CZ291604B6

CZ291604B6 - 6,9-Disubstituované 2-[trans-(4-aminocyklohexyl)amino]puriny, farmaceutické prostředky obsahující tyto sloučeniny a použití

Info

Publication number: CZ291604B6
Application number: CZ20003106A
Authority: CZ
Inventors: Jennifer A. Dumont; Alan J. Bitonti; David R. Borcherding; Norton P. Peet; Randall H. Munson; Patrick W. K. Shum
Original assignee: Aventis Pharmaceuticals Inc.
Priority date: 1998-02-26
Filing date: 1999-02-18
Publication date: 2003-04-16
Also published as: OA11480A; DK1056745T3; HUP0100931A3; JP2002504553A; ES2219038T3; UA62996C2; BR9908325A; DE69918062T2; SK12912000A3; AU3299099A; EP1056745B1; TW541308B; TR200002482T2; PL344021A1; NZ506234A; AU748178B2; EP1056745A2; CA2320448A1; AP1258A; ATE269332T1

Abstract

Slou eniny obecn ho vzorce I, ve kter m R je vybr n ze skupiny zahrnuj c R2, R2NH- a H.sub.2.n.N-R3-; ve kter²ch R2 je C.sub.1.n.-C.sub.8.n.-alkylov skupina nebo skupina obecn ho vzorce II, ve kter m: Z je fenylov skupina, heterocyklick skupina nebo cykloalkylov skupina, R4 ka d² jednotliv znamen atom vod ku nebo C.sub.1.n.-C.sub.4.n.-alkylovou skupinu, a n je cel slo 1 a 8, p°i em ka d z uveden²ch alkylov²ch skupin obsahuj c ch 1 a 8 atom uhl ku a Z je p° padn substituov na, R3 p°edstavuje C.sub.1.n.-C.sub.8.n.-alkylenovou skupinu, a R1 je cyklopentylov skupina nebo izopropylov skupina; a farmaceuticky p°ijateln soli, optick izomery a hydr ty odvozen od t chto slou enin. Jejich pou it pro inhibov n progrese bun n ho cyklu, konkr tn pro inhibov n cyklin dependentn ch kin z, zejm na cdk-2, a rovn k prevenci apopt zy v neuron ln ch bu k ch a k inhibov n v²voje novotvaru.\

Description

6,9-Disubstituované 2-[trans-(4-aminocyklohexyl)amino] puriny, farmaceutické prostředky obsahující tyto sloučeniny a použití

Oblast techniky

Vynález se týká 6,9-disubstituovaných 2-[trans-(4-aminocyklohexyl)amino]purinů a použití těchto látek pro antineoplastická činidla nebo pro léčení neuronálního poškození a degenerace.

Dosavadní stav techniky

Buněčné dělení, jak v normálních tak v neoptických buňkách, je přísně řízený jev, kteiý probíhá v definovaných stadiích. Klidové buňky, které se aktivně nedělí, jsou ve fázi G_o, jako jsou buňky konečně diferencované nebo buňky ve stavu dočasně zastaveného dělení. První fáze je Gi fáze (označená symbolem G je odvozeno od anglického slova gap = mezera), během které se buňka připravuje na syntézu DNA. V pozdní Gi fázi, v bodě, který je nazýván restrikční bod nebo R bod, buňka přechází do S fáze, ve které nastává syntéza DNA. Po dokončení S fáze buňka přejde do G₂ fáze, během níž s buňka připravuje na dělení a po ní následuje mitóza neboli M fáze.

Počáteční pokusy týkající se regulace buněčného cyklu odhalili existenci proteinu nazývaného faktor podporující zrání („Maturation Promoting Factor“, MPT), což je heterodimer s kinázou aktivitou. Později srovnávání dále identifikovaných proteinů a jejich příslušných genů objevilo rodinu kvasinkových genů známých jako geny řídicí buněčné dělení (geny cdc -„cell division control“). Další pokusy prokázaly, že některé geny cdc kódují kinázy a byly později nazvány kinázy závislé na cyklu = cyklin-dependentní kinázy (cdk „cyclin-dependent kinase“). V důsledku této další klasifikace mají některé proteiny buněčného cyklu dvojí označení, jak cdkl, který je také znám jako cdc2. Kinázová složka MPF se nyní označuje jak p34^cdc2a regulační podjednotka MPT se nyní nazývá cyklin B. Cykliny byly nejdříve identifikovány jako proteiny, jejichž hladiny oscilují během buněčného cyklu a jsou specificky degradovány v mitóze. Doposud byly identifikovány zvířecí cykliny A-I a cdk 1-8. Dále byly určeny subtypy cyklinů a cdk Jako jsou cykliny B1 a B2, což názvosloví ještě více komplikuje.

Další výzkum buněčné regulace prokázal, že stadia buněčného dělení jsou dosažena částečně modulací cyklicnů a cyklin-dependentních kináz (cdk). Cykliny postupně regulují cdk a je pro ně charakteristická homologní oblast o 100 aminokyselinách, nazývaná „cyklinový box“ který je zapojen do vazby proteinového partnera kinázy. Cdk jsou blízce příbuzné, co se týče sekvence a velikosti (35-40 kD), a jsou definovány jako proteinové kinázy aktivované prostřednictvím vazby regulačních podjednotek cyklinu. Cdk obsahuje konzervativní oblast aktivního místa o přibližné velikosti 300 aminokyselin, které je charakteristické pro všechny eukaryotické proteinkinázy. Zdá se tedy, že jak cykliny, tak cdk jsou vysoce konzervativní proteinové rodiny.

Izolace jednotlivých cyklů a cdk umožnila další identifikaci úlohy a interakce každé složky v přechodech mezi fázemi buněčného cyklu. Nadměrné hladiny cdk přetrvávají v průběhu celého buněčného cyklu. Aktivace cdk nastává při syntéze cyklinu a vazbě na katalytickou podjednotku cdk, výsledkem toho je stimulace aktivity cdk, výsledkem toho je stimulace aktivity cdk/serin/threoninkinázy. Kompletní aktivace cdk vyžaduje fosfory láci konzervovaného threoninového zbytku lokalizovaného v T smyčce prostřednictvím kinázy aktivující cyklin-dependentní kinázu (CAK), která sama je tvořena komplexem cdk/cyklin složeným z cyklinu H a cdk7 a třetího proteinu o velikosti přibližně 32 kD.

Inaktivace komplexu cdk-cyklin může být důsledkem fosforylace theoninového a/nebo tyrosinového zbytku ve vazebném místě pro ATP a cdk nebo vazby jednoho z celé řady endogenních inhibičních proteinů.

-1 CZ 291604 B6

Ve fázi G! se cykliny typu D vážou na několik odlišných cdk, včetně cdk2, cdk4, cdk5 a cdk6, ale nejČastěji se spojují s cek4 a cdk6. Má se za to, že cykliny typu D působí jako senzory pro růstové hormony, které propojují progresi buněčného cyklinu s vnějšími podněty. Komplexy cyklin E-cdk2 se objevují v buněčném cyklu savčích buněk po komplexech typu cyklin D-cdk. Syntéza cyklinu E je přísně regulována a nastává v pozdní Gi a časné S fázi. Komplex cyklin E-cdk2 je nezbytný pro to, aby buňka začala replikaci DNA.

Cykliny Gi, cyklin D a cyklin E jsou přechodně tvořené protieny, s biologickým poločasem přibližně 20 minut. Má se za to, že krátký poločas je důsledkem sekvence PĚST v C-koncové oblasti těchto proteinů, jejichž degradace se zdá být zprostředkovaná metabolickou dráhou ubikvitinu.

Cykliny G₂, cyklin A a cyklin B jsou stabilní v průběhu interfáze a jsou specificky zničeny v mitóze prostřednictvím metabolické dráhy ubikvitinu. Zdá se, že jak cyklin A tak cyklin B2 jsou degradovány pouze tehdy, když jsou v komplexu se svým cdk partnerem [cyklin A-cdk2 a cyklin A/B-cdkl (cdc2)J. Ale destrukce cyklinu Bl je spojena s integritou mitotického aparátu na konci metafáze. Jestliže je vřeténko sestaveno nesprávně nebo jestli jsou chromozony nesprávně seřazeny, pak je destrukci Bl zabráněno.

Retinoblastomový protein (Rb), jaderný fosfoprotein velikosti 105 kD, je substrátem pro komplexy cyklin-cdk pro cdk-2,4 a 6 v Gi fázi a působí jako jeden z hlavních kontrolních bodů v buněčném cyklu prostřednictvím pečlivě uspořádané fosfoiylace a defosforylace. V Go/G] existuje Rb v hypofosferylovaném stavu. Jak buňka postupuje do pozdní Gi fáze, Rb se stává hyperfosforylovaný prostřednictvím komplexů cyklinu D, které inaktivují Rb a vedou buňku do S fáze, což má za následek progresi buněčného cyklu a buněčné dělení. Tento stav hyperfosforylace Rb zůstává během G₂. Během pozdní M fáze je Rb defosforylován, a tak se vrací do hypofosforylovaného stavu. Fosforylace proteinu Rb mění jeho vazebné vlastnosti, v hypofosforylovaném stavu Rb váže a odděluje specifické transtripční faktory, jako E2F, jehož vazba zabraňuje úniku z Gi fáze. Jakmile cdk hyperfosforylují Rb, jsou transkripční faktory uvolněny a to pak může aktivovat transkripci genů nezbytných pro progresi S fáze, například gen thymidinkinázy, myc, myb, adihydrofolátreduktázy a DNA polymerázy-a.

Lokalizace komplexů cyklin-CDK je také velmi sugestivní, co se týče úlohy, kterou má každý komplex v metabolické dráze. Jaderné cykliny A a E se vážou kpl07 a pl30 pravděpodobně proto, že jsou v jádru. Savčí cyklin Bl se akumuluje v cytoplazmě v G₂ fázi a translokuje se do jádra na začátku mitózy. Cyklin B asociuje s aparátem vřeténka, konkrétně s pólem vřeténka, a má se za to, že cyklin B-cdc2 kináza může být do tvorby vřeténka zapojena prostřednictvím fosforylujících složek mitotického aparátu. Navíc cyklin Bl je částí zpětnovazebního mechanismu, který zajišťuje správné sestavení mitotického aparátu v metafázi. Lidský cyklin B2 je téměř výlučně asociován s membránovým kompertmentem, obzvláště s Golgino aparátem. Cyklin B2-cdc2 je zapojen do rozpojování Golgiho aparátu, když buňka vstupuje do mitózy.

Cdc2-cyklin B kináza je klíčový mitotický faktor, který se jeví jako vysoce konzervativní a má se za to, že je zapojen v přechodech buněčného cyklu ve všech eukaryotických buňkách. Histon H1 je substrát pro cdc2-cyklin B, histon H1 je selektivně fosforylovaný na specifických místech v mitóze, což je dle předpokladu důležité pro kondenzaci chromatinu. Komplex cec2-cyklin B také fosforyluje lamin, který je zodpovědný za rozpad jaderné membrány. Jaderná membrána je tvořena z polymeru laminových podjednotek, které jsou hyperfosforylované v mitóze, a tato fosforylace je zodpovědná za jejich rozpojení. Lamin je částí rodiny proteinů intermediámích fibril a cdc2-cylin B fosforyluje podskupinu míst fosforylovaných v mitóze na cytoplazmatických podjednotkách intermediámích fibril, vimentinu a dezminu. Tak je komplex cdc2-cyklin B zapojen do reorganizace buněčné architektury v mitóze.

Kromě toho cdc2-cyklin B je zapojen do reorganizace mikrofilament prostřednictvím fosforylace kaldezmanu (jiného než ve svalech) a proteinu o velikosti 83 kD, který se váže k aktinu

-2CZ 291604 B6 a kalmodulinu a inhibuje aktivitu aktomyozin-ATPázy. V mitóze je kaldezmon fosforylován prostřednictvím cdc2-cyklinu B, což zeslabuje jeho afinitu k aktinu a způsobuje, že disocium je mikrofilament.

Cdc2-cyklin B zasahuje do regulace aktinomyozinových vláken prostřednictvím fosfory láce myozinu v kontraktivních cirkulámích fibrilách, které rozdělí buňku na dvě (cytokineze).

V metafázi je regulační lehký řetězec myozinu Π (MLC) fosforylován na dvou základních místech v N-koncové části. Fosforylací myozinu se zabrání jeho interakcí s aktinem. V anafázi jsou tato dvě místa defosforylována.

Cdc2-cyklin B má také úlohu v reorganizaci membránového kompartmentu v mitóze. Například cdc2-cyklin B fosforyluje rablAp a rab4p. Když je rab4p fosforylován cdc2-cyklinem B, disociuje z membránového kompartmantu.

V mitóze je většina transkripčních forem inhibována. Cdc2-cyklin B má opět úlohu v inhibici transkripce zprostředkované pol ΙΠ prostřednictvím fosfory láce ΊΤΙΠΒ. Za předpokladu, že transtrikce zprostředkovaná pol I, pol Π a pol ΠΙ sdílí několik společných faktorů, jako je protein vázající sekvenci TATA (TBA), je pravděpodobné, že cdc2-cyklin B je zapojen do tlumení všech transkripčních forem v mitóze.

Za předpokladu, že komplexy cyklin/cdk jsou důležité pro spouštění cyklu buněčného dělení, jsou pod přísnými regulačními mechanismy. Od výchozího objevu bylo prokázáno, že cyklin a cdk interagují s jinými transkripčními faktory a proteiny zapojenými do celé řady buněčných metabolických drah. Cdk7 byl rozpoznám jako složka transkripčního faktoru ΠΗ (TFIIH), která má kinázovou aktivitu C-koncové domény (CDT) RNA polymerázy Π. Nedávno bylo objeveno, že také cdk8, která se spojuje s cyklinem C, fosforyluje CTD DNA polymerázy Π, ale nezdá se, že má aktivitu CAK. Je tedy jasné, že kromě regulace buněčného cyklu se cdk podílí na celé řadě buněčných funkcí. CDK-inhibiční proteiny (CDI) jsou malé proteiny, které vážou a inaktivují specifické komplexy cyklin-CDK nebo monomemí CDK. Tyto inhibitory mohou být zařazeny do dvou rodin na základě podobnosti sekvencí a funkcí. Rodina INK4 zahrnuje pló¹¹^⁴⁸, pló¹^⁴, pl8 a pl9, které specificky vážou cdk4 a cdk6. pló¹¹^⁴ a pl5^rNK4B obsahují čtyři ankyrinové repetice a kromě toho, že jsou významně homologní, jsou kódovány sousedními geny v lokusu 9pl2.

Vysoké buněčné hladiny pl6 mají za následek inaktivaci cdk4, protože pl6 váže komplexy cyklin D-cdk4 a cyklin D-cdk6. Gen pro pló¹^⁴ (MTS1) je považován za potenciální nádorový supresorový gen, protože je přestavován, deletován nebo mutován ve velkém počtu nádorových buněčných linií a v některých primárních nádorech. V jedné studii heteditámího melanomu měla téměř polovina rodin mutace zárodečné linie v genu pl6^W4. Rb je represor pló¹^⁴. Inaktivace buněčného Rb, buď mutací nebo virovými antigeny, koreluje se zvýšenými hladinami pló⁸^⁴. pló®®⁴, pl5¹¹^⁴⁸ _a pl8 inhibují vazby cyklin D s cdk4 a cdk6.

Druhá rodina CDI je rodina Kip/Cip, která zahrnuje p21^Cipl, WAF-1, p27^Kipl a p57^kip2. p27^Kipl se vyskytuje v proliferujících buňkách v latentní nebo maskované formě. V průběhu stimulace je p27^Kipl demaskován a váže a inhibuje komplexy cyklin-CDK4/6. Proteiny rodiny Kip/Cip jsou silně homologní v N-koncové části, oblasti, která váže komplexy cyklin-cdk. Proteiny rodiny Kip/Cip vážou a inhibují komplexy cyklin-cdk zapojené do komplexů G] a S fází přednostně proti komplexům M fáze.

P21 (známý také jako WAF1, Cipl a Sdil) je indukován p53 a tvoří temámí komplex s jaderným antigenem proliferující buňky (PCNA) a podjednotkou DNA polymerázy δ v několika komplexech cyklin_CDK2, včetně cyklinů A, Dl a E. Exprese p21^w v rostoucích, klidových a stárnoucích buňkách koreluje sjeho úlohou jako negativním regulátorem vstupu do S fáze. p21^WAF_1 mRNA se zvyšuje, když buňka stárne nebo je v klidové fázi a po sérové stimulaci

-3CZ 291604 B6 klidových buněk a snižuje se, když buňka vstupuje do S fáze. p21 inaktivuje komplexy cyklin E-cdk2, cyklin A-cdk2 a cyklin Dl, D2 a D3-cdk4.

Genetická analýza četných lidských nádorů odhalila neúměrný počet změněných proteinů 5 buněčného cyklu a má se za to, že tato aberace způsobuje abnormální buněčný cyklus. Například cyklin Dl je bcl-l/PRADl proto-onkogen, který je buď nadměrně exprimován nebo deregulován v celé řadě lidských nádorů. Gen cyklin D1/CCND1, lokalizovaný na chromozomu 1 lql3, je amplifikován u velkého počtu karcinomů, hlavně karcinomu prsu a plicních karcinomů jiných než malobuněčných. To koreluje s pozorováním, že nadměrná exprese cyklinu Dl je ío společný rys u nádorů s tímto specifickým amplikonem (amplifikovaným fragmentem) llql3.

Gen pro pl6 je přestavěn, deletován nebo mutován u velkého počtu nádorových buněčných linií a u některých primárních nádorů. Mutace v cdk4, specificky mutace Arg24Cys, byla identifikována ve dvou nepříbuzných rodinách s heteditámím melanomem. Tato mutace byla nalezena u 11/11 pacientů s melanomem, 2/17 nepostižených a 0/5 manželů/manželek (Zuo 15 a kol., Nátuře Genetics, 12, 97-99, 1996). Tato mutace má specifický účinek na doménu cdkč vázající pló¹¹®⁴³, ale nemá žádný vliv na schopnost vazby k cyklinu D a tvorbu funkční kinázy. V důsledku této mutace je komplex cyklin D/cdk4 rezistentní na normální fyziologickou inhibici prostřednictvím p 16¹^⁴³. Další studie ukázaly, že téměř u poloviny příbuzenstva s familiárním melanomem se prokázala vazba v oblasti chromozomu 9p21, který obsahuje gen pló¹^⁴³. Typy 20 identifikovaných mutací pló¹¹^⁴³ zahrnují nonsense mutaci, mutaci donora sestřihu, neidentifikovanou mutaci, která zabraňuje transkripci pló¹¹^⁴“ a 3 missense mutanty (mutace měnící smysl kodonu), které jsou neschopné vázat cdk4 nebo cdk6. Nadměrná exprese cdk4 jako důsledek amplifikace genů byla identifikována ve studii 32 gliomových buněčných linií (He, J., a kol., Cancer Res., 54, 5804-5807, 1994). Tato alterace byla pozorována u deseti případů 25 sintaktními geny p 16. Genetická analýza gliomových buněčných linií odhalila, že 24 z 32 gliomových buněčných linií (He, J., a kol., Cancer Res., 54, 5804-5807,1994). Tato alterace byla pozorována u deseti případů s intaktními geny pl6. Genetická analýza gliomových buněčných linií odhalila, že 24 z 32 gliomových buněčných linií mělo jednu ze dvou alternativních genetických alterací, z nichž každá ukazovala, že zvýšená aktivita cdk4 kinázy je důležitá pro 30 vývoj gliového nádoru. cdk4 je na mapě dlouhého raménka chromozomu 12 a její nadměrná exprese byla nalezena u určitých nádorů díky její amplifikaci jako složky amplikonu, který zahrnuje další relevantní geny, jako je SAS a MDM2. Všechny z výše uvedených stavů vedou k aktivaci cdk4. Byla také publikována nadměrná exprese cyklinů B1 a E u leukemických buněčných linií a u buněčných linií solidního tumoru, jakož i změněný charakter exprese cyklinu 35 E u karcinomu prsu.

Buněčná hyperproliferace se objevuje u velkého počtu chorobných stavů. Nejběžnější hyperproliferační nemoci jsou novotvary, které jsou typicky pojmenovány podle původního zdroje hyperproliferační tkáně. Novotvary jsou definovány jako nový nárůstek zvířecí nebo 40 rostlinné tkáně, který více či méně připomíná tkáň, ze které pochází, ale neslouží žádné fyziologické funkci a jejich charakter je benigní, potenciálně maligní nebo maligní. Novotvary vznikají jako důsledek ztráty normální kontroly, což vede k neregulovanému růstu. Neoplastické buňky mohou postrádat diferenciaci a získávají schopnost invadovat do místních tkání a metastazovat. Novotvary se mohou vyvinout v každém typu tkáně každého orgánu v každém 45 věku. Výskyt novotvarů a úmrtnost obecně stoupají s věkem, přičemž určité novotvary mají vrchol výskytu mezi 60. a 80. rokem (například prostata, žaludek a tlusté střevo). Ale jiné novotvary mají vrchol výskytu od narození do 10 let věku (například akutní lymfoblastická leukemie). Dieta, expozice karcinogenům, zejména tabáku a familiární predispozice také ovlivňují výskyt konkrétních novotvarů.

Neoplastické buňky se liší od normálních buněk v celé řadě důležitých aspektů, včetně ztráty diferenciace, zvýšené ainvazivnosti a snížené citlivosti na léky. Další důležitá odlišnost je nekontrolovaný růst buněk, o kterém se předpokládá, že je důsledkem ztráty normálních buněčných kontrolních mechanismů těchto buněk, které jsou buď deaktivovány, obcházeny nebo

-4CZ 291604 B6 na ně není brán zřetel jinak, což umožňuje neoplastickým buňkám proliferovat bez ohledu na normální kontrolní mechanismy.

Novotvar je abnormální tkáňová hmota, jejíž růst se vymyká kontrole a není koordinován s růstem normální tkáně a trvá stejně nadměrným způsobem i po skončení podnětu, který změnu vyvolal.

Novotvary se rozdělují na benigní nebo maligní. Benigní novotvary projevují pomalý, lokalizovaný růst, který je obvykle ohraničen díky jejich opouzdření pomocí fibrózního pouzdra z pojivové tkáně. Zatímco benigní novotvary zřídka způsobí smrt organismu, u neléčených maligních novotvarů je vysoká pravděpodobnost, že organismus usmrtí. Maligní novotvary jsou obecně neopouzdřené a obvykle rychleji rostou. Maligní novotvary často invadují do okolních tkání a cév a šíří se na vzdálená místa v těle. Maligní novotvary jsou genericky popisovány jako „karcinomy“ nebo jako „tumory“, druhý termín označuje zduření.

Myeloproliferační choroby je skupina nemocí charakterizovaná abnormální proliferací jedná nebo více hemopoetických buněčných linií nebo složek pojivové tkáně. Normálně se do myelopliferačních chorob zahrnují čtyři nemoci: polycythaemia vera (primární polycytémie, Vaquezova choroba), myelofibróza (myeloidní metaplázi nejasného původu), chronická myeloidní leukemie a primární (esenciální) trombocytémie. Akutní leukemie, zejména erytroleukemie, a paroxysmální noční hemoglobinurie jsou také zařazovány jako myeloproliferační choroby. Každá z těchto chorob je identifikována podle svého předkládajícího charakteristického rysu nebo podle místa proliferace. Ačkoliv jsou důsledkem proliferace různých buněk, bylo dokázáno, že každá nemoc je způsobena klonální proliferací vznikající na úrovni pluripotentní kmenové buňky, což způsobuje různý stupeň abnormální proliferace erythroidních, myeloidních a megakaryocytových prekurzorů v kostní dřeni. Všechny myeloproliferační choroby mají tendenci končit jako akutní leukemie.

Leukemie jsou maligní novotvary krvetvorných tkání. S vyvoláním leukemie u lidí jsou spojovány přinejmenším dva viry. Virus Epstein-Barrové se spojuje s Burkittovým lymfomem a lidský lymfotropní virus T buňky, také nazývaný virus lidské akutní leukemie/lymfomu (HTLV-1), byl dáván do souvislosti s některými leukémiemi a lymfomy T buněk. Expozice, zejména déletrvající expozice chemickým činidlům, jako je benzen a některá protinádorová léčiva, nebo ionizujícímu záření, genetické predispozice (například Downův syndrom) a které familiární choroby (například Foanconiho anémie) mají za následek predispozici k leukémii.

Má se za to, že rozvoj leukemie nastává prostřednictvím jednoho buněčného cyklu ve dvou nebo více krocích s následnou proliferací a klonální expanzí. Leukemie jsou v současnosti tříděny podle své buněčné zralosti, akutní leukemie jsou převážně nedifencované buněčné populace a chronické leukemie mají zralejší buněčné formy. Akutní leukemie se dále dělí na lymfoblastové (ALL, také známa jako akutní leukemie lymfatické řady) a myelogenní myeloblastová, myelomonoblastová). Mohou být dále tříděny pomocí morfologických a cytochemických znaků podle francouzsko-americko-britské (FAB) klasifikace nebo podle typu a stupně diferenciace. Chronické leukemie se klasifikují buď jako lymfatické (CLL) nebo myeloidní (CML). CLL je charakterizována výskytem zralých lymfocytů v krvi, kostní dřeni a Iymfoidních orgánech. CML je charakterizována převahou granulocytů ve všech stupních diferenciace v krvi, kostní dřeni, játrech, slezině a jiných orgánech.

Myelodysplastický syndrom (MDS) je charakterizován jako klonální proliferační choroba, u které je normální nebo hypercelulámí kostní dřeň sdružena s anemií a poruchami myelopoézy. Hemopoetické buňky, které mohou proliferovat, zahrnují erythroidní, myeloidní amegakaryocytové formy. MDS je relativně nové označení skupiny chorob známých jako preleukemie, refaktemí anémie, Ph-chromozom negativní chronická myeloidní leukemie, chronická myelomonocytová leukemie a myeloidní metaplázie nejasného původu. Systém FAB poskytuje další klasifikaci myelofibrózy.

-5CZ 291604 B6

Lymfomy jsou heterogenní skupina novotvarů vznikajících v retikuloendotelovém a lymfatickém systému. Hlavní typy lymfomů jsou Hodgkinova choroba a nehodgkinské lymfomy, a také vzácnější Birkittův lymfom a mycosis fungoides. Hodgkinova choroba je chronické onemocnění s lymforetikulámí proliferací neznámé příčiny, která se může vyskytovat v lokalizované nebo diseminované formě a je dále charakterizována podle čtyř histopatologických profilů. Nehodgkinské lymfomy jsou heterogenní skupiny nemocí, jež spočívá v neoplastické proliferací lymfoidních buněk, které jsou obvykle v těle diseminovány. Dřívější termíny, lymfosarkom a retikulosarkom, byly nyní nahrazeny termíny, které odrážejí původ buněk a biologický průběh nemoci. Rappaportova klasifikace je založena na histopatologii, na stupni diferenciace nádoru a na tom, zda je růstový model difuzní nebo modulární. Klasifikace podle Lukeše a Collinse je založena na původu buňky, specificky zda pochází zT nebo B buňky, histiocytu (nebo monocytu) nebo je původ neklasifikovatelný. Intemational Panel Working Formulation of the National Cancer Institute třídí nehodgkinské lymfomy s použitím výše uvedených klasifikací.

Burkittův lymfom je vysoce nediferencovaný lymfom B buněk, který má tendenci postihovat místa jiná než lymfatické uzliny a retikuloendotelový systém. Burkittův lymfom má na rozdíl od jiných lymfomů specifickou geografickou distribuci, což svědčí pro neidentifikovaný hmyzí vektor a infekční agens. Důkazy ukazují na virus herpes podobný viru Epstein-Barrové.

Mycosis fungoides je vzácný chronický lymfom T buněk postihující kůži a příležitostně vnitřní orgány.

Dyskrezie plazmatických buněk (PCD) nebo monoklonální gamapatie jsou choroby charakterizované disproporční proliferací jednoho klonu buněk normálně zapojených do syntézy imunoglobulinu (Ig) a výskytem strukturálně a elektroforeticky homogenního Ig nebo jeho polypeptidové podjednotky v séru nebo moči. Choroba může být nejdříve asymptomatická až k progresivním zjevným novotvarům (například mnohočetný myelom). Choroba je důsledkem disproporční proliferace jednoho klonu prokujícího specifický Ig: IgG, Igm, IgA, IgD nebo IgE.

Mnohočetný myelom, také známý jako myelom plazmatických buněk nebo myelomatóza, je progresivní neoplastické onemocnění, pro které jsou charakteristické tumory plazmatických buněk kostní dřeně a nadměrná produkce intaktního monoklonálního Ig (IgG, IgA, IgD nebo IgE) nebo Bence Jonesova proteinu, což jsou volné monoklonální lehké řetězce kappa nebo lambda. Difuzní osteoporóza nebo diskrétní osteolytické léze vznikají v důsledku náhrady expandujícími tumory plazmatických buněk nebo díky faktoru aktivujícím osteoklasty, který je secemován maligními plazmatickými buňkami.

Makroglobulinémie nebo primární či Waldenstromova makroglobulinémie je dyskrazie plazmatických buněk postihující B buňky, které normálně syntetizují a secemují IgM. Makroglobulinémie se liší od myelonu a jiných PCD a připomíná lymfomatózu. Mnoho pacientů má příznaky zvýšené viskozity krve, únavu, slabost, kožní a slizniční krvácení apod.

Nemoc těžkých řetězců je neoplastická dyskrazie plazmatických buněk charakterizovaná nadměrnou produkcí homogenních těžkých řetězců Ig γ, α, μ a δ. Tyto poruchy mají za následek nekompletní monoklonální Ig. Klinický obraz se podobá více lymfomů než mnohočetnému myelomu.

Hypersplenismus je syndrom, při kterém je oběhová cytopenie spojena se splenomegalií. Léčení pacientů s hypersplenismem vyžaduje léčbu základní nemoci, ne splenektomii. Lymfoproliferační a myeloproliferační choroby jsou určitou, ale ne jedinou, příčinou hypersplenismu. Myeloproliferační choroby způsobující hypersplenismus zahrnují polycytémii vera, myelofibrózu s myeloidní metaplázií, chronickou myeloidní leukémii a esenciální trombocytémii. Chronická lymfocytová leukemie a lymfomy (včetně Hodgkinovy choroby) jsou specifické lymfoproliferační choroby, které mohou vyvolat hypersplenismus.

-6CZ 291604 B6

Plicní tkáň je místo jak benigních tak maligních primárních tumorů, a také místo metastáz karcinomů z mnoha dalších orgánů a tkání. Kouření cigaret je příčinou ohromného procenta plicních karcinomů, odhadem více než devadesáti procent případů u mužů a přibližně sedmdesáti procent případů u žen. Expozice vlivům pracovního prostředí, jako je azbest, radiace, arzen, chromany, nikl, chlormethyletery, jedovatý plyn a emise koksovací pece, je také spojena s plicním karcinomem. Nejběžnější typy plicního karcinomu jsou epidermoidní, malobuněčný, velkobuněčný karcinom a adenokarcinom.

Přibližně devadesát pět procent rakoviny žaludku jsou karcinomy, méně běžné jsou lymfomy a leiomyosarkomy. Karcinomy žaludku jsou klasifikovány podle celkového vzezření, vyčnívající, penetrující (tumor má ostrou, dobře ohraničenou hranici a může být ulcerován) a infiltruj ící nebo smíšený, který má charakteristické vlastnosti dvou dalších typů.

Rakoviny pankreatu mohou být tumory exokrinní, což jsou většinou adenokarcinomy vznikající spíše z buněk kanálků než z buněk acinů, nebo tumory endokrinní, které zahrnují inzulinom. Pankreatické tumory produkující gastrin postihují buňky jiné než typu β nebo tumory ve stěně duodena mohou způsobit Zollingerův-Ellisonův syndrom, který se vyznačuje hypergastrinémií. Někdy další endokrinní abnormality, zejména příštítných tělísek nebo hypofýzy a nadledvin, vyvolají poruchu mnoha žláz známou jako mnohočetná endokrinní neoplázie (MEN). Tumory buněk jiného typu než β mohou způsobit syndrom známý jako syndrom pankreatické cholery, jehož příčinou je nádor pankreatu produkující VIP (vipom), který je charakterizován dlouhotrvajícími masivními řídkými průjmy.

Novotvary střev zahrnují tumory tenkého střeva, tumory tlustého střeva a rakovinu tračníku a rekta. Benigní tumory tenkého střeva mohou vznikat z novotvarů jejuna a ilea, včetně leiomyomů, lipomů, neurofibromů a fibromů. Maligní tumory tenkého střeva, jako jsou adenokarbinomy, jsou vzácné a typicky vznikají v proximálním jejunu. Pacienti s Crohnovou chorobou tenkého střeva jsou v těchto adenokarcinomům náchylnější než pacienti s Crohnovou chorobou tlustého střeva. U pacientů s Crohnovou chorobou mají tumory tendenci objevovat se distálně v překlenutých nebo zanícených kličkách střeva. Karcinoidy typicky vznikající v tenkém střevě, zejména v ileu, a přibližně v polovině případů existují mnohočetné tumory. Kaposiho sarkom, který se často vyskytuje u příjemců transplantátu a u pacientů sAIDS, má gastrointestinální postižení přibližně v polovině případů. Léze se mohou objevit kdekoliv v gastrointestinálním traktu, ale jsou obvykle nalézány v žaludku, tenkém střevu nebo distálním tračníku.

Tumory tlustého střeva zahrnují polypy tračníku a rekta. Polypy jsou tvořeny masou tkáně, která vychází ze střední stěny a vyčnívá do lumen. Polypy se třídí podle histologie, jako tubulámí adenomy, tubulovilózní adenomy, vilózní adenomy, hyperplastické polypy, hamartomy, juvenilní polypy, polypoidní karcinomy, pseudopolypy, lipomy, leiomyomy a ještě vzácnější tumory.

Maligní tumory mohou také vznikat v anorektu. Jsou to epidermoidní (z dlaždicových buněk) karcinomy anorekta, ze kterých se skládají tři až pět procent rektální a anální rakoviny.

V západních zemích jsou karcinomy tračníku a rekta na druhém místě za karcinomem plic, co se týče evidence nových případů každý rok. V USA v roce 1989 zemřelo přibližně 75 000 lidí na tyto karcinomy, přibližně 70 % se vyskytlo v rektu a sigmoideu a 95 % byly adenokarcinomy.

Novotvary jater zahrnují benigní novotvary, které jsou relativně časté, ale často neodhalené, a maligní novotvary. Hepatocelulámí adenom je nej důležitější benigní novotvar jater. Asymptomatické malé hemangiomy se vyskytují u jednoho až pěti procent dospělých. Adenomy žlučovodů a další mezenchymální novotvary se také vyskytují, ale jsou relativně vzácné. Maligní novotvary jater jsou nejčastější formou jatemího tumoru a játra jsou častým místem metastáz přenášených krevním oběhem, obvykle z plic, prsu, tračníku, pankreatu a primárních nádorů žaludku. Výskyt hepatocelulámího karcinomu je spojen s chronickou virosou hepatitidou B

-7CZ 291604 B6 v určitých částech Afriky a jihovýchodní Asie. V severní Americe, Evropě a jiných oblastech s nízkou prevalencí má většina pacientů jako základní onemocnění cirhózu jater. Fibrolamelmí karcinom je jiná varianta hepatocelulámího karcinomu s charakteristickou morfologií maligních hepatocytů zachycených v lamelámí fibrózní tkáni. Fibrolamelámí karcinom obvykle postihuje relativně mladé dospělé a nemá žádný vztah s dříve existující cirhózou, chronickou infekcí virovou hepatitidou B nebo jinými známými rizikovými faktory. Další primární malignity jater zahrnují cholangiokarcinom (tumor vznikající zepitelu intrahepatických žlučovodů), hepatoblastom (který je jeden z nejčastějších karcinů u dětí) a angiosarkom (který je spojován s průmyslovou expozicí vinylchloridu). Leukemie a příbuzné choroby mohou postihnout hepatické tkáně, má se za to, že je to důsledek infiltrace abnormálními buňkami.

Syndrom mnohočetné endokrinní neoplázie (MEN) je skupina geneticky rozdílných familiárních nemocí zahrnujících adenomatózní hyperplázii a tvorbu maligních tumorů v několika endokrinních žlázách. Byly identifikovány tři odlišné syndromy. Typ I (MEN-I) je charakterizován tumory příštítných tělísek, pankreatických ostrůvků a hypofýzy. Typ H (MEN-Π) je charakterizován medulámím karcinomem štítné žlázy, feochromocytomem a hyperparathyreózou. Typ ΙΠ (MEN-ΠΙ) je charakterizován mnohočetnými slizničními neuromy, medulámím karcinomem štítné žlázy a feochromocytomem.

Syndrom karcinoidu je obvykle způsobován metastazujícím intestinálním karcinoidem, který secemuje nadměrné množství vazoaktivních látek, včetně serotoninu, bradykininu, histaminu, prostaglandinů a polypeptidových hormonů. Abnormální hladiny těchto látek způsobují celou řadu příznaků, často záchvatovité zrudnutí kůže („flush“), cyanózu, kolikovité bolesti v břiše, průjem a onemocnění srdeční chlopní.

Novotvary kostí a kloubů, mohou být benigní nebo maligní. Benigní tumory kostí zahrnují osteochondromy (osteokarcilaginózní exostózy), které jsou nejčastější benigní kostní tumory u dětí mezi 10. až 20. rokem, benigní, chondromy (které jsou lokalizované uvnitř kosti), které se vyskytují nejčastěji u dětí u mladých dospělých mezi 10 až 30. rokem, chondroblastom (který vzniká v epifýze), který je vzácný, ale nejčastější u dětí mezi 10. až 20. rokem, chondromyxoidní fibromy, osteoidní osteom, obrovskobuněčné tumory a fibromatózní léze. Primární maligní nádory kostní zahrnují osteogenní sarkom (osteosarkom), který je druhý nejčastější primární kostní nádor, fibrosarkomy, maligní fibrózní histiocytom, chondrosarkomy, mezenchymální chodrosarkomy, Ewingův nádor (Ewingův sarkom), maligní lymfom kostní, mnohočetný myelom a maligní obrovskobuněčný tumor.

Primární karcinomy jiných tkání mohou metastazovat do kostní tkáně. Nejčastější jsou karcinomy vznikající v prsu, plicích, prostatě, ledvinách a štítné žláze.

Novotvary centrálního nervového systému (CNS) se obecně třídí podle orgánu. Primární intrakraniální novotvary jsou rozděleny do šesti skupin: tumory 1) lebky, 2) mening, 3) kraniálních nervů, 4) neuroglií a ependymu, 5) hypofýzy nebo epifýzy, a 6) kongenitálního původu. Novotvary lebky zahrnují osteom, hemangiom, granulom, xantom a osteitis deformans. Meningeální novotvary zahrnují meningiom, sarkom a glomatózu. Novotvary kraniálních nervů zahrnují gliom optického nervu a schwannom 8. a 5. kraniálního nervu. Novotvary neuroglií zahrnují gliomy a ependymomy. Novotvary hypofýzy nebo epifýzy zahrnují adenom hypofýzy apinealom. Novotvary kongenitálního původu zahrnují kraniofaryngiom, chordom, germinom, teratom, termoidní cystu, angiom a hemangioblastom.

Novotvary míchá jsou léze, které tísní míchu nebo její kořeny, vznikající z míšního paranchymu, kořenů, mening nebo obratlů. Primární novotvary míchy jsou mnohem méně běžné než intrakraniální tumory. Metastatické léze jsou běžné a mohou vznikat z karcinomů plic, prsu, prostaty, ledvin, štítní žlázy nebo lymfomů.

-8CZ 291604 B6

Novotvary močopohlavní soustavy se vyskytují v každém věku a u obou pohlaví, ale zodpovídají za přibližně 30 % karcinomů u mužů a 4 % u žen. Adenokarcinom prostaty významně přispívá k počtu malignit u mužů nad 50 let. Adenokarcinom prostaty má vztah k hormonům a jeho patologie je typicky grandulámí. Karcinom ledvin, adenokarcinom, se podílí pouze přibližně jedním až dvěma procenty na karcinomech dospělého věku, ale většina solidních tumorů ledvin je maligní. Wilmsův tumor, embryonální adenomyosarkom ledvin, se vyskytuje fetálně a často není diagnostikován po mnoho let. Novotvary pánvičku ledvinné a ureteru jsou histologicky podobné. Novotvary močového měchýře mohou být indukovány známými karcinogeny močové soustavy, jako jsou anilinová barviva, a nejběžnější je karcinom z přechodního epitelu. méně běžný je dlaždicobuněčný karcinom. Vzácnější novotvary močopohlavní soustavy zahrnují karcinom erytry a penisu. Novotvary varlat jsou zodpovědné za většinu solidních malignit u mužů pod 30 let. Většina maligních testikulámích tumorů vzniká z primordiální zárodečné buňky a třídí se podle postiženého buněčného typu.

Karcinom prsu je nejčastější karcinom u žen. V USA je kumulativní riziko pro ženy každého věku, že se u nich rozvine karcinom prsu, přibližně 10 %, ale riziko úmrtí na nemoc je pouze přibližně 3,6 %. Ale riziko stoupá s věkem, rodinnou anamnézou karcinomu prsu, expozici záření a do vyššího rizika zasahuje dokonce i dieta.

U karcinomů prsu se rutinně provádí analýza estrogenových a progesteronových receptorů. Přibližně dvě třetiny pacientem mají tumory prsu pozitivní na estrogenový receptorů (ER+). Předpokládá se, že tumory, které jsou progesteron-pozitivní, mají funkční estrogenový receptor a výskyt obou receptorů poskytuje větší pravděpodobnost příznivé odpovědi na endokrinní léčbu než výskyt pouze jednoho receptorů. Endokrinní léčba, obvykle tamoxifenem, je výhodná u tumorů pozitivních na estrogenový receptor. Estrogeny a androgeny jsou také účinné, ale pro nežádoucí vedlejší účinky vyvolané vyššími hladinami těchto hormonů jsou méně oblíbené než jiné formy endokrinní léčby. Karcinom prsu může metastazovat do téměř každého orgánu v organismu, ale nejčastější místa metastáz jsou plíce, játra, kosti, lymfatické uzliny a kůže.

Lokulární karcinom in šitu (LCIS) nebo lobulámí neoplázie se nej častěji nachází u žen před menopauzou. Duktální karcinom in šitu (DCIS) se vyskytuje u obou skupin, žen před menopauzou i po ní. DCIS vytváří hmatatelnou masu. LCIS a DCIS zodpovídají za přibližně 90 % všech karcinomů prsu. Vzácnější formy, medulámí a tubulámí léze, mají poněkud lepší prognózu.

Nej časnější gynekologické novotvaiy jsou endometriální karcinomy, které se řadí na čtvrté místo co do četnosti za karcinom prsu, kolorektální karcinom a plicní karcinom u žen. Endometriální karcinomy jsou charakterizovány svou klinickou klasifikací, pohybující se v rozmezí od stadia in šitu na stupni 0 do stadia metastáz do vzdálených orgánů na stupni IVB. Endometriální karcinomy typicky produkují estrogen a současně léčebné přístupy zahrnují chirurgický výkon a progesteronovou terapii.

Karcinomy vaječníků jsou zodpovědné za přibližně 18% všech gynekologických novotvarů. Přibližně 80 % maligních ovariálních karcinomů vzniká z ovariálního epitelu a třídí se podle své histologie. Tumory mohou také vznikat ze zárodečných buněk nebo stromatu.

Karcinom vulvy je zodpovědný za přibližně 3 až 4 % všech gynekologických novotvarů. Karcinom vulvy se obvykle vyskytuje po menopauze, a přibližně z 90 % to je spinocelulámí karcinom. Přibližně 4 % tvoří bazocelulámí karcinomy a zbytek zahrnují intraepiteliální karcinomy, adenokarcinom Bartholinské žlázy, fibrosarkom a melanom.

Vaginální karcinom zodpovídá přibližně za 1 % gynekologických malignit, s vrcholícím výskytem ve věku od 45 do 65 let. Přibližně 95 % vaginálních karcinům jsou spinocelulámí karcinomy. Primární karcinom vejcovodu je vzácný a typicky se šíří přímo nebo lymfatickými cévami.

-9CZ 291604 B6

Nemoci trofoblastu nebo novotvary trofoblastického původu mohou následovat po intrauterinním nebo extrauterinním těhotenství. Degenerativní těhotenství má za následek mola hydatidosa, která je v 80 % benigní.

Novotvary mohou vznikat ve zvukovodu a narušit sluch. Vznikají také ceruminomy, jsou typicky maligní navzdory histologicky benignímu obrazu a léčí se chirurgickým odstraněním. Bazocelulámí a spinocelulámí karcinomy se často vyvíjejí na zevním uchu jako důsledek pravidelné expozice slunci a jsou také typicky léčeny chirurgickým odstraněním. Střední ucho může být sídlem, spinocelulámího karcinomu. Achromafinní paragangliomy mohou vznikat ve spánkové kosti.

Nejčastější maligní nádor nosu a vedlejších dutin nosních je spinocelulámí karcinom, méně častě jsou adenoidní cystické a mykoepidermoidní karcinomy, maligní smíšené tumory, adenokarcinomy, lymfomy, fibrosarkomy, osteosarkomy, chondrosarkomy a melanomy.

Spinocelulámí karcinom nosohltanu je nej častěji pozorován u dětí u mladých dospělých.

Nej častější malignity horních cest dýchacích jsou spinocelulámí karcinomy tonzil a hrtanu. Oba jsou častější u mužů a jsou spojovány s kouřením tabáku a požíváním ethanolu, přibližně 85 % pacientů s karcinomem hlavy nebo krku má anamnézu konzumace etanolu a tabáku.

Přibližně 90 % karcinomů hlavy a krku tvoří spinocelulámí (epidermoidní) karcinom. Melanomy, lymfomy a sarkomy jsou relativně vzácné formy primárních karcinomů hlavy a krku. Karcinomy hlavy a krku se třídí podle velikosti metastáz do krčních lymfatických uzlin a průkazem vzdálených metastáz.

Karcinomy oka mohou vznikat v kůži očních víček a mohou být benigní nebo neoplastické. Běžné benigní výrůstky jsou xantelazmata, která jsou tvořena subkutánními žlutavě bílými plochými pláty lipidových látek. Bazocelulámí karcinomy jsou častější, typické léčení je chirurgické odstranění nebo radiační terapie. Další méně časté maligní tumory jsou spinocelulámí karcinomy nebo karcinomy Meibomových žláz a další typy melanom. Nejčastější primární malignita oka jsou maligní melanom cévnatky.

Tumory také vznikají v kožní tkáni, a zahrnují benigní tumory, jako jsou mateřská znaménka, lipomy apod., a také maligní tumory. Přibližně 40-50% maligních melanomů vzniká z melanocytů v mateřských znaménkách. Maligní karcinomy může jsou buď bazocelulámí nebo spinocelulámí karcinomy a často vznikají v oblastech kůže vystavené slunci. Jsou to nejčastější maligní a jejich výskyt stoupá. Méně časté malignity zahrnují maligní melanom, Pagetovu chorobu bradavky nebo extramamámí chorobu Patentovu, Kaposiho sarkom (KS) a kožní lymfom T buněk (mycosis fúngiodes). Výskyt KS se zvyšuje jako důsledek zvýšeného výskytu AIDS. KS se vyskytuje u přibližně jedné třetiny pacientů s AIDS.

Karcinomy ústní dutiny jsou zodpovědné za přibližně 5 % karcinomů u mužů a 2 % karcinomů u žen. Nejčastější forma karcinomu ústní dutiny je spinocelulámí karcinom. Výskyt stoupá s věkem a rizikovými faktory, zejména konzumací tabáku a alkoholu.

Chirurgický výkon je nejstarší účinná forma léčení novotvarů. Úspěchu je velkou měrou dosaženo, jestliže je novotvar detekován ve svých časných stadiích a nemetastazoval. Radiace je také důležitá terapie a je to výhodná léčba mnoha novotvarů, jako je Hodgkinova choroba, časné stadium nehodgkinských lymfomů a spinocelulámí karcinom hlavy a krku. Radiace je prokazatelně velmi úspěšná jako doplněk chirurgického výkonu a protinádorových léků.

V léčbě novotvarů jsou také použitelné protinádorové léky, které se třídí podle mechanismu působení. Prokázalo se, že obzvláště účinnou terapií jsou četné kombinace typicky proti-10CZ 291604 B6 nádorových léků s odlišným mechanismem účinku, umožňují nižší dávkování a mnohdy minimalizují negativní vedlejší účinky. Protinádorové léky často zasahují do základních biologických procesů nezbytných pro buněčnou replikaci na růst.

Alkylační látky, jako mechloretamin a cyklofosfamid, alkylují DNA a omezují replikaci DNA.

K antimetabolitům, které jsou cílem na rozvrácení metabolických drah nezbytných pro buněčné dělení, patří následující léky.

Antagonisté kyseliny listové se vážou na dihydrofolátreduktázu a interferují se syntézou pyrimidinu Antagonisté kyseliny listové jsou specifické pro sfázi. Velmi často používaný antagonista kyseliny listové je metotroxát.

Purinoví antagonisté blokují syntézu purinu de novo a jsou specifické pro S fázi. Příkladem purinového antagonisty je 6-merkaptopurin.

Antagonisté pyrimidinu interferují s thymidylát syntázou, tím snižují tvorbu thymidinu a jsou specifické pro S fázi. Často používaný antagonist apyrimidinu je 5-fluorouracil.

Cytarabin inhibuje DNA polymerázu a je specifický pro S fázi.

Rostlinné alkaloidy zahrnují vínka alkaloidy, jako je vinblastin a vinkristin, a podofylotoxiny, jako je etoposid. Rostlinné alkaloidy jsou účinné v metafázi a inhibují mitózu celou řadou mechanismů včetně změny mikrotubulámích proteinů.

Antibiotika zahrnují doxorubicin a daunomycin, které se vmezeřují do DNA vláken a inhibují rozvinutí DNA, bleomycin, který způsobuje zlomy DNA vláken a mitomycin, který inhibuje syntézu DNA tím, že působí jako bifunkční alkylační látka.

Mezi nitrózomočoviny patří karmustin a lomustin a alkylují DNA nebo karbamoylují aminokyseliny v proteinech.

Anorganické ionty, jako cisplatina, se vmezeřují do DNA vláken a mezi ně a inhibují rozvinutí DNA.

Látky ovlivňují biologickou odpověď, jako interferony, mají antiproliferační účinek, ale jejich specifická úloha není známa. Interferony zahrnují interferon a (leukocytový), interferon β (fibroblastový) a interferon γ (lymfocytový).

Enzymy, jako asparagináza, jsou také používané pro změny metabolických drah důležitých pro rakovinné buňka. Asparagináza vyčerpá asparagin, na kterém závisí leukemické buňky.

Hormony a jejich analogy, jako tamoxifen, flutamid a progesteron, mají nespecifické účinky, ale jsou použitelné pro léčbu určitých novotvarů, o kterých je známo, že jsou hormon-responzivní, zejména novotvary prsu, vaječníků a prostaty. Tamoxifen, často používaný v léčbě novotvarů prsu, nachází buňky v klidu a váže se na estrogenový receptor. Flutamid, často používaný v léčbě novotvarů prostaty, se váže na androgenový receptor.

Cytokininy jsou přirozeně se vyskytující a syntetické regulátory růstu rostlin. Přirozené cytokininy mají tendenci k nespecifické inhibici různých proteinkináz. Molekulární mechanismy, kterými cytokininy regulují buněčný růst a dělení, ještě nebyly stanoveny. Studie naznačují, že cytokininy mohou zvyšovat dostupnost DNA templátu, aktivovat RNA polymerázu, ovlivňovat polyadenylaci a sekundární strukturu mRNA a stimulovat tvorbu a aktivitu polyribozomů. Předpokládá se, že cytokininy ovlivňují buněčné dělení prostřednictvím interakce s regulačními proteiny buněčného cyklu. Jak cytokininy, tak cyklin-dependentní kinázy (cdk) působí jako

-11 CZ 291604 B6 mnohočetné a podobné kontrolní body buněčného cyklu, například v přechodech Gj/S a Gi/M a S a M fázích.

Olomoucin, 6-(benzylamin)-2-[(2-hydroxyethyl)amin]-9-methylpurin, byl nejdříve vynalezen jako herbicid. Nedávno bylo objeveno, že olomoucin je syntetický cytokinin, který v mikromolámích koncentracích specificky inhibuje některé cdk, včetně p34^cdc2/cyklin B kinázy, ale nemá žádný účinek na další důležitější proteinkinázy, jako cAMP- a cGMP-dependentní kinázy a proteinkinázu C. V současnosti bylo ukázáno, že olomoucin má dobrou selektivitu pro cdk-cyklin proteinkinázy, ale má pouze mírnou inhibiční aktivitu, s IC₅₀ přibližně Ί μΜ. (Veselý, J., a kol., Eur. J. Biochem., 224, 771-786, 1994). Krystalová struktura olomoucinu o velikosti 2,4 .10’¹⁰m po společné kiystalizaci s cdk2 vedla ke zjištění, že purinová část olomocinu se váže k konzervativní ATP vazebné kapse, zatímco benzylaminové skupiny se šíří do oblasti aktivního místa unikátního pro cdk2 kinázy.

Roskovitin, 2-(l-ethyl-2-hydroxyethylamin)-6-benzyl-amin-9-izopropylpurin, je nedávno syntetizovaný purin, u kterého bylo dokázáno, že má selektivitu pro některé cyklin-dependentní kinázy a co se týče cdk2 a cdc2 je desetkrát aktivnější než olomoucin (Meijer, L., a kol., Eur. J. Biochem., 243, 527 - 536, 1997, a PCT/FR96/01905). Meijer a kol. publikovali, že většina kináz není významně inhibována rokovitinem. Ale cdc2-cyklin B, cdk2-cyklin A, cdk2-cyklin E a cdk5-p35 jsou podstatně inhibovány IC50 o hodnotách 0,65, 0,7, 0,7 a 0,2 μΜ, v daném pořadí. Na rozdíl od toho, roskovitin projevoval hodnoty IC50 větší než 100 μΜ pro cdk4—cyklin Dl a cdk6-cyklin D2.

Havlíček a kol. (J. Med. Chem., 40, 408-412, 1997) publikovali, že roskovitin a příbuzné analogy substituované v pozicích 2, 6 a/nebo 9 inhibují p34^cdc2-cyklin B kinázy. Žádný z analogů nemá vyšší hodnoty IC50 než (R) enantiomer roskovitinu, který má hodnotu IC₅₀ než (R) enantiomer roskovitinu, který má hodnotu IC₅₀ 0,2 μΜ. (S) enantiomer má hodnotu IC50 0,8 μΜ, racemická směs (R/S) má hodnotu IC₅₀ 0,65 μΜ. Tito autoři uzavřeli, že N⁶-benzylový substituent roskovitinu je lepší než izopentenylový nebo cyklohexylmethylový substituent.

National Cancer Institure (NCI) je organizace řízená vládou Spojených Států zaměřená na objevování a vývoj nových terapeutických produktů pro onkologii. V roce 1985 NCI ustanovila novou strategii pro screening rakoviny týkající se lidských nádorových buněčných linií pro in vitro testy jako primární screening rakoviny. Celkový počet šedesáti lidských nádorových buněčných linií, pocházejících ze sedmi typů karcinomu (karcinomu plic, tračníku, melanomu, karcinomu ledvin, vaječníků, mozku a leukemie), bylo vybráno pro zahrnutí do panelu NCI (Grever, M.R., a ko., Seminars in Oncology, 19, 622-638, 1992). Také protokoly použití v těchto testech byly v literatuře publikovány. Americká sbírka mikroorganismů a tkáňových kultur (Američan Typu Tissue Collection, ATCC) působí jako depozitář pro tyto a další nádorové buněčné linie. Použitelné lidské nádorové buněčné linie zahrnují následující:

MCF7: lidský adenokarcinom prsu, hormn-dependentní, MDA-MB-231: lidský adenokarcinom prsu, hormon-independentní,

HT-29: lidský adenokarcinom tračníku, průměrně dobře diferenciovaný stupeň Π, HCT-15: lidský adenokarcinom tračníku,

A549: lidský nemalobuněčný karcinom plic,

MDS-114: lidský malobuněčný karcinom plic,

PC-3: lidský adenokarcinom prostaty, hormon-independentní, a DU 145: lidský karcinom prostaty, hormon-independentní.

Skehan, P. a kol. (J. Nati. Cancer Inst., 82, 1107-1112, 1990) zavedl vhodné protokoly pro použití těchto nádorových buněčných linií pro screening protinádorových léků.

-12CZ 291604 B6

Meijer a kol., (viz výše) publikovali, že roskovitin inhibuje proliferaci při in vitro screeningu orientovaného na NCI nemoci, to znamená 60 lidských nádorových buněčných linií obsahujících devět nádorových typů (leukemie, nemalobuněčný karcinom plic, karcinom tračníku, karcinom centrálního nervového systému, melanom, karcinom vaječníků, karcinom ledvin, karcinom prostaty, karcinom prsu) s průměrnou hodnotou IC₅₀ 16 μΜ. Výsledky jednotlivých nádorových linií nebyly publikovány.

Dva odlišné inhibitory cdk, flavopiridol a olomoucin, potlačují smrt nervových buněk PC 12 a sympatických neuronů ve dvou modelových systémech přežívání neuronů (Park a kol., J. Biol. Chem., 271, 14, 8161-8169, 1996). Koncentrace každého inhibitoru požadovaná pro podporu přežívání korelovala s množstvím nezbytných pro inhibici proliferace. Apoptóza neuronů je důležitý aspekt jak pro vývoj nervového systému, tak jako složka neuronového poranění a onemocnění.

Buněčná linie PC-12 původně pochází z medulámího feochromocytomu nadledvin laboratorního potkana. Když jsou pěstovány v médiu obsahujícím sérum, buňky PC-12 se dělí a připomínají prekurzory adrenálních chromaffinních buněk a sympatických neuronů. Po přidání nervového růstového faktoru (NGF) získávají buňky PC-12 fenotypové vlastnosti sympatických neuronů. Po odstranění buď séra nebo séra a NGF, obojí buňky PC-12, jak nestimulované, tak neuronově diferencované, prodělají apoptózu, což je analogické s odpovědí sympatických neuronů.

Úloha regulace buněčného cyklu v apoptóze může být znázorněna odstraněním NGF nebo séra, což má za následek nekoordinovanou progresi buněčného cyklu a smrt buněk u nestimulovaných buněk PC-12. Inhibitoiy cdk nezabrání smrti těchto proliferačně kompetentních nestimulovaných buněk PC-12 po odstranění trofického faktoru. Existuje hypotéza, že post-mitoticky diferencované nebo sympatické neurony usilují o nenáležitý opětný vstup do buněčného cyklu po odnětí NGF, což má za následek buněčnou smrt. Ale expozice flavopiridolu nebo olomoucinu, které inhibují cdk, zabraňuje apoptózu v těchto buňkách.

Změny v aktivitě cdk a cyklinů jsou pozorovány během apoptózy mnoha odlišných buněčných typů. Apoptóza buněk HL60 indukovaná kamptotecinem nebo araC je spojena se zvýšenou aktivitou cdc2 a kinázovou aktivitou sdruženou s cyklinem E. Apoptóza indukovaná kamptotecinem buněk RKO je spojena se zvýšením exprese cyklinu Dl.

Kamptotecin vyvolává apoptózu cerebrálních kortikálních neuronů u laboratorního potkana (Morris a Geller, J. Cell Biol., 134, 757-770, 1996). Kamptotecinem ošetřené neproliferující neuronově diferencované buňky PC-12 odumřely během 6 dnů po ošetření a kultivované sympatické neurony laboratorního potkana odumřely během 5 dnů po ošetření, dokonce i v přítomnosti NGF (Park a kol., J. Neurosci., 17(4), 1256-1270, 1997). Ale podávání buď obou dohromady, nebo jednotlivého olomoucinu či flavopiridolu, v přítomnosti nebo nepřítomnosti kamptotecinu, mělo za následek přibližně 30 % buněčnou úmrtnost v 6. den. Maximální ochrana buněk PC-12 nebo sympatických neuronů laboratorního potkana před smrtí byla pozorována u 1 μΜ flavopiridolu a 200 μΜ olomoucinu, což jsou minimální koncentrace, které zcela inhibují syntézu DNA proliferujících buněk PC-12. Podávání izo-olomoucinu, inaktivního analogu olomocinu, buněčné smrti nervových buněk ošetřených kamtotecinem nezabránilo.

Bylo také dokázáno, že flavopiridol a olomoucin ochraňují kortikální neurony před odumřením indukovaném kamprotecinem (Park a kol., J. Neurosci., 17(4), 1256-1270, 1997). Hodnoty IC50 pro flavopiridol a olomoucin byly 0,1 μΜ a 100 μΜ, v příslušném pořadí. Podávání izo-olomoucinu buněčné smrti nervových buněk ošetřených kamprotecinem nezabránilo.

Z výše uvedených pozorování vyplývá několik důsledků. Připouští se, že pacienti léčení radiací nebo protinádorovými přípravky prodělávají nežádoucí vedlejší účinky, včetně rozvoje nových novotvarů nebo nežádoucí buněčné apoptózy. Například u některých pacientů léčených vysokými dávkami araC pro refřaktemí leukémii se rozvíjí cerebelámí toxický syndrom, charakterizovaný

- 13CZ 291604 B6 ztrátou Purkyněho neuronů (Winkelman a Hinges, Ann. Neurol., 14, 520-527, 1983, a Vogel aHorouipian, Cancer, 71, 1303-1308, 1993). Bylo publikováno že u pacientů léčených cisplatinou se rozvíjely periferní neuropatir (Wallach, a kol., J. Fla. Med. Assoc., 79, 821-822, 1992, a Mansfíeld a Castillo, AJNR Am. J. Neuroradiol., 15, 1178-1180, 1994). Se zřetelem na tato pozorování společně nebo samotné podávání sloučenin podle předkládaného vynálezu pro léčbu novotvarů bude snižovat nebo znemožňovat buněčnou apoptózu, obzvláště neuronové poškození způsobené léčbou protinádorovými přípravky nebo radiací.

Cerebrovaskulámí onemocnění je nejčastější příčina neurologické invalidity v západních zemích. Hlavní specifické typy cerebrovaskulámího onemocnění jsou cerebrální insuficience způsobená přechodnými poruchami průtoku krve, infarktem, krvácením a arteriovenózními průtoky krve, infarktem, krvácením a arteriovenózními malformacemi. Vaskulámí příhoda mozková (mrtvice) umožňuje ischemické léze. U cefebrovaskulámího onemocnění se objevuje nežádoucí neuronová apoptóza. Léčení inhibitory cdks může být cesta ktomu, jak v těchto případech zabránit neuronovému poškození a degeneraci.

V publikované mezinárodní patentové přihlášce WO 97/20 842 se uvádí 2,6- a 9-substituované purinové deriváty a zejména 2-(l-R-hydroxymethylpropylamino)-6-benzylamino-9-izopropylaminopurin (roscovitin) jako inhibitory cyklin-dependentních kináz. Například roscovitin je neselektivní inhibitor cdk-1, cdk-2 a cdk-5. Tyto deriváty projevují antiproliferační vlastnosti využitelné například pro léčení nádorů a pro přípravu herbicidních prostředků.

V publikované mezinárodní patentové přihlášce WO 97/16 452 se popisují 2-amino-6-anilinpurinové deriváty, které jsou uváděny jako p^34edc2/cyklin B^cdcl3kinázové (cdk-1) inhibitory, přičemž tyto látky jsou vhodné pro léčení hyperproliferačních nemocí, například nádorů, ovšem žádná konkrétní výsledky týkající se těchto vlastností nejsou uvedeny.

Postup přípravy 2,3-dihydroxycyklopentanových purinů je uveden v publikované mezinárodní patentové přihlášce WO 96/02 543. Tyto deriváty jsou zde popisovány jako protizánětová léčiva. Zejména je nárokováno, že tyto deriváty jsou vhodné pro léčení pacientů trpících zánětovými stavy, kteří jsou citliví na leukocyty vyvolané poškození tkáně. Účinek těchto sloučenin na cyklin-dependentní kinázy není v tomto dokumentu uváděn.

V publikované mezinárodní patentové přihlášce WO 94/17 090 se uvádí 2,6-diaminoporin-p-Dribo-furanoronamidové deriváty, které se používají jak protizánětová činidla rovněž pro léčení pacientů trpících zánětovými stavy, kteří jsou citliví na leukocyty vyvolané poškození tkáně. Účinek těchto sloučenin na cyklin-dependentní kinázy není v tomto dokumentu rovněž nijak zmiňován.

Podstata vynálezu

Podstatu předmětného vynálezu představují 6,9-disubstituované 2-[trans-(4-aminocyklohexyl)aminojpuriny obecného vzorce I:

ve kterém:

-14CZ 291604 B6

R je vybrán ze skupiny zahrnují C2, R2NH- a H₂N-R3-, ve kterých:

R2 je vybrán ze skupiny zahrnující alkylovou skupinu obsahující 1 až 8 atomů uhlíku a skupinu obecného vzorce Π:

R4 (C)n Z (ii),

R4 ve kterém:

Z je vybrán ze souboru zahrnujícího fenylovou skupinu, heterocyklickou skupinu a cykloalkylovou skupinu, přičemž heterocyklická skupina je vybrána ze souboru zahrnujícího piperidinylovou skupinu, pyridinylovou skupinu, izoxazolylovou skupinu, tetrahydrofuranylovou skupinu, pyrrolidinylovou skupinu, morfolinylovou skupinu, piperazinylovou skupinu, benzimidazolylovou skupinu, thiazolylovou skupinu, thiofenylovou skupinu, furanylovou skupinu, indolylovou skupinu, 1,3-benzodioxolylovou skupinu, tetrahydropyranylovou skupinu, imidazolylovou skupinu, tetrahydrothienylovou skupinu, pyranylovou skupinu, dioxanylovou skupinu, pyrrolylovou skupinu, pyrimidinylovou skupinu, pyrazinylovou skupinu, triazinylovou skupinu, oxazolylovou skupinu, purinylovou skupinu, chinolinylovou skupinu nebo izochinolinylovou skupinu, a cykloalkylovou skupinu se míní alicyklický zbytek obsahující 3 až 8 atomů uhlíku, a

R4 každý jednotlivé znamená navzájem na sobě nezávisle atom vodíku nebo alkylovou skupinu obsahující 1 až 4 atomy uhlíku, a n je celé číslo 1 a 8, přičemž každá z uvedených alkylových skupin obsahujících 1 až 8 atomů uhlíku a Z je případně substituována jedním až třemi substituenty, které mohou být stejné nebo rozdílné a které jsou vybrány ze souboru zahrnujícího atom halogenu, OH a alkylovou skupinu obsahující 1 až 4 atomy uhlíku,

R3 představuje alkylenovou skupinu obsahující 1 až 8 atomů uhlíku, a

R1 je vybrán ze souboru zahrnujícího cyklopentylovou skupinu a izopropylovou skupinu, a farmaceuticky přijatelné soli, optické izomery a hydráty odvozené od těchto sloučenin.

Do rozsahu předmětného vynálezu rovněž náleží použití výše uvedených sloučenin obecného vzorce I pro přípravu léčiva k léčení hyperproliferativní poruchy. Touto hyperproliferativní poruchou může být stav neoplastického onemocnění je vybrán ze souboru zahrnujícího leukémii, karcinom, adenokarcinom, sarkom, melanom nebo smíšený typ novotvaru. Leukemie je vybrána ze souboru zahrnujícího akutní lymfolastickou leukémii, chronickou leukémii, akutní myeloblastovou leukémii a chronickou myelocytovou leukémii. Karcinom je vybrán ze souboru zahrnujícího karcinom čípku, prsou, prostaty, jícnu, žaludku, tenkého střeva, tlustého střeva, vaječníků a plic. Adenokarcinom je vybrán ze souboru zahrnujícího aenokarcinom čípku, prsu, prostaty, jícnu, žaludku, tenkého střeva, tlustého střeva, vaječníků a plic. Sarkom je vybrán ze souboru zahrnujícího esterom, orteosarkom, lipom, liposarkom, hemangiom a hemangiosarkom. Melanom je vybrán ze souboru zahrnujícího amelanotický melanom a melanotický melanom.

-15CZ 291604 B6

Smíšený typ novotvaru je vybrán ze souboru zahrnujícího karcinosarkom, lymfoidní tkáňový typu, folikulámí retikulum, buněčný sarkom a Hodgkinsova nemoc. Výše uvedenou hyperproliferativní poruchou může být stav neoplastického onemocnění.

Do rozsahu předmětného vynálezu rovněž náleží použití sloučenin výše uvedeného obecného vzorce I pro přípravu léčiva k prevenci apoptózy n neuronálních buňkách, konkrétně apoptózy vyvolané antioneoplastickými činidly, cerebrovaskulámím onemocněním, mrtvicí nebo infarktem.

Do rozsahu předmětného vynálezu rovněž náleží použití sloučeniny výše uvedeného obecného vzorce I k přípravě léčiva k ochraně neuronových buněk před apoptózou.

Do rozsahu předmětného vynálezu rovněž náleží použití sloučenin výše obecného vzorce I k přípravě léčiva k ochraně neuronových buněk před poškozením vyvolaným antineoplastickými činidly.

Do rozsahu předmětného vynálezu rovněž náleží farmaceutický prostředek pro ochranu neuronových buněk před apoptózou a poškozením vyvolaným antineoplastickými činidly, jehož podstata spočívá vtom, že obsahuje vzorkové množství 6,9-disubstituovaného 2-[trans-(4aminocyklohexyl)amino]purinu výše uvedeného obecného vzorce I ve směsi nebo v jiném spojení s inertním nosičovým materiálem.

Do rozsahu předmětného vynálezu rovněž náleží farmaceutický prostředek pro ochranu neuronových buněk před apoptózou a poškozením vyvolaným antineoplastickými činidly, jehož podstata spočívá v tom, že obsahuje účinné cdk-2 inhibiční množství 6,9-disubstituovaného 2-[trans-(4-aminocyklohexyl)aninopurinu výše uvedeného obecného vzorce I ve směsi nebo v jiném spojení s inertním nosičovým materiálem.

Do rozsahu výše uvedených sloučenin výše uvedeného obecného vzorce I patří rovněž i nové sloučeniny obecného vzorce Ia:

NHR

N

I R1 ve kterém:

R znamená R2, přičemž:

R2 představuje alkylovou skupinu obsahující 1 až 8 atomů uhlíku případně substituovanou jedním až třemi substituenty, které mohou být stejné nebo rozdílné a Ideré jsou vybrány ze souboru zahrnujícího atom halogenu, OH a alkylovou skupinu obsahující 1 až 4 atomy uhlíku,

R1 je vybrán ze souboru zahrnujícího cyklopentylovou skupinu a izopropylovou skupinu, a farmaceuticky přijatelné soli, optické izomery a hydráty odvozené do těchto sloučenin.

Konkrétně jsou těmito výhodnými sloučeninami:

dihydrochlorid 2-[trans-(4-aminocyklohexyl)amino]-6-(butylamino)-9-cyklopentylpurinu, dihydrochlorid 2-[trans-(4-aminocyklohexyl)amino]-6-(oktylammo)-9-cyklopentylpurinu, dihydrochlorid 2-[trans-(4—aminocyklohexyl)amino]-6-[(3-(3-methyl-4-hydroxy)butyl)amino]-9-cyklopentylpurinu, dihydrochlorid 2-[trans-(4-aminocyklohexyl)aniino-6-[(5-hydroxy-l, 5-dimethylhexyl)amino9-cykIopentylpurinu, dihydrochlorid 2-[trans-(4-aminocyklohexyl)ammo]-6-[5-(hydroxy)pentylammo]-9-cyklopentylpurinu, dihydrochlorid 2-[trans-(4-aminocyklohexyl)amino]-6-[(3-hydroxypropyl)amino]-9-cyklopentylpurinu, dihydrochlorid 2-[trans-(4-aminocyklohexyl)amino]-6-(pentyhnino)-9-cyklopentylpurinu, dihydrochlorid 2-(trans-(4-aminocyklohexyl)ammo]-6-(methylamino)-9-cyklopentylpurinu, dihydrochlorid 2-[trans-(4-aminocyklohexyl)amino]-6-(ethylamino)-9-cyklopentylpurinu, dihydrochlorid 2-[trans-(4-aminocyklohexyl)amnio]-6-[(3-methylbutyl)amino]-9-cyklopentylpurinu, dihydrochlorid 2-[trans-(4-aminocyklohexyl)amino]-6-[(butyl)amino]-9-(2-propyl)purinu, dihydrochlorid 2-[trans-(4-aminocyklohexyl)amino]-6-(hexylamino)-9-cykIopentylpurinu, dihydrochlorid 2-[trans-(4-aminocyklohexyl)amino]-6-(propylamino)-9-cyklopentylpurinu, a dihydrochlorid 2-[trans-(4-aminocyklohexyl)amino]-6-[2,2,2-trifluorethylamino]-9-cyklopentylpurinu.

Do rozsahu výše uvedených sloučenin výše uvedeného obecného vzorce I patří rovněž i nové sloučeniny obecného vzorce Ib:

ve kterém:

R znamená R2, přičemž:

R2 představuje skupinu obecného vzorce Π:

R4

I —(C)n—Z

I

R4 ve kterém:

Z znamená fenylovou skupinu případně substituovanou jedním až třemi substituenty, které mohou být stejné nebo rozdílné a které jsou vybrány ze souboru zahrnujícího atom halogenu, OH a alkylovou skupinu obsahující 1 až 4 atomy uhlíku,

-17CZ 291604 B6

R4 každý jednotlivě navzájem na sobě nezávisle představuje atom vodíku nebo alkylovou skupinu obsahující 1 až 4 atomy uhlíku, a n je celé číslo 1 až 8,

Konkrétně jsou těmito výhodnými sloučeninami:

dihydrochlorid (S)-2-[trans-(4-aminocyklohexyl)amino]-6-[(a-methylbenzyl)amino]-9-cyklopentylpurinu, dihydrochlorid 2-[trans-(4-aminocyklohexyl)amino]-6-(3-jodbenzylamino)-9-cyklopentylpurinu, dihydrochlorid 2-[trans-(4-aminocyklohexyl)ammo]-6-[(3,4-dichlorbenzyl)amino]-9-cyklopentylpurinu, dihydrochlorid 2-[trans-(4-aminocyklohexyl)amino]-6-[(3-methylbenzyI)amino]-9-cyklopentylpurinu, dihydrochlorid 2-[trans-(4-aminocyklohexyl)amino]-6-[(3-chlor)benzylamino]-9-(2-propyl)purinu, dihydrochlorid (R)-2-[trans-(4-aminocyklohexyl)amino]-6-[(a-methylbenzyl)amino]-9cyklopentylpurinu, dihydrochlorid 2-[trans-(4-aminocyklohexyl)amino]-6-[(2-chlorbenzyl)amino]-9-cyklopentylpurinu, dihydrochlorid 2-[trans-(4-aminocyklohexyl)amino]-6-(4-fenylbutylamino)-9-cyklopentylpurinu, dihydrochlorid 2-[trans-(4-aminocyklohexyl)amino)-6-[3-(fenyl)propylamino]-9-cyklopentylpurinu, dihydrochlorid 2-[trans-(4-aminocyklohexyl)amino]-6-[(4-chlorbenzyl)amino]-9-cyklopenylpurinu, dihydrochlorid 2-[trans-(4-aminocyklohexyl)amino]-6-[(3-chlorbenzyl)amino]-9-cyklopentylpurinu, dihydrochlorid 2-[trans-(4-aminocyklohexyl)amino]-6-[(4-chlor-2-fluorbenzyl)amino]-9cyklopentylpurinu, dihydrochlorid 2-[trans-(4-aminocyklohexyl)amino]-6-[(2-fluorbenzyl)amino]-9-cyklopentylpurinu, dihydrochlorid 2-[trans-(4-aminocyklohexyl)amino]-6-[2-(fenyl)ethylamino]-9-cyklopentylpurinu, dihydrochlorid 2-[trans-(4-aminocyklohexyl)amino]-6-[(4-hydroxyfenyl)ethylamino]-9cyklopentylpurinu, sloučenina podle nároku 3, kterou je:

trihydrochlorid2-[trans-(4-aminocyklohexyl)amino]-6-(benzylamino)-9-(2-propyl)purinu, dihydrochlorid 2-[trans-(4-aminocyklohexyl)amino]-6-[benzylamino]-9-cyklopentylpurinu, dihydrochlorid 2-[trans-(4-ammocyklohexyl)amino]-6-[(2,4~dichlorbenzyl)amino]-9-cyklopentylpurinu, dihydrochlorid 2-[trans-(4-aminocyklohexyl)amino]-6-[(4-fluorbenzyl)amino]-9-cyklopentylpurinu, a dihydrochlorid 2-[trans-(4-aminocyklohexyl)amino]-6-[(3-jodbenzyl)amino]-9-(2-propyl)purinu.

-18CZ 291604 B6

Do rozsahu výše uvedených sloučenin výše uvedeného obecného vzorce I patří rovněž i nové sloučeniny obecného vzorce Ic:

NHR

ve kterém:

R znamená R2, přičemž:

R2 představuje skupinu obecného vzorce Π:

R4

I —(C)n—Z

I

R4 (II), ve kterém:

Z znamená heterocyklickou skupinu případně substituovanou jedním až třemi substituenty, které mohou být stejné nebo rozdílné a které jsou vybrány ze souboru zahrnujícího atom halogenu, OH a alkylovou skupinu obsahující 1 až 4 atomy uhlíku,

R4 každý znamená navzájem na sobě nezávisle atom vodíku nebo alkylovou skupinu obsahující 1 až 4 atomy uhlíku, a n je celé číslo 1 až 8,

Konkrétně jsou těmito výhodnými sloučeninami:

dihydrochlorid 2-[trans-(4-aminocyklohexyl)amino]-6-[(3-indolyl)-2-ethylamino]-9-cyklopentylpurinu, dihydrochlorid 2-[trans-(4-aminocyklohexyl)amino]-6-[2-(3,4-methylendioxyfenyl)ethylamino]-9-cyklopentylpurinu, dihydrochlorid 2-[trans-(4-aminocyklohexyl)amino]-6-[(3-pyridyl)-2-ethylamino]-9-cyklopentylpurinu, dihydrochlorid 2-[trans-(4—aminocyklohexyl)amino]-6-[(4-pyridyl)methylamino]-9-cyklopentylpurinu, trihydrochlorid 2-[trans-(4-aminocyklohexyl)amino]-6-[3-(4-morfolinyl)propylamino]-9cyklopentylpurinu,

-19CZ 291604 B6 dihydrochlorid 2-[trans-(4-aminocyklohexyl)amino]-6-[2-(2-pyridyl)ethylamino]-9-cyklopentylpurinu, trihydrochlorid 2-[trans-(4-aminocyklohexyl)amino]--6-[2-(4-morfolinyl)ethylamino]-9cyklopentylpurinu, dihydrochlorid 2-[trans-(4-aminocyklohexyl)amino]-6-(2-thiofenmethylamino)-9-cyklopentylpurinu, dihydrochlorid 2-[trans-(4-aminocyklohexyl)amino]-6-[(2-benzimidazolyl)methylamino]-9cyklopentylpurinu, dihydrochlorid 2-[trans--(4-aminocyklohexyl)amino]-6-[(2--tetrahydropyranyl)methylamino]-10 9-cyklopentylpurinu, dihydrochlorid 2-[trans-(4-aminocyklohexyl)amino]-6-[(4—pyridyl)-2-ethylamino]-9-cyklopentylpurinu, dihydrochlorid 2-[trans-(4-aminocyklohexyl)amino]-6-(2-furanmethylamino)-9-cyklopentylpurinu, trihydrochlorid 2-[trans-(4-aminocyklohexyl)amino]-6-[(3-(2-imidazoyl)propyl)amino]-9-(2propyljpurinu, dihydrochlorid 2-[trans-(4-aminocyklohexyl)amino]-6-[3--(l-imidazolyl)propylamino]-9cyklopentylpurinu, a dihydrochlorid 2-[trans-(4—aminocyklohexyl)amino]-6-[3-(2-imidazolyl)propylaniino]-920 cyklopentylpurinu.

Do rozsahu výše uvedených sloučenin výše uvedeného obecného vzorce I patří rovněž i nové sloučeniny obecného vzorce Id:

NHR

ve kterém:

R znamená R2, přičemž:

R2 představuje skupinu obecného vzorce Π:

^4 —(C)n—Z I R4 (II), ve kterém:

Z znamená cykloalkylovou skupinu případně substituovanou jedním až třemi substituenty, které mohou být stejné nebo rozdílné a které jsou vybrány ze souboru zahrnujícího atom halogenu, OH a alkylovou skupinu obsahující 1 až 4 atomy uhlíku,

-20CZ 291604 B6

R.4 každý jednotlivě navzájem na sobě nezávisle znamená atom vodíku nebo alkylovou skupinu obsahující 1 až 4 atomy uhlíku, a n je celé číslo 1 až 8,

R1 je vybrán ze souboru zahrnujícího cyklopentylovou skupinu a izopropylovou skupinu, a farmaceuticky přijatelné soli, optické izomery a hydráty odvozené od těchto sloučenin. Konkrétně jsou těmito výhodný sloučeninami:

dihydrochlorid 2-[trans-(4-aminocyklohexyl)amino]-6-[(cyklohexyl)methylamino]-9-cyklopentylpurinu, dihydrochlorid 2-[trans-(4-aminocyklohexyl)amino]-6-[(cyklopropyl)methylamino]-9-(2propyl)purinu, a dihydrochlorid 2-[trans-(4—aminocyklohexyl)amino]-6-[(cyklopropyl)methylamino]-9-cyklopentylpurinu.

Do rozsahu výše uvedených sloučenin výše uvedeného obecného vzorce I patří rovněž i nové sloučeniny obecného vzorce Ia':

NHR

(Ia), ve kterém:

R znamená R2NH-, přičemž:

R2 představuje alkylovou skupinu obsahující 1 až 8 atomů uhlíku případně substituovanou jedním až třemi substituenty, které mohou být stejné nebo rozdílné a které jsou vybrány ze souboru zahrnujícího atom halogenu, OH a alkylovou skupinu obsahující 1 až 4 atomy uhlíku,

R1 je vybrán ze souboru zahrnujícího cyklopentylovou skupinu a izopropylovou skupinu, a farmaceuticky přijatelné soli, oproti izomery a hydráty odvozené od těchto sloučenin.

Konkrétně jsou těmito výhodnými sloučeninami:

dihydrochlorid 2-[trans-(4-aminocyklohexyl)amino]-6-[2,2,2-trifluorethylhydrazino]-9-cyklopentylpurinu, a dihydrochlorid 2-[trans-(4-aminocyklohexyl)amino)-6-(2-hydroxyethydrazino)-9-cyklopentylpurinu.

Do rozsahu výše uvedených sloučenin výše uvedeného obecného vzorce I patří rovněž i nové sloučeniny obecného vzorce Ib':

NHR

(ib), ve kterém:

R znamená R2NH přičemž:

R2 představuje skupinu obecného vzorce Π:

R4

I —(C)n—Z t R4 (II).

ve kterém:

R1 je vybrán ze souboru zahrnujícího cyklopentylovou skupinu a izopropylovou skupinu, a farmaceuticky přijatelné soli, optické izomeiy a hydráty odvozené od těchto sloučenin.

Konkrétně je výhodnou sloučeninou tohoto typu: dihydrochlorid 2-[trans-(4-aminocyklohexyl)amino]-6-[2-fenethylhydrazino]-9-cyklopentylpurinu.

Do rozsahu výše uvedených sloučenin výše uvedeného obecného vzorce I patří rovněž i nové sloučeniny obecného vzorce Ic':

ve kterém:

-22CZ 291604 B6

R znamená R2NH-, přičemž:

R2 představuje skupinu obecného vzorce Π:

R4

I —(C)n—Z

I

R4 (II) >

ve kterém:

Z znamená heterocyklickou skupinu případně substituovanou jedním až třemi substituenty, které mohou být stejné nebo rozdílné a které jsou vybrány ze souboru zahrnujícího Hal, OH a alkylovou skupinu obsahující 1 až 4 atomy uhlíku,

Do rozsahu výše uvedených sloučenin výše uvedeného obecného vzorce I patří rovněž i nové sloučeniny obecného vzorce Id':

ve kterém:

R znamená R2NH-, přičemž:

R2 představuje skupinu obecného vzorce Π:

-23 CZ 291604 B6 (II) >

R4

I —(C)n—Z

I

R4 ve kterém:

Z znamená cykloalkylovou skupinu případně substituovanou jedním až třemi substituenty, které mohou být stejné nebo rozdílné a které jsou vybrány ze souboru zahrnujícího Hal, OH a alkylovou skupinu obsahující 1 až 4 atomy uhlíku,

R4 každý jednotlivě navzájem na sobě nezávisle znamená atom vodíku nebo alkylovou skupinu obsahující 1 až 4 atomy uhlíku, a n je celé číslo 1 až 8,

Do rozsahu výše uvedených sloučenin výše uvedeného obecného vzorce I patří rovněž i nové sloučeniny obecného vzorce Ie:

(Ie), ve kterém:

R znamená H₂N-R3-, přičemž:

R3 představuje alkylenovou skupinu, a

Ze skupiny těchto látek jsou výhodnými sloučeninami konkrétně:

dihydrochlorid 2-[trans-(4-aminocyklohexyl)amino]-6-[(4-aminobutyl)amino]-9-cyklopentylpurinu, a dihydrochlorid 2-[trans-(4-aminocyklohexyl)amino]-6-[(8-aminooktyl)amino]-9-cyklopentylpurinu.

-24CZ 291604 B6

Jak již bylo uvedeno, používají se sloučeniny podle předmětného vynálezu k inhibování progrese buněčného cyklu, konkrétně k inhibování cdk-2.

Kromě toho se sloučeniny podle předmětného vynálezu používá k prevenci apoptózy v nervových buňkách, zvláště k prevenci apoptózy nervových buněk vyvolané antineoplatickými činidly nebo která je výsledkem cerebrovaskulámího onemocnění. Kromě toho se tyto sloučeniny používají k prevenci apopotózy vyvolané kyslíkovou deplecí, výhodně k prevenci apoptózy vyvolané cerebrovaskulámím onemocněním, nebo k prevenci apoptózy vyvolané mrtvicí nebo infarktem.

Sloučenin podle předmětného vynálezu je rovněž možno použít k inhibování vývoje novotvarů. Těchto sloučenin je možno rovněž využít k léčení pacienta postiženého neoplastickým onemocněním, při kterém se podává sloučenina podle vynálezu. Ve výhodném provedení je podávané množství této sloučeniny terapeuticky účinným množstvím této sloučeniny. Ve výhodném provedení je podávána jediná sloučenina podle vynálezu. V alternativním provedení se podává dávka sloučeniny podle předmětného vynálezu ve spojení s jiným antineoplastickým činidlem.

Kromě toho se předmětný vynález týká, jak již bylo uvedeno, prostředku obsahujícího stanovitelný podíl sloučeniny výše definovaného obecného vzorce I ve směsi nebo v jiné kombinaci s inertním nosičovým materiálem. Předmětný vynález se rovněž týká farmaceutického prostředku obsahujícího účinné inhibiční množství libovolné sloučeniny obecného vzorce I nebo její alternativní formy ve směsi nebo v jiné kombinaci s jedním nebo více farmaceuticky přijatelnými nosičovými materiály nebo excipienty.

V popisu předmětného vynálezu je používán termín „heterocyklická skupina“ nebo heterocyklus, přičemž tímto termínem se míní libovolný zbytek s uzavřeným kruhem, ve kterém jeden nebo více atomů v kruhu představuje prvek jiný než atom uhlíku, přičemž mezi tyto zbytky je možno bez jakéhokoliv omezování zařadit piperidinylovou skupinu, pyridinylovou skupinu, izoxazolylovou skupinu, tetrahydrofuranylovou skupinu, pyrrolidinylovou skupinu, morfolinylovou skupinu, piperazinylovou skupinu, benzimidazolovou skupinu, thiazolylovou skupinu, thiofenylovou skupinu, furanylovou skupinu, indolylovou skupinu, 1,3-benzodioxolylovou skupinu, tetrahydropyranylovou skupinu, imidazolylovou skupinu, tetrahydrothiofenylovou skupinu, pyranylovou skupinu, dioxanylovou skupinu, pyrrolylovou skupinu, pyrimidinylovou skupinu, pyrazinylovou skupinu, triazinylovou skupinu, oxazolylovou skupinu, purinylovou skupinu, chinolinylovou skupinu a izochinolinylovou skupinu.

Termínem „alkylová skupina obsahující 1 až 4 atomy uhlíku“ se v textu předmětného vynálezu míní nasycená nebo nenasycená uhlovodíková (hydrokarbylová) skupina s přímým nebo rozvětveným řetězcem, obsahující jeden až čtyři atomy uhlíku, přičemž mezi tyto skupiny je možno zařadit, ovšem bez jakéhokoliv omezování pouze na tyto skupiny, methylovou skupinu, ethylovou skupinu, propylovou skupinu, izopropylovou skupinu, 1-propenylovou skupinu,

2- propenylovou skupinu, n-butylovou skupinu, izobutylovou skupinu, terciární butylovou skupinu, sekundární butylovou skupinu, 1-butenylovou skupinu, 2-butenylovou skupinu,

3- butenylovou skupinu a podobné další skupiny.

Termínem „alkylová skupina obsahující 1 až 8 atomů uhlíku“ se v textu předmětného vynálezu míní nasycená nebo nenasycená uhlovodíková (hydrokarbylová) skupina s přímým nebo rozvětveným řetězcem obsahující jeden až osm atomů uhlíku, přičemž mezi tyto skupiny je možno zařadit, ovšem bez jakéhokoliv omezování pouze na tyto skupiny, methylovou skupinu, ethylovou skupinu, propylovou skupinu, izopropylovou skupinu, 1-propenylovou skupinu,

3- butenylovou skupinu, pentylovou skupinu, neopentylovou skupinu, hexylovou skupinu, heptylovou skupinu, oktylovou skupinu a podobné další skupiny.

-25 CZ 291604 B6

Termínem „alkylenová skupina obsahující 1 až 8 atomů uhlíku“ se v textu předmětného vynálezu míní nasycená nebo nenasycená hydrokarbylová skupina s přímým nebo rozvětveným řetězcem obsahující jeden až osm atomů uhlíku, přičemž mezi tyto skupiny je možno zařadit, ovšem bez 5 jakéhokoliv omezování pouze na tyto skupiny, methylenovou skupinu, ethylenovou skupinu, propylenovou skupinu, izopropylenovou skupinu, 1-propenylovou skupinu, 2-propenylenovou skupinu, n-butylenovou skupinu, izobutylenovou skupinu, terciární butylenovou skupinu, sekundární butylenovou skupinu, 1-butenylenovou skupinu, 2-butenylenovou skupinu, 3butenylenovou skupinu, pentylenovou skupinu, neopentylenovou skupinu, hexylenovou skupinu, 10 heptylenovou skupinu, oktylenovou skupinu a podobné další skupiny.

Termínem „cykloalkylová skupina“ se v textu předmětného vynálezu míní nasycená nebo nenasycená alicyklická část obsahující tři až osm atomů uhlíku, přičemž mezi tyto skupiny je možno zařadit, ovšem bez jakéhokoliv omezování pouze na tyto skupiny, cyklopropylovou 15 skupinu, cyklobutylovou skupinu, cyklopentylovou skupinu, cyklohexylovou skupinu, cykloheptylovou skupinu, cyklooktylovou skupinu a podobné jiné skupiny.

V textu předmětného vynálezu použitým termínem „Hal“ nebo halogen se míní halogenová skupina, přičemž mezi tyto skupiny je možno zařadit fluorové, chlorové, bromové a jodové části.

V textu předmětného vynálezu je použit termín „optický izomer“ nebo „optické izomeiy“, přičemž tímto termínem se míní libovolná stereo-izomemí konfigurace, která může existovat v případě dané sloučeniny obecného vzorce I.

V textu předmětného vynálezu je použit termín „hydrát“ nebo „hydráty“, přičemž tímto termín se míní reakční produkt jedné nebo více molekul vody se sloučeninou obecného vzorce I, ve kterém vazba H-OH není rozštěpena a mezi tyto produkty patří monohydráty a rovněž tak i multihydráty.

V textu předmětného vynálezu je použit termín „farmaceuticky přijatelné soli“, přičemž tímto termínem se míní reakční produkt jedné nebo více molekul jedné nebo více molekul libovolné netoxické kyseliny se sloučeninou obecného vzorce I. Jako ilustrativní příklad anorganických kyselin, které jsou vhodné pro přípravu vhodných solí je možno uvést kyselinu chlorovodíkovou, kyselinu bromovodíkovou, kyselinu sírovou a kyselinu fosforečnou a soli kyseliny s kovem, jako 35 je například monohydrogenfosforečnan sodný a hydrogensíran draselný. Jako ilustrativní příklady organických kyselin, které tvoří vhodné soli se sloučeninami podle předmětného vynálezu, je možno uvést mono-, di- a trikarboxylové kyseliny. Jako ilustrativní příklad těchto kyselin je možno uvést například kyselinu octovou, kyselinu glykolovou, kyselinu mléčnou, kyselinu pyrohroznovou, kyselinu maleinovou, kyselinu hydroxymaleinovou, kyselinu 40 benzoovou, kyselinu hydroxybenzoovou, kyselinu fenyloctovou, kyselinu skořicovou, kyselinu salicylovou, kyselinu 2-fenoxybenzoovou, a kyseliny sulfonové, jako například kyselina methansulfonová, kyselina trifluormethansulfonová a kyselina 2-hydroxyethanosulfonová.

Výše uvedené sloučeniny obecného vzorce I je možno připravit za použití metod a technických 45 prostředků všeobecně známých pro odborníky pracující vdaném oboru z dosavadního stavu techniky. Obecné schéma postupu syntetické přípravy těchto sloučenin je uvedeno dále jako Schéma A, přičemž v tomto schématu všechny substituenty, pokud nebude výslovně uvedeno jinak, mají stejný význam jako bylo uvedeno shora.

-26CZ 291604 B6

Schéma A

RNH₂ 4 stupeň b

H_ZN

stupeň c

Podle tohoto Schématu A, ve stupni (a) se do reakce uvádí 2,6-dichlorpurin vzorce 1 se vhodným alkoholem obecného vzorce 2, přičemž se získá odpovídající 9-substituovaná-2,6-dichlorpurinová sloučenina, která má obecný vzorec 3, přičemž se použije pro odborníky v daném oboru běžných a obecně známých metod z dosavadního stavu techniky.

Například je možno uvést, že 2,6-dichlorpurin vzorce 1 je možno uvést do reakce se vhodným alkoholem obecného vzorce 2 v přítomnosti trifenylfosfinu a diethylazodikarboxylátu ve vhodném aprotickém rozpouštědle, jako je například tetrahydrofuran. Tyto reakční složky se obvykle promíchávají společně při teplotě místnosti po dobu v rozmezí od 5 hodin do 5 dní. Takto získaný výsledný 9-substituovaný-2,6-dichlorpurin obecného vzorce 3 je možno oddělit z reakčního prostředí extrakčními metodami, což je běžně používaný postup z dosavadního stavu techniky, nebo je možno použít obvyklejší metody a sice výsledný 9-substituovaný-2,6-dichlorpurin obecného vzorce 3 oddělit odstraněním rozpouštědla, načež potom následuje přímé převedení produktu do kolony naplněné silikagelem a eluování vhodným rozpouštědlem, jako je například methylenchlorid nebo směs rozpouštědel, jako je například směs hexanu a ethylacetátu. Surový 9-substituovaný-2,6-dichlorpurin obecného vzorce 3 je možno potom přečistit chromatografíckou metodou neboje možno jej použít pro další postup bez čištění.

Ve stupni (b) se 6-chlor-funkční skupina tohoto 9-substituovaného-2,6-dichlorpurinu obecného vzorce 3 uvede do reakce se vhodným aminem obecného vzorce 4, přičemž se získá odpovídající 9-substituovaná-6-aminová-2-chlorpurinová sloučenina obecného vzorce 5.

Například je možno uvést, že 9-substituovaný-2,6-dichlorpurin obecného vzorce 3 je možno uvést do reakce se vhodným aminem obecného vzorce 4 ve vhodném bezvodém polárním rozpouštědle, jako je například methanol. Tyto reakční složky se v obvyklém provedení společně promíchávají při teplotě varu pod zpětným chladičem po dobu v rozmezí od 30 minut do 3 dní. Takto získaný výsledný 9-substituovaný-6-amino-2-chlorpurin obecného vzorce 5 se potom odstraní z reakčního prostředí extrakčními metodami, které jsou v tomto oboru z dosavadního stavu techniky běžně známy, nebo v případě, že se tento 9-substituovaný-6-amino-2-chlorpurin obecného vzorce 5 vysráží z roztoku, je možno jej oddělit filtrací.

-27CZ 291604 B6

Ve stupni (c) 2-chlor-funkční skupina tohoto 9-substituovaného-6-amino-2-chlorpurinu obecného vzorce 5 reaguje s 1,4-cyklohexandiaminem obecného vzorce 6, přičemž se získá sloučenina obecného vzorce I.

Například je možno uvést, že se vhodný 9-substituovaný-6-amino-2-chlorpurin obecného vzorce 5 může uvést do reakce s molámím přebytkem 1,4-cyklohexandiaminu obecného vzorce 6. Tyto reakční složky se obvykle umístí v tlakové trubici, která se utěsní a zahřeje na teplotu pohybující se v rozmezí od asi 80 °C do asi 150 °C po dobu v rozmezí od 30 minut do 3 dní. Takto získaná sloučenina obecného vzorce I se oddělí zreakčního prostředí extrakčními metodami, které jsou v tomto oboru z dosavadního stavu techniky známé, načež je možno získaný produkt přečistit chromatografíckou metodou.

Výchozí materiály, které se používají v tomto obecném schématu A pro syntetickou přípravu sloučenin podle vynálezu, jsou pro odborníky pracující v daném oboru snadno dostupné.

Příklady provedení vynálezu

V následujících příkladech bude předmětný vynález blíže objasněn s pomocí konkrétních příkladů provedení, které jsou ovšem pouze ilustrativní a nijak neomezují rozsah tohoto vynálezu. V těchto příkladech budou sloučeniny připravovány syntetickým postupem odpovídajícím schématu A. V těchto příkladech „g“ znamená gramy, „mmol“ znamená milimoly, „ml“ znamená mililitry, „bp“ znamená teplotu varu, „°C“ znamená stupně Celsia, ,,μΓ znamená mikrolitry, „pg“ znamená mikrogramy a „pM“ znamená mikromolámí.

Příklad 1

Dihydrochlorid 2-[trans-(4-aminocyklohexyl)amino]-6-(3-jodbenzylamino)-9-cyklopentylpurinu.

Schéma A, stupeň (a):

2,6-dichlor-9-cyklopentylpurin.

Podle tohoto provedení byl rozpuštěn cyklopentanol (v množství 260 mg, 3,02 mmol“, 2,6-dichlorpurin (680 mg, 3,60 mmol) a trifenylfosfin (950 mg, 3,60 mmol) v suchém THF (20 mililitrů) a tato reakční směs byla ochlazena na teplotu 0 °C. Potom byl přidán diethylazodikarboylát (570 pl, 3,60 mmol), přičemž tento přídavek byl proveden po kapkách během intervalu 15 minut pod atmosférou dusíku. Tento výsledný roztok byl promícháván po dobu 60 hodin při teplotě místnosti. Použité rozpouštědlo bylo odpařeno ve vakuu, produkt byl přímo zaveden do kolony naplněné silikagelem, načež bylo provedeno eluování methylenchloridem, čímž byla získána požadovaná titulní sloučenina ve formě surové směsi.

Schéma A, stupeň (b):

2-chlor-6~(3-jodbenzyl)amino)-9-cyklopentylpurin.

Podle tohoto provedení byl rozpuštěn 2,6-dichlor-9-cyklopentylpurin (použito 620 mg, v surovém stavu), hydrochlorid 3-jodbenzylaminu (použito 810 mg, 3,00 mmol) a triethylamin (použito 835 pL, 6,00 mmol) v suchém ethanolu (20 mililitrů). Tato reakční směs byla zahřívána při teplotě varu pod zpětným chladičem po dobu 15 hodin, načež byla ochlazena a pevný podíl byl zfíltrován, čímž byla získána požadovaná titulní sloučenina ve formě bílé pevné látky.

Výtěžek: 680 miligramů.

-28CZ 291604 B6 ’Η-NMR (Me₂SO-d₆ + D₂O, δ):

8,27 (s, 1H, purin H-8), 7,74 (s, 1H), 7,61 (d, 1H), 7,39 (d, 1H), 7,16 (t, 1H), 4,78 (m, 1H), 4,62 (bs, 2H), 2,15 (m, 2H), 1,90 (m, 4H), 1,70 (m, 2H); CIMS (NH₃) 454 (MřT), 328.

Schéma A, stupeň (c):

Dihydrochlorid 2-[trans-(4-aminocyklohexyl)ammo]-6-(3-jodbenzylamino)-9-cyklopentylpurinu.

Podle tohoto provedení byl smíchán 2-chlor-6-(3-jobenzyl)amino)-9-cyklopentylpurin (použito 130 mg, 0,287 mmol) a 1,4-cyklohexandiamin (použito 2,00 gramy, přebytek) v tlakové trubici, která byla utěsněna a zahřívána při teplotě 140 °C po dobu 18 hodin. Tato reakční směs byl ochlazena, načež byl přidán dichlormethan CH₂C1₂ (40 mililitrů), a potom byl získaný produkt promyt vodou (dva podíly po 20 mililitrech). Po usušení (síran hořečnatý), odpaření rozpouštědla ve vakuu a vyčištění v chromatografícké koloně naplněné silikagelem (10 : 1 : kapky CH₂C1₂/MeOH/NHtOH) byla získána požadovaná titulní sloučenina.

Výtěžek: 140 miligramů (92 %).

Tato sloučenina byla převedena na hydrochloridovou sůl.

’Η-NMR (Me₂SO-d₆ + D₂O, δ):

7,83 (d, 1H), 7,71 (s, 1H, purin H-8), 7,60 (s, 1H), 7,38 (d, 1H), 7,14 (t, 1H), 4,63 (m, 3H), m, 1H), 2,99 (m, 1H), 1,50 - 2,20 (m, 14H), 1,10 - 1,50 (m, 2H); CIMS (NH₃) 532 (MFT).

Příklad 2

Dihydrochlorid 2-[trans-(4-aminocyklohexyl)amino]-6-[(3-indolyl)-2-ethylamino]-9-cyklopentylpurinu.

Schéma A, stupeň (b):

2-chlor-6-[(3-indolyl)-2-ethylamino]-9-cyklopentylpurin.

Podle tohoto provedení byl použit 2-chlor-6-[(3-indolyl)-2-ethylamino]-9-cyklopentylpurin, který byl připraven ze 2,6-dichlor-9-cyklopentylpurinu, tryptaminu a triethylaminu v podstatě stejným způsobem jako je uvedeno v příkladu 1.

Schéma A, stupeň (c):

Podle tohoto provedení byl použiti dihydrochlorid 2-[trans-(4-ammocyklohexyl)amino]-6-[(3indolyl)-2-ethylamino]-9-cyklopentylpurinu, který byl připraven ze 2-chlor-6-[(3-indolyl)-2ethylamino]-9-cyklopentylpurinu v podstatě stejným způsobem jako je uvedeno v příkladu 1, Schéma A, stupeň (c).

CIMS (NH₃) 459 (Mtf); Rf (min) = 3,47

-29CZ 291604 B6

Příklad 3

Dihydrochlorid 2-[trans-(4-aminocyklohexyl)amino]-6-(butylamino)-9-cyklopentylpurinu.

Schéma A, stupeň (b):

2-chlor-6-(butylamino)-9-cyklopentylpurin.

Podle tohoto provedení byl použit

2-chlor-6-(butylamino)-9-cyklopentylpurin, který byl připraven ze 2,6-dichlor-9-cyklopentylpurinu, n-butylaminu a triethylaminu v podstatě stejným způsobem jako je uvedeno v příkladu 1, Schéma A, stupeň (b).

Schéma A, stupeň (c):

Dihydrochlorid 2-[trans-(4-aminocyklohexyl)ammo]-6-(butylamino)-9-cyklopentylpurinu.

Podle tohoto provedení byl použit dihydrochlorid 2-[trans-(4-aminocyklohexyl)amino]-6(butylamino)-9-cyklopentylpurinu, který byl připraven z 2-chlor-6-(butylamino)-9-cyklopentylpurinu v podstatě stejným způsobme jako je uvedeno v příkladu 1, Schéma A, stupeň (c).

CIMS (NH₃) 466 (ΜΗ*); R_f (min) = 3,45.

Příklad 4

Dihydrochlorid 2-[trans-(4-aminocyklohexyl)ammo]-6-[2-(3,4-methylendioxyfenyl)ethylamino]-9-cyklopentylpurinu.

Schéma A, stupeň (b):

2-chlor-6-[2-(3,4—methylendioxyfenyl)ethylamino]-9-cyklopentylpurin.

Podle tohoto provedení byl použit 2-chlor-6-[2-(3,4-methylendioxyfenyl)ethylamino]-9-cyklopentylpurin, který byl připraven z 2,6-dichlor-9-cyklopentylpurinu, 3,4-methylendioxyfenylethylaminu a triethylaminu v podstatě stejným způsobem jako je uvedeno v příkladu 1, Schéma A, stupeň (b).

Schéma A, stupeň (c):

Dihydrochlorid 2-[trans-(4-aminocyklohexyl)amino]-6-“[2-(3,4-methylendioxyfenyl)ethylamino]-9-cyklopentyl-purinu.

Podle tohoto postupu byl použit dihydrochlorid 2-[trans-(4-aminocyklohexyl)amino]-6-[2(3,4-methylendioxyfenyl)ethylamino]-9-cyklopentylpurinu, kteiý byl připraven z 2-chlor-6-[2(3,4-methylendioxyfenyl)ethylamino]-9-cyklopentylpurinu v podstatě stejným způsobem jako je uvedeno v příkladu 1, Schéma A, stupeň (c).

CIMS (NH₃) 464 (MIT); R_f (min) = 2,28

-30CZ 291604 B6

Příklad 5

Dihydrochlorid 2-[trans-(4-aminocyklohexyl)amino]-6-[(4-aminobutyl)ainino]-9-cyklopentylpurinu.

Schéma A, stupeň (b):

2-chlor-6-[(4-aminobutyl)amino]-9-cyklopentylpurin.

Podle tohoto postupu byl použit 2-chlor-6-[(4-aminobutyl)amino]-9-cyklopentylpurin, který byl připraven ze 2,6-dichlor-9-cyklopentylpurinu, 1,4-diaminobutanu a triethylaminu v podstatě stejným způsobem jako je uvedeno v příkladu 1, Schéma A, stupeň (b).

Schéma A, stupeň (c):

Dihydrochlorid 2-[trans-(4-aminocyklohexyl)amino]-6-[(4-aminobutyl)amino]-9-cyklopentylpurinu.

Podle tohoto příkladu byl použit dihydrochlorid 2-[trans-(4-aminocyklohexyl)amino]-6-[(4aminobutyl)amino]-9-cyklopentylpurinu, který byl připraven z 2-chlor-6-[(4-aminobutyl)amino]-9-cyklopentylpurinu v podstatě stejným způsobem jako je uvedeno v příkladu 1, Schéma A, stupeň (c).

CIMS (NH₃) 387 (MHf); R_f (min) = 3,10.

Příklad 6

Dihydrochlorid (S)-2-[trans-(4-aminocyklohexyl)amino]-6-[(a-methylbenzyl)amino]-9cyklopentylpurinu.

Schéma A, stupeň (b):

2-chlor-6-[(a-methylbenzyl)amino]-9-cyklopentylpurin.

Podle tohoto postupu byla uvedená sloučenina, 2-chlor-6-[(a-methylbenzyl)amino]-9-cyklopentylpurin, připravena z 2,6-díchlor-9-cyklopentylpurinu, (Sj-a-methylbenzylaminu a triethylaminu v podstatě stejným způsobem jako je uvedeno výše v příkladu 1, Schéma A, stupeň (b).

Schéma A, stupeň (c):

Dihydrochlorid 2-[trans-(4-aminocyklohexyl)ammo]-6-[(a-methylbenzyl)amino]-9-cyklopentylpurinu.

Podle tohoto postupu byla uvedena sloučenina, dihydrochlorid 2-[trans-(4-aminocyklohexyl)amino]-6-[(a-methylbenzyl)amino]-9-cyklopentylpurinu, připravena z 2-chlor-6-[(a-methylbenzyl)amino]-9-cyklopentylpurinu v podstatě stejným způsobem jako je uvedeno v příkladu 1, Schéma A, stupeň (c):

CIMS (NH₃) 420 (MlT); R_f (min) = 0,42.

-31 CZ 291604 B6

Příklad 7

Dihydrochlorid 2-[trans-(4-aminocyklohexyl)amino]-6-[(3-pyridyl)-2-ethylamino]-9-cyklopentylpurinu.

Schéma A, stupeň (b):

2-chlor-6-[(3-pyridyl)-2-ethylamino]-9-cyklopentylpurin.

Podle tohoto postupu byla uvedená sloučenina, 2-chlor-6-[(3-pyridyl)-2-ethylamino]-9-cyklopentylpurin, připravena z 2,6-dichlor-9-cyklopentylpurinu, 3-(ethylamino)pyridinu a triethylaminu v podstatě stejným způsobem jako je uvedeno výše v příkladu 1, Schéma A, stupeň (b).

Schéma A, stupeň (c):

Podle tohoto postupu byla výše uvedená sloučenina, dihydrochlorid 2-[trans-(4-aminocyklohexyl)amino]-6-[(3-pyridyl)-2-ethylamino]-9-cyklopentylpurinu, připravena z 2-chlor-6-[(3pyridyl)-2-ethylamino]-9-cyklopentylpurinu v podstatě stejným způsobem jako je uvedeno v příkladu 1, Schéma A, stupeň (c).

CIMS (MH₃) 421 (MH⁴); Rf (min) = 3,13.

Příklad 8

Dihydrochlorid 2-[trans-(4—aminocyklohexyl)amino]-6-[(4-pyridyl)methylamino]-9-cyklopentylpurinu.

Schéma A, stupeň (b):

2-chlor-6-[(4-pyridyl)methylamino]-9-cyklopentylpurin.

Podle tohoto postupu byla uvedená sloučenina, 2-chlor-6-[(4-pyridyl)methylamino]-9-cyklopentylpurin, připravena z 2,6-dichlor-9-cyklopentylpurinu, 4-aminomethylpyridinu a triethylaminu v podstatě stejným způsobem jako je uvedeno v příkladu 1, Schéma A, stupeň (b).

Schéma A, stupeň (c):

Dihydrochlorid 2-[trans-(4-aminocyklohexyl)amino]-6-[(4-pyridyl)methylamino]-9-cyklopentylpurinu.

Podle tohoto postupu byla uvedená sloučenina, dichlorid 2-[trans-(4-aminocyklohexyl)amino]6-[(4-pyridyl)m^ethyla^mino]-9-cyklopentylpurinu, připravena z 2-chlor-6-[(4-pyridyl)methylamino]-9-cyklopentylpurinu v podstatě stejným způsobem jako je uvedeno v příkladu 1, Schéma A, stupeň (c).

CIMS (NH₃) 407 (Mtf); R_f (min) = 3,13.

-32CZ 291604 B6

Příklad 9

Dihydrochlorid 2-[trans-(4-aminocyklohexyl)amino]-6-[3-(4-morfolinyl)propylamino]-9cyklopentylpurinu.

Schéma A, stupeň (b):

2-chlor-6-[3-(4-morfolinyl)propylamino]-9-cyklopentylpurin.

Podle tohoto postupu byla uvedená sloučenina, 2-chlor-6-[3-(4-morfolinyl)propylamino]-9cyklopentylpurin, připravena z 2,6-dichlor-9-cyklopentylpurinu, 3-aminopropylmorfolinu a triethylaminu v podstatě stejným způsobem jako je uvedeno v příkladu 1, Schéma A, stupeň (b).

Schéma A, stupeň (c):

Podle tohoto postupu byla uvedená sloučenina, dihydrochlorid 2-[trans-(4-aminocyklohexyl)amino]-6-[3-(4-morfolinyl)propylamino]-9-cyklopentylpurinu, připravena z 2-chlor-6-[3-(4morfolinyl)propylamino]-9-cyklopentylpurinu v podstatě stejným způsobem jako v příkladu 1, Schéma A, stupeň (c).

CIMS (NH₃) 443 (MET); R_f (min) = 3,11.

Příklad 10

Dihydrochlorid 2-[trans-(4~aminocyklohexyl)amino]-6-[(3,4-dichlorbenzyl)amino]-9-cyklopentylpurinu.

Schéma A, stupeň (b):

2-chlor-6-[(3,4-dichlorbenzyl)amino]-9-cyklopentylpurin.

Podle tohoto postupu byla uvedena sloučenina, 2-chlor-6-[(3,4-dichlorbenzyl)amino]-9-cyklopentylpurin, připraven z 2,6-dichlor-9-cyklopentylpurinu, 3,4-dichlorbenzylaminu a triethylaminu v podstatě stejným způsobem jako je uvedeno v příkladu 1, Schéma A, stupeň (b).

Schéma A, stupeň (c):

Dihydrochlorid 2-[trans-(4-aminocyklohexyl)amino]-6-[(3,4-dichlorbenzyl)amino]-9-cyklopentylpurinu.

Podle tohoto postupu byla uvedená sloučenina, dihydrochlorid 2-[trans-(4-aminocyklohexyl)amino]-6-[(3,4-dichlorbenzyl)amino]-9-cyklopentylpurinu, připravena z 2-chlor-6-[(3,4-dichlorbenzyl)amino]-9-cyklopentylpurinu v podstatě stejným způsobem jako je uvedeno v příkladu 1, Schéma A, stupeň (c).

CIMS (NH₃) 474 (MlT); R_f (min) = 2,34.

-33CZ 291604 B6

Příklad 11

Dihydrochlorid 2-[trans-(4-aminocyklohexyl)ainino]-6-[(3-methylbenzyl)amino-9-cykIopentylpurinu

Schéma A, stupeň (b):

2-chlor-6-[(3-methylbenzyl)amino]-9-cyklopentylpurin.

Podle tohoto postupu byla uvedená sloučenina, 2-chlor-6-[(3-methylbenzyl)amino]-9-cyklopentylpurin, připravena z 2,6-dichlor-9-cyklopentylpurinu, 3-methylbenzylaminu a triethylaminu, přičemž se postupovalo v podstatě stejným způsobem jako v příkladu 1, Schéma A, stupeň (b).

Schéma A, stupeň (c):

Dihydrochlorid 2-[trans-(4-aminocyklohexyl)amino]-6-[(3-methylbenzyl)amino]-9-cyklopentylpurinu.

Podle tohoto postupu byla uvedená sloučenina, dihydrochlorid 2-[trans-(4-aminocyklohexyl)amino]-6-[(3-methylbenzyl)amino]-9-cyklopentylpurinu, připravena z 2-chlor-6-[(3-methylbenzyl)amino]-9-cyklopentylpurinu v podstatě stejným způsobem jako je uvedeno v příkladu 1, Schéma A, stupeň (c).

CIMS (NH₃) 420 (MH*); Rf (min) = 2,29.

Příklad 12

Dihydrochlorid 2-[trans-(4-aminocyklohexyl)amino]-6-[2-(2-pyridyl)ethylamino]-9-cyklopentylpurinu

Schéma A, stupeň (b):

2-chlor-6-[2-(2-pyridyl)ethylamino]-9-cyklopentylpurin.

Podle tohoto postupu byla uvedená sloučenina, 2-chlor-6-[2-(2-pyridyl)ethylamino]-9-cyklopentylpurin, připravena z 2,6-dichlor-9-cyklopentylpurinu, 2-(ethylamino)pyridinu a triethylaminu, přičemž se postupovalo v podstatě stejným způsobem jako v příkladu 1, Schéma A, stupeň (b).

Schéma A, stupeň (c):

Dihydrochlorid 2-[trans-(4-aminocyklohexyl)amino]-6-[2-(2-pyridyl)ethylamino]-9-cyklopentylpurinu.

Podle tohoto postupu byla uvedená sloučenina, dihydrochlorid 2-[trans-(4-aminocyklohexyl)amino]-6-[2-(2-pyridyl)ethylamino]-9-cyklopentylpurinu, připravena z 2-chlor-6-[2-(2pyridyl)ethylamino]-9-cyklopentylpurinu, přičemž se postupovalo v podstatě stejným způsobem jako v příkladu 1, Schéma 1, stupeň (c).

CIMS (NH₃) 421 (MH¹); Rf (min) = 3,13.

-34CZ 291604 B6

Příklad 13

Trihydrochlorid 2-[trans-(4-aminocyklohexyl)ammo]-6-[2-(4-morfblinyl)ethylamino]--9-cyklopentylpurinu.

Schéma A, stupeň (b):

2-chlor-6-[2-(4-morfolinyl)ethylamino]-9-cyklopentylpurin.

Podle tohoto postupu byla uvedená sloučenina, 2-chlor-6-[2-(4-morfolinyl)ethylamino]-9cyklopentylpurin, 2-aminoethylmorfolinu a triethylaminu, přičemž se postupovalo v podstatě stejným způsobem jako v příkladu 1, Schéma A, stupeň (b).

Schéma A, stupeň (c):

Trihydrochlorid 2-[trans-(4-aminocyklohexyl)amino]-6-[2-(4-morfblinyl)ethylamino]-9cyklopentylpurinu.

Podle tohoto postupu byla uvedená sloučenina, trihydrochlorid 2-[trans-(4-aminocyklohexyl)amino]-6-[2-(4-morfolinyl)ethylamino]-9-cyklopentylpurinu, připravena z 2-chlor-6-[2-(4morfolinyl)ethylamino]-9-cyklopentylpurinu, přičemž se postupovalo v podstatě stejným způsobem jako v příkladu 1, Schéma A, stupeň (c).

CIMS (NH₃) 429 (MlT); R_f (min) = 3,08.

Příklad 14

Dihydrochlorid2-[trans-(4-aminocyklohexyl)amino]-6-[2-hydroxyethylhydrazino]-9-cyklopentylpurinu.

Schéma A, stupeň (b):

2-chlor-6-[2-hydroxyethylhydrazino]-9-cyklopentylpurin

Podle toho provedení byla uvedená sloučenina, 2-chlor-6-[2-hydroxyethylhydrazino]-9-cyklopentylpurin, připravena z 2,6-dichlor-9-cyklopentylpurinu, 2-hydroxyethylhydrazinu a triethylaminu, přičemž se postupovalo v podstatě stejným způsobem jako v příkladu 1, Schéma A, stupeň (b).

Schéma A, stupeň (c):

Dihydrochorid 2-[trans-(4-aminocyklohexyl)amino]-6-[2-hydroxyethylhydrazino]-9-cyklopentylpurinu.

Podle tohoto postupu byla výše uvedená sloučenina, dihydrochlorid 2-[trans-(4-aminocyklohexyl)amino]-6-[2-hydroxyethylhydrazino]-9-cyklopentylpurinu, připravena z 2-chlor-6-[2hydroxyethylhydrazino]-9-cyklopentylpurinu, přičemž se postupovalo v podstatě stejným způsobem jako v příkladu 1, Schéma A, stupeň (c).

CIMS (NH₃) 375 (MlT); R_f (min) = 3,15.

-35 CZ 291604 B6

Příklad 15

Dihydrochlorid 2-[trans-(4-aminocyklohexyl)amino]-6-[(3-chlor)benzylamino]-9-(2-propyl)purinu.

Schéma A, stupeň (a):

2,6-dichlor-9-(2-propyl)purin

Podle tohoto postupu byla uvedena sloučenina, 2,6-dichlor-9-(2-propyl)purin, připravena z 2,6-dichlorpurinu a izopropanolu, přičemž se postupovalo v podstatě stejným způsobem jako v příkladu 1, Schéma A, stupeň (a), stím rozdílem, že cyklopentanol byl nahražen izopropanolem.

Schéma A, stupeň (b):

2-chlor-6-[(3-chlor-benzylamino]-9-(2-propyl)purin.

Podle tohoto postupu byla uvedená sloučenina, 2-chlor-6-[(3-chlor)benzylaminu]-9-(2propyl)purin, připravena z 2,6-dichlor-9-(2-propyl)purinu, 3-chlorbenzylaminu a triethylaminu, přičemž se postupovalo v podstatě stejným způsobem jako v příkladu 1, Schéma A, stupeň (b).

Schéma A, stupeň (c):

Podle tohoto postupu byla uvedená sloučenina, dihydrochlorid 2-[trans-(4-aminocyklohexyl)amino]-6-[(3-chlor)benzylamino]-9-(2-propyl)purinu, připravena z 2-chlor-6-[(3-chlor)benzylamino]-9-(2-propyl)purinu, přičemž se postupovalo v podstatě stejným způsobem jako v příkladu 1, Schéma A, stupeň (c).

CIMS (NH₃) 414 (MH⁺); R_f = (min) 3,44.

Příklad 16

Dihydrochlorid (R)-2-[trans-(4-ammocyklohexyl)amino]-6-[(a-methylbenzyl)amino]-9cyklopentylpurinu.

Schéma A, stupeň (b):

2-chlor-6-[(a-methylbenzyl)amino]-9-cyklopentylpurin.

Podle tohoto postupu byla uvedená sloučenina, 2-chlor-6-[(a-methylbenzyl)amino]-9-cyklopentylpurin. připravena z 2,6-dichlor-9-cyklopentylpurinu, (R)-a-methylbenzylaminu a triethylaminu, přičemž se postupovalo v podstatě stejným způsobem jako v příkladu 1, Schéma A, stupeň (b).

Schéma A, stupeň (c):

Dihydrochlorid (R)-2-[trans-(4-aminocyklohexyl)amino]-6-[(a-methylbenzyl)amino]-9cyklopentylpurinu.

-36CZ 291604 B6

Podle tohoto postupu byla uvedená sloučenina, dihydrochlorid (R)-2-[trans-(4—aminocyklohexyl)amino]-6-[(a-methylbenzyl)amino]-9-cyklopentylpurinu, připravena z 2-chlor-6-[(amethylbenzyl)amino]-9-cyklopentylpurinu, přičemž se postupovalo v podstatě stejným způsobem jako v příkladu 1, Schéma A, stupeň (c).

CIMS (NH₃) 420 (MH*); R_f (min) = 2,27.

Příklad 17

Dihydrochlorid 2-[trans-(4-aminocyklohexyl)amino]-6-(2-thiofenmethylamino)-9-cyklopentylpurinu.

Schéma A, stupeň (b):

2-chlor-6-(2-thiofenmethylamino)-9-cyklopentylpurin.

Podle tohoto postupu byla uvedená sloučenina, 2-chlor-6-(2-thiofenmethylamino)-9-cyklopentylpurin, připravena z 2,6-dichlor-9-cyklopentylpurinu, 2-thiofenmethylaminu a triethylaminu, přičemž se postupovalo v podstatě stejným způsobem jako v příkladu 1, Schéma A, stupeň (b).

Schéma A, stupeň (c):

Podle tohoto provedení byla uvedená sloučenina, dihydrochlorid 2-[trans-(4—aminocyklohexyl)amino]-6-(2-thiofenmethylamino)-9-cyklopentylpurinu, připravena z 2-chlor-6-(2-thiofenmethylamino)-9-cyklopentylpurinu, přičemž se postupovalo v podstatě stejným způsobem jako v příkladu 1, Schéma A, stupeň (c).

CIMS (NH₃) 412 (MH*); R_f = (min) 3,43.

Příklad 18

Dihydrochlorid 2-[trans-(4-aminocyklohexyl)amino]-6-[(2-chlorbenzyl)amino]-9-cyklopentylpurinu

Schéma A, stupeň (b):

2-chlor-6-[(2-chlorbenzyl)amino]-9-cyklopentylpurin.

Podle tohoto postupu byla uvedená sloučenina, 2-chlor-6-[(2-chlorbenzyl)amino]-9-cyklopentylpurin, připravena z 2,6-dichlor-9-cyklopentylpurinu, 2-chlorbenzylaminu a triethylaminu, přičemž se postupovalo v podstatě stejným způsobem jako v příkladu 1, Schéma A, stupeň (b).

Schéma A, stupeň (c):

Dihydrochlorid 2-[(trans-(4-aminocyklohexyl)amino]-6-[(2-chlorbenzyl)amino]-9-cyklopentylpurinu.

-37CZ 291604 B6

Podle tohoto postupu byla uvedená sloučenina, dihydrochlorid 2-[trans-(4—aminocyklohexyl)amino]-6-[(2-chlorbenzyl)amino]-9-cyklopentylpurinu, připravena z 2-chlor-6-[(2-chlorbenzyl)amino]-9-cyklopentylpurinu, přičemž se postupovalo v podstatě stejným způsobem jako v příkladu 1, Schéma A, stupeň (c).

CIMS (NH₃) 440 (ΜΗ*); R_f (min) = 2,28.

Příklad 19

Dihydrochlorid 2-[trans-(4-aminocyklohexyl)amino]-6-[(2-benzimidazolyl)methylamino]-9cykíopentylpurinu.

Schéma A, stupeň (b):

2-chlor-6-[(2-benzimidazolyl)methylamino]-9-cyklopentyl-purin.

Podle tohoto postupu byla uvedená sloučenina, 2-chlor-6-[(2-benzimidazolyl)methylamino]-9cyklopentyl-purin, připravena z 2,6-dichlor-9-cyklopentylpurinu, 2-(methylamino)benzimidazolu a triethylaminu, přičemž se postupovalo v podstatě stejným způsobem jako v příkladu 1, Schéma A, stupeň (b).

Schéma A, stupeň (c):

Dihydrochlorid 2^[trans-(4-aminocyklohexyl)amino]-6-[(2-benzimidazolyl)methylamino]-9cyklopentylpurinu

Podle tohoto postupu byla uvedená sloučenina, dihydrochlorid 2-[trans-(4-aminocyklohexyl)amino]-6-[(2-benzimidazolyl)methylamino]-9-cyklopentylpurinu, připravena z 2-chlor-6-[(2benzimidazolyl)methylamino]-9-cyklopentylpurinu, přičemž se postupovalo v podstatě stejným způsobem jako v příkladu 1, Schéma A, stupeň (c).

CIMS (NH₃) 372 (M1T); R_f (min) = 3,4.

Příklad 20

Dihydrochlorid 2-[trans-(4-aminocyklohexyl)amino]-6-(oktylamino)-9-cyklopentyIpurinu.

Schéma A, stupeň (b):

2-chlor-6-(oktylamino)-9-cyklopentylpurin.

Podle tohoto provedení byla uvedená sloučenina, 2-chlor-6-(oktylamino)-9-cyklopentylpurin, připravena z 2,6-dichlor-9-cyklopentylpurinu, n-oktylaminu a triethylaminu, přičemž se postupovalo v podstatě stejným způsobem jako v příkladu 1, Schéma A, stupeň (b).

Schéma A, stupeň (c):

Dihydrochlorid 2-[trans-(4~aminocyklohexyl)amino]-6-(oktylammo)-9-cyklopentylpurinu.

Podle tohoto provedení byla uvedená sloučenina, dihydrochlorid 2-[trans-(4-aminocyklohexyl)amino]-6-(oktylamino)-9-cyklopentylpurinu, připravena za použití 2-chlor-6-(oktylamino)-9-38CZ 291604 B6 cyklopentylpurinu, přičemž se postupovalo v podstatě stejným způsobem jako v příkladu 1,

Schéma A, stupeň (c).

CIMS (NH₃) 428 (MHf); R_f (min) = 4,23.

Příklad 21

Dihydrochlorid 2-[trans-(4-aminocyklohexyl)amino]-6-(4-fenylbutylamino)-9-cyklopentylpurinu.

Schéma A, stupeň (b):

2-chlor-6-(4-fenylbutylamino)-9-cyklopentylpurin.

Podle tohoto postupu byla výše uvedená sloučenina, 2-chlor-6-(4-fenylbutylamino)-9-cyklopentylpurin, připravena z 2,6-dichlor-9-cyklopentylpurinu, 4-fenylbutylaminu a triethylaminu, přičemž se postupovalo v podstatě stejným způsobem jako v příkladu 1, Schéma A, stupeň (b).

Schéma A, stupeň (c):

Dihydrochlorid 2-[trans-(4—aminocykIohexyl)amino]-6-(4-fenylbutylamino)-9-cyklopentylpurinu.

Podle tohoto postupu byla uvedená sloučenina, dihydrochlorid 2-[trans-(4-aminocyklohexyl)amino]-6-(4-fenylbutylamino)-9-cyklopentylpurinu, připravena za použití 2-chlor-6-(4fenylbutylamino)-9-cyklopentylpurinu, přičemž se postupovalo v podstatě stejným způsobem jako v příkladu 1, Schéma A, stupeň (c).

CIMS (NH₃) 448 (MH⁴); R_f (min) = 4,09.

Příklad 22

Dihydrochlorid 2-[trans-(4-aminocyklohexyl)amino]-6-[(cykIohexyl)methylamino]-9-cyklopentylpurinu.

Schéma A, stupeň (b):

2-chlor-6-[(cyklohexyl)methylamino]-9-cyklopentylpurin.

Podle tohoto postupu byla výše uvedená sloučenina, 2-chlor-6-[(cyklohexyl)methylamino]-9cyklopentylpurin, připravena za použití 2,6-dichlor-9-cyklopentylpurinu, aminomethylcyklohexyl a triethylaminu, přičemž se postupovalo v podstatě stejným způsobem jako v příkladu 1, Schéma A, stupeň (b).

Schéma A, stupeň (c):

Dihydrochlorid 2-[trans-(4-ammocyklohexyl)amino]-6-[(cyklohexyl)methylamino]-9-cyklopentylpurinu.

Podle tohoto postupu byla uvedená sloučenina, dihydrochlorid 2-[trans-(4-aminocyklohexyl)amino]-6-[(cyklohexyl)methylamino]-9-cyklopentylpurinu, připravena za použití 2-chlor-6-39CZ 291604 B6 [(cyklohexyl)methylamino]-9-cyklopentylpurinu, přičemž se postupovalo v podstatě stejným způsobem jako v příklad 1, Schéma A, stupeň (c).

CIMS (NHj) 412 (MlT); R_f (min) = 2,33.

Příklad 23

Dihydrochlorid 2-[trans-{4-aminocyklohexyl)amino]-6-[(3-(3-methyl-4-hydroxy)butyl)amino]-9-cyklopentylpurinu.

Schéma A, stupeň (b):

2-chlor-6-[(3-(3-methyl-4-hydroxy)butyl)amino]-9-cyklopentylpurin.

Podle tohoto postupu byla uvedená sloučenina, 2-chlor-6-[(3-{3-methyl-4-hydroxy)butyl)amino]-9-cyklo-pentylpurin, připravena za použití 2,6-dichlor-9-cyklopentylpurinu, 2-(2-hydroxymethyl)butylaminu a triethylaminu, přičemž se postupovalo v podstatě stejným způsobem jako v příkladu 1, Schéma A, stupeň (b).

Schéma A, stupeň (c):

Dihydrochlorid 2-[trans-(4~aminocyklohexyl)amino]-6-[(3-(3-methyl-4—hydroxy)butyl)amino]-9-cyklopentylpurinu.

Podle tohoto postupu byla výše uvedená sloučenina, dihydrochlorid 2-[trans-(4-aminocyklohexyl)amino]-6-[(3-(3-methyl-4-hydroxy)butyl)amino]-9-cyklopentylpurinu připravena za použití 2-chlor-6-[(3-(3-methyl-4-hydroxy)butyl)amino]-9-cyklopentylpurinu, přičemž se postupovalo v podstatě stejným způsobem jako v příkladu 1, Schéma A, stupeň (c).

CIMS (NH₃) 404 (MH⁴·); R_f (min) = 3,15.

Příklad 24

Dihydrochlorid 2-[trans-(4-aminocyklohexyl)amino]-6-[3-(fenyl)propylamino]-9-cyklopentylpurinu.

Schéma A, stupeň (b):

2-chlor-6-[3-(fenyl)propylamino]-9-cyklopentylpurín.

Podle tohoto postupu byla uvedená sloučenina, 2-chlor-6-[3-(fenyl)propylamino]-9-cyklopentylpurin, připravena za použití 2,6-dichlor-9-cyklopentylpurinu, 3-aminopropylbenzenu a triethylaminu, přičemž se postupovalo v podstatě stejným způsobem jako v příkladu 1, Schéma A, stupeň (b).

Schéma A, stupeň (c):

Podle tohoto postupu byla uvedená sloučenina, dihydrochlorid 2-[trans-(4-aminocyklohexyl)amino]-6-[3-(fenyl)propylamino]-9-cyklopentylpurinu, připravena za použití 2-chlor-6-40CZ 291604 B6 [3-(fenyl)propylamino]-9-cyklopentyl-purinu, přičemž se postupovalo v podstatě stejným způsobem jako v příkladu 1, Schéma A, stupeň (c).

CIMS (NH₃) 434 (MlT); Rf (min) = 0,49.

Přiklad 25

Dihydrochlorid 2-[trans-(4-aminocyklohexyl)amino]-6-[5-(hydroxy)pentylamino]-9-cyklopentylpurinu.

Schéma A, stupeň (b):

2-chlor-6-[5-(hydroxy)pentylamino]-9-cyklopentylpurin.

Podle tohoto postupu byla výše uvedená sloučenina, 2-chlor-6-[5-(hydroxy)pentylamino]-9cyklopentylpurin, připravena za použití 2,6-dichlor-9-cyklopentylpurinu, 5-hydroxypentylaminu a triethylaminu, přičemž se postupovalo v podstatě stejným způsobem jako v příkladu 1, Schéma A, stupeň (b).

Schéma A, stupeň (c):

Dihydrochlorid 2-[trans-(4—aminocyklohexyl)amino]-6-[5-(hydroxy)pentylamino]-9-cyklopentylpurinu.

Podle tohoto postupu byla výše uvedená sloučenina, dihydrochlorid 2-[trans-(4-aminocyklohexyl)amino]-6-[5-(hydroxy)pentylamino]-9-cyklopentylpurinu, připravena za použití 2-chlor6-[5-(hydroxy)pentyIamino]-9-cyklopentyIpurinu, přičemž se postupovalo v podstatě stejným způsobem jako v příkladu 1, Schéma A, stupeň (c).

CIMS (NH₃) 402 (MlT); Rf (min) = 3,25.

Příklad 26

Dihydrochlorid 2-[trans-(4-aminocyklohexyl)amino]-6-(pentylamino)-9-cyklopentylpurinu.

Schéma A, stupeň (b):

2-chlor-6-(pentylamino)-9-cyklopentylpurin.

Podle tohoto postupu byla výše uvedená sloučenina, 2-chlor-6-(pentylamino)-9-cyklopentylpurin, připravena za použití 2,6-dichlor-9-cyklopentylpurinu, pentylaminu a triethylaminu, přičemž se postupovalo v podstatě stejným způsobem jako v příkladu 1, Schéma A, stupeň (b).

Schéma A, stupeň (c):

Dihydrochlorid 2-[trans-(4—aminocyklohexyl)amino]-6-(pentylamino)-9-cykIopentylpurinu.

Podle tohoto provedení byla výše uvedená sloučenina, dihydrochlorid 2-[trans-(4-aminocyklohexyl)amino]-6-(pentylamino}-9-cyklopentylpurinu, připravena za použití 2-chlor-6-(pentylamino)-9-cyklopentylpurinu, přičemž se postupovalo v podstatě stejným způsobem jako v příkladu 1, Schéma A, stupeň (c).

-41 CZ 291604 B6

CIMS (NH₃) 386 (W); R_f (min) = 3,52.

Příklad 27

Dihydrochlorid2-[trans-(4-aminocyklohexyl)amino]-6-[(4-chlorbenzyl)amino]-9-cyklopentylpurinu.

Schéma A, stupeň (b):

2-chlor-6-[(4-chlorbenzyl)amino]-9-cyklopentylpurin.

Podle tohoto postupu byla uvedená sloučenina, 2-chlor-6-[(4-chlorbenzyl)amino]-9-cyklopentylpurin, připravena za použití 2,6-dichlor-9-cyklopentylpurinu, 4-chlorbenzylaminu a triethylaminu, přičemž se postupovalo v podstatě stejným způsobem jako v příkladu 1, Schéma A, stupeň (b).

Schéma A, stupeň (c):

Dihydrochlorid 2-[trans-(4-aminocyklohexy)amino]-6-[(4-chlorbenzyl)amino]-9-cyklopentylpurinu.

Podle tohoto postupu byla výše uvedená sloučenina, dihydrochlorid 2-[trans-(4-aminocyklohexyl)amino]-6-[(4-chlorbenzyl)amino]-9-cyklopentylpurinu, přičemž se postupovalo v podstatě stejným způsobem jako v příkladu 1, Schéma A, stupeň (c).

CIMS (NH₃) 440 (MET); Rf (min) = 2,29:

Příklad 28

Dihydrochlorid 2-[trans-(4-aminocyklohexyl)amino]-6-(methylamino)-9-cyklopentylpurinu.

Schéma A, stupeň (b):

2-chlor-6-(methylamino)-9-cyklopentylpurin.

Podle tohoto postupu byla výše uvedená sloučenina, 2-chlor-6-(methyIamino)-9-cyklopentylpurin, připravena za použití 2,6-dichlor-9-cyklopentylpurinu, hydrochloridu methylaminu a triethylaminu, přičemž se postupovalo v podstatě stejným způsobem jako v příkladu 1, Schéma A, stupeň (b).

Schéma A, stupeň (c):

Dihydrochlorid 2-[trans-(4—aminocyklohexyl)amino]-6-(methylamino)-9-cyklopentylpurinu.

Podle tohoto provedení byla výše uvedená sloučenina, dihydrochlorid 2-[trans-(4-aminocyklohexyl)amino]-6-(methylamino)-9-cyklopentylpurinu, připravena za použití 2-chlor-6-(methylamino)-9-cyklopentylpurinu, přičemž se postupovalo v podstatě stejným způsobem jako v příkladu 1, Schéma A, stupeň (c).

CIMS (NH₃) 330 (MET); Rf (min) = 3,15.

-42CZ 291604 B6

Příklad 29

Dihydrochlorid 2-[trans-(4-aminocyklohexyl)amino]-9-[(3-chlorbenzyl)amino]-9-cyklopentylpurinu.

Schéma A, stupeň (b):

2-chlor-6-[(3-chlorben2yl)amino]-9-cyklopentyIpurin.

Podle tohoto postupu byla požadovaná sloučenina, 2-chlor-6-[(3-chlorbenzyl)amino]-9-cyklopentylpurin, připravena za použití 2,6-dichlor-9-cyklopentylpurinu, 3-chlorbenzylaminu a triethylaminu, přičemž se postupovalo v podstatě stejným způsobem jako v příkladu 1, Schéma A, stupeň (b).

Schéma A, stupeň (c):

Dihydrochlorid 2-[trans-(4-aminocyklohexyl)ammo]-6-[(3-chlorbenzyl)amino]-9-cyklopentylpurinu.

Podle tohoto postupu byla požadovaná sloučenina, dihydrochlorid 2-[trans-(4-aminocyklohexyl)amino]-6-[(3-chlorbenzyl)amino]-9-cyklopentylpurinu, připravena za použití 2-chlor-6[(3-chlorbenzyl)amino]-9-cyklopentylpurinu, přičemž se postupovalo v podstatě stejným způsobem jako v příkladu 1, Schéma A, stupeň (c).

CIMS (NH₃) 440 (MlT); R_f (min) = 2,30.

Příklad 30

Dihydrochlorid 2-[trans-(4-aminocyklohexyl)amino]-6-[(2-tetrahydropyranyl)methylamino]9-cyklopentylpurinu.

Schéma A, stupeň (b):

2-chlor-6-[(2-tetrahydropyranyl)methylamino]-9-cyklo-pentylpurin.

Podle tohoto postupu byla požadovaná sloučenina, 2-chlor-6-[(2-tetrahydropyranyl)methylamino]-9-cyklo-pentylpurin, připravena za použití 2,6-dichlor-9-cyklopentylpurinu, 2-aminomethyltetrahydropyranu a triethylaminu, přičemž se postupovalo v podstatě stejným způsobem jako v příkladu 1, Schéma A, stupeň (b).

Schéma A, stupeň (c):

Dihydrochlorid 2-[trans-(4-ammocyklohexyl)amÍno]-6-[(2-tetrahydropyranyl)methylamino]9-cyklopentylpurinu.

Podle tohoto postupu byla požadovaná sloučenina, dihydrochlorid 2-[trans-(4-aminocyklohexyl)amino]-6-[(2-tetrahydropyranyl)methylamino]-9-cyklopentylpurinu, připravena za použití 2-chlor-6-[(2-tetrahydropyranyl)-methylaminu]-9-cyklopentylpurinu, přičemž se postupovalo v podstatě stejným způsobem jako v příkladu 1, Schéma A, stupeň (c):

CIMS (NH₃) 414 (MEf); R_f (min) = 3,39.

-43CZ 291604 B6

Příklad 31

Dihydrochlorid 2-[trans-(4—aminocyklohexyl)amino]-6-[(4-pyridyl)-2-ethylamino]-9-cyklopentylpurinu.

Schéma A, stupeň (b):

2-chlor-6-[(4-pyridyl)-2-ethylamino]-9-cyklopentylpurin

Podle tohoto postupu byla požadovaná sloučenina, 2-chlor-6-[(4-pyridyl)-2-ethylamino]-9cyklopentylpurin, připravena za použití 2,6-dichlor-9-cyklopentylpurinu, 4-(ethylamino)purinu a triethylaminu, přičemž se postupovalo v podstatě stejným způsobem jako v příkladu 1, Schéma A, stupeň (b).

Schéma A, stupeň (c):

Dihydrochlorid 2-[trans-(4-aminocyklohexyl)amino]-6-[(4-pyridyl)-2-ethylamino]-9-cyklopentylpurinu.

Podle tohoto provedení byla výše uvedená sloučenina, dihydrochlorid 2-[trans-(4-aminocyklohexyl)amino]-6-[(4-pyridyl)-2-ethylamino]-9-cyklopentylpurinu, připravena za použití 2-chlor-6-[(4—pyridyl)-2-ethylamino]-9-cyklopentylpurinu, přičemž se postupovalo v podstatě stejným způsobem jako v příkladu 1, Schéma A, stupeň (c).

CIMS (NH₃) 421 (MÍT); Rf (min) = 3,13.

Příklad 32

Dihydrochlorid 2-[trans-(4—aminocyklohexyl)amino]-6-[(cyklopentyl)methylamino]-9-(2propyl)purinu.

Schéma A, stupeň (b):

2-chlor-6-[(cyklopropyl)methylamino]-9-(2-propyl)purin.

Podle tohoto postupu byla výše uvedená sloučenina, 2-chlor-6-[(cyklopropyl)methylamino]-9(2-propyl)purin, připravena za použití 2,6-dichlor-9-(2-propyl)purmu, cyklopropylmethylaminu a triethylaminu, přičemž se postupovalo v podstatě stejným způsobme jako v příkladu 1, Schéma A, stupeň (b).

Schéma A, stupeň (c):

Dihydrochlorid 2-[trans-(4-aminocyklohexyl)amino]-6-[(cyklopropyl)methylamino]-9-(2propyl)purinu.

Podle tohoto postupu byla požadovaná sloučenina, dihydrochlorid 2-[trans-(4—aminocyklohexyl)amino]-6-[(cyklopropyl)methylamino]-9-(2-propyl)purinu, připravena za použití 2-chlor-6-[(cyklopropyl)methylamino]-9-(2-propyl)purinu, přičemž se postupovalo v podstatě stejným způsobem jako v příkladu 1, Schéma A, stupeň (c).

CIMS (NH₃) 344 (M1T); R_f (min) = 3,25.

-44CZ 291604 B6

Příklad 33

Dihydrochlorid 2-[trans-(4-aminocyklohexy)amino]-6-(ethylamino)-9-cyklopentylpurinu.

Schéma A, stupeň (b):

2-chlor-6-(ethylamino)-9-cyklopentylpurin.

Podle tohoto postupu byla uvedená sloučenina, 2-chlor-6-(ethylamino)-9-cyklopentylpurin, připravena za použití 2,6-dichlor-9-cyklopentylpurinu, hydrochloridu ethylaminu a triethylaminu, přičemž se postupovalo v podstatě stejným způsobem jako v příkladu 1, Schéma A, stupeň (b).

Schéma A, stupeň (c):

Dihydrochlorid 2-[trans-(4-aminocyklohexyl)amino]-6-(ethylamino)-9-cyklopentylpurinu.

Podle tohoto postupu byla požadovaná sloučenina, dihydrochlorid 2-[trans-(4-aminocyklohexyl)amino]-6-(ethylammo)-9-cyklopentylpurinu, připravena za použití 2-chlor-6-(ethylamino)-9-cyklopentylpurinu, přičemž se postupovalo v podstatě stejným způsobme jako v příkladu 1, Schéma A, stupeň (c).

CIMS (NH₃) 472 (MlT); R_f (min) = 3,46.

Příklad 34

Dihydrochlorid 2-[trans-(4-aminocyklohexyl)amino]-6-[(cyklopropyl)methylamino]-9-cyklopentylpurinu.

Schéma A, stupeň (b):

2-chlor-6-[(cyklopropyl)methylamino]-9-cyklopentylpurin.

Podle tohoto postupu byla výše uvedená sloučenina, 2-chlor-6-[(cyklopropyl)methylamino]-9cyklopentylpurin, připravena za použití 2,6-dichlor-9-cyklopentylpurinu, aminomethylcyklopropanu a triethylaminu, přičemž se postupovalo v podstatě stejným způsobem jako v příkladu 1, Schéma A, stupeň (b).

Schéma A, stupeň (c):

Podle tohoto postupu byla požadovaná sloučenina, dihydrochlorid 2-[trans-(4-aminocyklohexyl)amino]-6-[(cyklopropyl)methylamino]-9-cyklopentylpurinu, připravena za použití 2chlor-6-[(cyklopropyl)methylamino]-9-cyklopentylpurinu, přičemž se postupovalo v podstatě stejným způsobem jako v příkladu 1, Schéma A, stupeň (c).

CIMS (NH₃) 370 (MH*·); R_f (min) = 2,21.

-45CZ 291604 B6

Příklad 35

Dihydrochlorid 2-[trans-(4-aminocyklohexyl)amino]-6-[2-fenethylhydrazino]-9-cyklopentylpurinu.

Schéma A, stupeň (b):

2-chlor-6-[2-fenethylhydrazino]-9-cyklopentylpurin.

Podle tohoto postupu byla uvedená sloučenina, 2-chlor-6-[2-fenethylhydrazino]-9-cyklopentylpurin, připravena za použití 2,6-dichlor-9-cyklopentylpurinu, 2-fenylethylhydrazinu a triethylaminu, přičemž se postupovalo v podstatě stejným způsobem jako v příkladu 1, Schéma A, stupeň (b).

Schéma A, stupeň (c):

Podle tohoto postupu byla uvedená sloučenina, dihydrochlorid 2-[trans-(4-aminocyklohexyl)amino]-6-[2-fenethylhydrazino]-9-cyklopentylpurinu, připravena za použití 2-chlor-6-[2fenethylhydrazino]-9-cyklopentylpurinu, přičemž se postupovalo v podstatě stejným způsobem jako v příkladu 1, Schéma A, stupeň (c).

CIMS (NH₃) 435 (MIT); R_f (min) = 3,54.

Příklad 36

Dihydrochorid2-[trans-(4-aminocyklohexyl)amino]-6-[(3-methylbutyl)amino]-9-cyklopentylpurinu.

Schéma A, stupeň (b):

2-chlor-6-[(3-methylbutyl)amino]-9-cyklopentylpurin.

Podle tohoto postupu byla požadovaná sloučenina, 2-chlor-6-[(3-methylbutyl)amino]-9-cyklopentylpurin, připravena za použití 2,6-dichlor-9-cyklopentylpurinu, 3-methylbutylaminu a triethylaminu, přičemž se postupovalo v podstatě stejným způsobem jako v příkladu 1, Schéma A, stupeň (b).

Schéma A, stupeň (c):

Dihydrochlorid 2-[trans-(4-aminocykiohexyl)amino]-6-[(3-methylbutyl)amino]-9-cyklopentylpurinu.

Podle tohoto postupu byla tato požadovaná sloučenina, dihydrochlorid 2-[trans-(4-aminocyklohexyl)amino]-6-[(3-methylbutyl)amino]-9-cyklopentylpurinu, připravena za použití 2chlor-6-[(3-methylbutyl)amino]-9-cyklopentylpurinu, přičemž se postupovalo v podstatě stejným způsobem jako v příkladu 1, Schéma A, stupeň (c).

CIMS (NH₃) 386 (MlT); Rf (min) 3,53.

-46CZ 291604 B6

Příklad 37

Dihydrochlorid 2-[trans-(4-aminocyklohexyl)amino]-6-[(butyl)amino]-9-(2-propyl)purinu.

Schéma A, stupeň (b):

2-chlor-6-[(butyl)amino]-9-(2-propyl)purin.

Podle tohoto postupu byla požadovaná sloučenina, 2-chlor-6-[(butyl)amino]-9-(2-propyl)purin, io připravena za použití 2,6-dichlor-9-(2-propyl)purinu, butylaminu a triethylaminu, přičemž se postupovalo v podstatě stejným způsobem jako v příkladu 1, Schéma A, stupeň (b).

Schéma A, stupeň (c):

Podle tohoto postupu byla požadovaná sloučenina, dihydrochlorid 2-[trans-(4-aminocyklohexyl)amino]-6-[(butyl)amino]-9-(2-propyl)purinu, připravena za použití 2-chlor-6-[(butyl)amino]-9-(2-propyl)purinu, přičemž se postupovalo v podstatě stejným způsobem jako 20 v příkladu 1, Schéma A, stupeň (c).

CIMS (NH₃) 346 (MřU); Rf (min) = 3,33.

Příklad 38

Dihydrochlorid 2-[trans-(4-aminocyklohexyl)amino]-6-(2-furanmethylamino)-9-cyklopentylpurinu.

Schéma A, stupeň (b):

2-chlor-6-(2-furanmethylamino)-9-cyklopentylpurin.

Podle tohoto postupu byla požadovaná sloučenina, 2-chlor-6-(2-furanmethylamino)-9-cyklo35 pentylpurin, připravena za použití 2,6-dichlor-9-cyklopentylpurinu, furfurylaminu a triethylaminu, přičemž se postupovalo v podstatě stejným způsobem jako v příkladu 1, Schéma A, stupeň (b).

Schéma A, stupeň (c):

Dihydrochlorid 2-[trans-(4-ammocyklohexyl)ammo]-6-(2-furanmethylamino)-9-cyklopentylpurinu.

Podle tohoto postupu byla požadovaná sloučenina, dihydrochlorid 2-[trans-(4-amino45 cyklohexyl)amino]-6-(2-furanmethylamino)-9-cyklopentylpurinu, připravena za použití 2-chlor-6-(2-furanmethylamino)-9-cyklopentylpurinu, přičemž se postupovalo v podstatě stejným způsobem jako v příkladu 1, Schéma A, stupeň (c).

CIMS (NH₃) 396 (MH*); Rf (min) = 3,38.

-47CZ 291604 B6

Příklad 39

Trihydrochlorid 2-[trans-(4—aminocyklohexyl)amino]-6-[(3-(2-imidazoyl)propyl)amino]-9(2-propyl)purinu

Schéma A, stupeň (b):

2-chlor-6-[(3-(2-imidazoyl)propyl)amino]-9-(2-propyl)purin

Podle tohoto postupu byla požadovaná sloučenina, 2-chlor-6-[3-(2-imidazoyl)propyl)amino]9-(2-propyl)purin, připravena za použití 2,6-dichlor-9-(2-propyl)purinu, 3-(2-imidazoyl)propylaminu a triethylaminu, přičemž se postupovalo v podstatě stejným způsobem jako v příkladu 1, Schéma A, stupeň (b).

Schéma A, stupeň (c):

Trihydrochlorid 2-[trans-(4-aminocyklohexyl)amino]-6-[(3-(2-imidazoyl)propyl)amino]-9(2-propyl)purinu.

Při provádění tohoto postupu byla požadovaná sloučenina, trihydrochlorid 2-[trans-(4-aminocyklohexyl)-amino]-6-[(3-(2-imidazoyl)propyl)amino]-9-(2-propyl)-purinu, připravena za použití 2-chlor-6-[(3-(2-imidazoly)-propyl)amino]-9-(2-propyl)purinu, přičemž se postupovalo v podstatě stejným způsobem jako v příkladu 1, Schéma A, stupeň (c).

CIMS (NH₃) 398 (MH*); R_f (min) = 3,01.

Příklad 40

Dihydrochlorid 2-[trans-(4-ammocyklohexyl)amino]-6-[(4-chlor-2-fluorbenzyl)amino]-9cyklopentylpurinu

Schéma A, stupeň (b):

2-chlor-6-[(4-chlor-2-fluorbenzyl)amino]-9-cyklopentyl-purin.

Podle tohoto postupu byla požadovaná sloučenina, 2-chlor-6-[(4-chlor-2-fluorbenzyl)aminoJ9-cyklopentyl-purin, připravena za použití 2,6-dichlor-9-cyklopentylpurinu, 4-chlor-2-fluorbenzylaminu a triethylaminu, přičemž se postupovalo v podstatě stejným způsobem jako v příkladu 1, Schéma A, stupeň (b).

Schéma A, stupeň (c):

Dihydrochlorid 2-[trans-(4-ammocyklohexyl)amino]-6-[(4-chlor-2-fluorbenzyl)amino]-9cyklopentylpurinu.

Při provádění tohoto postupu byla požadovaná sloučenina, dihydrochlorid 2-[trans-(4—aminocyklohexyl)-amino]-6-[(4-chlor-2-fluorbenzyl)amino]-9-cykIopentyl-purinu, připravena za použití 2-chlor-6-[(4-chlor-2-fluorbenzyl)amino]-9-cyklopentylpurinu, přičemž se postupovalo v podstatě stejným způsobem jako v příkladu 1, Schéma A, stupeň (c).

CIMS (NH₃) 458 (MH⁺); R_f (min) = 2,31.

-48CZ 291604 B6

Příklad 41

Dihydrochlorid 2-[trans-(4-aminocyklohexyl)amino]-6-(hexylamino)-9-cyklopentylpurinu.

Schéma A, stupeň (b):

2-chlor-6-(hexylamiiio)-9-cyklopentylpurin.

Podle tohoto postupu byla požadovaná sloučenina, 2-chlor-6-(hexylamino)-9-cyklopentylpurin, připravena za použití 2,6-dichlor-9-cyklopentylpurinu, n-hexylaminu a triethylaminu, přičemž se postupovalo v podstatě stejným způsobem jako v příkladu 1, Schéma A, stupeň (b).

Stupeň A, stupeň (c):

Podle tohoto postupu byla uvedená sloučenina, dihydrochlorid 2-[trans-(4—ammocyklohexyl)amino]-6-(hexylamino)-9-cyklopentylpurinu, připravena za použití 2-chlor-6-(hexylamino)-9-cyklopentylpurinu, přičemž se postupovalo v podstatě stejným způsobem jako v příkladu 1, Schéma A, stupeň (c).

CIMS (NH₃) 400 (MH⁴); R_f (min) = 4,03.

Příklad 42

Dihydrochlorid 2-[trans-(4-aminocyklohexyl)amino]-6-[(2-fluorbenzyl)amino]-9-cyklopentylpurinu.

Schéma A, stupeň (b):

2-chlor-6-[(2-fluorbenzyl)amino]-9-cyklopentylpurin.

Při provádění tohoto postupu byla uvedená sloučenina, 2-chlor-6-[(2-fluorbenzyl)amino]-9cyklopentylpurin, připravena za použití 2,6-dichlor-9-cyklopentylpurinu, 2-fluorbenzylaminu a triethylaminu, přičemž se postupovalo v podstatě stejným způsobem jako v příkladu 1, Schéma A, stupeň (b).

Schéma A, stupeň (c):

Dihydrochlorid 2-[trans-(4-aminocykIohexyl)amino]-6-[(2-fluorbenzyl)amino]-9-cyklopentylpurinu

Při provádění tohoto postupu byla uvedená sloučenina, dihydrochlorid 2-[trans-(4-aminocyklohexyl)amino]-6-[(2-fluorbenzyl)amino]-9-cyklopentylpurinu, připravena za použití 2-chlor-6-[(2-fluorbenzyl)amino]-9-cyklopentylpurinu, přičemž se postupovalo v podstatě stejným způsobem jako v příkladu 1, Schéma A, stupeň (c).

CIMS (NH₃) 424 (ΜΗ⁴); R_f (min) = 2,22.

-49CZ 291604 B6

Příklad 43

Dihydrochlorid 2-[trans-(4-aminocyklohexyl)amino]-6-[2-(fenyl)ethylamino]-9-cyklopentylpurinu.

Schéma A, stupeň (b):

2-chlor-6-[2-(fenyl)ethylamino]-9~cyklopentylpurin.

Podle tohoto postupu byla tato sloučenina, 2-chlor-6-[2-(fenyl)ethylamino]-9-cyklopentylpurin, připravena za použití 2,6-dichlor-9-cyklopentylpurinu, 2-aminoethylbenzenu a triethylaminu, přičemž se postupovalo v podstatě stejným způsobem jako v příkladu 1, Schéma A stupeň (b).

Schéma A, stupeň (c):

Dihydrochlorid 2-[trans-(4-aminocyklohexyl)amino]-6-[2-(fenyl)ethylammo]-9-cykIopentylpurinu.

Při provádění tohoto postupu byla uvedená sloučenina, dihydrochlorid 2-[trans-(4-aminocyklohexyl)amino]-6-[2-(fenyl)ethylamino]-9-cyklopentylpurinu, připravena za použití 2chlor-6-[2-(fenyl)ethylamino]-9-cyklopentyl-purinu, přičemž se postupovalo v podstatě stejným způsobem jako v příkladu 1, Schéma A, stupeň (c):

CIMS (NH₃) 420 (MH'); R_f (min) = 0,43.

Příklad 44

Dihydrochlorid 2-[trans-(4-aminocyklohexyl)amino]-6-(propylamino)-9-cyklopentylpurinu.

Schéma A, stupeň (b):

2-chlor-6-(propylamino)-9-cyklopentylpurin.

Při provádění tohoto postupu byla uvedená sloučenina, 2-chlor-6-(propylamino)-9-cyklopentylpurin, připravena za použití 2,6-dichlor-9-cyklopentylpurinu, n-propylaminu a triethylaminu, přičemž se postupovalo v podstatě stejným způsobem jako v příkladu 1, Schéma A, stupeň (b).

Schéma A, stupeň (c):

Podle tohoto postupu byla uvedená sloučenina, dihydrochlorid 2-[trans-(4-aminocyklohexyl)amino]-6-(propylamino)-9-cyklopentylpurinu, připravena za použití 2-chlor-6-(propylamino)-9-cyklopentylpurinu, přičemž se postupovalo v podstatě stejným způsobem jako v příkladu 1, Schéma A, stupeň (c).

CIMS (NHj) 358 (ΜΗ^1-); R_f (min) = 3,31.

-50CZ 291604 B6

Příklad 45

Trihydrochlorid2-[trans-(4-aminocyklohexyl)amino]-6-(benzylamino)-9-(2-propyl)purinu.

Schéma A, stupeň (b):

2-chlor-6-(benzylamino)-9-(2-propyl)purin.

Při tomto postupu byla uvedena sloučenina, 2-chlor-6-(benzylamino)-9-(2-propyl)purin, připravena za použití 2,6-dichlor-9-(2-propyl)purinu, benzylaminu a triethylaminu, přičemž se postupovalo v podstatě stejným způsobem jako v příkladu 1, Schéma A, stupeň (b).

Schéma A, stupeň (c):

Dihydrochlorid 2-[trans-(4-aminocyklohexyl)amino]-6-(benzylamino)-9-(2-propyl)purinu.

Podle tohoto postupu byla uvedená sloučenina, dihydrochlorid 2-[trans-(4-aminocyklohexyl)amino]-6-(benzylamino)-9-(2-propyI)purinu, připravena za použití 2-chlor-6-(benzylamino)-9-(2-propyl)purinu, přičemž se postupovalo v podstatě stejným způsobem jako v příkladu 1, Schéma A, stupeň (c).

CIMS (NH₃) 380 (MlT); Rf (min) = 3,34.

Příklad 46

Dihydrochlorid 2-[trans-(4-aminocyklohexyl)amino]-6-[3-(imidazolyl)propylamino]-9-cyklopentylpurinu

Schéma A, stupeň (b):

2-chlor-6-[3-(l-imidazolyl)propylamino]-9-cyklopentylpurin.

Podle tohoto postupu byla požadovaná sloučenina, 2-chlor-6-[3-(l-imidazolyl)propylamino]9-cyklopentylpurin, připravena za použití 2,6-dichlor-9-cyklopentylpurinu, l-(3-aminopropyl)imidazolu a triethylaminu, přičemž se postupovalo v podstatě stejným způsobem jako v příkladu 1, Schéma A, stupeň (b).

Schéma A, stupeň (c):

Dihydrochlorid 2-[trans-(4—aminocyklohexyl)amino]-6-[3-( 1 -imidazolyl)propylamino]-9cyklopentylpurinu

Při tomto postupu byla požadovaná sloučenina dihydrochlorid 2-[trans-(4-aminocyklohexyl)amino]-6-[3-(l-imidazolyl)propylamino]-9-cyklopentylpurinu, připravena za použití 2-chlor-6-[3-(l-imidazolyl)-propylamino]-9-cyklopentylpurinu, přičemž se postupovalo v podstatě stejným způsobem jako v příkladu 1, Schéma A, stupeň (c):

CIMS (NH₃) 424 (MřT); R_f(min) = 3,13.

-51 CZ 291604 B6

Příklad 47

Dihydrochlorid 2-[trans-(4—aminocyklohexyl)amino]-6-[benzyIamino]-9-cyklopentylpurinu. Schéma A, stupeň (b):

2-chlor-6-[ben2ylamino]-9-cyklopentylpurin.

Při provádění tohoto postupu byla uvedená sloučenina, 2-chlor-6-[benzylamino]-9-cyklopentylpurin, připravena za použití 2,6-dichlor-9-cyklopentylpurinu, benzylaminu a triethylaminu, přičemž se postupovalo v podstatě stejným způsobem jako v příkladu 1, Schéma A, stupeň (b).

Schéma A, stupeň (c):

Dihydrochlorid 2-[trans-(4-aminocyklohexyl)amino]-6-[benzylamino]-9-cyklopentylpurinu.

Podle tohoto postupu byla uvedená sloučenina, dihydrochlorid 2-[trans-(4—aminocyklohexyl)amino]-6-[benzylamino]-9-cyklopentylpurinu, připravena za použití 2-chlor-6-[benzylamino]-9-cyklopentylpurinu, přičemž se postupovalo v podstatě stejným způsobem jako v příkladu 1, Schéma A, stupeň (c).

CIMS (NHj) 406 (ΜΗ*); R_f (min) = 2,23.

Příklad 48

Dihydrochlorid 2-[trans-(4-aminocyklohexyl)amino]-6-[(2,4-dichlorbenzyl)amino]-9-cyklopentylpurinu.

Schéma A, stupeň (b):

2-chlor-6-[(2,4-dichlorbenzyl)amino]-9-cyklopentylpurin.

Podle tohoto postupu byla požadována sloučenina, 2-chlor-6-[(2,4-dichlorbenzyl)amino]-9cyklopentylpurin, připravena za použití 2,6-dichlor-9-cyklopentylpurinu, 2,4-dichlorbenzylaminu a triethylaminu, přičemž se postupovalo v podstatě stejným způsobem jako v příkladu 1, Schéma A, stupeň (b).

Schéma A, stupeň (c):

Dihydrochlorid 2-[trans-{4-ammocyklohexyl)ammo]-6-[(2,4-dichlorbenzyl)amino]-9-cyklopentylpurinu

Při provádění tohoto postupu byla uvedená sloučenina, dihydrochlorid 2-[trans-(4-aminocyklohexyl)amino]-6-[(2,4-dichlorbenzyl)amino]-9-cyklopentylpurinu, připravena za použití 2-chlor-6-[(2,4-dichlorbenzyl)amino]-9-cyklopentylpurinu, přičemž se postupovalo v podstatě stejným způsobem jako v příkladu 1, Schéma A, stupeň (c).

CIMS (NH₃) 474 (MH‘); R_f (min) = 2,34.

-52CZ 291604 B6

Příklad 49

Dihydrochlorid 2-[trans-(4-aminocyklohexyl)amino]-6-[2,2,2-trifluorethylamino]-9-cyklopentylpurinu.

Schéma A, stupeň (b):

2-chIor-6-[2,2,2-trifluorethylamino]-9-cyklopentylpurin.

Podle tohoto postupu byla požadovaná sloučenina, 2-chlor-6-[2,2,2-trifluorethylamino]-9cyklopentylpurin, připravena za použití 2,6-dichlor-9-cykIopentylpurin, připravena za použití 2,6-dichlor-9-cyklopentylpurinu, hydrochloridu 2,2,2-trifluorethylaminu a triethylaminu, přičemž se postupovalo v podstatě stejným způsobem jako v příkladu 1, Schéma A, stupeň (b).

Schéma A, stupeň (c):

Podle tohoto postupu byla požadovaná sloučenina, dihydrochlorid 2-[trans-(4-aminocyklohexyl)amino]-6-[2,2,2-trifluorethylamino]-9-cyklopentylpurinu, připravena za použití 2-chlor-6-[2,2,2-trifluorethylamino]-9-cyklopentylpurinu, přičemž se postupovalo v podstatě stejným způsobem jako v příkladu 1, Schéma A, stupeň (c).

CIMS (NH₃) 398 (MH⁴); R_f (min) = 3,33.

Příklad 50

Dihydrochlorid 2-[trans-(4-aminocyklohexyl)ammo]-6-[(4-fluorbenzyl)amino]-9-cyklopentylpurinu.

Schéma A, stupeň (b):

2-chlor-6-[(4-fluorbenzyl)amino]-9-cyklopentylpurin.

Podle tohoto postupu byla požadovaná sloučenina, 2-chlor-6-[(4-fluorbenzyl)amino]-9-cyklopentylpurin, připravena za použití 2,6-dichlor-9-cyklopentylpurinu, 4-fluorbenzylaminu a triethylaminu, přičemž se postupovalo v podstatě stejným způsobem jako v příkladu 1, Schéma A, stupeň (b).

Schéma A, stupeň (c):

Dihydrochlorid 2-[trans-(4-aminocyklohexyl)amino]-6-[(4-fluorbenzyl)amino]-9—cyklopentylpurinu.

Při provádění tohoto postupu byla uvedená sloučenina, dihydrochlorid 2-[trans-(4-aminocyklohexyl)amino]-6-[(4-fluorbenzyl)amino]-9-cyklopentylpurinu, připravena za použití 2-chlor-6[(4-fluorbenzyl)amino]-9-cyklopentyl-purinu, přičemž se postupovalo v podstatě stejným způsobem jako v příkladu 1, Schéma A, stupeň (c).

CIMS (NH₃) 424 (MH*); R_f (min) = 2,24.

-53CZ 291604 B6

Příklad 51

Dihydrochlorid 2-[trans-(4-aminocyklohexyl)amino]-6-[(3-jodbenzyl)amino]-9-(2-propyl)purinu.

Schéma A, stupeň (b):

2-chlor-6-[(3-jodbenzyl)amino]-9-(2-propyl)purin.

Podle tohoto postupu byla požadovaná sloučenina 2-chlor-6-[(3-jodbenzyl)amino]-9-cyklopentylpurinu, 3-jodbenzylaminu a triethylaminu, přičemž se postupovalo v podstatě stejným způsobem jako v příkladu 1, Schéma A, stupeň (b).

Schéma A, stupeň (c):

Podle tohoto postupu byla požadovaná sloučenina, dihydrochlorid 2-[trans-(4-aminocyklohexyl)amino]-6-[(3-jodbenzyl)amino]-9-(2-propyl)purinu, připravena za použití 2-chlor-6[(3-jodbenzyl)amino]-9-(2-propyl)purinu, přičemž se postupovalo v podstatě stejným způsobem jako v příkladu 1, Schéma A, stupeň (c).

CIMS (NH₃) 506 (MH⁺); R_f(min) = 3,53.

Příklad 52

Dihydrochlorid 2-[trans-(4-aminocyklohexyl)amino]-6-[2,2,2-trifluorethylhydrazino]-9cyklopentylpurinu.

Schéma A, stupeň (b):

2-chlor-6-[2,2,2-trifluorethylhydrazino]-9-cyklo-pentylpurin.

Při provádění tohoto postupu byla uvedená sloučenina, 2-chlor-6-[2,2,2-trifluorethylhydrazino]-9-cyklo-pentylpurin, připravena za použití 2,6-dichlor-9-cyklopentylpurinu, 2,2,2-trifluorethylhydrazinu a triethylaminu, přičemž se postupovalo v podstatě stejným způsobem jako v příkladu 1, Schéma A, stupeň (b).

Schéma A, stupeň (c):

Dihydrochlorid 2-[trans-(4-ammocyklohexyl)amino]-6-[2,2,2-trifluorethylhydrazino]-9cykiopentylpurinu.

Podle tohoto postupu byla uvedená sloučenina, dihydrochlorid 2-[trans-(4-aminocyklohexyl)amino]-6-[2,2,2-trifluorethylhydrazino]-9-cyklopentylpurinu, připravena za použití 2-chlor-6[2,2,2-trifluorethyl-hydrazino]-9--cyklopentylpurinu, přičemž se postupovalo v podstatě stejným způsobem jako v příkladu 1, Schéma A, stupeň (c):

CIMS (NH₃) 413 (ΜΗ*); R_f (min) = 3,28

-54CZ 291604 B6

Příklad 53

Dihydrochlorid 2-[trans-(4-aminocyklohexyl)amino]-6-[(3-hydroxypropyl)amino]-9-cyklopentylpurinu.

Schéma A, stupeň 0?):

2-chlor-6-[(3-hydroxypropyl)amino]-9-cyklopentylpurin.

Podle tohoto postupu byla uvedená sloučenina, 2-chlor-6-[(3-hydroxypropyl)amino]-9-cyklopentylpurin, připravena za použití 2,6-dichlor-9-cyklopentylpurinu, 3-amino-l-propanolu a triethylaminu, přičemž se postupovalo v podstatě stejným způsobem jako v příkladu 1, Schéma A, stupeň (b).

Schéma A, stupeň (c):

Dihydrochlorid 2-[trans-(4-aminocyklohexyl)amino]-6-[(3-hydroxypropyl)amino]-9-cyklopentylpurinu

Podle tohoto postupu byla uvedená sloučenina, dihydrochlorid 2-[trans-(4—aminocyklohexyl)amino]-6-[(3-hydroxypropyl)amino]-9-cyklopentylpurinu, připravena za použití 2-chlor-6[(3-hydroxypropyl)amino]-9-cyklopentylpurinu, přičemž se postupovalo v podstatě stejným způsobem jako v příkladu 1, Schéma A, stupeň (c).

CIMS (NH₃) 374 (MH⁴); Rj (min) = 3,17.

Příklad 54

Dihydrochlorid 2-[trans-(4—aminocyklohexyl)amino]-6-[(5-hydroxy-l,5-dimethylhexyl)amino]-9-cyklopentyl-purinu.

Schéma A, stupeň (b):

2-chlor-6-[(5-hydroxy-l,5-dimethylhexyl)amino]-9-cyklopentylpurin.

Při provádění postupu podle tohoto provedení, byla požadovaná sloučenina, 2-chlor-6-[(5hydroxy-l,5-dimethylhexyl)amino]-9-cyklopentylpurin, připravena za použití 2,6-dichlor-9cyklopentylpurinu, hydrochloridu 6-amino-2-methyl-2-heptanolu a triethylaminu, přičemž se postupovalo v podstatě stejným způsobem jako v příkladu 1, Schéma A, stupeň (b).

Schéma A, stupeň (c):

Podle tohoto postupu byla požadovaná sloučenina, dihydrochlorid 2-[trans-(4-aminocyklohexyl)amino]-6-[(5-hydroxy-l ,5-dimethylhexyl)amino]-9-cyklopentyl-purinu, připravena za použití 2-chlor-6-[(5-hydroxy-l,5-dimethylhexyl)amino]-9-cyklopentylpurinu, přičemž se postupovalo v podstatě stejným způsobem jako v příkladu 1, Schéma A, stupeň (c).

CIMS (NH₃) 444 (ΜΙΓ); R_f (min) = 3,37.

-55 CZ 291604 B6

Příklad 55

Dihydrochorid2-[trans-(4-aminocyklohexyl)amino]-6-[(4-hydroxyfenyl)ethylamino]-9-cyklopentylpurinu

Schéma A, stupeň (b):

2-chlor-6-[(4-hydroxyfenyl)ethylamino]-9-cyklopentylpurin.

Podle tohoto postupu byla uvedená sloučenina, 2-chlor-6-[(4-hydroxyfenyl)ethylamino]-9cyklopentylpurin, připravena za použití 2,6-dichlor-9-cyklopentylpurinu, hydrochloridu tyraminu a triethylaminu, přičemž se postupovalo v podstatě stejným způsobme jako v příkladu 1, Schéma A, stupeň (b).

Schéma A, stupeň (c):

Dihydrochlorid 2-[trans-(4-aminocyklohexyl)amino]-6-[(4-hydroxyfenyl)ethylamino]-9cyklopentylpurinu

Podle tohoto postupu byla požadovaná sloučenina, dihydrochlorid 2-[trans-(4-aminocyklohexyl)amino]-6-[(4-hydroxyfenyl)ethylamino]-9-cyklopentylpurinu, připravena za použití 2-chlor-6-[(4—hydroxyfenyl)-ethylamino]-9-cyklopentylpurinu, přičemž se postupovalo v podstatě stejným způsobem jako v příkladu 1, Schéma A, stupeň (c).

CIMS (NH₃) 436 (ΜΗ*); R_f (min) = 3,38.

Příklad 56

Dihydrochlorid 2-[trans-(4-aminocyklohexyl)amino]-6-[(8-aminooktyl)amino]-9-cyklopentylpurinu.

Schéma A, stupeň (b):

2-chlor-6-[(8-aminooktyl)amino]-9-cyklopentylpurin.

Podle tohoto postupu byla uvedená sloučenina, 2-chlor-6-[(8-aminooktyl)amino]-9-cyklopentylpurin, připravena za použití 2,6-dichlor-9-cyklopentylpurinu, 1,8-diaminooktanu a triethylaminu, přičemž se postupovalo v podstatě stejným způsobem jako v příkladu 1, Schéma A, stupeň (b).

Schéma A, stupeň (c):

Při provádění tohoto postupu byla tato sloučenina, dihydrochlorid 2-[trans-(4—aminocyklohexyl)amino]-6-[(8-aminooktyl)amino]-9-cyklopentylpurinu, připravena za použití 2-chlor-6-[(8-aminooktyl)amino]-9-cyklopentyl-purinu, přičemž se postupovalo v podstatě stejným způsobem jako v příkladu 1, Schéma A, stupeň (c).

CIMS (NH₃) 443 (MH⁺); R_f (min) = 3,30.

-56CZ 291604 B6

Termín „neoplastické onemocnění“, použitý v popisu předmětného vynálezu, se vztahuje k abnormálnímu stavu nebo nemoci charakterizované nekontrolovanou proliferací. Neoplastická onemocnění zahrnují leukemie, karcinomy a adenokarcinomy, sarkomy, melanomy a smíšené typy novotvarů.

Termín leukemie zahrnuje akutní lymfoblastovou, chronickou lymfocytovou, akutní myeloblastovou a chronickou myelocytovou leukémii, bez jakéhokoliv omezování pouze na tyto stavy.

Termín karcinomy a adenokarcinomy zahrnuje novotvary čípku, prsu, prostaty, jícnu, žaludku, tenkého střeva, tračníku, vaječníků a plic, bez jakéhokoliv omezování pouze na tyto stavy.

Termín sarkomy zahrnuje esteromy, osteosarkom, lipom, liposarkom, hemangiom a hemangiosarkom, bez jakéhokoliv omezování pouze na tyto stavy.

Termín melanom zahrnuje amelanotický a melanotický melanom, bez jakéhokoliv omezování pouze na tyto stavy.

Termín smíšené typy novotvarů zahrnuje karcinosarkom, typu lymfoidní tkáně, sarkom buněk folikulámího retikula a Hodgkinovu chorobu, bez jakéhokoliv omezování pouze na tyto stavy.

Termín „terapeuticky účinné množství“ sloučeniny podle vzorce I se týká množství, které je účinné při podání jedné nebo několikanásobné dávky pacientovi kontrolovat růst novotvaru nebo metastáz novotvarů nebo zabránit apoptóze. Terapeuticky účinné množství sloučeniny podle vynálezu výše uvedeného obecného vzorce bude kolísat podle věku, hmotnosti, typu léčeného novotvaru, kombinace jiných protinádorových léků a dalších kriterií každému odborníkovi pracujícímu v daném oboru běžně známých, při použití standardních klinických a laboratorních testů a postupů. Terapeuticky účinné množství sloučeniny podle vynálezu výše uvedeného obecného vzorce bude kolísat podle typu buněk náchylných k apoptóze, lokalizace infarktu, a také věku, hmotnosti a dalších kriterií každému odborníkovi pracujícímu v daném oboru běžně známých.

Termín „kontrola růstu“ novotvaru se vztahuje ke zpomalení, přerušení, pozastavení nebo zastavení růstu novotvaru nebo metastáz novotvaru. Termín „kontrola růstu“ novotvaru se také vztahuje ke zmínění novotvaru nebo metastáz novotvaru.

Účinné množství sloučeniny podle vynálezu výše uvedeného obecného vzorce je to množství, které je účinné při podání jedné nebo několikanásobné dávky pacientovi zajistit protinádorové působení nebo zabránit apoptóze. Termín „protinádorový účinek“ se vztahuje ke zpomalení, přerušení, zabránění nebo zničení dalšího růstu neoplastických buněk.

Účinné protinádorové množství sloučeniny podle vynálezu výše uvedeného obecného vzorce může být snadno určeno ošetřujícím lékařem, jako odborníkem pracujícím v daném oboru, při použití známých technik a pozorováním výsledků dosažených za analogických okolností. Při určování účinného množství bere ošetřující lékař do úvahy velký počet faktorů, včetně, ale bez jakéhokoliv omezení pouze na tyto faktory, druhu savce, jeho velikosti, věku a povšechného zdravotního stavu, specifické nemoci, které se léčba týká, stupně nebo komplikace nebo závažnosti nemoci, reakce jednotlivého pacienta, konkrétní podávané sloučeniny podle vynálezu výše uvedeného obecného vzorce, způsobu podávání, charakteristické biologické dostupnosti podávaného přípravku, vybraného dávkového režimu, použití doprovodné medikace a dalších relevantních okolností.

Další provedení podle předkládaného vynálezu zahrnuje způsob profylaktického ošetření pacienta v riziku vývoje neoplastického onemocnění, přičemž tento způsob zahrnuje podávání profylakticky účinného protinádorového množství sloučeniny podle vynálezu výše specifického

-57CZ 291604 B6 obecného vzorce. Termín „pacient v riziku vývoje neoplastického onemocnění“ se vztahuje k pacientovi, který díky rozpoznání genetické predispozice ke tvorbě novotvarů měl nebo v současnosti má novotvar, je k expozici karcinogenním činidlům, má rizikovou dietu, věk nebo má další riziko faktory spojené s vývojem neoplastického onemocnění. Upřednostňovaní pacienti v riziku vývoje neoplastického onemocnění jsou pacienti, kteří mají pozitivní vyšetření na onkogenní viru, jsou v remisi po dřívější léčbě novotvaru(ů), konzumují tabákové výrobky nebo byly dříve exponováni karcinogenům jako je azbest nebo mají pozitivní vyšetření na různé neoplastické genetické markéry.

Onkogenní viry jsou ty viry, které jsou ve spojení s karcinomy. Například virus Rousova sarkomu kuřat, virus Shopova papilomu králíků a myší leukemické viry jsou zvířecí viry, o kterých bylo potvrzeno, že hrají důležitou roli ve vývoji různých druhů karcinomů. Lidský papilomavirus je spojen s karcinomem pohlavních orgánů. Virus vyvolávající nemoc molluscum contagiosum je sdružován s tumoiy molluscum contagiosum. Virus JC, lidský papovirus, je spojován s poruchami retikuloendotelového systému, jako je leukemie a lymfom. Lidské retroviry, jako lidské lymfotropní viry T buňky (HTLV) typu 1 a 2 jsou spojovány s některými lidskými leukémiemi a lymfomy. Viry lidské imunodeficience (HTV) typu 1 a 2 jsou příčinou AIDS. Virus Epstein-Barrové je spojen s různými malignitami, včetně nazofaryngálního karcinomu, afrického Burkittova lymfomu a lymfomů u příjemců orgánových transplantátů, kterým je podáván imunosuprese.

Genetickými markéry jsou mutace, přesmyky a podobně, jako například BRCA 1, bcl-l/PRADl, cyklin D1/CCND1, pl6, cdk4, zejména mutace Arg24Cys, pló¹^⁴³. Genetické markéry jsou spojovány s predispozicí k různým novotvarům. Například alterace v gelu BRCA 1 jsou sdružovány s vyšším rizikem karcinomu prsu a vaječníků. Další genetické markéry zahrnují alterace v genu MMSC1, který interaguje s genem MMCA1 karcinomu mozku a prostaty, v genu CtIP, který je sdružován s genem BRCA1 při karcinomu prsu a vaječníků, váže se na gen BRCA1 a je spojován s metabolickou drahou onkogenu El A, a v genu MKK3, kteiý je kontrolní gen buněčného cyklu, který působí jako nádorový supresor při karcinomu plic prostřednictvím aktivace apoptózy. Pacienti v riziku vývoje neoplastického onemocnění také zahrnují pacienty, kteří nadměrně exprimují různé proteiny buněčného cyklu, včetně cdk4, cyklinů Bl a E. Pacienti v riziku vývoje neoplastického onemocnění jsou pacienti, kteří mají zvýšené hladiny nádorových markérů. Známé nádorové markéry zahrnují prostatické specifický antigen (PSA) a plazmatický růstový faktor 1 podobný inzulín (IGF-1), což jsou markéry karcinomu prostaty. Proteiny jaderné matrix (NMP) jsou spojovány s výskytem karcinomu, zejména močového měchýře a tračníku.

Předpokládá se, že účinné množství sloučeniny podle předmětného vynálezu výše specifikovaného obecného vzorce kolísá od přibližně 25 ng na kg tělesné hmotnosti za den (ng/kg/den) do přibližně 500 mg/kg/den. Výhodné účinné množství sloučeniny podle vynálezu výše specifikovaného obecného vzorce se pohybuje od přibližně 1 pg/kg/den do přibližně 500 pg/kg/den. Výhodnější množství sloučeniny podle vynálezu výše specifikovaného obecného vzorce se pohybuje od přibližně 1 pg/kg/den do přibližně 50 pg/kg/den.

Sloučeniny výše specifikovaného obecného vzorce podle vynálezu může být podávána v libovolné formě nebo libovolným způsobem, který učiní sloučeninu biologicky dostupnou v účinném množství. Sloučeniny podle vynálezu mohou být podávány perorálním nebo parenterálním způsobem. Sloučeniny podle vynálezu mohou být podávány perorálně, subkutánně, intramuskulámě, intravenózně, transdermálně, intranazálně, rektálně, okulámě a podobně. Výhodné je perorální podávání. Odborník, který připravuje farmaceutické prostředky, může snadno určit příslušné formy sloučeniny podle vynálezu podle zjištěných konkrétních vlastností sloučeniny, léčené nemoci, stupně nemoci, reakce jiných pacientů a dalších relevantních okolností.

Sloučenina podle vynálezu výše specifikovaného obecného vzorce může být kombinována s nosičovými materiály, excipienty nebo dalšími sloučeninami za účelem přípravy prostředků

-58CZ 291604 B6 obsahujících tuto sloučeninu podle vynálezu. Prostředek obsahující sloučeninu podle vynálezu obsahuje sloučeninu podle vynálezu výše specifikovaného obecného vzorce v kombinaci nebo v jiném spojení s jedním nebo více inertními nosiči. Prostředky obsahující sloučeninu podle vynálezu jsou použitelné například jako vhodné prostředky podle vynálezu. Inertní nosič je látka, která se nerozkládá nebo nijak kovalentně nereaguje se sloučeninou podle vynálezu výše specifikovaného obecného vzorce. Inertní nosič může být tuhá, polotuhá nebo tekutá látka. Výhodnými nosičovými látkami jsou voda, vodné pufry, organická rozpouštědla a farmaceuticky přijatelné nosiče nebo excipienty. Výhodně vodné pufry zajišťují pufrovací rozmezí, ve kterém se sloučeniny podle vzorce nerozkládá. Výhodné pufrovací rozmezí je rozmezí od přibližně pH 4 až do přibližně pH 9. Výhodnými organickými rozpouštědly jsou acetonitril, ethylacetát a hexan.

Farmaceutický prostředek obsahující sloučeninu podle vynálezu výše specifikovaného obecného vzorce obsahuje tuto sloučeninu podle vynálezu v kombinaci nebo v jiném spojení s jedním nebo více farmaceuticky přijatelným nosičem nebo excipientem. Farmaceuticky přijatelným nosičem nebo excipientem může být tuhá, polotuhá nebo tekutá látka, která může sloužit jako vehikulum nebo médium pro sloučeninu podle vynálezu. Vhodné farmaceuticky přijatelné nosičové materiály nebo excipienty jsou každému odborníkovi pracujícímu v daném oboru dobře známy.

Farmaceutický prostředek obsahující sloučeninu podle vynálezu výše specifikovaného obecného vzorce může být upraven pro různý způsob podávání. Je-li způsob podávání perorální, parenterální nebo lokální, je výhodný farmaceutický prostředek obsahující tuto sloučeninu podle vynálezu ve formě tablety, pastilky, tobolky, tinktuiy, sirupu, oplatky, žvýkací gumy, čípku, roztoku nebo suspenze.

Výhodný perorální farmaceutický prostředek obsahující sloučeninu podle vynálezu obsahuje sloučeninu výše specifikovaného obecného vzorce podle vynálezu v kombinaci s inertním ředidlem nebo s poživatelným nosičem. Výhodné formy perorálních farmaceutických prostředků obsahujících sloučeninu podle vynálezu jsou tablety, pastilky, tobolky, tinktury, sirupy, oplatky, žvýkací gumy, roztoky nebo suspenze.

Výhodné farmaceutické prostředky obsahující sloučeninu podle vynálezu výše specifikovaného obecného vzorce obsahují od přibližně 4 % do přibližně 80 % této sloučeniny. Výhodné farmaceutické prostředky obsahují množství sloučeniny podle vynálezu od přibližně 50 ng do přibližně 500 pg, výhodnější farmaceutický přípravek obsahuje množství sloučeniny podle vzorce od přibližně 1 pg do přibližně 200 pg.

Sloučenina podle vynálezu výše specifikovaného obecného vzorce může být podávána samotná nebo ve formě farmaceutického přípravku v kombinaci s farmaceuticky přijatelným nosičem nebo excipientem.

V popisu předmětného vynálezu jsou používány následující zkratky: mg, miligram, pg, mikrogram, ng, nanogram, TEA, triethylamin, mmol, milimol, ml, mililitr, C, Celsius, h, hodina, TLC, chromatografie na tenké vrstvě, CH₂C1₂, metylenchlorid, MeOH, methanol, EtOH, ethanol, N, normální, HC1, kyselina chlorovodíková, TFA, kyselina trifluoroctová, DIEA, diizopropylethylamin, RT PCR, polymerázová řetězová reakce navazující na reverzní transkripci, HEPES, 4-(2-hydroxyethyl)-l-piperazinethansulfonová kyselina, mgCl₂, chlorid hořečnatý, EGTA, ethyIenglykol-bis(P-aminoethylether)-N,N,N',N'-tetraoctová kyselina, EDTA, ethylendiamintetraoctová kyselina, DTT, dithiotreitol, MOI, násobek infekce, NaF, fluorid sodný, BSA, bovinní sérový albumin, p.o., perorální nebo perorálně, i.v., intravenózní nebo intravenózně, s.c., subkutánní nebo subkutánně.

-59CZ 291604 B6

Příklad 57

Test cyklin-dependentní kinázy 4.

Hodnoty IC₅₀ pro inhibici dbk4 byly získány prostřednictvím následující metody:

Substrát:

Fúzní protein glutathion-S-transferáza-retinoblastomový protein (GST-Rb) (Kaelin, W.G., Jr, a kol., Cell, 64, 521-532, 1991) byl získán od Dr. Williama Kaelina. GST-Rb byl připraven pomocí transfekce E. coli plazmidem pGEX-Rb (370-928). Transformované bakterie byly pěstovány přes noc do saturace, pak byly naředěny médiem YT a inkubovány 2 hodiny při 37 °C. Protein byl indukován inkubací s 0,1 mM izopropylthioglykosidem po dobu 3 hodin. Po sedimentaci prostřednictvím centrifugace byly buňky lyžovány sonikací vpufru STE (0,1 mM NaCl, 10 mM Tris, pH 8,0, 1 mM EDTA) obsahujícím 10 % sarkosylu. Částicový materiál byl odstraněn cetrifugací a lyzát byl inkubován s glutathion-Sepharose při teplotě 4 °C. Perličky byly promyty kinázovým pufrem, a pak se prováděla kvantifikace proteinů separovaných prostřednictvím SDS-PAGE a obarvených Coomasie modří při použití proteinovuho standardu o známé koncentraci.

Exprese CDK4/cyklinu Dl ve hmyzích buňkách:

Lidská cyklin-dependentní kináza 4 (ckd4) byla klonována pomoci RT PCT s použitím degenerovaných primerů na bázi publikovaného aminokyselinové sekvence (Matsushime, H., a kol., Cell, 71, 323-334, 1992). cDNA pro lidský cyklin Dl byla klonována pomocí RT PCR s použitím genomové DNA z buněk MCF-7. Sekvence byla shodná s publikovanou sekvencí (Xiong, Y., a kol., Cell, 65, 691-699, 1991). Obě cDNA pro cdk4 a cyklin Dl byly kolonovány do pFastBac (Life Technologies) a rekombinantní Bacmid DNA obsahující cDNA byl tvořen místně specifickou transpozicí s použitím Bac-to-Bac bakulovirového expresního systému zakoupeného od Life Technologies (katalogové č. 10359-016). Bacmid DNA byl použit ke transfekci hmyzích buněk Sf9 pro produkci rekombinantního viru. Po plakové purifikaci viru byly virové preparáty amplifikovány dokud nebylo dosaženo vyšších titrů virových kmenů. Byla určena optimální společná exprese (koexprese) rekombinantních proteinů dosažená při MOI 0,1 jak pro cdk4 tak pro cyklin Dl v době 72 hodin po infekci.

Byly připraveny lyzáty buněk Sf9 společně infikovaných s cdk4 a cyklinem Dl v 50mM HEPES, pH 7,5, 10 mMmgCh, 1 mM DTT, 0,1 mM fenylmethylsulfonylfluoridu, 5 pg/ml aprotininu, a 5 pg/ml leupeptinu s použitím talkové láhve PARR při tlaku dusíku 3447,3 kPa (500 psi) po dobu 5 minut při teplotě 4 °C. Nerozpustná látka byla sedimentována při 10 000 x g po dobu 20 minut při teplotě 4 °C. K supematantu byl přidán glykocel do koncentrace 10 % a supematant byl uchováván při teplotě -80 °C v poměrných částech.

Kinázový test:

96-jamkové filtrační destičky Millipore Multiscreen (0,65 pm filtry Durapore) byly předem navlhčeny 200 μΐ kinázového pufru (50 mM HEPES, pH 7,5, 10 mM mgCl₂, 1 mM EGTA). Do každé jamky bylo přidáno 50 μΐ GST-Br (0,5 pg) navázaného n a perličky Glutathion-Sepharose a roztok byl odstraněn aplikací vakua. Testovaný vzorek obsahuje 50 mM EÍEPES, pH 7,5, 10mMmgCl₂, 1 mM EDTA, 1 mM DTT, 1 mM EGTA, 10 mM β-glycerofosfátu, 0,1 mM ortovanadičnanu sodného, 0,1 mM NaF, 0,25 % BSA, 10 μΜ ATP a 0,25 pCi [γ³³Ρ]-ΑΤΡ. Pro zahájení testu bylo přidáno 0,1 pg cdk4/cyklinu Dl (lyzát hmyzích buněk) a probíhala inkubace po dobu 30 minut při teplotě 37 °C. Reakce byla ukončena filtrací na zařízení Millipore Vacuum Manifold. Destičky byly čtyřikrát promyty TNEN (20 mM Tris, pH 8,0, 100 mM NaCl, 1 mM EDTA, 0,5 % Nonidet P-40). Po usušení destiček při teplotě místnosti byly filtrační destičky

-60CZ 291604 B6 umístěny v destičkových adaptérech (Packard) a do každé jamky bylo přidáno 40 μΐ scintilační tekutiny Microscint-O^R (Packard). Fólie Top Seal A byla použita pro přikrytí destiček před měření na scintilačním počítači Top Count Scintillation Counter.

Výsledky jsou uvedeny v tabulce 1.

Příklad 58

Inhibiční studie s cdk2

Hodnoty IC50 pro inhibice CDK2 byly určovány pomocí následující metody:

Test cyklin-dependentní kinázy 2:

Substrát:

GST-Rb, jak je popsán výše pro cdk4/cyklin Dl Exprese CDK2/cyklinu E ve hmyzích buňkách:

Rekombinantní bakuloviiy pro lidskou cdk2 a cyklin E byly získány od Dr. Davida Morgana zUC, Berkeley (Desai, D. a kol., Molec. Biol. Cell, 3, 571-582, 1992). Optimální společná exprese ve hmyzích buňkách byla získána při MOI 0,1 a 1,0 pro cdk2 a cyklin E, v příslušném pořadí, 72 hodin po infekci.

Kinázový test:

Podmínky testu pro cdk2/cyklin E byly totožné s podmínkami pro cdk4/cyklin Dl včetně substrátu. Koncentrace rekombinantního cdk2/cyklinu E v testu byla 0,1 pg na 100 μΐ testovacího vzorku. Inkubace byla prováděna po dobu 30 minut při teplotě 30 °C.

Výsledky jsou uvedeny v tabulce 1.

Příklad 59

Protokol testu cdk7/cyklin H

Substrát:

peptidový substrát H2N-RRR(YSPTSPS)4-COOH na bázi sekvence CTD RNA polymerázy Π:

Exprese CDK7/cyklinu H ve hmyzích buňkách:

Lidská cdk7 byla klonována pomocí RT PCR. Sekvence byla shodná s pubklikovanou sekvencí (Tassan, J.P., a kol., J. Cell. Biol., 127, 467-478, 1994, a Darbon, J.M., a kol., Oncogene, 9, 3127-3138, 1994). cDNA pro cyklin H byla také klonována pomocí RT PCR, přičemž sekvence byla shodná s publikovanou sekvencí (Fisher a Morgan, Cell, 78, 713-724, 1994). Rekombinantní Bacmid DNA a virové kmeny byly připraveny tak, jak je popsáno výše pro cdk4 a cyklin Dl. Optimální koexprese bylo dosaženo v MOI 1 a 2 pro cdk7 a cyklin H, v příslušném pořadí, 48 hodin po infekci.

Kinázový test:

Test měřil fosforylaci peptidového substrátu (založeném na C-koncové doméně RNA polymerázy Π) prostřednictvím cyklin-dependentní kinázy 7, která je aktivována cyklinem

-61 CZ 291604 B6

H. [y³³P]-fosfát byl přenesen z [γ³³Ρ]-ΑΤΡ na peptidovým substrát pomocí enzymu. Test se prováděl na 96-jamkových destičkách se dnem ve tvaru V, pak po ukončení reakce byl proveden přenos na 96-jamkové fosfocelulózové filtrační destičky Millipore Multiscreen. Peptid je zachycen na fosfocelulózové membráně po promytí roztokem kyseliny fosforečné.

Metoda:

Enzymový test se prováděl na 96-jamkových destičkách se dnem ve tvaru V v celkovém objemu 100 μΐ. Testovaný vzorek obsahoval 15 μΜ ATP, 0,5 pCi [γ³³Ρ]-ΑΤΡ, 50 mM HEPES, pH 7,5, 10 mM mgCl₂, 1 mM EDTA, 1 mM DTT, 10 mM β-glycerofosfát, 0,1 mM ortovanadičnan sodný, 0,1 mM NaF, 10 μΜ peptidový substrát. Pro zahájení testu bylo přidáno 0,125 ng cdk7 a cyklinu H (lyzát hmyzích buněk). Inkubace byla prováděna po dobu 5 minut při teplotě 24 °C. Reakce byla ukončena přidáním 40 μΐ chladné 300 mM kyseliny fosforečné ke každému vzorku. Obsah jamek se dnem ve tvaru V byl pak přinesen na 96-jamkové fosfocelulózové filtrační destičky Millipore. Po ponechání 15 minut při teplotě místnosti byly filtrační destičky odsáty ve vakuu a jamky byly promyty 4 x se 100 μΐ chladné 75 mM kyseliny fosforečné. Po odstranění odsávací sestavy byly filtry úplně usušeny, umístěny do adaptérů na mikrodestičky přístroje Multiscreen a do každé jamky bylo přidáno 40 μΐ scintilační tekutiny Microscint-O. Destičky byly přikryty fólií Top Seal A a měřeny 1,5 minuty na scintilačním počítači Packard Top Count Scintillation Counter.

Výsledky jsou uvedeny v tabulce 1.

Příklad 60

Protokol testu CDKl/cyklin B[³³P]SPA

Substrát:

Test používá biotinylovaný substrátový peptid (biotin-PKTPKKAKKL) pocházející z in vitro p34^cdc2 fosforylačního místa histonu Hl.

Exprese CDKl/cyklinu B1 ve hmyzích buňkách:

Lidská cdkl byla klonována pomocí RT PCR. Sekvence byla shodná s publikovanou sekvencí (Lee, M.G., a Nurse, P., Nátuře, 327, 31-33, 1987). cDNA pro cyklin B byla také klonována pomocí RT PCR a sekvence byla shodná s publikovanou sekvencí (Pines, J., a Hunter, T., Cell, 58, 833-846, 1989). Rekombinantní Bacmid DNA a virové kmeny byly připraveny tak, jak je popsáno výše pro cdk4 a cyklin Dl. Optimální koexprese bylo dosaženo vMOI 0,1 pro cdkl a cyklin B1 48 hodin po infekci.

Kinázový test:

Enzymová testovací souprava pro p34^cdc2 SPA[³³P]kinázu byla zakoupena od firmy Amersham Life Science (katalog, č. RPNQ0170) a protokol byl prováděn v 96-jamkovém formátu, jak doporučuje výrobce. Každý testovací vzorek obsahoval 50 mM Tris HC1, pH 8,0, 10 mM mgCl₂, 0,1 mM Na₃VO₄ (ortovanadičnan sodný), 0,5 μΜ ATP, 0,2 pCi ³³P-ATP, 2 μΜ DTT a 0,75 μΜ biotinylovaný peptid a 3 μg cdkl/cyklinu B v lazátu hmyzích buněk při celkovém objemu testovacího vzorku 100 μΐ. Inkubace byla prováděna po dobu 30 minut při teplotě 30 °C. Reakce byla ukončena přidáním 200 μΐ stop pufru (50 μΜ ATP, 5 mM EDTA, 0,1 % (objem/objem) Triton X-100 ve fyziologickém roztoku pufrovaném fosfáty)/s perličkami SPA potaženými streptavidinem (2,5 mg/ml). Destička byla ponechána přes noc při teplotě místnosti, a poté

-62CZ 291604 B6 přikryta fólií Packard TopSeal a měřena na scintilačním počítači Packard TopCount. Hodnota IC₅o byla určována vynesením dat do esovité křivky s použitím software GraphPad Prism.

Příklad 61

Inhibice tumoru in vitro

In vitro proliferační test:

Proliferace nádorových buněk byla měřena s použitím testu se sulforhodaminem B, jak je popsán (Skehan, P., a kol., J. Nati. Cancer Inst., 82, 1107-1112, 1990). Nádorové buňky byly odebírány do roztoku trypsin-EDTA, přičemž buňky, které se nebarvily trypanovou modří, byly spočítány, přidány na 96-jamkové destičky a inkubovány přes noc při teplotě 37 °C. Do jamek bylo přidáno léčivo po naředění kultivačním médiem. Tři dny později bylo médium odstraněno a opět doplněno médiem obsahujícím čerstvý lék a inkubace probíhala další 4 dny. Buňky pak byly fixovány 0,1 ml 10 % trichloroctové kyseliny po dobu 60 minut při teplotě 4 °C. Destičky byly pětkrát opláchnuty vodou z vodovodu, usušeny na vzduchu a barveny 30 minut 0,4% sulforhodaminem B v 1% kyselině octové a usušeny na vzduchu. Navázaná barva byla solubilizována s 0,1 ml 10 mM Tris (pH 10,5) po dobu 5 minut, přičemž se měřila absorbance při 490 nm pomocí čtecího zařízení Titertek Multiscan MCC/340.

Pro kvantifikaci buněčné proliferace byl jako alternativa použit test proliferace buněk CyQUANT.

Test proliferace buněk CyQUANT.

Pro kvantifikaci proliferace nádorových buněk byl jako alternativa použit test proliferace buněk CyQUANT. Nádorové buňky byly odebírány do roztoku trypsin-EDTA, přičemž buňky, které se nebarvily trypanovou modří byly spočítány, přidány na 96-jamkové destičky a inkubovány přes noc při teplotě 37 °C. Do jamek bylo přidáno léčivo po naředění kultivačním médiem. Tři dny později bylo médium odstraněno a destičky byly zmraženy při teplotě -80 °C po dobu alespoň 30 minut. Po rozmražení destiček bylo do každé jamky přidáno 200 μΐ CyQUANT-GR a buněčném lyzačním pudru (molekulární sondy č. C-7026) a destičky byly inkubovány 3 až 5 minut při teplotě místnosti. Flurescence CyQUANT-GR byla měřena na Fluorescenčním destičkovém čtecím zařízení Molecular Cevices Fmax (excitace 485 nm, emise 530 nm).

Buněčné linie:

MCF7 je lidský adenokarcinom prsu, hormon-dependentní (HTB 22),

MDA-MB-231 je lidský adenokarcinom prsu, hormon-independentní (HTB 26),

HT-29 je lidský adenokarcinom tračníku, průměrně dobře diferenciovaný stupeň Π (HTB 38),

HCT-15 je lidský adenokarcinom tračníku (CCL 225),

A549 je lidský nemalobuněčný karcinom plic (CC1185), PC-3 je lidský adenokarcinom prostaty, hormon-independentní (CRL 1435) a

DU 145 je lidský karcinom prostaty, hormon-independentní (HTB 81).

-63 CZ 291604 B6

Všechny buněčné linie byly získány z Američan Type Tissue Collection, přičemž ukládací čísla ATCC jsou uvedena v závorkách.

Buňky MCF7, MDA-MB—435 a MDA-MB-231 byly pěstovány ve vylepšeném minimálním 5 esenciálním médiu (Biofluids) bez fenolové červeně doplněném 5% fetálním bovinním érem,

0,01 mg/ml gentamycinem a 3mM L-glutaminem. Všechny další buněčné linie byly pěstovány v médiu RPMI 1640 (Life Technologies) doplněném 5% fetálním bovinním sérem, 0,01 mg/ml gentamycinem a 3mM L-glutaminem.

Výsledky jsou uvedeny v tabulce 1.

-64CZ 291604 B6

i =L Š u 0 h P > c •rt i US i k 0 Ό Μβ β a 0 k • •rt r4 8 cu	\| prostata \|	•Λ •r s	♦ §	· * vy χα <řcř	♦ . ♦ XX w··*·	Í>L
3 fi.	• ♦ G* O :β·-*	« ♦ n rVY^f 0 c?	♦ * XÝ	♦ ♦ XX m vy
v o Ή H 0·	2 = a	* ♦ O O	• *' ’Τ m XX O O	* ♦ Y.Y	♦ ♦ ό r*
C\ m <	« ♦ (NO^	* « <*> r- £3· 0 0	♦ * 2-Ξ	♦ ♦ n x ”* «Υ
0 > +J O ’3 m 3 H 4J	1 O ΙΛ a-	♦ ♦ cTeT	• * 5 x 0⁰	♦ ♦ 33	♦ * ·* 0 νγ’νί'
δ 2 m
H »	♦ ♦ ‘Λ·	♦ ♦ © VY XX O O	♦ * x X n	* · XX vy -**·
ní « 0.	Žás		♦ ♦ VY VY XX 0 0		♦: * <N ~
e a S*^M	-· ♦ UY CY — κΓ	• · XX © ©	♦ * 0 X — f*l	• jL “2-
b. r
Φ 5 >—	eo cT	VY CM θ’	X	ni
φ S'« —- λ * js -r4 Q W g gu H	\0 \o —•no o o o, 00 0	o — 0 — XX 00	Os O O B ® s	= s 0 X ď©
Struktura		/ t	<< z= / í	fe~ £
_á3 o « S ’^H»0	H r*» X en Ή a	e r4 —*	s 3* >Í4 Λ	TJ 4 H ·* cn \H VY a

-65CZ 291604 B6

o	♦ ♦ Ο X© γύ’^τ’	£«cS—	O CM 00 Os o o
O O cT*r>	♦ ♦ ďo fn ^cT*	V) x© CM 00 00	Í3A o
xr -e vi	··. ·. x© «η ©^ř	VY ·*»	cm cn m s© cr<r
NO <©	+- ♦-χ VI s©*vT	Ql_rX	S n. ©-
	♦ -» rTrT
00 XO		m e*T m	«η^-cm*
ťN»tσν	♦ ♦ vatN VY \©	cn s© *- rT	χχχ CM —
	♦ · O o
	\o xd*
CM O <n r?	♦ · cn vy	cm cm -^cT
Q°1. C1		s*. o —	£ Γχ. θ’
tn ^r	—	m ττ O *©	f*s ν»
O*	<£·	O θ'	Ο
o r* rCM — IN <io<l o o o		C4 >	CM
<M O	Ο θ’
	l	y ^*·Ό
Uf	<J-<		YfrO
ZZ rf	ace A	zs	•X*ó ý
p z £	P 1	$	Ρ
.3 3 2	příklad 25	g d, X -r rl m li cu	příklad 29
>h ft

-66CZ 291604 B6 cdk4 MCF-7 231 435 HT-29 HCT-tS Colo265 A549 DMSII4 PC3 DUÍ 45

©	♦ ·	>o ♦			• *		♦ ♦
	S	co řt					Γ** —
© O	cTcf	o —			cm rT		T· Γ4
r- r*	♦ ♦	* ♦			♦ o		'.« ♦
ťvr>					«VI		m tt
G O		rh —			v> r·*·
©v r*i	• ♦	♦			• ♦		• ♦
	eo ©				~ co		CM O
o o					cn CM		CM CM
O	M *	írt *			» ·		♦ 4f
Ό λθ	“ x.	ri. X			xo —		Mř v%
©*©	o~—	©					CM —
	«! ♦	♦ ♦			». ♦
	«Λ	© *-<r			CM		r- Ό

<*j m
SLŠ	♦ ♦	# ♦			« <
'Q	« OĎ			CM CM		V ©.
O					··— C**		CM
	♦ ♦	* ·			• *		♦ ♦
	C£ <A CM Λ	c^v^ cn			V> MT		rr p* ΤΓ CM
	♦ ·	» ·			♦ ♦		* *
o ra	CM	cn \0			GK CM		Cs CM
O*“					CM ΓΊ		·· CM
C\ — VVOO G ©
	©		o		©
cn \©	o		0		©		r-
dřcS	A		A		Λ
	22		ooí?		CM	M3
© ©	<?_S i « O C		O i		O	G ©*
=H ň-	< H	V			p-°	í 5
	*-Q		H zz 1	f-	H as J		H J
	$		$		ř
X	í		t		J		< X
en Ό	S		0	Vk o
4 H «Μ »U cu	r4 \λ >u		5 s >rt >U A	4. M M Ή >M Λ		ÍZ «Η QU

Cdk4 MCF-7 231 435 HT-29 ÍtCT-15 Co!o205 A549 DMSI14 PC3 DUI45

♦ ♦ en «	♦		© Ό <N rF --*—
♦ .♦	* »	o* o “	S3-J2·
* r*	♦ ♦		(N Os ~ cT
	·' .♦ «·	—' <N	«a **
L <n.		♦ ♦ <m cTt*)

			<n T*		<N Os <N
			*n Ό		n ·* 6Γ
♦ * rntn	• «. <H <N	Γί,^χ, rT o?
* · © ví ví	• .♦ m e*\
♦ ♦ r* **_ rí^cn	♦ ♦ ^© ttm	9,¾ CM «*>	—^op — ©*
			o r>		r* xo
					© O
					Z“»,
		η κι			©Λ*
-		O o	*-		<N _e

O O OC 3 ©«Γβί,ε,	J> ® C O O Ϊ o~©-3	0© •«r G> eS“	© v>	© wt— w<n Γ* 50 VS ΛΟ
ο'ο'ο'βί'ο' a~
			ío-^		JW
X	—C z	\__/\
	Λ	»	H 7 Ά		S-Q zx
	t	ř ’	$		z X
přiklad 52	s M £ >k 0.	X ΓΗ •’Γ >H	3 M X <rl >M A

-68CZ 291604 B6 cdk2 Cdk4 MCF-7 231 435 HT-29 HCT-15 Colo20j Λ549 DMSI14 PC3 DU145

2 cx	♦ < ©	ό ♦	♦ ♦. Γ,<Μ \0 ř·
* · 09	♦ ♦ CX© r*>	♦ ♦ m O oo co © c5“	♦ ♦' Γ4 O
♦ ♦ Ό Tf _:·5- cm	♦ ♦ v? vT	* o OO eó	♦ ♦ o L r^cr
♦ ♦ Ό Vy	♦ O	• < os cn O o	.♦ o cn r- v©
* ♦ rv co_ 'θ’ Γ	♦ * <n Ό	• ♦ m 09 \p m o” O	♦ ♦.. <n cm

♦ .4» rn m	• ♦ o — fC'	* · S2-	♦ ♦ t> o
♦ · — rn	• « m ©	.* ♦	♦ ♦ VI ό r*
♦ ·	♦ · r* oď	• ♦ c^cr	♦ « CM,M> ϋτΓνΓ

rn_m dTcT	O <3 Λ
o C* o n	o © 00 \o o o θ'o	vy 09 O cT	o> 00 O cT
Q > -q-Cj ?—( z n >	ď z X	.. 0 . ^-0 £	zx 0 2 r
přiklad 7	Ό H * £ >w 0.	•S H 2 % Ζζ	23 m4 >k A

-69CZ 291604 B6 cdk2 C(lk4 MCF-7 231 435 HT-29

♦ ♦	« .♦ OO	Χ -- rT	r* o
	♦ * '•Q.oo, o o	© rčí“ γΤ~	t^OS G\ \q·
« xa.	♦. ♦ r^y©, 0*0	ί*Γ6Γ	m cm — xcř*
♦ CM CM“	♦ ;« «Λ ο“ο*		m o
♦ * yo íovF	♦. 4 — 00 •α-r*. ο ο
		Tj- rΓ Γ<	O ««.
* ♦ cn.©_ r* x©~	♦ ♦ C* « οο“	ο^οο ^τ'	09
• < O CM	4 ♦ <Ί<μ_
• . * 09* 'O	w ♦ 00 Ο*^ ο^-©	CMWk m	© TL. “ eo
		G^m - cn	oT vF
CM rF			oo
o OV 11 o « O c	ο — -Ο m cn „ Ο Ο π Ο Ο £	τΤ Ct e_ o	_t \O <«S ?L.S T cFZ*~ c • o
γ·^. o	Uf ί	tL. Y frO l	Y / i
Ό e s <* Ή >H 0.	Ό Ιί 5 — <π η >Η 0«	o 4 d o M P.	Ό Λ rH #sj m CM q r* >h A

cdk2_______cdk4 MCF-7 23» 435 HT-29 HCT-IS Coto205 A549 DMS114 PC3 PUI4S

♦	♦ ♦	· *	♦ ♦
60	rVQ.	60 tr>	‘^'β.
CM	Ό t^·	v> \c	χτ m
.♦	« «	> ♦	♦ ♦
ΓΊ	CM	X© xT	r·* xr
<m	r* Ό	M* V7	cř tť“
·♦	♦ · OO <N_ oo <O*	* ♦	* -♦
	Ci	-T^·
*-	• «	* ♦	♦ ♦
X	cx c*	r? σ\	o®. *n
	rs Ό	r* w	CM CM
	♦..	♦. «	♦ ♦
X		x© *ť	ν^<*χ
. <M	¥“> yv	xf	m Ό

4»	♦ «	• «	> *
rT		r- ·*	«Λ rř-rv
	• «	» .«	« ♦
	χτ m	o o	oo —
		Μ «Μ	ίϊ *I
•	• ♦	♦ *	♦ ♦
o.	e® X.	m ·—» «·	<M Ό
	χτ σχ	vy oo	CM en

		r- oo o o*	XT to
o C*		oC	v\
® a	—	Z H
«* s5	o	©s	θ'
í	Q />	γ	J· Ž \
>		LR	\
'-Q	Ť*	^x V( XS	$
SX I	J	rv
jf		Jj	>
ť f	r	i	vj z 3f
5	1	oo •0	X© vn
>U	a 2 ’d	α H X Ή	X
Oi	ά	•M Λ	>M ft

-71 CZ 291604 B6

C(|k4 MCF-7 J3i 435 HT-29 HCFIS Cok>205 A549 DMSI14 PC3 DUI45

♦ * ♦. ♦ — -“'m cm*	0 _ 00 ř o^-*	<n O rn	© to —- SL •VLIJ ® o ® cT
• <4» 4» Χ »0 00 CM rF -Fcm*	CO oo o o	•Fím“	«-> ř> K £. Ξ~Ξ2<
* · · * — — η n	00 ·— oo Os oo	βχ,ι^ CM m	2 ř© P cT
♦. *. ♦·	o oo os cF<^		trt <r> *
~~ CM -F	CM tn	o o 5-
♦ · ♦ · CM CM S© -O
CM m μτ «η
	ι·χ,«Χ, rs c*T	— CM CM CM	♦ X_o © ©X θ’
♦ ♦ ♦ ♦ CM <m rTrr	«X	*X®L	2 :L· S Ss © © © g-
♦ -» o n
60* 00
rn γχ*χ cnT cm CT W	o -^rF	X© ©o	- g C «-©-©-g·
	— <Ί.	CM*rF	νΤΊ- 1, 2.XX? © © ©
	** s© -”ó*	M3 O“	Kg cF cT
CM O	o ~ 2 i	M3 O 2 li	0 (A
o cT	® >5		3-
Q 4M rf	ή	y z^zO	1 w^-0 VQ ·<
( J=X 2—4 Z ¹ z-< ζχ
? J	z X	z	X
a* m4	H	4 •j O « >M 0.	•a 3s
0.	»M *O	0«

Cdk4 MCF-7 231 435 HT-29 ltCT-15 Colo205 A549 DMSH4 PC3 011145

O	* * — \©	oe^cp. ί <©	* ·
r> c\ o o	• . *· íH	oo ei *n tF	♦ · SQ ·£ -řm
	♦ ·· t>>o 00 *·	5Λ —·	♦ ♦ r* oo m cn
* o	* ♦	ΓΜ	0' 0 o< Os •í** <*T
	** 00		♦ · n rs ·>» ·· —· m
σν οχ		— m
*0^x0.	♦ -4» o © «R W—'	n ~ 00*~	* ♦ V> Ά
	* 0 X *'		0 « Ά Ό
	• ♦ «Ί SO m5*	^L<s r —	* * r^s© čí 6Γ
		5© V\_ rTr<“
Cs o	Ό Os o o	=	o* ©
o rr w e	oí=· Z 1	o <n cT	3.2 o'©
X	]Ó-^sX3 Qr cs f	^sl· W³ / í	O ^jT° Π-( *ř f
D A rl — * 2 *rl >U Λ	n o A «Η M mH >U a	ťO 4 H •M — >*< a	©s w i

-73CZ 291604 B6

Cdk4 MCF-7 231 435 HT-25 HCT-15 Colo205 A549 DMSII4 PC3 DU145

γμ_τγ	Ά O cm*	O V“> CM γι’	♦
o» cm M Os Ó O	*Γ 'T CM —	eo_cs_	• *Q_
o *“	'V'®. C4 —	<n ©_ cTrT	♦ 5·
** o	o oo	o o	*
w·	CM r-	CM tf>	«m
			♦ r^_
m	50 O	CL>o yp rn
CM oo cm 6Γ	oo_»n_ *r <n	—m	♦
			♦ >0 cT
—· ΙΛ	o o	— *n	♦ r*.
CM CM	xr <ή	c*í cň
r»_so_ ··*		-.*2-
0,25	CM
091	z—s 96 ·* — 1	g		o O S ir
c	<= £	<5*		0 ^a
		B	/
Λκ³	0 X^S^-ζ		<
			i^-	J
X	i			e t
3 Η M 4i a	X £ m4 0.	M e ή 'τ >h A	rr Ό .4 H M Ή »M 04

Cdk2 Cdk4 MCF-7 231 435 HT-29 HCT-13 Colo205 A54? DMS1 (4 PC3 DUt«

♦ 4 o O	♦ « 8s Λ	4 * r^_oi encn		4 4 o oF-^
♦ 4 t^*\o	4 4 —: ΓΎ	4 4 o M rr		4 4
• ♦	4 4 ΓχΟ ^eř	4' 4 o o* ríO4		* tn “ o“
4 * m m	— ee	4 ♦ O*. VY d rq		4 « ΓχΟ_
4 4 s© >5*	4 4 QO w*.	• 4. ^04 c-Γ «*ř		4 4

* 4 ÍZ S2	• · Qt ΤΓ	♦ ♦ vn «o		♦ 4.
4 4 ·*τ oo“ ct	• « c\ v>	4 4 ''X.o. cTcř		4 4 <*ϊ_« oF·^
♦ 4 0.0. Ό	4 4 04 *-	4 4 cm/o ’τ’λλ		4 4 r* cs <s-í-

<n oi O θ'	o-	o· ee		Tf oF
o ~ 04 n 04 » gT C	o “TT M 04 π o ,e	cn Ví 04 ď“	o oo^ o	ⁿ-n<r ® o a
V 2* \ ,^s-O 1 í		>	L^pO * Λ. Z /	\ Xs-O CK í
Ό A H 04 •H *· »h P.	B Λ R >M 01	1 d * £*·» >M a	•o H «Μ * 04 A	8 rM -* e 'rt 04 pi

-75CZ 291604 B6 cdk2 cdk4____MCF-7 23! 435 HT-29 HCT-lí Co!o205 A549 DMSI14 PC3 DUI4S

• < so \©	η.’τ r· ~	r· —	*A — —
* <	00 .oo r*	co*	m 9L· — <n
• « rí	o *x — «Λ	<o 00 oT\e	o o ©Tc^
• · <0χχ>	•χ·* <**»	·— 00* —	Ojo- 00 —*
* ·
	M CO	éo *n	r* <o —» *
♦ · CM	to xr	x© m	SO Γ4
• 4» r** m CM* 04
♦ ♦	Ό O· m **·	r- ~	«0 *“
		$2	<r
MS _ © X. cT=>	C* CM	r*	^r n
	£7	O OJ	©	© cm
		o*	o*	o“
			s J	O
Π X	rf	-Yq-O zs	Φ CfO ss rf	YQO KZ( zz rf
		z z	A	rf 1
5 H — Jí £ >U 0.	příklad 42	•u a	CM 4 H M Ή ’H a

cdk2 cdk4 MCF-7 231 435 HT-29 HCŤ-IS Co!o205 A549 DMŠII4 PC3 DUI45

xo vy		CM Tř 00 IA rF rFc-FcT’
o 00 t/T-eT		rívr^^
r*		w_c ®. .^.
τζ^οο \©VT		rFeTrToT

Λζ^ΟΟ «Tr*·		-χΓχ'^Γ'^ m rn m rn*
'ο’νΓ		<n rT cFcF

		0.-^0 OQ_ pn ěh C4 ~
— VY, cm*		m cm cí ·—
	rF		m
o. <4 o“	o C* CO M r* II o sS	© c oo o	<r · o 3
⁵ Y-( 2X % X	ř	a- -V XX	a
příklad 16	•o « H >M Λ	co r4 X *H Λ 0.	1 X gj ή rv >M Dt

-TI CZ 291604 B6











	O o Λ
O Ό rT	5₍10
⁵ JET >	I 0^0 2X
Ό 1 H M •d 0.	příklad 4

78CZ 291604 B6

Příklad 62

Test in vivo

Test užívající implantát pod ledvinné pouzdro

Nahé myši byly umístěny v mikroizolátech s přetlakem vzduchu. Chirurgické výkony a podávání dávek léků se provádělo v boxu s laminámím prouděním vzduchu. Test používající implantát pod ledvinné pouzdro se provedl stejným způsobem jako je uvedeno v práci autorů Bogden, A.E., Kalton, D.E., Cobb, W.R. a Esber, H. J. (A rapid screening methodfor testing chemotherapeutic agents against human tumor xenografts; vHouchens, D.P. a Ovejera, A.A. (vydavatelé) Proceedings of the Symposium on the Use of Athymic (Nudě) Mice in Cancer Research, s., 231-250. New York: Gustav Fischer New York, lne., 1978). V krátkosti shrnuto, nádory o velikosti 400 až 500 mm³ odebrané z myší, na kterých byly udržovány, byly nařezány na segmenty o velikosti 1 mm³, přičemž velikost byla kontrolována pomocí okulárového mikrometru operačního mikroskopu. Poté, co byla ledvina vyjmuta z dutiny břišní, byly segmenty nádoru implantovány pod ledvinné pouzdro samců nahých myší (starých 6 až 8 týdnů) pomocí trokaru 13 Ta. Po implantaci se změřily největší a nejmenší průměr segmentu nádoru pomocí okulárového mikrometru operačního mikroskopu. Ledvina byla vrácena zpět do tělesné dutiny a incize v břišní stěně byla uzavřena hedvábným šitím a kožní řez byl uzavřen svorkami na rány. Podávání léků začalo v den následující po implantaci a pokračovalo 12o samců nahých myší (starých 6 až 8 týdnů) pomocí trokaru 13 Ta. Po implantaci se změřily největší a nejmenší průměr segmentu nádoru pomocí okulárového mikrometru operačního mikroskopu. Ledvina byla vrácena zpět do tělesné dutiny a incize v břišní stěně byla uzavřena hedvábným šitím a kožní řez byl uzavřen svorkami na rány. Podávání léků začalo v den následující po implantaci a pokračovalo 12 dnů, kdy byly ledviny opět vyjmuty z dutiny břišní a měřila se velikost nádorů stejným způsobem, jak je popsán výše. Objem nádoru se vypočítával ze vzorce V = délka x šířka/2, jak je popsáno v práci autorů Houchens, D.P., Ovejera, A.A. a Backer, A.D. (The therapy of human tumors in athymic (nudě) mice; N Houchens, D.P. a Ovejera, A.A. (vydavatelé) Proceedings ofthe Symposium on the Use of Athymic (Nudě) Mice in Cancer Research, S. 267-280. New York: Gustav Fischer New York, Ing., 1978). Výsledky jsou uvedeny v tabulce 2.

Tabulka 2

Inhibice růstu nádoru lidské prostaty PC-3 na nahých myších (pokus č. 1, test používající implantát pod ledvinné pouzdro).

Pokud č. 1		V/V_o, mm³ (průměr ± střední odchylka)	%T/C^b
Bez léčby		4,4 ± 0,8^a	100
Příklad 1	1 mg/kg i.p. denně	4,8 ± 3,l^a	109
	3 mg/kg i.p. denně	2,0 ± l,0^a	44

^a V/Vo = objem v 0. den/objem ve 12. den, ^b % T/C = (průměrný objem u léčených zvířat ve 12. den/průměmý objem u kontrolních zvířat ve

12. den)x 100

-79CZ 291604 B6

PATENTOVÉ NÁROKY

Claims

1. 6,9-Disubstituované 2-[trans-(4-aminocyklohexyl)amino] puriny obecného vzorce Ir (I), ve kterém: ío R je vybrán ze skupiny zahrnující R2, R2NH- a H₂N-R3- ve kterých.

R2 je vybrán ze skupiny zahrnující alkylovou skupinu obsahující 1 až 8 atomů uhlíku a skupinu obecního vzorce Π:

R4

I —(C)n—Z

I R4 (ii).

15 ve kterém:

Z je vybrán ze souboru zahrnujícího fenylovou skupinu, heterocyklickou skupinu a cykloalkylovou skupinu,

20 přičemž heterocyklická skupina je vybrána ze souboru zahrnujícího piperidinylovou skupinu, pyridinylovou skupinu, izoxazolylovou skupinu, tetrahydrofuranylovou skupinu, pyrrolidinylovou skupinu, morfolinylovou skupinu, piperazinylovou skupinu, benzimidazolylovou skupinu, thiazolylovou skupinu, thiofenovou skupinu, furanylovou skupinu, indolylovou skupinu, 1,3-benzhodioxolylovou skupinu, tetrahydropyranylovou skupinu, imidazolylovou skupinu,

25 tetrahydrothienylovou skupinu, pyranylovou skupinu, dioxanylovou skupinu, pyrrolylovou skupinu, pyrimidinylovou skupinu, pyrazinylovou skupinu, triazinylovou skupinu, oxazolylovou skupinu, purinylovou skupinu, chinolinylovou skupinu nebo izochinolinylovou skupinu, a cykloalkylovou skupinou se míní alicyklický zbytek obsahující 3 až 8 atomů uhlíku, a

R4 každý jednotlivě znamená navzájem na sobě nezávisle atom vodíku nebo alkylovou skupinu obsahující 1 až 4 atomy uhlíku, a n je celé číslo 1 až 8, přičemž každá z uvedených alkylových skupin obsahujících 1 až 8 atomů uhlíku a Z je případně substituována jedním až třemi substituenty, které mohou být stejné nebo rozdílné a které jsou vybrány ze soboru zahrnujícího atom halogenu OH a alkylovou skupinu obsahující 1 až 4 atomy uhlíku,

-80CZ 291604 B6

R3 představuje alkylenovou skupinu obsahující 1 až 8 atomů uhlíku a

2. 6,9-Disubstituované 2-[trans-(4-aminocyklohexyl)amino]puriny podle nároku 1 obecného vzorce I, ve kterém

R znamená R2, přičemž

R2 znamená alkylovou skupinu obsahující 1 až 8 atomů uhlíku, případně substituovanou jedním až třemi substituenty, které mohou být stejné nebo rozdílné a které jsou vybrány ze souboru zahrnujícího atom halogenu, OH a alkylovou skupinu obsahující 1 až 4 atomy uhlíku;

3. 6,9-Disubstituované 2-[trans-(4-aminocyklohexyl)amino]puriny podle nároku 2, kterými jsou:

dihydrochlorid 2-[trans-(4-aminocyklohexyl)amino]-6-(butylamino)-9-cyklopentylpurinu, dihydrochlorid 2-[trans-(4-aminocyklohexyl)amino]-6-(oktylamino)-9-cykIopentylpurinu, dihydrochlorid 2-[trans-(4-aminocyklohexyl)amino]-6-[(3-(3-methyl-4-hydroxy)butyl)amino]-9-cyklopentylpurinu, dihydrochlorid 2-[trans-(4-aminocyklohexyl)amino-6-[(5-hydroxy-l,5-dimethylhexyl)amino9-cyklopentylpurinu, dihydrochlorid 2-[trans-(4-aminocyklohexyl)amino]-6-[5-(hydroxy)pentylamino]-9-cyklopentylpurinu, dihydrochlorid 2-[trans-(4-aminocyklohexyl)amino]-6-[(3-hydroxypropyl)amino]-9-cyklopentylpurinu, dihydrochlorid 2-[trans-(4-aminocyklohexyl)amino]-6-(pentylamino)-9-cyklopentylpurinu, dihydrochlorid 2-(trans-(4-aminocyklohexyl)amino]-6-(methylamino)-9-cyklopentylpurinu, dihydrochlorid 2-[trans-(4-aminocykIohexyl)amino]-6-(ethylamino)-9-cyklopentylpurinu, dihydrochlorid 2-[trans-(4-ammocyklohexyl)amino]-6-[(3-methylbutyl)amino]-9-cyklopentylpurinu, dihydrochlorid 2-[trans-(4-aminocyklohexyl)amino]-6-[(butyl)amino]-9-(2-propyl)purinu, dihydrochlorid 2-[trans-(4-aminocyklohexyl)amino]-6-(hexylamino)-9-cyklopentylpurinu, dihydrochlorid 2-[trans-(4-aminocyklohexyl)amino]-6-(propylamino)-9-cyklopentylpurinu, dihydrochlorid 2-[trans-(4-aminocyklohexyl)amino]-6-[2,2,2-trifluorethylamino]-9-cyklopentylpurinu.

4. 6,9-Disubstituované 2-[trans-(4-aminocyklohexyl)amino]puriny podle nároku 1 obecného vzorce I, ve kterém:

R znamená R2, přičemž

R2 znamená skupinu obecného vzorce II

-81 CZ 291604 B6

R4

I (C)^{n z} (II),

R4 ve kterém

Z znamená fenylovou skupinu případně substituovanou jedním až třemi substituenty, které 5 mohou být stejné nebo rozdílné a které jsou vybrány ze souboru zahrnujícího atom halogenu, OH a alkylovou skupinu obsahující 1 až 4 atomy uhlíku,

R4 každý představuje navzájem na sobě nezávisle atom vodíku nebo alkylovou skupinu obsahující 1 až 4 atomy uhlíku, a n je celé číslo od 1 do 8,

R1 je vybrán ze souboru zahrnujícího cyklopentylovou skupinu a izopropylovou skupinu,

15 a farmaceuticky přijatelné soli, optické izomery a hydráty odvozené od těchto sloučenin.

5. 6,9-Disubstituované 2-[trans-(4—aminocyklohexyl)amino]puriny podle nároku 4, kterými jsou:

20 dihydrochlorid (S)-2-[trans-(4-aminocyklohexyl)amino]-6-[(a-methylbenzyl)amino]-9-cyklopentylpurinu, dihydrochlorid 2-[trans-(4-aminocyklohexyl)amino]-6-(3-jodbenzylamino)-9-cyklopentylpurinu, dihydrochlorid 2-[trans-(4-aminocyklohexyl)amino]-6-[(3,4-dichlorbenzyl)amino]-9-cyklo25 pentylpurinu, dihydrochlorid 2-[trans-(4-aminocyklohexyl)amino]-6-[(3-methylbenzyl)amino]-9-cyklopentylpurinu, dihydrochlorid 2-[trans-(4-aminocyklohexyl)amino]-6-[(3-chlor)benzylammo]-9-(2-propyl)purinu,

30 dihydrochlorid (R)-2-[trans-(4-aminocyklohexyl)amino]-6-[(a-methylbenzyl)amino]-9cyklopentylpurinu, dihydrochlorid 2-[trans-(4-aminocyklohexyl)amino]-6-[(2-chlorbenzyl)amino]-9-cyklopentylpurinu, dihydrochlorid 2-[trans-(4-aminocyklohexyl)amino]-6-(4-fenylbutylamino)-9-cyklopentyl35 purinu, dihydrochlorid 2-[trans-(4-aminocyklohexyl)amino)-6-[3-(fenyl)propylamino]~9-cyklopentylpurinu, dihydrochlorid 2-[trans-(4-aminocyklohexyl)amino]-6-[(4-chlorbenzyl)amino]-9-cyklopenylpurinu,

40 dihydrochlorid 2-[trans-(4-aminocyklohexyl)amino]-6-[(3-chlorbenzyl)amino]-9-cyklopentylpurinu, dihydrochlorid 2-[trans-(4-aminocyklohexyl)amino]-6-[(4-chlor-2-fluorbenzyl)amino]-9cyklopentylpurinu, dihydrochlorid 2-[trans-(4-aminocyklohexyl)amino]-6-[(2-fluorbenzyl)amino]-9-cyklopentyl45 purinu, dihydrochlorid 2-[trans-(4-aminocyklohexyl)amino]-6-[2-(fenyl)ethylamino]-9-cyklopentylpurinu,

-82CZ 291604 B6 dihydrochlorid 2-[trans-(4-aniinocyklohexyl)amino]-6-[(4-hydroxyfenyl)ethylamino]-9cyklopentylpurinu, trihydrochlorid 2-[trans-(4-aminocyklohexyl)amino]-6-(benzylainino)-9-(2-propyl)purinu, dihydrochlorid 2-[trans-(4-aminocyklohexyl)amino]-6-[benzylamino]-9-cyklopentylpurinu, dihydrochlorid 2-[trans-(4-aminocykIohexyl)ammo]-6-[(2,4-dichlorbenzyl)amino]-9-cyklopentylpurinu, dihydrochlorid 2-[trans-(4-aminocyklohexyl)amino]-6-[(4-florbenzyl)amino]-9-cyklopentylpurinu, dihydrochlorid 2-[trans-(4-aminocyklohexyl)amino]-6-[(3-jodbenzyl)amino]-9-(2-propyl)purinu.

6. 6,9-Disubstituované 2-[trans-(4—aminocyklohexyl)amino] puriny podle nároku 1 obecného vzorce I, ve kterém:

R je R2, přičemž

R2 znamená skupinu obecného vzorce II

R4 (C)it Z (ii),

R4 ve kterém:

Z znamená heterocyklickou skupinu případně substituovanou jedním až třemi substituenty, které mohou být stejné nebo rozdílné a které jsou vybrány ze souboru zahrnujícího atom halogenu OH a alkylovou skupinu obsahující 1 až 4 atomy uhlíku,

7. 6,9-Disubstituované 2-[trans-(4-aminocyklohexyl)amino] puriny podle nároku 6, kteiými jsou:

dihydrochlorid 2-[trans-(4-aminocyklohexyl)amino]-6-[(3-indolyl}-2-ethylamino]-9-cyklopentylpurinu, dihydrochlorid 2-[trans-(4-aminocyklohexyl)amino]-6-[2-(3,4-methylendioxyfenyl)ethylamino]-9-cyklopentylpurinu, dihydrochlorid 2-[trans-(4-aminocyklohexyl)amino]-6-[(3-pyridyl)-2-ethylamino]-9-cyklopentylpurinu, dihydrochlorid 2-[trans-(4-aminocyklohexyl)amino]-6-[(4-pyridyl)methylamino]-9-cyklopentylpurinu, trihydrochlorid 2-[trans-(4-aminocyklohexyl)amino]-6-[3-(4-morfolinyl)propylamino]-9cyklopentylpurinu,

-83CZ 291604 B6 dihydrochlorid 2-[trans-(4-aminocyklohexyl)amino]-6-[2-(2-pyridyl)ethylamino]-9-cyklopentylpurinu, trihydrochlorid 2-[trans-(4-aminocyklohexyl)amino]-6-[2-(4-morfolinyl)ethylamino]-9cyklopentylpurinu, dihydrochlorid 2-[trans-(4-ammocyklohexyl)amino]-6-(2-thiofenmethylamino)-9-cyklopentylpurinu, dihydrochlorid 2-[trans-(4-aminocyklohexyl)amino]-6-[(2-benzimidazolyl)methylamino]-9cyklopentylpurinu, dihydrochlorid 2-[trans-(4-ammocyklohexyl)amino]-6-[(2-tetrahydropyranyl)methylamino]9-cyklopentylpurinu, dihydrochlorid 2-[trans-(4-aminocyklohexyl)amino]-6-[(4-pyridyl)-2-ethylamino]-9-cyklopentylpurinu, dihydrochlorid 2-[trans-(4-aminocyklohexyl)amino]-6-(2-furanmethylamino)-9-cyklopentylpurinu, trihydrochlorid 2-[trans-(4-aminocyklohexyl)amino]-6-[(3-(2-imidazoyl)propyl)amino]-9-(2propyl)purinu, dihydrochlorid 2-[trans-(4-aminocyklohexyl)amino]-6-[3-( 1 -imidazolyl)propylamino]-9cyklopentylpurinu, dihydrochlorid 2-[trans-(4-aminocykIohexyl)amino]-6-[3-(2-imidazoyl)propylamino]-9cyklopentylpurinu.

8. 6,9-Disubstituované 2-[trans-(4-aminocyklohexyl)amino] puriny podle nároku 1 obecného vzorce I, ve kterém:

R je R2, přičemž

R2 znamená skupinu obecného vzorce Π

Γ (C)n Z (ii),

R4 ve kterém:

Z znamená cykloalkylovou skupinu případně substituovanou jedním až třemi substituenty, které mohou být stejné nebo rozdílné a které jsou vybrány ze soboru zahrnujícího atom halogenu, OH a alkylovou skupinu obsahující 1 až 4 atomy uhlíku,

R4 každý představuje navzájem na sobě nezávisle atom vodíku nebo alkylovou skupinu obsahující 1 až 4 atomy uhlíku, a n je celé číslo do 1 do 8,

9. 6,9-Disubstituované 2-[trans-(4-aminocyklohexyl)amino] puriny podle nároku 8, kterými jsou:

-84CZ 291604 B6 dihydrochlorid 2-[trans-(4-aininocyklohexyl)amino]-6-[(cyklohexyl)methylainino]-9-cyklopentylpurinu, dihydrochlorid 2-[trans-(4-aminocyklohexyl)amino]-6-[(cyklopropyl)methylamino]-9-(2propyl)purinu, dihydrochlorid 2-[trans-(4-aminocyklohexyl)amino]-6-[(cyklopropyl)methylamino]-9-cyklopentylpurinu.

10. 6,9-Disubstituované 2-[trans-(4-aminocyklohexyl)amino] puriny podle nároku 1 obecného vzorce I, ve kterém:

R znamená skupinu R2NH-, přičemž

R2 znamená alkylovou skupinu obsahující 1 až 8 atomů uhlíku případně substituovanou jedním až třemi substituenty, které mohou být stejné nebo rozdílné a které jsou vybrány ze souboru zahrnujícího atom halogenu, OH a alkylovou skupinu obsahující 1 až 4 atomy uhlíku,

11. 6,9-Disubstituované 2-[trans-(4-aminocyklohexyl)amino] puriny podle nároku 10, kterými jsou:

dihydrochlorid 2-[trans-(4-aminocyklohexyl)amino]-6-[2,2,2-trifluorethylhydrazino]-9-cyklopentylpurinu, dihydrochlorid 2-[trans-(4-aminocyklohexyl)amino)-6-(2-hydroxyethylhydrazino)-9-cyklopentylpurinu.

12. 6,9-Disubstituované 2-[trans-(4-aminocyklohexyl)amino] puriny podle nároku 1 obecného vzorce I, ve kterém:

R znamená skupinu R2NH-, přičemž

R2 znamená skupinu obecného vzorce Π:

R4

I (C)n Z _(II),

I

R4 ve kterém:

-85CZ 291604 B6 a farmaceuticky přijatelné soli, optické izomery a hydráty odvozené od těchto sloučenin.

13. 6,9-Disubstituovaný 2-[trans-(4-aminocyklohexyl)amino] purin podle nároku 12, kteiýmje:

14. 6,9-Disubstituované 2-[trans-(4-aminocyklohexyl)amino] puriny podle nároku 1 obecného vzorce I, ve kterém:

R znamená skupinu R2NH-, přičemž

R2 znamená skupinu obecného vzorce Π:

R4

I (C)ⁿ 2 íin.

R4 ve kterém:

15. 6,9-Disubstituované 2-[trans-(4-aminocyklohexyl)amino] puriny podle nároku 1, obecného vzorce I, ve kterém:

R znamená skupinu R2NH-, přičemž

R2 znamená skupinu obecného vzorce Π:

R4

I —(C)n—Z _(n),

R4 ve kterém:

16. 6,9-Disubstituované 2-[trans-(4-aminocyklohexyl)amino] puriny podle nároku 15, obecného vzorce I, ve kterém:

R znamená skupinu H₂N-R3-, ve které

R3 znamená alkylenovou skupinu obsahující 1 až 8 atomů uhlíku a

17. 6,9-Disubstituované 2-[trans-(4-aminocyklohexyl)amino] puriny podle nároku 16, kterými jsou :

dihydrochlorid 2-[trans-(4-aminocyklohexyl)amino]-6-[(4-aminobutyl)amino]-9-cyklopentylpurinu, nebo dihydrochlorid 2-[trans-(4-aminocyklohexyl)amino]-6-[(8-aminooktyl)amino]-9-cyklopentylpurinu.

18. Použití purinů obecného vzorce I podle nároku 1 pro přípravu léčiva k léčení hyperproliferativní poruchy.

19. Použití podle nároku 18, při kterém touto hyperproliferativní poruchou je stav neoplastického onemocnění.

20. Použití podle nároku 18, při kterém tento stav neoplastického onemocnění je vybrán ze souboru zahrnujícího leukémii, karcinom, adenokarcinom, sarkom, melanom nebo smíšený typ novotvaru.

21. Použití podle nároku 19, při kterém leukemie je vybrána ze souboru zahrnujícího akutní lymfolastickou leukémii, chronickou leukémii, akutní myeloblastovou leukémii a chronickou myelocytovou leukémii.

22. Použití podle nároku 19, při kterém karcinom je vybrán ze souboru zahrnujícího karcinom čípku, prsu, prostaty, jícnu, žaludku, tenkého střeva, tlustého střeva, vaječníků a plic.

23. Použití podle nároku 19, při kterém adenokarcinom je vybrán ze souboru zahrnujícího adenokarcinom čípku, prsu, prostaty, jícnu, žaludku, tenkého střeva, tlustého střeva, vaječníků a plic.

-87CZ 291604 B6

24. Použití podle nároku 19, při kterém sarkom je vybrán ze souboru zahrnujícího esteron, osteosarkom, lipom, lipsarkom, hemangiom a hemangiosarkom.

25. Použití podle nároku 19, při kterém melanom je vybrán ze souboru zahrnujícího 5 amelanotický melanom a melanotický melanom.

26. Použití podle nároku 19, při kterém smíšený typ novotvaru je vybrán ze souboru zahrnujícího karcinosarkom, lymfoidní tkáňový typ, folikulámí retikulum, buněčný sarkom a Hodgkinsovu nemoc.

27. Použití podle nároku 18, při kterém hyperproliferativní poruchou je stav neoplastického onemocnění.

28. Použití sloučeniny obecného vzorce I podle nároku 1 pro přípravu léčiva k prevenci

15 apoptózy v neuronálních buňkách.

29. Použití podle nároku 28, kde apoptóza je vyvolána antioneoplastickými činidly.

30. Použití podle nároku 28, kde apoptóza je vyvolána cerebrovaskulámím onemocněním

31. Použití podle nároku 28, kde apoptóza je vyvolána mrtvicí nebo infarktem.

32. Použití sloučeniny obecného vzore I podle nároku 1 k přípravě léčiva k ochraně neuronových buněk před apoptózou.

²⁵

33. Použití sloučeniny obecného vzorce I podle nároku 1 k přípravě léčiva k ochraně neuronových buněk před poškozením vyvolaným antineoplastickými činidly.

34. Farmaceutický prostředek pro ochranu neuronových buněk před apoptózou a poškozením 30 vyvolaným antineoplastickými činidly, vyznačující se tím, že obsahuje účinné množství 6,9-disubstituovaného 2-[trans-(4-aminocyklohexyl)amino]purinu obecného vzorce I podle nároku 1 ve směsi nebo v jiném spojení s inertním nosičovým materiálem.

35. Farmaceutický prostředek pro ochranu neuronových buněk před apoptózou a poškozením 35 vyvolaným antineoplastickými činidly, vyznačující se tím, že obsahuje 6,9-di- substituovaný 2-[trans-(4-aminocyklohexyl)amino]purin obecného vzorce I podle nároku 1 v množství účinném pro inhibice cdk2 ve směsi nebo v jiném spojení s inertním nosičovým materiálem.