CZ137599A3

CZ137599A3 - Způsob odstranění látek, redukujících manganistan a alkyljodidů

Info

Publication number: CZ137599A3
Application number: CZ991375A
Authority: CZ
Inventors: Madan Singh; George A. Blay; Michael L. Karnilaw; Melchior A. Meilchen; Wayne D. Picard; Valerie Santillan; Mark O. Scates; Robin S. Tanke; Paull G. Torrence; Richard F. Vogel Jr.; Jay R. Warner
Original assignee: Celanese International Corporation
Priority date: 1996-10-18
Filing date: 1997-10-17
Publication date: 1999-09-15
Also published as: EP0934243A2; ZA979228B; CA2267887A1; SA97180510B1; AU4985597A; RU2181715C2; HUP0000457A1; MY124684A; IN192600B; BR9712325C1; UA64723C2; CN1264801C; ATE247620T1; US6143930A; CA2267887C; DE69724266D1; WO1998017619A3; PL189501B1; BR9712325A; DK0934243T3

Description

Konjugáty BDNF a NT-3 s vodou rozpustným polymerem

Oblast techniky

Vynález se týká nové třídy BDNF a NT-3 derivátů, ve., kterých je BDNF a NT-3 molekula navázána na vodou rozpustný polymer, a způsobu přípravy těchto derivátů.

Dosavadní stav techniky

Proteiny určené pro terapeutické použití jsou v současné době dostupné v adekvátních množstvích ve vhodných formách, které jsou z velké části výsledkem rekombinantních DNA technologií. Chemické deriváty těchto proteinů mohou účinně blokovat proteolytické enzymy před fyzikálním kontaktem s proteinovým hlavním řetězcem a tak zabraňovat degradaci. Dalšími výhodami může být, za určitých podmínek, ;

zvýšení stability terapeutického proteinu, prodloužení cirkulační doby terapeutického proteinu a ” snížení jeho' í imunogenicity. Je však třeba uvést, že účinek modifikace | příslušného proteinu nelze předpokládat. Přehledným článkem, popisujícím modifikaci proteinů a fúzní proteiny je Francisův článek „Focus on Growth Factors 3: 4-10, pub. Mediscript, Mountview Court, Friern Barnet Lane, Londýn, Anglie (1992).

Polyethylenglykol („PEG nebo -„peg) je jediná chemická část, která se používá při přípravě („pegylatizaci) terapeutických proteinových produktů („pegylátovaných proteinů). Pro ošetření vážných kombinovaných imunodeficientních chorob byl například ί

vyvinut Adagen, což je formulace pegylované adenosindeaminázy. Při klinických testech zaměřených na ošetřeni poraněni hlavy byla použita pegylatovaná superoxiddismutáza. V první fázi klinických testů, zaměřených na léčení hepatitidy, se prováděly testy s pegylátovaným alfa interferónem. Rovněž existují záznamy o predklinických testech prováděných s pegyl.átovanon glukocerebrosidázou a pegylovaným hemoglobinem. Ukázalo se, že některým proteinům poskytuje navázání polyethylenglykoluochranu před proteolýzou, Sada a kol., J. Fermentation Bioengineering 71: 137 až 139 (1991) . Způsoby navázání určitých polyethylenových zbytků jsou již dostupné, viz patent US 4,179,337 (Davis a kol.) a patent US 4,002,531 (Royer) a přehled viz Abuchowski a kol.

Dalšími vodou rozpustnými polymery, které se používají ^F pro modifikaci proteinů, jsou například kopolymery ethylenglykolu a propylenglykolu, karboxymethylcelulóza, dextran, polyvinylakohol, polyvinylpyrrolidon, poly-1,3dioxan, poly-1,3, 6-trioxan, kopolymery ethylenu a anhydridu kyseliny maleinové a poiyaminové kyseliny (buď homopolymery ' nebo nahodilé kopolymery).

Pro navázání polyethylenglykolových molekul na protein se používá celá řady prostředků. Polyethylenglykolové molekuly se váží na protein zpravidla přes reakční skupinu, která je součástí proteinu. Pro' toto navázání jsou vhodné aminoskupiny, například aminoskupiny na lysihových zbytcích nebo N-koncích. Výše jmenovaný Royerův patent například uvádí, že pro navázání polyethylenglykolových molekul na enzym se používá redukční alkylace. Evropská patentová přihláška 0 539 167, publikovaná 28. dubna 1993, cituje, že peptidy a organické sloučeniny s volnou aminoskupinou (aminoskupinami) se modifikuji imidátovým derivátem PEG nebo příbuznými vodou rozpustnými organickými polymery. Patent US 4,904,584 (Shaw) se týká modifikace lysinových zbytků v proteinech, používané při navazování polyethylenglykolových molekul pomocí reakčních aminových skupin.

Specifickým terapeutickým proteinem, který již byl chemicky modifikován, je stimulační faktor granulocytové kolonie, tj. G-CSF, viz Evropské patentové přihlášky EP 0 401 384, EP 0 473 268 a EP 0 335 432. Dalším příkladem specifického terapeutického proteinu je pegylátovaný IL-6, popsaný v patentu US 5,264,209 (Mikayama a kol.). Evropská patentová přihláška 0 154 316, publikovaná 11. září 1985 rovněž popisuje reakci lymfokinu s aldehydem polyethylenglykolu.

Produktem pegylace proteinových molekul je zpravidla směs chemicky modifikovaných proteinových molekul. Pro ilustraci lze uvést případ, kdy proteinové molekuly s pěti lysinovými zbytky a třemi aminoskupinami na N-konci, pokud se použijí ve výše popsaných reakcích, poskytnou heterogenní směs, kdy část produktu má šest ' polyethylenglykolových zbytků, část produktu má pět, čtyři, tři, dva nebo jeden polyethylenglykolový zbytek a část tohoto produktu nemá na sobě navázaný žádný polyethylenglykolový zbytek. Polyethylenglykolové zbytky nemusí být u různých molekul, obsahujících několik polyethylenglykolových zbytků, navázány ve stejném místě. U výše popsaných metod je zpravidla žádoucí, aby byla mezi proteinem a polyethylenglykolovou molekulou přítomna vazebné skupiny. Součástí postupu, který popisuje Delgado a kol., v „Coupling of PEG to Protein by Activation with Tresyl i

Chloride, Aplications In Immunoaffinity Cell Partitioning, Separations Using Aqueous Phase Systems, Applications In Cell Biology and Biotechnology, Plenum Press, New York, NY (1989), na stránkách 211 až 213, je zabudování tresylchloridu, který eliminuje potřebu vazebné skupiny mezi proteinem a polyethylenglykolovou molekulou. Použití tohoto způsobu při výrobě terapeutických produktů může být obtížné, protože použití tresylchloridu s sebou přináší vznik toxických vedlejších produktů.

Chamow a kol., Bioconjugate Chem. 5:133 až 140 (1994) popisuje modifikaci CD4 imunoadresinu monomethoxyethylenglykolaldehydem („MePEG glykolaldehydem) za použití redukční alkylace. Autoři uvádějí, že vazebná schopnost modifikovaného CD4-IgG (na proteinový gp 120) in vitro se snižuje rychlostí odpovídající rozsahu MePEGylatizace.

Růstový faktor odvozený z mozku (BDNF) a neutrofin-3 (NT-3) jsou známými polypeptidy, spadajícími do třídy neurotrofních faktorů, označovaných jako neurotrofiny, která rovněž zahrnuje nervový růstový faktor (NGF). Tyto faktory podporují přežívání neuronů a zachování jejich funkce a jsou hlavními kandidáty při terapeutickém léčení neurodegenerativních onemocnění, Bardě a kol., Neuron 2:1525 až 1534 (1989); Snider a kol., Cell 77:627 až 638 (1994). Způsoby identifikace a rekombinantní produkce těchto faktorů byly již v patentové literatuře popsány, viz například viz patent US 5,169,762 (Gray a kol.) pro NFG, patenty US 5,180,820 (Barde a kol.) a 5,229,500 (Barde a kol.) pro BDNF a publikovaná PCT přihláška č. WO 91/03569 pro NT-3.

t

Podstata vynálezu

Jak již bylo uvedeno, vynález se obecně týká BDNF a NT-3 derivátů, ve kterých jsou BDNF nebo NT-3 polypeptidové zbytky navázány na vodou rozpustný polymer.

Konkrétněji se vynález týká BDNF a NT-3 derivátů, které jsou produktem reakce polypetidů s reakčnimi (tj. „aktivovanými) vodou rozpustnými polymerními částmi, při které se uvedený polymer naváže na polypeptid. Tohoto navázáni lze dosáhnout použitím zde popsaných reakcí, jakými jsou acylace nebo alkylace. Acylace nebo alkylace s polyethylenglykolem nebo jiným vodou rozpustným polymerem se může provádět za' podmínek, za kterých se získá hlavní monoderivatizovaný (monofunkcionalizovaný) nebo polyderivatizovaný (polyfunkcionalizovaný) produkt. Polyderivatizace zpravidla zahrnuje navázání polyethylenglykolu nebo jiného vodou rozpustného polymeru na ε-aminoskupiny lysinových zbytků polypeptidu a může dále zahrnovat navázání polymeru na N-konec polypeptidu. Monoderivatizace výhodně zahrnuje navázání polymeru na α-aminoskupinu zbytku BDNF nebo NT-3 polypeptidového zbytku s N-zakončením, t j . selektivní navázání vodou rozpustné polymerové části na N-konec polypeptidu. Monoderivatizace tedy v podstatě poskytuje homogenní přípravek polymer/BDNF nebo polymer/NT-3 konjugátových molekul a stejně tak (pokud se použije polyethylenglykol) přípravek pegylátovaných BDNF nebo NT-3 molekul, které mají polyethylenglykolovou část navázanou přímo na BDNF nebo NT-3 část.

BDNF a NT-3 deriváty podle vynálezu jsou použitelné pro stejné účely jako trofické faktory BDNF resp. NT-3. Těmito účely je zejména podpora přežívání neuronů a jejich funkčnosti in vitro a in vivo a rovněž mohou být použity jako potenciální terapeutická činidla pro léčení neurodegenerativních onemocnění u lidí, zahrnujících kromě jiných například Parkinsonovu amyotrofickou laterální sklerózu (ALS), Huntingtonovu chorobu, retinální degeneraci, periferální neuropatii a Alzheimerovu chorobu. Jak ukazují některé níže uvedené příklady, derivatizace (modifikace) podle vynálezu může rovněž zlepšovat schopnosti molekuly migrovat mozkovou tkání, a tedy usnadňovat dopravu účinné látky do terapeuticky cílových míst uvnitř mozku.

Vynález dá^le poskytuje způsob přípravy výše zmíněné množiny BDNF a NT-3 derivátů, ve kterých jsou' vodou rozpustné polymery, zejména polyethylenglykol, navázány na α-aminoskupinu na N-konci polypeptidu (BDNF nebo NT-3) za vzniku homogenní populace derivatizovaných molekul, tj. konjugátů těchto polypeptidů s polymerem.

Stručný popis obrázků

Obr. 1 znázorňuje příklad BDNF (nebo NT-3) acylace, prováděné za použití N-hydroxysukcinimidylových (NHS) aktivních esterů monoethoxypolyethylenglykolaldehydů, jejímž produktem je polypegylátovaný BDNF nebo NT-3, přičemž k označuje počet MPEG molekul zreagovaných s molekulou BDNF nebo NT-3, n označuje stupeň polymerace

MPEG, použitého při reakci (n = 2000 pro MPEG, mající molekulovou hmotnost 100 kDa a n = 40 pro MPEG, mající molekulovou hmotnost 2 kDa) a m označuje celkový počet primárních aminoskupin na BDNF nebo NT-3 molekulu.

Obr. 2 znázorňuje přiklad nespecifické redukční alkylace BDNF (nebo NT-3), prováděné za použití monomethoxyethylenglykolových aktivních aldehydů, jejímž produktem je polypegylátovaný produkt, přičemž k, m a n jsou definovány stejně jako na předchozím obrázku.

Obr. 3 znázorňuje příklad místně specifické redukční alkylace BDNF nebo NT-3 na α-aminoskupině N-zakončeného polypeptidového zbytku, která se provádí za použití ’ monomethoxyethylenglykolových aktivovaných aldehydů a která poskytuje v podstatě monopegylátovaný produkt (na N-konci).

obr. 4 znázorňuje cholinacetyltransferázovou (ChAT) imunohistochemii axotomizovaných .faciálních motoneutronů na in vivo zvířecím modelu, navrženém pro testování ztráty periferní nervové funkce. Yan a kol., J. Neurosci. 14(9):5281 až 5291 (1994). Pravé faciální nervy dospělých krysích samiček se přerušily a zvířata se ošetřovala každodenně po dobu sedmi následujících dní subkutánním způsobem: PBS (A) ; nepegylátovanym BDNF v dávce 5 miligramů na kilogram tělesné hmotnosti, mg/kg, (B); pegylátovaným na N-zakončení v dávce 0,3 miligramů na kilogram tělesné hmotnosti, mg/kg, (C); nebo nahodile pegylátovaným BDNF v dávce 0,3 miligramů na kilogram tělesné hmotnosti, mg/kg (D). U krys ošetřených PBS měla axotomie za následek velký pokles ChAT imunoreaktivity v poškozených faciálních » jádrech, (pod písmenem A faciální jádra na pravé straně). Na druhé straně ošetření jak ňepegylátovaným BDNF, tak pegylátovaným BDNF (pod písmenem C a D) tlumí poraněním indukovaný pokles ChAT imunoreaktivity. Použité symboly mají následující význam: FN - faciální jádro; py pyrimidalní trakt; Sp5 - jádro spinálního trojklanného nervu. Měřítko (pod písmenem D) představuje 1 mm.

Obr. 5 znázorňuje křivku vyjadřující závislosti dávka - odezva po ošetření testovaných zvířat nepegylátovaným BDNF a pegylátovaným BDNF na stejném modelu axotomizováných íaciálních motoneuronů jako v příkladu 4. Zvířata dostala denně subkutánní injekci (s.c.) vehikula (O), nepegylátovaného BDNF (□) , N-zakončeného pegylátovaného BDNF O, nebo nahodile__p.e.gylá.t.o.vaného BDNF () v dávkách indikovaných na dobu několika dní. Stanovené hodnoty představovaly průměrné hodnoty + SEM (n=4) Data se analyzovala pomocí ANOVY a následně testem Dunett t. *, p < 0,05; **, p < 0,01, BDNF ošetření vs. vehikulum.

Obr. 6 znázorňuje sloupcový diagram, ukazující průnik nepegylátovaného BDNF („NAT-BDNF) nebo pegylátovaného BDNF („PEG-BDNF) do mozku živých krys po jediné injekci aplikovaní do středu pravého žíhaného tělesa (Corpus Striatum). o dvacet čtyři hodin později se zvířata perfúzně-fixovala 4% paraformaldehydem. Mozky se vyjmuly, dezintegrovaly a napustily protilátkou specifickou pro BDNF. Tento postup popsal Yan a kol., v Soc. Neurosci. Abs. 20:1306 (1994). Celkový objem BDNF penetrace do mozkové tkáně se kvantifikuje integrací všech BDNF imunoreakčních tkáňových sekcí. Stanovené hodnoty představovaly průměrné hodnoty + SEM (n = 4) . Data se analyzovala testem Student t. *, Ρ < 0,0001.

Obr. 7 znázorňuje sloupcový diagram, ukazující průnik nepegylátovaného BDNF a pegylátovaného BDNF do mozku živých krys po kontinuálním lokálním několikadenním podání. Celkový objem BDNF průniku se kvantifikoval stejným způsobem jako na obrázku 6. Stanovené hodnoty představovaly průměrné hodnoty + SEM (n = 4). Data se analyzovala testem Student t. *, p < 0,0001.

Obr. 8 znázorňuje retrográdní transport nepegylátovaného BDNF (pod písmeny A a B) a pegylátovaného BDNF (pod písmeny C a D) mozkovou tkání do dopaminergických neuronů, nacházejících se uvnitř mozkové tkáně, po infúzi zavedené do žíhaného tělesa mozku živých krys za použití stejného postupu jako v případě obrázku 7. Pod písmeny Ba D jsou zvětšeniny čtvercového výřezu uvedených'pod písmeny A resp. C. Symboly pod písmenem A mají následující význam; SNC - substantia nigra reticulata; a VTA - ventrální tegmentální oblast. Čára pod písmenem D představuje měřítko, které znamená 500 pm pro A'a Ca 200 μιη pro panely B a D.

Vhodnými pro použití v rámci vynálezu jsou přirozené sekvence BDNF a NT-3 (t. j. přirozeně se vyskytující), a stejně tak jejich fragmenty, prekurzory a polypeptidové molekuly, reprezentující jednu nebo více aminokyselinových substitucí, delecí nebo adicí, které jsou odvozeny z přirozené sekvence a které vykazují biologické vlastnosti podobné biologickým vlastnostem molekul přirozené sekvence, tj. chiméry, analogy a pod.. Výrazy „BDNF a „NT-3 budou, nebude-li stanoveno jinak, zahrnovat tyto polypeptidy v libovolné výše jmenované formě.

Způsoby přípravy BDNF a NT-3, zejména rekombinantními prostředky, které jsou zpravidla nejpraktičtější pro získání větších množství, jsou známy. Použitelné postupy jsou popsány ve vědecké a patentové literatuře, například v již jmenovaných patentech US 5,180,820 a 5,229,500 a publikované PCT přihlášce WO 91/03569. Zvláště výhodné pro použiti v rámci vynálezu jsou přirozené sekvence BDNF a NT3, které jsou exprimované rekombinaci v prokaryotických a eukaryotických buňkách včetně rekombinantnich polypeptidových produktů, exprimovaňých z lidských nukleotidových sekvencí („r-HuBDNF a „r-HuNT-3) včetně sekvenci exprimovaňých v bakteriálních buňkách, které obsahují na Nkonci methioninový zbytek (tj. „r-metBDNF a „r-metNT-3). Příkladem těchto polypeptidů jsou polypeptidy, mající sekvence, které jsou uvedeny v seznamu sekvencí na konci textu přihlášky vynálezu, pod označením SEQ ID No: 1 („rHuBDNF), SEQ ID No: 2 (r-metHuBDNF), SEQ ID No: 3 („rHuNT-3) a SEQ ID No: 4 („r-metHuNŤ-3).

Pegylatizace BDNF a NT-3 se může provádět pomočí libovolné v daném oboru známé pegylatizační reakce. Viz například: Focus growth Factors 3(2):4-10 (1992; EP 0 154 316; EP 0 401 384 a další zde citované publikace. Výhodně se pegylatizace provádí pomocí acylační nebo alkylační reakce s molekulou reakčního polyethylenglykolu (nebo analogického reakčního vodou rozpustného polymeru). Tyto výhodné způsoby derivatizace za použití polyethylenglykolu budou podrobněji diskutovány níže.

Acylace

Pegylatizace acylací zpravidla zahrnuje reakci aktivního esterového derivátu polyethylenglykolu (PEG) s BDNF nebo NT-3 polypeptidem. Pro provádění pegylatizace těchto polypeptidů lze prakticky použít libovolnou molekulu reakčního PEG. Výhodným aktivovaným PEG esterem je PEG esterifikovaný na N-hydroxysukcinimid („NHS). Výraz „acylace, jak je zde použit, zahrnuje neomezujícím způsobem následující typy vazeb mezi BDNF nebo NT-3 a vodou rozpustným polymerem, například PEG: amidovou, karbamátovou, urethanovou a pod., viz Bioconjugate Chem. 5:133-140 (1994). Pro reakci lze zvolit libovolné známé reakčni podmínky, tj. teplotu, rozpouštědlo a pH, nebo následně vyvinuté, které nebudou inaktivovat BDNF nebo NT-3 druhy, určené pro modifikaci. Zpravidla se aplikují reakčni podmínky, které budou popsány níže. Příkladná reakce NHS esteru monomethoxy-PEG je znázorněna na obrázku 6.

Pegylatizace alkylací poskytne zpravidla polypegylátovaný BDNF nebo NT-3 produkt, ve kterém budou lysinové ε-aminoskupiny pegylátované přes acylovou vazebnou skupinu. Spojovací vazbou bude výhodně amid. Výsledný produkt bude rovněž výhodně v podstatě (např., > 95%) mono, di- nebo tri-pegylátovaný. Nicméně některé druhy s vyšším stupněm pegylatizace (až maximální počet lysinových ε-aminokyselinových skupin BDNF a NT-3 plus jedna ot-aminoskupina na aminoskupinou zakončeném konci BDNF nebo NT-3) budou zpravidla vznikat v množstvích, závisejících na specifických reakčnich podmínkách, které se při reakci použijí. Pokud je to žádoucí, lze čistší pegylátované druhy ze směsi obsahující rovněž nezreagované druhy separovat standardními purifikačními technikami, zahrnujícími mimo jiné dialýzu, vysolování, ultrafiltraci, iontoměničovou chromatografii, gelovou filtrační chromatografii a elektroforézu.

Alkylace

Pegylatizace alkylací zpravidla zahrnuje reakci aldehydového derivátu PEG s polypeptidem, například BDNF nebo NT-3, v přítomnosti redukčního činidla. Pegylatizace alkylací může rovněž poskytnout polypegylátovaný BDNF nebo

NT-3. Příkladnou redukční alkylační reakci, která poskytuje polypegylátovaný produkt, znázorňuje obrázek 7. Navíc v případě vhodně použitých reakčních podmínek lze dosáhnout pegylatizace, která proběhne v podstatě pouze na N-konci α-aminoskupiny BDNF nebo NT-3 polypeptidu (tj., dochází výlučné k tvorbě monopegylátováných druhů). Příkladnou redukční alkylační reakci s BDNF nebo NT-3, která poskytuje monopegylátovaný produkt, znázorňuje obrázek 8. v dalších případech monopegylatizace nebo polypegylatizace se PEG skupiny výhodně naváží na polypeptid přes -CH₂-NH- skupinu. Pokud jde o -CH₂- skupinu, tento typ vazby se zde označuje jako „alkylová vazba.

Modifikace neboli· derivatižacé pomocí redukční alkylace poskytuje monopegylátovaný produkt,' který využívá různé reaktivity různých typů primárních aminoskupih (lysin vs. N-koncová), které jsou k dispozici pro derivatizaci BDNF nebo NT-3. Reakce se provádí při pH (viz níže), které umožňuje využít výhody rozdílných pK₄ mezi ε-aminoskupinami lysinových zbytků α-aminoskupiny N-koncem zakončeného zbytku polypeptidu. Touto selektivní derivatizaci se řídí navázání vodou rozpustného polymeru, který obsahuje reakční skupinu, například aldehyd, na polypeptid. Konjugace s polymerem probíhá převážně na N-konci polypeptidu. Kromě toho probíhá nepodstatná modifikace dalších reakčních skupin, například aminoskupin v lysinovém bočním řetězci. Důležitým znakem vynálezu je, že poskytuje v podstatě homogenní přípravu konjugovaných molekul monopolymeru a BDNF nebo monopolymeru a NT-3, což znamená, že se molekula polymeru navázala na BDNF nebo NT-3 v podstatě pouze v jediném místě. Konkrétněji, pokud se použije polyethylenglykol, potom vynález rovněž poskytne pegylátovaný BDNF nebo NT-3, postrádající možné antigennové vazebné skupiny a mající polyethylenglykolovou molekulu navázanou přímo na BDNF nebo NT-3 polypeptid.

Ve výhodném provedení se vynález týká pegylátovaného BDNF a NT-3, ve kterých je (jsou) PEG skupina (skupiny) navázaná (navázané) přes acylovou nebo alkylovou skupinu. řT-a-k—j-i-ž—bylo—uvedeno—výše—tyto—produkty—mohou----být monopegylátované nebo polypegylátované (např. obsahující 2 až 6, výhodně 2 až 5 PEG skupin). PEG skupiny se zpravidla váží na a a/nebo ε aminoskupinu polypeptidového řetězce, dá se rovněž předpokládat, že by se mohly PEG skupiny vázat na libovolnou aminoskupinu polypeptidové struktury, která je dostatečně ·reaktivní na - to, aby se mohla za vhodných reakčních podmínek navázat na PEG skupinu.

Polymerní molekuly, používané jak při acyklačním, tak při acylačním přístupu, lze zvolit z vodou rozpustných polymerů nebo jejich směsi. Zvolený polymer, by měl být vodou rozpustný, aby se polypetid, na který se naváže, nesrážel ve vodném prostředí, například fyziologickém prostředí. Zvolený polymer by měl být modifikovaný tak, aby měl k dispozici jednu reakční skupinu, například aktivní esterovou skupinu pro acylaci nebo aldyhydovou skupinu pro alkylaci, přičemž výhodně by měl být modifikován tak, aby bylo možné způsobem podle vynálezu řídit stupeň polymerace. Výhodným reakčním PEG aldehydem je propionaldehyd polyethylenglykolu, který je ve vodě stabilní, nebo jeho mono Ci až Ci₀ alkoxy- nebo aryloxyderiváty (viz patent US 5,252,714). Polymer může být větvený nebo přímý. Pro terapeutické použití konečného produktu je výhodné, aby byl použitý polymer farmaceuticky přijatelný. Vodou rozpustný polymer lze zvolit ze skupiny, zahrnující například

polyethylenglykol (např. monomethoxypolyethylenglykol), dextran, poly(N-vinylpyrrolidon), homopolymery propylenglykolu, kopolymery polypropylenoxidu a ethylenoxidu, polyoxyethylátováné polyoly (např. glycerol) a polyvinylalkoholy. Při acylačních reakcích by měl mít zvolený polymer jednu reakční esterovou skupinu. Při redukční alkylaci by měl mít zvolený polymer jednu reakčn í_a1dehydu_________ skupinu. Jako vodou rozpustný polymer se zpravidla nevolí přirozeně se vyskytující glykosylové zbytky, které se běžněji připravují pomocí savčích rekombinantních expresních systémů. Zvolený polymer může mít libovolnou molekulovu hmotnost a může být větvený nebo přímý.

Zvláště' výhodným vodou rozpustným polymerem pro použití v rámci vynálezu je polyethylenglykol. Výraz „polyethylenglykol, jak je zde použit, zahrnuje libovolnou formu PEG, která se používá pro derivatizaci &)modifikaci) jiných proteinů, například mono- (Ci-C₁₀) alkoxy- nebo aryloxypolyethylenglykol.

Derivatizaci lze zpravidla provádět za libovolných vhodných podmínek, používaných pro zreagování biologicky účinných látek s molekulou aktivovaného vodou rozpustného polymeru. Způsoby přípravy pegylátovaného BDNF nebo NT-3 budou zpravidla zahrnovat následující kroky: (a) uvedení BDNF nebo NT-3 polypeptidu do reakce s polyethylenglykolem (například reakčním esterovým nebo aldehydovým derivátem PEG) za podmínek, za kterých se BDNF nebo NT-3 naváže na jednu nebo více PEG skupin, a (b) získání reakčního produktu. Optimální reakční podmínky pro acylační reakce se zpravidla určí případ od případu na základě známých parametrů a s přihlédnutím k požadovanému produktu. Čím větší bude poměr PEG : proteinu, tím vyšší bude procentu polypegylátovaného produktu.

Při použití způsobu podle vynálezu bude redukční alkylace, poskytující v podstatě homogenní populaci konjugovaných molekul monopolymeru a polypeptidu, zahrnovat následující kroky: (a) uvedení BDNF nebo NT-3 polypeptidu do reakce s polyethylenglykolem za redukčně alkylačních podmínek, při pH vhodném pro selektivní modifikaci ctaminoskupin koncových polypeptidových skupin, a (b) získání reakčního produktu.

Pro získání v podstatě homogenní populace molekul ko.njugátu monomeru a BDNF nebo monomeru a NT-3, jsou redukčně alkylačními podmínkami ty podmínky, které umožňují selektivní navázání vodou rozpustné polymerní části na Npolypeptidový konec. Tyto reakční podmínky zpravidla poskytují rozdíl v pK_a lysinových ε-aminoskupin a aaminoskupiny na N-konci (pKa je pH, při kterém je 50% aminoskupin protonizováno a 50% nikoliv). Hodnota pH rovněž ovlivňuje poměr polymeru ku polypeptidu, který se má použít. Zpravidla platí, že pokud je pH nižší, je zapotřebí větší přebytek polymeru proti polypeptidu (tj. tj. méně reaktivnější je N-koncová α-aminoskupina, tím je pro dosažení optimálních podmínek zapotřebí více polymeru). Pokud je pH hodnota vyšší, potom nemusí být poměr polymer polypeptid tak vysoký (tj. pokud jsou k dispozici reaktivnější skupiny, potom je zapotřebí pouze pár molekul polymeru) . Pro účely vynálezu je optimální pH 3 až 9, výhodně 3 až 6.

Dalším důležitým faktorem je molekulová hmotnost polymeru. Zpravidla platí, že čím vyšší je molekulová hmotnost polymeru, tím méně polymerních molekul se může navázat na polypeptid. Podobným způsobem optimalizuje tyto parametry větvení polymeru. Čím vyšší molekulová hmotnost (nebo více větví), tím vyšší musí být poměr polymer : polypeptid. Pro zde uvažované pegylatační reakce se výhodná průměrná molekulová hmotnost polymeru pohybuje přibližně od 2 kPa do 100 kPa (výraz přibližně znamená + 1 kPa) . Výhodněji se průměrná molekulová hmotnost použitého polymeru pohybuje v rozmezí přibližně od 5 kPa do 50 kDa a nej výhodněji přibližně od 12 kDa do 25 kDa. poměr vodou rozpustného polymeru ku BDNF nebo NT-3 bude zpravidla ležet v rozmezí od 1:1 do 100:1, výhodně (pro polypegylatizaci) od 1:1 do 20:1 a (pro monopegylatizaci) od 1:1 do 5:1.

Při použití výše popsaných podmínek poskytne redukční alkylace podle vynálezu selektivní navázání ' polymeru na libovolný BDNF nebo NT-3 polypeptidový protein, mající aaminoskupinu na konci zakončeném aminoskupinou a v podstatě homogenní přípravu konjugátu monopolymeru a polypeptidového proteinu. Výraz „konjugát monopolymeru a polypeptidového proteinu, jak je zde použit, znamená kompozici obsahující jedinou polymerní molekulu navázanou na BDNF nebo NT-3 molekulu. Konjugátu monopolymeru a polypeptidového proteinu bude mít polymerní molekulu umístěnou na N-konci polypeptidového řetězce a nikoliv na lysinových postranních skupinách. Příprava zpravidla poskytne více než 80% konjugátu monopolymeru a polypeptidového proteinu a výhodněji více než 90% konjugátu monopolymeru a polypeptidového proteinu, přičemž zbývající molekuly zůstanou nezreagované (tj. zbytek tvoří polypeptid postrádající polymerní část). Níže uvedené příklady způsobu přípravy konjugátu monopolymeru a polypeptidového proteinu poskytly přibližně alespoň 90% tohoto konjugátu a přibližně

10% nezreagovaného polypeptidů. Konjugát monopolymeru a polypeptidového proteinu je biologicky aktivní.

redukční činidlo, určené pro redukční alkylaci podle vynálezu, by mělo být stabilní ve vodném roztoku a výhodně by mělo být schopné redukovat pouze Schiffovu bázi, vytvořenou při počátečním procesu redukční alkylace. Výhodná redukční čirTídla¹ mohou byt zvolena že škupíňyT zahrnující borohydrid sodný, kyanoborohydrid sodný, dimethylamin-boran, trimethylamin-borah a pyridinboran. Zvláště výhodným redukčním činidlem je kyanoborohydrid sodný.

Další reakční parametry, například rozpouštědlo, reakční časy, teploty atd. a rovněž způsob čištění produktů, lze zvolit případ od případu na základě publikovaných informací, týkajících se derivatizace proteinů vodou rozpustnými polymery (viz zde citované publikace). Konkrétněji budou tyto parametry diskutovány v níže uvedených příkladech.

Pro přípravu směsi molekul konjugátů monopolymeru a polypeptidového proteinu lze zvolit acylační ' a/nebo alkylační metod a výhoda této volby spočívá v tom, že umožňuje při pravit směs, která bude obsahovat požadovaný poměr konjugátu monopolymeru a polypeptidového konjugátu. takže pokud je to žádoucí, lze připravit směs různých polypeptidů s různým počtem navázaných polymerních molekul (tj. di-, tri-, tetra- atd.) a kombinovat s konjugátovým materiálem monopolymeru a polypeptidů, připraveným za použití způsobů podle vynálezu a mít tedy směs s předem stanoveným poměrem konjugátů monopolymeru a polypeptidů.

Jak již bylo uvedeno, konjugáty monopolymeru a polypeptidu podle vynálezu lze použit pro stejné účely jako BDNF nebo NT-3. Již dříve bylo známo, že tyto polypeptidy jsou účinné například jako trofické faktory, které podporují přežívání neuronů a zachování jejich funkčnosti in vitro, a umožňují tak studii a použití neuronů při výzkumech. Tyto buňky se v kultuře zpravidla udržují velmi těžko naživu. Tyto biologické aktivity rovněž umožňují použít tyto polypeptidy in vivo při neurologických studiích zvířat a představují potenciální terapeutická činidla pro léčení neurodegenerativním chorob, které souvisí se ztrátou neuronové funkce.

Pro terapeutické účely lze konjugáty . polymeru a polypeptidu ·podle vynálezu formulovat a podávat v libovolném sterilním biologicky slučitelném farmaceutickém nosiči, kterým může být například solný fyziologický roztok, pufrovaný biologický roztok, dextróza a voda. Množství konjugátu polymeru a BDNF nebo polymeru a NT-3, ktere bude účinné při léčení konkrétní poruchy nebo zdravotního stavu, bude záviset na povaze poruchy nebo stavu a lze ho stanovit standardními klinickými technikami. Kde je to možní, je žádoucí pře prováděním testů na lidech sestavit pro farmaceutické kompozice podle vynálezu křivku, vyjadřující závislost dávka - odezva a to nejprve in vitro například v BDNF a NT-3 biologických testovacích systémech popsaných v literatuře a následně na použitelných zvířecích modelech. Způsoby podání budou zahrnovat intradermální, intramuskulární, intraperitoneální, intravenózní, subkutánní, intranazální, pulmonální a orální. Kromě toho může být žádoucí zavést farmaceutické kompozice do centrální nervové soustavy libovolnou vhodnou cestou včetně intraventriculární nebo intratekální. Dále může být žádoucí aplikovat farmaceutické kompozice lokálně do oblasti, která toto ošetření vyžaduje. Toho lze dosáhnout například lokální infúzí během chirurgického zákroku, injektováním pomocí katetru nebo použitím implantátu tvořeného porézním, neporézním, želatinovým, vláknitým nebo membránovým materiálem.

Prípřavá koňkréižních ďérivátů BDNF a NT—3 podl-evynálezu a jejich fyzikální a biologické vlastnosti budou diskutovány v následující části textu, 'je třeba uvést, že následující příklady mají pouze ilustrativní charakter a nikterak neomezují rozsah vynálezu, který je jednoznačně vymezen přiloženými patentovými nároky v těchto příkladech se, není-l-i stanoveno·, jinak, použily lidské BDNF a NT-3 polypeptidy, které se připravily rekombinací v E. coli (tj., r-metHuBDNF a r-metHuNT-3).

Příklady provedení vynálezu

Příklad 1

Příprava konjugátu monoPEG (6 kPa) a BDNF s místem navázáním na N-koncové g-aminoskupině (skupinách)

Do vychlazeného (4°C), míchaného roztoku r-metHuBDNF (2,5 mg/ml) ve 100 mM fosfátu sodného', jehož pH bylo 4.0, obsahujícího 20 mM NaCNBH₃, se přidal dvojnásobný molární přebytek aktivovaného aldehydu methoxypolyethylenglykolu (MPEG), majícího průměrnou molekulovou hmotnost 6 000 daltonů (tj., 6 kDa).

Rozsah modifikace proteinu v průběhu reakce se monitoroval pomocí velikostně vylučovací chromatografie za použití sloupce Superose 6HR 10/30 (Pharmacia) eluovaneho . rychlostí 0,4 ml/min 100 mM fosforečnanu sodného, pH 6,9, obsahujícího 0,5 M NaCl. Po deseti hodinách vylučovací chromatografie ukázala, že již byl v podstatě veškerý polypeptid (který v roztoku existoval jako dimer) převeden na dvě možné formy pegylátovaného derivátu zakončeného Nkoncovou skupinou: MPEG konjugovaný na jedné nebo obou Ňkoncových skupinách BDNF dimeru.

Reakční směs se následně naředila sterilní vodou na pětinásobný objem a aplikovala na HiLoad 16/10 S Sepharose HP iontoměničový sloupec (Pharmacia),, uvedený do rovnovážného stavu pomocí 20 mM sodnofosfátovým.. pufrem, pH 7,5. Reakční směs se· aplikovala na sloupec rychlostí 1 ml/min a'nezreagovaný MPEG aldehyd se eluoval třemi objemy sloupce stejného pufru. Pro eluci dvou forem, pegylátovaného BDNF dimeru s N-zakončenim se použil., lineární eluční gradient s pětisetmrnutovou změnou koncentrace od 0% do 100% 20 mM fosforečnanu sodného, pH 7,5, obsahující 0,75 M NaCl. Frakce, obsahující MPEGBDNF deriváty se zachytily, zahustily a sterilně přefiltrovaly.

Příklad 2

Příprava konjugátu monoPEG (20 kPa) a BDNF s místem navázáním na N-koncové α-aminoskupině (skupinách)

V tomto příkladu se použil stejný postup jako v příkladu 1 s tou výjimkou, že se použil aldehyd methoxypolyethylenglykolu (MPEG) s molekulovou hmotností 20 000 daltonů (20 kDa) a pH 5,0.

Příklad 3

Příprava konjugátu monoPEG (6 kPa) a BDNF redukční alkylací za použití MPEG aldehydů

Do vychlazeného (4*C), míchaného .roztoku r-metHuBDNF (10 mg/ml) ve 100 mM pufru BICINE, pH 8,0, obsahujícího 20 mM NaCNBH₃, se přidal čtyřnásobný molární přebytek aktivovaného aldehydu methoxypolyethylenglykolu (MPEG), majícího průměrnou molekulovou hmotnost 6 000 daltonů (tj., 6 kDa).

Rozsah modifikace proteinu v průběhu reakce se monitoroval pomocí velikostně vylučovací chromatografie za použití sloupce Superose 6HR 10/30 (Pharmacia) eluované rychlostí 0,4 ml/min 100 mM fosforečnanu sodného, pH 6,9, obsahujícího 0,5 M NaCl. Po deseti hodinách vylučovací chromatografie ukázala, že již byl v podstatě veškerý polypeptid modifikován MPEG.

Reakční směs se následně naředila sterilní vodou na pětinásobný objem, pH se upravilo pomocí kyseliny fosforečné na pH 7 a aplikovala na HiLoad 16/10 S Sepharose HP iontoměničový sloupec (Pharmacia), uvedený do rovnovážného stavu pomocí 20 mM sodnofosfátovým pufrem, pH 7,5. Reakční směs se aplikovala na sloupec rychlostí 1 ml/min a nezreagovaný MPEG aldehyd se eluoval třemi objemy sloupce stejného pufru. Pro eluci konjugatů MPEG a BDNF se použil lineární pětisetminutový gradient od 0% do 100% 20 mM fosforečnanu sodného, pH 7,5, obsahující

0,75 M NaCl. Frakce, obsahující MPEG-BDNF konjugáty, se zachytily, zahustily a sterilně přefiltrovaly.

Příklad 4

Příprava konjugátu monoPEG ¢6 kPa) a BDNF redukční acylací za použití MPEG aldehydů

V tomto příkladu se požil stejný postup jako v příkladu 3 s tou výjimkou, že se použil šestinásobný molární přebytek MPEG aldehydu.

Příklad 5

Příprava konjugátu polyPEG (6 kPa) a BDNF acylací za použití aktivovaných MPEG derivátů

Do vychlazeného (4°C), míchaného roztoku r-metHuBDNF (6 mg/ml) ve 0,1 M pufru BICINE, pH 8,0, se přidal čtyřnásobný molární přebytek aktivovaného su-kcinim-idylesteru -karboxymethyl MPEG, maj.ícího.,průměrnou molekulovou hmotnost 6 000 daltonů (tj., 6 kDa). Polymer se rozpustil mírným mícháním a reakce se nechala pokračovat při stejné teplotě.

Rozsah modifikace proteinu v průběhu reakce se monitoroval pomocí velikostně vylučovací chromatografie za použití sloupce Superose 6HR 10/30 (Pharmacia) eluované rychlostí 0,4 ml/min 100 mM fosforečnanu sodného, pH 6,9, obsahujícího 0,5 M NaCl. Po třech hodinách vylučovací chromatografie ukázala, že již byl v podstatě veškerý BDNF dimer modifikován MPEG.

Reakčni směs se následně naředila sterilní vodou na čtyřnásobný objem, pH se upravilo pomocí 0,5M kyseliny fosforečné na pH 7 a tento roztok se aplikoval na HiLoad 16/10 S Sepharose HP iontoměničový sloupec (Pharmacia), uvedený^-do r o vn o v ázněho š'tavu'pOmocí 2O~mM^—s'odno‘fo'sf átovým pufrem, pH 7,5. Nezreagovaný MPEG aldehyd se eluoval třemi objemy sloupce stejného pufru. Pro eluci konjugátů MPEG a BDNF se použil lineární pětisetminutový gradient od 0% do 100% 20 mM fosforečnanu sodného, pH 7,5, obsahující 0,75 M NaCl. Frakce, obsahující MPEG-BDNF konjugáty, se zachytily, zahustily a sterilně přefiltrovaly.

Příklad 6

Příprava konjugátů polyPEG (6 kPa) a BDNF acylací za použití aktivovaných MPEG derivátů

V tomto příkladu se použil postup popsaný v příkladu 5 s tou výjimkou, že se použil ekvimolární poměr reakčních činidel.

Příklad 7

Příprava konjugátů polyPEG (20 kPa) a BDNF acylací za použití aktivovaných MPEG derivátů

V tomto příkladu se použil postup popsaný v příkladu 5 s tou výjimkou, že se použil MPEG sukcinimidylpropionát mající průměrnou molekulovou hmotnost 20 kDa a šestinásobný molární přebytek MPEG.

Příklad 8

Příprava konjugátu monoPEG (20 kPa) a NT-3 s místem navázáním na N-koncové g-aminoskupině (skupinách)

Do vychlazeného (4’C), míchaného roztoku r-metHuNT-3 (4,77 mg/ml) v 20 mM fosfátu sodného, jehož pH bylo 4.0, obsahujícího 150 mM NaCl a 20 mM NaCNBH₃, se přidal trojnásobný molární přebytek aktivovaného MPEG, majícího průměrnou molekulovou hmotnost 20 000 daltonů (tj., 20 kDa).

Rozsah modifikace proteinu v průběhu reakce se monitoroval pomocí velikostně vylučovací chromatografie za použití sloupce Superose 6HR 10/30 (Pharmacia) eluované rychlostí 0,4 ml/min .10 mM fosforečnanu sodného, pH 7,1, obsahujícího 150 mM NaCl. Po čtyřech hodinách vylučovací chromatografie ukázala, že již byl v podstatě veškerý polypeptid (který v roztoku existoval jako dimer) převeden na dvě možné formy pegylátovaného derivátu zakončeného Nkoncovou skupinou: MPEG konjugovaný na jedné nebo obou Nkoncových skupinách NT-3 dimeru.

Reakční směs se následně naředila 20 mM fosforečnanem sodným na pětinásobný objem, pH 7,1, a aplikovala na HiLoad 16/10 Ξ Sepharose HP iontoměničový sloupec (Pharmacia), uvedený do rovnovážného stavu pomocí 20 mM sodnofosfátovým pufrem, pH 7,5. Reakční směs se aplikovala na sloupec rychlostí 1 ml/min a nezreagovaný MPEG aldehyd se eluoval třemi objemy sloupce stejného pufru. Pro eluci dvou forem pegylátovaného NT-3 dimeru s N-zakončením se použil lineární pětisetminutový gradient od 0% do 100% 20 mM fosforečnanu sodného, pH 7,1, obsahující 0,4 M NaCl.

Frakce, obsahující MPEG-NT-3 deriváty se zachytily, zahustily a sterilně přefiltrovaly.

Podobným způsobem modifikace BDNF nebo NT-3 s MPEG aldehydy s různou průměrnou molekulovou hmotností, například s molekulovou hmotností ležící v rozmezí od 5 kDa do 50 kDa, lze připravit i další MPEG-BDNF nebo MPEG-NT-3 'kohjiigňtyt Honro‘g‘eni’ťa~výs'l^_e'dných^— pegyl”átovaných~BDNF—neboNT-3 konjugátů se stanová Nátriumdodecylsulfátpolyakrylamidovou gelovou elektroforézou (SDS-PAGR), za použití 10 až 20% nebo 4 až 20% prefabrikovaných gradienčních gelů (Integrated Separation systems). Pro charakterizování účinné velikosti (hydrodynamického poloměru) všech MPEG-BDNF nebo MPEG-NT-3 druhů se .použil 10/30 (Pharmacia) gelový filtrační sloupec. Proteiny se detekovaly UV absorbancí při 280 nm. BIO-RAD gelové filtrační standardy slouží jako granulované proteinové markéry molekulové hmotnosti. Molekulové hmotnosti konjugátů se stanovily sedimentací rovnovážným analytickým ultracentrifugací a z matrice pomocí laserové desorpční hmotnostní spektrometrie. Struktura každého N-zakončeného MPEG-BDNF nebo MPEG-NT-3 konjugátu byla potvrzena standardními metodami sekvencováni proteinů s N-zakončením a peptidovým mapováním.

Biologická aktivita in vitro MPEG-BDNF konjugátů, připravených v příkladech 1 až 7, se stanovila na základě jejich vliv na růst vnitřní soli, 3-(4,5-dimethylthiazol-2yl)-5-(3-karboxymethoxyfenyl)-2-(4-sulfofenyl)2H-tetrazolia, způsobený PC12/pcDneo-trkB#18 buňkami. Tyto výsledky a rovněž základní reakční parametry použité při přípravě konjugátů jsou shrnuty v níže uvedené tabulce 1.

TABULKA

yních parametrů

tiky konjugátu

Aktiv, in vitro

100% '

O rd

n

Ol 00

25

Ol

28

co

-

S o uh rn charakte ristik a hlavních parametrů konjugátu MPEG-BDNF a hla·;

přípravných reakci

Charakteris

MPEGj BDNF

N/A

OJ

Ol

2, 4

4, 6

2,3

co Ol

a - mol/mol BDNF dimeru b - zdánlivá relativní molekulová hmotnost, stanovená gélovou filtrací n/a - neaplikovatelné ^;

MH^b kDa

27

co s.

483,8

τ Όττ

257, 2

298, 0

113,2

934,3

Reakčni podmínky

MPEG* BDNF

N/A

00

12 ' '

00

Ol

co

_;Hd

N/A

iD

co

00

co

reakčni MPEG

HM, kDa

N/A

kO

20

CO

co

kO

kD

20

Typ

N/A

Aldehyd

| NHSester

NHSester

Konjugát

r-metHuBDNF

monoMPEG-BDNF

polyMPEG-BDNF

3 Q CQ 1 O ω PU S o a

(1)

Ol

(3)

(4)

(5) !

(6)

(Δ)

Příklad 9

Hodnocení in vivo biologické aktivity konjugátu MonoMPEG (20 kPa) na motoneuronech u dospělých krys

Jak se již ukázalo dříve BDNF chrání vývoj motoneuronů před přirozeně se vyskytující a axotomii indukovanou buněčnou—smrti;__Y.an__a__kpL·.Nature 360:753-755(1992);

Oppenheim.a kol., Nature 360:757-759 (1992); a Sendtner a kol.., Nature 360:757-7'59 (1992). Rovněž se ukázalo, že axotomizované dospělé motoneutrony reagují na exogenní BDNF a přesněji na BDNF, aplikované různými způsoby podání, tak že tlumí axotomii indukované snížení chilonacatyltransferázové (ChAT) imunoreaktivity ve faciálních motoneuronech dospělých krys; Yan a kol., J.Neurose!. 14(9):5281-5291 (1994). Snížení aktivity ChAT indikuje ztrátu motoneuronové funkce, protože ChAT je vitálním neurotransmiterem, produkovaným motoneurony. Tyto studie tedy ukazují, že BDNF je použitelný jako potenciální terapeutické činidlo pro motoneuronové choroby dospělých jedinců. Tato studie hodnotila in vivo biologickou aktivitu pegylátovaných a nahodile pegylátovaných druhů BDNF (viz příklad 1 a 3) na poškozených dospělých motoneuronech.

Metody

A. veterinární chirurgie a léčení

Dospělé samičky Sprague-Dawleyových krys (celkem 52 krys, n=4 pro každou skupinu) se znecitlivěly koktejlem (43 mg/ml ketaminhydrochloridu, 8,6 mg/ml xylazinu a 1,43 mg/ml acepromazinu), který jim byl podán v dávce 0,7 ml/kg tělesné hmotnosti. Po znehybnění se pravý faciální nerv přeřízl v blízkosti foramenu » · · · · · ···::: • · · · · · · · .·«· ··* »· · ·· stylomastoideumu. Zvířata se každodenně ošetřovala sedm dni subkutánním způsobem, přičemž prvním dnem ošetření byl den, kdy byl proveden chirurgický zákrok (den 0) . Použité dávky tvořilo 0,1, 0,3, 1,0 a 5,0 mg na kg tělesné hmotnosti nepegylátovaného BDNF, monoPEG(20kDa)-BDNF s N-zakončením, nebo nahodilého polyMPEG-BDNF konjugátu, vždy v PBS. Kontrolní skupinu tvořila skupina krys, která se ošetřila pouze PBS.

B. ChAT imnunohistochemie

Krysy se utratily předávkováním anestetika a promyly transkardiálně PBS a následně 4% paraformaldehydem v 0,1 M sodnofosfátovým pufrem, pH 7,2. Po izolování mozkových kmenů se tyto kmeny konzervovaly hlubokým zmrazením pomocí 30% sacharózou v PBS, na. posuvné mikrotomovém podložce a následně se faciální jaderná oblast nařezala na 80 pm sériové koronární řezy. Řezy se potom připravily pro imunohistochemii zpracováním za použití myší monoklonální protilátky působící proti ChAT (ascity, 1:500, Chemicon, Temecula, CA) , a následně 2 pg/ml sekundární biotinylátované koňské antimyší protilátky pomocí ABC metody (Vector Laboratories, Burlingame, CA), kterou popsal Yan a Johnson v J. Neurose!. 8(9):3481-3498 (1988).

C. Kvantifikace imunohistochemických řezů

Pro kvantifikaci relativní intenzity ChAT zbarvení se použil zobrazovací analyzer Quantimet 520 (Leica, Inc., Deerfield,. IL) spojený s mikroskopem Nikon Optiphot-FXA. Pro získání vysoce kontrastních obrazu faciální nukleové oblasti v histologických řezech se použil filtr s 510 nm úzkou pásmovou propustí (Oriel Corp., Stratford, CT) spolu s objektivem Nikon-Plan Apochromatic 2x. Relativní intenzita ChAT imunoreaktivity se stanovila získáním průměrné intenzity stupnice šedi pro každé jádro, od které se odečetlo zabarvení pozadí, sousedící ChAT negativní šedé hmoty. Pro kvantifikaci se použily tři nebo čtyři řezy, obsahující faciální jádra, z každého zvířete.

Protože BDNF ošetření neovlivňuje ChAT imunozabarvení něpořušěňyčh“fačíalňích^—j'aďěř7'”vyj-á-dři-l-a—se—zrs-kaná—data jako poměr relativní optické hustoty porušených a neporušených faciálních jader ve stejném vzorku. Získaná data se statisticky analyzovala pomocí testu ANOVA a následně pomocí testu Dunnett t.

D. Výsledky

Axotomie u dospělých krys způsobuje rychlý a reprodukovatelný pokles ChAT imunoreaktivity motoneuronů, Lams a kol., Brain Res. 475:401-406 (1988) a Armstrong a kol., J. Comp. Neurol. 304:596-607 (1991). Ke stanovení účinků nepegylátovaného BDNF a pegylátovaného BDNF na dospělých motoneuronech, se použil výše popsaný typ řezu faciálního nervu, u kterého se studoval vlivu těchto polypeptidů na expresi ChAT v motoneuronech.

Několik dní po přeříznutí pravého faciálního nervu se ChAT imunoreaktivita v poškozeném faciálním jádru, ošetřovaném PBS, v podstatě vymizela (Obr. 4, pod písmenem A, faciální jádro na pravé straně). Subkutánní ošetření přirozeným BDNF (5 mg/kg, obr. 4 pod písmenem B), konjugátem N-zakončeného monoMPEG a BDNF (0,3 mg/kg, obr. 4, pod písmenem C) a nahodilým konjugátem polyMPEG a BDNF (0,3 mg/kg, obr. 4, pod písmenem D) značně zmírnilo poškozením indukované snížení ChAT imunoreaktivity. Za účelem kvantifikace tohoto jevu se měřila průměrná optická hustota jak poškozeného, tak nepoškozeného faciálního jádra ChAT zabarveného řezu. Jak přirozený, tak N-zakončený monoMPEG-BDNF konjugát a rovněž nahodilý polyMPEG-BDNF konjugát snížily dávkově dependentním způsobem ChAT imunoreaktivitu (obrázek 5). Přirozený BDNF při dávce 5 mg/kg dávce vykazoval značné zmírnění poškozením indukované ChAT imunoreaktivity oproti kontrolnímu vehikulu (ρ,Ο,ΟΙ). Ošetření N-zakončeným monoMPEG-BDNF konjugátem nebo nahodilým polyMPEG-BDNF konjugátem mělo za následek podstatné zlepšení oproti kontrolnímu vehikulu při všech testovaných dávkách a proti přirozenému BDNF při nižších testovaných dávkách (p<0,01). Zjištění, že ošetření pěgylátovaným BDNF posunulo křivku, vyjadřující závislost dávka-odezva, přibližně o dvacetinásobek doleva v porovnání s přirozeným BDNF (obr. 5), naznačilo zvýšení účinnosti pegylátovaného BDNF na poškozených motoneuronech.

Příklad 10

Hodnocení In Vitro biologické aktivity konjugátu Nzakončeného monoMPEG a NT-3 v embrionickém kuřecím DRG biologickém testu

Srovnatelné biologické aktivity nepegylátovaného NT-3 a N-zakončeného monoMPEG(20kDa)-NT-3 konjugátu se měřily pomocí testu embrionického kuřecího dorzálního kořenového ganglionu (DRG), který popsal Lindsay a kol., v Dev. Biol. 112:319-328 (1985). Pět embrionických (E8) kuřecích dorzálních kořenových ganglionů na jamku se kultivovalo jako explantáty v kolagenové matrici 2 ml F14 média, obsahujícího 5% normálního koňského séra. Účinky neurotrofního faktoru (jak nepegylátovaného, tak pegylátovaného) se stanovily vizuálně pod fázovým, mikroskopem a vyhodnotily na stupnici 0 až 5 (0 znamenala žádný neutritový výrůstek a 5 znamenala maximální neutritový výrůstek).

Výsledky shrnuté v níže uvedené tabulce 2 naznačují, že pegylátovaný NT-3 netrpí ztrátou aktivity v porovnání s něpěgyrátdvaným—NT-3~což—j-e-překvapi-v-ý—v-ýs-l-edek—v-zh-ledem. ke zkušenostem s jinými pegylátovanými proteiny, testovanými in vitro, které podléhají podstatnému snížení biologické aktivity.

TABULKA 2

- Biotest E8 kuřecího DRG In vitro
. Faktor	Konc. vzorku (ng/ml)	Neutritový výrůstek
NT-3	0,5	co Cxl CM s
	5	4, 4, 5, ,
	10	co •h. LT) o
	50	ΙΓ) CJ m o LO o
v
Pegylátovaný NT-3	5	4, 4, 4, 2, 2
	50	co co co
	500	CM ·*. ir> o m o o
	1000________	LO O co cn m

Příklad 11

Další hodnocení In Vivo biologické aktivity N-zakončeného monoMPEG(20kDa)-BDNF konjugátu u dospělých krys- Pronikání mozkovou tkání

1. Jediná injekce vedená do žíhaného tělesa

Jeden mikrolitr nepegylátovaného BDNF nebo N-zakončeného monoMPEG(20kDa)-BDNF konjugátu . (1 mg/ml fosfátem pufrovaného solného roztoku) se 18 až 20 hodin injektovalo in vivo do středu pravého žíhaného tělesa mozku dospělé krysí samičky (n=4). O dvacet čtyři hodin později se „zvířata utratila_předávkováním anestézií a transkardiálně .promyla PBS a následně 4% paraformaldehydu v 0,1 M sodnofosfátovým pufrem, pH 7,2. Po izolování mozkových kmenů se tyto kmeny konzervovaly hlubokým zmrazením pomocí 30% sacharózou v PBS, zmrazily na posuvné mikrotomovém podložce a následně se faciální jaderná oblast nařezala na 60 pm sériové koronární řezy. Řezy se potom připravily pro imunohistochemii zpracováním za použití 1 pm/rnl králičí protilátky, působící proti BDNF, a následně 2 pg/ml sekundární biotinylátované králičí protilátky, působící proti BDNF, pomocí ABC metody (Vector Laboratories, Burlingame, CA), kterou popsal Yan a Johnson v J. Neurosci. 8(9):3481-3498 (1988). V případě obou použitých látek, tj . nepegylátovaného a pegylátovaného BDNF vzorku, bylo možné pozorovat velmi intenzívní zabarvení v místě vpichu. Pegylátovaný BDNF pronikal přibližně do 2,4x větší oblasti tkáně než nepegylátovaný BDNF, jak je patrné z obrázku 6. Několik pozitivně značených neuronů se nacházelo rovněž v černé hmotě (není znázorněno).

2. Sedmičlenní infúze zavedená do žíhaného tělesa

Dospělé krysí samičky (n = 4) přijímaly denní infúzi 12 gg, buď nepegylátovaného BDNF nebo N-zakončeného monoMPEG(20kDa)-BDNF konjugátu, která se aplikovala po dobu sedmí dní do žíhaného tělíska. Průnik obou forem BDNF, k němuž došlo v rámci této studie, je dokonce lepší než v pripadě^jednoaučhéhd“iňjěktá’žníh-o“po-stupu7’-který-byl--popsánvýše. Pegylátovaný BDNF difundoval do mnohem větší oblasti než přirozený BDNF (přibližně 6,Ix Větší oblasti, viz obrázek 7). Po provedení infúze pegylátovaným BDNF bylo v oblasti substantia nigra compacta („SNC) a ve ventrální tegmentální oblasti („VTH) pozitivně označeno mnohem více neuronů (obr. 8, pod písmeny C a D), než po infúzi nepegylátovaným BDNF (viz obr. 8 pod písmeny A a B) . Za většího energetického zvětšení, bylo možno pozorovat BDNFimunoreaktivitu jako tečky uvnitř cytoplazmy obklopující jádro, což naznačilo, že BDNF bylo retrográdní transportováno z nervového zakončení do těla buňky. Pozitivní zabarvení, patrné v mediálové ventrální části substantia nigra reticulata („SNR) bylo v neurofilu a nesouviselo s žádným buněčným tělem. Toto zabarvení bylo způsobeno nespecifickou difúzí a nikoliv receptorem mediovaným retrográdním transportem; Ferguson a kol., J. Comp. Neutrol. 313:680-692 (1991).

Tyto výsledky jsou velmi významné. Zjistilo se, že po parenchymální aplikaci do mozku zvířat, je průnik BDNF mozkovou tkání velmi slabý. Nyní získaná data ukazují značné zlepšení schopnosti difúze v případě použití pegylátovaného BDNF, který svědčí o potenciálně vyšší terapeutické účinnost, alespoň pokud jde o tyto formy podání.

SEZNAM SEKVENCI

INFORMACE PRO SEQ ID NO:1:

(i) SEKVENČNÍ CHARAKTERISTIKY:

(A) DÉLKA: 119 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina ~ (0) DRUH ŘETĚZCE: jednoďučhý (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY:protein (xi) POPIS BIOLOGICKY VÝZNAMNÝCH MÍST SEKVENCE:

SEQ ID NO:1:

His 1 Ser Gly

Ser Glu Gly

Asp Trp Thr 35

Pro Val 20 Val

Ala 5 Thr Thr

Arg Ala Val

Arg Ala Leu

Gly Asp Glu 40

Glu Lys 25 Lys

Leu 10 Lys Val

Ser Thr Pro

Val Ala Glu

Cys Val Ser 45

Asp Asp 30 Lys

Ser 15 Met Gly

lie Ser Gin

-

Leu

Lys 50

Gin Tyr

Phe

Tyr

Glu 55

Thr

Lys

Cys

Asn

Pro 60

Met

Gly

Tyr

Thr

Lys €5

Glu

Gly Cys

Arg

Gly 70

lie

Asx

Lys

Arg

His 75

Trp

Asn

Ser

Gin

Cys 80

Arg

Thr

Gin

Ser 85

Tyr

Val

Arg

Ala

Leu 90

Thr

Met

Asp

Ser

Lys 95

Lys

Arg

lie

Gly Trp 100

Arg

Phe

lie

Arg

lie 105

Asp

Thr

Ser

Cys

Val ¹¹⁰

Cys

Thr

Leu Thr lie Lys Arg Gly Arg 115

INFORMACE PRO SEQ id NO:2:

(i) SEKVENČNÍ CHARAKTERISTIKY:

(A) DÉLKA: 120 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) DRUH ŘETĚZCE: jednoduchý _(D)_ „TOPOLOGIE:_ lineární. _ _ (ii) TYP MOLEKULY:protein (xi) POPIS BIOLOGICKY VÝZNAMNÝCH MÍST SEKVENCE: SEQ ID NO:2:

Met His Ser Asp Pro Ala Arg Arg Gly Glu Leu Šer Val Cys Asp Ser 1 5 1015 lie Ser Glu Trp Val Thr Ala Ala Asp Lys Lys Thr Ala Val Asp Met 20 2530

Ser Gly Gly Thr Val Thr Val Leu Glu Lys Val Pro Val Ser Lys Gly 35 4045

Gin Leu Lys Gin Tyr Phe Tyr Glu Thr Lys Cys Asn Pro Met Gly Tyr 50 5560

Thr Lys Glu Gly Cys Arg Gly lie Asp Lys Arg His Trp Asn SerGin

70 7580

Cys Arg Thr Thr Gin Ser Tyr Asx Arg Ala Leu Thr Met Asp SerLys

9095

Lys Arg lie Gly Trp Arg Phe He Arg lie Asp Thr Ser Cys Asx Cys 100 105110

Thr Leu Thr lie Lys Arg Gly Arg

115 120 » * t· • » » · ·1 • · »š «·♦· ·«« ♦· *

INFORMACE PRO SEQ ID NO:3:

(i) SEKVENČNÍ CHARAKTERISTIKY:

(A) DÉLKA: 119 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina

1	(C) DRUH ŘETĚZCE: jednoduchý (D) TOPOLOGIE: lineární

(ii) TYP MOLEKULY:protein (xi) POPIS BIOLOGICKY VÝZNAMNÝCH MÍST SEKVENCE: SEQ ID NO:3:

Tyr Ala Glu 1	His Lys Ser His Arg Gly Glu Tyr Ser Val Cys Asp Ser 5 10 15
Glu Ser Leu	Trp Val Thr Asp Lys Ser Ser Ala lie Asp lie Arg Gly 20 25 30
His Gin Val 35	Thr Val Leu Gly Glu lie Lys Thr Gly Asn Ser Pro Val 40 45
Lys Gin Tyr 50	Phe Tyr Glu Thr Arg Cys Lys Glu Ala Arg Pro Val Lys 55 60
. Asn Gly Cys 65	Arg Gly lie Asp Asp Lys His Trp Asn Ser Gin Cys Lys 70 75 80
Thr Ser Gin	Thr Tyr Val Arg Ala Leu Thr Ser Glu Asn Asn Lys Leu 85 90 95
Val Gly Trp	Arg Trp lie Arg Ile Asp Thr Ser Cys Val Cys Ala Leu 100 105 110
Ser Arg Lys 115	Ile Gly Arg Thr

INFORMACE PRO SEQ ID NO:4:

(i) SEKVENČNÍ CHARAKTERISTIKY:

(A) DÉLKA: 120 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) DRUH ŘETĚZCE: jednoduchý _______________(_D)_TOPOLOGIE: lineární______ (ii) TYP MOLEKULY:protein (xi) POPIS BIOLOGICKY VÝZNAMNÝCH MÍST SEKVENCE:

SEQ ID NO:4:

Met Tyr Ala Glu His 1 5

Lys Ser His Arg Gly Glu Tyr Ser Val Cys Asp

15

Ser Glu Ser Leu Trp Val Thr Asp Lys 20 25

Gly His Gin Val Thr Val Leu Gly Glu 35 40

Ser Ser Ala lie Asp 30

Ile Lys Thr Gly Asn 45 lie Arg

Ser Pro

Val Lys Gin Tyr Phe Tyr Glu Thr Arg Cys Lys Glu Ala Arg Pro Val 50 5560

Lys Asn Gly Cys Arg Gly Ile Asp Asp Lys His Trp Asn Ser GinCys

70 7580 .

Lys Thr Ser Gin Thr Tyr Val Arg Ala Leu Thr Ser Glu Asn AsnLys

9095

Leu Val Gly Trp Arg Trp Ile Arg 100

Ile Asp Thr Ser Cys Val Cys Ala 105 110

Leu Ser Arg Lys Ile Gly Arg Thr

115 120

Claims

PATENTOVÉ NÁROKY

1. BDNF derivát .obsahující BDNF polypeptid, navázaný

----------------na—ai-espoň—j-eden-vodou-rczpustny-’pc-l-ymerv
2. NT-3 derivát obsahující NT-3 polypeptid, navázaný na alespoň jeden vodou rozpustný polymer.
3. Derivát podle nároku 1 nebo 2, vyznačený tím , že polypeptid je připraven rekombinací v bakteriální buňce.
4. Derivát podle nároku 1 nebo 2, vyznačený tím , že se vodou rozpustný polymer zvolí ze skupiny zahrnující dextran, poly(N-vinylpyrrolidon), polyethylenglykol, polypropylenglykol, poly-1,3-dioxan, poly-1,3,6trioxan, kopolymery polypropylenoxidu a ethylenoxidu, polyoxyethylátované polyoly a polyvinylalkoholy.
5. Derivát podle nároku 4, vyznačený tím, že vodou rozpustným polymerem je polyethylenglykol.
6. Derivát podle nároku 5, vyznačený tím, že polyethylenglykolem je monomethoxypolyethylenglykol.
7. Derivát podle nároku 5,vyznačený tím, že polyethylenglykol je navázán ňa polypeptid pomocí acy-1 o v-é—neb o - a-l-ky-lov-é—va-z by-.—------ —---------_:------------
8. Derivát podle nároku 5, vyznačený tím, že polyethylenglykol má molekulovou hmotnost přibližně 2 až 100 kDa.
9. Derivát podle nároku 8,vyznačený tím, že polyethylenglykol má molekulovou hmotnost přibližně od 5 kDA do 50 kDa.
10. Způsob navázání vodou rozpustného polymeru na polypeptid, zvolený ze skupiny zahrnující BDNF a NT-3, vyznačený tím, že vodou rozpustný polymer má jednu reakční aldehydovou skupinu a uvedený způsob zahrnuj e:

(a) uvedení polypeptidů do reakce s vodou rozpustným polymerem za redukčně alkylačních podmínek, při pH, které je natolik kyselé, že umožní α-aminoskupině na N-konci uvedeného polypeptidů být reaktivní; a (b) izolování polypeptidů, navázaného na alespoň jeden vodou rozpustný polymer.
11. Způsob podle nároku 10, vyznačený tím, že dále zahrnuje (c) separaci polypeptidu, navázaného na alespoň jednom vodou rozpustném polymeru, od nezragovaných molekul.
12. Způsob podle nároku 10, v y z n a č e n ý tím., že polymer je farmaceuticky přijatelný.
13. Způsob podle nároku 10, vyznačený tím, že se vodou rozpustný polymer zvolí ze skupiny zahrnující dextran, poly(N-vinylpyrrolidon), polyethylenglykol, polypropylenglykol, poly-1,3-dioxan, poly-1,3,6trioxan, kopolymery polypropylenoxidu a ethylenoxidu, polyoxyethylátované polyoly a polyvinylalkoholy.
14. Způsob podle nároku 13, v y z n a c e n y tím, že vodou rozpustným polymerem je polyethylenglykol.
15. Způsob podle nároku 10, vyznačený tím, že pH hodnota se pohybuje přibližně mezi 3 a 9.
16. Způsob podle nároku 10, vyznačený tím, že redukčně . alkylační podmínky zahrnují použití nátriumkyanoborohydridu jako redukčního činidla.

tvf

42 l .
17. Způsob navázáni polyethylenglykolové molekuly na i

polypeptid, zvolený ze skupiny ‘zahrnující BDNF a NT-3, vyznačený tím, že polyethylenglykolové molekula^. má jednu reakční aldehydovou. skupinu a uvedený způsob zahrnuje:

.i (a) . uvedení polypeptidu do · reakce s k

V/-_______polyethylenglykolovou molekulou za__ redukčně .alkyl^?D-.í.ch

I í x . podmínek, ;při pH, které je natolik kyselé, že umožní a_A aminoskupině na N-konci uvedeného . polypeptidu být • , reaktivní; a

(. (b) izolování polypeptidu, navázaného na polyethylenglykol..
18. Způsob podle nároku 17, vyznačený tím, že dále zahrnuje (c) separaci reakčního produktu od nezragovaných molekul.
19. Způsob podle nároku 17, vyznačený tím, že polyethylenglykolové molekula má molekulovou hmotnost přibližně 2 kDa až 100 kDa.
20. Konjugát vodou rozpustného polymeru a polypeptidu, připraví způsobem podle nároku 17.
21. V podstatě homogenní přípravek BDNF, monopegyláto- vaného na α-aminoskupině N-konce polypeptidu.
22. V podstatě homogenní přípravek NT-3, monopegylátovaného na a-aminoskupině N-konce polypeptidu.
23. Způsob zlepšení in vivo účinnosti BDNF při ošetření poškozených motoneuronů, vyznačený ——g_e- -_zahrnu je-použ i ti—pegy-láto váného- de-r i-vátu-BDNF-.- -
24. Způsob zlepšení in vivo účinnosti NT-3 při ošetření poškozených motoneuronů, vyznačený tím, že zahrnuje použití pegylátovaného derivátu BDNF.