CZ20002104A3

CZ20002104A3 - Krystaly peptidu-1, podobného glukagonu

Info

Publication number: CZ20002104A3
Application number: CZ20002104A
Authority: CZ
Inventors: James Arthur Hoffmann; Ronald Norbert Hermeling; Chakravarthy Narasimhan
Original assignee: Eli Lilly And Company
Priority date: 1997-12-16
Filing date: 1998-12-14
Publication date: 2001-08-15
Also published as: EP0926159A3; CN1281369A; PE20000059A1; JP2002508332A; US20010014666A1; ZA9811466B; CO5040043A1; EA200000652A1; ID25534A; USRE41133E1; HRP20000409A2; AR019806A1; CA2315243A1; SV1998000147A; NO20003081L; PL341210A1; KR20010033146A; BR9813658A; NZ505182A; HUP0100046A2

Description

Oblast techniky

Vynález se týká peptidové chemie, a to oblasti aplikovaného farmaceutického výzkumu a vývoje. Tento vynález poskytuje jednotlivé krystaly tvaru tetragonálnich plochých tyčinek nebo destiček peptidu-1, podobného glukagonu, dále molekul příbuzných peptidu-1, způsobů jejich přípravy a prostředků a použití těchto výhodných krystalických forem.

Dosavadní stav techniky

GLP-1, což je peptid se 37 aminokyselinami, vznikající přírodní cestou proteolýzou proteinového prekursoru se 160 aminokyselinami, preproglukagonu, byl poprvé identifikován v roce 1987 jako hormon vylučovaný vnitřní sekrecí. GLP-1 je vylučován L-buňkami střeva podle přijímání potravy a bylo zjištěno, že stimuluje sekreci insulinu (insulinotropní účinek), což ovlivňuje příjem glukosy buňkami, které snižují hladinu glukosy v séru (viz, např., Mojsov, S., Int. J. Peptide Protein Research, 40:333343 (1992)). GLP-1 je méně aktivní. Následným endogenním štěpením mezi polohami 6 a 7 vzniká biologicky účinnější GLP1(7-37)OH peptid. Zhruba 80% GLP-1(7-37)OH, který je takto produkován, se amiduje na C-zakončení za současného odstranění koncového glycinového zbytku v L-buňkách a je běžně označován jako GLP-1(7-36)NH₂. Molekuly, které jsou v podstatě homologní nebo jsou to deriváty nebo jsou založeny na nativních formách těchto molekul se obecně budou v tomto popisu označovat jako GLP.

•» · · ·

9 9 9 9

99999 9 9 9

9 99 9

Biologické účinky a metabolická přeměna volných kyselin, amidové formy a mnohých dalších známých GLP, jsou si podobné a jsou slibné jako léčiva diabetů, obesity a souvisejících stavů. Nicméně, mnoho GLP má nevýhodu extremně krátkého biologického poločasu života, který je u některých dokonce 3-5 minuty, což způsobuje, že jsou neatraktivní pro použití jako farmaceutické prostředky. V současné době s má za to, že aktivita dipeptidyl-peptidázy-IV (DPP-IV) snadno inaktivuje mnoho druhů GLP a je částečně zodpovědná za velmi krátký poločas života, který je u nich pozorován. Rychlá absorpce a čištění, které následují po parenterálním podání, jsou také významnými faktory. Z těchto důvodů existuje potřeba najít prostředky, které by prodloužily působení těchto slibných účinných látek.

Jedním ze stávajících přístupů je modifikovat tyto molekuly tak, aby se chránily před štěpením in vivo působením DPP-IV. Například viz US Pat. No. 5,512,549. Je již dlouho známo, že u insulinu se dá prodlouženého působení dosáhnout subkutánním podáváním krystalických proteinových formulací, které působí jako zásobníky, uvolňující rozpustný protein v průběhu delší doby.

Heterogenní mikrokrystalické klastry GLP 1(7-37)OH byly připravovány z roztoků solí a jejich vlastnosti byly zkoumány po máčení krystalů za přítomnosti zinku a/nebo m-kresolu (Kim a Haren, Pharma. Res. Vol. 12 No. 11 (1995)). Také byly připraveny surové krystalické suspense GLP (7-36) NH₂obsahující jehličkovité krystaly a amorfní sraženiny z fosfátových roztoků, obsahujících zinek nebo protamin (Přidal, et. al., International Journal Pharmaceutics Vol·. 136, pp. 53-59 (1996)). Také EP 0 619 322 A2 popisuje přípravu mikrokrystalických forem GLP-1(7-37)OH mícháním • · • · · 0 · · ··

0 · · ······· O

0 » 0 0 · · 0 • 0* ···· ·· ♦ ·· · roztoků proteinu v pufru s pH 7-8,5 s přísadou určitých kombinací solí a nízkomolekulárních polyethylenglykolu (PEG).

Nicméně, tyto krystalické klastry a surové suspense nejsou pro přípravu dlouho působících farmaceutických formulací GLP ideální, jelikož jsou to volně vázané a heterogenní shluky krystalů nebo amorfně-krystalické suspense, které mají sklon k zachycování nečistot a na druhé straně jsou obtížně vyrobitelné a nevhodné pro reprodukovatelnou přípravu a podávání.

Nejpřekvapivěji bylo nyní.objeveno, že jednotlivé tetragonální krystaly různých GLP tvaru hladkých tyček nebo destiček se dají reprodukovatelně získat z matečného roztoku, obsahujícího GLP rozpuštěný v pufrovaném roztoku a Ci_3 alkohol nebo popřípadě mono- nebo disacharid a to ve velmi širokém rozmezí pH. Výsledné jednotlivé krystaly tvaru plochých tyček nebo destiček a proti krystalickým klastrům nebo surovým suspenzím GLP-1(7-37)OH, známým v dosavadním stavu techniky, nabízejí signifikantní výhody.

Jednotlivé tetragonální krystaly tvarů plochých tyčinek nebo destiček podle tohoto vynálezu mají menší tendenci zachycovat nečistoty a proto se mohou vyrábět ve větších výtěžcích a podávat reprodukovatelněji než známé heterogenní klastry. Krystalické kompozice podle tohoto vynálezu jsou farmaceuticky atraktivní protože jsou relativně jednotné a setrvávají v suspenzi déle než krystalické klastry nebo amorfní krystalické suspenze, kteří mají tendenci rychle se usazovat, agregovat nebo se shlukovat, ucpávat jehly injekčních stříkaček a obecně jsou příčinou nepředvídatelného dávkováni. Nejdůležitější je, že krystalické kompozice podle tohoto vynálezu vykazují lepší rozsah, uniformitu a reprodukovatelnost farmakokinetiky, která se dá modulovat • · • 9 přidáním zinku s použitím obvyklých technik namáčení krystalů, alternativně při současném působení zinkem jako součástí krystalizačního roztoku.

Podstata vynálezu

Tento vynález zahrnuje způsoby přípravy jednotlivých tyčinkovitých nebo destičkovitých krystalů molekul příbuzných peptidu-1 podobných krystalům glukagonu (GLP's), které zahrnují přípravu .krystalů obsahujících čištěný GLP a pufrovací činidlo obsahující alkohol nebo mono nebo di sacharid a popřípadě síran amonný nebo zinečnatý.

V jiném provedení vynález spočívá v krystalech GLP, vybraných ze skupiny GLP-1 analogů, GLP-1 derivátů, DPP-IV chráněných GLP, analogů peptidů GLP-1 nebo biosyntetických analogů GLP1, které mají morfologický tvar tetragonálních tyčinek nebo destiček. Vynález také zahrnuje v podstatě homogenní kompozice GLP krystalů, farmaceutické formulace a způsoby pro přípravu formulací a způsoby léčení cukrovky, obesity a příbuzných stavů.

Podrobný popis vynálezu

Podle zavedených představ v rámci dosavadního stavu techniky byly aminový konec GLP 1(7-37)OH označen číslem zbytku 7 a karboxylový konec číslem 37. Toto názvosloví se přenáší na ostatní GLP. Pokud není uvedeno jinak, předpokládá se, že C-zakončení má obvyklou karboxylovou formu. Aminokyselinová sekvence a příprava GLP-1(7-37)OH jsou podle dosavadního stavu techniky dostatečně známy. Viz US Patent č. 5,120,712, jehož obsah je do popisu zahrnut formou odkazu.

Pro přehled je pořadí sekvence znázorněno dále.

• * · 0 0 0 0 0 0 0 0 0 · · 0 0 0 0

0 0000 ··

0 00 0000000 0

0000000 00 * 00 0

His-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-Gly-Arg-Gly-COOH (SEQ ID NO:1)

GLP-1 analog je definován jako molekula, která má jednu nebo více aminokyselinových substitucí, delecí, inverzí nebo adicí na GLP-1(7-37) a může zahrnovat d-aminokyselinové formy. GLP-1 analogy jsou známé podle dosavadního stavu techniky, přičemž jde, mimo jiné, o GLP-1(7-34), GLP-1(7-35), GLP-1(7-36)NH2, Gln⁹-GLP-1(7-37), d-Gln⁹-GLP-l(737), Thr¹⁶-Lys¹⁸-GLP-1 (7-37) a Lys^ie-GLP-1 (7-37 ) , Gly⁸-GLP-1 (7-36) NH2, Gly⁸-GLP-1 (7-37 ) OH, Val⁸-GLP-1 (7-37) OH, Met⁸-GLP-1(7-37)OH, acetyl-Lys⁹-GLP-l(7-37), Thr⁹-GLP-1 (737), D-Thr⁹-GLP-1 (7-37) , -Asn⁹-GLP-1 (7-37) , D-Asn⁹-GLP-1(737), Ser²²-prg²³-prg²⁴-Gln²⁶GLP-l(7-37), Arg²³-GLP-1 (7-37), Arg²⁴-GLP-1 (7-37) , cc-methyl-Ala^s-GLP-1 (7-36) NH2, Gly⁸-Gln²¹-GLP-1 (7-37) OH a podobně.

Další analogy GLP-1, podle vynálezu jsou charakterizovány vzorcem:

Rl-X-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Y-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys-Z-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-Gly-Arg-R2 (SEQ ID NO:2) kde: Rl je zvolen ze skupiny, do které patří L-histidin, D-histidin, desamino-histidin, 2-aminohistidin, beta-hydroxyhistidin, homohistidin, alfa-fluormethylhistidin, alfamethyl-histidin; X je zvoleno ze skupiny, do které patři Ala, Gly, Val, Thr, Met, Ile a alfa-methyl-Ala; Y je zvoleno ze skupiny, do které patří Glu, Gin, Ala, Thr, Ser a Gly; Z je zvoleno ze skupiny, do které paří Glu, Gin, Ala, Thr, Ser a • »· ·· * ·· • · · · · · · ··· • · · · · · · · • · ·· ······· ·

6· · · · · · · «······ · 9 « · « ·

Gly; a R2 je zvoleno ze skupiny, do které patří NH₂ a

Gly-OH.

GLP-1 analogy byly také popsány v WO 91/11457 a patří mezi ně GLP-1(7-34), GLP-1(7-35), GLP-1(7-36) nebo GLP-1(7-37) nebo jejich amidové formy a farmaceutickypřijatelné soli, které mají alespoň jednu modifikaci, vybranou ze skupiny, do které patří;

(a) nahrazení lysinu v poloze 26 a/nebo 34 glycinem, serinem, cysteinem, threoninem, asparaginem, glutaminem, tyrosinem, alaninem, valinem, isoleucinem, leucinem, methioninem, fenylalaninem, argininem nebo Dlysinem; nebo nahrazení argininu v poloze 36 glycinem, serinem, cysteinem, threoninem, asparaginem, glutaminem, tyrosinem, alaninem, valinem, isoleucinem, leucinem, methioninem, fenylalaninem, lysinem nebo a D-argininem;

(b) nahrazení tryptofanu v poloze 31 aminokyselinou odolnou proti oxidaci;

(c) alespoň jedno následující nahrazení: valinu v poloze 16 tyrosinem; šeřinu v poloze 18 lysinem; glutamové kyseliny v poloze 21 aspartovou kyselinou; glycinu v poloze 22 serinem; glutaminu v poloze 23 argininem; alaninu v poloze 24 argininem; a glutaminem pro lysin v poloze 26; a (d) alespoň jedno z následujících nahrazení: alaninu v poloze 8 aminokyselinou, vybranou ze skupiny, do které patří: glycin, serin nebo cystein; glutamové kyseliny v poloze 9 aminokyselinou, vybranou ze skupiny, do které patří aspartová kyselina, glycin, serin, cystein, threonin, asparagin, glutamin, tyrosin, alanin, valin, isoleucin, • * • « ft · · • ft ft ft · · • · ft · · · · • · · · • · · · · · • · ftft ft······ ·· leucin, methionin nebo fenylalanin; glycinu v poloze 10 aminokyselinou, vybranou ze skupiny, do které patří serin, cystein, threonin, asparagin, glutamin, tyrosin, alanin, valin, isoleucin, leucin, methionin nebo fenylalanin; a aspartové kyseliny v poloze 15 glutamovou kyselinou; a (e) nahrazení histidinu v poloze 7 jednou aminokyselinou ze skupiny, do které patří glycin, serin, cystein, threonin, asparagin, glutamin, tyrosin, alanin, valin, isoleucin, leucin, methionin nebo fenylalanin nebo Dnebo N-acylovaná nebo alkylovaná forma histidinu; přičemž v substitucích (a), (b) , (d) a (e) mohou být popřípadě použity aminokyseliny v D-formě a aminokyseliny v poloze 7 mohou být popřípadě v N-acylované nebo N-alkylované formě.

GLP-1 derivát je definován jako molekula, která má sekvenci aminokyselin jako GLP-1(7-37) nebo jako analog GLP-1, ale navíc má jednu chemickou modifikaci na jedné nebo několika postraních skupinách aminokyselin, a-uhlíkových atomech, terminální aminoskupině nebo terminální karboxylové kyselé skupině. Chemické modifikace jsou, mimo jiné, přidání chemických skupin, vytvoření nových vazeb a odstranění chemických skupin. Modifikace na postranních skupinách aminokyselin jsou, mimo jiné, acylace lysinových ε-aminoskupin, N-alkylace argininu, histidinu nebo lysinu, alkylation glutamových nebo aspartových karboxylových kyselých skupin deamidace glutaminu nebo asparaginu. Modifikace terminální aminoskupiny je, mimo jiné, desaminace, zavedení N-nižšího alkylu, N-di-nížšího alkylu a N-acylu. Modifikace terminální karboxyskupíny je, mimo jiné, vytvoření amidu, nižší alkyl amidu, dialkylamidu a nižší alkyl esteru. Nižší alkyl je C1-C4 alkyl. Kromě toho, jedna nebo více

4 • · · 444 44

4444 · 4 4 4

4 · 4 · 4 44 • 4 44 4 · 4 4 4 4 4 4

4 4 4 4 4 4

444444« «4 4 44 4 postranních skupin nebo terminálních skupin, může být chráněna chránící skupinou známou chemikům, obeznámeným s chemií proteinů. α-Uhlíkový atom aminokyseliny může být mono- nebo di-methylovaný.

Další GLP-1 deriváty jsou chráněny v U.S. Patentu 5,188,666, který je záměrně začleněn do popisu formou odkazu. Takovéto molekuly jsou vybrány ze souboru, do kterého patří peptidy, které mají následující sekvenci aminokyselin:

His-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-X (SEQ ID N0:3) a jeho farmaceuticky přijatelné soli, přičemž X je zvoleno ze souboru, který sestává z Lys-COOH a Lys-Gly-COOH; a jeho deriváty, ve kterých je peptid vybrán ze souboru, sestávajícího z farmaceuticky přijatelných nižších alkyl esterů; a farmaceuticky přijatelných amidů vybraných ze skupiny, sestávající z amidu, nižšího alkyl amidu a nižšího dialkylamidu.

Podle tohoto vynálezu se mohou použít ještě další deriváty GLP-1, chráněné v US patentu 5,512,549, který je záměrně začleněn do tohoto popisu formou odkazu, popisované vzorcem:

(SEQ ID N0:4)

Rl-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Xaa-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-Gly-Arg-R³

I

R² • 44 444 ·4

4444 444 444 · 4444 44 '4 44 4444444 4

4 4 4 4 4 4

4·44444 44 4 ·4 4 kde R¹ je vybrán ze skupiny, do které patří 4-imidazopropionyl, 4-imidazoacetyl, nebo 4-imidazo-a,a-dimethylacetyl; R² je vybrán ze skupiny, do které patří C6-C10 nevětvený acyl, nebo chybí; R³ je vybrán ze skupiny, která sestává z Gly-OH nebo NH₂; a Xaa je Lys nebo Arg.

DPP-IV chráněné GLP znamená GLP-1 analogy,které jsou resistentní vůči působení DPP-IV. Mezi ně patří analogy, které mají modifikovaný nebo d aminokyselinový zbytek v poloze 8. Mezi tyto analogy také patří biosyntetické analogy GLP-1, které mají Gly nebo 1 aminokyselinové zbytky Val, Thr, Met, Ser, Cys nebo Asp v poloze 8. Mezi další DPP-IV, chráněné GLPy, patří des- amino His⁷ deriváty.

GLP-1 peptidové analogy jsou definovány jako GLP-1 analogy nebo deriváty, kromě acylovaných forem.

Biosyntetické analogy GLP-1 jsou definovány jako jakékoliv GLP-1 analogy nebo deriváty, které obsahují pouze aminokyselinové zbytky, které se vyskytují v přírodě a jsou tudíž schopné být exprimovány živými buňkami, přičemž mezi tyto živé buňky se počítají i rekombinační buňky a organismy.

Léčení je definováno jako péče o pacienta a její organizování pro účely boje proti chorobě, stavu, nebo poruše a zahrnuje podávání sloučeniny podle vynálezu za účelem prevence nástupu příznaků nebo komplikací, zmírnění příznaků nebo komplikací nebo eliminace choroby, stavu nebo poruchy. Léčení diabetů tudíž zahrnuje udržování fysiologicky žádoucích hladin glukosy v krvi pacientů, kteří to potřebují.

• ·· ·· · ·· • · · · ft·· ··· • · ···· · · • ft ·· ······· 9

GLP krystaly tvaru plochých tyčinek nebo destiček podle tohoto vynálezu, které se připravují s použitím zde chráněného způsobu, se do určité míry mění co do velikosti a tvaru. Obecně mají tyto destičky rozměry zhruba v rozmezí 2-25 mikrometrů (pm) krát 10-150 pm a jsou ploché, přičemž mají tloušťku zhruba 0,55 pm. Takovéto jednotlivé krystaly rostou z jednoho nukleačního bodu a neobjevují se v podobě více hvězdicově spojených klastrů, známých v dosavadním stavu techniky.

Informace o sekvencích, které jsou zde podány a stav techniky v oboru syntézy proteinů v pevné fázi umožňují získat jednotlivé GLP cestou chemických syntéz. Nicméně některé GLP je také možné získat enzymaticky fragmentací proglukagonu s použitím technik, které jsou odborníkovi v oboru dostatečně známy. Kromě toho se může k expresi GLP podle vynálezu použít dobře známých technik využívajících rekombinační DNA.

Principy chemického získávání polypeptidů syntézou v pevné fázi jsou v oboru dostatečně známé a lze je nalézt v souhrnných publikacích v tomto oboru, například Dugas, H. a Penney, C., Bioorganic Chemístry (1981) Springer-Verlag, New York, pgs. 54-92, Merrífield, J.M., Chem. Soc., 85:2149 (1962) a Stewart a Young, Solid Phase Peptide Synthesis, pp. 24-66, Freeman (San Francisco, 1969).

Dosavadní stav techniky v molekulární biologii rovněž poskytuje další prostředky, kterými může GLP odborník v oboru získat. Přestože se GLP mohou vyrábět syntézou v pevné fázi, rekombinačními metodami nebo fragmentací glukagonu, rekombinační metody jsou výhodné, jestliže se vyrábí ·· · * · · • · · ·

biosyntetické analogy GLP-1, protože je možno dosáhnout vyšších výtěžků.

Pro účely tohoto vynálezu jsou výhodné analogy peptidů GLP-1 a biosyntetické analogy peptidů GLP-1. Výhodnější jsou DPP-IV chráněné GLP, ještě výhodnější jsou biosyntetické analogy peptidů GLP-1. Jiné výhodné analogy peptidů GLP-1 jsou ty, které obsahují jednu aminokyselinu substituovanou v poloze 8, která má d a modifikované aminokyselinové zbytky. Ještě více výhodné jsou biosyntetické analogy GLP-1 peptidů, které obsahují jednu aminokyselinovou substituci v poloze 8, která je výhodně tvořena Gly nebo 1 aminokyselinovým zbytkem ze souboru zahrnujícího Val, Thr nebo Met v poloze 8.

Tento vynález poskytuje a způsob výroby samostatných tetragonálních tyčinkovitých GLP krystalů z matečného roztoku. Za nízkého pH až za neutrálních pH podmínek, pohybujících se v rozmezí od asi pH 6-7, výhodně asi 6,4 ± asi 0,2, obsahuje krystalizační roztok nebo matečný roztok finální koncentraci GLP asi 1-10 mg/ml, výhodně 2-7 mg/ml.

Při praktickém provedení vynálezu lze použít řadu běžných pufrovacích roztoků, obsahujících alkohol nebo raononebo di-sacharid. Výhodný je 10 až 50 mM Tris, octan amonný, octan sodný nebo Bis-Tris. Koncentrace alkoholu v matečném roztoku se pohybuje v rozmezí asi 2-15% (obj./obj.), výhodně 3-13%. Výhodné alkoholy jsou vybrány ze skupiny, obsahující methanol, ethanól, propanol nebo glycerol, přičemž ethanól je nejvýhodněj ší.

Popřípadě se dá všeobecně zvýšit výtěžek krystalů přidáním přibližně 1% (hmot./obj.) síranu amonného do matečného roztoku. Odborník v oboru rozpozná výhody přidávání ·· · ochranných prostředků jako je azid sodný a jiné stabilizátory do matečného roztoku, aby se předešlo růstu bakterií.

V dalším provedení se může místo alkoholu použít mononebo disacharidů ve stejných poměrech (hmot./obj.) jaké byly použity u alkoholu. Mono nebo disacharídy vhodné k použití podle nároků pří způsobu podle vynálezu jsou trehalóza, manitol, glukóza, erytróza, ribóza, galaktóza, fruktóza, maltóza, sacharóza a laktóza, přičemž trehalóza je podle našeho mínění výhodná.

V ještě dalším provedení podle vynálezu se může způsob provádět v prostředí neutrálního nebo vysokém pH, obsahujícím zinek, přičemž pH se pohybuje v rozmezí 7-10, výhodně je pH v rozmezí asi 7,2-9,7. Za těchto podmínek je koncentrace krystalujících GLP v rozmezí přibližně 1-20 mg/ml, výhodně asi 2-10 mg/ml. Celkové množství zinku v molárním poměru k GLP, se pohybuje od asi 0,5 do 1,7 výhodně od 0,6 do 1,5.

Za takovýchto neutrálních nebo vyšších pH za současného působení zinku jsou vhodné koncentrace pufrů a solí v rozmezí od asi 10-100 mM glycinu a 0-200 mM NaCl, výhodně 40-60 mM glycine a 0-150 mM NaCl. Výhodné pufry jsou glycin, aspartová kyselina a Tris. Podmínky přítomnosti alkoholu nebo cukru jsou stejné, jak byly specifikovány v,předešlém textu popisu vynálezu.

Když je matečný roztok připraven, ponechá se stát při teplotě přibližně 15-37°C, výhodně asi při teplotě 18-25°C, po dobu 12-48 hodin, až se dostavila krystalizace. Krystaly se pak mohou přenášet nebo se s nimi může manipulovat nějakým jiným způsobem bez znatelného škodlivého ovlivnění krystalické morfologie, což naznačuje, že takovéto krystaly • · • ·· ·· · ·· • ♦ · t · · · · • · ···· ·· • · · · ··»···· · • · · · · · · ······· · · · tt · se mohou skladovat delší dobu bez výrazného poškození jejich struktury.

V dalším provedení se dá připravit farmaceutická formulace přidáním farmaceuticky přijatelných excipientů, nosičů, stabilizátorů a rozpouštědel přímo do matečného roztoku po vytvoření krystalů. V tomto provedení se pak za sterilních podmínek se pak provede krystalizace, načež se přidají další přísady. Zinek se může přidávat přímo do matečného roztoku, aby se zinek do krystalů inkorporoval. Do matečného roztoku se mohou přidat stabilizátory, aby se dosáhlo formulací, vhodných pro více injekcí z téhož zásobníku. Do matečného roztoku se také mohou po vzniku krystalů přidat další excipienty, jako jsou antioxidanty, pufry, kyseliny a zásady za účelem úprav pH, isotonické přísady a podobně.

V dalším provedení vynález poskytuje homogenní kompozice samostatných tetragonálních krystalů GLP tvaru plochých tyčinek nebo destiček. Před vyřešením způsobů, jak je zde popsáno a chráněno, by nebylo možno dosáhnout přípravy takovýchto kompozic. Kompozice podle vynálezu jsou vhodné pro přípravu farmaceutických prostředků, které mají prodlouženou dobu působení a které jsou určeny pro léčení nebo prevenci cukrovky, obesity a souvisejících a příbuzných stavů.

Krystaly GLP a kompozice, chráněné podle vynálezu, se mohou popřípadě podrobit působení zinku s použitím běžných technik máčení. Máčením krystalů v roztoku asi 0,5 mg/ml zinku, vznikají komplexy krystalů, které slouží k prodloužení doby působení podaných GLP. Také proměnlivostí koncentrace zinku se může měnit složení komplexu, což vede k delší nebo kratší době působení.

• · • φ • · · ·· • · · φ · · · · •••φφφφ · • φ · ·

Jak' vylo poznamenáno, vynález poskytuje farmaceutické formulace, které jsou zahrnuty v samostatných tetragonálních krystalů GLP tvaru plochých tyčinek nebo destiček, spolu s jedním nebo více farmaceuticky přijatelnými ředidly, nosiči nebo excipienty. Krystaly se dají uvést do formulace pro parenterální podávání pro terapeutické nebo profylaktické léčení cukrovky, obesity nebo s nimi souvisejících nebo příbuzných stavů. Například se mohou krystaly podle tohoto vynálezu mísit s obvyklými farmaceutickými nosiči a excipienty. Formulace zahrnující chráněné krystaly obsahují od asi 0,5 do 50 mg/ml aktivní GLP a přesněji od asi 1,0 do 10 mg/ml. Kromě toho se mohou krystaly podle tohoto vynálezu podávat samotné nebo v kombinaci s jinými antidiabetickými přísadami. Pro subkutánní nebo intramuskulární aplikace se mohou použít formulace krystalů podle vynálezu ve formě suspenzí v originálním nebo modifikovaném krystalizačním matečném roztoku nebo ve farmaceutickém rozpouštědle jako je nepyrogenní destilovaná voda, fysiologický roztok nebo 5% roztok glukózy. Vhodné formulace krystalů podle tohoto vynálezu se dají připravit pro podávání ve formě suspenze na bázi vody nebo farmaceuticky přijatelného oleje, například jako ester s kyselinami s dlouhým řetězcem jako je ethyl oleát.

Do formulace podle vynálezu, která umožňuje vícedávkové použití se také mohou výhodně přidávat farmaceuticky přijatelné stabilizátory jako je alkylparaben, zejména methylparaben, ethylparaben, propylparaben nebo butylparaben nebo chlorbutanol, fenol nebo meta-kresol.

Formulace může také obsahovat isotonické přísady, což jsou přísady, které jsou fysiologicky tolerovány a dodávají • *· ·· 9 ·· • · · · · · 9 999 • 9 9999 99

9 9 9 9 9999 · · 9

9 9 9 9 9 9 • 99 ···· ·· 9 99 9 formulaci vhodnou koncentraci solí, aby se předešlo procházení vody přes buněčnou membránu. Sloučeniny jako je glycerin se všeobecně pro uvedené účely v obvyklých koncentracích. Jiní možné isotonické přísady jsou například soli, např. NaCl, dextróza, manitol a laktóza. Výhodnou isotonickou přísadou je také glycerin. Koncentrace isotonických přísad je ve známém rozmezí pro parenterální formulace a u glycerinu je výhodně asi 16 mg/ml až asi 25 mg/ml.

Formulace může také obsahovat farmaceuticky přijatelnou pufrující přísadu, která udržuje pH na žádoucí úrovni. pH je ideálně takové, aby byla pro pacienta při podávání přijatelné a při tom by ještě byla formulace dostatečně stabilní a to fyzikálně a chemicky. Výhodně se pH udržuje a upravuje na středně kyselí až středně zásadité a to tak, aby se pohybovalo mezi asi pH 5 a pH 9. Výhodněji je pH mezi asi 6 a 8. Pufrovací přísady jsou, mimo jiné, citrát, acetát, fosfát, Tris nebo zásaditá aminokyselina, jako je lysin nebo arginin, které jsou známé tím, že jsou farmaceuticky přijatelné v uvedených pH rozmezích. V oboru jsou známé i. další farmakologicky přijatelné pufry pro pufrování pH v těchto rozmezích. Výběr a koncentrace pufru je pro odborníka známý.

Příklady provedení

Příklad 1 pH 6,4 s 1,0% síranu amonného • · • φ* φ« φ φφ *» » φ · φ » « • φ φφφφ φφ φ φ φφ φφφφφφφ φ φ φ φφφ φ φ φφφ φφφφ φφφ φφφ

Do 3,0 ml skleněné ampulky bylo naváženo 12,5 mg chemicky syntetizovaného analogu GLP-1(7-37)OH, který má Ala v poloze 8 nahrazenou Val (V8-GLP-1) a na něj bylo působeno 2,0 ml pufru 10 mM Tris-HCl, 0,02% NaN₃ o pH 6,4, což poskytlo čirý roztok s pH = 3,6. Toto pH roztoku bylo upraveno na 8,7 přidáváním 2N NaOH, a pak bylo pH sníženo na 6,4 přidáváním IN HCI. Roztok zůstal v průběhu úprav pH čirý. Roztok byl filtrován přes a 0,22 mikrometrový filtr Millex GV13 pro injekce (Millipore, Bedford MA) do nové 3,0 ml skleněné ampulky. Koncentrace V8-GLP-1 zásobního roztoku byla 4,76 mg/ml jak bylo potvrzeno měřením absorbance při 280 nm a použitím extinkčního koeficientu o hodnotě 2,015 pro 1,0 mg/ml V8-GLP-1 roztok v 1 cm kývete. 0,25 ml alikvotního podílu tohoto zásobního roztoku V8-GLP-1 bylo přeneseno do 2,0 ml skleněné ampulky. Do tohoto roztoku bylo přidáno 0,25 ml pufru 10 mM Tris-HCl, 0,02% NaN₃ o pH 6,4, obsahujícího 2,0% (NH₄)₂SO4. Ampulky byly hermeticky uzavřeny, jemně promíchány a poté umístěny při 18 °C. Po 36 hodinách byly krystalické klastry potvrzeny identifikací při 200 násobném zvětšení. Pro kvantitativní stanovení, byla část matečného roztoku odebrána a tento vzorek byl odstředěn při 16 000 g. Obsah V-GLP-1 přetrvávající čirý supernatant byl stanoven měřením absorbance při 280 nm jak je uvedeno v předešlém textu popisu. Získané krystaly byly kvantifikovány odečtením množství V8-GLP-1 v supernatantu od množství V8-GLP-1 ve výchozím roztoku. Tento vzorek ukázal krystalizační výtěžek 63,9%.

« 99 499 49

9 9 · · · 9 9

9 9 9 9 · 9

9 4 9999999 ·

Příklad 2 pH 6,4 s 1% ethanolu a 1,0% síranu amonného

Do 2,0 ml skleněné ampulky bylo přeneseno 0,25 ml alikvotního podílu zásobního roztoku V8-GLP-1 jako v příkladu 1. Do tohoto roztoku bylo přidáno 0,25 ml pufru o složení 10 mM Tris-HCl, 0,02% NaN₃ o pH 6,4, obsahující 2,0 % (NH₄)₂SO₄ a 2,0 % ethanolu. Roztok byl poté zpracován a podroben analytickému hodnocení jako v příkladu 1. Tento vzorek poskytoval krystalické klastry a trochu jednotlivých a samostatných tetragonálních krystalů. Výtěžek byl 73,1%.

Příklad 3 pH 6,4 s 5% Ethanol a 1,0% Síran amonný

0,25 ml alikvotního podílu V8-GLP-1 zásobního roztoku bylo přeneseno do 2,0 ml skleněné ampulky jako v příkladu 1. Do tohoto roztoku bylo přidáno 0,25 ml pufru, obsahujícího 10 mM Tris-HCl, 0,02% NaN₃ o pH = 6,4, obsahující 2,0 % (NH₄)₂SO₄ a 10,0 % ethanolu. Roztok byl poté zpracován a podroben analytickému hodnocení jako v příkladu 1. Tento vzorek poskytoval krystalické klastry, jednotlivé a samostatné tetragonální krystaly a nějaké tyčinky. Výtěžek byl 80,3%.

» · • « ί

• ·

• · ·»

Příklad 4 pH 6,4 s 10% Ethanol a 1,0% Síran amonný

Do 2,0 ml skleněné ampulky bylo přeneseno 0,25 ml alikvotního podílu zásobního roztoku V8-GLP-1 jako v příkladu 1. Do tohoto roztoku byl přidán 0,25 ml 10 mM Tris-HCl, 0,02% NaN₃, pH 6,4, pufr obsahující 2,0 % (NH₄)₂SO₄a 20,0 % ethanol. Roztok byl poté zpracován a podroben analytickému hodnocení jako v příkladu 1. Tento vzorek poskytoval jednotlivé a samostatné tetragonální krystaly a tyčinky. Výtěžek byl 81,9%.

Příklad 5 pH 6,4 s 1% Ethanol

Do 2,0 ml skleněné ampulky bylo přeneseno 0,25 ml alikvotního podílu zásobního roztoku V8-GLP-1 jako v příkladu 1. Do tohoto roztoku bylo přidáno 0,25 ml pufru s obsahem 10 mM Tris-HCl, 0,02% NaN₃ o pH 6,4, obsahující 2,0% ethanol. Roztok byl poté zpracován a podroben analytickému hodnocení jako v příkladu 1. Tento vzorek poskytoval v malém množství krystalické klastry. Výtěžek byl 8,8%.

Příklad 6 pH 6,4 s 5% Ethanol

Do 2,0 ml skleněné ampulky bylo přeneseno 0,25 ml alikvotního podílu zásobního roztoku V8-GLP-1 jako v příkladu 1. Do tohoto roztoku bylo přidáno 0,25 ml pufru s • · · • * «

• · · · · · 9 • r · · · obsahem 10 mM Tris-HCl, 0,02% NaN₃ o pH 6,4 s obsahem 10,0 % ethanolu. Roztok byl poté zpracován jako v příkladu 1 a podroben analytickému hodnocení jako v příkladu 1. Tento vzorek poskytoval krystalové klastry, jednotlivé a samostatné tetragonální krystaly a tyčinky. Výtěžek byl 39,1%.

Příklad 7 pH 6,4 s 10% Ethanol

Do 2,0 ml skleněné ampulky bylo přeneseno 0,25 ml alikvotního podílu zásobního roztoku V8-GLP-1 jako v příkladu 1. Do tohoto roztoku bylo přidáno 0,25 ml pufru s obsahem 10 mM Tris-HCl, 0,02% NaN₃, pH 6,4, obsahující 20,0% ethanol. Roztok byl poté zpracován a podroben analytickému hodnocení jako v příkladu 1. Tento vzorek poskytoval jednotlivé a samostatné tetragonální krystaly a tyčinky. Výtěžek byl 55,5%.

Příklad 8

Farmakokinetika

Do skleněné ampulky 1 bylo naváženo 28 mg biosyntetického V8-GLP-1 a rozmícháno v 4,5 ml 10 mM NH₄OAc, což poskytlo slabě zakalený roztok s pH 5,6. Tento materiál byl úplně rozpuštěn pomocí úpravy pH na 9,5 přidáváním 5N NaOH a zůstal úplně rozpuštěn po snížení pH roztoku ne 6,4 přidáváním 2N HCI. Tento roztok byl filtrován přes a 0,22 mikrometrový filtr Millex GV13 pro injekce do nové skleněné ampulky, což poskytlo celkový objem 4,3 ml. Koncentrace V8• 9 ·· 9 9 · 99 • •99 9 · · 9

9 9 · 9 · · · ♦ 9 9 · 9999 99 9

9 · 9 9 4 9

999*99» 9* 9 99

-GLP-1 roztok byla 5,51 mg/ml, jak bylo potvrzeno měřením absorbance při 280 nm 20ti násobně zředěného zásobního roztoku a použitím extinkčního koeficientu o hodnotě 2,015 pro 1 mg/ml V8-GLP-1 roztok v 1 cm kývete. Do tohoto roztoku bylo přidáno 4,3 ml srážecího pufru o složení 10 mM NH₄OAc,

2,0% (NH₄)₂SO₄, 20% ethanol o pH 6,4. Ampulky byly hermeticky uzavřeny, roztok byl jemně promíchán a poté byly ampulky uloženy při 18 °C. Po 72 hodinách byly jednotlivé a samostatné tetragonální krystaly potvrzeny při 200X zvětšení. Tyto krystaly byly z matečného roztoku odebrány nízkorychlostním odstředěním a resuspendovány v 10 mM NH₄0Ac, mg/ml glycerinu, pH 5,5, pufru (pufr A) na koncentraci asi 4,0 mg/ml. Část matečného roztoku byla odebrána a tento vzorek byl odstředěn při 16 000 g. Obsah V8-GLP-1 v stabilně čirém supernatantu byl stanoven měřením absorbance při 280 nm. Krystalizační výtěžek byl kvantifikovány odečtením V8GLP-1 množství v supernatantu od V8-GLP-1 množství ve výchozím roztoku. Tento krystalizace poskytla 83% výtěžek.

Vypočítané alikvotní podíly obsahující 4,0 mg/ml V8-GLP-1 ve formě krystalových suspenzí, připravených podobným způsobem, jak je uvedeno shora, byly přeneseny do pěti skleněných ampulek a rozpuštěny v pufru A na koncentraci mírně nad předpokládanou výslednou koncentrací 2,5 mg/ml V8GLP-1. Do krystalických suspenzí byly přidány alikvotní podíly se zásobním roztokem ZnCl₂ (33,4 mg/ml Zn⁺⁺ v pufru A), aby se dosáhlo výsledných koncentrací zinku 0,5, 1,0, 1,5, nebo 2,4 mg/ml zinku. Suspenze byly jemně promíchány a umístěny na 18 hodin při 5 °C. Výsledné koncentrace V8-GLP-1 v každé ampulce byly nyní 2,5 mg/ml. Po 18 hodinách byly suspenze krystalů zinkového V8-GLP-1 přeneseny do pokojové teploty, prošly přes injekční jehlu 30 gauge a byly upraveny na pH 6,0 přidáváním IN NaOH.

• · • I

4»·

9· ·

Suspenze obsahující 0,1 mg/ml zinkového krystalického V8-GLP-1 bylo připraveno nejprve působením suspenze krystalů s obsahem 2,5 mg/ml na roztok s obsahem zinku 0,15 mg/ml, a to stejným způsobem, jak je popsáno shora. Po 18 hodinách při 5 °C byly zinkem takto ošetřené krystaly odděleny nízkorychlostním odstředěním a přeneseny do pufru B (pufr A obsahující 0,1 mg/ml zinku). Výsledná koncentrace V8-GLP-1 této suspenze byla upravena na 2,5 mg/ml pomocí pufru B.

Takto získaná suspenze prošla přes injekční jehlu 30 gauge a pH bylo zvýšeno na 6,0 přídavkem IN NaOH.

Pět shora popsaných krystalických suspenzí zinkového V8-GLP-1, každá při 2,5 mg/ml V8-GLP-1 a obsahující 0,1, 0,5, 1,0, 1,5 nebo 2,4 mg/ml zinku, bylo testováno na přes noc hladovějících psech plemene beagle. Každé zvíře obdrželo jednotlivě subkutánní injekci 24 nmol/kg krystalického zinkového V8-GLP-1 ve formě suspenze při času nula. Zvířatům byly odebírány vzorky arteriální krve (1,5 ml) při určených dobách, tyto vzorky byly přeneseny do zkumavek, předem ošetřených EDTA a obsahující 40 μΐ Trasylolu, a poté byl každý vzorek odstředěn. Část plasmy každého vzorku byla oddělena uskladněna při -80 °C až do doby analýzy.

Koncentrace imunoreaktivní V8-GLP-1 v plasmě každého vzorku byla měřena pomocí metody RIA. Tabulka 1 ukazuje výsledné imunoreaktivní hladiny V8-GLP-1 v plasmě po 24 hodinových periodách pro každou suspenzi.

• · • 9 ····-« 9 • · ·

Tabulka 1:

Imunoreaktivní V8-GLP-1

Hladiny (pikomolární) v psí plasmě:

• » · 9 « 0 V · « • 9

9 9 · 0 9 ·

	0,1 mg /ml Zinek (n=5)	0,5 mg/ml Zinek (n=5)	1,0 mg/ml Zinek (n=3)	1,5 mg/ml Zinek (n=5)	2,4 mg/ml Zinek(n=5)
Doba (h)	V8-GLP-1 (PM)	SEM	V8-LP-1 (pM)	SEM	V8-GLP-1 (pM)	SEM	V8-GLP-1 (pM)	SEM	V8-GLE-1 (pM)	SEM
0	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0
1,5	nd	nd	123	41	27	4	7	5	5	5
3,0	nd	nd	132	38	38	7	40	13	27.	21
4,5	nd	nd	196	51	108	41	76	34	83	37
6,0	301	57	264	79	140	55	142	47	143	60
7,5	nd	nd	265	71	184	' 57	198	61	179	63
9,0	nd	nd	344	94	220	61	252	64	214	66
10,5	nd	nd	302	80	231	78	250	66	225	50
12,0	nd	nd	282	78	236	76	267	60	238	42
13,5	nd	nd	238	54	241	97	286	74	236	38
15,0	nd	nd	263	67	273	118	325	114	246	28
16,5	nd	nd	235	51	234	106	275	77	218	25
18,0	nd	nd	210	47	184	62	254	59	211	23
19,5	nd	nd	221	54	209	120	278	57	173	9
21,0	nd	nd	215	54	219	115	301	48	178	13
22,5	nd	nd	224	54	193	72	232	23	167	9
24,0	190	30	210	51	187	72	227	34	166	25
30,0	nd	nd	nd	nd	nd	nd	nd	nd	171	24

SEM - střední chyba nd = nebyl stanoven • · • · « · • · · · »······ · • · · · · · · «·«··♦· *· · ··

Příklad 9 pH 9,4 s 5% trehalózy a zinkem

6,8 mg lyofilizovaného biosyntetického V8-GLP-1 bylo naváženo do 3,0 ml skleněné ampulky. Poté byl přidán pro rozpuštění peptidu pufr obsahující 1,0 ml 25 mM glycin-HCl, 150 mM NaCl, 5% trehalózy, o pH 9,0. Roztok byl poté upraven na pH 10,3 přidáváním 5N NaOH. Zatímco roztok byl jemně míchán bylo přidáno 9,0 μΐ 10 mg/ml roztoku chloridu zinečnatého ve vodě a pH upraveno na 9,4 působením 2N HCI. Výsledná koncentrace V8-GLP-1 byla 5,4 mg/ml, jak bylo potvrzeno měřením absorbance při 280 nm 10 x zředěného roztoku. Roztok byl poté filtrován přes 0,22 mikrometrový filtr Millex GV13 pro injekce. Ampulky byly opatřeny čepičkami, jemně promíchány, a poté umístěny při teplotě okolí. Po 24 hodinách V8-GLP-1 krystalové klastry a jednotlivé a samostatné obdélníkové krystaly potvrzeny identifikací při 430 násobném zvětšení a bylo odhadnuto, že mají délku asi 40 mikrometrů, šířku asi 15 mikrometrů a tloušťku asi 3 mikrometrů. Část matečného roztoku byla odebrána, a tento vzorek byl odstředěn při 16,000 x g. Obsah V8-GLP-1 v trvale čirém supernatantu byl stanoven měřením absorbance při 280 nm. Získané krystaly byly kvantifikovány odečtením množství V8-GLP-1 v supernatantu od množství V8GLP-1 ve výchozím roztoku. Tento vzorek ukázal krystalizační výtěžek 89,8%. Při pokusech bez trehalózy nebyla krystalická morfologie malých obdélníků pozorována.

Příklad 10 pH 9,4 s 10% manitolu a zinkem • · · ·

• 9

6,8 mg lyofilizovaného biosýntetického V8-GLP-1 bylo naváženo do 3,0 ml skleněné ampulky, a pak bylo působeno 1,0 ml pufru 25 mM glycin-HCl, 150 mM NaCl, 10% manitolu, pH 9,0, a směs byla dispergována, což poskytlo čirý roztok. Roztok byl poté upraven na pH 10,3 pomoci 5N NaOH. Zatímco roztok byl jemně míchán, bylo přidáno 9,0 μΐ 10 mg/ml roztoku chloridu zinečnatého ve vodě a pH upraveno na 9,4 pomocí 2N HCI. Výsledná koncentrace V8-GLP-1 byla 5,31 mg/ml, jak bylo potvrzeno měřením absorbance při 280 nm měřením 10 x zředěného krystalizačního roztoku. Roztok byl poté filtrován na 0,22 mikrometrovém filtru Millex GV13 pro injekce. Ampulky byly opatřeny čepičkami, jemně promíchány, a poté umístěny při teplotě okolí. Po 24 hodinách byly malé obdélníkové destičkovité krystaly V8-GLP-1 potvrzeny identifikací při 430ti násobném zvětšení a bylo odhadnuto, že jsou asi 10 až 30 mikrometrů dlouhé a 10 mikrometrů široké. Výtěžek byl stanoven jako v příkladu 9. Tento vzorek ukázal krystalizační výtěžek 35%.

Příklad 11 pH 9,0 se zinkem

Byl připraven 1-ml alikvotního podílu roztoku V8-GLP-1 o koncentraci 3 mg/ml v pufru 50 mM glycine-150 mM NaCl, který měl pH = 9,0. Do tohoto roztoku bylo přidáno 7,5 μΐ 20,85 mg/ml chloridu zinečnatého ve vodě, načež následovala úprava pH zpět na pH = 9,0. Po jemném promíchání byl čirý vzorek v 3-ml skleněné ampulce uložen při teplotě okolí do dalšího dne. Po této době byly krystalické sraženiny zkoumány pod

• · · ··· ·· «« t · φφφ · · φ φ · φ φ · ·· • · · φ · ···< φ · · φ φ φφφ · φ φφφ φφφφ Φ· · ·· mikroskopem při 90ti násobném zvětšení, což odhalilo klastry malých destiček. Pro kvantitativní stanovení výtěžku krystalizace, byla celá suspenze zfiltrována přes filtr 0,2 pm (Gelman Sciences, Ann Arbor, Michigan). Obsah V8-GLP-1 v trvale čirém filtrátu byl vyhodnocen by spektroskopickou kvantitativní analýzou při vlnové délce 280 nm, s použitím extinkčního koeficientu o hodnotě 2,015 pro 1 mg/ml roztok V8-GLP-1 v 1 cm kývete. Krystalizační výtěžek byl vyhodnocen odečtením množství V8-GLP-1 v supernatantu od V8-GLP-1 množství ve výchozím roztoku. Tento vzorek ukázal krystalizační výtěžek 5,6%.

Příklad 12 pH 9,0 s 10% ethanolu a zinkem.

Roztok 1-ml alikvotního podílu roztoku V8-GLP-1 byl připraven jako v příkladu 11, jen s tím rozdílem, že roztok před přidáním roztoku chloridu zinečnatého byl přidán roztok 110 pl absolutního ethanolu. Tento vzorek poskytl větší tetragonální krystaly s určitým obsahem klastrů ve výtěžku 80,6 %.

Příklad 13 pH 9,5 s 10% ethanolu a zinkem

Roztok V8-GLP-1 při 10 mg/ml v pufru 50 mM glycin-150 mM NaCl při pH 10,5 byl přefiltrován přes sterilní 0,2 pm filtr Acrodisc (Gelman Sciences, Ann Arbor, Michigan). Do 500 pl tohoto roztoku bylo přidáno 500 pl pufru s obsahem • « •« « · · · » ··♦ • >1 ···* · · • · « · ·····«· · « · «4 · . · * *····♦· ·· * *’ * mM glycinu a 150 mM NaCl s pH 9,0. Do tohoto roztoku bylo poté přidáno 110 pl absolutního ethanolu a následně 7,5 pl 20,85 mg/ml roztoku chloridu zinečnatého ve vodě. Bylo použito malých přídavků IN HC1, kterými se upravilo pH roztoku na hodnotu 9,5. Po jemném zamíchání byl výsledný roztok byl uzavřen v 3-ml skleněné ampulce a dva dny uložen při teplotě okolí. Byly získány samostatné krystalické destičky V8-GLP-1 o velikosti až do 150 pm délky, přibližně 25 pm šířky a méně než 5 pm tloušťky, a to ve výtěžku 72 %.

Příklad 14 pH 7,9 s 8,5% ethanolu a zinkem

Byl připraven vzorek V8-GLP-1 o koncentraci 4 mg/ml v 50 mM glycinovém pufru o pH = 9,5, který byl následně přefiltrován přes 0,2 pm filtr (Gelman Sciences, Ann Arbor, Michigan). Do 1-ml tohoto roztok bylo přidáno 100 pl absolutního ethanolu a poté 60 pl 2,08 mg/ml roztoku chloridu zinečnatého ve vodě. Byly použity malé přídavky 0,lN HC1, kterými byla reakce roztoku upravena na pH = 8,0. Po jemném zamíchání byl výsledný roztok uzavřen do 3-ml skleněné ampulky a uložen při teplotě okolí na dvě hodiny. pH tohoto čirého roztoku bylo poté upraveno na pH 7,86 malými přídavky 0,lN HC1 a roztok byl dále uložen při teplotě okolí na dva dny. Mikroskopické zkoumání odhalilo středně velké, samostatné tetragonální destičky a nějaké klastry. Obsah V8-GLP-1 ve stabilně čirém supernatantu byl vyhodnocen spektroskopií s použitím vlnové délky 280 nm a extinkčního koeficientu o hodnotě 2,015 pro 1 mg/ml roztok V8-GLP-1 v lem kývete. Krystalizační výtěžek byl vyhodnocen odečtením množství V8-GLP-1 v supernatantu od množství V8-GLP-1 ve • 4 s · * · * ·

9 9.· 9 9 9 · · 9 9 9 9 9

9 9 9 9999999 výchozím roztoku. Tento vzorek ukázal krystalizační výtěžek 92,2%.

Příklad 15 pH 8,3 s 10% ethanolu a zinkem

Byl připraven vzorek V8-GLP-1 o koncentraci 7 mg/ml v pufru 100 mM glycinu o pH 10,5 a následně přefiltrován přes 0,2 pm filtr (Gelman Sciences, Ann Arbor, Michigan). Do 0,5 ml tohoto roztoku bylo přidáno 0,4 ml vody. Poté bylo přidáno 100 μΐ absolutního ethanolu a následně asi 6 μΐ 20,86 mg/ml roztoku chloridu zinečnatého ve vodě. Poté byly použity malé přídavky IN HCI, jimiž bylo pH roztoku upraveno na hodnotu 8,33. Po jemném míchání byl výsledný roztok uzavřen ve 3-ml skleněné ampulce a dva dny uložen při teplotě okolí. Mikroskopické zkoumání odhalilo samostatné tetragonální destičky a nějaké klastry. Obsah V8-GLP-1 ve stabilně čirém supernatantu byl vyhodnocen spektroskopickou analýzou při vlnové délce 280 nm, s použitím extinkčního koeficientu o hodnotě 2,015 pro 1 mg/ml roztok V8-GLP-1 v 1 cm kyvetě. Krystalizační výtěžek byl vyhodnocen odečtením množství V8-GLP-1 v supernatantu od množství V8-GLP-1 ve výchozím roztoku. Tento vzorek ukázal krystalizační výtěžek 92,4%.

Příklad 16 pH 7,4 s 8,6% ethanolu a zinku

Byl připraven vzorek V8-GLP-1 o koncentraci 4 mg/ml v pufru 50 mM glycinu o pH 9,0 a následně zfiltrován přes filtr φ · • φ •φφφ «φφ φφ « φ φφφ» φ· φ · φ φ ΦΦΦΦΦΦ· · φ φ φφ» φ · _ΛΛ φ φ φ · φ φ φ ♦· * ··

0,2 pm (Gelman Sciences, Ann Arbor, Michigan). Do 5 ml tohoto roztoku bylo přidáno 500 μΐ absolutního ethanolu a následně 300 μΐ 2,08 mg/ml roztoku chloridu zinečnatého ve vodě. Malé přídavky IN HCI byly pak použity k úpravě roztoku na pH 7,40.

Po jemném promíchání byl výsledný roztok uzavřen do 10-ml skleněné ampulky a uložen při teplotě okolí po dobu dvou dnů. Mikroskopické zkoumání odhalilo středně velké, samostatné tetragonální krystaly. Obsah V8-GLP-1 ve stabilně čirém supernatantu byl kvantitativně stanoven spektroskopicky při vlnové délce 280 nm, s použitím extinkčního koeficientu o hodnotě 2,015 pro 1 mg/ml roztok V8-GLP-1 v 1 cm kyvetě. Krystalizační výtěžek byl vyhodnocen odečtením množství V8GLP-1 v supernatantu od množství V8-GLP-1 ve výchozím roztoku. Tento vzorek ukázal krystalizační výtěžek 85,0%.

Příklad 17 pH 6,4 s 5 % ethanolu a 1,0 % síranu amonného

V8-GLP-1 (12,5 mg) byl navážen do 20 ml skleněné ampulky. Bylo přidáno 2,0 ml 10 mM pufru na bázi octanu amonného, obsahujícího 150 mM NaCl s pH = 6,4. pH tohoto slabě zakaleného roztoku bylo upraveno na 9,5 přidáváním 5N NaOH a poté sníženo na pH 6,4 pomocí 2N HCI. Tento čirý roztok byl přefiltrován přes filtr 0,22 pm Millex GV 13 pro injekce (Millipore, Bedford, MA) do nové 20 ml skleněné ampulky. Koncentrace zásobního roztoku V8-GLP-1 byla stanovena měřením absorbance při 280 nm s použitím extinkčního koeficientu o hodnotě 2,015 pro 1,0 mg/ml roztok V8-GLP-1 v 1 cm kyvetě. Koncentrace proteinu byla upravena na 5,0 mg/ml. Byl připraven precipitační roztok o pH 6,4, obsahující 10 mM octanu amonného, 150 mM NaCl, 2 % síranu « » ♦ • · · · · amonného a 10% ethanolu a tento roztok byl zfiltrován přes filtr 0,22 pm Millex GV13 pro injekce. 2 ml tohoto precipitačního roztoku byly pomalu přidány ke 2 ml zásobního roztoku V8-GLP-1 ve skleněných ampulkách. Ampulky byly jemně promíchány a inkubovány při pokojové teplotě 2 dny. Byly pozorovány tetragonální destičkovité krystaly s výtěžkem krystalizace 92 %.

Suspenze krystalů byla upravena na pH =5,5 přidáním IN HCI a byl k ní přidán chlorid zinečnatý do výsledné koncentrace 0,15 mg/ml. Po zinkovém máčení přes noc při pokojové teplotě bylo pH suspenze upraveno na 7,5 přídavkem IN NaOH a byl přidán stabilizátor meta-kresol v takovém množství, aby měl koncentraci 3,16 mg/ml. Tento příklad ukazuje, že pokud je to žádoucí, může se připravit stabilizovaná formulace GLP-1 krystalů přímo pro farmaceutické použití bez izolace krystalů odstřeďováním. nebo filtrací v mezistupni.

Příklad 18 pH 7,6 s 8,5 % ethanolu a zinkem

Byl připraven vzorek V8-GLP-1 o koncentraci 4 mg/ml v pufru s obsahem 50 mM glycinu o pH = 9,0 a tento vzorek byl zfiltrován přes 0,2 pm filtr (Acrodisc od Gelman Sciences,

Ann Arbor, Michigan). Do 10 ml takto získaného roztoku byl přidán 1 ml absolutního ethanolu a dále 600 μΐ vodného roztoku octanu zinečnatého (dihydrátu) o koncentraci 6,7 mg/ml. Pak bylo přidáno 100 μΐ 2% kyseliny octové, což vedlo k výslednému pH asi 7,6. Po jemném promíchání byl výsledný roztok byl uzavřen ve 20-ml skleněné ampulce a ·· • · « φ • · · • 9··9 • » ·· ·· · uložen při teplotě okolí na dobu 24 hodin. Mikroskopické zkoumání odhalilo středně velké, samostatné tetragonální krystaly. Do celého množství tohoto roztoku bylo poté přidáno 3,555 ml roztoku, obsahujícího 3,5 ml 14 mg/ml roztoku meta-kresolu ve vodě a 55 μΐ 2% kyseliny octové, což vedlo k suspenzi s výsledným pH asi 7,2. Po jemném promíchání byla suspenze byl uzavřena do 20-ml skleněné ampulky a uložena při teplotě okolí na dobu 24 hodin. Mikroskopické zkoumání opět odhalilo středně velké, samostatné tetragonální krystaly.

Po pětiminutovém odstředění alikvotního podílu při teplotě okolí byl obsah V8-GLP-1 v trvale čirém supernatantu stanoven HPLC analýzou zředěného vzorku srovnáním s HPLC analýzou V8-GLP-1 standardních roztoků. Krystalizační výtěžek byl kvantifikován odečtením množství V8-GLP-1 v supernatantu od množství V8-GLP-1 ve výchozím roztoku. Tato stabilizovaná formulace V8-GLP-1 ukázala krystalizační výtěžek 97,7 %.

Příklad 19

Stabilita krystalu

Jednotlivé a samostatné tetragonální krystaly V8-GLP-1 byly připraven v pufru s obsahem 10 mM NH40Ac, 1% (NH₄)₂SO4, 10% ethanolu o pH 6,4 při 18 °C, jak je popsáno v příkladu 8. Tyto krystaly byly odděleny od matečného roztoku nízkorychlostním odstředěním a resuspendovány v pufru s obsahem 10 mM NH40Ac a 16 mg/ml glycerinu o pH 5,5, na koncentraci asi 4,9 mg/ml V8-GLP-1. 2 ml této suspenze bylo nízkorychlostně odstředěno a supernatant byl odebrána pipetou. Sraženina pak byla resuspendována v pufru s obsahem 4 ml 10 mM octanu amonného a 16 mg/ml glycerinu o pH 5,5, • ft • ftft • ···· ft dále obsahujícím 0,1 mg/ml zinku. Tato suspenze krystalů byla ponechána máčet v roztoku zinku přes noc při 4 °C.

Zinkem nasáklá suspenze krystalů byla rozdělena do čtyř 1-ml alikvotních podílů. Tyto suspenze byly nízkorychlostně odstředěny a jejich supernatanty byly odstraněny pipetou. Čtyři suspenze krystalů byly připraveny v pufru s obsahem 10 mM octanu amonného, 16 mg/ml glycerinu a 0,1 mg/ml zinku o pH 6,0. Vzorky, rozdělené podle tabulky 2, byly podrobeny dalším úpravám pH na 7,4 působením O,1N NaOH a/nebo přídavky meta-kresolu, přičemž úpravy byly provedeny na výslednou koncentraci 3,16 mg/ml. Každá suspenze byla dále rozdělena na polovinu pro testování, jaký má vliv uložení při pokojové (asi 22 °C) i při snížené teplotě na 4 °C, čímž se získalo celkově 8 testovacích vzorků, jak je znázorněno v tabulce 2.

Po 10 dnech byly suspenze krystalů zkoumány pod mikroskopem. Filtráty suspenzí byly poté analyzovány kvantitativně pomocí HPLC, a byl vyhodnocen obsah V8-GLP-1 v krystalických suspenzích. Výsledky HPLC uvedeny v tabulce 2.

4

4 •

4 ·

• 444 • 4

4

4« 4

4 >4 • 4 ·

4 4

4 4 4

444 4« ·

Tabulka 2:

Rozpuštěný podíl V8-GLP-1 v suspenzi krystalů po skladování 10 dnů:

Vzorek	pH	Skladovací teplota	mg/ml meta-kresol	Rozpuštěný podíl V8-GLP-1 podle HPLC
A	6, 0	4 °C	0	0,19 %
B	7,4	4 °C	0	0,10 %
C	6, 0	4 °C	3,16	0,05 %
D	7,4	4 °C	3,16	0,06 %
E	6,0	22 °C	0	0,16 %
F	7,4	22 °C	0	0,08 %
G	6, 0	22 °C	3,16	0, 03 %
H	7,4	22 °C	3,16	0,04 %

Tento experiment ukázal, že méně než 0,2 % V8-GLP-1 pěptidu přechází v průběhu 10 dnů do rozpuštěného stavu, a to jak ve stabilizované, tak i v nestabilizované formulaci krystalů.

Mikroskopicky, suspenze krystalů vykázaly menší spojování či shlukování u samostatných, tetragonálních krystalů při pH 7,4, než při pH = 6,0 a menší při 4 °C než při 22 °C. Meta-kresol patrně nemá signifikantní účinek na shlukování krystalů. Další testování ukázalo, že přítomnost více než 3 % ethanolu v krystalické suspenzi, buď při krystalizaci z matečného roztoku nebo při použití jako dalších přísad, velice silně redukuje tendenci krystalů ke shlukování, a to jak v případě stabilizované, tak i nestabilizované formulace. Další testy odhalily, že přestože krystaly jsou relativně stabilní v přítomnosti meta-kresolu, fc · • · · · fc · • fcfcfc fcfcfc • · fcfcfcfc fc fcfcfcfc fcfcfcfc • fc fc · « • fcfc fcfcfcfc fcfc · fc • fc · jsou méně stabilní v přítomnosti 5 % fenolu, což vede k pomalému vzniku amorfního materiálu.

Další testy stability krystalů ukázaly, že krystaly V8-GLP-1, připravené při pH 6,4, jsou velmi chemicky stabilní, nenašly se žádné degradační píky při HPLC analýze po skladování při 5 °C nebo při pokojové teplotě ani po dvou měsících.

Testy stability krystalů připravených v glycinovém pufru, jak jsou popsány v příkladu 16, ukázaly, že krystaly V8-GLP-1, skladované v původním matečném roztoku nebyly stabilní pokud byl přidán meta-kresol do hladiny 3,16 mg/ml. Tento test vedl k rozpuštění krystalů po pouhém 1 dni. Nestability krystalů v této kompozici by se mohla účinně blokovat přidáním zinku (použitím roztoku chloridu zinečnatého) před přidáním stabilizátoru.

Claims

PATENTOVÉ NÁROKY

1. Způsob přípravy samostatných krystalů tvaru tyčinek nebo destiček molekul příbuzných glukagonu-podobného peptidu-1 (GLP), vyznačující se tím, že se při tomto způsobu připravuje krystalizační roztok, obsahující GLP a pufrovací činidlo, alkohol nebo mono- nebo disacharid a popřípadě síran amonný nebo zinek.
2. Způsob podle nároku 1, vyznačující se tím, že GLP je ve výsledné koncentraci mezi asi 1-10 mg/ml a je vybrán ze skupiny, do které patří GLP-1 analog a GLP-1 derivát a dipeptidyl-peptidázou-IV (DPP-IV) chráněný GLP a peptidový analog GLP-1, nebo biosyntetický analog GLP-1, přičemž pufrovacím činidlem je pufr o koncentraci asi 10 až 50 mM, má pH asi 6 až 7 a je vybrán ze skupiny, sestávající z Tris, octanu amonného, octanu sodného nebo Bis-Tris, přičemž alkohol nebo mono nebo disacharid je vybrán ze skupiny, sestávající z methanolu, ethanolu, propanolu, glycerinu, trehalózy, manitolu, glukózy, erytrózy, ribózy, galaktózy, fruktózy, maltózy, sacharózy a laktózy, a kde je přítomno asi 1 % síranu amonného.
3. Způsob podle nároku 1 vyznačující se tím, že se přidává celkové množství zinku v molárním poměru 0,5-1,7 ku GLP, který je přidáván v takovém množství, které odpovídá výsledné koncentraci mezi asi 1-20 mg/ml a je vybrán ze skupiny, do které patří analog GLP-1, derivát GLP-1 a DPP-IV chráněný GLP a peptidový analog GLP-1 nebo biosyntetický GLP-1 analog, přičemž pufrovací činidlo se přidává v množství asi 10 až 100 mM, má pH asi 7 až 10 a je vybráno ze skupiny, sestávající z glycinu, aspartové kyseliny nebo Tris a alkohol • · · ·· nebo mono nebo disacharid je vybrán ze skupiny, do které patří methanol, ethanol, propanol, glycerol, trehalóza, manitol, glukóza, erytróza, ribóza, galaktóza, fruktóza, maltóza, sacharóza a laktóza.
4. Způsob podle kteréhokoliv z nároků 1 až 3, vyznačující se tím, že GLP je vybrán ze skupiny, do které patří DPP-IV. chráněné GLP nebo biosyntetický GLP.
5. Způsob podle kteréhokoliv z nároků 1 až 4, vyznačující se tím, že GLP je DPP-IV chráněný GLP vybraný ze ' skupiny, sestávající z Val-8-GLP-l(7-37)OH, Thr-8-GLP1(7-37)OH, Gly-8-GLP-l(7-37)OH nebo Met-8-GLP-l(7-37)OH.
6. Způsob podle kteréhokoliv z nároků 1 až 5, vyznačující se tím, že se provádí přídavný krok, spočívající v namáčení krystalů GLP v roztoku, obsahujícím zinek.
7. Krystaly GLP, které mají tetragonální plochou tyčinkovitou nebo destičkovitou morfologii, vybrané ze skupiny, do které patří analog GLP-1 a derivát GLP-1 a DPP-IV chráněný GLP a peptidový analog GLP-1 nebo a biosyntetický analog GLP-1.
8. Krystaly podle nároku 7, ve kterých GLP. je vybrán ze skupiny, sestávající z DPP-IV chráněného GLP nebo biosyntetického GLP.
9. Krystaly podle nároku 7, kde GLP je vybrán ze skupiny, sestávající z Val-8-GLP-l(7-37)OH, Thr-8-GLP1(7-37)OH, Gly-8-GLP-l(7-37)OH nebo Met-8-GLP-I(7-37)OH.