CZ20002373A3

CZ20002373A3 - Způsob extrakce kapsulárních polysacharidů z buněčných komponent gramnegativních a grampozitivních bakterií a modifikovaný kapsulární polysacharid

Info

Publication number: CZ20002373A3
Application number: CZ20002373A
Authority: CZ
Inventors: Francis Michon; Milan Blake
Original assignee: North American Vaccine, Inc.
Priority date: 1997-12-23
Filing date: 1998-12-23
Publication date: 2000-12-13
Also published as: JP2010011862A; KR100641490B1; EP1051506B8; EP1051506B1; KR20060086978A; ES2611464T3; ES2346022T3; AU2307199A; WO1999032653A9; EP2226336B1; AU754256C; KR100757630B1; EP3118225A1; EP1051506B2; KR20010033494A; NO20003226D0; CA2316975C; JP2001526902A; CA2316975A1; DE69841676D1

Description

ZPŮSOB EXTRAKCE KAPSULÁRNÍCH POLYSACHARIDŮ Z BUNĚČNÝCH KOMPONENT GRAMNEGATIVNÍCH A GRAMPOZITIVNÍCH BAKTERIÍ A MODIFIKOVANÝ KAPSULÁRNÍ POLYSACHA RID

Priorita je nárokována dle provizorní US patentové přihlášky č. 60/068 608, podané 23.

12. 1997, která je zde zahrnuta jako odkaz.

Oblast techniky

Předmětný vynález se vztahuje ke způsobům extrakce a izolace kapsulárnich polysacharidů (CPS) z gramnegativních i grampozitivních bakterií. Extrahované polysacharidy jsou užitečné pro přípravu vakcín, obsahujících buď samotné polysacharidy nebo polysacharidy konjugované s proteiny.

Dosavadní stav techniky

Bakteriální infekce, způsobené grampozitivní bakterií jako jsou Streptococcus, Staphylococcus, Enterococcus, Bacillus, Corynebacterium, Listeria, Erysipelothrix a Clostridiwn a gramnegativní bakterií jako jsou Haemophilus, Shigella, Vibrio cholerae, Neisseria a určité typy Escherichia coli, způsobují vážná onemocnění na celém světě. Toto spolu s vyskytující se rezistencí bakterií vůči antibiotikům indikuje potřebu vyvinout bakteriální vakcíny.

Např. streptokokové tvoří široký rod různých grampozitivních bakterií, které byly na základě antígenicity a struktury polysacharidů jejich buněčné stěny (26, 27) uspořádány do několika skupin. Dvě z těchto skupin jsou spojovány s vážnými lidskými infekcemi. Streptokokové skupiny A způsobují řadu infekčních onemocnění včetně „streptokokové angíny“, revmatické horečky, streptokokového impetiga a sepse.

Streptokokové skupiny B nebyly až do počátku sedmdesátých let uváděny v běžných lékařských učebnicích jako lidské patogeny. Od té doby však studie ukázaly, že streptokokové skupiny B jsou významnými perinatálními pathogeny jak v USA tak i v rozvojových zemích (37). Infekce, způsobené streptokoky systémové skupiny B v průběhu prvních dvou měsíců života, postihují přibližně tři z každých 1000 porodů (12), čímž vzniká ročně v USA 11 000 nových případů. Tyto infekce způsobují symptomy vrozené pneumonie, sepsi a meningitidu. Podstané číslo těchto dětí umírá nebo má trvalé neurologické následky. Dále mohou být infekce streptokoky skupiny B příčinou onemocnění ve vysokém stupni těhotenství, která se vyskytují přibližně u 50 000 žen ročně. Další rizikovou skupinu, ohroženou infekcemi streptokoky skupiny

B, tvoří ti, kteří mají změněnou imunitní odpověď ať již vrozeně, chemoterapeuticky nebo jinými způsoby.

Streptokokové skupiny B mohou být dále rozděleny na základě bakteriálních kapsulámích polysacharidů do několika odlišných typů. Typy Ia, Ib, Π, IH, IV, V, VI, VII a VIII vysvětlují většinu patogenicity následkem infekce skupinou B, přičemž streptokokové skupiny B typu Ia, Ib, II, ΠΙ a V reprezentují více než 90 % všech známých případů. Struktura polysacharidů každého z těchto různých typů byla charakterizována (19 až 22, 44). Podobně jako bylo zjištěno u mnoha dalších lidských bakteriálních pathogenů, mohou kapsulámí polysacharidy streptokoků skupiny B, jsou-li použity ve vakcínách, poskytnout účinnou ochranu vůči infekcím těmito bakteriemi viz 4, 6, 24, 29, 30,42,43,45.

Významnou příčinou onemocnění jsou také gramnegativní bakterie. Až do nedávné doby, kdy byly vyvinuty a začaly být používány vakcíny na bázi polysacharid-protein proti bakterii Hctemophilus influenza typ b (Hib), byly infekce bakterií Hib odpovědné za mnoho případů mentální retardace u dětí. Infekce bakteriemi N. meningitidis a E. coli K1 jsou odpovědné za neonatální meningitidu. Kmeny gramnegativní bakterie E. coli jsou spojovány s vážnými onemocněními včetně smrti v důsledku požití masa, nakaženého kmeny E. coli.

Produkce vakcín na bázi kapsulámích polysacharidů a vakcín na bázi polysacharidových konjugátů ve velkém měřítku vyžaduje odpovídající zajištění dodávky přečištěných kapsulámích polysacharidů. Způsoby izolace kapsulámích polysacharidů z bakteriálních buněk, které jsou uvedeny ve stavu techniky (40, 42), spočívají v působeni enzymu mutanolysinu na buňky. Mutanolysin štěpí bakteriální buněčnou stěnu, která propouští buněčné komponenty. Tento postup zahrnuje působení dalších enzymů na buněčný lyzát, jehož cílem je odstranit proteiny a nukleové kyseliny a přečištění preparátu různými sráženími a chromatografíckými postupy. Žádoucí jsou takové způsoby získávání přečištěných kapsulámích polysacharidů, které jsou účinné, jednoduché a které poskytují vysoké výtěžky.

Podstata vynálezu

Tento vynález poskytuje způsob extrakce kapsulámích polysacharidů (CPS) z buněčných komponent jak gramnegativních tak i grampozitivních bakterií. Podle tohoto vynálezu mohou být CPS extrahovány z bakteriálních supernatantu nebo bakteriálních buněk hydrolýzou vazby, která je labilní vůči bázi a která spojuje CPS a další buněčné komponenty. Výhodou extrakčního

postupu, který je poskytován tímto vynálezem, je fakt, že extrahované CPS jsou vysoce neporušené.

Jiné provedení tohoto vynálezu poskytuje způsob získávání přečištěného kapsulárního polysacharidu deacetylací určitého procenta A-acetylových skupin CPS v průběhu bazické extrakce, jejíž cílem je usnadnit separaci CPS od dalších buněčných komponent. Aby byl poskytnut přečištěný CPS, který bude mít stejnou opakující se jednotku struktury co se týče N-acetylových skupin jako nativní polysacharid, může být určité procento acetylových skupin zpětně opět začleněno nebo může být použita acylace modifikovanými alkylovými skupinami s cílem získat modifikovaný CPS.

Ve výhodnějším provedení jsou CPS extrahovány ze streptokoků skupiny B (GBS).

V nejvýhodnějím provedení jsou CPS extrahovány z GBS typu la, lb, II, III, V a VIII.

V dalším výhodnějším provedení jsou CPS extrahovány ze S. pneumoniae.

V nej výhodnějším provedení jsou CPS extrahovány ze S. pneumoniae typ III, IV a XIV.

V jiném výhodnějším provedení jsou CPS extrahovány z bakterie Neisseria nebo Escherichia. V nejvýhodnějším provedení jsou CPS extrahovány z Neisseria meningitidis typ B, C, Y nebo W135 nebo z Escherichia coli Kl.

Přečištění kapsulárních polysacharidů z bakteriálních supematantů nebo bakteriálních buněk podle tohoto vynálezu má oproti jiným způsobům následující výhody: (a) jednoduchost (minimální počet kroků), (b) účinnost (vysoký výtěžek a čistota), (c) bezpečnost (např. omezení nebo vyloučení použití hořlavých organických rozpouštědel) a (d) obecnou aplikovatelnost na všechny gramnegativní a grampozitivní bakterie.

Způsob podle vynálezu zahrnuje působení bazického roztoku na zahuštěné extrakty a/nebo izolované bakteriální buňky. Kromě extrahování CPS způsobuje bazická extrakce také deacetylací V-acetyl skupin. Stupeň deacetylace může být změněn úpravou reakčních podmínek. Aby byly získány CPS, jsou extrahované CPS separovány od buněčných komponent, výhodněji chromatograficky. Aby byl získán CPS nebo modifikovaný CPS, mohou být některé nebo většina acetylskupin opětovně začleněna. Konečného přečištění CPS může být dosaženo gelovou permeační chromatografií. V dalším provedení poskytuje vynález jako výsledek extrakce za bazických podmínek nové, případně modifikované CPS, které jsou vhodné pro použití jako vakcíny nebo konjugované vakcíny.

Provedením tohoto vynálezu je poskytnout způsob přípravy podstatně čistých CPS, které jsou schopny vyvolat u savců tvorbu protilátek, které jsou baktericidní a chrání živočichy vůči infekci.

Dalším provedením tohoto vynálezu je použít tyto CPS ve vakcínách a to buď samostatně nebo konjugované s polypeptidem, s cílem chránit lidi nebo zvířata vůči infekci a to zejména tím kmenem bakterie, ze kterého byl CPS izolován. V určitých případech může polysacharid, použitý v tomto vynálezu, indukovat tvorbu protilátek, které vykazují křížovou reaktivitu s jinými patogeními bakteriemi, čímž vytváří ochranu vůči infekci těmito jinými bakteriemi.

Předmětem tohoto vynálezu je poskytnout způsob izolace kapsulárních polysacharidů z buněčných komponent, obsažených v supernatantech gramnegativních nebo grampozitivních bakterií nebo v buňkách gramnegativních nebo grampozitivních bakterií. Tyto kapsulámí polysacharidy mohou být poté použity buď jako vakcíny nebo mohou být vázány na polypeptidy za vzniku konjugovaných molekul, které jsou užitečné jako vakcíny.

Tento vynález poskytuje způsob získávání kapsulárních polysacharidů z gramnegativních a grampozitivních bakterií použitím bazické hydrolýzy vazby, která je labilní vůči bázi a která připojuje CPS k buněčným komponentám. Způsob vynálezu se skládá z extrakce CPS grampozitivní a gramnegativní bakterie uvedením bakterie nebo roztoku, obsahujícího fragmenty bakterie, do kontaktu shází. CPS může být poté různými postupy získán z báze zpět. Příklady grampozitivních bakterií, které však nejsou v žádném smyslu limitující a které mohou být použity podle tohoto vynálezu jsou Streptococcus, Staphylococcus, Enterococcus, Bacillus, Corynebacterium, Listeria, Erysipelothrix a Clostridium, Přesněji, výhodnější je použití bakterie Streptococcus a nej výhodnější je použití streptokoků skupiny B typ Ia, lb, Π, ΠΙ, IV, V, VI, VII a VIII Mezi příklady gramnegativních bakterií, které jsou užitečné pro tento vynález, ale které nejsou v žádném směru limitující, patří Haemophilus influenza, Neisseria meningitidis a Escherichia coli. Přesněji, pro použití jsou výhodnější H. influenza typ b, N. meningitidis typ B, C, YaW135a£ coli Kl.

Podle vynálezu může být použita pro hydrolýzu vazby, která je labilní vůči bázi, ve vodném nebo organickém rozpouštědle řada různých podmínek. Stupeň, do kterého jsou hydrolyzovány V-acetylvazby sacharidů, může být regulován reakčními podmínkami. Hydrolýza V-acetylových skupin je výhodná pro separaci CPS od jiných buněčných komponent, protože čím více TV-acetylvazeb je štěpeno, tím hydrofilnější bude CPS v porovnání se zbylými buněčnými komponentami. Tento rozdíl v polaritě může být využit pro účinnost chromatografické separace. Separace dvou nebo více složek ze směsi, která je založena na rozdílu v polaritě, je odborníkům v daném oblasti techniky dobře známá.

Například při chromatografii s hydrofobní interakcí jsou sloučeniny s relativně vysokou hydrofobicitou zadržovány na koloně déle než sloučeniny, které jsou hydrofilnější. Naopak při

chromatografii s hydrofilní interakcí jsou hydrofilní sloučeniny zadržovány na koloně déle než sloučeniny, které jsou hydrofobnější. Použití obou metod za sebou umožňuje odstranit nečistoty, které jsou v porovnání se sledovanou sloučeninou méně či více polární.

Volné aminoskupiny nebo karboxyskupíny, přítomné na CPS, mohou být využity pro usnadnění účinné chromatografické separace. Separace dvou nebo více složek ze směsi, která je založena na rozdílech v náboji, je odborníkům v dané oblasti techniky dobře známá. Při ionexové chromatografii na katexu jsou sloučeniny, které obsahují kladně nabité skupiny jako např. protonované aminy, zadržovány na koloně déle než sloučeniny s malým nebo nulovým kladným nábojem, které procházejí kolonou relativně rychle. Naopak při ionexové chromatografii na anexu jsou záporně nabité sloučeniny jako např. karboxylové kyseliny zadržovány na koloně, zatímco sloučeniny s malým nebo žádným nábojem procházejí kolonou relativně rychle.

Po separaci deacetylovaných CPS od ostatních buněčných komponent mohou být aminoskupiny zpětně acetylovány. Různá acetylační činidla a reakční podmínky umožňují regulovat stupeň, do kterého jsou aminoskupiny reacetylovány. Nečistoty, začleněné v acetylačním kroku, jsou co se týče velikosti malé ve srovnání s reacetylovaným CPS a proto mohou být odseparovány od CPS gelovou permeační chromatografií.

Gelová permeační chromatografie například umožňuje účinnou separaci relativně velkých CPS. Rozdíl v polaritě nebo náboji může být také příležitostně využit při přečišťování CPS od zbývajících nečistot.

Příprava kapsulárních polysacharidů

Podle předmětného vynálezu může být bakteriální polysacharid izolován a přečištěn od buněčných komponent ve 4 krocích: bazická extrakce, chromatografická separace, TV-acylace a chromatografické přečištění.

Výchozí materiály

Materiály pro extrahování CPS mohou být získány ze zahuštěných bakteriálních supematantů, z homogenizovaných bakteriálních buněk nebo upraveného média. Buňky mohou být odděleny odstředěním nebo mikrofiltrací a supernatant bývá většinou 10 až 15 krát zahuštěn. Výhodněji jsou bakteriální supernatanty a upravená média zahuštěny tak, aby CPS byly přítomny v koncentraci asi 5 až 20 mg/ml. Dále mohou být také extrahovány přímo peletované buňky.

• 9 9 9 9 · 4 4 · • ·· · · 44 4 9 4 4 ·· 99 49 ··

Bazická extrakce

Zahuštěný bakteriální supernatant nebo upravené médium mohou být uvedeny do kontaktu s řadou různých bází s cílem extrahovat CPS. Případně mohou být uvedeny do kontaktu s řadou různých bází také izolované bakteriální buňky. Příklady bází, které mohou být použity podle tohoto vynálezu a které nejsou v žádném směru limitující, jsou NaOH, KOH, LiOH, NaHCO₃, Na₂CO₃, K₂CO₃, KCN, Et₃N, NH₃, H₂N₂H₂, NaH, NaOMe, NaOEt nebo KO/Bu. Báze jako NaOH, KOH, LiOH, NaH, NaOMe nebo KO/Bu jsou nejúčinněji používány v rozmezí koncentrací 0,5 až 5,0 N. Báze jako NaHCO₃, Na₂CO₃, K₂CO₃, KCN mohou být použity v tak vysokých koncentracích, jaké jim umožňuje jejich rozpustnost. Organické báze jako Et₃N mohou být použity ve středních až vysokých koncentracích (50 až 100%) a to tak dlouho, dokud je zde činidlo jako např. voda nebo alkohol, nutné k tomu, aby proběhla hydrolýza. Báze jako je NH₃nebo H₂N₂H₂ mohou být použity v téměř jakékoliv koncentraci včetně 100%. Mohou být použita rozpouštědla jako je voda, alkoholy (výhodněji Cj až C4), dimethyísulfoxid, dimethylformamid nebo směsi těchto a jiných organických rozpouštědel. Bázické extrakční roztoky, obsahující vodu, jsou nejvýhodnější.

Nejúčinnější rozsah pH pro extrahování CPS z buněčných složek je od asi 9 do 14, přičemž pH optimum je okolo 12. Ačkoli může být extrakce dosaženo při teplotě od asi 4 °C, vyšší výtěžky jsou očekávány při zvýšení teploty, výhodněji do oblasti mezi asi 40 až 100 °C, a/nebo při míchání reakční směsi. Výhodnější je použít přibližně 1 až 20 g buněčné pasty do asi 11 roztoku báze. Příležitostně mohou být zahuštěné supernatanty zředěny 10N roztokem NaOH až na konečnou koncentraci NaOH v reakční směsi 2 N.

Chromatografická separace

Extrahované CPS, které jsou přítomny v bazickém extrakčním roztoku, mohou být odděleny od nečistot, pocházejících z buněčných komponent, chromatograficky. Příkladem chromatografických separačních metod, které však nejsou nijak limitující, je ionexová chromatografie (kationtová nebo aniontová), chromatografie s hydrofilní interakcí, chromatografie s hydrofobní interakcí nebo gelová permeační chromatografie. Výhodnějším způsobem je chromatografie s hydrofobní interakcí (HIC). Ještě výhodnější je chromatografie s hydrofobní interakcí na nosiči phenylsepharose, kdy dochází k odstranění většiny vysokomolekulámích, uv-aktivních kontaminant z bazického extraktu. Kapsulámí polysacharid bude eluován na počátku eluce vysokým pH (pH 10 až pH 8) a vysokou koncentrací soli (2 N až

Ί

ΦΦ φφ φφ φφ ·· • φφφφ φ 4 4 4 φφφ φ φ φφ φ φ 4 4 • ΦΦΦ Φ 4 Φ 4 4 44 Φ ••Φ 4 4 4 · Φ 4 4 ·

ΦΦΦΦΦ ΦΦ ΦΦ 4 4 4Φ

Ν), zatímco hydrofobnější protein a nukleové kyseliny budou zadržovány. Nelimitujícím příkladem chromatografie s hydrofobní interakcí je chromatografie na pryskyřici alkylsepharose nebo sepharose, přičemž výhodnější pryskyřice je Phenyl Sepharose HP (Pharmacia Bíotech; Piscataway, NJ). Kolona může být předem ekvilibrována 0,5 až 5,0 N roztokem NaHCO₃ a eluce je prováděna objemem, který je roven jednomu objemu kolony a při průtoku 0,5 až 50 ml/min.. Po eluci roztokem NaHCO₃, jehož objem je roven jednomu objemu kolony, může být použita pro eluci z kolony voda, jejíž objem je roven jednomu až deseti objemům kolony. U frakcí mohou poté být stanoveny polysacharidy a to způsoby, které jsou v dané oblasti techniky známé. Výhodnějším způsobem detekce polysacharídu, obsahujícího kyselinu sialovou, je stanovení pomocí orcinolu, které je popsáno v Příkladech provedení vynálezu.

TV-acetylace

Separace extrahovaného kapsulárního polysacharídu za bazických podmínek je podporována odstraněním V-acetylskupin z kyseliny sialové a aminocukerných zbytků kapsulárních polysacharidů, jinak stabilních vůči bázi, v průběhu extrakce.

Shromážděné frakce po HIC, obsahující kapsulární polysacharidy, mohou být příležitostně reacetylovány do požadovaného stupně pomocí řady různých acetylačních činidel. Nelimitujícími příklady acetylačních činidel jsou acetanhydrid, acetylchlorid, pentafluorofenylacetát, 4-nitrofenylacetát. Toto je uvedeno např. v Theodora W. Greene a Peter G. M. Wuts, Protective Groups in Organic Syntheses, 2^nd Ed. (1991). Výhodnějším způsobem je smíchání s acetanhydridem o koncentraci od asi 0,5 M do asi 2 M, přičemž výhodnější jsou koncentrace od asi 0,7 M do asi 1 M, kdy dochází kreacetylaci volných aminoskupin kapsulárního polysacharídu a tudíž k regeneraci nativní struktury polysacharídu.

Chromatografické přečištění

Přečištěním reacetylovaného CPS může být získán CPS, který je vhodný pro použití při přípravě imunologických činidel jako jsou antigeny a vakcíny. Pro tento vynález jsou vhodné různé příklady chromatografického přečištění. Pro účinné odseparování reacetylováných CPS od reakčních složek může být použita například ionexová chromatografie (kationtová nebo aniontová), chromatografie s hydrofobní interakcí, chromatografie s hydrofilní interakcí nebo gelová permeační chromatografie. Výhodnějším postupem je použití gelové permeační • 0 ·· ·· ·· 00 • · ♦ · * 0000 • •0 ···· 0 0 0 0 chromatografie na náplni Superdex (zesítěná agaróza a dextran), kdy dochází k odstranění zbytkových kontaminant a výsledkem je přečištěný CPS.

Konkrétně je výhodnější Superdex 200 PG, který má frakcionační rozsah (Mw) pro dextrany 1 000 až 100 000. Při použití PBS jako eluentu jsou rychlosti průtoku výhodněji od asi

0,1 do 10 ml/min..

Kapsulární polysacharidy, získané bázickou extrakcí podle tohoto vynálezu, jsou nové (viz obr. 11 a obr. 12) a zachovávají epitopy na svých nativních strukturách (obr. 5 až 10). Dále, CPS, připravené podle vynálezu, vyvolávají tvorbu protilátek, které vykazují křížovou reaktivitu s nativním CPS a bakterie je exprimují. Postupy podle tohoto vynálezu, kterými lze získat CPS, jsou v porovnání s postupy, které jsou uvedeny ve stavu techniky lepší a to z důvodu (a) relativní jednoduchosti s jakou jsou postupy tohoto vynálezu prováděny, (b) vyšších výtěžků izolace a (c) vyšších výtěžků pro konjugaci. Při bazické extrakci jsou navíc degradovány bakteriální DNA a RNA a tudíž nejsou v konečném produktu, který je připraven podle tohoto vynálezu, přítomny v patrnějších množstvích.

Struktura extrahovaných CPS

Kapsulární polysacharidy, extrahované způsobem, který je uveden v tomto vynálezu, mají ve srovnání s CPS, extrahovanými dříve uvedenými způsoby, specifickou strukturu. CPS jsou získány hydrolýzou, která je katalyzována bází, fosfodiesterových vazeb, spojujících kapsulární polysacharidy a polyrhamnózu a hydrolýzou, katalyzovanou bází, fosfodiesterových vazeb, spojujících polyrhamnózu a peptidoglykan, (viz obr. 11). Podle alternativního modelu pro strukturu bakteriální buněčné stěny, jsou stejné, strukturálně jedinečné CPS získány hydrolýzou, která je katalyzována bází, fosfodiesterových vazeb, spojujících kapsulární polysacharidy a peptidoglykan a hydrolýzou, katalyzovanou bází, fosfodiesterových vazeb, spojujících polyrhamnózu a peptidoglykan (viz obr. 12).

Způsoby, uvedené ve stavu techniky, používají pro štěpení odlišných vazeb enzymy. Například lysozym byl použit pro hydrolýzu polymeru A^/-acetylgíukosamin//V-acetylmuramová kyselina, Mutanolysin byl použit pro hydrolýzu vazby mezi polymerem A-acetylglukosaminWacetylmuramová kyselina a částí peptidu a lysostaphin byl použit pro hydrolýzu části peptidu bakteriální buněčné stěny.

Distribuce absolutní molární hmotnosti kapsulárních polysacharidů tohoto vynálezu je úzká, což naznačují nízké hodnoty polydisperzity (M_W/M_N) viz tab. 2. Tato jednotnost je významná zejména při přípravě trvalých a účinných vakcín.

• · »

• « φ φ φ φ

Vakcíny

Tento vynález je rovněž zaměřen na přípravu vakcín. V souladu s tímto vynálezem může být izolovaný CPS, popsaný výše, použit jako antigen pro tvorbu protilátek, které vykazují reaktivitu vůči CPS a proto také vykazují reaktivitu vůči organismu, ze kterého byl CPS izolován.

Vakcíny tohoto vynálezu mohou poskytovat aktivní nebo pasivní imunitu. Vakcíny pro poskytováni aktivní imunity obsahují přečištěný CPS tohoto vynálezu. Výhodněji tato vakcína obsahuje CPS, konjugovaný na alespoň jeden antigenní peptid.

Protilátky

Techniky extrakce a izolace CPS, které jsou popsány výše, umožňují přípravu velkých množství CPS tohoto vynálezu. Toto usnadňuje tvorbu protilátek reaktivních vůči CPS.

V jiném provedení mohou být protilátky proti CPS vytvořeny jakoukoliv technikou, která je dobře známá v dané oblasti techniky. Podle jednoho přístupu mohou být protilátky vytvářeny prostřednictvím aplikace preparátu izolovaného CPS nebo jeho derivátů nebo fragmentů hostitelskému organismu (zvíře). Hostitelské zvíře může být potkan, myš, králík, primát (ne člověk) nebo člověk. Tyto příklady však nejsou nijak limitující. Výhodněji je hostitelem člověk. Imunologické odezvy mohou být znásobeny použitím adjuvants, která jsou vdané oblasti techniky známá.

Proti CPS mohou být také připraveny monoklonální protilátky a to jakoukoliv technikou, která je v dané oblasti techniky dobře známá. Jeden postup používá kultury hybridomových buněčných linií (Kohler a Milstein (1975) Nátuře 256: 495 až 497). Monoklonální protilátky proti CPS mohou být lidské monoklonální protilátky, chimérické monoklonální protilátky nebo polidštěné monoklonální protilátky, připravené jakoukoliv z technik, které jsou v dané oblasti techniky dobře známé. V jednom přístupu mohou být chimérické monoklonální protilátky vytvořeny tak, že mají jinou než lidskou (např. myšší) doménu pro vazbu antigenů, kombinovanou s lidskou konstantní oblastí (Takeda a kol. (1985), Nátuře 314:452). Polidštěné protilátky mohou být vytvořeny podle postupů, které uvádí Queen a kol., US patent č. 5 585 089.

Protilátky proti CPS mohou být přečištěny jakoukoliv technikou, která je dobře známá v dané oblasti techniky včetně imunoabsorpce a imunoafinitní chromatografíe nebo jinými chromatografickými technikami (např, HPLC). Tyto příklady však nejsou nijak limitující.

* ··* · · · » « • ·· · · ·» » « · * ♦ ··· » · · ft · · « « • · · · · ♦ · ·»··

4 99 »· 9 · «« tf

Protilátky mohou být také přečištěny ze séra, plasmy nebo média buněčné kultury jako imunoglobulinové frakce.

Molekuly protilátky tohoto vynálezu mohou být neporušené imunoglobulinové molekuly, podstatně neporušené imunoglobulinové molekuly nebo ty části imunoglobulinové molekuly, které obsahují vazebné místo pro antigen např. Fab fragmenty.

Fragmenty protilátek proti CPS mohou být vytvořeny jakoukoliv technikou, která je dobře známá v dané oblasti techniky (Campbell (1985) Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology, Sv. 13, Burdon a kol, Elsevier Science Publishers, Amsterdam).

Konjugované molekuly

CPS tohoto vynálezu může být použit u řady gramnegativních a grampozitivních bakterií pro vyvolání protilátkové odezvy a to buď .samostatně nebo konjugovaný na jinou imunogenní molekulu jako je polypeptid nebo protein. Konjugace CPS na polypeptid přeměňuje imunitní odezvu na CPS, která je většinou nezávislá na T-buňkách na závislou na T-buňkách. Dále, velikost polypeptidu je výhodněji taková, aby byla dostatečná pro způsobení změny odezvy z nezávislé na T-buňkách na závislou na T-buňkách. Toto může být užitečné při použití menších polypeptidů za účelem poskytování druhého imunogenu.

Pro konjugaci CPS s peptidem může být použit jakýkoliv způsob konjugace. Výhodnější způsob je popsán v US patentu č. 4 356 170, který popisuje začlenění terminálních aldehydových skupin do polysacharidu přes oxidační štěpení vicinálních diolů a spojem aldehydových skupin a peptidových aminoskupin redukční aminací.

Mělo by však být zřejmé, že konjugované vakcíny vynálezu nejsou omezeny pouze na ty, které jsou vytvářeny prostřednictvím redukční aminace. Vakcíny mohou být také produkovány konjugováním CPS s peptidem pomocí jakékoliv spojovací metody, které jsou dobře známé odborníkům v dané oblasti techniky, jako je např. použití raménka na bázi dihydrazidu kyseliny adipové, které je popsáno v Schneerson, R. a kol. (1980) J. Exp. Med. 1952:361 až 476 a v US patentu č. 4 644 059 nebo např. technologie binárního raménka, která je popsána v Marburg, S. a kol. (1986)7 Am. Chem. Soc. 108:5282 až 5287.

Tento vynález poskytuje možnost vytvořit konjugované molekuly, ve kterých je peptid připojen na CPS prostřednictvím jednoho nebo více míst na CPS. Dále, konjugované molekuly, připravené podle tohoto vynálezu, mohou být s ohledem na proteinovou složku monomery, dimery, trimery a ještě více zesítěné molekuly, kde CPS zesíťuje současně více proteinů.

V jiném provedení tohoto vynálezu mohou být protilátky proti CPS tohoto vynálezu použity jako farmaceutické preparáty v terapeutické nebo profylaktické aplikaci s cílem propůjčit pasivní imunitu jednoho hostitele jinému jedinci (tzn. znásobit imunitní odezvu jedince vůči gramnegativní nebo grampozitivní bakterii nebo poskytnout odezvu u jedinců se sníženou nebo téměř žádnou imunitou, včetně pacientů s AIDS). Pasivní přenos protilátek je v dané oblasti techniky známý a může být proveden jakoukoliv známou metodou. Podle jedné metody jsou protilátky proti CPS nebo jejich konjugáty, které jsou předmětem předmětného vynálezu, vytvořeny v imunokompetentním hostitelském („donor“) zvířeti, poté jsou z hostitele získány a přeneseny do příjemce. Například pro tvorbu protilátek, reaktivních vůči CPS nebo konjugátu CPS tohoto vynálezu, může být použit lidský donor. Protilátky mohou být poté v průběhu léčby aplikovány v terapeuticky nebo profylakticky účinných množstvích lidským příjemcům, čímž je příjemci udělena rezistence vůči bakteriím, které jsou vázány protilátkami, jejichž tvorba byla vyvolána póly sacharidovou složkou (yiz Grossman, M. a Cohen, S. N. „Basic and Clinical Immunology“, 7. vyd., (Stites, D. P. a Terr, A.T., Appleton & Lange 1991), Kapitola 58 „Immunization“.).

Farmaceutické prostředky

Farmaceutické prostředky tohoto vynálezu mohou obsahovat CPS nebo konjugované molekuly, obsahující CPS a farmaceuticky přijatelné nosiče jako je fyziologický roztok, dextróza, glycerol, ethanol apod. V jiném provedení obsahuje farmaceutický prostředek jinou imunogenní skupinu jako je peptid nebo prostředky, obsahující protilátky, jejichž tvorba byla vyvolána některým z CPS tohoto předmětného vynálezu. Aby byla zvýšena imunologická odezva příjemce, může prostředek obsahovat také adjuvants. Tato adjuvants mohou být činidla na bázi hliníku jako je ledek nebo činidla s dlouhým alkylovým řetězcem jako je stearyltyrosin (viz US patent č. 583 372, podaný 17.9.1990; EP patent 0 549 617 Bl; Moloney a kol. US patent č. 4 258 029). Toto je uvedeno také v Jennings a kol,, US patent č. 5 683 699 a Paoletti a kol. J Infectious Diseases 1997, 175:1237 až 1239. Tyto farmaceutické prostředky jsou konkrétně užitečné jako vakcíny.

Pro vyvolání pasivní imunity mohou být farmaceutické prostředky tvořeny polyklonálními nebo monoklonálními protilátkami nebo jejich deriváty nebo fragmenty, což je popisováno výše. Množství protilátky, fragmentu nebo derivátu bude odpovídat terapeuticky nebo profylakticky účinnému množství, stanovenému standartními klinickými technikami.

• ·· · · ·· ·· · · • ftft · · · · ···· • ··· · · ftft ftftft·

Farmaceutické preparáty tohoto vynálezu mohou být jedinci aplikovány prostřednictvím účinných způsobů, známých ve stavu techniky. Mezi jednotlivé cesty patří intradermální, intraperitoneální, intravenózní, podkožní, intramuskulární, orální a intranazální aplikace, přičemž existují i další způsoby.

Prostředky vynálezu mohou obsahovat takové standardní nosiče, pufry nebo ochranná činidla, známé odborníkům v dané oblasti, které jsou vhodné pro vakcíny včetně, nikoliv však pouze, jakéhokoliv vhodného farmaceuticky přijatelného nosiče jako je fyziologický roztok nebo další kapaliny, které je možno aplikovat injekčně. Rovněž přítomna mohou být aditiva, běžná pro vakcíny, např. stabilizátory jako je laktóza nebo sorbitol a adjuvants, zvyšující imunogenní odpověď jako je fosforečnan, hydroxid nebo síran hlinitý a stearyltyrosin. Vakcíny, připravené podle tohoto vynálezu, mohou být také použity jako složky polyvalentních vakcín, které vyvolávají imunitní odezvu vůči mnoha infekčním činidlům.

Vakcíny předmětného vynálezu jsou podávány v množstvích, která jsou dostatečná pro vyvolání tvorby protilátek, jakožto součásti imunogenní odpovědi. Dávky mohou být upraveny na základě velikosti, hmotnosti nebo věku jedince, který vakcínu přijímá. Protilátková odezva může být u jedince monitorována prostřednictvím stanovení titru protilátky nebo baktericidní aktivity, které, je-li to třeba, mohou být proto, aby se zvýšila odpověď, znásobeny. Pro dítě je většinou jedna dávka asi 10 pg konjugované vakcíny nebo asi 0,5 pg až 20 pg/kg. Dospělím je podávána dávka konjugované vakcíny asi 0,5 pg až 20 pg/kg. Pro CPS vakcíny je typická dávka asi 25 pg každého jednotlivého CPS v jedné dávce. To znamená, že vakcína proti streptokokovi skupiny B by měla obsahovat 25 pg každé formy CPS každého z devíti sérotypů.

Diagnostické soupravy

V jiném provedení mohou být použity CPS předmětného vynálezu nebo jeho deriváty nebo fragmenty pro přípravu bezpečnějších diagnostických souprav, které neobsahují toxiny jako je toxin pneumolýzy, ale které mohou ještě indikovat přítomnost protilátek proti gramnegativní nebo grampozitvní bakterii. Přítomnost těchto protilátek může indikovat dřívější vystavení působení patogenu a předpovídat jedince, kteří by mohly být rezistentní vůči infekci. Diagnostická souprava může obsahovat alespoň jeden z CPS tohoto vynálezu nebo jeho deriváty nebo fragmenty a činidla, vhodná pro detekci reakce protilátky. Pri detekci jsou smíchány modifikovaný CPS nebo jeho deriváty nebo fragmenty a vzorek, který obsahuje protilátku proti gramnegativní nebo grampozitivní bakterii. Reakce protilátky může být identifikována jakoukoliv metodou, popsanou ve stavu techniky včetně např. stanovení ELISA. Identifikace je důležitá a může zabránit zbytečné vakcinaci.

Diagnostická souprava může dále také obsahovat pevný nosič nebo magnetické kuličky nebo plastikovou matrici a alespoň jeden CPS tohoto vynálezu nebo jeho deriváty nebo fragmenty.

V některých případech může být výhodnější, aby CPS nebo deriváty nebo fragmenty byly

V v značeny. Činidla pro značení jsou v dané oblasti techniky dobře známá. Činidla pro značení například zahrnují, ale nejsou tím nijak omezena, radioaktivitu, chemiluminiscenci, biolumuniscenci, luminiscenci nebo jiné identifikační „konce“ , které lze vhodně analyzovat. Do diagnostické soupravy mohou být aplikovány shromážděné a přečištěné tělní tekutiny nebo tkáňové vzorky (např. krev, sérum, sliny). CPS, deriváty nebo fragmenty mohou, ale nemusí být přečištěny a mohou být složeny ze směsi molekul.

Pevné nosiče jsou v dané oblasti techniky známé, jsou dostupné a zahrnují, aniž by tím byly limitovány, polystyren, polyethylen, polypropylen, polykarbonát nebo jakýkoliv pevný plastikový materiál ve tvaru zkumavky, kuliček, mikročástic, měřící tyčky, destiček apod. Mezi matrice dále příležitostně patří membrány, mikrotitrační destičky s 96 jamkami, zkumavky a mikrozkumavky Eppendorf. Tyto matrice obecně obsahují jakýkoliv povrch, na který může být zachyceno činidlo, vážící ligand, nebo povrch, který sám o sobě poskytuje místo pro zachycení ligandu.

Všechny publikace, patenty a články, které jsou zde uvedeny, jsou zde úmyslně zvlášť začleněny in toto jako odkazy. Následující příklady jsou uvedeny pro ilustraci předmětného vynálezu, ale nejsou v žádném smyslu chápány jako omezení rozsahu vynálezu. Odborníkům v dané oblasti by mělo být zřejmé, že může být provedena řada změn a nahrazení, aniž by tím došlo k odchýlení se od smyslu a rozsahu vynálezu.

Přehled obrázků ve výkresech

Obr. 1: NMR spektrum (500 MHz) kapsulámího polysacharidu, získaného ze streptokoků skupiny B typ la, zaznamenané v D₂O při 50 °C.

Obr. 2: NMR spektrum (500 MHz) kapsulámího polysacharidu, získaného ze streptokoků skupiny B typ Ib, zaznamenané v D₂O při 50 °C.

Obr. 3: NMR spektrum (500 MHz) kapsulámího polysacharidu, získaného ze streptokoků skupiny B typ II, zaznamenané v D₂O při 50 °C.

• ·

Obr. 4: NMR spektrum (500 MHz) kapsulárního polysacharidu, získaného ze streptokoků skupiny B typ III, zaznamenané v D₂O při 50 °C.

Obr. 5: NMR spektrum (500 MHz) kapsulárního polysacharidu, získaného ze streptokoků skupiny B typ V, zaznamenané v D₂O při 50 °C.

Obr. 6: Inhibice králičího antiséra proti GBSPla na destičkách potažených GBSPIa-HSA. Obr. 7: Inhibice králičího antiséra proti GBSPIb na destičkách potažených GBSPIb-HSA. Obr. 8: Inhibice králičího antiséra proti GBSPII na destičkách potažených GBSPII-HSA. Obr. 9: Inhibice králičího antiséra proti GBSPIII na destičkách potažených GBSPIII•HSA.

Obr. 10: Inhibice králičího antiséra proti GBSPV-TT na destičkách potažených GBSPV-HSA.

Obr. 11: Schematické znázornění struktury GBS, zobrazující peptidoglykan i se skupinovým subkapsulárním antigenem (polyrhamnóza) a kapsulámím polysacharidem (Michon a kol., Biochemistry 1988, 27:5341 až 5351). X a Y představují zbytky TV-acetylglukosamin a Nacetylmuramovou kyselinu. Prázdné šipky naznačují předpokládaná místa štěpení: lysozymem (A), mutanolysinem (B), lysostaphinem (C) nebo bází a to hydrolýzou fosfodiesterových vazeb, připojujících kapsulámí polysacharid a polyrhamnózu na peptidoglykan.

Obr. 12: Schematické znázornění struktury GBS, zobrazující peptidoglykan spolu se skupinovým subkapsulárním antigenem (polyrhamnóza) a kapsulárním polysacharidem (Michon a kol., Biochemistry 1988, 27:5341 až 5351). X a Y představují zbytky A-acetylglukosamin a Nacetylmuramovou kyselinu. Prázdné šipky naznačují předpokládaná místa štěpení: lysozymem (A), mutanolysinem (B), lysostaphinem (C) nebo bází a to hydrolýzou fosfodiesterových vazeb, připojujících kapsulámí polysacharid na peptidoglykan a hydrolýzou fosfodiesterových vazeb, připojujících polyrhamnózu na peptidoglykan.

Příklady provedení vynálezu

Přiklad 1. Bakteriální kmeny, růstová média a kultivační podmínky

Kmen streptokokoka skupiny B typ lb H36b (ATCC 12401) byl získán ze sbírky American Type Culture Collection (Rockville, MD). Ostatní použité kmeny 090 (typ la), 18RS21 (typ II), M781 (typ III) a 1169-NT I (typ V) laskavě poskytl D. L. Kasper, Harvard Medical School. Neisseria meningitidis typ B, C, Y a W135 laskavě poskytl Carl Frasch z CBER, FD A a Escherichia coli K1 laskavě poskytl Willie Vann z CBER, FD A.

• · · ···· ···· ···· 1 ··· · ·· ·

Každý kmen streptokoka skupiny B byl kultivován individuálně v dialyzačním (membrána s vylučovacím limitem molekulové hmotnosti (NMWL) 10 000) kazetovém systému (Pellicon, Millipore Corp., Bedford, MA) s 3,5% médiem Columbia (Difco Laboratories, lne., Detroit, MI), obohaceném 6% glukózou. Pro inokulaci 14 1 růstového média (vide supra) ve fermentoru Bioflo IV o objemu 20 1 (New Brunswick Scientific Co., Edison, NJ) bylo použito 150 ml kultury, kultivované v Erlenmayerově baňce 8 hod. při 37 °C a za stálého třepání. Teplota fermentační kultury byla udržována na 37 °C, pH bylo nepřetržitě upravováno přídavkem 10 N NaOH na hodnotu 7,1 a kultura byla vzdušněna při průtoku 1,5 Emin. Buňky byly sklizeny po 17 hod. mikrofiltrací přes dutá vlákna (hollow-fiber) MiniRros s porozitou 0,2 μηι (Microgon, lne., Laguna Hills, CA). Supernatant kultury byl až do dalšího zpracování sterilně uchováván při 4 °C. Pelety buněk byly získány odstředěním separovaných buněk při 9000 rpm v odstředivce Sorvall GSA rotor (DuPont Clinical & Instruments Div., Wilmington, DE) po dobu 50 min.

Příklad 2. Obecný postup přípravy kapsulárních polysacharidů

Extrakce a chromatografie s hydrofobní interakci

Pelety byly suspendovány ve 4 násobném objemu 1 N NaOH, přičemž jeden gram vlhké buněčné pasty byl brán jako jeden objem. Suspenze byla přes noc inkubována při 37 °C. Zbytky buněk byly odstraněny odstředěním při 12 000 rpm po dobu 30 min. v odstředivce Sorvall GSA rotor. Po neutralizaci koncentrovanou HCI (J. T. Baker, Phillipsburg, NJ) byl supernatant diafíltrován přes membránu Pellicon 10 000 NMWL proti 2 N NaHCCh (pH 9,6). Vznikající retentát byl poté aplikován na kolonu Pharmacia XK 26/60 s náplní Phenyl Sepharose HP (Pharmacia Biotech; Piscataway, NJ), předem ekvilibrovanou 2 N NaHCO}. Byl použit preparativní chromatografický systém Pharmacia, který je popsán níže. Kolona byla nejdříve eluována při průtoku 4 ml/min. roztokem 2 N NaHCCh, jehož objem byl roven jednomu objemu kolony, následovalo promytí vodou, jejíž objem byl roven dvěma objemům kolony. U frakcí byl stanoven obsah polysacharidů (vide infra) a ty frakce, které obsahovaly kapsulární polysacharid, byly spojeny.

Kapsulární polysacharidy byly také přečištěny ze supernatantů kultury. Po odstranění buněk bylo médium 10 až 15 krát zahuštěno (Pellicon, membrána 10 000 NMWL) a diafiltrováno proti 10 násobnému objemu vody. Do vznikajícího retentátu byl přidán 10 N NaOH, aby byla konečná koncentrace 1 M. Tento roztok byl přes noc inkubován při 37 °C a

9 zneutralizován koncentrovanou HCI. Zpracování pokračovalo podle postupu, který je uveden výše pro extrakci buněk.

Pro zisk jedné dávky kapsulárního polysacharidu typu III byly buňky a supernatant kultury extrahovány společně a to následujícím způsobem. Supernatant kultury, oddělený od buněk, byl zahuštěn a diafiltrován a vznikající retentát byl vystaven působení báze, což je popsáno výše. Peleta buněk byla suspendována ve 4 objemech retentátu, ošetřeného bází a dále byl zpracováván postupem, popsaným výše pro extrakcí buněk (vide supra).

Re-A-acetylace

Vzhledem ktomu, že v důsledku vystavení polysacharidu dříve popsaným extrakčním podmínkám dochází k uvolnění V-acetylskupin z polysacharidů, byly polysacharidy re-TVacetylovány a to tak, že byl do spojených, frakcí po kapkách přidáván acetanhydrid (Aldrich Chemical Co., Milwaukee, WI) do konečné koncentrace 0,8 M. Tato reakční směs byla míchána při laboratorní teplotě po dobu 1 hod. a pH bylo přídavkem 10 N NaOH udržováno na hodnotě 9. Reakční pH bylo poté zvýšeno na 13 a reakce probíhala dalších 30 min. Roztok, obsahující re-/Vacetylovaný kapsulámí polysacharid, byl diafiltrován proti vodě pomocí kazetového systému Minitan (membrána 10 000 NMWL, Millipore) a retentát byl zlyofilizován. Lyofilízovaný preparát byl znovu rozpuštěn v PBS (pH 7,4) a přečištěn gelovou permeační chromatografií na koloně Superdex 200 PG (vida infra). Frakce, obsahující kapsulární polysacharid, byly spojeny, diafiltrovány proti vodě (vida supra), retentát byl zlyofilizován a výsledkem byl přečištěný CPS.

Gelová permeační chromatografie

Analytická gelová permeační chromatografie (GPC) byla provedena na FPLC systému Pharmacia, vybaveném UV detektorem Pharmacia UV-1 (s filtrem 280 nm), diferenčním refraktometrem R401 firmy Waters Corp. (Milford, MA) a kolonou firmy Pharmacia Superose 6 HR 10/30 (vysoce zesítěná agaróza). Kolona byla eluována při průtoku 0,5 ml/min. PBS, pH 7,4. Pro stanovení mrtvého objemu (V_o) byl použit dextran (molekulová hmotnost přibližně 2 χ 10⁶, Sigma Chem Co., St. Louis, MO) a pro stanovení celkového objemu náplně kolony (V_t) byl použit azid sodný. Relativní eluční objemy jsou vyjadřovány jako K_av = (V_e - V_o)/(V_t - V_o), kde V_e je eluční objem, odečtený ze zápisu refraktometru. Preparativní GPC byla provedena na systému Pharmacia, který obsahoval výše zmíněné detektory, pumpu P-50, sběrač frakcí

• 00	• ·	00	0 0	0 0
• · 0	•	•	0	0	•	0	0	0
• 0 00	•	0	0	0	•	0	0	0
								0
• · ·	•	0	0	0	•	0	0	0
0 0 0 0 ·	0 0		•	0		0 0		00

FRAC-100, kontrolní jednotku GP-250 Plus a kolonu XK 26/100 s náplní Superdex 200 PG (Pharmacia). Kolona byla eluována PBS při průtoku 1 ml/min.

Příklad 3 Analýza polysacharidů

Stanovení molární hmotnosti

Distribuce absolutní molární hmotnosti polysacharidů byla stanovena analytickou GPC s in-líne připojenou fotometrickou detekcí pomocí víceúhlového rozptylu laserového světla a diferenční refraktometrickou detekcí (GPC-MALLS/RI). Tento postup byl proveden v chromatografickém systému pro kapalinou chromatografií, který se skládal z HPLC pumpy Jasco PU-980 (Easton, MD), nástřikového ventilu Rheodyne model 7125 (Cotati, CA) a kolony Superose 6 HR 10/30, ekvilibrované PBS při průtoku 0,5 ml/min. Mobilní fáze byla připravena vultračisté vodě (Stephens Scientific, Riverdale, NJ) a byla filtrována přes in-line připojený filter o průměru 25 mm (Millipore), vybavený membránou Millipore typ GV 0,22 mm. Vzorky polysacharidů (1 až 2 mg) byly v mobilní fázi rozpuštěny na koncentraci 10 mg/ml a vzniklé roztoky byly v mikrozkumavce odstředěny 2 až 3 min. při 14 000 rpm. Cílem odstředění bylo odstranit mechanické nečistoty před nástřikem. Efluenty z kolony byly přímo analyzovány in-line připojeným fotometrem miniDAWN s pevným tříúhlovým rozptylem laserového světla (Wyatt Technology Corp., Santa Barbara, CA), připojeným k diferenčnímu refřaktometru HewlettPackard model 1047A. Analogový signál, vystupující z refřaktometru, byl přiváděn do miniDAWN přes pomocný vstupní kanál. Získaná data o rozptylu byla zpracována pomocí Wyattova softwaru ASTRette a EASI. Plocha píku byla vypočítána pomocí Wyattova softwaru jako suma ploch 200 až 300 lichoběžníků nebo „kousků“, na které byl rozdělen celý pík. Z takto získané plochy byly vypočítány průměrná molekulová hmotnost a průměrná molární hmotnost (M_w a M„) polysacharidu, eluovaného v daném piku. Specifický přírůstek refrakčního indexu (dn/dc), určený pro všechny póly sacharidy pomocí on-line připojeného refřaktometru HP 1047A, byl 0,140 ml/g. Tato hodnota byla srovnatelná s hodnotami, které byly dříve získány pro jiné polysacharidy (7, 8, 38).

NMR spektroskopie

Jednorozměrná NMR spektra vzorků polysacharidů (4 až 5 mg/ml) v D₂O (Aldrich) byla zaznamenána při 500 MHz na spektrometru AMX 500 (Bruker Instruments, Billerica,

MA). Spektra byla získána při 50 °C a chemické posuny byly vztaženy na vnější standard

2,2,3,3-tetradeuterio-3-(trimethylsilyl)propionát (Aldrich) v D2O.

• fcfc ·· ·· ·· ·· ·· · fcfcfcfc fcfcfcfc • fcfcfc fcfcfcfc ···· • fc fcfcfc fcfc fcfcfc fcfc · ··· fcfcfcfc ···· • fcfc fcfc fcfc fcfc fcfc fcfc

Chemické analýzy

Množství polysacharidů v efluentu z preparativní kolony a v přečištěných polysacharidech byl stanoven modifikovanou mikrometodou s použitím orcinolu, kterou popsali Reuter a Schauer (35) pro kyselinu sialovou. Stručně, 100 μΐ vzorku nebo kontroly, které obsahují 1 až 1,5 pg standardu NeuAc nebo až 300 pg/ml přečištěného kapsulárniho polysacharidů bylo přidáno do 1,5 ml mikrozkumavky pro odstředění, ve které bylo 100 μΐ orcinolového činidla (35). Vzorky byly dobře promíchány a povařený 15 min. ve vroucí vodní lázni. Poté byly vzorky ochlazovány 5 min. v ledové vodní lázni a pak bylo ke každému vzorku přidáno 500 μΐ isoamylalkoholu (Fluka Chemical Co., Ronkonkoma, NY). Vzorek byl důkladně promíchán a 2 až 3 min odstředěn v mikrozkumavce při 3000 rpm. Tento postup byl opakován, aby byla zajištěna úplná extrakce chromoforu do alkoholu. Do nízkovazebné polystyrénové mikrotitrační destičky s 96 jamkami ve tvaru T (Corning Costar Corp., Cambridge, MA) bylo převedeno 200 μΐ alkoholové fáze každého vzorku a poté byla destička změřena při 560 nm na zařízení pro čtení mikrotitračních destiček Molecular Devices Emax (Menlo Park, CA). Čistota konečných preparátů polysacharidů byla odvozena z obsahu kyseliny sialové pomocí následujících hmotností: 314,3 g/mol pro terminální zbytek NeuAc; 1004 g/mol pro opakující se jednotku CPS typu la, lb nebo III; 1328 g/mol pro opakující se jednotku CPS typu II nebo V.

Obsah proteinů byl stanoven u vzorků, obsahujících 1 až 2 mg kapsulárniho polysacharidů v 1 ml v PBS, pomocí postupu podle Bradfordové (9) s použitím činidla Pierce Coomassie Plus a koňských IgG jako standardu. Obsah nukleových kyselin byl stanoven přímou UV-fotometrií při 260 nm. Fotometrická měření při těchto stanoveních byla provedena na spektrofotometru Shimadzu model UV160U (Shimadzu Scientific Inst., Columbia, MD).

Příklad 4. Výtěžky

Výtěžky kapsulárniho polysacharidů, získaného z různých sérotypů streptokoků skupiny B, jsou ukázány v tab. 1. Pro všechny sérotypy byly výtěžky polysacharidů přečištěného z pelet buněk vyšší než ze supernatantů kultury a pohybovaly se v rozmezí od 4 násobných výtěžků pro typ II do 60 násobných výtěžků pro typ lb. Výtěžky ze supematantu stejně tak jako z buněk jsou v tab. 1 pro srovnání udány jako miligramy polysacharidů na 1 litr kultury (mg/1). Jsou-li tedy * ·· 1· 91 11 19 • · · ···· · ♦ * · 1111 1 111 1 9 9 ♦ • · · · · · · ··· * · · uvažovány fermentace 14 litrů, pak se celkové výtěžky z buněk pohybovaly od 1,1 g pro typ Ia do 0,6 g pro typ II, přičemž celkové výtěžky ze supematantů se pohybovaly od 150 mg pro typ II do 14 mg pro typ lb. V případě, že byly zpracovávány buňky a supernatant z fermentace typu III dohromady, byl výtěžek 63 mg/l nebo 0,9 g celkově podobný výtěžku, který byl získán v případě samotné pelety buněk Různost mezi kmeny streptokoků skupiny B, studovaná prostřednictvím poměrů výtěžků kapsulárních polysacharidů, získaných z buněk ku polysacharidům ze supematantů, naznačuje odlišné tendence sérotypů uvolňovat kapsulární polysacharidy za daných růstových podmínek. Množství kapsulárních polysacharidů, spojených s buňkou, které jsou přečišťovány zde uvedeným postupem, se blíží množstvím, která je možno získat ze vsádkových fermentací kmenů streptokoků skupiny B typ Ia, III, IV, V a VI a která lze odvodit od množství kyseliny sialové, vázané na buňku (je použita jako značka kapsulámího polysacharidů), jak uvedl von Hunoistein a kol. (39). Silnější extrakční podmínky (např. silnější báze, vyšší teplota nebo míchání extrakční směsi) by měly zvyšovat výtěžky kapsulárních polysacharidů, vázaných na buňku.

Tabulka 1

Výtěžky kapsulámího polysacharidů streptokoka skupiny B
Sérotyp	Výtěžek ze supernatantu (mg/1)^A	Výtěžek z pelety buněk (mg/l)^A
Ia	4	79
lb	1	64
II	11	42
b	4	65
V	5	65

Výtěžky jsou vyjádřeny jako mg konečného přečištěného kapsulámího polysacharidů na 1 litr růstové kultury.

Jsou-li medium a buňky zpracovávány dohromady, je výtěžek ze streptokoka skupiny B typu III63 mg/l.

Výsledky

Analýza přečištěných polysacharidů

Pro každý studovaný sérotyp streptokoka skupiny B potvrdila jednorozměrná *Η NMR spektrometrie preparátů polysacharidů z obou zdrojů jejich identitu s dříve publikovanými spektrálními daty pro odpovídající typy polysacharidů (41, 44). NMR spektra všech těchto preparátů také naznačuji velmi nízké hladiny kontaminace. Reprezentativní NMR spektra pěti polysacharidů streptokoka skupiny B jsou ukázána na obr. 1 až 5. Množství nukleových kyselin, detekované přímou UV fotometru při 260 nm, nepřekročilo 1 hmotn. %, zatímco protein, stanovovaný metodou podle Bradfordové (9), nebyl detekován v žádném preparátu polysacharidů v množství vyšším než je spodní detekční limit této metody (1 pg/ml). Čistoty všech polysacharidů, spočítané z obsahu, kyseliny sialové, která byla stanovena pomocí mikrometody sorcinolem (35), byly asi 100 %. Pro všechny preparáty polysacharidů, získané výše popsaným způsobem, jsou tudíž spektrální a fotometrická data v souladu s vysoce přečištěnými kapsulárními polysacharidy s minimální kontaminací proteiny a nukíeovými kyselinami.

Velikost molekuly polysacharidů

Relativní eluční objemy (jako K_av) polysacharidů, přečištěných na koloně Superose 6, odečtené ze záznamů GPC s RI detekcí ve vrcholu píku, jsou uvedeny v tab. 2.

V jednotlivých analýzách byly stanoveny absolutní molární hmotnosti polysacharidů pomocí GPC-MALLS/RI. Tato metoda umožňuje přímý odhad molární hmotnosti makromolekul nezávisle na chromatografických parametrech jako je průtoková rychlost a retenční objem a aniž by byly třeba sekundární standardy, jejichž hydrodynamické vlastnosti se mohou velmi lišit od vlastností analytu, který je testován. GPC-MALLS/RI byla ustanovena jako metoda pro charakterizaci v případě polysacharidů, které jsou předmětem zájmu ve farmaceutické oblasti (7, 8, 10, 17, 25). Distribuce molárních hmotností jsou obvykle uváděny jako průměrné molekulové hmotnosti (M_w) a jako polydisperzita (M_w/Mn), což naznačuje rozsah distribuce. Zatímco polydisperzita určuje jednotnost, rozložení molární hmotnosti určuje homogenitu.

Údaje o molární hmotnosti přečištěných polysacharidů streptokoka skupiny B jsou uvedeny v tab. 2. Pro každý sérotyp byla rozloženi molární hmotnosti preparátů polysacharidů z obou zdrojů podobná. Průměrné molekulové hmotnosti těchto preparátů se pohybují v rozmezí kg/mol pro kapsuíární polysacharidy, spojené s buňkou, z typu V do 318 kg/mol pro kapsulámí polysacharidy typu la, přečištěné ze supernatantu kultury. Distribuce pro všechny preparáty jsou úzké, což naznačují nízké hodnoty jejich polydisperzity (M_W/M_N < 1,6). Tyto hodnoty byly srovnatelné s hodnotami, které byly získány podobnými analýzami kapsulámích polysacharidů několika sérotypů S. pneumoniae a Haemophilus influenzae typ b (7, 17).

• ··	9 9	99	99	99
99 9	9		9	9 9	9	*	•	•
9 999	9		9	99	9	•	*	•
								•
9 9 9	9		9	9 9	•	•	9	•
99 9 9 9		99		9 9				♦ ·

Tabulka 2

Biochemická a biofyzikální charakterizace přečištěných kapsulámích polysacharidů streptokoka skupiny B
Sérotyp	K_av	(kg/mol)^A	Polydisperzita M_w/M_n	Obsah nukleových kyselin (%)	Obsah proteinů (%)
la (S)⁰	0,005	318	1,35	0,23	0,21
la (C)^c	0,010	311	1,31	0,15	<0,01
Ib(S)	0,191	170	1,20	0,95	<0,01
Ib(C)	0,150	218	1,61	0,33	<0,01
Π(δ)	0,152	246	1,46	0,13	<0,01
H(C)	0,115	289	1,46	0,12	<0,01
ffl(S)	0,343	NS	NS	0,58	<0,01
III (C)	0,268	108	1,24	0,10	<0,01
ΙΠ (S+C)	0,272	104	1,22
V(S)	0,257	92	1,28	0,26	0,27
V(C)	0,156	179	1,15	0,17	0,09
V(C)	0,241	99	1,20

molární hmotnost byla stanovena GPC-MALLS/RI ⁰ (S) označuje polysacharid přečištěný ze supernatantu ^c (C) označuje polysacharid přečištěný z pelety buněk

Podle NMR spekter molární hmotnosti naznačují, že u každého sérotypů jsou rozdíly mezi polysacharidy, které byly přečištěny ze supernatantu nebo z pelet buněk (stejně jako z obou kombinovaných zdrojů u typu III) nevýznamné. Protože NMR spektra preparátů každého sérotypů naznačují, že jsou chemicky identické, předpokládá se také stejné imunochemické

99 ·· 99 9«

9999 9999

999 9 · 99 9 99 9

999 99 9 · 9 99 9

9999 9999

999 99 99 99 99 99 chování těchto preparátů. Rozhodnutí, zda při extrakci kombinovat supernatant s buňkami proto tudíž záleží pouze na příspěvku k výtěžku, který je očekáván ze supernatantu (tab. 1). Z tohoto důvodu může být použití kombinovaného extraktu typu II výhodnější.

Příklad 4. Imunochemická analýza

Kompetitivní inhibice ELISA

Mikrotitrační destičky (Nunc Polysorp) byly pasivně potaženy buď GBSPu-HSA, GBSPm-HSA, GBSPu-HSA, GBSPm-HSA nebo GBSPv-HSA (100 ng polysacharidů ve 100 μΐ pro každou jamku), které byly rozpuštěny v PBS (50 nM fosforečnan sodný, 150 mM NaCl, pH=7,4). Potahování probíhalo 1 h při 37 °C, poté byly destičky promyty PBS + 0,05% Tween 20 (PBS-Tween, pH=7,4), poté byly blokovány 150 μΙ/jamku roztokem PBS s 0,1% BSA. Po tomto sekundárním potažení byly destičky opět promyty a skladovány až do dalšího použití při 4 °C.

Králičí antiséra proti celým buňkám Streptococcus skupiny B proti GBSPi_a, GBSPm, GBSPu, GBSPin (Dennis Kasper) byla jednotlivě titrována na destičky, potažené GBSPu-HSA, GBSPm-HSA, GBSPu-HSA, GBSPm-HSA. Podobně bylo králičí antisérum proti GBSPv-TT titrováno na destičku potaženou GBSPv-HSA. Pro inhibiční studie bylo vybráno jako vhodné ředění, odpovídající asi 50 % maximálního signálu.

Antiséra byla zředěna PBS-Tween. Inhibitory byly zředěny 5 krát v po sobě následujících ředěních pufrem, obsahujícím zředěná antiséra. Do jamek potažené mikrotitrační destičky bylo duplicitně pipetováno 100 μΐ těchto vzorků a destička byla inkubována při laboratorní teplotě 1 hod. Poté byla promyta a do každé jamky bylo přidáno 100 μΐ konjugátu kozlích protilátek proti králičím a křenové peroxidázy (Kirkegaard & Perry), který byl rozpuštěn v roztoku PBSTween podle návodu od výrobce. Destičky byly inkubovány při laboratorní teplotě a poté byly znovu promyty. Do každé jamky bylo pipetováno 100 μΐ substrátu TMB (k.č. 50-76-04, Kirkegaard & Perry). Reakce byla zastavena po 5 min. přídavkem 100 μΐ jednosložkového roztoku (k.č. 50-85-04, Kirkegaard & Perry) a byla změřena absorbance při 450 nm. Inhibice byla stanovena jako procento maximálního signálu, kterého je dosaženo u zředěného antiséra bez přítomnosti jakéhokoliv inhibitoru.

♦ ί ··

0 0 0

0 00

0 0 0

00

0 0 000 00

00 ·0 0'

0 0 0 • 0 0 0

0< 0

00

Výsledky

Vazebné inhibiční křivky pro každé specifické GBS antiserum la, lb, II, III, V s odpovídajícími homologními kapsulárními polysacharidovými antigeny jsou ukázány na obr. 5 až 10. Jak je vidět z těchto křivek, měl každý PS antigen, jestliže byl extrahován ze supematantu kultury nebo kutivačního média, podobné inhibiční vlastnosti, které naznačují jejich antigenní rovnocennost. Postup, používaný pro získání těchto kapsulárních polysacharidů, tedy negativně neovlivňuje jejich antigenicitu.

··?·..' ·.< /, • ·· ·# ♦ · ©♦ ·· • * · * · © · © · · φ• ·*· · · ·· © © · · • * ·©· ··;.··» © » · ·· © · · · · © -©·© © ♦·· ·* ♦· »♦ ·« ·©

Literatura

1. Anderson, P., G. Peter, R.B. Johnson, L.H. Wetterlow and D.H. Smith. 1972. Immunization of humans with polyribophosphate, the capsular antigen of Haemophilus influenzae type b. J.Clin.Invest. 51:39-44.

2. Avery, O.T. and W.F. Goebel. 1931. Chemo-immunological studies on conjugated carbohydrate-proteins V. The immunological specificky of an antigen prepared by combining the capsular polysaccharide of type 3 pneumococcus with foreign protein. J.Exp.Med. 54:437-447.

3. Baker, C.J. and D.L. Kasper. 1985. Group B síreptococcal vaccines. Rev.Inf.Dis. 7:458-467.

4. Baker, C.J., M.A. Rench, M.S. Edwards, R.J. Carpenter, B.M. Hays and D.L. Kasper. 1988. Immunization of pregnant women with a polysaccharide vaccine of group B Streptococcus. N.Engl.J.Med. 319:1180-1185.

5. Baker, C.J., M.A. Rench and D.L. Kasper. 1990. Response to Type III polysaccharide in women whose infants háve had invasive Group B síreptococcal infection. New Engl.J.Med. 322:1857-1860.

6. Baltimore, R.S., D.L. Kasper and J. Vecchitto. 1979. Mouše protection test for group B Streptococcus type III. J.Infect.Dis. 140:81-86.

7. Bednař, B. and J.P. Hennessey. 1993. Molecular size analysis of capsular polysaccharide preparations from Streptococcus pneumoniae. Carbohyd.Res. 243:115-130.

8. Beri, R.G., J. Walker, E.T. Reese and J.E. Rollings. 1993. Characterization of chitosans via coupled size-exclusion chromatography and multiple-angle laser light-scattering technique. Carbohyd.Res. 238:11-26.

9.

Bradford, M.M.. 1976. A Rapid and sensitive method for the quantitation of

• 44	49	• 4	4»	44
44 ·	9	•	« 4	4	4	•	•
• 449	9	4	99	4	4	4	4
							4
4 4 4	9	4	4 4	4 '	4	4	/4
444 49	49		• 4	49			4 4

microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Analyt.Biochem. 72:248-254.

10. D'Ambra, A.J., J.E. Baugher, P.E. Concannon, R.A. Pon and F. Michon. 1997. Direct and indirect methods for molar-mass analysis of fragments of the capsular polysaccharide of Haemophilus influenzae type b. AnaLBiochem. (In Press)

11. Dick, W.E., Jr. and M. Beurret. 1989. Glycoconjugates of bacterial carbohydráte antigens. p. 48-114. In: J.M. Cruse and R.E. Lewis,Jr., Contributions to microbiology and immunology. S.Karger, Basel.

12. Dillon, H.C., Jr., S. Khare and B.M. Gray. 1987. Group B streptococcal carriage and disease: A 6-year prospective study. J.Pediat. 110:31-36.

13. Goebel, W.F. and O.T. Avery. 1931. Chemo-immunological studies on conjugated carbohydrate-proteins IV. The synthesis of the p-aminobenzyl ether of the soluble specific substance of type 3 pneumococcus and its coupling with protein. J.Exp.Med. 54:431-436.

14. Gold, R., M.L. Lepow, I. Goldschneider, T.L. Draper and E.C. Gotschlich. 1975. Clinical evaluation of group A and group C meningococcal polysaccharide vaccines in infants. J.Clin.Invest. 56:1536-1547.

15. Gold, R., M.L. Lepow, I. Goldschneider and E.C. Gotschlich. 1977. Immune response of human infants to polysaccharide vaccines of Groups A and C Neisseria meningitidis. J.Infect.Dis. 136S:S31-S35.

16. Gold, R.M., M.L. Lepow, I. Goldschneider, T.F. Draper and E.C. Gotschlich. 1978. Antibody responses of human infants to three doses of group A Neisseria meningitidis vaccine administered at two, four and six months of age. J.Infect.Dis. 138:731-735.

17. Hennessey, J.P., B. Bednař and V. Manam. 1993. Molecular size analysis of Haemophilus influenzae type b capsular polysaccharide. J.Liq.Chromat.

0» 00 • <0 0 ·0 0

0 0 0 ·-· 0 . 0.

00 • ·0 ·· ·♦

16:1715-1729.

18. Howard, J.G., G.H. Christie, B.M. Courtenay, E. Leuchars and A.J.S. Davies. 1971. Studies on immunological paralysis. VI. Thymic-independence of tolerance and immunity to type III pneumococcal polysaccharide. Cell.Immunol. 2:614-626.

19. Jennings, H.J., E. Katzenellenbogen, C. Lugowski and D.L. Kasper. 1983. Structure of the native polysaccharide antigens of type Ia and type Ib Group B Streptococcus. Biochemistry 22:1258-1263.

20. Jennings, H.J., K.-.G. Rosell and D.L. Kasper. 1980. Structural determination and serology of the native polysaccharide antigen of type III group B Streptococcus. Can.J.Biochem. 58:112-120.

21. Jennings, H.J., K.-.G. Rosell and D.L. Kasper. 1980. Structure and serology of the native polysaccharide antigen of type Ia group B Streptococcus. Proc.Nat.Acad.Sci.USA. 77:2931-2935.

22. Jennings, H.J., K.-.G. Rosell, E. Katzenellenbogen and D.L. Kasper. 1983. Structural determination of the capsular polysaccharide antigen of type II Group B Streptococcus. J.Biol.Chem. 258:1793-1798.

23. Jennings, H.J. and R.K. Sood. 1994. Synthetic glycoconjugates as human vaccines. p. 325-371. In: Y.C. Lee and R.T. Lee, Neoglycoconjugates: Preparation and applications. Academie Press, New York.

24. Kasper, D.L., C.J. Baker, R.S. Baltimore, J.H. Crabb, G. Schiffman and H.J. Jennings. 1979. Immunodeterminant specificity of human immunity to type III group B Streptococcus. J.Exp.Med. 149:327-339.

25. Knobloch, J.E. and P.N. Shaklee. 1997. Absolute molecular weight of low-molecular-weight heparins by size-exclusion chromatography with multiangle laser light scattering detection. Anal.Biochem. 245:231-241.

·· ·· ·♦ ·· • · · · · « · · • · *· * · · · • ··.·♦·, «· · • · · ' · ·' fti · . ft ftz -.‘· • · ftft ft· ftft

26. Lancefield, R.C.. 1933. A serological differentiation of human and other groups of haemolytic streptococci. J.Exp.Med. 57:571-595.

27. Lancefield, R.C.. 1938. A micro-precipitin technique for classifying hemolytic streptococci and improved methods for producing antigen. Proc.Soc.Exp.Biol.and Med. 38:473-478.

28. Lancefield, R.C., M. McCarty and W.N. Everly. 1975. Multiple mouse-protective antibodies directed against group B streptococci: Speciál reference to antibodies effective against protein antigens. J.Exp.Med. 142:165-179.

29. Madoff, L.C., L.C. Paoletti, J.Y. Tai and D.L. Kasper. 1994. Matemal immunization of mice with Group B streptococcal type III polysaccharide-beta C protein conjugate elicits protective antibody to multiple serotypes. J.Clin.Invest. 94:286-292.

30. Marques, M.B., D.L. Kasper, A. Shroff, F. Michon, H.J. Jennings and M.R. Wessels. 1994. Functional activity of antibodies to the group B polysaccharide of group B streptococci elicited by a polysaccharide-protein conjugate vaccine. Infect.Immun. 62:1593-1599.

31. Makela, P.R.H., H. Peltola, H. Kayhty, et al. 1977. Polysaccharide vaccines of group A Neisseria meningitidis and Haemophilus influenzae type b: A field trial in Finland. J.Infect.Dis. 136:S43-50.

32. Michon, F., J.R. Brisson, A. Dell, D.L. Kasper and H.J. Jennings. 1988. Multiantennary group-specific polysaccharide of group B Streptococcus. Biochem. 27:5341-5351.

33. Peltola, A., H. Kayhty, A. Sivonen and P.R.H. Mákelá. 1977. Haemophilus influenzae type b capsular polysaccharide vaccine in children: A double blind field study of 100,000 vaccines 3 months to 5 years of age in Finland. Pediatrics 60:730-737.

• *· ·· »» 49 ·· ·* * ·«·« » · * · ··«· · · ·· » » « « • · ·»· · · ··· * · φ • · · · φ φ '-· *\ » 4·'- ru

4·4 44 ·« 4 4 94 44

34. Peltola, Η., P.R.H. Makela, H. Jousimies, et al. 1977. Clinical efficacy of meningococcal group A vaccine in children three months to fíve years of age. N.Engl.J.Med. 297:686-691.

35. Reuter, G. and R. Schauer. 1994. Determination of sialic acids. p. 168-199. In: W.J. Lennarz and G.W. Hart, Methods in Enzymology Vol. 230 Techniques in Glycobiology. Academie Press, New York.

36. Robbins, J.B. and R. Schneerson. 1990. Polysaccharide-protein conjugates: A new generation of vaccines. J.Infect.Dis. 161:821 -832.

37. Smith, A.L. and J. Haas. 1991. Neonatal Bacterial Meningitis, p. 313-333.

In: W.M. Scheld, R.J. Whitley and D.T. Durack, Infections of the Central Nervous System. Raven Press, Ltd., New York.

38. Tsunashima, T., K. Moro, B. Chu and T.-Y. Liu. 1978. Characterization of group C meningococcal polysaccharide by light-scattering spectroscopy. III. Determination of molecular weight, rádius of gyration, and translational diffusional coefficient.. Biopolymers 17:251-265.

39. von Hunolstein, C., L. Nicolini, S. D’Ascenzi, C. Volpe, G. Alfarone and G. Orefici. 1993. Sialic acid and biomass production by Streptococcus agalactiae under different growth conditions. Appl.Microbiol.Biotechnol. 38:458-462.

40. Wessels, M.R., W.J. Benedi, H.J. Jennings, F. Michon, J.L. DiFabio and D.L. Kasper. 1989. Isolation and characterization of type IV group B Streptococcus capsular polysaccharide. Infect.Immun. 57:1089-1094.

41. Wessels, M.R., J.L. DiFabio, V.J. Benedi, etal. 1991. Structural determination and immunochemical characterization of the type V group B Streptococcus capsular polysaccharide. J.Biol.Chem. 266:6714-6719.

42. Wessels, M.R., L.C. Paoletti, D.L. Kasper, et al. 1990. Immunogenicity in animals of a polysaccharide-protein conjugate vaccine against type III group B • 0* 00 ·» ·♦ >0 • 0 6 0009 0000 »·· 0 0 0» 0 0 4 0 «et φ··· ···· «00 00 0« _*··,. 00 00

Streptococcus. J.ClinJnvest. 86:1428-1433.

43. Wessels, M.R., L.C. Paoletti, A.K. Rodewald, et al. 1993. Stimulation of protective antibodies against type la and lb group B streptococci by a type la polysaccharide-tetanus toxoid conjugate vaccine. Infectlmmun. 61:4760-4766.

44. Wessels, M.R., V. Pozsgay, D.L. Kasper and H.J. Jennings. 1987. Structure and immunochemistry of an oligosaccharide repeating unit of the capsule polysaccharide of Type III Group B Streptococcus·. A revised structure for the Type III Group B streptococcal polysaccharide antigen. J.Biol.Chem. 262:8262-8267.

45. Wyle, S.A., M.S. Artenstein, B.L. Brandt, et al. 1972. Immunologic response of man to group B meningococcal polysaccharide vaccines. J.Infect.Dis.

Claims

PATENTOVÉ NÁROKY

1. Způsob separace nukleové kyseliny a/nebo proteinu od prostředku, který obsahuje kapsulární polysacharid vyznačující se tím, že přečištěný kapsulární polysacharid je získán tak, že prostředek je uveden do kontaktu s bazickým činidlem a kapsulární polysacharid je odseparován od nečistot, které vznikají v důsledku působení báze na nukleovou kyselinu a/nebo protein.
2. Způsob podle nároku 1,vyznačuj ící se tím, že určité procento /V-acetylskupin, přítomných v kapsulárním polysacharidů, je během extrakce hydrolyzováno a poté reacetylováno tak, že re-V-acetylovaný kapsulámí polysacharid vykazuje křížovou reaktivitu s nativním kapsulárním polysacharidem.
3. Způsob separace nukleové kyseliny a/nebo proteinu od prostředku podle nároku 1, který obsahuje kapsulámí polysacharid, vyznačující se tím, že dále zahrnuje kroky:

a) případné separování kapsulámího polysacharidů od nukleové kyseliny a/nebo proteinu pomocí chromatografie;

b) reakci kapsulámího polysacharidů z kroku a) s acylačním činidlem;

c) přečištění kapsulámího polysacharidů z kroku b) pomocí chromatografie.
4. Způsob podle nároku 3, vyznačující se tím, že pH bazických podmínek je mezi přibližně 9 a 14.
5. Způsob podle nároku 4, vyznačující se tím, že pH bazických podmínek je asi

12.
6. Způsob podle nároku 3,vyznačující se tím, že kapsulámí polysacharid pochází z jakékoliv bakterie rodu Streptococci.
7. Způsob podle nároku 3, vyznačující se tím, že kapsulámí polysacharid pochází z bakterie Streptococci skupiny B.

• · • ··· . · ·· · ·· · • · · · * ·· ··· ·· · • . · ···· ···· ··· ·· ·· ·· ·· ··
8. Způsob podle nároku 3,vyznačující se tím, že kapsulární polysacharidy pocházejí z Streptococci skupiny B typů Ia, Ib, Π, ΠΙ, V, VI a VIII.
9. Způsob podle nároku 3, vyznačující se tím, že bazické činidlo obsahuje organickou bázi.
10. Způsob podle nároku 3, vyznačující se tím, že bazické činidlo obsahuje anorganickou bázi.
11. Způsob podle nároku 3, vyznačující se tím, že bazické činidlo obsahuje NaOH, KOH nebo LiOH.
12. Způsob podle nároku 3,vyznačující se tím, že separace v chromatografiekém krokuje uskutečněna chromatografií s hydrofobní interakcí.
13. Způsob podle nároku 3,vyznačující se tím, že acylační čnidlo je acetanhydrid, acetylchlorid, pentafluorofenylacetát nebo 4-nitrofenylacetát.
14. Způsob podle nároku 3,vyznačující se tím, že kapsulární polysacharid je přečištěn chromatografícky a to gelovou permeační chromatografií.
15. Způsob podle nároku 3, vyznačující se tím, že bazické činidlo obsahuje anorganickou bázi, chromatografická separace je uskutečněna chromatografií s hydrofobní interakcí, acylační činidlo je acetanhydrid, acetylchlorid, pentafluorofenylacetát nebo 4-nitrofenylacetát a kapsulární polysacharid je chromatograficky přečištěn gelovou permeační chromatografií.
16. Způsob podle nároku 3, vyznačující se tím, že bazické činidlo obsahuje NaOH, chromatografický separační krok je chromatografie s hydrofobní interakcí, acylační činidlo je acetanhydrid a chromatografický krok, ve kterém je získán kapsulární polysacharid, je gelová filtrační chromatografie.

• · • · • ·
17. Způsob podle nároku 3,vyznačující se tím, že kapsulární polysacharid pochází z jakékoliv bakterie rodu Neisseria.
18. Způsob podle nároku 3, vyznačující se tím, že kapsulární polysacharid pochází z N. meningitidis typ C.
19. Způsob podle nároku 1, vyznačující se tím, že přečištěný kapsulární polysacharid obsahuje méně než asi 1 hmotn. % nukleové kyseliny a méně než asi 1 pg/ml proteinu.
20. Kapsulární polysacharid streptokoka skupiny B produkovaný postupem, který se skládá z působení bazického činidla na prostředek, obsahující kapsulární polysacharid streptokoka skupiny B, nukleovou kyselinu a/nebo protein a ze separace přečištěného kapsulárního polysacharidu, vyznačující se tím, že:

CPS typ la má: Ka_V přibližně v rozmezí 0,010 až 0,005

M_w přibližně v rozmezí 318 až 311 kg/mol přibližně v rozmezí 1,35 až 1,31 CPS typ lb má: K_av přibližně v rozmezí 0,191 až 0,150

M_w přibližně v rozmezí 218 až 170 kg/mol M_w/M„ přibližně v rozmezí 1,61 až 1,20

CPS typ II má: K_av přibližně v rozmezí 0,152 až 0,115

M_w přibližně v rozmezí 289 až 246 kg/mol M_w/M„ přibližně 1,46

CPS typ III má: K_av přibližně v rozmezí 0,343 až 0,268

M_w přibližně v rozmezí 108 až 104 kg/mol M_w/M_n přibližně v rozmezí 1,24 až 1,22

CPS typ V má: K_3V přibližně v rozmezí 0,257 až 0,156

M_w přibližně v rozmezí 179 až 92 kg/mol M_w/M_n přibližně v rozmezí 1,28 až 1,15
21. Způsob extrakce kapsulárního polysacharidu od jiných buněčných komponent gramnegativních a grampozitivních bakterií, vyznačující se tím, že se skládá z uvedení • ··· · · ·· • · · · · *· · • · · · · · · ··· ·· ·· ·· bakteriálních buněk, homogenízovaných bakteriálních buněk, upraveného média, supematantu bakteriální kultury nebo jejich směsí do kontaktu s bazickým činidlem za bazických podmínek a ze separace kapsulárního polysacharidu od nečistot, které vznikají v důsledku kontaktu jiných buněčných složek s bazickým činidlem s cílem získat přečištěný kapsulární polysacharid.
22. Způsob podle nároku 18, vyznačující se tím, že bazické podmínky jsou přibližně mezi pH 9 a pH 14.
23. Způsob podle nároku 19, vyznačující se tím, že bazické podmínky jsou přibližně pH

12.
24. Způsob podle nároku 20, vyznačující se tím, že zahrnuje kontakt bakteriálních buněk s bazickým činidlem.
25. Způsob podle nároku 25, vyznačující se tím, že přečištěný kapsulární polysacharid obsahuje méně než asi 1 hmotn. % nukleových kyselin a méně než asi 1 pg/ml proteinu.
26. Způsob podle nároku 25, vyznačující se tím, že separačním krokem je chromatografická separace.
27. Způsob podle nároku 25,vyznačující se tím, že kapsulární polysacharid pochází z jakékoliv bakterie rodu Neisseria.
28. Způsob podle nároku 25, vyznačující se tím, že kapsulární polysacharid pochází z N. meningitidis typ C.
29. Způsob podle nároku 25, vyznačující se tím, že jakákoliv bakterie je rodu

Strepptococci.
30. Způsob podle nároku 25, vyznačující se tím, že kapsulární polysacharid pochází z StiPptococci skupiny B.
31. Způsob podle nároku 25, vyznačující se tím, že bakterie jsou Streptococci skupiny B typu Ia, lb, II, III, V, VI nebo VIII.