CZ20002201A3 - Transgenní zvířecí model pro degenerativní onemocnění chrupavek - Google Patents

Transgenní zvířecí model pro degenerativní onemocnění chrupavek Download PDF

Info

Publication number
CZ20002201A3
CZ20002201A3 CZ20002201A CZ20002201A CZ20002201A3 CZ 20002201 A3 CZ20002201 A3 CZ 20002201A3 CZ 20002201 A CZ20002201 A CZ 20002201A CZ 20002201 A CZ20002201 A CZ 20002201A CZ 20002201 A3 CZ20002201 A3 CZ 20002201A3
Authority
CZ
Czechia
Prior art keywords
mmp
animal
transgenic
transgenic animal
expression
Prior art date
Application number
CZ20002201A
Other languages
English (en)
Inventor
Lisa Ann Neuhold
Loran Marie Killar
Original Assignee
American Home Products Corporation
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Priority claimed from US08/994,689 external-priority patent/US6613958B1/en
Application filed by American Home Products Corporation filed Critical American Home Products Corporation
Publication of CZ20002201A3 publication Critical patent/CZ20002201A3/cs

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K67/00—Rearing or breeding animals, not otherwise provided for; New or modified breeds of animals
    • A01K67/027—New or modified breeds of vertebrates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C12N15/8509—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells for producing genetically modified animals, e.g. transgenic
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K67/00—Rearing or breeding animals, not otherwise provided for; New or modified breeds of animals
    • A01K67/027—New or modified breeds of vertebrates
    • A01K67/0275—Genetically modified vertebrates, e.g. transgenic
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A61P19/02—Drugs for skeletal disorders for joint disorders, e.g. arthritis, arthrosis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A61P19/04—Drugs for skeletal disorders for non-specific disorders of the connective tissue
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
    • C12N9/50—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25)
    • C12N9/64—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue
    • C12N9/6421—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue from mammals
    • C12N9/6489—Metalloendopeptidases (3.4.24)
    • C12N9/6491—Matrix metalloproteases [MMP's], e.g. interstitial collagenase (3.4.24.7); Stromelysins (3.4.24.17; 3.2.1.22); Matrilysin (3.4.24.23)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2217/00—Genetically modified animals
    • A01K2217/05—Animals comprising random inserted nucleic acids (transgenic)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2217/00—Genetically modified animals
    • A01K2217/07—Animals genetically altered by homologous recombination
    • A01K2217/072—Animals genetically altered by homologous recombination maintaining or altering function, i.e. knock in
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2217/00—Genetically modified animals
    • A01K2217/20—Animal model comprising regulated expression system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2227/00—Animals characterised by species
    • A01K2227/10—Mammal
    • A01K2227/105—Murine
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2267/00—Animals characterised by purpose
    • A01K2267/03—Animal model, e.g. for test or diseases
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2267/00—Animals characterised by purpose
    • A01K2267/03—Animal model, e.g. for test or diseases
    • A01K2267/0393—Animal model comprising a reporter system for screening tests
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2830/00—Vector systems having a special element relevant for transcription
    • C12N2830/008—Vector systems having a special element relevant for transcription cell type or tissue specific enhancer/promoter combination

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Environmental Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Animal Husbandry (AREA)
  • Rheumatology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Physical Education & Sports Medicine (AREA)
  • Biodiversity & Conservation Biology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Pain & Pain Management (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Orthopedic Medicine & Surgery (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Description

(57) Anotace:
Řešení poskytuje zvířecí modelové systémy pro degenerativní onemocnění chrupavky, které zahrnují transgenní zvířata, která mohou exprimovat rekombinantní, matrix-degradující enzymy (MDE), zejména matrix metaloproteinázy (MMP), dočasným a prostorově regulovaným způsobem. Dále poskytuje metody pro vyvolání fenotypových indikátorů degenerativních onemocnění chrupavky u zvířat a metody pro určení schopnosti látek působit proti degenerativnímu onemocnění chrupavky. Rovněž poskytuje izolované nukleové kyseliny kódující proMMP polypeptidy, které vykazují konstitutivní enzymatickou aktivitu a izolované enzymatické proMMP peptidy.
O
CN
CN
I
O
O o
CN
N
O ·· ·· • · · ··· · · · • · · · · · · · » · ·· · · ··· · • · · · · · ·
I · · ·· ·· ·· ·
Τίττη
Ζ^ο1
Transgenní zvířecí model pro degenerativní onemocnění chrupavek.
Oblast techniky
Předkládaný vynález se vztahuje k transgenním savcům, kteří dočasně a místně exprimují rekombinantni enzymy degradující matrix. Vynález se dále vztahuje k modelovým systémům zahrnujícím takováto transgenní zvířata pro studium degenerativních kloubních onemocnění, včetně systémů pro identifikaci terapeutických činidel a léčebných režimů.
Dosavadní stav techniky
Degenerativní onemocnění chrupavky, včetně onemocnění kloubů a plotének, jako např. osteoartritida, revmatická artritida a osteochondrodysplasie, jsou široce rozšířené, zejména v pokročilejším věku. Časné symptomy, společné těmto onemocněním, zahrnují progresivní ztrátu proteoglykanú v kloubu (projevující se ztrátou metachromazie (metachromasia)); degradace kolagenu; tvoření vláken (fibrillation) na povrchu chrupavek; a nakonec ztrátu chrupavky (která se dokáže radiologicky jako zúžení mezikloubního prostoru).
Jeden z prvních cílů, který je ovlivněný tímto onemocněním, je kolagen typu II, hlavní strukturální kolagen vyskytující se v kloubní chrupavce. Mezi produkcí kolagenu typu II a katabolickými enzymy, které degradují kolagen typu II během normální přeměny chrupavky a kosti, existuje rovnováha. Výsledkem porušení této rovnováhy můžou být patologické stavy, jako např. degenerativní kloubní onemocnění.
Mezi enzymy, které degradují složky extracelulární matrix, patří matrixové metaloproteázy (matrix metalloproteinases (MMPs)), rodina enzymu vyžadujících pro svojí aktivitu zinek, a agrekanázy (aggrecanase) (tabulka 1).
Tabulka 1
matrix degradující enzymy
substráty
kolagen fO c H P (Ό «-< 0> >N c O 1Z >1 1—i t? o Φ P o U ú. fibronektin laminin i ί 1 c P co O : jiné
Γ. Metaloproteinázy
Kolagenázy
MMP-1 (střevní kolagenázy) I . TI, III, VII, X
MMP-P (neutroli lni koiagenázy) I, II, 111
MMP-1.3 (koiagenáza 3) I, II, III
Selat inázy
MMP-3 (žel atináza A) TV, v, VII, IX
MMP-? (zelatináza P‘ τ y y X v
St romeo l.y·: i ny
MMP-3 (xtromeolysin 1 ) aktivuje .MMP zymogeny
MMP-7 (mat r i 1 ys i n} i v
M‘' I'·' *c:‘ V· · ·; IV, v, 1X akt ivuje MM P zymogeny
ΜΪ-JF··—11 ít : raeo ' yo i r. o! r y aktivuj e serpiny
J i né
Mí P -1Ϊ í me t 3 ί. o o i a s t ď ·
MM ť “ .. -í pr?MMř-2 proMMP-13
MMP-I3
MMP-1-3 proMMP-2
MMP-1. 7
ί I. Ag rek.-mázy
MMP jsou syntetizovány ve spojených kloubech chondrocyty, které jsou (u zralé kloubní chrupavky) zcela diferencovanými buňkami udržujícími specificky chrupavčitý matrix fenotyp. Nadměrná produkce MMP (vzhledem k endogenním inhibitorům MMP), která se objevuje při kloubních onemocněních, může vést k degradaci chrupavky. Například kolagen typu II je substrátem pro MMP-13 a MMP-1 (Knuper et al., J. Biol. Chem. 271:1544, 1996) a jak MMP-1, tak MMP-13 proteiny je možné detekovat imunohistochemicky v lidských osteoartritických pletivech. V některých případech je možné nalézt MMP-13 a jeho štěpné produkty ve větším množství než MMP-1 (Billinghurst et al.,
J. Clin. Inves. 99:1534, 1997). MMP-13 tak může hrát důležitou roli v degradaci chrupavky spojené s osteoartritidou a dalšími ·· ···· 4 · ·· ·· ·· · ···· ··· • · 4 4 4 4 · · • · · · 4 · · · 4
4444 4 ·· · · · · 444 degenerativními kloubními onemocněními (Mitchell et al., J. Clin. Inves. 97:761, 1996) .
Zvířecí modely pro syndromy související s osteoartritidou byly popsány u morčat (Watson et al., Arth. Rheum. 39:1327, 1996) a u STR/ORT ínbredního kmene myši (Das-Gupta et al., Int. J. Exp. Path. 74:627,1993). U morčat se spontánní osteoartritida vyvíjí dlouho (šest měsíců nebo déle) a jenom u některých sublinií SRT/ORT myší dochází vždy k vývoji degenerativního kloubního onemocnění. Délka a/nebo variabilita těchto modelů je tedy činí méně vhodnými pro studie spojené s vývojem nových léků.
Další modely osteoartrítidy zahrnují chirurgicky vyvolané destabilizace kloubu, např. protnutí předního křížového vazu a/nebo částečnou minisektomii (meniscectomy) u králíků a psu, která stimuluje degradaci chrupavky (Hulth et al., Acta Orthop. Scand. 41:522, 1970). Jiný model využívá injekce bakteriální kolagenázy do kloubu zvířete, čímž se indukuje biochemické protnutí vazu (Van der Kraan et al., J. Exp. Pathol. 71:19, 1990). Protože ale (i) je nezbytný chirurgický nebo jiný zákrok u každého zvířete (ii) zvířata jsou velká a drahá a/nebo (iii) průběh onemocnění není vždy stejný, nemužou být tyto modely snadno použitelné pro velké studie, včetně studií při vývoji léků.
Transgenní zvířecí modely mohou principiálně poskytnout reprodukovatelný zvířecí model pro degenerativní kloubní onemocnění. Předchozí pokusy vytvořit transgenní zvířata exprimující MMP, jako např. MMP-1 a stromeolysin, nevedly ale k pozorovatelnému fenotypu kloubní degenerace u těchto transgenních zvířat. Mohlo se tak stát díky letalitě embryí, způsobené konstitutivní expresí těchto enzymů. Witty et al., Mol.Biol. Cell 6:1287, 1995 vytvořili transgenní zvířata, která konstitutivně tvoří MMP-1 a stromelysin v pletivech mléčné žlázy, ale tato zvířata nevykazují symptomy osteoartrítidy. D'Armíento et al., Cell 71:955, 1992 představil transgenní myši exprimující lidskou intersticiální kolagenázu v plicích. Liu et al., J. Cell Biol. 130:227, 1995 představili transgenní zvířata se zvýšenou expresí mutovaného kolagenu II typu, což vede k poruchám spojovacích tkání, ale ne k osteoartritidě. Žádný z těchto transgenních zvířecích systémů neposkytuje užitečný zvířecí model
pro osteoartritidu (Khokha et al., Cancer and Metastasis Rev. 14:97, 1995; Shapiro, Natrix Biol. 15:527, 1997).
Mezi odborníky tedy existuje potřeba pro zvířecí modelový systém, který by napodoboval lidské degenerativní kloubní onemocnění, jako např. osteoartritidu, revmatickou artritidu a chondrodysplasii. Transgenní zvířata, obsahující regulovatelné heterologní geny, jejichž exprese by způsobovala degeneraci chrupavek, by byla zvláště vhodná jako reprodukovatelně experimentální kontrola v čase s možností ovlivňovat expresi transgenu a tak s možností regulovat samotný patologický syndrom. Takováto zvířata se můžou použít pro určení hladiny exprese transgenu nutné pro vyvolání onemocnění a (a to je důležité) můžou se použít pro hledání nových léků a optimalizaci léčebných režimů. Zvláště důležité je pak to, že takováto transgenní zvířata se můžou použít pro další určení role matrix degradujících enzymů v degradaci chrupavky a pro (v in-vivo testování) vyhledávání sloučenin, které mění tyto enzymy, nebo sloučenin, které inhibují vývoj degenerativních kloubních onemocnění.
Přehled vynálezu
Předkládaný vynález poskytuje transgenní ne-humání zvířata nebo jejich potomstvo, jejichž somatické a zárodečné (germline) buňky obsahují (ve stabilně integrované formě) jeden nebo více heterologních nebo rekombinantních genů, kódujících polypeptidy tvořící enzymaticky aktivní, matrix degradující enzymy (MDE matrix-degrading enzymes) zejména MMP. Mezi MMP použité ve vynálezu patří MMP-1, MMP-2, MMP-3, MMP-7, MMP-8, MMP-9, MMP-10, MMP-11, MMP-12, MMP-13, MMP-14, MMP-15, MMP-16 a MMP-17, nejlépe jeden nebo víc ze skupiny MMP-1, MMP-3, MMP-8 a MMP-13, a ještě lépe buď MMP-1, nebo MMP-13, nebo oba. Patří sem také enzymaticky aktivní varianty, fragmenty a kombinace těchto polypeptidů. Také se můžou použít jiné matrici degradující enzymy, včetně agrekanáz (aggrecanase). MDE mužou být odvozeny z jakéhokoliv druhu, nejlépe z člověka.
V preferovaném případě jsou rekombinantní MDE kódující geny selektivně exprimovány v kloubních chondročytech transgenních zvířat • · · · · · ·· ·· • · · · · · · • · · · ·· • · · · · · • · · · « · · ··
a exprese se projeví patologickými symptomy charakteristickými pro kloubními degenerativní onemocnění.
Vynález poskytuje transgenní zvířata nebo jejich potomstvo, jejichž somatické a zárodečné buňky obsahují stabilně integrovaný první rekombinantní gen kódující MDE nebo jeho enzymaticky aktivní odvozeninu, přednostně konstitutivně aktivní variantu proMMP-13 (označenou jako MMP-13*), zahrnující sekvenci popsanou v SEQ ID NO:4. Je vhodné, když je první rekombinantní gen pod řízenímu prvního regulovatelného promotoru a v optimálním případě první regulovatelný promotor obsahuje tet07 sekvenci, jako například promotor popsaný v SEQ ID NO:5. Transgenní zvíře může dále obsahovat druhý rekombinantní gen kódující polypeptid regulující první regulovatelný promotor a přednostně je to tTA polypeptid. V těchto případech je druhý rekombinantní gen pod řízením druhého regulovatelného promotoru, zejména takového, který obsahuje sekvence odvozené od kloubně specifického promotoru, nejlépe pro kolagen typu
II. Takový je např. promotor označený v SEQ ID NO:6. Selektivní exprese druhého rekombinantního genu v pletivech kloubu tak vede k regulované specifické expresi rekombinantního MDE v kloubu.
V jiném aspektu poskytuje vynález izolované nukleové kyseliny kódující enzymaticky aktivní varianty MMP, zejména varianty lidského proMMP-13 a nejlépe MMP-13*. Vynález také zahrnuje rekombinantní klonovací vektory obsahující tyto nukleové kyseliny; buňky obsahující vektory; metody pro produkci polypeptidů odvozených od MMP-13 zahrnující pěstování buněk za podmínek vhodných pro expresi MMP-13; a izolované polypeptidy odvozené od MMP-13.
V dalším aspektu vynález poskytuje metody pro vyvolání fenotypových změn charakteristických pro degenerativní onemocnění chrupavek u savců, tj. vystavení transgenních zvířat vynálezu podmínkám, které vedou k expresi MDE kódovaných transgeny. Preferuje se, když jsou transgenní zvířata (obsahující první rekombinantní gen kódující MMP-13* operačně připojený k tet07 promotoru a druhý rekombinantní gen kódující tTAprotein operačně připojený ke kolegenovému promotoru II typu) udržována v přítomnosti tetracyklinu nebo tetracyklnového analoga. Chce-li se indukovat exprese MMP-13*, odstraní se tetracyklin nebo tetracyklinový analog a MMP-13* je selektivně exprimován v kloubních pletivech; výsledkem jsou « · · · · · • ·
fenotypové změny charakteristické pro degenerativní onemocnění chrupavek.
V dalším aspektu vynález poskytuje metody pro určení eventuálního vlivu směsi působící proti degenerativním onemocněním chrupavky. Tyto metody jsou založeny na podávání známých dávek směsí transgenním zvířatům vynálezu buď před, nebo poté, co došlo k vývoji fenotypových znaků typických pro degenerativní onemocnění chrupavky; sledování ukazatelů po předem stanovený čas po podání směsi; a porovnání rozsahu ukazatelů u zvířat, kterým se podala směs ve srovnání s kontrolními transgenními zvířaty, kterým se směs nepodala. Jakýkoliv rozdíl v (i) povaze nebo rozsahu fenotypových znaků degenerativních onemocnění chrupavek, (ii) v čase nutném pro projevení ukazatelů nebo (iii) potřebě dalších opatření pro zlepšení stavu naznačují možnost, že směs působí proti degenerativním onemocněním chrupavky.
Stručný popis obrázků
Obrázky 1A a 1B. (A) Schematická ilustrace struktury lidské
MMP-13 (kolagenázy 3). První okénko (odpovídající krajnímu aminokonci) představuje pre-doménu (signální peptid) směřující vznikající proMMP-13 k sekreci. Druhé okénko představuje pro doménu, která se účastní na udržení latentního stavu enzymu. Vidět je konzervovaná sekvence (SEQ ID NO:1) uvnitř pro domény, která je důležitá pro zachování latence enzymu. Třetí okénko představuje 170 aminokyselinovou katalytickou doménu, která obsahuje konzervovanou oblast (je uvedená; SEQ ID NO:2) důležitou pro katalytickou aktivitu. Čtvrté okénko představuje doménu na karboxy konci velkou 200 aminokyselin. (B) Schéma sekvence nukleové kyseliny (SEQ ID NO:3) kódující konstitutivně aktivní variantu lidského proMMP-13, označenou MMP-13* a aminokyselinovou sekvenci MMP-13* (SEQ ID N0:4). Resídua, která jsou mutovaná vzhledem k nemutovanému typu MMP-13 (zobrazena většími znaky) jsou GTC nukleotidy na pozici 299-301.
Obrázky 2Ά a 2B. Binární strategie použitá pro získání pro chondrocyty specifickéu, doxycyklinem (doxycyclíne, DOX) regulované exprese MMP-13*. (A) První schéma ukazuje krysí promotor kolagenu typu II regulující expresi tetracyklinového represoru - VP16 *····· · · · · · · · • · · · · · · · · «· • · ···· · · · • · · · · · · · · · « • · · 9 · · · « · ···· * 99 ·· ·· ··· aktivátorovy fúzní protein (TA) následovaný místem pro sestřih (splice) a polyadenylačním signálem z SV40 (tento konstrukt má označení CPE - TA). (B) Druhé schéma ukazuje Tet07 promotor (Gossen a Bujard, Proč. Nati. Acad. Sci. USA, 89:5547, 1992) ovládající expresi konstitutivně aktivního lidského MMP 13 proteinu, následovaný sestřihovým a polyadenylačním signálem z SV40 (tento konstrukt má označení Tet07 - MMP13*). Tyto dva nezávislé transgenní konstrukty byly současně vpraveny mikroinjekcí do oplodněných myších embryí, čímž vznikl dvojitý transgen nesoucí oba geny. Za přítomnosti DOX je exprese transgenu vypnuta; odstraní-li se DOX, exprese transgenu se zapne. Šipka označuje místo začátku transkripce, hvězdička ukazuje konstitutivně aktivní mutaci v transgenu MMP13.
Obrázky 3A a 3B. Promotor genu pro kolagen typu II cílí expresi na klouby zkušební transgenní myši exprimující beta-galaktosidázu pod řízením krysího promotoru kolagenu typu II. (A) Schéma CPE-lacZ konstruktu. Krysí promotor kolagenu typu II (první políčko) řídí expresi genu β-galaktosidázy (LacZ) (druhé políčko), pak následuje úsek pro β-globinovou úpravu sestřihem a polyadenylační signál (poslední políčka spojená symbolem pro sestřih). (B) Celkové barvení na beta-galaktosidázovou aktivitu E16 embryí. Transgenní embryo vlevo vykazuje zbarvení (šipky) ve srovnání s netransgenním embryem. (C) Větší detail lokte a přední tlapky u transgenního embrya; je vidět β-galaktosidázové zabarvení (šipky). Obrázky 3B a 3C výrazněji ilustrují vynález jsou li vyvedeny barevně, ale pro pochopení vynálezu stačí černobílé provedení.
Obrázky 4A a 4B. Expresní profil TA a MMP13 RNA provedený pomocí RT-PCR. (A) Amplifikace TA cDNA z celkové RNA. (B)
Amplifikace MMP13* cDNA z celkové RNA. Dráha 1: markéry molekulových hmotností 0Xl64/Hae III; dráha 2: PCR amplifikace transgenní (dráha 6) genomové DNA; dráha 3: PCR amplifikace ne-transgenní genomové DNA; dráha 4: netransgenní (wild type) myš s DOX; dráha 5: netransgenní myš bez DOX; dráhy 6-7: transgenní myš (asi 4 měsíce) s DOX; dráhy 8-9: transgenní myš (asi 4 měsíce) od narození bez DOX. Šipky la a 1b ukazují specifický fragment MMP13* dlouhý 648 bp a specifický fragment 859 bp dlouhý. Pro každou reakci se použily c-fos primery jako interní kontrola; sestřižená mRNA měla 187 bp • ♦ · · ♦ · · φ · · •9 9 9 99 9 9 • ·♦ · (šipka 3) a nesestřižená mRNA 303 bp (šipka 2). Obdobné fragmenty nebyly detekovatelné v odpovídajících drahách obsahujících RNA pro PCR, kde nebyla provedena reverzní transkripce (data nejsou doložena).
Obrázky 5A a 5B. Fotografie ilustrující imunohistochemickou lokalizaci štěpných produktů kolagenu II typu v růstové ploténce (growth plate) a u kloubní chrupavky transgenní myši exprimující transgen z obrázku 2. Pletivo se obarvilo protilátkou, která je specifická proti štěpným produktům kolagenu II typu. (A) Pletivo získané z myší, na které působil doxycyklin, čímž se zabránilo expresi MMP-13*. (B) Pletivo získané z myší, na které nepůsobil doxycyklin (což umožnilo expresi MMP-13*) po dobu 30 dní ve věku 3 měsíců. Obrázky 5A a 5B výrazněji ilustrují vynález jsou li barevné, ale pro pochopení vynálezu stačí černobílé provedení.
Obrázky 6A, 6B a 6C. Barevná fotografie dokumentující barvení kloubní chrupavky a růstové ploténky čéšky u transgenní myši s dvěma transgeny Safraninem O. (A) Pletivo odvozené z myši, na kterou působil doxycyklin. (B) Pletivo odvozené z myši 7 dní poté, co se přestal aplikovat doxycyklin. (C) Pletivo odvozené z myši 14 dní poté, co se přestal aplikovat doxycyklin. Obrázky 6A-C výrazněji ilustrují vynález jsou li barevné, ale pro pochopení vynálezu stačí černobílé provedení.
Obrázky 7A, 7B, 7C a 7D. Podélný průřez zadními koleními klouby (A a B) a synoviem (C a D). (A a C) Věkem shodná kontrola z vrhu a (B a D) linie 6 bez působeni DOX. Zkratky: L, léze; AG, kloubní chrupavka; AG, angiogeneze; IH, infiltrační hyperplasie (infiltration hyperplasia); BM, kostní dřeň; a PL, čéškový vaz. Lokalizace stehenní kosti a čéšky jsou na obrázku vyznačené. Obrázky 7A-D výrazněji ilustrují vynález jsou li barevné, ale pro pochopení vynálezu stačí černobílé provedení.
Detailní popis vynálezu.
Předkládaný vynález je založený na objevu, že regulovaná exprese matrix-degradujicích enzymu v chrupavce transgenní myši vyvolá charakteristické fenotypové změny spojené s matrix degenerativními onemocněními kloubů a meziobratlových plotének.
• · ···· •444
Zvířecí modely vynálezu poskytují nové modelové systémy pro syndromy matrix degenerující choroby, které můžeou být použité pro detailní charakterizaci patologií lidských kloubů a meziobratlových plotének, a také pro výzkum nových léků a optimalizaci léčebných režimů.
Transgenní zvíře vynálezu je zvíře s buňkami, které obsahují transgen, který byl zaveden buď do zvířete, nebo do předků zvířete v prenatálním (zárodečném) stavu. Transgenní zvíře se může například vytvořit vnesením příslušného genu do samčího pronuklea oplodněného oocytu, např. mikroinjekčně; pak se nechá oocyt vyvinout v pseudogravidním samičím pěstounském zvířeti. Daný gen může obsahovat příslušné promotorové sekvence, intronové sekvence a polyadenylační signální sekvence. Metody pro přípravu transgenních zvířat jsou uvedené např. v U.S. Patentech 4 736 866 a 4 870 009 a v Hogan et al., A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 1986. Zvíře, o kterém se zjistil, že je transgenní, se může použít pro chov dalších zvířat nesoucích transgen. Transgenní zvíře nesoucí jeden transgen se může pářit s jiným transgenním zvířetem, které je nositelem jiného transgenu a dát tak vzniknout „dvojitě transgennímu zvířeti, které bude vlastnit oba transgeny. Nebo se případně oba transgeny můžou společně vnést mikroinjekcí, čímž také vznikne „dvojitě transgenní zvíře. Můžou také existovat zvířata s více než dvěma transgeny. Kromě toho se můžou pářit heterozygotní transgenní zvířata, tj. zvířata s pouze jednou kopií transgenu, s druhým heterozygotním zvířetem se stejným transgenem a získat tak homozygotní zvířata s dvěmi kopiemi transgenu.
Předkládaný vynález zahrnuje transgenní zvířata, přednostně savce, které exprimují z rekombinantního genu MDE, zejména MMP a nejlépe MMP s kolagenázovou aktivitou. MDE pro využití ve vynálezu zahrnují kompletně (without limitation) MMP a agrekanázy (aggrecanase). Užitečné MMP zahrnují bez omezení kolagenázy označené MMP-1, MMP-8 a MMP-13; stromelysiny (stromelysins) označené MMP-3, MMP-10 a MMP-11; želatinázy (gelatinases) označené MMP-2 a MMP-9; metalloelastázy označené MMP-12; a membránové MMP označené MMP-14, MMP-15, MMP-16 a MMP-17 (Matrisian, BioEssays, 14:455, 1992). Zde používaný termín matrix degradující aktivita se vztahuje k proteolytické degradaci složek matrix, včetně např. kolagenu, zejména kolegenu typu II a hlavně trojité helikální formě kolagenu
typu II (triple helical form of type II collagen). Jakýkoliv polypeptid, vykazující matrix degradujcící aktivitu, se může použít při praktikování vynálezu, včetně enzymaticky aktivních fragmentů výše zmíněných enzymů. Je vhodné, když dochází k expresi enzymatické aktivity MMP-13. Enzymatická aktivita MMP-13 zde používaná se vztahuje k proteolytické degradaci kolagenu II typu.Může se tedy použít jakýkoliv MMP-13 polypeptid nebo jeho fragment či odvozenina s MMP-13 enzymatickou aktivitu. Enzymy můžou být odvozené od jakéhokoliv zvířecího druhu, včetně například lidí, myší, krys, králíků, prasat, krav nebo nehumáních primátů, či jejich kombinace. Preferuje se, když je MMP-13 nebo jeho odvozenina lidského původu.
Normálně jsou MMP syntetizovány jako prekurzory (tj. jako zymogeny nebo proenzymy), jejichž enzymatická aktivita je latentní; proteolytické odstranění pro oblasti po sekreci vede k enzymaticky aktivnímu proteinu. V preferovaném případě vynálezu je možné obejít potřebu proteolytického zpracování použitím enzymových nebo proenzymových variant, které jsou enzymaticky aktivní i v nerozštípnutém stavu. Takovéto varianty se můžou produkovat běžnými technikami pro místní nebo náhodnou mutagenezi spojenou s analýzou kolagenázové enzymatické aktivity (viz dále). Tímto způsobem se můžou do proenzymové sekvence zavést modifikace (včetně např. inzercí, delecí nebo substitucí), zejména do pro-oblasti nebo v blízkosti místa štěpení pro-oblasti a získat tak konstitutivně aktivní polypeptidy, které nevyžadují pro aktivaci proteolytické zpracování. Nebo se případně může celá pro-oblast odstranit. Kromě toho se můžou použít rekombinantní geny, u kterých se sekvence kódující přírodní signální peptid nahradí heterolgoní sekvencí, která funguje jako signální peptid, tj. vyvolává sekreci. Použití genů kódujících jakékoliv takovéto modifikované MMP polypeptidy je obsaženo ve vynálezu.
Upřednostňuje se, když je při používání vynálezu používán konstitutivně aktivní MMP-13. Zvláště je vhodné, když varianta MMP-13 obsahuje sekvenci zahrnující mutaci v sekvencí kódující PRCGVPDV oblast, SEQ ID N0:7, zejména substituci Pro';':! na Val; sekvence tohoto polypeptidu je znázorněna v SEQ ID NO:4 a tento polypeptid je označený jako MMP-13*. V jiném případě konstitutivně aktivní varianta MMP-13 obsahuje substituci Val'iB za Gly.
Transgenní zvířata vynálezu přednostně vykazují MMP aktivitu regulovaně. Regulovaná exprese znamená dočasné a/nebo prostorové řízení. Dočasné řízení se vztahuje ke schopnosti potlačit expresi MMP aktivity do předem určené doby při vývoji transgenních zvířat, po které se může exprese MMP aktivovat a udržovat na této úrovni po dobu, která je žádoucí. Je dobré, když je exprese MMP potlačená během embryonálního vývoje a aktivovaná u dospělých zvířat. Prostorové řízení znamená schopnost selektivně exprimovat MMP v určitých pletivech. Upřednostňuje se, když se MMP aktivita exprimuje v kloubních pletivech a zejména v kloubních chondrocytech.
Dočasné řízení exprese MMP se dosáhne použitím jednoho nebo více polypeptidů obsahujících represor transkripce, aktivátor transkripce, nebo zesilovač transkripce nebo jejich kombinaci ve spojení s použitým promotorem reagujícím na transkripční represor/aktivátor, který je operačně spojený se sekvencí kódující MMP. V určitých případech je dočasná kontrola exprese MMP dosažená (i) expresí (v transgenních zvířatech) represorového polypeptidu operačně spojeného s polypeptidem, který přímo nebo nepřímo aktivuje transkripci v eukaryotických buňkách, přičemž dochází k tvorbě fúzního polypeptidu represor-aktivátor; a (íi) spojeným využitím cílového promotoru operačně spojeného s MMP kódující sekvencí, jejíž transkripční aktivita reaguje na fúzní polypeptid represoraktivátor. Typicky jsou nukleotidové sekvence, kódující represorový polypeptid, přiligovány ve čtecím rámci k sekvencím kódujícím polypeptid transkripčniho aktivátoru, čímž vznikne chimérický gen kódující fúzní protein.
Mezi užitečné represorové polypeptidy patří všechny polypeptidy obsahující sekvence odvozené z bakteriálních represorú, včetně např. tetracyklinového represorú, LacR represorú, KRAB domény a lambda represorú (cro a cl) a další a také eukaryotické represory, včetně těch, které se účastní syntézy aminokyselin nebo cukrů. Mezi užitečné polypeptidové přímé aktivátory transkripce patří protein 16 herpes simplex viru (VP 16); kvasniční GAL 14; kvasniční STÁT; steroidové receptory, jako např. progesteronový a estrogenový receptor; a konstitutivní aktivátory, jako např. c-fos, c-jun a SP-1. Nebo muže být represorový polypeptid připojen k polypeptidu, který nepřímo aktivuje transkripci náborem transkripčniho aktivátoru fcfc ···· • · · · · » « · * · ·· · · · • ·· · · · · ♦ pro interakci s fúzním proteinem represor-aktivátor; mezi takovéto nepřímé aktivátorové proteiny patří protein vážící se k TATA boxu (TBP - TATA Box Binding Protein) a základní (basic) transkripční faktory, včetně základního transkripčního faktoru D.
Podle vynálezu se používá každý fúzní protein represoraktivátor ve spojení s cílovým promotorem, který reaguje na určitý fúzní protein a který reguluje transkripci sekvence kódující MDE. Promotor typicky obsahuje alespoň jednu operátorovou sekvenci reagující na represorovou část fúzního polypeptidů represoraktivátor, který je operačně připojený k nejméně jednomu promotoru (to at least a minimal promotér), který ovlivňuje transkripci v eukaryotických buňkách. Příkladem vhodných, na represor-citlivých operátorových sekvencí, můžou být sekvence odvozené z operonu tetracyklinové rezistence kódované u TnlO v E.coli, operonu lamda represoru a kvasničního GAL represorového operonu. Příkladem vhodných eukaryotických promotorů, ze kterých můžou být odvozeny minimální promotory, jsou například cytomegalovirus (CMV) IE promotor, promotor PtK-1 (thimidin kináza), HSP (heat shock protein) promotor a jakýkoliv eukaryotický promotor obsahující TATA box. Minimální promotorové sekvence mužou být odvozeny od těchto promotorů (i) tvorbou delečních mutantu využitím běžných metod a (ii) testováním schopnosti výsledné sekvence aktivovat transkripci u buněčné linie. U.S. Patent No. 5 650 298 uvádí fúzní protein represor-aktivátor, obsahující sekvence odvozené z tetracyklinového represoru sfúzovaného s VP16 sekvencemi, který je označen jako tTA a tTA-vnímavý promotor, označený.tet07, který obsahuje od TnlO odvozenou sekvenci spojenou s částí CMV IE promotoru.
Dočasná kontrola se může případně dosáhnout (i) expresí heterologního nebo rekombinantního polypeptidů (nebo polypeptidů) transkripčního aktivátoru v transgenním zvířeti a (ii) spojeným využitím cílového promotoru operačně připojeného k sekvenci kódující MMP, jejíž transkripční aktivita reaguje na heterologní nebo rekombinantní transkripční aktivátor. Mezi užitečné transkripční aktivátory patří modifikovaný ekdyzonový (ecdysone) receptor, u kterého je VP16 transkativační doména (připojená k transaktivační doméně glukokortikoidního receptoru z amino-konce) sfuzovaná s ligand vázající doménou a sekvencí ekdyzonového receptoru karboxy12 ··.. ·«
• * * ♦ · · ♦ • « · · ·· « * ···**· • · » · · ♦ ♦ ·.· « ·< ♦· konce (No et al., Proč. Nati. Acad. Sci. USA 93:3346, 1996); chimérický protein označený jako pGL-VP, obsahující aktivátorové sekvence VP16, aktivační sekvence GAL4 a ligand mutovaného lidského progesteronového receptoru vázající doménu (Wang et al., Proč. Nati. Acad. Sci. USA 91:8180, 1994; Wang et al., Gene Therapy 4:432,
1997); a chimérické proteiny obsahující transkripční aktivátory fúzované s estrogen (nebo jiný steroide) vázající doménou (Mattioni et al., Meth Cell Biol. 43:335, 1994). Ekdyzonový receptorový systém využívá receptor retinoidu X (RXR) pro tvorbu heterodimerů s chimérickým receptorem a reaguje na ekdozyn muristeron (analog ekdozynu) nebo dexamethazon (dexamethasone). Systém pGL-VP reaguje na mifepriston (mifepristone) (RU486). Chimérické receptory obsahující estrogen vázající doménu reagují na hydroxytamoxifen (analog estrogenu).
Prostorové řízení exprese MDE se dosáhne použitím transkripčních promotorů, které zaměří transkripci selektivně do kloubních pletiv. Výraz specifická exprese v kloubech se zde používá ve významu exprese větší v kloubech, než v jiných buňkách; typicky je hladina exprese v nekloubních pletivech menší než 10; hladiny exprese v kloubech. Preferuje se, když je exprese, v nekloubních pletivech nedetekovatelná. Užitečné promotorové sekvence, které vyvolají kloubně specifickou expresi sekvence, ke které jsou operačně připojené, zahrnují sekvence odvozené od promotoru kolagenu typu II. Je zřejmé, že kloubně specifický promotor vynálezu může obsahovat jednu nebo více kopií určitých sekvencí nebo sub-sekvencí a tyto sekvence můžou být v přímé nebo opačné orientaci relativně vůči sobě navzájem a relativně vůči sekvenci, jejíž exprese je řízena promotorem.
Koordinované prostorové a dočasné řízení exprese MDE se přednostně dosáhne (i) umístěním exprese fúzního polypeptidu represor-aktivátor nebo transkripčního aktivátorového polypeptidu pod řízení promotoru specifického pro kloub (ii) umístěním exprese MDE nebo odvozeniny MDE pod řízení promotoru odpovídajícího na fúzní polypeptid represor-aktivátor nebo transkripční aktivátorový polypeptid a (iii) tak, že jsou transgenní zvířata během fetálního vývoje a v časně po narození v podmínkách, kdy je exprese MDE potlačena.
»«·· ·· ·«
Metoda, kterou jsou transgenní zvířata udržována během fetálního vývoje a časně po narození v podmínkách, kdy nedochází k expresi MDE, závisí na tom, které určité transgeny jsou exprimované. Když se použije fúzní polypeptid represor-aktivátor, represe se dosáhne tak, že se zvířatům podává látka, která se váže na fúzní protein represor-aktivátor a výsledkem pak je represe transkripce cílového MDE genu. U zvířat obsahujících transgen kódující fúzní polypeptid represor-aktivátor obsahující tet represorové sekvence se represe dosahuje podáváním tetracyklinu nebo tetracyklinového analoga v potravě nebo pitné vodě pro matku a po narození i pro potomstvo. Tetracyklin nebo analog tetracyklinu se také může podávat tak, že se chirurgicky subkutánně implantují pelety, které s postupujícím časem tyto látky uvolňují (Innovative Research of America, lne., Sarasota FL). V tomto případě vazba tetracyklinu nebo tetracyklinového analoga na fúzní protein represor-aktivátor zabrání vazbě fúzního proteinu na analogický promotor a aktivaci transkripce. Tetracyklinová analoga jsou sloučeniny blízce příbuzné tetracyklinu, které se vážou k tet represoru s Ka nejméně 10‘JM‘, nebo lépe s afinitou 10?M'* či větší. Mezi účinná tetracyklinová analoga patří doxycyklin (doxycycline), anhydrytrotetracyklin (anhdryrotetracycline), chlortetracyklin (chlortetracycline) , epioxytetracyklin (epioxytetracycline) a další. Použité dávky jsou takové, aby se podstatně omezila exprese MMP. Typicky se tetracyklin nebo tetracyklinový analog podávají v pitné vodě pro zvířata v dávce asi 1 mg/ml. Když se mají MMP exprimovat, přestane se tetracyklin nebo jeho analog podávat.
V jiných případech se represe dosáhne tak, že se zvířeti nedostane látky, která je nutná pro aktivitu transkripčního aktivátorového polypeptidu. Například jestliže je transkripční aktivátor modifikovaný ekdyzonový receptor, jsou zvířata během fetálního a časně postnatálního vývoje bez ekdyzonu nebo ekdyzonového analoga. Ekdyzonová analoga jsou sloučeniny blízce příbuzné ekdyzonu, které se váží na modifikovaný ekdyzonový receptor s Ka nejméně 10'’M‘. Mezi užitečná ekdyzonová analoga patří například muristeron A (muristerone A). Když se požaduje exprese MDE, je zvířatům podán např, ekdyzon nebo muristeron A intraperitoneální injekcí v dávkách mezi asi 10 mg a asi 20 mg /zvíře. Obdobně • « · * · · použije-li se pGL-VP, aktivace se dosáhne podáním mefiprestonu (mefiprestone).
V preferovaném případě se vytvoří transgenní zvíře, jehož somatické a zárodečné buňky obsahují dva rekombinantní geny ve stabilní integrované formě: (i) první rekombinantní gen obsahuje sekvenci kódující MMP-13*, kde je sekvence operačně spojená s tetO7 promotorem; a (ii) druhý rekombinantní gen kóduje tTA protein operačně připojený k promotoru kolagenu typu II. V tomto případě jsou zvířata udržována během fetálního a časně postnatálního vývoje v přítomnosti tetracyklinu nebo tetracyklinového analoga, čímž dochází k represi genu. Později se tetracyklin nebo tetracyklinový analog odstraní a v kloubních pletivech dochází k selektivní expresi enzymatické aktivity MMP-13.
Zvířecí modely pro degenerativní onemocnění chrupavky
Předkládaný vynález poskytuje zvířecí modelové systémy, které reprodukovatelné vykazují fenotypové změny charakteristické pro degenerativní onemocnění chrupavky, jako například onemocnění kloubní nebo plotének. Tyto onemocnění zahrnují bez omezení osteoartrítidu, revmatickou artritidu, chondrodysplazii a degenerativní onemocnění meziobratlových plotének. Modelové systémy vynálezu vykazují jeden nebo více fenotypových indikátorů běžných pro tyto onemocnění, mezi které patří například ztráta proteoglykanu (detekované například tím, že se ztrácí barvení Safraninem 0) a štěpení kolagenu typu II v postižených pletivech. Systémy zahrnují transgenní zvířata popsaná výše, u kterých jsou v určeném čase během života transgenních zvířat exprimovány v chrupavkách rekombinantní nebo heterologní MDE, zejména MMP. Načasování objevení se indikátorů degenerace chrupavek je dáno aktivací exprese MDE a monitorováním účinku na chrupavky (viz níže). Preferuje se, když dochází k expresi jednoho nebo více MDE po narození, nejlépe tehdy, když zvířata dosáhnou dospělosti.
Exprese transgenú je typicky monitorována extrahováním mRNA z různých pletiv a jedním z následujících postupů: (i) reverzní transkripce s polymerázovou řetězovou reakcí (RT-PCR) s použitím primerů homologních k transgenům; (ii) ochrana před RNasami (RNase
..... · ··'' ♦ »·· ·* - «φ • * φ φ · φ · • φ φ φφφ φ φ φφφφ» φ φ φ φ φ φ φφφφ φ φφ «· protection); a (iii) Northern blot analýza (Northern blot analysis). Také se může provést in šitu hybridizace.
Fyziologické účinky exprese MDE na kloubní chrupavky se monitorují na testovaných zvířatech po usmrcení, obarvením parafinových odvápněných chrupavek (i) hematoxylinem a eosinem (s využitím konvenčních technik) a následovně dvojitým barvením (ii) Safraninem 0 a barvivém „fast green (Peter et al., J. Exp. Pathol. 71:19, 1990). Nebo se můžou zmrazené řezy obarvit pomocí protilátek, které jsou specifické pro fragmenty štěpení odvozené od kolagenu typu II (Billinghurst et al., J. Clin. Invest. 99:1534, 1997). Typicky vyvolá alespoň sedmidenní exprese MMP transgenu (transgenů) detekovatelnou ztrátu proteoglykanu a změny v morfologii růstové ploténky (growth plate morphology) (viz např. přiklad 5 dole).
V rámci tohoto vynálezu jsou zvířecí modely, u kterých exprese MDE, zejména MMP a hlavně enzymaticky aktivních forem MMP-13, vede ke ztrátě proteoglykanu a/nebo ke štěpení kolagenu typu II.
Jiné fenotypové indikátory degenerativních onemocnění chrupavek, které mohou být monitorovány v transgenních zvířatech podle tohoto vynálezu, zahrnují například celkové pozorování změn ve funkci kloubů a histologické důkazy (i) tvoření vláken (fibrilation) a ztráty kloubní chrupavky a (ii) tvorba osteofytu.
Transgenní zvířata vynálezu jsou užitečným modelem pro syndromy patologických stavů, které vykazují narušení složení, morfologie a/nebo funkce chrupavky, včetně osteoartritidy; revmatické artritidy; degenerativní onemocnění meziobratlových plotének; chondriodysplasie včetně např. Kneistovy dysplasie (Kneist dysplasy), achondrogeneze (achondrogenesis) a hypofosfatie (hypophosphatasia); a proteoglykany vyvolané poruchy, jaké se objevují např. u brachymorfních (brachym.orphic) zvířat (Halí et al., Cartilage: Molecular Aspects, CRC Press, 1991, pp. 201-203).
Transgenní zvířata vynálezu se můžou podrobit dalším zákrokům s cílem ovlivnit indikátory degenerace chrupavek a/nebo doplnit fenotyp nemocných zvířat dalšími fyziologickými efekty, jako např. těmi, které jsou spojeny s určitým onemocněním. Například se na transgenní zvířata může působit látkami vyvolávajícími záněty s cílem zvýšit degradací kolagenu a/nebo indukovat ztrátu proteoglykanu (viz např. příklad 6 dále). Kromě toho se pro
« • · zopakování symptomů určitého onemocnění nebo syndromu může použít načasování a rozsah indukce MDE, ať už s nebo bez dalších zákroků.
Metody pro hodnocení látek, které ovlivňují degenerativní onemocnění chrupavky.
Předkládaný vynález zahrnuje metody pro objevování a hodnocení účinnosti léčiv a léčebných postupů proti degenerativním onemocněním chrupavky, zejména kloubním degenerativním onemocněním. V jedné formě vynálezu se transgenní zvířata chovají za podmínek, kdy exprese jednoho nebo více MDE vede ke vzniku jednoho nebo více fenotypových ukazatelů degenerativního onemocnění chrupavky. Jakmile dojde k objevení se symptomů, můžou se hodnotit látky, které mají působit proti degenerativnímu onemocnění chrupavky. Podávají se ve známých dávkách zvířatům, u kterých se objevily symptomy;
monitorováním fenotypových indikátoru po předem určenou dobu po podání testovaných látek; a porovnáním s rozsahem fenotypových indikátorů u zvířat, kterým se aplikovala látka, se zvířaty kontrolními. Kontrolní zvířata zahrnují transgenní zvířata stejného pohlaví a věku chovaná za stejných podmínek (tj. exprimující transgeny), kterým se ale neaplikuje testovaná látka. Jakékoliv statisticky významné odchylky v rozsahu nebo povaze fenotypových indikátorů naznačují možné působení testované látky proti degenerativnímu onemocnění chrupavky. Fenotypovými indikátory degenerativního onemocnění chrupavky se rozumí ztráta proteoglykanu, zúžení kloubní mezery (joint space narrowing), degradace kolagenu a odbourávání chrupavky.
Schopnost látky působit proti degenerativním onemocněním chrupavky, zejména proti degenerativnímu onemocnění kloubů, se hodnotí jejím aplikováním transgennímu zvířeti ve známé dávce před a/nebo současně s indukcí exprese MDE u transgenního zvířete; monitorováním fenotypových indikátorů degenerativního onemocnění chrupavky po určenou dobu po aplikaci látky a indukci MDE; a porovnáním rozsahu fenotypových indikátorů a/nebo onemocnění u zvířete, kterému byla aplikována testovaná látka a zvířete kontrolního, kterému testovaná látka podána nebyla. Jakákoliv statisticky významná odchylka v rozsahu nebo povaze fenotypových • · * · ··« · · *· ··«· ·· · ♦ • #
indikátorů a/nebo onemocnění naznačují možné působení testované látky proti degenerativnímu onemocnění chrupavky.
Další náznak schopnosti látky působit proti degenerativnímu onemocnění chrupavky je její schopnost způsobit jakékoliv snížení rozsahu nebo trvání jiných ošetření, včetně např. dávky a doby podávání jiné terapeutické látky použité pro ulehčení symptomů onemocnění.
Sloučeniny, které se můžou testovat na jejich schopnost působit proti degenerativnímu onemocnění chrupavky, se můžou nalézt např. mezi zdroji přírodních látek, fermentačními zdroji (včetně rostlin a mikroorganismů), kombinačními zdroji, zdroji sloučenin, syntetických sloučenin a sloučenin vzniklých jako výsledek cíleného návrhu a syntézy. Zdroje syntetických sloučenin jsou komerčně dostupné například od Maybridge Chemical Co. (Trevillet, Cornwal, UK), Comgenex (Princeton, NJ), Brandon Associates (Merrimack, NH) a Microsource (New Milford, CT). Řídce se vyskytující chemické zdroje jsou dostupné od Aldrich Chemical Company, lne. (Milwaukee, WI). Zdroje přírodních látek ve formě extraktů z bakterií, hub, rostlin a zvířat jsou k dispozici například od Pan Laboratories (Bothell, WA) , nebo MycoSearch (NC), nebo je možné si je snadno připravit. Knihovny přírodních nebo synteticky připravených látek je navíc možné snadno modifikovat konvenčními chemickými, fyzikálními a biochemickými způsoby (Blondelle et al., TibTech 14:60, 1996)
Transgenní zvířata
Pojem transgenní zvířata se zde používá pro zvířata, do kterých byl vnesen jeden nebo více heterologních a/nebo rekombinantních genů. Transgeny můžou být z odlišného druhu, nebo z toho samého druhu jako transgenní zvíře, ale nevyskytují se přirozeně ve zvířeti v té podobě a/nebo na chromozomálním lokusu jako transgen. Transgeny můžou obsahovat cizorodé DNA sekvence, tj. sekvence normálně se nevyskytující v genomu hostitelského zvířete. Místo těchto sekvencí (nebo kromě nich) transgeny můžou obsahovat endogenní DNA sekvence, které byly přeskupeny nebo mutovány in vitro, s cílem ovlivnit normální in vivo expresi genu, nebo ovlivnit či eliminovat biologickou aktivitu endogenního genového produktu kódovaného genem.
• ·
• · ······· • ·· · ·· · · ·· ···
Vynález se také týká DNA fragmentů, které jsou vneseny do preexistujícího genu, s cílem např. změnit modely exprese nebo poskytnout prostředky pro regulaci exprese genu (Watson et al., „The Introduction of Foreign Genes Into Mice. v Recombinant DNA, 2nd Ed., W.H. Freeman & Co., New York, 1992, str. 255-272; Gordon, J.W.,
Intl. Rev. Cytol. 115:171, 1989; Jaenisch, Science 240:1468, 1989; Rossant, Neuron 2:323, 1990).
Transgenní, nehumánní zvířata vynálezu se získají vnesením transgenů do zárodečné buňky nehumánních zvířat. Pro vnesení transgenu vynálezu se používají cílové embryonální buňky v různém vývojovém stadiu. V závislosti na stavu vývoje cílové embryonální buňky (buněk) se na to používají různé metody. Mezi tyto metody patří například mikroinjekce zygoty, integrace viru, transformace embryonálních kmenových buněk postupem popsaným dále a další metody.
1. Preferovanou metodou pro vnesení transgenu do zvířecího genomu je mikroinjekce zygoty. Jako cílová buňka pro mikroinjekci transgenní DNA sekvencí se preferuje zygota, což je fertilizované vajíčko, u kterého nedošlo k pronukleární fúzi nebo následnému buněčnému dělení. Myší samčí pronukleus dosahuje velikosti asi 20 mikrometrů v průměru, což je velikost dostatečná pro reprodukovatelnou injekci 1-2 pikolitrú roztoku s transgenní DNA. Použití zygoty pro vnesení transgenu má výhodu v tom, že ve většině případů dojde k inkorporaci sekvence transgenní DNA do genomu hostitelského zvířete před prvním buněčným dělením (Brinster et al., Proč. Nati. Acad. Sci. USA 82:4438, 1985). V důsledku toho všechny buňky vzniklých transgenních zvířat (zakladatelská zvířata - founder animals) stabilně ponesou inkorporovaný transgen na určitém genetickém lokusu, označený jako transgenní alela. Transgenní alela vykazuje Mendelovskou dědičnost, tj . polovina potomstva z křížení mezi transgenním zvířetem a netransgenním zvířetem bude dědit transgenní alelu v souladu s Mendelovskými pravidly náhodného uspořádání.
2. Pro vnesení transgenu vynálezu do zvířete se také může použít integrace viru. Vyvíjející se embrya jsou pěscována in vitro do vývojového stádia blastocyt. Blastomery se můžou infikovat odpovídajícími retroviry (Jaenich, Proč. Nati. Acad. Sci. USA 73:1260). Infekce blastomer se muže zvýšit enzymatickým odstraněním « · zóny pellucida. Transgeny se vnesou virálními vektory, které typicky nesou defekt pro replikaci, ale které zůstávají způsobilé pro integraci k viru připojené DNA sekvence (včetně sekvence transgenní DNA připojené k takovéto virové sekvenci) do hostitelského zvířecího genomu. Transfekce se snadno a účinně dosáhne kultivováním blastomer v monovrstvě buněk produkujících transgen obsahující virový vektor. Infekce je také možné dosáhnout použitím buněk v pozdějším vývojovém stádiu, například blastocel. V každém případě bude většina zakladatelských zvířat získaných integrací viru mozaikových pro transgenní alelu; to znamená, že transgen je inkorporován pouze do části všech buněk zakladatelského transgenního zvířete. Navíc může dojít k vícenásobné integraci viru do jednotlivého zakladatelského zvířete, čímž vznikne více transgenních alel, které segregují v budoucích generacích potomků. Vnesení transgenu do zárodečných buněk touto metodou je možné, ale dochází k němu pravděpodobně s nižší frekvencí. Jakmile je ale touto metodou vnesen transgen do zárodečné buňky, je možné získat potomstvo, kde bude transgenní alela přítomná ve všech zvířecích buňkách, tj. jak v somatických, tak v zárodečných buňkách.
3. Embryonální kmenové (embryonal stem, ES) buňky můžou také sloužit jako cílové buňky pro vnesení transgenu vynálezu do zvířat. ES buňky se získají z neuhnizděných (pre-implantation) embryí, která se kultivují in vitro (Evans et al., Nátuře 292: 154, 1981). ES buňky, které byly transformovány transgenem, se můžou kombinovat se zvířecím blastocytem; ES buňky poté osídlí embryo a přispějí ke vzniku zárodečné buňky výsledného zvířete (což je chiméra, tj. je složená z buněk odvozených ze dvou nebo více zvířat). Opět platí, že jakmile je transgen vnesen touto metodou do zárodečných buněk, můžeme získat potomky, u kterých je transgenní alela přítomná ve všech zvířecích buňkách, tj. jak somatických tak zárodečných buňkách.
I když je počáteční vnesení transgenu Lamarkistická (neMendelovská) událost, můžou být transgeny vynálezu stabilně integrovány do zárodečných buněk a přenášeny do potomstva transgenního zvířete jako Mendelovské místo (Mendelian loci). Jiné transgenní techniky dají vzniknout mozaikovým transgenním zvířatům, u kterých některé buňky nesou' transgeny a jiné buňky ne. U • · · ·
• · · · ·· · ·· · • · »····· ····· ·· ·· ·· mozaikových transgenních zvířat, kde zárodečné buňky nenesou transgen, nedochází k přenosu transgenu do potomstva. Nicméně se dají mozaiková transgenní zvířata použít pro demonstraci fenotypu spojeného s transgeny.
V praxi vynálezu jsou zvířata udržovací linie křížena se zvířaty s takovým genetickým původem, kdy exprese transgenu vyvolá symptomy degenerativního onemocnění chrupavky. Potomstvo se zděděnými transgeny vynálezu se odliší od ostatních potomků ve vrhu, kteří nezdědili transgen, analýzou genetického materiálu z potomstva na přítomnost sekvencí nukleové kyseliny z transgenu vynálezu. Například biologické tekutiny, které obsahují polypeptidy výhradně kódované transgeny vynálezu, se můžou analyzovat imunoanalýzami na přítomnost těchto polypeptidů. Jednodušším a spolehlivějším způsobem identifikace potomstva je získání vzorku tkáně z „okraje zvířete, například z ocasu, a analýza vzorku na přítomnost sekvencí nukleových kyselin odpovídajících části nebo částem sekvence DNA transgenu vynálezu. Přítomnost takovýchto sekvencí nukleové kyseliny se může provést například hybridizační („Southern) analýzou s DNA sekvencemi odpovídajícími určité části transgenu, analýzou produktu PCR reakce s použitím DNA sekvence ze vzorku jako substrátu, oligonukleotidy odvozenými z DNA sekvence transgenu a podobně.
Nukleové kyseliny, vektory, expresní systémy a polypeptidy.
Předkládaný vynález zahrnuje izolované nukleové kyseliny kódující MDE, zejména MMP a enzymaticky aktivní fragmenty od nich odvozené, a také konstitutivně aktivní varianty MMP a enzymaticky aktivní fragmenty z nich odvozené. Vynález také zahrnuje dodatky výše uvedených nukleových kyselin; vektory obsahující nukleové kyseliny; buňky obsahující vektory; a izolované polypeptidy kódované nukleovými kyselinami.
Při práci s předkládaným vynálezem se použije mnoho technik běžných v molekulární biologii, mikrobiologii, rekombinantni DNA a proteinové biochemii, jako například techniky vysvětlené například v Sambrook et al., 1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spriong Harbour Laboratory Press, Cold Spring Harbour, New York; DNA Cloning: A Practical Approach, Volume and II, • · · · · ·
99·· ··
1985 (D.N. Glover ed.); Oligonucleotide Synthesis, 1984, (M.L. Gait ed.); Transcription and Translation, 1984 (Hames and Higgins eds.);
A Practical Guide to Molecular Cloning; série, Methods in Enzymology (Academie Press, lne.); a Protein Purification: Principles and Practice, Second Edition (Springer - Verlag, N.Y.) atd.
Zde používaný termín „nukleová kyselina nebo „polynukleotidy se vztahuje k puriny a pyrimidiny obsahujícím polymerům jakékoliv délky, buď polyribonukleotidům nebo polydeoxyribonukleotidúm nebo směsi polyribo-polydeoxyribo nukleotidů. To zahrnuje jedno- a dvouřetězcové molekuly, např·. DNA-DNA, DNA-RNA a RNA-RNA hybridy a také „proteinové nukleové kyseliny (protein nucleid acids, PNA) vytvořené konjugací bází k aminokyselinové kostře. Patří sem také nukleové kyseliny obsahující modifikované báze.
„Kódující sekvence nebo „protein kódující sekvence je polynukleotidová sekvence schopná transkripce na mRNA a/nebo schopná translace na polypeptid. Hranice ohraničující kódující sekvenci jsou typicky dané translačním startovacím kodonem na 5'-konci a translačním stop kodonem na 3'-konci.
Zde používaný pojem „komplementsekvence nukleové kyseliny se vztahuje k antimediátorové (antisense) sekvenci, která se účastní Watsnon-Crickova párování baží s originální sekvencí.
Zde používaný pojem „izolovaná nukleová kyselina nebo polypeptid se vztahuje ke komponentům, které jsou získány z místa svého normálního výskytu (například jejich přirozeného výskytu, vyskytují-li se přirozeně). Izolovaná nukleová kyselina nebo polypeptid typicky obsahují méně než 50% (v lepším případě méně než 75?; a nejlépe méně než 90%) buněčných komponentů, se kterými byly původně sdružené.
Nukleová nebo polynukleotidová sekvence, která je „odvozená od určené sekvence, se vztahuje k sekvenci, která odpovídá oblasti zmíněné sekvence. Pro sekvence nukleových kyselin to zahrnuje sekvence, které jsou homologní nebo komplementární k dané sekvenci a také „sekvenčně konzervativní varianty a „funkčně konzervativní varianty. Pro polypeptidové sekvence se to týká „funkčně konzervativních variant. Sekvenčně konzervativní varianty jsou ty, u kterých změna jednoho nebo více nukleotidu v daném kodónu nemá vliv na aminokyselinu kódovanou touto pozicí. Funkčně konzervativní • · ···· ·· · · ·· • · · · · · · · · · varianty jsou ty, u kterých byl daný aminokyselinový zbytek v polypeptidu změněn bez ovlivnění celkové konformace a funkce přirozeného polypetidu. Může se jednat například o záměnu aminokyseliny za jinou se stejnými fyzikálně chemickými vlastnostmi (jako například kyselá, zásaditá, hydrofobní a podobně). Mezi „funkčně konzervativní varianty patří také jakékoliv polypeptidy, které mají schopnost vyvolat protilátky specifické proti danému polypeptidu.
Nukleové kyseliny, zahrnující jakékoliv zde uvedené sekvence nebo jejich varianty, se můžou připravit konvenčními metodami. Například DNA se může syntetizovat chemicky např. použitím fosforamiditové metody využívající pevného povrchu (Matteucci et al., 1981, J. Am. Chem. Socc 103:3185) nebo metodu popsanou v práci Yoo et al., 1989, J. Biol. Chem. 764: 17708, nebo použitím jiné všeobecně známé metody. Může se toho také dosáhnout následným spojením řady oligonukleotidových kazet obsahujících páry syntetických oligonukleotidů.
Díky degeneraci genetického kódu může být daná aminokyselinová sekvence nebo její část kódovaná mnoha ruz,nýni nukleotidovými sekvencemi. Mužou se tak vybrat kodóny pro optimální expresi v porokaryotních nebo eukaryotních systémech. Takovéto degenerované varianty jsou také zahrnuté v tomto vynálezu.
Nukleové kyseliny se také mužou odborníkům známými způsoby modifikovat. Takovýmito modifikacemi můžou být například metylace, „čepičky, substituce jednoho nebo více přirozeně se vyskytujících nukleotidů jejich analogy, internukleotidové modifikace jako například modifikace s nenabitými vazbami (např. metyl fosfonáty, fosfotriestery, fosforamidy (phosphoramidates), karbamáty atd.) a s nabitými vazbami (např. fosforothioáty (phosphorothioates), fosforodithioáty (phosphorodithioates) atd.). Nukleové kyseliny můžou obsahovat jednu nebo více kovalentně připojených částí, jako např. proteiny (např. nukleázy, toxiny, protilátky, signální peptidy, poly-L-lysin atd.), interkalátory (např. akridin, psoralen atd.), chelátorv (např. kovy, radioaktivní kovy, železo, oxidační kovy atd.) a alkylační činidla (alkylators). Termín „nukleová kyselina také zahrnuje PNA. Nukleová kyselina může být upravena tvorbou metylového nebo etylového fosfotriesteru nebo alkyl • · 4 4 4 4 ·· ·· ·* • 4 4 4 · 4 · · *·
4 4 444 4 ·
4 4444 44 4
4··4· · · · · * · · · · fosforamidátovu vazbou. Sekvence nukleových kyselin předkládaného vynálezu můžou být také modifikovány značkou schopnou produkovat detekovatelný signál, ať už přímo nebo nepřímo. Značkami můžou'být například radioisotopy, fluorescenční molekuly, biotin a podobně.
Polypeptidy vynálezu se můžou exprimovat s použitím mnoha známých vektorů, jako např. pUC plasmidu, pET plasmidů (Novagen, lne., Madison, WI) nebo pRSET či pREP plasmidy (Invitrogen, San Diego, CA) a mnoha vhodných hostitelských buněk, s využitím metod uvedených nebo citovaných zde, nebo známých odborníkům v této oblasti. Konkrétní výběr vektor/hostitel není pro praxi vynálezu kritický. Rekombinantní klonovací vektory často budou obsahovat jeden nebo více replikačních systémů pro klonování nebo expresi; jeden nebo více markérů pro selekci v hostiteli, například resistenci na antibiotikum; a jednu nebo více expresních kazet. Vkládané kódující sekvence se můžou syntetizovat standardními metodami, izolovat z přírodních materiálů, připravit jako hybridy a podobně. Známými metodami se může provést ligování kódujících sekvencí k elementům regulujícím transkripci a/nebo k jiným aminokyseliny kódujícím sekvencím. Vhodné hostitelské buňky se můžou transformovat/transfekovat/infikovat jakoukoliv vhodnou metodou včetně elektroporace, absorpce zprostředkované CaCL·, infekce houbami, mikroinjekcemi, mikroprojektily nebo jinými zavedenými metodami.
Vhodné hostitelské buňky zahrnují bakterie, archebakterie, houby, kvasinky, rostlinné a živočišné buňky (zvláště savčí buňky). Zejména se používají E. coli, S. aureus, B. subtilis, Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces carlsbergensís, Schizosaccharomyces pombi, buňky SF9, buňky C129, buňky 293, Neurospora, buňky CHO, COS, HeLa a imortalizované savčí myeloidní a lymfoidní buněčné linie. Mezi preferované replikační systémy patří M13, ColEl, SV40, baculovirus, lambda, adenovirus, cytomegalovirus a další. Byl izolován velký počet regulačních oblastí inicializujících transkripci a terminaci, které jsou účinné v transkripci a translaci heterologních proteinů v různých hostitelích. Příklady těchto oblastí, metod izolací, způsobů manipulace atd. jsou známé (Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Willey, 1977). Za podmínek • · · · · · • · ♦ • · • · * • · ···· ·
vhodných pro expresi se můžou hostitelské buňky použít jako zdroj rekombinantně získaných peptidů a polypeptidů.
MDE předkládaného vynálezu, včetně funkčně konzervativních variant, se můžou izolovat z přirozených nebo heterologních organismů nebo buněk (včetně například baktérií, hub, hmyzích, rostlinných nebo savčích buněk), do kterých byly vneseny a následně exprimovány protein kódující sekvence. Tyto polypeptidy můžou být také produkovány v nebuněčných systémech pro syntézu proteinů, které můžou být následně obohacené mikrosomálními membránami - pro dosažení glykosylace a zpracování pre-prokolagenáz signálním peptidem (signál peptide processing of preprocollagenases). Polypeptidy můžou být kromě toho chemicky syntetizovány komerčně dostupnými automatizovanými postupy, včetně například uzavřené syntézy na pevné fázi (exclusive solid phase synthesis), metodami částečné pevné fáze, kondenzace fragmentů nebo klasickou syntézou s roztoky.
Metody pro purifikaci polypeptidu jsou odborníkům dobře známé a patří mezi ně například prepatativní disková gelová elektroforéza, isoelektrická fokusace, HPLC, HPLC s reversní fází, gelová filtrace, iontově výměnná a dělící chromatografie a protiproudné rozdělení (contercurrent distribution). Pro některé účely je výhodnější vyprodukovat polypeptid v rekombinantním systému, kde protein obsahuje další sekvenci -kotvu (tag)-, která usnadní purifikaci. Takovouto sekvencí muže být například polyhistidinová sekvence. Polypeptid se pak může purifikovat z hrubého lyzátů hostitelské buňky chromatografií na vhodné matrici na pevné fázi, nebo se jako purifikační činidlo můžou použít protilátky připravené proti těmto peptidům. Použitelné jsou i další purifikační metody.
Konstrukce a analýza variant MMP a odvozenin, které vykazují enzymatickou aktivitu a přednostně konstitutivní enzymatickou aktivitu, se může dosáhnout rutinní aplikací konvenčních metod. Zaprvé, nukleová kyselina kódující MMP se modifikuje buď místní nebo náhodnou mutagenezí, nebo se použije v konstrukčním plánu jako jeden segment fúzního genu. Je dobré,když postup dá vzniknout modifikaci buď obsažené uvnitř sekvence kódující pro-oblast, nebo blízko štěpného místa pro oblastí; to zahrnuje úplné odstranění pro-oblasti. Nebo se mužou připravit sekvence kódující fúzní • » · · · · · · 4 4 ·4
4 4 4 4 4 4 4 4 4
4 4 4 94 9 4
4 4 4 4 4 4 4 4
4449 9 44 99 44 444 proteiny buď mezi enzymaticky aktivními MMP doménami a jinými polypeptidy, nebo mezi různými MMP. Modifikovaná nukleová kyselina se potom použije pro programování syntézy varianty MMP, buď v bezbuněčných systémech nebo v intaktních buňkách (včetně permeabilizovaných buněk), nebo v transgenním zvířeti. Přednostně se pro expresi variant MMP nebo odvozenin používají buď bezbuněčné systémy, nebo buněčné systémy. Rozsah štěpení pro-oblasti se hodnotí metabolickým značením a rozdělením MMP produktu pomocí SDS-PAGE. Nakonec se měří enzymatická aktivita MMP s použitím konvenčních testů, jako například kvantifikací štěpení přírodních substrátů nebo modelových peptidů, jak je uvedeno např. v Weingarten et al., Biochem. 24:6730, 1985; Woessner et. Al, J. Biol. Chem., 263:16918 a Knight et al., FEBS Letts., 296:263, 1992. V tomto případě se může rutinně připravit a testovat na MMP enzymatickou aktivitu velký počet variant MMP a jejich odvozenin, včetně např. funkčně konzervativních variant MMP-13*.
Popis preferovaných forem
Následující příklady jsou zamýšlené jako některé demonstrace předkládaného vynálezu.
Příklad 1: Konstrukce genu kódujícího modifikovaný, konstitutuivně aktivní ProMMP-13
Následující experimenty se provedly s cílem vytvořit gen kódující prokolagenázu (procollagenase) odvozený od MMP-13, který je enzymaticky aktivní nedojde-li k rozštěpení pro-oblasti. Sekvence této varianty proMMP-13, označené jako MMP13* je uvedená v SEQ ID NO: 4 .
Místní mutagenese pro modifikování MMP-13 cDNA
Rozštěpením plazmidu pNot3A (Freije et al., J. Biol. Chem.
269:16766, 1994; GENBANK přístupové číslo X75308) enzymy Xbal a
HindlII a purifikací vzniklého fragmentu o délce asi 1515 bp se získal fragment cDNA kódující proMMP. Tento fragment se nakloňoval • · ♦ · • · · · · « do Tet-rezistentního/Amp-citlivého pAlter plasmidu (Promega,
Madison, WI), který byl rozštěpen enzymy Xbal a HindlII.
Místní mutageneze se provedla s použitím soupravy Altered Sites II in vitro Mutagenesis System (Promega, Madison, Wi). Stručně, fágemidová jednořetězcová DNA se vypurifikovala z kultur obsahujících pomocný fág R408 (Promega). Kromě ampicilinových - ne tetracyklinových (Amp repair - Tet knock-out) konverzních oligo (Promega) se k jednořetězcové DNA připojil fosforylovaný oligonukleotid se sekvencí
5'-AAGCCAAGATGCGGGGTTGTCGATGTGGGTGAATACAAT-3', SEQ ID NO:8; pak proběhla syntéza mutovaného řetězce. Reakční směs se potom použila pro transformaci E. coli kmene ES1001 mutS (bez reparace) a kultura se pěstovala v selektivním médiu s ampicilinem. Z izolovaných klonů se získala DNA, kterou se transformovaly buňky JM109, které se dále pěstovaly na LB miskách s ampicilinem (120 ug/ml).
Výše uvedeným postupem se dosáhlo substituce prolinu za valin na pozici 99. Modifikovaný MMP se označil jako MMP13* (SEQ ID NO:4).
Podobné technika místní metageneze se také použila pro záměnu valinu za glycin na pozici 98. Použil se nukleotid se sekvencí GAAAAAGCCAAGATGCGGGGGTCCTGATGTGGGTGAATAC-5', SEQ ID NO:9 obdobně, jak je uvedeno výše. Tímto postupem se nahradil valin za glycin na aminokyselinové pozici 98.
Po potvrzení výše uvedených mutací přímým sekvenováním se uvolnila cDNA kódující MMP13* z vektora pAlter-MMP13* pomocí enzymů ExoRI a HindlII.
Příklad 2: Určení enzymatické aktivity MMP-13*
Materiál a metody cDNA kódující obě mutantní formy MMP-13 a nemutovanou MMP-13 se subklonovaly do vektora BS(SK-) (Stratagene), který obsahuje CMV promotor (Xhol - EcoRI) a SV40 splice poly(A)n (Xbal - Ncol). Duplicitní kultury Hela buněk (misky 10 cm) se transfekovaly 50 ug těchto plasmidú pomocí CaPO.j precipitační metody (Promega) . Po 5 hodinách se buňky vystavily 1 minutovému glycerolovému šoku; použil se roztok obsahující stejné množství 2x HBS + 303 glycerolu. Tento
postup je popsaný v technickém manuálu Profection Mammalian
Transfection Systems (Promega).
Za 24 hodin po transfekci se kultivační médium (D-MEM s 10% fetálního hovězícho séra) vyměnilo za D-MEM bez séra s lOuM CGS-27023A, inhibitoru MMP (Ciba-Geigy). Předpokládá se, že pokud není přidán MMP inhibitor, je MMP produkovaný kulturou rozložen; přidáním MMP inhibitoru do kultivačního média vede tedy k detekovatelnému MMP13 proužku.
Za 48 hodin po přidání bezsérového média s MMP inhibitorem se odebralo 10 ml supernatantu a asi 200x zkoncentrovalo (koncentrátory Centriprep-30 a Centricon-10, Amicon). Poté se ke každému vzorku přidalo stejné množství provozního pufru 2x Tris-gylycin SDS. Vzorky se potom nanesly na 4-16%, zabarvený beta kaseinový zymogram SDS polyakrylamidový gel (Novex). Po elektroforéze se gely 30 minut renaturovaly při laboratorní teplotě v renaturačním pufru (Novex) a následovala jejich inkubace přes noc při 37 °C ve vyvíjecím pufru pro zymogram (Novex).
Výsledky
Normálně jsou MMP syntetizovány jako prekurzory (tj. prokolagenázy nebo zymogeny), jejichž enzymatická aktivita je skrytá. Proteolytickým odstraněním proregionu po sekreci vznikne aktivní protein. Nutnost proteolytického zpracování je možné obejít použitím prokolagenázové varianty, která je aktivní i bez rozštěpení. Konstitutivně aktivní varianta MMP13 použitá jako transgen obsahuje substituci prolinu za valin v sekvenci kódující oblast PRCGVPDV (SEQ ID NO:7). Tato oblast je mezi MMP vysoce konzervovaná a důležitá pro řízení enzymové aktivity.
Aktivita pozměněného MMP13 proteinu se určila pomocí kaseinového zymogramu (údaje nejsou uvedené). HeLa buňky sekretují tři MMP druhy. Jeden se pohybuje stejně jako 92kDa MMP9 enzym, označovaný také jako želatináza B (gelatinaze B). Odštěpení prodomény MMP během aktivace enzymu vede ke ztrátě asi 10 kDa. Molekulová hmotnost druhého proužku odpovídá upravené formě želatinázy B. Jak stromelysin-1 (MMP3) tak stromelysin-2 (MMP10) mají 54 kDa a jeden nebo oba mohou odpovídat čtvrtému proužku.
• 9
Pro-MMP13 by se měl pohybovat jako cca 60 kDa; je vidět v dráze 1 obsahující nerozštěpený rekombinantní MMP13. HeLa buňky se transfekovaly konstrukty exprimujícími jak rodičovské, tak mutantní formy MMP13. Detekovala se ale jenom --60 kDa proMMP13 forma u buněk exprimujících oba konstrukty, což naznačuje, že k autoproteolýze proenzymu na konečnou formu v exogenním systému zřejmě nedochází. Tyto výsledky ukazují, že substituce prolinu za valin nemá vliv na přirozenou aktivitu MMP13 nebo jeho substrátovou specifitu.
Tato metoda umožňuje rychlé vyšetření variant MMP13, které si zachovají MMP13 aktivitu.
Příklad 3: Konstrukce transgenních vektorů
Konstrukce MMP-13* připojených k tet07
V dalším kroku se cDNA kódující MMP-13* operačně připojila k transkripční regulační sekvenci odvozené od tet07 promotoru následujícím postupem:
BS(SK-) vektor (Stratagene) se rozštěpil enzymy KpnI a Notl. Syntetický duplexový oligonukleotid s následující sekvencí se rozštěpil enzymy KpnI a Notl a přiligoval do vektora:
5' -GGTACCACTAGTAAGCTTAGATCTCATATGGTCGACCCCGGGGAATTCCTGCAGGGATCC TCTAGAAGTACTCCATGGGTATACATCGATGCGGCCGC-3 ', SEQ ID NO:10.
BS(SK-) vektor modifikovaný výše uvedeným postupem se rozštěpil enzymy Xbal a Ncol. Do vektora se naligoval fragment (745 bp) obsahující SV40 sesazovací (splice) místo a polyadenylační signál, který se získal rozštěpením pcDNAI/Amp (Invitrogen, Carlsbad, CA) enzymy Xbal a Ncol.
Výsledný vektor se zlínearizoval rozštěpením enzymy Xhol a EcoRI a následně se přiligoval 460 bp Xhol-EcoRI fragment obsahující promotorovou oblast tetO7 z pUHD 10-3 (Gossen et al., Proč. Nati. Acad. Sci. USA 89:5547, 1992). Tento vektor se následně rozštěpil enzymem Spěl, konce se zarovnaly Klenow polymerázou a dále se rozštěpil enzymem EcoRI. pAlter-MMP13* se roštěpil enzymem HíndlII, zarovnal Klenow polymerázou a rozštěpil enzymem EcoRI; tak se získal fragment kódující MMP-13*. Fragment MMP13* EcoRI se dále nakloňoval do vektora štěpeného EcoRI (viz výše).
• · ftftftft ftft ftft ftft • ft ft ftftftft · • ft ftftftft ftft · • · ftft ftft ftftft ft ft • · ftftftft ftftft • ftftft · ftft ftft ftft ftftft
Transgen dlouhý 2792 bp, SEQ ID NO: 11 (obr. 2B), se uvolnil enzymy Xhol a Notl a purifikoval v CsCl gradientu před mikroinjekcí do oplodněných vajec.
Konstrukce promotor kolagenu typu II - tTa gen
Gen kódující fúzní protein tTa represor-aktivátor se operativně připojil k promotoru specifickému pro klouby (kolagen typu II).
K modifikovanému BS(SK-) vektoru, obsahujícímu spojovací místo SV40 a polyadenylační signál, popsanému výše v příkladu 1 a rozštěpenému enzymy Ndel a Smál, se přiligoval 1897 bp dlouhý fragment obsahující promotor a zesilovač pro kolagen II. Tento fragment se získal štěpením plazmidu PBSAHl enzymem HindlII, zarovnáním pomocí Klenow polymerázy a štěpením Ndel.
Plasmid se potom rozštěpil enzymy EcoRI a BamHI a přiligoval k 1025 bp dlouhému fragmentu kódujícímu fúzní protein tetracyklin/VPl6 represor-aktivátor. Ten se enzymy EcoRI a BamHI uvolnil z plazmidu pUHG15-l (Gossen et al., viz výše). Plazmid se linearizoval rozštěpením BglII, defosforyloval telecí střevní fosfatázou a přiligoval k 1554 BamHI fragmentu zesilovače získanému z plazmidu PBSAHl.
Nakonec se pomocí enzymu KpnI a Notl uvolnil z vektora 5276 bp dlouhý transgen, SEQ ID NO:12 (obr. 2A) , purifikoval na gelu a pomocí CsCl centrifugace, dialyzoval proti pufru použitému pro mikroinjekce (5 mM Tris-HCl pH 7,4 a 0,1 mM EDTA pH 8,0) a použil pro mikroinjekci.
Gen promotor kolagenu typu II - β galaktosídáza
Reporterový gen, vhodný pro hodnocení exprese podmíněné promotorem kolagenu typu II v jednotlivých pletivech, se operačně připojil k promotoru kolagenu typu II.
4179 bp dlouhý fragment BamHI-BglII, obsahující . β-galaktosidázový gen zfázovaný se spojovací sekvencí β-globinu a polyadenylačním signálem, se vyštěpil z plazmidu pUGH16-3 (Gossen et al., viz výše) a nakloňoval do BamHI místa nemodifikovaného BS(SK-) (Stratagene). Tento plasmid se rozštěpil EcoRI a HindlII a • ftftft ftft ftft ·« · • ♦ · ftft·· ftft·· • ft ftft ftft ftftft ft · ftftftft···· · ft · ftftftft ft·· • ftftft · ftft ftft ftft ftftft přiligoval k 655 bp dlouhému HindlII-EcoRI fragmentu s promotorovou sekvencí kolagenu typu II, která se vyštěpila z plazmidu popsaného výše. Plasmid se potom rozštěpil EcoRI a přiligoval k 2807 bp dlouhému EcoRI fragmentu, který se vyštěpil z plasmidu s promotorem kolagenu typu II popsanému výše. Pro ověření orientace každého inzertu se použilo mapování restrikčními enzymy. 7664 bp dlouhá sekvence transgenu (SEQ ID NO:13, obr. 3A) se uvolnila pomocí enzymů HindlII a Notl, purifikovala na gelu a pomocí CsCl centrifugace, dialyzovala proti pufru použitému pro mikroinjekce (5 mM Tris-HCl pH 7,4 a 0,1 mM EDTA pH 8,0) a použila pro mikroinjekcí myších embryí.
Výsledky
Obr. 2A a 2B ukazují schématické znázornění syntetických genů vytvořených s cílem dosáhnout regulované exprese MMP13 v chondryocytěch. Indukovatelné exprese transgenu se dosáhlo použitím tetracyklinem regulovatelného expresního systému (Gossen et al., viz výše; Furth et al., Proč. Nati. Acad. Sci. USA, 91:93029306, 1994). U prvního konstruktu (obr. 2A) je exprese tetracyklinem řízeného VP16 transaktivátorového fúzního proteinu pod řízením promotoru kolagenu typu II. Tento konstrukt směruje expresi fúzního proteinu VP16 do chondryocytú. U druhého konstruktu (obr. 2B) je exprese cDNA kódující modifikovanou verzi MMP13 proteinu (MMP13*) pod řízením fúzního proteinu VP16. Při přítomnosti doxycyklinu, tetracyklinového analoga dodávaného v pitné vodě, se VP16 fúzní protein neváže k Tet07 promotoru syntetického genu MMP13* a gen je neaktivní. Při odstranění doxycyklinu transaktivátor stimuluje transkripci lidské MMP13* cDNA a produkci modifikovaného proteinu.
Oba transgenní konstrukty, uvedené na obr. 2A a 2B, se kromě ověření aktivity MMP13* před mikroinjekcí testovaly v primárních hovězích chondryocytech a v zárodečných myších fibroplastech. Výsledky ukázaly schopnost promotoru kolagenu typu II indukovat expresi druhého konstruktu s buď Tet07-luciferázou nebo TetO7-MMP13* (data nejsou uvedena).
Obrázek 3A je schematickou ilustrací transgenu použitého pro posouzení tkáňově specifické regulace vyvolané promotorem kolagenu ·· 4444 •4 4« 44
4 4444 4
4 4444 4 4 4
4 4 4 44 444 4 4
4 4444 44 4
4444 4 44 44 44 ··· typu II. Konstrukt nukleové kyseliny obsahuje: (i) sekvence odvozená z promotoru kolagenu typu II; (ii) sekvence kódující bakteriální β -galaktosidázu (Lac Z); a (iii) sekvence obsahující spojovací β-globinový spojovací a polyadenylační signál.
Příklad 4: Tvorba a charakterizace transgeních myší exprimujících tetracyklinem regulovaný LacZ nebo MMP-13* v kloubních pletivech.
Pro získání transgenních myší exprimujících MMP-13* gen nebo LacZ (β -galaktosídázový) reporterový gen se provedly následující experimenty.
Materiál a metody:
Příprava a testování transgenních myší. Pro tvorbu myší exprimujících MMP-13* pod řízením tetracyklinu se do oplodněných myších embryí společně mikroinjekčně aplikovaly v ekvimolárních množstvích DNA fragment Xhol-Notl tetO7-MMP13* dlouhý asi 2784 bp (obr. 2B) a DNA fragment KpnI-Notl CPE-tTA dlouhý si 5265 bp (obr. 2A). Pro tvorbu myší exprimujících reporterový gen se do (FVB/N) oplodněných vajec injikoval HindlII-Notl LacZ fragment dlouhý 7641 bp (obr. 3A) , podle popisu (Hogan et al., Manipulation the Mouše Embryo, Cold Spring Harbor Laboratories, 1966). (Velikost restrikčních fragmentu je menší než transgeny popsané v příkladu 3, protože endonukleázová štěpná místa jsou uvnitř transgenů).
Zakládající zvířata (founders animals) se nejdříve identifikovala pomocí PCR následujícím postupem. Transgen kódující tTA se identifikoval použitím primerů odpovídajícímu tTA sekvenci (5'-CGAGGGCCTGCTCGATCTCC-3' , SEQ ID NO: 14) a primerů odpovídajícímu nepřepisovanému 3' konci (5' -GGCATTCCACCACTGCTCCC-3', SEQ IDNO:15). Výsledný PCR produkt měl velikost 584 bp. Transgen kódujíc MMP13* se identifikoval použitím primerů odpovídajícím sekvencím kódujícím MMP13* (5'-GAGCACCCTTCTCATGACCTC-3', SEQ ID NO: 16) a nepřepisovanému 3' konci. Výsledný PCR produkt měl velikost 731 bp.
Transgen kódující lacZ se identifikoval použitím primerů odpovídajícím signálu lokalizovanému v. jádře β-galaktosidázového • · ··· · genu (5'-GTTGGTGTAGATGGGCGCATCG-3', SEQ ID NO: 17) a (5'-GCGGGGTCTCAGGTTACAGCC-3', SEQ ID NO: 18). Výsledný PCR produkt měl velikost 673 bp.
Pro ověření výsledků PCR se provedla Southern blot analýza dolního konce DNA rozštěpené BamHI/NcoI nebo PvuII/NcoI a hybridízované k 3' netranslaťovanému konci za vysoce stringentních podmínek. Počet kopií transgenní DNA, která se integrovala do genomu, se určil porovnáním relativní intenzity hybridizačního signálu z transgenních myší se signálem získaným s použitím kontrolní DNA obsahující 10 a 100 genomových ekvivalentů obdobné DNA, která byla injikovaná.
Počet kopií se určil s využitím Taqman kvantitativní PCR podle návodu výrobce (Perkin Elmer). Transgenní linie se získaly pářením zakladatelských zvířat s FVB/N nemutovaným typem myší a následující generace se identifikovaly pomocí PCR.
Všem myším byl podáván doxycyklin (Sigma Chemical Co., St. Louis MO) připravený jako zásobní roztok s koncentrací 100 mg/ml v 501 etanolu a zředěný na konečnou koncentraci 1 mg/ml v kyselé pitné vodě, která se denně měnila (Schultze et al., Nátuře Biotech. 14:499, 1996).
Barvení celého embrya na β-galaktosidázovou (lacZ) aktivitu. Samice nemutovaného typu se pářily s transgenními samci s CPE-lacZ konstruktem. Šestnáctý embryonální den (E16) se samice usmrtily a embrya se obarvila pro zjištění β-galaktosidázové aktivity podle popisu Hogan et al., 1996 (viz výše). Před fixací se odebraly z E16 embryí ocasy, které se analyzovaly na přenos transgenu pomocí PCR.
Expresní analýza pomocí RT-PCR. Transgenní exprese se zjišťovala RT-PCR. Po homogenizaci pletiv v Trizolu (Life Technologies) se vyizolovala celková RNA. Syntéza prvního řetězce se provedla pomocí Superscript preamplification kit od Gibco/BRL. Stručně, 5 ug celkové RNA se upravilo působením Dnase I po dobu 15 minut pří laboratorní teplotě; následovala inaktivace přidáním 2 ul 25mM EDTA a zahřátím na 65 °C/15 minut. K RNA se potom přidalo 0,5 ug olígo dT a vlastní reverzní transkripce proběhla podle návodu výrobce. PCR analýza cDNA se provedla s použitím následujících ·« ·»·· souprav primerů (5'-3' sekvence): tet activator:
CGCCCAGAAGCTAGGTGTAGAG (SEQ ID NO:19) a CGGCCATATCCAGAGCGCCG (SEQ ID NO:20); MMP13*: GCCCTCTGGCCTGCTGGCTCATG (SEQ ID NO:21) a CAGGAGAGTCTTGCCTGTATCCTC (SEQ ID NO:22). Výsledné PCR produkty jsou 859 a 648 bp velké. Pro ověření integrity mRNA a účinnosti rereverzní transkripce každá PCR reakce obsahovala také c-fos primerový set: 5'-AGGAGGGAGCTGACAGATACACTCC-3' (SEQ ID NO:23) a 5'-AGGCCACAGACATCTCCTCTGG-3' (SEQ ID NO:24). PCR analýza se provedla s cDNA s využitím Taq-gold polymerázy (Perkin Elmer) - 10 minut 95 °C a pak 35 cyklů - 60 vteřin 96 °C, 90 vteřin 67 °C, 60 vteřin 72 °C. Konečná syntéza se provedla při 72 °C po dobu 12 minut. Reakční produkty se analyzovaly na 2% agarózovém gelu a vizualizovaly barvením ethidium bromidem.
RT-PCR zárodečných fibroblastů. Tet07-lacZ samice se pářily s transgenními samci s oběma (CPE-tTA a TetO7-MMP13*) transgeny. Samice se utratily v den E15 a z embryí se připravily fibroblasty (Graham et al., Virology, 52:456, 1973; Lopata et al., Nucl. Acids Res., 12:5707, 1984). Fibroblasty se pěstovaly v DMME médiu (Gibco/BRL) s 103 FBS (fetální hovězí sérum). Fibroblasty se dále transfekovaly požadovaným expresním plasmidem kalcium fosfátovou precipitační metodou. Za 48 po transfekci se pomocí Trizolové metody (Gibco/BRL) získala celková RNA. Syntéza prvního pramene cDNA se provedla s využitím Superscript preamplífication systém (Gibco/BRL). Exprese MMP13* se identifikovala PCR s využitím primerů specifických pro lidskou MMP13 (GCCCTCTGGCCTGCTGGCTCATG) (SEQ ID NO:21) a (CAGGAGAGTCTTGCCTGTATCCTC) (SEQ ID NO:22). Výsledný PCR produkt měl veli1kost 648 bp.
Imunohistochemie. Exprese MMP13* v dvojitě transgenních liniích se dále analyzovala imunohistochemicky s použitím protilátek specifických pro z MMP-13 odvozených štěpných fragmentů kolagenu typu II. Pro tento účel se klouby fixovaly 60 minut v 45 paraformaldehydu v PBS při neutrálním pH a laboratorní teplotě. Poté se dvakrát opláchly v PBS a inkubovaly přes noc v 0,lM Trís-HCl, pH 7,4 a částečně dekalcifikovaly v 0,2M EDTA při neutrálním pH. Vzorky se přenesly do TOC. média a Hacker/Bright kryostatem se nařezaly 6 mm
9 tt · t · · • · • * • · « · ··«» · ·· ·· • · · • » ·» • · · · • · * ·· ··
9· ·* · zmrazené řezy. Řezy se obarvily protilátkami specifickými proti epitopu přítomnému v degradovanému produktu kolagenu typu II, konkrétně v TCA degradačnim produktu, který je také určenou 3/4 částí (which is also designated the 3/4 piece). Billinghurst et al., J. Clin. Invest. 99:1534, 1997.
Výsledky
Tetracyklin a jeho analoga jsou známými inhibitory MMP aktivity. Porovnávali jsme hladiny DOX v séru při přídavku 1 mg/ml do pitné vody a in vitro IC50. V MCA fluorescenčním testu se IC5o=59,l uM, zatímco hladiny v séru ukazovaly 2,64 uM, při využití zónového inhibičního testu. Tyto údaje ukazují, že množství DOX v séru je 22,4x nižší než množství, při kterém může být 50- MMP aktivity inhibováno. Je tedy nepravděpodobné, že dochází k významné inhibici DOXem.
Obrázek 3B je fotografií obarvení celého vzorku (whole mount staining) na β-galaktosidázovou aktivitu 16 embryonální den u transgenních myší exprimujících transgen zobrazený na obr. 3A. Modré zabarvení (šipky) je zřejmé u kloubů v celém těle transgenních zvířat, zatímco u netransgenních potomku ve vrhu není. pozorovatelné jakékoliv zbarvení. Konkrétně klouby zahrnující kotníky, kolena, kyčle, články prstu, zápěstí, lokty, ramenní klouby a obratel vykazovaly expresi transgenu. Kromě chrupavky kloubu, se také zabarvila modře chrupavka, která nebyla doposud osifikována na kost v daném vývojovém stádiu, tj . některé obličejové, lebeční a žeberní kosti. Obrázek 3C ukazuje zvětšení lokte a tlapky. Tato data potvrzují expresní schopnosti promotoru kolagenu typu II a jsou užitečná pro určení těch pletiv (kloubů), které budou exprímovat MMP13* transgen.
Konstrukty uvedené na obrázcích 2A a 2B se oba společně injikovaly do oplodněných myších embryí. Ze 112 nově narozených myší jich 7 neslo oba transgeny, ale jenom čtyři odvozené linie byly schopné rozmnožování. Transgeny se identifikovaly pomocí PCR a ověřily Southern blot analýzou s využitím sondy specifické pro transgen (data nejsou uvedena). Počet kopií každého ze čtyř transgenu se dále stanovil pomocí Taqman kvantitativní PCR. (data ·« ··** • fc fc fc fc fc • fcfcfc fcfc • · • · fc * · • · • fc fcfc fcfc fcfc « · • fc • · · • · • fc nejsou uvedena). V krátkosti, počet kopií transgenů se pohyboval od 1 do 32 pro tet aktivátor a od 1 do 20 pro MMP13*. Konkrétně linie 6 obsahovala asi 8 kopií tet aktivátoru a asi 3 kopie transgenů MMP13*.
Exprese transgenů TA a MMP13* se nejdříve hodnotila v kolením kloubu zadních končetin u myší starých 4 měsíce (linie 6). Pro kontrolu účinnosti každé reakce se prováděla amplifikace c-fos endogenní cDNA. Obrázek 4 ukazuje amplifikací fragmentu dlouhého 890 bp získaného pomocí TA-specifických primerů. RT-PCR ukázala, že TA transgen je exprimován v transgenních myších jak s DOX, tak bez DOX, ale. nebyl exprimován v netransgenních kontrolách (dráhy 4-5) . Konstitutivní exprese TA se dá očekávat, protože je řízená konstitutivně aktivním promotorem. Navíc je exprese TA omezená na klouby a nebyla pomocí RT-PCR prokázaná v jiných pletivech, včetně mozku, srdce, jater, ledvin, sleziny nebo kosterního svalstva (údaje nejsou uvedené).
Obrázek 4B ukazuje amplifikací 645 bp dlouhého fragmentu získaného s primery specifickými pro MMP13*. Povšimněte si, že primery pro MMP13* jsou specifické pro lidský MMP13 a nereagují se svým endogenním myším homologem, kolagenázou-1. RT-PCR ukázala, že k expresi MMP13* nedocházelo v netransgenních kontrolách (dráhy 4-5). Dráhy 6-7 ukazují, že dochází k expresi transgenů MMP13* u myší, kterým byl podáván DOX. Odstraněním DOXu z pitné vody došlo ke značnému zvýšení exprese (dráhy 8-9), podle našich odhadu asi 5-10x. Po elektroforéze byly pak PCR fragmenty přenesené na nylonovou membránu a hybridizovány s TA nebo MMP13* specifickými sondami pro ověření identity PCR produktů (data nejsou uvedená).
Fibroblasty z několika transgenních linií. (např. linie 8 a 42) byly schopné exprimovat MMP13*, což se dokázalo přítomností PCR produktu o předpokládané délce. Nebyl detekován žádný MMP13* RT-PCR pruh u buněk transformovaných samotným nosičem. Tyto výsledky ukazují, že u těchto myší je transgen MMP13* integrován do transkripčně aktivní oblasti chromatinu.
Již za tři dny po zastavení podávání doxycyklinu bylo možné detekovat imunologicky štěpné produkty MMP-13. Po 30 dnech bez doxycyklinu bylo možné pozorovat podstatný nárůst obarvení u »· ···· • : / • * • · ··»· · «« ·· • · * · *·• · * !
» · · „ ·» *<
·· « · «
• * • * ·· ··
Φ ·*· růstových plotének a u kloubových chrupavek (obr 5), ale výsledky se u různých myších linií lišily (viz tabulka 1 níže).
Tabulka 1
Imunohist ^chemie
Fi zvířata dní bez DOX HMMP13 Ab protilátky pro štěpné fragmenty kolagenu typu II ztráta zabarvení Sď í rariinem 0
linie 8 wt - - neznatelná
linie 8 0 d - - neznatelná
3 d + + neznatelná
7 d + + e + rn í r n á
14 d + +· + + + + nevelká
wt - - neznatelná
lilii e 6 30 d nezniká
linie 8 30 d + L i + 'ř + n-/»Lká
líní e -12 30 d •i - neznatelná
Příklad 5: Fenotyp MMP13* transgenní myši.
Materiály a metody
Pro studium účinku aktivity MMP13* na chrupavky u dospělých transgenních zvířat se myším přestal podávat doxycyklin postupně vzrůstající dobu, po které se usmrtily. Parafínové, formaldehydem fixovanách řezy dekalcifikovaných chrupavek se nařezaly a obarvily (i) hematoxylinem a eosinem (H&E) a (ii) Safraninem O a následně fast green (American Histo Labs, Gaíthersburg MD). Barvící techniky pro kloubní chrupavky jsou popsané (Peter et al., J. Exp. Pathol. 71:19, 1990).
Výsledky
Kontrolní transgenní zvířata bez exprese MMP13* si udržela významné množství obarvení Safraninem O v kloubní chrupavce a růstové ploténce jejich čéšky (obr. 6A) . Naproti tomu transgenní zvířata linie 8 vykazují podstatnou ztrátu barvení Safraninem O ve svých kloubech po té, co se přestal podávat doxycyklin. Po sedmi • · · · « * • « ·· ·· • · · · · dnech bylo možné pozorovat mírnou redukci obarvení Safraninem 0 v chrupavce čéšky (obr. 6B), které se zvětšovalo a 14 den se pozorovala poněkud větší ztráta obarvení u kloubní chrupavky a růstové ploténky (obr. 6C). Značná ztráta zabarvení Safraninem O se také pozorovala u ostatních kloubů, včetně chrupavky zánártí a stehenní kostí, dále u zápěstí, a kotníku na prstu, což ukazuje na sníženou proteoglykanovou koncentraci v těchto oblastech v porovnání s kontrolou.
Pro zaznamenání všech změn kloubních chrupavek vyvolaných expresí transgenu se myši linie 6 udržovaly s nebo bez DOX po dobu 114 dní; z jejích kloubů se připravily řezy a obarvily H&E. Při porovnání s věkově shodnými kontrolami, se u transgenních zvířat bez DOX vyvinul patologický nález připomínající osteoartritidu. Na obr. ΊΑ je vidět, že u kontrolního zvířete nevznikly léze nebo jiná osteoartritická patologie, zatímco transgenní zvířata vykazují tvorbu lézí na svých kloubních chrupavkách (obr. 7B). H&E sekce konkrétně vykazují značnou ztrátu chrupavek, ohniskové narušení, narušení které se rozšiřuje do kostí a zanícené synovíum. Uvnitř synovia je důkaz fibroidní nekrózy, metaplasie a synoviální buněčné hyperplasie. Kromě těchto symptomů osteoartritidy jsou pozorovány některé změny charakteristické spíše pro revmatickou artritidu. Tyto změny zahrnují angiogenezi - pozorovatelnou infiltraci buněk krevních krvinek, monocytú a makrofágu. Obrázky 7C a 7D ukazují synovíum ve vyšším rozlišení.
Diskuze
Podařilo se úspěšně vytvořit transgenní myši exprimující konstitutivně aktivní lidský MMP13 protein v kloubních chrupavkách dospělých zvířat. Ukázali jsme, že ojedinělá kombinace technologií, tj. tetracyklinem regulovatelný genový expresní systém a pro chondryocyty specifická exprese konstitutivně aktivního MMP proteinu, nám umožnila vyvinout transgenní model, u kterého dochází k tvorbě lézí a dalším osteoartritickým patologickým změnám.
Použitím regulovatelného/indukovatelného systému jsme se vyhnuli škodlivým účinkům na embrya, i když jsme dosáhli významné exprese hMMP13* v dospělých myších. Lac Z barvení předvedené na obr. 3 * ·
• · ’ i · ·· .· .· . ϊ · · ♦ · • ζ · · * • i ·» ·· • · · · * ukazuje, že k expresi kolagenu II dochází během vývoje zhruba ve fázi E16 a kolagen typu II se účastní tvorby kostry. Kolagen typu II spolu s kolagenem typu I jsou známé jako substráty pro proteolytické štěpení pomocí MMP13. Předpokládali jsme proto, že neregulovaná exprese MMP13 během embryogeneze by byla letální.
Ustanovili jsme čtyři transgenní linie obsahující oba transgeny. U dvou linií, které exprimovaly hMMP13*, byla hladina exprese u jedné velmi nízká, ale druhá exprimovala významné množství hMMP13*. Linie, která exprimovala pouze menší množství transgenu vykazovala histologické důkazy ztráty proteoglykanu. Po šesti měsících bez DOX nebyly ale pozorovány žádné léze. Linie 6, která exprimuje podstatně větší množství hMMP13*, vykazuje po čtyřech měsících bez DOX osteoartritidovou patologii včetně tvorby lézí, degenerace chrupavky a zánětu synovia. Navíc může být exprese hMMP13* u linie 6 řízená tj. spuštěná nebo zastavená badatelem. Tyto výsledky dále potvrzují, že fenotyp je závislý na expresi hMMP13* a není výsledkem integrace na určité místo v chromatinu.
Stejně jako u linie 6 se také u pacientů s osteoartritidou objevuje mezi jinými kloubní destrukce/poškození, léze, fibroídní nekróza, metaplasie, synoviální buněčná hyperplasie a záněty synovia (při nepřítomností T-buněk). Ne všechny patologické stavy pozorované u transgenních myší připomínají ale osteoartrítidu. Například angiogeneze a infiltrace monocytú a makrogágu jsou patologické stavy pozorované během zánětlivého procesu spojeného s revmatoidní artritidou. Za povšimnutí stojí nepřítomnost neutrofilú v synoviální tekutině. Putování neutrofilú k místu zánětu je charakteristický znak pro patologii revmatické artritidy.
Údaje předložené v této práci poskytují přímé důkazy, že MMP13 je rozhodujícím hráčem při vzniku osteoartritidy. Transgenní zvířata popsaná v této práci navíc poskytují zvířecí model pro testování účinnosti terapeutik. Sloučeniny, které mění aktivitu MMP13 nebo inhibují postup osteoartritidy, se můžou monitorovat na tvorbě lézí a jiných patologických osteoartritických (OA) změnách v různý čas během postupu choroby. Schopnost vyvolat a zastavit expresí hMMP13* a tak řídit tvorbu/načasování vzniku lézí bude výhodou při určení účinností sloučeniny.
··· • 0 • · ·
* • 000 *
Tento osteoartriticlě podobný (OA-like) transgenní model se také může použít pro získání odpovědí na rozšiřující se seznam biologických otázek. Kolagen typu II štěpí kromě MMP13 také intersticiální kolagenáza (MMP1) a neutrofilní kolagenáza (MMP8). U transgenních myší konstitutivně exprimujících aktivní MMP1 nebo MMP8 je tedy možné očekávat podobný fenotyp jejich kloubních chrupavek.
Příklad 6: Rozšíření vývoje symptomů kloubních onemocnění u MMP-13 transgeních myší
Následující ošetření se dělají s cílem zvýraznit symptomy kloubní degenerace vykazované transgennímy zvířaty vynálezu.
U skupiny transgenních myší byla indukována exprese transgenů ve věku 4-12 měsíců. Dva až šest týdnů po indukci je myším aplikován intraperitoneálně zánětlivé činidlo, jako například lipopolysacharidy (10-100 ug), zamosan (1-10 mg), superantigen stafylokokového enterotoxinu B (1-100 ug) nebo TGF- β (1-10 ug) nebo některé jiné. Zvířatům může být případně injikováno do kloubu zánětlivé nebo funkci chondryocytú ovlivňující činidlo, jako například lipopolysacharid (1-100 ng), zymosan (50-250 ug), papain (10-100 ug) , TGF- β (0,01-1 ug), kostní morfogenní protein - 2 (bone Morphogenic Protein - 2) (2-1000 ng) IL-1 (1-100 ng). TGF-a (10-200 ng), IGF (0,01-1 ug) nebo FGF (0,01-1 ug) nebo některé další. Transgení myši stejného stáří a pohlaví chované tak, aby nedocházelo k expresi transgenů byly ošetřeny stejným způsobem a sloužili jako kontrola.
Vývoj symptomů degenerativních kloubních onemocnění je monitorován celkovým pozorováním kloubních otoků a funkcí a histologickým hodnocením kloubů ve vybrané časové řadě po vystavení účinkům zánětlivého činidla.
Činidla budou indukovat akutní zánětlívou odpověď a/nebo krátkodobou ztrátu proteoglykanu na dobu kratší než jeden týden. Akutní zánětlivá odpověď a/nebo dočasné změny chrupavky budou dále regulovat expresi genu v chondryocytech, zvyšovat expresi transgenů a zvyšovat hladinu produkovaných MMP-13.
Všechny patenty aplikace, články, publikace a testovací metody zmíněné výše jsou tímto zahrnuté odkazem jako ceiek.
< φ · ♦ φ ·
Ve světle výše zmíněných popisů se bude mnoho variant předkládaného vynálezu samo nabízet odborníkům. Takové zřejmé variace jsou v plném souladu s přiloženými nároky.
» · · · · •9 »909
9 *
· • •9« *
SEQUENCE LISTING
<110> Neuhold, Lisa Killar, Loran <120> TRANSGENIC ANIMAL MODEL FOR DEGENERATIVE DISEASES OF CARTILAGE <130> AHP-97285PCT <140> TBA <141>
<150> 60/060,312 <151> 1997-12-19 <150> 08/994,609 <151> 1997-12-19 <160> 24 <170> FastSEQ for Windows Version 3.0 <210> 1 <211> 7 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1
Pro Arg Cys Gly Xaa Pro Asp 1 5 <21O> 2 <211> 12 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2
His Glu Xaa Gly His Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa His Ser 1 5 10 <210> 3 <211> 1521 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 3 caagatgcat ccaggggccc tggccgcccc ccccttcccg agccggaccc accgccgggc cccgcccccc cccagcggcg gcgacgaaga tgacccgcct gaggaagacc cccagcccgc agagcgccac ccgagaccac accaccaccc cacaaacccc gcgggaaccc cgaaggagaa cgcagcaagc cccacgaccg agaggccccg agaaacgcag cccccccccg gctcagaggt gactggcaaa cttgacgata acaccccaga cgccacgaaa aagccaagat gcggggccgc cgacgcgggc gaacacaacg cccccccccg aacccccaaa cggcccaaaa cgaatccaac ccacagaacc gcgaaccaca cccccgacac gacccacccc gaagccgaaa aggcacccaa aaaagccccc aaagcccggc ccgacgcaac ccccccgaac cccaccagac cccacgacgg caccgccgac accacgaccc cccccggaac caaggagcac ggcgaccccc acccacccga cgggcccccc ggcccgccgg cccacgcccc cccccccggg ccaaaccacg gaggagacgc ccaccccgac gacgacgaaa cccggacaag cagccccaaa ggccacaacc cgccccccgt cgccgcgcac gagcccggcc accccccagg ccccgaccac cccaaggacc ccggagcacc cacgcccccc acccacaccc acaccggcaa aagccacccc acgccccccg acgacgacgc
120
180
240
300
360
420
480
540
600
660
720
780 líbacaagggatc cagtctctct atggtccagg agatgaagac cccaacccta aacacccaaa aacgccagac aaatgtgacc cttccttatc ccttgatgcc attaccagtc tccgaggaga aacaatgatc tttaaagaca gattcttctg gcgcctgcat cctcagcagg ttgatgcgga gctgttttta acgaaatcat tttggccaga acttcccaac cgtattgatg ctgcatatga gcacccttct catgacctca tcttcatctt cagaggtaga aaattttggg ctcttaatgg ttatgacatt ctggaaggtt atcccaaaaa aatatctgaa ctgggtcttc caaaagaagt taagaagata agtgcagctg ttcactttga ggatacaggc aagactctcc tgttctcagg aaaccaggtc tggagatatg atgatactaa ccatattatg gataaagact atccgagact aatagaagaa gacttcccag gaattggtga taaagtagat gctgtctatg agaaaaatgg ttatatctat tttttcaacg gacccataca gtttgaatac agcatctgga gtaaccgtat tgttcgcgtc atgccagcaa attccatttt gtggtgttaa gtgtcttttt aaaaattgtt atttaaatcc tgaagagcat ttggggtaat acttccagaa gtgcggggta ggggaagaag agctatcagg agaaagcttg g <210> 4 <211> 471 <212> PRT <213> Homo sapiens
840
900
960
1020
1080
1140
1200
1260
1320
1380
1440
1500
1521 <400> 4
Met His Pro Gly Val Leu . Ala Ala Phe Leu Phe Leu Ser 1 Trp 1 Thr : His
1 5 10 15
Cys Arg Ala Leu Pro Leu Pro Ser Gly Gly Asp Glu Asp Asp Leu Ser
20 25 30
Glu Glu Asp Leu Gin Phe Ala Glu Arg Tyr Leu Arg Ser Tyr Tyr His
35 40 45
Pro Thr Asn Leu Ala Gly Ile Leu Lys Glu Asn Ala Ala Ser Ser Met
50 55 60
Thr Glu Arg Leu Arg Glu Met Gin Ser Phe Phe Gly Leu Glu Val Thr
65 70 75 80
Gly Lys Leu Asp Asp Asn Thr Leu Asp Val Met Lys Lys Pro Arg Cys
85 90 95
Gly Val Val Asp Val Gly Glu Tyr Asn Val Phe Pro Arg Thr Leu Lys
100 105 110
Trp Ser Lys Met Asn Leu Thr Tyr Arg Ile Val Asn Tyr Thr Pro Asp
115 120 125
Met Thr His Ser Glu Val Glu Lys Ala Phe Lys Lys Ala Phe Lys Val
130 135 140
Trp Ser Asp Val Thr Pro Leu Asn Phe Thr Arg Leu His Asp Gly Ile
145 150 155 160
Ala Asp Ile Met Ile Ser Phe Gly Ile Lys Glu His Gly Asp Phe Tyr
165 170 175
Pro Phe Asp Gly Pro Ser Gly Leu Leu Ala His Ala Phe Pro Pro Gly
180 185 190
Pro Asn Tyr Gly Gly Asp Ala His Phe Asp Asp Asp Glu Thr Trp Thr
195 200 205
Ser Ser Ser Lys Gly Tyr Asn Leu Phe Leu Val Ala Ala His Glu Phe
210 215 220
Gly His Ser Leu Gly Leu Asp His Ser Lys Asp Pro Gly Ala Leu Met
225 230 235 240
Phe Pro Ile Tyr Thr Tyr Thr Gly Lys Ser His Phe Met Leu Pro Asp
245 250 255
Asp Asp Val Gin Gly Ile Gin Ser Leu Tyr Gly Pro Gly Asp Glu Asp
260 265 270
Pro Asn Pro Lys His Pro Lys Thr Pro Asp Lys Cys Asp Pro Ser Leu
275 280 285
Ser Leu Asp Ala Ile Thr Ser Leu Arg Gly Glu Thr Met Ile Phe Lys
290 295 300
Asp Arg Phe Phe Trp Arg Leu His Pro Gin Gin Val Asp Ala . Glu . Leu
305 310 315 320
Phe Leu Thr Lys Ser Phe Trp Pro Glu . Leu . Pro i Asr i Arg ’ Ile : ASp i Ala
325 330 • • ·« · • • • ··· • 0« * • ♦ · • • ·* » » * · ♦ · » » »· ·· » · ·« • · ♦ · ·· 335 í 0 • • · • 4
Ala Tyr Glu His Pro Ser His Asp Leu Ile Phe Ile Phe Arg Gly Arg
340 345 350
Lys Phe Trp Ala Leu Asn Gly Tyr Asp Ile Leu Glu Gly Tyr Pro Lys
355 360 365
Lys Ile Ser Glu Leu Gly Leu Pro Lys Glu Val Lys Lys Ile Ser Ala
370 375 380
Ala Val His Phe Glu Asp Thr Gly Lys Thr Leu Leu Phe Ser Gly Asn
385 390 395 400
Gin Val Trp Arg Tyr Asp Asp Thr Asn His Ile Met Asp Lys Asp Tyr
405 410 415
Pro Arg Leu Ile Glu Glu Asp Phe Pro Gly Ile Gly Asp Lys Val Asp
420 425 430
Ala Val Tyr Glu Lys Asn Gly Tyr Ile Tyr Phe Phe Asn Gly Pro Ile
435 440 445
Gin Phe Glu Tyr Ser Ile Trp Ser Asn Arg Ile Val Arg Val Met Pro
450 455 460
Ala Asn Ser Ile Leu Trp Cys
465 470 <210> 5 <211> 470 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220>
<223> Tet promotér cloned into cytomegaloviral promotér, tet 07 promotér <400> 5 ctcgagttta ccactcccta tcagtgatag agaaaagtga aagtcgagtt taccactccc tatcagtgat agagaaaagt gaaagtcgag tttaccactc cctatcagtg atagagaaaa gtgaaagtcg agtttaccac tccctatcag tgatagagaa aagtgaaagt cgagtttacc actccctatc agtgatagag aaaagtgaaa gtcgagttta ccactcccta tcagtgatag agaaaagtga aagtcgagtt taccactccc tatcagtgat agagaaaagt gaaagtcgag ctcggtaccc gggtcgagta ggcgtgtacg gtgggaggcc tatataagca gagctcgttt agtgaaccgt cagatcgcct ggagacgcca tccacgctgt tttgacctcc atagaagaca ccgggaccga tccagcctcc gcggccccga attagcttga tatcgaattc <210> 6 <211> 3479 <212> DNA <213> Unknown <220>
<223> Sprague Dawley rat type II collagen promotér.
<400> 6 ggtaccacta gtaagcttag atccactgtc tgggattaca tcaggacaac cgaagcctgg aaagtgtatt aggtagagca ttttcttcca cgtgtttggg cacgtttccg acagctagga ttccagctct gtctttgtat gttacagact gtaaatcaat cgcaggtgaa actgtttgga cagtaggtgg ggatcaaaga ccctccgccc gtgagactct aggcgctttc ccctgccacc agcctgtctc cagagatgct ctggaaggag gcgggcccgg gcggtctttc tgctctttag cgtggcggac gcggcggcgg gggcagggct ggagcagaga gcgctgcagt gatagaactt tctgaccccg ctgcgcaggg cggcagggtg gcagggtggc agggtggcga gctaagccag agccgaacgc tggagctctg ggaggaacat cgaaggtttg tatgtggtct gagatcggcc tgactatatt tttttgtcct aaatttgcaa gcacacaccc acaaagctgc ggtcttgacc ggtattcttt atagagcgca atggagtgag ctgagtgtct aaacgatttc cctaattcat ctgatagcag aggcgctctc ctaattggcg aagagctgcc tcatgtccgc aactttttgg cagagtgaat tccacagctt tgtgtgtgtg tgtggggggg ggtgtaaggg gtgtctaaaa ctttcggtct cctactattc tgtatctcga ccggttggtt ttacaccccg gctcatctca
120
180
240
300
360
420
470
120
180
240
300
360
420
480
540
600
660
720
780
♦ ···
ccaacgcaaa accaggaacg gaaactcccc aagcgccgca agggaccggc gtcccccgcg agaggcaagg ccccccccgc aagcaacaca atgccgcacg cctttccgcg ttacactgtt ctgtctgatg cacccggccg aagccagcca caaaatgtcc gacccaaaac ataggccggg cagcacacct gctccaaagt cgggggttcc ttcgagacaa aagttcccta acccccttgt ggggtaaggt ggggaagacg tggcggcgga ccggagccgc cgctgctccc aagagccgaa ctcggttgtc gtccccctct cgcctaccta cgcgagcctc ctggaaaact ccccccgccc cgcctttcca ttctaacccc agagggggca cgatcaggcc cttggcaggc cagccccgcg cgaccgggag ccgggtctcc cccggacccg cacccccact tcagaaacct ggctgcgaag ggttcgggag agcgatggct gagagctgtg cccagtgggt gcccgcctgc gttccccgaa gcggtaacga ccacaattag ggctcctttc gagggctgtg gatctcatat agctagcttg cccgggctaa cagctttcta aagatgcaag gcatagaaat ctgaggtggt atgggggtag aggagttact gaggaccatc tatggaagga cggggttggg tgtgtgtgtg caactaggaa ctccagactc tccaggctaa ttagacaagt tgcagctcct gtgtaggaat gatttttttc caggcgggag gtcccccaga cctaaactcc gccttgagtc agcagaactc gtgtggcagt actgggcaca gtgggccctg gggggccggg catataaccg tgcctcctcc ctccgcgctc cccctatgga agagcccacg accccgaccc gggagacccc tccagatggg aaccgggctc ccccccgacc cgccacctcc agaggcagcc ggggaaccgg ggtggcgccg tcgggcagcc tccggagccc ggcgcacccc cgcaagctag gatccgacag gcagaggcag aacggcaccc caagcctcac gcggcacgcc ccccccccaa gcctaaacca ccacccccaa gaccccggga gggagcaagg cgcgcgtgtg actctggcgc tccggccagg gggcacccac gtctccaatc ttagtccctt acaccagacc atagccagtt ttcaccgaca tttaggattc ccatccccac taaagctcca cgaggaaagg cccaagtggg tcgggggcgg gcccggcctg gggcggcccg gagcccctgc tcctgctcct tgccgccccg
1L cccaaggacc cccctcccct acatccgcat agtcctcctt ctgaaaccct tgtatgcgct ccccgacccc cgggctccgg ttctaatcgg atcgggcggc gcttcctccg atttaatcct catccacaaa cagtacaatc ctcgcgatcc ccatggtcca aaggatctag tacataaaga acttgaagtt gggtaattct ggacttccag ggccctaatt agaaaaggtg acagagcaag aaggcaagtg tgtgtgtgtg tttccccccc gcctcagagt tcccccggag cggctgcgtg ccctggcctg ctctcttagc ggatggggga ggtaccccgc tgggcagctt cttcctttct tgcttatgcc ggccggaggc ggcgaccgga gaagctgggc ggcaggctcc cggcttgggc tgggagaaga agagcctcct ccgagctccg • · · • » t » · · · • · · ··· * ♦♦ cgacgcgggg ccacccttcc cccccagccc tgcgaggctt gcccgtattc cgagaaaagc cctcccccac ccccgcgcgc ccagccacaa caggatgcta accgcaccta actccttacc gagtcagcca cgctctgatg gtaaaaatgt aagaagactt agccaaaggc acactctctc ctttgtttcc ccccaccccc cggcaacaca tccaaggttc tattcgggga ggccgagccc aggctggagg tgtgtgtgtc cctcacaaaa ggtcaacagt attcctgaac cggattttgc ccccttacac cacacacacc tgggttaggg aaaggagctg ccatcagctt cccgttactt tctgcaaaca cccccctctc ggccgtctcg tcaccaaagg gggggcgggg tggtttgcca cgcagagcgc gcatgagggc cccgcaagct gaaggcggac acgagtttgg cagcctccaa gtttgcgttg atttaaactg cccattcatg aatatatccc agcggcgacg agaatcactt tctgtgtagc ggcgatctgg ctacgaatgt gcagctctca ccgcatagtt gtgagagtca cggcactgca aaagactcga cttttccagc atcctgagaa caacattccc gaaatcccac cctttgctta cccatcctca ccggcagttt cccagggata tcggggatgg ctgagcccag ccctggccag ctgggccagg tgcggtgtcc ctccacacag tccagtcccc aggctgggct gaaggcaggt atactttggc cgtcctccct accccctccc gcctgtggtt gtgccccgcc ggcgactggc tcccaggtta gcccttggag cgccgggctg gcggtagaga ggggaattc
840
900
960
1020
1090
1140
1200
1260
1320
1380
1440
1500
1560
1620
1680
1740
1800
1860
1920
1980
2040
2100
2160
2220
2280
2340
2400
2460
2520
2580
2640
2700
2760
2820
2880
2940
3000
3060
3120
3180
3240
3300
3360
3420
3479 <210> 7 <211> 8 <212> PRT <213> Horr.o sapiens <400> Pro Arg Cys
Gly Val Pro Asp Val 5 <210> 8 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220>
·« ♦···
<223> MMP13* Mutagenic Oligonucleotide <400> 8 aagccaagac gcggggttgt cgatgtgggt gaatacaat <210> 9 <211> 40 <212> DNA <213> Artificíal Sequence <220>
<223> MMP13* Mutagenic Oligonucleotide <400> 9 gaaaaagcca agatgcgggg gtcctgatgt gggtgaatac 40 <210> 10 <211> 98 <212> DNA <213> Artificíal Sequence <220>
<223> BS(SK-) vector <400> 10 ggtaccacta gtaagcttag atctcatatg gtcgaccccg gggaattcct gcagggatcc tctagaagta ccccatgggt atacatcgat gcggccgc <210> 11 <211> 2792 <212> DNA <213> Artificíal Sequence <220>
<223> tet-07/MMP13* transgene <400> 11 ctcgagttta ccactcccta tcagtgatag agaaaagtga aagtcgagtt taccactccc 60 tatcagtgat agagaaaagt gaaagtcgag tttaccactc cctatcagtg atagagaaaa 120 gtgaaagtcg agtttaccac tccctatcag tgatagagaa aagtgaaagt cgagtttacc 180 actccctatc agtgatagag aaaagtgaaa gtcgagttta ccactcccta tcagtgatag 240 agaaaagtga aagtcgagtt taccactccc tatcagtgat agagaaaagt gaaagtcgag 300 ctcggtaccc gggtcgagta ggcgtgtacg gtgggaggcc tatataagca gagctcgttt 360 agtgaaccgt cagatcgcct ggagacgcca tccacgctgt tttgacctcc atagaagaca 420 ccgggaccga tccagcctcc gcggccccga attagcttga tatcgaattc gagctcggta 480 cccggggatc ctctagacaa gatgcatcca ggggtcctgg ctgccttcct cttcttgagc 540 tggactcatt gtcgggccct gccccttccc agtggtggtg atgaagatga tttgtctgag 600 gaagacctcc agtttgcaga gcgctacctg agatcatact accatcctac aaatctcgcg 660 ggaatcctga aggagaatgc agcaagctcc atgactgaga ggctccgaga aatgcagtcc 720 ttcttcggct tagaggtgac tggcaaactt gacgataaca ccttagatgt catgaaaaag 780 ccaagatgcg gggttgtcga tgtgggtgaa tacaatgttt tccctcgaac tcttaaatgg 840 tccaaaatga atttaaccta cagaattgtg aattacaccc ctgatatgac tcattctgaa 900 gtcgaaaagg cattcaaaaa agccttcaaa gtttggtccg atgtaactcc tctgaatttt 960 accagacctc acgatggcat tgctgacatc atgatctctt ttggaattaa ggagcatggc 1020 gacctctacc catttgatgg gccctctggc ctgctggctc atgcttttcc tcctgggcca 1080 aatcatggag gagatgccca ttttgatgat gacgaaacct ggacaagtag ttccaaaggc 1140 cacaactcgt ttcttgttgc cgcgcatgag ttcggccact ccttaggtct tgaccactcc 1200 aaggaccctg gagcactcat gtttcctatc tacacctaca ccggcaaaag ccactttatg 1260 cttcctgatg acgatgtaca agggatccag tctctctatg gtccaggaga tgaagacccc 1320 aaccccaaac acccaaaaac gccagacaaa tgtgaccctt ccttatccct tgatgccatt 1380 accagtcccc gaggagaaac aatgatcttt aaagacagat tcttctggcg cctgcatccc 1440 u
ftft · • ft ·· ft ftft · ftftft* • ftft · • ♦ · · ft* ·· ftftftft • · • ftftft · κ
ft ft •
ft cagcaggccg atgcggagct gtttttaacg aaatcactcc ggccagaact ccccaaccgt actgacgctg catatgagca cccttctcat gacctcatct tcatcttcag aggtagaaaa ttttgggctc ttaatggtta tgacattctg gaaggttatc ccaaaaaaac atctgaactg ggtcttccaa aagaagttaa gaagataagt gcagctgttc actttgagga tacaggcaag actctcccgt tctcaggaaa ccaggtctgg agatatgatg atactaacca tattatggat aaagactatc cgagactaat agaagaagac ttcccaggaa ttggtgataa agtagatgct gtctatgaga aaaatggtta tatctatttt ttcaacggac ccatacagtt tgaatacagc atctggagta accgtattgt tcgcgtcatg ccagcaaatt ccattttgtg gtgttaagtg tctttttaaa aattgttatt taaatcccga agagcatttg gggtaatact tccagaagtg cggggtaggg gaagaagagc tatcaggaga aagccccagt tccagagggc cctattctat agtgtcacct aaacgccaga ggatctttgt gaaggaacct tacttctgtg gtgtgacata attggacaaa ctacctacag agatttaaag ctctaaggta aatataaaat ttttaagtgt ataatgtgtt aaactactga ttctaattgt ttgtgtattt tagattccaa cctatggaac cgacgaacgg gagcagcggt ggaatgcctt taatgaggaa aacctgtttt gctcagaaga aatgccatct agtgatgatg aggctactgc cgactcccaa cattctactc ctccaaaaaa gaagagaaag gtagaagacc ccaaggactt tccctcagaa tcgctaagtt ttttgagtca tgccgtgttt agtaatagaa ctcttgcttg ctttgctatt tacaccacaa aggaaaaagc tgcactgcta tacaagaaaa ttatggaaaa atatttgacg tatagtgcct tgactagaga tcataatcag ccataccaca tttgtagagg ttttacttgc tttaaaaaac ctcccacacc tccccctgaa cctgaaacat aaaatgaatg caattgttgt tgttaacctg tttattgcag ctcataatgg ttacaaataa agcaatagca tcacaaattt cacaaataaa gcattttttt cactgcattc tagttgtggt ttgtccaaac tcaccaacgt atcttatcat gtctggatca tcccgccacg ggtatacatc gacgcggccg cc <210> 12 <211> 5276 <212> DNA <213> Artificial Sequenee <220>
<223> tetracycline/VP16 repressor-activator fusion linked to a type II collagen promotér and enhancer, CPE-tTA transgene <400> 12 ggtaccacta gtaagcttag atccactgtc tgggattata tcaggacaac cgaagcctgg aaagtgtatt aggtagagca ttttcttcca cgtgtttggg cacgtttccg acagctagga ttccagctct gtctttgtat gttacagact gtaaatcaat cgcaggtgaa actgtttgga cagtaggcgg ggatcaaaga ccctccgccc gtgagactct aggcgctttc ccctgccacc agcctgtctc cagagatgct ctggaaggag gcgggcccgg gcggtctttc tgctctttag cgtggcggac gcggcggcgg gggcagggct ggageagaga gcgctgcagt gatagaactt tctgaccccg ctgcgcaggg cggcagggtg gcagggtggc agggtggcga gctaagccag agccgaacgc tggagctctg ggaggaacat cgaagtgttt gtatgtggtc tgagatcggc ctgactatat ttttttgtcc taaatttgca agcacacacc cacaaagctg cggtcttgac cggtattctt tatagagcgc aatggagtga gctgagtgtc taaacgattt ccctaattca tetgatagea gaggcgctct cctaattggc gaagagctgc ctcatgtccg caactttttg gcagagtgaa ttccacagct ttgtgtgtgt gtgtgggggg gggtgtaagg ggtgtctaaa actttcggtc tcccactatt ctgtatctcg accggttggt tttacacccc ggctcatctc atcaacgcaa acacccccac tctcctatgg acccaaggac ctgacgtggg ggaaggtgga cattaggaac gtcagaaacc tagagtccac gctcctcctc tccatctttc cacgagtttg ggaaacttct tggctgcgaa gactttgacc cacatctgca tttctcagcc ccagcttcca aaagtgccgc aggttcggga ggggagacct cagtcctcct ttgcgaggct tgtttgcgtt gagggattgg cagcgatggc ttccagatgg gctgaaaccc tgcccgtatt tatttaaact ggttcctcgt ggagagctgt gaaccgggcc ctgtatgcgc tcgagaaaag ccccattcat gagaggcaag gcccagcggg tccccccgac tccccgaccc ccctctccca caatacatcc cccctccctg tgcccgcctg ccgccacctc ccgggctccg gccccgcgcg cagcggcgac gaagcaacac agttccccga aagaggtagc tttttaattg gccagccaca aagaatcacc tatgccgcac ggcggtaacg aggggaaccg gatcgggcgg ccaggatgct atctgtgtag cccttctcgt gccacaatta gggcggcgct ggcttcctcc gaccgcacct aggcgatctg gttacaccgc tggctccttt cctgggcagc cacttaatcc tactttttac tctacgaacg cccgcctgac ggagggctgt gcccggagcc ccatccacaa agagtcagcc agcagctccc
1500
1560
1620
1660
1740
1800
1Θ60
1920
1980
2040
2100
2160
2220
2280
2340
2400
2460
2520
2580
2640
2700
2760
2792
120
180
240
300
360
420
480
540
600
660
720
780
840
900
960
1020
1080
1140
1200
1260
1320
1380
1440
1500
1560
·· a » « « «· • · · »
• · *
«* *· «··· a · · aacgtacccc accacgcccg gatcatcccg ccacgggtat acatcgatgc ggccgc <210> 13 <211> 7664 <212 > DNA <213> Artificial Sequence <220>
<223> beta-galactosidase (lacZ) gene linked to beta-globin splice sequence and polyadenylation signál, and linked to type II collagen promotér sequence <400> 13 ggtaccacta gtaagcttag atccactgtc tgggattata tcaggacaac cgaagcctgg aaagtgtatt aggtagagca ttttcttcca cgtgtttggg cacgtttccg acagctagga ttccagctct gtctttgtat gttacagact gtaaatcaat cgcaggtgaa actgtttgga cagtaggtgg ggatcaaaga ccctccgccc gtgagactct aggcgctttc ccctgccacc agcctgtctc cagagacgct ctggaaggag gcgggcccgg gcggtctttc tgctctttag cgtggcggac gcggcggcgg gggcagggcc ggagcagaga gcgctgcagt gatagaactt tctgaccccg ctgcgcaggg cggcagggtg gcagggtggc agggtggcga gctaagccag agccgaacgc tggagctctg ggaggaacac cgaagtgttt gcacgtggcc tgagatcggc ctgactatat ttttttgtcc taaatttgca agcacacacc cacaaagctg cggccttgac cggtattctt tatagagcgc aatggagtga gctgagtgtc taaacgattt ccctaattca tctgatagca gaggcgctct cctaattggc gaagagctgc ctcatgtccg caactttttg gcagagtgaa ttccacagct ttgtgtgtgt gtgtgggggg gggtgtaagg ggtgtctaaa actttcggtc tcctactatt ctgtatctcg accggttggt tttacacccc ggctcatctc atcaacgcaa acacccccac tctcctatgg acccaaggac ctgacgtggg ggaaggtgga cattaggaat gtcagaaacc tagagtccac gctcctcctc tccatctttc cacgagtttg ggaaacttct tggctgcgaa gactttgacc cacatctgca tttctcagcc ccagcttcca aaagtgctgc aggttcggga ggggagacct cagtcctcct ttgtgaggct tgtttgcgtt gagggattgg cagcgatggc ttccagatgg gctgaaaccc tgcccgtatt tatttaaacc ggccccccgc ggagagctgt gaatcgggct ctgtatgcgc tcgagaaaag ccccacccac gagaggcaag gcccagtggg tccccccgac tccccgaccc ccctctccca caacacaccc cccctccccg tgcccgcctg ccgccacctc ccgggctccg gccccgcgcg cagcggcgac gaagcaacac agttccccga aagaggcagc cccctaaccg gccagccaca aagaaccacc tatgccgcac ggcggtaacg aggggaaccg gatcgggcgg ccaggatgct atctgtgtag cccttttcgt gccacaatta gggcggcgcc ggcttcctcc gaccgcacct aggcgatctg gttacaccgt tggctccttt cttgggcagt catttaatcc tactttttac tctacgaatg tctgtctgat ggagggctgt gtccggagcc ccatccacaa agagtcagcc agcagctctc acacccggct ggatctcata tggtgcactc ccagcacaac ctgctctgat gccgcacagc caagccagcc aagctagctt gcgcaagcta gcttgcgatc cgtaaaaatg tgcgagagcc acaaaatgtc ttccgggcca agatccgaca gccatggtcc aaagaagact tcggcactgc agactcaaaa ccagctttct agcagaggca gaaggatcta gagccaaagg caaagacttg aataggctgg gaagatgcaa gaacggcacc ttacataaag aacactctct ccttttccag ccagcacact tgcatagaaa ttaagtttta cacttgaagt tctttgtttc catcctgaga agccccaaag tctgaggtgg cgcggcacgc tgggtaatcc tccccacccc ccaacattcc ccgggggttc cacgggggca gcttctccca aggacttcca gcggcaacac agaaatccca cttcgagaca aaggagttac cgcccaaacc aggccctaat ttccaaggtt ccctttgctc aaagttccct agaggaccat ctcacttcta aagaaaaggt gtattcgggg acccatcctc aacccccccg ttatggaagg agacttcggg aacagagcaa gggctgagcc cccggcagcc cggggcaagg ccggggccgg ggggagcaag gaaggcaagt gaggctggag gcccagggac aggggaagac gtgtgtgcgt gcgcgcgcgc gcgcgcgcgc gtgtgtgtgt ctcggggatg gcggcggcgg acaactagga aactctggcg ctttctcctc ccctcacaaa actgagtcca gctggagccg cctccagact ctctggccag ggcctcagag tggtcaacag tccctggcca gcgttgcccc ccccaggcca agggcaccca ctcccctgga gattcctgaa cctgggccag gaagagccga accagacaag cgcccccaac ccggctgcgt gcggattttg ttgcggtgtc ccccggccgc ctgcagttcc tttagccccc cccccggccc gccccttaca cccccacaca ggcccccccc tgtgtaggaa tacaccagac cctctcctag ccacacacac ctccagtccc
9
5276
120
180
240
300
360
420
480
540
600
660
720
780
840
900
960
1020
1080
1140
1200
1260
1320
1380
1440
1500
1560
1620
1680
1740
1800
1860
1920
1980
2040
2100
2160
2220
2280
2340
2400
2460
2520
2580
2640
2700 acacccggcc <
caagccagcc i acaaaatgcc t agactcaaaa <.
aataggctgg <
ccagcacact i agctccaaag 1 ctgggggttc <
ctccgagaca i aaagttcccc i aacctccttg 1 tggggtaagg i aggggaagat <
gtggtggcgg i gccggagccg gcgttgctct gaagagccga ccccggttgt ggtccccctc ccgtctacct ttgcgagcct tccggaaaac ctcccccgcc tcgcctttcc cttctaaccc tagagggggc ccgatcaggc ccttggcagg acagccccgc gcgaccggga gccgggtctc acccggaccc atatgtctag tcggaatcga cattgtattg cagataggca gtaataacgc atttaggtac tatgccaaca ttaccttagg cacctactac aaggtgcaga aacttaaatg ctaccatcga cggctccgcg cgaccgatgt acgccgacgc cgggatttac ttgagcagat gatcctctag aacctcacct aggtaaatat tattttagat aggaaaacct ctcaacattc cagaattgct ctatttacac tgatgtatag cttgctttaa gttgttgtta aatttcacaa ggatcccata aagctagctt ttccgggcta ccagctttct gaagatgcaa tgcatagaaa tctgaggtgg catgggggta aaggagttac agaggaccat ttatggaagg ttggggttgg gtgtgtgtgt acaaccagga cctccagact ctccaggcta attagacaag ctgcagttcc tgtgtaggaa agattttttt ccaggtggga tgtcccccag ccctaaactc agccttgagt cagcagaacc agtgtggcag cactgggcac tgtgggctct ggggggctgg gcatataacc ctgcctcctc gctccgtgct attagataaa aggcttaaca gcatgtaaaa ccatactcac taaaagtttt acggcctaca aggtttttca ttgcgtattg tgatagtatg gccagccttc tgaaagtggg gggcctgctc cctgtccttt cagcctgggg gctagacgat : cccccacgac gtttaccgat í agggccctat ctgtggtgtg . aaaattctca : tccaacctat : gttttgctca : tactcctcca . aagtctcctg : cacaaaggaa j tgccttgacc i aaaacccccc i acttgtttat i ataaagcatc cggtgcaccc gcgcaagcca agatccgaca agcagaggca gaatggcatt tcaagtttta tgtggtatgc gcttctccca tgcttaaacc ctcacttcta .
agacttcggg
Sgggagcaag gtgtgtgtgt aaccctggcg ctctggccag agggcaccca tgtctccaat tttagtccct tacaccagac catagctagt gttcaccgac atttaggatt cccaccccca ctaaagctcc ccgaggaaag ccccaagtgg atcgggggcg ggtccggccc ggggcggccc ggagcctccg cccctgctcc ctgccgcctc agtaaagtga acccgcaaac aataagcggg tcttgccctt agatgtgctt gaaaaacagc ctagagaatg gaagatcaag ccgccattat tcattcggcc tccgcgtaca gatctcccgg ccccccgcgg gacgagctcc ttcgacctgg tccgcccccc gccctcggaa tctatagtgt acataattgg agtgtataac ggaaccgatg gaagaaacgc aaaaagaaga agccatgctg aaagccgcac agagatcata acacctcccc cgcagcttac ccccccaccg
4 »· #«·· • 9 · • 4 · 4 «4 ·· 4 4 4 4 4 4 44 4 4 4 • 4 4
« 4 4 9 4 4 4 4 4 » • 4
Φ · w — w — » - <<·« · fl* · · ...
tcagtacaac ccgctccgat gccgcatagt 1620
gcccgcgatc cgcaaaaacg cgcgagagtc 1680
gccacggtcc aaagaagacc ccggcaccgc 1740
gaaggatcta gagccaaagg caaagacttg 1800
ttacataaag aacactctct cctcttccag 1860
cacttgaagc tcttcgtctc catcctgaga 1920
tgggtaattc tccccacccc ccaacattcc 1980
aggacttcca gcggcaacac agaaatccca 2040
aggccccaat tcccaaggtt ccctttgctt 2100
aagaaaaggt gtattcgggg acccaccccc 2160 —
aacagagcaa gggccgagcc tccggcagtt 2220
gaaggcaagt gaggctggag gcccagggat 2280
gtgtgtgtgt gtgtgtgtgt ctcggggatg 2340
ctttctcctc ccctcacaaa actgagtcca 2400
ggcctcagag tggtcaacag tccctggcca 2460
ctcccctgga gattcctgaa cctgggccag 2520
ccggctgcgt gcggattttg ttgcggtgtc 2580
tccctggcct gccccttaca cctccacaca 2640
cctctcttag ccacacacac ctccagtccc 2700
tggatggggg atgggctagg gaggctgggt 2760
aggtaccccg caaaggagct ggaaggcagg 2820
ctgggcagct tccatcagcc tatactttgg 2880
ccttcccttc tcccgtcact tcgtcctccc 2940
atgcctatgc ccccgcaaac aaccccctcc 3000
gggccggagg ccccccttct cgcctgcggt 3060
gggcgaccgg aggccgtccc ggtgccccgc 3120
ggaagccggg ctcaccaaag gggcgactgg 3180
gggcaggctc cgggggcggg gtcccaggtt 3240
gcggtttggg ctggtttgcc agcctttgga 3300
ctgggagaag acgcagagcg ccgctgggct 3360
tagagccccc tgcatgaggg cgcggtagag 3420
gccgagcttc gcccgcaagc tggggaattc 3480
ttaacagcgc attagagctg cttaacgagg 3540
tcgcccagaa gctaggtgta gagcagccta 3600
ctttgctcga cgccttagcc attgagatgt 3660
tagaagggga aagctggcaa gatcttttac 3720
tactaagtca tcgcgatgga gcaaaagtac 3780
acgaaactct cgaaaaccaa ttagcctttt 3840
cattatatgc actcagcgct gtggggcatt 3900
agcatcaagt cgctaaagaa gaaagggaaa 3960
tacgacaagc tatcgaatta tttgatcacc 4020
ttgaattgat catatgcgga ccagaaaaac 4080
gccgcgcgcg cacgaaaaac aaccacgggt 4140
acgacgacgc ccccgaagag gcggggctgg 4200
gacacacgcg cagactgtcg acggcccccc 4260
acttagacgg cgaggacgtg gcgatggcgc 4320
acacgtcggg ggacggggat tccccgggtc 4380
acggcgctct ggatatggcc gaccccgagt 4440
tcgacgagta cggcgggcag ggggcgcgag 4500
cacctaaatg ctagaggatc cctgtgaagg 4560
acaaactacc cacagagatt taaagctcta 4620
gtgttaaact actgattcta accgcctgtg 4680
aacgggagca gcggcggaac gcccccaacg 4740
catccagcga cgatgaggct accgccgact 4800
gaaaggtaga agaccccaag gaccttccct 4860
tgtttagcaa tagaactctc gcctgcctcg 4920
cgccacacaa gaaaattatg gaaaaatacc 4980
accagccata ccacatttgt agaggtttca 5040
ctgaacctga aacataaaat gaacgcaacc 5100
aacggctaca aacaaagcaa cagcaccaca 5160
cattccagct gtggtccgcc caaacccacc 5220
4^ ·· ···· • · • 4
4· 11 • 1 1 11
1
1 1 11
111 ι 1 11111911 1
1 1111111 1111 1 11 ·« ·* ·*· κ
ccgtcúaccc agatttttcc catagccagt tggatzggggg acgggtitagg gaggccgggt 2760 ccgcgagccc ccaggcggga gcccaccgac aggcaccccg caaaggagcc ggaaggcagg 2820 cccggaaaac cgccccccag actcaggacc ccgggcagcc cccaccagcc cacaccttgg 2880 cccccccgcc ccctaaaccc cccaccccca cccccccccc ccccgccacc ccgccccccc 2940 ccgccccccc agccccgagc ccaaagcccc acgcccacgc ccccgcaaac aacccccccc 3000 cccccaaccc cagcagaacc ccgaggaaag gggccggagg cccccccccc cgcccgcggc 3060 cagagggggc agcgcggcag tcccaagcgg gggcgaccgg aggccgcccc ggcgccccgc 3120 ccgatcaggc caccgggcac aCcgggggcg ggaagccggg cccaccaaag gggcgaccgg 3180 ccccggcagg tgcgggcccc ggtccggccc gggcaggccc cgggggcggg gccccaggtc 3240 acagccccgc ggggggccgg ggggcggccc gcggcccggg ccggcttgcc agccctcgga 3300 gcgaccggga gcatataacc ggagcccccg ccgggagaag acgcagagcg ccgctgggcc 3360 gccgggcctc ccgcctcccc ctcccgcccc tagagcctcc tgcacgaggg cgcggcagag 3420 acccggaccc gccccgcgcc ctgccgcccc gccgagcttc gcccgcaagc cggggaattc 3480 ggacccccgg gaccgaaaga gcccgctaaa gcaaaaaaga agccaccatg tcgctcactt 3540 tgaccaacaa gaacgcgacc cccgccgccg gcccgggagg cattggcctg gacaccagca 3600 aggagccgcc caagcgcgac cccgccgccc cacaacgccg tgaccgggaa aaccctggcg 3660 ctacccaacc taatcgccct gcagcacatc cccctttcgc cagccggctt catagcgaag 3720 aggcccgcac cgaccgcccc ccccaacagc cgcgcagccc gaatggcgaa' tggcgccttg 3780· cctggcctcc ggcaccagaa gcggcgccgg aaagccggcc ggagcgcgat ccccccgagg 3840 ccgataccgc cgtcgccccc ccaaactggc agacgcacgg tcacgatgcg cccatctaca 3900 ccaacgcaac ccatcccacc acggccaacc cgccgtttgc tcccacggag aacccgacgg 3960 gctgccaccc gcccacatct aatgctgatg aaagccggcc acaggaaggc cagacgcgaa 4020 ccacccccga cggcgccaac ccggcgcccc acccgcggcg caacgcgcgc cgggccggcc 4080 acggccagga cagccgcccg ccgcccgaac ccgacccgag cgcaccccca cgcgccggag 4140 aaaaccgccc cgcggcgacg gcgccgcgcc ggagcgacgg cagccacccg gaagaccagg 4200 acacgcggcg gacgagcggc accccccgcg acgccccgcc gccgcacaaa ccgaccacac 4260 aaaccagcga cccccacgcc gccacCcgcc ccaacgacga ccccagccgc gccgaaccgg 4320 aggccgaagc ccagacgcgc ggcgagccgc gcgaccaccc acgggcaaca gcccccccac 4380 ggcagggcga aacgcaggcc gccagcggca ccgcgccccc cggcggcgaa accaccgacg 4440 agcgcggcgg ccacgccgac cgcgccacac cacgcccgaa cgccgaaaac ccgaaaccgc 4500 ggagcgccga aaccccgaac ccccaccgcg cggcggccga accgcacacc gccgacggca 4560 cgccgaccga agcagaagcc cgcgacgccg gcccccgcga ggcgcggaCc gaaaacggcc 4620 cgctgccgcc gaacggcaag ccgccgccga cccgaggcgc caaccgccac gagcaccacc 4680 ccccgcatgg ccaggccacg gacgagcaga cgacggcgca ggacaccccg ccgacgaagc 4740 agaacaaccc caacgccgcg cgcCgcccgc accacccgaa ccacccgccg cggcacacgc 4800 cgcgcgaccg ccacggcccg cacgcggcgg acgaagccaa caccgaaacc cacggcaCgg 4860 cgccaacgaa cccgccgacc gacgacccgc gccggccacc agcgacgagc gaacgcgCaa 4920 cgcgaacggc gcagcgcgac cgcaaccacc cgagcgcgac cacccggccg ccggggaacg 4980 aaccaggcca cggcgccaac cacgacgcgc cgcaccgccg gaccaaaccc gccgaccccc 5040 cccgcccggc acagcacgaa ggcggcggag ccgacaccac ggccaccgac accacccgcc 5100 cgacgcacgc gcgcgcggac gaagaccagc cccccccggc cgcgccgaaa cggcccacca 5160 aaaaacggcc cccgccaccc ggagagacgc gcccgccgac cccccgcgaa cacgcccacg 5220 cgacgggcaa cagccccggc ggccccgcca aacaccggca ggcgccccgc cagcaccccc 5280 gttcacaggg cggccccgcc tgggaccggg cggaccagcc gccgaccaaa cacgacgaaa 5340 acggcaaccc gcggccggcc cacggcggcg accccggcga cacgccgaac caccgccagc 5400 cccgcacgaa cggcccggcc cccgccgacc acacgccgca cccagcgccg acggaagcaa 5460 aacaccagca gcagcccccc cagccccgcc cacccgggca aaccaccgaa gcgaccagcg 5520 aacacccgcc ccgccacagc gacaacgagc ccccgcaccg gacggcggcg ccggacggca 5580 agccgccggc aagcggcgaa gcgcccccgg acgccgcccc acaaggcaaa cagccgaccg 5640 aaccgcccga accaccgcag ccggagagcg ccgggcaacc ccggcccaca gcacgcgcag 5700 cgcaaccgaa cgcgaccgga cggccagaag ccgggcacac cagcgcccgg cagcagcggc 5760 gcccggcgga aaaccccagc gcgacgcccc ccgccacgcc ccacgccacc ccgcacccga 5820 ccaccagcga aacggacccc cgcaccgagc cgggcaacaa gcgccggcaa cccaaccgcc 5880 agccaggccc ccccccacag ccgcggaccg gcgacaaaaa acaaccgccg acgccgcCgc 5940 gcgaccagcc cacccgcgca ccgccggaca acgacaccga cgcaagcgaa gcgacccgca 6000 ccgaccccaa cgcccgggcc gaacgccgga aggcggcggg ccaccaccag gccgaagcag 6060 cgccgccgca gcgcacggca gacacacccg ccgacgcggc gccgaccaca accgcccacg 6120 cgcggcagca ccaggggaaa accccactca ccagccggaa aacccaccgg accgacggca 6180 gcggccaaac ggcgaccacc gccgacgccg aagcggcgag cgacacaccg cacccggcgc 6240 ggaccggccc gaaccgccag ccggcgcagg cagcagagcg ggcaaaccgg cccggaccag 6300 ggccgcaaga aaaccacccc gaccgcccca ccgccgcccg ccccgaccgc cgggacccgc 6360
XT?
• ·
cattgtcaga catgtatacc ccgtacgtct ccccgagcga aaacggtctg cgctgcggga cgcgcgaatt gaattatggc ccacaccagc ggcgcggcga cttccagtcc aacatcagcc gccacagcca acagcaaccg atggaaacca gccatcgcca tctgctgcac gcggaagaag gcacatggcc gaacatcgac ggtctccata tggggattgg tggcgacgac tcctggagcc cgtcagtatc ggcggaatta cagctgagcg ccggtcgcta ccatcaccag ttggtctggt gtcaaaaata ataataaccg gcaggccatg tctgaaagca ttcgcgtaag gaaatccatt acgtactatt taaaaaacac aaacttttgg atgttcggtt tattcttttt ctcttacttt tttatcatgg gagcctactt cccgcttttc ccgatttggc cacacgacat caaccatatg agcaaaagcg atacgggtat tatttttgcc gctatttctc tgttgtcgct attattccaa ccgccgctgg tctgctttct gacaaactcg gcctcgactc cagactgaga acttcagggt gagtttgggg acccttgatt gttctttctt tttcgctatt gaaaaattca tgttatatgg agggggcaaa gttttcaggg tgttgtttag aatgggaaga tgtcccttgt atcaccatgg accctcatga taatttcgtt tccttcactt tctactctgt cgacaaccat tgtctcctct tattttcttt tcattttctg taactttttt cgttaaactt tagcttgcat ttgtaacgaa tttttaaatt caetttcgtt tatttgtcag attgtaagta ctttctctaa tcactttttt tccaaggcaa tcagggtaat tatattgtac ttcagcacag tcttagagaa caattgttat aattaaatga taaggtagaa catttctgca tataaattct ggctggcgtg gaaatattct tattggtaga aacaactaca tcccggcaat catcctgcct ttctctttat ggttacaatg atatacactg tttgagatga ggataaaata ctctgagccc aaaccgggcc cctctgccaa ccatgttcat gccttcttct ttttcctaca gctcctgggc aacgtgctgg ttgttgtgct gtctcatcat tttggcaaag aattcactcc tcaggtgcag gccgcctatc agaaggtggt ggctggtgcg gccaacgccc tggctcacaa ataccaccga gatc
6420
6480
6540
6600
6660
6720
6780
6840
6900
6960
7020
7080
7140
7200
7260
7320
7380
7440
7500
7560
7620
7664 <210> 14 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Seguence <220>
<223 > primer corresponding to tTA seguence <400> 14 cgagggcctg ctcgatctcc <210> 15 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Seguence <220>
<223> primer corresponding to 3' untranslated region of tTA seguence <400> 15 ggcattccac cactgctccc
<210> 16 <211> 21 <212> DNA <213> Homo sapiens
<400> 16
gagcaccctc ctcatgacct c <21O> 17 <211> 22 <212> DNA <213> Escherichia coli
• · <400> 17 gttggtgtag atgggcgcat cg
<210> 18 <211> 21 <212> DNA <213> Escherichia coli
<400> 18
gcggggtctc aggttacagc c <210> 19 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220>
<223> PCR primer corresponding to tet activator <400> 19 cgcccagaag ctaggtgtag ag
<210> 20
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220> <223> PCR primer for tet
<400> 20
activator cggccatatc cagagcgccg
<210> 21 <211> 23 <212> DNA <213> Homo sapiens
<400> 21
gccctctggc ctgctggctc atg
<210> 22 <211> 24 <212> DNA <213> Homo sapiens
<400> 22
caggagagtc ttgcctgtat cctc
<210> 23
<211> 25
<212> DNA
<213> Mus muscalis
<400> 23
aggagggagc tgacagatac actcc

Claims (27)

  1. PATENTOVÉ NÁROKY
    1. Transgenní nehumání savec nebo jeho potomstvo se somatickými a zárodečnými buňkami, které obsahují ve stabilně integrované formě rekombinantní gen kódující polypeptid, zahrnující enzymaticky aktivní, matrix degradující enzym, kde je zmíněný rekombinantní gen selektivně exprimován v chondryocytech zmíněného savce a zmíněná exprese vyvolá patologické symptomy, charakteristické pro degenerativní onemocnění chrupavky
  2. 2. Transgenní zvíře nebo jeho potomstvo se somatickými a zárodečnými buňkami, které obsahují stabilně integrovaný první rekombinantní gen kódující polypeptid vybraný ze skupiny skládající se Z MMP-1, MMP-2, MMP-3, MMP-7, MMP-8, MMP-9, MMP-10, MMP-13,
    MMP-14, MMP-15, MMP-16, MMP-17 a jejich enzymaticky aktivních variant.
  3. 3. Transgenní zvíře definované v nároku 2, kde zmíněný první rekombinantní gen je selektivně exprimován v synoviálních chondriocytěch daného zvířete.
  4. 4. Transgenní zvíře definované v nároku rekombinantní gen kóduje MMP-13.
    2, kde zmíněný první
  5. 5. Transgenní zvíře je lidský.
    definované v nároku
    4, kde zmíněný MMP-13
  6. 6. Transgenní zvíře definované v nároku 4, kde zmíněný první rekombinantní gen kóduje variantu polypeptidu MMP-13 obsahující enzymaticky aktivní proMMP-13.
  7. 7. Transgenní zvíře definované v nároku 6, kde rekombinantní gen obsahuje sekvenci kódující MMP-13, daný popsanou v SEQ
    ID NO:1.
    *1 ·· · · · · · · ·· ·· ·· · · « · · · .
    • « ·»·· · · • · · · · · ·· ····· ·· · · · ·
  8. 8. Transgenní zvíře definované v nároku 2, kde je zmíněné vybrané ze skupiny skládající se z myši, krysy, králíka, ovce, krávy, kozy a prasete.
  9. 9. Transgenní zvíře definované v nároku 8, kde je zmíněné zvíře myš.
    zvíře
  10. 10. Transgenní zvíře definované v nároku 2, kde je exprese zmíněného rekombinantního genu pod řízením prvního regulovatelného promotoru.
  11. 11. Transgenní zvíře definované v nároku 10, kde zmíněný první regulovatelný promotor obsahuje tet07.
  12. 12. Transgenní zvíře definované v nároku 11, kde má zmíněný promotor sekvenci uvedenou v SEQ ID NO:2.
  13. 13. Transgenní zvíře definované v nároku 10, obsahující dále druhý rekombinantní gen kódující polypeptid, který reguluje zmíněný první promotor.
  14. 14. Transgenní zvíře definované v nároku 12, kde je exprese zmíněného druhého rekombinantního genu pod řízením druhého regulovatelného promotoru.
  15. 15. Transgenní zvíře definované v nároku 13, kde zmíněný druhý regulovatelný promotor obsahuje sekvence odvozené od promotoru kolagenu typu II, který způsobuje selektivní expresi zmíněného druhého rekombinantního genu v kloubních pletivech.
  16. 16. Transgenní myš nebo její potomstvo se somatickými a zárodečnými buňkami, které obsahují ve stabilně integrované formě:
    (i) první rekombinantní gen obsahující sekvenci kódující odlišný MMP-13 polypeptid obsahující MMP-13*, kde je zmíněná sekvence operačně připojená k tetO7 promotoru; a • · · ♦· · (ii) druhý rekombinantní gen kódující tTA protein operativně připojený k sekvenci odvozené od promotoru kolagenu typu II.
  17. 17. Transgenní myš definovaná v nároku 16, kde exprese zmíněných rekombinantních genů v kloubním pletivu vyvolá patologické symptomy charakteristické pro degenerativní kloubní degenerativní onemocnění.
  18. 18. Izolovaná nukleová kyselina kódující enzymaticky aktivní proMMP-13, kde má zmíněná nukleová kyselina sekvenci vybranou ze skupiny skládající se ze sekvence popsané v SEQ ID NO:1, její sekvenčně konzervativní mutanty a funkčně konzervativní mutanty.
  19. 19. Rekombinantní klonovací vektor obsahující nukleovou kyselinu definovanou v nároku 18.
  20. 20. Hostitelskou buňku obsahující vektora definovaného v nároku 19.
  21. 21. Metodu pro produkci polypeptidu zahrnující kultivaci buňky definované v nároku 20 za podmínek vhodných pro expresi zmíněného enzymaticky aktivního proMMP-13
  22. 22. Metoda pro vyvolání fenotypových změn spojených s degenerativním onemocněním chrupavky u savců, zahrnující udržování savce definovaného v nároku 1 za podmínek, kdy je zmíněný rekombinantní gen selektivně exprimován v kloubním pletivu zmíněného savce.
  23. 23. Metoda pro vyvolání fenotypových změn spojených s degenerativním onemocněním chrupavky u savců, zahrnující udržování savce definovaného v nároku 2 za podmínek, kdy je zmíněný rekombinantní gen selektivně exprimován v kloubním pletivu zmíněného savce.
  24. 24. Metoda pro vyvolání fenotypových změn spojených s degenerativním onemocněním chrupavky u myši, zahrnující udržování
    00 9999 > ·0 • 0 0 • 00 myši definované v nároku 16 po předem stanovenou dobu bez tetracyklinu nebo jeho biologicky aktivních analoga.
  25. 25. Metoda pro určení schopnosti látky působit proti degenerativnímu onemocnění chrupavky, přičemž zmíněná metoda zahrnuje:
    (i) podávání známé dávky látky transgennímu zvířeti definovanému v nároku 1 za podmínek, kdy se projevují fenotypové indikátory spojené s degenerativním onemocněním chrupavky;
    (ii) sledování vývoje fentotypových indikátorů degenerativního onemocnění chrupavky po předem určenou dobu po podávání látky; a (iii) porovnání rozsahu fenotypových indikátorů u zvířete, kterému se podávala látka ve srovnání s kontrolním transgenním zvířetem, kterému se látka nepodávala, kde jakýkoliv rozdíl v povaze nebo rozsahu fenotypových indikátorů nebo jakýkoliv rozdíl v čase nutném pro vývoj fenotypových indikátorů naznačuje možnost, že daná látka působí proti degenerativnímu onemocnění chrupavky.
  26. 26. Metoda pro určení schopnosti látky působit proti degenerativnímu onemocnění chrupavky, přičemž zmíněná metoda zahrnuje:
    (i) udržování transgenního zvířete definovaného v nároku 16 po předem určenou dobu bez tetracyklinu nebo tetracyklinového analoga, kdy zmíněné udržování způsobí objevení se jednoho nebo více fenotypových indikátorů degenerativního onemocnění chrupavky ve zmíněném zvířeti;
    (ii) podávání známé dávky zmíněné látky zvířeti;
    (iii) sledování vývoje zmíněných fenotypových indikátorů po předem určenou dobu po podání látky; a (iii) porovnání rozsahu fenotypových indikátorů u zvířete, kterému byla podávána daná látka ve srovnání s kontrolním transgenním zvířetem, které nebylo vystaveno účinkům látky, kde jakýkoliv rozdíl v povaze nebo rozsahu fenotypových indikátorů naznačuje schopnost látky působit proti degenerativnímu onemocnění chrupavky.
    4^ ·« *···
  27. 27. Metoda pro určení schopnosti látky působit proti degenerativnímu onemocnění chrupavky, přičemž zmíněná metoda zahrnuje:
    (i) poskytnutí transgenního zvířete definovaného v nároku 16, které se udržovalo za přítomnosti tetracyklinu nebo tetracyklinového analoga, aby se potlačila exprese zmíněného prvního rekombinantniho genu;
    (ii) v podstatě současné (a) podání známé dávky zmíněné látky zmíněnému zvířeti a (b) zastavení podávání zmíněného tetracyklinu;
    (iii) sledování vývoje fenotypových indikátorů degenerativního , onemocnění chrupavky po předem určenou dobu po podání látky; a (iv) porovnání rozsahu fenotypových indikátorů u zvířete, i kterému byla podána daná látka ve srovnání s kontrolním transgenním zvířetem, které nebylo vystaveno účinkům látky, kde jakýkoliv rozdíl v povaze nebo rozsahu indikátorů, nebo jakýkoliv rozdíl v čase nutném pro vývoj indikátorů, naznačuje schopnost látky působit proti degenerativnímu onemocnění chrupavky.
CZ20002201A 1997-12-19 1998-12-18 Transgenní zvířecí model pro degenerativní onemocnění chrupavek CZ20002201A3 (cs)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US6831297P 1997-12-19 1997-12-19
US08/994,689 US6613958B1 (en) 1997-12-19 1997-12-19 Transgenic mouse model for degeneration of type II collagen in joints

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CZ20002201A3 true CZ20002201A3 (cs) 2001-11-14

Family

ID=26748837

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CZ20002201A CZ20002201A3 (cs) 1997-12-19 1998-12-18 Transgenní zvířecí model pro degenerativní onemocnění chrupavek

Country Status (8)

Country Link
EP (1) EP1040196A2 (cs)
JP (1) JP2002533055A (cs)
KR (2) KR100685105B1 (cs)
AU (2) AU1931699A (cs)
CA (1) CA2314357A1 (cs)
CZ (1) CZ20002201A3 (cs)
IL (1) IL136626A0 (cs)
WO (1) WO1999031969A2 (cs)

Families Citing this family (16)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6787319B2 (en) 1997-04-16 2004-09-07 American Home Products Corp. β-amyloid peptide-binding proteins and polynucleotides encoding the same
US7005295B1 (en) 1997-04-16 2006-02-28 Wyeth β-amyloid peptide-binding proteins and polynucleotides encoding the same
US20040006205A1 (en) * 2001-04-03 2004-01-08 Li Li Therapeutic polypeptides, nucleic acids encoding same, and methods of use
US7186693B2 (en) 2001-08-16 2007-03-06 Kimberly - Clark Worldwide, Inc. Metalloproteinase inhibitors for wound healing
US6906036B2 (en) * 2001-08-16 2005-06-14 Kimberly-Clark Worldwide, Inc. Anti-aging and wound healing compounds
US7071164B2 (en) 2001-08-16 2006-07-04 Kimberly-Clark Worldwide, Inc. Anti-cancer and wound healing compounds
US7479579B2 (en) * 2001-12-20 2009-01-20 The Regents Of The University Of California Triple transgenic mouse model of Alzheimer's disease
US7148194B2 (en) 2002-12-30 2006-12-12 Kimberly-Clark Worldwide, Inc. Method to increase fibronectin
US7189700B2 (en) 2003-06-20 2007-03-13 Kimberly-Clark Worldwide, Inc. Anti-chrondrosarcoma compounds
EP2402449A3 (en) * 2006-05-01 2012-04-04 Aarhus Universitet An animal model and a method for producing an animal model
CA2721713C (en) 2008-05-05 2019-07-09 Novimmune Sa Anti-il-17a/il-17f cross-reactive antibodies and methods of use thereof
EP2427203B1 (en) 2009-05-05 2018-10-17 Novimmune S.A. Anti-il-17f antibodies and use thereof
KR101176139B1 (ko) * 2010-05-20 2012-08-22 광주과학기술원 관절염 동물모델로서 연골 특이적 ＨＩＦ?２α 형질전환 마우스 및 이의 용도
US9894889B2 (en) * 2013-12-12 2018-02-20 Mie University Transgenic non-human mammal that expresses human MMP2
KR102167443B1 (ko) * 2019-03-25 2020-10-19 주식회사 카티프라임 체외 골관절염 모델 및 이를 이용한 골관절염 치료제 스크리닝 방법
WO2025176195A1 (en) * 2024-02-23 2025-08-28 Biocytogen Pharmaceuticals (Beijing) Co., Ltd. Genetically modified non-human animal with human or chimeric mmp-7

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE19501032A1 (de) * 1995-01-14 1996-07-18 Max Delbrueck Centrum Mittel zur Behandlung von rheumatischen Erkrankungen

Also Published As

Publication number Publication date
JP2002533055A (ja) 2002-10-08
AU1931699A (en) 1999-07-12
AU2003257928A1 (en) 2003-11-20
KR100685105B1 (ko) 2007-02-22
KR20010033289A (ko) 2001-04-25
WO1999031969A3 (en) 1999-11-25
AU2003257928B2 (en) 2007-07-12
KR20050109080A (ko) 2005-11-17
WO1999031969A2 (en) 1999-07-01
EP1040196A2 (en) 2000-10-04
CA2314357A1 (en) 1999-07-01
IL136626A0 (en) 2001-06-14
KR100558288B1 (ko) 2006-03-10

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Rausa et al. The cut-homeodomain transcriptional activator HNF-6 is coexpressed with its target gene HNF-3β in the developing murine liver and pancreas
US6790639B2 (en) Mammalian osteoregulins
CN100381570C (zh) 滑膜细胞蛋白质
KR100558288B1 (ko) 연골의 퇴행성 질환용 트랜스제닉 동물 모델
JP2001509378A (ja) 哺乳動物におけるダブルマスル化を引き起こすミオスタチン遺伝子の変異
US20110088106A1 (en) Compositions and methods for mediating cell cycle progression
JP2002525067A (ja) レプチン誘導遺伝子
US6482937B1 (en) Porcine Oct-4 promoter
US6252130B1 (en) Production of somatic mosaicism in mammals using a recombinatorial substrate
US6613958B1 (en) Transgenic mouse model for degeneration of type II collagen in joints
JP2000511410A (ja) ナンセンス介在ｒｎａ崩壊の哺乳動物の調節因子
US20020155564A1 (en) Cloning of a high growth gene
US6303370B1 (en) Tissue-specific regulatory elements
US20100107265A1 (en) Double-muscling in mammals
AU741340B2 (en) Non human transgenic animal in which the expression of the gene coding for insulin is deleted
JP2003523192A (ja) Ｆｏｘｃ２を発現する肥満のトランスジェニック動物モデル
AU735296B2 (en) Mammalian and human REC2
JPH10509586A (ja) 機能的に破壊されたインターロイキン−１β変換酵素遺伝子を有するトランスジェニック非ヒト動物
PL197770B1 (pl) Zwierzę transgeniczne, transgen, znakowane epitopowo TBP, ich zastosowanie i sposób wytwarzania, sposób charakteryzowania składu i wyodrębniania kompleksów transkrypcyjnych wyższego rzędu, sposób identyfikowania czynnika TAF i/lub czynnika oddziaływującego z TAF oraz przeciwciało
US6747187B1 (en) Knockout mouse for the tumor suppressor gene ANX7
JP2003506056A (ja) 腫瘍抑制遺伝子ａｎｘ７のノックアウトマウス
JP2005027672A (ja) ｐ２５ポリペプチドをコードするトランスジーンを有するトランスジェニック非ヒト動物及びトランスジェニック非ヒト哺乳類細胞
AU2007221983A1 (en) Transgenic animal model for degenerative diseases of cartilage
CA2242382C (en) Compositions and methods for mediating cell cycle progression
JP2001299141A (ja) ノックイン非ヒト哺乳動物

Legal Events

Date Code Title Description
PD00 Pending as of 2000-06-30 in czech republic