CZ150695A3 - DNA kodující 2-acyltransferásy - Google Patents

Description

Předložený vynález se týká modifikovaných rostlin. Zejména se vynález týká rostlin modifikovaných tak, že alespoň část rostliny /například semena rostliny/ je schopna poskytnout komerčně využitelný olej.

Dosavadní stav techniky

Rostliny jsou již dlouhou dobu komerčně cenným zdrojem oleje. Nutriční využití olejů získaných z rostlin bylo dosud dominantní, ale pozornost je nyní obracena k rostlinám jako zdroji průmyslově využitelných olejů, například jako náhrad nebo zlepšení minerálních olejů. Olejová semena, jako z řepky, obsahují různé lipidy /Hildish and Williams, Chemical Composition of Natural Lipids, Chapman Halí, Londýn,

1964/. Nyní je projevován zájem o změnu lipidového složení za použití rekombinantní DNA technologie /Knauf,

TIBtech, únor 1987, 40-47/, ale dosud nebyly realizovány žádné z těchto cílů a to z mnoha různých příčin navzdory stále se zvyšující náročností, technologie.

Úspěch ve změně obsahu lipidů v olejích získaných z rostlin vyžaduje spolehlivou znalost biochemie a genů, které jsou zde obsaženy. V širším smyslu jsou dostupná dvě řešení. Za prvé mohou být rostliny modifikovány tak, aby umožnily syntézu mastných kyselin, které jsou nové /pro rostlinu/í tak, mohou být například laurát a/nebo stearát syntetizovány v řepce. Za druhé, způsob a/nebo přebytek inkorporace mastných kyselin do glycerolového řetězce lipidu může být změněn. Druhé řešení je obsaženo v předloženém vynálezu i když první může být navíc také využito.

Lipidy jsou vytvářeny v rostlinách adicí skupin mastné kyseliny na glycerolový řetězec sérií acyltransferásových enzymů. V glycerolové molekule jsou tři polohy,

-2do kterých mohou být skupiny mastné kyseliny /acyl/ substituovány a substituce dosahovaná v každé poloze je katalyzována polohově specifickým enzymem: tento enzym je znám jako 1-, 2- a 3-acyltransferása.

Jedním, ale ne pouze tímto, současným cílem lipidového inženýrství v rostlinách je poskytnutí olejů, obsahujících lipidy s vysokým obsahem erukové /22:1/ kyseliny. Eruko vou kyselinu obsahující lipidy jsou komerčně žádoucí z mnoha důvodů, zejména jako náhrady nebo doplňky minerálních olejů za určitých podmínek, jak bylo uvedeno výše. V případě oleje ze semen řepky /Brassica napus/, v současnosti jedné z nejvýznamnějších olej produkujících plodin, specifita enzymu 2-acyltransferása pozitivně rozpoznává inkorporaci erukové kyseliny v poloze 2. Tak i když jsou tyto kultivary řepky schopny inkorporovat kyselinu erukovou v polohách 1 a 3, není zde žádná /nebo je alespoň redukovaná/ diskriminace vůči erukové kyselině, pouze maximálně 66 % mastných kyselin inkorporovaných do triacylglacerolů může být kyselina eruková. Takové odrůdy řepky jsou známé jako HEAR /high erucic acid rape - řepka s vysokým obsahem kyseliny erukové/.

Bylo by žádoucí zvýšit obsah kyseliny erukové v běžných řepkových olejnatých semenech, jakož i HEAR odrůdách; totéž je možno uvést u rostlin, které jsou zdrojem rostlinných olejů, jako je kukuřice, slunečnice a sója, což představuje jen několik příkladů takových rostlin. I když v zásadě je možné zavést do požadované rostliny DNA, kódující 2-acyltransferásu specifickou pro odlišnou mastnou kyselinu, například z odlišné rostliny, v praxi zde existuje řada problémů.

-3Zaprvé jsou 2-acyltransferása a 3-acyltransferása membránově vázané a proto nerozpustné enzymy. Nebyly čištěny. Toto činí práci s nimi obtížnou a vylučuje použití mnoha běžných DNA klonovacích postupů. Tato obtíž paradoxně neleží ve způsobu klonování genu /nebo alespoň cDNA/ kódujícího 1-acyltransferásový enzym, který je rozpustný: ve skutečnosti rekombinantní DNA práce vždy vždy podléhá tomuto enzymu ze zcela rozdílných důvodů, jmenovitě zvýšení odolnosti vůči chladu v listech tabákových rostlin - Murata a spol. /Nátuře 356 710-713 /1992//.

Zadruhé je velmi málo známo o 2- a 3-acyltransferásách. Není zde žádná představa o jejich velikosti nebo jak jsou cíleny k membránám. Nejsou dostupné žádné údaje o nukleotidových nebo aminokyselinových sekvencích a vůči nim nebyl zvýšeny žádné protilátky.

I když zde byla diskuse o tom, že je žádoucí modifikovat 2-acyltransferásovou specifitu, například importováním genu, kódujícího odpovídající enzym, ale odlišné specifity, z jiných druhů, existuje zde v oboru potřeba klíčového řešení, které by umožnilo práci provést. Předložený vynález poskytuje takové klíčové řešení ve formě DNA sekvence /ve specifickém případě cDNA sekvence/ kódující 2-acyltransferásu. DNA sekvence na obr. 1 z nukleotidů 130 až 1254 kóduje 2-acyltransferásu z kukuřice /Zea mays/, obsahující stop kodon.

Podstata vynálezu

Podle prvního aspektu vynálezu je zde poskytnuta rekombinantní nebo izolovaná DNA sekvence, výhodně kódující enzym, mající membránově navázanou acyltransferásovou aktivitu a vybranou z:

i/ DNA sekvence, zahrnující DNA sekvenci z obr. 1, kódující alespoň od MET^ do Stop₄₁₈ /seQ ID: 2/ nebo její

-4komplementárná řetězec, ii/ nukleokyselinové sekvence hybridizující k DNA sekvenci z obr. 1 /SEQ IDí 1/ nebo jejánu komplementárnímu řetězci za přísných podmínek a iii/ nukleokyselinové sekvence, které by měly hybridizovat k DNA sekvenci z obr. 1 /SEQ ID:1/, nebo jejímu komplementárnímu řetězci, ale s degenerací genetického kódu.

Fragmenty výše uvedených sekvencí, délky například alespoň 15, 20, 30, 40 nebo 60 nukleotidů, také spadají do rozsahu vynálezu.

Vhodné přísné podmínky zahrnují solné roztoky přibližně 0,9 molární při teplotě od 35 °C do 65 °C. Konkrétněji, přísné hybridizační podmínky zahrnují 6 x SSC, 5 x Denhardtův roztok, 0,5% pyrofosforačnan tetrasodný a 50 ,ug/ml denaturované:

DNA sledího spermatu; promývá se 2 x 30 minut pri 65 C v 1 x SSC, 0,1% SDS a 1 x 30 minut v 0,2 x SSC, 0,1 %

SDS při 65 °C.

Sekvence nukleové kyseliny v rozsahu prvního aspektu vynálezu budou obecně kodovat protein, mající 2-acyltransferásovou aktivitu, jako je aktivita enzymu kódovaného nukleokyselinovou sekvencí na obr. 1. Nukleokyselinové sekvence nekódující protein, mající enzymatickou aktivitu /nebo relevantní enzymatickou aktivitu/, ale jinak v souladu s prvním aspektem vynálezu jak je uveden výše, mohou být použitelné pro jiné účely /a proto také jsou zahrnuty v rozsahu vynálezu/; například mohou být použitelné jako sondy, jejichž použitelnost je dána nukleokyselinovými sekvencemi podle prvního aspektu vynálezu, včetně samotné sekvence na obr.1.

-5Využitelnost sondy vzniká následovně. Protože zde je pravděpodobně vysoký stupeň homologie mezi acyltransferásami různých druhů /a zejména mezi 2-acyltransferásami různých druhů/ sekvence na obr. 1 /nebo části této sekvence, nebo jinými sekvencemi v rozsahu vynálezu/ může být použita k sondování cDNA nebo genomických knihoven jiných druhů za účelem klonování DNA sekvencí, kódujících acyltransferásy, mající požadované specifity. Například, jestliže je žádoucí produkovat olej, mající vysoký obsah erukové kyseliny esterifikované ke glycerolu, může být sondována DNA knihovna jakýchkoliv druhů, které přirozeně vytvářejí kyselinu erukovou Vhodné rostliny zahrnují /Limnathes spp., zejména L.alba a zejména, L.douglassi/ a Crambe. Limnathes douglassi je preferovaný druh, protože studie specifity ukazují, že je zde pozitivní rozlišování proti inkorporaci erukové kyseliny do polohy 2 triacylglyceridu. Knihovny organismů jiných než vyšších rostlin mohou být sondovány? například určité bakterie mohou mít acyltransferásu požadované specifity.

DNA podle vynálezu bude obecně mít vyšší stupeň homologie s alespoň částí sekvence na obr. 1 než se známými sekvencemi .

Rekombinantní DNA podle vynálezu může mít formu vektoru, který může mít dostatečné regulační sekvence /jako je promotor/ pro řízení exprese. Vektory, které nejsou expresní vektory jsou vhodné pro klonovací účely /jako mohou být samotné expresní vektory/. Hostitelské buňky /jako jsou bakterie a rostlinné buňky/ obsahující vektory podle vynálezu jako takové tvoří součást vynálezu.

DNA sekvence podle vynálezu mohou být použity při dalším způsobu klonování genu z jiných druhů: jestliže DNA je kopulována do vhodného promotoru, například expresního vektoru ve vhodném hostitelském organismu, může být produkován protein. Takový protein může být použit pro přípravu

-6polyklonálních nebo monoklonálních protilátek, nebo jiných vazebných molekul, které pak mohou být použity pro prohledávání při expresi homologních proteinů v jiných druzích, například jako část screeningového programu DNA knihovny.

Vhodné cDNA knihovny cílových druhů budou obecně připraveny, jestliže je požadovaný gen pravděpodobně exprimován j cDNA embryové knihovny /připravené v časném stadiu lipidové syntézy/, budou preferovány - například Limnanthes spp..

Vynález tak umožňuje klonování širokého množství genů /nebo obecněji DNA sekvencí/, kódujících acyltransferásy a 2-acyltransferásy zejména, za použití DNA sekvencí jak jsou popsány výše.

Takové acyltransferásy, jako je z Limnathes spp. mohou být také klonovány přímo, například za použití komplementačních studií, z DNA knihovny požadovaných druhů. Například jestliže je E.coli použita jako komplementační hostitel, je zvolen mutant, který je defektní v relevantním enzymu /například 2-acyltransferáse/? DNA knihovna z cílových druhů /jako je L.douglassi/ se klonuje do mutantního komplementačního hostitele? hostitelské buňky inkorporující do svéhogenomu gen cílové acyltransferásy, mohou být snadno odděleny za použití vhodného selektivního media. E.coli mutant JC201 je vhodný hostitel pro použití v koraplementačních studiích týkajících se 2-acyltransferásy.

Klonování acyltransferásového genu, který byl zvolen, do mikrobiálního hostitele, jako je bakterie podobná E.coli, tak, že gen může být exprimován má zvláštní výhodu v tom, že substrátová specifita acyltransferásového genu může být hodnocena v mikrobiálním hostiteli před přípravou transformovaných rostlin, čímž se ušetří čas pro výzkum. Takové

-7hodnocení může být provedeno kompetitivními substrátovými zkouškami, ve kterých různě detegovatelné značené substráty pro enzym vzájemně soutěží o inkorporaci do glyceridu. Například ^c-erucyl CoA a ^H-oleoyl CoA mohou být použity jako kompetitivní substráty pro 2-acyltransferásu a mohou být měřena relativní množství nebo tritia přijatého do glyceridu. /Protože 2-acyltransferásy mají akčeptor, substráty na bázi glycerolu, a donor, substráty na bázi mastných kyselin, může být pokus proveden s různými akceptory, jako je l-erucyl-glycerol-3-fosfát a l-oleoyl-glycerol-3fosfát/. Gen, kódující enzym, který přednostně dodává erukovou kyselinu k akceptoru /zejména l-erucyl-glycerol-3-fosfát/ může být takto identifikován jako DNA sekvence volby pro další použití ve vynálezu jak je popsáno dále.

Ve druhém aspektu vynálezu je poskytnuta rostlina, mající jeden nebo více nerozpustných acyltransferásových enzymů, majících substrátovou specifitu, která se liší od přirozeného enzymu rostliny.

I když místně řízená mutagenese a/nebo jiné techniky proteinového inženýrství mohou být použity ke změnění specifity enzymu přirozeného pro rostlinu, je preferováno, že rostlina bude transgenní a inkorporovat expresibilní acyltransferásový gen, kódující enzym požadované specifity z jiných druhů. 2-Acyltransferásy jsou enzymy volby. Například jak je popsáno výše, 2-acyltransferásový enzym, který má zvýšenou specifitu pro, nebo alespoň nepůsobí proti, eru^^ove kyselině, může být připraven těmito prostředky k expresi v rostlině, která by normálně neinkorporovala erukovou kyselinu do triacylglyceridů. Důležité provedení vynálezu se týká genetickým inženýrstvím zpracovaných rostlin, které

-8mají vyšší hladiny erukové kyseliny inkorporováné do triacylglacerolů než je tomu v nezpracovaných rostlinách.

I když toto je výhodné provedení, není vynález omezen na zvýšení inkorporace kyseliny erukové do glyceridů: podle okolností mohou být žádoucí i jiné kyseliny.

K acyltransferásovému transgenu byl operativně kopulován promotor, aby tento byl expresibilní. Protože za současného stavu v oboru je obtížné přesně regulovat místo inkorporace transgenu do hostitelského genorau, je výhodné, aby transgen byl kopulován ke svému promotoru před transformací rostliny. Promotory vhodné podle vynálezu mohou být časově- a/nebo semenově specifické, ale není zde žádná nutnost, aby takové byly: konstitutivní promotory, jako je CaMV 35S promotor, mohou být ve skutečnosti preferovány, protože to jsou obvykle silné promotory. Jiné tkáně jsou naneštěstí nežádoucím způsobem ovlivněny, jestliže transgen, kódující acyltransferásový enzym je exprimován v nich, protože využitelnost mastná kyselina CoA substrátů je účinně omezena na semeno.

Konstrukt promotor-transgen, je-li připraven, se zavede do rostlinných buněk jakýmikoliv vhodnými prostředky. Vynález zahrnuje takové rostlinné buňky. Výhodně je DNA transformována do rostlinných buněk za použití bezraménkového Ti-plasmidového vektoru a nesena Agrobacteriem postupy známými v oboru, jak jsou například popsány v EP-A0116718 a EP-A-0270822. Alternativně by mohla být cizí DNA zavedena přímo do rostlinných buněk za použití zařízení s elektrickým výbojem, tato metoda je preferována jestliže je Agrobacterium neúčinné, například tam, kde je rostlina, která je příjemcem, jednoděložná. Vhodná může také být jakákoliv jiná metoda, která poskytuje stabilní inkorporaci DNA do jaderné DNA jakékoliv rostlinné buňky jakéhokoliv druhu. Toto zahrnuje druhy rostlin, které nejsou v současnosti schopny genetické transformace.

-9Výhodně obsahuje DNA podle předloženého vynálezu také druhý chimérický gen / markér gen/, který umožňuje aby transformovaná rostlina nebo tkáňová kultura, obsahující cizí DNA byly snadno odlišeny od jiných rostlin nebo tkáňových kultur, které neobsahují cizí DNA. Příklady takového markerového genu zahrnují antibiotickou rezistenci /Herrera-Estrella a spol., EMBO J. 2/6/ 987-95 /1983/ a Herrera-Estrella a spol., Nátuře 303 209-13 /1983//, herbicidní rezistenci /EP-A-0242246/ a glukorurodidasovou /GUS/ expresi /EP-A-0344029/. Exprese markerového genu je výhodně kontrolována druhým promotorem, který umožňuje expresi buněk jiných než je tapetum, a tak umožňuje selekci buněk nebo tkáně, obsahujících markér v jakémkoliv stadiu regenerace rostliny. Preferovaný druhý promotor je odvozen od genu, který kóduje 35S podjednotku obalového proteinu viru květákové mozaiky /Cauliflower Mosaic Virus - CaMV/.

Může však být použit jakýkoliv jiný vhodný druhý promotor.

Celá rostlina může být regenerována z jediné transformované rostlinné buňky a vynález proto poskytuje transgenní rostliny /nebo jejich části, jako je rozmnožovací materiál/, obsahující DNA podle vynálezu jak je uvedena výše. Regenerace může být provedena známými metodami.

V jednom provedení vynálezu může být nativní acyltransferásový gen transgenní rostliny, který odpovídá transgenu učiněn alespoň částečně neoperativním nebo může být odstraněn. Tak, jestliže transgen kóduje 2-acyltransferásu, může být rostlinná nativní 2-acyltransferása učiněna neoperativní, například, technikami antisense nebo ribozymovou technikou, které jsou v oboru známy.

-10Prostředky podle vynálezu mohou být produkovány rostliny, vytvářející olej se stanoveným obsahem lipidů. Například lipidové složení triacylglyceridů v rostlině může být podstatně změněno za produkce triglyceridů s požadovanou mastnou kyselinou /například kyselinou erukovou/ v určitém obsahu který je vyšší než bylo doposud možné. Například olejnatá semena řepky /B.napus/ mohou být transformována za vzniku oleje, jehož triacylglycerid má obsah erukové kyseliny nad 70 %.

Je zřejmé, že rostliny se zvýšenými hladinami lipidů mohou být produkovány prostředky podle předloženého vynálezu. Avšak vynález je také vhodný pro produkci rostlin se sníženými hladinami lipidů, které mohou být požadovány jest liže jsou žádoucí zvýšené hladiny proteinu a/nebo škrobu. Snížených hladin lipidů může být dosaženo interferováním se správnou funkcí genu, kódujícího 2-acyltransferásu, například antisense nebo ribozymovou technologií. /Takové rostliny s redukovanými lipidy mohou být, je-li to žádoucí, dále zpracovávány pro vyšší obsah proteinu a/nebo škrobu, je-li to žádoucí/.

Promotory, které přirozeně pohánějí 2-acyltransferásy mohou také být získány hybridizací a/nebo restrikcí a/nebo sekvenačními studiemi za použití sekvence na obr. 1.

Vynález umožňuje produkci proteinu kódovaného DNA podle prvního aspektu předloženého vynálezu, který je požadován. Protein může být exprimován hostitelskými buňkami nesoucími DNA ve formě expresního vektoru. Protein, kterým může být enzym, mající aktivitu 2-acyltransferásy, může mít aminokyselinovou sekvenci, které je shodná s nebo homologní se sekvencí na obr. 1. Stupeň homologie bude obecně větší než u známých proteinů a musí být alespoň 40,50, 60, 70,

80, 90, 95 nebo 99 %.

-11Preferované rysy každého aspektu předloženého vynálezu jsou pro každý další aspekt mutatis mutandis.

Vynález je ilustrován následujícími příklady.

Příklady se opírají o připojené obrázky.

Popis obrázků na připojených výkresech

Obr. 1 představuje cDNA sekvenci získanou v příkladu 1 /SEQ ID: 1/ a její odvozenou proteinovou sekvenci /SEQ ID: 2/.

Obr. 2 představuje sekvenci seskupení části genových produktů z plsB /SEQ ID: 3/ a plsC /SEQ ID: 4/ s částí sekvence uvedené na obr. 1 /SEQ ID:5/, ukazující konzervovaný motiv. plsB je E.coli sn-glycerol-3fosfát acyltransferásového genu a plsC 1-acyl-sn-glycerol-3-fosfát acyltransferásového genu E.coli. Dvojtečky označují přesná srovnání mezi dvěma sekvencemi a jediná tečka konzervativní aminokyselinové substituce. Hvězdičky označují shodné aminokyseliny ve všech třech sekvencích a zbytky konzervované ve dvou ze tří sekvencí jsou označeny symbolem +.

Obr. 3A, 3B a 3C: Membránové fosfolipidy z E.coli kmenů byly extrahovány do chloroformu a odděleny 2-rozměrnou chromatografií na tenké vrstvě, první rozměr /vzestupný/ byl vyvíjen za použití chloroformu:methanolu: vody /65:25:4/ a druhý rozměr /zleva doprava/ byl vyvíjen chloroformemsmethanolem:kyselinou octovou /65:25:10/. Fosfolipidy byly vizualizovány autoradiografií po 16 h při -70 °C za použití Fuji RX filmu. E.coli kmeny, které byly použity /obr. 3A/: JC201, který nese termosenzitivní mutaci v 1-acyl-sn-gly-12cerol-3-fosfát acyltransferásovém genu; /obr.

3B/: JC201, obsahující plasmid pPLSC, který kóduje E.coli l-acyl-sn-glycerol-3-fosfát acyltransferásový gen; /obr. 3C/: JC201, obsahující plasmid, jehož cDNA inzertová sekvence je uvedena na obr. 1. LPA, lysofosfatidická kyselina; PE, fosfatidylethanolamin;

CL, cardiolipin; PG, fosfatidylglycerol; PA, fosfatidická kyselina; O, původ. 20 % P je inkorporováno v LPA v JC201 a zbývající odpovídající hladina je inkorporována v PE v obou dalších kmenech.

Obr. 4: Acyltransferásové zkoušky byly provedeny za použití 32

P-značené lysofosfatidické kyseliny, která byla extrahována z E.coli kmene JC201 a oleoyl CoA jako acyl-donoru. Fosfolipidy přítomné v reakčních směsích byly extrahovány do chloroformu a odděleny za použití silikagelové chromatografie na tenké vrstvě. Pro vyvíjení desek byl použit chloroformxmethanol:kyselina octová:voda /25:15:4:2/. Fosfolipidy byly vizualizovány autoradiografií po 16 h při -70 °C za použití Fuji RX filmu. Použitými E.coli kmeny byly: JC201, který nense termosenzitivní mutaci v l-acyl-sn-glycerol-3fosfát acyltransferásovém genu; JC201, obsahující plasmid pPLSC, který kóduje E.coli 1-acyl-sn-glycerol3-fosfát acyltransferásový gen; JC201, obsahující plasmid jehož kukuřiční cDNA inzertová sekvence je uvedena na obr. 1. LPA, lysofosfatidická kyselina; PA, fosfatidická kyselina.

Obr. 4 představuje porovnání proteinové sekvence uvedené na obr. 1 /SEQ ID:6/ se sekvencí odvozenou /SEQ ID:7/ z B.napus semenového cDNA inzertu, který byl izolován při DNA hybridizaci k sekvenci kukuřičné cDNA. Sekvence byly seřazeny pomocí FastA seřazovacího programu /1988/.

Dvojtečky označují shodné aminokyseliny a jednotlivé *

tečky konzervativní aminokyselinové substituce.

-13kukuřice = 374 ak vs. řepka = 311 ak 51,5% identita, optimalizované skoré: 705

Příklady provedení vynálezu

Příklad 1

Derivace cDNA sekvence z obr. 1

Komplementační studie za použití kukuřičné cDNA expresní knihovny transferované do E.coli mutantu JC201 umožňují izolaci plasmidů, kódujícího 2-acyltransferásový enzym z kukuřice. cDNA inzert tohoto plasmidů má velikost l,6kb a obsahuje póly A konec velikosti 70 bp. Inzert byl sekvenován za poskytnutí uvedených dat a translace sekvence odhaluje přítomnost pouze jednoho velkého otevřeného čtecího rámečku. Toto je znázorněno na obr. 1 s navrženým start methioninem a stop kodonem v rámečku. 2-Acyltransferása je velikosti 374 aminokyselin a sekvenování ve směru otevřeného čtecího rámečku ukazuje, že protein je exprimován jako část fuzního proteinu v E.coli. Tento tvoří 10 aminokyselin β-galaktosidásového proteinu, 43 aminokyselin /uvedeno v sekvenci/, odpovídajících

5'netranslatovanému regionu mRNA a 374 aminokyselin proteinu. Srovnání proteinových sekvencí ve velkém otevřeném čtecím rámečku s 2-acyltransferásou E.coli ukazuje malou celkovou identitu, ale je zde rozsah 80 zbytků, který má velkou hladinu konzervativní substituce a obsahuje některé aminokyseliny, které jsou konzervovány ve 2-acyltransferáse, 1-acyltransferáse a N-acetylglukosamin acyltransferáse E.coli.

-14Příklad 2

Inkorporace P do celkových fosfolipidů

E.coli kmeny byly kultivovány v minimálním mediu, obsahujícím P orthofosfát. Celkové fosfolipidy byly extrahovány do organických rozpouštědel a odděleny 2D chromatografií na tenké vrstvě /obr. 3//lysofosfatidická kyselina /LPA/ je substrát pro 2-acyltransferásu /2-AT/.

Jak je zřejmé z obr. 3A, akumulace P-znacené LPA v mutantu JC 201 ilustruje nepřítomnost plně funkční 2-AT. Adicí plasmidu, nesoucího bučí nativní E.coli gen /obr. 3B/ nebo kukuřičný klon uvedený na obr. 1 /obr. 3C/ navrací 2-AT aktivitu buňkám, umožňující LPA aby byla odstraněna a dále metabolizována /lysofosfatidická kyselina/.

tyto údaje ukazují, že DNA sekvence uvedená na obr.

kóduje 2-AT.

Příklad 3

Nadexprese cDNA cDNA region specifikující proteinovou sekvenci uvedenou na obr. 1 byl klonován do E.coli nadexpresního vektoru pETlld /Studier a spol., Meth.Enzymol. 185 60-89/1990//. Zvýšená 2-acyltransferásová aktivita po indukci exprese z plasmidového inzertu potvrzuje, že sekvence na obr. 1 je sekvence 2-AT.

Příklad 4

Lokalizace 2-AT aktivity v E.coli buňkách, obsahujících kukuřičný klon

Byly provedeny 2-acyltransferásové studie za použití

-15membrán izolovaných z mutantu kmene JC.201, který postrádá 2-AT a z JC.201, obsahujícího kukuřičný plasmid /obr. 4/.

2-AT aktivita nebyla detegována v membránových frakcích z JC.201. Adice plasmidu nesoucího nativní E.coli gen nebo sekvenci uvedenou na obr. 1, k JC.201 vede k navrácení 2-AT aktivity membránám.

Příklad 5

Použití kukuřičné cDNA jako heterologní sondy pro získání cDNA z olejnatých semen řepky

Knihovna semenové cDNA z Brassica napus byla screenována sekvencí uvedenou na obr. 1 za použití standardních technik /Sambrook a spol. Molecular Cloning - A Laboratory Manual. 2.vydání, Cold Spring Harbor Laboratory Press,

1989/.

Podmínky

Pro hybridizaci kukuřičného cDNA inzertu do řepkové knihovny: hybridizace byla v 6xSSC, 5xDenhardtův roztok,

0,5 % SDS, 0,5% pyrofosforečnan tetrasodný a 50 ^ug/ml denatu rované DNA sledího spermatu. Filtry byly promývány 2 x 30 minut při 65 °C v lxSSC, 0,1 %SDS a 1 x 30 minut v 0,2xSSC? 0,1% SDS při 65 °C.

Hybridizující klon byl sekvenován a proteinová sekvence odvozena od velkého ORF. Spojení této proteinové sekvence se sekvencí odvozenou z kukuřičného cDNA klonu uvedenou na obr. 1, je uvedeno na obr. 5.

-16Silná identita mezi těmito sekvencemi ilustruje potenciál použití sekvence uvedené na obr. 1 pro získání další 2-ATS.

Příklad 6

Transgenní rostliny

Sekvence uvedená na obr. 1 může být klonována těsně vedle vhodného promotoru, do vhodného vektoru pro expresi do rostlin. Vektor může být použit ke transformování rostlin a výsledné rostliny exprimující 2-AT mohou být analyzovány na obsah lipidů. Lipidový metabolismus se očekává jako přeregulovaný a zvýšené hladiny lipidů byly detegovatelné v semenech.

Příklad 7

Antisense

Sekvence uvedená na obr. 1 může být klonována, těsně vedle víiodného promotoru, v antisense orientaci do vhodného vektoru pro expresi v rostlinách. Vektor může být použit pro transformování rostlin a výsledné rostliny exprimující 2-AT mohou být analyzovány na protein a obsah škrobu. Zvýšené hladiny škrobu a proteinu jsou považovány za detegovatelné v semenech.

Příklad 8

Potlačení nativní 2-AT

DNA sekvence 2-AT odvozená od L.douglassii /získaná jak je popsáno v příkladu 5/ může být zavedena do olejnaté řepky /OSR/ za exprese vhodného promotoru, za použití vektorů a metod transformace rostlin, které jsou v oboru dobře známé. Druhá sekvence, obsahující antisense nebo ribozymy vůči řepkové cDNA /příklad 5/ může být zavedena pro současnou expresi. Výsledná transformovaná rostlina je považována za

-17mající 2-AT aktivitu, odpovídající aktivitě L.douglassii, se současným potlačením nativního řepkového 2-AT genu.

Modifikovaná OSR rostlina takto získaná měla vyšší hladiny erukové kyseliny v poloze 2 svých triacylglycerolů, než mají původní rostliny.Navíc byly nalezeny vyšší hladiny trierucinu v oleji semen.

Příklad 9

Screening genomové knihovny

Sekvence uvedená na obr. 1 se použije ke screeningu geno mové knihovny Arabidopsis a hybridu získaného použitím klonu Za použití standardních technik může být z tohoto klonu získán promotor, promotor může být použit k působení na expresi v rostlinných buněčných membránách.

-18Seznam sekvencí (1) Obecná informace:

(i)Přihlašovatel:

(A)Jméno: Nickerson BIOCEM Limited _TT1 . he jen US ') (g)Ulice: Cambridge Science Park, Milton Road (C)Mesto: Cambridge (E)Země: United Kingdom

Í^p)Póštovní kod: ^{(ZIP) : 034 4GZ} (A) Jméno:; SLABAS, Antoni Ryszard

,. I jen US I (B) Ulice 8 Telford Close, High Shinclffe (C) Město: Durham (E) Země: United Kingdom

Poštovní kod:^(ZIp)^{: DH1 2YJ} (A) Tměno BROWN, Adrian Paul (US pouze) (B) ulice 4 Church Villas, Shadforth (C) město: Durham (E) žerně ^: United Kingdom W poštovní kod <^{ZIP) : DH6 1LQ} (ii) Název vynálezu: DNA, kódující 2-acyltransferásy (iii) počet sekvencí: : 7 (iv) počítačově čtecí forma:

(A) typ media: Floppy disk (B) počítač- : IBM PC compatible (O operační systém: ’ PC-DOS/MS-DOS (D) software : Patentln Release #1.0, Version #1.25 (EPO) (_V) údaje ó přihlášce:

číslo přihlášky:.. - wo PCT/GB93/_ (2) Informace o SEQ i^ NO: i:

(i) charakteristiky sekvence:

(A) délka: 1514 párů bází !^B! typ: nukelová kyselina φ) řetězec: dvojitý topologie: lineární (ii) typ molekuly: cDNA (ix) rysy:

(A) jméno/klíč: cds (B) lokace ^: 130..1254 (xi) Popis sekvence: seq ID NO: i:

CCCCGTCCTC CTCGTCGCCG GCGGAGCCGC CTACTATCGC CTGGAGAAGG AGCGCCGCGG

GGAGCTTTTC CCACTGCCGA CTGCCGTCTG ACCCTCCGAG ATCGGAAGCG GCGCCGGCGC

CGGCCGGCG ATG GCG ATC CCG CTC GTG CTC GTC GTG CTC CCG CTC GGC Met Ala Ile Pro Leu Val Leu Val Val Leu Pro Leu Gly

10

120

168

CTG CTC Leu Leu

TTC CTC

CTG TCC Leu Ser

GGC Gly 20

CTC ATC GTC AAC GCC ATC CAG GCC GTC

216

Phe

Leu

Leu

lle

Val Asn

Ala 25

lle Gin

Ala

Val

15

CTA

TTT

GTG

ACG

ATA

AGG

ccc

TTT

TCG

AAG

AGC

TTC

TAC

CGT

CGG

ATC

264

Leu

Phe

Val

Thr

lle

Arg

Pro

Phe

Ser

Lys

Ser

Phe

Tyr

Arg

Arg

lle

30

35

40

45

AAC

AGA

TTC

TTG

GCC

GAG

CTG

CTG

TGG

CTT

CAG

CTT

GTC

TGG

GTG

GTG

312

Asn

Arg

Phe

Leu

Ala

Glu

Leu

Leu

Trp

Leu

Gin

Leu

Val

Trp

Val

Val

50

55

60

GAC

TGG

TGG

GCA

GGT

GTT

A^G

GTA

CAA

CTG

CAT

GCA

GAT

GAG

GAA

ACT

360

Asp

Trp

Trp

Ala

Gly

Val

Lys

Val

Gin

Leu

His

Ala

Asp

Glu

Glu

Thr

65

70

75

TAC

AGA

TCA

ATG

GGT

AAA

GAG

CAT

GCA

CTC

ATC

ATA

TCA

AAT

CAT

CGG

408

Tyr

Arg

Ser

Met

Gly

Lys

Glu

His

Ala

Leu

lle

lle

Ser

Asn

His

Arg

80

85

90

AGT

GAT

ATT

GAT

TGG

CTC

ATT

GGA

TGG

ATA

TTG

GCC

CAG

CGT

TCA

GGG

456

Ser

Asp

lle

Asp

Trp

Leu

lle

Gly

Trp

lle

Leu

Ala

Gin

Arg

Ser

Gly

95

100

105

TGC

CTT

GGA

AGT

ACA

CTT

GCT

GTC

ATG

AAG

AAG

TCA

TCC

AAG

TTC

CTT

504

Cys

Leu

Gly

Ser

Thr

Leu

Ala

Val

Met

Lys

Lys

Ser

Ser

Lys

Phe

Leu

110

115

120

125

CCA

GTT

ATT

GGC

TGG

TCA

ATG

TGG

TTT

GCA

GAG

TAC

CTC

TTT

TTG

GAA

552

Pro

Val

Xle

Gly

Trp

Ser

Met

Trp

Phe

Ala

Glu

Tyr

Leu

Phe

Leu

Glu

130

135

140

AGG

AGC

TGG

GCC

AAG

GAT

GAA

AAG

ACA

CTA

AAG

TGG

GGT

CTC

CAA

AGG

600

Arg

Ser

Trp

Ala

Lys

Asp

Glu

Lys

Thr

Leu

Lys

Trp

Gly

Leu

Gin

Arg

145

150

155

TTG

AAA

GAC

TTC

CCT

AGA

CCA

TTT

TGG

CTA

GCT

CTT

TTC

GTC

GAG

GGT

648

Leu

Lys

Asp

Phe

Pro

Arg

Pro

Phe

Trp

Leu

Ala

Leu

Phe

Val

Glu

Gly

160

165

170

ACT

CGC

TTT

ACT

CCA

GCA

AAG

CTT

CTC

GCA

GCT

CAG

GAA

TAT

GCG

GCC

696

Thr

Arg

Phe

Thr

Pro

Ala

Lys

Leu

Leu

Ala

Ala

Gin

GlU

Tyr

Ala

Ala

175

180

185

TCC

CAG

GGC

TTA

CCG

GCT

CCT

AGA

AAT

GTA

CTT

ATT

CCA

CGT

ACC

AAG

744

Ser

Gin

Gly

Leu

Pro

Ala

Pro

Arg

Asn

Val

Leu

lle

Pro

Arg

Thr

Lys

190

195

200

205

GGA

TTT

GTA

TCT

GCT

GTA

AGT

ATT

ATG

CGA

GAT

TTT

GTT

CCA

GCC

ATT

792

Gly

Phe

Val

Ser

Ala

Val

Ser

lle

Met

Arg

Asp

Phe

Val

Pro

Ala

lle

210

215

220

TAT

GAT

ACA

ACT

GTA

ATA

GTC

CCT

AAA

GAT

TCC

CCT

CAA

CCA

ACA

ATG

840

Tyr

Asp

Thr

Thr

Val

lle

Val

Pro

Lys

Asp

Ser

Pro

Gin

Pro

Thr

Met

225

230

235

CTG

CGG

ATT

TTG

AAA

GGG

CAA

TCA

TCA

GTG

ATA

CAT

GTC

CGC

ATG

AAA

888

Leu

Arg

lle

Leu

Lys

Gly

Gin

Ser

Ser

Val

lle

His

Val

Arg

Met

Lys

240

245

250

CGT

CAT

GCA

ATG

AGT

GAG

ATG

CCA

AAA

TCA

GAT

GAG

GAT

GTT

TCA

AAA

936

Arg

His

Ala

Met

Ser

Glu

Met

Pro

Lys

Ser

Asp

Glu

Asp

Val

Ser

Lys

255 260 265

TGG Trp 270	TGT Cys	AAA GAC Lys Asp	ATT TTT GTG GCA AAG GAT GCC TTA CTG GAC AAG CAT	984
Ile	Phe Val Ala Lys 275	Asp Ala Leu 280	Leu Asp	Lys	His 285
TTG	GCA	ACA GGC	ACT	TTC GAT GAG GAG	ATT AGA CCT	ATT GGC	CGT	CCA	1032
Leu	Ala	Thr Gly	Thr 290	Phe Asp Glu Glu	Ile Arg Pro 295	Ile Gly Arg 300	Pro
GTG	AAA	TCA TTG	CTG	GTG ACC CTG TTC	TGG TCG TGC	CTC CTG	CTG	TTT	1080
Val	Lys	Ser Leu 305	Leu	Val Thr Leu Phe 310	Trp Ser Cys	Leu Leu 315	Leu	Phe
GGC	GCC	ATC GAG	TTC	TTC AAG TGG ACA	CAG CTT CTG	TCG ACG	TGG	AGG	1128
Gly	Ala	Ile Glu 320	Phe	Phe Lys Trp Thr 325	Gin Leu Leu	Ser Thr 330	Trp	Arg
GGT	GTG	GCG TTC	ACT	GCC GCA GGG ATG	GCG CTT GTG	ACG GGT	GTC	ATG	1176
Gly	Val 335	Ala Phe	Thr	Ala Ala Gly Met 340	Ala Leu Val 345	Thr Gly	Val	Met
CAT	GTC	TTC ATC	ATG	TTC TCC CAG GCT	GAG CGG TCG	AGC TCA	GCC	AGG	1224
His 350	Val	Phe Ile	Met	Phe Ser Gin Ala 355	Glu Arg Ser 360	Ser Ser	Ala	Arg 365
GCG Ala	GCA Ala	CGG AAC Arg Asn	CGG Arg	GTC AAG AAG GAA Val Lys Lys Glu	TGAAAAATGG AGGGTGGAGA		1271

	370		375 '
TGAGGTTCTC	GTGGGGTTTG	TTATGGGCAA	CCTTCAAAAG	GACTCTCCAT	TCATATTAGT	1331
ATTAATTCAT	ATATATGCAG	CGCCAAATTC	CAGACATTGA	TATGCTCTCA	AATAGGATGT	1391
TCTGCTCCCC	TCTTGTATTT	GTATGCAGGA	AAGGGTTTGT	AGGGAGTTTA	CCCCCCCCCC	1451
CCCCCCCCCC	GCCTTTCTTT	GGGGAAGAAA	GACATATTCT	GGAAGCCTTC	CAGTAGTTCA	1511

AAA

1514

-21(2) Informace O SEQ ID NO: 2:

(£) Charakteristiky sekvence:

(A) délka: 374 aminokyselin (B) typ: aminokyselina (D) topologie: lineární (ii)typ molekuly: protein

(xi)

popis sekvence:

SEQ

ID NO 2:

• *

2:

Met 1

Ala

Ile

Pro

Leu 5

Val

Leu

Val

Val

Leu 10

Pro

Leu

Gly

Leu

Leu 15

Phe

Leu

Leu

Ser

Gly 20

Leu

Ile

Val

Asn

Ala 25

Ile

Gin

Ala

Val

Leu 30

Phe

Val

Thr

Ile

Arg 35

Pro

Phe

Ser

Lys

Ser 40

Phe

Tyr

Arg

Arg

Ile 45

Asn

Arg

Phe

Leu

Ala 50

Glu

Leu

Leu

Trp

Leu 55

Gin

Leu

Val

Trp

Val 60

Val

Asp

Trp

Trp

Ala 65

Gly

Val

Lys

Val

Gin 70

Leu

His

Ala

Asp

Glu 75

Glu

Thr

Tyr

Arg

Ser 80

Met

Gly

Lys

Glu

His 85

Ala

Leu

Ile

Ile

Ser 90

Asn

His

Arg

Ser

Asp 95

Ile

Asp

Trp

Leu

Ile 100

Gly

Trp

Ile

Leu

Ala 105

Gin

Arg

Ser

Gly

Cys 110

Leu

Gly

Ser

Thr

Leu 115

Ala

Val

Met

Lys

Lys 120

Ser

Ser

Lys

Phe

Leu 125

Pro

Val

Ile

Gly

Trp 130

Ser

Met

Trp

Phe

Ala 135

Glu

Tyr

Leu

Phe

Leu 140

Glu

Arg

Ser

Trp

Ala 145

Lys

Asp

Glu

Lys

Thr ISO

Leu

Lys

Trp

Gly

Leu 155

Gin

Arg

Leu

Lys

Asp 160

Phe

Pro

Arg

Pro

Phe 165

Trp

Leu

Ala

Leu

Phe 170

Val

Glu

Gly

Thr

Arg 175

Phe

Thr

Pro

Ala

Lys 180

Leu

Leu

Ala

Ala

Gin 185

Glu

Tyr

Ala

Ala

Ser 190

Gin

Gly

Leu

Pro

Ala 195

Pro

Arg

Asn

Val

Leu 200

Ile

Pro

Arg

Thr

Lys 205

Gly

Phe

Val

Ser

Ala 210

Val

Ser

Ile

Met

Arg 215

Asp

Phe

Val

Pro

Ala 220

Ile

Tyr

Asp

Thr

Thr 225

Val

Ile

Val

Pro

Lys 230

Asp

Ser

Pro

Gin

Pro 235

Thr

Met

Leu

Arg

Ile 240

Leu

Lys

Gly

Gin

Ser 245

Ser

Val

Ile

His

Val 250

Arg

Met

Lys

Arg

His 255

Ala

Met

Ser

Glu

Met 260

Pro

Lys

Ser

Asp

Glu 265

Asp

Val

Ser

Lys

Trp 270

Cys

Lys

Asp

Ile

Phe 275

Val

Ala

Lys

Asp

Ala 280

Leu

Leu

Asp

Lys

His 285

Leu

Ala

Thr

Gly

Thr

Phe

Asp

Glu

Glu

Ile

Arg

Pro

Ile

Gly

Arg

Pro

Val

Lys

Ser

290

295

300

Leu

Leu

Val

Thr

Leu

Phe

Trp

Ser

Cys

Leu

Leu

Leu

Phe

Gly

Ala

Ile

305

310

315

320

Glu

Phe

Phe

Lys

Trp

Thr

Gin

Leu

Leu

Ser

Thr

Trp

Arg

Gly

Val

Ala

325

330

335

Phe

Thr

Ala

Ala

Gly

Met

Ala

Leu

Val

Thr

Gly

Val

Met

His

Val

Phe

340

345

*

350

Ile

Met

Phe

Ser

Gin

Ala

Glu

Arg

Ser

Ser

Ser

Ala

Arg

Ala

Ala

Arg

355

t

360

365

Asn

Arg

Val

Lys

Lys

Glu

370

-232) Informace o ' id NO: 3:

charakteristiky sekvence:

(A) délka: 15 aminokyselin (B) typ: aminokyseliny (D) topologie: lineární . (ii) typ molekuly: protein (xi) popis sekvence: seq ID NO: 3:

Tyr Phe Val Glu Gly Gly Arg Ser Arg Thr Gly Arg Leu Leu Asp 1 5 10 15

-24(2) Informace ® SEQ ID NO: 4:

Charakteristiky sekvence: (_Ajdélka: 15 aminokyselin (B)typ: aminokyselina (D)topologie: lineární (ii) : typ molekuly: protein (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 4:

Met Phe Pro Glu Gly Thr Arg Ser Arg Gly Arg Gly Leu Leu 15 10

Pro

-25(2) Informace o seq ID no.· 5:

charakteristiky sekvence:

(A) délka: 15 aminokyselin (B) typ: aminokyselina (D) topologie:-lineární (ii) typ molekuly: protein (xi)popis sekvence: SEQ ID NO: 5:

Leu Phe Val Glu Gly Thr Arg Phe Thr Pro Ala Lys Leu Leu Ala 15 10 15 (2) Informace o seq je no_: g_; ^!il sekvence:

: 374 aminokyselin (D) tyP^: aminokyselina topologie: lineární (ii) typ molekuly: protein (xi) popis sekvence: SEQ ID NO: 6:

Met 1

Ala

Ile

Pro

Leu 5

Val

Leu

Val

Val

Leu 10

Pro

Leu

Gly

Leu

Leu 15

Phe

Leu

Leu

Ser

Gly 20

Leu

Ile

Val

Asn

Ala 25

Ile

Gin

Ala

Val

Leu 30

Phe

Val

Thr

Ile

Arg 35

Pro

Phe

Ser

Lys

Ser 40

Phe

Tyr

Arg

Arg

Ile 45

Asn

Arg

Phe

Leu

Ala 50

Glu

Leu

Leu

Trp

Leu S5

Gin

Leu

Val

Trp

Val 60

Val

Asp

Trp

Trp

Ala 55

Gly

Val

Lys

Val

Gin 70

Leu

His

Ala

Asp

Glu 75

Glu

Thr

Tyr

Arg

Ser 80

Met

Gly

Lys

Glu

His 85

Ala

Leu

Ile

Ile

Ser 90

Asn

His

Arg

Ser

Asp 95

Ile

Asp

Trp

Leu

Ile 100

Gly

Trp

Ile

Leu

Ala 105

Gin

Arg

Ser

Gly

Cys 110

Leu

Gly

Ser

Thr

Leu 115

Ala

Val

Met

Lys

Lys 120

Ser

Ser

Lys

Phe

Leu 125

Pro

Val

Ile

Gly

Trp 130

Ser

Met

Trp

Phe

Ala 135

Glu

Tyr

Leu

Phe

Leu 140

Glu

Arg

Ser

Trp

Ala 145

Lys

Asp

Glu

Lys

Thr 150

Leu

Lys

Trp

Gly

Leu 155

Gin

Arg

Leu

Lys

Asp 160

Phe

Pro

Arg

Pro

Phe 165

Trp

Leu

Ala

Leu

Phe 170

Val

Glu

Gly

Thr

Arg 175

Phe

Thr

Pro

Ala

Lys 180

Leu

Leu

Ala

Ala

Gin 185

Glu

Tyr

Ala

Ala

Ser 190

Gin

Gly

Leu

Pro

Ala 195

Pro Arg Asn Val Leu Ile Pro Arg Thr 200

Lys Gly Phe 205

Val

Ser

Ala

Val

Ser

Ile

Met

Arg

Asp

Phe

Val

Pro

Ala

Ile

Tyr

Asp

Thr

210

215

220

Thr

Val

Ile

Val

Pro

Lys

Asp

Ser

Pro

Gin

Pro

Thr

Met

Leu

Arg

Ile

225

230

235

240

Leu

Lys

Gly

Gin

Ser

Ser

Val

Ile

His

Val

Arg

Met

Lys

Arg

His

Ala

245

250

255

Met

Ser

Glu

Met

Pro

ř Lys

Ser

Asp

Glu

Asp

Val

Ser

Lys

Trp

Cys

Lys

260

265

270

Asp

Ile

Phe

Val

Ala

Lys

Asp

Ala

Leu

Leu

Asp

Lys

His

Leu

Ala

Thr

275

280

285

Gly

Thr

Phe

Asp

Glu

Glu

Ile

Arg

Pro

Ile

Gly

Arg

Pro

Val

Lys

Ser

290

295

300

Leu

Leu

Val

Thr

Leu

Phe

Trp

Ser

Cys

Leu

Leu

Leu

Phe

Gly

Ala

Ile

305

310

315

320

Glu

Phe

Phe

Lys

Trp

Thr

Gin

Leu

Leu

Ser

Thr

Trp

Arg

Gly

Val

Ala

325

330

335

Phe

Thr

Ala

Ala

Gly

Met

Ala

Leu

Val

Thr

Gly

Val

Met

His

Val

Phe

340

345

350

Ile

Met

Phe

Ser

Gin

Ala

Glu

Arg

Ser

Ser

Ser

Ala

Arg

Ala

Ala

Arg

355

360

365

Asn

Arg

Val

Lys

Lys

Glu

370

-27(2') informace o ^SE*Q ID NO: 7:

(i) Charakteristiky sekvence:(A) délka: ²⁹⁵ aminokyselin tyP^: aminokyselina ^D topologie: lineární . (ii) typ molekuly: protein (xi) popis sekvence: SEQ ID NO: 7:

Met 1

Ala

Met

Ala

Ala 5

Ala

Val

Ile

Val

Pro 10

Leu

Gly

Ile

Leu

Phe 15

Phe

Ile

Ser

Gly

Leu 20

Val

Val

Asn

Leu

Leu 25

Gin

Arg

Ser

Gly

Cys 30

Leu

Gly

Ser

Ala

Leu 35

Ala

Val

Met

Lys

Lys 40

Ser

Ser

Lys

Phe

Leu 45

Pro

Val

Ile

Gly

Trp 50

Ser

Met

Trp

Phe

Ser 55

Glu

Tyr

Leu

Phe

Leu 60

Glu

Arg

Asn

Trp

Ala 65

Lys

Asp

Glu

Ser

Thr 70

Leu

Lys

Ser

Gly

Leu 75

Gin

Arg

Leu

Asn

Asp 80

Phe

Pro

Arg

Pro

Phe 85

Trp

Leu

Ala

Leu

Phe 90

Val

Glu

Gly

Thr

Arg 95

Phe

Thr

Glu

Ala

Lys 100

Leu

Lys

Ala

Ala

Gin 105

Glu

Tyr

Ala

Ala

Ser 110

Ser

Glu

Leu

Pro

Val 115

Pro

Arg

Asn

Val

Leu 120

Ile

Pro

Arg

Thr

Lys 125

Gly

Phe

Val

Ser

Ala 130

Val

Ser

Asn

Met

Arg 135

Ser

Phe

Val

Pro

Ala 140

Ile

Tyr

Asp

Met

Thr 145

Val

Ala

Ile

Pro

Lys ISO

Thr

Ser

Pro

Pro

Pro 155

Thr

Met

Leu

Arg

Leu 160

Phe

Lys

Gly

Gin

Pro 165

Ser

Val

Val

His

Val 170

His

Ile

Lys

Cys

His 175

Ser

Met

Lys

Asp

Leu 180

Pro

Glu

Ser

Glu

Asp 185

Glu

Ile

Ala

Gin

Trp 190

Cys

Arg

Asp

Gin

Phe 195

Val

Thr

Lys

Asp

Ala 200

Leu

Leu

Asp

Lys

His 205

Ile

Ala

Ala

Asp

Thr 210

Phe

Ala

Gly

Gin

Lys 215

Glu

Gin

Asn

Ile

Gly 220

Arg

Pro

Ile

Lys

Ser 225

Leu

Ala

Val

Val

Leu 230

Ser

Trp

Ala

Cys

Leu 235

Leu

Thr

Leu

Gly

Ala 240

Met

Lys

Phe

Leu

His 245

Trp

Ser

Asn

Leu

Phe 250

Ser

Ser

Trp

Lys

Gly 255

Ile

Ala

Leu

Ser

Ala

Leu

Gly

Leu

Gly

Ile

Ile

Thr

Leu

Cys

Met

Gin

Ile

260 265 270

Leu Ile Arg Ser Ser Gin Ser Glu Arg Ser Thr Pro Ala Lys Val Ala 275 280 285

-28Pro Ala Lys Pro Lys Asp Asn

Claims (18)

1. o c O

   PATENTOVÉ NÁROKY ty/sve-v to ď cn

   1. Rekombinantní nebo izolovaná DNA sekvence vybraná z (i) DNA sekvence, obsahující DNA sekvenci z obr. 1, kódující alespoň od Met₄₄ do Stop₄₁g (SEQ ID: 2) nebo její komplementární řetězec, (ii) nukleokyselinové sekvence hybridizující k DNA sekvenci z obr. 1 (SEQ ID: 1) nebo jejímu komplementárnímu řetězci za přísných podmínek a (iii) nukleokyselinové sekvence, které by měly hybridizovat k DNA sekvenci z obr. 1 (SEQ ID: 1), nebo jejímu komplementárnímu řetězci, ale za degenerace genetického kódu.
2. 2. DNA sekvence podle nároku 1, která kóduje enzym, mající membránově vázanou acyltransferázovou aktivitu.
3. 3. DNA sekvence podle nároku 2, ve které acyltransferázová aktivita je 2-acyltransferázová aktivita.
4. 4. Izolovaný protein, který je produktem exprese DNA sekvence podle nároku 1, 2 nebo 3.
5. 5. Protilátka schopná specifického navázání k proteinu podle nároku 4.
6. 6. Rostlina, která má jeden nebo více nerozpustných acyltransferázových enzymů s jinou substrátovou specifitou, než má nativní enzym rostliny.
7. 7. Rostlina podle nároku 6, která je transgenní pro nerozpustný acyltransferázový enzym z jiných druhů.
8. 8. Rostlina podle nároku 6 nebo 7, kterou j e řepka, kukuřice, slunečnice nebo sója.
9. 9. Rostlina podle nároku 7, kde uvedeným jiným druhem je druh rodu Limanthes, jako je L. alba nebo výhodně L. douglassi, nebo Crambe.
10. 10. Rostlina podle kteréhokoliv z nároků 6 až 9, kde nerozpustným acyltransferázovým enzymem je 2-acyltransferáza.
11. 11. Rostlina podle nároku 10, kde 2-acyltransferáza má vyšší specifitu pro kyselinu erukovou než přirozený enzym rostliny.
12. 12. Rostlina podle kteréhokoliv z nároků 6 až 11, kde uvedený přirozený enzym je alespoň částečně učiněn neoperativním nebo je odstraněn, například ribozymem nebo antisense nukleovou kyselinou.
13. 13. Způsob získání oleje, vyznačující se tím, že zahrnuje kultivaci rostliny podle kteréhokoliv z nároků 6 až 12 a sklizeň oleje produkovaného rostlinou nebo její částí, zej ména semeny.
14. 14. Protein, který je v podstatě homologní k proteinu podle nároku 4.
15. 15. Fragment DNA sekvence podle nároku 1, 2 nebo 3, obsahující alespoň 15 nukleotidů.
16. 16. DNA kódující RNA, která je v opačném směru (antisense) k RNA, kódované DNA podle nároku 1, 2 nebo 3.
17. 17. DNA, kódující ribozym specifický k RNA, kódované DNA podle nároku 1, 2 nebo 3.
18. 18. Izolovaná nebo rekombinantní DNA, obsahující promotor, který přirozeně pohání expresi genu k produkci proteinu podle nároku 4 nebo 14.