CZ186899A3

CZ186899A3 - Kompozice povrchově aktivních látek s alkylpolyoxyalkyleny a ethoxyláty

Info

Publication number: CZ186899A3
Application number: CZ19991868A
Authority: CZ
Inventors: Thomas Anthony Cripe; Daniel Stedman Connor; Phillip Kyle Vinson; Laurent James Charles Theophile Roger Burckett-St.; Kenneth William Willman
Original assignee: The Procter & Gamble Company
Priority date: 1996-11-26
Filing date: 1997-11-19
Publication date: 2000-04-12
Also published as: MA24408A1; CZ302716B6; CN1441042A; HUP0001842A2; AR011769A1; WO1998023712A2; EP0944699A2; TR199901159T2; JP2007016246A; WO1998023712A3; JP2001506679A; CA2272139A1; HUP0001842A3; CN1120226C; JP4364308B2; CA2272139C; CN100457880C; CN1244892A; BR9713301A

Description

Použití molekul, schopných vázat MHC-II nebo napodobujících MHC-II pro výrobu farmaceutického prostředku

Oblast techniky

Vynález se týká použití molekul, schopných vázat MHC-II pro výrobu farmaceutického prostředku, určeného pro interferenci interakce mezi aktivačním podnětem pro fagocyty a molekulou MHC-II, vázanou na buněčný materiál.' .

Dosavadní stav techniky

Lipopolysacharidy, LPS jsou složkou buněčné stěny gram-negativních bakterií. Infekce těmito bakteriemi může vést ke vzniku nemocnění, ohrožujícího život. Příčinou těchto onemocnění je specifická vazba LPS na fagocyty, například monocyty, makrofágy a granulocyty, které jsou tímto způsobem aktivovány a vylučují pak různé cytokiny včetně faktoru alfa-nekrosy nádorů, TNF-alfa, interleukinu 1, IL-1,. dále IL-6, IL-8 a dalších látek, vyvolávajících zánět. Tyto látky mohou přímým působením nebo aktivací_λsekundárních mediátorů vyvolat kaskádu pochodů, v jejichž důsledku dochází k poruchám systému pro srážení krve, k vasodilataciselhání celé řady orgánů a nakonec k septickému šoku, Jak bylo popsáno v publikacích Bone R., Chest 101, 802 - 808, 1991 a Glauser M., Zanetti G., Baumgartner J. a Cohen J., Lancet, 338, 732 - 736, 1991.

Obecně je význačná aktivace fagocytárních buněk, v jejímž důsledku dochází k sekreci řady mediátorů zánětů ústředním prvkem vzniku pathologických stavů, označovaných jako systemický zánětlivý reaktivní syndrom, SIRS. Kromě aktivace působením LPS se může SIRS vyvinout také v důsledku

-2-.

různých jiných klinických stavů, jako jsou infekce bakteriemi nebo viry, úrazy, popáleniny, pankreatitida, reakce štěpu na hostitele a hostitele na štěp, hemofagocytosa a rada dalších. Toxický šok, vyvolaný exotoxiny, například stafylokokovým toxinem A gram-positivních bakterií je jedním z příkladů zánětlivých onemocnění. Dalšími exotoxiny, označovanými také jako superaktigeny, jsou stafylokokový toxin B a streptokokové toxiny.

Bylo prokázáno, že .se LPS váže na glykosylfosfatidylinositolem (GPI) zakotvený monocyt^rní antigen CD14. CD14 se. nachází, na povrchu monocytů, makrofágů a granulocytů, avšak je možno jej nalézt také v rozpustné formě bez zakotvení GPI v krevním séru zdravých jedinců. Mimoto bylo prokázáno, že aktivaci monocytů působením LPS je možno zabránit monoklonálními protilátkami proti CD14. Byly proto vysloveny názory, že CD14 může sloužit jako·receptor pro LPS podle Wright S. D., Ramos R. A., Tobias P.S., Ulevitch R. J. a Mathison J. C., Science 249, 1431 -1433, 1990. Mimoto by tato látka mohla zprostředkovat také účinek LPS na cytoplasmu. Bylo však pozorováno, žena LPS mohou reagovat i CD14- -negativní buňky podle Couturier C., Jahns G. , Kazatchkine M. D. a Haeffner Cavaillon N. , Eur. J. Immunol., 22, 1461 1466, 1992, Frey E. A. a další, J. Exp. Med., 176, 1665 1671, 1992 a Haziot A., Rong G. W., Silver J. a GO'yert S. M., J. Immunol., 151, 1500 - 1507, 1993.

Mimoto je známo, že CD14 je molekula, zakotvená glykosylfosfatidylinositolem GPI, která nemá transmembránovou a cytoplasmatickou doménu podle Haziot A. a další, J. Immunol., 141, 547 - 552, 1988. To znamená, že CD14 nemůže převádět do cytoplasmy signály. Předpokládá se, že v případě bílkovin, vázaných na GPI je zapotřebí asociovaných

- 3 transmembránových molekul pro převod signálu. To však znamená, že skutečná molekula pro převod LPS a pravděpodobně další podněty, vyvolávající SIRS ještě nebyl identifikována.

V případe aktivace buněk působením LPS je tedy . zřejmě nutná interakce dalších molekul, odlišných od CD14, aby bylo možno vysvětlit aktivaci buněk působením LPS podle Tobias P. S. a Ulevitch R. J., Immunobiology, 187, 227 - 232, 1993. Byly vysloveny doměnky, že LPS vytváří komplex s CD14, vázaným na membránu nebo rozpustným a současně s bílkovinou,, která váže LPS a je označována LBP. Na tvorbě tohoto komplexu se patrně mohou účastnit i další molekuly z krevního séra. . Komplex se pak dostává do interakce s dosud neidentifikovanou molekulou buněčného povrchu, což vede k aktivaci buněk.:

CD14 byl popsán jako látka, hrající klíčovou roli na počátku aktivace buněk produkty pouzdra gram-positivních i gram-negativních organismů podle Pugin J. a další, Immunity, 1, 509, 1994. I v tomto'případěse mohou účastnit jiné molekuly, vázané na membránu nebo odvozené od krevního., séra interakce mezi buněčným povrchem, tato interakce pak vede k aktivaci buněk.

P o d s-t a-t a—v-yn á-1- ez-u----·-------------—^;— -----·—^::—:----—_::------- *·

Nyní bylo zjištěno, že molekuly hlavního komplexu histokompatíbility II, MHC-II Jsou nezbytné pro aktivaci buněk působením LPS tak, že slouží jako receptory a/nebo Jako prvky pro přenos signálu pro molekulové komplexy LPS a molekuly typu CD14 a LBP. U Člověka jsou molekuly MHC známy jako antigen lidských leukocytů, HLA. Bylo prokázáno, že reaktivita na LPS závisí na expresi molekul MHC-II na buněčném powíWf¹ x vrchu. Buněčná linie, označovaná jako THP-1 je buněčná linie monocytů, která byla popsána jako THP-1 v publikaci

Tsuchiya M. a další, Int. J. Cancer, 26, 171 - 176, 1980 a u níž dochází k expresi MHC-II· Další buněčná linie, označováná jako THP-1,6 ¹¹ je monocytární buněčná linie, u níž nedochází k expresi MHC-II a která byla odvozena od buněčné MHC+ MHC + linie THP-1 samovolnou mutací. Buňky THP-1 vylučují „ MHCcytokiny pri reakci na LPS, kdežto u buněk THP-1.6 k tomuto vylučování nedochází. Mononukleární buňky z lidské periferní krve, které jsou CD14-positivní a MHC II-negativní, PBMC rovněž nereagují na LPS. Expresi NHC-II a reaktivitu na w x MHCLPS je u bunecne linie THP-1.6 obnovit transfekcí těchto buněk při použití.CIITA, což je kódový nukleární faktor (cDNA pro tento faktor), nezbytný pro expresi molekul MHC II na buněčném povrchu.

Převod dalších podnětů pro vznik SIRS do buněk může být rovněž zprostředkován molekulami MHC II. Již dříve bylo prokázáno, že se exotoxiny mohou rovněž vázat na molekuly MCH II na buněčném povrchu. Aktivita jiných produktů' gram-positivních organismů je alespoň z části zprostředkována přes. CD14 a je proto pravděpodobné,· že se komplex tech-to produktů s CD14 rovněž dostává do interakce s molekulami MHC II pro aktivaci buněk.

Prevence a/nebo potlačení svstemického zánětlivého reaktivního syndromu by tedy bylo možno dosáhrfóut přerušením interakce mezi komplexem LPS a dalšími molekulami, například CD14 a LBP (dále bude tento komplex označován jako CD14/LPS/LBP) a MHC II, vázaným na buněčný materiál. Podle vynálezu je možno tuto interferenci uskutečnit dvěma různými způsoby.

Především je možno blokovat vazbu komplexu CD14/ /LPS/LBP na buněčně vázaný MHC II pomocí molekul, schopných vázat MHC II, například protilátek proti MHC II, CD14 nebo

- 5 odvozených peptidů. Tento typ molekul se dostává do kompetíce s uvedeným komplexem a brání jeho vazbě, avšak sám neaktivuje MHC II. Funkce MHC II ve'smyslu přenosu je tímto způsobem blokována.

Je však možno postupovat také tak, že se LPS nebo komplex CD14/LPS/LBP v oběhu vychytá molekulami, napodobujícími v tomto smyslu MHC II. Komplexy, vázané na rozpustný MHC II nebo na molekuly, podobné MHC II již nejsou schopné se vázat na MHC, vázaný na buněčný materiál a nemůže tedy dojít k aktivaci buněk.

Molekuly, schopné vázat MHC II jsou jakékoliv molekuly, schopné blokovat vazbu LPS nebo svrchu uvedeného komplexu na MHC· II. Může jít·o protilátky proti MHC II, a to monoklonální a polyklonální, zaměřené proti místu vazby CD14/LPS nebo LPS' v buňce. Jako molekuly, vhodné pro vazbu MHC II je možno použít také fragmenty protilátek.

Molekula typu.MHC II může být rozpustná molekul^/ MHC II jako taková a mimoto jakákoliv jiná molekula, schopná blokovat místo vazby MHC II na LPS nebo komplex CD14/LPS. Molekuly tohoto typu mohou být úplné molekuly MHC II nebo -je-j-i-ch—fragmen-t-y-nebo^j-pod-j-edno-t-ky-ř--J-e—také-možno-použ-í-t-pep--tidy, které jsou schopné se vázat na LPS nebo na komplex LPS/ /CD14/LBP bez aktivace MHC II. Tyto peptidy mohou být alespoň homologní vzhledem k MHC II a může například jít o vhodné D-aminokyseliny, tvořící peptidy s antagonistickými vlastnostmi. Molekuly se mohou nacházet v rozpustné formě nebo ve formě, vázané na povrch nosiče.

Na základě informací, uvedených v průběhu přihlášky může každý odborník snadno identifikovat vhodné molekuly svrchu uvedených typů.

- 6 Tento typ molekul může pocházet z jakéhokoliv vhodného zdroje, od Člověka nebo jiného živočicha a může být připraven různými postupy, například izolací ze supernatantu buněčné kultury MHC II-positivních buněk nebo z rozrušených buněk. Zvláště vhodnou izolační metodou je imunoafinitní chromatografie. Vhodné molekuly je možno připravit také genetickou technologií, chemickými postupy pro výrobu bílkovin a jakýmkoliv dalším vhodným způsobem.

Podle vynálezu je možno uvedené dva typy molekul použít při prevenci a/nebo léčení zánetlivých onemocnění, jako jsou septický šok, reakce mezi štěpem a hostitelem po transplantaci orgánů, například po transplantaci kostní dřeně, dále může jít o odmítnutí štěpu, zánětlivé reakce po popáleninách, úrazech, infekcích slinivky břišní a podobně.

Uvedené látky je možno použít také pro prevenci nebo léčení dalších zánětlivých reakcí, k nimž dochází například po chirurgickém zákroku, jako jsou výstup tekutiny z kapilár- J nich cév, alergická onemocnění, autoimunitní choroby, napři- i klad lupus erythematodes (LE) a příbuzné formy, sklerodermie a příbuzné formy, eosinofilní fasciitis, S-jogrenův syndrom, polymyositis, dermatomyositis, periarteritis nodosa, Wegenerova granulomatosis, arteritis temporalis, polylyalgia rheu- matica, a podobně, dále může jít-o rheumatoidní poruchy, jako jsou rheumatoidní arthritis, juvenilní chronická arthritis, Feltyho syndrom, Caplanův syndrom, ankylosující spondylitis (Marie-Strumpell-Bechterewova choroba), lupenka, Reíterův syndrom nebo Behcetův syndrom.

Další choroby, které je možno uvedeným způsobem léčit a které alespoň z části vznikají na základě autoimunitního mechanismu jsou například cukrovka, Crohnova nemoc, solitis ulcerosa, vředová onemocnění zažívacího systému, infekce ledvin, jako glomerulonphritis a nephritis, arte7 riosklerotické poruchy, roztroušená sklerosa, Alzheimerova nemoc, hyperthyreosa, a hypothyreosa.

Uvedeným způsobem je možno léčit také zánětlivé reakce jednoho nebo většího počtu orgánů, spojené s nádorovými poruchami, jako jsou leukemie, nádory krevních buněk, karcinom, fibrom, sarkom a různé.typy histiocytoz.

Pomocí svrchu uvedených látek je možno uskutečnit také prevenci a/nebo léčení virových onemocnění, jako AIDS. Je známo, že stimulace LPS zvyšuje replikaci viru HIV uvnitř buněk. V případě, že se stimulace působením LPS blokuje vazbou MHC II a/nebo podobnými molekulami podle vynálezu, dochází k odstranění těchto podnětů, podporujících replikaci viru. Molekuly podle vynálezu tedy mají na buňky, infikované HIV. ochranný účinek vzhledem k tomu, že brání stimulaci replikace viru.

Na základe údajů, uvedených v příkladové.části je i možno připustit následující model pro aktivaci buněk puso- á bením LPS. Na jedné straně se LPS může vázat na CD14, váJ zaný na membránu (mCD14), což je interakce, urychlovaná bílkovinou LBP podle publikace Hailmann E. a další, J. Exp. Med., !’79~277~I9’9”4~KbmpIě^i.PS7^JTňCDr4, zakotveným pomocí GPI a popřípadě LBP. se pak dostává, do interakce s molekulami MHC II přes membránu a v důsledku toho dochází k převedení signálu. Tato situace je znázorněna na obr. 3A. Na druhé straně se může LPS spolu s LBP vázat na rozpustný CD14 (sCD14) v krevním séru a vzniklý komplex se pak může vázat na molekuly MHC II na povrchu CD14-negativních buněk, čímž dochází k aktivaci CD14-negativních, avšak MHC II-positivních buněk. Tato situace je znázorněna.na obr. 3B. Přestože je znázorněn kontakt C.D14 a MHC II, mohou se na této interakci účastnit také LBP a LPS a ještě další dosud neidentifikované

- 8 molekuly. Aktivačním podnětem mohou být také.složky gram-ipositivních bakterií, přestože v tomto případe ještě nebyla úloha LBP zcela objasněna. Nelze vyloučit možnost, že některé aktivační podněty mohou působit přímo na molekuly MHC II bez tvorby komplexu s CD14 nebo LBP. Nyní se všeobecně uznává, že stimulace je zprostředkována molekulami MHC II. Blokování nebo napodobení těchto molekul může te-. dy předejít převádění aktivačního podnětu.

Podstatu vynálezu tedy tvoří použití molekul, schopných vázat MHC II nebo napodobit MHC II pro výrobu _tfarmaceutického prostředku, který může obsahovat jeden nebo oba typy molekul. Farmaceutické prostředky, které obsahují uvedené molekuly jako svou účinnou složku, je možno použít pro interakci s aktivačními podněty, například LPS, k zábraně aktivace buněk, u.nichž dochází k expresi molekul . MHC II, například fagocytů, tyto prostředky, mohou mít formu prášků, suspenzí, roztoků, sprejů, emulzí, infuzí, prostředků pro inhalace,' mastí nebo krémů a je možno je užít pro místní podání, rektální nebo vaginální podání nebo podánído nosu a také pro perorální podání, parenterální podání, například nitrožilní, intradermální, nitrosvalové nebo intrathekální podání a podobně nebo pro podání vstřebáváním pokožkou-,—inhalací—a^podobně-.—T-y-to—farmaceutické—pros-tředky— je možno připravit tak, že se účinná složka smísí s farmaceuticky přijatelným nosičem neutrální povahy nebo se v něm rozpustí.. Nosičem může být například vodné nebo nevodné rozpouštědlo, stabilizátory, emulgátory, smáŠedla a další přísady, například barviva nebo látky pro úpravu chuti. Koncentrace účinné složky ve farmaceutickém prostředku se může měnit v rozmezí 0,001 až 100 % hmotnostních, v závislosti na způsobu podání a na celkovém způsobu léčení. Dávka účinné látky rovněž závisí na léčeném onemocnění a na způsobu podání, je možno použít dávky 0,01 mikrogramu až 1 mg,

- 9 například je možno použít rozmezí .dávek 0,1 až 100 mikro gramů na kg tělesné hmotnosti.

Praktické provedení vynálezu bude osvětleno následujícími příklady, které však nemají sloužit k omezení roz sáhu vynálezu.

Příklady provedení vynálezu

Příklad 1

Pravdivost předpokladu, že MHC II je převaděč a/nebo receptor pro komplex, zahrnující LPS, CD14, LBP a popřípadě další molekuly při aktivaci fagocytárních buněk působením LPS byla zkoumána srovnáním sekrece cytokinů u buněčných li'nií_r a to MHC II-positivhích (HLA-DR) a MHC II-negativních po stimulaci působením LPS. Sekrece cytokinů je mírou aktivace uvedených buněk.

Materiály a metody '

ΜΗΓ+ x

Buněčná linie THP-1 je'CD14-negativni, MHC II-positivní monocytární buněčná linie lidského původu, popsa-ná-v-pub-l-i-k-ac-i—T-sueh-i-ya-M—a-ůa-l-š-í-j—s-v-rehu-.—Buněčná— 1-i-nie—— THP-1.6^MHC je spontánně vzniklá, MHC Ίΐ-negativní mutanta uvedené linie, která byla klonována opakovaným mezním ředěním uvedené buněčné linie.

Exprese HLA-DR byla obnovena tak, že buněčná linie THP-1.6 byla podrobena transfekci při použiti CIITA (transaktivační látka skupiny II, bílkovina jádra, nezbytná pro expresi bílkovin MHC II podle publikace Steimle V., Otten L, A., Zufferey N. a Mach B., Cell 75, 135-146, 1993 za vzniku buněk THP-1.6 CIITA).

- 10 Exprese HLA-DR a CD18 na povrchu buněk THP-1^MHC+divokého typu, buněk THP-1.6 , vzniklých mutací a

THP-1.6^MHC“CIITA (buňky THP-1.6^MHC~ po transfekci při použití CIITA) byla prokazována průtokovou cytometrií.

Různé buněčné linie byly pěstovány v koncentraci g buněk/ml v prostředí, doplněném 10 % FCS a stimulovány působením.LPS v dávkách 0, 1, 10, 100 ng/ml a 1 mikrogram/ml. Po 24 hodinách byly odebrány supernatanty a pomocí zkoušky ELISA v nich byl stanoven obsah TNF-alfa a IL-8.

Výsledky a diskuse

Životnost buněk nebyla působením LPS narušena. Více než 95 % buněk bylo životaschopných, jak.bylo prokázáno pomocí barvení trypanovou modří. ·

Exprese.CD18 byla u. všech buněčných linií obdobná, MHC — avšak buněčná linie THP-1.6 produkovala expresí podMHC + statně' nižší množství HLA-DR než linie THP-1

MHC+ '

Po stimulaci buněk THP-1 reagovaly po působení LPS buňky sekrecí TNF-alfa a IL-8, jak je zřejmé z obr.l. , „ , ΜΗΓ-Na— druhé—straně^-HÍjA=DR=negatřvm^—buněčná^-tinte’^-THP=1^—6 ' ----nemohla být působením LPS stimulována k vylušování TNF-alfa ani IL-8 ani při použití vysokých dávek LPS. Avšak v případě, že byla tato buněčná linie podrobena transfekci pomocí CIITA, došlo k obnově reakce buněčné linie na LPS i k expresi HLA-DR. Bylo možno uzavřít, že exprese molekul HLA-DR je nezbytná pro aktivaci buněk monocytů působením LPS.

Příklad 2 . Aby bylo možno potvrdit výsledky z příkladu 1, byly výsledky, získané při použití buněčné linie ověřeny při použití buněk, odebraných nemocnému s deficiencí molekul MHC II, což je vzácné onemocnění, které še projevuje jako závažná nedostatečnost imunitního systému již v dětství. Exprese CD14 není u těchto nemocných narušen. PBMC nemocného s deficiencí MHC II a kontrolních nemocných byly pěstovány v přítomnosti zvyšujících se dávek LPS za současného měření koncentrace TNF-alfa a IL-1 v supernatantech těchto buněk.

Materiály a metody ...

Od nemocných s MHC-II deficiencí a od zdravých jedinců byly odebrány mononukleární buňky z periferní krve.

Pak byla stanovena exprese HLA-DR v buněčném materiálu nemocného (šrafováný histogram na levé straně obr.. 2) a v buněčném-materiálu zdravého jedinqe (šedý histogram) pomocí barvení, přímou imunofluorescencí a průtokovou cytometrií.

Buněčný materiál PBMC nemocného (silnější čára) a zdravého kontrolního jedince (tenká Čára) byl pěstován v 6 koncentraci 10 buněk/ml v prostředí, které bylo zaplněno 10 % lidského AB-positivního séra a pak byl buněčný materiál stimulován přidáním 0, 1, 10 a 100 ng/ml LPS. Po 24 hodinách byly odebrány supernatanty a zkouškou ELISA v nich byla stanovena koncentrace TNF-alfa.

- 12 Výsledky a diskuse

Buněčný materiál PBMC od zdravých jednotlivců vylučoval po stimulaci LPS jak TNF-alfa, tak IL-1, jak bylo očekáváno. Avšak v případě PBMC nemocného s MHC II-deficiencí nedošlo po působení LPS k vylučování většího množství cytokinů, jak je zřejmé z obr. 2. Je tedy zřejmé, že požadavek na expresi molekul typu MHC II není omezen na skupinu THP-1^^⁺ buněčných linií.

Údaje prokazují, že CD14, vázaný na buněčnou mem- . bránu není nezbytný pro aktivaci buněk působením LPS Μΐ-ΤΡ j.

(buňky THP-1 neprodukují CD14) ani dostatečný' pro zajištění této aktivace (u PBMC nebocných s MHC II-deficiencí dochází k expresi normálního množství CD14).

Znamená to, že pokusy poněkud vymezily, avšak zcela neupřesnily úlohu rozpustného CD14.. Ve všech pokusech bylo užito prostředí, doplněné sérem s obsahem rozpustného CD14. Z tohoto důvodu byly pokusy opakovány tak, že buněčný materiál THP-1^MHC+, THP-1.6^MHC“ a THP-1.6^MHC'CIITA byl pěstován v prostředí, které neobsahovalo^Jsérum. V tomto případě nedošlo při působení zvyšujících se dávek LPS k -sek-ree-i—vý-znamně-jší-ho-množs-t-v-í—T-NF-a-l-fa---—-------— --β'

Výsledky prokazují, že molekuly MHC II máji zásadní význam pro reakci buněk na LPS. Buněčný materiál u nějž nedochází k expresi GLA-DR nemůže vylučovat cytokiny po stimulaci LPS. Je možno uvést, že nedostatečná reakce na LPS může být způsobena faktorem, blízce spojeným s MHC II a regulovaným CIITA spíše než vlastním nedostatkem exprese MHC II, který způsobuje sníženou reaktivitu na LPS. Avšak nedostatek odpovědi na LPS není omezen na sekreci jednoho z cytokinů vzhledem k tomu, že došlo ke snížení koncentrace cytokinů TNF-alfa, IL-1 i IL-8. Mimoto nebyla až dosud

- 13 nalezena žádná jiná molekula kromě MHC II, která by byla, řízena CIITA, a to přes intensivní snahy. Konečně je nutno uvést, že onemocnění není způsobeno defektem CIITA. Po transfekci B-buněk těchto nemocných, transformovaných virem Epstein Barr, EBV, nedošlo k obnově exprese molekul MHC II.

Příklad 3

Fyzikální interakce molekul MHC II a CD14 byla prokázána třemi různými způsoby.

V prvním případě byly MHC II-positivní a MHC Il-negativní buněčné linie inkubovány s protilátkami, specifickými proti MHC II nebo s kontrolními protilátkami a s radioaktivním CD14 (CD14^ÍÍ) nebo s kontrolními radioaktivními molekulami.. Komplexy MHC II a CD14^K mohly být vysráženy pouze interakcí .mezi, proteinem A-agarosou a protilátkami, specifickými proti MHC II. V případě použití kontrolních molekul nebo kontrolních protilátek nebylo možno prokázat ve sraženině žádnou, radioaktivitu. Totéž platí v případě, že nejsou přítomny žádné molekuly MHC II.'

-------Ve—d-puhém—p-ř-í-padě—by-ly-mo-l-ekuiy-MHC^-H—inkubovány“ s radioaktivním CD14. Předpokládá se tvorba komplexů typu MHC II/CD14 . Teoreticky je možno tyto komplexy vysrážet protilátkami proti kterékoliv ze dvou částí komplexu a protein A-agarosou.

Za třetí byla zkoumána schopnost protilátek proti CD14 blokovat interakci mezi MHC II a CD14*.

Princip těchto pokusů je znázorněn na obr. 4.

Metody

1) Produkce radioaktivního CD14

Rekombinantní CD14 byl zís^n' transkripcí/translací in vitro z cDNA pro CD14 v plné délce, materiál byl připraven pomocí PCR, sekvence nukleotidů byla ověřena při použití systému rozrušených retikulocyklů, vázaných na TNT T7 podle návodu výrobce (Promega, Švýcarsko) v přítom.35 nosti S-methioninu. Jako kontrola byla připravena in vitro radioaktivně značená luciferáza transkripcí/translací při použití téhož systému.

2} Produkce rozrušených buněk

Tak zvané buňky 293 jsou odvozeny od buněk lidské embryonální ledviny, transformovaných pomocí DNA lidského adenovíru typ 5 (ATCC označení CRL 1573). U buněk 293 divokého typu nedochází k expresi molekul MHC II při průkazu analýzou FACS. Tyto buňky jsou tedy považovány za MHC II-negativní buňky. Buňky 293 po transfekci cDNA z alfa-, beta- a invariantních řetězců i) lidských buněk MHC II byly získány od Dr. Jacques Neefjes, Netherlands Cancer InstifufěT-Amsterdam. U^—těchto buněk dochází k expresi MHC II ^a byly tedy použity jako MHC II-positivní buňky. Lysáty MHC II-positivních a MHC II-negativních buněčných linií byly připraveny následujícím způsobem:

g x 10 buněk bylo rozrušeno v Petriho misce v 1 ml příslušného pufru (Boehringer Mannheim, kit pro značení a imunoprecipitaci). Po 30 minutách byly rozdrcené buňky rozrušeny působením ultrazvuku 3 x 15 sekund, načež byly na 30 minut uloženy do ledu a pak byl materiál odstředěn. Supernatanty byly podrobeny imunoprecipitaci následujícím způsobem.

3) Imunoprecipitace v pokusu 1

Imunoprecipitace byla prováděna při použití přísluš ných Činidel v kitu, uvedená v předchozím odstavci podle návodu výrobce (Boehringer Mannheim, Švýcarsko). Postup byl prováděn tak, že vzorky byly předem vyčeřeny při použití 50 mikrolitrů suspenze protein A-agarosy. Po odstranění tohoto materiálu odstředěním byly supernatanty inkubovány s následujícími protilátkami: L243 (anti-HLA-DR, ATCC označení HB 55), 1B5 (anti-MHC II, od Dr. Jacques Neefjes, Netherland Cancer Institute, Amsterdam) a anti-CD3 (Pharmingen, San Diego, USA/AMS Biotechnology, Švýcarsko). Po 1 hodině bylo přidáno 50 mikrolitrů protein A-agarosy a vzorek byl inkubován 3 hodiny, načež byl šestkrát promyt.

Výsledná usazenina byla znovu uvedeny so suspenze ve 30 mikrolitrech pufru (50 mM tris o pH 7,5, 20 mM NaCl, 1 mM EDTA, 2 mM PMSF) a pak bylo přidáno 5 mikrolitrů roztoku, získaného in vitro transkripcí/translací při použití radioaktivně značeného CD 14, výsledná směs byla inkubována ještě 30 minut při teplotě místnosti.^JPo odstředění byly usazeniny dvakrát promyty promývacím pufrem'2 a pak Ještě_dvakrát_pr_qmývac.ím_p.ufr.e.m_3_(.p.uf.ny_2_a_3—t.v.o.ř.í_ao.u=_ Část obsahu kitu pro značení buněk a pro imunoprecipitaci, Boehringer Mannheim, Švýcarsko). Usazeniny se pak rozpustí a vaří ve standardním pufru pro provádění SDS-PAGE a podrobí se elektroforéze na gelu při použití 10% SDS polyakrylamidového gelu s následnou autoradiografií.

4) Čištění molekul MHC II

Molekuly MHC II byly extrahovány a čištěny z buněk THP-1 podle publikace Gorga J. C. a další, J. BIol. Chem.. 262, 16087 - 16094, 1987 s malými modifikacemi. Protilátka

- 16 L243 (anti-HLA-DR, ATCC označení HB 55) byla imobílizována na sloupci protein A-Sepharosy 4B zesítěním s dimethylpimelimidátem. Buňky THP-1 byly rozrušeny na ledu v tris-HC1 o pH 8,0 s obsahem 0,1 mM PMSF. Všechny následující stupně byly prováděny při teplotě 4 °C. Rozrušený materiál byl odstředěn při 3000 g a usazenina byla promývána tak dlouho, až byl získán čirý supernatant. Supernatanty byly spojeny, odstředěny 40 minut při 160 000 g a usazenina pak byla znovu rozpuštěna přidáním prostředku Nonider P40 do konečné koncentrace 4 %. Po odstředění 2 hodiny při 160 OOOg byl supernatant nanesen na řadu sloupců v následujícím pořadí:. Sepharosa 4B, 10 ml, normální králičí sérum-Affigel 10, 10 ml, protein A-Sepharose 4B, 2 ml, L243-Sepharose 4B, 12 ml. Sloupce byly promyty pěti objemy 10 mM tris-HCl/0,1% Nonidet P40 o pH 8,0, pak dvěma objemy 10 mM M0PS/140 mM NaCl/0,1% deoxycholáť o pH 8,0 a Čtyřmi objemy 10 mM tris-HCl/0,1% deoxycholát o pH 8,0. Sloupec, obsahující protilátku L243 pak byl oddělen, od ostatních sloupců a rychle vymyt směsí 50 mM glycinu/0,1% deoxycholát o pH 11,5. Byly odebírány frakce po 10· ml a upraveny na pH 7,0 až 8,0 ihned po svém vymytí 2M glyciném o pH 2,0. Vymyté moleku-. ly HLA-DR byly koncentrovány ultrafiltraďí při použití membrány, oddělující látky do molekulové hmotnosti 30 000. Po 't.rojnásobriém_pr_omy_tí_sm.ě.s.í_t.r.i.s-H.C.l.Z.O_,.l%_de.oxy_cho.lá±_o____ pH 8,0 byla bílkovina znovu zředěna tímtéž pufrem.

5) Imunoprecipitace v pokusu 2 mikrolitrů roztoku, obsahujícího radioaktivně značený CD14, získaný transkripcí/translací in vitro bylo smíšeno s 1 mikrolitrem roztoku, který obsahoval přibližně 10 ng molekul MHC II a směs byla inkubována 30 minut při teplotě místnosti. Pak byly přidány protilátky a směs byla inkubována 1 hodinu při teplotě 4 °C. Po přidání 50 mikro

- 17 litrů protein A-agarosy, byly vzorky inkubovány ještě 3 hodiny při teplotě 4 °C. Po odstředění byly usazeniny promyty celkem dvakrát promývacím pufrem 2 a pak ještě dvakrát promývacím pufrem 3 (pufry jsou obsahem imunoprecipitačního kitu, Boehringer Mannheim, Švýcarsko). Usazeniny se pak rozpustí a povaří v běžném pufru pro provádění SDS-PAGE a podrobí elektroforéze na 10% SDS polyakrylamidovém gelu a pak autoradiografií.

6) Imunoprecipitace v pokusu 3

Před přidáním radioaktivně značeného CD14 ke vzorkům pro imunoprecipitaci jako v oststních pokusech se roztok, který obsahuje CD14 inkubuje se směsí protilátek proti CD14 celkem 10 minut při teplotě místnosti. Směs obsahovala vždy 10 mikrogramů každé z následujících protilátek proti CD14: RM05-2 (Immunotech, Švýcarsko), LeuM3 (Beckton a Dickinson, Švýcarsko), MY4 (Coulter, Švýcarsko), Tuk 4 (Dako, Švýcarsko) a mimoto 100 mikrolitrů supernatantu následujících hybridomů anti-CD14: 3C10, 63D3 (oba získány od ATCC). Jako kontrolní vzorek bylo použito PBS v tomtéž objemu jako směs protilátek uvedené složky byly přidány k 5 mikrolitrům roztoku s obsahem radioaktivně značeného CD14.

Protilátky, které byly použity pro imunoprecipitaci, byly ΜΎ4 (anti-CD14) a L243 (anti-MHC II).

Výsledky

Pokus 1

Průkaz současné precipitace molekul MHC II a CD14 při použití lysátů MHC II-positivních a MHC-II-negativních buněk

- 18 Výsledky tohoto pokusu jsou znázorněny na obr. 5. Na levé straně panelu jsou uvedeny výsledky pokusů při použití lysátu buněk 293 po transfekci MHC II, to znamená po společné transfekci alfa, beta a i-řetězce MHC II, na pravé straně jsou uvedeny výsledky s použitím lysátu MHC II-negativních buněk 293 divokého typu.

V drahách 1 a 2 je možno pozorovat pouze nezřetelné pásy, odpovídající pravděpodobně radioaktivnímu CD14 v dráze 1 -a luciferáze v dráze 2, tyto látky byly pravděpodobně v malém množství nespecificky vysráženy kontrolní protilátkou anti-CD3. Pásy, odpovídající radioaktivně značenému CD14 jsou zřetelně viditelné v drahách 3 a 5, příčinou jsou dvě odlišné protilátky, rozpoznávající molekuly MHC II, a to v dráze 3.jde o L243 .a v dráze 5 o 1B5, obě protilátky srážejí CD14 . Společný precipitační účinek těchto protilátek, proti MHC II je specifický pro CD14 vzhledem k tomu, že působením těchto protilátek nedochází ke srážení podstatnějšího množství radioaktivně značené kontrolní bílkoviny, luciferázy, jak je zřejmé z drah 4 a 6. Společné·· srážení CD14 protilátkami proti MHC.II závisí na přítomnosti molekul MHC II vzhledem k tomu, že k tomuto jevu nedochází v nepřítomnosti molekul MHC II při použití lysátu MHC II-negativních buněk 293 v drahách 7 až 9.

Pokus 2

Průkaz koprecipitace molekul MHC II a CD14 při použití molekul MHC II, čištěných na imunoafinitním sloupci

Výsledky tohoto pokusu jsou znázorněny na obr. 6. Na levé straně panelu jsou uvedeny výsledky imunoprecipitačních pokusů, provedených v přítomnosti čištěných molekul MHC II, na pravé steaně jsou znázorněny výsledky, získané v pokusech, provedených v nepřítomnosti Čištěných molekul MHC II, to znamená při použití příslušného pufru jako negativní kontroly.

V drahách 1 a 4 je možno pozorovat slabé pásy, odpovídající molekulární CD14, vysráženým kontrolními protilátkami anti-CD3. V dráze 3 je možno pozorovat pás, odpovídající CD14 po vysrážení protilátkou anti-CD14. V dráze 2 má pás, odpovídající CD14 vyšší intensitu než ve· dráze 3, přestože v tomto případě bylo srážení uskutečněno při použití protilátek'proti MHC II.. V nepřítomnosti čištěných molekul MHC II dochází k silné precipitaci CD14 protilátkami anti-CD14 ve dráze 6, kdežto koprecipitace CD14 při použití protilátek anti-MHC nepřevyšuje základní úroveň, jak je zřejmé z dráhy 5.

Pokus 3

Fyzikální interakci mezi CD14 a molekulami MHC II je. možno potlačit protilátkami anti-CD14

Výsledky-tohoto pokusu jsou.znázorpěny na obr. 7. Dráhy 1 a 5 prokazují, že protilátka MY4, anti-CD14 sráží radioaktivně značený CD14, získaný in vitro transkripcí/ /translací, a to nezávisle na přítomnosti (dráha 1) nebo nepřítomnosti (dráha 5) molekul MHC II. CD14 se silně sráží působením L243, protilátky proti MHC II za předpokladu, že jsou přítomné molekuly MHC II (dráha 2), avšak k vysrážení dochází pouze v malém množství v nepřítomnosti molekul MHC II (dráha 6). V případě, že se na CD14 nejprve působí směsí protilátek anti-CD14 před smísením s lysátem buněk, které obsahují molekuly MHC II, není možno CD14 vysrážet protilátkami proti MHC II. Výsledek ve dráze 4 prokazuje, že pufr v kontrolním vzorku nemá žádný vliv na koprecipitaci CD14 působením.protilátek proti MHC II. Dráhy a 8 znázorňují výsledky týchž pokusů jako ve drahách 3 a 4, pokusy však byly provedeny v nepřítomnosti molekul MHC II.

Příklad 4

Aby bylo možno prokázat úlohu MHC II při aktivaci buněk in vivo, byly použity myši, jimž chybějí molekuly MHC II. V případě, že se molekuly MHC II účastní aktivačního mechanismu po stimulaci LPS, nemělo by u myší bez těchto molekul docházet k běžným fyziologickým účinkům po stimulaci LPS. Podobný pokus byl proveden také in vitro při použití krve týchž myší.

Metody

Pro pokus in vivo bylo vstřiknuto 100 mikrogramů LPS (e. coli0111:B4 po zředění sterilním 0,9% NaCl) nitrožilně myším bez molekuly MHC II, divokého typu C56BL/6 a B6-Aa°/Aa° (Hoffmann-La Roche, Kontgen a další, International Immunology, 5, 957 - 964, 1993)/ Po 2 hodinách byly myši usrceny a za sterních podmínek byla odebrána krev, která byla po sražení při teplotě místnosti odstředěna 5 minut při 13 000 ot/min. Pak bylo odděleno krevní sérum a byl stanoven obsah TNF-alfa, který je typickou látkou, která znamená aktivaci fagocytů, stanovení bylo provedeno zkouškou ELISA (Biosource). Výsledky jsou znázorněny na obr. 8.

Pro pokusy in vitro byla užita heparizovaná krev myší divokého typu C57BL/6, MHC II-pozitivních (tmavé kruhy na obr. 9) a myší B6-Aa°/Aa° (prázdné čtverce), u nichž nedochází k expresi MHC II po cíleném rozrušení genu Aa^ pro molekuly MHC II. Krev byla inkubována v přítomnosti

O, 0,1, 1, 10 a 100 ng/ml LPS. Po 4 hodinách inkubace se stanoví koncentrace TNF-alfa v plasmě zkouškou ELISA (Biosource). Výsledky jsou znázorněny na obr. 9.

Je zřejmé, že sekrece TNF-alfa je vyšší u myší nebo u buněk, u nichž dochází k expresi molekul MHC II.

Příklad 5

Vliv vazby molekul, schopných vázat MHC II a napodobujících molekuly MHC II in vivo byl zkoumán následují—' cím způsobem.

Metoda

Myši C57B1/6 divokého typu byly Jednotlivě zváženy a injekčně jim byla podána dávka LD^q, stanovená v předběžných pokusech.. Před'injekčním podáním zkoumaných látek byly myši předem-ošetřeny následujícími látkami:

Skupina 1: rozpustné molekuly MHC II v dávce v rozmezí 1. mikrogram až 1 mg/kg hmotnosti, skupina 2: protilátky proti MHC II v tomtéž roznezí uvedených dávek a skupina 3: fyziologický roztok chloridu sodného (kontrolní skupina).

Pro kontrolu byly třem dalším skupinám podány rozpustné molekuly MHC II, protilátka proti MHC II nebo fyziologický roztok chloridu sodného bez následujícího podání LPS.

Délka přežití myší byla sledována následujících 7 dnů. Myši byly pravidelně pozorovány v průběhu prvních 48

- 22 hodin k zaznamenání příznaků. Jedna z podskupin myší byla usmrcena a byla odebrána krev ještě před uhynutím, vyvolaným LPS a v séru těchto zvířat byla stanovena koncentrace TNF-alfa při použití zkoušky ELISA.

Výsledky

Úmrtnost a koncentrace TNF-alfa v krevním séru byly statisticky významně nižší u myší ze skupin, jimž byly podány rozpustné molekuly MHC II ve srovnání se skupinami, jimž byly podány protilátky proti MHC II (výsledky nejsou uvedeny). Kontrolní skupiny, jimž byly podány'molekuly MHC II nebo protilátky proti MHC II, avšak bez podání LPS měly přibližně shodné koncentrace TNF-alfa bez statisticky významených rozdílů v koncentraci této látky proti kontrolní skupině myší, jimž. byl. podán pouze . fyziologický roztok chloridu sodného.bez podání LPS.

Claims

PATENTOVÉ NÁROKY

1. Použití molekul, schopných vázat MHC II pro vý- robu farmaceutického prostředku pro zábranu interakce mezi aktivačním podnětem pro fagocyty a molekulami MHC II, vázanými na buňky pro ovlivnění přenosu signálu na fagocyty.
2. Použití molekul,schopných vázat MHC II pro výrobu farmaceutického prostředku pro zábranu interakce mezi lipopolysacharidem LPS nebo komplexem tohoto, lipopolysacharidu s jinými molekulami, například C.D14 a LBP a molekulami MHC II, vázanými na buňky pro ovlivnění přenosu signálu na fagocyty.
3. Použití molekul, schopných vázat MHC II pro výrobu farmaceutického.’ prostředku pro zábranu interakce mezi produkty grampositivních bakterií nebo komplexy produktu grampositivních bakterií s molekulami, například CD14 a molekulami MHC II, vázanými na buňky pro ovlivnění přenosu signálu na fagocyty.
4. Použití molekul, schopných vázat MHC II podle -něk-terého-z-nárok-ů—1—až—3—při—němž—je-mo-tekulOU—sčlTop^---nou vázat MHC II protilátka proti MHC II nebo její fragment nebo jakákoliv molekula, odvozená od takové protilátky, například humanizovaná, bispecifická nebo jinak zpracovaná molekula a podobně.
5. Použití molekul, schopných vázat MHC II podle některého z nároku 1 až 4, při němž je farmaceutický prostředek určen pro prevenci a/nebo léčení zánětlivých onemocnění, septického šoku, interakcemezi štěpem a hostitelem po transplantacích orgánů, například kostní dřeně,

- 24 odmítnutí štěpu, zánětlivé reakce jednoho nebo většího počtu lidských orgánů v důsledku popálenin, poranění, infekcí slinivky břišní, například v případě syndromu nedostatečnosti dýchacího ústrojí u dospělých, ARDS a podobně, pro prevenci a/nebo léčení zánětlivých reakcí jednoho nebo většího počtu lidských orgánů po chirurgických zákrocích, například zvýšené prostupnosti kapilár, alergických onemocnění jednoho nebo většího počtu lidských orgánů, zánětlivých reakcí jednoho nebo většího počtu lidských orgánů v souvislosti s autoimunitním onemocněním, například lupus erythomatodes, LEajeho subforem, sklerodermie a jejích subforem, eosinofilní fasciitidy, Sjdgrenova syndromu, polymyositidy, dermatomyositidy, nodosní periarteritidyWegenerovy granulomatosy, temporální arteritidy, rheumatické polymyalgie a podobně, zánětlivých reakcí jednoho nebo'většího počtu lidských orgánů v souvislosti s rheumatoidními poruchami, jako jsou rheumatoidní .arthritis, juvenilní chronická arthritis, Feltyho.syndrom,.Caplanův syndrom, ankylosující spondylitis (choroba Marie-StrUmpell-Bechterew), lupenka, Reiterův syndrom, Behcétův.syndrom, zánětlivých reakcí jednoho nebo většího počtu lidských orgánů v souvislosti s chorobami, které jsou alespoň z části důsledkem autoimunitních mechanismů, jako jsou cukrovka, Crohnova nemoc, colitis ulcerosa, vředová choroba zažívací soustavy, záněty ledvin, jako glomerulonephritis a nephritis, arterioskl^rotické poruchy, roztroušená sklerosá, Alzheimerova nemoc, hyperthyreosa a hypothyreosa, zánětlivých reakcí jednoho nebo většího poctu orgánů v souvislosti s nádorovými poruchami, jako jsou leukemie, nádory krevních buněk, karcinom, fibrom, sarkom a různé typy histiocytosy a virových onemocnění, například AIDS.