CZ171492A3 - Polypeptide, process of its preparation, pharmaceutical composition containing thereof and its use as an intermediate for insulin preparation - Google Patents

Description

Polypeptid, způsob jeho přípravy, farmaceutický prostředek, který ho obsahuje a jeho použiti jakožto meziproduktu pro přípravu inzulínu

Oblast teohníky

Vynález se týká polypeptidů A-C-B proinzulin, způsobu jeho přípravy, farmaceutického prostředku, který ho obsahuje a použití , A-C-B-proinzulinu jakožto meziproduktu pro přípravu inzulínu.

Dosavadnl stav techniky

Intenzivní studie diabetes vedly k tomu, že inzulín je skutečně nejlépe prostudován ze všech bílkovinových molekul. Proto je inzulín výhodným substrátem pro zkoušeni vlivu obměn v primární struktuře vyššího řádu bilkovinové struktury a funkce, Rekombinantni DNA technologie usnadňuje generaci nových inzulínových analogů pro SAR a terapeutická použiti. Katalogované efekty takových obměn pravděpodobně objasni pravidla řidiči vztah mezi primárními a vyššími řády konformace bílkoviny. Takové modifikace primární struktury jsou poměrně vzácnější se zřetelem na nativní sekvenci. Avšak takové omezené odlišnosti od nativní sekvence poskytuji málo informací, jelikož jde o odlišnou cestu.

Úkolem sledování biochemie je spíše konstrukce umělých molekul s předem určenými funkcemi než naděje na objeveni přírodně >

se vyskytující sloučeniny, mající žádouci vlastnosti.Přes významné pokroky ve stavu techniky chybi příklady syntetických analogů, které se značně liší svojí primární strukturou od svých přírodně se vyskytujících protějšků. Vynález využívá dobře charakterizované molekuly inzulínu pro vývoj syntetického analogu proinzulinu, který se značně liši strukturou a fyzikálnmimi vlastnostmi od přírodně se vyskytující proinzulinové molekuly a od známých analogů proinzulinu.

Inzulín je bílkovina, sestávající ze dvou podjednotkových polypeptidů, obecně označovaných jakožto A-řetézec a B-řetězec, které jsou kovalentně vázány prostřednictvím disulfidických vazeb. Lidský inzulín, který je representativním příkladem inzulínové struktury, je graficky znázovněn na obr. 29. Biochemický způsob výroby inzulínu je v oboru dobře znám a popsal ji například Stryer L., Biochemistry, 2, vydání, 1981, W.H. Freeman & Co., San Francisco, str. 847 až 848. Přírodní in vivo chemická cesta k inzulínu vede přes předproinzulin a proinzulin jakožto meziprodukty.

Inzulín se rekombinančně připravuje prostřednictvím exprese proinzulinu a následným enzymatickým zpracováním. Proinzulin, bezprostřední prekursor inzulínu, je jednořetězcová bílkovina. Dva řetězce inzulínové molekuly se produkují excisi interní oblasti, běžně označovanou jakožto C-region nebo C-peptíd proinzulinu. Po vytvořeni intrařetězcového a interřetězcového disulfidického sesitění se internální po 1ypeptidová sekvence (C-peptid) vypustí působením trypsinu a enzymů karboxypeptidasy B, čimž se získá funkční inzulínová molekula.

Provede se translace proinzulinovového genu k dosaženi odpovídající aminokyselinové sekvence B-řetězec/C-peptid/A-řetězec. Jelikož rekombinantnl produkce inzulínu začíná spíše u proinzulinové molekuly než u předproinzulinové molekuly, má rekombinantnl proinzulinová molekula charakteristicky methioninový zbytek na aminokyse1 lnovém konci. Proto se tento methionin, odvozený od Nkonce proinzulinu, přenáší a zůstává na aminokyselinovém konci inzulínového B-řetězce, Proto se tento methioninový zbytek neodstraní bakteriální hostitelskou buňkou. Je proto nutné chemicky nebo enzymaticky odstraňovat tento N-koncový methionin in vitro k získáni nativní proinzulinové nebo inzulínové molekuly.

Působení methionylaminové peptidasy (MAP), bílkoviny vlastni E. coli, odstraňuje N-koncový deformylováný methionin za podmínky, že druhým zbytkem není arginin, aspartát, glutamin, glutamát, isoleucin, leucin, lysin nebo methionin. Přezkoušení primární struktury inzulínové molekuly, přičemž lidský inzulín je representativním příkladem, uvedeným na obr. 29, dokládá, že N-koncový zbytek B-fetězce, odpovídajíc! N-koncovému zbytku přírodního proinzulinu, je fenylalanin. Tento transkripční a translační pořádek bráni odstranění N-koncového methioninu z rekombinačně E. coli produkované proinzulinové molekuly působením MAP. Avšak N-koncovou aminokyselinou A-řetězoe je glyaoín, jehož přitomnost neihhibuje působeni MAP. Proto, v případě reverzní sekvence translace ze systému B-řetězec/C-peptid/A-řetézec na A-řetězec/C-peptíd/B-řetězec bude působeni MAP eliminovat N-koncový methionin. Tím se také vyloučí potřeba dodatečného translačniho odstraňování N-koncevého methioninu, což má velké obchodní a technické přednosti.

Podstata vynáiezu

Podstatou vynálezu je polypeptidové sloučenina obecného vzorce I

Metx-A-C-B (I) kde znamená

Met aminokyselinu methionin, x O nebo 1,

A řetězec A inzulínu nebo jeho funkční derivát,

B řetězec B inzulínu nebo jeho funkční derivát,

C C-peptid inzulínu nebo peptid obecného vzorce

Xi- X₂- P - X₃- X₄ kde znamená

Xi,X2,Xa a X₄ bazické aminokyseliny, které jsou stejné nebo odliěné a

P peptid obsahující 4 až 35 aminokyselin s výjimkou cysteinu, a jeji farmaceuticky vhodné soli.

Podstatou vynálezu je také způsob přípravy funkční inzulínové molekuly nebo inzulínového analogu, při kterém se používá nových výchozích látek a nových meziproduktů. Tento nový způsob přípravy přes inzulínový prekursor, je založen na inverzi kódující sekvence proinzulinu ze systému B-řetězec/C-peptid/A-řetězec na systém A/řetězec/C-peptid/B-řetězec. Nový, vytvořený inzulínový prekursor vylučuje potřebu posttrans1ačniho chemického nebo enzymatického odstraňování N-koncového methioninu z rekombinantní inzulínové molekuly.

Vynález se také týká nového meziproduktu inzulínového prekursoru, který v podstatě sestává z prvků, ze kterých se konstruuje inzulín biosyntetickou cestou. Tyto nové inzulínové prekursory mají: (al větší inzulínovou aktivitu než přírodně se vyskytuji cí prcinzulin, (b) delší poločas in vivo se zřetelem na inzulín z přírodního proínzulinu a (c) vykazuji zvýšenou schopnost vázat IGF-I receptor ve srovnání s přírodním pro inzulinem. Charakteristiky a omezení vynálezu vyplývají ze studia konstrukce nové molekuly, zvláště se zřetelem na C-peptid, který je instruktivní pro konstrukci analogických molekul proínzulinu a inzulínu.

Restrikční místo a funkční mapy na přiložených výkresech jsou přibližná znázornění popisovaného rekombinantniho DNA vektoru. Informace o retrikčnim místu není vyčerpávající: proto může být více restrikčních míst pro daný typ na vektoru, než je na obr. znázorněno.

Na	obr.	1	je	restrikční	místo	a	funkční	mapa	plasmidu	pkC283.
Na	obr.	2	je	restrikční	místo	a	funkční	mapa	plasmidu	pkC283PX.
Na	obr.	3	je	restrikční	místo	a	funkční	mapa	plasmi du	pkC283-L.
Na	obr.	4	je	restrikční	místo	a	funkční	mapa	plasmidu	pkC283-LB.
Na	obr.	5	je	restrikční	místo	a	funkční	mapa	plasmidu	pkC283-PRS
Na	obr.	6	je	restrikční	místo	a	funkční	mapa	plasmidu	pL32.
Na	obr.	7	je	restrikční	místo	a	funkční	mapa	plasmidu	PNM789.
Na	obr.	8	je	schéma konstrukce	plasmidu	120.
Na	obr.	9	je	restrikční	místo	a	funkční	mapa	plasmidu	pL47.
Na	obr.	10	je	restrikční	místo	a	funkční	mapa	plasmidu	pPR12.
Na	obr.	11	je	restrikční	místo	a	funkční	mapa	plasmidu	PPR12AR1.
Na	obr.	12	je	restrikční	místo	a	funkční	mapa	plasmidu	pLHO.
Na	obr.	13	je	schéma konstrukce	plasmidu	pLHOC.
Na	obr .	14	je	restrikční	místo	a	funkční	mapa	plasmi du	PCZR126S.
Na	obr.	15	je	schéma, 1	objasňující základní	rozdíly orientace

A-řetězce, B-řetězce a C-peptidu a BCA a ACB proinzulinové molekuly.

Na obr,16 je schéma způsobu konstrukce ACB-PI kódující sekvence, odvozené od kompozitu kompatibilní kratší syntetické DNA sekvence.

Na obr. 17 je specifická DNA sekvence, zahrnutá v konstrukci analogu lidského ACB-PI genu, použitého pří konstrukci ACB-PI cenu.

Na obr. 18

Na	obr.	19
Na	obr.	20
Na	obr.	21

Na obr. 22

Na obr. 23

Na obr. 24

Na obr. 25

Na obr. 26

Na obr. 27 Na obr, 28 le jedno provedení umístění restrikčních endcnuklsazových štěpících bodů, určených do analogu lidské ACB-PI kódující sekvence, čímž se usnadňuje integrace do zvláštních klonovacích vektorů, příkladně uvedených, je restrikční místo a funkční mapa plasmidu pRB181. je restrikční místo a funkční mapa plasmidu pRB182. je reversní fázová HPLC analýza Met-ACB proinsulinu a ACB-proinzulinu. Chromatografické podmínky jsou uvedeny v příkladech.

je peptidové mapováni ACB-proinzulinu po trypsin/pepsinové dlgesci. Chromatogram vykazuje rezultujicí peptidy spolu s elučnimi posicemi tři možných disulfidických isomerních peptidů.

Ϊ-'jsou výsledky zkoušky vázáni lidského placentálního inzulínového receptoru. Graf ukazuje konkurenci lidského inzulínu, lidského proinzulinu, ACB-proinžulinu, Met-ACB-proinzulínu s izsi inzulínem v připadá vázání na inzulínový receptor.

je vázáni lidského placentálnlho IGF-I receptoru. Diagram představuje konkurenci lidského IGF-I, Met-ACBproinzulinu, ACB-proin2ulinu, lidského inzulinu a lidského proinzulinu s rGF-I ’v připadá vázání na

H -Ijt·.

'«/Ϊ-,

-, Η.·!»·»*»

IGF-I receptor.

je HPLC analýza proteolytické transformace ACB-proinzulinu na inzulín, Chromatogram předvádí (a) reakci po 24 hodinách, (b) biosyntetický lidský inzulín a (c) biosyntetický lidský proinzulin. Chromatografické podmínky jsou uvedeny v příkladech.

je znázorněna preparativní HPLC chromatografie proinzulinové konverzni reakce.

je peptidová mapa inzulinu z konvemi reakce.

je vázání lidského placentálního inzulínového receptoru. Je znázorněna konkurence s izsj inzulínem lidského inzulinu a lidského inzulinu, připraveného z ACB-proinzulinu se zřetelem na vázáni na lidský inzulínový receptor.

Na obr. 29 jsou znázorněny rozdíly primární struktury mezi přírodně se vyskytujícími molekulami (BCA) lidského proinzulinu a nového invertovaného (ACB) lidského proinzulinu.

Pro účely tohoto popisu se používá následujících výrazů:

ACB-hPI zkratka pro lidský ACB proinzulin

ACB-PI zkratka pro ACB proinzulin

ACB proinzulin. je po 1 ypeptidová molekula, která obsahuje (a) aminokyselinou sekvenci odpovídající inzulínovému A-řetězci nebo jejímu funkčnímu analogu, vázanou sekvenciélně na (b) spojovací peptid, který váže karboxylovou koncovou aminokyselinu inzulínového A-řetězce na aminovou koncovou aminokyselinu inzulínového B-řetězce, přičemž spojovací peptid obsahuje alespoň 8 aminokyselin, vážených sekvenciélně na (c) aminokyselinovou sekvenci odpovídající inzulínovému B-řetězci nebo jeho funkčnímu analogu. A-řetězec A-tetězec inzulínu nebo /jeho funkčního analogu, _?.··_λ,·._:-.·λ,.který vytváří jednu nebo dvě subjednotky inzulínové molekuly

Ala aminokyselina alanin

Analog sloučenina, která je strukturálně podobná jiné sloučenině. Pokud se výrazu používá v souvislosti s po lypeptidy,’ vztahuje se na primární, sekundární nebo terciární strukturu

Arg aminokyselina arginin

Asn aminokyselina asparagin

Asp aminokyselina asparagová kyselina

B-řetězec B-řetězec inzulínu nebo jeho funkčniho analogu, odpovídající větší subjednotce dvou řetězců inzulínové molekuly pár bázi (bp) se týká DNA nebo RNA. Zkratky A,C, G a T odpovídají 5'-monofosfátovým formám nukleotidů (deoxy)adenin, (deoxy)citidin, (deoxy)guanin a (deoxy)thymidin, jak se vyskytuji v DNA molekulách. Zkratky U, C, G a' T odpovídají 5'-monofosfátovým formám nukleotidů uráčil, cystídin, guanin a thymin, jak se vyskytuji v RNA molekulách. V DNA s dvojím řetězBCA proinzulin

C-peptid 'A>; · » *

Cys

DNA

EDTA

ED5O

FAB-MS

Funkční analog

Gin

Glu

Gly

His čem se pár bází může vztahovat na partnerský vztah

A s T nebo C s G. V heteroduplexu DNA/RNA se pár bázi nůže vztahovat na partnerský vztah T s U nebo

C s G.

přírodně se vyskytující proinzulin nebo jeho funkční analogy. Jde o výraz, používaný k rozlišení ACB-proinzulinové molekuly, zde popsané, přičemž translační řád inzulínových subjednotek je převrácen .

polypepdivová sekvence alespoň osmi aminokyselin, kde je tento polypeptid umístěn mezi inzulínový A-řetězec aminokyselinové sekvence (nebo funkčního analogu aminokyselinové sekvence inzulínového

A-řetězce) a inzulínový B-řetězec aminokyselinové sekvence (nebo analogu aminokyselinové sekvence inzulínového B-řetě2ce) umožňující dostatečné konformačni permutace pro vhodné vytvořeni intrařetězcových a interřetězcových disulfidických můstků inzulínové prekursorové molekuly.

aminokyselina cystein nebo polovina cystinového zbytku kovalentně vázaného prostřednictvím disulfidického můstku na jinou polovinu cystinového zbytku.

desoxyribunekleová kyselina.

zkratka ethylendiamintetraoctové kyseliny.

zkratka poloviční maximální hodnoty.

zkratka hmotové spektrometrie s bombardováním rychlými atomy.

molekula nebo sloučenina mající podobné funkční vlastnosti avšak modifikovanou strukturu se zřetelem na přírodně se vyskytující formu molekuly nebo sloučeniny.

aminokyselina glutamin.

aminokyselina glutamová kyselina.

aminokyselina glycin.

aminokyselina hystidin.

a inzulínový

Ile

Leu

Lys

Met

Met-ACB-PI

Met-ACB-hPI hPI zkratka pro lidský proinzulin.

inzulín bilkovinový hormon nebo jeho funkční analog, který snižuje hladinu cukru v krvi a stimuluje využití glukózy a blokuje glykogeno1yzu. Je univerzálně zjišťován u savců, majících pankreas.

prekursor jednořetězcový polypeptid, který vzniká, když se internální aminokyselinová sekvence vyřízne ze dvouřetězcové molekuly inzulínu nebo analogu inzulínu.

aminokyselina isoleucin. aminokyselina leucin. aminokyselina lysin.

aminokyselina methionion nebo jeji deformylovaný analog.

zkratka methionyl ACB proinzulínu, zkratka methionyl ACB lidského-proinzúlinu.™

Met-ACB-proinzulin ACB proinzulinová molekula s methioninovým zbytkem kovalentně vázaným na aminokonec ACB-proinzulinové molekuly.

mRNA mediátorová RNA.

MWCO zkratka excisní molekulové hmotnosti.

NIDDM zkratka “diabetes mel litus Nezávis ré~ná~lnžuTihtr.

NLe

Nva

Orn

Phe

Plasmid

PMSF

Pro

Čtecí rámec norleucin.

norvalin.

ornithin.

aminokyselina fenylalanin.

extrachromosomální spontáně se replikující genetický element.

zkratka fenylmethylsulfonylfluoridu.

aminokyselina prolin.

nukleotidová sekvence, ze které translaci dochází ke čteni v tripletech translačním aparátem tRNA a ribosomů a příbuzných faktorů každého tripletu v souhlase s příslušnou aminokyselinou. Protože je každý triplet oddělený a téže délky, musí být kódující sekvence násobkem tří, včlenění nebo vypušRekombinantni

Rekombinantni

Replikon

RNA

RP-HPLC

-,y ' · ''

Ser

Thr

Transkripce

Translace

Tris

Trp

Tyr

Val

Vektor tění (koncová posunová mutace) páru bázi může vést ke dvěma odlišným bílkovinám, zakodovávaným stejnou sekvencí. K pojištěni proti tomu tripletové kodony odpovídající žádanému polypeptidů, musí být vázány v násobku tři od iniciačního kodonů, to je, musí být dodržen správný čtecí rámec.

DNA klonovací vektor jakékoliv autonomní replikačni činidlo včetně, avšak bez jakéhokoliv omezení, plasmidú a fágů, zahrnující DNA molekulu, ke které jeden nebo několik segmentů DNA může být přidáno nebo je přidáno.

DNA expresní vektor jakýkoliv rekombinantni DNA klonovací vektor, do něhož je včleněn promotor.

DNA sekvence, která řídí a umožňuje autonomní replikaci plasmidu nebo jiného vektoru. - -- — .

ribonukleová kyselina. ~ ý zkratka pro reverzní fázovou vysoko účinnou kapálihovou chromatografií.

aminokyselina serin.

aminokyselina threonin.· * ™ ^v ~ ~ proces, kdy se genetická informace, obsažená v nukleotidové sekvenci- DNA-, přepisujďdb ^rkompIemé“h-^_’^?'” tárni RNA sekvence.

proces překládáni genetické informace zmediátorové RNA do primární struktury polypeptidového řetězce pro specifikaci a přímou syntézu polypeptidového řetězce.

zkratka pro tris(hydroxymethyl)aminomethan. aminokyselina tryptofan. aminokyselina tyrosin. aminokyselina valin.

replikon, používaný pro transformaci buněk v genové manipulaci nesoucí polynukleotidové sekvence odpovídající vhodným bilkovinovým molekulám, které při kombinaci se vhodnou řídicí sekvenci dodávají specifické vlastnosti hostující buňce, která se má transformovat. Plasmidy, viry a bakteriofág jsou vhodnými vektory, jelikož jsou replikony ve vlastním slova smyslu. Umělé vektory se konstruují vyříznutím a spojováním DNA molekul z různých zdrojů za použití restrikčních enzymů a ligas. Vektory zahrnuji rekombinantni DNA klonovací vektory a rekombinantni DNA expresní vektory.

X-gal zkratka pro 5-brom-4-chlor-3-indolγΙ-β-D-galaktosid.

	Vynález se tedy	týká polypeptidových	sloučenin obecného
vzorce X
		Metx-A-C-B	(i)
kde	znamená
Met	aminokyselinu	methionin,
X	0 nebo 1,
A .... · - 'V'1	........řetězec A.inzulínu nebo jeho funkční	. · ' · ř- **·' : derivát, ·
B	řetězec B inzulínu nebo jeho funkční	derivát, —
C	C-peptid inzulínu nebo peptid obecného vzorce . /

Xi- X₂- P - X₃- X₄ kde znamená

Xi,X2,X3 a X4 bazické aminokyseliny, které jsou stejné nebo odlišné a

P peptid obsahující 4 až 35 aminokyselin s výjimkou cysteinu.

Sloučeniny obecného vzorce I mají dvě oddělená působeni:

(a) jakožto prekursory rekombinantni produkce inzulínu a

b) jakožto nezávislé, terapeuticky účinné sloučeniny.

Užitečnost sloučenin podle vynálezu obecného vzorce I jakožto prekursorú inzulínu, je dále popsána.

Sloučeniny obecného vzorce I konstituují nové proinzulinové bi-ifcoviny ·· ne-bo inzulínové prekursory, dále označované jakožto ACB-proinzuliny, které máji nezávisle příznivé vlastnosti vedle toho, že jsou meziprodukty na nové cestě k inzulínu, jak je dále popsáno.Podle výhodného provádění vynálezu, jak je příklady doloženo, mají sloučeniny obecného vzorce I následující a11 minokyse1inou sekvenci: (sekvence ID číslo 1)

Gly	Ile	Val	Glu	Gin	Cys	Cys	Thr	Ser
Ile	Cys	Ser	Leu	Tyr	Gin	Leu	Glu	Asn
Tyr	Cys	Asn	Arg	Arg	Glu	Ala	Glu	Asp
Leu	Gin	Val	Gly	Gin	Val	Glu	Leu	Gly
Gly	Gly	Pro	Gly	Ala	Gly	Ser	Leu	Gin
Pro	Leu	Ala	Leu	Glu	Gly	Ser	Leu	Gin
Lys	Arg	Phe	Val	Asn	Gin	His	Leu	Cys
Gly	Ser	His	Leu	Val	Glu	Ala	Leu	Tyr
Leu	Val	Cys	Gly	Glu	Arg	Gly	Phe	Phe
Tyr	Thr	Pro	Lys	Thr

Na obr. 15 a 29 je graficky objasněn celý strukturální rozdíl mezi přírodním BCA proinzulinem a novým, invertovaným ACB” proinzulínem. Strukturální rozdíly přírodního proinzulinu (ozna. dováného zde a na obr. 15 jakožto BCA-proinzulín na rozdíl od.no-?* vého invertovaného ACB-proinzulinu) a ACB-proinzulinu jsou enormní.

V oboru je dobře známo, Se určité obměny struktury bílkoviny jsou dostatečné k inhibici nebo k naprostému předejití vlastni formace sekundární a terciární struktury, což vede k nefunkční bílkovině. To platí zvláště pro molekuly, které závisí na vlastni formě disulfidických příčných vazeb pro dosaženi účinnosti, jako má proinzulin a inzulín. To je zcela neočekáváte1 né a překvapující, že konformačmi rozdíl mezi ACB-proinzulinem a BCA-proinzulinem vede k molekule, která (a) má významně větší inzulínovou účinnost než nativní proinzulin a (b) po vyříznutí C-peptidu vytváří funkční inzulínovou molekulu se všemi disulfidickými příčnými vazbami vhodně vytvořenými a bez N-koncového raethioninového zbytku na A-řetězci.

Zjistilo se, že forma proinzulinu, střižená na Arg65-Gly66 vazbě, má větší inzulínovou účinnost než přírodní forma proinzulinu, pravděpodobně jakožto výsledek uvolněni aminokyselinového koncového zbytku na A-řetězci obsaženém v místě a v celé struktuře proinzulinu (Peavy D.E. a kol., 1985, J. Biol. Chem., ročník

260, str. 13989 až 13394). ACB-proinzuli nová molekula má má volný aminokyselinový konec A-řetězce, avšak vykazuje zvýšenou účinnost, když se C-peptid zakotví na obou koncích za vytvoření sta- } bilnější konformace.

Primární struktura inzulinu a proinzulinu je široe modifikována. Tyto modifikace poskytly inzulínové a proinzulínové molekuly mající nejrůznějši žádoucí vlastnosti, užitečné pro ošetřováni různých forem diabetes, k usnadněni průmyslové (zvláště rekombinantni) výroby a/nebo k výrobě výhodnějších farmaceutických prostředků. Representativní, nikoliv však vyčerpávající seznam takových modifikaci je v následující tabulce I. Vvynález se tedy týká ACB-proinzulinových molekul se změnami v primární struktuře, jejichž representativní seznam je uveden v Tabulce I. Způsobem podle vynálezu se připravuji inzulínové analogy se včleněnými proimárnimi strukturálními změnami, jejichž representativní seznam je zřejmý z následující tabulky X. .,..·..'.··-.··...

· ·, - · Λ, · ·. ·.' \ -t > ίίή ' ^T‘ ^T‘ ' · ♦*

Tabulka I

A.

	Inzulinové a pro	inzulínové i	sneiοσν
Změny 7	edné aminokysf	ri i ny
Gly A2i	Glu A2i	hSer a2i	Thr	Bio	ASp	B25
Seř A2i	Leu a2i	Gly a22	Asp	BiO'	HÍS	B25
Ala A21	Met a2i	Ala A22	Arg	Bio	Glu	B26
His A21	Tyr a2i	Asp B9	Ile	Bi2	Glu	B27
Asp A21	. Val A21	ASII Bg	HÍS	Bl6	Asp	B28 .
Thr A21	Ile A21	HÍS Bg	Gin	Bi7	Ala	B30
Gin A21	Trp a2i	GlU Bio	Gin	b2o	des-	B3o
Thr3o-NH2	Ala3Q-NH2					. - -tl
Změny dvou amihokyseiin
Gly A2i	a Asp Bj.0		His A2i	a	Lys B27
Ser a2i	a Asp Bio	_X.—	=· Asp'' A2i	-a- ‘	Lys b27
Thr a2i	a. Asp Bio		Gly A21	a	Arg b27
Ala A2i	a Asp Bio	..........	Ser a2i	a	Arg B27	-
His A21	a. Asp Bio		Thr A21	a	Arg B27
Asp A2i	.a Asp Bio	-	-Ala-A2i	a	Arg B27
Gly a2i	ε Thr Bio		Glu B27	a	- Glu Bie
Ser A2i	a Thr Bio		Asp B5	a	Asn BIO
Thr a2i	a Thr Bio		Glu Bi2	a	Gin B13
Ala A2i	a Thr Bio		Ser B14	a	Asp Bi7
His A2i	a Thr Bio		Lys B2s	a	Pro B2g
Asp A2í	a. Thr Bio		His A21	a	Arg B27
Gly A21	a Arg Bio		Asp A2i	a	Arg B27

Tabu1ka {pokračováni ') i

Ser	a2i	a.	Arg	Bl0	Glu	Bl2	a	des	B30
Thr	A2í	a	Arg	Bl0	Asp	Bio	a.	Ser	b2
Ala	a2i	a.	Arg	Bio	Asp	Bio	a	Asp	B28
His	A2i	5	. Arg	Bio	Glu	Bio	a.	. Glu	A13
Asp	a2i	a.	Arg	Bi0	Glu	B27	a	Ser	Al3
Asp	Bio	a.	des-	-B30	Glu	B27	a	Asp	A2í
Thr	Bio	a -	. des-	'B30	Glu	B27	a	Glu	Bl
Arg	Bio	a	des-	'B30	Glu	B27	a.	ASp	b9
Gly	A2i	a.	Lys	B27	Gly	A21	a	Ala	B30
Ser	a2i	a	Lys	B27	Ser	A21	a	Ala	B30
Thr	a2i	a-	Lys	B27	Thr	A21	a	Ala	B30
Ala	a2i	a	Lys	B27	Ala	A21	a.	Ala	B30
des	B29	a.	. des	B30	hSer A2.	l a.	Ala B30

c. Změny tří aminokyselin

A21	Gly	+	Lys	B27	+	Gin	Al7
A21	Ser	+	Lys	B27	+	Gin	Ai7
a2i	Thr	+	Lys	B27	+	Gin	A17
A21	Ala	+	Lys	B27	+	Gin	Al?
A21	His	+	Lys	®27	+	Gin	Aí7
A21	ASp	+	Lys	B27	+	Gin	Ai7
Gly' A2i	+	Lys	B27	+	Gin	Bl3
Ser	A?1	+	Lys	B27	+	Gin	Bl3
Thr	A2i	+'	Lys	B27	+	Gin	Bl3
Ala	A21	+	Lys	B27	+	Gin	Bí3
His	A21	+	Lys	B27	+	Gin	Bl3
Asp	A21	+	Lys	B.27	+	Gin	Bl3
Gly a2i	+'	Arg	B27	+	Gin	Al7

Tabulka I (pokračováni t

Ser	A2i	+	Arg	B27	+	Gin	Al?
Thr	a2i	+	Arg	B27	+	Gin	Al7
Ala	a2i	+	Arg	B27	+	Gin	Al7
His	A21	+	Arg	B27	+	Gin	A27
Asp	a2i	+	Arg	B27	+	Gin	Al7
Gly	A21	+	Arg	B27	+	Gin	B13
Ser	A21	+	Arg	®27	+	Gin	Bl3
Thr	A21	+	Arg	B27	+	Gin	Bl3.
Ala	A21	+	Arg	B27	+	Gin	®13
His	a2i	+	Arg	B27	+	Gin	Bl3
Asp	A21	+	Arg	B27	+	Gin	>13
Asp	Bio	+	His	Ae	+	His	b2s
Glu	Bio	+	Glu	A3	+	Glu	b22
Glu	B27	+	Ser	b5	+	ASp	b5
Glu	B27	+	His	As	+	. Asp	b9
Glu	B27	+	Asp A2i	+	Asp	b9
des	b2s	+	des	B29	+	des	B30
Gly a2i	+	Asp	Bio	+	Ala	B30
Ser	A21	+	Asp	Bio	+	Ala	B30
Thr	A21	+	Asp	BlO	+	Ala	B30
Ala	A21	+	Asp	B10	+	Ala	S30
His	A21	+	Asp	Bio	+	Ala	B30
Asp	A21	+	Asp	BlO	+	Ala	B30
Gly A2i	+	Thr	Bio	+	Ala	B30
Ser	A21	+	Thr	Bio	+	Ala	B30
Thr	A21		Thr	Bio	+	Ala	B30
Ala	A21	*	Thr	Bio.	+	Ala	B30
His	A21	+	Thr	Bio	+	Ala	B30
Asp	A2i	+	Thr	Bio	+	Ala	B30
Gly a2i	*	Arg	Bio	+.	Ala	B30
Ser a2i		Arg	Bio	+	Ala	B30

		Tabulk	ia I	(pokr	ačováni
Thr	a2i	* Arg	Bio	+ Ala	B30
Ala	a2i	+ Arg	Bio	+ Ala	B30
His	A21	+ Arg	Bio	+ Ala	B30
Asp	A21	+ Arg	Bio	+ Ala	B30
Gly	A21	+ Asp	BlO	+ des	B30
Ser	A21	+ Asp	BlO	+ des	B30
Thr	A21	+ ASp	Bio	+ des	B30
Ala	A21	+ Asp	Bio	+ des	B30
His	A21	+ Asp	Bio	+ des	B30
Asp	A21	+ ASp	Bio	+ des	B30 .
Gly	A21	+. Thr	Bio	+ des	B30
Ser	A21	+ Thr	Bio	+ des	B30
Thr	A21	+ Thr	BlO	+ des	B30
Ala	A21	+ Thr	Bio	+ des	B30
His	A21	+ Thr.	BlO	+ des	B30
r ASP	Asi	+ Thr	Bio	+ des	B30
Gly	A21	+ Arg	Bio	+ des	B30
Ser	A21	+ Arg	BlO	+ des	B30
Thr	A21	+ Arg	Bl0	+ des	B30
Ala	A21	+ Arg	Bio	+ des	B30
His	A21	:+ Arg	Bio	* des	B'30 - -
Asp	A21	* Arg	BlO	+ des	B30
Thr	BlO	+ Glu	B28	+ Pro	B29
Arg	Bio	+ Glu	B28	+ Pro	B2g
Asp	Bio	+ Lys	b28	+ Pro	B29
Thr	Bio	+ Lys	B28	+ Pro	B29
Arg	Bio	+ Lys	B28	+ Pro	B29
Gly	A21	+ Glu	B28	+ Pro	B29
Ser	A21	+ Glu	B20	+ Pro	B29
Thr	A21	+ Glu	B28	+ Pro	029
Ala	»21	+ Lys	B28	+ Pró	B29
His	A21	* Lys	B28	+ Pro	B29

'Tabuíks I (pokračováni)

ASp	a2i	+ Lys B2s +	Pro B29
Glu	B28	+ Pro B2g +	Ala B30
Glu	B28	+ Pro B29 +	des B30
Lys	b28	+ Pro B2g +	Ala B30
Lys	b28	+ Pro B29 +	des B30
Arg	b27	+ Gly A2i +	ThrB3Q-NH2

®· Změny čtyř aminokyselin

Gly a2i	+ Lys B27 + Gin	A17 +	Gin	B13
Ser a2i	+ Lys B27 + Gin	Αχ? +	Gin	B13
Thr A2i	+ Lys B27 + Gin	A17 +	Gin	B13
Ala A2i	+ Lys B27 + Gin	A17 ♦	Gin	B13
Asp a2i	+ Lys B27 + Gin	A17 +	Gin	B13 ···
HÍS A21	+ Lys B27 + Gin	A17 +	Gin	B13
Gly a2i	+ Arg B27 + Gin	A17 +	Gin	b13
Ser a2i	♦ Arg B27 + Gin	A17 +	Gin	B13
Thr A2i	+ Arg B27 + Gin	Ai7 ’+	Gin	B13 .-
Ala A2i	+ Arg B27 + Gin	A17 +	Gin	Bi3-
Asp A2i	+ Arg B27 + Gin	Αΐ7^+	Gin	Bi3—
HÍS A2l	+ Arg B27 + Gin	Al7 +	Gin	B13
Glu Bio	+ His Αθ + His	B4· +	His	b27 - --
des B27	+ des b28 + des	B2g +	des	B30
Gly A2l	+ Asp Bio * GlU	b28 +	Pro	B29
Ser A2i	+ Asp Bio + Glu	b28 +	Pro	B29
Thr A21	+ Asp Bio + Glu	B2a +	Pro	b29 -
Ala A2i	+ Asp Bio + Glu	b28 +	Pro	b29
His A2i	+ Asp Bio + Glu	b28 +	Pro	b29
Asp A2i	+ Asp Bio + Glu	b28 +	Pro	B29
Gly a2i	+ Thr Bio + Glu	b28 +	Pro	B29
Ser a2i	+ Thr Bio * Glu	b28 *	Pro	B29

Tabui ka (pokračováni >

Thr A2i	+	Thr	Bio	+	Glu	B2g +	Pro	B2g
Ala A2i	+	Thr	bio	+	Glu	B28 +	Pro	B29
His A2i	+	Thr	Bio	+	Glu	B28 +	Pro	B2g
ASp A21	+	Thr	Bio	+	Glu	B28 +	Pro	®29
c-iy a21	+	Arg	Bio	+	Glu	B2s +	Pro	B2g
Ser A2í	+	Arg	Bio	+	Glu	B28 +	Pro	B29
Thr a2í	+	Arg	Bio	+	Glu	B28 +	Pro	B29
Ala A2i	+	Arg	Bio	+	Glu	B28 +	Pro	B2g
His A2i	+	Arg	Bio	+	Glu	B28 +	Pro	B29
ASp A21	+	Arg	Bio	+	Glu	B28 +	Pro	B2g
Gly A21	+	Asp	Bio	+	Lys	B28 +	Pro	B29
Ser A2i	+	Asp	Bio	+	Lys	B28 +	Pro	B29
Thr A2i	+	Asp	Bio	+	Lys	B28 +	Pro	B29
Ala A21	+	Asp	Bio	+	Lys	B28 +	Pro. B2g
His A2i	+	Asp	Bio	+	Lys	B28 +	Pro.B2g
ASP A2i	+	Asp	Bio	+	Lys	B28 +..	Pro	B2g
Gly A2i	+	Thr	Bio	+	Lys	B28 +	Pro	B2g
Ser A2i	+	Thr	Bio	+	Lys	B28 +	Pro	B29
Thr A21	+	Thr	Bio	+	Lys	B28 +	Pro	B2g
Ala A2i	+	Thr	Bio	+	Lys	B2g +	Pro	B29
His A2i	+	Thr	Bio	+	Lys	B28 *	Pro	B29
ASp A2i	+	Thr	Bio	+	Lys	B28 +	Pro	B2g
Gly A2i	+	Arg -Bio	+	Lys	B28 +	Pro	B2g
Ser A2i	+	Arg	bio	+	Lys	B2g +	Pro	B29
Thr A2i	+	Arg	Bio	+	Lys	B28 +	Pro	B2g
Ala A2i	+	Arg	Bio	+	Lys	B2e +	Pro	B29
His A2i	+	Arg	Bio	+	Lys	B2S +	Pro	B2g
Asp A2i	+	Arg	Bio	+	Lys	B28 +	Pro	B2g
Gly A2i	+	Glu	B28	+	Pro	B2g +	Ala	B30
Ser A2i	+	Glu	B28	+	Pro	B2g +	Ala	B30
Thr A2i	+	Glu	B28	+	Pro	B2g +	Ala	B30
Ala A2i	+	Glu	B28		Pro	B29 +	Ala	B30

Ta bu i k.a I i pokračovániϊ

		His	A21 +	Glu	Β2θ	+	Pro	B29	+	Ala	B30
B		Asp A2i +	Glu	b28	+	Pro	b29	+	Ala	B3c
		Gly A2i +	Lys	B2a	+	Pro	b29	+	Ala	B30
		Ser	A2i +	Lys	B28	+	Pro	b29	+	Ala	B30
		Thr	A21 +	Lys	b28	+	Pro	B29	+	Ala	B30
		Ala	A21 +	Lys	B2a	+	Pro	B29	+	Ala	s30
		His	a21 +	Lys	B28	+	Pro	B29	+	Ala	B30
		Asp	A21 ♦	Lys	B28	+	Pro	B29	+	Ala	B30
		Gly	A21 +	Glu	B28	+	Pro	b29	+	des	B30
		Ser	a21 +	Glu	b28	+	Pro	B29	+	des	B30
		Thr	A21 +	Glu	B28	+	Pro	B29	+	des	B30
		Ala	A21 +	Glu	B28	+	Pro	B2g	+	des	B30
		His	A21 +	Glu	b28	+	Pro	B29	+	des	B30
		Asp	a21 +	Glu	b28	+	Pro	B2g	+	des	b30
		Gly A2i +	Lys	b28	+	Pro	B2g	+	des	b30
. . . j -		Ser	A2i +	Lys	B28	+	Pro	B29	+	des	b3°
f.,JV ř·,“·. >		Thr	A21 +	Lys	B28	+	Pro	B29	+	des	B30
		Ala	A21 +	Lys	b28	+	Pro	b29	+	des	B30
		His	A21 +	Lys	b28	+	Pro	B29	+	des	b30
		Asp	a21 +	Lys	b28	+	Pro	B29	+	des	b30
		Asp	Bio +	Glu	b28	+	Pro	b29	+	Ala	B30
*?		Thr	Bio +	Glu	b28	+	Pro	B29	+	Ala	b30
		Arg	BlO +	Glu	B28	+	Pro	B2g	+	Ala	B30
«		Asp	Bio +	Lys	b28	+	Pro	B29	+	Ala	B30
		Thr	BlO +	Lys	B28	+	Pro	B29	+	Ala	B30
		Arg	Bio +	Lys	B28	+	Pro	B29	+	Ala	B30
		Asp	Bia +	Glu	B28	+	Pro	B29	+	des	b3Q
•		Thr	Bio +	Glu	B28	+	Pro	b29	+	des	B30
		Arg	Bio +	Glu	B28	+	Pro	B29	+	des	B30
•		Asp	Bio +	Lys	b28	+	Pro	B29	+	des	B30

Tabulka I (pokračováni)

Thr	B i 0	+	Lys	B? 3	+	Pro	B 2 7	+	des	B .3
Arg	Bio	+	Lys	B 7 ρ	+	Pro	B 7 B	+	des	B 3 0
des	B ? 7	+	des	B2 a	+	des	B 7 B	+	des	B 3 0

E. Změny pěti aminosyselin des B26 + des B27 + des B28 + des B29 + des B30

Jakkoliv je výhodné používat přírodně se vyskytující C-peptidové sekvence, jak shora uvedeno, jsou přípustné variace délky a aminokyselinové sekvence tohoto peptidu a získá se nicméně funkční ACB-PI molekula. Molekulární modelovací studie ukazuji, že C-peptidová oblast shora uvedených ACB-PI může mít i délku jen 8 aminokyselin. Tyto studie dále ukazuji, že C-peptid. může být delší než je jeho přirozená délka (35 aminokyselin v připadě lidského proinzulinu) a stále ještě umožňuje vhodné vytvořeni sekundární, terciární a kvarterní struktury zralé inzulínové molekuly.Je-... dinými požadavky je (1) aby délka byla dostatečná k umožněni vytvořeni vlastni disulfidické vazby v ACB-proinzulínové molekule a (2) aby byla odštěpitelná',od ACB-PI molekuly s doprovodným vtvořenim inzulínu.

Jiná provedení vynálezu?zahrnuji-ACB-proin2ulinové mol okuly králíků, opic, koní, krys I a krys II, vepřů, skotu, psů, morčat, Činčil nebo kachen. Je výhodné, aby aminokyselinová sekvence ACB-proinzulínové molekuly těchto alternativních druhů byla přírodně se vyskytující sekvenci aminokyselin A-řetězce následovanou přírodně se vyskytující sekvenci C-peptidu, následovanou přírodně se vyskytující sekvencí B-řetězce. Jiná provedeni vynálezu se zaměřuji na funkční analogy proinzulinové molekuly, odvozené od shora uvedených druhů.

ACB-proinzulinové útvary obsahující C-peptidy obecného vzorce:

Xi~X2“(4 - 8 aminokyse1in)-X3-X4

Χι~Ϊ2“(9 - 13 aminokyselin)-X3~X4

Xi-X2~(14 - 19 aminokyselin)-X3-X4

Xi-X₂-(2O - 24 aminokyselin)-X3^-X4

Xi-Xj-(25 - 31 aminokyselin)-Xi-X.·, kde znamená Xi,X?,X₃ a X4 bázické aminokyseliny, přičemž Xi,X₂,X3 a X₄ jsou stená nebo různé a kde intervenujici aminokyše inová sekvence neobsahuje cysteinový zbytek, se mohou rovněž použit při prováděni vynálezu. Podle výhodného provedeni vynálezu se voli Χι,Χζ,Χί a X» ze souboru zahrnujícího Arg, Lys a Orn.

Intervenující poptidy o délce řetězce větší než 35 aminokyselin jsou podle vynálezu plně užitečné. Avšak se vzrůstající délkou C-peptidu současně vzrůstá konformační nezávislost ACB-proinzulinové molekuly, mající tak prodloužený C-peptid. Vzrůstající konformační nezávislost vede obecně k molekule se sníženou účinností vytvářet vlásenkový útvar. Proto podle výhodného provedení vynálezu obsahuje C-peptid méně než přibližně 35 aminokyselin.

Kromě nové struktury bílkoviny, dokložené jejími meziprodukty, prokázaly tyto nové sloučeniny také terapeutický význám. Jakkoliv většina biologické účinnosti proinzulinu je v řetězcích A a B, nebyl znám možný vliv C-peptidové vazby na biologickou účinnost proinzulinu. Uvolněním aminokyselinové koncové skupiny glycinu A-l se získal inzulínový analog, který má větší inzulínovou účinnost než přírodní BCA-proinzulín, podržuje si déle in vivo poločasové charakteristiky přírodního proinzulinu;ACB-proinzulin mé také schopnost stimulovat DNA syntézu v buňkách hladkého svalstva pro svoji schonost vázat IGF-I receptor.

Biologické účinnosti dvou invertovaných proinzulinů se charakterizují četnými zkouškami in vivo a in vitro. Ve všech případech invertované proinzuliny vykazují účinnost přijímat glukózu, která leží mezi účinnosti inzulínu a proinzulinu. Při zkoušení na schopnost konkurence se ^'-'inzulínem se zřetelem na vázáni na placentální membránové inzulínové receptory, Met-ACB-proinzulin a ACB-proinzulin poskytují ED50 hodnoty 5,5 a 3,1 nM ve srovnáni k inzulínu (0,45 nM) a proinzulinu (20,4 nM) jak je zřejmé z obr. 23 a z tabulky II,

Tabulka II

Biologické aktivity invertovaných proinzulinových analogů in vitro

EDso (nM)

Analog	Receptor inzulinuu	Receptor IGF-I	Transport glukózy
Inzulín	0,45	328,00	0,043
IGF-I	ND	0,45	ND
proinzulin	20,40	10000,00	ND
ACB-proinzulin	3,10	520,00	0, 83
Met-ACB-proinzulin	5,50	940,00	2,50

ND = nestanoveno

Schopnopst ACB-proinzulinů stimulovat přijímáni glukózy adipocyty se rovněž měří a poskytuje podobné hodnoty pro potenci těchto dvou bílkovin ve srovnáni s inzulínem, jak je ukázáno , . v tabulce II. Na rozdíl od jejich chováni na inzulínovém receptoru jsou obě molekuly mnohem podobnější k inzulínu než k proinzulinu se zřetelem na schopnost stimulovat DNA syntézu v lidských buňkách hladkého svalstva.

Invertované proinzuliny jsou značně účinnější in vivo než in vitro a vykazují stejné prodlouženi trváni působeni, jak je zřejmé z tabulky III.

Tabulka III

Hypoglycemické působeni inzulínových analogů in vivo

	Max. hypoglycenické	ED50(nM)í	Re 1ativni	biologické
Látka	působení	(%)1		působeni	na inzulín
	1 hodina	2 hodiny 1	hodina 2 hodiny	1 hodina	2 hodiny
H-Insulin	59,0±4,3	4S,7±6,7	lrQ±0,01 l,6±0,09 100,0 100,0
hPI	55,1±2,6	61,0±4,0	9,3±1,7 8,2±0,8	14,312,8	19,5± 1,8
MetACSHPI	54,4±8,4 '	64,813,8	8.4±0,4 5.1±0,0	15,4±0;7	31.3± 0,0
ACB-hPT	60f5±9.5	69í5±9>5	3.3±l,0 3,4±Q,8	39,6±3,6	47,l±10.6

¹ Maximální hypoglycemické působeni sé vyjadřuje jako procentová změna od času nula, korigovaná pro kontrolní skupinu při téže zkoušce ⁷ Hodnoty ED50 znamenají koncentrci bílkoviny, která poskytuje poločas maximální hypoglycemícké účinnosti 1 nebo 2 hodiny po subkutannim podání

Všechny hodnoty v tabulce III jsou středem +S.E.M. pro tři oddělená stanovení v případě lidského inzulinu a pro dvě oddělená stanoveni v případě každého proinzulinu.

Lidský inzulín produkuje maximální hypoglycemickou odezvu jednu hodinu po subkutannim podání a koncentrace glukózy v krvi se vrací na základní hodnotu po 3 až 4 hodinách. Lidský proinzulin a ACB-proinzulíny produkuji maximální hypoglycemícké působení 2 hodiny po subkutannim podání a pokračují k vytvářeni větái biologické odezvy v průběhu další 3 až 4 hodinové periody, přičemž velikost odezvy závisí na podané dávce. Kromě toho se zjistilo, že invertované proinzuliny jsou zhruba . dvojnásobně .účinné než f ’’ .......... ' ⁷ proinzuliny in vivo, přičemž ACB-proinzulín je účinnější než Met-ACB-proinzulínová sloučenina, jak je zřejmé z tabulky III.

Vynález se také týká způsobu ošetřování diabetes mellitus. ^; Vynález se rovněž týká způsobu ošetřování diabetes mellitus nezávislého na inzulinu. Tento způsob ošetřováni je založen na podávání organismu množství ACB-proinzulinu v dávce přibližně 10 až 1000 pg/kg. Výhodnou dávkou je přibližně 10 až 100 pg/kg účinné látky. Typické denni dávka pro dospělého člověka je přibližně 0,5 až 100 mg.

Při prováděni tohoto ošetřování se sloučenina obecného vzorce I podle vynálezu může podávat jakožto jedna denní dávka nebo v několika dávkách za den. Režim ošetřováni může vyžadovat podávání v průběhu delší doby. Množství na podávanou dávku nebo celkové podávané množství závisí na takových faktorech, jako je povaha a závažnost onemocněni, věk a celkový zdravotní stav ošetřovaného a snášenlivost nemocného pro podávanou sloučeninu obecného vzorce I podle vynálezu.

Obvykle se ošetřování provádí podáváním sloučeniny obecného vzorce I intravenozni infuzí. Při tomto způsobu se sterilní far24 maceutický prostředek vhodné rozpustné soli sloučeniny včleňuje do fyziologické kapaliny, jako je například 5% dextrozový roztok a získaný roztok se pomalu podává infuzí IV. Může se však také použít jiného způsobu infuze IV.

Sloučeniny obecného vzorce I, to je ACB-proinzuliny jsou užitečné pro náhradu dlouho působícího bazálniho inzulínu. ACBproinzul inové analogy mají značný terapeutický význam, zvláště v případě diabetes mellitus nezávislé na.inzulínu (NIDDM) k řízeni glukozového metabolismu.

Vynález se dále týká farmaceutických prostředků, obsahujících jakožto účinnou látku sloučeninu obecného vzorce I podle vynálezu. Sloučeniny podle vynálezu obecného vzorce I, s výhodou ve formě farmaceuticky vhodných solí, se mohou zpracovávat pro orální nebo parenterální podání pro terapeutické nebo profylaktické ošetřováni diabetes mellitus a/nebo diabetes mellitus nezávislé -~ na inzulinu (NIDDM).

Například se sloučeniny podle vynálezu obecného vzorce I mohou mísit s běžnými farmaceutickými nosiči a excipienty a používat ve formě například tablet, kapsli, elixírů, suspenzí, sirupů a oplatek. Farmaceutické prostředky, obsahující ACB-proinzulinovou sloučeninu, mohou obsahovat účinné látky hmotnostně 0,1 až 90 % a obecně obsahuji účinné látky hmotnostně 10 až :30 %. Farma-- ceutické prostředky mohou obsahovat běžné nosiče a excipienty, jako jsou kukuřičný škrob, želatina, laktoza, sacharóza, mikrokrystalická celulóza, kaolin, mannitol, fosforečnan divápenatý, chlorid sodný a kyselina alginová.

Jakožto ro2ptylovaci činidla, běžně používaná ve farmaceutických prostředcích podle vynálezu, se uvádějí kroskaramel losa,, mikrokrystalická celulóza, kukuřičný Škrob, glykolát a kyselina alginová.

Jakožto pojivo tablet se uvádí akacia, methylcelulóza, natři umkarboxymethyl celulóza, poylvinylpyrro1idon (Povidone), hýdroxypropylmethylcelulóza, sacharóza, škrob a ethylcelulóza.

Jakožto mazadla, kterých se může použit, se uvádějí stearát hořečnatý nebo jiné kovové stearáty, kyselina stearová, kapalný silikon, mastek, vosky, oleje a kolo.i dni oxid křemičitý.

Může se rovněž použit ochucovacích přísad, jako je například peprmint, olej libavky položené a šery aroma.

Může být rovněž žádoucí přidávat barvicí přísadu, aby měla dávkovači forma hezčí vzhled maceutického prostředku.

Pro intravenózní (IV) rozpustná forma sloučeniny nebo k napomáhání identifikace farpodání se může rozpouštět ve vodě podle vynálezu obecného vzorce I v jedné z běžně používaných intravonoznich kapalin a farmaceutický prostředek se může podávast intravenózní infuzí. Může se použit například fysiologické solanky, Ringerova roztoku nebo 5% dextrozového roztoku.

Pro intramuskulárně podávané farmaceutické prostředky se může rozpouštět sterilní vhodně rozpustná sůl sloučenin podle vynálezu obecného vzorce I, napřikkad hydrochloridová sůl a podávat ve farmaceuticky vhodném ředidle-, jako je pyrogenu prostá voda (destilované voda), fyziologická solanka nebo ' 5% glukozový roztok, Vhodná, nerozpustná forma sloučeniny obecného vzorce I podle vynálezu se může zpracovávat a podávat jakožto suspenze ve vodné bázi nebo ve farmaceutický vhodné olejové bázi, jako je například ester mastné kyseliny s dlouhým řetězcem, napřikkad ethýlbleát.

Pro orální podání jsou zvláště vhodné sterilní farmaceutické prostředky ve formě vhodné soli AGB-proinzulínu; jako je například hydrochloridová sůl, formulované v ředidle, jako je napříkad destilovaná nebo deionizovaná voda.

Nebo může být jednotkovou dávkovači formou sloučeniny podle vynálezu obecného vzorce I roztok sloučeniny, s výhodou jeji soli, ve vhodném ředidle ve sterilně hermeticky uzavřených ampulich. Koncentrace sloučeniny v jednotkové dávce se může měnit a může být například přibližně hmotnostně X % až přibližně 50 % v závislosti na formě příslušné sloučeniny a na jeji rozpustnosti a na dávce, určené lékařem.

Vynález se dále týká způsobu rekombinantni produkce ACB-PX bílkovin nebo Met-ACB-PI bílkovin, přičemž tento způsob zahrnuje:

1. vytvořeni syntetického genu, přičemž tento gen zahrnuje DNA sekvenci zakodujicí ACB-PI peptidovou sloučeninu obecného vzorce I,

2. vneseni tohoto genu do vhodného vektoru obsahujícího promotor operátorovou regionální funkci v hostující molekule,

3. orientování uvedeného genu ve vektoru k dosaženi transkripce a translace syntetického genu a aby byl gen pod transkripční kontrolou promotor operátorového regionu,

4. tranformování· hostující buňky vektorem,

5. kultivaci hostující buňky za podmínek vhodných k navozeni transkripce a translace genu a

6. získáni a čištění produkované peptidové sloučeniny.

Syntetické geny, in vitro a in vivo transkripce a translace, vedoucí k produkci sloučenin obecného vzorce I podle vynálezu, jsou známy ze stavu techniky. Vzhledem k přírodní degeneraci genetického kódu, pracovník v oboru zná konstrukci potřebného počtu DNA sekvencí pro zakódování sloučenin obecného vzorce I. .

Podle výhodného provedení způsobu vynálezu, jak je také příklady doloženo,se dosahuje rekombinantni produkce sloučenin obecného vzorce I za použiti syntetického genu zahrnujícího DNA sekvenci (sekv. ID čislo 2).

Tato DNA sekvence zakodovává sloučeninu obecného vzorce I do aminokyselinové sekvence (sekv. ID číslo 1).

Giy	Ile	Val	Glu	Gin	Cys	Cys	Thr	Ser
Ile	Cys	Ser	Leu	Tyr	Gin	Leu	Glu	Asn
Tyr	Cys	Asn	Arg	Arg	Glu	Ala	Glu	Asp
Leu	Gin	Val	Gly	Gin	Val	Glu	Leu	Gly
Gly	Gly	Pro	Gly	Ala	Gly	Ser	Leu	Gin
Pro	Leu	Ala	Leu	Glu	Gly	Ser	Leu	Gin
Lys	Arg	Phe	Val	Asn	Gin	His	Leu	Cys
Gly	Ser	His	Leu	Val	Glu	Ala	Leu	Tyr
Leu	Val	Cys	Gly	Glu	Arg	Gly	Phe	Phe
Tyr	Thr	Pro	Lys	Thr

Gen žakodujíci AČB-proinzulinovou molekulu se může vytvořit syntetickou metodologii. Taková metodologie konstrukce syntetického genu je v oboru dobře známa (Brown E.L., Belagaje R., Ryan

M. J. a Khorana H.G., 1979, Methods in Enzymology, Academie Press,

N. Y., svazek 68, str. 109 až 151). DNA segmenty, odpovídající příslušnému proinzulinovému genu, se generují za použití běžného DNA syntetizujícího přístroje, jako jsou DNA syntetizer Applied Biosystems Model 38OA nebo 38OB (obchodně dostupné u společnosti Applied Biosystems, lne., 850 Lincoln Center Drive, Foster City, CA 94404)Syntetický ACB-PI gen se může vytvářet tak, aby měl restrikční endonukleazová místa štěpeni na jednom ze dvou konců transkriptu k usnadnění izolace a k intergaci do expresních a amplifikačnich plasmidů. Volba restrikčních míst je taková, aby se vhodně orientovaly ACB-PI kódující sekvence s řízením sekvenci k dosažení vhodného čtecího rámce a exprese ACB-PI molekuly. Může se včleňovat obměna jiných takových míst štěpeni v závislosti na použitých konstruktech určitého plasmidu a mohou se generovat technikami o sobě známými v oboru. Schematické znázorněni tohoto procesu je na obr. 16. ·'Specifické sekvence kompozitu, objasňující konstrukci 276 páru bází lidské ACB-PI molekuly jsou na obr. 17. Výhodné provedeni vynálezu, používající ACB-PI kódující sekvence, je na obr. 18, který objasňuje pozice restrikce endonukloasových štěpících míst pro EcoRI, HindlII, Ndel a BamHI. Sekvence na obr. 18 odpovídá výhodným ACB-proinzulinovým kódujícím sekvencím lidského, příkladně uváděného ACB-PI.

Jak je příkladně uvedeno, ACB-PI gen se vytváří ze dvou polovin, jak je zřejmé z obr, 16. Jedna polovina genu se vytváří míšením a ligaci oligonukleotidů 1, 2, 5 a 6. Zatímco druhá polovina genu se vytváří míšením a ligaci oligonukleotidů 3,4,7 a 8, jak je zřejmé z obr. 16. Obě poloviny genových fragmentů se čisti 15% polyakrylamidovou gelovou elektroforezou. DNA se získá elektroforeticky z gelu vykrojením oblasti gelu, odpovídající ACB-PI genovým polovicím a podrobením tenkého výřezu elektroforeze. Elektroforeticky izolované fragmenty DNA se pak odsoluji na sloupci Sephadexu G-50 nebo jeho ekvivalentu. ACB-PI genové polovice se pak navzájem spojí za vzniku.ACB-PI genu, který se pak integruje do vhodného vektoru pro amplifikaci (zvýšení počtu kopii) DNA.

Syntetické geny, zakodující sloučeniny obecného vzorce I podle vynálezu, se mohou včleňovat do vektorů vhodných pro klo28 novaci účely. Pro tento účel dostupné různé plasmídy a techniky integrace a amplífikace a selekce jsou v oboru dobře známy (Sambrook J., Fritsch E.F., Miniatis T., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2.vydání, svazek 1, Cold Spring. Harbor Press, 1989). DNA sekvence se také může amplifikovat za použiti polymerazové řetězové reakce, popsané v Current Protocols in Molecular Biology, (1989 a doplňky), Wilwy Interscience, N.Y.

Podle výhodného provedení způsobu podle vynálezu se používá pUC18 plasmidu (obchodně dostupný u společnosti Boehringer-Mannheim Biochemicals, P.O.Box 50414, Indianopolis, Indiana 46250) pro DNA amplifikační fázi. Volba plasmidu pUC18 se vztahuje na přítomnost EcoRI a HindlII restrikóni endonukleasové Štěpící body v mnohačetném klonovacím místu pUClQ. Volba amplifakčního plasmidu určuje restrikóni endonukleasové body Štěpení ACB-PI kódující sekvence. Volba plasmidu a konstrukce syntetického ACB-PI genu jdou ruku v ruce, jelikož amplifikační plasmid určuje restrikóni sekvenci pro včleněni do. ACB-PI sekvence a odpovidajicich sekvencí oligonukleotidů používaných pro konstrukci syntetického AVB-PI genu.

Podle jednoho provedeni vynálezu se přibližně 5 μ$ pUC18 plasmidu suspenduje v 10 pl pufru, vhodného pro jedno z určitých restrikóni ch enzymových míst urČené„,.„.d<3__;ACB-PI,._syntetického genu. Podle výhodného provedeni vynálezu, přiklady doloženého, je tímto restričnim enzymem HindlII. Plasmid pUC18 se v souhlase s tím suspenduhe v 10 μΐ HindlII pufru (l M chlorid sodný, 50 mM chlorid hořečnatý, 100 mM tris-HCl, hodnota pH = 8,0, 10 mM dithioerythritol). Do tohoto roztoku se přidá ekvivalent 20 jednotek vhodného restrikčniho enzymu. Podle výhodného provedeni vynálezu to odpovídá 2 μΐ HindlII, který je získatelný od společnosti Boehringer-Mannheim Biochemicals, P.O.Box 50414, Indianopolis, Indiana 46250. Roztok se zředí 85 μΐ vody, mírně se míchá a nechá se inkubovat při teplotě 37 ⁼ C po dobu dvou hodin. Reakce se ukonči a DNA se vysráší za použiti tři objemů ethanolu, 0,3 M v octanu sodném. Peleta se odstředí a vysuší.

Peleta se pak znova suspenduje v 10 pml restrikčniho enzymového pufru, přizpůsobeného k jinému distálnímu volenému rest29 rikčnímu enzymovému místu ACB-PI genu. Podle výhodného provedeni vynálezu, příklady doloženého, je EcoRI jiným restrikčním enzymovým místem. Peleta se tudíž suspenduje v 10 μί EcoRI pufru (1M chlorid sodný, 100 mM chlorid hořečnatý, 500 mM tris-HCl, hodnota pH 7,5, 10 mM dithiorythritol). Do tohoto roztoku se přidá ekvivalent 20 jednotek vhodné reatrični endonukleasy, s výhodou EcoRI. EcoRI a HindlII restrikční enzymya různé jiné restrikční endonukleasy, které se mohou použítv tomto protokolu, jsou obchodné dostupné například u společnosti Boehringer-Mannheim Biochemicals, P.O.Box 50414, Indianopolis,Indiana 46250. Pak se přidá 88 μί vody a roztok se mírně michá a inkubuje se při teplotě 37 ’C po dobu dvou hodin. Reakce se pak ukonči a DNA se vysráží třemi objemy ethanolu, 0,3 M v octanu sodném. DNA ze shora uvedené digesce se pak podrobuje elektroforese na 1% agarosovém gelu o nízké teplotě tání. Větší restrikční fragment, odpovídající linearizovánému vektoru DNA,-se odřízne z gelu. Vektor DNA se získá vedením gelového tenkého řezu sloupcem Elutip-dR (obchodně dos- ^{μ r} tupný u společnosti Schlichter 4 Schuell, Keene, NH, USA) v podstatě v souhase s instrukcemi výrobce. DNA se pak vysráží, jak shora uvedeno a vysuší se, DNA se ukládá v 30 μί 10 mM tris-HCl, hodnota pH 8,0.

Přibližně 5 μί vektoru DNA^k se 'smísís'10 pikomól syntetických DNA fragmentů, odpovídajících dvěma polovinám ACB-PI syntetického genu, v 50 μί ligačního pufru (50 mM tris-HCl, hodnota pH

7,6, 100 mM chlorid hořečnatý, 10 mM DTT (dithiothreitol), 800 mM ATP a 3,5 jednotek T4 DNA ligazy (obchodně dostupné u společnosti Boehrínger-Mannheim Biochemicals, P.O.Box 50414, Indianopo1is, Indiana 46250). Reakční směs se pak inukubuje při teplotě 4 °C přes noc a pak se transformuje do vymrazených kompetentních E.coli DH5a buněk (obchodně dostupných u společnosti Bethesda Research laboratories, lne., P.O. Box 6009, Gaithersburg, MD 20877) o sobě známým způsobem pro pracovníky v oboru a znázorněných ve standardních laboratorních příručkách, jako je například Sambrook J. a kol., jak shora uvedeno. Transformanty výhodného provedeni podle vynálezu se nechávají růst při teplotě 37 ’C přes noc na x-gal TY agarových destičkách, obsahujících 100 gg/ml am30 picillinu. Volba antibiotika a prostředí závisí na amplifikačnim vektoru a použité buněčné linii.

Klony, obsahující správný inzert, se volí modro/bilou kolonovou selekci. Ztráta funkčnosti lacZ genu se přičítá transformantům, jelikož bod inzerce klonovaci oblasti pUC18 je v lacZ kódující sekvenci. Selekce klonů, obsahujících vhodnou sekvenci, se potvrzuje ds-DNA sekvencovánim za použiti Sequenasy * (obchodně dostupné u společnosti United States Biochemical Corp., P.O. Box 22400, Cleveland, OH 44122) podle protokolu, dodávaného výrobcem. Výsledný plasmid lidské . ACB-PI sekvence se určuje pRBlBl. Vyvíjející se řetězec, nesoucí amplifikačnl plasmid, se pak nechává růst přes noc při teplotě 37 ‘C v prostředí TY, obsahujícím 100 ng/ml ampicilinu a plasmid, obsahující syntetickou ACB-hPI kódující sekvenci se Izoluje způsobem, který popsal Maniartis T., Fritsch, E.F. a Sambrook J., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, New York (1982), str. 89 až 94. Obecně přibližně 20 pg plasmidu DNA, shora izolovaného, se suspenduje ve 20 μΐ pufru, vhodného pro jeden z vnitřně začleněných do restrikčnich mlet. Volba těchto vnitřních restrikčnich míst je funkci volby vektoru pro expresi, používaného ve vztahu k řídicím oblastem vektoru pro expresi. Podle výhodného provedeni vynálezu, příklady doloženého, je restrikčnim enzymem volby Ndel. Ke shora uvedenému roztoku se přidá přibližně 40 jednotek restrikčnlho enzymu, 175 μΐ vody a mírně se míchá a inkubuje se při teplotě 37 ’C po dobu jedné hodiny. Pak se přidá přibližně 40 jednotek jiné vnitřní restrikční endonukleasy (podle příkladného výhodného provedeni BamHI) a inkubuje se při teplotě 37 ’C po dobu dalších dvou hodin. Reakce se pak ukonči a DNA se vysrážl třemi objemy ethanolu, 0,3 M v octanu sodném. Roztok se pak podrobuje elektroforeze na 1,2% agarosovém gelu o nízké teplotě tání. Fragment, odpovídající přibližně 265 bp ACB-hPI kódující sekvenci, se pak odřízne od gelu. ACB-hPI DNA se získá vedením sloupcem Elutip-d^, jak je popsáno v přikladu 2. Po vysráženi a vysušeni ve vakuu se DNA ukládá v 25 μΐ 10 mM tris-HCl, hodnota pH 8,0.

Expresní plasmid, kterého se-používá, se může volit z Čet31 ných alternativ, má vhodnou kontrolní oblast a vhodná restrikční mista usnadňující integraci ACB-PI kódující sekvence operativně se zřetelem na řidiči oblasti. Nejrůznější vektory pro expresi, užitečné pro transformaci prokaryotických a transfektnich eukaryotických buněk jsou v oboru dobře známy. Jakožto příklady takových vektorů provexpresi se uvádějí pTrc 99A, pKK223-3, pKK223-2, pDR54O tac promotorovy vektor pDR trp promotorovy vektor, pcz2O, pLEBBGH2 a pLHOC. Podle nejvýhodnějálho prováděni způsobu podle vynálezu, jak je příklady doloženo, pokud je hostitelskou buňkou E. coli K12 buňka, je vektorem pro expresi pCZR126S. Plasmid se může připravovat podle dále uvedeného přikladu 3.

K dosaženi účinné transkripce syntetického genu, musí být gen. operativně asociován s promotorovou operátorovou oblasti. V oboru jsou dobře známy nejrůznějši promotor operátorové oblasti funkční v E.coli hostitelských buňkách. Podle výhodného provedeni způsobu podle vynálezu, jak je příklady doloženo,je promotorovou operátovou oblasti promotorové oblast lambda pL.

Podle výhodného provedeni je oblast promotorového operátoru syntetického genu, jenž má zakódovanou sloučeninu obecného vzorce I, umístěna v téže následné orientaci vzhledem k počátečnímu kodonu ATG, jakou zaujímá promotorové operace vzhledem k počátečnímu kodonu ATG genu, z něhož byla odvozena. Syntetické nebo modifikované promotorové operátorové oblasti jsou vytvořeny o sobě známým způsobem ze stavu techniky. Jestliže se používá takových syntetických nebo modifikovaných promotor operátorových oblastí, mají být orientovány se zřetelem na ATG startující kodon ACB-PI genu, jak je určeno jejich kreétory.

Podle výhodného provedeni způsobu podle vynálezu, jak je příklady doloženo, se suspenduje přibližně 15 pg zvoleného expresního plasmidu (pCZR126S) ve 20 μΐ pufru, odpovídajícího prvnímu ze dvou vniřních restrikčních míst ACB-PI kódující sekvence (způsobem objasňujícím Ndel restrikční místo). Přidává se přibližně 40 jednotek restrikčnlho enzymu (například NDel), 175 μΐ vody a inkubuje se po dobu dvou hodin při teplotě 37 *C. Po inkubaci se DNA vysráži ve třech objemech ethanolu, 0,3 M v octanu sodném, jak shora uvedeno, vysuší se a suspenduje se ve 20 μΐ restrikčního enzymového pufru odpovídajícího druhému vnitřnímu restrikčnímu místu (způsobem objasňujícím BamHI restrikční místo). Pak se přidá přibližně 25 jednotek druhého restrikčního enzymu (například BamHI) a přibližně 178 μΐ vody, mírně se promíchá a inkubuje se po dobu dalších dvou hodin při teplotě 37 *C. Reakce se pak ukončí a DNA se vysráýí třemi objemy ethanolu 0,3 M v ethylacetátu. Vektor pCZR126S, izolovaný tímto způsobem, se pak podrobuje elektroforeze na 1% agarozovém gelu s nízkou teplotou táni. Větší fragment, odpovídající vektoru DNA, se pak ve formě tenkého řezu odřízne z gelu a vektor DNA se izoluje vedením přes sloupec Elutip-d*. Po vysrážení a vysušeni se ukládá v 35 μΐ lOmM trls-HCl, hodnota pH 8,0.

Přibližně 2,5 μΐ shora uvedeného vektoru DNA roztoku se pak smísí s přibližně 12 μΐ roztoku čištěného ACB-PI fragmentu, shora připraveného. Do tohoto roztoku se přidá 4 μΐ lOraMrATP, » 0,5 μΐ IM dithiothreitolu, 5 μΐ 10X ligazového pufru (500 mM trls-HCl, hodnota pH 7,6, 100 mH chlorid hořečnatý), 26 μΐ vody a 0,5 μΐ (3,5 jednotek) T4 DNA ligasy (obchodně dostupné u společnosti Pharmacia, lne., 800 Centennlal Avenue,Piscataway, N.J. 08854). Reakční směs se pak inkubuje při teplotě 4 “C po dobu 16 hodin.

Jak příklady doloženo/-xdigačni^eměs-^^se^zředi ^50-.μ^:1-10 mM tris-HCl (hodnota pH 7,6) a 3 μΐ chloridu vápenatého a následně se použije k přímé transformaci příslušných buněk E. coli K12 RV308, jak je popsáno v příkladu 3A. Podle výhodného provedeni vynálezu buňky E. coli K12 RV308 se používají jakožto hostující buňky, mohou se však použít také četné jiné buňky, přičemž se příkladně uvádějí E. coli K12 L201, L687, L693, L507, L64O,

L641, L695, L814 (E. coli Β), přičemž tento výčet není míněn jako omezení. Transformované hostitelské buňky se pak vnesou na vhodné prostředí za selektivního tlaku antibiotika odpovídajícího resistenci přítomného genu na expresní plasmid. Kultura se pak inkubuje po dobu vhodnou pro hostitelskou buňku a při teplotě vhodné pro hostitelskou buňku.

Způsoby transformace buněk shora uvedenými vektory, jsou v oboru dobře známy a obecně je popsali Maniatis a kol. (19.88)

Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York Current Protocols in Molecular Biology (1989) a doplňky. Tato metodologie transformace buněk E. coli, používaná při nejvýhodnějším prováděni způsobu podle vynálezu,je příklady objasněna a doložena. Přesné podmínky, za kterých se buňky E. coli transformuji a kultivuji, závisejí na povaze E. coli hostujících buněk a na použitých expresních nebo klonovacich vektorech. Například vektory, které včleňuji tepelně zaveditelné promotor operátorové oblasti, například cl857 tepelně zaveditelnou lamda fágovou promotor operátorovou oblast, vyžaduji teplotní posun v kultivačních podmínkách k navozeni bllkovlnové syntézy.

K expresi bílkovin dochází ve vysoce koncentrovaných bakteriálních expresních systémech, charakteristicky se agreguji na granule nebo inkluzni útvary, které obsahuji vysokou hladinu bílkoviny (Kreuger a kol. (1990) Protein Folding,Gierasch & King, str. 136 až 142, American Association for the Advancement of Science Publication No. 89-18S, Washington, D.C.) Takové bllkovlnové agregáty se musejí solubi1izovat pro další čištěni a izolaci žádaného bllkovlnového produktu.-Id. Pro solubilizaci bílkovin se mohou použit nejrůznějšl techniky užívající silně denaturovaných roztoků, jako j e napříkl ad guani dl ni um-HCl a/nebo slabě denatuřováných roztoků, jako je například dithiothreitol (DTT). Postupné odstraněni denaturačnich Činidel· (často dialyzou) v převáděcím roztoku umožňuje, aby denaturovaná bílkovina přijala svoji nativní konformaci. Příslušné podmínky denaturace a převedeni se stanovuji pro určitý bilkovlnový expresní systém a/nebo pro příslušnou bílkovinu.

Přezkoušení ACB-prolnzulin obsahující bakterie po fermantaci Indikuje přítomnost granulovaných útvarů. Po Izolaci, solubilizaci a sulfitolyze se rekombinantnl bílkoviny oddělí na anexovém sloupci. Mono Q chromatografie sulfito lyžovaných bílkovin se provádí po odsoleni reverzní fázovou HPLC, Čímž se získají dva ACB-proInsulinové fondy (pool). Fond A (32 mg) vykazuje hmotový pik 9878 podle FAB-MS a aminokoncová sekvence vykazuje Gly-IleVal. Fond B (115 mg) vykazuje hmotový pík 10009 podle FAB-MS a aminokoncová sekvence vykazuje Met-Gly-Ile. Spolu s hodnotami aminokyselinové analyzy, se zdá, že fond A odpovidá autentickému ACB-proinzulin-S-sulfonátu zatímco fond B odpovidá ACB-proinzulinS-sulfonátové molekule plus odpovídajícímu iniciátorovému methioninovému zbytku k iniciaci kodonu. RP-HPLC, aminokyselinová analýza a N-koncové sekvencováni ukazují, Se oba bílkovinové fondy jsou znečištěny majoritní složkou druhého fondu kromě několika jiných plků.

S-Sulfonáty obou ACB-proinzulinových molekul se konvertuji na disulfidicky zpárované vlásenkové ACB proinzulinová molekuly za použití kombinace vysoké hodnoty pH a přidaného thlolu , jak popsal Frank B.H. a kol., (1981), Peptides, Synthesis, Structure and Function, Proceedings of the Seventh American Peptide Symposium (Rich, D.H. a Gross E.), str. 729 až 738, Pierce Chemical Co., Rockford, IL. Obě molekuly vytvářejí vlásenkovou strukturu v dobrém výtěžku (více než 75 %) a Čistí se reverzní fázovou

HPLC, Čímž se získá 33 mg MetO-Glyl-ACB-proinzulinu (2-B6) (Met-ACB-proinzulin) a 4 mg Glyl-ACB-proinzulinu (2-86) (ACB-proinzulin). Nízké výtěžky každého analogu jsou způsobeny potřebou řezů ve fondu a shromážděním frakci z čištění příčné kontaminace mezi dvěma invertovanými proinzullnovými formami. Bílkoviny se charakterizují se zřetelem na čistotu a identitu použitím RP-HPLC (obr. 21) aminoterminál ním sekvencovánim, aminokyselinovou analýzou a FAB-MS s očekávanými výsledky. Kromě toho se Glyl-ACB proinzulinová (2-86) molekula analyzuje se zřetelem na vzor zpárováni disulfidických vazeb.

Vynález se týká dále způsobu rekombinantni produkce nativních inzulínových bílkovin nebo inzulínových analogů, při kterém konzervativních i minimalizaci se

1. vytváří syntetický gen, přičemž tento gen zahrnuje DNA sekvenci zakodujici ACB-PI peptidovou sloučeninu obecného vzorce I, kde x znamená 1,

2. tento gen se vnáší do vhodného vektoru obsahujícího promotor operátorovou regionální funkci v hostující molekule E. coli,

3. uvedený gen se orientuje ve vektoru k dosažení transkripce a translace syntetického genu a aby byl gen pod transkripčni kontrolou promotor-operátorové oblasti,

4. hostující buňka E. coli se transformuje vektorem,

5. transformovaná hostující buňka E. coli se kultivuje za podmínek vhodných k navození transkripce a translace genu

6. ACB-PI peptid se ziská a čišti,

7. ACB-PI peptid se štěpí vhodnými peptidazami nebo chemickými činidly, takže se C-peptld odštěpí.

Vynález tedy poskytuje zcela novou cestu pro přípravu inzulínu za použití rekombinantni DNA technologie. Vynález využívá použiti zcela nového genu, mRNA a proinzullnových meziproduktů pro produkci funkční lidská inzulínové molekuly spolu s konstituováním nové rekombinantni biosyntetické cesty k inzulínu. ACB-proinzullnová molekula se výrazně liší svoji strukturou od nativní prolnzulinové molekuly (zde označované BCA-proinzulin pro účely srovnáni) a přesto se může účinně konvertovat za získáni funkční inzulínové molekuly.

Tato nová cesta přípravy inzulínu je odlišná od současného způsobu replikace přírodních procesů v odlišných organismech. Tento alternativní způsob vede k inzulínu za značných úspor v rekombinantní produkci obchodně významných množství inzulínu eliminaci požadavku odstraňováni N-koncového methionu z rekombinantni molekuly za použiti cathepsinu C nebo jiných způsobů za využiti vnitřního působeni methionylaminopeptidazy E. coli hostující buňky k odstraněni N-koncového methloninu.

Jelikož je odstraněni N-koncového methloninového zbytku ACB-PI závislé na přítomnosti MAP, musí zvolená hostující buňka vnitřně produkovat MAP nebo musí být konstruována k produkci MAP. Proteasa MAP je vlastni buňkám E. coli. Proto se může použit různých řad buněk E. coli, které produkuji MAP, při způsobu podle vynálezu. Jakožto přiklad E. coli hostujících buněk, užitečných při prováděni způsobu podle vynálezu, se uvádějí buněčné řady E. coli K12 L2O1, L687, L693, L5O7, L640, L641, L695, L814 (E.

coli B). Podle výhodného prováděni vynálezu je E. coli hostující buňkou E. coli K12 RV3O8.

Konverze ACB-PI molekuly s jednoduchým řetězcem na funkční nativní inzulín nebo na inzulínový analog vyžaduje odštěpeni in36 ternálniho C-peptidu. To je možné enzymatickými nebo chemickými prostředky například bromkyanovým štěpením. Jestliže se použije aminokyselinových sekvencí nativního lidského proinzulinu, A-řetězec, B-řetězec a P-peptid, při konstrukci ACB-hPI peptidu, jak příkladně doloženo, je aminokyselinová sekvence ACB-hPI peptidu následující:

Gly	Ile	val	GlU	Gin	Cys	Cys	Thr	Ser	Ile
Al	A2	A3	A4	A5	A6	A7	AS	A9	A10
Cys	Ser	Leu	Tyr	Gin	Leu	GlU	Asn	Tyr	Cys
All	A12	A13	A14	A15	A16	A17	A18	A19	A20 -
Asn	Arg Arg	Glu	Ala	Glu	Asp	Leu	Gin	Val
A21	Cl	C2	C3	C4	C5	C6	C7	C8	C9
Gly Gin	Val	Glu	Leu	Gly Gly Gly	Pro	Gly '--' '31,.....
CIO	Cli	C12	C13	C14	C15	C16	C17	C18	^2^9 V** '.'' ί“* J
Ala	Gly	Ser	Leu	Gin	Pro	Leu Ala-	Leu	GlU · ·;. · ,...·--;’·' ·//·.. ,··
C20	C21	C22	C23	C24	C25	C26	C27	C28	C29 :---v- ·
Gly	ser	Leu	Gin	Lys Arg	Phe	val	Asn	Gin
C30	C31	C32	C33	C34	C35	. Bl..	.12	B3	B4 - .......-......
HiS	Leu	Cys	Gly	Ser	His	Leu	Val	Glu	Ala
B5	B6	B7	BS	B9	BIO	Bil	B12	B13	B14
Leu	Tyr	Leu	Val	Cys	Gly	Glu	Arg	Gly	Phe
B15	B16	B17	B18	B19	Ξ20	B21	B22	B23	B24
Phe	Tyr	Thr	Pro	Lys	Thr
325	B26	B27	B2S	B29	B30

Následující diagram objasňuje trypsinenzymatický model zpracováni ACB-PI, používaný při konverzi ACB-PI na inzulin:

Trypsin i i

ACB-PI Tyr-Cys-Asn-Arg-Arg-Glu

ACB-PI# 19 20 21 22 23 24 Insulin# A19 A20 A21 Cl C2 C3 i i

Gln-Lys-Arg-Phe-Val-Ile 63 64 65 66 67 68

C42 C43 C44 BI B2 B3

Jelikož trypsin štěpí na karboxypolohách Arg21, ARg22, Lys64 a Arg65, ziská se směs inzulínových bílkovin při tryptickém štěpení ACB-PI. Ty zahrnuji:

ArgA22, ArgA23> Args-i ArgA22, Args-i ArgA22, Arga23

ArgA22 insulin insulin insulin insulin

Následující štěpeni shora uvedených druhů s karboxypeptldazou B odstraňuje argininové zbytky z karboxykonce A-řetězce, Čímž se produkuje

Arge-ι inzulin ~ nativní inzulin

Může se .tudíž produkovat -~na tivni_; .„lidský_ zralý.,, inzul in ...........

proteolytickým štěpením ACB-hPI meziproduktu. B-koncový methioninový zbytek ACB-PI molekuly se., vnitřně-odstraňuje s přibližně 30% účinnosti působení methionylaminopeptidasy (MAP) v- hostující buňce.

ACB-proinzulin se konvertuje na lidský inzulin použitím trypsinu a karboxypeptidasy B, jak se používá pro normální proinzulin a jak popsal Xemmler H. a kol., (1971) J. Biol. Chem., svazek 246, str. 6786 až 6791. Konverze ACB-proinzulinu na inzulin vyžaduje podstatně drsnější podmínky než odpovídající,transformace proinzulinu. Reakce se sleduje RP-HPLC, jak je ukázáno na obr.

a vykazuje naprosté vymizeni výchozího materiálu spolu s výskytem několika nových bilkovinových plků. Obr. 25 se týká transformace A-C-B-proinzulinu na lidský inzulín. Na ose x se odečítá doba v sekundách, na ose y odezva v milivoltech. Spodní křivka platí pro lidský proinzulin, vyšší pro lidský inzulín a nejvyšší odpovídá 23 hodinové transformaci. Legenda k obr. 25:

Způsob HBL 4 PK

Chemik číslo Harlan

Sloupec 15 cm VYDAC C18

Koncentrace

Gradient

Příprava vzorku

Podmínky

Zařízení 8

Den zkoušky 07/12/90

Detektor 214 HM, 02 AUFS

O,1 mg/ml

52,5 5,2.317,35,0,5 použité zředěni O,1N HC1

45C, 1 ml/mln, 40 UL injekci, A-0,1%

TFA. B-DITT0/50% CH₃CH — A = 201,1/2 lidský proinzulín ^Λ .

— C = B<17 hodinová traqnsformace — řada III3 injekce 2 lidský inzulín

Po enzymovém štěpeni se získaná peptidová směs rozdělí na své 3ložky za použiti RP-HPLC, jak je zřejmé z obr. 25 a různé frakce se shromáždi a analyzuji se, jak je doloženo v tabulce IV.

Legenda k obr. 26, který se týká transformace Gly-A-C-B HPI na BHI přes trypsin & CPB. Na ose x se odečítá doba v sekundách, na ose y odezva v mi livoltech.

Způsob

Chemik Číslo

Sloupec

Podmínky

Zařízení

Den zkoušky

Detektor

HBL 4 PK Harlan cm VYDAC C18 pep & Prot

07/26/90

214 nm, 2,0 AUFS

I mg vzorku + trYpsin a CPB 45C, 1 ml/min, A-O,l% TFA, B-v 50% CH₃CN grád 35-52,5/5 až 60/5 až 53/30 ař 90/.1 — řada III3 injekce 4 podíl A528MH025

Tabulka IV

Analýza peptidů z proteolytické transformace ACB-proinzulinu na inzulín

Pik #	Identita	A FAB/MS	nalytická metoda
AAAa	HPLC	Peptidová mapa
2 +	4	B22 30	ND	ano	ND	ND
3 +	5	B22 29	ND	ano	ND	ND
9		C-peptid	3020,3	ND	ano	ND
14		DOP-inzulin C	4866,4	ano	ND	ND
16		Arg-inzulin	5964.8	ano	ND	ND
17		*» <* *» inzulín	5808,5	7 nd	ano	„ ' · . · · ' U z*·*-. r · . . ·- df .„yiyýirru 'ano ,'1·-'··
17		des-Thr-inzulin	5707,3	ND	ND	ano

ND => nestanoveno *Amino kyselinová analysa ^bV8 proteásový peptid mapující ^cdeS (B22~3o_inzulin <>des-Thr^{B 3} inzulín

Píky 2 + 4a 3 + 5 na obr. 26 se identifikuji jakožto

GFFYTPK = Gly-Phe-Phe-Tyr-Thr-Pro-Lys (B^23-29) a GFFYTPKT « Gly-Phe-Phe-Tyr-Thr-Pro-Lys-Thr (B²³'³⁰), což je pravděpodobné výsledkem štěpeni trypsinem na Arg-22 B-řetězce inzulínu (Tabulka IV) a jsou jakožto dublety pro nutnost dvou oddělených jednotlivých vstřiků na sloupec. Pík 9 (obr. 26) se identifikuje jako C-peptid na základě koeluce C-peptidovým standardem a molekulovým hmotovým stanovením FAB-MS (tabulka IV). Pik 14 (obr*. 26) odpovídá des-oktapeptid (B^23-3°) inzulínu, což je druhý produkt reakce, který poskytuje pik 2 a 3. Pik 16 se identifikuje jako mono-Arginzulln, pravděpodobně mono-Arg(A22)-inzulln, na základě FAB-MS a aminokyselinová analyzy (tabulka IV). Větái izolovaný pik z trans40 ί

•S formace je frakce 17 (133 gg), Tento bilkovinový pik koeluuje s autentickým biosyntetickým lidským inzulinem za použití RP-HPLC,

jak dokládá obr. 27,	na kterém je peptidová mapa	inzulínu. Na ose
x se odečítá doba v	sekundách, na ose y odezva	v milivoltech.
Legenda k obr. 27:
Způsob	MYL-0
Chemik číslo	A885
Sloupec	ZORBAX C8 150A
Příprava vzorku
Podmínky
Zařízeni	159
Den zkoušky	08/07/90
Detektor	214 NM
	enzymové štěpeni jako přes	WOT-O
A:	5%ACN/75%H2O/2O% 1,25M Na2SO4	...

-— řada 718 injekci - 1 podlí AS0086 — řada 718 injekcí 2 podíl A52-8MH-O25-17

Při analýze FAB-MS se získá plk molekulová hmotnosti 5808,5, jak se očekává pro lidský Inzulín. Kromě toho se pozoruje menái plk molekulové hmotnosti 5707,3, představující 10 až 125 % veškeré bílkoviny a identifikovaný jako des-Thr(B30) inzulín. Des-Thr (B30) inzulín je znám ke kochramatografovánl s lidským inzulinem za RP-HPLC systému, použitého tak, že se neočekává neúspěch k odděleni tohoto materiálu od lnzulinu. Pik 17 se také analyzuje za použiti Staphylococcus aureus V8 proteazovóho peptidů, mapujícího podle Chance R.E a ko.l. (1981), Peptides, Synthesis, Structure and Function. Proceedings of the Seventh American Peptide Symposium (Rlch, D.H. & Gross, £.), str. 721 až 728, Plerce Chemical Company, Rockford, IL, přičemž se zjišťuje, že je identický s biosyntetickým lidským inzulinem za očekáváni, že se pozoruje malý pik, reprezentující (GFFYTPK) Gly-Phe-Phe-Tyr-Thr-Pro-Lys (z desThr(B³o)inzulinu) vedle normálního piku (GFFYTPKT) Gly-Phe-PheTyr-Thr-Pro-Lys-Thr, jak je zřejmé z obr. 27. Jak je zřejmé z obr 30, produkovaný inzulin proteolytickou transformaci ACB-inzulinu je 100% biologicky aktivní při receptorových zkouškách lidského placentálnlho inzulinu.

Pro další stanoveni, zdali bílkovina, produkovaná příkladným enzymatickým štěpením ACB-proinzulinů odpovídá nebo neodpovídá na tivnímu lidskému inzulinu, se porovnávají obrazce trypsin + pepsinového štěpeni ACB-proinzulinem produkované bílkoviny ve srovnáni s obrazci trypsin + pepsinových štěpících obrazců lidského inzulinu. Prostřednictvím trypsin + pepsinového štěpeni lidského Inzulínu se získá stabilní A1-13/B1-11 fragment plus četné jiné menši fragmenty, jak popisuje Toren, P a kol., (1988) Anal. Biochem. svazek 169, str. 267 až 299. Z 12 možných inzulínových disulfidických izomerů, obsahujících jednoduchý A a B řetězec, pouze tři mohou poskytovat volné a oddělené fragmenty při štěpeni s pepsinem, jmenovitě přírodní hormon a dva disulfidické izornéry chemicky syntetizované dřivé, jak popisuje Sleber P.a kol;,(1978) Hoppe-Seylor's Z. Physiol. Chem., svazek 359, str. 113. až 123. Fragment A1-13/B1-11 se získá 2 trypsin/pepsinového štěpení ACBproinzul inu a porovnává-se s ^fragmenty^Al-13/Bl-ll, .^získanými z těchto tři inzulínových izomerů. Kompletní pepsinové štěpeni ukazuje, že větší HPLC pik koeluuje s A1-13/B1-11 fragmentem z přírodního Inzulinu a že neobsahuje žádný z plků soutěžících A1-13/B1-11 fragmentů,ze dvou disulfidických izomerů^ jak je ukázáno na obr. 22. Větší štěpný pík se Čistí (53 gg) a podle zjištění má očekávané aminokyselinové složení pro A1-13/B1-11.

Následující příklady praktického provedení vynález objasňuji, nijak jej však neomezuji.

Příklady provedeni vynálezu

Přiklad 1

Konstrukce syntetického ACB-proin2ullnového genu

278 pár bázi DNA fragment, který zakodovává lidský ACB-proinzulinový gen se udrčí na bázi dobře známé aminokyselinové sekvence lidské proinzullnové molekuly a zahrnuje sekvence:(pozitivní řetězec sekv ID číslo 2, negativní řetězec = sekv ID číslo 3) ^f - AGCTTCATATGGGCATTGTGGAACAATGCTGTACCAGCATCTCCTCCOTG

3' - AGTATACCCGTAACACCTTGTTACGACATGGTCGTAGACGAGGGAC

TACCAGCTGGAGAACTACTGCAACCGCCGTGAGGCAGAGGACCTGCAGGTG

ATGGTCGACCTCITCATGACGTTGGCGGCACTCCGTCTCCTGGACGTCCAC

GGTCAGGTGGAGCTGGGCGGTGGCCCGGGTGCAGGCAGCCTGCAGCCGCTG

CCAGTCCACCTCGACCCGCCACCGGGCCCACGTCCX3TCGGACGTCGGCGAC

GCČCTGGAGGGTrCCCTGCAGAAGCGTITrTTGAACCAACACCTGTGCGGC

CGGGACCTCCCAAGGGACGTCTTCGCAAAAAACTTGGTTGTGGACACGCCG

Γ ' ’ · *·”-./•.tyf*» ·. ,ί'-ν;; ’ . ..... ' ' -γ. J·'. ’·'

TCCCACCTGGTGGAAGCTCTGTACCTGGTGTGCGGTGAACGTGGCTTCTTC AGGGTGGACCACCrrCGAGACATGGACCACACGCCACTTGCACCGAAGAAG , ’ .

TACACCCCGAAGACCTAGQATCCG - 3'

- · - ATCTCGGGCTTCTCGATCCTAGGCTTAA. - 5'

Nukleotidové sekvence se modifikují na svých zakončeních 5' a 3* přidáním bází k vytvořeni NDel a BamHI restrikčních poloh lemovaných HindlII a ECoRI polohami pro klonování genu do polyspojovnikové oblasti pUC18 plasmidu. Osm syntetických oligonukleotidů (oblasti 1 - 8 ve shora uvedeném grafu), lišících se délkou od 56 do 74 bázi, jak shora uvedeno, se generují za použiti DNA syntetizeru Applied Biosystems Model 38OA nebo 38OB (obchodní produkt společnosti Applied Biosystems, 850 Lincoln Center Drive, Foster City, CA 94404) podle pokynů výrobce a čisti se elektroforezou na 15% polyakrylamidového gelu. Tyto oligonukleotidy se fosforylují za použiti (gamma-p32] ATP a polynukleotidové kinásy a pak se komplexuji s T4 DNA ligasou k vytvoření dvou 139 párů r

bázi dlouhých DNA duplexů, jak popisuje Brown, E.L.,, Belagaje R., Ryan M.J. a Khorana H.G., (1979), Method in Enzymology, Academie Press, N.Y. 68, str. 109 až 151.

První polovina ACB-PI genu se formuje míšením nefosforylovaného oligonukleotidu 1 fosforylovánými oligonukleotidy 2, 5 a 6, zatímco druhá polovina genu se formuje míšením fosforylovaných oligonukleotidů 3, 4 a 7 nefosforylovaným o1igonukleotidem 8. Obě poloviny genových fragmentů se čistí na 15% polyakrylamidovém gelu a DNA se zisků z gelového tenkého řezu elektroforeticky a odsolením na sloupci Sephadexu G-50.

Příklad 2

Konstrukce plasmidu pRB 181

Přibližně 5 pg plasmidu pUCie (obchodně dostupný u společnosti Boehringer-Mannheim) se suspenduje v 10 μΐ 10X Hindlil _f pufru (IM chloridu sodného, 50 mM chloridu hořečnatého, 100 «Μ tris-HCl, hodnota pH 8,0, 10 mM dithioerythritolu), ve 2 μΐ HindXII restrikční endonuklease (obchodně dostupná u společnosti Boehringer-Mannheim, 20 jednotek), v 85 μΐ vody, mírně se míchá a inkubuje se při teplotě 37 *C po dobu dvou hodin. DNA se vysrážl třemi objemy ethanolu, 0,3 M v octanu sodném. Po odstředění a usušení ve vakuu se peleta rozpustí v 10 μΐ 10X EcoRI pufru (IM chloridu sodného, 100 mM chloridu hořečnatého, 500 mM tris-HCl, hodnota pH 7,5, 10 mM dithioerythritolu), ve 2 μΐ EcoRI restrikčniho enzymu (obchodně dostupný u společnosti BoehringerMannheim, 20 jednotek), v 88 μΐ vody, mírně se míchá a Inkubuje se při teplotě 37 *C po dobu dalších dvou hodin. DNA se opět vysráží třemi objemy ethanolu, 0,3 M v octanu sodném, a podrobuje se elektroforeze na 1% agarosovém gelu s nízkou teplotou tání. Větší HlndlII/Eco Rl restrikční fragment (2623 bp) se odřízne z gelu a DNA se získá vedením sloupcem Elutip-d^R (obchodně dostupný u společnosti Schlicher & Schuell, Keene, NH, 03431) podle návodu výrobce. Po vysrážení a usušeni se DNA skladuje v 30 μιηΐ lOmM tris-HCl, hodnota pH 8,0 při teplotě 4 ’C.

Přibližně 5 μΐ tohoto vektoru DNA se smísí s 10 pikomoly dvou syntetických DNA fragmentů, shora připravených, v 50 μΐ ligačního pufru (50mM tris-HCl, 10 mM chloridu hořečnatého, 10 mM DTT, 800 uM ATP a 3,5 jednotek T4 DNA ligasy, hodnota pH 7,6).Reakční směs se inkubuje při teplotě 4 ’C přes noc a převede se do zmrazených příslušných buněk E. coli DH5 (obchodně dostupných u společnosti Bethesda Research Laboratories, Ino., P.O. Box 6009, Gaithersburg, MD 20877). Transformanty se nechávají růst přes noc při teplotě 37 *C na x-gal TY agarových destičkách, obsahujících 100 pg/ml ampicilinu. Voli se klony obsahující správný inzert ztrátou funkcionálního lacZ genu podle modro/bílé kolonové selekce a potvrzuje se ds-DNA sekvencovánim za použiti Sekvenasové soupravyy (obchodně dostupná u společnosti United States Biochemical Corp.). Získaný plasmid se označuje jako pRBiei.

Přiklad 3

Konstrukce rekombinantních vektorů a hostitelů

A. Konstrukce plasmidu pCZR126S

1. Izolace plasmidu pkC283 “ >

Lyofily E. coli K12 BE1201/pKC283 se získají u společnosti

No rthern Regi onal Research - -Labor atory, -Peer iá, 111 i no is61604f pod číslem NRRL BG-15830. Lyofily se dekantujl do zkumavky obsahující 10 ml LB prostředí (10 g Bacto-tryptonu, 5 g Bacto kvasničného extraktu a 10 g chloridu sodného na litr, hodnota pH nastavena na 7,5) a inkubuje se po dobu dvou hodin při teplotě 32 'C, přičemž se vytvoří kultury 50 pg/ml v ampicilinu a pak se inkubuje pří teplotě 32 ’C přes noc. Buňky E. coli K12 BE1201/pKC283 se kultivuji při teplotě 32 °C, jelikož buňky obsahují k teplotě citlivý cl represni gen, integrovaný do buněčné DNA. Jesliže se použiji buňky, které obsahují divoký typ lambda pL represorového genu nebo které neobsahuji lambda pL promotér při izolačním postupu, jak popsáno v následujících příkladech, je inkubačni teplota 37 ’C.

Malý díl kultury, pěstované přes noc, se vnese na LB-agarové destičky (LB prostředí s 15 g/1 Bacto-agaru), obsahující 5 gg/ml ampicilinu tak, že se získá jednoduchý kolonový izolát E. coli K12 BE1201/pKC283. Získaná jednoduchá kolona se naočkovává do 10 ml LB prostředí, obsahujícího 50 gg/ml ampicilinu a inkubuje se přes noc při teplotě 32 ’c za intenzivního třepání. Naočkovává se 10 ml kultury, kultivované přes noc, do 500 LB prostředí, obsahujícího 50 gg/ml ampicilinu a inkubuje se při teplotě 32 ’C za intenzivního třepáni tak dlouho, až kultura dosáhne stacionární fáze.

Následující procedura je přizpůsobená podle Maniatis a kol., 1982, Molecular Cloning (Cold Spring Harbor Laboratory). Buňky se sklidí odstředěním při 4000 g po dobu 10 minut při teplotě 4 'C a pak se supernatant zahodí. Buněčná peleta se promyje ve 100 ml ledově chladného STE pufru (O,1M chloridu sodného, 10 mM Tris-HCl, hodnota pH 7,8 a 1 mM EDTA). Po promyt! se buněčná peleta resuspenduje v 10 ml Roztoku 1 (50 mM glukóza, 25 mM Tris-HCl, hodnota pH 8,0 a 10 mM EDTA), obsahujícím 5 mg/ml lysozymu a ponechá se při teplotě místnosti po dobu 10 minut. Přidá se 20 ml Roztoku 2 (0,2 N hydroxidu sodného a 1 % SDS) do buněk zpracovaných lysozymem a roztok se mírně míchá za Inverze. Směs se inkubuje na ledu po dobu 10 minut.

Přidá se 15 ml ledově chladného 5 M octanu draselného, hodnota pH 4,8 do zpracované'směsi buněk á roztok se míchá za inverze. Roztok se inkubuje na ledu po dobu 10 minut. Připraví se 5 M roztok octanu draselného přidáním 11,5 ml ledové kyseliny octové do 28,5 ml vody a 60 ml 5 M octanu draselnéiho. Získaný roztok je 3 M se zřetelem na draslík a 5 M se zřetelem na acetát.

Lysovaná směs buněk se odstředuje v odstředivce Beckman SW27 (nebo v rovnocenné odstředivce) při počtu otáček 20000/min po dobu 20 minut při teplotě 4 'C. Buněčná DNA a zlomky vytvářejí pe-l-s-tu—aa—dně—zkumavky“získá se přibližně 36 ml supernatantu a přidá se 0,6 objemů isopropanolu, smísí se a ziskaný roztok se ponechá při teplotě místnosti po dobu 15 minut. Plasmid DNA se ziská ostředovánim při 12000 g po dobu 30 minut při teplotě místnosti . Supernatant se vyhodi a DNA peleta se promyje 70% ethanolem při teplotě místnosti. Ethanolový promývací roztok se dekantuje a peleta se vysuší ve vakuovém desikátoru. Peleta se pak re46 suspenduje v 8 ml TE pufru (10 mM Tris-HCl, hodnota pH 8,0 a lmM EDTA).

Přidá se 8 g chloridu česného do DNA roztoku. Přibližně 0,8 ml 10 mg/ml roztokuu ethidiumbromidu ve vodě se přidá na každých 10 ml roztoku chloridu česného - DNA. Konečná hustota roztoku je přibližně 1,55 g/ml a ethidiumbromidová koncentrace je přibližně 600 pg/ml. Roztok se převede do odstředivkové zkumavky Beckman Type 50, náplni se po vrch parafinovým olejem, utěsní se a odstředuje se při počtu otáček 45000/min po dobu 24 hodin při teplotě 20 ’C. Po odstředění jsou viditelné dva pásy DNA v obyčejmém světle. Po odstraněni čepičky ze zkumavky, se odstraní nižší DNA pás použitím stříkačky s hypodermnl jehlou #21, zavedenou z boku odstředivkově zkumavky.

Ethidiumbromid se odstraní opakovanou extrakcí vodou nasycenou 1-butanolem. Chlorid česný se odstraní, dialyzou proti TE pufru. Po extrakcích pufrovaným fenolem.a pak chloroformem se DNA., vysráží, promyje se 70% ethanolem a vysuší se. Získá se přibližně 1 mg plasmidu pKC283 a uloží se při teplotě 4 *C v TE pufru při koncentraci přibližně 1 pg/μΐ. Restrikčni poloha a funkční mapa plasmidu pKC283 je na obr. 1.

- Příklad 3.A.2 ' ' -------Konstrukce plasmidu pKC283FX

Přibližně 10 μΐ plasmidu pKC283 DNA, připraveného způsobem podle přikladu 1, se smíchá se 20 μΐ systému 10 X střední- solný restrikčni pufr (500 mM chlorid sodný, 100 mM Tris-HCl, hodnota pH 7,5, 100 mM chlorid hořečnatý a 10 mM DTT), 20 μΐ 1 mg/ml BSA, μΐ restričního enzymu PvuII (přibližně 50 jednotek, jak definováno společnosti Bethesda Research Laboratories (BSL), od které jsou všechny zde používané restrikčni enzymy) a 145 μΐ vody a získaná reakční směs se inkubuje při teplotě 37 ’C po dobu dvou hodin. Restrikčni enzymové reakce, zde popisované, se rutinně ukončuji fenolovou a pak chloroformovou extrakci, po které’se provede vysráženi DNA, promytí ethanolem a resuspendování DNA v TE pufru. Po ukončeni PvuII štěpeni, jak shora popsáno., PvuII

Štěpený plasmid pKC283 DNA se vysráží a pak se resuspenduje v 5 μΐ TE pufru.

Přibližně 600 pikomol (pM) Xhol spojovníků (5'-CCTCGAGG-3') (sekvence Id číslo 4) se kinazuje ve směsi obsahující 10 μΐ 5 X pufru Kinasa (300 mM Tris-HCl, hodnota pH 7,8, 50 mM chloridu hořečnatého a 25 mM DTT), 5 μΐ 5 mM ATP, 24 μΐ vody, 0,5 μΐ T4 polynukleotidové kinasy (přibližně 2,5 jednotek, jak definováno P-L Biochemicals), 5 μΐ 1 mg/ml BSA a 5 μΐ 10 mM spermidinu inkubaci směsi při teplotě 37 ‘C po dobu 30 minut.

Přibližně 12,5 μΐ kinasovaných Xhol spojovníků se přidá do 5 μΐ PvuII Štěpeného plasmidu pkC283 DNA a pak se přidá 2,5 μΐ 10 X ligasového pufru (300 mM Tris-HCl, hodnota pH 7,6, 100 mM chlorid hořečnatý a 50 mM DTT), 2,5 μΐ 1 mg/ml BSA, 7 μΐ 5 mM ATP, 2,5 μΐ (přibližně 2,5 jednotek podle P-L Biochemicals>T4 DNA ligasy, 2,5 μΐ 10 mM spermidinu a 3 μΐ vody do DNA. Výsledná ligačni reakční směs se inkubuje přes noc při teplotě 4 C.^Po ukončeni ligačni reakce se reakční směs nastaví tak, aby měla složeni vysoce slaného pufru (0,1 M chloridu sodného, 0,05 M TrisHCl, hodnota pH 7,5, 10,0 mM chloridu hořečnatého a 1 mM DTT). Přidá se přibližně 10 μΐ (100 jednotek) restrikčnlho enzymu Xhol do směsi a získaná reakční směs se Inkubuje při teplotě 37 ‘C po dobu dvou hodin.

Reakce se ukonči a Xhol štěpená DNA se vysráží, resuspenduje a provede se ligace shora popsaným způsobem s tou výjimkou, že se do ligačni směsi nepřidá žádný Xhol spojovník. Ligatovaná DNA je žádaným plasmidem pKC283PX. Restrikční místo a funkční mapa plasmidu pKC283PX je na obr. 2.

Příklad 3.A.3

Konstrukce E. coli K12 MO (lambda ±)/pKC283PX

E. coli K12 M0(lambda*) se může získat od Northern Regional

Research Laboratories, kde je uloženo pod číslem NRRL B-15993, v lyofilizovaném stavu. E. coli K12 M0(lambda*) obsahuje divoký typ lambda pL CI represorový gen, takže transkripce z hybridu pLIpp promotéru podle vynálezu neprobíhá v buňkách E. coli K12

M0(lambda*). Lyofily se rekonstituuji, jednoduché kolonie

MO(lambda⁺) se izoluji a připraví se 10 ml přes noc kultivovaých

M0(lambda*) buněk v podstatě způsobem podle přikladu 29A1 s tou výjimkou, že teplota při inkubaci je 37 ‘C a v růstovém prostředí se nepoužívá žádného ampicilinu, ³

Použije se 50 pl kultury kultivované přes noc k naočkováni 5 tni LB prostředí, které také obsahuje 10 mM síran hořečnatý a 10 mM chlorid hořečnatý. Kultura se inkubuje při teplotě 37 *C přes noc za intenzivního třepáni. Následující ráno se kultura zředí na 200 ml LB prostředím, obsahujícím 10 mM síranu hořečnatého a 10 mM chloridu hořečnatého. Zředěná kultura se inkubuje při teplotě 37 °C za intenzivního třepáni až je absorbance při 550 nm (Asso) přibližně 0,5, což indikuje hustotu buněk přibližně 1 x 10θ buněk/ml. Kultura se ochladl na 10 minut v lázni ledové vody a buňky se pak shromáždi odstředováním při 4000 g po dobu—10 minut při 4 ’C. Buněčná peleta se resuspenduje ve 100 mi stu-, děného 10 mM síranu hořečnatého a pak se bezprostředně znova peletizuje odstředěním. Buněčná peleta se resuspenduje ve 100 mil 30 mM chloridu vápenatého a inkubuje se na ledu po dobu 20 minut.

Buňky se opět shromáždi odstředěním a resuspendují se v 10 ml 30 mM chloridu vápenatého: Půl mililitrový podíl buněk se přidá do ligované DNA, připravené--poďle přikladu^;29A2r DNA še při- ”^' ΐ praví 30 mM v chloridu vápenatém. Směs buněk a DNA se Inkubuje na ledu po dobu jedné hodiny, tepelně se na ni působí při 42 *C po >

dobu 90 sekund a pak se ochladl na ledu v průběhu přibližně dvou minut. Směs buněk a DNA se zředí na 10 ml LB prostředím ve 125 ml baňkách a inkubuje se při teplotě 37 ‘C po dobu jedné hodiny. Nanesou se 100 μΐ podíly na LB agarové destičky obsahující ampicilin a inkubuji se při teplotě 37 “C až do výskytu kolonii.

Kolonie se jednotlivě kultivují a plasmid DNA jednotlivých kolonii se zkoumá restrikční enzymovou analýzou a gelovou elektroforézou. Plasmid DNA se izoluje způsobem podle příkladu 29A1, avšak stupeň gradientu chloridu česného se vynechává dokud se žádané E. coli K12 M0(lambda*)/pKC283PX transformáty neidentifikuji. Restrikční místo a funkční mapa plasmidu pKC283PX je na obr.

2.

Přiklad 3.A.4

Konstrukce E. coli K12 MO (lambda ±)/pKC283-L

Připraví se 10 gg plasmidu pKC283PX DNA způsobem podle přikladu 29A1 a rozpustí se v 2o μΐ 10X vysoce slaného pufru, 20 μί 1 mg/ml BSA, 5 μί (přibližně 50 jednotek) restrikčního enzymu BglII, 5 μί (přibližně 50 jednotek) restrikčního enzymu Xhol a 150 μί vody a získaná reakční směs se inkubuje po dobu dvou hodin při teplotě 37 *C. Reakce se ukonči a po vysráženi BglII-Xhol štěpené DNA se DNA resuspenduje v 5 μΐ TE pufru. Syntetizuje a kinazuje se DNA spojovník s konci DNA s jednoduchým řetězcem charakteristický restrikčním enzymovým Štěpením BglII a Xhol. Spojovník se kinazuje v podstatě způsobem podle přikladu 3A2. DNA spojovník má následující strukturu: .....

• IV ’ -GATCTATTAACTCAATCTAGAC- 3 ’

111111111111111111 ' -ATAATTGAGTTAGATCTGAGCT- 5' (sekv. ID číslo 5) (sekv. ID číslo 6)

Shora uvedený spojovník 3β syntetizuje z deoxyoligonukleo- . tidů s jednoduchým řetězcem o sobě známým způsobem. Deoxyoligonukleotidy s jednoduchým řetězcem se mohou syntetizovat za použiti komerčně dostupných zařízeni, jako je například syntetizátor 380 DNA Syntetizer společnosti Applide Biosystems (850 Lincoln Centre Drive, Foster City, CA 94404),, který využívá fosforamiditové chemie. Jiné procesy pro syntézu DNA jsou v oboru rovněž známy.

Běžně modifikovaný fosfortriesterový způsob syntetzy DNA s jednoduchým řetězcem popsal Itakura a kol., 1977, Science 198:1056 and

Crea a kol., 1978, Proč. Nat. Acad. Sci. USA 75:576. Kromě toho_ popsal speciální způsob DNA syntézy Hslung a kol., 1983, Nucleic Acid Research 11:3227 a Narang a kol., 1980, Methods in Enzymology 68:90.

Spojovník a BglII-Xhol štěpený plasmid pKC283PX se ligatuje v podstatě způsobem podle přikladu 3A2. Ligatovaná DNA konstituuje žádaný plasmid pKC283PX. Restrikční místo a funkční mapa plas50 midu pKC283-L jsou na obr. 3, Plasmid pKC283-L DNA se používá k transformací E. coli K12 MO(lambda⁺) a rezultujici E. coli K12

M0(lambda*)/pKC283-L transformanty se identifikuji v podstatě způsobem podle přikladu 3A3.

Přiklad 3.A.5.

Konstrukce E. coli K12 M0(lambda*)/pKC283-LB

Přibližně 10 μg plasmidů pKC283-L DNA, připraveného v podstatě způsobem podle přikladu 29A1, se rozpustí ve 20 μΐ 10X vysoce slaného pufru, 20 μΐ 1 mg/ml BSA, 5 μΐ (přibližně 50 jednotek restrikčního enzymu Xhol a 155 μΐ vody a získaná reakčni směs se inkubuje při teplotě 37 *C po dobu dvou hodin. Xhol štěpený plasmid pKC283-L DNA se pak vysráži z reakčni směsi přidáním tří objemů 95% ethanolu a jedné desetiny objemu 3 M octaňu sodného, inkubuje se v lázni suchý led - ethanol po dobu 5 minut a odstře-; dl se. Získaná DNA peleta se promyje 70% ethanolem, vysuší se a resuspenduje se ve 2 μΐ 10X zlomového translačhlho pufru (0,5 M Tris-HCl, hodnota pH 7,2, 0,1 M síranu hořečnatého a 1 mM DTT), v 1 μΐ roztoku 2 mM v každém deoxynukleotldtrifosfátu, 15 μΐ vody, 1 μΐ (přibližně 6 jednotek podle P-L Biochemicals) Klenou, který je velkým fragmentem E. coli DNA polymerasy I a v 1 μΐ 1 mg/ml BSA. Získaná reakčni směs se inkubuje při teplotě 25 °C po dobu 30 minut, reakce se ukonči inkubaci roztoku při teplotě 70 C po dobu 5 minut.

BamHI spojovníky (5'CGGGATCCCG-3')(sekv. ID číslo 7) se kinasuje a ligatuje na Xhol štěpený, Klenowem zpracovaný plasmid pKC283-L DNA v podstatě způsobem podle přikladu 3Ά2. Po llgačnl reakci se DNA štěpí s přibližně 100 jednotkami BamHI po dobu přibližně dvou hodin při teplotě 37 °C ve vysoce slaném pufru. Po BamHI štěpení se připraví DNA pro ligaci v podstatě stejným způsobem jako podle přikladu 3A2.

Přibližně 5,9 kb BamHI restrikčnl fragment se cirkularizuje ligaci a transformuje se na E. coli K12 M0(lambda*) v podstatě stejným způsobem jako podle přikladu 3A2 a 3A3. E. coli K12 MO (lambda*)/pKC283-LB transformanty se identifikuji a pak se při51 pravi plasmid pKC283-L DNA v podstatě způsobem podle přikladu

3A1. Restrikční místo a funkční mapa plasmidu pKC283-LB jsou na t obr. 4.

Přiklad 3.A.6

Konstrukce E. coli K12 M0(lambda*)/pL32

Přibližně 10 gg plasmidu pKC283PX se štěpí restričním enzymem Sáli ve vysoce slaném pufru, zpracuje se Klenowem a ligatuje se na EcoRI spojovník (5'GAGGAATTCCTC-3')(sekv. ID číslo 8) v podstatě stejným způsobem, jako je popsáno v přikladu 3A5 s výjimkou používaného výchozího plasmidu, restrikčního enzymu a spojovníku. Po štěpeni s restrikčnim enzymem EcoRI, které vede k odštěpení přibližně 2,1 kb DNA, přibližně 4,0 kb EcoRI se restrikč- ’ ni fragment cirkularizuje ligací na výsledný plasmid pKC283PRS. Ligatované DNA se používá k transformaci E. coli K12 M0(lambda*) v podstatě stejným způsobem jako podle příkladu 3A3. E. coli K12 M0(lambda*)/pKC283-LB transformanty se identifikují a pak se připraví plasmid pKC283PRS DNA v podstatě způsobem podle příkladu 3A1. Restrikční místo a funkční mapa plasmidu pKC283PRS jsou na obr.5.

Přibližně 10 gg plasmidu pXC283PRS se štěpí ve 200 pl vysoce slaného pufru s přibližně 50 jednotkami každého z restrikčnich enzymů Pstl a Sphl. Po inkubasci reakční směsi při teplotě 37 ’C jí po dobu přibližně dvou hodin se reakční směs podrobuje elektroforeze na 0,6% agarozovém gelu s nízkou teplotou gelovánl (společnosti FMC Corporation, Marině Colloids Division, Rockland,

Maine 04841) po dobu 2 až 34 hodin při přibližně 130 V a přibližně 75 mA v Tris-acetátovém pufru.

Gel se zabarví ve zředěném roztoku ethidiumbromidu a pás ;-Diiír; konstituující pffBTfŽňě 0,85 kb Pstl-Sphl restrikční fragment,, který se zviditelni v dlouhovlnném ultrafialovém světle, se odřízne od gelu ve formě malého segmentu. Objem segmentu se stanoví podle hmotnosti a hustoty segmentu a přidá se stejný objem 10 mM Tris-HCl, hodnota pH 7,6 do zkumavky obsahující segment. Segment se pak roztaví inkubací při teplotě 72 ’C. Ziská se přibližně 1 g přibližně 0,85 kb Pstl-Sphl pas restrikčního fragmentu plasmidů pKC283- v objemu asi ÍOO μΐ. Analogicky se štěp! plasmid pKC283-LB s restrikčnimi enzymy Pstl a Sphl, a výsledný přibližně 3,0 kb restrikční fragment se izoluje elektroforézou agarosového gelu a připrav! se k ligaci.

Přibližně 0,85 kb Pstl-Sphl restrikční fragment plasmidů pKC283PRS se ligatuje na přibližně 3,0 kb Pstl-Sphl restrikční fragment plasmidů pKC283-LB v podstatě způsobem podle přikladu 3A2. Ligatovaná DNA konstituuje žádaný plasmid pL32. Restrikční místo a funkční mapa plasmidů pL32 jsou na obr. 6. Plasmid pL32 se transformuje na buňky E. coli K12 M0(lambda*) v podstatě stejným způsobem jako podle přikladu 3A3. Plasmid pL32 DNA se připravuje z E. coli K12 M0(lambda*)/pL32 transformantů v podstatě způsobem podle přikladu 3A1. Analýza plasmidů pL32 DNA dokládá, že vice než jeden EcoRI spojovník je vázán na Klenowem zpracovaná Sáli zakončeni plasmidů pKC283PX. Obsah více než jednoho EcoRI spojovníku neovlivňuje použitelnost;plasmidů pL32\ nebo derivátu, plasmidů pL32 a může se zjistit podle přítomnosti Xhol restrikčniho místa, které se.generuje, kdykoliv jsou spolu vázány dva spojovníky EcoRI. Alternativně se může konstruovat plasmid pL32 odštěpením Sall-EcoRI a ligaci podle prvního odstavce tohoto přikladu na plasmid pKC283-LB.

Přiklad 3.A.7

Konstrukce E. coli K12 M0(lambda±)/pL47

E. coli KI2 RV308/pNM789 se může získat od Northern Regional Research Laboratories, kde je uloženo pod Číslem NRRL B-18216 v lyofiiizovaném stavu. Restrikční místo a funkční mapa pNM789 jsou na obr. 7. Plasmid DNA se extrahuje z kultury v podstatě stejným způsobem, jako je popsáno v příkladu 1, přičemž však inkubační teplota je 37 °C. Suspenduje se 10 μg pNM789 ve 200 μΐ PvuII pufru (50 mM Tris-HCl, hodnota pH 7,5, 60 mM chloridu sodného a 6 mM chloridu hořečnatého). Přidá se jedna jednotka PvuII a reakčni směs se inkubuje po dobu 5 minut při teplotě 37 °C. Enzym se inaktivuje udržováním na teplotě 65 *C po dobu 10 minut. Pak se přidá 30 μΐ BamHI pufru ((200 mM Tris-HCl, hodnota pH 8,0, IM chloridu sodného a 70 mM chloridu hořečnatého), 70 gl vody a 10 jednotek BamHl a reakční směs se inkubuje po dobu jedné hodiny při teplotě 37 ’C. Pak se přidá 5 jednotek alkalické fosfatasy a inkubuje se po dobu jedné hodiny při teplotě 65 C. Oddělí se Fragmenty DNA na 1¾ agarozovém gelu a čistí se DNA jednoduchý řez fragmentu (obr. 8).

DNA spojovník s chybějícím zakončením a BamHl zakončením se syntetizuje v podstatě způsobem podle přikladu 3A4. Tento spojovník (na 118 v obr. 8) má následující strukturu:

5'-CTGTGCCTTCTAG- 3' lllllllllllll ’ -GACACGGAAGATCCTAG-5' (sekv. ID Číslo 9) (sekv. ID Čislo 10)

Shora uvedený spojovník je kinasován a ligatován do BamHI-PvuII Štěpeného plasmidu pNM789 v podstatě stejným způsobem, jako je popsáno v přikladu 3A2. Této ligační směsi se používá k transformaci buněk E. coli K12 RV3O6 a izolace plasmidu se provádí na těchto transformantech v podstatě stejným-způsobem, jako je popsáno v přikladu 3A3. Selektují ee. některé plasmidy, které obsahuji vhodný PvuII fragment (494bp) -a Xbal-BamHI fragment (628bp). Sekvence alespoň dvou z nich se stanovuje sekvenco--—.. vánim z polohy BamHl se zřetelem na polohu Smál a selektuje se jeden klon s Žádanou sekvenci. Tento plasmid jakožto meziprodukt ‘ se označuje jako plasmid 120.— Schéma~tohoto“postupu‘a restrikční ...... ⁷ místo a funkční mapa plasmidu 120 jsou na obr. 8.

K izolaci EK-BGH kódující DNA se “štěpí přibližně 10 gg plasmidu 120 ve 200 gl vysoce slaného pufru obsahujícího 50 jednotek každého z restrikčních enzymů Xbal a BamHl. Štěpné produkty se oddělí na agarozovém celu elektrofaraónu a £-0,6 kb Xbal-BamHI restrikční fragment, který zakodovává EK-BGH, se izoluje a připraví pro ligaci v podstatě stejným způsobem, jako je popsáno v příkladu 29A6.

Plasmid pL32 se také štěpí restrikčnimi enzymy Xball a BamHl a přibližně 3,9 kb restrikční fragment se izoluje a připraví pro ligaci. Přibližně 3,9 kb Xbal-BamHI restrikční fragment plas54 midu pL32 se liguje na přibližně 0,6 kb XBal-BamHI restrikční fragment plasmidu 120 v podstatě stejným způsobem, jako je popsáno v přikladu 3A2, čimž se získá plasmid pL47. Restrikční místo a funkční mapa plasmidu pL47 jsou na obr. 9. Plasmid pL47 se pak transformuje na E. coli K12 MO(lambda⁺) v podstatě stejným způsobem jako podle přikladu 3Ά3 a identifikuji se E. coli K12 MO(lambda⁺)/pL47 transformanty. Plasmid pL47 DNA se připravuje z transformantů v podstatě způsobem podle přikladu 3A1.

Příklad 3.A.8

Konstrukce E. coli K12 RV308/pPR12ARl

Plasmid pPR12 obsahuje k teplotě citlivý pL represorový gen cI857 a plasmid pBR322 a gen přispívající k odolnosti k tetracyklinu. Plasmid pPR12 je popsán v americkém patentovém spise čislo 4 436815 (uděleném 13. března 1984). Restrikční místo a funkční., mapa pPŘ12 jsou na obr. 10.

Přibližně 10 μg plasmidu pPR12 se štěpí s přibližně 50 jednotkami restrikčnlho enzymu EcoRI ve 200 μΐ vysoce slaného pufru při teplotě 37 C dvou hodin. EcoRI štěpený plasmid pPR12 DNA se vysrážl a zpracovává se činidlem Klenow v podstatě způsobem podle přikladu 3A5. Po Klenowě reakci se EcoRI štěpí, Klenowem zpracovaný plasmid pPR12 DNA se recirkularlzuje ligací způsobem v podstatě stejným, jako je popsáno v příkladu 3A2. Ligovaná DNA , která konstituuje žádaný plasmid pPR12áRl, se používá k transformaci E. coli K12 RV308 v podstatě stejným způsobem, jako je popsáno v přikladu 3A3, avšak selekce je založena na odolnosti tetracyklinu (5 pg/ml) nikoliv na odolnosti ampicilinu. E. coli K12 RV3O8 je dostupný v NRRL pod číslem NRRL B-15624. Po identifikaci transformantů E.coli K12 RV3O8/pPR12^Rl se připravuje plasmid pPR12ARl DNA z trasformantů v podstatě stejným způsobem, jako je popsáno v přikladu 3A11.

Přibližně 10 μg plasmidu pPR12úRl se štěpí přibližně 50 jednotkami restrikčniho enzymu Aval ve 200 μΐ středně slaného pufru při teplotě 37 ’C po dobu dvou hodin. Plasmid pPR12&Rl DNA Štěpený Aval se vysráži a zpracuje se činidlem Klenow v podstatě stejným způsobem, jako je popsáno v přikladu 3A5. Po Klenowě reakci se Aval štěpený, činidlem Klenow zpracovaný plasmid pPR12/$Rl DNA ligatuje na EcoRI spojovníky (5'-GAGGAATTCCTC-3') v podstatě stejným způsobem, jako je popsáno v příkladu 3A2. Po legaci spojovníku se DNA vysráži a pak se resuspenduje v přibližně 200 μΐ vysoce slaného pufru, obsahujícího přibližně 50 jednotek restrikčniho enzymu EcoRI. Získaná reakční směs se inkubuje při teploitě 37 *C po dobu přibližně dvou hodin. Po EcoRI štěpeni se reakčni smě3 vnese na agarozový gel a přibližně 5,1 kb EcoRI restrikčniho fragmentu se čistí v podstatě způsobem podle přikladu 3A6. Přibližně 5,1 kb EcoRI restrikčni fragment recirkularizuje ligacl v podstatě stejným způsobem, jako je popsáno v přikladu 3A2. Ligatovaná DNA konstituuje Žádaný plasmid pPR12ARl. Plasmid pPR12ARl se transformuje na E. coli K12 RV3O8 v podstatě stejným způsobem, jako je popsáno v přikladu 3A3, přičemž je však selekce založena na odolnosti teracyklinu a nikoliv na odolnosti ampičilinu. Po identifikaci E. coli K12 RV3O8/pPR12ARl tranformantů se připraví plasmid pPR12ARl DNA v podstatě stejným způsobem, jako je popsáno v přikladu 3A1.Restrikčni místo a funkční mapa plasmidu pPR12ARI je na obr. 11.

Příklad 3.A.9

Konstrukce E. coli K12 RV308/pL110

Přibližně 10 μ% plasmidu pPR!2ARl DNA se suspenduje v přib_HSně_^00_ul^yaoťifi_jj^rjáhe—pu&Kib—&«3-ah'<ťří-cTrh«r přTBTTžně^- 5Ό^-jednotek každého z restrtikčnich enzymů Pstl a EcoRI a Štěpící reakční směs se inkubuje při teplotě 37 “C po dobu přibližně dvou hodin. Restikčni směs se pak vnese na agarozový gel a izoluje se přibližně 2,9 kb Pstl-EcoRl restrikčniho fragmentu a připraví se pro ligaci v podstatě stejným způsobem, jako je popsáno v příkladu 3A6.

Přibližně 10 μ% plasmidu pL47 se štěpí restrikčními enzymy Pstl a BamHI ve 200 μΐ vysoce slaného pufru při teplotě 37 °C po dobu dvou hodin. Pstl a BamHI štěpená DNA se vnese na agarozový gel a izoluje se přibližně 2,7 kb Pstl-BamHI restrikčního fragmentu, který obsahuje počátek replikace a část genu, přispívajícího k odolností ampicilinu a připraví se pro ligaci v podstatě stejným způsobem, jako je popsáno v přikladu 3A6. V oddělené reakci se přibližně 10 μg plasmidu pL47 DNA štěpí restrikčními enzymy EcoRI a BamHI v 200 μΐ vysoce slaného pufru při teplotě 37 *C po dobu dvou hodin a izoluje se přibližně 1,03 kb EcoRI a BamHI restrikční fragment, který obsahuje novou transkripčni a translačni aktivační sekvenci a EK-BGH kódujici DNA a připraví se pro ligaci v podstatě stejným způsobem, jako je popsáno v přikladu 3A6 Přibližně 2 μς přibližně 1,03 kb EcoRI a BamHI restrikčního fragmentmentu se použije při konstrukci plasmidu pLHO.

Přibližně 2,7 kb Pstl-BamHI a přibližně 1,03 kb EcoRI a BamHI restrikčních fragmentmentů plasmidu pLHO se ligátuje na přibližně 2,9 kb Pstl-EcoRI restrikční fragment plasmidu pPR12ARl ke konstrukci plasmidu pLHO a ligatované DNA se použije k transformaci E. coli K12 RV308v podstatě stejném způsobu, jako je popsá-,. no v příkladu 3A2 a 3A3, přičemž se však využívá odolnosti k tetracyklínu a níkoliy^odolnosti k ampicilinu,_;;jakožto _;báze prose-, lekci transformantů.

Dvě Pstl restrikční enzymy rozpoznávací mista jsou v EK-BGH kódujici oblasti, která není vyznačena v restrikčním místu a na funkčních mapách na obr. Restrikční místo a funkční mapa plasmidu pLHO je na obr. 12.

Příklad 3.A.10

Konstrukce E. coli K12 RV308/pL110C

Přiklad 3.A.10,a

Konstrukce E. coli K12 RV308/pL110CA

Přibližně 1 μ<3 plasmidu pLHO DNA se štěpí s restrikčním enzymem Ndel ve 20 μΐ celkového objemu, obsahujícího 2 μΐ 10X vysoce slaného pufru (1,0 M chloridu sodného, 0,50 M Tris-HCl, hod57 nota pH 7,5, 0,10 M chloridu hořečnatého a 10 mři dithiothreitolu) a 3 jednotky Ndel enzymu po dobu jedné hodiny při teplotě 37 ’C ReakČni směs se extrahuje systémem fenol/chloroform a DNA se vysráží ethanolem. Ndel štěpený plasmid pLHO DNA se rozpust! v 50 μΐ IX Klenow pufru (40 mM fosforečnanu draselného, hodnota pH 7,5, 6,6 mM chloridu hořečnatého, 1,0 mM 2-merkaptoethanolu, 33 μΜ dATP, 33 μΜ dCTP, 33 μΜ dGTP a 33 μΜ TTP). Přidají se 2 μΐ (přibližně 10 jednotek, New England Biolabs) velkého fragmentu E. coli DNA polymerasy I, známé jakožto činidlo Klenow, a smísí se s DNA a získaná reakční směs se inkubuje při teplotě 16 °C po dobu jedné hodiny. Reakce se ukonči extrakci fenolem a DNA se čistí běžným způsobem. Ndel štěpená, činidlem Klenow zpracovaná DNA se pak ligatuje s T4 DNA ligasou při teplotě 4 ^aC po dobu 16 hodin. Získaná DNA se použije k běžné transformaci E. coli K12 kmen RV3O8 (NRRL B-15624). Transformanty se- -selektuji na L-agarových destičkách, obsahujících 100 pg/ml ampicilinu a plasmidy se izoluji z resistentních kolonií způsobem rychlé alkalické extrakce, kterou popsali Birnboim a Doly. Selektuje se plasmid (pLHOA podle obr. 13) prostý místa Ndel.

Přiklad 3.A.10.b

Konstrukce fágu pLHOB místně specifickou mutagěnesi

Protokol pro eliminaci BamHI místa v genu udělujícím odolnost proti tetracyklinu při místně specifické mutagenese je na pravé straně obr. 13.

Příklad 3.A.10.b(i)

Konstrukce fágu M13Tc3

Plasmid pLHO slouží jakožto zdroj genu dodávajícího odolnou b. ..pm-ti—tg-t-rag-yk-I-i-rmy—PřřbTiTíne^-50 pg plasmidů pLHO v 50 pl TE pufru se přidá do 25 pl 10X HindlII pufru a 170 μΐ vody. Přibližně 5 pl (přibližně 50 jednotek) restrikčniho enzymu HindlII se přidá do roztoku plasmidů pLl10 DNA a získaná reakční směs se inkubuje při teplotě 37 *C po dobu dvou hodin. Přibližně 13 pl 2 M Tris-HCl, hodnota pH 7,4 a 5 μΐ (přibližně 50 jednotek) restrikčniho enzymu EcoRI se přidá do Hindi! štěpeného plasmidů

-½ pLHO DNA a reakční směs se inkubuje po dobu dvou dalších hodin při teplotě 37 ’C. Reakce se ukončí extrakcí reakční směsi TE nasyceným fenolem, načež se fenol odstraní chloroformovou extrakcí. EcoRI-HindlII štěpený plasmid pLHO DNA se pak získá vysráženim a odstředěním, vnese se na 1% agarozový gel a izolouje se velký, přibližně 4,3 kb EooRI-HindlII restrikční fragment a čisti se.

Přibližně 5 gg fágu ml3mpl8 (New England Biolabs) se rozpustí v 50 μΐ TE pufru a pak se štěpi Hindlil a EcoRI shora popsaným způsobem. Hindlil - EcoRI excizni fág M13mpl8 DNA se Čisti způsobem popsaným pro pLHO s tou výjimkou, že se izoluje a čisti přibližně 7,25 bk restrikční fragment.

Přibližně 100 nanogramů přibližně 4,3 kb Hindlil - EcoRI fragmentu plasmidu pLHO se smísí s přibližně 100 nanogramy přibližně 7,25 kb Hindlil - EcoRI fragmentu fágu M13mpl8, 2 μΐ 10X ligasového pufru, 1 μΐ (přibližně 100 jednotek) T4 DNA ligasy a 14 μΐ vody. Ligační reakce se inkubuje při teplotě 15 *C po' dobu 1,5 hodin. Ligatovaná DNA konstituuje žádaný fág ml3Tc3 DNA. Reatrikční místo a funkční mapa fágu ml3Tc3 je na obr. 13.

Jednoho ml přes noc pěstované kultury E. coli K12 JM109 (E. coli K12 JMI01 od společnosti New England Biolabs se může použit místo E, coli K12 JM109) se používá k naočkováni 50 ml živné půdy L a získaná kultura se inkubuje při teplotě 37 “C za provzduěftování tak dlouho, až O.D.bbo j® 0/3 až 0,4. Buňky se resuspendují ve 25 ml 10 mM chloridu sodného, inkuhujl se na ledu po dobu 10 minut a oddělí se odstředěním. Buňky se resuspendují ve 1,15 ml 75 mM chloridu vápenatém. 200 μΐ podíl buněk se odstraní, přidá se do 10 μΐ ligatované DNA, shora připravené, a inkubuje se na ledu po dobu přibližně 40 minut. Směs buněk a DNA se inkubuje při teplotě 42 C po dobu dvou minut a různé podíly (1, 10 a 100 μΐ) se odstraní a přidají se do 3 ml horního agaru ( půda L s 0,5 % agaru se udržuje roztavená při teplotě 45 ’C), který obsahuje také 50 μΐ 2% X-Gal, 50 μΐ 100 mM IPTG a 200 μΐ E. coli K12 JM109 v logaritmické růstové fázi.Směs buněk a horního agaru se pak nanese na L-agarové destičky, obsahující 40 mg/ml X-Gal (5-brom-4chlor-3-indolyl-B-D-thiogalaktosid) a O,1 mM IPTG (isopropyl-8-Dthiogalak-tosid) a destičky se inkubuji při teplotě 37 °C přes noc.

Následující ráno se jednotlivě používá některých proti modré Čirých plaketek k naočkování 2 ml živné půdy L a získané kultury se inkubujl při teplotě 37 ’C za provzdušňování po dobu dvou hodin. Absence modré barvy naznačuje, že došlo k žádoucí inzerci DNA. Potom se kultury odstředí a přidá se 200 μΐ získaného supernatantu do 10 ml kultur (O.D.550 * ) E. coli K12JM1O9 rostoucích při teplotě 37 ’C za provzdušňování, Tyto kultury se inkubujl po dobu dalších 30 minut při teplotě 37 °C. Potom se buňky peletizují odstředěním a používá se jich pro přípravu replikačni formy rekombinantniho fágu, který obsahuji. Dvouřetězcová replikačni forma fágu DNA se izoluje z buněk za použiti obrácené verze způsobu podle přikladu 1. Transformanty, obsahující fág M13Tc3 DNA, se identifikuji restrikční enzymovou analýzou jejich fágu DNA.

Přiklad 3.A.10.B(ii)

Příprava fágu ml3Tc3 DNA s jednoduchým řetězcem

Odstředí se 1,5 ml přes noc pěstované kultury E. coli K12

JM109/ml3Tc3 a 1200 μΐ supernatantu, obsahujícího fág ml3Tc3, se použije naočkováni 25 ml kultury E. coli K12JM109 při O.D.^o přibližně 0,4 až 0,5. Kultura se inkubuje po dobu 6 hodin při teplotě 37 ’C za provzdušňování, odstředí se a ziskaný supernatant, přibližně 20 ml, se přenese do nové zkumavky. Přibližně 2 ml roztoku, obsahujícího 20 % polyethylenglykolu (PEG) 6000 a 14,6 % chloridu sodného, se přidá do supernatantu, který se pak inkubuje po dobu 20 minut.

Supernatant se odstředuje po dobu 25 minut při počtu otáček 7000/min a získaná peleta, která obsahuje fág ml3Tc3 DNA s jednoduchým řetězcem, se resuspenduje v 500 μΐ TE pufru. DNA roztok se extrahuje dvakrát TE-nasyceným fenolem a dvakrát chloroformem. •DNA—s—ýe-d-n&ďtt&hým—řetězcem se^-pak vysráží za použití octanu sodného a ethanolu a odstředí se. Získaná peleta se promyje 70% ethanolem, vysuší se a pak 3e rozpustí v 60 μΐ vody.

Přiklad 3.A.lO.b(iii)

Mutagenese

Fragment DNA s jednoduchým řetězcem, používaný v mutagene60 si se syntetizuje na automatickém systetizeru DNA. Fragment má sekvenci 5'-CCCGTCCTGTGGATACTCTACGCCGA-3' (sekv. ID číslo 11) a je homologický k oblasti obklupujici BamHI polohu (5 -GGATCC-3') v genu přispívajícím k odolnosti proti tetracyklinu plasmidu pBR322 s tou výjimkou, že A zbytek druhý od zakončení 5^r (nebo třetí od zakončení 3') je C v plasmidu pBR322. Tato obměna nemění aminokyselinové složeni bílkoviny přispívající k odolnosti proti tetracyklinu, eliminuje však místo BamHI.

Přibližně 10 pikomol mutagenního primeru a M13 univerzální primer (Bethesda Research Laboratories (BRL)), P.O. Box 6009, Gaithersburg, MD 20760) se individuálně zpracovávají 10 jednotkami (BRL) T4 polynukleotidkinasy ve 2o μΐ IX kinasového pufru (60 mM Tris-HCl, hodnota pH 7,8, 15 mM 2-merkaptoethanolu, 10 mM chloridu hořečnatého a 0,41 μΜ ATP) po dobu 30 minut při teplotě 37 *C. Kinasou zpracovaných DNA se používá v dále popsaném procesu mutagenese.

Teplotní hybridizačnl reakce se provádí vzájemným míšením 300 nanogramů (1,2 μΐ) fágu ml3Tc3 s jednoduchým řetězcem, 1 pikomol (2 μΐ) univerzálního primeru, 1 pikomol (2 μΐ) mutagenního primeru, 2 μΐ 10X pufru pro teplotní hydridizaci (100 mM Tris-HCl, hodnota pH 7,5, 1 mM EDTA a 500 mM chloridu sodného) a 12,8 μΐ vody. Reakční-směs se-inkubuje přivteplůtě 80 ,’C podobu dvou minut, při . teplotě 50 *C po dobu 5 minut a pak se nechá ochladit na teplotu místnosti.

Extenzní reakce se provádí přidáním 5 μΐ 10X extenzního pufru (500 mM Tris-HCl, hodnota pH 8,0, 1 mM EDTA a 120 mM chloridu hořečnatého), 5 μΐ 2 mM dATP, 1 μΐ roztoku 6 mM v každém dGTP, TTP a dCTP; 1 μΐ přibližně 2 jednotky, Pharmacia P-L Biochemicals, 800 Centennial Avenue, Piscataway, NJ 08854) enzymu Klenow, 1 μΐ (100 jednotek) T4 DNA ligasy a 17 μΐ vody do směsi tepelně hybridované DNA. Extenzní reakční směs se inkubuje při teplotě místnosti po dobu jedné’ hodiny, pak při teplotě 37 ’C po dobu 2,5 hodin a pak přes noc při teplotě 4 *C.

Reakce se ukonči dvěma extrakcemi TE-nasyceným fenolem a následnými dvěma extrakcemi chloroformem. DNA se vysráží ethanolem a octanem sodným. DNA se oděli odstředěním a resuspenduje

..... ř '· >

se v 50 μΐ vody a 6 μΐ 10X SI pufru se pak přidá do roztoku DNA.

Roztok DNA se rozdělí do tři zkumavek. Přidá se přibližně

200 jednotek (Miles Laboratories) SI nukleasy do dvou zkumavek. Jedna SI reakční směs se inkubuje při teplotě místnosti po dobu 5 minut, druhá po dobu 10 minut. Reakce se ukonči extrakcí reakční směsi dvakrát TE-nasyceným fenolem. Po fenolových extrakcích následují dvě extrakce chloroformem. Pak se DNA vysráži z reakční směsi octanem sodným a ethanolem. Nezpracovaný vzorek DNA slouží jako negativní kontrola. SI zpracované vzorky se udržují od sebe oddlěleně po dobu zbylé procedury, poskytují však podobné výsledky.

DNA pelety se resuspenduji ve 20 μί vody a 10 μΐ získaného roztoku se použije k transformaci E. coli K12 JM109 (může se váak rovněž použít E. coli K12 JM101) v souhlase s postupem používaným při konstrukci fágu ml3Tc3, přičemž se váak na destičky nepřidává ani IPTZG ani X-Gal.

Replikativní forma DNA s dvojím řetězcem z přibližně 48 plaketek se Izoluje shora popsaným způsobem a zkoumá se na přítomnost BamHI restrikčního místa/ Izoláty bez BamHI místa se dále třidi při přípravě DNA s jednoduchým řetězcem, jak shora popsáno. DNA s jednoduchým řetězcem se sekvencuje za použití di-deoxysekvenčniho způsobu (J.H. Smith, 1980, Methods in“ Enzymology 65'f str. 560 až 580). Žádaný izolát se označuje jako pLHOB (obr. 13).

Přiklad 3.A.10.C

Konstrukce plasmidu pLHOC

Přibližně 50 pg replikační formy fágu pLHOB DNA se átěpi ve 250 μί IX Nhel pufru (50 mM chloridu sodného, 6 mM Tris-HCl, ho-dnoÁa^-pH—^:7-rS-r^- 6r-mii-uirroriátt^—fiófěčňafiřho a 6 mM 2-mekaptoethanolu) obsahujícího přibližně 50 jednotek Nhel restrikčního enzymu při teplotě 37 ’C po dobu dvou hodin. Pak se přidá 5 μί 5M chloridu sodného do Nhel štěpeného fágu pLHOB DNA, načež se přidá 5 μί (přibližně 50 jednotek) Sáli restrikčního enzymu. Štěpení se provádí po dobu dvou hodin při teplotě 37 ’C. Žádaný přibližně

422 bp Nhel - Sáli fragment, obsahující mutátované oblast genu způsobujícího odolnost proti tetracyklinu, se pak izoluje z akrylamidového gelu o sobě známým způsobem v oboru.

Plasmid pLHOA DNA se štěpí Nhel a Sáli za identických podmínek s tou výjimkou, že plasmid pLHOA se nahrazuje pro fág pLHOB. Přibližně 6,1 kb Nhel - SA1I restrikční fragment plasmidu pLHOA se čisti od agarozy.

Žádaný plasmid pLIIOC se konstruuje ligací spolu se ÍOO nanogramy každého z Nhel - Sáli fragmentů pLHOA (přibližně 6,1 kb) a plllOB (přibližně 422 bp) za použití o sobě známých způsobů, Restrikční místo a funkční mapa plasmidu pLHOC je na obr. 13. Žádaný plasmid pLHOC dodává odolnost proti tetracyklinu 10 pg/ml tetracyklinu v E. coli avšak BamHI místo v genu, dodávajícím odolnost proti tetracyklinu, chybí.

Přiklad 3.A.11

Konstrukce plasmidu pCZRlll

Plasmid pLHOC obsahuje jednoduché Clal restrikční místo, které se odstraní v průběhu následujících reakci. Přibližně 1 pg plasmidu pLIIOC se štěpí s Clal v podstatě způsobem podle příkladu 3A2 s tou výjimkou, že se použije restrikčního enzymu Clal a 10X pufru (500 mM chloridu sodného, 100 mM Tris-HCl, hodnota pH 7,9 a 100 mM chloridu hořečnatého), Clal štěpená DNA se pak zpracovává činidlem Klenow v podstatě způsobem, který je popsán v příkladu 3A5 jedině s tou výjimkou, Že se přidá jedině dCTP místo všech čtyř dNTP.

DNA se pak vysráží a resuspenduje se v 50 pl Mung Beán nukleasového pufru (50 mM octanu sodného, hodnota pH 5,0, 30 mM ' chloridu sodného a 1 mM síranu zinečnatého). Přidá se jedna jednotka Mung Beán nukleasy (obchodně dostupné od New England Biolabs) a reakční směs se inkubuje při teplotě 30 *C po dobu 30 minut. Zkumavka se pak umísti do ledu a přidá se chlorid sodný do 0,2 M a směs se pak extrahuje systémem fenol/chloroform, vysráží se ethanolem a resuspenduje se v 10 mM Tris-HCl (hodnota pH 0,0). DNA se pak spontánně ligatuje a transformuje do buněk E. coli v podstatě způsobem podle přikladu 3A3 ¹ a 3A4. Výsledný plasmid se označuje jako plasmid pCZRlll.

Přiklad 3.A.12

Konstrukce plasmidů pCZR126S

Přibližně 26 pg plasmidů pCZRlll se štěpí působením Xbal následujícím způsobem. 1OX Xbal pufr, sestává z 600 mM Tris-HCl, 100 mM chloridu hořečnatého, IM chloridu sodného a 10 mM 2-merkaptoěthanolu, hodnota pH 7,5 (a má teplotu 37 ’C). 50 μΐ 10X Xbal pufru, 15 μΐ Xbal (10 J(jj1 ) a 185 μΐ vody se přidá do 250 μΐ vody obsahující přibližně 25 μg plasmidů pCZRlll. Štěpení se provádí při teplotě 37 ’C po dobu jedné hodiny..Xbal štěpený pCZRlll se pak extrahuje fenolem, přidá se 1/10 objemu 3M octaňu sodného,a 3 objemy ethanolu. Směs se inkubuje v lé2ni suchého ledu aethanolu po dobu 5 minut a pak se odstředí. Vysrážená DNA se resuspenduje v 50 μΐ vody.

Xbal štěpený plasmid pCZRlll se štěpí BamHI následujícím způsobem: 0,2 μΐ BamHI (10 J/μΙ), 10 μ 1 BamHI pufru (.100 mM Tris-HCl, 50 mM chloridu hořečnatého, 1 M chloridu sodného a 10 mM 2-merkapotoethanolu, hodnota pH 8,0, o teplotě 37 *C a 90 μΐ vody se přidá do 50 μΐ Xbal štěpeného pLHO, získaného, jak shora uvedeno. Štěpení se provádí po dobu 5 minut při teplotě 37 °c. Štěpená pCZRlll se extrahuje do fenolu a přidá se 1/10 objemu octaňu sodného a pak 3 objemy ethanolu. vysrážená DNA se resuspenduje v 50 μΐ 10 mM Tris, i mM EDTA, hodnota pH 8,0.

Xbal a BamHI štěpený pCZRlll se pak vnese na agarosový gel a izoluje se DNA pás při přibližně 5,8 kb. Plasmid pCZR126S se produkuje ligaci přibližně 5,8 kb fragmentu pCZRlll na Xbal na Ndel spojovník a syntetický gen kódující EKm hovězí růstový -aůrmffír; kter~ý^—obsahuje Ndel místo na zakončení 5'a BamHI místo na zakončení 3'.Xbal až Ndel sekvence se produkuje za použiti standardní oligonukleotidové sekvenční metodiky a sesává z následujících sekvenci. (pozitivní řetězec: sekv. ID číslo 12, negativní řetězec = sekv. ID óislo 13).

5’ CTAGAGGGTATTAATAATGTATATTGAlTrTAATAAGGAGGAATAATCA 3’ ||| II li! IIII II II 1 II 11 Ul II111II I i 1111 I 11111 U TCCCATAATTATTACATATAACTAAAATrATTCCTCCTTAITAGTAT 5'

Uvedená sekvence se konstruuje chemickou syntézou obou řetězců a míšením k umožnění hydridi.zace. Gen, zakodujíci EK bGH se konstruuje z 16 chemnicky syntetizovaných kusů DNA s jednoduchým řetězcem o délce 71 až 83 nukleotidů, které zahrnuji dohromady oba komplementární řetězce celého genu. Jeho syntéza se provádí za použiti zařízení Applied Biosystems (ABS) a sestává z následující sekvence (sekv. ID číslo 2 a 3).

' TATGITCCCATTGGATGATGATGATAAGITCCCAGCCATGTCCTT li II lili Hltil III lllllllll liliím IIIHIIII ACAAGGGTAACCTACTACTACTATTCAAGGGTCGGTACAGGAA

GTCOGGCCTGTITGCCAACGCTGTGCTCCGGGCTCAGCACCTGCATCAGCTGGCTGCTGA I 1.11 11 I I I I I I I III 111 I I 111I I I 11 11 11 1111 f I 111II11 1111 I I 11111 111 CAGGCCGGACAAACGGTTGCGACACGAGGCCCGAGTCGTGGACGTAGTCGACCGACGACT

CACCTTCAAAGAGTTTGAGCGCACCTACATCCCGGňGGGACAGAGATACrCCATCCAGAA I I I I I I i 11 I I Π I I I I 111 I I 11 11 I 11 I I i I I 111 11 11 11 I 11 111 11 111 I 11 111 GTGGAAGITTCTCAAACTCGCGTGGATGTTkGGGCCTCCCTGTCTCTATGAGGTAGGTCTT ‘ · - ^-7

CACCGAGGTTGCCTTCTGCTrCTCTGAAACCATCCCGGCCCCCACGGGCAAGAATGAGGC 111111111 1111111111111111111111111111111II111111111111111111 GTCGGTCCAAO^GAAGACGAAGAGACTTIGGTAGGGCCGGGGGTGCCCGITCITACTCCG CCAGCAGAAATCAGACTTGGAGCIGCTTCGCATCIGACTGCTCCTCATCCAGT(3GTGGCT ^? iii ni ni ii iii mi iii iii it iii mi im ii ii mi lim iíi mu ii

GGTCGTCTTTAGTCTGAACCTCGACGAAGCGTAGAGTGACGAGGAGTAGGTCAGCACCGA

TGGGCCCCTGCAGTTCCTCAGCAGAGTCTTCACCAACZAGCTTGGTGITrGGCACCTCGGA mu mi mu um nu mním m mi um umimiiimi

ACCCGGGGACGTCAAGGAGTCGTCTCAGAAGTGGTTGTCGAACGACAAACCGTGGAGCCT

CCGTGTCTATGAGAAGCTGAAGGACCTGGAGGAAGGCATCCTGGCCCTGATGCGGGAGCT

III 1 lil I I lil lil I iii i I lil lil m lil m lil lil lil lil lil lil m lil

GGCACAGATACTCTrCGACTTCCTGGACCTCCTTCCGTAGGACCGGGACTACGCCCTCGA ..........

GGAAGATGGCACCCCCCGGGCTGGGCAGATCCTCAAGCAGACCTATGACAAATTTGACAC ......

m umím mim iíi umím imiiiiimimmmimm

CCITCTACCGTGGGGGGCCCGACCCGTCTAGGAGTrCGTCTGGATACTGTrTAAACTGTC aaacatgcgcagtgacgacgcgctgctcaagaactacggtctgctctcctgcttccggaa i 111 m m m ni m 11 m u-ι i mu u u u m i m m u m mm

TrrGTACGCGTCACTGCTGCGCGACGAGTrCTTGATGCCAGACGAGAGGACGAAGGCCIT

GGACCTGCATAAGACGGAGACGTACCTGAGGGTCATGAAGTGCCGCCGCTTCGGGGAGGC i i i m i i iii iii i i ul u m iii ul κι u m ui ii ui m ii iii ui ui

CCTGGACGTATTCTGCCTCTGCATGGACTCCCAGTACTTCACGGCGGCGM GCCCCTCCG

CAGCTGTGCCTTCTAG 3' minu mm ii

GTCGACACGGAAGATCCTAG 5'

Konstrukce plasmidu pCZR126S se provádí ligací následujících složek přibližně 0,28 pg 5,8 fragmentu, získaného z plasmidu _Λ pLHO po kompletním štěpeni s Xbal a parciálním štěpení s BamHI v celkovém objemu 2 μΐ, přibližně 0,18 pg syntetický gen kódujícího derivátu hovězího růstového faktoru, který má 5' zakončeni odpovídající Xbal místu a 3’ zakončeni odpovídající BamHI místu v celkovém objemu 2,5 μΐ, 8,75 pikomol chemicky syntetizovaného Xbal na Ndel spojovník v 1 μΐ. Píasmidové složky se vnesou do 6 μΐ 5x ligačního pufru: 250 mM Tris-HCl, 50 mM chloridu hořečnatého, 5 mM ATP, 5 mM DTT, 25% (objem/objem) polyethylenglykolu 8000, hodnota pH 7,6, 2 μΐ ligasy a 16,5 μΐ vody. Ligačni směs se inkubuje přes noc při teplotě 16 “C. Cirkularizovaný plasmid pCZR126S se pak používá ke transformaci buněk E. coli RV308 v podstatě stejným způsobem, jako je popsáno v přikladu 3A3. resfcV. · ^J · trikčni místo a funkční mapa plasmidu pCZR126S je na obr. 14. ...

Příklad 4

Konstrukce plasmidu pRB182

Přibližně 20 plasmidu pRB181, připraveného způsobem pod- « le přikladu 2, se suspenduje ve 20 μΐ 10X Ndel pufru, 5 μΐ Ndel restrikčnlho enzymu (Boehringer-Mannheim, 40 jednotekjv·~·^175'*μΙ ·.:

vody, mírně se míchá a inkubuje se při teplotě 37 °C po dobu jedné hodiny. Pak se do reakční směsi přidá 4 μΐ BamHI restrikčnlho enzymu (Boehringer-Mannheim, 40 jednotek) a inkubuje se při teplotě 37 “C po dobu dalších dvou hodin. DNA se vysrážl třemi objemy ethanolu a 0,3M octanu sodného a provede se elektroforeza na 1,2% agarozovém gelu o nízké teplotě tání. Menší (přibližně 265 bp) Ndel/BamHI restrikční fragment, zakodujici ACB lidský proin_-z-ulinc-v-ý—gor*T—se—aářx-z-ae—ód— géi-u—ar-DiíA—se^-zřská^-Věúěhlm sloupcem

Elutip-d způsobem, popsaným v přikladu 2. Po vysráženi a usušeni se DNA ukládá v 25 μΐ 10 mM Tris-HCl, o hodnotě pH 8,0.

Přibližně 15 μg plasmidu pCZR126S (jehož konstrukce je shora uvedena v přikladu 3) se suspenduje ve 20 μΐ 10X Ndel pufru, 5 μΐ Ndel restrikčnlho enzymu (40 jednotek) a 175 μΐ vody, mírně se míchá a inkubuje se při teplotě 37 “C po dobu dvou hodin. Po in66 kubaci se DNA vysráží třemi objemy ethanolu, jak shora uvedeno, vysuší se a resuspenduje se ve 20 μΐ 10X BamHI pufru, 2,5 μΐ BamHI restrikčního enzymu (25 jednotek) a 17Θ μΐ vody. Mírně se míchá a pak se reakční směs inkubuje při teplotě 37 °C po dobu dvou hodin. DNA se opět vysráží třemi objemy ethanolu a podrobí se elektroforeze na 1% agarozovém gelu o nízké teplotě táni. Větší fragment, odpovídající vektoru DNA se odřízne od thototo gelu a DNA se získá na slupci Elutip-d způsobem, popsaným v přikladu

2. Po vysráženi a usušení se vektor DNA ukládá při teplotě 4 ’C v 35 μΐ 10 mM Tris-HCl o hodnotě pH 8,0.

Přibližně 2,5 μΐ vektoru DNA se smíchá s 12 μΐ čištěného ACB-proinzulínového genového fragmentu, jak shora uvedeno, 4 μΐ 10 mN ATP, 0,5 μΐ ÍM dithiothreitolu, 5 μΐ 10X ligasového pufru (500 mM TrÍ3-HCl, hodnota pH 7,6, 100 mM chloridu hořečnatého), μΐ vody a 0,5 μΐ T4 ΕΝΑ ligasy (Pharmacia, One., 800 Centennial Avenue, Piscataway, N.J. 08854, 3,5 jednotek). Reakčni směs se inkubuje při teplotě 4 ’C po dobu 16 hodin. Ligatovaná směs se zředí 50 μΐ 10 mM Tris-HCl (hodnota pH 7,6) a 3 μΐ ÍM chloridu, sodného a následně se transformuje do E. coli K12 RV3O8 způsobem podle shora uvedeného přikladu 3A3. Buftky se nanesou ňa agarové destičky doplněné 5 μί/πιΐ tetracyklinu a inkubuji se přes noc při , teplotě 32 ‘C. - - . <

Plasmidy z 3 mL kultur se izolují z kolonií odolných tetracyklinu způsobem rychlé alkalické extrakce, popsané v Moleculař Cloning: A Laboratory Manual (1982), vydal Maniatis T., Fritsch E.F. a Sambrook J., Cold Spring Harbor Publications, New York,str. 368 až 369. Přítomnost správného lidského ACB-proinzullnového genového fragmentu se stanovuje minitřídicí operací, kterou popsal Birnboim H.C., Edoly J. (1979) Nucleic Acids Res. 1, str. 1513 až 1523, za použití polakrylamidové gelové elektroforesy k analýze Xbal/BamHI štěpeného fragmentu. Tyto plasmidové inzerty se správným rozměrem (přibližně 314 bp) se selektují zesílením a čištěním. Expresní plasmid obsahující lidský ACB proinzulinový gen se označuje jako pRB182, Restrikční místo a funkční mapa plasmidu pRB182 je na obr. 20.

Příklad 5

Fementace

Provozní výroba buněk pro extrakci a Čiětěni rekombinantniho ACB-proinzulinu se provádí za použiti BioFlo stolní fermentační nádoby (obchodně dostupné u společnosti New Brunswick Scientific Co., Inc. P.O.Box 986, 44 Talraadge Road, Edison, NJ 08817). Naočkovává se 5 litrů 2X TY půdy, obsahující 5 pg/ml tetracyklinu (získáno u společnosti Sigma Chemical Co.) plus 1,0 ml protipěniciho prostředku SAG 5693 (obchodně dostupného u společnosti Union Carbide, Specialty Chemical Division, Danbury, CT 06817-0001) za použiti 100 ml bakteriální kultury E. coli K12 RV 308 buněk, obsahující plasmid pRB182 a nechá se růst přes noc při teplotě 30 ’C. Buňky se nechají růst při teplotě 32 °C až do konce exponen- s ciálni růstové fáze. Pak se přidají glukóza a aminokyseliny do λ koncentrace 0,2% a 0,1% a teplota se zvýSi na 42 ’C k navozeni ϊ syntézy bílkoviny. Buňky se 2ískaji z růstového prostředí dvě hodiny po navozeni odstředovánim při 500 g po dobu 10 minut při teplotě 4 C. Supernatant se vyhodí a peleta se promyje jednou # ledově chladným TE pufrem (10 mM tris-HCl, hodnota pH 8,0, l.mM EDTA).

Exprese a akumulace ACB-PI se etanoví zviditelněním celkové buněčné bílkoviny s následným oddělením do 10 až 20% polyakrylamidového gelu způsobem, který popsal Laemmli, U.K. (1970) Nátuře (London), 227, str. 680 až 685. Provede se lyže peletizovaných buněk přidáním modifikovaného vzorku pufru (0,125 M Tris-HCl, hodnota pH 6,8, 2% SDS, 30% glycerol, 1M 2-merkaptoethano1 5M močovina) a vaři se po dobu 5 minut. Pásy se zjiáťuji zabarvením modři Coomassie Blue kvantitativním sejmutím.

-Spsc-í-fic-ká—í-de-Frt-i-f-i-kač-w—ACB—přáTřraruri-rnu—se^-stanoví^-analys zou Western Blot v podstatě jak popisuje Johnson D.A. a kol.

(1984) Gene Anal. Techn, svazek 1, str. 3 až 8 za použití kozího anti-HPI, Činmž se zjisti C-peptid, načež se přidá biotinylovaná druhá antilátka ( osli antikozí IgG) a zviditelni se s bilkovinovou detekční soupravou Vectastain (obchodně dostupná u společnosti Vector Laboratories, Inc., 30 Ingold Rd., Burlingam, CA a

94010) v podstatě podle návodu prodejce.

Přiklad 6

Čištění a charakterizace rDNA ACB-proinzulinu

Suspenduje se 43,5 g buněk E.coli (mokré hmotnost) v 400 ml mM Tris-HCl, hodnota pH 7,6, obsahujícím 10 mM EDTA, 1 mM PMSF, 10% sacharozu a 100 /jtg/ml lysozymu. Směs se intenzivně míchá při teplotě místnosti po dobu 1,5 hodin (přibližně 25 °C), chladí se na ledu po dobu 30 minut a buňky se rozruší působením zvuku. Granule se oddělí odstředováním při 200 g při teplotě 4 °C po dobu jedné hodiny. Granule se potom promyji 20 mM Tris-HCl, IM chloridu sodného, hodnota pH 7,6. Granule se rozpustí za mícháni ve 200 ml 20 mM Tris-HCl, 8 M guanidin-HCl, hodnota pH 8,8. Pak se přidá 7 g siřičitanu sodného a 5 g NajSiOe a roztok se michá po dobu tří hodin při teplotě místnosti. Po odstředěni se supernatant dialyzuje za použiti 1000 MWCO dialyzačniho vaku (obchodně dostupný u společnosti Spectrum Medical Industries, ' lne. Los Angeles, CA 90060) proti třem změnám 2 litrů 10 mM octanu amonného, hodnota pH 7,4. Vzniklá sraženina se oddělí odstředováním při 2200 g při teplotě 40 C po dobu jedné hodiny. Supernatant se okyselí na hodnotu pH 3,6 6 N kyselinou chlorovodíkovou a vytvořená sraženina 'šé shromáždf a přidá se' do” sraženiny z dialyzátu.

Přiklad 7

Čištění ACB-proinzulin-S-sulfonátu

Peleta, získaná způsobem podle přikladu 6, obsahující

ACB-proin2ulin-S-sulfonát, se rozpustí ve 20 mM Tris-HCl, 7,5 M močoviny, hodnota pH 7,6 a vnese se na sloupec Mono Q HR 10/10 (obchodně dostupný u společnosti Pharmacia LKB Biotechnology, 800 Centennial Ave., Piscataway, NJ 08854). Sloupec se eluuje rychlosti 0,5/min za použití 760 minutového gradientu 0,05 až 0,2 M chloridu sodného' obsahujícího 20 mM Tris-HCl, hodnota pH

7,6, 7,5 M močoviny. Frakce se analyzuji RP-HPLC za použití gradientu systému 30 až 42 % CH3CN do O,1 M monohydrogenfosforeč69 nanu amonného, hodnota pH 7,0, 1,5 ml/min na 0,46 x 25 cm sloupci Zorbax C8 (obchodně dostupný u společnosti DuPont, tfilmington, DE 19898), přičemž se udržuje teplota 45 'C. RP-HPLC separace se provádí za použiti Rainin HP reverzní fázové HPLC aparatury (obchodně dostupná u společnosti Rainin Instruments, Woburn, MA 01801). Na základě analyzy obsahu frakcí RP-HPLC se shromáždí dva fondy odpovídající ACB-proinzulin-S-sulfonátu z Monoo Q sloupce a odsolí se na sloupci Zorbax C8 použitím RP-HPLC za použití gradientu 10 až 35 % CHaCN do O,1 M hydrogenuhličitanu amonného, hodnota pH 8,0, zmrazí se v kapalném dusíku a lyofilizuje se.

Přiklad 8

Konverze ACB-proinzulinsulfonátu na ACB-proinzulin

ACB-proinzulinsulfonátový lyofilizát, připravený podle příkladu 7, se rozpustí v 50 mM glycinu,~hodnota pH 10,5, při teplotě 4 °C na koncentraci přibližně 0,2 mg/ml. Do tohoto roztoku se přidají dva ekvivalenty cystein-HCl. Nechá se stát po dobu tři dnů, přičemž se ACB-proinzulin vytvoří v přibližně 75% výtěžku.

Bilkovinový roztok se pak okyselí kyselinou octovou na hod- - notu pH 2,0, vnese se na sloupec RP-HPLC 2,2 x 25 cm Vydac C18 (obchodně dostupný u společnosti The·SeparationsGroup,¹ Hesperla,“'

CA 92345) a eluuje se isoktratickým pufrem 0,1% trifluoroctová kyselina v systému HjO:CH3CH (72 : 28). za 1,5 ml/min. Frakce, obsahující žádaný materiál, se shromáždí RP-HPLC do fondu, zmrazí se v kapalném dusíku a lyofílizují se.

Přiklad 9 —-S-ta-n s-ven-l—ρ á-£-ů- ai-š-arl-fřátckýahřa z e b^-v^—ACB-pr o i nz u ii nu

250 mg bílkoviny se rozpustí v 250 ml 0,05 hydrogenuhličítánu amonného, hodnota pH 9,0. Přidá se 25 μΐ 0.1 mg/ml roztoku vepřového trypsinu (obchodně dostupný u společnosti Sigma Chemical Co., P.O. Box 14508, St. Louis, MO 63178) ve vodě a inkubuje se za štěpení po dobu dvou hodin při teplotě 25 ’C. Toto trypsinové štěpeni, které uvolňuje N-zakončeni řetězce B, se ukonči přidáním 280 μΐ 0,1 N kyseliny chlorovodíkové. Pak se přidá 25 μΐ 0,1 mg/ml roztoku pepsinu (obchodně dostupného od společnosti Boehringer-Mannheim Biochemical, P.O.Box 50816, Indianopolis, Indiána 46250) v 0,01 N kyselině chlorovodíkové. Štěpici směs se inkubuje po dobu 22 hodin při teplotě 25 “C, přičemž se štěpeni ukonči přidáním 25 μΐ 0,1 mg/ml roztoku pepstatinu (obchodně dostupný u společnosti Sigma Chemical Co.) v 10% kyselině octové a 900 μΐ vody. Reakční směs se pak vnese na 4,6 x 450 mm sloupec Zorbax C8, udržovaný na teplotě 45 °C, který je vyvážený 0,1 M fosforečnanem sodným, hodnota pH 2,1, 1 ml/min a peptidy se eluuji lineárním gradientem 15 až 30 % methylkyanidu ve výchozím pufru. Větší elučni pik při 25 % methylkyanidu se shromáždi, zředí se vodou, odsoli se na Sep-Pak patroně (obchodně dostupná u společnosti Waters) a lyofilizuje.se. Shromážděný materiál se pak analyzuje aminokyselinovou analýzou na analyzátoru Model 6300 (obchodně dostupný u společnosti Beckman Instruments, Fullerton, CA 92634).

Uspořádáni disulfidických vazeb ACB-proinzulinů se potvrzuje trypsin/pepsinovým štěpením molekul a následnou HPLC analýzou, jak popisuje Toren P a kol., (1986) Anal Biochem., ročník 169, str. 287 až 299.

Přiklad 10 ,

Transformace ACB-proinzulinu na lidský inzulin

Zpracovává se 1,03 mg ACB-proinzulinu 1 μg trypsinu (společnosti Sigma Chemical CO) a 10 pg karboxypeptidasy B (Lilly, vyčištěné z vepřového pankreas) ve 2 ml hydrogenuhličitanu amonného, hodnota pH 8,8, po dobu 23 hodin při teplotě 23 °C. Reakce se pak ukonči přidáním 2,0 ml 0,1 N kyseliny chlorovodíkové a vzorek se vnese ve formě dvou 2 ml vstřiků na sloupec Vydac C18 (obchodně dostupný u společnosti The Sěparátions Group, Hesperia, CA 92345), vyvážený 0,1% vodnou trifluoroctovou kyselinou při udržováni teploty 45 ’C a eluuje se gradientovým programem po dobu 5 minut 17 až 26,25%, po dobu 5 minut 26,25 až 31,25% a po dobu 35 minut 31,25 až 42,5% methylkyamidem do 0,1% vodné kyseliny trifluoroctové rychlostí 1 ml/min. Eluované peptidy se shromáždi a analyzují se FAB-MS, aminokyselinovou analýzou a v případě inzulín obsahujícího píku biologickou analýzou a mapováním peptidu.

Příklad 11

Biologická analýza ACB-proinzulinu

Inzulínová a IGF-I zkouška receptorového vázání za použití lidské placentální membrány se provádí v podstatě způsobem, který popsal Grappuso P.A. a kol. (1988) J. Clin. Endocrinol. Metab., ročník 67, str. 194 až 197 s tou výjimkou, že se inkubace provádí při teplotě 4 °C po dobu 18 hodin a membrány se shromáždí na jednotce Skatron Cell Harvester (obchodně dostupné u společnosti Skatron, lne., Sterling, VA). Provádí se zkouška transportu glukózy v krysích adipocytech v podstatě způsobem, který popsal Kashwagi M. a kol., (1983), J. Clin. Invest., ročník 72, str. 1246 až 1254.

In vivo účinnost ACB-proinzulinu se stanoví na vyhladovělých krysách. Sameček hubené krysy Sprague-Dawley (dostupný u společnosti Charles River Laboratories, Wilmington, MA 01887) o tělesné hmotnosti 190 až 210 g se nechá bez potravy 16 hodin. Náhodně se voli 10 zvířat a rozdělí se do dvou skupin po pěti krysách. Kontrolní skupině se subkutánně vstříkne fysiologický roztok (0,1 ml na 100 g tělesné hmotnosti) zytimco experimentální skupině se vstříkne tentýž slaný roztok obsahující zkoušený peptid. Odebere se krev (0,1 ml) z ocasu každé krysy pro stanoveni obsahu glukózy (Sigma Diagnostice, glucose [Trinder], adress) před podáním peptidu a potom 30 minut, 1, 2, 3 a 4 hodiny po podáni peptidu. --'Lypcč-ts^s-s^s-tř-e-dn-í—pr-s-c-s-n-tcvá.—změna—s-d—c-h-v-i-l-5—íiuTa—pi-dš—Hebó minus S.E.M. krevní glukózy u kontrolní skupiny a ošetřné skupiny krys a konečné výsledky se vyjádři podle změn u experimentální a kontrolní skupiny. Stanovuje se působení 5 až 7 různých dávek.

Sekvenční přehled (1) Obecná informace:

(i) Autoři: Bel agaje, Rama M

DiMarchi, Richard D.

Heath, William F Long, Harlan B (ii) Název vynálezu: Polypeptid, způsob jeho přípravy, farmaceutický prostředek, který ho obsahuje a jeho použiti jakožto meziproduktu pro přípravu inzulínu (iii) Počet sekvencí: 13 (iv) Adresa:

(A) Název: Eli Lilly and Company (B) ulice: Lilly Corporate Center (C) město: Indianopolis · -----(D) stát: Indiana (E) zem: USA (F) ZIP: 462S5 (v) Údaje pro počítač '*· --H . · . ' (A) typ media:floppy disk (B) počítač: IBM PČ kompatibilní —..... · , ⁷ » ¹ (C) operační systém: PC-DOS/MS-DOS (D) Software: Patentln release # 1,0, verse #1,25 (vi) Údaje pro přihlášku vynálezu . . . ..

(A) čislo přihlášky vynálezu (B) datum podáni (C) zatřídění (viii) Údaje zástupce (A) jméno: Conrad William A (B) registrační číslo. 32089 (C) čislo : X-78866 (ix) telekominukační spojeni (A( telefon: 317-276-6013 (2) Informace pro sekv. ID číslo: 1 (i) sekvenční charakteristiky (A) délka: 86 aminokyselin (B) typ: aminokyselina (C) řetězce: jednoduchý (D) topologie: lineární (ii) Typ molekuly: bílkovina (xi) sekvenční deskripce: sekv. ID číslo 1

Gly 1

Ile

Val

Glu

Gin 5

Cys Cys

Thr

Ser

Ile 10

Cys Ser

Leu

Tyr

Gin 15

Leu

Glu

Asn

Tyr

Cys 20

Asn

Arg Arg

Glu

Ala 25

Glu

Asp Leu

Gin

val 30

Gly

Gin

Val

Glu

Leu 35

Gly Gly Gly

Pro

Gly 40

Ala

Gly

Ser Leu

Gin 45

Pro

Leu

Ala

Leu

Glu 50

Gly

Ser

Leu

Gin

Lys 55

Arg

Phe

Val

Asn Gin 60

His

Leu

Cys

Gly

Ser 65

His

Leu

Val

Glu

Ala 70

Leu

Tyr

Leu

Val

Cys Gly 75

Glu

Arg Gly

Phe 80

Phe

Tyr

Thr

Pro

Lys 85

Thr

-

(2) Informace pro sekv. ID číslo: 2 (i) sekvenční charakteristiky (A) délka: 278 párů bázi, (B) typ: nukleová kyselina (C) řetězce: jednoduchý (D) topologie: lineární=.-..

(ii) Typ molekuly: DNA (genomická) (xi) sekvenční deskripce: sekv. ID číslo 2

AGCTTCATAT GGGCATTGTG GAACAATGCT GTACCAGCAT CTGCTCCCTG TACCAGCTGG 60

AGAACTACTG CAACCGCCGT GAGGCAGAGG ACCTGCAGGT GGGTCAGGTG GAGCTGGGCG 120

GTGGCCCGGG TGCAGGCAGC CTGCAGCCGC TGGCCCTGGA GGGTTCCCTG ^-55TTTTGAACCA ACACCTGTGC GGCTCCCACC TGGTGGAAGC TCTGTACCTG GTGTCCGGTG

AACGTGGCTT CTTCTACACC CCGAAGACCT AGGATCCG

240

278 (2) Informace pro sekv. ID číslo: 3 (i) sekvenční charakteristiky (A) délka: 277 párů bázi (B) typ: nukleová kyselina (C) řetězce: jednoduchý (D) topologie: lineární (ii) Typ molekuly: DNA (genomická) (xi) sekvenční deskripce: sekv. ID číslo 3

AATTCGGATC CTAGGTCTTC GGGTGTAGAA GAAGCCACGT TCACCGCACA CCAGGTACAG 60

AGCTTCCACC AGGTGGGAGC CGCACAGGTG TTGGTTCAAA AAACGCTTCT GCAGGGAACC 120

CTCCAGGGCC AGCGGCTGCA GGCTGCCTGC ACCCGGGCCA CCGCCCAGCT CCACCTGACC 180

CACCTGCAGG TCCTCTGCCT CACGGCGGTT GCAGTAGTTC TCCAGCTGGT ACAGGGAGCA 240

GATGCTGGTA CAGCA1TGTT CCACAATGCC CATATGA 277 (2) Informace pro sekv. ID čislo: 4 (i) sekvenční charakteristiky (A) délka: 6 párů bázi (B) typ: nukleová kyselina (C) řetězce: jednoduchý (D) topologie: lineární (ii) Typ molekuly: DNA (genomická) (xi) sekvenční deskripce: sekv. ID číslo 4

CCTCGAGG 8 (2) Informace pro sekv. ID čislo: 5 (i) sekvenční charakteristiky (A) délka: 22 párů bázi (B) typ: nukleová kyselina (C) řetězce: jednoduchý (D) topologie: lineární (ii) Typ molekuly: DNA (genomická) < j < á (xi) sekvenční deskripce: sekv. ID číslo 5 GATCTATTAA CTCAATCTAG AC (2) Informace pro sekv. ID číslo: 6 (i) sekvenční charakteristiky (A) délka: 22 párů bázi (B) typ: nukleové kyselina (C) řetězce: jednoduchý (D) topologie: lineární (ii) Typ molekuly: DNA (genomická) (xi) sekvenční deskripce: sekv. ID číslo 6 TCGAGTCTAG ATTGAGTTAA TA (2) Informace pro sekv. ID číslo: 7 (i) sekvenční charakteristiky (A) délka: 10 párů bázi

..... (B) typ: nukleová kyselina .. .......

(C) řetězce: jednoduchý (D) topologie: lineární (ii) Typ molekuly: DNA (genomická) (xi) sekvenční deskripce: sekv. ID čislo 7 CGGGATCCG (2) Informace pro sekv. ID číslo: 8 (i) sekvenční charakteristiky (A) délka: 12 párů bázi (B) typ: nukleová kyselina (C) řetězce: jednoduchý (D) topologie: lineární (TÍ“F~ Typ”mol^Ťčri^í^NA“CgénómicXár) (xi) sekvenční deskripce: sekv. ID číslo 8 GAGGAATTCC TC (2) Informace pro sekv. ID číslo: 9 (i) sekvenční charakteristiky (A) délka: 13 párů bází (B) typ: nukleová kyselina (C) řetězce: jednoduchý (D) topologie: lineární (ii) Typ molekuly: DNA'(genomická) (xi) sekvenční deskripce: sekv. ID Číslo 9

CTGTGCCTTC TAG (2) Informace pro sekv. ID čislo: 10 (i) sekvenční charakteristiky (A) délka: 17 párů bázi (B) typ: nukleová kyselina (C) řetězce: jednoduchý (D) topologie: lineární (ii) Typ molekuly: DNA (genomická) (xi) sekvenční deskripce: sekv. XD čislo 10 GATCCTAGAA GGCACAG (2) Informace pro sekv. ID čislo: 11 (i) sekvenční charakteristiky (A) délka: 26 párů bázi (B) typ: nukleová kyselina (C) řetězce: jednoduchým·'^-·”·*-' ™^;'^;ΐ·^!(D) topologie: lineární (ii) Typ molekuly: DNA (genomická) (xi) sekvenční deskripce: sekv. ID Čislo 11 CCCGTCCTGT GGATACTCTA CGCCGA (2) Informace pro sekv. ID číslo: 12 (i) sekvenční charakteristiky (A) délka: 49 párů bázi (B) typ: nukleová kyselina (C) řetězce: jednoduchý (D) topologie: lineární (ii) Typ molekuly: DNA (genomická) (xi) sekvenční deskripce: sekv. ID číslo 12

CTAGAGGGTA ,TTAATAATGT ATATTGATTT TAATAAGGAG GAATAATCA (2) Informace pro sekv. ID čislo: 13 (i) sekvenční charakteristiky (A) délka: 47 párů bází (B) typ: nukleová kyselina (C) řetézce: jednoduchý (D) topologie: lineární (ii) Typ molekuly: DNA (genomická) (xi) sekvenční deskripce: sekv, ID číslo 13 TATGATTATT CCTCCTTATT AAAATCAATA TACATTATTA

ATACCCT

Průmyslová využitelnost

Nové molekuly odvozené od složek proinzulinu rekombinantni DNA technologii. Sloučeniny podobné inzulínu, vhodné pro ošetřování diabetes mellitus, nezávislé na inzulínu, Nový způsob rekombinantní produkce inzulínu. · · .- ......

Claims (26)

1. λΐΞνNÁROKY (I)

   PATENTOVÉ /

   1. Polypeptid obecného vzorce I

   Met_x-A-C-B kde znamená

   Met aminokyselinu methionin, x O nebo i,

   A řetězec A inzulínu nebo jeho funkční derivát,

   B řetězec B inzulínu nebo jeho funkční derivát,

   C C-peptid inzulínu nebo peptid obecného vzorce

   Xi- X₂- P - X₃- X₄ kde znamená

   X1.X2.X3 a X₄ bazické aminokyseliny, které jsou stejné nebo odlišné a

   P peptid obsahující 4 až 35 aminokyselin s výjimkou cysteinu, a jeho farmaceuticky vhodné soli.
2. 2. Polypeptid podle nároku 1 obecného vzorce I, kde aminokyselina v poloze 21 A-řetězce je volena ze souboru zahrnujícího Gly, Ala, Asp, a Asn.
3. 3. Polypeptid podle nároku 2 obecného vzorce I, kde aminokyselina v poloze 10 B-řetězce je Asp.
4. 4. Polypeptid podle nároku 3 obecného vzorce I, kde aminokyselina v poloze 30 B-řetězce je Ala nebo chybí.
5. 5. Polypeptid podle nároku 3 obecného vzorce I, kde aminokyselina v poloze 29 B-řetězce je Pro.
6. 6. Polypeptid podle nároku 5 obecného vzorce selina v poloze 28 B-řetězce je Glu nebo Lys.
7. 7. Polypeptid podle nároku 2 obecného vzorce selina v poloze 27 B-řetězce je Arg.
8. 8. Polypeptid podle nároku 7 obecného vzorce I, kde aminokyselina v poloze 13 B-řetěžce je Gin.
9. 9. Polypeptid podle nároku 7 obecného vzorce I, kde aminokyselina v poloze 17 A-řetězce je Glu.
10. 10. Polypeptid podle nároku 7 obecného vzorce I, kde aminokyselina y poloze 21 A-řetězce je Gly a aminokyselina v poloze 3.0 Bkde aminokykde aminoky79 řětězce je Thr-NH?.
11. 11. Polypeptid podle nároku 2 obecného vzorce I, kde aminokyselina v poloze 29 B-řetězce je Pro.
12. 12. Polypeptid podle nároku 11 obecného vzorce I, kde aminokyselina v poloze 28 B-řetězce je Glu nebo Lys.
13. 13. Polypeptid podle nároku 12 obecného vzorce I, kde aminokyselina v poloze 30 B-řetězce je Ala.
14. 14. Polypeptid podle nároku 2 obecného vzorce I, kde aminokyselina v poloze 30 B-řetězce je Ala.
15. 15. Polypeptid podle nároku 1 obecného vzorce Σ, kde aminokyselina v poloze 10 B-řetězce je Asp nebo His.
16. 16. Polypeptid podle nároku 15 obecného vzorce I, kde aminokyselina v poloze 28 B-řetě2ce je Asp.
17. 17. Polypeptid podle nároku 15 obecného vzorce I, kde aminokyI* selina v poloze 30 B-řetězce je vypuštěna.

    >
18. 18. Polypeptid podle nároku 1 obecného vzorce I, kde aminokyselina v poloze 28 B-řetězce je Lys a aminokyselina v poloze 29 B·. •’Μ. ' řetězce je Pro.
19. 19. Polypeptid podle nároku 1 obecného vzorce I, kde aminokyselina v poloze 29 a 30 B-řetězce je vypuštěna.
20. 20. DNA sloučenina 2akodující kteroukoliv sloučeninu podle nároku 1 až 19. —
21. 21. Rekombinantni DNA vektor obsahující DNA sloučeninu podle nároku 20.
22. 22. Způsob rekombinantni přípravy polypeptidu podle nároku 1 až 19,vyznačující se tím, že

    a. se vytváří DNA sekvence zakodujicí polypeptid podle nároku 1 až 19

    b. tato DNA sekvence se vnáší do vhodného vektoru obsahujícího promotor operátorovou regionální funkci v hostující buňce,

    c. orientuje se DNA sekvence ve vektoru k dosažení transkripce a translace DNA sekvence za transkripčniho řízeni promotor operátorového regionu,

    d. tranformuje se hostující buňky vektorem,

    e. kultivuje se hostující buňka za podmínek vhodných k navození transkripce a translace genu a rtf:.

    S

    f. ziská a čisti se produkovaný peptid zakódovaný DNA sekvenci.
23. 23. Způsob přípravy polýpeptidů obecného vzorce I podle nároku 1 až 19, vyznačujíc! se tí m,že se postupuje syntézou peptidu v pevné fázi.
24. 24. Způsob přípravy inzulinu, vyznačující se t i m , že

    a. se připravuje polypeptid obecného vzorce I poodle nároku 1 až 19 a

    b. štěpí se vhodnými peptidasami nebo chemičkám! činidly k odštěpeni C-peptidu.
25. 25. Způsob přípravy inzulínu, vyznačující se t 1 η , že

    a. se konstruuje DNA sekvence zakodujici polypeptid obecného ··'-·’ vzorce I, podle nároku 1 až 19,

    b. tato DNA sekvence se vnéší do vhodného vektoru obsahujícího promotor operátorovou regionální funkci v hostující buňce,

    c. DNA sekvence se orientuje ve vektoru k dosaženi transkripce a translace DNA sekvence a transkripfini kontroly promotor... operátorové oblasti, ---- d. hostující buňka se transformuje vektorem, - —·

    e. transformovaná hostující buňka se kultivuje za podmínek vhodJ ných k. navozeni transkripce a trans láce..genu ._______

    f. polypeptid zakódovaný DNA sekvencí se ziská a čišti,

    g. polypeptid zakódovaný genem se štěpí vhodnými peptidazami nebo chemickými Činidly, takže se C-peptid odštěpí.
26. 26. Farmaceutický prostředek pro ošetřováni diabetes, NIDDM a pro stimulaci proliferace buněk hladkého svalstva, vyznačující se ti m , Že jako účinnou složku obsahuje polypeptid obecného vzorce I podle nároku 1 až 19 spolu s jedním nebo několika farmaceuticky vhodnými nosiči, exc.ipienty nebo ředidly.

    1 až

    1 až

    1 až ti polypeptidu\obecného/vzorce třování diabetes.

    oužiti polýpeptidů ob^cpého vzorce etřování NIDDM.

    ití polýpeptidů jíbecri^ho vzorce

    I podl\ nar^r'^v’

    X «

    I podle ní -oku

    I pod/e nárok aci prolifera/e buněkuiladského svaPstva.

    (~9.ϊ kb)