CZ20003106A3

CZ20003106A3 - 6,9-Disubstituované 2-[trans-(4-aminocyklohexyl)-amino]puriny a jejich použití

Info

Publication number: CZ20003106A3
Application number: CZ20003106A
Authority: CZ
Inventors: Jennifer A. Dumont; Alan J. Bitonti; David R. Borcherding; Norton P. Peet; Randall H. Munson; Patrick W. K. Shum
Original assignee: Aventis Pharmaceuticals Inc.
Priority date: 1998-02-26
Filing date: 1999-02-18
Publication date: 2000-12-13
Also published as: ZA991548B; SK12912000A3; NO20004281D0; CA2320448C; WO1999043676A2; PL344021A1; CA2320448A1; ES2219038T3; AP1258A; UA62996C2; PT1056745E; IL138044A; AR019822A1; DE69918062D1; ATE269332T1; IL138044A0; EP1056745A2; TW541308B; EE04315B1; OA11480A

Description

Vynález se týká 6,9-disubstituovaných 2-{transX^^ařffinocyklohexylý'amÍTio-]-puri-nů—a—použiti—t-ěeht-o—látek—pro-antineoplastická činidla nebo pro léčení neuronálního poškození a degenerace.

Dosavadní stav techniky , Buněčné dělení, jak v normálních tak v neoplastických buňkách, je přísně řízený jev, který probíhá v definovaných stadiích. Klidové buňky, které se aktivně nedělí, jsou ve fázi G_o, jako jsou buňky konečně diferencované nebo buňky ve stavu dočasně zastaveného dělení. První fáze je fáze (označení symbolem G je odvozeno od anglického slova gap = mezera), během které se buňka připravuje na syntézu DNA.

V pozdní G-^ fázi, v bodě, který je nazýván restrikční bod nebo R bod, buňka přechází do S fáze, ve které nastává syntéza DNA. Po dokončení S fáze buňka přejde do G₂ fáze, během níž se buňka připravuje na dělení a po ní následuje mitóza neboli M fáze.

Počáteční pokusy týkající se regulace buněčného cyklu odhalily existenci proteinu nazývaného faktor podporující zrání (Maturation Promoting Factor,

MPF), což je heterodimer s kinázovou aktivitou. Později srovnáváni dále identifikovaných proteinů a jejich příslušných genů objevilo rodinu kvasinkových genů známých • · ·· i* jako geny řídící buněčné dělení (geny cdc - cell division control). Další pokusy prokázaly, že některé geny cdc kóduji kinázy a byly později nazvány kinázy závislé na cyklinu = cyklin-dependentní kinázy (cdk cyclin-dependent kinase). V důsledku této další klasifikace mají některé proteiny buněčného cyklu dvojí označení, jako cdkl, který j« také znám jako cdc2. Kinázová složka MPF se nyní označuje cdc2 » <m Ί €» řn -í -'fe τλο/4 -ί ω rl r·»

VU11U v Λ g, MPF se nyní n3.x,yvtx cyklin B^ eyklriny^-byly^-nejdříve ídenŤfifTkovány jako proteiny, jejichž hladiny oscilují během buněčného cyklu a jsou specificky degradovány v mitóze. Doposud byly identifikovány zvířecí cykliny A-I a cdk 1-8. Dále byly určeny subtypy cyklinů a cdk, jako jsou cykliny B1 a B2, což názvosloví ještě více komplikuje.

Další výzkum buněčné regulace prokázal, že stadia buněčného děleni jsou dosažena částečně modulací cyklinů a cyklin-dependentních kináz (cdk). Cykliny postupně regulují cdk a je pro ně charakteristická homologní oblast o 100 aminokyselinách, nazývaná cyklinový box, který je zapojen do vazby proteinového partnera kinázy. Cdk jsou blízce příbuzné, co se týče sekvence a velikosti (35-40 kD), a jsou definovány jako proteinové kinázy aktivované prostřednictvím vazby regulačních podjednotek cyklinu. Cdk obsahuje konzervativní oblast aktivního místa o přibližné velikosti 300 aminokyselin, které je charakteristické pro všechny eukaryotické proteinkinázy. Zdá se tedy, že jak cykliny, tak cdk jsou vysoce konzervativní proteinové rodiny.

Izolace jednotlivých cyklinů a cdk umožnila další identifikaci úlohy a interakce každé složky v přechodech mezi fázemi buněčného cyklu. Nadměrné hladiny cdk

fc • <·

3.

přetrvávají v průběhu celého buněčného cyklu. Aktivace cdk nastává při syntéze cyklinu a vazbě na katalytickou podjednotku cdk, výsledkem toho je stimulace aktivity cdk/serin/threoninkinázy. Kompletní aktivace cdk vyžaduje fosforylaci konzervovaného threoninového zbytku lokalizovaného v T smyčce prostřednictvím kinázy aktivující cyklin-dependentní kinázu (CAK), která sama je tvořena komplexem cdk/cyklin složeným z cyklinu H a cdk? a třetího -proteinu^-o^- vel-řkosti^- přibT-řžně^-32^—kD_

Inaktivace komplexu cdk-cyklin může být důsledkem fosforylace threoninového a/nebo tyrosinového zbytku ve vazebném místě pro ATP v cdk nebo vazby jednoho z celé řady endogenních inhibičních proteinů.

Ve fázi se cykliny typu D vážou na několik odlišných cdk, včetně cdk2, cdk4, cdk5 a cdkó, ale nejčastěji se spojují s cdk4 a cdkó. Má se za to, že cykliny typu D působí jako senzory pro růstové hormony, které propojují progresi buněčného cyklu s vnějšími podněty. Komplexy cyklin E-cdk2 se objevují v buněčném cyklu savčích buněk po komplexech typu cyklin Ď-cdk. Syntéza cyklinu E je přísně regulována a nastává v pozdní G^ a časné S fázi. Komplex cyklin E-cdk2 je nezbytný pro to, aby buňka začala replikaci DNA.

Cykliny , cyklin D a cyklin E jsou přechodně tvořené proteiny, s biologickým poločasem přibližně 20 minut. Má se za to, že krátký poločas je důsledkem sekvence PĚST v C-koncové oblasti těchto proteinů, jejichž degradace se zdá být zprostředkovaná metabolickou dráhou ubikvitinu.

Cykliny G₂, cyklin A a cyklin B jsou stabilní

•	• ·	•	·«	«·	• ·
• · ·	•	• · ·		» ·	•	•
• ·	•	• ·	•	• ·	9	•
						•
• ·	•	• ·	•	• ·	•	•
• · ·	* ·	• · ·	·< ·	• ·	• ·

v průběhu interfáze a jsou specificky zničeny v mitóze prostřednictvím metabolické dráhy ubikvitinu. Zdá se, že jak cyklin A tak cyklin B2 jsou degradovány pouze tehdy, když jsou v komplexu se svým cdk partnerem [cyklin A-cdk2 a cyklin A/B-cdkl(cdc2)]. Ale destrukce cyklinu B1 je spojena s integritou mitotického aparátu na konci metaíáze. Jestliže je vřeténko sestaveno nesprávně nebo jestli jsou chromozomy nesprávně seřazeny, pak je destrukci B1

-zabráněno-:-;

Retinoblastomový protein (Rb), jaderný fosfoprotein velikosti 105 kD, je substrátem pro komplexy cyklin-cdk pro cdk-2,4 a 6 v G^ fázi a působí jako jeden z hlavních kontrolních bodů v buněčném cyklu prostřednictvím pečlivě uspořádané fosforylace a defosforyláce. V Gq/G^ existuje Rb v hypofosforylovaném stavu. Jak buňka postupuje do pozdní G-^ fáze, Rb se stává hyperfosforylovaný prostřednictvím komplexů cyklinu D, které inaktivují Rb a vedou buňku do S fáze, což má za následek progresi buněčného cyklu a buněčné dělení. Tento stav hyperfosforylace Rb zůstává během G2. Během pozdní M fáze je Rb defosforylován, a tak se vrací do hypofosforylovaného stavu. Fosforylace proteinu Rb mění jeho vazebné vlastnosti, v hypofosforylovaném stavu Rb váže a odděluje specifické transkripční faktory, jako E2F, jehož vazba zabraňuje úniku z G-^ fáze. Jakmile cdk hyperfosforylují Rb, jsou transkripční faktory uvolněny, a tó pak může aktivovat transkripci genů nezbytných pro progresi S fáze, například gen thymidinkinázy, myc, myb, adihydrofolátreduktázy a DNA polymerázy-α.

Lokalizace komplexů cyklin-CDK je také velmi sugestivní, co se týče úlohy, kterou má každý komplex v metabolické dráze. Jaderné cykliny A a E se vážou k pl07 «'· a pl30 pravděpodobně proto, že jsou v jádru. Savčí cyklin B1 se akumuluje v cytoplazmě v G2 fázi a translokuje se do jádra na začátku mitózy. Cyklin B asociuje s aparátem vřeténka, konkrétně s pólem vřeténka, a má se za to, že cyklin B-cdc2 kináza může být do tvorby vřeténka zapojena prostřednictvím fosforylujících složek mitotického aparátu. Navíc cyklin B1 je částí zpětnovazebního mechanismu, který zajišťuje správné sestavení mitotického aparátu v metafázi.

-tidský—cyklin—B2—je—téměř—výlučně asociován—s—membránovýmkompartmentem, obzvláště s Golgiho aparátem. Cyklin B2-cdc2 je zapojen do rozpojování Golgiho aparátu, když buňka vstupuje do mitózy.

Cdc2-cyklin B kináza je klíčový mitotický faktor, který se jeví jako vysoce konzervativní a má se za to, že je zapojen v přechodech buněčného cyklu ve všech eukaryotických buňkách. Histon H1 je substrát pro cdc2-cyklin B, histon H1 je selektivně fosforylovaný na specifických místech v mitóze, což je dle předpokladu důležité pro kondenzaci chromatinu. Komplex cdc2-cyklin B také fosforyluje lamin, který j e zodpovědný za rozpad j aderné membrány. J aderná membrána j e tvořena z polymeru laminových podj ednotek, které jsou hyperfosforylované v mitóze, a tato fosforylace je zodpovědná za jejich rozpojení. Lamin je částí rodiny proteinů intermediárních fibril a cdc2-cyklin B fosforyluje podskupinu míst fosforylovaných v mitóze na cytoplazmatických podjednótkách intermediárních fibril, vimentinu a dezminu. Tak je komplex cdc2-cyklin B zapojen do reorganizace buněčné architektury v mitóze.

Kromě toho cdc2-cyklin B je zapojen do reorganizace mikrofilament prostřednictvím fosforylace kaldezmonu (jiného než ve svalech) a proteinu o velikosti 83 kD, který se váže

k aktinu a kalmodulinu a inhibuje aktivitu aktomyozin-ATPázy. V mitóze je kaldezmon fosforylován prostřednictvím cdc2-cyklinu B, což zeslabuje jeho afinitu k aktinu a způsobuje, že disociuje od mikrofilament.

Cdc2-cyklin B zasahuje do regulace aktinomyozinových vláken prostřednictvím fosforylace myozinu v kontraktilních •lni 1 á q -rm r»

1-» ·Ρι hi “(cyťokinezejt V^—metafázi.^-j e regulační lehký^Vřetězec myozinu II (MLC) fosforylován na dvou základních místech v N-koncové části. Fosforylací myozinu se zabrání jeho interakci s aktinem. V anafázi jsou tato dvě místa defosforylována.

Cdc2-cyklin B má také úlohu v reorganizaci membránového kompartmentu v mitóze. Například cdc2-cyklin B fosforyluje rablAp a rab4p. Když je rab4p fosforylován cdc2-cyklinem B, disociuje z membránového kompartmentu.

V mitóze je většina transkripčních forem inhibována. Cdc2-cyklin B má opět úlohu v inhibici transkripce zprostředkované ροϊ III prostřednictvím fosforylace TFIIIB Za předpokladu, že transkripce zprostředkovaná pol I, pol II a pol III sdílí několik společných faktorů, jako je protein vázající sekvenci TATA (TBA), je pravděpodobné, že cdc2-cyklin B je zapojen do tlumení všech transkripčních forem v mitóze.

Za předpokladu, že komplexy cyklin/cdk jsou důležité pro spouštění cyklu buněčného dělení, jsou pod přísnými regulačními mechanismy. Od výchozího objevu bylo prokázáno, že cykliny a cdk interaguji s jinými transkripčními faktory a proteiny zapojenými do celé řady buněčných metabolických

drah. Cdk7 byl rozpoznán jako složka transkripčního faktoru IIH (TFIIH), která má kinázovou aktivitu C-koncové domény (CTD) RNA polymerázy II. Nedávno bylo objeveno, že také cdk8, která se spojuje s cyklinem C, fosforyluje CTD RNA polymerázy II, ale nezdá se, že má aktivitu CAK. Je tedy jasné, že kromě regulace buněčného cyklu se cdk podílí na celé řadě buněčných funkcí. CDK-inhibiční proteiny (CDI) jsou malé proteiny, které vážou a inaktivují specifické

-komplexy— ey-k-l-i-n-CDK—nebo—monome-rní—CDK-—Tyto—i-nhi-b-i-t-orymohou být zařazeny do dvou rodin na základě podobnosti ' sekvencí a funkcí. Rodina INK4 zahrnuje plS^^K⁴®, pl6^^⁴, pl8 a pl9, které specificky vážou cdk4 a cdkó. pló^K⁴a pl5 obsahují čtyři ankyrinové repetice a kromě toho, že j sou významně homologní, j sou kódovány sousedními geny v lokusu 9pl2.

Vysoké buněčné hladiny pl6 mají za následek inaktivaci cdk4, protože pl6 váže komplexy cyklin D-cdk4 a cyklin D-cdk6. Gen pro pló^^⁴ (MTS1) je považován za potenciální nádorový supresorový gen, protože je přestavován, deletován nebo mutován ve velkém počtu nádorových buněčných linií a v některých primárních nádorech. V jedné studii hereditárniho melanomu měla téměř polovina rodin mutace zárodečné linie v genu pló^^⁴. Rb je represor pló^^^⁴. Inaktivace buněčného Rb, buď mutací nebo virovými antigeny, koreluje se zvýšenými hladinami pló^^⁴. pló^INK4, pl5^^^4Ba pl8 inhibují vazbu cyklinu D s cdk4 a cdkó.

Druhá rodina CDI je rodina Kip/Cip, která zahrnuje pžiCipiVAF-¹, _p27^KiP¹ a p57^KiP². p27^KiP¹ se vyskytuj e v proliferujících buňkách v latentní nebo maskované formě.

V průběhu stimulace je p27^¹P·*’ demaskován a váže a inhibuje komplexy cyklin-CDK4/6. Proteiny rodiny Kip/Cip jsou silně

'/3

• · *	• * ·	• · ··

• · ·	r · ·	• ·· i

• · ·	• « - · β·	« · · ·
• · · · ·		··

homologní v N-koncové části, oblasti, která váže komplexy cyklin-cdk. Proteiny rodiny Kip/Cip vážou a inhibují komplexy cyklin-cdk zapojené do komplexů G-^ a S fází přednostně proti komplexům M fáze.

P21 (známý také jako VAF1, Cipl a Sdil) je indukován p53 a tvoří ternární komplex s jaderným antigenem proliferující buňky (PCNA) a podjednotkou DNA polymerázy δ v několiTča^-komplexech^-čykTin^CDK'2—včetně—cykl-ínů—A^—Dl-a-ik Exprese p21^^AF-1 v rostoucích, klidových a stárnoucích buňkách koreluje s jeho úlohou jako negativním regulátorem vstupu do S fáze. p21^^AF_1 mRNA se zvyšuje, když buňka stárne nebo je v klidové fázi a po sérové stimulaci klidových buněk a snižuje se, když buňka vstupuje do S fáze. p21 inaktivuje komplexy cyklin E-cdk2, cyklin A-cdk2 a cyklin Dl, D2 a D3-cdk4.

Genetická analýza četných lidských nádorů odhalila neúměrný počet změněných proteinů buněčného cyklu a má se za to, že tato aberace způsobuje abnormální buněčný cyklus. Například cyklin Dl je bcl-l/PRADl proto-onkogen, který je buď nadměrně exprimován nebo deregulován v celé řadě lidských nádorů. Gen cyklin D1/CCND1, lokalizovaný na chromozomu llql3, je amplifikován u velkého počtu karcinomů, hlavně karcinomu prsu a plicních karcinomů j iných než malobuněčných. To koreluje s pozorováním, že nadměrná exprese cyklinu Dl je společný rys u nádorů s tímto specifickým amplikonem (amplifikovaným fragmentem) llql3.

Gen pro pl6 je přestavěn, deletován nebo mutován u velkého počtu nádorových buněčných linií a u některých primárních nádorů. Mutace v cdk4, specificky mutace Arg24Cys, byla identifikována ve dvou nepříbuzných rodinách s hereditárním melanomem. Tato mutace byla nalezena u 11/11 pacientů «·· ·>9 u poloviny příbu^ens s melanomem, 2/17 nepostižených a 0/5 manželů/manželek (Zuo a kol., Nátuře Genetics, 12, 97-99, 1996). Tato mutace má specifický účinek na doménu cdk4 vázající pl6^IN^^4a, ale nemá žádný vliv na schopnost vazby k cyklinu D a tvorbu funkční kinázy. V důsledku této mutace je komplex cyklin D/cdk4 rezistentní na normální fyziologickou inhibici prostřednictvím pló^INK4a. Další studie ukázaly, že téměř tva s familiárním melanomem se prokázala vazba k obTasti chromozomu 9p21“ který^-obsahuje^-gen pl6lNK4a. Typy identifikovaných mutací pl6^^^4a zahrnují nonsense mutaci, mutaci donora sestřihu, neidentifikovanou mutaci, která zabraňuje transkripci pl6^^^4a a 3 missense mutanty (mutace měnící smysl kodonu), které jsou neschopné vázat cdk4 nebo cdk6. Nadměrná exprese cdk4 jako důsledek amplifikace genů byla identifikována ve studii 32 gliomových buněčných linií (He, J., a kol., Cancer Res., 54,

5804-5807, 1994). Tato alterace byla pozorována u deseti případů s intaktními geny pl6. Genetická analýza gliomových buněčných linií odhalila, že 24 z 32 gliomových buněčných linií mělo jednu ze dvou alternativních genetických alterací, z nichž každá ukazovala, že zvýšená aktivita cdk4 kinázy je důležitá pro vývoj gliového nádoru. cdk4 je na mapě dlouhého raménka chromozomu 12 a její nadměrná exprese byla nalezena u určitých nádorů díky její· amplifikaci jako složky amplikonu, který zahrnuje další relevantní geny, jako je SAS a MDM2. Všechny z výše uvedených stavů vedou k aktivaci cdk4. Byla také publikována nadměrná exprese cyklinů B1 a E u leukemických buněčných linií a u buněčných linií solidního tumoru, jakož i změněný charakter exprese cyklinu E u karcinomu prsu.

Buněčná hyperproliferace se objevuje u velkého počtu chorobných stavů. Nejběžnější hyperproliferační nemoci jsou

novotvary, které jsou typicky pojmenovány podle původního zdroje hyperproliferační tkáně. Novotvary jsou definovány jako nový nárůstek zvířecí nebo rostlinné tkáně, který více či méně připomíná tkáň, ze které pochází, ale neslouží žádné fyziologické funkci a jejich charakter je benigní, potenciálně maligní nebo maligní. Novotvary vznikají jako důsledek ztráty normální kontroly, což vede k neregulovanému růstu. Neoplastické buňky mohou postrádat diferenciaci a zí“skávaj“í schopnost^-invadovat—do—m-í-stniahtkání a metastazovat. Novotvary se mohou vyvinout v každém typu tkáně každého orgánu v každém věku. Výskyt novotvarů a úmrtnost obecně stoupají s věkem, přičemž určité novotvary maj i vrchol výskytu mezi 60. a 80. rokem (například prostata, žaludek a tlusté střevo). Ale jiné novotvary mají vrchol výskytu od narození do 10 let věku (například akutní lymfoblastická leukémie). Dieta, expozice karcinogenům, zejména tabáku, a familiární predispozice také ovlivňují výskyt konkrétních novotvarů.

Neoplastické buňky se liší od normálních buněk v celé řadě důležitých aspektů, včetně ztráty diferenciace, zvýšené invazivnosti a snížené citlivosti na léky. Další důležitá odlišnost je nekontrolovaný růst buněk, o kterém se předpokládá, že je následkem ztráty normálních buněčných kontrolních mechanismů těchto buněk, které jsou buď deaktivovány, obcházeny nebo na ně není brán zřetel jinak, což umožňuje neoplastickým buňkám proliferovat bez ohledu na normální kontrolní mechanismy.

Novotvar je abnormální tkáňová hmota, jejíž růst se vymyká kontrole a není koordinován s růstem normální tkáně a trvá stejně nadměrným způsobem i po skončení podnětu, který změnu vyvolal.

Novotvary se rozděluj i na benigní nebo maligní.

Benigní novotvary projevují pomalý, lokalizovaný růst, který je obvykle ohraničen díky jejich opouzdření pomocí fibrózního pouzdra z pojivové tkáně. Zatímco benigní novotvary zřídka způsobí smrt organismu, u neléčených maligních novotvarů je vysoká pravděpodobnost, že organismus usmrtí. Maligní novotvary jsou obecně neopouzdřené a obvykle rychlreji—rostouc—MaTigní— novotvary—často—invadujT—dookolních tkání a cév a šíří se na vzdálená místa v těle. Maligní novotvary jsou genericky popisovány jako karcinomy nebo jako tumory, druhý termín označuje zduření.

Myeloproliferační choroby je skupina nemocí charakterizovaná abnormální proliferací jedné nebo více hemopoetických buněčných linií nebo složek pojivové tkáně. Normálně se do myeloproliferačních chorob zahrnují čtyři nemoci: polycythaemia vera (primární polycytémie, Vaquezova choroba), myelofibróza (myeloidní metaplázie nejasného původu), chronická myeloidní leukémie a primární (esenciální) trombocytémie. Akutní leukémie, zejména erytroleukémie, a paroxysmální noční hemoglobinurie jsou také zařazovány jako myeloproliferační choroby. Každá z těchto chorob je identifikována podle svého převládajícího charakteristického rysu nebo podle místa proliferace.

Ačkoliv jsou důsledkem proliferace různých buněk, bylo dokázáno, že každá nemoc je způsobena klonální proliferací vznikající na úrovni pluripotentní kmenové buňky, což způsobuje různý stupeň abnormální proliferace erytroidních, myeloidních a megakaryocytových prekurzorů v kostní dřeni. Všechny myeloproliferační choroby mají tendenci končit jako akutní leukémie.

Leukémie jsou maligní novotvary krvetvorných tkání.

S vyvoláním leukémií u lidí jsou spojovány přinejmenším dva viry. Virus Epstein-Barrové se spojuje s Burkittovým lymfomem a lidský lymfotropní virus T buňky, také nazývaný virus lidské akutní leukémie/lymfomu (HTLV-1), byl dáván do souvislosti s některými leukémiemi a lymfomy T buněk. Expozice, zejména déletrvající expozice chemickým činidlům, jako je benzen a některá protinádorová léčiva, nebo ionizujícímu záření,—genetické—pred-i-spoz-i-ee—(-napřikladDovnův syndrom) a některé familiární choroby (například Fanconiho anémie) mají za následek predispozici k leukémii.

Má se za to, že rozvoj leukémie nastává prostřednictvím jednoho buněčného cyklu ve dvou nebo více krocích s následnou proliferací a klonální expanzí. Leukémie jsou v současnosti tříděny podle své buněčné zralosti, akutní leukémie jsou převážně nediferencované buněčné populace a chronické leukémie mají zralejší buněčné formy. Akutní leukémie se dále dělí na lymfoblastové (ALL, také známa jako akutní leukémie lymfatické řady) a myeloidní (AML, také známa jako akutní myelocytární, myelogenní, myeloblastová, myelomonoblastová). Mohou být dále tříděny pomocí morfologických a cytochemických znaků podle francouzsko-americko-britské (FAB) klasifikace nebo podle typu a stupně diferenciace. Chronické leukémie se klasifikují buď jako lymfatické (CLL) nebo myeloidní (CML). CLL je charakterizována výskytem zralých lymfocytů v krvi, kostní dřeni a lymfoidních orgánech. CML je charakterizována převahou granulocytů ve všech stupních diferenciace v krvi, kostní dřeni, játrech, slezině a jiných orgánech.

Myelodysplastický syndrom (MDS) je charakterizován jako klonální proliferační choroba, u které je normální nebo

hypercelulární kostní dřeň sdružena s anémií a poruchami myelopoézy. Hemopoetické buňky, které mohou proliferovat, zahrnují erytroidní, myeloidní a megakaryocytové formy. MDS je relativně nové označení skupiny chorob známých jako preleukémie, refrakterní anémie, Ph-chromozom negativní chronická myeloidní leukémie, chronická myelomonocytová leukémie a myeloidní metaplázie nejasného původu. Systém FAB poskytuje další klasifikaci myelofibrózy.

Lymfomy jsou heterogenní skupina novotvarů vznikajících v retikuloendotelovém a lymfatickém systému. Hlavní typy lymfomů jsou Hodgkinova choroba a nehodgkinské lymfomy, a také vzácnější Burkittův lymfom a mycosis fungoides. Hodgkinova choroba je chronické onemocnění s lymforetikulární proliferací neznámé příčiny, která se může vyskytovat v lokalizované nebo diseminované formě a je dále charakterizována podle čtyř histopatologických profilů. Nehodgkinské lymfomy jsou heterogenní skupina nemocí, jež spočívá v neoplastické proliferací lymfoidních buněk, které jsou obvykle v těle diseminovány. Dřívější termíny, lymfosarkom a retikulosarkom, byly nyní nahrazeny termíny, které odrážejí původ buněk a biologický průběh nemoci. Rappaportova klasifikace je založena na histopatologii, na stupni diferenciace nádoru a na tom, zda je růstový model difúzní nebo nodulární. Klasifikace podle Lukeše a Collinse je založena na původu buňky, specificky zda pochází z T nebo B buňky, histiocytu (nebo monocytu) nebo je původ neklasifikovatelný. International Panel Vorking Formulation of the National Cancer Institute třídí nehodgkinské lymfomy s použitím výše uvedených klasifikací.

Burkittův lymfom je vysoce nediferencovaný lymfom B buněk, který má tendenci postihovat místa jiná než

lymfatické uzliny a retikuloendotelový systém. Burkittův lymfom má na rozdíl od jiných lymfomů specifickou geografickou distribuci, což svědčí pro neidentifikovaný hmyzí vektor a infekční agens. Důkazy ukazují na virus herpes podobný viru Epstein-Barrové.

Mycosis fungoides je vzácný chronický lymfom T buněk pO3tT±iu.j jLCj. IíUíZjL 3, plTll

Ďyskrazie plazmatických buněk (PCD) nebo monoklonální ΓΓατη·αϊ^<ϊ+*5 crm nHnr· nhv pharflVŤfin *7ηνίϊτΐβ di ísnrnn-orcm & U- p* W. V -J- V-»' J OCIUl J W, ·*.**»*-*- ·—! — — —proliferací jednoho klonu buněk normálně zapojených do syntézy imunoglobulinu (Ig) a výskytem strukturálně a elektroforeticky homogenního Ig nebo jeho polypeptidové podjednotky v séru nebo moči. Choroba může být nejdříve asymptomatická až k progresivním zjevným novotvarům (například mnohočetný myelom). Choroba je důsledkem disproporční proliferace jednoho klonu produkujícího specifický Ig: IgG, IgM, IgA, IgD nebo IgE.

Mnohočetný myelom, také známý jako myelom plazmatických buněk nebo myeíomatóza, je progresivní neoplastické onemocnění, pro které jsou charakteristické tumory plazmatických buněk kostní dřeně a nadměrná produkce intaktního monokloňálního Ig (IgG, IgA, IgD nebo IgE) nebo Bence Jonesova proteinu, což jsou volné monoklonální lehké řetězce kappa nebo lambda. Difúzní osteoporóza nebo diskrétní osteolytické léze vznikají v důsledku náhrady expandujícími tumory plazmatických buněk nebo díky faktoru aktivujícím osteoklasty, který je secernován maligními plazmatickými buňkami.

Makroglobulinémie nebo primární či Valdenstrómova

• 9 9				‘99'
9 '9	•	^f9	9	9 9
• 9	•	«	9	· ·

• 9	•	'9	9	9 9
• · ·'·		9 9		9 9

makroglobulinémie je dyskrazie plazmatických buněk postihující B buňky, které normálně syntetizují a secernuji IgM. Makroglobulinémie se liší od myelomu a jiných PCD a připomíná lymfomatózu. Mnoho pacientů má příznaky zvýšené viskozity krve, únavu, slabost, kožní a slizniční krvácení apod.

Nemoc těžkých řetězců je neoplastická dyskrazie ^llažmažtickyeh^—buněk—charakterizovaná—nadměrnou—pjroduke-í-— homogenních těžkých řetězců Ig y, α, μ a δ. Tyto poruchy mají za následek nekompletní monoklonální Ig. Klinický obraz se podobá více lymfomu než mnohočetnému myelomu.

Hypersplenismus je syndrom, při kterém je oběhová cytopenie spojena se splenomegalií. Léčení pacientů s hypersplenismem vyžaduje léčbu základní nemoci, ne splenektomii. Lymfoproliferační a myeloproliferační choroby jsou určitou, ale ne jedinou, příčinou hypersplenismu. Myeloproliferační choroby způsobující hypersplenismus zahrnují polycytémii vera, myelofibrózu s myeloidní metaplázií, chronickou myeloidní leukémii a esenciální trombocytémii. Chronická lymfocytová leukémie á lymforný (včetně Hodgkinovy choroby) jsou specifické lymfoproliferační choroby, které mohou vyvolat hypersplenismus.

Plicní tkáň je místo jak benigních tak maligních primárních tumorů, a také místo metastáz karcinomů z mnoha dalších orgánů a tkání. Kouření cigaret je příčinou ohromného procenta plicních karcinomů, odhadem více než devadesáti procent případů u mužů a přibližně sedmdesáti procent případů u žen. Expozice vlivům pracovního prostředí, jako je azbest, radiace, arzén, chromany, nikl,

chlormethyletery, jedovatý plyn a emise koksovaci pece, je také spojena s plicnim karcinomem. Nej běžnější typy plicního karcinomu jsou epidermoidní, malobuněčný, velkobuněčný karcinom a adenokarcinom.

Přibližně devadesát pět procent rakoviny žaludku jsou karcinomy, méně běžné jsou lymfomy a leiomyosarkomy. Karcinomy žaludku jsou klasifikovány podle celkového vzezření , vyčrTí vajTUíi penet r u j“ící^—Ctumor ~má~ostrou;—dobře— ohraničenou hranici a může být ulcerován) a infiltrující nebo smíšený, který má charakteristické vlastnosti dvou dalších typů.

Rakoviny pankreatu mohou být tumory exokrinní, což jsou většinou adenokarcinomy vznikající spíše z buněk kanálků než z buněk acinů, nebo tumory endokrinní, které zahrnují inzulinom. Pankreatické tumory produkující gastrin postihují buňky jiné než typu β nebo tumory ve stěně duodena mohou způsobit Zollingerův-Ellisonův syndrom, který se vyznačuje hypergastrinémií. Někdy další endokrinní abnormality, zejména příštítných tělísek nebo hypofýzy a nadledvin, vyvolají poruchu mnoha žláz známou jako mnohočetná endokrinní neoplázie (MEN). Tumory buněk j iného typu než β mohou způsobit syndrom známý jako syndrom pankreatické cholery, jehož příčinou je nádor pankreatu produkující VIP (vipom), který je charakterizován dlouhotrvajícími masivními řídkými průjmy.

Novotvary střev zahrnují tumory tenkého střeva, tumory tlustého střeva a rakovinu tračníku a rekta. Benigní tumory tenkého střeva mohou vznikat z novotvarů jejuna a ilea, včetně leiomyomů, lipomů, neurofibromů a fibromů. Maligní tumory tenkého střeva, jako jsou adenokarcinomy, jsou vzácné

• .· · 4	44 4	* 44 4 4 4	4	4 4 4	4 4 4 4	4
• ·	4	4 4	4	•	4 <4	4
						4
4 4	4	4 <4	4	4	4 4	4
4 4 4	4 4	44 4 44		4 4	44

a typicky vznikají v proximálnim jejunu. Pacienti s Crohnovou chorobou tenkého střeva j sou k těmto adenokarcinomům náchylnější než pacienti s Crohnovou chorobou tlustého střeva. U pacientů s Crohnovou chorobou mají tumory tendenci objevovat se distálně v překlenutých nebo zanícených kličkách střeva. Karcinoidy typicky vznikají v tenkém střevě, zejména v ileu, a přibližně v polovině případů existují rnnohočetné tumory. Kaposího sarkom, který se často vyskytuje u příjemců transplantátu a u pacientů s AIDS, má gastrointestinální postiženi přibližně v polovině případů. Leze se mohou objevit kdekoliv v gastrointestinálním traktu, ale jsou obvykle nalézány v žaludku, tenkém střevu nebo distálním tračníku.

Tumory tlustého střeva zahrnují polypy tračníku a rekta. Polypy jsou tvořeny masou tkáně, která vychází ze střevní stěny a vyčnívá do lumen. Polypy se třídí podle histologie, jako tubulární adenomy, tubulovilózní adenomy, vilózní adenomy, hyperplastické polypy, hamartomy, juvenilní polypy, polypoidní karcinomy, pseudopolypy, lipomy, leiomyomy a ještě vzácnější tumory.

Maligní tumory mohou také vznikat v anorektu. Jsou to epidermoidní (z dlaždicových buněk) karcinomy anorekta, ze kterých se skládaj i tři až pět procent rektální a anální rakoviny.

V západních zemích jsou karcinomy tračníku a rekta na druhém místě za karcinomem plic, co se týče evidence nových případů každý rok. V USA v roce 1989 zemřelo přibližně 75 000 lidí na tyto karcinomy, přibližně 70 % se vyskytlo v rektu a sigmoideu a 95 % byly adenokarcinomy.

• • · 9	·· •	• ·« ·	·· •	•	·· •	•	·· •
• ·	•	• ·	•	•	•	•	•
							•
• ·	•	• ·	•	•	9	•	•
···	• ·	« · ·	• ·		··		··

Novotvary jater zahrnují benigní novotvary, které jsou relativně časté, ale často neodhalené, a maligní novotvary. Hepatocelulární adenom je nejdůležitější benigní novotvar jater. Asymptomatické malé hemangiomy se vyskytují u jednoho až pěti procent dospělých. Adenomy žlučovodů a další mezenchymální novotvary se také vyskytuj í, ale j sou relativně vzácné. Maligní novotvary jater jsou nej častější formou jaterního tumoru a játra jsou častým místem metastáz přenášených krevním oběhem, obvykle z plic, prsu, tračníku, pankreatu a primárních nádorů žaludku. Výskyt hepatocelulárniho karcinomu je spojen s chronickou virovou hepatitidou B v určitých částech Afriky a jihovýchodní Asie. V severní Americe, Evropě a j iných oblastech s nízkou prevalencí má většina pacientů jako základní onemocnění cirhózu jater. Fibrolamelární karcinom je jiná varianta hepatocelulárniho karcinomu s charakteristickou morfologií maligních hepatocytů zachycených v lamelární fibrózní tkáni. Fibrolamelární karcinom obvykle postihuje relativně mladé dospělé a nemá žádný vztah s dříve existující cirhózou, chronickou infekcí virovou hepatitidou B nebo j inými známými rizikovými faktory. Další primární malignity jater zahrnují cholangiokarcinom (tumor vznikaj ící z epitelu intrahepatických žlučovodů), hepatoblastom (který je jeden z nejčastějších karcinomů u dětí) a angiosarkom (který je spojován s průmyslovou expozicí vinylchloridu). Leukémie a příbuzné choroby mohou postihnout hepatické tkáně, má se za to, že je to důsledek infiltrace abnormálními buňkami.

Syndrom mnohočetné endokrinní neoplázie (MEN) je skupina geneticky rozdílných familiárních nemocí zahrnujících adenomatózní hyperplázii a tvorbu maligních tumorů v několika endokrinních žlázách. Byly identifikovány tři odlišné syndromy. Typ I (MEN-I) je charakterizován • 9. «·

• · « tumory příštítných tělísek, pankreatických ostrůvků a hypofýzy. Typ II (MEN-II) je charakterizován medulárním karcinomem štítné žlázy, feochromocytomem a hyperparathyreózou. Typ III (MEN-III) je charakterizován mnohočetnými slizničními neuromy, medulárním karcinomem štítné žlázy a feochromocytomem.

Syndrom karcinoidu je obvykle způsobován tnetastazu jícím—intes~ti.-náJ^í.-m—k-a-rei-no-i-dem-,—který—secernuj_e— nadměrné množství vazoaktivních látek, včetně serotoninu, brádykininu, histaminu, prostaglandinů a polypeptidových hormonů. Abnormální hladiny těchto látek způsobují celou řadu příznaků, často záchvatovité zrudnutí kůže (flush), cyanózu, kolikovité bolesti v břiše, průjem a onemocnění srdečních chlopní.

Novotvary kostí a kloubů mohou být benigní nebo maligní. Benigní tumory kostí zahrnují osteochondromy (osteokartilaginózní exostózy), které jsou nej častější benigní kostní tumory u dětí mezi 10. až 20. rokem, benigní chondromy (které jsou lokalizované uvnitř kosti), které se vyskytují nej častěji u dětí a mladých dospělých mezi 10.' až 30. rokem, chondroblastom (který vzniká v epifýze), který j vzácný, ale nejčastější u dětí mezi 10. až 20. rokem, chondromyxoidní fibromy, osteoidní osteom, obrovskobuněčné tumory a fibromatózní léze. Primární maligní nádory kostní zahrnují osteogenní sarkom (osteosarkom), který je druhý nejčastější primární kostní nádor, fibrosarkomy, maligní fibrózní histiocytom, chondrosarkomy, mezenchymální chondrosarkomy, Ewingův nádor (Ewingův sarkom), maligní lymfom kostní, mnohočetný myelom a maligní obrovskobuněčný tumor.

Primární karcinomy jiných tkání mohou metastazovat do kostní tkáně. Nejčastější jsou karcinomy vznikající v prsu, plicích, prostatě, ledvinách a štítné žláze.

Novotvary centrálního nervového systému (CNS) se obecně třídí podle orgánu. Primární intrakraniální novotvar; jsou rozděleny do šesti skupin: tumory 1) lebky, 2) mening, \ 1-____· JL· T _ Λ — X, -,Α Λ \ 4 4

J ) JS..LČHiiaililUll UČIVU, M·) lit-U±Ug±XX Ct rrM-t -P/r rzi j hiebo epifýzy, a 6) kongenitálního původu. Novotvary lebky zahrnují osteom, hemangiom, granulom, xantom a osteitis rlo-r r»í<3T-« -ir^rroAlri-í n7ΓΛ-Γ tzq ▼’Χ ( nr o li O ť i WAri Ί ΓΊΠΊ t~\TYi

UVXUXlliaiib . ilk/lixiigu-axiix livjvutvuxj z-tniriiuj x jnc-nxiig J-C/IU , sark a glomatózu. Novotvary kraniálních nervů zahrnují gliom optického nervu a schwannom 8. a 5. kraniálního nervu. Novotvary neuroglií zahrnují gliomy a ependymomy. Novotvary hypofýzy nebo epifýzy zahrnují adenom hypofýzy a pinealom. Novotvary kongenitálního původu zahrnují kraniofaryngiom, chordom, germinom, teratom, dermoidní cystu, angiom a hemangioblastom.

Novotvary míchy jsou léze, které tísní míchu nebo její kořeny, vznikající z míšního parenchymu, kořenů, mening nebo obratlů. Primární novotvary míchy jsou mnohem méně běžné než intrakraniální tumory. Metastatické léze jsou běžné a mohou vznikat z karcinomů plic, prsu, prostaty, ledvin, štítné žlázy nebo lymfomů.

Novotvary močopohlavní soustavy se vyskytuj í v každém věku a u obou pohlaví, ale zodpovídají za přibližně 30 % karcinomů u mužů a 4 % u žen. Adenokarcinom prostaty významně přispívá k počtu malignit u mužů nad 50 let. Adenokarcinom prostaty má vztah k hormonům a jeho patologie je typicky glandulární. Karcinom ledvin, adenokarcinom, se podílí pouze přibližně jedním až dvěma procenty na

karcinomech dospělého věku, ale většina solidních tumorů ledvin je maligní. Vilmsův tumor, embryonální adenomyosarkom ledvin, se vyskytuje fetálně a často není diagnostikován po mnoho let. Novotvary pánvičky ledvinné a ureteru j sou histologicky podobné. Novotvary močového měchýře mohou být indukovány známými karcinogeny močové soustavy, jako jsou anilinová barviva, a nejběžnější je karcinom z přechodního οη-ί+αΐι, KA-vn/r /a rll o'zd π ηηίλΐ rn Αηπ v VaminniTi Γ\ΤΊ A í <1 T

U _l_ U- , 111 UVX-ilJ J Χ-» W -1-fc* Z « X* -U W-XA»-- x-» — novotvary močopohlavnlr~sOustavy~zahrnuj'í~karclnom^—uretry a penisu. Novotvary varlat jsou zodpovědné za většinu

Sni 4 < γ»1ί mo Ί t ijr. t t π ίΤϊΐΐ’Τ’ΐ® r%rtrl Ί PŤ VAi«iTri« TTS« Ί Ί ζτη 1

X^_U J- U11X VU1 111UA.-U -I- gixa. X- X*- *** X< ť » M- X> X* x* W x* w· · » w testikulárních tumorů vzniká z primordiální zárodečné buňky a třídí se podle postiženého buněčného typu.

Karcinom prsu je nejčastější karcinom u žen. V USA je kumulativní riziko pro ženy každého věku, že se u nich rozvine karcinom prsu, přibližně 10 %, ale riziko úmrtí na nemoc je pouze přibližně 3,6 %. Ale riziko stoupá s věkem, rodinnou anamnézou karcinomu prsu, expozici záření a do vyššího rizika zasahuje dokonce i dieta.

U karcinomů prsu se rutinně provádí analýza estrogenových a progesteronových receptorů. Přibližně dvě třetiny pacientek maji tumory prsu pozitivní na estrogenový receptor (EŘ+). Předpokládá se, že tumory, které jsou progesteron-pozitivní, mají funkční estrogenový receptor a výskyt obou receptorů poskytuje větší pravděpodobnost příznivé odpovědi na endokrinní léčbu než výskyt pouze jednoho receptorů. Endokrinní léčba, obvykle tamoxifenem, je výhodná u tumorů pozitivních na estrogenový receptor. Estrogeny a androgeny j sou také účinné, ale pro nežádoucí vedlej ší účinky vyvolané vyššími hladinami těchto hormonů jsou méně oblíbené než jiné formy endokrinní léčby. Karcinom

• · . ..i,:.#···'.··'' ''•.«rwehrt···*?

• ·

prsu může metastazovat do téměř každého orgánu v organismu, ale nejčastější místa metastáz jsou plíce, játra, kosti, lymfatické uzliny a kůže.

Lobulární karcinom in šitu (LCIS) nebo lobulární neoplázie se nejčastěji nachází u žen před menopauzou. Duktální karcinom in šitu (DCIS) se vyskytuje u obou skupin, žen před menopauzou i po ní. DCIS vytváří hmatatelnou masu.

LCIS a DCIS zodpovídají za přibližně 90 % všech karcinomů prsu. Vzácnější formy, medulární a tubulární léze, mají poněkud lepši prognózu.

Nejčastější gynekologické novotvary jsou endometriální karcinomy, které se řadí na čtvrté místo co do četnosti za karcinom prsu, kolorektální karcinom a plicní karcinom u žen. Endometriální karcinomy jsou charakterizovány svou klinickou klasifikací, pohybující se v rozmezí od stadia in šitu na stupni 0 do stadia metastáz do vzdálených orgánů na stupni IVB. Endometriální karcinomy typicky produkují estrogen a současné léčebné přístupy zahrnují chirurgický výkon a progesteronovou terapii.

Karcinomy vaječníků jsou zodpovědné za přibližně 18 % všech gynekologických novotvarů. Přibližně 80 % maligních ovariálních karcinomů vzniká z ovariálního epitelu a třídí se podle své histologie. Tumory mohu také vznikat ze zárodečných buněk nebo strornátu.

Karcinom vulvy je zodpovědný za přibližně 3 až 4 % všech gynekologických novotvarů. Karcinom vulvy se obvykle vyskytuje po menopauze, a přibližně z 90 % to je spinocelulární karcinom. Přibližně 4 % tvoří bazocelulární karcinomy a zbytek zahrnuje intraepiteliální karcinomy, • ·

adenokarcinom Bartholinské žlázy, fibrosarkom a melanom.

Vaginální karcinom zodpovídá přibližně za 1 % gynekologických malignit, s vrcholícím výskytem ve věku od 45 do 65 let. Přibližně 95 % vaginálních karcinomů jsou spinocelulární karcinomy. Primární karcinom vejcovodu je vzácný a typicky se šíří přímo nebo lymfatickými cévami.

Nemoci trof'obia'stu^—nebo^—novotvary—tTofoblrast-i-ekéhopůvodu mohou následovat po intrauterinním nebo extrauterinním těhotenství. Degenerativní těhotenství má za následek mola hydatidosa, která je v 80 % benigní.

Novotvary mohou vznikat ve zvukovodu a narušit sluch. Vznikají také ceruminomy, jsou typicky maligní navzdory histologicky benignímu obrazu a léčí se chirurgickým odstraněním. Bazocelulární a spinocelulární karcinomy se často vyvíjejí na zevním uchu jako důsledek pravidelné expozice slunci a jsou také typicky léčeny chirurgickým odstraněním. Střední ucho může být sídlem spinocelulárního karcinomu. Achromafinní paragangliomy mohou vznikat ve spánkové kosti.

Nejčastější maligní nádor nosu a vedlejších dutin nosních je spinocelulární karcinom, méně časté jsou adenoidní cystické a mukoepidermoidní karcinomy, maligní smíšené tumory, adenokarcinomy, lymfomy, fibrosarkomy, osteosarkomy, chondrosarkomy a melanomy.

Spinocelulární karcinom nosohltanu je nejčastěji pozorován u dětí a mladých dospělých.

Nejčastější malignity horních cest dýchacích jsou

spinocelulární karcinomy tonzil a hrtanu. Oba jsou častější u mužů a jsou spojovány s kouřením tabáku a požíváním ethanolu, přibližně 85 % pacientů s karcinomem hlavy nebo krku má anamnézu konzumace etanolu a tabáku.

Přibližně 90 % karcinomů hlavy a krku tvoří spinocelulární (epidermoidní) karcinom. Melanomy, lymfomy a sarkomy jsou relativně vzácné formy primárních karcinomů

Hlavy a krku.—Karcinomy—hlavy—a—krku—se—t-ř-í-d-í—pod-l-e-------velikosti a místa postižení primárním novotvarem, počtem a velikostí metastáz do krčních lymfatických uzlin a průkazem vzdálených metastáz.

Karcinomy oka mohou vznikat v kůži očních víček a mohu být benigní nebo neoplastické. Běžné benigní výrůstky jsou . xantelazmata, která jsou tvořena subkutánními žlutavě bílými plochými pláty lipidových látek. Bazocelulární karcinomy jsou častější, typické léčení je chirurgické odstranění nebo radiační terapie. Další méně časté maligní tumory jsou spinocelulární karcinomy nebo karcinomy Meibomových žláz a další typy melanomů. Nejčastější primární malignita oka je maligní melanom cévnatky.

Tumory také vznikají v kožní tkáni, a zahrnují benigní tumory, jako jsou mateřská znaménka, lipomy apod., a také maligní tumory. Přibližně 40-50 % maligních melanomů vzniká z melanocytů v mateřských znaménkách. Maligní karcinomy kůže jsou bud’ bazocelulární nebo spinocelulární karcinomy a často vznikají v oblastech kůže vystavované slunci. Jsou to nejčastější malignity a jejich výskyt stoupá. Méně časté malignity zahrnuji maligní melanom, Pagetovu chorobu bradavky nebo extramamární chorobu Patentovu, Kaposiho sarkom (KS) a kožní lymfom T buněk (mycosis fungoides).

··· · · · · · · · ··· ·· ··· ·· »· ♦·

Výskyt KS se zvyšuje jako důsledek zvýšeného výskytu AIDS. KS se vyskytuje u přibližně jedné třetiny pacientů s AIDS.

Karcinomy ústní dutiny jsou zodpovědné za přibližně 5 % karcinomů u mužů a 2 % karcinomů u žen. Nejčastější forma karcinomu ústní dutiny je spinocelulární karcinom. Výskyt stoupá s věkem a rizikovými faktory, zejména konžumací tabáku a alkoholu.

Chirurgický výkon je nej starší účinná forma léčení novotvarů. Úspěchu je velkou měrou dosaženo, jestliže je novotvar detekován ve svých časných stadiích a nemetastazoval, Radiace je také důležitá terapie a je to výhodná léčba mnoha novotvarů, jako je Hodgkinova choroba, časné stádium nehodgkinských lymfomů a spinocelulární karcinom hlavy a krku. Radiace je prokazatelně velmi úspěšná jako doplněk chirurgického výkonu a protinádorových léků.

V léčbě novotvarů jsou také použitelné protinádorové léky, které se třídí podle mechanismu působení. Prokázalo se, že obzvláště účinnou terapií jsou četné kombinace typicky protinádorových léků s odlišným mechanismem účinku, umožňují nižší dávkování a mnohdy minimalizují negativní vedlejší účinky. Protinádorové léky často zasahují do základních biologických procesů nezbytných pro buněčnou replikaci nebo růst.

Alkylační látky, jako mechloretamin a cyklofosfamid, alkyluji DNA a omezují replikaci DNA.

K antimetabolitům, které jsou cílené na rozvrácení metabolických drah nezbytných pro buněčné dělení, patří následující léky.

Antagonisté kyseliny listové se vážou na dihydrofolátreduktázu a interferují se syntézou pyrimidinu. Ántagonisté kyseliny listové jsou specifické pro S fázi. Velmi často používaný antagonista kyseliny listové je metotrexát.

Purinoví antagonisté blokují syntézu purinu de novo a j sou špěcif fcke pro S fúzi“ Přikladeni—purínovehoantagonisty je 6-merkaptopurin.

Antagonisté pyrimidinu interferují s thymidylát syntázou, tím snižují tvorbu thymidinu a jsou specifické pro S fázi. Často používaný antagonista pyrimidinu je

5-fluorouracil.

Cytarabin inhibuje DNA polymerázu a je specifický pro S fázi.

Rostlinné alkaloidy zahrnují vínka alkaloidy, jako je vinblastin a vinkristin, a podofylotoxiny, jako je etoposid. Rostlinné alkaloidy jsou účiriné v metafázi a inhíbují mitózu celou řadou mechanismů včetně změny mikrotubulúrních proteinů.

Antibiotika zahrnují doxorubicin a daunomycin, které se vmezeřují do DNA vláken a inhibuji rozvinutí DNA, bleomycin, který způsobuje zlomy DNA vláken a mitomycin, který inhibuje syntézu DNA tím, že působí jako bifunkční alkylační látka.

Mezi nitrózomočoviny patří karmustin a lomustin a alkylují DNA nebo karbamoylují aminokyseliny v proteinech.

	• ·	e · ·	• ·	··
• · ·	•	• · ·	•	•	·,	•	·.
• ·	•	• ·	•	•	•	•	•
						•
• ·	•	• ·'	•	•	•	•	•
• · ·	• *	··· ··		• ·			··

Anorganické ionty, jako cisplatina, se vmezeřuji do DNA vláken a mezi ně a inhibují rozvinutí DNA.

Látky ovlivňující biologickou odpověď, jako interferony, mají antiproliferační účinek, ale jejich specifická úloha není známa. Interferony zahrnují

Z 1 . Ir »-*- -r«4- O Z -p-i V» -*· T O C + Τ'τ'τ \ lliUClfCl Oll LI _l_Cí UN.UUJ UU V y / , Xli J- -L Lz-l- Uii p \ -L -L CZ-X. v/c/ -LfcXxZS uo v j / a interferon y (lymfocytový“)i iQfni

S-7 t“X x rmy r -i rt Ir r~* C! CZ Τ’ C! fr T“» O 1 Έ “Τ’ Ž3 i/ V% i 1 r? 1 \7 Ci Τ'» n Τ'* <T\

Í_LaA2L.^ 111^ , J UTtU CtbytÍJ- , j 5vzw I.CÍ1YV- ρ» _ι_ V p/j_x_z změny metabolických drah důležitých pro rakovinné buňky. Asparagináza vyčerpá asparagin, na kterém závisí leukemické buňky.

Hormony a jejich analogy, jako tamoxifen, flutamid a progesteron, mají nespecifické účinky, ale jsou použitelné pro léčbu určitých novotvarů, o kterých je známo, že jsou hormon-responzivní, zejména novotvary prsu, vaječníků a prostaty. Tamoxifen, často používaný v léčbě novotvarů prsu, nachází buňky v klidu a váže se na estrogenový receptor. Flutamid, .často používaný v léčbě novotvarů prostaty, se váže na androgenový receptor.

Cytokininy jsou přirozeně se vyskytující a syntetické regulátory růstu rostlin. Přirozené cytokininy mají tendenci k nespecifické inhibici různých proteinkináz. Molekulární mechanismy, kterými cytokininy regulují buněčný růst a dělení, ještě nebyly stanoveny. Studie naznačují, že cytokininy mohou zvyšovat dostupnost DNA templátu, aktivovat RNA polymerázu, ovlivňovat polyadenylaci a sekundární strukturu mRNA a stimulovat tvorbu a aktivitu polyribozomů. Předpokládá se, že cytokininy ovlivňují buněčné dělení • · prostřednictvím interakce s regulačními proteiny buněčného cyklu. Jak cytokininy, tak cyklin-dependentní kinázy (cdk) působí jako mnohočetné a podobné kontrolní body buněčného cyklu, například v přechodech G^/S a G^/M a S a M fázích.

Olomoucin, 6-(benzylamin)-2-[(2-hydroxyethyl)aminj-9-methylpurin, byl nejdříve vynalezen jako herbicid.

bjeveno, že olomoucin je syntetický cytokinin, kxr1<. ..

iNVuaviiu w ~který v miKromolárních^-koncentracích specificky—řnhírbuje-některé cdk, včetně p34^ct^^c2/cyklin B kinázy, ale nemá žádný

14-V, -I- UV Λ na dal •oteinkinázy, j akí ;AMPa cGMP-dependentní kinázy a proteinkinázu C. V současnosti bylo ukázáno, že olomoucin má dobrou selektivitu pro cdk-cyklin proteinkinázy, ale má pouze mírnou inhibiční aktivitu, s IC^Q přibližně 7 μΜ. (Veselý, J., a kol., Eur.

J. Biochem., 224, 771-786, 1994). Krystalová struktura olomoucinu o velikosti 2,4 Á po společné krystalizaci s cdk2 vedla ke zjištění, že purinová část olomoucinu se váže v konzervativní ATP vazebné kapse, zatímco benzylaminové skupiny se šíří do oblasti aktivního místa unikátního pro cdk2 kinázy.

Roskovitin, 2-(l-ethyl-2-hydroxyethylamin)-6-benzyl-amin-9-isopropylpurin, je nedávno syntetizovaný purin, u kterého bylo dokázáno, že má selektivitu pro některé cyklin-dependentní kinázy a co se týče cdk2 a cdc2 je desetkrát aktivnější než olomoucin (Meijer, L., a kol., Eur. J. Biochem., 243, 527 -536, 1997, a PCT/FR96/01905). Meijer a kol. publikovali, že většina kináz není významně inhibována roskovitinem. Ale cdc2-cyklin B, cdk2-cyklin A, cdk2-cyklin E a cdk5-p35 jsou podstatně inhibovány IC^q o hodnotách 0,65, 0,7, 0,7 a 0,2 μΜ, v daném pořadí. Na rozdíl od toho, roskovitin projevoval hodnoty IC^q větší než

• '· ·	* .♦·	99
• · ·	• · ·	.· 9 9
• » ·	• · '·	’9 -9 '9
«·· ··	··· 99	9 «

100 μΜ pro cdk4-cyklin Dl a cdk6-cyklin D2.

Havlicek a kol. (J. Med. Chem., 40, 408-412, 1997) publikovali, že roskovitin a příbuzné analogy substituované v pozicích 2, 6 a/nebo 9 inhibují p34^ct^^c2-cyklin B kinázy. Žádný z analogů nemá vyšší hodnoty IC^q než (R) enantiomer roskovitinu, který má hodnotu IC^q 0,2 μΜ. (S) enantiomer má hodnotu IC.-n 0.8 uM. racemická směs (R/S) má hodnotu IC_cn

O V ' '

-0—65μ-Μ-—T-i-t-o—a-u-t-oř-i—u-z-a-v-ře-l-i-j—že—N——benz-y-l-ov-ý—subs-t-i-t-uen-troskovitinu je lepši než isopentenylový nebo cyklohexylmethylový substituent.

National Cancer Institute (NCI) je organizace řízená vládou Spojených Států zaměřená na objevování a vývoj nových terapeutických produktů pro onkologii. V roce 1985 NCI ustanovila novou strategii pro screening rakoviny týkající se lidských nádorových buněčných linií pro in vitro testy jako primární screening rakoviny. Celkový počet šedesáti lidských nádorových buněčných linií, pocházejících ze sedmi typů karcinomu (karcinomu plic, tračníku, melanomu, karcinomu ledvin, vaječníků, mozku a leukémie), bylo vybráno pro zahrnutí do panelu NCI (Gréver, M.R., a kol., Seminářs in Oncology, 19, 622-638, 1992). Také protokoly použité v těchto testech byly v literatuře publikovány. Americká sbírka mikroorganismů a tkáňových kultur (American Type Tissue Collection, ATCC) působí jako depozitář pro tyto a další nádorové buněčné linie. Použitelné lidské nádorové buněčné linie zahrnují následující:

MCF7 : lidský adenokarcinom prsu, hormon-dependentní, MDA-MB-231: lidský adenokarcinom prsu, hormon-independentní, HT-29: lidský adenokarcinom tračníku, průměrně dobře diferenciovaný stupeň II,

HCT-15: lidský adenokarcinom tračníku,

·' ·· ·,' *· ·· '·· •» * · · · · · > % · · · • * · φ · · · · · · • · ·· · · · · ·» · · · · • · · · · · ·'·'·» :· · · ·· ··· «· ·· ··

DU 145: lidský karcinom

Skehan, P. a kol. 1107-1112, 1990) zavedl

Ί 4 τ íiauuiuvyuii uuiíwiiVvh

A549: lidský nemalobuněčný karcinom plic,

DMS-114: lidský malobuněčný karcinom plic,

PC-3: lidský adenokarcinom prostaty, hormon-independentni, a prostaty, hormon-independentni.

(J. Nati. Cancer Inst., 82, vhodné protokoly pro použití těchto

Ti cpregníno nrnt -i n á d nrnvvrb —---------- --TeRui

Meijer a kol. (viz. výše) publikovali, že roskovitin inhibuje proliferaci při in vitro screeningu orientovaného na NCI nemoci, to znamená 60 lidských nádorových buněčných linií obsahujících devět nádorových typů (leukémie, nemalobuněčný karcinom plic, karcinom tračníku, karcinom centrálního nervového systému, melanom, karcinom vaječníků, karcinom ledvin, karcinom prostaty, karcinom prsu) s průměrnou hodnotou IC^q 16 μΜ. Výsledky jednotlivých nádorových linií nebyly publikovány.

Dva odlišné inhibitory cdk, flavopiridol a olomoucin, potlačují smrt nervových buněk PC-12 a sympatických neuronů ve dvou modelových systémech přežívání neuronů (Park a kol., J. Biol. Chem., 271, 14, 8161-8169, 1996). Koncentrace každého inhibitoru požadovaná pro podporu přežívání korelovala s množstvím nezbytným pro inhibici proliferace. Apoptóza neuronů je důležitý aspekt jak pro vývoj nervového systému, tak jako složka neuronového poranění a onemocnění.

Buněčná linie PC-12 původně pochází z medulárního feochromocytomu nadledvin laboratorního potkana. Když jsou pěstovány v médiu obsahujícím sérum, buňky PC-12 se dělí a připomínají prekurzory adrenálních chromaffinních buněk rλϊ/· a sympatických neuronů. Po přidání nervového růstového faktoru (NGF) získávají buňky PC-12 fenotypové vlastnosti sympatických neuronů. Po odstranění buď séra nebo séra a NGF, obojí buňky PC-12, jak nestimulované, tak neuronově diferencované, prodělají apoptózu, což je analogické s odpovědí sympatických neuronů.

Úloha regulace buněčného cyklu v apoptóze může být znázorněna odstraněním NGF nebo séra, což má za následek nekoordinovanou progresi buněčného cyklu a smrt buněk u nestimulovanycn ounex rC-iz. inhibitory cdk nezabrani smrti těchto proliferačně kompetentních nestimulovaných buněk PC-12 po odstraněni trofického faktoru. Existuje hypotéza, že post-mitoticky diferencované nebo sympatické neurony usilují o nenáležitý opětný vstup do buněčného cyklu po odnětí NGF, což má za následek buněčnou smrt. Ale expozice flavopiridolu nebo olomoucinu, které inhibují cdk, zabraňuje apoptóze v těchto buňkách.

Změny v aktivitě cdk a cyklinů jsou pozorovány během apoptózy mnoha odlišných buněčných typů. Apoptóza buněk HL60 indukovaná kamptotecinem nebo araC je spojena se zvýšenou aktivitou cdc2 a kinázovou aktivitou sdruženou s cyklinem E. Apoptóza indukovaná kamptotecinem buněk RKO je spojena se zvýšením exprese cyklinu Dl.

Kamptotecin vyvolává apoptózu cerebrálních kortikálních neuronů u laboratorního potkana (Morris a Geller, J. Cell Biol., 134, 757-770, 1996). Kamptotecinem ošetřené neproliferující neuronově diferencované buňky PC-12 odumřely během 6 dnů po ošetření a kultivované sympatické neurony laboratorního potkana odumřely během 5 dnů po ošetření, dokonce i v přítomnosti NGF (Park a kol.,

» '··		• ··			··	··
«· ·	·.	* · ·	•	4	•	•	•
• ·	•	• ·	•	•	•	•	•
							•
• ·	•	• ·	•	•	•	•	•
v· · · · ·		··· ··			• 4'	··

J. Neurosci., 17(4), 1256-1270, 1997). Ale podávání buď obou dohromady, nebo jednotlivého olomoucinu či flavopiridolu, v přítomnosti nebo nepřítomnosti kamptotecinu, mělo za následek přibližně 30 % buněčnou úmrtnost v 6. den.

Maximální ochrana buněk PC-12 nebo sympatických neuronů laboratorního potkana před smrtí byla pozorována u 1 μΜ flavopiridolu a 200 μΜ olomoucinu, což jsou minimální koncentrace, které zcela inhibují syntézu DNA proliferujícch buněk PC^12i Podávaní i“So~ol.Omoucinu~ inaktrvní-ho^-analoguolomoucinu, buněčné smrti nervových buněk ošetřených kamptotecinem nezabránilo.

Bylo také dokázáno, že flavopiridol a olomoucin ochraňuj i kortikální neurony před odumřením indukovaném kamptotecinem (Park a kol., J. Neurosci., 17(4), 1256-1270, 1997). Hodnoty IC^q pro flavopiridol a olomoucin byly 0,1 μΜ a 100 μΜ, v příslušném pořadí. Podávání iso-olomoucinu buněčné smrti nervových buněk ošetřených kamptotecinem nezabránilo.

Z výše uvedených pozorování vyplývá několik důsledků. Připouští se, že pacienti léčení radiací nebo protinádorovými přípravky prodělávají nežádoucí vedlejší účinky, včetně rozvoj e nových novotvarů nebo nežádoucí buněčné apoptózy. Například u některých pacientů léčených vysokými dávkami araC pro refrakterní leukémii se rozvíjí cerebelární toxický syndrom, charakterizovaný ztrátou Purkyněho neuronů (Vinkelman a Hinges, Ann. Neurol., 14, 520-527, 1983, a Vogel a Horouipian, Cancer, 71, 1303-1308, 1993). Bylo publikováno že u pacientů léčených cisplatinou se rozvinuly periferní neuropatie (Vallach, a kol., J. Fla. Med. Assoc., 79, 821-822, 1992, a Mansfield a Castillo, AJNR Am. J. Neuroradiol., 15, 1178-1180, 1994). Se zřetelem na • ·« ·♦ -·· '· · · · '♦ · · · • · · · · · · tato pozorování společné nebo samotné podávání sloučenin podle předkládaného vynálezu pro léčbu novotvarů bude snižovat nebo znemožňovat buněčnou apoptózu, obzvláště neuronové poškození způsobené léčbou protinádorovými přípravky nebo radiací.

Cerebrovaskulární onemocněni je nejčastější příčina iivur j-h v t* v zápEtúnxcbi 2sinxcti. HT&vtix specifické^-typy cerehrovaskulrárníhO^-onemocnění—jsoucerebrální insuficience způsobená přechodnými poruchami průtoku krve, infarktem, krvácením a arteriovenóznírai malformacemi. Vaskulární příhoda mozková (mrtvice) označuje ischemické léze. U cerebrovaskulárního onemocnění se objevuje nežádoucí neuronová apoptóza. Léčení inhibitory cdks může být cesta k tomu, jak v těchto případech zabránit neuronovému poškození a degeneraci.

Podstata vynálezu

Vynález se týká nových sloučenin obecného vzorce I:

ve kterém:

R je vybrán ze skupiny zahrnující R2, R2NHa H₂N-R3-, ve kterých:

R2 j e vybrán ze skupiny zahrnuj icí alkylovou skupinu obsahující 1 až 8 atomů uhlíku a skupinu obecného

vzorce

R4

I —(C)n-7.

I

R4 'vc kXcrcm z

Z je vybrán ze souboru zahrnujícího fenylovou skupinu, heterocyklickou skupinu a cykloalkylovou skupinu,

R4 Kti^dy j sduuTXive znamena navzájem na jza _sie atom vodíku nebo alkylovou skupinu obsahuj ící 1 až 4 atomy uhlíku, a n je celé číslo 1 až 8, přičemž každá z uvedených alkylových skupin obsahujících 1 až 8 atomů uhlíku a Z je případně substituována jedním až třemi substituenty, které mohou být stejné nebo rozdílné a jsou vybrány ze souboru zahrnujícího Hal, OH a alkylovou skupinu obsahující 1 až 4 atomy uhlíku,

R3 představuje alkylenovou až 8 atomů uhlíku, a skupinu obsahuj ící

R1 je vybrán ze souboru zahrnujícího cyklopentylovou skupinu a isopropylovou skupinu, a farmaceuticky přijatelných solí, optických isomerů a hydrátů odvozených od těchto sloučenin.

Vynález se rovněž týká způsobu inhibování progrese buněčného cyklu. Konkrétně se vynález týká způsobu inhibování cdk-2.

<· ·

Předmětný vynález se rovněž týká způsobu prevence apoptozy v nervových buňkách. Zvláště výhodnou metodou podle předmětného vynálezu je prevence apoptozy nervových buněk vyvolaná antineoplastickými činidly nebo která je výsledkem cerebrovaskulárního onemocnění. Další výhodnou metodou podle předmětného vynálezu je metoda prevence apoptozy vyvolaná kyslíkovou deplecí. Podle ještě výhodnějšího provedení preŮmeTCny-vynádjez—poskytuje—metodu—met-odu—prevence—apopiozy_ vyvolané cerebrovaskulárním onemocněním. Dalším výhodným provedením podle vynálezu je metoda prevence apoptozy vyvolané mrtvicí nebo infarktem.

Předmětný vynález se týká metody inhibování vývoje novotvarů. Předmětný vynálezu rovněž poskytuje metodu léčení pacienta postiženého neoplastickým onemocněním, při kterém se podává sloučenina výše uvedeného obecného vzorce. Ve výhodném provedení je podávané množství této sloučeniny terapeuticky účinným množstvím této sloučeniny. Ve výhodném provedení metoda podle předmětného vynálezu zahrnuje podávání jediné sloučeniny výše uvedeného obecného vzorce.

V alternativním provedení výhodná metoda podlé předmětného“ vynálezu zahrnuje podávání dávky sloučeniny výše uvedeného obecného vzorce ve spojení s jiným antineoplastickým činidlem.

Kromě toho se předmětný vynález týká prostředku obsahujícího stanovitelný podíl sloučeniny obecného vzorce I ve směsi nebo v jiné kombinaci s inertním nosičovým materiálem. Předmětný vynález se rovněž týká farmaceutického prostředku obsahujícího účinné inhibiční množství sloučeniny obecného vzorce I ve směsi nebo v jiné kombinaci s jedním nebo více farmaceuticky přijatelnými nosičovými materiály

nebo excipienty.

Vynález se týká nových sloučenin obecného vzorce I:

R je vybrán ze skupiny zahrnující R2, R2NHa H₂N-R3-, ve kterých:

R2 je vybrán ze skupiny zahrnující alkylovou skupinu obsahující 1 až 8 atomů uhlíku a skupinu obecného vzorce

R4

I —(C)n-7

I

.....................- -..........R4.......................:........................

ve kterém :

R4 každý jednotlivé znamená navzájem na sobě nezávisle atom vodíku nebo alkylovou skupinu obsahující 1 až 4 atomy uhlíku, a n je celé číslo 1 až 8, přičemž každá z uvedených alkylových skupin

9 ·9 • 9 9	•	9 <9 9 9	99 9	9	99 9	•9 9 9	9
• 9	9	9 9	9	9	9	9	9
							9
• ·	9	9 -9	.9	9	9	9	9
'·· · · 9		• 99	9 9		9 9	99

obsahujících 1 až 8 atomů uhlíku a Z je případně substituována jedním až třemi substituenty, které mohou být stejné nebo rozdílné a jsou vybrány ze souboru zahrnujícího Hal, OH a alkylovou skupinu obsahující 1 až 4 atomy uhlíku,

R3 představuje alkylenovou skupinu obsahující 1 až 8 atomů uhlíku, a

-Ri—je^-vybrán—ze—souboru—zahmující-ho—cyklopentylovouskupinu a isopropylovou Skupinu, a farmaceuticky přijatelných soli, optických isomerů a hydrátů odvozených od těchto sloučenin.

Do rozsahu výše uvedených sloučenin výše uvedeného obecného vzorce I patří rovněž i nové sloučeniny obecného vzorce Ia:

(Ia) ve kterém:

R znamená R2, přičemž:

R2 představuje alkylovou skupinu obsahující 1 až 8 atomů uhlíku případně substituovanou jedním až třemi substituenty, které mohou být stejné nebo rozdílné a které j sou vybrány ze souboru zahrnuj ícího Hal, OH a alkylovou skupinu obsahující 1 až 4 atomy uhlíku, tf ·« » ·♦ ·· · · ·· ·

9 9 · 9

99 • 9 9 9

9 9 9

99 • · · · · ·«· ·· 999 «·

R1 je vybrán ze souboru zahrnujícího cyklopentylovou skupinu a isopropylovou skupinu, a farmaceuticky přijatelné soli, optické isomery a hydráty odvozené od těchto sloučenin.

Do rozsahu výše uvedených sloučenin výše uvedeného obecného vzorce I patří rovněž i nové sloučeniny obecného 'vzorce Tb: ----

db) ve kterém:

R znamená R2, přičemž:

R2 představuje skupinu obecného vzorce:

R4 —(C)n-Z

I

R4 ve kterém :

Z znamená fenylovou skupinu případně substituovánou jedním až třemi substituenty, které mohou být stejné nebo rozdílné a které jsou vybrány ze souboru zahrnujícího Hal, OH a alkylovou skupinu obsahující 1 až 4 atomy uhlíku,

R4 každý jednotlivě navzájem na sobě nezávisle představuje atom vodíku nebo alkylovou skupinu obsahující 1

• · A • ·	*· • •	• A* AA * · • · ♦	·> A · A
A «	•
• ·		A ♦ ♦	• »	A
AAA	< A	®A A « »	AA

až 4 atomy uhlíku, a n je celé číslo 1 až 8,

Do rozsahu výše uvedených sloučenin výše uvedeného obecného vzorce I patří rovněž i nové sloučeniny obecného vzorce Ic:

ve kterém:

R znamená R2, přičemž:

R2 představuje skupinu obecného vzorce:

R 4 —(C)n-7

R4 ve kterém :

Z znamená heterocyklickou skupinu případně substituovánou jedním až třemi substituenty, které mohou být stejné nebo rozdílné a které jsou vybrány ze souboru

obsahujíci 1 az 4 atomy zahrnujícího Hal, OH a alkylovou skupinu obsahující 1 až 4 atomy uhlíku,

R4 každý znamená navzájem na sobě nezávisle atom vodíku nebo alkylovou skupinu uhlíku, a n je celé číslo 1 až 8,

RI jd VyUlTžtll ouuuuxu skupinu a isopropylovou skupinu, lahrnuiícího cyklonentvlovou a farmaceuticky přijatelné so odvozené od těchto sloučenin.

optické isomery a hydrátv

Do rozsahu výše uvedených sloučenin výše uvedeného obecného vzorce I patří rovněž i nove sloučeniny obecného vzorce Id:

.......R1 ve kterém:

R znamená R2, přičemž:

R2 představuje skupinu obecného vzorce:

R4

I —(C)n-T

I

R4

	- 41 -	• · · * · · » • · · • · Φ	♦ ♦·♦ ·♦ · ♦ • · ·	• · · · ♦ · · · • · · «
		• · · · ·	·· · ··	·· ·· ~

ve kterém :

Z znamená cykloalkylovou skupinu případně substituovánou jedním až třemi substituenty, které mohou být stejné nebo rozdílné a které jsou vybrány ze souboru zahrnujícího Hal, OH a alkylovou skupinu obsahující 1 až 4 atomy uhlíku,

R4 každý jednotlivě navzájem na sobě nezávisle znamená atom vodíku nebo alkylovou skupinu obsahuj ící 1 až 4 atomy uhlíku, a n je celé číslo 1 až 8,

Do rozsahu výše uvedených sloučenin výše uvedeného obecného vzorce I patří rovněž i nové sloučeniny obecného vzorce Ia’:

ve kterém:

R znamená R2NH-, přičemž:

R2 představuje alkylovou skupinu obsahující 1 až 8 atomů uhlíku případně substituovanou jedním až třemi substituenty, které mohou být stejné nebo rozdílné a které

4» ·· ·· ·· * · ^ · · · · · • · · · · · « • · 9 9 9 9 9 9

9 9 9 9 9 9

9 9 9 9 9 9 9 jsou vybrány ze souboru zahrnujícího Hal, OH a alkylovou skupinu obsahující 1 až 4 atomy uhlíku,

R1 je vybrán ze souboru zahrnujícího cyklopentylovou skupinu a isopropylovou skupinu, a farmaceuticky přijatelné soli, optické isomery a hydráty οό ΐέοΓίΧο S-Louóonín_?

Do rozsahu výše uvedených sloučenin výše uvedeného obecného vzorce I patří rovněž i nové sloučeniny obecného vzorce Ib’ :

ve kterém:

______________R znamená R2NH-, přičemž:

R2 představuje skupinu obecného vzorce:

R4

-(C)n-Z

I

R4 ve kterém :

Z znamená fenylovou skupinu případně substituovánou jedním až třemi substituenty, které mohou být stejne nebo rozdílné a které jsou vybrány ze souboru zahrnujícího Hal, '•2<* 43

OH a alkylovou skupinu obsahující 1 až 4 atomy uhlíku,

R4 každý jednotlivě navzájem na sobě nezávisle představuje atom vodíku nebo alkylovou skupinu obsahující 1 až 4 atomy uhlíku, a n je celé číslo 1 až 8,

R1 je vybrán ze souboru zahrnujícího cyklopentylovou skupinu u isopropylovou skupinu, a farmaceuticky přijatelné soli, optické isomery a hydráty

S1

Do rozsahu výše uvedených sloučenin výše uvedeného obecného vzorce I patří rovněž i nové sloučeniny obecného vzorce Ic’:

ve kterém:

R znamená R2NH-, přičemž:

R2 představuj e skupinu obecného vzorce:

R4

I

-(C)n-7.

I

R4

- _)-1J /«giai·:

ve kterém :

Z znamená heterocyklickou skupinu případně substituovánou jedním až třemi substituenty, které mohou b stejné nebo rozdílné a které jsou vybrány ze souboru zahrnuj ícího Hal, OH a alkylovou skupinu obsahuj ící 1 až 4 atomy uhlíku,

R4 každý znamená navzájem na sobě nezávisle atom vodíku nebo alkylovou skupinu obsahuj ící 1 až 4 atomy uhlíku, a n je celé číslo 1 až 8,

Do rozsahu výše uvedených sloučenin výše uvedeného obecného vzorce I patří rovněž i nové sloučeniny obecného vzorce Id’ :

ve kterém:

R znamená R2NH-, přičemž:

R2 představuj e skupinu obecného vzorce:

• · ·· ··· #·

R4 l ₇ —(C)n-TI

R4 ve kterém :

Z znamená cykloalkylovou skupinu případně ___1_ _ ___ _ - £. __ _ _ _ _! _ -J -£ —. —. -M. 2£, —w Λ I» i-· -*» -í -4- · w ·» t 1»- -+- X—» O »r» X—*T-* i

5UĎS Li lUUVaílUU JCUllllll ČXZ. Licím ĎUUa LI LUCii LJ¹ , KUt>tL· liiuiiuu uj stejné nebo rozdílné a které jsou vybrány ze souboru zahrnuj icího Hal, OH a alkylovou skupinu obsahuj ící 1 až 4

a.t Omy Ui! i Ϊ KU ,

Do rozsahu výše uvedených sloučenin výše uvedeného obecného vzorce I patří rovněž i nové sloučeniny obecného vzorce Ie:

R1 fle)

- 46 ve kterém:

R znamená H₂N-R3-, přičemž:

R3 představuje alkylenovou skupinu, a R1 je vybrán ze souboru zahrnujícího cyklopentylovou skupinu a isopropylovou skupinu, a farmaceuticky přijatelné soli, optické rsomery a hydráty ‘ U */< 3. L LC-Llli-Ll odvozené od těchto sloučenin.

V popisu předmětného vynálezu byl pí heterocyklická skupina nebo heterocyklus, přičemž tímto termínem se míní libovolný zbytek s uzavřeným kruhem, ve kterém jeden nebo více atomů v kruhu představuje prvek jiný než atom uhlíku, přičemž mezi tyto zbytky je možno bez jakéhokoliv omezování zařadit piperidinylovou skupinu, pyridinylovou skupinu, isoxazolylovou skupinu, tetrahydrofuranylovou skupinu, pyrrolidinylovou skupinu, morfolinylovou skupinu, piperazinylovou skupinu, benzimidazolovou skupinu, thiazolylovou skupinu, thiofenylovou skupinu, furanylovou skupinu, indolylovou skupinu, 1,3-benzodioxolylovou skupinu, tetrahydropyranylovou skupinu, imidazolylovou skupinu, tetrahydrothiofenylovou skupinu, pyranylovou skupinu, dioxanylovou skupinu,' pyrrolylovou skupinu, pyrimidinylovou skupinu, pyrazinylovou skupinu, triazinylovou skupinu, oxazolylovou skupinu, purinylovou skupinu, chinolinylovou skupinu a isochinolinylovou skupinu.

Termínem alkylová skupina obsahující 1 až 4 atomy uhlíku se v textu předmětného vynálezu míní nasycená nebo nenasycená uhlovodíková (hydrokarbylová) skupina s přímým nebo rozvětvený, řetězcem obsahující jeden až čtyři atomy

—4'-6'6'---— 4— · « · · · · · • · · * uhlíku, přičemž mezi tyto skupiny je možno zařadit, ovšem bez jakéhokoliv omezováni pouze na tyto skupiny, methylovou skupinu, ethylovou skupinu, propylovou skupinu, isopropylovou skupinu, 1-propenylovou skupinu,

2- propenylovou skupinu, n-butylovou skupinu, isobutylovou skupinu, terciární butylovou skupinu, sekundární butylovou skupinu, 1-butenylovo.u skupinu, 2-butenylovou skupinu,

3- butenylovou skupinu a podobné další skupiny.

Termínem alkylová skupina obsahující 1 až 8 atomů uhlíku se v textu předmětného vynálezu míní nasycená nebo nenasycená uhlovodíková (hydrokarbylová) skupina s přímým nebo rozvětveným řetězcem obsahující jeden až osm atomů uhlíku, přičemž mezi tyto skupiny je možno zařadit, ovšem bez jakéhokoliv Omezování pouze na tyto skupiny, methylovou skupinu, ethylovou skupinu, propylovou skupinu, isopropylovou skupinu, 1-propenylovou skupinu,

2- propenylovou skupinu, n-butylovou skupinu, isobutylovou skupinu, terciární butylovou skupinu, sekundární butylovou skupinu, 1-butenylovou skupinu, 2-butenylovou skupinu,

3- butenylovou skupinu, pentylovou skupinu, neopentylovou skupinu, hexylovou skupinu, heptyLovou skupinu,oktylovou skupinu a podobné další skupiny.

Termínem alkylenová skupina obsahující 1 až 8 atomů uhlíku se v textu předmětného vynálezu míní nasycená nebo nenasycená hydrokarbylenová skupina s přímým nebo rozvětveným řetězcem obsahující jeden až osm atomů uhlíku, přičemž mezi tyto skupiny je možno zařadit, ovšem bez jakéhokoliv omezování pouze na tyto skupiny, methylenovou skupinu, ethylenovou skupinu, propylenovou skupinu, isopropylenovou skupinu, 1-propenylenovou skupinu,

2-propenylenovou skupinu, n-butylenovou skupinu, ··

isobutylenovou skupinu, terciární butylenovou skupinu, sekundární butylenovou skupinu, l-butenylenovou skupinu,

2-butenylenovou skupinu, 3-butenylenovou skupinu, pentylenovou skupinu, neopentylenovou skupinu, hexylenovou skupinu, heptylenovou skupinu, oktylenovou skupinu a podobné další skupiny.

Termínem cykloalkylová skupina se v textu předmětného vynálezu míní nasycená—nebo—nenasycená----alicyklická část obsahující tři až osm atomů uhlíku, přičemž mezi tyto skupiny je možno zařadit, ovšem bez jakéhokoliv omezování pouze na tyto skupiny, cyklopropylovou skupinu, cyklobutylovou skupinu, cyklopentylovou skupinu, cyklohexylovou skupinu, cykloheptylovou skupinu, cyklooktylovou skupinu a podobné jiné skupiny.

Textu předmětného vynálezu použitým termínem Hal nebo halogen se míní halogenová skupina, přičemž mezi tyto skupiny je možno zařadit fluorové, chlorové, bromové a jodové části.

V textu předmětného vynálezu je použit termín ”optický isomer nebo optické isomery, přičemž tímto termínem se míní libovolná stereo-isomerní konfigurace, která může existovat v případě dané sloučeniny obecného vzorce I.

V textu předmětného vynálezu je použit termín hydrát nebo hydráty, přičemž tímto termín se míní reakční produkt jedné nebo více molekul vody se sloučeninou obecného vzorce

I, ve kterém vazba H-OH není rozštěpena a mezi tyto produkty patří monohydráty a rovněž tak i multihydráty.

V textu předmětného vynálezu je použit termín

farmaceuticky přijatelné soli, přičemž tímto termínem se míní reakčni produkt jedné nebo více molekul jedné nebo více molekul libovolné netoxické kyseliny se sloučeninou obecného vzorce I. Jako ilustrativní příklad anorganických kyselin, které jsou vhodné pro přípravu vhodných solí je možno uvést kyselinu chlorovodíkovou, kyselinu bromovodíkovou, kyselinu sírovou a kyselinu fosforečnou a soli kyseliny s kovem, jako je například monohydrogenfosforečnan sodný a hydrogensíran draselný.—Jako^-irbustrati-vní—příklad organických_kys£lin.,_ které tvoří vhodné soli se sloučeninami podle předmětného vynálezu, je možno uvést mono-, di- a trikarboxylové kyseliny. Jako ilustrativní příklad těchto kyselin je možno uvést například kyselinu octovou, kyselinu glykolovou, kyselinu mléčnou, kyselinu pyrohroznovou, kyselinu malonovou, kyselinu jantarovou, kyselinu glutarovou, kyselinu fumarovou, kyselinu jablečnou, kyselinu vinnou, kyselinu citrónovou, kyselinu askorbovou, kyselinu maleinovou, kyselinu hydroxymaleinovou, kyselinu bezoovou, kyselinu hydroxybenzoovou, kyselinu fenyloctovou, kyselinu skořicovou, kyselinu salicylovou, kyselinu

2-fenoxybenzoovou, a kyseliny sulfonové, jako je například kyselina methansulf oriová, kyselina' trifluormethansulfonová a kyselina 2-hydroxyethansulfonová.

Výše uvedené sloučeniny obecného vzorce I je možno připravit za použití metod a technických prostředků všeobecně známých pro odborníky pracující v daném oboru z dosavadního stavu techniky. Obecné schéma postupu syntetické přípravy těchto sloučenin je uvedeno dále jako Schéma A, přičemž v tomto schématu všechny substituenty, pokud nebude výslovně uvedeno jinak, mají stejný význam jako bylo uvedeno shora.

Schéma

C I

O stupeň b

Cl

R'-OH 2 c i

stupen

H R

H-N-

stupeň c •NH.

NHR

Podle tohoto Schématu A, ve stupni (a) se do reakce uvádí 2,6-dichlorpurin vzorce 1 se vhodným alkoholem obecného vzorce 2, přičemž se získá odpovídající 9-substituovaná-2,6-dichlorpurinova sloučenina, která ma obecný vzorec 3, přičemž šě použije pro odborníky v daném oboru běžných a obecně známých metod z dosavadního stavu techniky.

Například je možno uvést, že 2,6-dichlorpurin vzorce 1 je možno uvést do reakce se vhodným alkoholem obecného vzorce 2 v přítomnosti trifenylfosfinu a diethylazodikarboxylátu ve vhodném bezvodém aprotickém rozpouštědle, jako je například tetrahydrofuran. Tyto reakční složky se obvykle promíchávají společně při teplotě místnosti po dobu v rozmezí od 5 hodin do 5 dni. Takto získaný výsledný 9-substituovaný-2,6-dichlorpurin obecného

222

vzorce 3 je možno oddělit z reakčniho prostředí extrakčními metodami, což jě běžně používaný postup z dosavadního stavu techniky, nebo je možno použít obvyklejší metody a sice výsledný 9-substituovaný-2,6-dichlorpurin obecného vzorce 3 oddělit odstraněním rozpouštědla, načež potom následuje přímé převedení produktu do kolony naplněné silikagelem a eluováni vhodným rozpouštědlem, jako je například methylenchlorid nebo směs rozpouštědel, jako je například směs hexanu a etKylacetátux Surový —

9-substituovaný-2,6-dichlorpurin obecného vzorce 3 je možno potom přečistit chromatografiekou metodou nebo je možno jej použít pro další postup bez čištění.

Ve stupni (b) se 6-chlor-funkční skupina tohoto 9-substituovaného-2,6-dichlorpurinu obecného vzorce 3 uvede do reakce se vhodným aminem obecného vzorce 4, přičemž se získá odpovídající 9-substituovaná-6-amino-2-chlorpurinová sloučenina obecného vzorce 5.

Například je možno uvést, že 9-substituovaný-2,6-dichlorpurin obecného vzorce 3 je možno uvést do reakce se vhodným aminem obecného vzorce 4 ve vhodném bezvodém polárním rozpouštědle, jako je například methanol. Tyto reakční složky se v obvyklém provedení společně promíchávají při teplotě varu pod zpětným chladičem po dobu v rozmezí od 30 minut do -3 dní. Takto získaný výsledný

9-substituovaný-6-amino-2-chlorpurin obecného vzorce 5 se potom odstraní z reakčniho prostředí extrakčními metodami, které jsou v tomto oboru z dosavadního stavu techniky běžně známy, nebo v případě, že se tento 9-substituovaný-6-amino-2-chlorpurin obecného vzorce 5 vysráží z roztoku, je možno jej oddělit filtrací.

Ve stupni (c) 2-chlor-funkční skupina tohoto 9-substituovaného-6-amino-2-chlorpurinu obecného vzorce 5 reaguje s 1,4-cyklohexandiaminem obecného vzorce 6, přičemž se získá sloučenina obecného vzorce I.

uvést du reakce s molar

Například je možno uvést, že se vhodný 9-substituovaný-6-amino-2-chlorpurin obecného vzorce 5 může lim nřebvtke™ 1 4-cvklohexandiaminu

Γ J ⁷ ·/ obecného vzorce 6. Tytoreakčnísložky—se—obvykle umístí v tlakové trubici, která se utěsní a zahřeje na teplotu

150 °C do dobu rozmezí od asi 80 °C do pohybuj ící se v rozmezí od 30 minut do 3 dní. Takto získaná sloučenina obecného vzorce I se oddělí z reakčního prostředí extrakčními metodami, které j sou v tomto oboru z dosavadního stavu techniky známé, načež je možno získaný produkt přečistit chromatografickou metodou.

Výchozí materiály, které se používají v tomto obecném schématu A pro syntetickou přípravu sloučenin podle vynálezu, jsou pro odborníky pracující v daném oboru snadno dostupné.

Příklady provedení vynálezu

V následujících příklad bude předmětný vynález blíže objasněn s pomocí konkrétních příkladů provedení, které jsou ovšem pouze ilustrativní a nijak neomezují rozsah tohoto vynálezu. V těchto příkladech budou sloučeniny připravovovány syntetickým postupem odpovídajícím schématu A. V těchto příkladech g znamená gramy, mmol znamená milimoly, ml znamená mililitry, bp znamená teplotu varu, °C znamená stupně Celsia, mm Hg znamená milimetry rtuťového sloupce, μΐ znamená mikrolitry, pg znamená

SES

mikrogramy a μΜ znamená mikromolární.

Příklad 1

Dihydrochlorid 2-[trans-(4-aminocyklohexyl)aminoj-6-(3-j odbenzylamino)-9-cyklopentylpurinu.

Schéma A, stupeň (a):

2,ó-uichlor-9-cyklopentylpurin.

Podle tohoto provedení byl rozpuštěn cyklopentanol (v množství 260 no '7 — ττϊοΤιίΊ

2,6-dichlorpurin (680 mg,

3,60 mmolu) a trifenylfosfin (950 mg, 3,60 mmol) v suchém THF (20 mililitrů) a tato reakční směs byla ochlazena na teplotu 0 °C.Potom byl přidán diethylazodikarboxylát (570 μΐ, 3,60 mmolu), přičemž tento přídavek byl proveden po kapkách během intervalu 15 minut pod atmosférou dusíku.

Tento výsledný roztok byl promícháván po dobu 60 hodin při teplotě místnosti. Použité rozpouštědlo bylo odpařeno ve vakuu, produkt byl přímo zaveden do kolony naplněné silikagelem, načež bylo provedeno eluování methylenchloridem, čímž byla získána požadovaná titulní sloučenina ve formě surové směsi.

Schéma A, stupeň (b):

2-chlor-6-(3-jodbenzyl)amino)-9-cyklopentylpurin.

Podle tohoto provedení byl rozpuštěn 2,6-dichlor-9-cyklopentylpurin (použito 620 mg, v surovém stavu), hydrochlorid 3-jodbenzylaminu (použito 810 mg, 3,00 mmoly) a triethylamin (použito 835 pL, 6,00 mmolů) v suchém ethanolu (20 mililitrů). Tato reakční směs byla zahřívána při teplotě varu pod zpětným chladičem po dobu 15 hodin, načež byla ochlazena a pevný podíl byl zfiltrován, čímž byla

získána požadovaná titulní sloučenina ve formě bílé pevné látky.

Výtěžek : 680 miligramů.

3-H-NMR (Me₂SO-d₆ +	d₂o,	δ):
8,27	(s, 1H, purin	H-8)	, 7,74 (s,	1H)	, 7,61	(d,	1H) ,
7,39	(d, 1H), 7,16	(t,	1H), 4,78	(m,	1H), 4,	62	(bs,
2,15	(m, 2H), 1,90	(m,	4H), 1,70	(m,	2H); .
	✓ \ Λ r- Λ /MTI+\ i	O
	RMHnJ ^3* ΙΠΠ	) » J	Z, O .

Schéma A, stupeň (c):

Dihydrocnlorid 2- ί trans - \ 4-auiinOcyKlobexyi j aminu j -b- f 4-j ou -benzylamino)-9-cyklopentylpurinu.

Podle tohoto provedení byl smíchán 2-chlor-6-(3-jodbenzyl)amino)-9-cyklopentylpurin (použito 130 mg, 0,287 mmolu) a 1,4-cyklohexandiamin (použity 2,00 gramy, přebytek) v tlakové trubici, která byla utěsněna a zahřívána při teplotě 140 °C po dobu 18 hodin. Tato reakční směs byla ochlazena, načež byl přidán dichlormethan CH₂C1₂ (40 mililitrů), a potom byl získaný produkt promyt vodou (dva podíly po 20 mililitrech). Po usušení (síran hořečnatý), odpaření rozpouštědla ve vakuu a vyčištění v chromatografické koloně naplněné silikagelem (10 : 1 :

kapky CH₂Cl₂/MeOH/NH₄OH) byla získána požadovaná titulní sloučenina.

Výtěžek : 140 miligramů (92 %) .

Tato sloučenina byla převedena na hydrochloridovou sůl.

¹H-NMR (Me₂SO-	d₆ +	D₂0, δ):
7,83	(d,	1H) ,	7,71	(s, 1H, purin H-8), 7,60 (s,	1H),
7,38	(d,	1H) ,	7,14	(ΐ, 1H), 4,63 (m, 3H),	3,62 i	(m, 1H),
2,99	(m,	1H) ,	1,50	- 2,20 (m, 14H), 1,10	- 1,50	(m, 2H);

CIMS (NH₃) 532 (MH⁺).

9		• ··		··		• ·
• · ·	•	• · ·	•	• *	•	*
• ·	•	• ·	•	• ·	•	•
						•
• ·	•	• ·	•	• ·	•	•
·· ·	• »	··· ··		··		• ·

Příklad 2

Dihydrochlorid 2-[trans-(4-aminocyklohexyl)amino]-6-[(3-indolyl)-2-ethylamino]-9-cyklopentylpurinu.

Schéma A, stupeň (b):

2-chlor-6-[(3-indolyl)-2-ethylamino]-9-cyklopentylpurin.

15__Jt _ _Λ τ>·

FUU1C uuiiULv J-*.

- Qyg tleni byl použit

- chlor - 6^[ (3 - i ndolyTj~2~ethy lamino-]-—9 -uyk-l-open-t-yl-pur-in.,_ který byl připraven ze 2,6-dichlor-9-cyklopentylpurinu, tryptaminu a triethylaminu v podstatě stejným způsobem jako je uvedeno v příkladu 1.

Schéma A, stupeň (c):

Podle tohoto provedení byl použit dihydrochlorid 2- [trans-(4-aminocyklohexyl)amino]-6-[(3-indolyl)-2ethylamino]-9-cyklopentylpurinu, který byl připraven ze 2-chlor-6-[(3-indolyl)-2-ethylamino]-9-cyklopentylpurinu v podstatě stejným způsobem jako jě uvedeno v příkladu 1, Schéma A, stupeň (c).

CIMS (NH₃) 459 (MH⁺); R_f (min) =3,47

Příklad 3

Dihydrochlorid 2-[trans-(4-aminocyklohexyl)amino]-6-(butylamino)-9-cyklopentylpurinu.

Schéma A, stupeň (b):

2-chlor-6-(butylamino)-9-cyklopentylpurin.

Podle tohoto provedení byl použit ·>

··· »·

2-chlor-6-(butylamino)-9-cyklopeirtylpurin, který byl připraven ze 2,6-dichlor-9-cyklopentylpurinu, n-butylaminu a triethylaminu v podstatě stejným způsobem jako je uvedeno v příkladu 1, Schéma A, stupeň (b) .

Schéma A, stupeň (c):

Dihydrochlorid 2-[trans-(4-aminocyklohexyl)amino]-6/1______1 ___· — π

V uu i~y _l tun-liiu) ~ · t, Jf -*“Ρ* UJ.J- X11W «

Podle tohoto provedení byl použit dihydrochlorid 2 — |_ trans — v 4 — ammocyK ronexy _l j ammo j — 6 — \ uu uy ímuiuuj ^— 9 — cyklopentylpurinu, který byl připraven z 2-chlor-6-(butylamino)-9-cyklopentylpurinu v podstatě stejným způsobem jako je uvedeno v příkladu 1, Schéma A, stupeň (c).

CIMS (NH₃) 466 (MH⁺); R_f (min) = 3,45.

Příklad 4

Dihydrochlorid 2-[trans-(4-aminocyklohexyl)amino]-6-[2-(3,4-methylendioxyfenyl)ethylamino]-9-cyklopentyl-purinu.

Schéma A, stupeň (b):

2-chlor-6-[2-(3,4-methylendioxyfenyl)ethylamino]-9-cyklopentylpurin.

Podle tohoto provedení byl použit 2-chlor-6-[2-(3,4-methylendioxyfenyl)ethylamino]-9-cyklopentylpurin, který byl připraven z 2,6-dichlor-9-cyklopentylpurinu,

3,4-methylendioxyfenylethylaminu a triethylaminu v podstatě stejným způsobem jako je uvedeno v příkladu 1, Schéma A, stupeň (b).

»* · • · · • · · ·· ·

Schéma A, stupeň (c):

Dihydrochlorid 2-[trans-(4-aminocyklohexyl)amino]- 6-[2-(3,4-methylendioxyfenyl)ethylamino]-9-cyklopentyl-purinu.

Podle tohoto postupu byl použit dihydrochlorid 2-[trans-(4-aminocyklohexyl)amino]-6-[2-(3,4methylendioxyfenyl)ethylamino]-9-cyklopentyipurinu, kterýbyl připraven z 2-chlor-6-[2-(3,4-methylendioxyfenyl)ethylamino]-9-cyklopentylpuřinu v podstatě stejným způsobem jako je uvedeno v příkladu 1, Schéma A, stupeň (c).

CIMS (NH₃) 464 (MH⁺); R_f (min) =2,28

Příklad 5

Dihydrochlorid 2-[trans-(4-aminocyklohexyl)amino]-6-[(4-aminobutyl)amino]-9-cyklopentylpuřinu.

Schéma A, stupeň (b):

2-chlor-6-[(4-aminobutyl)amino]-9-cyklopentylpurin.

Podle tohoto postupu byl použit 2-chlor-6-[(4-aminobutyl)amino]-9-cyklopentylpurin, který byl připraven ze 2,6-dichlor-9-cyklopentylpurinu,

1,4-diaminobutanu a triethylaminu v podstatě stejným způsobem jako je uvedeno v příkladu 1, Schéma A, stupeň (b).

Schéma A, stupeň (c):

Dihydrochlorid 2-[trans-(4-aminocyklohexyl)amino]-6-[(4-aminobutyl)amino]-9-cyklopentylpurinu.

Podle tohoto příkladu byl použit dihydrochlorid 2-[trans-(4-aminocyklohexyl)amino]-6-[(4-aminobutyl)amino]-

	t · · • · · ·	Φ ·· • · · ·	·· ·· • · · ·
- 58 -	♦ · ·	• · ·	♦ · · ·
	• · · • · · · ·	• · · ··· ··	• · · · «· · ·

9-cyklopentylpurinu, který byl připraven z 2-chlor-6-[(4-aminobutyl)amino]-9-cyklopentylpurinu v podstatě stejným způsobem jako je uvedeno v příkladu 1, Schéma A, stupeň (c).

CIMS (NH₃) 387 (MH⁺); R_f (min) = 3,10.

Příklad 6

Dihydrochlorid (S)-2-[trans-(4-aminocyklohexyl)amino]-6^^_(^nffet~hyTbenzylýam±nOj^9=eyklOpentyipu-rďnu---A C “í^- i ' T· 7Ί · Ki * (JVIXX/JUIA Xi ) O W γ j ·

2-chlor-6-[(α-methylbenzyl)amino]-9-cyklopentylpurin.

Podle tohoto postupu byla uvedená sloučenina, 2-chlor-6-[(α-methylbenzyl)amino]-9-cyklopentylpurin, připravena z 2,6-dichlor-9-cyklopentylpurinu, (S)-a-methylbenzylaminu a triethylaminu v podstatě stejným způsobem jako je uvedeno výše v příkladu 1, Schéma A, stupeň (b) .

Schéma A, stupeň (c):

Dihydrochlorid 2-[trans-(4-aminocyklohexy lj amino]-6-[(α-methylbenzyl)amino]-9-cyklopentylpurinu.

Podle tohoto postupu byla uvedená sloučenina, dihydrochlorid 2-[trans-(4-aminocyklohexyl)amino]-6-[(α-methylbenzyl)amino]-9-cyklopentylpurinu, připravena z 2-chlor-6-[(α-methylbenzyl)amino]-9-cyklopentylpurinu v podstatě stejným způsobem jako je uvedeno v příkladu 1, Schéma A, stupeň (c).

CIMS (NH₃) 420 (MH⁺); R_f (min) = 0,42.

Příklad . __ ·ί£·59

Dihydrochlorid 2-[trans-(4-aminocyklohexyl)amino]-6-[(3-pyridyl)-2-ethylamino]-9-cyklopentylpurinu.

Schéma A, stupeň (b):

2-chlor-6-[(3-pyridyl)-2-ethylamino]-9-cyklopentylpurin.

Podle tohoto postupu byla uvedená sloučenina,

2- chlor-ó-[(3-pyridyl)-2-ethylamino]-9-cyklopentylpurin, připravena z 2,6-dichlor^9—cyklopentyipu-r-i-nu-j

3- (ethylamino)pyridinu a triethylaminu v podstatě stejným způsooem jaKo je uveaer vý se nříkladu 1, Schéma A, stupeň (b).

Schéma A, stupeň (c):

Podle tohoto postupu byla výše uvedená sloučenina, dihydrochlorid 2-[trans-(4-aminocyklohexyl)amino]-6-[(3-pyridyl)-2-ethylamino]-9-cyklopentylpurinu, připravena z 2-chlor-ó-[(3-pyridyl)-2-ethylamino]-9-cyklopentylpurinu v podstatě stejným způsobem jako je uvedeno v příkTadu 1, Schéma A, stupeň (c).

CIMS (NH₃) 421 (MH⁺); R_f (min) = 3,13.

Příklad 8

Dihydrochlorid 2-[trans-(4-aminocyklohexyl)amino]-6- t (4-pyridyl)methylamino] -9-cyklopentylpurinu.

Schéma A, stupeň (b):

2-chlor-ó-[(4-pyridyl)methylamino]-9-cyklopentylpurin.

Podle tohoto postupu byla uvedená sloučenina,

• '·

• 9 · · · · · • · · · · · · 9 • · C · · 9 ♦ « « · · · 9 9 ·

9 9 · · · ·

999 99 ·· «·

2-chlor-6-[(4-pyridyl)methylamino]-9-cyklopentylpurin, připravena z 2,6-dichlor-9-cyklopentylpurinu, 4-aminomethylpyridinu a triethylaminu v podstatě stejným způsobem jako je uvedeno v příkladu 1, Schéma A. stupeň (b) .

Schéma A, stupeň (c):

Dihydrochlorid 2-[trans-(4-aminocyklohexyl)amino]-6-[(4-pyridyl)methylamino]-9-cyklopentylpurinu.

Podle tohoto postupu byla uvedená sloučenina, dihydrochlorid 2-[trans-(4-aminocyklohexyl)amino]-6_[(4-pyridyl)methylamino]-9-cyklopentylpurinu, připravena z 2-chlor-6-[(4-pyridyl)methylamino]-9-cyklopentylpurinu v podstatě stejným způsobem jako je uvedeno v příkladu 1, Schéma A, stupeň (c).

CIMS (NH₃) 407 (MH⁺); R_f (min) = 3,13.

Příklad 9

Dihydrochlorid 2-[trans-(4-aminocyklohexyl)amino]-6_ [3_(4-morfolinyl)propylamino]-9-cyklopentylpurinu.

Schéma A, stupeň (b):

2-chlor-6-[3-(4-morfolinyl)propylamino]-9-cyklopentylpurin.

Podle tohoto postupu byla uvedená sloučenina,

2- chlor-6-[3-(4-morfolinyl)propylamino]-9-cyklopentylpurin, připravena z 2,6-dichlor-9-cyklopentylpurinu,

3- aminopropylmorfolinu a triethylaminu v podstatě stejným způsobem jako je uvedeno v příkladu 1, Schéma A, stupeň (b).

Schéma A, stupeň (c):

Dihydrochlorid 2-[trans-(4-aminocyklohexyl)amino]-6- [3- (4-morfolinyl)propylamino]-9-cyklopentylpurinu.

Podle tohoto postupu byla uvedená sloučenina, dihydrochlorid 2-[trans-(4-aminocyklohexyl)amino]-6_[3_(4-morfoiinyl)propylamino]-9-cyklopentylpurmu, připravena z 2-chlor-6-[3-(4-morfolinyl)propylamino]-9-cyklopentylpurinu v podstatě stejným způsobem jako v příkladu 1, Schéma A, stupeň (c).

CIMS (NH·,) 443 (MH⁺) ; R_f (min) =3,11

Příklad 10

Dihydrochlorid 2-[trans-(4-aminocyklohexyl)amino]-6- [ (3,4-dichlorbenzyl)amino]-9-cyklopentylpurinu

Schéma A, stupeň (b):

2-chlor-6-[(3,4-dichlorbenzy1)amino]-9-cyklopentylpur in.

Podle tohoto postupu byla uvedená sloučenina, 2-chlor-6-[(3,4-dichlorbenzyl)amino]-9-cyklopentylpurin, připravena z 2,6-dichlor-9-cyklopentylpurinu,

3,4-dichlorbenzylaminu a triethylaminu v podstatě stejným způsobem jako je uvedeno v příkladu 1, Schéma A, stupen (b).

Schéma A, stupeň (c):

Dihydrochlorid 2-[trans-(4-aminocyklohexyl)amino]-6- [ (3,4-dichlorbenzyl)amino]-9-cyklopentylpurinu.

Podle tohoto postupu byla uvedená sloučenina, dihydrochlorid 2-[trans-(4-aminocyklohexyl)amino]-6-[ (3,4-dichlorbenzyl)amino]-9-cyklopentylpurinu, připravena z 2-chlor-6-[(3,4-dichlorbenzyl)amino]-9-cyklopentylpurinu v podstatě stejným způsobem jako je uvedeno v příkladu 1, Schéma A, stupeň (c).

CIMS (NH₃) 474 (MH⁺); R_f (min) =2,34.

Příklad 11

Dihydrochlorid 2-[trans-(4-aminocyklohexyl)amino]-6- [ (3-methyibenzyl) amino] -9-cyklopentylpurmu

Schéma A, stupeň (b):

2- chlor-6-[(3-methylbenzyl)amino]-9-cyklopentyIpurin.

Poďle tohoto postupu—byla—uvedená—sioueen-i-na-y--2- chlor-6-[(3-methylbenzyl)amino]-9-cyklopentylpurin, připravena z 2,6-dichlor-9-cyklopentylpurinu,

3- methylbenzylaminu a triethylaminu, přičemž se postupovalo v podstatě stejným způsobem jako v příkladu 1, Schéma A, stupeň (b).

Schéma A, stupeň (c):

Dihydrochlorid 2-[trans-(4-aminocyklohexyl)amino]-6- [ (3-methylbenzyl)amino]-9-cyklopentylpurinu.

Podle tohoto postupu byla uvedená sloučenina, dihydrochlorid 2-[trans-(4-aminocyklohexyl)amino]-6- [ (3-methylbenzyl)amino]-9-cyklopentylpurinu, “připravena z 2-chlor-6-[(3-methylbenzyl)amino]-9-cyklopentylpurinu v podstatě stejným způsobem jako je uvedeno v příkladu 1, Schéma A, stupeň (c).

CIMS (NH₃) 420 (MH⁺); R_f (min) =2,29

Příklad 12

Dihydrochlorid 2-[trans-(4-aminocyklohexyl)amino]-6- [2-(2-pyridyl)ethylamino]-9-cyklopentylpurinu

Schéma A, stupeň (b):

2-chlor-6-[2-(2-pyridyl)ethylamino]-9-cyklopentylpurin.

'·' · · 9 ·» · · · · • · · · · · · · 9 · · · • · · · · · · · · · • · 9 9 9 9 · ·· * · * • · · ··· ···· ··· β· ·· 9 9 ·· ··

Podle tohoto postupu byla uvedená sloučenina, 2-chlor-6-[2-(2-pyridyl)ethylamino]-9-cyklopentylpurin, připravena z 2,ó-dichlor-y-cyklopentylpurinu,

2-(ethylamino)pyridinu a triethylaminu, přičemž se postupovalo v podstatě stejným způsobem jako v příkladu r, Schéma A, stupeň (b).

Schéma A, stupeň (c) : Dihydrochlorid 2-[trans-(4-aminocyklohexyl)amino]-6-[2-(2-pyridyl)ethylamino]-9-cyklopentylpurinu.

Podle tohoto postupu byla uvedená sloučenina, dihydrochlorid 2-[trans-(4-aminocyklohexyl)amino]-6-[2-(2-pyridyl)ethylamino]-9-cyklopentylpurinu, připravena z 2-chlor-6-[2-(2-pyridyl)ethylamino]-9-cyklopentylpurinu, přičemž se postupovalo v podstatě stejným způsobem jako v příkladu 1, Schéma A, stupeň (c) .

CIMS (NH₃) 421 (MH⁺); R_f (min) = 3,13.

Příklad 13

Trihydrochlorid 2-[trans-(4-aminocyklohexyl)amino]-6-[2-(4-morfolinyl)ethylamino]-9-cyklopentylpurinu.

Schéma A, stupeň (b):

2-chlor-6-[2-(4-morfolinyl)ethylamino]-9-cyklopentylpurin.

Podle tohoto postupu byla uvedená sloučenina, 2-chlor-6-[2-(4-morfolinyl)ethylamino]-9-cyklopentylpurin, připravena z 2,6-dichlor-9-cyklopentylpurinu,

2-aminoethylmorfolinu a triethylaminu, přičemž se postupovalo v podstatě stejným způsobem jako v příkladu 1, Schéma A, stupeň (b).

• · · • · « ·* ··

Schéma A, stupeň (c):

Trihydrochlorid 2-[trans-(4-aminocyklohexyl)amino]-6_ [2-(4-morfolinyl)ethylamino]-9-cyklopentylpurinu.

Podle tohoto postupu byla uvedena sloučenina, -trihydrochlorid 2- [trans- (4-aminocyklohexyl)amino] -6_[2-(4-morfolinyl)ethylamino]-9-cyklopentylpurinu, -připlavena—z—2^-chlor^i6-r [2- (4-morfolinyl)ethylaminoj -y·

-cyklopentylpurinu, přičemž se postupovalo v podstatě stejným způsobem jako v příkladu 1, Schéma A, stupen (c) CIMS (NH₃) 429 (MH⁺); R_f (min) = 3,08.

Příklad 14

Dihydrochlorid 2-[trans-(4-aminocyklohexyl)amino]-6- [2-hydroxyethylhydrazino]-9-cyklopentylpurinu.

Schéma A, stupeň (b):

2-chlor-6-[2-hydroxyethylhydrazino]-9-cyklopentylpur in

Podle tohoto provedení byla uvedená sloučenina,

2-chlor-6-[2-hydroxyethylhydrazino]-9-cyklopentyJpurin,------připravena z 2,6-dichlor-9-cyklopentylpurinu,

2-hydroxyethylhydrazinu a triethylaminu, přičemž se postupovalo v podstatě stejným způsobem jako v příkladu 1, Schéma A, stupeň (b).

Schéma A, stupeň (c):

Dihydrochlorid 2-[trans-(4-aminocyklohexyl)amino]-6-[2-hydroxyethylhydrazino]-9-cyklopentylpurinu.

Podle tohoto postupu byla výše uvedená sloučenina, dihydrochlorid 2-[trans-(4-aminocyklohexyl)amino]-6

··' ♦ · t · ·· · · · ·> · · • · · * · · · · · · • · ·· ·· · · · · · * • · · · · a ··· · ··· ··. ··· ·· ·· ··

-[2-hydroxyethylhydrazino]-9-cyklopentylpurinu, připravena z 2-chlor-6-[2-hydroxyethylhydrazino]-9-cyklopentylpurinu, přičemž se postupovalo v podstatě stejným způsobem jako v příkladu 1, Schéma A, stupeň (c).

CIMS (NH₃) 375 (MH⁺); R_f (min) =3,15

Příklad 15

Dihydrochlorid 2-[trans-(4-aminocyklohexyl)amino]-6—[YS^hlóřybenžyTlaminoj^-Cž^propylýpurinu^-Schéma A, stupen (a):

2.6- dichlor-9-(2-propyl)purin

Podle tohoto postupu byla uvedená sloučenina,

2.6- dichlor-9-(2-propyl)purin, připravena z 2,6-dichlorpurinu a isopropanolu, přičemž se postupovalo v podstatě stejným způsobem jako v příkladu 1, Schéma A, stupeň (a), s tím rozdílem, že cyklopentanol byl nahražen isopropanolem.

Schéma A, stupeň (b):

2-chlor-6-[(3-chlor)benzylamino]-9-(2-propy1)puřin.

Podle tohoto postupu byla uvedená sloučenina,

2- chlor-6-[(3-chlor)benzylamino]-9-(2-propyl)purin, připravena z 2,6-dichlor-9-(2-propyl)purinu,

3- chlorbenzylaminu a triethylaminu, přičemž se postupovalo v podstatě stejným způsobem jako v příkladu 1, Schéma A, stupeň (b).

Schéma A, stupeň (c):

Dihydrochlorid 2-[trans-(4-aminocyklohexyl)amino]-6-[(3-chlor)benzylamino]-9-(2-propyl)purinu.

• · « ··♦ ··

·

4 · ' .4 ·, '4 «

• ·· 4 •4·4 4·

Podle tohoto postupu byla uvedená sloučenina, dihydrochlorid 2-[trans-(4-aminocyklohexyl)amino]-6-[(3-chlor)benzylamino]-9=(2-propyl)purinu, připravena z 2-chlor-6-[(3-chlor)benzylamino]-9-(2-propyl)purinu, přičemž se postupovalo v podstatě stejným způsobem jako v příkladu 1, Schéma A, stupeň (c).

CIMS (NH-) 414 (MH⁺); R_f = (min) 3,44.

Příklad 16

Dihydrochlorid (R)-2-[trans-(4-aminocyklohexyl)amino]-6- [ (α-methylbenzyl)amino]-9-cyklopentylpurinu.

Schéma A, stupeň (b);

2-chlor-6-[(α-methylbenzyl)amino]-9-cyklopentylpurin.

Podle tohoto postupu byla uvedená sloučenina, 2-chlor-6-[(α-methylbenzyl)amino]-9-cyklopentylpurin, připravena z 2,6-dichlor-9-cyklopentylpurinu, (R)-a-methylbenzylaminu a triethylaminu, přičemž se postupovalo v podstatě stejným způsobem jako v příkladu 1, Schéma A , štupěň (b’)^_7 ” ~

Schéma A, stupeň (c):

Dihydrochlorid (R)-2-[trans-(4-aminocyklohexyl)amino]-6- [ (a-methylbenzyl)amino]-9-cyklopentylpurinu.

Podle tohoto postupu byla uvedená sloučenina, dihydrochlorid (R)-2-[trans-(4-aminocyklohexyl)amino]-6- [ (α-methylbenzyl)amino]-9-cyklopentylpurinu, připravena z 2-chlor-6-[(α-methylbenzyl)amino]-9-cyklopentylpurinu, přičemž se postupovalo v podstatě stejným způsobem jako v příkladu 1, Schéma A, stupeň (c).

CIMS (NH₃) 420 (MH⁺); R_f (min) = 2,27

Příklad

Dihydrochlorid 2- [trans- (4-cuiii±±Gcyklohexyl)amino] -6-(2-thiofenmethylamino)-9-cyklopentylpurinu.

Schéma A, stupeň (b):

2chlor-6-(2-thiofenmethylamino)-9-cyklopentylpurin.

Podle tohoto postupu byla uvedená sloučenina, 6-(2-thiofenmethylamino)-9-cyklopentylpurin, připravena z 2,6-dichlor-9-cyklopentylpurinu,

2-thiofenmethylaminu a triethylaminu, přičemž se postupovalo v podstatě stejným způsobem jako v příkladu 1, Schéma A, stupeň (b).

Schéma A, stupeň (c):

Dihydrochlorid 2-[trans-(4-aminocyklohexyl)amino]-6-(2-thiofenmethylamino)-9-cyklopentylpurinu.

Podle tohoto provedení byla uvedená sloučenina, dihydrochlorid 2-[trans-(4-áminócyklóhěxýl)amino]-6-(2-thiofenmethylamino)-9-cyklopentylpurinu, připravena z 2-chlor-6-(2-thiofenmethylamino)-9-cyklopentylpurinu, přičemž se postupovalo v podstatě stejným způsobem jako v příkladu 1, Schéma A, stupeň (c).

CIMS (NH₃) 412 (MH⁺); R_f = (min) 3,43.

Příklad 18

Dihydrochlorid 2-[trans-(4-aminocyklohexyl)amino]-6-[(2-chlorbenzyl)amino]-9-cyklopentylpurinu

Schéma A, stupeň (b):

• <♦· · ·· *» · · · · · · · ·' « « • · · · · * · · · « • · · » · · · » · · · · • · · · · · · · · · ··· ·· «'·· tt ·· <·

2-chlor-6-[(2-chlorbenzyl)amino]-9-cyklopentylpurin.

Podle tohoto postupu byla uvedená sloučenina, 2-chlor-ó-[(2-chlorbenzyl)amino]-9-cyklopentylpurin, připravena z 2,6-dichlor-9-cyklopentylpurinu, 2-chlorbenzylaminu a trietnylaminu, přičemž se postupová v podstatě stejným způsobem jako v příkladu 1, Schéma A,

--- \ - s

Schéma A, stupeň (c):

Dihydrochlorid 2-[trans-(4-aminocyklohexyl)amino]-6-[(2-chlorbenzyl)amino]-9-cyklopentylpurinu.

Podle tohoto postupu byla uvedená sloučenina, dihydrochlorid 2-[trans-(4-aminocyklohexyl)amino]-6-[(2-chlorbenzyl)amino]-9-cyklopentylpurinu, připravena z 2-chlor-6-[(2-chlorbenzyl)amino]-9-cyklopentylpurinu, přičemž se postupovalo v podstatě stejným způsobem jako v příkladu 1, Schéma A, stupeň (c).

CIMS (NH₃) 440 (MH⁺); R_f (min) = 2,28.

P ř í k 1 a d .......19 ........................ --------------------------- ------------ -........

Dihydrochlorid 2-[trans-(4-aminocyklohexyl)amino]-6- [ (2-benzimidazolyl)methylamino]-9-cyklopentylpurinu.

Schéma A, stupeň (b):

2-chlor-6-[(2-benzimidazolyl)methylamino]-9-cyklopentyl-purin.

Podle tohoto postupu byla uvedená sloučenina, 2-chlor-6-[(2-benzimidazolyl)methylamino]-9-cyklopentyl-purin, připravena z 2,6-dichlor-9-cyklopentylpurinu,

2-(methylamino)benzimidazolu a triethylaminu, přičemž se

postupovalo v podstatě stejným způsobem jako v příkladu 1, Schéma A, stupeň (b).

Schéma A, stupeň (c):

Dihydrochlorid 2-[trans-(4-aminocyklohexyl)amino]-6-[(2-benzimidazolyl)methylamino]-9-cyklopentylpurinu

Podle tohoto postupu byla uvedená sloučenina, drhjzdrOCháTor id—2~[“trans---(-4--ami-nocy-k-l-ohexy-l-)-amino-]^řL·:-[(2-benzimidazolyl)methylamino]-9-cyklopentylpurinu, připravena z 2-chlor-6-[(2-benzimidazolyljmethylamino]-9-cyklopentylpurinu, přičemž se postupovalo v podstatě stejným způsobem jako v příkladu 1, Schéma A, stupeň (c) . CIMS (NH₃) 372 (MH⁺); R_f (min) =3,4.

Příklad 20

Dihydrochlorid 2-[trans-(4-aminocyklohexyl)amino]-6-(oktylamino)-9-cyklopentylpurinu.

Schéma A, stupeň (b):

2-chlor-6-(oktylamino)-9-cyklopentylpurin.

Podle tohoto provedení byla uvedená sloučenina, 2-chlor-6-(oktylamino)-9-cyklopentylpurin, připravena z 2,6-dichlor-9-cyklopentylpurinu, n-oktylaminu a triethylaminu, přičemž se postupovalo v podstatě stejným způsobem jako v příkladu 1, Schéma A, stupeň (b).

Schéma A, stupeň (c):

Podle tohoto provedení byla uvedená sloučenina, '99

IQ

··· ·· • ·99 99 ·* ::: : :: :

• 9 9 9 9 ·· * • · 9 9 9 9 9

99 99· 99 dihydrochlorid 2-[trans-(4-aminocyklohexyl)amino]-6-(oktylamino)-9-cyklopentylpurin, připravena za použití 2-chlor-6-(oktylamino)-9-cyklopentylpurinu, přičemž se postupovalo v podstatě stejným způsobem jako v příkladu Schéma A, stupeň (c).

1,

CIMS (NH₃) 428 (MH⁺); R_f (min) = 4,23.

Příklad 21

l)i-hydroehi-ori-d—2—[trans-(-4--aminocyklohexyl_)_aininct]i6ji -(4-fenylbutylamino)-9-cyklopentylpurinu.

Schéma A, stupeň (b):

2-chlor-6-(4-fenylbutylamino)-9-cyklopentylpurin.

Podle tohoto postupu byla výše uvedená sloučenina, 2-chlor-6-(4-fenylbutylamino)-9-cyklopentylpurin, připravena z 2,6-dichloř-9-cyklopentylpurinu, 4-fenylbutylaminu a triethylaminu, přičemž se postupovalo v podstatě stejným způsobem jako v příkladu 1, Schéma A, stupeň (b).

Schéma A, stupeň (c):

Dihydřočhloři d 2-[trans-(4-aminocyk1 ohexy 1)amino]-6-------(4-fenylbutylamino)-9-cyklopentylpurinu.

Podle tohoto postupu byla uvedená sloučenina, dihydrochlorid 2-[trans-(4-aminocyklohexyl)amino]-6-(4-fenylbutylamino)-9-cyklopentylpurinu, připravena za použití 2-chlor-6-(4-fenylbutylamino)-9-cyklopentylpurinu, přičemž se postupovalo v podstatě stejným způsobem jako v příkladu 1, Schéma A, stupeň (c).

CIMS (NH₃) 448 (MH⁺); R_f (min) = 4,09.

- 71 1· $ ·' £ • '· ·· · • · · ·

Dihydrochlorid 2-[trans-(4-aminocyklohexyl)amino]- 6-[(cyklohexyl)methylamino]-9-cyklopentylpurinu.

Schéma. A, stupen (b) :

2-chlor-6-[(cyklohexyl)methylamino]-9-cyklopentylpurin.

Podle tohoto postupu byla výše uvedená sloučenina,

2-chlor- 6-[(cyklohexyl)methylamino]-9-cyklopentylpurin, připravena—za—použ-i-t-í—2,6-dichlor^9-cyklopentylpurinu, aminomethylcyklohexanu a triethylaminu, přičemž se postupovalo v podstatě stejným způsobem jako v příkladu 1, Schéma A, stupeň (b) .

Schéma A, stupeň (c):

Dihydrochlorid 2-[trans-(4-aminocyklohexyl)amino]-6-[(cyklohexyl)methylamino]-9-cyklopentylpurinu.

Podle tohoto postupu byla uvedená sloučenina, dihydrochlorid 2-[trans-(4-aminocyklohexyl)amino]-6- [ (cyklohexyl)methylamino]-9-cyklopentylpurinu, připravena za použití 2-chlor-6-[(cyklohexyl)methylamino]-9-cyklopentylpurinu, přičemžse postupovalo v podstatě stejným způsobem jako v příkladu 1, Schéma A, stupeň (c). CIMS (NH₃) 412 (MH⁺); R_f (min) = 2,33

Příklad 23

Dihydrochlorid 2-[trans-(4-aminocyklohexyl)amino]-6-[(3-(3 -methyl-4-hydroxy)buty1)amino]-9-cyklopentylpurinu.

Schéma A, stupeň (b):

2-chlor-6-[(3-(3-methyl-4-hydroxy)butyl)amino]-9-cyklo-pentylpurin.

• .·*	A '.· A		AA	··
• A · A	« A A '·	A,	A	A A
AAA	• A *	A	A	• A

Ά · .A	AAA	A	A	A A
• · · :a a	• A A A A		AA	A A

Podle -tohoto postupu byla uvedená sloučenina,

2-chlor-6-[(3-(3-methyl-4-hydroxy)butyl)amino]-9-cyklo-pentylpurin, připravena za použití 2,6-dichlor-9-cyklopentylpuřinu, 2-(2-hydroxymethyl) butylammu a triethylaminu, přičemž se postupovalo v podstatě stejným způsobem jako v příkladu 1, Schéma A, stupeň (b) .

Schéma A, stupeň (c):

Dlhýdfochlorid“2^[-tT ans^(-4--am-i-noeyk-l-ohe x-y-1-) am ino]^6=[(3-(3-methyl-4-hydroxy)butyl)amino]-9-cyklopentylpuřinu.

Podle tohoto postupu byla výše uvedená sloučenina, dihydrochlorid 2-[trans-(4-aminocyklohexyl)amino]-6-[(3-(3-methyl-4-hydroxy)butyl)amino]-9-cyklopentylpuřinu, připravena za použití 2-chlor-6-[(3-(3-methyl-4-hydroxy)-butyl)amino]-9-cyklopentylpurin, přičemž se postupovalo v podstatě stejným způsobem jako v příkladu 1, Schéma A, stupeň (c).

CIMS (NH₃) 404 (MH⁺); R_f (min) = 3,15.

Příklad 24

Dihydrochloridl·2- [trans-(4-ami nocyklohexy L)amino]- 6 - --[3-(fenyl)propylamino]-9-cyklopentylpurinu.

Schéma A, stupeň (b):

2-chlor-6-[3-(fenyl)propylamino]-9-cyklopentylpurin.

Podle tohoto postupu byla uvedená sloučenina,

2- chlor-6-[3-(fenyl)propylamino]-9-cyklopentylpurin, připravena za použití 2,6-dichlor-9-cyklopentylpurinu,

3- aminopropylbenzenu a triethylaminu, přičemž se postupovalo v podstatě stejným způsobem jako v příkladu 1, Schéma A, stupeň (b).

«4

'9 9 9 ^,·'·'9 (·· ·· • · · 9 9 · 9 · · 9 9 9

999 9 ·· 9999 • 9 99 9 9 999 99 9

999 999 9.9 9 9

999 99 '999 99 99 99

Schéma A, stupeň (c):

Dihydrochlorid 2-[trans-(4-aminocyklohexyl)amino]-6-[3-(řenyl)propylamino]-9-cyklopentylpurinu.

Podle tohoto postupu byla uvedená sloučenina, dihydrochlorid 2-[trans-(4-aminocyklohexyl)amino]-6-[3-(fenyl)propylamino]-9-cyklopentylpurinu, připravena za použi/tí chlOr-6- [3—(-fenyTípropylamino]---9--cyklopentyl^·--purinu, přičemž se postupovalo v podstatě stejným způsobem jako v příkladu 1, Schéma A, stupeň (c).

CIMS (NH₃) 434 (MH⁺); R_f (min) =0,49.

Příklad 25

Dihydrochlorid 2-[trans-(4-aminocyklohexyl)amino]-6-[5-(hydroxy)pentylamino]-9-cyklopentylpurinu.

Schéma A, stupeň (b):

2-chlor-6-[5-(hydroxy)pentylamino]-9-cyklopentylpurin.

Podle tohoto postupu byla výše uvedená sloučenina, 2-chlor-6- [ 5- (hydroxy) pentylamino] -9-cyklopentylpurin připravena za použití 2,6-dichlor-9-cyklopentylpurinu, 5-hydroxypentylaminu a triethylaminu, přičemž se postupovalo v podstatě stejným způsobem jako v příkladu 1, Schéma A, stupeň (b).

Schéma A, stupeň (c):

Podle tohoto postupu byla výše uvedená sloučenina, dihydrochlorid 2-[trans-(4-aminocyklohexyl)amino]-6-3 fjí

v podstatě

A ----„Ji z n, o Luycii ·

-[5-(hydroxy)pentylamino]-9-cyklopentylpurinu, připravena za použití 2-chlor-6-[5-(hydroxy)pentylamino]-9-cyklopentylpurinu, přičemž se postupovalo _____·__<____o.__i_____3,, -i í^LOjiiyni zpuauuciu v piiKiauu x, ouiiuma

CIMS (NH₃) 402 (MH⁺); R_f (min) = 3,25.

Příklad 26

Dihydrochlorid 2-[trans-(4-aminocyklohexyl)amino]-6-=-(-pentyT-amí-no)---9^eyk-l·openΐyT-pu-ri-nu^Schéma A, stupeň (b):

2-chlor-6-(pentylamino)-9-cyklopentylpurin.

Podle tohoto postupu byla výše uvedená sloučenina, 2-chlor-6-(pentylamino)-9-cyklopentylpurin, připravena za použití 2,6-dichlor-9-cyklopentylpurinu, pentylaminu a triethylaminu, přičemž se postupovalo v podstatě stejným způsobem jako v příkladu 1, Schéma A, stupeň (b).

Schéma A, stupeň (c):

Dihydrochlorid 2-[trans-(4-aminocyklohexyl)amino]-6-(pentylamino)-9-cyklopentylpurinu.

Podle tohoto provedení byla výše uvedená sloučenina, dihydrochlorid 2-[trans-(4-aminocyklohexyl)amino]-6-(pentylamino)-9-cyklopentylpurinu, připravena za použití 2-chlor-6-(pentylamino)-9-cyklopentylpurinu, přičemž se postupovalo v podstatě stejným způsobem jako v příkladu 1, Schéma A, stupeň (c).

CIMS (NH₃) 386 (MH⁺); R_f (min) = 3,52.

Příklad 27

Dihydrochlorid 2-[trans-(4-aminocyklohexyl)amino]-675 '·· ·· ¹ · · ·

- [ (4-chlorbenzyl)amino] -9-cyklopentylpurinu.,

Schéma A, stupeň (b) :

_ι_ n__zr r / a _i_ n__i______τ λ___· — ~ 1 η ______i_____

Δ-UiilUl - U - L K*t “ Vll-LUl UCUZj' _L ) CU11J.11U J “ > ” ±pui.

Podle tohoto postupu byla uvedená sloučenina, 2-chlor-ó-[(4-chlorbenzyl)amino]-9-cyklopentylpurin, Dřioravena za Doužití 2.6-dichlor-9-cvkloDentvlDurinu.

4—eh-lorbenzyiami-nu—a—triet-hyTam-i-nus—př-i-ěemž— se—posTupovaTo v podstatě stejným způsobem jako v příkladu 1, Schéma A, stupeň (b).

Schéma A, stupeň (c) :

Dihydrochlorid 2-[trans-(4-aminocyklohexyl)amino]-6- [ (4-chlorbenzyl)amino]-9-cyklopentylpurinu.

Podle tohoto postupu byla výše uvedená sloučenina, dihydrochlorid 2-[trans-(4-aminocyklohexyl)amino]-6-[ (4-chlorbenzyl)amino]-9-cyklopentylpurinu, připravena za použití 2-chlor-ó-[(4-chlorbenzyl)amino]-9-cyklopentylpurinu, přičemž se postupovalo v podstatě Stejným způsobem jako v příkTadu Ϊ, Schéma A, stupeň (c) . CIMS (NH₃) 440 (MH⁺); R_f (min) =2,29.

P ř í k 1 a d 28

Dihydrochlorid 2-[trans-(4-aminocyklohexyl)amino]-6-(methylamino)-9-cyklopentylpurinu.

Schéma A, stupeň (b):

2-chlor-ó-(methylamino)-9-cyklopentylpurin.

Podle tohoto postupu byla výše uvedená sloučenina, 2-chlor-ó-(methylamino)-9-cyklopentylpurin, připravena za + -- ··

• • 4 ·	• 4 •	4 4· • 4 4	4	4	44 4	44 4	4
• 4	•	• ·	4	4	4	4	4
							4
• 4	•	• β	4	4	4	4	4
4 4 4	• 4	• •4 44			4 4	4 4

použití 2,6-dichlor-9-cyklopentylpurinu, hydrochloridu methylaminu a triethylaminu, přičemž se postupovalo v podstatě stejným způsobem jako v příkladu 1, Schéma A, __ ______ y z i_ \

Stupen o) .

Schéma A, stupeň (c):

Podle tohoto provedení byla výše uvedená sloučenina, dihydrochlorid 2-[trans-(4-aminocyklohexyl)amino]-6-(methylamino)-9-cyklopentylpurinu, připravena za použití 2-chlor-6-(methylamino)-9-cyklopentylpurinu, přičemž se postupovalo v podstatě stejným způsobem jako v příkladu 1, Schéma A,, stupeň (c) .

CIMS (NH₃) 330 (MH⁺); R_f (min) = 3,15.

Příklad 29

Dihydrochlorid 2-[trans-(4-aminocyklohexyl)amino]-6- [ (3-chlorbenzyl)amino]-9-cyklopentylpurinu.

Schéma Á, stupeň (b):

2-chlor-6-[(3-chlorbenzyl)amino]-9-cyklopentylpurin.

Podle tohoto postupu byla požadovaná sloučenina,

2- chlor-6-[(3-chlorbenzyl)amino]-9-cyklopentylpurin, připravena za použití 2,6-dichlor-9-cyklopentylpurinu,

Schéma A, stupeň (c):

Dihydrochlorid 2-[trans-(4-aminocyklohexyl)amino]-6-

» ·* » *· ·· ·· ·♦ · · ·· · · * · « e • · · · · · Φ · « 9 • · · ·«· · t 9 · *·· ·· ·»· 49 ·· ··

-[(3-chlorbenzyl)amino]-9-cyklopentylpurinu.

Podle tohoto postupu byla požadovaná sloučenina, dihydrochlorid 2- [trans- (4-aminocyklohexyl)amino] -6-[(3-chlorbenzyl)amino]-9-cyklopentylpurinu, připravena za použití 2-chlor-6-[(3-chlorbenzyl)amino]-9-cyklopentylpurinu, přičemž se postupovalo v podstatě steinvm zníisnhem iako v nříkladu 1. Schéma A. stupeň (c) .

---_u--J--- -_£--- ------ - --- X- * - ' ei-MS—(NHy)—4-4Q—(-MH—)-;—R_f (m-i-n-)—=—.2,30.--Příklad 30

Dihydrochlorid 2-[trans-(4-aminocyklohexyl)amino]-6-[(2-tetrahydropyranyl)methylamino]-9-cyklopentylpurinu.

Schéma A, stupeň (b):

2-chlor-6-[(2-tetrahydropyranyl)methylamino]-9-cyklo-pentylpurin.

Podle tohoto postupu byla požadovaná sloučenina, 2-chlor-6-[(2-tetrahydropyranyl)methylamino]-9-cyklo-pentylpurin, připravena za použití 2,6-dichlor-9-cyklopeňtýlpurinu, 2-áminomethyltetrahydropyranu a triethylaminu, přičemž se postupovalo v podstatě stejným způsobem jako v příkladu 1, Schéma A, stupeň (b).

Schéma A, stupeň (c):

Podle tohoto postupu byla požadovaná sloučenina, dihydrochlorid 2-[trans-(4-aminocyklohexyl)amino]-6-[(2-tetrahydropyranyl)methylamino]-9-cyklopentylpurinu, připravena za použití 2-chlor-6-[(2-tetrahydropyranyl)78

-methylamino]-9-cyklopentylpurinu, v podstatě stejným způsobem jako v stupeň (c).

přičemž se postupovalo příkladu 1, Schéma A, . . . .. .1T \ ΑΛΑ /MTl+\ .

umo ^iNn^j μϊη· j ,

Příklad 31

Dihydrochlorid 2-[trans-(4-aminocyklohexyl)amino]-6· -Γ(4-nvri rivl1 -2-ethvlaminol-9-cvkloDentvlnurinu.

·- \ · sr j j — z — j-------- — - - ^_ ju- - - x

Schéma A, stupeň (b):

2-chlor-6-[(4-pyridyl)-2-ethylamino]-9-cyklopentylpurin

Podle tohoto postupu byla požadovaná sloučenina, 2-chlor-6-[(4-pyridyl)-2-ethylamino]-9-cyklopentylpurin, připravena za použití 2,6-dichlor-9-cyklopentylpurinu,

4-(ethylamino)pyridinu a triethylaminu, přičemž se postupovalo v podstatě stejným způsobem jako v příkladu 1, Schéma A, stupeň (b).

Schéma A, stupeň (c):

Dihydrochlorid 2-[trans-(4-aminocyklohexyl)amino]-6- [ (4-pyridyl)^2-ethyíámiňo]^97'cyklopěntýlpůřinú.

Podle tohoto provedení byla výše uvedená sloučenina, dihydrochlorid 2-[trans-(4-aminocyklohexyl)amino]-6-[(4-pyridyl)-2-ethylamino]-9-cyklopentylpurinu, připravena za použití 2-chlor-6-[(4-pyridyl)-2-ethylamino]-9-cyklopentylpurinu, přičemž se postupovalo v podstatě stejným způsobem jako v příkladu 1, Schéma A, stupeň (c). CIMS (NH₃) 421 (MH⁺); R_f (min) =3,13.

Příklad 32

Dihydrochlorid 2-[trans-(4-aminocyklohexyl)amino]-6- 79

[(cyklopropyl)methylamino]-9-(2-propyl)purinu.

Schéma A, stupeň (b):

O .v- .< [ / „..1, T \ ητη-ί η o 1 _ Q _ f O _ nrnn\;l r>n r· 4

X “ UzllXUX ” o “ L v C^KXUpX upj X J HIV* Lil} XIA1IIXX1W j ✓ \ ~ ť J J ť -*Podle tohoto postupu byla výše uvedená sloučenina, 2-chlor-6-[(cyklopropyl)methylamino]-9-(2-propyl)purin, připravena za použití 2,6-dichlor-9-(2-propyl)purinu, eykXopropyT-methyi-am-i-nu—a-^bri-et-hyl-ami-nu-,—přičemž—sepostupovalo v podstatě stejným způsobem jako v příkladu 1, Schéma A. stuneň fb).

Schéma A, stupeň (c):

Dihydrochlorid 2-[trans-(4-aminocyklohexyl)amino]-6-[(cyklopropyl)methylamino]-9-(2-propyl)purinu.

Podle tohoto postupu byla požadovaná sloučenina, dihydrochlorid 2-[trans-(4-aminocyklohexyl)amino]-6-[(cyklopropyl)methylamino]-9-(2-propyl)purinu, připravena za použití 2-chlor-6-[(cyklopropyl)methylamino]-9-(2-propyl)purinu, přičemž se postupovalo v podstatě stejným způsobeni jako v příkladu 1, Schéma A, stupeň (c) CIMS (NH₃) 344 (MH⁺); R_f (min) =3,25.

Příklad 33

Dihydrochlorid 2-[trans-(4-aminocyklohexyl)amino]-6-(ethylamino)-9-cyklopentylpurinu.

Schéma A, stupeň (b):

2-chlor-6-(ethylamino)-9-cyklopentylpurin.

Podle tohoto postupu byla uvedená sloučenina, 2-chlor-6-(ethylamino)-9-cyklopentylpurin, připravena za

•	4 4	4	44 44		4 4
• · ·	4	4 4 4	4 4	•	4	4
• ·	* '	4 ·	·· 4 4	4	4	4
4 ·	4 4	4 4	-4' '4 4	4	4	4
4 4 4	4 ·	4 4 4	4 4 '4 «		• 4	4

použití 2,6-dichlor-9-cyklopentylpurinu, hydrochloridu ethylaminu a triethylaminu, přičemž se postupovalo v podstatě stejným způsobem jako v příkladu 1, Schéma A, stupeň (b).

Schéma A, stupeň (c):

Dihydrochlorid 2-[trans-(4-aminocyklohexyl)amino]-6_ (A-tbvl am-ι nnpntvl niiri nn tr -------Podle tohoto postupu byla požadovaná sloučenina, dihydrochlorid 2-[trans-(4-aminocyklohexyl)amino]-6-(ethylamino)-9-cyklopentylpurinu, připravena za použití 2-chlor-6-(ethylamino)-9-cyklopentylpurinu, přičemž se postupovalo v podstatě stejným způsobem jako v příkladu 1, Schéma A, stupeň (c).

CIMS (NH₃) 472 (MH⁺); R_f (min) = 3,46.

Příklad 34

Dihydrochlorid 2-[trans-(4-aminocyklohexyl)amino]-6-[(cyklopropyl)methylamino]-9-cyklopentylpurinu.

Schéma Á, stupeň (b):

2-chlor-6-[(cyklopropyl)methylamino]-9-cyklopentylpurin.

Podle tohoto postupu byla výše uvedená sloučenina, 2-chlor-6-[(cyklopropyl)methylamino]-9-cyklopentylpurin, připravena za použití 2,6-dichlor-9-cyklopentylpurinu, aminomethylcyklopropanu a triethylaminu·, přičemž se postupovalo v podstatě stejným způsobem jako v příkladu 1, Schéma A, stupeň (b).

Schéma A, stupeň (c):

Dihydrochlorid 2-[trans-(4-aminocyklohexyl)amino]-6f-««

-[(cyklopropyl)methylamino]-9-cyklopentylpurinu.

Podle tohoto postupu byla požadovaná sloučenina, dihydrochlorid 2-[trans-(4-aminocyklohexyl)amino]-6-[(cyklopropyl)methylamino]-9-cyklopentylpurinu, připravena za použiti 2-chlor-6-[(cykiopropyi)methylamino]-9-cyklopentylpurinu, přičemž se postupovalo v podstatě stejným způsobem jako v příkladu 1, Schéma A, stupeň (c). CIMS (NH₃) 370 (MH⁺); R_f (min) = 2,21---Příklad 35

Dihydrochlorid 2-[trans-(4-aminocyklohexyl)amino]-6-[2-fenethylhydrazino]-9-cyklopentylpurinu.

Schéma A, stupeň (b):

2-chlor-6-[2-fenethylhydrazino]-9-cyklopentylpurin.

Podle tohoto postupu byla uvedená sloučenina, 2-chlor-6-[2-fenethylhydrazino]-9-cyklopentylpurin, připravena za použití 2,6-dichlor-9-cyklopentylpurinu, 2-fenylethylhydrazinu a triethylaminu, přičemž se postupoval ó v podstatě stejným způsobem jako v příkladu *1 Schéma A, stupeň (b) .

Schéma A, stupeň (c) :

Podle tohoto postupu byla uvedená sloučenina, dihydrochlorid 2-[trans-(4-aminocyklohexyl)amino]-6-[2-fenethylhydrazino]-9-cyklopentylpurinu, připravena za použití 2-chlor-6-[2-fenethylhydrazino]-9-cyklopentylpurinu, přičemž se postupovalo v podstatě

• · · · · · • · t ·· ·· ·· stejným způsobem jako v příkladu 1, Schéma A, stupeň (c). CIMS (NH₃) 435 (MH⁺); R_f (min) = 3,54.

Přiklad 36

Dihydrochlorid 2-[trans-(4-aminocyklohexyl)amino]-6-[(3-methyIbutyl)amino]-y-cyklopentylpurinu.

Schéma A, stupeň (b);

-2—ch-l-ot-6—[-(-3—methy-lhutyl-)-amino-]^9^cy-klopenty_lp-ur_iii___

Podle tohoto postupu byla požadovaná sloučenina,

2- chlor-6-[(3-methylbutyl)amino]-9-cyklopentylpurin, připravena za použití 2,6-dichlor-9-cyklopentylpurinu,

3- methylbutylaminu a triethylaminu, přičemž se postupovalo v podstatě stejným způsobem jako v příkladu 1, Schéma A, stupeň (b).

Schéma A, stupeň (c):

Dihydrochlorid 2-[trans-(4-aminocyklohexyl)amino]-6-[(3-methylbutyl)amino]-9-cyklopentylpurinu.

~ Podle tohoto postupu byla tato požadovaná sloučenina-, dihydrochlorid 2-[trans-(4-aminocyklohexyl)amino]-6-[(3-methylbutyl)amino]-9-cyklopentylpurinu, připravena za použití 2-chlor-6-[(3-methylbutyl)amino]-9-cyklopentylpurinu, přičemž se postupovalo v podstatě stejným způsobem jako v přikladu 1, Schéma A, stupeň (c). CIMS (NH₃) 386 (MH⁺); R_f (min) = 3,53.

Příklad 37

Dihydrochlorid 2-[trans-(4-aminocyklohexyl)amino]-6-[(butyl)amino]-9-(2-propyl)purinu.

• ·· *· ·· • · · · · · · » • φ · t · » t • φ · · · · · · • a · · · · · ··· ·« · * <·

Schéma A, stupeň (b) :

2-chlor-6-[(butyl)amino]-9-(2-propyl)purin.

Dza^Tq + /-»krx+/-x 1-X/-XC·-t-nrxii α ηητίΡΓίπ'ίζαηά Ί mirp.n 4 r»íA

UU V VA1VJ U W p/V7kJ W ** J -A.W* p» «_— — ,

2-chlor-6-[(butyl)amino]-9-(2-propyl)purin, připravena za použiti 2,6-dichlor-9-(2-propyi)purinu, butylaminu a triethylaminu, přičemž se postupovalo v podstatě stejným způsobem jako v příkladu 1, Schéma A, stupeň (b).

Schéma A, stupeň (c):

Podle tohoto postupu byla požadovaná sloučenina, dihydrochlorid 2-[trans-(4-aminocyklohexyl)amino]-6-[(butyl)amino]-9-(2-propyl)purinu, připravena za použití 2-chlor-6-. [(butyl)amino]-9-(2-propyl)purinu, přičemž se postupovalo v podstatě stejným způsobem jako v příkladu 1, Schéma A, stupeň (c).

CIMS (NH₃) 346 (MH⁺); R_f (min) = 3,33.

P ř i k J _a a ₃₈

Dihydrochlorid 2-[trans-(4-aminocyklohexyl)amino]-6-(2-furanmethylamino)-9-cyklopentylpurinu.

Schéma A, stupeň (b):

,2-chlor-6-(2-furanmethylamino)-9-cyklopentylpurin.

Podle tohoto postupu byla požadovaná sloučenina, 2-chlor-6-(2-furanmethylamino)-9-cyklopentylpurin, připravena za použití 2,6-dichlor-9-cyklopentylpurinu, furfurylaminu a triethylaminu, přičemž se postupovalo v podstatě stejným způsobem jako v příkladu 1, Schéma A,

stupeň (b).

Schéma A, stupeň (c):

ΤΉ hvd d 2- Γ -f-τ-απβ _ (d-ami nnpvld nbfiYvl Ί amino 1 - 6 -(2-furanmethylamino)-9-cyklopentylpurinu.

Podle tohoto postupu byla požadovaná sloučenina, dihydrochlorid 2-[trans-(4-aminocyklohexyl)amino]-6(-2—f-u-j?a-nme-t-hy-l-am-i-no-)-^—Gy-kJL-opentyXpur-inu-,_př_iprav-ena_zapoužití 2-chlor-6-(2-furanmethylamino)-9-cyklopentylpurinu, přičemž se postupovalo v podstatě stejným způsobem jako v příkladu 1, Schéma A, stupeň (c) .

CIMS (NH₃) 396 (MH⁺); R_f (min) = 3,38.

Příklad 39

Trihydrochlorid 2-[trans-(4-aminocyklohexyl)amino]-6-[(3-(2-imidazoyl)propyl)amino]-9-(2-propyl)purinu

Schéma A, stupeň (b):

2-chlor-6-[(3-(2-imidazoyl)propyl)amino]-9-(2-propyl)purin \ Podle “tóhótói postupu? bylá~ požadovaná sloučeni na, .....

2- chlor-6-[(3-(2-imidazoyl)propyl)amino]-9-(2-propyl)purin, připravena za použití 2,6-dichlor-9-(2-propyl)purinu,

3- (2-imidazoyl)propylaminu a triethylaminu, přičemž se postupovalo v podstatě stejným způsobem jako v příkladu 1,

Schéma A, stupeň (b).

Schéma A, stupeň (c):

Trihydrochlorid 2-[trans-(4-aminocyklohexyl)amino]-6-[(3-(2-imidazoyl)propyl)amino]-9-(2-propyl)purinu.

Při provádění tohoto postupu byla požadovaná

- 85 -	9 99 • · · 9 • · ·	• 9 9 99 9 9 9 9 ·	·· 99 * 9 9 9 9 · · 9
	• · · • · · · ·	• · · ·· 9 · 9	9 9 9 9 • 9, 9 9

sloučenina, trihydrochlorid 2-[trans-(4-aminocyklohexyl)-amino]-6-[(3-(2-imidazoyl)propyl)amino]-9-(2-propyl)-purinu, připravena za použití 2-chlor-6-[(3-(2-imidazoyl)-propyl)amino]-9-(2-propyl)purinu, přičemž se postupovalo v podstatě stejným způsobem jako v příkladu 1, Schéma A, stupeň (c).

CIMS (NH₃) 398 (MH⁺); R_f (min) = 3,01.

Příklad

Dihydrochlorid 2-[trans-(4-aminocyklohexyl)amino]-6— [ 4 — chior- 2-1 iuor Denzy± j amino j -9-cyKlopentyxpurmu

Schéma A, stupeň (b):

2-chlor-6-[(4-chlor-2-fluorbenzyl)amino]-9-cyklopentyl-purin.

Podle tohoto postupu byla požadovaná sloučenina, 2-chlor-6-[(4-chlor-2-fluorbenzyl)amino]-9-cyklopentyl-purin, připravena za,použití 2,6-dichlor-9-cyklopentylpurinu, 4-chlor-2-fluorbenzylaminu a triethylaminu, přičemž se postupovalo v podstatě stejným způsobem jako v příkladu 1, Schéma A, stupeň (b).

Schéma A, stupeň (c):

Dihydrochlorid 2-[trans-(4-aminocyklohexyl)amino]-6-[(4-chlor-2-fluorbenzyl)amino]-9-cyklopentylpurinu.

Při provádění tohoto postupu byla požadovaná sloučenina, dihydrochlorid 2-[trans-(4-aminocyklohexyl)-amino]-6-[(4-chlor-2-fluorbenzyl)amino]-9-cyklopentyl-purinu, připravena za použití 2-chlor-6-[(4-chlor-2-fluorbenzyl)amino]-9-cyklopentylpurinu, přičemž se postupovalo v podstatě stejným způsobem jako v příkladu 1,

Schéma A, stupeň (c).

CIMS (NH₃) 458 (MH⁺); R_f (min) = 2,31.

Příklad 41

Dihydrochlorid 2-[trans-(4-aminocyklohexyl)amino]-6-(hexylamino)-9-cyklopentylpurinu.

O „ -|_ í Λ ---, ^v / 1\ otiiieiiia λ, stupen lOj;

~2-chlor-6-(hexylamino)-9-cyklopentylpurin.

Podle tohoto postupu byla požadovaná sloučenina, 2-chlor-6-(hexylamino)-9-cyklopentylpurin, připravena za použití 2,6-dichlor-9-cyklopentylpurinu, n-hexylaminu a triethylaminu, přičemž se postupovalo v podstatě stejným způsobem jako v příkladu 1, Schéma A, stupeň (b).

Schéma A, stupeň (c):

Podle tohoto postupu byla uvedená sloučenina, dihydrochlorid 2-[trans-(4-aminocyklohexyl)amino]-6-(hexylamino)-9-cyklopentylpurinu, připravena za použití 2-chlor-6-(hexylamino)-9-cyklopentylpurinu, přičemž se postupovalo v podstatě stejným způsobem jako v příkladu 1, Schéma A, stupeň (c).

CIMS (NH₃) 400 (MH⁺); R_f (min) =4,03.

Příklad 42

Dihydrochlorid 2-[trans-(4-aminocyklohexyl)amino]-6-[(2-fluorbenzyl)amino]-9-cyklopentylpurinu.

Schéma A, stupeň (b):

• ·

2-chlor-6-[(2-fluorbenzyl)amino]-9-cyklopentylpurin.

Při provádění tohoto postupu byla uvedená sloučenina, 2-chlor-6-[(2-fluorbenzyl)amino]-9-cyklopentylpurin, připravena za použití 2,6-dichlor-9-cyklopentylpurinu,

2-fluorbenzylaminu a triethylaminu, přičemž se postupovalo v podstatě stejným způsobem jako v příkladu 1, Schéma A, stupeň (b).

Schéma A, stupeň (c):

umydrochlorid 2-[trans- (4-amlnocyklohexyl)aminoj-6-[(2-fluorbenzyl)amino]-9-cyklopentylpurinu

Při provádění tohoto postupu byla uvedená sloučenina, dihydrochlorid 2-[trans-(4-aminocyklohexyl)amino]-6-[(2-fluorbenzyl)amino]-9-cyklopentylpurinu, připravena za použití 2-chlor-6-[(2-fluorbenzyl)amino]-9-cyklopentylpurinu, přičemž se postupovalo v podstatě stejným způsobem jako v příkladu 1, Schéma A, stupeň (c). CIMS (NH₃) 424 (MH⁺); R_f (min) =2,22.

Příklad 43

Dihydrochlorid 2-[trans-(4-aminocyklohexyl)amino]-6- [2-(fenyl)ethylamino]-9-cyklopentylpurinu.

Schéma A, stupeň (b):

2-chlor-6-[2-(fenyl)ethylamino]-9-cyklopentylpurin.

Podle tohoto postupu byla tato sloučenina,

2-chlor-6-[2-(fenyl)ethylamino]-9-cyklopentylpurin, připravena za použití 2,6-dichlor-9-cyklopentylpurinu, 2-aminoethylbenzenu a triethylaminu, přičemž se postupovalo v podstatě stejným způsobem jako v příkladu 1, Schéma A, • ·♦ ·· ·· ♦; · · · · ♦ ♦ · »' » » ♦/ • · « · · · »··«; • · · · · · · · » · » < « · · · '· » · · ♦ ··· · · ··· '·· · W; ·· stupeň (b).

Schéma A, stupeň (c):

Dihydrochlorid 2-[trans-(4-aminocyklohexyl)amino]-6-[2-(fenyl)ethylamino]-9-cyklopentylpurinu.

Při provádění tohoto postupu byla uvedená sloučenina,

3-6UIiijuxOvííxux tu L ttciiio- ^T-aiiitiiuujhxuiiCA.yřy aminu J

-[2-(fenyl)etfiylamino]-9-cyklopentylpurinu, připravena za použití 2-chlor-6-[2-(fenyl)ethylamino]-9-cyklopentyl_ Vií í -r- -i -r-i :mz se postupovalo v poGstate stcjným způsobem jako v příkladu 1, Schéma A, stupeň (c) .

CIMS (NH₃) 420 (MH⁺); R_f (min) =0,43.

Příklad 44

Dihydrochlorid 2-[trans-(4-aminocyklohexyl)amino]-6-(propylamino)-9-cyklopentylpurinu.

Schéma A, stupeň (b):

2-chlor-6-(propylamino)-9-cyklopentylpurin.

Při provádění tohoto postupu byla uvedená sloučenina, 2-chlor-6-(propylamino)-9-cyklopentylpurin, připravena za použití 2,6-dichlor-9-cyklopentylpurinu, n-propylaminu a triethylaminu, přičemž se postupovalo v podstatě stejným způsobem jako v příkladu 1, Schéma A, stupeň (b).

Schéma A, stupeň (c):

Podle tohoto postupu byla uvedená sloučenina, dihydrochlorid 2-[trans-(4-aminocyklohexyl)amino]-6-M1

-(propylamino)-9-cyklopentylpurinu, připravena za použití 2-chlor-6-(propylamino)-9-cyklopentylpurinu, přičemž se postupovalo v podstatě stejným způsobem jako v příkladu 1, Schéma A, stupeň (c).

CIMS (NH₃) 358 (MH⁺); R_f (min) = 3,31.

Příklad

T_ 2 1____1___1_-1___! J x x xxiy ui uumui xu r------— i λ ~__'__~1______i \ ____·__l zr

L Lxtxxia- (^-cuii-Liiuu^A-LuiíCAy x) tmimu j - u · (benzylamino) -9- (’2-propyl) purinu.

cnema n., sxupen \ o) *

2-chlor-6-(benzylamino)-9-(2-propyl)purin.

Při tomto postupu byla uvedená sloučenina,

2-chlor-6-(benzylamino)-9-(2-propyl)purin, připravena za použití 2,6-dichlor-9-(2-propyl)purinu, benzylaminu a triethylaminu, přičemž se postupovalo v podstatě stejným způsobem jako v příkladu 1, Schéma A, stupeň (b).

Schéma A, stupeň (c):

Dihydrochlorid 2-[trans-(4-aminocyklohexyl)amino]-6-(benzylamino)-9-(2-propyl)purinu.

Podle tohoto postupu byla uvedená sloučenina, dihydrochlorid 2-[trans-(4-aminocyklohexyl)amino]-6-(benzylamino)-9-(2-propyl)purinu, připravena za použití 2-chlor-6-(benzylamino)-9-(2-propyl)purinu, přičemž se postupovalo v podstatě stejným způsobem jako v přikladu 1, Schéma A, stupeň (c).

CIMS (NH₃) 380 (MH⁺); R_f (min) = 3,34.

Příklad 46

Dihydrochlorid 2-[trans-(4-aminocyklohexyl)amino]-6-

-[3-(l-imidazolyl)propylamino]-9-cyklopentylpurinu

Schéma A, stupeň (b):

2-chlor-6-[3-(l-imídazolyl)propylaminoj-9-cyklopentylpurin.

Podle tohoto postupu byla požadovaná sloučenina, 2-chlor-6-[3-(l-imidazolyl)propylamino]-9-cyklopentylpurin, či 2 i r—i -í -+- -í O A _ <4 i Ί nv _ Q _ z>xrV- Ί ηη<=π + ν1 m ír· *í m i pi ipiav C1J-CU LO. J- U x ₉ ks ~ v*x*-*xxxwx--* j v j ,

1- ('3-aminopropyl) imidazolu a triethylaminu, přičemž se postupovalo v podstatě stejným způsobem jako v příkladu 1, >K-ztÍ^lllCX ΓΎ ,

Schéma A, stupeň (c):

Dihydrochlorid 2-[trans-(4-aminocyklohexyl)amino]-6- [3-(l-imidazolyl)propylamino]-9-cyklopentylpurinu

Při tomto postupu byla požadovaná sloučenina, dihydrochlorid 2-[trans-(4-aminocyklohexyl)amino]-6-[3-(1-imidazolyl)propylamino]-9-cyklopentylpurinu, připravena za použití 2-chlor-6-[3-(1-imidazolyl)-propylamino]-9-cyklopentylpurinu, přičemž se postupovalo v podstatě stejným způsobem jako v příkladu 1, Schéma A, stupeň (c).

CIMS (NH₃) 424 (MH⁺); R_f (min) =3,13.

P ř í k 1 a d 47

Dihydrochlorid 2-[trans-(4-aminocyklohexyl)amino]-6-[benzylamino]-9-cyklopentylpurinu.

Schéma A, stupeň (b):

2-chlor-6-[benzylamino]-9-cyklopentylpurin.

Při provádění tohoto postupu byla uvedená sloučenina,

2-chlor-6-[benzylamino]-9-cyklopentylpurin, připravena za použití 2,6-dichlor-9-cyklopentylpurinu, benzylaminu a triethylaminu, přičemž se postupovalo v podstatě stejným způsobem jako v příkladu í, Schéma A, stupeň (b).

Schéma A, stupeň (c):

Dihydrochlorid 2-[trans-(4-aminocyklohexyl)amino]-6Γ Κ~-»Γ-»ττΊ «-» «V* -í x-», 1 O 71.7- Ί T-\Τ'* -f- X 7 1 ΤΛ1 1ΤΊ TI 1 1

L UCiiZ.j' -LCUll J-1XV7 J - JZ - u-j Λ. j_ u J V4.J. J-xxJ. .

Podle tohoto postupu byla uvedená sloučenina, Ginydrocfiioná z — ltrans— ^#-ainj.iioi;yíixuhcxyx)<rfnino] — 6 —

-[benzylamino]-9-cyklopentylpurinu, připravena za použití 2-chlor-6-[benzylamino]-9-cyklopentylpurinu, přičemž se postupovalo v podstatě stejným způsobem jako v příkladu 1, Schéma A, stupeň (c).

CIMS (NH₃) 406 (MH⁺); R_f (min) = 2,23.

Příklad 48

Dihydrochlorid 2-[trans-(4-aminocyklohexyl)amino]-6-[(2,4-dichlorbenzyl)amino]-9-cyklopentylpurinu.

Schéma A, stupeň (b):

2-chlor-6-[(2,4-dichlorbenzyl)amino]-9-cyklopentylpurin.

Podle tohoto postupu byla požadovaná sloučenina, 2-chlor-6-[(2,4-dichlorbenzyl)amino]-9-cyklopentylpurin, připravena za použití 2,6-dichlor-9-cyklopentylpurinu,

2,4-dichlorbenzylaminu a triethylaminu, přičemž se postupovalo v podstatě stejným způsobem jako v příkladu 1, Schéma A, stupeň (b).

Schéma A, stupeň (c):

Dihydrochlorid 2-[trans-(4-aminocyklohexyl)amino]-692 « ·· ·· ·· • · · ·' · · '·, • · · · * .· «' • · · · · · · ··· «« ·· ··

-[(2,4-dichlorbenzyl)amino]-9-cyklopentylpurinu

Při provádění tohoto postupu byla uvedená sloučenina, dihydrochlorid 2-[trans-(4-aminocykiohexyi)amino]-6-[(2,4-dichlorbenzyl)amino]-9-cyklopentylpurinu, připravena za použití 2-chlor-6-[(2,4-dichlorbenzyl)amino]-9-cyklopentylpurinu, přičemž se postupovalo v podstatě o uvj xxjy ui bem jako v příkladu 1, Schéma A, stupeň (c).

CIMS—(NHy)^t74—(ΜΗ*)—R^-(m±nj-=-2T3-4—

B S. ' V Ί ,4 AQ

X X. X. A. JL. Ol V» “ >

Dihydrochlorid 2-[trans-(4-aminocyklohexyl)amino]-6-[2,2,2-trifluorethylamino]-9-cyklopentylpurinu.

Schéma A, stupeň (b):

2-chlor-6-[2,2,2-trifluorethylamino]-9-cyklopentylpurin.

Podle tohoto postupu byla požadovaná sloučenina, 2-chlor-6-[2,2,2-trifluorethylamino]-9-cyklopentylpurin, připravena za použití 2,6-dichlor-9-cyklopentylpurinu, hydrochloridu 2,2,2-trifluorethylaminu a triethylaminu, přičemž se postupovalo v podstatě stejným způsobem jako v příkladu 1, Schéma A, stupeň (b).

Schéma A, stupeň (c):

Podle tohoto postupu byla požadovaná sloučenina, dihydrochlorid 2-[trans-(4-aminocyklohexyl)amino]-6-[2,2,2-trifluorethylamino]-9-cyklopentylpurinu, připravena za použití 2-chlor-6-[2,2,2-trifluorethylamino]-9-cyklopentylpurinu, přičemž se postupovalo v podstatě

9 <9 9 9 9 *9 9 9 9 9

9 9 9 9 9

9 9 9 9 9 9

9 9 9 9 9 stejným způsobem jako v příkladu 1, Schéma A, stupeň (c). CIMS (NH₃) 398 (MH⁺); R_f (min) = 3,33.

Příklad 50

Dihydrochlorid 2-[trans-(4-aminocyklohexyl)amino]-6-[(4-fluorbenzyl)amino]-9-cyklopentylpurinu.

Schéma A, stupeň (b):

2- chlor - 6 - [“(4^řTuorbenzy Ij^anriňoj^—cyklOpen-tylpuri-nPodic tohoto postupu byj.a poradovánu sloučenina, 2-chlor-6-[(4-fluorbenzyl)amino]-9-cyklopentylpurin, připravena za použití 2,6-dichlor-9-cyklopentylpurinu,

4-fluorbenzylaminú a triethylaminu, přičemž se postupovalo v podstatě stejným způsobem jako v příkladu 1, Schéma A, stupeň (b).

Schéma A, stupeň (c):

Dihydrochlorid 2-[trans-(4-aminocyklohexyl)amino]-6- [ (4-fluorbenzyl)amino]-9-cyklopentylpurinu.

Při provádění tohoto postupu byla uvedená sloučenina, dihydrochlorid 2-[trans-(4-aminocyklohexyl)amino]-6-[(4-fluorbenzyl)amino]-9-cyklopentylpurinu, připravena za použití 2-chlor-6-[(4-fluorbenzyl)amino]-9-cyklopentyl-purinu, přičemž se postupovalo v podstatě stejným způsobem jako v příkladu 1, Schéma A, stupeň (c).

CIMS (NH₃) 424 (MH⁺); R_f (min) = 2,24.

Příklad 51

Dihydrochlorid 2-[trans-(4-aminocyklohexyl)amino]-6-[(3-jodbenzyl)amino]-9-(2-propyl)purinu.

	• · · • «	• •	·* •
·· · • ·	• •	* ·	• ♦
						·,
• ·	·'	• ·	•	•	• ·	•
··· ··		(·· ·	·,·	• ·	··

Schéma A, stupeň (b) :

2-chlor-6-[(3-jodbenzyl)amino]-9-(2-propyl)purin.

Podle tohoto postupu byla požadovaná sloučenina,

2- chlor-6-[(3-jodbenzyl)amino]-9-(2-propyl)purin, připravena za použití 2,6-dichlor-9-cyklopentylpurinu,

3- jodbenzylaminu a triethylaminu, přičemž se postupovalo v podstatě stejným způsobem jako v příkladu 1, Schéma A, stupeň (b).

Schéma A, stupen (cj:

Podle tohoto postupu byla požadovaná sloučenina, dihydrochlorid 2-[trans-(4-aminocyklohexyl)amino]-6-[(3-jodbenzyl)amino]-9-(2-propyl)purinu, připravena za použití 2-chlor-6-[(3-jodbenzyl)amino]-9-(2-propyl)purinu, přičemž se postupovalo v podstatě stejným způsobem jako v příkladu 1, Schéma A, stupeň (c) .

CIMS (NH₃) 506 (MH⁺); R_f (min) =3,53.

Příklad 52

Dihydrochlorid 2-[trans-(4-aminocyklohexyl)amino]-6-[2,2,2-trifluorethylhydrazino]-9-cyklopentylpurinu.

Schéma A, stupeň (b):

2-chlor-6-[2,2,2-trifluorethylhydrazino]-9-cyklo-pentyIpur in.

Při provádění tohoto postupu byla uvedená sloučenina, 2-chlor-6-[2,2,2-trifluorethylhydrazino]-9-cyklo-pentylpurin, připravena za použití 2,6-dichlor-9-

- 95 cyklopentylpurinu, 2,2,2-trifluorethylhydrazinu a triethylaminu, přičemž se postupovalo v podstatě stejným způsobem jako v příkladu 1, Schéma A, stupeň (b).

Schéma A, stupeň (c):

Podle tohoto postupu byla uvedená sloučenina-; dihydrochlorid 2-[trans-(4-aminocyklohexyl)amino]-6- [2,2,2-trif Iuoretnyj_nyurazinoj -y-cyklopentyIpurinu, připravena za použití 2-chlor-6-[2,2,2-trifluorethyl-hydrazino]-9-cyklopentylpurinu, přičemž se postupovalo v podstatě stejným způsobem jako v příkladu 1, Schéma A, stupeň (c).

CIMS (NH₃) 413 (MH⁺); R_f (min) = 3,28.

Příklad 53

Dihydrochlorid 2-[trans-(4-aminocyklohexyl)amino]-6-[(3-hydroxypropyl)amino]-9-cyklopentylpurinu.

Schéma A, stupeň (b):

2-chlor-6-[(3-hydroxypropyl)amino]-9-cyklopentylpurin.

Podle tohoto postupu byla uvedená sloučenina,

2- chlor-6-[(3-hydroxypropyl)amino]-9-cyklopentylpurin, připravena za použití 2,6-dichlor-9-cyklopentylpurinu,

3- amino-l-propanolu a triethylaminu, přičemž se postupovalo v podstatě stejným způsobem jako v příkladu 1, Schéma A, stupeň (b).

Schéma A, stupeň (c):

Dihydrochlorid 2-[trans-(4-aminocyklohexyl)amino]-6-

• * ·· ·· ·· < · « · * »» · • · · · · · · • · ··· ·» · ·· · · · · · ··· ·· ·· ··

- [ (3-hydroxypropyl)amino]-9-cyklopentylpurinu

Podle tohoto postupu byla uvedená sloučenina, dihydrochlorid 2-[trans-(4-aminocyklohexyl)amino]-6-[ (3-hydroxypropyl)amino]-9-cyklopentylpurinu, připravena za použití 2-chlor-6-[(3-hydroxypropyl)amino]-9-cyklopentylpurinu, přičemž se postupovalo v podstatě stejným způsobem jako v příkladu 1, Schéma A, stupen (c).

CIMS (NHp 374 (MH*’) ; R_f (min) = 3,177 f ř i k 1 tx d 5 4

Dihydrochlorid 2-[trans-(4-aminocyklohexyl)amino]-6- [ (5-hydroxy-1,5-dimethylhexyl)amino]-9-cyklopentyl-purinu.

Schéma A, stupeň (b):

2-chlor-6-[(5-hydroxy-l,5-dimethylhexyl)amino]-9-cyklopentylpurin.

Při provádění postupu podle tohoto provedení, byla požadovaná sloučenina, 2-chlor-6-[(5-hydroxy-l,5-dimethýlhexyl)amino]-9-cyklopentylpurin, připravena za použití 2,6-dichlor-9-cyklopentylpurinu, hydrochloridu 6-amino-2-methyí-2-heptanolu a triethylaminu, přičemž se postupovalo v podstatě stejným způsobem jako v příkladu 1, Schéma A, stupeň (b).

Schéma A, stupeň (c):

Dihydrochlorid 2-[trans-(4-aminocyklohexyl)amino]-6- [ (5-hydroxy-l,5-dimethylhexyl)amino]-9-cyklopentyl-purinu.

Podle tohoto postupu byla požadovaná sloučenina,

dihydrochlorid 2-[trans-(4-aminocyklohexyl)amino]-6-[(5-hydroxy-l,5-dimethylhexyl)amino]-9-cyklopentyl-purinu, připravena za použití 2-chlor-6-[(5-hydroxy-1,5-dimethyihexyl)aminoj-9-cyklopentylpurinu, přičemž se postupovalo v podstatě stejným způsobem jako v příkladu 1, Schéma A, stupeň (c).

CIMS (NH₃) 444 (MH⁺); R_f (min) = 3,37.

P ř i k 1 a d 55

Dihydrochlorid 2-[trans-(4-aminocyklohexyl)amino]-6[ (4-hydroxyienyijexnyiamino j -9-cykxopentyJ.purinu

Schéma A, stupeň (b) :

2-chlor-6-[(4-hydroxyfenyl)ethylamino]-9-cyklopentylpurin.

Podle tohoto postupu byla uvedená sloučenina, 2-chlor-6-[(4-hydroxyfenyl)ethylamino]-9-cyklopentylpurin, připravena za použití 2,6-dichlor-9-cyklopentylpurinu, hydrochloridu tyraminu a triethylaminu, přičemž se postupovalo v podstatě stejným způsobem jako v příkladu 1, Schéma A, stupeň (b).

Schéma A, stupeň (c):

Dihydrochlorid 2-[trans-(4-aminocyklohexyl)amino]-6- [ (4-hydroxyfenyl)ethylamino]-9-cyklopentylpurinu

Podle tohoto postupu byla požadovaná sloučenina, dihydrochlorid 2-[trans-(4-aminocyklohexyl)amino]-6- [ (4-hydroxyfenyl)ethylamino]-9-cyklopentylpurinu, připravena za použití 2-chlor-6-[(4-hydroxyfenyl)-ethylamino]-9-cyklopentylpurinu, přičemž se postupovalo v podstatě stejným způsobem jako v příkladu 1, Schéma A, stupeň (c).

•J 'jé • ·4 · 44 • 4 4 · ·· 4 · • · · 4 4 € • 4 4 4 4 4

·.*· 44 ·«· 41 ♦ · '/· • · · · « 4 4 9 • 4 4 4

4· *e

CIMS (NH₃) 436 (MH⁺); R_f (min) = 3,38.

Příklad. 56

Dihydrochlorid 2-[trans-(4-aminocyklohexyl)amino]-ó-[(8-aminooktyl)amino]-9-cyklopentylpurinu.

Schéma A, stupeň (b):

2- rcr - f\ - Γ ( R - ίΑττπ' nnnlftvl Ί aminnl-Q- i- vH nnpntvl mu — ------ - u \ — ------------—-------J ' —_r---- j

Podle tohoto postupu byla uvedená sloučenina,

O _ T o T* = A __ Γ ( Q ₌ o τη -i tt lz- + \ O tt» T~»r> 1 _ O _ ot rlž· 1 o.tacim -4- τζΊ tmi»· -i -»’ vutu *_/!_ ’_» l ν'-* ώπι riíuUn l- * _í_ * cXiií-lxxO j ~ j h±L’p.'V-ií u j — J-' Ui-U tu , připravena za použití 2,6-dichlor-9-cyklopentylpurinu,

1,8-diaminooktanu a triethylaminu, přičemž se postupovalo v podstatě stejným způsobem jako v příkladu 1, Schéma A, stupeň (b).

Schéma A, stupeň (c):

Dihydrochlorid 2-[trans-(4-aminocyklohexyl)amino]-6-[(8-aminooktyl)amino]-9-cyklopentylpurinu.

Při provádění tohoto postupu byla tato sloučenina, dihydrochlorid 2-[trans-(4-aminocykÍohexyÍ)amino]-6-[ (8-aminooktyl)amino]-9-cyklopentylpurinu, připravena za použití 2-chlor-6-[(8-aminooktyl)amino]-9-cyklopentyl-purinu, přičemž se postupovalo v podstatě stejným způsobem jako v příkladu 1, Schéma A, stupeň (c).

CIMS (NH₃)‘ 443 (MH⁺); R_f (min) = 3,30.

Termín neoplastické onemocnění, použitý v popisu předmětného vynálezu, se vztahuje k abnormálnímu stavu nebo nemoci charakterizované nekontrolovanou proliferací. Neoplastická onemocnění zahrnují leukémie, karcinomy a adenokarcinomy, sarkomy, melanomy a smíšené typy • · novotvarů.

Termín leukémie zahrnuje akutní lymfoblastovou, chronickou lymfocytovou, akutní myeíobiastovou a chronickou myelocytovou leukémii, bez jakéhokoliv omezování pouze na tyto stavy.

T*m τ ό 1/·* /> -i Π ΓΛΤΠΤ r O 0/4 O V* z>Tz· o »* τ·» ornt r Γ7 Τ-» »-·»—» i i -4 c* »-* r -t- ▼»·»-» -»-» » τ . syliivuij v*. iAV*vnwi\tA,x K>X1ÍV111J 11 Lij c iiuvui.va±j čípku, prsu, prostaty, jícnu, žaludku; tenkého střeva, tračníku, vaječníků a plic, bez jakéhokoliv omezování pouze tytí ívy.

Termín sarkomy zahrnuje esteromy, osteosarkom, lipom, liposarkom, hemangiom a hemangiosarkom, bez jakéhokoliv omezování pouze na tyto stavy.

Termín melanom zahrnuje amelanotický a melanotický melanom, bez jakéhokoliv omezování pouze na tyto stavy.

Termín smíšené typy novotvarů zahrnuje karčinosarkom, typu lymfoidní tkáně, sarkom buněk folikulárního retikula a Hodgkinovu chorobu, bez jakéhokoliv omezování pouze na tyto stavy.

Termín terapeuticky účinné množství sloučeniny podle vzorce (I) se týká množství, které je účinné při podání jedné nebo několikanásobné dávky pacientovi, kontrolovat růst novotvaru nebo metastáz novotvarů nebo zabránit apoptóze. Terapeuticky účinné množství sloučeniny podle vynálezu výše uvedeného obecného vzorce bude kolísat podle věku, hmotnosti, typu léčeného novotvaru, kombinace jiných protinádorových léků a dalších kritérií každému odborníkovi pracujícímu v daném oboru běžně známých, při použiti

100 ·· 4 44 ·· 44

standardních klinických a laboratorních testů a postupů. Terapeuticky účinné množství sloučeniny podle vynálezu výše uvedeného obecného vzorce bude kolísat podle typu buněk náchylných k apoptóze, lokalizace infarktu, a také věku, hmotnosti a dalších kritérií každému odborníkovi pracujícímu v daném oboru běžně známých.

ΤβίϊΓϊϊΐτη konXrolei 2?u.s”tLi novoXvcijrLi ss les zpOmalení^-; přerušení^-; pozastavení^-nebo^-zastavení růstu novotvaru nebo metastáz novotvaru. Termín kontrola růstu novotvaru se také ν’metastáz novotvaru.

nebo

Účinné množství sloučeniny podle vynálezu výše uvedeného obecného vzorce je to množství, které je účinné při podání jedné nebo několikanásobné dávky pacientovi zajistit protinádorové působení nebo zabránit apoptóze. Termín protinádorový účinek se vztahuje ke zpomalení, přerušení, zabránění nebo zničení dalšího růstu neoplastických buněk.

Účinné protinádorové množství sloučeniny podle vynálezu výše uvedeného obecného vzorce může být snadno určeno ošetřuj ícím lékařem, j ako odborníkem pracuj ícím v daném oboru, při použití známých technik a pozorováním výsledků dosažených za analogických okolností. Při určování účinného množství bere ošetřující lékař do úvahy velký počet faktorů, včetně, ale bez jakéhokoliv omezení pouze na tyto faktory, druhu savce, jeho velikosti, věku a povšechného zdravotního stavu, specifické nemoci, které se léčba týká, stupně nebo komplikace nebo závažnosti nemoci, reakce jednotlivého pacienta, konkrétní podávané sloučeniny podle vynálezu výše uvedeného obecného vzorce, způsobu podávání,

101

charakteristické biologické dostupnosti podávaného přípravku, vybraného dávkového režimu, použití doprovodné medikace a dalších relevantních okolnosti.

Další provedení podle předkládaného vynálezu zahrnuje způsob profylaktického ošetření pacienta v riziku vývoje neoplastického onemocnění, přičemž tento způsob zahrnuje podávání profylakticky účinného protinádorového množství “sloučeniny podle vynálezu výše specifikovaného obecného vzorce. Termín pacient v riziku vývoje neoplastického

VJ1XV1HV*>

ss vzxaniij © κ pacienxovi, Kxcxy GiKy χοζρυζπ&ιχβ genetické predispozice ke tvorbě novotvarů měl nebo v současnosti má novotvar, je v expozici karcinogenním činidlům, má rizikovou dietu, věk nebo má další rizikové faktory spojené s vývojem neoplastického onemocnění. Upřednostňovaní pacienti v riziku vývoje neoplastického onemocnění jsou pacienti, kteří mají pozitivní vyšetření na onkogenní virus, jsou v remisi po dřívější léčbě novotvaru(ů), konzumují tabákové výrobky nebo byli dříve exponováni karcinogenům jako je azbest nebo mají pozitivní vyšetření na různé neoplastické genetické markéry.

Onkogenní viry jsou ty viry, které jsou ve spojení s karcinomy. Například virus Rousova sarkomu kuřat, virus Shopova papilomu králíků a myší leukemické viry jsou zvířecí viry, o kterých se bylo potvrzeno, že hrají důležitou roli ve vývoji různých druhů karcinomů. Lidský papilomavirus je spojen s karcinomem pohlavních orgánů. Virus vyvolávající nemoc molluscum contagiosum je sdružován s tumory molluscum contagiosum. Virus JC, lidský papovirus, je spojován s poruchami retikuloendotelového systému, jako je leukémie a lymfom. Lidské retroviry, jako lidské lymfotropní viry T buňky (HTLV) typu 1 a 2 jsou spojovány s některými

102

lidskými leukémiemi a lymfomy. Viry lidské imunodeficience (HIV) typu 1 a 2 jsou příčinou AIDS. Virus Epstein-Barrové je spojován s různými malignitami, včetně nazofaryngálního karcinomu, afrického Burkittova lymfomu a lymfomů u příjemců orgánových transplantátů, kterým je podávána imunosuprese.

Genetickými markéry jsou mutace, přesmyky a podobně, iako například BRCA 1, bcl-l/PRADl, cyklin D1/CCND1, ρ16, “GenetícKe marker y“

TNK-4acdk4, zejména mutace Arg24Cys, pló jsou spojovány s predispozicí k různým novotvarům. Například alterace v genu BRCA 1 jsou sdružovány s vyšším rizikem karcinomu prsu.a vaječníků. Další genetické markéry zahrnují alterace v genu MMSC1, který interaguj e s genem MMCA1 karcinomu mozku a prostaty, v genu CtIP, který je sdružován s genem BRCA1 při karcinomu prsu a vaječníků, váže se na gen BRCA1 a je spojován s metabolickou drahou onkogenu E1A, a v genu MKK3 , který je kontrolní gen buněčného cyklu, který působí jako nádorový supresor při karcinomu plic prostřednictvím aktivace apoptózy. Pacienti v riziku vývoje neoplastického onemocnění také zahrnují pacienty, kteří nadměrně exprimují různé proteiny buněčného cyklu, včetně cdk4, cyklinů B1 a Έ. Pacienti v riziku vývoje neoplastického onemocnění jsou pacienti, kteří mají zvýšené hladiny nádorových markérů. Známé nádorové markéry zahrnují prostatický specifický antigen (PSÁ) a plazmatický růstový faktor 1 podobný inzulínu (IGF-lj , což jsou markéry karcinomu prostaty. Proteiny jaderné matrix (NMP) jsou spojovány s výskytem karcinomu, zejména močového měchýře a tračníku.

Předpokládá se, že účinné množství sloučeniny podle předmětného vynálezu výše specifikovaného obecného vzorce kolísá od přibližně 25 ng na kg tělesné hmotnosti za den

ΊΓ2

- 103

(ng/kg/den) do přibližně 500 mg/kg/den. Výhodné účinné množství sloučeniny podle vynálezu výše specifikovaného obecného vzorce se pohybuje od přibližně 1 gg/kg/den do přibližně ’ f\ — /1__/ J__ gg/Kg/UOli.

Vyhuuncj ai iiiJLiuédiVÍ sluUucnii±y podle vynálezu výše specifikovaného obecného vzorce se pohybuje od přibližně 1 gg/kg/den do přibližně 50 gg/kg/den.

Sl nnr-pni na vvíp. ςηρ,ρ.ι f i knvanéhn nhernéhn vznrr.e nnHle ~vy nál-ezu-můž e^—být^—pod á vána—v^L-ibobol né—formě^-nebo^-ib o volnýmzpůsobem, který učiní sloučeninu biologicky dostupnou v účinném množství. Sloučeniny podle vynálezu mohou být podávány perorálním nebo parenterálním způsobem. Sloučeniny podle vynálezu mohou být podávány perorálně, subkutánně, intramuskulárně, intravenózně, transdermálně, intranazálně, rektálně, okulárně a podobně. Výhodné j e perorální podávání. Odborník, který připravuje farmaceutické prostředky, může snadno určit příslušné formy sloučeniny podle vynálezu podle zjištěných konkrétních vlastností sloučeniny, léčené nemoci, stupně nemoci, reakce jiných pacientů a dalších relevantních okolností.

Sloučenina podle vynálezu výše specifikovaného obecného vzorce může být kombinována s nosičovými materiály, excipienty nebo dalšími sloučeninami za účelem přípravy prostředků obsahujících tuto sloučeninu podle vynálezu. Prostředek obsahující sloučeninu podle vynálezu obsahuje sloučeninu podle vynálezu výše specifikovaného obecného vzorce v kombinaci nebo v jiném spojení s jedním nebo více inertními nosiči. Prostředky obsahující sloučeninu podle vynálezu jsou použitelné například jako vhodné prostředky pro velkoobjemové dodávky nebo pro skladování sloučeniny podle vynálezu. Inertní nosič je látka, která se nerozkládá nebo nijak kovalentně nereaguje se sloučeninou podle

104

vynálezu výše specifikovaného obecného vzorce. Inertní nosič může být tuhá, polotuhá nebo tekutá látka. Výhodnými nosičovými látkami jsou voda, vodné pufry, organická rozpouštědla a farmaceuticky přijatelné nosiče nebo excipienty. Výhodné vodné pufry zajišťují pufrovací rozmezí, ve kterém se sloučenina podle vzorce nerozkládá. Výhodná pufrovací rozmezí je rozmezí od přibližně pH 4 až do

ΟΓ^αΠί ckyii acetonitril, ethylacetát^-aTTiexan.

XV I >sar > -X vynálezu výše specifikovaného.obecného vzorce obsahuje tuto sloučeninu podle vynálezu v kombinaci nebo v jiném spojení spojení s jedním nebo více farmaceuticky přijatelným nosičem nebo excipientem. Farmaceuticky přijatelným nosičem nebo excipientem může být tuhá, polotuhá nebo tekutá látka, která může sloužit jako vehikulum nebo médium pro sloučeninu podle vynálezu. Vhodné farmaceuticky přijatelné nosičové materiály nebo excipienty j sou každému odborníkovi pracuj ícímu v daném oboru dobře známy.

Farmaceutický prostředek obsahuj ící sloučeninu podle vynálezu výše specifikovaného obecného vzorce může být upraven pro různý způsob podávání. Je-li způsob podávání perorální, parenterální nebo lokální, je výhodný farmaceutický prostředek obsahující tuto sloučeninu podle vynálezu ve formě tablety, pastilky, tobolky, tinktury, sirupu, oplatky, žvýkací gumy, čípku, roztoku nebo suspenze.

Výhodný perorální farmaceutický prostředek obsahující sloučeninu podle vynálezu obsahuje sloučeninu výše specifikovaného obecného vzorce podle vynálezu v kombinaci s inertním ředidlem nebo s poživatelným nosičem. Výhodné

105

formy perorálnlch farmaceutických prostředků obsahujících sloučeninu podle vynálezu jsou tablety, pastilky, tobolky, tinktury, sirupy, oplatky, žvýkací gumy, roztoky nebo suspenze.

Výhodné farmaceutické prostředky obsahující sloučeninu podle vynálezu výše specifikovaného obecného vzorce obsahují od přibližně 4 % do přibližně 80 % této sloučeniny. Výhodné farmaceutické prostředky obsahují množství sloučeniny podle vynálezu od přibližně 50 ng do přibližně 500 pg, výhodnější farmaceutický přípravek obsahuje množství sluučcuiny. podle vzorce od přibližně 1 pg do přibližně 200 pg.

Sloučenina podle vynálezu výše specifikovaného obecného vzorce může být podávána samotná nebo ve formě farmaceutického přípravku v kombinaci s farmaceuticky přijatelným nosičem nebo excipientem.

V popisu předmětného vynálezu jsou používány následující zkratky: mg, miligram, pg, mikrogram, ng, nanogram, TEA, triethylamin, mmol, milimol, ml, mililitr, C, Celsius, h, hodina, TLC, chromatografie na tenké vrstvě, CH₂C1₂, metylenchlorid, MeOH, methanol, EtOH, ethanol, N, normální, HC1, kyselina chlorovodíková, TFA, kyselina trifluoroctová, DIEA, diisopropylethylamin, RT PCR, polymerázová řetězová reakce navazující na reverzní transkripci, HEPES, 4-(2-hydroxyethýl)-1-piperazinethansulfonová kyselina, MgCl₂, chlorid hořečnatý, EGTA, ethylenglykol-bis(β-aminoethylether)-Ν,Ν,Ν’,N’-tetraoctová kyselina, EDTA, ethylendiamintetraoctová kyselina, DTT, dithiotreitol, MOI, násobek infekce, NaF, fluorid sodný,

BSA, bovinní sérový albumin, p.o., perorální nebo perorálně, i.v., intravenózní nebo intravenózně, s.c., subkutánní nebo

.. 'V

106 subkutánně.

Příklad 57

Test cyklin-dependentní kinázy 4.

Hodnoty IC^q pro inhibici cdk4 byly získány prostřednictvím následující metody:

-Substrát:^-

Fúzní protein glutathion-S-transferáza-retinoLUIÍIU VJ ί--¹- 1 “Í\L·'ý -L Til , n. ’

Cell, 64, 521-532, 1991) byl získán od Dr. Villiama Kaelina. GST-Rb byl připraven pomocí transformace E. cóli plazmidem pGEX-Rb (379-928). Transformované bakterie byly pěstovány přes noc do saturace, pak byly naředěny médiem YT a inkubovány 2 hodiny ve 37 °C. Protein byl indukován inkubací s 0,1 mM isopropylthioglykosidem po dobu 3 hodin.

Po sedimentaci prostřednictvím centrifugace byly buňky lyžovány sonikací v pufru STE (0,1 mM NaCl, 10 mM Tris, pH 8,0, 1 mM EDTA) obsahujícím 10 % sarkosyl. Částicový materiál byl odstraněn centrifugací a lyzát byl inkubován s glutathion-Sepharose při teplotě 4 °Č. Perličky byly promyty kinázovým pufrem, a pak se prováděla kvantifikace proteinů separovaných prostřednictvím SDS-PAGE a obarvených Coomasie modří při použití proteinového standardu o známé koncentraci. .

Exprese CDK4/cyklinu Dl ve hmyzích buňkách:

Lidská cyklin-dependentní kináza 4 (cdk4) byla klonována pomocí RT PCR s použitím degenerovaných primerů na bázi publikované aminokyselinové sekvenci (Matsushime, H., a kol., Cell, 71, 323-334, 1992). cDNA pro lidský cyklin Dl

107

byla klonována pomocí RT PCR s použitím genomové DNA z buněk MCF-7. Sekvence byla shodná s publikovanou sekvencí (Xiong, Y. , a kol., Cell, 65, 691-699, 1991). Obě cDNA pro cdk4 a cyklin Dl byly klonovány do pFastBac (Life Technologies) a rekombinantní Bacmid DNA obsahující cDNA byl tvořen místně specifickou transpozicí s použitím Bac-to-Bac bakulovirového expresního systému zakoupeného od Life Technologies (katalogové č. 10359-016). Bacmid DNA byl použit ke transT ekci”^imyzích^—buněk^-ST9^—pro~produkci—rekombi.-nan-tnrho— viru. Po plakové purifikaci viru byly virové preparáty amplifikovány dokud nebylo dosaženo vyšších litrů virových kmenů. Byla určena optimální společná exprese (koexprese) rekombinantních proteinů dosažená při MOI 0,1 jak pro cdk4 tak pro cyklin Dl v době 72 hodin po infekci.

Byly připraveny lyzáty buněk Sf9 společně infikovaných s cdk4 a cyklinem Dl v 50mM HEPES, pH 7,5, 10 mM MgCl₂, mM DTT, 0,1 mM fenylmethylsulfonylfluoridu, 5 gg/ml aprotininu, a 5 gg/ml leupeptinu s použitím talkové láhve PARR při tlaku dusíku 3447,3 kPa (500 psi) po dobu 5 minut při teplotě 4 °C. Nerozpustná látka byla sedimentována při 10 000 x g po dobu 20 minut při teplotě 4 °C.

K supernatantu byl přidán glycerol do koncentrace 10 % a supernatant byl uchováván při teplotě -80 °C v poměrných částech.

Kinázový test:

96-jamkové filtrační destičky Millipore Multiscreen (0,65 gm filtry Durapore) byly předem navlhčeny 200 μΐ kinázového pufru (50 mM HEPES, pH 7,5, 10 mM MgCl₂, 1 mM EGTA). Do každé jamky bylo přidáno 50 gl GST-Rb (0,5 gg) navázaného na perličky glutathion-Sepharose a roztok byl φφ

- 108 • · φ φ φ φ φ φ • · φ φ φ φ φ φ φφ φφ odstraněn aplikací vakua. Testovaný vzorek obsahuje 50 mM HEPES, pH 7,5, 10 mM MgCl₂, 1 mM EDTA, 1 mM DTT, 1 mM EGTA, 10 mM β-glycerofosfátu, 0,1 mM ortovanadičnanu sodného,

0,1 mM Nap, 0,25 % BSA, 10 μΜ ATP a 0,25 gCi [y³³P]-ATP. Pro zahájení testu bylo přidáno 0,1 gg cdk4/cyklinu Dl (lyzát hmyzích buněk) a probíhala inkubace po dobu 30 minut při teplotě 37 °C. Reakce byla ukončena filtrací na zařízení v J Ί π j______ ir_______ κ j J --2 *1 i τ ___zj i x -u _______<

Hxmpurc vfcujuuni nanxxuxu. vcí> ιιυκγ uyxy uuyiXKxau μχ umy uy

TNEN (20 mM Tris, pH 8,0, 100 mM NaCl, 1 mM EDTA, 0,5'

Nonidet P-40). Po usušení destiček při teplotě místnosti byty tiltračni destiCKy umístěny v destičkových adapterecn (Packard) a do každé jamky bylo přidáno 40 μΐ scintilační tekutiny Microscint-O^ (Packard). Fólie Top Seal A byla použita pro přikrytí destiček před měřením na scintilačním počítači Top Count Scintillation Counter.

Výsledky j sou uvedeny v tabulce 1.

Příklad 58

Inhibiční studie s cdk2

Hodnoty IC^q pro inhibici CDK2 byly určovány pomocí následující metody:

Těst cyklin-dependentní kinázy 2:

Substrát:

GST-Rb, jak je popsán výše pro cdk4/cyklin Dl Exprese CDK2/cyklinu E ve hmyzích buňkách:

Rekombinantní bakuloviry pro lidskou cdk2 a cyklin E byly získány od Dr. Davida Morgana z UC, Berkeley (Desai, D. a kol., Molec. Biol. Cell, 3, 571-582, 1992). Optimální

109

• ·· ·· ·· ·· · · · · · · • · · · · · · • · · · · · · · • · · · · · · ··· ·· ·· ·· společná exprese ve hmyzích buňkách byly získána při MOI 0,1 a 1,0 pro cdk2 a cyklin E, v příslušném pořadí, 72 hodin po infekci.

Kinázový test:

Podmínky testu pro cdk2/cyklin E byly totožné pOkJlllXHJS.ČXlilX pi O UUfkt/ U_y Λ.ΧΧ11 V± V^OLiiC- OUUO L.XO.L.U .

Koncentrace rekombinantního čdk2/cykTínu E v testu byla 0j“l gg na 100 μΐ testovacího vzorku. Inkubace byla prováděna po

UUUU-i w z\ o ,

X€plOXC '

Výsledky j sou uvedeny v tabulce 1.

Příklad 59

Protokol testu cdk7/cyklin H

Substrát:

Peptidový substrát H2N-RRR(YSPTSPS)^-COOH na bázi sekvence CTD RNA polymerázy II.

Exprese CDK7/cyklinu H ve hmyzích buňkách:

Lidská cdk7 byla klonována pomocí RT PCR. Sekvence byla shodná s publikovanou sekvencí (Tassan, J.P., a kol.,

J. Cell. Biol., 127, 467-478, 1994, a Darbon, J.M., a kol., Oncogene, 9, 3127-3138, 1994). cDNA pro cyklin H byla také klonována pomoci RT PCR, přičemž sekvence byla shodná s publikovanou sekvencí (Fisher a Morgan, Cell, 78,

713-724, 1994). Rekombinantní Bacmid DNA a virové kmeny byly připraveny tak, jak je popsáno výše pro cdk4 a cyklin Dl. Optimální koexprese bylo dosaženo v MOI 1 a 2 pro cdk7

110 « «· A ·· ·· ·· ·· · · ··»· ·♦·♦ · · «·· · · · * ·· ·· · · · · · ·· · ··· ··· · · · · ··· ·· ··· ·· ·· ·· a cyklin H, v příslušném pořadí, 48 hodin po infekci.

Kinázový test:

Test měřil fosforylací peptidového substrátu (založeném na C-koncové doméně RNA polymerázy II) prostřednictvím cyklin-dependentní kinázy 7, která je t· z *-»· r < 3 i z* aktivována cvklinem H. ř/’’PÍ-fosfát bvl Dřenesen ~ — r - ·* x ______ z [ψ Pj-ATP na peptidový substrát pomocí enzymu. Test se prováděl na 96-jamkových destičkách se dnem ve tvaru V, pak po ukončeni reakce byl proveden přenos na 96-jamkové fosfocelulózové filtrační destičky Millipore Multiscreen. Peptid je zachycen na fosfocelulózové membráně po promytí roztokem kyseliny fosforečné.

Metoda:

Enzymový test se prováděl na 96-jamkových destičkách se dnem ve tvaru V v celkovém objemu 100 μΐ. Testovaný vzorek obsahoval 15 μΜ ATP, 0,5 μθί [^^P]-ATP, 50 mM HEPES, pH 7,5, 10 mM MgCl₂, 1 mM EDTA, 1 mM DTT, 10 mM β-glycerofosfát, 0,1 mM ortovanadičnan sodný, 0,1 mM NaF, μΜ peptidový substrát. Pro zahájení testu bylo přidáno 0,125 ng cdk7 a cyklinu H (lyzát hmyzích buněk). Inkubace byla prováděna po dobu 5 minut při teplotě 24 °C. Reakce byla ukončena přidáním 40 μΐ chladné 300 mM kyseliny fosforečné ke každému vzorku. Obsah jamek se dnem ve tvaru V byl pak přenesen na 96-jamkové fosfocelulózové filtrační destičky Millipore. Po ponechání 15 minut při teplotě místnosti byly filtrační destičky odsáty ve vakuu a jamky byly promyty 4 x se 100 μΐ chladné 75 mM kyseliny fosforečné. Po odstranění odsávací sestavy byly filtry úplně usušeny, umístěny do adaptérů na mikrodestičky přístroje

111 • *· ·· « · · 4 · • · · · • · · ··» ·· • · · · ··· «· ··

Multiscreen a do každé jamky bylo přidáno 40 μΐ scintilační tekutiny Microscint-O. Destičky byly přikryty fólií Top Seal A a měřeny 1,5 minuty na scintilačním počítači Packard Top Count Scintillation Counter.

Výsledky jsou uvedeny v tabulce 1.

Ό -X. 4 V -B ~ J ΖΓΛ

X JL -X Jk. JL VI UU “Protokol testu CDKT/cyKTin BT^^Pj SPA

Suoštrsrc z

Test používá biotinylovaný substrátový peptid (biotin-PKTPKKAKKL) pocházející z in vitro p34^c<^^c^ fosforylačního místa histonu H1.

Exprese CDKl/cyklinu B1 ve hmyzích buňkách:

Lidská cdkl byla klonována pomocí RT PCR. Sekvence byla shodná s publikovanou sekvencí (Lee, M.G. a Nurse, P., Nátuře, 327, 31-33, 1987). cDNA pro cyklin B byla také klonována pomocí RT PCR a sekvence byla shodná s publikovanou sekvencí (Pines, J., a Hunter, T., Cell, 58, 833-846, 1989) .. Rekombinantní Bacmid DNA a virové kmeny byly připraveny tak, jak je popsáno výše pro cdk4 a cyklin Dl. Optimální koexprese bylo dosaženo v MOI 0,1 pro cdkl a cyklin B1 48 hodin po infekci.

Kinázový test:

Enzymová testovací souprava pro p34^ct^^c^ SPA[^^P] kinázu byla zakoupena od firmy Amersham Life Science (katalog, č. RPNQ0170) a protokol byl prováděn • · • ·

- 112 v 96-jamkovém formátu, jak doporučuje výrobce. Každý testovací vzorek obsahoval 50 mM Tris HC1, pH 8,0, 10 mM MgCl2, 0,1 mM Na^VO^ (ortovanadičnan sodný), 0,5 μΜ ATP,

0,2 pCi “''P-ATP, 2 μΜ DTT a 0,75 μΜ biotinylovaný peptid a 3 μg cdkl/cyklinu B v lyzátu hmyzích buněk při celkovém objemu testovacího vzorku 100 μΐ. Inkubace byla prováděna po dobu 30 minut při teplotě 30 °C. Reakce byla ukončena _ či č J A ~ 4 ~ 'ifWy .. Ί piiuaiij-iu stop pufru (50 μΜ ATP, 5 mM EDTA, 0,1 % (objem/objem) Triton X-100 ve fyziologickém—roztokupufrovaném fosfáty)/s perličkami SPA potaženými ag/ml). Destička byla ponechána přes nt

SXrepX&VlQ při teplotě místnosti, a poté přikryta fólií Packard TopSeal a měřena na scintilačním počítači Packard TopCount. Hodnota IC₅₀ byla určována vynesením dat do esovité křivky s použitím software GraphPad Prism.

Příklad 61

Inhibice tumoru in vitro

In vitro proliferační test:

Proliferace nádorových buněk byla měřena s použitím testu se sulforhodaminem B, jak je popsán (Skehan, P., a kol., J. Nati. Cancer Inst., 82, 1107-1112, 1990). Nádorové buňky byly odebírány do roztoku trypsin-EDTA, přičemž buňky, které se nebarvily trypanovou modří, byly spočítány, přidány na 96-jamkové destičky a inkubovány přes noc při teplotě 37 °C. Do jamek bylo přidáno léčivo po naředění kultivačním médiem. Tři dny později bylo médium odstraněno a opět doplněno médiem obsahuj ícím čerstvý lék a inkubace probíhala další 4 dny. Buňky pak byly fixovány 0,1 ml 10 % trichloroctové kyseliny po dobu 60 minut při teplotě 4 °C. Destičky byly pětkrát opláchnuty vodou

113 • < 9 • ·

z vodovodu, usušeny na vzduchu a barveny 30 minut 0,4 % sulforhodaminem B v 1 % kyselině octové a usušeny na vzduchu. Navázaná barva byla solubilizována s 0,1 ml 10 mM Tris (pH 10,5) po dobu 5 minut, přičemž se měřila absorbance při 490 nm pomocí čtecího zařízení Titertek Multiscan MCC/340.

alternativa použit test proliferace~buně'k CyQUANT.

lest . UXXXVX eU >_ _/-VTT A ΜΓΓ¹zyuuAtt i .

Pro kvantifikaci proliferace nádorových buněk byl jako alternativa použit test proliferace buněk CyQUANT. Nádorové buňky byly odebírány do roztoku trypsin-EDTA, přičemž buňky, které se nebarvily trypanovou modří byly spočítány, přidány na 96-jamkové destičky a inkubovány přes noc při teplotě 37 °C. Do jamek bylo přidáno léčivo po naředění kultivačním médiem. Tři dny později bylo médium odstraněno a destičky byly zmraženy při teplotě -80 °C po dobu alespoň 30 minut. Po rozmražení destiček bylo do každé jamky přidáno 200 μΐ CyQUANT-GR v buněčném lyzačním pufru (molekulární sondy č. C-7026) a destičky byly inkubovány 3 až 5 minut při teplotě místnosti. Fluorescence CyQUANT-GR byla měřena na fluorescenčním destičkovém čtecím zařízení Molecular Devices Fmax (excitace 485 nm, emise 530 nm).

Buněčné linie:

MCF7 je lidský adenokarcinom prsu, hormon-dependentní (HTB 22),

MDA-MB-231 je lidský adenokarcinom prsu, hormon-independentní (HTB 26),

HT-29 je lidský adenokarcinom tračníku, průměrně dobře diferenciovaný stupeň II (HTB 38) ,

HCT-15 je lidský adenokarcinom tračníku (CCL 225),

A549 je lidský nemalobuněčný karcinom plic (CCL 185),

PC-3 je lidský adenokarcinom prostaty, hormon-independentní (CRL 1435), a

DU 145 je lidský karcinom prostaty, hormon-independentní (HTB 81).

Všechny buněčné linie byly získány z American Type Tissue Collection, přičemž ukládací čísla ATCC jsou uvedena v závorkách.

Buňky MCF7, MDA-MB-435 a MDA-MB-231 byly pěstovány ve vylepšeném.minimálním esenciálním médiu (Biofluids) bez fenolové červeně doplněném 5 % fetálním bovinním sérem,

0,01 mg/ml gentamycinem a 3mM L-glutaminem. Všechny další buněčné linie byly pěstovány v médiu RPMI 1640 (Life Technologies) doplněném 5 % fetálním bovinním sérem,

0,01 mg/ml gentamycinem a 3mM L-glutaminem.

Výsledky j sou uvedeny v tabulce 1.

-115 • · · · · • ·

Σ η β «Λ υ C	η) μ 1« +J 01 0 Η &	«Λ *Τ S	* 0^ o	* ♦ o >© o c?	♦ ♦ 00 'C	IM- rC* —
ο _# 1 Ο C.	« * 5*5-	« ♦ cm r-* wS Tf O c?	♦ ♦ 33	* * X. m ví
φ ϋ -Η γΗ 0-	cň _ β	* * o o	* * m o o		« « \© r*
C\ <	* » CM <»	* * m c* \p o o	* *	* * rsi m Ο\*
I Proliferace nádorových buněk in viti	0 > φ >Μ ť 01 'φ +J (0 3 Η 4J	« ο ΙΖ) © ® <3	♦ » cT c7	♦ * oo «* S®'	* * ©o c? 0?	* · -^0 «η* tn“
ř- U -
Η © I	♦ * »A_ — cí	* * c\ tn XO o o	♦ ♦ — CM r?	* ♦ «η —
ιϋ <0 Μ Α	ί S3 «η » «- «η Σ .		» * V\ W1 OO 00 o o		♦ ♦ n ~
c Ξπ _ss~	* « νχ m	♦ « oo S©, o“ θ’	♦ « Ό κι — cn	* ř- sS·⁰⁰ ‘
b. U f? Σ
Φ 2 Λ « _{? S •ií a ué ·§^υ η Η	oo o*	vn . _...cm.. -.....- ---* θ’	Tf .	_______»§L· ..
	<4 © ® ©-
Φ 0 «Μ _ •Η · -> 3Š 21 s“ ~	”T V© Ό — CM O 0.0 o o” o o	O\ — o — o o o o	ox Z? © 11 ©” c	0 0 θ' o
Struktura	/ 'Cr^ zs X X* z	< M ^! v( X 2	Xfu¹ zz X Ϊ	s 0 )C^ \ ,·’ '* Z—.' z ^X 2=.- \ 5 , / z
1 1 ι- MDL číslo i	*0 (0 . h m 44 m Ή a	•d m H 3- --->W“ 04	Ό rt 44 JO ‘ Ή	Ό rt H, 44 m Ή 1Λ -------_>U ft
>W a

cdk2 Cdk4 MCF-7 231 435 HT-29 HCT-15 Colo205 A549 DMSII4 PC3 DUI45

i

- 117

cdk2 cdk4 MCF-7 231 435. HT-29 HCT-15 Colo205 | A549 DMSII4 PC3 DUI45

o o“ o	♦ . ♦ m «λ 00	\© ♦ oo r* o	♦ * tt °®. cT c?	17* 21*
r- r» o o*	♦ *	♦ ♦ rn“	♦ «- <X<*i vn” t-T	* * m ’Τ
C\ rň o o	©0^ O	·»	* · ~ oo <n 6?	* ♦ n o CM <N
O m Ό \O 0*0	So* Ό	« I. r\> T.	♦ ♦	♦ ♦ v% CM —
	* ♦	* ♦ ©\ ·—	♦ ♦ CM ~	♦ ♦ r» \o
m m
S- O	♦ «	♦ ♦ OO 00	♦ ♦ CM ťN '·» — c	♦ ♦ ΤΓ ©\ cn cm
	♦ « Q4 <*> ts c7	♦ ♦ m	♦ ♦ «/Γ rr*	* ♦ •’Τ Γ* -<r cm
O*’“	* «	» ♦	♦ ♦ Ch_ CM^ cT cn“	* * C\ CM — CM
0,59 0/81			-
C\ vo ---------— - ďo	o u.------------<- Λ	o ....-----__o-------·__________ Λ	β ..------- -O_______________- A	...-----p*---------·'.. .....
0/)33 0,017	00« — O.S n ° o S	00 <í <1 o u © c	CM tt O O*	Ό rr o o
Xfi'⁰ ^x zx z CM Z	XX í	. -CrQ i i z	< ^!Λ^ XX í ř	í ó-O M^· 2Z 9 X
i přiklad 3 i t	•o Λ ——------ >w 04	i i I přiklad ‘28 i ř l 1	V-) •o <0, H sd >U. 04	Ό flj H .¾ —___ >M 04

Lm·..

• · • · • ·

-118 , 9 » <

» 9 9 4 » · » « ·· , ·· cdk2 cdk4 MCF-7 231 435 HT-29 HCT-15 Colo205 | AS49 DMSI14 PC3 DU145

♦ « 4 ch oo. ' cT c?	» * o	0_00^	©-\Ο CM cm*-^~
* ♦ ^d. -O· cq	» * Γ-^Γχ	ph . od o *	o -^d.
♦	» *	d.d	d. ~ ©
	• * 00*\0_	t** w^ *- CŇ
' « X- dΣτ <*> PH	♦ ♦ (n.© cT ph*
		WH — -- *· WH \O	ct^rt cm --* cT
* * PH PH	» * Χ.'Ο. <N cT	d.d cT cT	O 0^0. 0 ~
« .« \© WH wn“	» ♦ d-d. CH* PH*
♦ « <Ň* PH	» * X.O. PS PH*	©_o_ (N PH*	—^oo _T 0“
		®^d	r* ό o cT
.. 0O_-- ------ ...... ........ ·—*	.. . ..PH WH_. _ . ....... O O*	’.......--.......	...~...........«_?........-
— rr H· CZ O\ ΊΤ T „ o o o II co~o~ 3,	0 Ό £? Ό ·>τ O O II θ'© =,	00 H· O O* ' '	O O WH Γ- WH WH WH i“·* OO ΓΗ WH \O OOOOOO 0 0 0o“ o o*
Mý Z£	?řr° ⁵ / f	9po zx A z z	^s\^( zr z z
Ό to d ín	Ό <0 * £	Ό tú H x r* Ή	Ό fl r-1
>M 0.	>n 0.	r >kl A	Ή >h ÍX

£

I sSrY

I * - 119 cdk2 cdk4 MCF-7 231 435 HT-29 HCT-15 Colo205 A549 DMSIII4 PC3 DUI45

cdk2 cdk4 MCF-7 231 435 HT-29 HCT-15 Colo205 A549 DMSI14 PC3 DUI45

* ♦ CP^ TT	* » r- o o	·- ς*τ	P* O
♦ « Ξ	« * 0O_ θ' o~	cJ~ cn~“	Γ*· C\ cT xo
\©_ */T	ř* o“ o~	p^tt_ en cT	m <N
♦ CN Sr	« ♦ v» vn O o		m o
-» * s© 'O v->	» ♦ oo νχΓ*o o
		r* p* p-	® ” Λ
♦ * Γ** Ό	* ♦ p— oo_ o o	®.°®. 'T	00 ~
-» ♦ O	* * cn_O£_
* * OO~ \©	* * OO Q\ 0*0	m rr**“	V© * OO
			Ch~ v?“
,_______cs________.____ Cl*	--------_r------	------------- -------	_______oo__, ________
o O OS II O H	O* — C m Ok „ O O 11 o o £,	ΤΓ Ox ©_ O	\O z-*\ ?i_š ¥ o c-c.
£ ,Α,ΎΊ < / z £	s 7 i	u. ιΓί =^-Λι IJ-P-¹ zz i	Y / z £
íklad 49	Ό ti r-f M — 'H <N	Ό ti d o 3	Ό ti 3 ⁰⁴
>M 04	a	04	>k 04

- 121 cdk2 cdk4 MCF-7 231 435 HT-29 HCT-15 Colo205 | AS49 DMSII4 PC3 DUI4S

« oo c7	* « P- v> s©	♦ ♦ οχνχ vs \©*	♦ * οχ>©^ m
♦ en_ cm	♦ ♦ CM ΤΓ r^s©	* « 'β.’Τ. ’Τ^- v?	* ♦ cm* ^,ti*”
Γχ	oo* s©“	* 4 σΓρί	• ♦ OS — - TT“
♦	♦ * os os s©	* ♦ p^ os r* «η	* ♦ °®_ *x cT cm“
♦ X. • ™	* * *χρχ «η v>	♦ ♦ so ~	* * v-> m rn“ so“

♦ cT	* *	P* —	* ♦ CM f*S
	♦ « m	♦ 4 o o	♦ « OO — fs“ rT
♦ ©_	* ♦ OO r?“ o*	* 4 m vs“ oo	♦ ♦ cm v> cm“ fS

. _____v*> ..... .....	........------------------------	________„ r· οχ________________ ď 6“	-- . —^..._.............. .... SO
o Ξ u	o	o C — II o =	v> o“
í ΟΓ « i	ZX i ř	0 Xť X 5	x z \ , 2^2-0 Z—, -o z sT
Ό ti H v-i X X- >U &	Ό ti -« 12 >M “ α	00 Ό ti r-H -- -----X- ----- Ή A	SO vs *0 ti H ----------- . _ Ή >M ----- oí :

- 122

MCF-7 231 435 HT-29 HCT-15 Colo205 A549 DMSI14 PC3 DU145

* * * ♦ cn. «η oo - γΓ	© — θ’	cn ©* cn	O\ oo — ♦ ci ci <zi 5ζ • β ďe _o-
* * # · cm“ cm“	oo oo Ό o ©	—cm“	ci ci ci í. O o O o-
* # ♦ * \© ©^ — ~	oo «— oo^os^ ©“ o	c\_r^ cT σΓ	—.. _ ♦ — © © _o-
♦ * ♦ C^_(N OO^ —í VN —	© ΤΓ oo c\ © ©“	v>	V) W1 © ©2“
* ♦ ♦ · cm^cm^^o^ cm“ rn“ rr <*T	•
	-i.rL en en	— CM CM CM	* ‘’Τ© © © -Γ-Γ-ΓΟ' ©
♦ * * * CM cTCM*ττ		<n“ r*“	oo o 2
* ♦ ©, CM_ 90 O0~
♦ * * * cn. «Q. 4Q, CM CM <*?	cT	TT.KO, s©“ oó’	- 2 £ *· o o o _o-
„ ·		Ώ_*Ι. ci rí“	•a- r- r- i, n.t.x.’? ooo₀-
	— '“' .....·''	v© ... --	r· e - ..........VTl ....... ©“ ©“
CM O o ©“	o £? 2 » o £,	v© Z? 2 11 «5“ =,	© m ©
Cl ^M'\xxv JuO ó	Λρ-° ⁼ z-< zx z C4 X	¹ z^ zx i z CM X	k-k k ζ^-ΖΊ Vh. ¹ V( s i
Ό 0 rM ’ * 2 Ή 0.	Ό (0 H X >M Ό CU^	Ό 0 H u © _________;d , a	Ό 0 H *d ___ ft

cdk2 cdkd MCF-7 231 435 HT-29 HCT-15 Colo205 A549 DMSII4 PC3 DUI4S

© ~	* * — S©	„o ^ř* 90	* * Tř ΓΜ tt f*-j“
t** O\ o o*	* i- — V>	90 »Λ	* « v© — Třen
4“	* ♦ © CO ““	»Λ —4	♦ ♦ r^oo^ m cn
1,7 0,98	♦ *	— r-	* ♦ η o
	- k' —· oo		♦ ♦ —* rn“
Os Os		— <*s
χο^χ^	* ♦ O O	<n^_ oo**-	* ♦ Ό.-Χ. v-> m
	« * —		♦ ♦ (40 «η xo
	* * ‘'X XCT xo	fí-—	* * cT cT
		x©_v^ rí“ γ***
Ο»	XO C\ --------•ο^ςΓ-·.--.- —	------------ Z-------------	----------o“o“ —..
o ΤΓ O	o - — 0 o ·£	o <n o	s§ 0 0
² 2Z X	Γ z 3t	VpO ² v^² 2X i	0 C x^x— ^ιΛ-( / f
Ό rt H * s 'd a	CN •o <ti »d‘ Λ ... * &	Ό « H Aí — Ή — a	o Ό <e H Ή- - ‘H Λ

-124

MCF-7 231 435 HT-29 HCT-15 Colo205 A549 DMSII4 PC3 DUI45

	wo ©\_ cT	O V-3 cm co*	♦
Os <N OO ©v θ’o	xg- ΤΓ CM~—	0O_Cs	♦ Ό.
o	CM —	CO_ O_ cT cm~	♦ w> ©~
— o	©_oo_ CM *=	© \o~ cT <*T	»
			♦ r*
cn” co*	\© r*	cm_s© ^r ro
CM OO CM oT	oo vo_ tt m	s© cm — co	«
			« v© cm“
cm” cm*	o_o_ rr co“	’Χ-’Ί. co co*	♦
		Γχ *Ί_ — co	·-
vo CM -----------_o---------- . ...-----	CM	C\_	------------------------
O v© o“	OO — *Z- II O e	o ©\ o	o G? ® n o =,
°\ OO / z z	⁰0' X í	s / X	kf .XX í
Ό ti >W~ . -	•o (8 3 * >U ft	Ό <0 H 44 © Ή ^r -------------_ft. ~	TT Ό « H Λ --------_xH------ >U a

<-»*ίβί.·ί

-125

C(lk2 cdk4 MCF-7 231 435 HT-29 HCT-15 Colo205 A549 DMS1I4 PC3 DU145

* « o o	♦ ~ ® O Λ	* * p^cm^ cT <*T		* ♦ cí'-^’
♦ ♦ Os r* ό	♦ «	» * © Tr_ <*? Tř		* ♦ r- oo
15* 11*	♦ ♦ C^O cC oo	* ♦ © p^_ en“ CM		* ~ •Z. Os — θ’
* * <*> m	* *	♦ * Γ- v> CM cm	·	* ♦ r^©_
* * χ. rt. s©· v©*	♦ ' « o© —	* * CM r«T cn		* « ο^^τ_

* * Z ⁰⁴	* ♦ Os	* « »n «η		♦ ♦ C^_P^
* « OO Os	* » Os \©	* ♦ </W , dToo		♦ * co_oo_ ©Γ ·—'
* * 0.0. x©*KO	♦ ♦ tt CM —	* * ΓΜ_>Ο_, *í~ v>		♦ * p^os_ ©Γ --^-

rn cm o©	c*	c* oo---------------—----	,TT __________ _ ·.. . _ .	cm-------------
0,220 (n=l)	© Z* e5 II ° ·£	o v> CM ©“	o r*· c^ ©	0,33 0,310 0\|460
SX 1 £ z	<· < M ^í-W zs X f	jť>O 4 ř	ZE í z £	Uf li {
říklad 12	říklad 37 I	říklad 35	f říklad i 23 1	i příklad I 20
0.	0.	Ol	ft

¹ '

- 126

9 • 9 ''· 9 '9 9 cdk2 Cdk4 MCF-7 231 435 HT-29 HCT-IS Colo205|AS49 DMSIII4 PC3 DUI45

* * x — \© \©	7.3 14	Cl —	11 S'L
* * cm^w^	eo oo“ r**	c* 00*	Γ4 ©L. ~· «η
S ÓS cT cm	o — V}	tn oo ο\\£	o o cTc\“
* * ©i.'©. σ\ cT	<r	—	S-Z
♦ * <*νττ_
	00 00	00 Wk	f-» wn
* * Γχ©_ CM* CM	m rr	vo m	'C CM
* * c** m cm“ č3
* ♦	Ό Γ*	Ο,ΠΊ c* ~	'Ο.’τ eo
		CM \O —	- rr
vn _ o._^L___________________ o®	___________	^:.p ' ' ^; __________r>__________	*T CM
o ~ *n » m li	o CM O*	o TT ΤΓ o	O CM VI -o“
p y i	2S z s	□ Ó ,-~<g T i-q / % s	?o-0 K_^² zz y z z
•o m 3 o\ Ή	Ό (0 u CM	Ό (0 H Λ <** 3 <N	CM TÍ (β H -M
Oi	>h a	ft	Ή a

!

-127Cdk2 cdk4 MCF-7 231 435 HT-29 HCT-15 Colo205 A549 DMSII4 PC3 DU145

v© vn“		cn <*i cm <n
óT
Γ** *Ti		©e_©s_
\o~		rT“ <m“ «J“ λΓ

oCr-»		- Γ^γ·^ m η n f*i
m — vo“wT,		eo_f^^r x. cm cT cT cT

C\_ */ΓτΤ		o «L n r?f? *-
·— vn__ T CM		r*?CN 6Γ —
---.....—-'----------------··	rr---------------------- ~	--. ----------------------—-	cn*
0,720	O — r* 11 o	o o ©o^ ©	z—< ττ “_n .O c 'w'
9o<] X z	0„ z= X i	□ zz X % z	o < .^-.Λ < X ’Λ^' X * z
Ό tú 3 j® Ή - —----->K~ - ---- a	Ό (0 H _ __ Λ	oo TJ Λ ·-l Λ_________ Oi	1 i příklad 39 1

9·

Cdk2 cdk4 MCF-7 231 435 HT-29 HCT-15 Colo20's AS49 PMSII4 PC3 DUI4S











—------------------------------......	O o
o Ό rf	5,10
9 o-o	ΓΊ pro zs s
I příklad 6 ! í 1 1	í přiklad 4 1 '1 1

- 128

129 • V <· > · · « • · « » · · β » · · « »· ··

Příklad 62

Testy in vivo

Test užívající implantát pod ledvinné pouzdro

Nahé myši byly umístěny v mikroizolátorech s přetlakem vzduchu. Chirurgické výkony a podáváni dávek léků se provádělo v boxu s laminamrm prouděním vzduchu.

Test používající implantát pod ledvinné pouzdro se prováděl se provedl stejným způsobem jako je uvedeno v práci autorů Bogden, A.a., Kelton, D.r., Cobb, V.R. a Esber, H.J .

(A rapid screening method for testing chemotherapeutic agents against human tumor xenografts·, v Houchens, D.P. a Ovejera, A.A.(vydavatelé) Proceedings of the Symposium on the Use of Athymic (Nudě) Mice in Cancer Research, s. 231-250. New York: Gustav Fischer New York, lne., 1978).

V krátkosti shrnuto, nádory o velikosti 400 az 500 mm odebrané z myší, na kterých byly udržovány, byly nařezány na segmenty o velikosti 1 mm , přičemž velikost byla kontrolována pomocí okulárového mikrometru operačního mikroskopu. Poté, co byla ledvina vyjmuta z dutiny břišní, byly segmenty nádoru implantovány pod ledvinné pouzdro samců nahých myší (starých 6 až 8 týdnů) pomocí trokaru 13 Ga. Po implantaci se změřily největší a nejmenší průměr segmentu nádoru pomocí okulárového mikrometru operačního mikroskopu. Ledvina byla vrácena zpět do tělesné dutiny a incize v břišní stěně byla uzavřena hedvábnými šitím a kožní řez byl uzavřen svorkami na rány. Podávání léků začalo v den následující po implantaci a pokračovalo 12 dnů, kdy byly ledviny opět vyjmuty z dutiny břišní a měřila se velikost nádorů stejným způsobem, jak je popsán výše. Objem nádoru se vypočítával ze vzorce V = délka x šířka /2, jak je popsáno v práci autorů Houchens, D.P., Ovejera, A.A. a Barker, A.D.

130

		• v	*·
»· ·	•	·· · ·	• ·	* «
• ·	•	• · ·	« ·	♦ Φ
• ·	•	: : i	• »	• ·
·· · *·		«·· ·>	»·	««

{The therapy of human tumors in athymic (nudě) micev Houchens, D.P. a Ovejera, A.A. (vydavatelé) Proceedings of the Symposium on the Use of Athymic (Nudě) Mice in Cancer Research, s. 267-280. New York: Gustav Fischer New York, lne., 1978). Výsledky jsou uvedeny v tabulce 2.

TABULKA 2

Inhibice růstu nádoru lidské prostaty PC-3 na nahých myších (pokus č. 1, test používající impiantat pí pouzdro).

Pokus č. 1		V/V mm³ (průměr ± střední odchylka	%T/C^b
Bez léčby		4,4 ± 0,8^a	100
Příklad 1	1 mg/kg i.p. denně	4,8 ± 3,l^a	109
	3 mg/kg i.p. denně	2,0 ± l,0^a	44

^a V/νθ = objem v 0. den/objem ve 12. den, ^b % T/C = (průměrný objem u léčených zvířat ve 12. den/ průměrný objem u kontrolních zvířat ve 12. den) x 100

Claims

1. Sloučenina obecného vzorce ve kterém:

R je vybrán ze skupiny zahrnující R2, R2NH- a H₂N-R3-, ve kterých:

R2 je vybrán ze skupiny zahrnující alkylovou skupinu obsahuj ící 1 až 8 atomů uhlíku a skupinu obecného vzorce

R4

I _ _ ____ _________ —(C)n—Z ______________ _______________

R4 ve kterém :

- 132 obsahujících 1 až 8 atomů uhlíku a Z je případně substituována jedním až třemi substituenty, které mohou být stejné nebo rozdílné a které jsou vybrány ze souboru zahrnujícího Hal, OH a alkylovou skupinu obsahující 1 až 4 atomy uhlíku,

R3 představuje alkylenovou skupinu obsahující 1 až 8 atomů uhlíku, a

R1 je vybrán ze souboru zahrnujícího cyklopentylovou Skupinu SL lSOprOpyiOVOU SKUplHU, a farmaceuticky přijatelné soli, optické isomery a hydráty odvozené od těchto sloučenin.

2. Sloučenina podle nároku 1, ve které

R znamená R2, přičemž

R2 znamená alkylovou skupinu obsahuj ící 1 až 8 atomů uhlíku, případně substituovanou jedním až třemi substituenty, které mohou být stejné nebo rozdílné a které j sou vybrány ze souboru zahrnuj ícího Hal, OH a alkylovou skupinu obsahující 1 až 4 atomy uhlíku;

R1 j e vybrán ze souboru zahrnuj ícího cyklopentylovou skupinu a isopropylovou skupinu, a farmaceuticky přijatelné soli, optické isomery a hydráty odvozené od těchto sloučenin.

3. Sloučenina podle nároku 2, kterou je dihydrochlorid 2-[trans-(4-aminocyklohexyl)amino]-6-(butylamino)-9-cyklopentylpurinu, dihydrochlorid 2-[trans-(4-aminocyklohexyl)amino]-6-(oktylamino)-9-cyklopentylpurinu, dihydrochlorid 2-[trans-(4-aminocyklohexyl)amino]-6-[(3- 133

• • A · • · A A · A A A A A A A A • A A · A · A A ·< • A> A • A A • A ·' A · A A A A A AAA A A AAA • · A A A A

- (3-methyl-4-hydroxy)butyl)amino]-9-cyklopentylpuřinu, dihydrochlorid 2-[trans-(4-aminocyklohexyl)amino]-6-[(5-hydroxy-1,5-dimethylhexyl)amino]-9-cyklopentylpurinu, dihydrochlorid 2-[trans-(4-aminocyklohexyl)amino]-6-[5-(hydroxy)pentylamino]-9-cyklopentylpurinu, dihydrochlorid 2-[trans-(4-aminocyklohexyl)amino]-6-[(3-hydroxypropyl)amino]-9-cyklopentylpurinu, dihydrochlorid 2-[trans-(4-aminocyklohexyl)amino]-6-(pentylamino)-9-cyklopentylpuřinu, dihydrochlorid 2-(trans-(4-aminocyklohexyl)amino]-6· — (methylamin-o) -y -cyKiopenTyipurinu, dihydrochlorid 2-[trans-(4-aminocyklohexyl)amino]-6-(ethylamino)-9-cyklopentylpurinu, dihydrochlorid 2-[trans-(4-aminocyklohexyl)amino]-6’ -[(3-methylbutyl)amino]-9-cyklopentylpurinu, dihydrochlorid 2-[trans-(4-aminocyklohexyl)amino]-6-[(butyl)amino]-9-(2-propyl)purinu, dihydrochlorid 2-[trans-(4-aminocyklohexyl)amino]-6-(hexylamino)-9-cyklopentylpurinu, dihydrochlorid 2-[trans-(4-aminocyklohexyl)amino]-6-(propylamino)-9-cyklopentylpurinu, dihydrochlorid 2-[trans-(4-aminocykÍohexyl)amino]-6-[2,2,2-trifluorethylamino]-9-cyklopentylpurinu.

4. Sloučenina podle nároku 1, ve které:

R znamená R2, přičemž R2 znamená skupinu

R4

I —(C)n-2

I

R4

·*

- 134

4 4 · • 4 • · • 4 • 4 4 4 4 4 4 i 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 • 4 4 4 • · 4 4 4 4 4 4 4 4 • · · · 4 4 4 4 4 4 4 4 4

ve které:

Z znamená fenylovou skupinu případně substituovanou jedním až třemi substituenty, které mohou být stejné nebo rozdílné a které jsou vybrány ze souboru zahrnujícího Hal, OH a alkylovou skupinu obsahující 1 až 4 atomy uhlíku,

R4 každý představuje navzájem na sobě nezávisle atom vodíku nebo alkylovou skupinu obsahující 1 až 4 atomy uhlíku, a n je celé číslo od 1 do 8_

5. Sloučenina podle nároku 4, kterou je dihydrochlorid (S)-2-[trans-(4-aminocyklohexyl)amino]-6-[(α-methylbenzyl)amino]-9-cyklopentylpurinu, dihydrochlorid 2-[trans-(4-aminocyklohexyl)amino]-6-(3-jodbenzylamino)-9-cyklopentylpurinu, dihydrochlorid 2-[trans-(4-aminocyklohexyl)amino]-6-[(3,4-dichlorbenzyl)amino]-9-cyklopentylpurinu, dihydrochlorid 2-[trans-(4-aminocyklohexyl)amino]-6- [ (3-methylbenzyl)amino]-9-cyklopentylpurinu, dihydrochlorid 2-[trans-(4-aminocyklohexyl)amino]-6-[(3-chlor)benzylamino]-9-(2-propyl)purinu, dihydrochlorid (R)-2-[trans-(4-aminocyklohexyl)amino]6-[(α-methylbenzyl)amino]-9-cyklopentylpurinu, dihydrochlorid 2-[trans-(4-aminocyklohexyl)amino]-6-[(2-chlorbenzyl)amino]-9-cyklopentylpurinu, dihydrochlorid 2-[trans-(4-aminocyklohexyl)amino]-6-(4-fenylbutylamino)-9-cyklopentylpurinu, dihydrochlorid 2-[trans-(4-aminocyklohexyl)amino)-6-

-[3-(fenyl)propylamino]-9-cyklopentylpurinu, dihydrochlorid 2-[trans-(4-aminocyklohexyl)amino]-6-[(4-chlorbenzyl)amino]-9-cyklopentylpurinu, dihydrochlorid 2-[trans-(4-aminocyklohexyl)amino]-6-[(3-chlorbenzyl)amino]-9-cyklopentylpurinu, dihydrochlorid 2-[trans-(4-aminocyklohexyl)amino]-6- [ (4-chlor-2-fluorbenzy1)amino]-9-cyklopentylpurinu, dihydrochlorid 2-[trtuis-(4-tuiiiuocyklohexyl) amino] -6

-[(2-fluorbenzy1)amino]-9-cyklopentylpurinu, dihydrochlorid 2-[trans-(4-aminocyklohexyl)amino]-6- [2- (feny1)ethyfaminoj -9-cyKfopentyipurmu;

dihydrochlorid 2-[trans-(4-aminocyklohexyl)amino]-6-[(4-hydroxyfenyl)ethylamino]-9-cyklopentylpurinu, sloučenina podle nároku 3, kterou je:

trihydrochlorid 2-[trans-(4-aminocyklohexyl)amino]-6-(benzylamino)-9-(2-propyl)purinu, dihydrochlorid 2-[trans-(4-aminocyklohexyl)amino]-6-[benzylamino]-9-cyklopentylpurinu, dihydrochlorid 2-[trans-(4-aminocyklohexyl)amino]-6- [ (2,4-dichlorbenzyl)amino]-9-cyklopentylpurinu, dihydrochlorid 2-[trans-(4-aminocyklohexyl)amino]-6- [ (4-fluorbenzyl)amino]-9-cyklopentylpurinu, dihydrochlorid 2-[trans-(4-aminocyklohexyl)amino]-6-[(3-jodbenzyl)amino]-9-(2-propyl)purinu.

6. Sloučenina podle nároku 1, ve které: R je R2, přičemž R2 znamená skupinu

R4

I —(C)n-2

I

R4 'í?riiť:u • ·

- 136 ve které:

Z znamená heterocyklickou skupinu případně substituovanou jedním až třemi substituenty, které mohou být stejné nebo rozdílné a které jsou vybrány ze souboru zahrnuj ícího Hal, OH a alkylovou skupinu obsahuj ící 1 až 4 atomy uhlíku,

R4 každý představuje navzájem na sobě nezávisle atom xzr>rl-í Vn ηβΚο o 1 ΙττζΊ ζλχγγμi clznm’ mi nbcabn 4 Ί ni 1 o rx A. ca t“ nmír

V _JU X-K W. KS KS fc*X.XV Jř -X- KS V KS W· «Ο XX. XXXbX KS KS «QVXXXW-J KS —A— -x. X» ť > ~T ΚΛ V. KS IKK J uhlíku, a __ n je celé číslo od 1 do 8,

7. Sloučenina podle nároku 6, kterou je dihydrochlorid 2-[trans-(4-aminocyklohexyl)amino]-6-[(3-indolyl)-2-ethylamino]-9-cyklopentylpurinu, dihydrochlorid 2-[trans-(4-aminocyklohexyl)amino]-6-[2- (3,4 - methylend i oxyfeny1) ethylamino ] - 9 - cy k 1opentylpur inu, dihydrochlorid 2-[trans-(4-aminocyklohexyl)amino]-6-[(3-pyridyl)-2-ethylamino]-9-cyklopentylpurinu, dihydrochlorid 2-[trans-(4-aminocyklohexyl)amino]-6-[(4-pyridyl)methylamino]-9-cyklopentylpurinu, trihydrochlorid 2-[trans-(4-aminocyklohexyl)amino]-6-[3-(4-morfolinyl)propylamino]-9-cyklopentylpurinu, dihydrochlorid 2-[trans-(4-aminocyklohexyl)amino]-6-[2-(2-pyridyl)ethylamino]-9-cyklopentylpurinu, trihydrochlorid 2-[trans-(4-aminocyklohexyl)amino]-6-[2-(4-morfolinyl)ethylamino]-9-cyklopentylpurinu, dihydrochlorid 2-[trans-(4-aminocyklohexyl)amino]-6-(2-thiofenmethylamino)-9-cyklopentylpurinu,

137 dihydrochlorid 2-[trans-(4-aminocyklohexyl)amino]-6-[(2-benzimidazolyl)methylamino ]-9-cyklopentylpurinu, dihydrochlorid 2-[trans-(4-aminocyklohexyl)amino]-6-[(2-tetrahydropyranyl)methylamino]-9-cyklopentylpurinu, dihydrochlorid 2-[trans-(4-aminocyklohexyl)amino]-6-[(4-pyridyl)-2-ethylamino]-9-cyklopentylpurinu, dihydrochlorid 2-[trans-(4-aminocyklohexyl)amino]-6-(2-furanmethylamino)-9-cyklopentylpur inu, trihydrochlorid 2-[trans-(4-aminocyklohexyl)amino]-6-[(3-(2-imidazoyl)propyl)amino]-9-(2-propyl)purinu, dihydrochlorid 2-[trans-(4-aminocyklohexyl)amino]-6-[3-(l-imidazolyl)propylamino]-9-cyklopentylpurinu, dihydrochlorid 2-[trans-(4-aminocyklohexyl)amino]-6-[3-(2-imidazoyl)propylamino]-9-cyklopentylpurinu.

8. Sloučenina podle nároku 1, ve které:

R je R2, přičemž R2 znamená skupinu

R4

------------- ----------(C)n--Z - - ~ .1

R4 ve které:

Z znamená cykloalkýlovou skupinu případně substituovanou jedním až třemi substituenty, které mohou být stejné nebo rozdílné a které jsou vybrány ze souboru zahrnuj ícího Hal, OH a alkylovou skupinu obsahuj ící 1 až 4 atomy uhlíku,

R4 každý představuje navzájem na sobě nezávisle atom vodíku nebo alkylovou skupinu obsahující 1 až 4 atomy uhlíku, a ížá·-;.- 7

- 138 n je celé číslo od 1 do 8,

kt prnn dihydrochlorid 2- [tranjs- (4-aminocyklohexyl)amino] -6-[(cyklohexyl)methylamino]-

9-cyklopentylpurinu, dihydrochlorid 2-[trans-(4-aminocyklohexyl)amino]-6-[(cyklopropyl)methylamino]-9-(2-propyl)purinu, dihydrochlorid 2-[trans-(4-aminocyklohexyl)amino]-6-[(cyklopropyl)methylamino]-9-cyklopentylpurinu.

10. Sloučenina podle nároku 1, ve které:

R znamená skupinu R2NH-, přičemž

R2 znamená alkylovou skupinu obsahuj ící 1 až 8 atomů uhlíku případně substituovanou jedním až třemi substituenty, které mohou být stejné nebo rozdílné a které jsou vybrány ze souboru zahrnuj ící ho a alkylovou skupinu obsahující

1 až 4 atomy uhlíku,

11. Sloučenina podle nároku 10, kterou je dihydrochlorid 2-[trans-(4-aminocyklohexyl)amino]-6-[2,2,2-trifluorethylhydrazino]-9-cyklopentylpurinu, dihydrochlorid 2-[trans-(4-aminocyklohexyl)amino)-6-(2-hydroxyethylhydrazino)-9-cyklopentylpurinu.

139

12. Sloučenina podle nároku 1, ve které: R znamená skupinu R2NH-, přičemž R2 znamená skupinu obecného vzorce:

R4

-(C)n-Z

H4 ve kterém:

R4 každý představuje navzájem na sobě nezávisle atom vodíku nebo alkylovou skupinu obsahuj ící 1 až 4 atomy uhlíku, a n je celé číslo od 1 do 8,

13. Sloučenina podle nároku 12, kterou je Dihydrochlorid 2-[trans-(4-aminocyklohexyl)amino]-6-[2-fenethylhydrazino]-9-cyklopentylpurinu.

14. Sloučenina podle nároku 1, ve které:

R znamená skupinu R2NH-, přičemž

R2 znamená skupinu obecného vzorce:

140

R4

I (C)nI

R4 ve kterém:

Z znamená heterocyklickou skupinu případně

07 “ί Τ~#=*τη τ cnhQŤ ýί*Tipdťv které mnhnu hvt stejné nebo rozdílné a které jsou vybrány ze souboru zahrnujícího Hal, OH a alkylovou skupinu obsahující 1 až 4 atomy uhlíku,

R4 každý představuje navzájem na sobě nezávisle atom vodíku nebo alkylovou skupinu obsahující 1 až 4 atomy uhlíku, a ri je celé číslo od 1 do 8,

15. Sloučenina podle nároku 1, ve které: R znamená skupinu R2NH-, přičemž R2 znamená skupinu obecného vzorce:

. R4

I —(C)n—2

I

R4 ve kterém:

Z znamená cykloalkylovou skupinu případně substituovanou jedním až třemi substituenty, které mohou být

141 stejné nebo rozdílné a které jsou vybrány ze souboru zahrnujícího Hal, OH a alkylovou skupinu obsahující 1 až 4 atomy uhlíku,

R4 každý představuje navzájem na sobě nezávisle atom vodíku nebo alkylovou skupinu obsahující 1 až 4 atomy uhlíku, a n je celé číslo od 1 do 8,

16. Sloučenina podle nároku 15, ve které:

R znamená skupinu H₂N-R3-, ve které

R3 znamená alkylenovou skupinu obsahuj ící 1 až 8 atomů uhlíku, a

17. Sloučenina podle nároku 16, kterou je dihydrochlorid 2-[trans-(4-aminocyklohexyl)amino]-6-[(4-aminobuty1)amino]- 9-cyklopentylpurinu, nebo dihydrochlorid 2-[trans-(4-aminocyklohexyl)amino]-6-[(8-aminooktyl)amino]-9-cyklopentylpurinu.

18. Způsob léčení hyperproliferativní poruchy u pacienta, vyznačující se tím, že se tomuto pacientovi podává sloučenina podle nároku 1.

19. Způsob podle nároku 18, vyznačující se tím, že

- 142 .·· β « ς>

• · · '·· touto hyperproliferativní poruchou je stav neoplastického onemocnění.

20. Způsob podle nároku 18, vyznačující se tím, že tento stav neoplastického onemocnění je vybrán ze souboru zahrnujícího leukémii, karcinom, adenokarcinom, sarkom, melanom nebo smíšený typ novotvaru.

21. Způsob podle nároku 19, vyznačujícíse tím,—želeukémie j e vybrána ze souboru zahrnuj ícího akutní lymfolastickou leukémi chronickou leukémii, akutní myeloblastovou leukémii a chronickou myelocytovou leukémii

22. Způsob podle nároku 19, vyznačující se tím, že karcinom je vybrán ze souboru zahrnujícího karcinom čípku, prsou, prostaty, jícnu, žaludku, tenkého střeva, tlustého střeva, vaječníků a plic.

23. Způsob podle nároku 19, vyznačující se tím, že adenokarcinom j e vybrán ze souboru zahrnuj ícího, adenokarcinom čípku, prsou, prostaty, jícnu, žaludku, tenkého střeva, tlustého střeva, vaječníků á plic.

24. Způsob podle nároku 19, vyznačující se tím, že sarkon je vybrán ze souboru zahrriujícího esteřom, osteosarkom, lipom, lipsarkom, hemangiom a hemangiosarkom.

25. Způsob podle nároku 19, vyznačující se tím, že melanom je vybrán ze souboru zahrnujícího amelanotický melanom a melanotický melanom.

26. Způsob podle nároku 19, vyznačující se tím, že smíšený typ novotvaru je vybrán ze souboru zahrnujícího

- 143 .·· karcinosarkom, lymfoidní tkáňový typ, folikulární retikulum, buněčný sarkom a Hodgkinsova nemoc.

27. Způsob podle nároku 17, vyznačující se tím, že hyperproliferativní poruchou je stav ňeoplastického onemocnění.

28. Způsob prevence apoptozy v neuronálních buňkách u pacienta, vyznačující se tím, ze se tomuto pacientovi podává sloučenina podle nároku 1.

29. Způsob podle nároku 27, vyznačující se tím, že apoptoza je vyvolána antioneoplastickými činidly.

30. Způsob podle nároku 27, vyznačující se tím, že apoptoza je vyvolána cerebrovaskuálním onemocněním

31. Způsob podle nároku 27, vyznačující se tím, že apoptoza je vyvolána mrtvicí nebo infarktem.

32. Způsob ochrany neuronových buněk před apoptozou, vyznačující se tím, že se tomuto pacientovi podává sloučenina podle nároku 1.

33. Způsob ochrany neuronových buněk před poškozením vyvolaným antineoplastickými činidly vyznačující se tím, že se tomuto pacientovi podává sloučenina podle nároku 1.

34. Prostředek, vyznačující se tím, že obsahuje zjistitelné množství sloučeniny podle nároku 1 ve směsi nebo v jiném spojení s inertním nosičovým materiálem.

35. Farmaceutický prostředek, vyznačující se tím, že

144 obsahuje účinné cdk-2 inhibični množství sloučeniny podle nároku 1 ve směsi nebo v jiném spojení s jedním nebo více farmaceuticky přijatelnými nosičovými materiály nebo excipienty.