CZ191999A3

CZ191999A3 - Zařízení k místnímu podávání tuhých nebo polotuhých prostředků, prostředků s retardovaným účinkem k parenterálnímu podávání a způsob jejich přípravy

Info

Publication number: CZ191999A3
Application number: CZ19991919A
Authority: CZ
Inventors: Roland Cherif-Cheikh
Original assignee: Delab
Priority date: 1996-12-02
Filing date: 1997-12-02
Publication date: 2000-03-15
Also published as: CA2273017C; HUP9904601A3; EP0952867A2; FR2756493A1; RU2207845C2; CZ301103B6; JP2001506144A; CA2273017A1; KR20000069264A; BR9713675A; CN1698580A; IL130211A; CN1244132A; DK0952867T3; ES2290971T3; HUP9904601A2; ATE370764T1; NO332358B1; EP0952867B1; HU228236B1

Description

Použiti nebivololu jako anti-aterogenniho činidla

Oblast techniky

Vynález se týká použití derivátů α,α'-iminobis(methylen)bis[2-chromanmethanolu] pro výrobu léčiva pro terapeutické a profylaktické ošetření lidí trpících stárnutím nebo degenerativními chorobami vaskulárního systému a nervové soustavy, které souvisí s oxidačním stresem.

Dosavadní stav techniky

Deriváty α, α'-iminobis(methylen)bis[2-chromanmethanolu] jsou popsány v EP-0,145,067 jako β-l blokační činidla, která mají terapeutický potenciál pro léčení hypertenze. Nebivolol, který je tvořen racemickou směsí (RSSS) a (SRRR) α,a'-iminobis(methylen)bis[2-chromanmethanolu] je genericky popsán ve výše zmíněném patentu a specificky ho popisuje EP-0,334,429, který rovněž uvádí, že (SRRR) enantiomer je účinným a selektivním β-l blokačním činidlem, zatímco (RSSS) enantiomer se neukázal být silným β-l blokačním činidlem, ale ukázalo se, že (RSSS) enantiomer představuje zesilovač pro celou řadu antihypertenzních činidel, například pro atenolol, propanolol, prazosin, hydralazin a je zajímavé, že i pro vlastní (SRRR) enantiomer. V průběhu dalších výzkumů se zjistilo, že nebivolol má několik přínosných hemodynamických účinků, které ho odlišují od ostatních β-l blokačních činidel, přičemž snížení krevního tlaku u spontánně hyperaktivních krys, snížení celkové

01-1033-97 Če ϊ í .· · ! í ’ “Í: ί ·· ···· ··· ··* ·· ·· periferní vaskulárni rezistence a zvětšeni tepového objemu u anesteziovaných psů, jsou rovněž připisovány zejména (RSSS) enantiomeru.

V současnosti prováděné experimenty ukazují, že deriváty a,a '-iminobis(methylen)bis[2-chromanmethanolu] mají silnou antioxidační účinnost jak in vitro, tak in vivo. Antioxidační vlastnosti in vitro a in vivo vykazuje po karvedilolu a jeho metabolitech zřejmě pouze druhá skupina β-l blokátorů, přičemž účinnost derivátů α, a'-iminobis(methylen)bis[2-chromanmethanolu] se zdá být mnohem silnější. Vzhledem ke svým antioxidačním vlastnostem mají deriváty α,a'-iminobis(methylen)bis[2-chromanmethanolu] terapeutickou použitelnost při léčení degenerativních onemocnění a rovněž při léčení stárnutí vaskulárního systému a nervové soustavy, které jsou způsobeny oxidačním stresem.

Podstata vynálezu

Jak již bylo uvedeno, vynález se týká použití derivátů a,a'-iminobis(methylen)bis[2-chromanmethanolu], farmaceuticky přijatelných kyselinových adičních solí, stereochemicky isomerních forem a libovolných směsí těchto derivátů, solí a stereoisomerů pro výrobu léčiva pro terapeutické proliferační ošetření lidí trpících stárnutím nebo degenerativními chorobami vaskulárního systému a nervové soustavy, které souvisí s oxidačním stresem, přičemž uvedené deriváty mají obecný vzorec (I):

01-1033-97 Če

ve kterém R¹ a R³ každý nezávisle znamená atom fluoru, hydroxyskupinu nebo atom vodíku, R² a R⁴ každý nezávisle znamená atom vodíku nebo hydroxyskupinu a jednotlivé hvězdičky označují stereogenové středy.

Vynález se rovněž týká způsobu léčení pacientů trpících stárnutím nebo degenerativními chorobami vaskulárního systému a nervové soustavy, souvisícími s oxidačním stresem, který zahrnuje podání účinného množství derivátu a,a'-iminobis(methylen)bis[2-chromanmethanolu], které zlepšuje, zastavuje, zpomaluje nebo zmírňuje průběh a/nebo účinky uvedeného stárnutí a degenerativních chorob.

Předpokládalo se, že sloučeniny, ve kterých R¹ a R³znamená hydroxyskupinu a R² a R⁴ znamená atom vodíku jsou hlavními metabolity vznikajícími z odpovídajících sloučenin, ve kterých R¹ a R³ znamená atom fluoru, ale nedávná zjištění ukázala, že tomu tak není. Nicméně tyto pseudometabolity mají silnou antioxidační aktivitu.

Specifické sloučeniny podle vynálezu zahrnují:

(RSSS) a (SRRR) a,a'-iminobis(methylen)bis[6-fluoro-2chromanmethanol], jejichž racemická směs je genericky známa jako nebivolol, jejich jednotlivé enantiomery (RSSS) a (SRRR) α,a'-iminobis(methylen)bis[6-hydroxy-2-chromanmethanol]; [ (RSSS) + (RSRR) + (SRSS) + (SRRR)]-a-[[[2-(chroman-2-yl)01-1033-97 Če

2-hydroxyethyl]amino]methyl]-6-hydroxy-2-chromanmethanolethandioát (1:1); [(SRSR)+(SRRS)+(RSSR)]α,a'-iminobis(methylen)bis[6-hydroxy-2-chromanmethanol], a

[(RRSR)+(RRRS)+(SSSR)+(SSRS)]-a-[[[2-(chroman-2-yl)-2-hydroxyethyl]amino]methyl]-6-hydroxy-2-chromanmethanolethandioát (1:1).

Sloučeniny obecného vzorce (I) lze připravit postupy popsanými v patentových dokumentech EP-0,145,067 a EP-0,334,429. Díky bazickým vlastnostem, kterými disponují, mohou být tyto sloučeniny ošetřením vhodnou kyselinou převedeny na své farmaceuticky přijatelné kyselinové adiční solné formy. Mezi vhodné kyseliny lze zařadit například anorganické kyseliny, jakými jsou kyselina halogenovodíková, zejména kyselina chlorovodíková nebo bromovodíková; kyselina sírová; kyselina dusičná; kyselina fosforečná a podobné kyseliny; nebo organické kyseliny, jako je například kyselina octová, kyselina propanová, kyselina hydroxyoctová, kyselina mléčná, kyselina pyrohroznová, kyselina oxalová, kyselina malonová, kyselina sukcinová, kyselina maleinová, kyselina fumarová, kyselina vinná, kyselina citrónová, kyselina methansulfonová, kyselina ethansulfonová, kyselina benzensulfonová, kyselina p-toluensulfonová, kyselina cyklámová, kyselina salicylová, kyselina p-aminosalicylová, kyselina jablečná a další kyseliny. Výraz „adiční sůl, jak je zde použit, zahrnuje rovněž solváty, které jsou sloučeniny obecného vzorce (I) a stejně tak jejich soli schopny tvořit. Těmito solváty jsou například hydráty, alkoholáty apod.. Výhodnou kyselinovou adiční solí nebivololu je jeho hydrochloridová sůl. Soli, které nejsou farmaceuticky přijatelné, mohou být použity při přípravě sloučenin obecného vzorce (I) a kompozic, obsahujících tyto sloučeniny.

01-1033-97 Če

Jako „oxidační stres je označován jev souvisící s působením, zejména škodlivými účinky, endogenních silných oxidantů uvnitř tkáně. Endogenními silnými oxidanty jsou například hyperoxid (0₂ ^-)*, peroxid vodíku (H₂0₂) a hydroxylový radikál (HO*) . Tkání může být centrální, periferní nebo medulární tkáň a zejména tkáň patřící k vaskulárnímu systému, nervovému systému, ledvinám, slinivce, parathyroidovým žlázám a gonádám. Oxidační poškozeni tkáňových buněk je připisováno lipidové peroxidáze, vedoucí ke změnám v integritě a funkci buněčné membrány. Endotelové poškození volnými kyslíkovými radikály je v současnosti považováno za klíčový krok iniciace a vývoje aterosklerózy a příbuzných vaskulárních onemocnění.

Terapeutické ošetření zahrnuje podání sloučeniny obecného vzorce (I) v množství účinném pro zlepšení, zastavení, zpomalení nebo zmírněni průběhu a/nebo účinků degenerativních onemocněni vaskulárního systému a nervové soustavy. Profylaktické ošetření zahrnuje podání této sloučeniny v množství, účinném pro prevenci nebo odložení nástupu a vývoje stárnuti nebo degenerativních onemocněni vaskulárního systému a nervové soustavy.

Antioxidační účinnost derivátů a,a'-iminobis(methylen)bis[2-chromanmethanolu] lze demonstrovat in vitro na jejich schopnosti štěpit volné radikály (hydroxylový radikál, hyperoxidový radikál a radikál oxidu dusičného) a zabraňovat tak radikálem mediované lipidové peroxidaci a cytotoxicitě. V kulturách neuronových buněk mohou účinně nahradit známý endogenní antioxidant, vitamin E (α-tokoferol). Tyto sloučeniny rovněž štěpením hyperoxidů (OD* připomínají účinky hyperoxiddismutázy (SOD). Antioxidační účinnost různých stereoisomerů sloučenin

01-1033-97 Če obecného vzorce (I) je srovnatelná, Antioxidační účinnost sloučenin obecného vzorce (I) je přímo úměrná počtu hydroxyskupin, přítomných ve sloučenině.

Zvláště zajímavým zjištěním je, že sloučeniny, ve kterých alespoň jedno R¹ až R⁴ znamená hydroxylovou skupinu, inhibuje v mikromolárním rozmezí dávkově dependentním způsobem vznik zoxidovaného lidského nízkohustotního lipoproteinu (ox-LDL) in vitro. Zoxidovaný LDL se podílí na aterogenezi a rovněž na tvorbě zoxidovaných membránových lipidů.

Stručný popis obrázků

Obr. 1 znázorňuje fáze rozlišitelné při tvorbě zoxidovaného LDL;

obr. 2 znázorňuje tvorbu zoxidovaného LDL in vitro v kontrolních podmínkách a v přítomnosti účinných látek.

Protože hydroxylace je důležitou enzymatickou reakcí v metabolizmu nebivololu lze předpokládat, že vzhledem k antioxidačnímu účinku jeho hydroxyanalogů, by měl mít nebivolol důležité ochranné účinky proti oxidačnímu poškození in vivo.

Toto tvrzení je potvrzeno nejneočekávanějším pozorováním v in vivo testu. Konkrétně se ukázalo, že u zvířat, která byla dlouhodobě léčena nebivololem bylo potlačeno normální stárnutí vaskulárního systému, pozorované u kontrolních zvířat, tj. proces stárnutí u léčených zvířat se zjevně zpomalil.

01-1033-97 Če

Patogenní degenerace vaskulárniho systému, například aterogeneze, ateromatóza, (tuková degenerace endotelu arterií), arterioskleróza, ateroskleróza, vaskulární hypertrofie spojená s hypertenzí, hyperlipoproteinémie a normální vaskulární degenerace v důsledku stárnutí; vaskulopatologie gonád a slinivky; parathyroidálni reakční hyperplazie; a chronické renální onemocnění; neoplastická onemocnění a zánětlivá onemocnění představují onemocnění a stavy vaskulárniho a nervového systému, které souvisí s oxidačním stresem a o nichž se uvažuje, jako o onemocněních a stavech, které by bylo možno léčit sloučeninami obecného vzorce (I).

Sloučeniny obecného vzorce (I) mohou mít dále terapeutickou hodnotu při prevenci a léčení ztráty neuronů v nervově soustavě, zejména v periferní nervové soustavě, která souvisí s oxidačním poškozením, např. při prevenci a léčení tromboembolického mrtvičného záchvatu, cerebrálního mrtvičného záchvatu, hemoragického mrtvičného záchvatu, cerebrální ischemie, cerebrálního angiospazmu, stárnutí mozku, mozkového nebo míšního traumatu, zástavy srdce, arteriální hypotenze, v kardiální a pulmonární chirurgii, vážné hypoglykemie, anoxie, hypoxie, perinatální asfyxie; a při zmírnění neurodegenerativních onemocnění, ve kterých hrají oxidační metabolické procesy významnou roli, například Huntingtonovy chorey, Alzheimerovy choroby, senilní demence, Pickovy choroby, Korsakoffovy choroby, amyotrofní laterální sklerózy, Parkinsonovy choroby, Downova syndromu, glutarové acidemie, epilepsie, konvulzivních stavů, demence způsobené vícečetným infarktem, neurodegenerace indukované virovou infekcí, například neurodemence doprovázející AIDS, kognitivní

01-1033-97 Če

obtíže, neuropatie a myopatie spojených s infekcí HIV, vzteklinou, spalničkami a tetanem.

Aterogeneze je komplexní proces charakteristický akumulací cholesterolu v makrofázich, nacházejících se v arteriální stěně. Makrofágy čerpají zoxidovaný LDL přes receptor zachycovače, který na rozdíl od normálního LDL-receptoru není regulován obsahem celulárního cholesterolu. Absence regulačního mechanizmu má za následek akumulaci celulárního cholesterolu a tvorbu pěnových buněk. Zoxidovaný LDL byl zjištěn in vivo v oblastech, které se nachází v blízkosti aterosklerotické léze (stručný přehled viz Jackson, R.L. a kol. (1993), Medicinal Research Reviews 13, 161 až 162). LDL oxidace zahrnuje lipidovou peroxidázu, tvorbu aldehydu, fragmentaci proteinu a spotřebu vitaminu E souvisící s LDL částicemi.

U člověka byly identifikovány auto-protilátky, působící proti zoxidovanému LDL. Jejich titr je nezávislým předběžným ukazatelem progrese krkavicové aterosklerózy (Salonen, J.T. a kol. (1992), The Lancet 339, č. 8798, 883 až 887). Navíc náchylnost k LDL oxidaci je spojována se závažností koronární aterosklerózy (Regnstróm, J. a kol. (1992), The Lancet 339, č. 8803, 1183 až 1186). Jakákoliv antioxidační vlastnost, připisovaná kardiovaskulární ochranné účinné látce, kromě jejích dalších farmaceutických vlastností, zvyšuje její terapeutický účinek při prevenci progrese aterosklerotického procesu.

Z dat uvedených v příkladu 1 vyplývá, že hydroxyanalogy nebivololu mají dalekosáhlý antioxidační účinek na lidský LDL. Koncentrace použité in vitro byly vysoké (2 μΜ), ale nebyly relevantní pro porovnání s in vivo stavem. Ve skutečnosti se ukázalo, že jak vitamin E, tak

01-1033-97 Če známý antioxidant a hypolipidemické činidlo probucol jsou zapojeny do lipidové fáze LDL částice po dobu několika týdnů (Reaven, P.D. a kol. (1992), Artheriosclerocis and Thrombosis, 12, č. 3, 318 až 324; Kagan, V.E. a kol. (1992), J. Lip. Res., 33, 385 až 397) . Krátká doba trvání experimetu v příkladu 1 nesimulovala tuto in vivo situaci. Distribuce účinných látek mezi vodnou fázi a kapalnou fázi LDL částic pravděpodobně nedosáhla rovnovážného stavu, takže nebyla stanovena antioxidační kapacita těchto účinných látek rozpustných v lipidech, jak vyplývá z extrémně vysoké koncentrace, kterou vyžadoval vitamin E jako referenční sloučenina (obr. 2). Kvalitativně je účinek nebivololových hydroxyanalogů a vitaminu E podobný. Oba zpoždújí oxidaci LDL, protože oxidace začíná až po spotřebování antioxidantů, přítomných v testovacím systému.

Farmaceutické kompozice sloučenin obecného vzorce (I) vhodné jako léčiva podle vynálezu obsahují alespoň jeden masťový základ nebo nosič, které jsou v daném oboru známy. Vhodnou volbou jednoho nebo několika masťových základů nebo nosičů se farmaceutické kompozice přizpůsobí orálnímu, rektálnímu, vaginálnímu, topickému, parenterálnímu (včetně intramuskulárního, subkutánního a intravenózního) nebo implantátovému podání nebo se připraví ve formě, vhodné pro inhalaci nebo insuflaci. Formulace mohou být, pokud je to vhodné, formulovány v diskrétních dávkových jednotkách.

Způsoby přípravy těchto kompozic jsou v daném oboru známy a spočívají v dokonalém smísení účinné složky a vehikula. Všechny tyto způsoby zahrnují smísení účinné složky s kapalnými nosiči nebo jemně rozptýlenými pevnými nosiči nebo oběma typy nosičů a, pokud je to nezbytné, následné vytvarování produktu do požadované formulace.

01-1033-97 Če

Farmaceutické kompozice pro orální podání mohou mít formu pevných dávkových forem, například tablet nebo kapslí, připravených pomocí běžných prostředků za použití farmaceuticky přijatelných vehikul, jakými jsou například vazebná činidla (zejména předželatinovaný škrob, polyvinylpyrrolidon nebo hydroxypropylmethylcelulóza); plniva (například laktóza, mikrokrystalická celulóza nebo fosforečnan vápenatý); maziva (například stearát hořečnatý, mastek nebo silika), dezintegrační činidla (například bramborový škrob nebo škrobglykolát sodný); nebo smáčecí činidla (například laurylsulfát sodný). Tablety mohou být potaženy v daném oboru známými způsoby.

Kapalné přípravky pro orální podání mohou mít například formu roztoků, sirupů nebo suspenzí nebo mohou být připraveny ve formě suchého produktu, který se před použitím smísí s vodou nebo jiným vhodným vehikulem. Tyto kapalné přípravky lze připravit pomocí běžných prostředků a za použití farmaceuticky přijatelných aditiv, jakými jsou například suspendační činidla (jako je sorbitolový sirup, methylcelulóza nebo hydrogenované stravitelné tuky); emulgační činidla (například lecitin nebo akácie); nevodná vehikula (například mandlový olej, olivové estery nebo ethylalkohol); a konzervační činidla (například methylnebo propyl-p-hydroxybenzoáty nebo kyselina sorbová).

Farmaceutické kompozice určené pro topické podání do úst mohou mít formu bukálních nebo sublingválních tablet, kapek nebo oplatek formulovaných běžným způsobem.

Sloučeniny podle vynálezu určené pro topické podání na pokožku mohou být formulovány jako krémy, gely, masti nebo lotiony nebo transdermální náplasti. Pro přípravu těchto kompozic lze například použít vodnou nebo olejovou bázi, ke

01-1033-97 Če

které lze přidat vhodné zahušťovací, gelující, emulgační, stabilizační, dispergační, suspendační a/nebo barvící činidlo.

Sloučeniny obecného vzorce (I) lze rovněž formulovat jako depotní přípravky. Tyto formulace s dlouhodobým působením mohou být aplikovány implantací (například subkutánní nebo intramuskulární) nebo pomocí intramuskulární injekce. Tyto sloučeniny mohou tedy být formulovány za použití vhodných polymerních nebo hydrofobních materiálů (například ve formě emulze v přijatelném oleji) nebo iontoměničových pryskyřic, nebo ve formě omezeně rozpustných derivátů, například ve formě omezeně rozpustné soli.

Sloučeniny obecného vzorce (I) lze formulovat pro parenterální podání pomocí injekce, zejména pomocí konvenční intravenózní, intramuskulární nebo subkutánní injekce, například pomocí injekce obsahující jednotkovou dávku nebo pomocí kontinuální intravenózní infuze. Formulace vhodné pro injektování mohou být připraveny v jednotkové dávkové formě, například ve formě ampulí nebo multidávkových zásobníků obsahujících navíc konzervační činidla. Tyto kompozice mohou mít také formu suspenzí, roztoků nebo emulzí v olejovém nebo vodném vehikulu a mohou obsahovat některá další aditiva, například suspendační, stabilizační a/nebo dispergační činidla. Alternativně může mít účinná látka práškovou formu, vhodnou pro smísení s vehikulem, například se sterilní vodou neobsahující pyrogen.

Sloučeniny obecného vzorce (I) mohou mít rovněž formu rektálních kompozic, jako jsou čípky nebo retenční

01-1033-97 Če

klystýry, které například obsahuji běžné čípkové báze, například kakaové máslo nebo další glyceridy.

Pro intranazální podání lze použít sloučeniny obecného vzorce (I) ve formě kapalného spreje, prášku nebo kapek.

Sloučeniny obecného vzorce (I) pro účely inhalace jsou běžně dodávány ve formě aerosolového spreje, který je uvolňován z natlakovaných obalů nebo rozprašovače pomocí vhodné hnací látky, například dichlorodifluoromethanu, trichlorofluoromethanu, dichlorotetrafluoroethanu, 1,1,1,2tetrafluoroethanu, oxidu uhličitého nebo dalšího vhodného plynu. V případě natlakovaného aerosolu lze dávkovou jednotku určit poskytnutím ventilu, který je schopen odměřit předem stanovené množství aerosolu. Kapsle a patrony, například želatinové, použitelné v inhalátoru nebo insuflátoru lze formulovat tak, aby obsahovaly práškovou směs sloučeniny podle vynálezu a vhodné práškové báze, například laktózy nebo škrobu. Jakákoliv z výše popsaných farmaceutických kompozic může být běžným způsobem připravena v kontrolované uvolňované formě.

Aby se zvýšila biologická dostupnost sloučenin obecného vzorce (I) lze tyto sloučeniny formulovat výhodně s vhodnými cyklodextriny. Vhodnými cyklodextriny jsou α-, β-, γ-cyklodextriny nebo ethery nebo jejich směsové ethery, ve kterých je alespoň jedna hydroxyskupina anhydroglukózových jednotek cyklodextrinu substituovaná alkylovou skupinou s 1 až 6 atomy uhlíku, zejména methylovou skupinou, ethylovou skupinou nebo isopropylovou skupinou; hydroxyalkylovou skupinou s 1 až 6 atomy uhlíku v alkylovém zbytku, zejména hydroxyethylovou skupinou, hydroxypropylovou skupinou nebo hydroxybutylovou skupinou;

01-1033-97 Če

karboxyalkylovou skupinou s 1 až 6 atomy uhlíku v alkylovém zbytku, zejména karboxymethylovou skupinou nebo karboxyethylovou skupinou; alkylkarbonylovou skupinou s 1 až 6 atomy uhlíku v alkylovém zbytku, zejména acetylovou skupinou; alkyloxykarbonylalkylovou skupinou s 1 až 6 atomy uhlíku v alkylových zbytcích nebo karboxyalkyloxyalkylovou skupinou s 1 až 6 atomy uhlíku v alkylových zbytcích, zejména karboxymethoxypropylovou skupinou nebo karboxyethoxypropylovou skupinou; alkylkarbonyloxyalkylovou skupinou s 1 až 6 atomy uhlíku v alkylových zbytcích, zejména acetyloxypropylovou skupinou.

Jako komplexotvorná činidla a/nebo solubilizační činidla stojí za zmínku zejména β-CD, 2,6-dimethyl-β-CD, 2-hydroxyethyl-p~CD, 2-hydroxyethyl-y-CD, 2-hydroxypropylγ-CD a (2-karboxymethoxy)propyl-p-CD, a zejména

2-hydroxypropyl-β-CD (2ΗΡ-β-Οϋ). Nejvýhodnějším cyklodextrinovým derivátem pro použití v kompozicích podle vynálezu je 2-hyroxypropyl-β-cyklodextrin, mající průměrnou molární substituci (M.S.) 0,35 až 0,50 (stanoveno hmotovou spektroskopií) a obsahující méně než 1,5 % nesubstituovaného β-cyklodextrinu. M.S. hodnoty, stanovené pomocí NMR nebo IR, se výhodně pohybují v rozmezí od 0,55 až 0,75.

Farmaceutické formulace mohou být tvořeny pouze sloučeninou obecného vzorce (I) a cyklodextrinem nebo cyklodextrinovým derivátem. Tuto pevnou formu lze běžně připravit lyofilizací vodného roztoku nebo také současným vysrážením sloučeniny obecného vzorce (I) a cyklodextrinu. Tato forma je použitelná zejména pro rekonstituci s vodou, fyziologickým roztokem nebo vodným roztokem cyklodextrinu,

01-1033-97 Če

nebo pro sloučeni s nefarmaceutickými pevnými látkami, zejména potravinami.

Farmaceutické kompozice podle vynálezu jsou vhodné zejména pro orální podání.

Tyto kompozice se mohou výhodně nacházet v diskrétních dávkových jednotkách, zejména v jednotkových dávkových formách. Běžná jednotková dávka formulace obsahuje přibližně 0,1 až 100 mg účinné látky. Denní dávka sloučeniny obecného vzorce (I) se bude měnit nejen v závislosti na konkrétní volbě sloučeniny ale rovněž v závislosti na volbě způsobu podání, povaze stavu, který má být léčen a věku, hmotnosti a celkovém stavu pacienta, přičemž volba konkrétního množství sloučeniny obecného vzorce (I), použitého jako denní dávka, bude ponechána zcela na ošetřujícím lékaři. Nicméně za vhodnou dávku se obecně považuje přibližně 0,1 až 20 mg/den. Vhodná denní dávka pro účely prevence se bude pohybovat ve stejném rozmezí.

Požadovaná dávka může být běžně poskytována ve formě jediné dávky nebo ve formě dělených dávek podávaných ve vhodných intervalech, například ve dvou, třech, čtyřech nebo více dílčích dávkách za den. Denní dávka nebivololu může být podána v jediné dávce (o.d.), protože tento režim poskytne během 24 hodin účinnou hladinu plazmy. Díky tvorbě účinných metabolitů se zvýšenou antioxidační účinností se bude antiaterogenický účinek nebivololu po opakovaném nebo při kontinuálním podání zvyšovat, pokud nedosáhne ustáleného stavu.

Sloučeniny obecného vzorce (I) lze rovněž použít v kombinaci s dalšími činidly snižujícími krevní tlak nebo s

01-1033-97 Če dalšími terapeutickými činidly, například hypolipemiky nebo hypolipidemiky, činidly snižujícími hladinu cholesterolu, ACAT inhibitory nebo antioxidanty. Vynález tedy dále poskytuje kombinaci obsahující zde definovanou kompozici společně s dalším terapeuticky účinným činidlem, zejména dalším činidlem snižujícím krevní tlak nebo hypolipemikem, hypolipidemikem, činidlem snižujícím hladinu cholesterolu, ACAT inhibitorem nebo antioxidantem. Jednotlivé složky kombinace mohou být podány odděleně, tj. současně, souběžně nebo postupně, libovolným výše popsaným způsobem nebo najednou, ve formě jediné farmaceutické formulace. Farmaceutický produkt, obsahující (a) sloučeninu obecného vzorce (I) a (b) další terapeutické činidlo, jak je zde definováno, jako kombinovaný přípravek pro současné oddělené nebo postupné použití při terapeutickém nebo profylaktickém ošetření lidí, trpících nemocemi stáří nebo degenerativními nemocemi vaskulárního nebo nervového systému, které jsou spojovány s oxidačním stresem, tedy představuje další aspekt vynálezu. Tento produkt může obsahovat sadu zahrnující zásobník s farmaceutickou kompozicí sloučeniny obecného vzorce (I) a druhý zásobník s farmaceutickou kompozicí druhého farmaceutického činidla. Výhoda produktu, tvořeného oddělenými kompozicemi dvou účinných složek, spočívá v tom, že lze v jednotlivých případech zvolit vhodné množství každé složky, načasování a sled podání těchto složek v závislosti na konkrétním pacientovi.

Vhodnými terapeutickými činidly pro použití ve výše definovaných kombinacích jsou například činidla snižující krevní tlak, zejména β-l blokační činidla, například atenolol, celiprolol, propanolol; hypolipemika, tj. léčiva použitelná při snižování hladiny nízkohustotního

01-1033-97 Če

lipoproteinu (LDL) nebo cholesterolu, jakými jsou například HMG CoA reduktázové inhibitory, například lovastatin, fluvastatin, pravastatin, simvastatin apod.; gemfibrozil; kyselina zaragozová; nebo antioxidanty, například probucol, vitamin E (α-tokoferol); nebo zejména sloučeniny, které kombinují několik výše zmíněných fyziologických vlastností, například karvedilol, verapamil, diltiazem, vitamin C (kyselina askorbová nebo její sůl).

Pokud se sloučeniny obecného vzorce (I) použijí v kombinaci se sekundárním terapeutickým činidlem, potom se dávka jednotlivých sloučenin může lišit od dávky v případě, kdy se sloučenina použije samotná. Pokus se tedy sloučeniny obecného vzorce (I) použijí společně s druhým terapeutickým činidlem, potom může být dávka každé sloučeniny stejná nebo častěji nižší než v případě použití samotné sloučeniny. Vhodné dávkování sloučenin v konkrétních případech spadá dó rutinní praxe odborníků v daném oboru.

Následující příklady mají pouze ilustrativní charakter a nikterak neomezují rozsah vynálezu, který je jednoznačně stanoven přiloženými patentovými nároky.

01-1033-97 Če

Příklady provedeni vynálezu

Příklad 1

Jn vitro oxidace lidské LDL

Lidská venózní krev se shromáždila na EDTA (2,68 mM konečná koncentrace). Plazma se izolovala odstředěním, přidalo se 37,3 mg/ml NaBr a provedla se solubilizace (konečná hustota 1,036 g/ml). Kyvety odstředivky se nejprve naplnily do úrovně odpovídající 2/3 jejich maximálního objemu a následně doplnily 1,036 g/ml roztoku NaBr a odstředbvaly se 18 hodin při 45 000 ot/min v rotoru 50 Ti (Beckmann). Po odstředění se odstranily plovoucí lipoproteiny. Hustota zbývajícího roztoku se upravila na 1,055 g/ml. Toto plnění kyvet odstředivky a samotné odstřeďování se zopakovalo. Po odstředění se plovoucí LDL dialyzoval proti pufru obsahujícím 127 mM NaCl, 8 mM Na₂HPO₄.2H₂O, 2,7 mM KC1 a 1,47 mM KH₂PO₄ při pH 7,4. Po ukončení dialýzy se LDL přefiltroval přes filtr Millipore (0,45 μΜ) a stanovil se obsah proteinu. Pomocí přefiltrovaného dialyzovaného pufru se připravilo ředění 25 μg/ml. Míra oxidace se určila ve spektrofotometru Pharmacia Ultraspec III. Tvorba konjugovaných dienů se zaregistrovala při 234 nm. 2 μΐ účinné látky nebo rozpouštědla (DMSO) se přidaly do Eppendorfových kyvet, do kterých se následně přidal 1 ml LDL (25 μg/ml) a tyto látky se lehce promíchaly a odstředbvaly 1 minutu při 13 000 g. Roztok se pipetoval do Quartzovy kyvety, která se tepelně stabilizovala ve spektrofotometru při teplotě 37 °C. Po ustálení rovnovážného stavu se přidáním CuSO₄ (konečná koncentrace 10 μΜ) iniciovala oxidační reakce. Absorbance se měnila každé tři minuty v průběhu experimentu.

01-1033-97 Če

Absorbance při 234 nm se rozdělila do tří fází: fáze zdržení, fáze propagace a fáze rozkladu (obr. 1) . Fáze zdržení je definována jako průnik základní osy směrnicí absorbanční křivky propagační fáze. Rychlost oxidace se definovala jako směrnice. Čas t^ se definoval jako čas potřebný pro dosažení maximální absorbance mezi fází propagace a fází rozkladu. Absorbance v čase t^x od které se odečetla absorbance v čase t₀ se vzala jako indikátor celkového množství vytvořených dienů. Pro ověření reprodukovatelnosti testu se připravil referenční LDL vzorek, který se udržoval ve tmě při teplotě 4 °C pod dusíkovou atmosférou. Tento referenční vzorek se zahrnul do každého oxidačního experimentu. LDL se izoloval z 23 subjektů. Plazmový cholesterol se pohyboval v rozmezí od 156 do 278 mg/dl (průměr 213 mg/dl), triglyceridy se pohybovaly v rozmezí od 47 do 328 mg/dl (průměr 191 mg/dl) a fosfolipidy se pohybovaly v rozmezí od 178 do 327 mg/dl (průměr 231 mg/dl).

Obr. 2 ukazuje antioxidační účinky dvou hydroxyanalogů nebivololu: [(RSSS)+(RSRR)+(SRSS)+(SRRR)]-a-[[[2-(chroman2-yl)-2-hydroxyethyl]amino]methyl]-6-hydroxy-2-chromanmethanolethandioát (1:1) a [(SRSR)+(SRRS)+(RSSR)]-α,α'iminobis-(methylen)bis[6-hydroxy-2-chromanmethanol]. Jak tmax tak doba zdržení se prodloužily a rychlost oxidace se snížila. Nebivolol nemá in vitro žádný oxidační účinek. Vitamin E jako referenční sloučenina nevykazoval při koncentraci nižší než 10 μΜ žádný antioxidační účinek (výsledky nejsou uvedeny). Čas t^x při 20 μΜ vitaminu E se v našich experimentálních podmínkách blížil t^x pro 2 μΜ hydroxymetabolitů nebivololu. Rychlost oxidace, počáteční absorbance a celkové množství dienů nebyly vitaminem E

01-1033-97 Če ovlivněny. Z výše uvedeného vyplývá, že hydroxymetabolity nebivololu mají antioxidační účinky na lidský LDL in vitro. Nebivolol může mít tedy důležité ochranné účinky proti oxidačnímu poškození in vivo, ke kterému dochází při ateroskleróze, zánětu a rakovině.

Příklad 2

In vivo antiateromatický účinek nebivololu

Aby se ověřilo, zda měl nebivolol nějaké účinky na vaskulární patologii spojenou se stárnutím, podal se určitému počtu krys orální cestou nebivolol v dávkách 0 (pouze nosič) 2,5, 10 a 40 mg/kg během 24 měsíců. Jako nosič se použil 2-hydroxypropyl-3-cyklodextrin, který zvyšuje biologickou dostupnost nebivololu. Do dvouleté studie se zapojily padesátičlenné samčí a samičí skupiny (pro každou dávku jedna samčí a jedna samičí skupina). Do studie se rovněž zapojila padesátičlenná samčí a padesátičlenná samičí skupina, kterým nebyl podán žádný nebivolol. Testovaná zvířata se pitvala s cílem stanovit, zda došlo k histologickým nenovotvarovým změnám. Byly pozorovány zejména následující histologické znaky, které lze spojovat s vaskulární degenerací nebo stárnutím:

vaskulopatie abdominálního mezotelu, slinivky a varlete, fokální a difuzní hyperplazie příštitných tělísek a renální histologii, zejména množství bazofilních kanálků, jako důkaz chronického renálního onemocnění a mineralizace.

Pro hodnocení histopatologických pozorování se použila následující stupnice od 0 do 3:

01-1033-97 Če

- 0: žádná histologická změna

- 1: mírná histologická změna

- 2: střední histologická změna

- 3: vážná histologická změna.

Veškeré dosažené výsledky se zprůměrovaly a pozorovaná hodnocení se analyzovala za použiti Mann-Whitney U testu (pravděpodobnost výskytu mezi limitními hodnotami) za účelem statistické detekce velkých rozdílů mezi kontrolními skupinami a ošetřenými skupinami. Tato hodnocení jsou shrnuta v níže uvedené tabulce. Hodnota pravděpodobnosti, vypočtená pomocí Mann-Whitney U testu:

* p<0,05 ** p<0,01 *** p>0,001.

Tabulka 1

Histologická změna	Dávková skupina	(mg/kg)
Kontrolní	Vehikulum	2,5	10	40
Samci
Abdominální mezotel:
vaskulopatie	2,50	—	—	—	0,00 *
Ledviny:
bazofilní kanálky	0,10	0,12	0,18	0,18	0,60***
chronické onemocnění	1, 68	1,40	1,32*	1,24*	0,66***
Slinivka:
vaskulopatie	0,30	0,18	0,04	0, 02*	0,00***
Příštítná tělíska:
difuzní hyperplazie	0,18	0,14	0, 08	0,15	0,02*
fokální hyperplazie	0,16	0, 08	0,04	0,02*	0,00**
Varle:
vaskulopatie	0,52	0, 48	0,20*	0,08**	0,02***

01-1033-97 Če

Dávková skupina (mg/kg)

Histologická změna	Kontrolní	Vehikulum	2,5	10	40
Samice
Ledviny:
bazofilní kanálky	0, 04	0,14	0,18	0,18*	0,42***
chronické onemocnění	1, 04	0,76	0, 88	0, 92	0,78
mineralizace	0, 96	0,74	0, 84	0, 64*	0,14***
(parenchym/pánev)
Slinivka
vaskulopatie	0,12	0,04	0,04	0,02	0,00*

Příklad 3

Primární kultury zárodečného hippokampu se připravily v podstatě již popsaným způsobem (Pauwels a kol., Van Aschouw H.P., Peeters L., Moeremans M., Leysen J.E. (1992) Chronic treatment with sabeluzole protects cultured rat brain neurons from the neurotoxic effects of excitatory amino acids. Synapse, 12:271 až 280). Sedmnáctý den vývoje embrya se z těl krys vyjmuly již vytvořené části hippokampu, které se následně disociovaly v 0,05% trypsinu, 0,1 ml/ml DNase I v DMEM (Dulbecco Modified Eagle Medium). Potom se přidalo koňské sérum (HS) konečné 4% koncentrace a buňky se odstředily, promyly DMEM a resuspendovaly v DMEM/Ham's F12 (3:1) obsahujícím 10% HS. Buňky se umístily na 24 mnohojamkových ploten, předem potažených póly L-lysinem (0,001%), při hustotě 4 x 10⁵ buněk/cm². První den kultivace se médium vyměnilo za chemicky definované CDM-R12 médium (DMEM-HEPES/Ham's F12 (3:1) obsahujícím 0,26% albumin bovinního séra, 30 nM selenitu sodného, 3 nM

01-1033-97 Če

3,3', 5-trijodo-L-thyroninu, 0,35 μΜ retinolu, 0,3 μΜ retinolacetátu, 2,3 μΜ DL-a-tokoferolu, 2,1 μΜ DL-a-tokoferolacetátu, 3,6 μΜ kyseliny linolenové, 3,6 μΜ kyseliny linolové, 0,125% humánního transferrinu, 20 nM progesteronu, 57,7 nM kortikosteronu, 49 U/l inzulínu, 0,4 μΜ biotinu, 10 μΜ L-karnitinu, 83 μΜ D(+)galaktózy, 3,3 μΜ glytathionu, 10 μΜ ethanolaminu, 0,1 mM putrescinu; Romijn H.J., van Huizen F., Wolters P.S. (1984) Towards an improved serum-free, chemicky definované médium pro dlouhodobou kultivaci tkáně mozkové kůry. Neurosci. Behav. Rev., 8:301 až 334). Akutní a dlouhodobé předběžné ošetření kultur se v podstatě provádělo již popsaným způsobem (Pauwels a kol., 1992). Účinné látky se rozpustily a naředily v 10% nebo 1% hydroxypropyl-p-cyklodextrinu, takže konečné koncentrace rozpouštědla při akutních a chronických expozicích byly 0,1%, resp. 0,01%. Sloučeninou A, použitou v následujících příkladech, byla

[(RRSR)+(RRRS)+(SSSR)+(SSRS)]-a-[[[2-(chroman-2-yl)-2-hydroxyethyl] amino]methyl] -6-hydroxy-2-chromanmethanolethandioát (1:1).

Při akutním ošetření se účinná látka nebo rozpouštědlo přidalo do kultur sedmý den. Po dvaceti minutách se médium nahradilo 200 μΐ chemicky definovaného DMEM média (stejné složení SDM-R12 média, ale bez Ham's F12) (kontrolní), nebo chemicky definovaného DMEM média obsahujícího aktivátor oxidačního stresu. Použitými aktivátory iniciačního stresu byly 1 mM nátrium nitroprussid (SNP, sloučenina generující radikál oxid dusičný) nebo 7,5 až 10 mM diethyldithiokarmabátu (DDTC, inhibitor hyperoxiddismutázy) a testovaná sloučenina.

01-1033-97 Če

Při dlouhodobých experimentech se účinná látka (koncentrační rozmezí 0,1 nM až 10 μΜ) přidala do séraprostého média první a čtvrtý den kultivace. Sedmý den se kultury promyly jednou DMEM a dvě hodiny se inkubovaly při 37°C 0,2 ml chemicky definovaného DMEM média. Potom se buňky promyly a médium se nahradilo 0,2 ml chemicky definovaného DMEM média (kontrolní) nebo chemicky definovaného DMEM média obsahujícího aktivátor oxidačního stresu (viz výše).

Jak při experimentálním akutním ošetření, tak při experimentálním dlouhodobém předběžném ošetření se extracelulární a intracelulární LDH (laktátdehydrogenázové) aktivity měřily spektrofotometricky při 340 nm pomocí analyzéru EPOS Analyzer 5060 a za použití metody, kterou popsal Bergmeyer (Bergmeyer, H.U., (1974) Biochemical reagents. V: Methods of Enzymatic Analysis. H.U. Bergmeyer, vyd. Academic Press, New York, 2. vyd., str. 480 až 242). Extracelulární LDH aktivita v kultivačním médiu a cytoplazmatická LDH aktivita, měřená po lýze buněk v 1 ml H₂O, se použily pro výpočet celkové LDH aktivity a procento uvolněné LDH. Procento neuroprotekce označuje procentickou inhibici uvolněné LDH, přičemž LDH uvolnění indukované aktivátorem oxidačního stresu je definováno jako 0% ochrana a základní (kontrolní) hladina LDH uvolnění je definována jako 100% ochrana.

Při experimentech zabývajících se deplecí vitaminu E (vitE) se primární kultury zpracovaly výše popsaným způsobem s tou výjimkou, že se první den kultivace původní médium zaměnilo za chemicky definované CDM-R12 médium s (kontrolní) nebo bez DL-a-tokoferolu (VitE) a DL-atokoferolacetátu, v přítomnosti nebo za absence testované

01-1033-97 Če sloučeniny. V případě, kde se použilo kultivační médium bez vitaminu E (vitE), bylo možno čtvrtý den kultivace pozorovat in vitro vážnou buněčnou smrt. Přidání sloučenin by mohlo uvedené kultury zachránit. Přežití kultury se měřilo pomocí cytoplazmatické LDH aktivity. Procentická vitE komplementace označuje procentickou cytoplazmatickou LDH, přičemž LDH hladiny, které jsou stejně vysoké jako hladiny pozorované u kultur obsahujících vitE, byly označeny jako 100% a LDH hladiny stejně nízké jako v případě kultur, které odčerpaly veškerý vitE byly označeny jako 0%. EC₅o pro komplementaci vitE označuje koncentraci sloučeniny potřebnou pro znovudosažení 50% přežití kultury, sledovanou v případě růstu kultury v médiu obohaceném ve vitE. Každá sloučenina se testovala při sedmi koncentracích, přičemž každá koncentrace se testovala třikrát. Výsledky experimentů, které jsou shrnuty v níže uvedené tabulce 2, se použily pro výpočet střední hodnoty EC₅o + standardní odchylka (SD) .

Tabulka 2: Test VitE komplementace: účinek nebivololových derivátů, skrínovancí data.

Tabulka 3: Test VitE komplementace: potence sloučeniny A.

Tabulka 4: In vitro neuroprotekce nebivololu, sloučeniny A karvedilolu proti oxidu dusičnému a hyperoxidovým radikálům.

Přežití primárních neuronových kultur in vitro závisí na přítomnosti antioxidantu vitE v kultivačním médiu. Pokud se pro růst kultur použije médium odčerpávající vitE, potom procento přežití klesne na + 20 % hodnoty, zjištěné pro kontrolní vzorek. Sloučeniny s antioxidačními vlastnostmi jsou schopny nahradit chybějící vitE a jako takové mohou, pokud se přidají do kultivačního média, zachránit kultury

01-1033-97 Če zbavené vitE. Několik nebivololových derivátů se testovalo při ΙΟ^-7 M a ΙΟ^-6 M v testu deplece vitE, prováděném na primárních neuronálních kulturách. Sloučenina A, nebivolol, 1-nebivolol a d-nebivolol byly schopny určitou měrou zachránit přežití kultur, které odčerpaly vitE (tabulka 2).

Sloučenina A byla nejúčinnější sloučeninou: úplnou záchranu růstu primárních neuronálních kultur ve VitE vyčerpaném médiu bylo možné pozorovat při koncentraci ΙΟ^-6 M (tabulka 2) . Koncentrace sloučeniny A, při které se dosáhne 50% záchrany kultury v porovnání s kontrolním vzorkem (kontrolní vzorek tvořila kultura pěstovaná v médiu obsahujícím 4,4 μΜ vitE), byla 126 + 88 nM (tabulka 3).

Ošetření kultur DDTC inhibitorem hyperoxiddismutázy a SNP donorem oxidu dusičného způsobilo radikály (O₂’, resp. NO ) mediovanou neurotoxicitu.

Sloučeniny s antioxidačními vlastnostmi jsou schopny chránit kultury před radikály mediovanou neurotoxicitou, pokud se přidají krátce před aktivací a během aktivace (akutní ošetření), nebo pokud se přidají šest dní před aktivací (dlouhodobé předběžné ošetření). Z tabulky 3 je zřejmé, že nebivolol a sloučenina A mohou způsobit neuroprotekci kultur namířenou proti DDTC nebo SNP jak v prvním, tak v druhém případě. Do dneška není znám mechanizmus neuroprotekce dependentní na léčení. Zjištění, že v případě nebivololu a sloučeniny A byla pozorována částečná ochrana proti SNP a DDTC a v případě karvedilolu tato ochrana pozorována nebyla, vede k závěru, že nebivolol a sloučenina A jsou v tomto ohledu vynikající účinné látky.

01-1033-97 Če

Tabulka 2

Test VitE komplementace: účinek nebivololových derivátů, skrinovaci data

Sloučenina	Koncentrace (M)	% vitE komplementace
(počet	testů)
Sloučenina A	10^-7	27	±	28	(16)
	10^s	85	±	21	(16)
Nebivolol	10’⁷	29	+	29	(15)
(RSSS, SRRR)	10~⁶	29	±	28	(15)
1-nebivolol	10’⁷	22	+	20	(13)
(SRRR)	10’⁶	24	+	26	(13)
d-nebivolol	10’⁷	12	±	17	(7)
(RSSS)	10⁶	19	±	22	(7)

Neuronálni primární kultury hippokampu rostly za absence faktoru přežití, vitE, což způsobilo vážnou buněčnou smrt. Pokud se deriváty nebivololu podaly během kultivace, potom bylo možné určitou měrou kultury zachránit. 100% vitE komplementace odpovídá přežití buněčné kultury, která je totožná s buněčnou kulturou obsahující vitE.

Tabulka 3

Test vitE komplementace: potence hydroxynebivololu

Sloučenina	střední EC₅o ± SD (počet dávkových odezev)
Sloučenina A	126 ± 88 nM (5)

Neuronálni primární kultury hippokampu rostly za absence faktoru přežití, vitE, což způsobilo vážnou

01-1033-97 Če

buněčnou smrt. Pokud se během kultivace podal hydroxynebivolol, potom bylo možné kultury zachránit. EC₅₀označuje koncentraci, při které se zachránilo 50 % kultury, měřeno pomoci cytoplazmatické LDH aktivity.

Tabulka 4

In vitro neuroprotekce nebivololem, sloučeninou A a karvedilolem proti radikálům oxidu dusičného a hyperoxidu

% neuroprotekce, střední hodnota ± SD (počet nezávislých kultur)
Sloučenina	Aktivátor	Dlouhodobé předběžné ošetření	Akutní ošetření
ΙΟ’⁷ M	ΙΟ^-6 M	ΙΟ^-7 M	10’^δ M
Nebivolol	DDTC	NA (2)	37 ± 23 (2)	32 ±28 (5)	29 ±16 (7)
(RSSS, SRRR)
	SNP	26 ± 13 (2)	36 ±18 (3)	NA (2)	NA (2)
Sloučenina A	DDTC	NA (2)	NA (2)	35 ±32 (5)	30 ±28 (6)
	SNP	39 ±13 (2)	38 (1)	NA (2)	NA (2)
Karvedilol	DDTC	NA (2)	NA (2)	NA (1)	NA (4)
	SNP	NA (1)	NA (1)	NA (1)	NA (1)

Neuronální primární kultury hippokampu se pěstovaly sedm dni v CDM-R12 médiu. Testované sloučeniny se buď aplikovaly na jednodenní a čtyřdenní kulturu (dlouhodobé předběžné ošetření) nebo se aplikovaly na sedmidenní kulturu (akutní ošetření). Aktivátor oxidačního stresu se podal sedmý den a na základě získaných výsledků pro

01-1033-97 Če inhibici LDH uvolňování se vypočetla neuroprotekce. NA označuje neúčinnou, tj. nižší než 25%, neuroprotekci.

Příklad 4

Konkurenční glutamátová inhibice absorpce cystinu v určitých buňkách způsobuje glutathionovou depleci a oxidační stres. Tento model oxidačního stresu byl popsán pro gliové C6 buňky gliomu (Kato a kol., 1992. A mechanism for glutamate toxicity in the C6 glioma cells involving inhibition of cystine uptake leading to glutathione depletion. Neurosci. 48:903 až 914) a pro neuronální buněčnou linii N18RE105 (Murphy a kol., 1989. Glutamate toxicity in a neuronal cell line involves inhibition of cystine transport leading to oxidative stress. Neuron

2:1547 až 1558).

Buněčná kultura: C6 gliomová buněčná linie (American Type Culture Collection, CCL 107) se kultivovala v DMEM doplněném 2 nebo 4 mM glutaminu, 1 mM pyruvátu a 5 nebo 10 % teplem aktivovaného séra telecího embrya. Kultury se uchovávaly při 37°C ve vodou nasycené atmosféře vzduchu a 5 až 10% oxidu uhličitého.

Glutathionová deplece a hodnocení účinných látek jako antioxidantů: Experimenty se prováděly na kulturách umístěných do dvacetičtyřjamkových ploten při koncentraci 30 000 až 50 000 buněk/cm² (měření toxicity a lipidperoxidová měření) nebo v devadesátišestijamkových plotnách při koncentraci 136 000 buněk/cm² (stanovení GSH). Po 8 až 24 hodinách se kultury přesunuly do kultivačního média za absence nebo v přítomnosti glutamátového

01-1033-97 Če J J .· ’ I i * ί Σ ! ·· ·«·· ··· ··♦ ·· ·· inhibitoru absorpce cystinu při konečné koncentraci 10 mM. Za účelem testování účinných látek ve smyslu jejich schopnosti inhibovat oxidační stres se účinná látka přidala společně s glutamátem (konečná koncentrace rozpouštědla byla 0,01 % hydroxypropyl-p-cyklodextrinu, 0,1% DMSO). Po 6 až 8 hodinách se měřila hladina intracelulárního glutathionu, po 14 až 20 hodinách se měřily lipidperoxidy a po 48 hodinách se pomocí LDH testu, prováděného podle Bergmeyera a Bernta (UV-test s pyruvátem a NADH, popsaný v „Methods of Enzymatic Analysis, 1974, H.U. Bergmeyer, ed. Acad. Press, New York, 2. vydání, str. 574 až 579., analyzovala toxicita a ochrana.

Stanovení GSH v C6 gl lomových kulturách: GSH hladiny se analyzovaly mikrometodou, kterou v podstatě popsal Vandeputte a kol. (A microtiterplate assay for total glutathione and glutathione disulfide contents in cultured/isolated cells: performance study of a new miniaturised protocol. 1994. Cell Biol. Toxicol. 10:415 až 421), s modifikací v promývání a homogenizačních procedurách. Buňky (v devadesátišestijamkových plotnách) se promyly PBS, homogenizovaly v 50 μΐ lOmM HC1 obsahující 1,3 % kyseliny 5-sulfosalicylové a homogenát se odstřeďoval 10 minut při 1 200 x g a při 4°C. 40 μΐ supernatantu se přemístilo do jamek devadesátišestijamkové plotny, do kterých se následně přidalo 200 μΐ reakčního činidla (1 mM 5,5'-dithiobis(2-nitrobenzoové kyseliny), 0,34 mM NADPH a 6,3 mM EDTA ve 143 mM fosfátového pufru pH 7,4) . Po pětiminutovém ochlazování na pokojovou teplotu se přidáním 40 μΐ glutathionreduktázy (8,5 lU/ml 143 mM fosfátového pufru, 6,3 mM EDTA pH 7,4) iniciovala reakce. NADPH oxidaci bylo možné sledovat při 414 nm po dobu pěti minut pomocí

01-1033-97 Če

zařízení Multiskan MCC/340 (Labsystems) a na základě získaných výsledků se následně vypočetla absorbance (DA)/min. Obsah glutathionu se určil ze standardní křivky pro rozpětí od 0,2 do 2.nmolu komerční GSH na test (v grafu je DA/min vynesena proti koncentraci).

Fluorescenční měření intracelulárních peroxidů: Tvorba intracelulárních peroxidů se stanovila za použiti 6-karboxy-2',7'-dichlorodihydrofluorescindiacetátu, di(acetoxymethylesteru) (C-DCDHF, molekulových sond). C-DCDHF se rozpustil v DMSO při koncentraci 10 mM a skladoval při -70°C pod dusíkovou atmosférou. Po vystavení kultury působení činidel odčerpávajících glutathion se na buňky na dobu jedné hodiny při teplotě 37°C aplikovalo 10 μΜ C-DCDHF. Po odsátí média se k buňkám přidal PBS a plotny se přečetly v mikroplotnovém čítači Cytofluor II (PerSeptive Biosystems). Pomocí 485/530 nm filtračního páru se zvolily excitace a emise vlnové délky. Výsledky se vyjádřily v relativních fluorescenčních jednotkách/gg proteinu.

Výsledky: Šestihodinové nebo delší ošetření

C6 gliomových buněčných kultur 10 mM glutamátu vedlo k prudkému snížení hladin intracelulárního glutathionu (tabulka 5). Redukce glutathionu má za následek oxidační stres, jak naznačuje + šestinásobné zvýšení toxických intracelulárních perixodů (tabulka 5). Po 16 až 48 hodinách se objevuje dokonce buněčná smrt. Do této toxicity není zahrnuta excitotoxicita, protože cytoplazmatické LDH uvolňování (index celulárni toxicity) nebylo NMDA antagonizačnim činidlem MK801 inhibováno (údaje nejsou uvedeny). Za použitých kultivačních podmínek představovalo základní uvolněné množství LDH v C6 gliomových kulturách

01-1033-97 Če

2,7 + 0,3 % celkové LDH (střední hodnota + SD, n=12) a uvolněné množství LDH po ošetření 10 mM glutamátu, trvajícím 48 hodin, představovalo 93,2 + 1,3 % celkového LDH. Účinnost nebivololu i sloučeniny A je při ochraně těchto kultur před buněčnou smrtí vysoká (tabulka 6). Zjistilo se, že IC₅₀ je jak v případě nebivololu, tak sloučeniny A přibližně 9 nM. Vzhledem k tomu, že tato ochrana není způsobena obnovou hladiny glutathionu (tabulka 5), která klesla v porovnání s touto hodnotou zdravých kontrolních buněk přibližně na polovinu, je nasnadě, že ochrana, kterou obě sloučeniny poskytují, je výsledkem narušení oxidačního stresu mediovaného GSH deplecí. Hodnocení intracelulárních peroxidů ukázalo, že jak nebivolol, tak sloučenina A vykazuje glutamátem mediované zvýšení peroxidace (tabulka 5).

Závěr: Výsledky výše popsaných in vitro experimentů jsou jasným důkazem toho, že obě sloučeniny působí v buněčné kultuře jako potenciální antioxidanty a chrání buňky před buněčnou smrtí způsobenou oxidačním stresem, protože inhibují oxidačním stresem mediované zvýšení hladiny toxických intracelulárních peroxidů.

01-1033-97 Če

Tabulka 5

Inhibice glutathionovou depleci mediované intracelulární peroxidace v C6 gliomových buňkách

Sloučenina	GSH hladiny pmol/jamku (průměr ± SD, 6)	Intracelulární peroxidy Relativní fluorescenční j ednotky/pg proteinu (průměr ± SD, n)
Rozpouštědlo	90 ± 9	86 ±16 (12)
Glutamát, 10 mM	296 ± 26	525 ± 57 (12)
+ sloučenina A, 1 pm	301 ±12	137 ±8 (3)
+ nebivolol, 1 pm	301 ±12	155 ± 13 (3)

Tabulka 6

Inhibice glutathionovou depleci mediovaného oxidačního stresu (toxicity) v C6 gliomových buňkách

Sloučenina	Ochrana IC₅₀, nM průměr ± SD, n = 3)
Sloučenina A Nebivolol	8,6 ± 0,2 9,1 ± 0,1

Claims

PATENTOVÉ NÁROKY

1. Použití derivátů α,a'-iminobis (methylen)bis [2chromanmethanolu], farmaceuticky přijatelných kyselinových adičních solí, stereochemicky isomerních forem a libovolných směsí těchto derivátů, solí a stereoisomerů pro výrobu léčiva pro terapeutické a profylaktické ošetření lidí trpících stárnutím nebo degenerativními chorobami vaskulárního systému a nervové soustavy, které souvisí s oxidačním stresem, přičemž uvedené deriváty mají obecný vzorec (I) :

ve kterém ve kterém R¹ a R³ každý nezávisle znamená atom fluoru, hydroxyskupinu nebo atom vodíku, R² a R⁴ každý nezávisle znamená atom vodíku nebo hydroxyskupinu a jednotlivé hvězdičky označují stereogenové středy.
2. Použití podle nároku 1, vyznačené tím, že choroba, která má být léčena se týká patologických forem degenerace vaskulárního systému, například aterogeneze, ateromatózy, arteriosklerózy, aterosklerózy, vaskulární hypertrofie spojené s hypertenzí,

01-1033-97 Če

hyperlipoproteinémie nebo normální vaskulární degenerace způsobené stárnutím; vaskulopatologie gonád a slinivky; parathyroidální reakční hyperplazie; chronického renálního onemocnění;

onemocnění.

neoplastických onemocnění a zánětlivých
3. Použití podle nároku 1, vyznačené tím, že sloučeninou obecného vzorce (I) je nebivolol.
4. Použití podle nároku 3, vyznačené tím, že se sloučenina obecného vzorce (I) použije pro výrobu farmaceutické kompozice určené pro orální podání.
5. Použití podle nároku 4, vyznačené tím, že se denní dávka nebivololu pohybuje v rozmezí od 0,1 do 20 mg.
6. Použití podle nároku 5, vyznačené tím, že se denní dávka podává v jednom podání.
7. Farmaceutická kompozice, vyznačená tím, že obsahuje farmaceuticky přijatelný nosič a jako účinné složky účinné množství sloučeniny obecného vzorce (I), definované v nároku 1, společně s účinným množstvím činidla snižujícího krevní tlak, hypolipemika,

01-1033-97 Če hypolipidemika, činidla snižujícího hladinu cholesterolu,

ACAT inhibitoru nebo antioxidantu.
8. Farmaceutická kompozice podle nároku 7, vyznačená tím, že sloučeninou obecného vzorce (I) je nebivolol.
9. Farmaceutická kompozice podle nároku 8, vyznačená tím, že je přizpůsobena pro orální podání.
10. Produkt, vyznačený tím, že obsahuje sloučeninu obecného vzorce (I) a další terapeutické činidlo, zvolené z činidla snižujícího krevní tlak, hypolipemika, hypolipidemika, činidla snižujícího hladinu cholesterolu, ACAT inhibitoru nebo antioxidantu, jako kombinovaný přípravek pro současné, oddělené nebo postupné použití při terapeutickém a profylaktickém ošetření lidí trpících stárnutím nebo degenerativními chorobami vaskulárního systému a nervové soustavy, které souvisí s oxidačním stresem.