CZ193498A3

CZ193498A3 - Nové deriváty inzulinu s rychlým začátkem působení, způsob jejich přípravy a farmaceutický prostředek, který je obsahuje

Info

Publication number: CZ193498A3
Application number: CZ981934A
Authority: CZ
Inventors: Johann Dr. Ertl; Paul Dr. Habermann; Karl Dr. Geisen; Gerhard Dr. Seipke
Original assignee: Hoechst Marion Roussel Deutschland Gmbh
Priority date: 1997-06-20
Filing date: 1998-06-18
Publication date: 1999-11-17
Also published as: AU740344B2; AU740344C; NL300170I2; NZ330700A; HU221176B1; DK0885961T3; CN1195777C; NO2006014I1; RU2207874C2; CY2005004I2; NO982860L; ZA985363B; ATE283919T1; FR05C0009I1; IL125006A; PT885961E; TW562806B; TR199801144A2; NO321720B1; CY2005004I1

Description

Nové deriváty inzulínu _s rychlým začátkem působení, způsob jejich přípravy a farmaceutický prostředek, který je obsahuje

Oblast techniky

Vynalez popisuje deriváty inzulínu, které ve srovnání s Hdským inzulínem vykazuji zrychlený' začátek působení, způsob jejich přípravy a jejich použiti především ve farmaceutických prostředcích k léčení Diabetes mellitus.

Dosavadní stav techniky

Ve světě trpí asi 120 ' miliónů ' lidí na Diabetes mellitus. Mezi nimi je asi 12 miliónů diabetiků typu I, pro ktere je aplikace inzulínu v současnosti jedinou možností terapie. Postiženi jsou doživotně, zpravidla několikrát denne odkázáni na injekci inzulínu. Ačkoli Diabetes typu II, kterým trpí asi 100 miliónů lidí, není primárně způsoben nedostatkem inzulínu, přesto se v mnoha případech léčba inzulínem používá jako příznivá nebo jediná možná forma terapie.

S pokračující dobou trvání onemocnění trpí velký počet pacientů takzvanými opožděnými diabetickými komplikacemi. Jedná se přitom v podstatě o mikro- ' a makrovaskulární poškození, které vedou, podle druhu a rozsahu, k selháni ledvin, k oslepnutí, ke ztrátě končetin nebo ke zvýšenému riziku onemocnění srdce nebo oběhového systému.

Příčinou komplikací je v první řadě chronicky zvýšená Ladina, glukózy v krevním obraze, protože i pečlivá snaha o dosazeni normální hladiny glukózy v krvi takovou inzulínovou terapií, jaká by odpovídala fyziologické regulaci, není

-2úspěšná (Ward, J. D. (1989) British Medical Bulletin 45, strana 111 _až 126; _Drury, _{p a |lg89)}

Medical Bulletin 45, strana 127 až 147; Kohner, E.M. (1989) British Medical Bulletin 45, strana 148 až 173) .

U zdravých jedinců sekrece, inzulínu úzce závisí na koncentraci glukózy v krvi. Její zvýšená hladina, ke které dochází po požiti potravy, je rychle kompenzována zvýšeným uvolňováním inzulínu. V období hladověni klesá hladina' inzulínu v plazmě na bazální hodnotu, která zaručuje kontinuální zásobování inzulin-senzitivnlch orgánů a tkáni glukózou. Optimalizace terapie, takzvaná intenzivní inzulínová terapie se v současnosti soustředí primárně na to, aby kolísaní koncentrace glukózy v krvi, a to zvláště smerem nahoru, bylo co možná nejmenši (Bolli, G. B. (1989) Diabetes Res. Clin. Pract. 6, strana 3 až 16; Berger, M (1989) Diabetes Res. Clin. Pract. 6, strana 25 až 32). To pak vede k výraznému sníženi výskytu a nástupu poškozeni behem pozdní fáze onemocněni. (The Diabetes Control and Complications Trial Research Group (1993) N. Engl. J. Med. 329, strana 977 až 986) .

Z fyziologie sekrece inzulínu je možné odvodit, že pro zlepšenou, intenzivní inzulínovou terapii jsou při použití subkutánně aplikovaných preparátů potřebné dva inzulínové přípravky _s odlišnou farmakodynamikou. Ke kompenzaci vzestupu glukózy v krvi po požití jídla musí inzulín začít účinkovat rychle a může působit jen několik hodin. K bazalnimu zásobováni, především v noci, by· měl být k dispozici preparát, který působí dlouho, nedosahuje žádného výrazného maxima koncentrace a začíná účinkovat jen velmi pomalu.

Preparáty, které jsou odvozeny z lidského a zvířecího inzulínu, splňují nároky inzulínové terapie jenom omezeně Rychle účinkující inzulín (Alt-inzulín) se po subkutánní

-3aplikaci dostává do krve a na místo působení příliš pomalu a působí po příliš dlouhou dobu. Důsledkem toho je, že postprandiální (po požití potravy) hladina glukózy je příliš vysoká a že za několik hodin po požití potravy hladina glukózy v krvi příliš výrazně klesne (Kang, S. a další (1991) Diabetes Care 14, strana 142 až 148; Home P.J. a další (1989) British Medical Bulletin 45, strana 92 až 110; Bolli, G. B. (1989) Diabetes Res. Clin. Pract. 6, strana S3 až S16) . Dostupné bazální inzulíny, především NPHinzulíny, vykazují příliš krátkou dobu působeni a dosahují příliš výrazného maxima koncentrace glukózy.

Vedle možnosti ovlivnit profil účinku inzulínu galenickými principy se v současnosti naskytuje možnost navrhnout s pomocí genových technik deriváty inzulínu s určitými vlastnostmi, jako je například začátek působení a doba účinku. Této změny lze dosáhnout tím, že se změní strukturní vlastnosti inzulínu. Použitím vhodných derivátů inzulínu by pak bylo možné dosáhnout podstatně lepší nastavení hladiny glukózy v krvi, které by bylo více podobné přirozeným poměrům.

Deriváty inzulínu se zrychleným začátkem působení jsou popsány v EP 0 214 826, EP 0 375 437 a EP 0 678 522. EP 0 214 826 mimo jiné popisuje substituci v pozici B27 a B28 avšak ne ve spojení se substitucí v pozici B3. EP 0 678 522 popisuje deriváty inzulínu, které mají v pozici B29 různé aminokyseliny, zejména prolin avšak ne kyselinu glutamovou. EP 0 375 437 popisuje inzulínové deriváty s lysinem nebo argininem v pozici B28, které můžou být ještě výhodně modifikovány v pozici B3 a/nebo A21.

V EP 0 419 504 jsou popsány deriváty inzulínu, které jsou chráněny proti chemickým modifikacím, přičemž je zaměněn asparagin v pozici B3 a minimálně ještě jedna další aminokyselina v pozici A5, A15, A18 nebo A21. Kombinace s

-4modifikacemi v pozicích B27, B28 nebo B29 vsak nebyly dosud popsány. Rovněž nebyl dosud popsán důkaz toho, že tyto sloučeniny mají pozměněnou farmakodynamiku s rychlejším začátkem působení.

Ve WO 92/00321 byly popsány deriváty inzulínu, u kterých je minimálně jedna aminokyselina v pozicích B1 až B6 nahrazena lysinem nebo argininem. Takovéto inzulíny vykazují podle WO 92/00321 prodloužený účinek. Kombinace s modifikacemi v pozicích B27, B28 a-B29 však nebyly popsány.

Cílem vynálezu je připravit deriváty inzulínu, které po aplikaci, především po subkutánní aplikaci, vykazují ve srovnáni s lidským inzulínem zrychlený začátek působení.

Deriváty inzulínu jsou deriváty přirozeně se vys.kytujicích inzulínů, t.j. lidského (viz. Sekvence id.č.:l t.j. A-řetězec lidského inzulínu; Sekvence id.č.:2 t.j. Břetězec lidského inzulínu, sekvenční protokol) nebo zvířecího inzulínu, které se od odpovídajícího, přirozeně se vyskytujícího inzulínu odlišují substitucí alespoň jednoho přirozeně se vyskytujícího aminokyselinového zbytku a/nebo adicí alespoň jednoho aminokyselinového zbytku a/nebo organického zbytku.

Cílem, předloženého patentu je dále poskytnout postup pro přípravu derivátů inzulínů s jmenovanými vlastnostmi, odpovídajících meziproduktů jako i jejich prekurzorů.

Vynález popisuje inzulínový derivát . nebo jeho fyziologicky přijatelnou sůl který splňuje tento cíl, ve kterém je asparagin (Asn) v pozici B3 řetězce B zaměněn za přirozeně se vyskytující bazický aminokyselinový zbytek a alespoň jeden aminokyselinový zbytek v pozicích B27, B28 nebo B29 B-řetezce je zaměněn za jiný přirozeně se vyskytující aminokyselinový zbytek, přičemž může být fakultativně vyměněn asparagin (Asn) v pozici A21 řetězce A za Asp, Gly, Ser, Thr nebo Ala a fenylalanin (Phe) v pozici 81 retezce Ba aminokyselinový zbytek v pozici B 30 řetězce B mohou zcela chybět.

Derivát Inzulínu nebo jeho fyziologicky přijatelnou sůl jsou znázorněny Vzorcem I (A1-A5) Cys-Cys-A8-A9-A10-Cys- (A12-A19) -Cys-A21 ^Z' ।

⁵-------3 s------S

Bl-Val-B3-Glu-His-Leu-Cys-(B8-B18)-Js-(B20-B26)-B27-B28-B29-B30 kde

Ab) označují aminokyselinové zbytky v pozicích AI az A5 retezce A lidského (srovnej se Sekvencí id.č.:l) nebo zvířecího inzulínu, (A12-A19) označují aminokyselinové zbytky v pozicích A12_ až A19 řetězce A lidského (srovnej se Sekvenci id.č.:l) nebo zvířecího inzulínu, (B8 B18) označuji aminokyselinové zbytky v pozicích B8 az B18 řetězce B lidského, (srovnej se Sekvencí id.č.:2) nebo zvířecího inzulínu, (B20-B26) označují aminokyselinové zbytky v pozicích B20~ až B26 řetězce B lidského (srovnej se Sekvencí id.č.:2) nebo zvířecího inzulínu,

A8,A9, A10 označují aminokyselinové zbytky v pozicích A8, A9 a A10 řetězce Alidského (srovnej se Sekvenci id.č.: 1) nebo zvířecího inzulínu,

A21 je Asn, Asp, Gly, Ser, Thr nebo Ala

030 ~označuje -OH nebo aminokyselinový zbytek v pozici B30 retezce B lidského (srovnej se Sekvenci id.č.:2) nebo zvířecího inzulínu

B1 označuje fenylalaninový zbytek (Phe) nebo atom vodíku

B3 označuje přirozeně aminokyselinový zbytek vyskytující baziéký

B27, B26 a B29 pozicích B27, B28, označují aminokyselinové zbytky v

Sekvencí id.č.:

a B29 řetězce B lidského (srovnej se

2) nebo zvířecího inzulínu nebo přirozeně se vyskytující aminokyselinový zbytek alespoň jeden aminokyselinový zbytek vždy jiný / přičemž a B29 řetězce B je vyměněn . za vyskytující aminokyselinový zbytek, dvaceti přirozeně se vyskytujících sou geneticky kódovány, jsou v dalším v pozici B27, B28 jiný přirozeně se alanin (Ala), valin (Val), serin (Ser), threonin (Thr), aminokyselin, textu glycin asparagin (Asn), glutamin (Gin), leucin (Leu), isoleucin cystein (Cys), methionin které (Gly), (lie), (Met), (Tyr), tryptofan (Trp) neutrální aminokyseliny, fenylalanin (Phe), tyrosin (Lys) a histidin (His) a prolin (Pro) označovány jak₀aminokyseliny arginin (Arg), lysin asparagová (Asp) aminokyseliny.

jako bazické a aminokyseliny kyselina a kyselina glutamová (Glu) jako kyselé

Výhodné jsou deriváty inzulínu podle vynálezu nebo jejrch fyziologicky přijatelné soli odvozené od hovězího vepřového nebo lidského inzulínu, zvláště výhodné jsou pak erivaty inzulínu nebo jejich fyziologicky přijatelné soli podle Vzorce I , kde

A8 znamená alanin (Ala),

A9 serin (Ser),

A10 valin (Val) a

B30 alanin (Ala) (aminokyselinové zbytky A8 až A10 a B30 hovězího insulinu);

A8 znamená threonin (Thr),

A9 serin (Ser) a

A10 isoleucin (lie) (aminokyselinové zbytky A8 až A10 lidského nebo prasečího insulinu), přičemž V m

B30 znamená alanin (Ala) (aminokyselinový zbytek B30 prasečího insulinu) nebo

B30 znamená threonin (Thr) (aminokyselinový zbytek B30 lidského insulinu, srovnej se Sekvencí id.č.:2).

Ve zvláště výhodném provedení vynálezu má derivát inzulínu nebo jeho fyziologicky přijatelná sůl podle Vzorce I aminokyselinové zbytky A8 až A10 a B30 lidského inzulínu a dále:

(AI až A5) označuje aminokyselinové zbytky v pozicích

AI až A5 řetězce A lidského inzulínu (srovnej se Sekvencí id.č.: 1), (A12 až A19) aminokyselinové zbytky v pozicích A12 až A19 řetězce A lidského inzulínu (srovnej se Sekvencí, id.č.:1), (B8 až B18) aminokyselinové zbytky v pozicích B8 až B18 řetězce B lidského inzulínu (srovnej se Sekvencí id.č.:2) a (B20 až B26) aminokyselinové zbytky v pozicích B20 až B26 řetězce B lidského inzulínu (srovnej se Sekvencí id.č.:2) .

V dalších výhodných provedeních vynálezu má derivát inzulínu nebo jeho fyziologicky přijatelná sůl podle Vzorce I v pozici B1 řetězce B fenylalaninový zbytek (Phe) nebo derivát inzulínu nebo jeho fyziologicky přijatelná sůl Vzorce I, který má jako aminokyselinový zbytek v pozici B3 řetězce B histidin (His), lysin (Lys) nebo arginin (Arg).

V jiném výhodném provedení vynálezu má derivát inzulínu nebo jeho fyziologicky přijatelná sůl podle Vzorce I alespoň jeden z aminokyselinových zbytků v pozicích B27, B28 a B29 řetězce B nahrazen jedním přirozeně se vyskytujícím aminokyselinovým zbytkem, který patří do skupiny tvořené neutrálními nebo kyselými aminokyselinami.

Vynález dále popisuje výhodný derivát inzulínu nebo jeho fyziologicky přijatelnou sůl podle Vzorce I kde alespoň jeden z aminokyselinových zbytků v pozicích B27, B28 a B29 retezce B je přirozeně se vyskytujícím aminokyselinovým zbytkem, který je vybrán ze skupiny tvořené aminokyselinami: isoleucin (lie), kyselina asparagová (Asp) a kyselina glutamová (Glu); a ve zvláště výhodném je alespoň jeden z aminokyselinových zbytků v pozicích B27 a B28 řetězce B nahrazen přirozeně se vyskytujícím aminokyselinovým zbytkem, který je vybrán ze skupiny neutrálních aminokyselin, nebo v dalším obzvláště výhodném provedení vynálezu je alespoň jeden z aminokyselinových zbytků v pozicích B27, B28 a B29 retezce B derivátu inzulínu podle vynálezu isoleucinovým zbytkem (lie).

Vynález dále popisuje výhodný derivát inzulínu nebo jeho fyziologicky přijatelnou sůl podle Vzorce I, kde alespoň jeden z aminokyselinových zbytků v pozicích B27, B28 a B29 řetězce B je přirozeně se vyskytujícím aminokyselinovým zbytkem, který je vybrán ze skupiny kyselých aminokyselin; nebo výhodně kde alespoň jeden z

aminokysellnových zbytků v pozicích B27, B28 a B29 řetězce B je zbytek kyseliny asparagové (Asp); nebo výhodně^- kde aminokyselinový zbytek v pozicích B27 nebo B28 řetězce B je zbytkem kyseliny asparagové (Asp), nebo ještě výhodněji kde alespoň jeden z aminokyselinových zbytků v pozicích B27, B28 a B29 řetězce B je zbytkem kyseliny glutamové (Glu).

Výhodným provedením vynálezu je.také derivát inzulínu nebo jeho fyziologicky přijatelná sůl podle Vzorce I, kde je aminokyselinový zbytek v pozici B29 řetězce B zbytkem kyseliny asparagové (Asp).

Dalším výhodným provedením vynálezu je derivát inzulínu nebo jeho fyziologicky přijatelná sůl podle Vzorce I, ve kterém je aminokyselinový zbytek v pozici B27 řetězce B zbytkem kyseliny glutamové (Glu); nebo derivát inzulínu nebo jeho fyziologicky přijatelná sůl podle Vzorce I, ve kterém je aminokyselinový zbytek v pozici B28 řetězce B zbytkem kyseliny glutamové (Glu) nebo derivát inzulínu nebo jeho fyziologicky přijatelná sůl Vzorce I, ve kterém je aminokyselinový zbytek v pozici B29 řetězce B zbytkem kyseliny glutamové (Glu).

Zvláště výhodným provedením vynálezu je derivát inzulínu nebo jeho fyziologicky přijatelná sůl podle Vzorce I, který se vyznačuje tím, že řetězec B vykazuje sekvenci

Phe Val Lys Gin His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Glu Thr (Sekvence id.č.:3), například lidský mutantni inzulín Lys (B3), Glu (B29).

Dalším zvláště výhodným provedením vynálezu je derivát inzulínu nebo jeho fyziologicky přijatelná sůl podle Vzorce

I, ve kterém je aminokyselinový zbytek v pozici B27 řetězce

B zbytkem aminokyseliny isoleucinu (lie); a zvláště výhodným pak je zejména derivát inzulínu nebo jeho fyziologicky přijatelná sůl podle Vzorce I, ve kterém B-řetězec vykazuje sekvenci

Phe Val Lys Gin His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr lie Pro Lys Thr (Sekvence id.č.:5), například lidský mutantní inzulín Lys (B3), He (B27) .

Dalším výhodným provedením vynálezu je derivát inzulínu nebo jeho fyziologicky přijatelná sůl podle Vzorce · I, ve kterém je v pozici B28 řetězce B isoleucinový zbytek (lie); a zvláště výhodným pak je zejména derivát inzulínu, nebo jeho fyziologicky přijatelná sůl podle Vzorce I, ve? kterém B-řetězec vykazuje sekvenci:

Phe Val Lys Gin His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr lie Lys Thr (Sekvence id.č.:4), například lidský mutantní inzulín Lys? (B3), lie (B28).

Dalším výhodným provedením vynálezu je derivát inzulínu nebo jeho fyziologicky přijatelná sůl podle Vzorce I, který se vyznačuje tím, že aminokyselinový zbytek v pozici B28 řetězce B je isoleucin (lie) a aminokyselinový zbytek v pozici A21 je asparagin (Asp); zejména výhodný pak je derivát inzulínu jehož A-řetězec vykazuje sekvenci:

Gly Ile Val Glu Gin Cys Cys Leu Tyr Gin Leu Glu Asn Tyr a B-řetězec sekvenci

Phe Val Lys Gin His Leu Cys Tyr Leu Val Cys Gly Glu Arg

Thr Ser Ile Cys Ser Leu Tyr.Gin

Cys Asp (Sekvence id.č.: 9)

Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu

Gly Phe Phe Tyr Thr Ile Lys Thr

-11ence id.£..10), například lidský mutantni inzulín (Lys (B3), lie (B28), Asp (A21) .

Deriváty inzulínu podle vzorce I je možné připravit pomoci genových technologií.

Vynález dále popisuje způsob přípravy derivátu inzulínu nebo jeho fyziologicky přijatelné soli podle Vzorce I konstrukci replikovatelného expresního systému, který obsahuje DNA sekvenci kódující prekurzor derivátu inzulínu, ve kterém je aminokyselinový zbytek v pozici AI retezce A spojen s aminokyselinovým zbytkem B30 řetězce B peptidovým řetězcem podle Vzorce II

-Arg- ii

Tí/¹ ’ ^Zn“^{ená PePtÍd}°^Vý řetězec s n aminokyselinovými zbytky přičemž n je celé číslo z intervalu od 0 do 34; _aretezec B je v pozici B1 prodloužen o peptidový řetězec podle Vzorce III

Met-R² _m-(Arg) _p- m

Me, R², dole znamená peptidový řetězec s m aminokyselinovými zbytky přičemž m celé číslo od 0 do 40 ve výhodném provedení vynálezu od 0 po 9, a p znamená 0, i nebo 2, přičemž pro p=0 konči R². výhodně aminokyselinou ysinem (Lys). Exprese v hostitelské buňce a uvolněni erivatu inzulínu z jeho prekurzoru je realizováno chemickými a/nebo enzymatickými způsoby.

Ve způsobu podle vynálezu může být hostitelskou buňkou bakterie, zejména pak bakterie E. coli.

_Je způsobu podle vynálezu může být hostitelskou buňkou rovněž kvasinka, přičemž ve výhodném provedeni vynálezu je touto buňkou kvasinka Saccharomyces cerevisiae.

-12K přípravě derivátu inzulínu s aminokyselinovou sekvencí podle Sekvence id.č.:9 (řetězec A) a Sekvence id.č.:10 (řetězec B) je výhodně použit prekurzor derivátu inzulínu se sekvencí:

Met Ala Thr Thr Ser Thr Gly Asn Ser Ala Arg Phe Val Lys Gin

His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr Leu Val Cys

Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr lie Lys Thr Arg Arg Glu Ala

Glu Asp Pro Gin Val Gly Gin Val Glu Leu Gly Gly Gly Pro Gly

Ala Gly Ser Leu Gin Pro Leu Ala Leu Glu Gly Ser Leu Gin Lys

Arg Gly Tle Val. Glu Gin Cys Cys Thr Ser Tle Cys Ser Leu Tyr

Gin Leu Glu Asn Tyr Cys Asp (Sekvence id.č.:11 ), Lys (B3), He (B28), Asp (A21 )preproinsulín.

K přípravě derivátu insulinu s aminokyselinovou sekvencí podle Sekvence id.č.:3 je výhodně použit prekurzor derivátu inzulínu se sekvencí:

Met Ala Thr Thr Ser Thr Gly Asn Ser Ala Arg

Phe Val Lys Gin His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu

Tyr Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Glu Thr

Arg Arg Glu Ala Glu Asp Pro Gin Val Gly Gin Val Glu Leu Gly

Gly Gly Pro Gly Ala Gly Ser Leu Gin Pro Leu Ala Leu Glu Gly

Ser Leu Gin Lys Arg

Gly Tle Val Glu Gin Cys Cys Thr Sey Tle Cys Ser Leu Tyr Gin

Leu Glu Asn Tyr Cys Asn (Sekvence id.č.: 6), Lys (B3), Glu (B29)-preproinsulín.

K přípravě derivátu inzulínu s aminokyselinovou sekvencí podle Sekvence id.č.:5 je výhodně použit prekurzor derivátu inzulínu se sekvencí:

Met Ala Thr Thr Ser Thr Gly Asn Ser Ala Arg

Phe Val Lys Gin His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu

-13Tyr Arg Gly Ser Gly Leu

Leu Val

Arg Gly Leu Tle Glu

Glu Pro Gin Val Asn

Cys Ala Gly Lys

Gly Glu Ala Arg

Glu Asp Gly

Pro

Ser

Sly Phe Phe Tyr i_{le Pro}

Gin

Leu

Val

Gin

Gly Gin

Pro Leu

Val

Ala

Lys Thr

Glu Leu

Leu Glu

Gly

Gly .

Glu Gin Cys

Tyr (Sekvence id.č

Cys Asn ’ θ) , Lys

Cys

Thr

Ser

He Cys

Ser

Leu Tyr

Gin (B3),

He (B27) -preproinsulin.

^K Přípravě derivátu sekvencí podle sekvence id.č.·4 _1ederivátu inzulínu se sekvenci:

inzulínu ^s aminokyselinovou výhodně použit prekurzor

Met Ala Thr Thr Ser Thr

Phe Vai Lys

Gly Asn

Tyr

Arg

Ser

Gly Leu

Leu Arg Gly Leu

Ile

Glu

Val

Glu Pro Gin Val Asn

Gin His Cys Gly Ala Glu Gly Ala

Leu

Glu Asp

Cys Arg Pro Ser

Gly Gly Gin

Leu

Lys

Arg

Glu Gin Cys

Cys

Tyr

Cys Asn (Sekvence id.č..-7), _lys

Vynález rovněž derivátu Sekvence sekvence systémy, inzulínu, id.č. : 6, i Ser ' Ser

Phe

Val .Gin

Ala

His

Phe

Pro

Arg Leu Tyr Gin Leu

Val

Thr

Val

Ala

Glu

Tle

Glu

Ala Leu

Lys Thr

Leu

Leu Glu

Gly

Thr Ser

Me Cys

Ser

Leu Tyr

Gin (B3), popisuje

He (B28)-preproinsulin.

totiž ne„t o Prekurzory výhodného

Peptidy podle Sekvence id č -u ld.č.:7 a ’

Sekvence

DNA, které kóduji

Sekvence id.č které obsahují vzpomínané prekurzory,

8;

tyto dna sekvence hostitelské buňky, které jsou transf systémem. formovány tímto expresní jakož i expresním errvatu inzulínu podle Vzorce I _SB -

Senovými technikami prostřednictvím cíl ^{PraVU3i hla}™« způsobů známých ze stavu techniky. ““tageneze pomoci

Pro požadovaný derivát- in„ t~ struktura, která e X “ ¹

P°te exprimována v hostitelské

-14buňce, výhodně v bakterii E. coli nebo v kvasince, zejména v kvasince Saccharomyces cerevisiae. V případě kdy genová struktura kóduje fúzní protein, je z něho uvolněn derivát inzulínu podle Vzorce I; analogické způsoby jsou popsány například v EP-A-0 211 299, EP-A-0 227 938, EP-A-0 229 998, EP-A 0 286 956 a v DE-patentové přihlášce číslo P 38 21 159.

.Odštěpení fúzní části proteinu po rozbití buňky může být realizováno chemicky halogencyanem (viz. EP-A-0 180 920) .

Při výrobě derivátu inzulínu prostřednictvím preproinzulínového prekurzoru, který obsahuje část fůzniho proteinu (presekvence) podle US 5,358,857 dochází k odštěpení fúzní části v dalším kroku spolu s odštěpením Cterminálniho peptidu.

Inzulínový prekurzor je dále podroben oxidační sulfitolýze podle metody popsané například R.C. Marshall a A.S. Inglis v Practical Protein Chemistry - A Handbook (vydavatel A. Darbre) 1986, strany 49 až 53 a následně je v přítomnosti thiolu renaturován za tvorby požadovaných disulfidických můstků způsobem popsaným například G.H. Dixon a A.C. Wardlow v Nature (1960), strana 721 až 724.

Inzulínový prekurzor může být složen také přímo, viz EP-A-0 600 372;. EP-A-0 668 292.

C-terminální peptid se odstraní štěpením trypsinem například způsobem popsaným v Kemmler a další, J.B.C. (1971), strana 6786 až 6791 a derivát inzulínu Vzorce I je přečištěn prostřednictvím známých technik, například chromatograficky viz EP-A-0 305 760 a krystalizací.

V případě, kdy je n ve Vzorci II rovno nule, štěpení trypsinem slouží k rozštěpení peptidové vazby mezi řetězcem

A a B.

V tomto způsobů konči řetězec B na C-konci argininem nebo dvěma argininovými zbytky. Ty mohou být odstraněny prostřednictvím karboxypeptidázy B.

Inzulínový derivát podle vynálezu má plnou biologickou aktivitu. To bylo prokázáno prostřednictvím intravenózní aplikace na králíkům a z poklesu glukózy v jejich krvi (Přiklad 5 a 6).

Rychlejší nástup účinku inzulínového derivátu po subkutánní aplikaci byl prokázán euglykemickou clamp technikou na hladovějícím psovi (Příklad 7). Bylo podáváno 0,3 lU/kg derivátu inzulínu a jako referenční preparát byl * použit lidský inzulín. Při clamp technice je po aplikáci inzulínu v krátkých časových intervalech, měřená hladinaglukózy v krvi a stejné množství glukózy je aplikováno, aby se kompenzoval její pokles. Výhodou metody je, že u zvířat henastupuje genová regulace, která by se dala očekávat v případě rychlého úbytku krevní glukózy po podání inzulínu. Množství a časový průběh glukózy podané infuzí, charakterizují působení inzulínu. Inzulíny Lys(B3), Glu(B29)- (Sekvence id.č. : 3) a .Lys (B3), lie (B28)- (Sekvence íd.č.:4) vykazují zřetelně rychlejší zažátek působení než lidský inzulín. K maximálnímu účinku (infúzní rychlosti glukózy) je dosaženo s lidským inzulínem 100 minut po aplikaci zatímco s inzulínem Lys(B3),Glu(B29)— (Sekvence id.č.:3) 80 minut a s inzulínem Lys (B3), He (B28) - (Sekvence id.č.:4) již po 60minutách. Proto by měla tato analoga lépe kompenzovat postprandiální nárůst glukózy v krvi než lidský inzulín, když se aplikují krátce před jídlem.

Popsané inzulínové deriváty jsou vhodné k terapii diabetes mellitus typu I jakož i typu II zejména ve spojení s bazálním inzulínem.

-16Vynález a/nebo jeho ; výrobě farma/ ^{Se Proto} také týká

Přijatelné' soli použiti derivátu inzulínu začátek působeni.

Přípravku, podle Vzorce I k který vykazuje rychlý

Jako fyziologicky nášené nosné médium nezávadné a j θ vhodný ^{S in2u}ímovým derivátem sterilní například qlukózv ítotonický vůči krv! ^kUChyňské

Prostředek jako j_{e n} .. ^také kyselinu V Wriklad fenol, ^y my P“bydroxy_benzoové. _Νο,_ηέ obsahovat p_Uf_r Nosné například acetát sodný, ^K nastavení οΗ (obvykle HC1) _Popf_{ipads χ} ^eliny obsahovat ionty zinku. ’ ^Ρί1Ρ««<< může dále vodní roztok solí, obsahuje

N-kresol médium který j_ekonzervační nebo ,ester sodný.

může navíc citrát sodný, fosfát

Přípravcích

Deriváty inzulínu mohou být použity ve farm ^{Ve f0}“^{ě je}3ich fyziologicky přijateinT^ ⁷ ťiijatelnych solí,

Jako jsou soli amonné nebo alkaH d nebo několika derivátů inzuK„_{u D}í ^d“ Í^noho inzulínu podle Vzorce I mohou θ ^{1 der}ivát «mto derivátů i„_2Ui_in:--- -·· navzájem směsi dalších rozpuštěné, amorfní a/_nebo nezávisle, _v ^v krystalické formě.

Někdy j _e výhodné st _b ,^{U POdle} ^“θ²“ ^PřidatstabilizátorUj který zabr.ni . “'^'“-“eohanické námaze různými materiály. Takovéto ^DE-* 32 « 177 neb0 ^V P^atentech _EP-a-1₈₆₀₉

Patřičné množství vhodného . proteinů _při

Přípravku _při kontaktu s stabilizátory _{jsou napf}._klad

Vynález dále obsahuje alespoň fyziologicky rozpuštěné,

PoPtsuie farmaceutický přípravek, _ktγ-at inzulínu a/nebo j^ ^{S POdle}/²°rce j, _{2ejména v}- ické formě.

jeden přijatelnou amorfní a/nebo krystal

-17Derivát inzulínu podle vynálezu se vyznačuje rychlým začátkem působení. V praktické inzulínové terapii je podle okolností vhodné rychle působící inzulín smíchat s přípravkem, který obsahuje depotní pomocnou látku (např. NPH-inzulín). Následkem toho je podle složení přípravku jeho profil účinku složen z profilů' jednotlivých komponent, jestliže jsou jednotlivé komponenty směsi stabilní a navzájem se neovlivňují. Při smíchání inzulínového derivátu s lidským NPH-inzulínem se však dá očekávat, že zejména při dlouhodobém skladování dochází k výměně mezi rozpuštěným derivátem a krystalickým NPH-inzulínem. Proto může být farmakodynamika depotního inzulínu jakož i rozpuštěného inzulínu s rychlým pozměněna nepředvídatelným způsobem. Proto je vhodné připravit rychle působící derivát s použitím depotní pomocné látky - jako je například NPH-inzulín. Tato depotní forma inzulínového derivátu může být libovolně míchána s rozpuštěnou rychle působící formou bez toho, aby se složení jedné nebo druhé formy v průběhu skladování měnilo.

Ačkoli vynález popisuje především rychle působící inzulínový derivát, zahrnuje také možnost připravit tento derivát pro lepší mísitelnost jako depotní formy, přičemž se jako depotní pomocná látka používá zejména aprotaminsulfát a inzulínový derivát a/nebo jeho fyziologicky přijatelná sůl se pak převede na kokristalickou formu s protaminsulfátem.

Vynález dále popisuje injikovatelný roztok, který obsahuje farmaceutické přípravky podle vynálezu v rozpuštěné formě.

-18Příklady provedeni vynálezu

Přiklad 1: Konstrukce proinzulínu Lys (B3) jako východisko pro plazmidy podle příkladů 2 až 4

V patentu Spojených států US 5,258,857 je popsán vektor pINT 90d jakož i PCR priinery Tir a Insu 11, Tyto komponenty slouží jakožto výchozí materiál pro konstrukci plazmidu pINT 125d, který kóduje požadovaný proinzulín Lys (B3). Dodatečně byl syntetizován primer Insu 35 se sekvencí:

5' TTT GTG AAG CÁG CAC CTG 3' a primer Insu 36 se sekvencí:

5' CAG GTG CTG CTT CAC AAA 3'.

Poté byla provedena jedna PCR reakce pomocí primerů Tir a Insu 36 a druhá PCR reakce za použití primerů Insu 11 a Insu 35. Jako templát byl využit plazmid pINT 90d.

Produkty obou reakcí jsou navzájem částečně komplementární takže je lze použít jako templáty pro další. PCR reakci s primery Tir a Insu 11. Produktem této reakce byl sjednocený fragment kódující variantu proinzulínu, která obsahuje v pozici 3 řetězce B aminokyselinu lysin. Tento PCR fragment byl poté přečištěn ethanolem, vysušen a poté se naštěpen restrikčnimi enzymy Ncol a Sail. Reakční směs byla po restrikci elektroforeticky rozdělena a byl vyizolován požadovaný fragment Ncol/Sal 1.

V citované přihlášce je popsána plazmid pINT 91d, který kóduje mini-proinzulín. Sekvence kódující miniproinzulín byla vyštěpena pomocí restrikčních enzymů Ncol a Sall a byl vyizolován zbývající plazmid. Do tohoto plazmidu byl vložen Ncol/Sall PCR fragment pomocí T4 ligázy za vzniku plazmidu pINT 125d. Tímto plazmidem byly transformovány bakterie E.coli K12, namnoženy a plazmid opětovně

-19'vyizolován. Struktura plazmidu byla překontrolována pomoci DNA-sekvenování a restrikční analýzy. Po této analýze byla DNA plazmidu pINT 125d použita jako templát pro vložení dalších mutací do této varianty genu pro proinzulín.

Příklad 2: Konstrukce proinzulínu Lys (B3) Glu (B29) Pro přípravu mutovaných proteinů byly nasyntetizovány dva primery: primer 329 se sekvencí

5' TTC TAC ACA CCC GAG ACC CGC GGC ATC G - 3' a primer 329b se sekvencí

5' GCC GCG GGT CTC GGG TGT GTA GAA GAA GC 3'

Jako templátu bylo použito DNA z plazmidů pINT125d a pINT91d. Primer 329a byl použit v PCR reakci spolu s primerem Insu 11 a plazmidem pINT 91d jakožto templátem a primer 329b byl použit v další PCR reakci s primerem Tir (viz příklad 1) a plazmidem pINT 125d. Vzhledem k tomu, že jsou oba produkty částečně komplementární, lze je spojit v další přímé PCR reakci s primery Tir a Insu 11. Vzíklý fragment DNA kóduje protein s požadovanou mutací. Tento fragment byl poté naštěpen enzymy Ncol a Sall a vzniklý Ncol/Sall fragment byl pomocí T4-ligázy vložen do zbytkového plazmidu pINT 91d.

Tímto postupem byl vytvořen plazmid pINT 32 9, který byl po amplifikaci v E.coli .kmene K12 podroben sekvenční a restrikční analýze, čímž byla ověřena jeho struktura.

Derivát proinzulínu kódovaný tímto plazmidem je charakterizován jak výše uvedenou záměnou aminokyselin tak i C-spojovacím peptidem, který sestává z argininu.

-20Přiklad 3: Konstrukce proinzulínu Lys (B3) n_e (B27)

Konstrukce tohoto proinzulínu byla provedena způsobem popsaným v předešlém přikladu s tím, že bylo použito následujících párů primerů:

primer KB3 JB 27A se sekvencí

5' TTC TAC ATC CCC AAG ACC CGC CG 3' spolu s primerem Insu 11 a primer K B3 J 27B se sekvencí

CTT GGG GAT GTA GAA GAA GCC TCG 3' spolu s primerem Tir.

Jako templát posloužil v obou PCR reakcích plazmld PINT 125d. Produkty obou reakci byly spojeny třetí PCR reakci tak, jak bylo popsáno v příkladu 1 a vzniklý produkt byl nakloňován do plaznidu obdobným způsobem za vzniku plazmidu pINT332.

Přiklad 4: Konstrukce proinzulínu Lys (B3) He (B28)

Konstrukce tohoto proinzulínu byla provedena způsobem popsaným v příkladu 3 s tím, že bylo použito následujících páru primerů:

primer KB3 JB 28A se sekvencí

5' TAC ACA ATC AAG ACC CGC CGG GAG - 3’ spolu s primerem Insu 11 a primer KB J B28B se sekvencí

GGT CTT GAT TGT GTA GAA GAA GCC TCG - 3' spolu s primerem Tir.

Způsobem obdobným výše popsanému byl vytvořen plazmld pINT

-21plazmidů obsahující

Přikladu 4 variant ln_zulinu

Bakterie E. _Coli kmene K12 bylv r

PINT 329, 332 a 3«^bYiy pomoci

Půldslušné · ^Re»™»bin_antni

Patentu SpojenýcTstLů ^kUitÍVOVány bakterie

Příslušných

Požadované výchozí variant inzulínu.

číslo 5227293.

suroviny _pro podle

Tak byly ^výrobu

Příklad 5:

Konstrukce

Asp (A21)

Proinzulínu ^L¥^s (B3), n_e (028), ,

Konstrukce tohoto

Popsaným v příkladu 3. jakožto templát proinzulínu připravený následující

Místo „1 ^Pr°^Vedena ^Působě® ^to Plazmidů piNT ,

Pro PCR reakci „ - ^bVl _p ^{1 P}°^UZlt P^zmid _{pINT 333}vloženi mutace _byly ^v Příkladu 4. primery;

primer P-pint365 ^a primer Tin.

CTACCAGCTG-3'

Vzniklý plazmid byl označ* °2nacen piNT 365.

Příklad 6;

Cas [h]

P° íntravenózni aplL™^ ' ^{G1U ÍB29}»

0,25 0,5 0,75

1/5

Lidský inzulín

100

89,17

67,56

73,24

73,13

78,12

Insulin ^Ζ^Β3^οΐΜΒ29)

100

89, 47

58, 32

66, 59

68,21 ______71, 95

^Cas Lidský ------inzulín ² 89, 47 ³. 107,01 --L 104,55

inzulín —-ΙΎ⁵ ÍB3) ,Glu(B29) 80, 88 94,2 ___ 99,78

® králíků obdržel π ^d4vce 0,2 _Iu/ka „ ... ^lntravenózně uvedeních v ^PrUb6h“ Sledujících uveaenych okamžicích uvedený inzulín v čtyř hodin byly byly vztahovány k stanovovány koncentrace krevní hodnoty nevykazují

Počáteční hodnotě žádné významné v čase 0.

glukózy Průměrné

G1u(B29) .

^mezi lidským inzulínem _a rozdíly biologické · inzulínem Lys(S3),

Příklad 7:

. - ^ivita inzulínů Lys(B3) Lys(B3),ii_{e(B28J po} . ^y ; ^'^(827) _akrálíkovi ravenozní aplikaci uvedených okamžicích a byly vztahovány k hodnoty nevykazují ⁶ králíků obdrželo intravo - — - :

_žá , , ^{case ϋ}· Průměrné aktivrty mezí lidským inzulíne^“ ^bÍ01°^ké a Lys(B3), Ile(B28j. Muliny Lys (B3), He (B27)

Cas [h]	Lidský inzulín	ΙηζΈϊίΓΐ^ΒΤΤΓ Ile(B27) 100	~Inzulín Lys(B3)”
0	100	Ile(B28)
0,33 0, 66	67,8 54,9	62, 6 60, 6	100 63,3
1	55, 2	66, 8	55, 8
_1,5	63	79,2	59, 3
		_______66, 7

~23~

Čas [h]	Lidský inzulín	Inzulín Lys(B3) Ile(B27) 90, 9	, Inzulín Lys(B3),
2	77,8	Ile(B28) 81, 6
3	91,5	96, 3	97,2
4	99, 5	96
		101,6

Příklad 8:

Farmakodynamika inzulínu L_ys(B3),_{Glu (}Lys (B3),n_{e (B28) po subkutánn}. _apl._kac. psího organismu a do podána dávka o 3 ιυ/Τ ^{lnzUlin) b}y^la subkutánně ££ /X ’'“™ “·> »1«.’

		Φ o •H	>0) XJ 0 XI	L0 ΙΏ	σι	CM O
P		c	a	ο	ο
'Ctí	Φ	M	j—\|
>	M	>Φ	44	ο	ο	o
Ή	'Φ	g	c	I	1	1
μ	44	ca	Ή
(D	'Φ		>
Ό	C
Ή	a o	Ό O
α	ω	Λ
Oj	φ
Ό Μ T	CO	c	β	co		^r
po kói n=		X Φ	{mi	ιΓ)	12	10
o		I \|
		Ψ4
0 _L „ rn		£
ří		i—l
(D
d f- 3 o <n ň ii a 5	X CO Ξ -M	c H g		100	80	60
;h Ln t : v
icic i úč: ?hlos tánně		Φ	>φ Ό 0
.adově j rychlýn ícího ryc kg subku	fáze	Směrnic	Ό 44 α -Η	ο	0, 227	0,267
	'Γ0		>
d _m í? o	β
^w > -	a
-í Ό £ 0 ⁿ	2 a	Ό
> $ o	es	0 Λ
glukóz inzulj profilu ila 1 x	N >	nflexni	(min)	43	33	16
> C		H
Ή Μ 'Η
U r>
(tí £ OJ
kl				4J
P >				ω		s.
C r? zť cti Q				£ ο φ	(Β3	B3)
U c 0 34 d	Preparát			0 Μ Η	Lin Lys Glu(Β29)	lin Lys( He (B28)
><D Λ				C Ή	zuJ	lZU
•2				1 Μ	In	G H
04

i glukózy oi.r’ SEM

;! ! s S ^{5 s §} — S 3 8 odooeoQoooodóooooo 6

ε φ 22 C	3) ilrace krevní mmi orůměr 1	^π d π π d d d d d d d d d d π d H
o '3 Ě	[B3). lte(B2l konce* Čas Min	11___________________1 150 155 160 165 170 175 180 185 100 195 200 205 210 215 220 225 230 235 240
rychl SEM)	inzulín Lysí jlukózy in’.kg'¹I SEM	L’ ’^s ^{3 š s} — s - í ^{0 0 0 0} oooooooa - 6 d d 6 d ó
inu s iměr ±	lost infuze t mg.m průměr I	s 3 s s S S E s 2 s S 3 ; n S 2 3 s _ _π T _π «οι--o - - d d d d d d d d d
□ N 3 c	rych Čas Min	S S S $ P £ 555 £ S g s* - - » _s o
ní derivátů 1	29) ntrace krevní glukózy mmol.r’ průměr I SEM	° o ° d ddddddddddddddd
I 3.82 3.71 3.81 3.67 3.81 3.83 3.75 3.85 3 .78 3.81 3.88 3.85 3.85 3.85 3.87 3.85 3.72 3.74 3.56
) podá ě v t=C	[B3), Glu(B: konce Čas Min	? ® 2 S S S S S § 8 § g ° S U § 3 ?
psů pc >kutánni	Inzulín Lys ( glukózy lín¹.kg'¹\| SEM	° ^q ** ° ° o o b ó 6 a ó g ó o q q 6
iných /kg sut	ilost infuze i mg.rr průměr
u 1 ač 0, 3 IU	rych Čas Min	151 156 161 166 171 176 181 186 191 196 201 206 211 216 221 226 231 236 240
.ukózy la 1 x	i glukózy ιοΙ.Γ' I SEM	S S Ϊ : s : g ; _{3 §} 3 : 2 2 _{s s} ^{0 0 0} ° ° o d d d d d d d d d d d d d
ací gl ka činí	itrace krevn mrr průměr	8 8 5 3 £ 5 2 S ” 5 5 g 8 3 tg ₅ g
Li > ii ^rg c ^Q 0) 0 :	i noecnst koncer Čas Min	149 154 159 164 169 174 179 164 109 194 199 204 209 214 219 224 229 234 239
C O * .! .a ¹ ►Φ	lukózy níkg’’ SEM 1 - - -	° ° o-o oddóódódódd
£ 3 Cli	^m ě — 41 _ Ň CB -® Ž M
	rychli Čas Min 1 l£l	* W 1 156 161 166 171 176 101 106 191 196 201 206 211 216 221 226 231 236 L ²⁴⁰

Průběh koncentrací glukózy u hladovějících psů po podání derivátů inzulínu s rychlým účinkem

Dávka činila 1 x 0,3 lU/kg subkutánně v t=0 formát dat(průměr ± SEM)

Rychlost infuze glukózy (mg.min’¹.kg'¹)

5.5 p----------;--_y-;-._;-y^^^^ • H-InsuŠnHóečhšt

5.0 4-)-)-.)-.:-)-:-)-)-)-4.:-:-)...)-4

4.5 14.4..4.4..).4...4.44..4.4.4..4 ⁴·°

3.5 1.1-4-(-:-4 ..1..1..:..1 -1-).-)-44-)...:

3.0 14.4..)...).4-4-).4.-44-)-44.4.4..)

2.5 i-.)-)-)-)-)-.)-)-)-)4-)-)2.0 u h i. i, ·ί. i i. i 1...1. i. i i i i i i

5.5 _r-----------------------) )LýsíB3),Glů(B29)-lhsulih )

5.0 4.-:---:-:-).4-----)-)-:-:-)-)--:-)

4_₅ I..;...)..)...)...)...;..!...;...)..)...!..)...)..)...)...)

3.0 I..)...).!-.)...).-).!.-)-.)-.)-;.-)...).!...)...:

2.5 1-ί-;-ί-ϊ··4-.;-.;.-;-ί...:... i. 44-4

2.0 i-->--i-I-i-i...i......ί .Li..1-1..i i i._.i_i

Minut

5.5

5.0 ) Lys(B3),lte(B28HnSulin) )

4.5 i-!

4,0

3.5

3.0

2.5 .)-4-)-)-)-)-)-4-)-)-.)-)-4-)-4-4-)

2.0 li i i i i i i i i i i

30 60 90 120 150 180 210 240

Minut

-28INFORMACE O SEKVENCI ID. Č. 1:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 21 aminokyselin!

(B) TYP: aminokyselina (C) POČET VLÁKEN: jedno (D) TOPOLOGIE: lineární (íi) TYP MOLEKULY: protein (ix) CHARAKTERISTICKÉ RYSY;

(AJ JMÉNO/KLÍČ: protein (B) UMÍSTĚNÍ: 1 až 21 (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE ID.Č: 1

Gly lie Val Glu Gin Cys Cys Thr Ser lie Cys Ser Leu Tyr Gin Leu ¹⁰ 15

Glu Asn Tyr Cys Asn 20

INFORMACE O SEKVENCI ID. Č. 2:

(1) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 30 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) POČET VLÁKEN: jedno (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: protein (íx) CHARAKTERISTICKÉ RYSY:

(A) JMÉNO/KLÍČ: protein (B) UMÍSTĚNÍ: 1 až 30 (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE ID.Č: 2

Phe Val Asn Gin His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr ¹⁰ 15

Leu Val cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys Thr ²⁰ 25 30

-29INFORMACE O SEKVENCI ID. Č. 3:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 30 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) POČET VLÁKEN: jedno (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: protein (ix) CHARAKTERISTICKÉ RYSY: (A) JMÉNO/KLÍČ: protein (B) UMÍSTĚNÍ: 1 až 30 (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE ID.Č: 3

Phe Val Lys Gin His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr

10 15

Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe· Phe Tyr Thr Pro Glu Thr 20 25 30

INFORMACE O SEKVENCI ID. Č. 4:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA:. 30 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) POČET VLÁKEN: jedno (D) TOPOLOGIE: lineární (íi) TYP MOLEKULY: protein (ix) CHARAKTERISTICKÉ RYSY: (A) JMÉNO/KLÍČ: protein (B) UMÍSTĚNÍ: 1 až 30 (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE ID.Č: 4

Phe Val Lys Gin His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr 15 10 15

Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe 20 25

Tyr Thr lie Lys Thr • 9

-30INFORMACE o SEKVENCI ID. č. 5 (i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 30 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) POČET VLÁKEN: jedno ÍD) TOPOLOGIE: lineární ^{(ÍÍ) TYP} MOLEKULY: protein (1X) CHARAKTERISTICKÉ RYSY;

(A) JMÉNO/KLÍČ: protein (B) UMÍSTĚNÍ: 1 _ag 3₀ ^{ÍXÍ) P}°^PIS DĚVENCE: SEKVENCE ID.Č: 5

Phe Val Lys Gin His Leu Cys Gly _{Ser His Leu w} v_al Cys Gly Glu Gly _{Phe phe Tyr}

Ala Leu Tyr 15

Thr

INFORMACE O SEKVENCI ID. Č. 6 (1) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 97 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) POČET VLÁKEN: jedno (D) TOPOLOGIE: lineární (H) TYP MOLEKULY: protein (ix) CHARAKTERISTICKÉ RYSY:

(A) JMÉNO/KLÍČ: protein (B) UMÍSTĚNÍ: 1 _až 97

	(Xi) POPIS SEKVENCE:	SEKVENCE ID.Č	: 6
Met 1	Ala Thr Thr Ser Thr 5	Gly Asn Ser	Ala Arg Phe Val 10
Leu	Cys Gly Ser His Leu 20	Val Glu Ala 25	Leu Tyr Leu Val
Arg	Gly Phe Phe Tyr Thr 35	Pro Glu Thr 40	Arg Arg Glu Ala 45

lys Gin His 15

Cys Gly Glu 30

Glu Asp Pro

Gin Val Gly Gin Val

Gin Pro Leu Ala Leu 65

Gin Cys Cys Thr Ser 85

Asn

Glu Leu Gly Gly Gly Pro Gly Ala Gly Ser Leu ⁵⁵ 60

Glu Gly Ser Leu Gin Lys Arg Gly He Vai Glu ⁷⁰ 75 ₈₀

He Cys Ser Leu Tyr Gin Leu Glu Asn Tyr Cys 90 ας

INFORMACE 0 SEKVENCI ID. Č. 7:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 97 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) POČET VLÁKEN: jedno (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: protein (ix) CHARAKTERISTICKÉ RYSY:

(A) JMÉNO/KLÍČ: protein (B) UMÍSTĚNÍ: 1 až 97 (Xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE ID.Č: 7

Met Ala Thr Thr Ser Thr Gly Asn Ser Ala Arg Phe Val Lys Gin His ⁵ 1015

Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr Leu Val Cys Gly Glu ²⁰ 2530

Arg Gly Phe Phe Tyr Thr He Lys Thr Arg Arg Glu Ala Glu Asp Pro 55 4045 ^Gln Gly Gin Val Glu Leu Gly Gly Gly Pro Gly Ala Gly Ser Leu ^ou -5560

Gin Pro Leu Ala Leu Glu Gly Ser Leu Gin Lys Arg Gly He Val Glu ⁷⁰ 75

Gin Cys Cys Thr Ser He Cys Ser Leu Tyr Gin Leu Glu Asn Tyr Cys ⁸⁵ 9095

Asn

-32TNFORMACE o SEKVENCI ID. Č. 8' ^U) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 97aminokyselin (B) TYP: aminokyselina ^{(C) P0ČET} VLÁKEN: _jedno (OJ topologie: i_ineárni ^{fll) TYP M}°LEKULY: protein ^(ix) charakteristické rysy:

(A) JMÉNO/KLÍČ: protein (B) UMÍSTĚNÍ; 1' _ag ₉₇ ^P°^PIS SEKVENCE: SEKVENCE _I0.č: _a

Met 1

Ala Thr

- - »· «

Leu

Cys Gly

Jer His Leu Val Glu Ala Leu

Tyr Leu Val Cys Gly Glu

Arg Gly Phe

Phe Tyr Tle _Pro Ly_s

Thr Arg Arg Glu Al_{a Gltl PrQ}

Gin Val Gly 50

Gin Val Glu

Leu 55

Gly

Gin 65

Pro Leu

Ala Leu

Glu 70

Gly

Gin

Cys Cys

Thr Ser lie

Asn

Gly Gly Pro Gly

Ser Leu

Gin

Lys 75

Ala

Gly

Cys Ser Leu

Tyr 90

Gin

Leu

Gly Ser Leu

Tle Val Glu

Glu Asn Tyr Cys 95

INFORMACE O SEKVENCI ID. Č. 9· ^(Í)- CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 21 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (O POČET VLÁKEN: jedno (Ο)’TOPOLOGIE: lineární

TYP MOLEKULY: protein (ix) CHARAKTERISTICKÉ RYSY;

(A) JMÉNO/KLÍČ: protein “33- (B) umístění. 1 _{až 21} ^{Ixil POP1S SEKV}™^ SEKVENCE _{ID δ; 9} l^{ly G1}“ «η Cys Cys

G1U Asn Tyr Cys Asp 20

Thr Ser ll_e ^{CyS Ser Leu} Tyt Gin Leu 15

INFORMACE o

SEKVENCI ID. č. 10:

CHARAKTERISTIKA (A) (B)

SEKVENCE:

D£lkA: 30 anúnok_y3ei_inTYP: aminokyselina (O POČET VLÁKEN: _jedno

TOPOLOGIE: l_ineárni

Phe (xi) Val

TYP MOLEKULY: _protein charakteristické rysy(A) JMĚNO/KLÍČ: p_rotein ^ÍB) ÚSTĚNÍ: 1 až 3₀ ^P°PIS SEKVENCE’ Lys

Gin

Nis Leu 5

Leu

Val

SEKVENCE id.Č: iq Cys Gly _Ser _{His Leu}10 ^val Glu Ala

Cys fo^y °¹“ ^G1* ae Phe Tyr _Thr

Leu Tyr 15 informace o SEKVENCI ID. č. 11

CHARAKTERIstjka SEKVENCE· ÍA) délka, ₉₇ ami_n<,k_yselin

YP- aminokyselina °' ^POeET jedno ^TOP°tOGI_E; l_ineám (B) (xi) m MOLEKULY; _proteinCHARAKTERISTICKÉ RYSY;

(A). JMÉN_0/Kllč. _prote._n <B) UMÍSTĚNÍ; 1 _{ai 97} ^SE™«; SEKVENCE _ID._e: „

Ile Lys Thr 30

-34Met Ala Thr Thr Ser Thr Gly Asn Ser Ala Arg Phe Val Lys Gin His 15 1015

Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr Leu Val Cys Gly Glu 20 2530

Arg Gly Phe Phe Tyr Thr lie Lys Thr Arg Arg Glu Ala Glu Asp Pro 35 4045

Gin Val Gly Gin Val Glu Leu Gly Gly Gly Pro Gly Ala Gly Ser Leu 50 5560

Gin Pro Leu Ala Leu Glu Gly Ser Leu Gin Lys Arg Gly lie ValGlu

70 7580

Gin Cys Cys Thr Ser lie Cys Ser Leu Tyr Gin Leu Glu Asn TyrCys

9095

Claims

PATENTOVÉ NÁROKY

Derivát inzulínu nebo jeho fyziologicky přijatelná sůl, kde aminokyselina asparagin (Asp) v pozicí B3 řetězce B je nahrazena přirozeně se vyskytující bazickou aminokyselinou a alespoň jedna z aminokyselin v pozicích B27, B28 nebo B29 řetězce B je nahrazena jinou přirozenou neutrální nebo kyselou aminokyselinou přičemž může být rovněž asparagin v pozici A21 řetězce A nahrazen aminokyselinami Asp, Gly, Ser, Thr nebo Ala a aminokyselina fenylalanin (Phe) v pozici B1 řetězce B a aminokyselina v pozici B30 řetězce B mohou zcela chybět.

Derivát inzulínu nebo jeho fyziologicky přijatelná sůl podle nároku 1, obecného vzorce I í í (A1-A5)-Cys-Cys-A8-A9-A10-Cys-(A12-A19)-Cys-A21

I I

S--------S s_______S

Bl-Val-B3-Glu-His-Leu-Cys-(B8-B18) -Cys-(B20-B26)-B27-B28-B29-B30 kde (A1-A5) jsou aminokyselinové zbytky v pozicích AI až A5 řetězce A lidského nebo zvířecího inzulínu (AI
2-AI 9) jsou aminokyselinové zbytky v pozicích A12 až A19 řetězce A lidského nebo zvířecího inzulínu ^A21 Asn, Asp, Gly, Ser, Thr nebo Ala

-36(B8 B18) jsou aminokyselinové zbytky v pozicích B8 až

B18 řetězce B lidského nebo zvířecího inzulínu (B20-B26) jsou aminokyselinové zbytky v pozicích B20 až B26 řetězce B lidského nebo zvířecího inzulínu

A8,A9,A10 jsou aminokyselinové zbytky v pozicích A8

4 A9 a A10 řetězce A lidského nebo zvířecího inzulínu

B30 je OH nebo aminokyselinový zbytek v pozici B30 řetězce B lidského nebo zvířecího inzulínu

B1 je zbytek aminokyseliny fenylalaninu (Phe) nebo vodíkový atom

B27,B28 a B29 jsou aminokyselinové zbytky v pozici B27, B28 a B29 řetězce B lidského ,nebo zvířecího inzulínu nebo vždy jeden jiný přirozeně se vyskytující aminokyselinový zbytek, přičemž vždy alespoň jeden ze zbytku v pozicích B27, B28 a B29 řetězce B je nahrazen přirozeně se vyskytujícím aminokyselinovým zbytkem který je vybrán ze skupiny tvořené neutrálními nebo kyselými aminokyselinami.

Derivát inzulínu nebo jeho fyziologicky přijatelná sůl obecného vzorce I podle nároku 2, ve kterém

A8 je alanin (Ala),

ΑΡ- je serin (Ser),

ΑΙΟ je valin (Val) a

B30 je alanin (Ala).

378.

4.

5.

6.

Derivát inzulínu _{nebo jehQ fyzl přijatel} nároku 2, ve kterém P^iatelna podle

A8

A9

A10

Derivát sůl

Je threonin (Thr), je serin (Ser) a je isoleucin (lie). znamená al_anin _(Aia). ' ” ^ttereffl

Derivát inzulínu nebo jeho v

Podle nároku 4 obecného vzorce I Ze - vzorci !. znamená _threonin sůl

B30 sůl

B30 sůl znamenají ' sterem symboly (A1-A5) (AI 2-AI 9) (B8-B18) (B20-B26)
3SOU aminokyselinové zbytky v pozicích AI až “ retezce A lidského inzulínu jsou aminokyselinové zbvtkv v =7 _Δια - ^yrKy v pozicích A12

A19 retezce A lidského inzulínu

3 sou aminokyselinové zbytky ^B1« řetězce B lidského inzulínu

3sou aminokyselinové zbytky až B26 řetězce inzulínu ^B lidského ^v pozicích B8 až nebo zvířecího v pozicích B20 nebo zvířecího

Derivát inzulínu nebo jeho podle alespoň jednoho z fyziologicky nároků 1

Přijatelná sůl

7, ve kterém

-38aminokyselinový zbytek v pozici B1 řetězce B je zbytek aminokyseliny fenylalaninu (Phe).

9. Derivát inzulínu nebo jeho fyziologicky přijatelná sůl podle alespoň jednoho z nároků 1 až 8, ve kterém aminokyselinový zbytek v pozici B3 řetězce B je zbytek aminokyseliny histidinu (His), lysinu (Lys) nebo argininu (Arg) .

10. Derivát inzulínu nebo jeho fyziologicky přijatelná sůl podle nároku 9, ve kterém aminokyselinový zbytek v pozici B3 řetězce B je zbytek aminokyseliny histidinu (His).

11. Derivát inzulínu nebo jeho fyziologicky přijatelná sůl podle nároku 9, ve kterém je aminokyselinový zbytek v pozici B3 řetězce B zbytkem aminokyseliny argininu (Arg) .

12. Derivát inzulínu nebo jeho fyziologicky přijatelná sůl podle nároku 9, ve kterém je aminokyselinový zbytek v pozici B3 řetězce B· zbytkem aminokyseliny lysinu (Lys).

13. Derivát inzulínu nebo jeho fyziologicky přijatelná sůl podle alespoň jednoho z nároků 1 až 12, ve kterém alespoň jeden z aminokyselinových zbytků v pozicích B27, B28 a B29 řetězce B přísluší přirozeně se vyskytující aminokyselině, která je vybrána ze skupiny tvořené isoleucinem (Zle), kyselinou asparagovou (Asp) a kyselinou glutamovou (Glu).

14. Derivát inzulínu nebo jeho fyziologicky přijatelná sůl podle alespoň jednoho z nároků 1 až 13, ve kterém alespoň jeden z aminokyselinových zbytků v pozicích B27, B28 a B29 řetězce B přísluší přirozeně se vyskytující aminokyselině, která je vybrána ze skupiny * tvořené kyselými aminokyselinami.

15. Derivát inzulínu nebo jeho fyziologicky přijatelná sůl podle nároku 14, ve kterém je alespoň jeden z aminokyselinových zbytků v pozicích B27, B28 a B29 řetězce B zbytkem kyseliny asparagové (Asp).

16. Derivát inzulínu nebo jeho fyziologicky přijatelná sůl podle nároku 14, ve kterém je alespoň jeden z aminokyselinových zbytků v pozicích B27, B28 a B29 řetězce B zbytkem kyseliny glutamové.

17. Derivát inzulínu nebo jeho fyziologicky přijatelná sůl podle alespoň jednoho z nároků 1 až 13, ve kterém alespoň jeden z aminokyselinových zbytků v pozicích B27, B28 a B29 řetězce B přísluší přirozeně se vyskytující aminokyselině, která je vybrána ze skupiny tvořené neutrálními aminokyselinami.

18. Derivát inzulínu nebo jeho fyziologicky přijatelná sůl podle nároku 17, ve kterém je alespoň jeden z aminokyselinových zbytků v pozicích B27, B28 a B29 řetězce B zbytkem aminokyseliny isoleucinu (lie) .

19. Derivát inzulínu nebo jeho fyziologicky přijatelná sůl podle nároku 15, ve kterém je aminokyselinový zbytek v pozici B27 řetězce B zbytkem kyseliny asparagové (Asp) .

20. Derivát inzulínu nebo jeho fyziologicky přijatelná sůl podle nároku 15, ve kterém je aminokyselinový zbytek v pozici B28 řetězce B zbytkem kyseliny asparagové (Asp) .

21. Derivát inzulínu nebo jeho fyziologicky přijatelná sůl podle nároku 15, ve kterém je aminokyselinový zbytek v pozici B29 řetězce B zbytkem kyseliny asparagové (Asp) .

22. Derivát inzulínu nebo jeho fyziologicky přijatelná sůl podle nároku 16, ve kterém je aminokyselinový zbytek v pozici B27 řetězce B je zbytkem kyseliny glutamové (Glu).

23. Derivát inzulínu nebo jeho fyziologicky přijatelná sůl podle nároku 16, ve kterém je aminokyselinový zbytek v pozici B28 řetězce B zbytkem kyseliny glutamové (Glu).

24. Derivát inzulínu nebo jeho fyziologicky přijatelná sůl podle nároku 16, ve kterém je aminokyselinový zbytek v pozici B29 řetězce B zbytkem kyseliny glutamové (Glu).

25. Derivát inzulínu nebo jeho fyziologicky přijatelná sůl podle nároku 18, ve kterém je aminokyselinový zbytek v pozici B28 řetězce B zbytkem aminokyselinu isoleucinu (lie) .

26. Derivát inzulínu nebo jeho fyziologicky přijatelná sůl podle alespoň jednoho z nároků 1 až 25 , ve kterém je aminokyselinový zbytek v pozici A21 kyseliny asparagové (Asp).

řetězce A zbytkem

27.

Derivát inzulínu nebo jeho fyziologicky přijatelná _SŮ1 podle nároku 26, ve kterém řetězec A obsahuj

Gly Ile Val Glu Gin Cys Cys Thr Ser Il_e e sekvenci

Tyr Gin Leu

Glu Asn Tyr Cys Asp (Sekvence

Cys Ser Leu id.č.: 9)

28.

a řetězec B obsahuje sekvenci

Phe val Lys Gin His Leu Cys Gly _Ser „is Leu Val

Thr T J ^{L6U %1 CVS 017 G1U Ar3 G1}* ^Ph* r Ile Lys Thr (Sekvence id.č.: 10).

Glu

Tyr

Derivát inzulínu podle nároku 24, Phe Val Lys Gin Ala Leu Tyr Leu Thr Pro Glu Thr nebo jeho fyziologicky přijatelná sůl ve kterém řetězec B obsahuje sekvenci His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr (Sekvence id.č.: 3).

29.

Derivát inzulínu podle nároku 18, nebo jeho fyziologicky přijatelná sůl ve kterém je aminokyselinový zbytek v pozici B27 řetězce B zbytkem aminokyseliny isoleucinu

30.

31.

Derivát inzulínu podle nároku 25,

Derivát inzulínu podle nároku 29, Phe Val Lys Gin Ala Leu Tyr Leu He Pro Lys Thr nebo jeho fyziologicky přijatelná sůl ve kterém řetězec B obsahuje sekvenci His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr (Sekvence id.č.: 5).

nebo jeho fyziologicky přijatelná sůl ve kterém řetězec B obsahuje sekvenci

-42Phe Val Lys Gin His Leu Cys Gly Ser His Leu Vai Glu Ala Leu Tyr Leu Vai Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr He Lys Thr (Sekvence id.č.:
4).

₄ 32. Způsob přípravy derivátu inzulínu nebo jeho fyziologicky přijatelné soli podle alespoň jednoho z

V nároků 1 až 30 vyznačující se tím, že zahrnuje konstrukci replikovatelného expresivního přenašeče, který obsahuje sekvenci DNA kódující prekurzor derivátu inzulínu, v němž je aminokyselinový zbytek v pozici AI řetězce A spojen s· aminokyselinovým zbytkem B30 řetězce B peptidovým řetězcem podle vzorce II

-R^_n-ArgII.

kde r1_q značí peptid s n aminokyselinovými zbytky a n je celé číslo z intervalu 0 až 34 a řetězec B je v pozici B1 prodloužen peptidovým řetězcem podle vzorce III

Met-R² _m-(Arg)pIII.

kde R² _m je peptid s m aminokyselinovými zbytky a m je celé Číslo z intervalu 0 až 40 a p je 0, 1 nebo 2 a dále zahrnuje expresi v hostitelských buňkách a postranslační úpravy derivátu inzulínu z prekurzoru chemickým a/nebo enzymatickým způsobem.

33. Způsob podle nároku 32 vyznačující se tím, že hostitelská buňka je buňka bakteriální.

34. Způsob podle nároku 33 vyznačující se tím, že bakteriální buňka je E. coli.

35. Způsob podle nároku 32 vyznačující se tím, že hostitelská buňka je kvasinka.

36. Způsob podle nároku 35 vyznačující se tím, že kvasinka je Sacharomyces cerevisiae.

37. Způsob podle libovolného z nároků 32 až 36 na přípravu derivátu inzulínu podle nároku '2 6 vyznačující se tím, že prekurzor inzulínu obsahuje sekvenci

Met Ala Thr Thr Ser Thr Gly Asn Ser Ala Arg PheVal

Lys Gin His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu· AlaLeu

Tyr Leu Val Cys Gly Glu Arg· Gly Phe Phe Tyr Thrlie

Lys Thr Arg Arg Glu Ala Glu Asp Pro Gin Val GlyGin

Val Glu Leu Gly Gly Gly Pro Gly Ala Gly Ser LeuGin

Pro Leu Ala Leu Glu Gly Ser Leu Gin Lys Arg Glylie

Val Glu Gin Cys Cys Thr Ser lie Cys Ser Leu Tyr Gin

Leu Glu Asn Tyr Cys Asp (Sekvence id. č.:ll) .

38. Způsob podle libovolného z nároků 32 až 36 na přípravu derivátu inzulínu podle nároku 28 vyznačující se tím, že prekurzor inzulínu obsahuje sekvenci

Met Ala Thr Thr Ser Thr Gly Asn Ser Ala Arg Phe Val

Lys Gin His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu

Tyr Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro

Glu Thr Arg Arg Glu Ala Glu Asp Pro Gin Val Gly Gin . Val Glu Leu Gly Gly Gly Pro Gly Ala Gly Ser Leu Gin

Pro Leu Ala Leu Glu Gly Ser Leu Gin Lys Arg Gly lie

Val Glu Gin Cys Cys Thr Ser lie Cys Ser Leu Tyr Gin

Leu Glu Asn Tyr Cys Asn (Sekvence id. č.:6).

39. Způsob podle libovolného z nároků 32 až 36 na přípravu derivátu inzulínu podle nároku 30 vyznačující se tím, že prekurzor inzulínu obsahuje sekvenci

Met Ala Thr Thr Ser Thr Gly Asn Ser Ala Arg Phe Val

Lys Gin His Leu Cys Gly Ser His·· Leu Val Glu Ala Leu

Tyr Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr lie Pro

Lys Thr Arg Arg Glu Ala Glu Asp Pro Gin Val Gly Gin

Val. Glu Leu Gly Gly Gly Pro Giy Ala Gly Ser Leu Gin

Pro Leu Ala Leu Glu Gly Ser Leu Gin Lys Arg Gly lie

Val Glu Gin Cys Cys Thr Ser lie Cys Ser' Leu Tyr Gin

Leu Glu Asn Tyr Cys Asn ( Sekvence id. č. : 8

40. Způsob podle libovolného z nároků 32 až 36 na přípravu derivátu inzulínu podle nároku 31 vyznačující se tím, že prekurzor inzulínu obsahuje sekvenci

Met Ala Thr Thr Ser Thr Gly Asn Ser Ala Arg Phe Val

Lys Gin His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu

Tyr Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr lie

Lys Thr Arg Arg Glu Ala Glu Asp Pro Gin Val Gly Gin

Val Glu Leu Gly Gly Gly Pro Gly Ala Gly Ser Leu Gin

Pro Leu Ala Leu Glu Gly Ser Leu Gin Lys Arg Gly lie

Val Glu Gin Cys Cys Thr Ser lie Cys Ser Leu Tyr Gin

Leu Glu Asn Tyr Cys Asn ( Sekvence id. č. :7 ) _φ

41. Prekurzor derivátu inzulínu podle nároku 37.

42. Prekurzor derivátu inzulínu podle nároku 38.

43. Prekurzor derivátu inzulínu podle nároku 39.

44. Prekurzor derivátu inzulínu podle nároku 40.

45. Sekvence DNA, která kóduje prekurzor inzulínu podle nároku 41.

46. Sekvence DNA, která kóduje prekurzor inzulínu podle nároku 42.

47. Sekvence DNA, která kóduje prekurzor inzulínu podle nároku 43.

48. Sekvence DNA, která kóduje prekurzor inzulínu podle nároku 44.

49. Expresivní přenašeč vyznačující se tím, že obsahuje sekvenci DNA podle nároku 45.

50. Expresivní přenašeč vyznačující se tím, že obsahuj se sekvenci DNA podle nároku 46.

51. Expresivní přenašeč vyznačující se tím, že obsahuje sekvenci DNA podle nároku 47.

52.

Expresivní přenašeč vyznačuj icí tím, že obsahuje sekvenci DNA podle nároku 48.

53. Hostitelská buňka transformovaná expresivním přenašečem podle libovolného z nároků 49 až 52.

54. Farmaceutický přípravek vyznačující se tím, že obsahuje alespoň jeden derivát inzulínu

-46a/nebo jeho fyziologicky přijatelnou sůl podle alespoň jednoho z nároků 1 až 30.

* 55. Farmaceutický přípravek podle nároku 54 vyznačující se tím, že obsahuje ty derivát inzulínu a/nebo jeho fyziologicky přijatelnou
5 sůl v rozpuštěné , amorfní nebo krystalické formě.

56.

Farmaceutický přípravek podle vyznačující se tím, že depotní pomocnou látku.

nároku 54 dále obsahuje

57. Farmaceutický přípravek podle nároku 56 vyznačující se tím, že depotní pomocná látka je protamin sulfát a derivát inzulínu a/nebo jeho fyziologicky přijatelná sůl jsou ve formě společného krystalu.

58. Injikovatelný roztok vyznačuj i c i farmaceutický přípravek s inzulínovou aktivitou se t i m , že obsahuje podle libovolného z nároků 54 až 56 v rozpuštěné formě.

59. Použití derivátu inzulínu a/nebo jeho fyziologicky přijatelné soli podle alespoň jednoho z nároků 1 až 31 k výrobě farmaceutického přípravku, který vykazuje inzulínovou aktivity s rychlým účinkem.