CZ20004136A3 - Humánní deadenylační nukleasa, způsob její přípravy a její použití - Google Patents

Abstract

Řešení se týká nukleové kyseliny kódující humánní deadenylační nukleasu, která má aminokyselinovou sekvenci odpovídající SEQ 11 nebo některé z jejích funkčních variant nebo jejich částí obsahujících nejméně 8 nukleotidů. Dále se týká způsobů jejich výroby a léčiv a diagnostik tyto látky obsahujících. Rovněž se týká použití uvedených látek.

Description

Oblast techniky

Tento vynález se týká humánní deadenylační nukleasy (DAN), její kódující nukleové kyseliny a rovněž způsobu její přípravy a jejího použití.

Dosavadní stav techniky

Intracelulární koncentrace mRNA je pravděpodobně řízena nejenom rychlostí její tvorby, nýbrž i rychlostí odbourávání. Přitom mRNA zřejmě nejsou odbourávány nějakou náhodnou nukleolytickou reakci, nýbrž specifickými mechanismy a při rychlostech odbourávání, které jsou pro příslušnou RNA specifické. V současné době jsou známy dva způsoby odbourávání, při nichž maj i rozhoduj ící úlohu póly(A)-konce molekul. V E.coli jsou póly(A)-konce molekul navázány na mRNAs nebo mRNA-fragmenty generované působením RNAse E. Zdá se, že póly(A)-konec molekuly funguje jako relativně nestrukturovaná jednotka určující vytváření komplexu, který obsahuje vedle jiných proteinů i procesivní 3’-exonukleasu představovanou polynukleotid-fosforylasou, a který obsahuje RNA-závislou ATPasu, která pomáhá exonuklease překonávat inhibující sekundární struktury v mRNA. Podobný mechanismus zřejmě funguje v chloroplastech.

V eukaryontech vede exonukleolytické zkracování póly(A)-konců molekul rovněž k odbourávání mnoha, nikoli však všech mRNA. Na rozdíl od tohoto procesu, probíhajícího v bakteriích, zřejmě póly(A)-odbourávající exonukleasa nepokračuje v odbourávání 3’-UTR a kódující sekvence.

-2• ·· · · ···

Namísto toho zřejmě eukaryotická exonukleasa po odbourání póly(A)-konce molekul přestane působit. U S. cerevisiae zahrnuje druhý krok odbourávání mRNA odstranění 5’-Cap-struktury působením specifické pyrofosfatasy. K odstranění CAP však dochází teprve až po zkrácení póly(A)-konce na cca 10 až 15 nukleotidů. Odstraněním CAP-struktury se uvolní přístup k mRNA pro 5’-exonukleasy, jejichž nejdůležitější zástupce je kódován XRN1-genem.

Sledování počátečního deadenylačního procesu v buňkách savců je poměrně jednoduché, naproti tomu sledování dalších kroků je obtížné vzhledem k rychlosti následujících procesů odbourávání a vzhledem k tomu, že chybějí analyzovatelné meziprodukty. Nepřímé důkazy však nasvědčují tomu, že k odstranění CAP-struktury dochází ve druhém kroku. Jeden homolog XRNl-genu byl popsán u myší. Stabilní mRNA se obecně deadenylují pomalu a nestabilní mRNA se deadenylují rychle. Rychlost odbourávání závisí na přítomnosti určitých destabilizuj ících sekvencí v 3’-UTR nebo v kódující sekvenci. Mutace v těchto sekvencích vedou nejenom ke stabilizaci mRNA, ale rovněž i ke zpomalení deadenylace. Naproti tomu inaktivace stabilizujícího prvku α-globulin-mRNA vede k nestabilitě a k urychlení deadenylace. Tyto údaje jednoznačně nasvědčují tomu, že odbourávání mRNA je regulováno rychlostí deadenylace.

Deadenylace některých mRNA může vést i k inaktivaci translace. To lze vysvětlit důležitostí póly(A)-konce pro iniciaci translace. Deadenylace jako kontrolní mechanismus translace má rozhodující roli při zrání oocytů a při rané embryonegesi u řady živočišných druhů. Tak např. u Drosophila reguluje polaritu embrya tzv. hunchback mRNA.

U obratlovců je možno v podstatě rozlišit při zrání oocytů a rané embryogenezi tři deadenylační reakce:

1. V nezralých oocytech je většina mRNA uložena v translačně-inaktivní formě s krátkými póly(A)-konci řetězce. Příkladem je mRNA pro tPA tkáně (tissue plasminogen activator) u myší. Zpočátku získá tato mRNA dlouhý póly(A)-konec řetězce při normální polyadenylační reakci, a tento konec se potom při deadenylaci zkrátí na oligo(A)-konec. Toto zkrácení je řízeno sekvencemi v 3’-UTR.

2. Při zrání oocytů probíhá deadenylace vedoucí k inaktivaci těch mRNA, které měly původně dlouhé póly(A)-konce řetězce a které byly aktivní v raných stadiích vývoje vajíčka. Tato deadenylace není závislá na specifických sekvencích v mRNA. Deadenylují se všechny mRNA s výjimkou těch, které jsou chráněny aktivním adenylačním procesem.

3. V průběhu rané embryogeneze se určité mRNA deadenyluji při specifické reakci, která rovněž vyžaduje specifické sekvence v 3’-UTR.

Všechny tři deadenylační reakce probíhají v cytoplasmě. Na rozdíl od somatických buněk však zůstávají tyto oligoadenylované nebo deadenylované mRNA v oocytech stabilní a znovu se adenyluji nebo odbourávají až v pozdějších vývojových stadiích.

Enzymy řídící tyto reakce nebyly doposud plně identifikovány. Bylo prokázáno, že odbourávání poly(A)- v kvasinkách je přímo nebo nepřímo závislé na póly(A)- vazném proteinu (ΡΑΒΙ). I když byla PABl-závislá Póly(A)nukleasa (PAN) vyčištěna (Sachs A.B. a Deardoff (1992) Cell, 70,

-4··· ·· ·· · · · ·« ···

961; Lovell, J.E. a spol. (1992) Genes Dev., 6, 2088), bylo možno zjistit u mutantů příslušných genů (PAN2 a PAN3) pouze nepatrné defekty při deadenylaci (Boeck, R. a spol. (1996) 271 (1), 432; Brovn, C. a spol. (1996) 16 (10) 5744).

Kórner Ch.G. a Vahle, E. (1997) J.Biol.Chem., 272,

10448, No.16 popsali póly(A)-specifickou 3’-exoribonukleasu o » z telecího brzlíku závislou na Mg o molekulové hmotnosti 74 kDa, která byla rovněž označena jako deadenylační nukleasa (DAN). Tato popsaná DAN z telecího brzlíku byla za určitých reakčních podmínek stimulována cytoplasmatickým póly(A)-vázajícím proteinem I (PAB I) (Kórner, Chr. a Vahle, E. (1997), supra) a byla použita jako Substrát Poly(A).

Podstata vynálezu

Cílem tohoto předkládaného vynálezu byla příprava humánní póly(A)-specifické 3’-exoribonukleasy.

V genové bance překvapivě nebyl nalezen žádný blíže charakterizovaný a sekvencovaný klon, který by podle tohoto vynálezu kódoval humánní deadenylační nukleasu (humánní DAN) .

Předmětem tohoto vynálezu je tudíž nukleová kyselina kódující humánní DAN s aminokyselinovou sekvencí podle SEQ 11 nebo její funkční varianta a její části s minimálně 8 nukleotidy, přednostně s minimálně 15 nebo 20 nukleotidy, zejména s minimálně 100 nukleotidy a zvláště preferovaně s minimálně 300 nukleotidy (dále uváděná jako nukleová kyselina podle tohoto vynálezu).

Tato kompletní nukleová kyselina kóduje protein se 639 aminokyselinami a s molekulovou hmotností 73,5 kDa. Exprese této nukleové kyseliny v E.coli vedla k proteinu, který vykazoval obdobné enzymatické aktivity jako DAN, kterou popsali Korner, Chr. a Vahle, E. (1997, supra). Další pokusy provedené podle tohoto vynálezu potvrdily, že v případě této nukleové kyseliny jde o nukleovou kyselinu, která kóduje humánní DAN. Tato nukleová kyselina podle tohoto vynálezu byla uložena dne 25. března 1998 v Německé sbírce mikroorganismů a buněčných kultur DSMZ - Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Mascheroder Veg lb, 38124 Braunschweig, pod číslem DSM 12075.

Preferovanou formou provedení je nukleová kyselina podle tohoto vynálezu, kterou je DNA nebo RNA, přednostně dvouvláknová DNA, zejména DNA se sekvencí nukleových kyselin podle SEQ 12 v pozici 58 až v pozici 1977. Obě tyto pozice označují podle tohoto vynálezu začátek a konec kódující oblasti.

Pojmem funkční varianta se podle tohoto vynálezu rozumí nukleová kyselina, která se funkčně používá s humánní DAN-kódující nukleovou kyselinou a je zejména humánního původu. Jako příklady použitých nukleových kyselin je možno uvést nukleové kyseliny z různých lidských buněk resp. tkání nebo alelické varianty. Tento předkládaný vynález zahrnuje rovněž varianty nukleových kyselin, které mohou pocházet z různých lidských jedinců.

V dalším významu se rozumí pod pojmem varianty podle tohoto vynálezu nukleové kyseliny vykazující homologii, zejména identitu sekvencí minimálně z cca 60 %, raději z cca 75 %, zejména z cca 90 % a především z cca 95 %.

Části nukleových kyselin podle tohoto vynálezu mohou být např. použity pro získávání jednotlivých epitopů, jako sondy pro identifikaci dalších funkčních variant nebo jako antisense-nukleové kyseliny. Tak např. nukleová kyselina skládající se minimálně z cca 8 nukleotidů je vhodná jako antisense-nukleová kyselina, nukleová kyselina skládající se minimálně z cca 15 nukleotidů je vhodná jako primér při PCR-postupu, nukleová kyselina skládající se minimálně z cca 20 nukleotidů je vhodná pro identifikaci dalších variant a nukleová kyselina skládající se minimálně z cca 100 nukleotidů je vhodná jako sonda.

V další preferované formě provedení obsahuje nukleová kyselina podle tohoto vynálezu jednu nebo několik nekódujících sekvencí a/nebo jednu póly(A)-sekvenci. Nekódujícími sekvencemi j sou např. intronové nebo regulační sekvence, jako jsou promotorové nebo enhancerové sekvence, pro řízení exprese genu kódovaného humánní DAN.

V další formě provedení je nukleová kyselina podle tohoto vynálezu obsažena ve vektoru, přednostně v expresním vektoru nebo v genově-terapeuticky účinném vektoru.

Těmito expresními vektory mohou být např. prokaryotické nebo eukaryotické expresní vektory. Příkladem prokaryotických expresních vektorů pro expresi v E.coli jsou např. T7 expresní vektor pGMIO (Martin,1966) kódující expresi N-terminálního Met-Ala-His6-Tagu, který umožňuje výhodné čištění exprimovaného proteinu přes sloupec Ni -NTA. Jako eukoaryotické expresní vektory pro expresi v Saccharomyces cerevisiae jsou vhodné např. vektory p426Met25 nebo p426GALl (Mumberg a spol. (1994) Nucl. Acids

Res., 22, 5767), pro expresi v buňkách hmyzu je možno použít např. Baculovirus-vektory, uvedené v EP-B1-0127839 nebo EP-B1-0549721 a pro expresi v buňkách savců je možno použít např. vektory SV40, které jsou všeobecně dostupné.

Expresní vektory obsahují zpravidla regulační sekvence vhodné i pro hostitelskou buňku, jako jsou např. trppromotor pro expresi v E.coli (viz např. EP-B1-0154133), ADH-2-promotor pro expresi v kvasinkách (Russel a spol. (1983), J.Biol.Chem. 258, 2674), baculovirus-polyhedrinpromotor pro expresi v buňkách hmyzu (viz např. EP-B10127839) nebo raný (fruh) SV40-promotor nebo LTRpromotory např. z MMTV (Mouše Mammary Tumor Virus /virus tumoru myších mléčných žláz/; Lee a spol. (1981)

Nátuře, 214, 228).

Příklady genově-terapeuticky účinných vektorů jsou virusvektory, především adenovirusvektory, zejména replikačně-deficientní adenovirusvektory nebo adenoasociované virusvektory, např. adenoasociováný virusvektor, skládající se výhradně ze dvou insertovaných terminálních opakovaných sekvencí (ITR).

Vhodné adenovirusvektory jsou popsány např. v pracích McGrory, V.J. a spol. (1988) Virol. 163, 614; Gluzman,

Y. a spol. (1982) v práci Eukaryotic Viral Vectors (Gluzman, Y. edit.), 187 Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, New York; Chroboczek, J. a spol. (1992)

Virol. 186, 280; Karlsson, S. a spol. (1986) EMBO J. 5,

2377 nebo ve V095/00655.

Vhodné adeno-asociované virusvektory jsou popsány např. v pracích Muzyczka, N. (1992) Curr.Top. Microbiol.

Immunol. 158, 97; VO95/23867; Samulski, R.J. (1989) J.

Virol. 63, 3822; VO95/23867; Chiorini, J.A. a spol. (1995) Human Gene Therapy 6, 1531 nebo Kotin, R.M. (1994) Human Gene Therapy 5, 793.

Genově-terapeuticky účinné vektory je možno získat i tak, že nukleová kyselina podle tohoto vynálezu vytvoří komplex s liposomy. K tomu jsou vhodné směsi liposomů, které popsali Felgner, P.L. a spol. (1987) Proč. Nati. Acad. Sci. USA 84, 7413; Behr, J.P. a spol. (1989) Proč. Nati. Acad. Sci. USA 86, 6982; Felgner, J.H. a spol. (1994) J. Biol. Chem. 269, 2550 nebo Gao, X. a Huang, L. (1991) Biochim. Biophys. Acta 1189, 195. Při této přípravě liposomů se DNA naváže iontově na povrch liposomů, a to v takovém poměru, aby na povrchu zůstal výsledný kladný náboj (Nettoladung), a aby liposomy úplně navázaly DNA do komplexu.

Nukleové kyseliny podle tohoto vynálezu je možno syntetizovat např. chemicky pomocí sekvence obsažené v SEQ12 nebo pomocí peptidové sekvence obsažené v SEQ11 s použitím genetického kódu např. podle fosfotriesterové metody (viz např. Uhlman, E. a Peyman, A. (1990) Chemical Reviews, 90, 543, No.4). Další možností pro získání nukleové kyseliny podle tohoto vynálezu je izolace ze vhodné genové banky, např. z humánní genové banky pomocí vhodné sondy (viz např. Sambrook, J. a spol. (1989) Molecular Cloning. A laboratory Manual. 2^nt^. Edition, Cold Spring Harbor, New York). Jako sondy jsou vhodné např. jednovláknové DNA-fragmenty o délce cca 200 až 500 nukleotidů, zejména o délce cca 300 až 400 nukleotidů, jejichž sekvence je možno odvodit ze sekvence nukleové kyseliny podle SEQ 12.

Dalším předmětem tohoto vynálezu je i samotný polypep-9-

tid s aminokyselinovou sekvencí podle SEQ 11 nebo jeho funkční varianta a jeho části minimálně se šesti aminokyselinami, přednostně minimálně s 12 aminokyselinami, zejména minimálně se 65 aminokyselinami a především se 638 aminokyselinami (dále uváděný jako polypeptid podle tohoto vynálezu). Tak na příklad je možno získat epitop obsahující polypeptid s cca 6-12, přednostně s cca 8 aminokyselinami, který po kopulaci s nosičem je možno použít pro přípravu specifických póly- nebo monoklonálních protilátek (viz např. US 5,656,435). Polypeptidy o délce minimálně 65 aminokyselin je možno používat pro přípravu póly- nebo monoklonálních protilátek i přímo bez nosiče.

Pojmem funkční varianta ve smyslu tohoto vynálezu se rozumějí polypeptidy, které mají obdobnou funkci jako peptid podle tohoto vynálezu, t.zn., že mají póly(A)-specifickou 3’-exoribonukleasovou aktivitu a jsou aktivní zejména při dvojích reakčních podmínkách. Při prvních reakčních podmínkách je za nepřítomnosti soli aktivita zcela závislá na přítomnosti spermidinu. Za nepřítomnosti spermidinu je aktivita tohoto enzymu závislá na koncentraci soli. Kromě toho za přítomnosti ΡΑΒΙ bylo za určitých reakčních podmínek pozorováno postupné odbourávání póly(A)-konce řetězce (viz též Kórner, Chr.G. a Vahle, E. (1997), supra). Produkty odbourání se liší především svou délkou o cca 30 nukleotidů. Variantami se rozumí i alelické varianty nebo polypeptidy odvozené z jiných lidských buněk resp. tkání. Rozumí se tím i polypeptidy pocházející z různých lidských jedinců.

V dalším smyslu se tím rozumí i polypeptidy vykazující homologii sekvencí, zejména identitu sekvencí z cca 70 %, raději z cca 80 %, zejména z cca 90 % a především z 95 % s polypeptidem s aminokyselinovou sekvencí podle SEQ 11.

Dále se sem zahrnuje i delece polypeptidu v oblasti 1-60, výhodně cca 1-30, zejména 1 - 15 a především cca 1-5 aminokyselin. Tak např. může chybět první aminokyselina methionin, aniž by se funkce tohoto polypeptidu podstatně změnila. Kromě toho se sem zařazují i fusní proteiny, které obsahují výše uvedené polypeptidy podle tohoto vynálezu, přičemž tyto fusní proteiny jako takové již obsahují funkci humánní DAN nebo tuto specifickou funkci získají až po odštěpení fušního podílu. Především se sem zařazují fusní proteiny s podílem zejména nehumánních sekvencí tvořených cca 1 až 200, raději cca 1 až 150, zejména cca 1 až 100 a především cca 1 až 50 aminokyselinami. Jako příklady nehumánních peptidových sekvencí je možno uvést prokaryotické peptidové sekvence, např. z galaktosidasy z E.coli nebo tzv. Histidin-Tag, např. Met-Ala-His^-Tag. Fusní protein obsahující tzv. Histidin-Tag je obzvláště vhodný pro čištění exprimovaného proteinu přes sloupce obsahující kovové ionty, např. přes sloupec obsahující Ni -NTA. NTA představuje komplexotvorné činidlo, kterým je nitrilotrioctová kyselina (Qiagen GmbH, Hilden).

Části polypeptidu podle tohoto vynálezu představují např. epitopy, které je možno specificky rozpoznat pomocí protilátek.

Při porovnání se známými nukleasami bylo zjištěno, že polypeptid podle tohoto vynálezu patří do skupiny tzv. RNaseD-Familie. V obr. 4 jsou zachyceny aminokyseliny vázané (konservierte) v EXO I, Exo II a EXO III motivech, které jsou pro tuto třídu exonukleas charakteristické. Ostatní vázané aminokyseliny jsou znázorněny na šedém podkladu. Tři kyselé aminokyselinové postranní řetězce, dva v exo I-doméně a jeden v exo III-doméně vážou přímo dva Mg^

- 11 • · ionty, které se podílejí na enzymatické hydrolýze. Třetí kyselý postranní aminokyselinový řetězec lokalizovaný v exo II-doméně váže jeden z těchto kovových iontů prostřednictvím molekuly vodného můstku (Vasserbrůckenmolekůle). Všechny tyto aminokyselinové zbytky jsou v rámci této skupiny látek (Familie) vysoce konzervovány a byly nalezeny i v humánní DAN podle tohoto vynálezu. Polypeptid podle tohoto vynálezu je možno proto nazvat póly(A)-specifická 3’-exoribonukleasa ze skupiny RNase D-Familie.

Polypeptid podle tohoto vynálezu byl připraven např. expresí nukleové kyseliny podle tohoto vynálezu ve vhodném expresním systému jak bylo popsáno dříve pomocí metod, které jsou odborníkům všeobecně známy. Jako hostitelské buňky byly vhodné např. buňky E.coli kmeny DH5, HB101 nebo BL21, kmen kvasinek Saccharomyces cerevisiae, linie hmyzích buněk Lepidopteran, např. ze Spodoptera Frugiperda nebo živočišné buňky jako jsou COS, Věro, 293 a HeLa, které je možno běžně získat.

Uvedené části polypeptidu je možno získat zejména také pomocí klasické syntézy peptidů (Merrifield-technika). Jsou vhodné zejména pro získávání antisér, jejichž pomocí je možno prozkoumávat vhodné genově-expresní banky pro získávání dalších funkčních variant polypeptidu podle tohoto vynálezu.

Další předmět tohoto vynálezu se vztahuje na postup přípravy polypeptidu podle tohoto vynálezu, přičemž nukleová kyselina podle tohoto vynálezu je exprimována ve vhodné hostitelské buňce a případně izolována.

Další předmět tohoto vynálezu se vztahuje i na proti- 12-

látky, které s polypeptidem podle tohoto vynálezu specificky reagují, přičemž výše uvedené části polypeptidu jsou buď samy imunogenní nebo je lze imunogenizovat navázáním na vhodný nosič, jako je např. hovězí sérový albumin resp. je možno jejich imunogenitu zvýšit.

Protilátky jsou buď polyklonální nebo monoklonální. Jejich příprava, která je rovněž předmětem tohoto vynálezu, se provádí např. podle všeobecně známých metod imunizací savců, např. králíků, polypeptidem podle tohoto vynálezu nebo jeho uvedenými částmi, případně za přítomnosti např. Freundova adjuvantu a/nebo aluminiumhydroxidových gelů (viz např. Diamond, B.A. a spol. (1981) The New England Journal of Medicine, 1344). Polyklonální protilátky vzniklé ve zvířatech imunologickou reakcí je možno nakonec pomocí všeobecně známých metod snadno z krve izolovat a vyčistit např. pomocí sloupcové chromatografie. Preferováno je afinitní čištění protilátek, při němž se např. C-terminální DAN-fragment naváže na NHS-aktivovaný HiTrap sloupec.

Monoklonální protilátky je možno připravit např. pomocí známých metod, které publikovali Vinter a Milstein (Vinter, G. a Milstein, C. (1991) Nátuře, 349, 293).

Dalším předmětem tohoto vynálezu je rovněž léčivo, které obsahuje nukleovou kyselinu podle tohoto vynálezu nebo polypeptid podle tohoto vynálezu a případně vhodné přísady nebo pomocné látky, a rovněž postup přípravy takovéhoto léčiva pro léčení rakoviny, autoimunitních onemocnění, zejména pro léčení roztroušené sklerosy nebo rheumatoidní arthritidy, Alzheimerovy nemoci, alergií, zejména neurodermitidy, alergií typ I nebo typ IV, arthrosy, atherosklerosy, osteoporosy, akutních a chronických

infekčních onemocnění a/nebo diabetů a/nebo pro ovlivnění buněčného metabolismu, zejména při imunosupresi, obzvláště při transplantacích, přičemž se nukleová kyselina podle tohoto vynálezu, např. tzv. antisense-nukleová kyselina nebo polypeptid podle tohoto vynálezu kombinuje s farmaceuticky vhodnými přísadami nebo pomocnými látkami.

Pro genově-terapeutické použití u člověka je vhodné zejména léčivo, které obsahuje nukleovou kyselinu podle tohoto vynálezu jako takovou (v holé - nackte formě) nebo ve formě jednoho z výšeuvedených genově-terapeuticky účinných vektorů nebo ve formě komplexů s liposomy.

Jako vhodná přísada nebo pomocná látka se hodí např. fyziologický roztok kuchyňské soli, stabilizátory, proteinasové inhibitory, nukleasové inhibitory atd.

Dalším předmětem tohoto vynálezu je i diagnostický prostředek obsahující nukleovou kyselinu podle tohoto vynálezu, polypeptid podle tohoto vynálezu nebo protilátky podle tohoto vynálezu a případně vhodné přísady a pomocné látky a rovněž postup přípravy tohoto diagnostického prostředku pro diagnosu rakoviny, autoimunitních onemocnění, zejména roztroušené sklerosy nebo rheumatoidní arthritidy, Alzheimerovy nemoci, alergií, zejména neurodermitidy, alergií typ I nebo typ IV, arthrosy, atherosklerosy, osteoporosy, akutních a chronických infekčních onemocnění a/nebo diabetů a/nebo pro analýzu buněčného metabolismu, zejména stavu imunity, obzvláště při transplantacích, přičemž se k nukleové kyselině podle tohoto vynálezu, polypeptidu podle tohoto vynálezu nebo k protilátkám podle tohoto vynálezu přidají vhodné přísady a/nebo pomocné látky.

- 14Tak např. je možno podle tohoto vynálezu s použitím nukleové kyseliny podle tohoto vynálezu připravit diagnostikům na bázi polymerasové řetězové reakce (PCR-diagnostika, např. podle EP-0200362) nebo na bázi Northern Blot-analýzy, jak je blíže popsáno v Příkladu 5. Tyto testy jsou založeny na specifické hybridizaci nukleové kyseliny podle tohoto vynálezu s komplementárním vláknem odpovídajícím příslušné mRNA. Nukleová kyselina podle tohoto vynálezu může být přitom modifikována např. postupem podle EP 0 063 879. Přednostně se DNA-fragment podle tohoto vynálezu označí pomocí vhodných činidel, např. pomocí radioaktivních látek a o např. α-P -dATP nebo neradioaktivních látek jako je napr. biotin, podle všeobecně známých metod a inkubuje se s izolovanou RNA, vázanou přednostně na vhodných membránách např. z celulózy nebo nylonu. Přitom je výhodné izolovanou RNA před hybridizaci a navázáním na membránu rozdělit podle velikosti, např. pomocí elektroforézy na agarosovém gelu.

Při stejném množství sledované RNA z každého vzorku tkáně je tak možno stanovit množství mRNA, specificky označené sondou.

Další diagnostikům obsahuje polypeptid podle tohoto vynálezu resp. jeho výšeuvedené imunogenní části. Tento polypeptid resp. jeho části, navázané přednostně na tuhé fázi, např. na nitrocelulose nebo na nylonu, je možno uvést do styku in vitro se sledovanou tělní tekutinou, např. krví, aby mohlo např. dojít k reakci s autoimunitními protilátkami. Tento komplex protilátka - peptid je potom možno prokázat např. pomocí značkovaných antihuman-IgG- nebo antihuman-IgM-protilátek. Při tomto značkování se jedná např. o enzym jako je peroxidasa, který katalýzuje barevnou reakci. Přítomnost autoimunitních protilátek a jejich množství je tak možno snadno a rychle prokázat pomocí * · • · ·

- 15 barevné reakce.

Další diagnostikům obsahuje protilátky podle tohoto vynálezu jako takové. Pomocí těchto protilátek je možno např. u vzorku lidské tkáně rychle a snadno zjistit, zda obsahuje příslušný polypeptid. V tomto případě jsou protilátky podle tohoto vynálezu značeny např. pomocí enzymu, jak bylo popsáno dříve. Specifický komplex protilátka-peptid je tak možno snadno a rychle prokázat pomocí enzymatické barevné reakce.

Další předmět tohoto vynálezu se týká i testu pro identifikaci funkčních interaktorů, jako jsou např. inhibitory nebo stimulátory obsahující nukleovou kyselinu podle tohoto vynálezu, polypeptid podle tohoto vynálezu nebo protilátky podle tohoto vynálezu a případně vhodné přísady a/nebo pomocné látky.

Vhodným testem pro zjišťování funkčních identifikátorů je např. tzv. Two-Hybrid System (Fields, S. a Sternglanz, R. (1994) Trends in Genetics, 10, 286). Při tomto testu se buňka, např. buňka kvasinek, transformuje (transformiert o. transfiziert) s jedním nebo více expresními vektory exprimujícími fusní protein, který obsahuje protein podle tohoto vynálezu a DNA-vaznou doménu známého proteinu, např. Gal4 nebo LexA z E.coli a/nebo exprimujícími fusní protein obsahující neznámý polypeptid a transkripčně-aktivační doménu obsahující např. Gal4, herpesvirus VP16 nebo B42. Kromě toho obsahuje tato buňka reportergen, např. LacZ-gen z E.coli, Green fluorescence protein nebo gen pro aminokyselinovou biosyntézu (Aminosáure-Biosynthesegen) z kvasinek His3 nebo Leu2, který kvasinky reguluje prostřednictvím regulačních sekvencí, jako jsou např.

»· « « V • ·

- 16·» «· » · » » « · · · · tt · • > · «« · » · lexA-promotor/operátor nebo tzv. Upstream Activation Sequence (UAS). Tento neznámý polypeptid je kódován např. DNA-fragmentem pocházejícím z genové banky, např. z humánní genové banky. Zpravidla se zároveň připravuje cDNA-genová banka pomocí popsaných expresních vektorů v kvasinkách, takže je možno tento test provést ihned.

Tak na příklad se v kvasinkovém expresním vektoru klonuje nukleová kyselina podle tohoto vynálezu ve funkční jednotce na nukleovou kyselinu kódující lexA-DNA-vaznou doménu, takže se exprimuje fusní protein z polypeptidu podle tohoto vynálezu a LexA-DNA-vazné domény v transformovaných kvasinkách. V jiném kvasinkovém expresním vektoru byly cDNA-fragmenty klonovány z cDNA-genové banky ve funkční jednotce na nukleovou kyselinu kódující Gal4-transkripčněaktivační doménu, takže byl exprimován fusní protein z neznámého polypeptidu a Gal4 transkripčně-aktivační domény v transformovaných kvasinkách. Kvasinky, které jsou např. Leu2, transformované oběma expresními vektory, obsahují nadto nukleovou kyselinu, která kóduje Leu2 a která je řízena LexA-promotor/operátorem. V případě funkční interakce mezi polypeptidem podle tohoto vynálezu a neznámým polypeptidem se váže Gal4-transkripčně-aktivační doména přes LexA-DNA-vaznou doménu na LexA-promotor/operátor, který se aktivuje a exprimuje Leu2-gen. To má za následek, že Leu2-kvasinky mohou růst na minimálním mediu, které neobsahuje žádný leucin.

Při použití LacZ- resp. Green Fluorescence Proteinreportergenu namísto genu pro biosyntézu aminokyselin je možno aktivaci transkripce prokázat tím, že se tvoří modře resp. zeleně fluoreskující kolonie. Modré resp. fluorescenční zabarvení je možno snadno prokázat spektrometríčky

- 17např. v případě modré barvy při 585 nm.

Tímto způsobem je možno snadno a rychle prozkoumat expresní genové banky na přítomnost polypeptidů, které s polypeptidem podle tohoto vynálezu reagují. Nakonec je možno nalezené nové polypeptidy izolovat a dále charakterizovat.

Další možností použití systému Two-Hybrid-System je ovlivnění interakce mezi polypeptidem podle tohoto vynálezu a známým nebo neznámým polypeptidem působením dalších látek, např. chemických sloučenin. Tímto způsobem je možno i snadno zjistit nové cenné chemicky syntetizovatelné účinné látky, které je možno použít jako terapeutické prostředky. Tento vynález se proto nevztahuje pouze na postup pro vyhledávání polypeptidických interaktorů, nýbrž zahrnuje i postup pro vyhledávání látek, které mohou s výšeuvedeným protein-protein-komplexem reagovat. Takovéto peptidické a rovněž chemické interaktory j sou proto ve smyslu tohoto vynálezu označovány jako funkční interaktory, které mohou mít inhibující nebo stimulující účinek.

Další možností použití polypeptidu podle tohoto vynálezu je póly(A)-specifické odbourávání nukleových kyselin, zejména mRNA. Póly(A)-specifické odbourávání nukleových kyselin se může uplatnit zejména ve výzkumných laboratořích.

Následující obrázky a příklady blíže ilustrují tento vynález, aniž by jej jakkoli omezovaly.

- 18Přehled obrázků na výkresech

SEQ 11 znázorňuje aminokyselinovou sekvenci humánní DAN s doménami pro Exo I (ADFFAIDGEFSGIS), Exo II (LVIGHNMLLDVMHTVH) a Exo III (SEQLHEAGYDAYITGLC).

SEQ 12 znázorňuje aminokyselinovou sekvenci humánní DAN včetně start- (Pos.58) a stopkodonu (Pos. 1977) s navazuj icím 3 ’UTR.

Obr. 1 znázorňuje eluční profil humánní DAN na MonoQ (obr. 3A) a na SDS-PAGE (obr. IB a 1C).

Obr. 2 znázorňuje Vestern-Blot-analýzu rekombinantní humánní DAN a nativní bovinní DAN

Obr. 3 zachycuje deadenylaci mRNA, akumulaci deadenylované RNA a vliv ΡΑΒΙ

Obr. 4 zachycuje porovnání známých nukleas s humánní

DAN podle tohoto vynálezu

Příklady provedení vynálezu

Příklad 1

Identifikace humánních DAN cDNA-klonů

Čištění bovinní DAN bylo provedeno postupem který popsali Kórner, G. a Vahle E. (1997), supra, následovně:

- 19Všechny čisticí operace byly prováděny při 4 °C.

Mezi jednotlivými čisticími operacemi byly vzorky namrazeny v kapalném dusíku a zmrazený na - 80 °C. Byl použit následující základní pufr: 50 mM Tris/HCll mM EDTA, 10 % (obj.) glycerin, 1 mM dithiothreitol, 0,4 pg/ml leupeptinhemisulfát, 0,7 pg/ml pepstatin, 0,5 mM fenylmethylsulfonylfluorid, 0,02 % (obj.) Nonidet P-40, pH 7,9. Při různých čisticích operacích byly k tomuto základnímu pufru přidávány různé koncentrace KCI, jak je popsáno dále.

Čerstvý telecí brzlík byl odebírán z místních jatek, převážen na ledu a skladován při teplotě - 80 °C. 1 kg brzlíku byl nechán roztát ve 2 1 základního pufru s 50 mM KCI a v homogenizátoru Varing Blendar byl homogenizován nejprve při nízké, později při střední a nakonec při nejvyšší rychlosti. Získaný homogenizát byl odstřeďován 1 hodinu při 16 000 x g a supernatant byl dekantován a přelit přes gázu s širokými oky. (Vahle, E., J. Biol. Chem., 266, 1991).

Tento extrakt z telecího brzlíku byl nanesen na sloupec DEAE Sepharosy FF (objem sloupce 4 1) a eluován při solném gradientu 50 až 600 mM KCI při 2,5-násobku objemu náplně kolony při průtoku 3 1/hod. Aktivní frakce byly vymývány z kolony při koncentraci soli mezi 75 a 200 mM KCI. Tyto frakce byly spojeny, přečištěny, zředěny síranem amonným na 30 % nasycený roztok a míchány 1,5 hod. na ledu. Po odstředění (30 min., 10 800 x g, tyto podmínky platí i pro dále uvedená odstřeďování) byl supernatant upraven pomocí síranu amonného na 50 %ní nasycení a znovu bylo provedeno míchání na ledu a odstředění. Sediment byl resuspendován ve 400 ml základního pufru s 50 mM KCI

a dialyzován po dobu 10 hodin proti 2 x 4,5 1 základního pufru a znovu odstřeďován. Sloupec Sepharose-Blue (7 x 36 cm) o objemu 1,4 1 byl ekvilibrován základním pufrem s 50 mM KC1 a dialyzovaný extrakt byl nanesen na kolonu. Tato kolona byla promyta základním pufrem o objemu 1,5-násobku objemu sloupce s 250 mM KC1 a eluována základním pufrem o objemu 1-násobku objemu sloupce s 1 M KC1 (rychlost průtoku 2 1/h).

Aktivní frakce z těchto dvou preparací vždy z 1,2 kg telecího brzlíku byly spojeny a vysráženy síranem amonným (60 %ní nasycení). Po odstředění byl sediment vyjmut do 200 ml základního pufru s 50 mM KC1, 12 hodin dialyzován proti 3x41 stejného pufru a ve dvou podílech nanesen na kolonu naplněnou Heparin-Sepharosou (2,5 x 37 cm). Tato kolona byla promyta základním pufrem o objemu 1,5-násobku objemu sloupce s 50 mM KC1 a nakonec eluována desetinásobkem objemu sloupce při gradientu do 500 mM KC1 (rychlost průtoku: 145 ml/h). Aktivní DAN byla eluována mezi 80 a 150 mM KC1. Aktivní frakce byly spojeny a dialyzovány proti základnímu pufru s 30 mM KC1 po dobu 4 hodiny. Dialyzát byl odstředěn a ve dvou podílech byl chromatografován na koloně s MonoQ FPLC (objem náplně 8 ml). Tato kolona byla promyta základním pufrem o objemu 2-násobku objemu sloupce s 50 mM KC1 a nakonec byla při gradientu se stoupající koncentrací soli (konečná koncentrace: 500 mM KC1, rychlost průtoku: 2,5 ml/h vymyta celkovým objemem 320 ml. Aktivní DAN byla eluována při cca 160 mM KC1. Aktivní frakce (40 ml) byly spojeny a 4 hodiny dialyzovány proti 2 1 základního pufru s 30 mM KC1, odstředěny a naneseny na další kolonu naplněnou MonoQ (objem náplně 1 ml, rychlost průtoku 0,9 ml/h). Aktivní DAN vázaná ve sloupci byla eluována základním pufrem s 500 mM KC1 a ve čtyřech podílech nanesena na kolonu naplněnou přípravkem Superdex HR 10/30 FPLC (ekvilibrace se

základním pufrem s 300 mM KC1, rychlost průtoku : 0,15 ml/h) (Korner, Ch.G. a Vahle, E. (1997), supra).

Různé frakce z kolony naplněné Superdexem, které vykazovaly DAN-aktivitu, byly shromážděny a rozděleny na koloně s přípravkem Phenyl-Superose (Korner, Ch.G. a Vahle, E. (1997), supra). Aktivní frakce byly shromážděny a diylazovány proti pufru (50 mM Tris-HCl, pH 7,9, 1 mM EDTA, 10 % (obj.) glycerin, 1 mM dithiothreitol, 0,4 μg/ml leupeptin-hemisulfát, 0,7 pg/ml pepstatin, 0,5 mM fenylmethylsulfonát (PMSF), 0,02 % (obj.) Nonidet p-40, 50 mM KC1). Po odstředění byl získaný dialyzát nanesen na kolonu se 100 plSmart MonoQ (PC 1.6/5). Nakonec byla kolona promyta 200 μΐ pufru. Vázané proteiny byly při gradientu se stoupající solnou koncentrací (konečná koncentrace 500 mM KC1) vymyty celkovým objemem odpovídajícím 40-násobku objemu náplně kolony. Frakce s pozitivní DAN-aktivitou byly eluovány při koncentraci cca 200 mM KC1. Dvě frakce s nejvyšší DAN-aktivitou byly analyzovány pomocí elektroforézy na SDS-polyakrylamidovém gelu. Nakonec byla provedena hydrolýza pomocí enzymu Protease Lys-C, rozdělení pomocí HPLC a bylo provedno sekvencování peptidů. Byly nalezeny následující sekvence:

1. KSFNFYVFPK,

2. KPFNRSSPD (V/K)K,

3. KYAESYVIQTYADYVG a rovněž

4. směs která se skládala z KEQEELNDA a KLFLMRVMD.

N-terminální sekvenci čištěné bovinní DAN nebylo možno

• · · · · stanovit.

Nakonec byla provedena EST (expressed sequence tags)-rešerše databanky pomocí programu BLAST (NCBI).Byly tak identifikovány následující klony:

I.M.A.G.E.-Konsortium klon ID 645295 pomocí peptidu 1 a 2 a

I.M.A.G.E.-Konsortium klon ID 301901 pomocí peptidu 3.

Úplné stanovení sekvencí nalezených klonů bylo provedeno na přístroji ABI373A-Sequenziergerát s použitím sady ABI Dye Terminátor Cycle Sequencing Kit.

Přitom bylo zjištěno, že I.M.A.G.E.-Konsortium klon ID 301901 kóduje 176 C-terminálních aminokyselin z DAN a celý 3’-UTR, zatímco I.M.A.G.E.-Konsortium klon ID645295 kóduje celý ORF a 5’-UTR a část 3’-UTR, což odpovídá proteinu se 639 aminokyselinami o molekulové hmotnosti 73,5 kDa (SEQ11). 57 nukleotidů, které byly vázány vzestupně (stromaufvárts) od prvního AUG kodonu neobsahovalo žádný stop-kodon v rastru (Leseraster). Tyto sekvence (AGAAUGG) obklopující tento AUG-kodon odpovídají tzv. Kozákovým pravidlům (Kozák, 1991), která popisují startovní sekvence preferované pro start translace. 3’-UTR o velikosti 0,7 kB se nachází v cDNA-klonu 645295 a póly(A)-konec molekuly se nechází na konci klonu 301901. Póly(A)-konci molekuly předchází ve vzestupném směru (stromaufwárts) vzácný polyadenylační signál AUUAAA (SEQ 12).

-23 Příklad 2

Příprava expresních vektorů

Plasmid pGMMCS byl konstruován následujícím způsobem:

Expresní vektor pGMIO (Martin, 1996), který obsahuje PABII cDNA-sekvenci (Nemetli, 1996) s N-terminálním označením (Tag) Met-Ala-His6-Tag byl vystaven působení Xho I a BamH I a získaný fragment, který obsahuje 3’-část PAB II byl nahrazen Xho I/BamH I-fragmentem z klonovacího místa Multiple Cloning Site z pBluescript KS (+/-) plasmidu. Získaný plasmid obsahuje sekvenci kontrolovanou

T7-promotorem, která začíná Met-Ala-Hisg a za tím následuje 5’-část z PAB II a Multi Cloning Site. Štěpné místo Nde I leží mezi His^-Tag a PAB II sekvencí a je možno je využít spolu s Multi Cloning Site k nahrazení zbývající PAB II sekvence jakoukoli kódující sekvencí.

Plasmid pGMMCS 301901 byl připraven následujícím způsobem:

Část sekvence humánního DAN-klonu obsahujícího 176 C-terminálních aminokyselin byla amplifikována s použitím PCR z klonu 301901 za následujících podmínek:

cyklů: 45 sek. při 94 °C, 45 sek. při 54 °C a 3,5 min. při 72 °C.

Pfu-polymerasa a primery Nde I 301901:

CCATATCCATATGCTTTTCAGTGCCTTTCCTAAC a Xho I 301901:

AGTACTCGAGTTACAATGTGTCAGG. Po působení Nda I a Xho I byly vzniklé cDNA-fragmenty čištěny s použitím sady Qia-Ex-Kit (Quiagen GmbH, Hilden) a integrovány do pGMMCS-vektoru t

• · ·

-24upraveného působením Nde I a Xho I. Tato sekvence byla potvrzena sekvencováním (Sequenzierung).

Plasmid pGMMCS645295 byl připraven následovně:

Kódující sekvence humánního DAN-klonu byla amplifikována s použitím PCR z klonu 645295 za následujících podmínek:

cyklů: 45 sek. při 94 °C, 45 sek. při 54 °C a 3,5 min. při 72 °C.

Pfu-polymerasa a primery Nde 1645295:

AGTGTCGCATATGGAGATAATCAGGAGCA a Xho I 645295:

AGTACTCAGCGGTTTGCTGCCCTCA. Vzniklý produkt byl klonován ve vektoru pCR2.1 za pomoci sady TA-Klonierungs-Kit (Invitrogen^). Po úpravě pomocí Nde I a Xho I byly vzniklé cDNA-fragmenty čištěny s použitím sady Qia-Ex-Kit (Quiagen) a integrovány do pGMMCS-vektoru upraveného pomocí Nde I a Xho I. Nakonec byla velká část sekvence generované při PCR odstraněna úpravou (Verdau) s použitím Dra III a BstE II a nahrazena příslušným fragmentem původního klonu. Tato nová sekvence byla potvrzena sekvencováním.

Příklad 3

Příprava protilátek

Protilátky proti C-terminální části humánní DAN byly získány následujícím způsobem:

Plasmid pGMMCS 301901 byl transformován v BL21 (pLysC).

Buňky byly inkubovány při 37 °C v SOB-mediu s 200 gg/ml

-25 přípravku Carbenicellin až do OD600 od 1,9 (bis zu einer OD600 von 1,9). Nakonec bylo přidáno 200 μΜ isopropyl-β-ϋ-thiogalaktosidu a inkubace byla prováděna dalších 5 hodin. Buňky byly shromážděny a převedeny do pufru A (100 mM NaH₂P0₄, 10 mM Tris, 8 M močovina, pH 7,9). Lýza buněk byla provedena ultrazvukem, lyzát byl odstředěn a inkubován po dobu 2 h při laboratorní teplotě s 3 ml Ni-NTA-náplní kolony. Tato náplň byla potom vložena do kolony a promyta 70 ml pufru A, pH 6,3. Nakonec byl sloupec promyt 15 ml pufru B (300 mM NaCI, 10 % (obj.) glycerin, 50 mM Tris,

0,01 % (obj.) Nonidet-P40, 8 M močovina, pH 7,9). Protein zůstal na koloně zadržen, přičemž byl obsah močoviny snížen dvěma gradienty močoviny (45 ml/h, gradient 1: pufr B z 8 na 4 M močoviny při laboratorní teplotě, gradient 2: ze 4 na 0 M močoviny při 4 °C). Protein byl z kolony eluován pufrem B, který obsahoval 500 mM imidazolu, dialyzován proti pufru B bez močoviny a použit pro imunizaci králíků.

Afinitní čištění anti-DAN-protilátky bylo provedeno následujícím způsobem:

C-terminální DAN-fragment byl navázán na NHS-aktivovaný HiTrap-sloupec (1 ml objem, Pharmacia, Freiburg) podle návodu výrobce. Na sloupec byly vloženy 3 ml séra a kolona byla promývána podle návodu výrobce. K získaným frakcím bylo přidáno 300 gg/ml BSA a 0,02 % (hmot./obj.) NaN^ a pufr byl vyměněn pomocí dialýzy.

Příklad 4

Exprese a čištění humánní DAN

Humánní DAN byla exprimována v E.coli jako fusní protein s N-terminálním His-Tagem (Met-Ala-His^-Tag) následujícím způsobem:

Plasmid pGMMCS645295 byl transformován v BL21 (pLysC). Buňky byly vloženy do 50 ml LB-media se 100 pg/ml přípravku Carbenicellin a s 24 gg/ml chloramfenikolu při 37 °C a potom byly převedeny do 500 ml kultury bez chloramfenikolu a dále byly inkubovány při 33 °C. Po dosažení 0D600 od 1,3 bylo přidáno 100 μΜ isopropyl-β-ϋ-thiogalaktosidu a inkubace byla prováděna další hodinu. Buňky byly shromážděny a převedeny do pufru A (50 mM Tris, 300 mM KC1, 0,1 mM MgAc, 1 mM β-merkaptoethanol, 0,4 pg/ml leupeptin, 0,7 mg/ml pepstatin, 0,5 mM PMSF, pH 7,9). Lýza buněk byla provedena ultrazvukem, lyzát byl odstředěn a inkubován po dobu 2 h při teplotě 4 °C o .

se 2 ml náplně kolony Ni -NTA. Tato náplň byla potom vložena do kolony a promyta 25 ml pufru A a pak byl sloupec promyt 20 ml pufru B (pufr A a 10 % (obj.) glycerin, 0,02 % (obj.) Nonidet-P40, bez hořčíku, pH 6,3). Nakonec byl protein eluován 5 ml pufru C (pufr B s 500 mM imidazolu). Potom následovala dialýza proti pufru D (50 mM Tris, 20 mM KC1, 1 mM EDTA, 5 ml PMSF, 10 % (obj.) glycerin, 0,02 (obj.) Nonidet-P40, pH 7,9). Tento preparát byl odstředěn a nanesen na kolonu s MonoQ (objem náplně 1 ml). Nakonec byla tato kolona promyta pufrem s 50 mM KC1 o objemu 5-násobku náplně kolony a eluována pufrem s gradientem s konečnou koncentrací 500 mM KC1 o objemu 40-násobku náplně kolony. Aktivní DAN byla eluována a vytvořila ostré maximum při cca 190 mM KC1 (obr. IA).

Čištěním se získal téměř homogenní preparát proteinu s předpokládanou molekulovou hmotností (obr. IB a 1C). Tento protein vykazoval póly(A)-specifickou 3’-exoribonukleasovou

aktivitu (viz Příklad 6). Z toho vyplývá, že nalezený cDNA-klon kóduje humánní DAN.

Příklad 5

Northern-Blot-analýza

RNA byla izolována z HeLa-buněk metodou kterou publikovali Chomczynski, P, a Sacchi, N (1987) Anal.Biochem. 162, 156. Poly(A)mRNA byla čištěna pomocí oligo(dT)-celulosy podle metody uvedené v publikaci Sambrook, J. a spol., (1989) Molecular Cloning. A Laboratory Manual,

2^nd. ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. Získaná RNA byla rozdělena na 1% agaroso-formaldehydovém gelu, převedena pomocí Kapillar-Blot na Hybond N⁺ membránu od fy. Amersham Buchler, Braunschweig a na tuto membránu byla fixována při dvouhodinové inkubaci při teplotě 80 °C. Sekvence kódující humánní DAN byla amplifikována pomocí PCR, pomocí Ramdom-Priming byla označena a- P-dATP a byla použita jako sonda. Hybridizace byla provedena popsaným způsobem a membrána byla promyta za velmi přísně definovaných (Stringenz) podmínek. Northern-Blot-analýza s poly(A)⁺RNA z HeLa-buněk prokázala jediný 3,1 kB fragment, který hybridizoval se sondou DAN. Tato velikost dobře odpovídá velikosti cDNA-klonu.

Příklad 6

Test DAN-aktivity

Stanovení DAN aktivity bylo provedeno popsaným způsobem (Kórner, Chr. G. a Vahle, E. (1997), supra). Elektro-28foréza na SDS-polyakrylamidovém gelu (SDS-PAGE) byla provedena podle Laemmli, U.K. (1970) Nátuře 227, 680.

Stejně jako bovinní enzym je i rekombinantní DAN aktivní v závislosti na neutralizaci náboje fosfátu za dvou rozdílných reakčních podmínek. Za nepřítomnosti soli je aktivita zcela závislá na přítomnosti spermidinu s koncentračním optimem 1 mM. Za těchto podmínek není specifická aktivita rekombinantní DAN (79 000 jedn./mg) výrazně pdlišná od aktivity čištěné bovinní DAN (110 000 jedn./mg). Za přítomnosti spermidinu je aktivita DAN potlačována solí. Za nepřítomnosti spermidinu je aktivita enzymu závislá na koncentraci soli s koncentračním optimem 150 mM octanu draselného . Bovinní DAN se za těchto podmínek chová podobně. Za těchto podmínek je však specifická aktivita rekombinantního proteinu (960 jedn./mg) nižší než aktivita čištěného enzymu získaného z telecího brzlíku (8070 jedn./mg). Tento rozdíl je možno vysvětlit posttranslační modifikací nebo přítomností kontaminujících proteinů v tomto preparátu.

Jestliže byla polyadenylovaná RNA s připojeným Cap inkubována s DAN-preparáty za nepřítomnosti soli, došlo k degradaci póly(A)-konce molekuly a byla získána zcela deadenylovaná RNA (obr. 3). Jestliže byla provedena tato analýza (Assay) za přítomnosti ΡΑΒΙ, byla aktivita částečně inhibována a bylo pozorováno postupné odbourávání póly(A)-konce molekuly. Převládající produkty odbourávání se ve své délce lišily o cca 30 nukleotidů, což bylo způsobeno zřejmě vázáním ΡΑΒΙ. Tyto výsledky souhlasí s pracemi zabývajícími se celkovým výzkumem hovězího proteinu (Kórner, Chr. a Vahle, E. (1997), supra). Ze shrnutých výsledků vyplývá, že rekombinantní protein je póly(A)-specifická 3’-exoribonukleasa.

Příklad7

Western-Blot-analýzy

Vestern-Blot-analýzy byly provedeny následujícím způsobem:

Proteiny byly rozděleny pomocí SDS-PAGE a přeneseny na nitrocelulosovou membránu pomocí Semidry-metody (Kyše-Andersen, 1984). Jednotlivé Bloty byly inkubovány s TNT-pufrem (20 % mM Tris-HCl, 150 mM NaCl, 0,05 % (obj.) Tween 20, pH 7,5) s 5 % (hmotn./obj.) odtučněného sušeného mléka. Stejný pufr byl použit pro inkubaci s antisérem a pro promývání. Jednotlivé Bloty byly inkubovány s protilátkami po dobu 2 až 3 hodin při laboratorní teplotě a nakonec byly promyty. Vázané protilátky byly prokazovány pomocí peroxidase-konjugováných vepřových-proti-králičích-protilátek (Peroxidase-konjugierter Schwein-anti-KaninchenAntikórper) (DAKO, Glostrup, Dánsko) a chemiluminiscenčním zabarvením (SuperSignal-Kit, Pierce).

Tyto analýzy prokázaly, že králičí protilátky vznikající proti C-terminálnímu fragmentu DAN se mohou srážet z částečně čištěných frakcí DAN. Tyto protilátky je možno pozorovat při Vestern-Blot-analýze jak bovinní, tak i humánní DAN (obr. 4). Při tomto pokusu se rekombinantní DAN jeví o něco větší než enzym v SDS-lyzátech z HeLebuněk, což je možno vysvětlit zavedením Tágu (1004 Da) do této sekvence. Kdyby první AUG v cDNA-sekvenci nebyl použitý Start-kodon, musela by být přírodní DAN z HeLa-buněk minimálně o 1260 Da větší než rekombinantní protein s Tágem. I tyto výsledky potvrzují použití první AUG-sekvence v cDNA-klonu jako startovního kodonu v podmínkách in vivo.

Claims (18)

1. Nukleová kyselina kódující humánní deadenylační nukleasu (DAN) s aminokyselinovou sekvencí podle SEQ 11 nebo její funkční varianta nebo její části obsahující nejméně 8 nukleotidů, přičemž SEQ 11 je součástí tohoto nároku.

2. Nukleová kyselina podle nároku 1 , vyznačující se tím, že touto nukleovou kyselinou je DNA nebo RNA, výhodně dvouvláknová DNA.

3. Nukleová kyselina podle nároku 1 nebo 2 , vyznačující se tím, že touto nukleovou kyselinou je DNA se sekvencí nukleových kyselin podle SEQ 12 od pozice 58 do 1977, přičemž SEQ 12 je součástí tohoto nároku.

4. Nukleová kyselina podle nároku 3 , vyznačující se tím, že tato nukleová kyselina obsahuje jednu nebo více nekódujících sekvencí a/nebo jednu póly(A)-sekvenci.

5. Nukleová kyselina podle některého z nároků 1 až 4 , vyznačující se tím, že tato nukleová kyselina je zahrnuta ve vektoru, přednostně v expresním vektoru nebo v genově-terapeuticky účinném vektoru.

6. Způsob přípravy nukleové kyseliny podle některého z nároků 1 až 4 , vyznačující se tím, že se tato nukleová kyselina syntetizuje chemickým způsobem nebo izoluje

-31 ·· ·· · ·· • · · · · · · · ··· ·· · ·· • · · · · · · · * • · · · · · · ·· · · · · · · · · z genové banky pomocí sondy.

7. Polypeptid s aminokyselinovou sekvencí podle SEQ 11 nebo jeho funkční varianta a jeho části minimálně se 6 aminokyselinami.

8. Způsob přípravy polypeptidu podle nároku 7 , vyznačující se tím, že se nukleová kyselina podle některého z nároků 1 ž 5 exprimuje ve vhodné hostitelské buňce.

9. Protilátky proti polypeptidu podle nároku 7.

10. Způsob přípravy protilátky podle nároku 9 , vyznačující se tím, že se savec imunizuje polypeptidem podle patentového nároku 7 a případně vzniklé protilátky se izolují.

11. Léčivo obsahující nukleovou kyselinu podle některého z nároků 1 až 5 nebo polypeptid podle nároku 7 a případně farmaceuticky vhodné přísady nebo pomocné látky.

12. Způsob přípravy léčiva pro léčbu rakoviny, autoimunitních onemocnění, zejména roztroušené sklerosy nebo rheumatoidní arthritidy, Alzheimerovy nemoci, alergií, zejméne neurodermitidy, alergií typ I nebo typ IV, arthrosy, atherosklerosy, osteoporosy, akutních a chronických infekčních onemocnění a/nebo diabetů a/nebo pro ovlivnění buněčného metabolismu, zejména při imunosupresi, obzvláště při transplantacích, vyznačující se tím, že se nukleová kyselina podle některého z nároků 1 až 5 nebo polypeptid podle nároku 7 nebo protilátka podle nároku 9 formuluje • «« · · · · · • « ♦ · » · · ··· • · · · ·· · » » • · · * · · · · ί · pomocnými látkami kyselinu podle s farmaceuticky vhodnými přísadami nebo

13. Diagnostikům obsahující nukleovou některého z nároků 1 až 5 nebo polypeptid podle nároku 7 nebo protilátku podle nároku 9 a případně farmaceuticky vhodné přísady nebo pomocné látky.

14. Způsob přípravy diagnostického prostředku pro diagnózu rakoviny, autoimunitních onemocnění, zejména roztroušené sklerosy nebo rheumatoidní arthritidy, Alzheimerovy nemoci, alergií, zejména neurodermitidy, alergií typ I nebo typ IV, arthrosy, atherosklerosy, osteoporosy, akutních a chronických infekčních onemocnění a/nebo diabetů a/nebo pro analýzu buněčného metabolismu, zejména stavu imunity, především při transplantacích, vyznačující se tím, že se nukleová kyselina podle některého z nároků 1 až 5 nebo polypeptid podle nároku 7 nebo protilátka podle nároku 9 smísí s farmaceuticky vhodným nosičem.

15. Způsob identifikace funkčních interaktorů obsahujících nukleovou kyselinu podle některého z nároků 1 až 5 nebo polypeptid podle nároku 7 nebo protilátku podle nároku 9 a případně farmaceuticky vhodné přísady a/nebo pomocné látky.

16. Použití nukleové kyseliny podle některého z nároků 1 až 5 nebo polypeptidu podle nároku 7 pro identifikaci funkčních interaktorů.

17. Použití nukleové kyseliny podle některého z nároků 1 až 5 pro vyhledávání variant humánní DAN , vyznačující se tím, že se genová banka prozkoumává pomocí uvedené nukleové kyseliny a nalezená varianta se izoluje.

18. Použití polypeptidu podle nároku 7 pro póly(A)-specifické odbourávání nukleových kyselin, zejména mRNA.