。Ｐｏｘｖｉｒｕｓ、　Ｔ’ａｒｖｏｖｉｒｕｓ、　Ｒｅｏｖｉｒｕｓ、　Ｐｉｃｏｒｎａｖｉｒｕｓ、　Ｍｙｘｏｖｉｒｕｓ、　Ｐａｒａ＋ａｙｘｏｖｉｒｕｓ、またはＲｅｔｒｏｖｆｒｕｓがある０病原性真菌、原生動物、および寄生虫による感染症を防護するワクチンも、本発明によって考えられる。さらに、ワクチンの免疫原性の構成成分が宿主のアレルゲンである実施態様では、このようなワクチンは、アレルギー性のホストを特異的に脱感作するように設計した暴露療法に使用され得る。その実施態様のひとつにおいては、本発明はを椎動物の免疫用ワクチンであるということができる。このワクチンは、病原性微生物の、生きた、病原性をもたない誘導体を含み、その誘導体は実質的に機能性アデニル化すイクレースおよびＡＭＰ受容体蛋白質を産生ずることができない一方、上述の動物の病原体であるかまたはアレルゲンを産生ずる微生物由来の組み換え遺伝子を発現することができる。さらに別の実施態様では、本発明の病原性のない微生物は、様々な宿主蛋白の合成用ベクターとして使用され得る。本発明の病原性のない微生物は、宿主に導入された後、ＧＡＬＴ、腸間膜リンパ節、および膵臓を包含する様々な免疫担当構造間を動き回ることができるので、このような微生物は様々な免疫調節産物を標的として使用される。したがって、免疫調節蛋白質またはペプチドをコードする１つ以上の遺伝子を組み換え技術により病原性のない微生物に導入すると、該微生物が適当な免疫担当組織内に定着したときに、該微生物は、組み換え産物を発現して、宿主の免疫反応を抑制、増大成は変化させる。免疫調節分子の例は下記のものを含むが、これらに限られるものではない。コロニー形成刺激抑制因子（マクロファージ、顆粒球、または混合物）、マクロファージケモト牛シン、マクロファージ阻止因子、白血球阻止因子、リンホトキシン、幼若化因子、インターフェロン、およびインクワクチンとは、将来の危害から保護するために、生きている生物の免疫系を刺激するのに使用する物質を意味する。免疫化とは、高値の抗体を維持する誘導プロセス、および／または１９２８球が病原体を殺し、モして／または生体内においてそのような作用を行う他の細胞（例えば食細胞）を活性化し得る細胞性免疫反応を誘導するプロセスをさしていい、それはその生物が依然に曝された病原体または抗原に向けられている。′免疫系”という熟語は、例えばインターフェロンの産生など、外来の物質の存在に対する単細胞生物反応を含み得るが、本願においては、生物の細胞または生物の細胞外液を侵聾する抗原性物質に対して、多細胞生物が抗体を産生ずる解剖学的特徴およびメカニズムに限定して、本熟語を適用する。このようにして産生される抗体は、イムノグロブリンＡＳＤ、Ｅ、Ｇ、またはＭのように、免疫学的クラスのいずれかに属し得る。本発明のワクチンはイムノグロブリンＡ（ＩｇＡ）の産生を刺激するものに限定されないが、とりわけ興味深いのは、ＩｇＡの産生を刺激するワクチンである。なぜなら、これは温血動物の分泌系によって産生される基本的な免疫グロブリンであるためである。例えば、ここに記述されている性質を有するワクチンは、ＩｇＡ産生に加えて例えば細胞性免疫および体液性免疫などの幅広い免疫反応を生み出すと考えられる。抗原に対する免疫反応は、十分に研究され、広く報告されているｏ　Ｂａｒｒｅｔｔ、　Ｊａｍｅｓ　Ｔ、、　Ｔｅｘｔｂｏｏｋ　ｏｆ　Ｉｍｍｕｎｏｌ虫、第４版、Ｃ，Ｖ、　Ｍｏ５ｂｙ　Ｃｏ、、ミズリー州、セントルイス（１９８３）に、免疫に関する概説がある。本発明の１つの実施態様では、ＧＡＬＴまたはＢＡＬＴに帰る病原性微生物の病原性をもたない誘導体が、病原体またはアレルゲンに対する抗体反応の刺激に使用される遺伝子産物のキャリアとして使用されている。「病原性のない（ａｖｉｒｕｌｅｎｔ）　Ｊとは、その属または種の微生物が、病原体として機能し得ないということを意味するのではなく、使用された特定の微生物が、処置される特定の動物に関して病原性がないということである。この微生物は、普通は病原性（ｐａｔｈｏｇｅｎｉｃ）の属または種に属することもあるが、病原性のない株に属さなければならない。病原性（Ｐａｔｈｏｇｅｎｉｃ）とは、疾病を引き起こしたり、正常な生理学的機能を傷害できることを意味する。病原性のない（ｌｖｉｒｕｌｅｎｔ）菌株は、対応する病原性菌株と通常は関連ある疾病の症状を完全に誘発することができない。ここで使用される微生物には、細菌、原生動物、および単細胞真菌類が含まれる。遺伝学的物質を第１の生物から、通常では第１の生物と遺伝学的物質が交換されない第２の生物に転移する手法は、組み換えＤＮＡの手法が急速に普及した結果、広く利用できるようになった。本願では、第２の生物の生殖で同一の遺伝学的物質を有する子孫が生じる方法で、ある生物から第２の生物に転移させた遺伝学的物質を、組み換え遺伝子と言う。遺伝子という用語は、あらゆる遺伝形質の生物学的単位を表すために、ここでは最も広い意味で使われている。組み換え遺伝子が、例えば機能性ポリペプチドである高分子を産生じたりあるいは調節することができ、親株に存在する完全な遺伝子である必要はない。抗原性産物を産生ずる際に、ガイドとして使用される鋳型として遺伝子が働けることだけが必要である。この産物は、親にはそのもの自体の型が見られないものであり得る。例えば、アミノ酸残基１００個を含むポリペプチド抗原をコードする機能的な遺伝子は、部分的にキャリア微生物に転移され、アミノ酸残基が僅か７５個または１０個というさえもあるものを含むポリペプチドが、宿主細胞の細胞機構によって産生される。しかし、この遺伝子産物が、親の生物に存在する類似した抗原に対する抗体産生を引き起こす抗原であれば、この遺伝子は本発明で定義された遺伝子という用語の範囲内であると考えられる。あるいは、特定の抗原またはそのフラグメントの７ミノ配列が知られていれば、ＤＮＡフラグメントまたはその類似体を、自動遺伝子合成装置などで化学的に合成し、そのＤＮＡ配列を適当な発現ベクターに導入することができる。スペクトルの他端には、幾つかの遺伝子産物をコードするＤＮＡの長い部分があり、そのうちの１個またはすべてが抗原となり得る。したがって、ここで定義し、特許請求の範囲に記載された遺伝子は、抗原を産生じ得る遺伝形質のいずれもの単位である。この遺伝子は、染色体、プラスミド、またはウィルス起源のいずれでもあり得る。遺伝子が免疫反応を効果的に起こすためには、遺伝子が発現されなければならない。遺伝子の発現とは、遺伝子構造内の固有の情報（ＤＮＡの塩基配列）が、遺伝子が存在する細胞の生物学的メカニズムによって、ＲＮＡ分子、ポリペプチドまたはその他の生物学的分子の形の物理的産物に変換されることを意味する。このようにして産生された生物学的分子を、遺伝子産物と呼ぶ。ここで用いられる遺伝子産物という用語は、罠　生物学的産物または、遺伝子のコントロール下で生じた生化学的反応の結果として産生されたあらゆる産物をさして言う。遺伝子産物は、例えば、ＲＮＡ分子、ペプチド、あるいは酵素または遺伝子の最初の産物（つまり代謝性の産物）である他の分子のフントロール下で産生された産物であり得る。例えば、遺伝子はまず、ＲＮＡ分子の合成をコントロールする。このＲＮＡ分子は、遺伝子が存在するオリジナル細胞にとっては外部の環境下で、リポソームの作用によってグリカン類の生成を調節する酵素に翻訳される。ＲＮＡ分子、酵素、グリカン類は全て、ここで使われる用語における遺伝子産物である。これらのうイ　ちのいずれもが、そして、Ｎ蛋白および多糖類のような他の多くの遺伝子産物が、動物の免疫系に導入されると、抗原と５　して作用する。糖蛋白およびリポ蛋白を包含する蛋白遺伝子産物は、ワクチンにおいて抗原として使用するのに好ましい遺伝子産物である。ワクチンが抗体を効果的に産生ずるためには、ワクチンを投与された動物の抗原産生機構が活動する状態になるように、抗原性の物質が放出されなければならない。したがって、遺伝子産物の微生物キャリアが動物に導入されなければならな）　い。先に述べたように、静脈内、筋肉内、皮下注射または乳房内、腹腔内あるいは膣投与など、他のワクチン投与方法も可能であるが、ＧＡＬＴまたはＢＡＬＴ細胞の好ましい反応を刺激すルタメニハ、経口投与、胃挿管、またはエアゾールの形のような方法による、消化管または気管支に、微生物または遺伝子産物を直接導入することが好ましい。キャリア微生物として病原性のない微生物を使用する場合には、キャリア微生物が動物内に存在すると直ちに、抗原が動物の免疫系に利用されるようにならなければならない。このことはキャリア微生物が死んで抗原分子が放出される時に、完成されると考えられる。勿論、溶解せずに原形質周囲の内容物を放出する“漏出性の”病原性のない変異株を使用することも可能である。あるいは、細胞が死ぬ前に、キャリア細胞によって外の環境にも利用できるようになるような抗原の産生をコントロールする遺伝子を選択してもよい。 ■変異による病原性のない菌株を使用することおよびＡｓｄ”クローニングベクターが時々欠損していることにより、各世代において細菌の約１％が溶解しく実施例参照）、細胞内容物を放出して、あらゆるコロニー形成および毒性抗原を含む放出細胞内容物に対する免疫反応を刺激する。病原体を使用して他の病原体からＧＡＬＴまたはＢＡＬＴに抗原を送り届けることは、その病原体が病原性をもたないように変えられるという事実が無ければ、バイエル板またはＢＡＬＴを侵邸する力を保持していても、不適当である。組み換え遺伝子が誘導される微生物は、ワクチンが投与される動物の病原体、またはその動物のアレルゲンまたは他の抗原を産生ずる微生物であり得る。アレルゲンとは、アレルギー反応を引き起こす物質であり、この場合は動物はアレルギー反応を引き起こす物質に対するワクチンを投与される。動物のフケおよび花粉などのような、多種多様な物質がアレルゲンとなり得、特定の物質に対しても、個々の動物のアレルギー反応を示す動物に、アレルゲンに対する耐性を惹起することは可能である。耐性を惹起する方法は周知であり、一般には投与量を増加しながら、動物にアレルゲンを投与することを包含する。耐性の惹起に関するさらなる検討は、先に引用したＢａｒｒｅｔｔの教科書にある。最後に、ベクターによって免疫調節遺伝子が発現される場合には、宿主生物自身が遺伝子物質源としての任務を果たすこともある。上に開示したタイプの生ワクチンを動物に投与する方法は、いずれの公知の標準法であってもよい。その方法としては経口摂取、胃挿管、または気管−鼻噴霧がある。このような方法を用いれば、ＧＡＬＴまたはＢＡＬＴ細胞に生ワクチンが容易に到達して抗体産生が惹起されるので、好ましい投与方法である。静脈内注射のような、キャリア微生物を動物の血流に到達させる他の投与方法も許容され得る。後述するが、本発明の実施態様による静脈内、筋肉内、または乳房内注射もまた許容される。好ましい投与方法は経口摂取、エアゾール噴霧または胃挿管法であるため、好ましいキャリア微生物は、ワクチンを投与されるべき動物の腸または気管支のリンパ上皮構造のいずれかに優先的に帰る種に属している微生物である。このような菌株は、腸病原性菌株の遺伝子操作によって産生された腸病原性菌株の病原性のない誘導体であることが望ましい。バイエル板に帰り、したがってＩｇＡ産生を直接刺激する菌株が最も好ましい。動物の場合、この中にはバイエル板に帰るＳａｌｍｏｎｅｌｌａ、　Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ−Ｅ、　ｃｏｌｉハイブリッドの特定の菌株が含まれる。組み換えＤＮＡの手法は、現在では十分に知られており、広く普及しているので、ルーチン操作であると考えられる。非常に一般的な広い用語では、この方法は、ある生物の遺伝物質、より一般的に言えば遺伝物質の一部、を第２の生物に転移さ昼、転移された遺伝物質が、転移光の生物の遺伝物質の恒久的な一部になる（組み換える）方法である。この方法においては、通常はまず、親株からＤＮＡの小部分（プラスミドまたは親の染色体のどちらか）を得る。プラスミド（染色体外因子とも呼ばれる）は細胞の染色体とは物理的に分離された遺伝形質単位である。ＤＮＡはどのような大きさであってもよく、ＤＮＡ分子の特定の塩基対部位で分離するように作用する制限エンドヌクレアーゼの作用によって得られることが多い。組み換え分子を形成するため、プラスミド、ファージまたはコスミドベクター用基結した後に、形質転換（外の環境からの禅のＤＮＡの取り込みであり、カルシウムイオンのような、様々な化学物質の存在により人工的に誘発される）ような様々な手段でその組み換え分子を宿主細胞に転移させる。形質導入のような他の方法も適しているが、この場合には、組み換えＤＮＡはファージ内にパッケージ化されている。適する形質導入ファージは当該分野において公知であり、コスミドベクター用の形質導入ファージを含むが、これに限られるものではない。組み換えＤＮＡがキャリア細胞内に入ると、分離された一部として存在し続ける（一般に完全な伝達プラスミド（ｃｏｕｐｌｅｔｅ　ｔｒａｎｓ＋ｎ１ｔｔｅｄ　ｐｌａｓｍｉｄ）がこの場合にあてはまる）か、または宿主細胞染色体に挿入されて、細胞分裂中に染色体とともに再生産される。病原性のない微生物の誘導体も本発明の範囲内であると考えられる。誘導体とは、病原性のない株の、有性的にまたは無性的に誘導された子孫であり、これは単数または複数の塩基置換、欠失、挿入または転移を含み、病原性がなくかつ免疫原性であるという特徴を保持している。キャリア微生物として使用する場合には、病原性のない細菌または組み換え誘導体の必要とされる投与量は、細菌または遺伝子産物の抗原性によって様々であり、既存ワクチンにおいて代表的な免疫反応を起こすのに十分な量だけが必要である。必要量はルーチンの実験で容易に設定される。所望の防護水準を提供するためには、必要に応じて複数回の投与を行う。細菌菌株の増殖および収穫後には、この細胞は凍結乾燥され得、特に食料品と混合する場合、あるいはカプセル内に調製する場合には、そのようにされる。病原性のない直配変異細菌株を含むワクチンは、処置される個体に薬学的に受容され得る賦形剤を用いて調製されてもよい。例えば、ワクチンが固体で投与される場合には、接種される個体に対して無毒で、しかも細菌と共存できる物質で細胞を被覆し、および／またはそのような物質によりカプセル化してもよい。液体として投与する場合には、例えばスキムミルク、生理食塩水、および／または生理的な濃度の、または生理的な濃度に近い他の無毒な塩、ならびに当業者に公知の、その他の適当な液体キャリアを包含する、適当な液体キャリアに細胞を懸濁してもよい。望ましい場合には、アジュバントを添加してもよい。ワクチンを経気管支チューブ投与用に調製する場合には、適当なバッファー中に調製してもよく、好ましくは、エアゾールの形で提供される。ワクチンが懸濁または溶解している薬学的賦形剤は、溶媒あるいは固体でもよく、あるいは接種されるべき動物に対して無毒で、しかもキャリア生物または抗原性遺伝子産物と適合し得る物質中にカプセル化されていてもよい。適当な薬学的賦形剤としては、生理食塩水および生理学的濃度または生理学的濃度に近い、その他の無毒な塩のような液体キャリア、およびヒトには使用されないタルクまたは農場の動物の餌料にも使用されるショ糖などの固体キャリアがある。必要に応じて抗原性を増強するためにアジュバントを添加してもよい。経気管支チューブ投与用に使用する場合には、ワクチンは好ましくはエアゾールの形で提供される。病原体由来の遺伝子産物による免疫化は、病原体由来の組み換え遺伝子によって特徴づけられた遺伝子産物を発現するキャリアとして作用する、病原性微生物の病原性のない誘導体による前免疫と組み合わせて使用されてもよい。病原体由来の遺伝子産物に対する分泌免疫システムが、ＧＡＬＴまたはＢＡＬｌ’のリンパ細胞を刺激するために該病原体由来の遺伝子産物を発現するキャリア微生物による免疫化により一部プライムされると、そのような非経口による免疫化は、分泌性免疫反応の発現を増強するブースターとして作用する。増強された反応は、２回目のブースターとして、または既往反応として知られており、その結果、長期にわたる宿主の免疫防護を生じる。ブースター免疫化を多数回繰り返すと、有益な結果が得られる。上記の開示は本発明を一般的に述べたものである。以下の特定の実施例を参照すれば、さらに完全な理解が得られる。ここでは、この実施例は説明のためにのみ記載されたものであって、他に指示のない限り、これに限定することを意図するものではない。（以下余白）実】０吋Ｓ、ｔ　ｈｉｍｕｒｉｕｍ　ｈｏＰ　の　築高度に病原性を有するマウス継代Ｓ、ｔ　ｈｉｍｕｒｉｌ工　Ｃｈｉ３１８１株およびＣｈｉ３３３９株を、旦工上ｈｉｍｕｒｉｕｍ　ＡＤ１５４株で培養したＰ２２　ＨＴｉｎｔの溶解産物により感染させ、テトラサイクリンおよび５−ブロモ４−クロロ−３インドリルホスフエート（ＢＣＩＰ）を含有するし寒天培地上で、形質転換体を選択した。ＡＤ１５４はｌ見り旦中にトランスポゾンＴｎ−１０の安定な挿入を有し、二二二互は高頻度（９０％）に２」−免ヱーの共形質導入を行う。テトラサイクリン耐性のＢＣＩＰ陰性形質導入体（白色コロニー）を、Ｐ２２ＨＴｆｎｔファージを含まなくなるまで線状に培地にぬりつけて単離を行った。この工程ニより、ＴｎｌＯ）ランスボゾンを組み込んだ形質導入体であり１」Ｌ免ヱー及び■」ＬＬ」−についての変異体である形質導入体が選択されＣｈｉ３６８６　（Ｃｈｉ３１８１由来）およびＣｈｉ３６８８　（Ｃｈｉ３３３９由来）と命名された。つぎに、これらの形質導入体を、Ｓ、ｔ　ｈｉｍｕｒｉｕｍＣｈｉ３３３９株で増殖させたＰ２２ＨＴｉｎｔにより感染させ、組換えによるＴｎｌＯの欠失を選択するためのＢＣＩＰを含有するフザリン酸含有寒天培地に植えた。フザリン酸耐性、ＢＣＩＰ陰性の形質導入体を、Ｐ２２ＨＴｉｎｔファージを含有しなくなるまで、再び同じ培地に線状にぬりつけて培養を行った。選択された形質導入体を非特異的酸性ホスファターゼ活性、Ｐ２２感染性、およびアデニンを欠く最小培地での増殖能力についてチェックした。Ｃｈｆ３６８７およびＣｈｉ３６８９　（表２）は、それぞれＣｈｉ３１８１およびＣｈｉ３３３９由来の２つの形質導入体であり、最小培地で増殖が可能であり、後述のプレート染色法による酸性ホスファターゼ活性を示さなかった。上記の記載において、使用された細菌株および得られたＬｈｏＰ変異株を表２に示す。Ｃｈｉ３１８１はＨｏ１ｓｅｒおよび５ｔａｒｋｅｒ　（１９８１）に記載されている５Ｒ−１１株と同一であり；Ｃｈｉ３３３９は、５ｃｈｒｉｅｉｄｅｒ（１９５６）に記載されているマウス継代ＳＬ　Ｉ　３４４株である。これらは、短期及び長期の保存に応じてそれぞれ、５０％グリセロール中−２０℃で、および５％グリセロールを含有する１％バタトベブトン中−７０℃で保持した。Ｓｃｈｍｅｉｇｅｒ　（１９７２）に記載のバクテリオファージＰ２２ＨＴｉｎｔを形質導入の研究に用いた。バクテリオファージｐ２２ＨＴｉｎｔを用いた形質導入体の条件は、Ｄａｖｉｓ（１９８０）に記載の通りである。細菌はＬｅｎｎｏｘ（１９５５）に記載のようにＬ培地あるいはＬ寒天培地で増殖させた。必要に応じて、ＢＣＴＰを４０マイクログラム／ｍｌの濃度で、そしてテトラサイクリンを１２マイクログラム／ｍｌの濃度で加えた。テトラサイクリン感受性でフザリン酸耐性変異体の選択は、Ｂｏｃｈｎｅｒ　（１９８３）に記載の方法および培地を用いて行った。艮主裡」１生菌株　伝子型　記憶Ｃｈｉ３６８６　配録ｕ匹■：：ＴｎｌＯＰ２２　ＨＴ　１ｎｔ（ＡＤ１５４）＝Ｃｈｉ３１８１非特異的酸性ホスファターゼ活性は、基本的にＴｏｈ−ｅらの方法（１９７３）を用い、Ｋｉ　ｅｒら（１９７９）により改変された方法により決定された。蘭単に述べれば、０゜６Ｍ酢酸ナトリウム、ｐＨ５，５、中に、次の濃度の基質の溶液を新たに調製した：アルファーナフチルホスフエート５ｍ　ｇ　／　ｍ　ｌ、テトラアゾ化−〇−ジアニシジン５０　ｍ　ｇ　／　ｍｌ。各基質溶液の１００μｌを、０．５Ｍ酢酸ナトリウム、ｐＨ５，５、中の０．６％寒天溶液２．８ｍｌに加えた。基質を含有するソフト寒天は、Ｌ寒天培地上に一夜増殖させた細菌コロニー上に重層した。非特異的酸性ホスファターゼ活性を示すコロニーは、基質を加えてから１０分以内でオレンジ色に呈色した。ｓ、ｔ　ｈｔｍｕｒｔｕｍの　ｈｏＰ′　の、上記実施例において単離されたｍヱー変異株Ｃｈｉ３６８７およびＣｈｉ３６８９を、Ｓ、ｔ　ｈｉｍｕｒｉｕｍの特性である病原性があることを示す、あるいは示唆するいくつかの決定因子の存在について調べた。それらは、Ｈｅｎ１ｅ−４０７細胞に接着し侵入する能力、病原性に必要とされるプラスミドの存在、運動性、１型線毛の存在およびＬＰＳ組成、および表現型の安定性である。変異株Ｃｈｉ３６８７およびＣｈｉ３６８９による組織培養細胞への侵入を、親株であるＣｈｉ３１８１および９ｈｉ３３３９の場合と比較した。ＡＴＣＣから入手したＨｅｎ１ｅ−４０７細胞を２４ウエルのプレートで増殖させた。増殖は１０％（ｖｏｌ／ｖｏｌ）子ウシ血清、５ｍＭグルタミン、ペニシリン（１００ユニツト／　ｍ　１　）およびストレプトマイシン（１００μｇ　／　ｍ　ｌ　）を補足したイーグル最小培地（ＭＥＭ）中で、適当な密度である５Ｘ１０’／ウエルとなるまで行った。細胞の単層を、１ウエルあたりノ＼ンクスの平衡塩類溶液（ＨＢ　Ｓ　Ｓ）中の１０６個の細菌で、５％ＣＯ２雰囲気中３７°Ｃで２時間にわたり感染させた。次いで細胞の単層を５ＸＨＢＳＳで洗浄し、デオキシコール酸ナトリウムを０．１％（ｗｔ／ｖｏｌ）の割合で含有するリン酸緩衝化生理食塩水（Ｐ　Ｂ　Ｓ）で溶解させて接着した細菌を検出し；ある−八は、１００μｇ　／　ｍ　ｌのゲンタマイシンを含有するイーグルのＭＥＭ培地と共にさらに３時間インキュベートし、細胞外の細菌を除去し；次いで同様の方法で細胞の溶解を行なった。その比較の結果を表３に示す。表３から、変異株であるＣｈｉ３６８７およびＣｈｉ３６８９の両者ともＨｅｎ１ｅ−４Ｑ７細胞に接着し侵入する能力は、親の野生型の株と同等であることが分かる。（つまり、ゲンタマイシン処理後３時間における組織培養物から回収した接種物は、変異株および親株とも実質的に同一であった。）表」工Ｓ、ｔｒ　ｈｉｍｕｒｉｕｍによるＨｅｎ１ｅ４０７　ヘの菌株　関連の遺伝子型　接着性（％）・　侵入（％）５Ｃｈｉ３１８１　野生型　１１．１±５．５　１６．１±７．２Ｃｈｉ３６８７　ビ　１０．４±４−８　１５．２±６．８Ｃｈｉ３３３９　野生型　１５．３±８．３　１９．３±８．７Ｃｈｉ３６８９　吐吐　１３．６±７．７　１７．５±７．８−感染後に回収した接種物の総接種量に対する割合（％）。数値は、３回の測定の平均±ＳＤを示す。ゝ、感染およびゲンタマイシンによる処理の後に回収した接種物の総接種に対する割合（％）。数値は３回の測定の平均±ＳＤを示す。上記の研究において、細菌株をＬ培地で３７℃で一晩放置して増殖させ、あらかじめ温められたし培地で希釈し、そして培養物のｏＩ）ｅｔａｓ値が０．７−０．９に到達するまで振盪培養することによって増殖させた。最少培地をＮｅ１ｄｈａｒｄｔ（１９７４年）において記載された方法で調製した。病原性プラスミド（ｖｉｒｕｌｅｎｃｅ　ｐｌａｓｍｉｄ）の存在または不存在をＢｉｒｎｂｏｉｍ（１９８３年）の方法を用いて試験した。この分析の結果（データは示されていない）により、両変異株およびその親株が１００ｋｂの病原性プラスミドを含有することが示された。このプラスミドはマウスにおけるｓ、ｔ　ｈ＋　ｕｒｔｕｍの病原性にとって必須であることが示された。例えば、ＧｕｌｉｇおよびＣｕｒｔｆｓｓ　（１９８７年）を参照されたい。運動性をＤｉｒｃｏ（ミシガン州、デトロイト、Ｄｉｆｃｏ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅ’ｓ）の運動性培地で試験した。 ■型線上の存在または不存在を、リン酸緩衝化生理食塩水中の３％（Ｖ／Ｖ）濃度の新たに得たモルモットの赤血球を用いて、血球凝集によって試験した。運動性および線毛の分析によってｌ垣且Ｐ変異株は運動性を有し、モして■型線上を発現した（データは示されていない）。ｍヱ変異株のＬＰＳ組成を親株のＬＰＳ組成と比較した。それはＨｉ　ｔ　ｃ　ｈ　ｃ　ｏ　ｃにおよびＢｒｏｗｎ（１９８３年）の方法を本質的に用いて行なった。この分析はＬａｅｍｍｌｉ（１９７０年）の方法によって調製されたポリアクリルアミドゲル上でドデシル硫酸ナトリウム（Ｓ　Ｄ　Ｓ）の存在下で行った。電気泳動の後、このゲルをＴｓａｆおよびＦｒａｓｃｈ　（１９８２年）の方法によって染色した。染色されたゲルの分析によって変異株、すなわちＣｈｉ３６８７およびＣｈｆ３６８９のＬＰＳ組成は、これらの親株、すなわちＣｈｆ３１８１およびＣｈｉ３３３９のＬＰＳ組成と同様であることが示された（データは示されていない）。変異株の表現型の安定性を、唯一のリン酸源としてＢＣＩＰを補った最少培地に細胞を植えることによって試験した。この状態において、Ｐｈｏ”への頻度または復帰変異はＣｈｉ３６８７では８Ｘ１０−’、そしてＣｈｉ３６８９では３×１０−９であった。マウスにおける　ｈＯＰパ　の１１１旦変異株、Ｃｈｉ３６８７および（ｈｉ３６８９の病原性を、これらの親株、ｃｈｉａｌｓｉおよびＣｈｉ３３３９の病原性と比較した。この比較は、Ｂ　Ａ　Ｌ　Ｂ　／　ｃマウスに腹腔内投与および経口投与の両方でその株を異なる用量で接種し、そして疾病の徴候について接種された動物を試験することにより行なった。８から１０週齢の雌のＢ　Ａ　Ｌ　Ｂ　／　ｃマウス（ミズリー州、セントルイス、５ａｓｃｏ、Ｉｎｃ、）を用いた。経口投与による接種は以下の方法により行なった。このマウスから４時間食物および水を絶ち、５０μｌの１０％（ｗｔ／ｖｏｌ）重炭酸ナトリウムを与え、次いで０．１％（ｗｔ／ｖｏｌ）のゼラチンを含有する緩衝化生理食塩水中に懸濁させた適当な細菌懸濁液（２０μｌ）を与えた。接種後、３０分で再び食物および水を与えた。腹腔内投与による接種は１００μｌの適当な変異株または野生型細菌のＢＳＧ懸濁液を２６ゲージの注射針を用いてマウスに注入することにより行われた。これらの研究において、細菌数は、マツコンキー寒天を用いることにより算出した。経口投与および腹腔内投与経路により投与された細菌の感染性の研究の結果を表４および表５に、それぞれ示す。ｃｈｉ３６８７またはＣｈｉ３６８９を経口投与で接種されたマウスは、野生型親株を経口投与した場合のＬＤ５．用量の１０４倍の微生物数を経口投与で試したところ、生き残った（表４）。生き残ったマウスは病気の徴候を示さず、試験後生なくとも３０日間健康であった。このマウスに腹腔内投与経路によって１１！旦変異株を投与することによっても、同様の結果が得られたく表５）。（以下余白）敷−土Ｃｈｉ３１８１Ｃ野生型　１×１０５２１５　弱っているＣｈｉ３３３９’　野生型　２Ｘ１０５　１１５　弱っているＣｈｉ３６８９　竺　２Ｘ１０”　５１５　健康２ｘ１０９５１５　健康ａ　試験後３０日における生き残り数ｂ　健康：病気の徴候がないこと；弱っている二目だって病気がちなことｃ　Ｃｈ１３１８１　（３ｘｌＯ５ＣＦＵ）およびＣｈｆ３３３９（６Ｘ１０’ ）についての経口投与のしＤ５８は以前決定された［ＧｕｌｉｇおよびＣｕｒｔｉｓｓ　（１９８７年）］。（以下余白）老−一１Ｃｈｉ３１８１’　野生型　２Ｘ１０２０１５Ｃｈｉ３３３９’　野生型　２Ｘ１ｏ”　０１５ａ　試験後３０日における生き残り数ｂ　健康：病気の徴候がないこと；弱っている二目だって病気がちなことＣＣｈｉ３１８１　（＜５０ＣＦＵ）およびＣｈｉ３３３９（＜５０ＣＦＵ）についての腹腔内投与のＬＤ５．は以前決定された［ＧｕｌｉｇおよびＣｕｒｔｉｓｓ　（１９８７年）コ。マウスにおける　ｈｏＰ・　の組１１且Ｐ変異株Ｃｈｉ３６８７または野生型親株Ｃｈｉ３１８１のいずれかで経口的に感染させたマウスにおける該細菌の組織分布を試験した。Ｂ　Ａ　Ｌ　Ｂ　／　ｃ雌マウスを、前出の病原性の研究で記載された方法により、Ｃｈｉ３６８７またはＣｈｉ３１８１のいずれかの約１０９個の細胞を用いて、経口的に感染させた。そして、微生物の分布を数日間にわたって調べた。このマウスはＣＯ２により窒息死させ、その膵臓を無菌的に取り出１２、そして組織ホモジナイザー（Ｂｒｉｎｋｍａｎ　ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）により均質化した。バイエル板を小腸から切り出し、ＢＳＧで洗浄してゆるやかに付着した細菌を除去し、そして同じホモジナイザーを用いて均質化した。ＢＳＧ懸濁液の適当な希釈溶液をマツコンキー寒天上に置き、細菌数を調べた。菌株を接種した後のバイエル板でのコロニー形成に基づく研究の結果を図１に表す。図１において、Ｃｈｉ３６８７　且１主Ｌｇ株を接種した後、およびＣｈｊ３１８１野生型菌株を接種した後、バイエル板から得られたＣＦＵを黒い四角および白い四角によりそれぞれ表した。それぞれの値は３匹のマウスの平均ＣＦＬＩ数を表し、そして、縦の棒線は標準偏差を示す。Ｃｈｆ３１８１を接種したマウスは投与後８日目に死亡した。１１立ヱ１１１株Ｃｈｆ３６８７が、限られてはいるが、接種されたマウスのバイエル板の感染を確立し得たことは図１から明らかである。バイエル板から回収された１ｈｏＰ変異株の数は、実質的に野生型親株の数より少ない０接種後１５日には、Ｃｈｉ３６８７を接種されたマウスのバイエル板から、微生物は単離されなかった。接種されたマウスの膵臓から得られたＣｈｆ３６８７およびＣｈｉ３１８１の回収の結果を図２に示す。Ｃｈｉ３６８７およびＣｈ　ｉ　３１８１を接種したマウスの膵臓から得られたＣＦＵを、白抜きの棒グラフおよび斜線の棒グラフによって、それぞれ示す。それぞれの幅の広い棒グラフは３匹のマウスの平均ＣＦＵ数を表し、そして縦の細い棒線は標準偏差を示す。図２に見られるように、Ｃｈｉ３６８７は感染マウスの膵臓からほとんど単離されず、この微生物は、観察された５匹の感染動物の内のたった３匹から、投与５日後に回収された。さらに、Ｃｈｉ３６８７は経口接種の７日後、膵臓において検出されなかった。腺腫は試験された全てのＣｈｆ３６８７感染動物中にはみられなかった。この感染性の低さは、この実験の時間経過を通して、感染動物の膵臓から回収された野生型（Ｃｈｉ３１８１）細胞の数が多いことと比べて非常に対称的である。Ｓ、ｔ　ｈｉｍｕｒｉｕｍの　ｈＯＰ・・　を　され丸工１工立呈ＩＢ　Ａ　Ｌ　Ｂ　／　ｃ雌マウスに上述のテクニックの経口投与または腹腔内投与いずれかを用いて、Ｌ１１ヱ変異株、Ｃｈｉ３６８７を接種した。この免疫は約１０８または１０”ＣＦＵの旦ｈｏＰ−変異株を経口投与で、または約１０５または１０６の菌株を腹腔内投与でのいずれかにより行われた。接種の３０日後、このマウスに野生型親株、Ｃｈｆ３１８１を投与した。この投与に用いられた野生型微生物の量は、投与経路により異なり、その量は野生型菌株のしＤ５ｅの１０３から１０４倍で示される。経口投与経路で投与および接種されたマウスの保護の結果を表６に示す。Ｃｈｉ３１８１をＬＤ５．の１０”倍の用量で接種された全てのマウスは、免疫量にかかわらず、生き残った。病原性菌株を１０’ＬＤ５ｓの用量で接種したとき、１０＠ＣＦＵのＣｈｉ３６８７で免疫された５匹のマウスのうち４匹、および１０’ＣＦＵのこの菌株で免疫された１０匹のマウスのうち９匹が、この感染において生き残った。全ての場合において、この試験で生き残ったものは健康のままであった。（以下余白）表１Ｃｈｉ３６ｇ７２ｘｌＯ”　Ｃｈｉ３１８１２ｘｌＯ８５１５健康Ｃｈｉ３１８１２Ｘ　１０”　４１５　健康Ｃｈｉ３６８７２Ｘ　１０’　Ｃｈｉ３１８１２Ｘ　１０８５１５　健康Ｃｈｉ３１８１２Ｘ　１０”　９７１０　健康−試験後３０日における生き残り数す、健康：病気の徴候がないこと腹腔内投与経路により投与および接種されたマウスの保護についての結果を表７に示す。１０５ＣＦＵまたは１０’ＣＦＵのＣｈｉ３６８７で免疫されたマウスは１０２ＣＦＵまたは１０’ＣＦＵのＣｈｉ３１８１の接種に対して抵抗性を示した。後者の用量は、非免疫マウスにおけるＣｈｉ３１８１のＬＤ、Ｂの１０４倍量に相当する。全ての生存個体は、接種後３０日間健康であった。紅免疫に用いた菌株　試験した菌株　生き残り数　外観すおよび用＠　（ＣＦＵ）　および用量（ＣＦＵ）　／総数１Ｃｈｉ３６８７２ｘｌＯ’　Ｃｈｉ３１８１２ｘｌＯ２３／３　健康Ｃｈｉ３１８１２ｘｌＯ’　３／３　健康Ｃｈｉ３６８７２Ｘ１０５Ｃｈｉ３１８１２Ｘ１０２３／３　健康Ｃｈｉ３１８１２Ｘ　１０ ’　３／３　健康・、試験後３０日における生き残り数す、健康：病気の徴候がないことｓ、ｔ　ｈｉｍｕｒｉｕｍの　ｈＯＰ　を　されたマウスの　延型゛−応ズ遅延型過敏（ＤＴＨ）は薬剤の細胞介在性応答を引き起こす能力を示すものである。ｌ！ｌ！！ヱー変異株に対するＤＴＨ応答を試験するために、マウスに１０ ’ＣＦＵのＣｈｔ３６８７を経口投与で接種し、そしてこのＤＴＨ応答を３０日後に測定した。この試験を免疫動物および対照動物で行った。そしてそれは、ＢＡＬＢ／ｃマウスの右後足跳に１．ＬＬＬ！ＬＬｍｕｒｉｕｍの全細胞溶解産物から得たタンパク質２０μｇのＰＢＳ溶液５０μｌを注射することによって行われた。同容量のＰＢＳを反対側の足跳に注射した。腫脹を接種２日夜デジマチックカリバー（ｄｆｇｉｍａｔｉｃ　ｃａｌｉｐｅｒ）（ミツトヨ、日本）で測定した。この結果を反対側のＰＢＳを注射したコントロールに対する接種された足踏の腫脹の増加の割合（％）として表す。Ｓ、ｔ　ｈｉｍｕｒｆｕｍの全細胞の溶解産物を調製するために、５Ｒ−１１をＬ培地でｏＩ）ｅｓｓ値が０．６に達するまで増殖させ、この細胞をＰＢＳで２回洗浄し、そして遠心分離により集め、そしてこの細胞ペレットを同じ緩衝液に懸濁させた。次いで、この細菌細胞を細胞破砕装置（Ｂ、Ｂｒａｕｎ、Ｍｅｌｓｕｎｇｅｎ　ＡＧ、西ドイツ）中で０．　１ｍｍのガラスピーズを用いて破壊し、そして細胞残層を１０゜０００ｇで１０分間遠心分離することにより取り除いた。ＤＴＨ実験の結果を表８に示す。Ｃｈｉ３６８７、すなわち３．ｔ　ｈｔｎ口ｔｒｉ土工のｍヱ誘導体を経口投与により免疫したマウスはＳ、ｔ　ｈｉｍｕｒｉｕｍの全細胞の溶解産物の注射に反応して、コントロール動物（ｐ＜ｏ。０２）より有意に強い足跡腫脹を示した。紅免疫に用いた菌株　ＤＴＨ応答ａＣｈｉＳ６８７　３１．６±６．６謬応答は抗体を注射した２日後、反対側のコントロール（ＰＢＳを注射された）足跡に対する試験された足跡の腫脹の増加の割合（％）として表す。この値は５匹のマウスの平均および標準偏差を表す。免疫された動物と免疫されていない動物との間の差は統計的に有意であった（Ｐ＜０．０２）。ｈＯＰ′　の　ｈＯ（１′　−・　のＣｈｉ３６８７およびＣｈｉ３６８９の両方の３株のｐｈ０１復帰変異体を１０ ’ＣＦＵのそれぞれの変異株を腹腔内接種することにより病原性を試験した。この６株のＰｈｏ＋復帰変異株はそれらが由来するところの菌株の非病原性を維持した。これは２」Ｌ免ヱー変異体においてホスファターゼの欠如は非病原性の原因ではなく、そしてこの旦ｈｏＰ−遺伝子産生物は野生型病原性にとって必須の１つまたはそれ以上の他の遺伝子を制御しなければならないということを証明している。ｈＯＰｏ　によって　′される゛　のｍ旦遺伝子生産物によって制御される重要な病原性の決定因子（すなわち、遺伝子）の同定はいくつかの方法のうちの１つで達成され得る。いくつかの、またはたぶん全てのそのような病原性決定因子は、おそらく細菌細胞表面上または周辺買占に位置する産生物を特定する。アルカリホスファターゼ（ＡＰ）の構造遺伝子を含有するトランスポゾンＴｎｍ人［ＭａｎｏｉｌおよびＢｅｃｋｗｉ　ｔｈ　（１９８４年）コはこれらの遺伝子を示すのに唯−適している。ＡＰ活性はこの酵素が細菌細胞質膜を通ってその周辺質またはその細胞表面に移行するときのみ発現し得る。ＴｎＬｌ１人は切断されてシグナル配列を指定するヌクレオチド配列が欠失しているので、ＡＰ活性は、Ｔｎ２」シ立」２を細菌の周辺質または細胞表面タンパク質の遺伝子に挿入して、周辺質または細胞表面タンパク質のシグナル配列と’ｒｎＬ１１人がコードするＡＰの融合タンパク質を形成するときのみ発現し得る０この場合、ＡＰは細胞質膜を通って移行し、そして色素産生のＡＰ基質ＢＣＩＰを含有する培地上で増殖するコロニーに青い色を与えることによって検出し得る。上記で記載されているような病原性の決定因子を同定するために、Ｔ　ｎ　１１且人ライブラリーを３．ｔ　ｈｉｍｕｒｉｕｍの野生型病原性菌株、例えば、Ｃｈｉ３３３９　（表２参照）で、適当なＴｎ１１１人置換ベクターで菌株を感染させることによって製造される。［ＭａｎｏｉｌおよびＢｅｃｋｗｉｔｈ（１９８４年）］。Ｃｈｉ３３３９の染色体または病原性プラスミド中へのＴｎ■」ＬえＡ挿入がカッマイシン（ｋａｎｏｍｙｃｉｎ）耐性を与えるので、この感染混合物をカッマイシンおよびＸＰを含有する寒天培地に植える。−晩インキユベートした後、全ての青いコロニーを取り出し、そして精製する。全てのこのような青いコロニーの細胞の混合物は、周辺質タンパク質（ｐｅｒｆｐｌａｓｍｉｃ　ｐｒｏｔｅｉｎｓ）および細胞表面タンパク質を指定する全ての遺伝子にＴｎ且ｈＯＡの挿入を有するにちがいないＴｎｌユｏＡライブラリーを構成する。Ｐ２２ＨＴ　ｉｎｔ形質導入用溶解産物はこのライブラリーで作製され、そして主、上Ｌ１エユ」」ロニし土工　ｍヱ変異株、例えば、Ｃｈｉ３６８９に形質導入するために用いる（表２参照）。カッマイシン耐性形質導入体をＢＣＩＰを含有する寒天培地上に植える０はとんどの形質導入体のコロニーは青くなる；しかじ、発現が野生型Ｌ１且ヱ遺伝子産物に依存する遺伝子にＴｎＬに１人を挿入すると白くなる。この白いコロニーは取り出され、そして精製され得る。これらのコロニー中の細胞が１１立ヱによって制御される遺伝子に挿入を有するという証明は、これらの変異体を形質導入してｗ”にすることによって得られ、それはＢＣＩＰを含有する青いコロニーを形成させなければならない。遺伝子のクローニング、ＤＮＡハイブリダイゼーション、およびＳ、ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍライブラリーのスクリーニングとそれに次ぐサブクローニング、インビトロにおける転写およびそれに連続する翻訳、および最終的なりＮＡ配列決定の標準的な方法を用いることにより、病原性の遺伝子およびその生産物を制御するＬ１１且が十分に解明される。動物および培養細胞による他の研究は、それぞれのこのようなＬ１工旦に制御される病原性遺伝子産物が病原性に影響を及ぼす機序およびこれらの遺伝子産物がワクチンの開発にどのように用いられ得るかを解明するために用いられ得る。（以下余白）ｍ１区と１匝次に挙げたものは、メリーランド州、ロックビル、パークローンドライブ１２３０１のアメリカンタイプカルチャーコレクション（Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｔｙｐｅ　Ｃｕ１ｔｕｒｅ（ｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）にブダペスト条約により寄託されている。生存試験により生存が確認された後、下記の受託番号が付与され、必要な料金が支払われた。米国特許法施行規則１．１４および米国特許法第１２２条にしたがい、特許庁長官により権利を与えられた者は、特許出願が係属している間、その培養物を入手することが可能である。その出願に基づく特許が許可されると、上記培養物の公衆に対する入手の制限は最終的に撤廃される。さらに、この命名された寄託物は、寄託日から３０年間、あるいは寄託物の分譲の請求のあった最後の日から５年間；または米国特許の存続期間；のいずれか最長の期間の間保持される。培養物が死滅するか不測の事故により破壊されたり、あるいはプラスミドを有する株においてそのプラスミドが脱落した場合には、同一の分類学上の種類の生存している培養物と差し換えられる。ここに記載されている寄託物は便宜のためにのみ記載されているのであり、ここでの記載内容を考慮して本願を実施するのに必要とされるものではない。これらの寄託物はここに参考として組み入れられている。（以下余白）Ｗｕ！Ｌ夏丘旦ＡＴＣＣＮ００Ｃｈｉ３６８７助旦口２　１９ｇ９年２月１４日　５３．８６４Ｃｈｉ３６８１１坦巴巳ユ匹ヱＢ１７３４：：　１９８９年２月１４日　５３．８６５ＴｎｌＯ ■」１ｈｉｓ６　坦副ム１Ｃｈｉ３６８９　ｖＬＵＬｈｉｓ６　吐堕ｕ１９ｇ９年２月１４日　５３．８６６上の　可　性病原性のない株、特に病原性のないサルモネラの菌株により効果的に免疫を行うには、該病原性のない微生物が、免疫された個体の腸管付属リンパ組織（ＧＡＬＴまたはバイエル板）において所定の期間生存し得ることが必要である。高度に病原性を有するサルモネラの菌株由来のＬ垣しヱ変異菌株はその免疫原性を有しながら、そのような能力を有する。従って、それらはワクチンの生産に商業的に有用である。さらに、本発明の細胞は７の欠失変異のソースとして利用され得る。このＬ１１旦はトランスポゾンの変異誘発により他の株に移り得、この株が病原性がない場合には所望のワクチンが得られる。・　遺伝子操作された微生物により合成された商業的に価値のある種々の副産物の生産が、バイオテクノロジー産業においてなされてきた。遺伝子操作された微生物をファーメンタ−による培養の条件で安定に維持することが本発明の細胞を用いることにより容易となる。この細胞とは例えば、１１！且遺伝子またはそれと同等の遺伝子の変異に加えて、デルタ−ａｓｄ変異を有し、ａｓｄ”遺伝子を選択マーカーとして有する細胞中にポリヌクレオチド挿入物を有する細胞である。且ｈｏＰ−表現型のものは微生物を扱うときに安全性が高く、そして、増殖し、タンパクを発現し得る細胞のみが所望の抗原をコードする。従って、所望の生産物の収量が比較的安全な条件下で増加する。ｌｏｇ　ＣＦＵｌｏｇ　ＣＦＵ国際調査報告

Claims

【特許請求の範囲】

１．サルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）によって引き起こされる病状を有する個体の処置のためのワクチンであって、免疫原性がありｐｈｏＰ変異体である病原性のないサルモネラ、および薬学的に受容され得る賦形剤を含有する、ワクチン。
２．請求項１に記載のワクチンであって、前記病原性のないサルモネラがさらに少なくとも１つの変異を有し、該変異は、該病原性のないサルモネラが由来する野生型のサルモネラの有する病原性を低下させる変異である、ワクチン。
３．請求項１に記載のワクチンであって、前記ｐｈｏＰ変異体がまた、免疫原性を有するデルタ−ｃｙａデルタ−ｃｒｐ変異体であり、薬学的に受容され得る賦形剤を有する、ワクチン。
４．病原性のある微生物によって引き起こされる病状を有する個体の処置のためのワクチンであって、病原性のない免疫原性ｐｈｏＰ異体であるサルモネラキャリ細胞を有し、該キャリア細胞が、該病原性微生物由来の免疫原性抗原をコードする発現ベクターにより形質転換されている、ワクチン。
５．請求項４に記載のワクチンであって、前記サルモネラキャリア細胞が該細胞に対して致死性の変異を有し、該致死性の変異を補い、平衡化された致死性宿主 −ベクターシステムを構築する、ベクター中の組換え遺伝子により、該変異が平衡化されている、ワクチン。
６．請求項４に記載のワクチンであって、前記サルモネラキャリア細胞が、ａ）ベーターアスパラギン酸セミアルデヒドデヒドロゲナーゼ（ａｓｄ）をコードする天然の機能性染色体遺伝子を欠き；ｂ）機能性Ａｓｄポリペプチドをコードする組換え遺伝子を有し、該遺伝子が天然の染色体ａｓｄ変異を補足するが、欠失した染色体遺伝子を組換えにより置換することができず；ｃ）機能性Ａｓｄポリペプチドをコードする組換え遺伝子と免疫原性抗原との間に物理的な結合を有し、機能性Ａｓｄの欠失により細胞の溶解が起こるような環境に細胞が置かれたときに、機能性Ａｓｄポリペプチドをコードする組換え遺伝子の欠失により細胞を溶解させる；ワクチン。
７．ｐｈｏＰについての変異体であるサルモネラの単離株であって、該細胞に対して致死性の変異を有し、該致死性の変異を補い、平衡化された宿主−ベクターシステムを構築する、ベクター中の組換え遺伝子により、該変異が平衡化されている、サルモネラの単離株。
８．ｐｈｏＰについての変異体であり、またデルタ−ｃｙａデルタ−ｃｒｐである、サルモネラの単離株。
９．ＡｔＣＣＮＯ．５３８６４，ＡＴＣＣＮＯ．５３８６５，ＡＴＣＣＮＯ．５３８６６，それらの誘導体、およびそれらの変異体でなる群から選択される、サルモネラの単離株。
１０．サルモネラによりひき起こされる疾病に対して個体を免疫する方法であって、請求項１のワクチンを該個体に免疫学的に有効な量で投与することを包含する、方法。
１１．サルモネラによりひき起こされる疾病に対して個体を免疫する方法であって、請求項２のワクチンを該個体に免疫学的に有効な量で投与することを包含する、方法。
１２．サルモネラによりひき起こされる疾病に対して個体を免疫する方法であって、請求項３のワクチンを該個体に免疫学的に有効な量で投与することを包含する、方法。
１３．病原性微生物によりひき起こされる病状に対して個体を免疫する方法であって、請求項４のワクチンを該個体に免疫学的に有効な量で投与することを包含する、方法。
１４．病原性微生物によりひき起こされる病状に対して個体を免疫する方法であって、請求項５のワクチンを該個体に免疫学的に有効な量で投与することを包含する、方法。
１５．病原性微生物によりひき起こされる病状に対して個体を免疫する方法であって、請求項６のワクチンを該個体に免疫学的に有効な量で投与することを包含する、方法。