CZ20004805A3 - Nadexprese genů fytasy v kvasinkových systémech - Google Patents

Description

Předmětem předkládaného vynálezu je produkce fytasy v kvasinkách. Kvasinkové kmeny, které exprimují heterologní fytasu a hetelogní fytasu produkovanou kvasinkami.

* Dosavadní stav techniky

Fytasy je specifická skupina monoester fosfatas, která je potřebná k počátečnímu uvolnění fosfátu (,>P) zfytinu (myoinositolhexafosfátu). Fytin je hlavní zásobní formou P v potravinách a jídlech obsahujících obilniny (Reddy N.R. et al, „Phytates in Legumes and Cereals. Advances in Food Research, 28:1 (1982)). Protože živočichové s jednoduchým žalůdkem jako např. prase a drůbež či také člověk mají v gastrointestinálním traktu jen malou fytasovou aktivitu, je téměř všechen přijatý fytinový fosfát nestráven. To vede k potřebě doplňování anorganického fosfátu pomocí drahých a neobnovitelných živin dodávaných do stravy těchto zvířat. Nežádoucí je též znečišťování přírodnho prostředí fosfáty vyměšovaným nestráveným fytinovým fosfátem skrze hnůj výše uvedených zvířat (Cromwell G.L. et al., „P-A Key Essential Nutrient. Yet a· Possible Major Pollutant - Its Centrál Role in Animal Nutrition. Biotechnology In the Feed Industry, Proceedings Altech 7th Annual Symposium, p.133 (1991)). Na fytin se dále váží esenciální stopové prvky jako je zinek, čímž fytin způsobuje výživové nedostatečnosti jako jsou růstová a mentální retardace u dětí přijímajících hlavně roslinou stravu, ze které nebyl odstraněn fytin.

I

Dvě fytasy - phyA a phyB z Aspergillus niger NRRL3135 byly klonovány a sekvenovány (Ehrlich K.C. et al., „Identification and Cloning of a Second Phytase Gene (phys) from Aspergillus niger (ficuum). Biochem. Biophys. Res. Commun., 195: 53-57 (1993); Piddington C.S. et al., „The Cloning and Sequencing of the Genes Encoding Phytase (phy) and pH 2.5 - optimum Acid Phosphatase (aph) from Aspergillus niger var. awamori. Gene, 133: 56 - 62 (1993)) . Nedávno byly izolovány nové geny fytasy z Aspergillus terreus a

Myceliophthora thermophila (Mitchell et al., „The Phytase Subfamily of Histidine Acid Phosphatases: Isolation of Genes for Two Novel Phytases From the Fungi Aspergillus terreus and Myceliophthora thermophila. Microbiology 143: 245 - 252 (1997)), Aspergillus fumigatus (Pasamotes et al. „Gene Cloning. Purification and Characterization of a Heat-Stable Phytase from the Fungus Aspergillus fumigatus Appl. Environ. Microbiol. 63: 1696 - 1700 (1997)), Emericella nidulans a Talaromyces thermophilus (Pasamontes et al. „Cloning of the Phytase from Emericella nidaluans and the Thermophilic Fungus Talaromyces thermophilus. Biochim. Biophys. Acta 1353: 217 - 223 (1997) a kukuřice (Maugenest et al. „Cloning and Characterization of cDNA Encoding a Maize Seedling Phytase. Biochem. J. 322: 511 - 517 (1997)).

Různé typy fytas byly izolovány a (nebo) purifikovány z Enterobacter sp.4 (Yoon et al. „Isolation and Identification of Phytase-Producing Bacterium. Enterobacter sp. 4 and Enzymatic Properties of Phytase Enzyme. Enzyme and Microbila Technology 18: 449-454 (1996)), Klebsiella terrigena (Greiner et al. „Purification and Characterization of Phytase from Klebsiella terrigena. Arch. Biochem.Biophys. 341: 201-206 (1997)) a Bacullus sp. DS11 (Kim et al. „Purification and Properties of the Thermostable Phytase from Bacillus sp. DS11. Enzyme and Microbial Technology 22: 2-7 (1998)). Vlastnosti těchto enzymů byly studovány. Dále byla popsána krystalografická struktura phy A z Asperfillus ficuum (Kostrewa et al. „Crystal Structure of Phytase from Aspergillus ficuum at 2.5 A Resolution. Nátuře Structure Biology 4: 185-190 (1997)).

Hartingsveldt a spolupracovnici vnesli gen phy A do A. niger a dosáhli tak desetinásobného zvýšeni phytasové aktivity oproti divokému kmeni („Cloning, Characterization and Overexpression of the Phytase-Encoding Gene (phyA) of Aspergillus Niger. Gene 127: 87-94 (1993)). Dodatečná mikrobiální fytasa z takovéhoto zdroje obsažená v potravě prasat a drůbeže se ukázala efektivní při zvyšování využití fytínového fosforu a zinku (Simons et al. : „Impovement of Phosphorus Availability By Microbilab Phytase in Broilers and Pigs. Br. J. Nutr.64: 525 (1990); Lei X.G. et al. „Supplementing CornSoybean Meals Diets With Microbila Phytase Liearly Improves Phytate P Utilization by Weaning Pigs. J.Anim. Sci. 71: 3359 (1993); Lei • * 4« · ·· *· • · · 9 · · 4 4 · 4·

9 9 9 9 9 9 94 : 4444 · · ♦ · · 9 ·4 • · · 4 4 44 ··· 9 99 999 999999

X.G. et al. „Supplementing Corn-Soybean Meals Diets With Microbila Phytase Maximizes Phytate P Utilization by Weaning Pigs. J.Anim. Sci. 71: 3368 (1993); Cromwell G.L. et al. „P-A Key essential

Nutrient. Yet a Possible Major Pollutant and its Centrál Role in Animal Nutrition. Biotechnology In the Feed Industry: Proceedings Alltech 7th Annual Symposium. P. 133 (1991)). Avšak náklady na dostupné komerční zdroje fytas a nestabilní aktivita enzymu během zahřívání při granulování krmivá předem brání praktickému využití v agroprůmyslu (Jongbloed A.W. et al. „Effect of Pelleting Mixed Feeds on Phytase Activity and Apparent Absorbability of Phosphorus and Calcium in Pigs. Animal Feed Science and Technology 28: 233-242 (1990)). Kromě toho není zřejmě fytasa produkvaná A. niger tím nejbezpečnějším zdrojem pro výrobu potravin určených člověku.

Kvasinky mohou být použity k efektivní produkci enzymu, protože rostou na jednoduchém a levném médiu. S vhodnou signální sekvencí může být enzym sekretován do média a poté výhodně izolován.

že jsou jsou bezpečným a

Některé kvasinkové expresní systémy mají další výhodu v tom, dobře přijímány v potravinovém průmyslu a efektivním producentem potravinových výrobků.

pastoris metanol jako

Pichia metabolizovat pro svou proteinů, vyšších ' T dobře známý heterologních mnoho výhod správné „zpracování proteinů posttranskripční modifikace.

tedy zřejmé, že je systém k ekonomické potravin a krmiv.

Je jednoduchý v průmyslu je metylotrofní výhradní zdroj uhlíku. Tento systém je způsobilost exprese vysokých hladin kvasinka schopná

Protože je to eukaryotní systém, eukariotních expresních systémů (protein processing), zde potřeba vyvinout produkci fytasy pro má Pichia jako jsou sbalení účinný aplikace

Podstata vynálezu

Předmětem předkládaného vynálezu je metoda produkce fytasy v kvasinkách vnesením heterologního genu kódujícího protein nebo polypeptid s fytasafosfatasovou aktivitou nebo aktivitou kysele fosfatasy do kvasinkového vlákna a expresi tohoto genu.

• ·

Předmětem předkládaného vynálezu jsou také proteiny a polypeptidy mající fytasovou aktivitu s teplotním optimem v rozmezí 57-65°C při pH od 2,5 do 3,5 či při 5,5. Zvláště důležité pro fytasu je pH optimum 2,5 až 3,5, protože toto je pH v žalůdku zvířat.

Vynález dále zajišťuje kvasinkové buňky nesoucí heterologní gen, který kóduje protein nebo polypeptid s fytasovou aktivitou a který je funkčně propojen s promotorem schopným exprese fytasy v kvasince.

Ještě dalším aspektem vynálezu je vektor mající gen z jiného organismu než kvasinky, který kóduje protein nebo polypeptid s fytasovou aktivitou, promotor, který je schopný inicializace transkripce v kvasinkách funkčně spojený s genem kódujícím peptid s fytasovou aktivitou a s počátkem replikace schopným udržet vektor v kvasinkách nebo schopným integrace do hostitelského genomu.

Vynález též zahrnuje metodu produkce proteinu nebo polypeptidu májích fytasovou aktivitu. Izolovaný gen appA, který kóduje protein nebo polypeptid s fytasovou aktivitou, je exprimován v hostitelské buňce.

Vynález také zahrnuje metodu konverze fytinu na inositol a anorganický fosfát Gen appA exprimuje protein nebo polypeptid s fytasovou aktivitou v hostitelské buňce. Fytin se poté naváže na protein nebo polypeptid. Po navázání je katalyzována přeměna fytinu na inositol a anorganický fosfát.

Popis obrázků na výkresech

Analýza rozpustného coli transformované

Obrázek

1:

připraveného indukovaným Dráha 1:

z E.

proteinu pomocí genem kódujícím Buňky byly kultivovány 4 hodiny a poté dráha 2

SDS-PAGE fytasu a sklizeny.

Markéry; dráha 2 a 3: transformanty pEPl (exprimovaný protein měl molekulovou hmotnost asi 55 kDa); dráha 4: transformant

IPTG.

transformovaný pouze expresním vektorem pET25b(+).

Obrázek 2: Analýza exprimovaného proteinu (fytasy) v E. coli pomocí Western blotu. Protilátky byly připraveny proti purifikované nativní fytase z A. niger. Každá jamka obsahovala 50 pg celkových vnitrobuněčných proteinů. Dráha 1 a 2: Rekombinantní buňky po a před indukcí. Dráha 3 a 4: kontrola (pouze expresní vektor) po a před indukcí.

*

Obrázek 3: Obraz analýzy mRNA PhyA z E.coli pomocí Nothern blotu. K analýze byla použita sonda PhyA o velikosti 1,4 kb. Každá jamka obsahovala 20 pg celkové RNA. Dráha 1 a 2: RNA izolovaná z kontrolních buněk (pouze s expresním vektorem) po a před indukcí.

Obrázek 4: Časová závislost indukované exprese fytasy (pEPl) v E.coliBL21(DE3). Buňky byly indukovány ve chvíli, kdy absorbance OD₆₀o dosáhla 0,5. V každém časovém bodě byl připraven vzorek rozpustných proteinů a kvantifikován pomocí SDS-PAGE analýzy.

Obrázek 5: SDS-PAGE analýza exprimované extracelulární fytasy ve fytasou transformované S.lividans po 72 hodinovém růstu. Buňky byly odstřeďovány 15 minut při 8000 x g. Supernatant byl poté analyzován pomocí gelové elektroforézy. Dráha 1: Markéry; dráha 2: kontrola obsahující pouze expresní vektor; dráha 3: pozitivní kolonie exprimující fytasu - molekulová hmotnost byla přibližně 57 kDa.

Obrázek 6: Analýza fytasy exprimované v S. lividans pomocí Western blotu. Při Western blotu byly použity protilátky připravené proti purifikované nativní fytase z A. niger. Každá jamka obsahovala 20 pg proteinů z kultivačního média (supernatantu). Dráha 1: Supernatant z kontroní buněčné kultury transformované vektorem; dráha 2: Supernatant z kultury inokulované positivními koloniemi.

Obrázek 7: Analýza extracelulární fytasy exprimované S. cerevisiae pomocí SDS-PAGE. Každá z jamek obsahovala 50 pg proteinů z kultivačního média (supernatantu). Dráha 1 až 3: Supernatant z kultury inokulované pozitivní kolonií a zklizené 5, 10 a 25 hodin po indukci. Dráha 4 až 6: Supernatant z kontrolní kultury transformované vektorem a zklizené 5, 10 a 25 hodin po indukci. Dráha 7: Markéry (kDa). Molekulová hmotnost exprimované fytasy byla přibližně 110 kDa (potvrzeno pomocí Western blotu).

Obrázek 8: Časová závislost extracelulární fytasové aktivity exprimované S. cerevisiae transformované konstruktem pYPPl po indukci galaktosou. Aktivita byla analyzována v supernatantu z nasbíraného média.

Obrázek 9: Analýza extracelulární fytasy exprimované S. cerevisiae pomocí Western blotu a po deglykosilaci (Endo H) . Při analýze byly použity protilátky připravené proti nativní purifikované fytase z A.niger. Dráha 1: Barevné SDS-PAGE standardy (kDa) od firmy Bio-Rad. Dráha 2 a 3: fytasa - deglykosilovaný protein - 10 a 20 pg. Dráha 4: glykosilovaná fytasa (20gg proteinu).

Obrázek 10: Nothern blot celkové RNA izolované z transformovaných buněk S. cerevisiae. Dráha 1: Kontrola (pouze s expresním vektorem pYES2). Dráha 2 a 3: Transformanty pYPPl.

Obrázek 11: Časová závislost extracelulární phyA fytasové aktivity produkované transformanty Pichia pastoris Muť (KM71) a MUT+ (X33) po indukci.

Obrázek 12: Analýza fytasy overexprimované v Pichia pomocí SDSPAGE. K transformaci byl použit konstrukt pPICZaA-PhyA ve vektoru KM71 (MUT^S).Dráha 1: proteinový žebříček. Dráha 2: 40 μΐ supernatantu AK1 (kolonie vykazovaly aktivitu extracelulární fytasy 21700 mU/ml). Kolonie byly sbírány 108 hodin po indukci. Dráha 3: 40 μΐ supernatantu kontrolního kmene overexprimujícího lidský serumalbumin (HAS. 6.7 kDa) na hladině lg/1. Dráha 4: 40 μΐ supernatantu kontroly KM71.

Obrázek 13: Vliv deglykosilace (s použitím Endo H) na termostabilitu exprimované fytasy v Pichia. Enzym byl zahříván 15 minut při 37° nebo 80°C, při pH 5,5 v 0,2 M citrátovém pufru.

Obrázek 14: Nothern analýza exprimované phyA mRNA tranformovaným kmenem Pichia pastoris (KM71 a X33). Pro bloting byla použita sonda phyA o velikosti 1,3 kb. Dráha 1 a 2: transformant KM71 před a po indukci. Dráha 3 a 4: transformant X33 po a před indukcí.

Obrázek 15: pH optimum extracelulární fytasy exprimované Pichia (X33). Pro pH 1,5, 2,5, 3,5, byl použit pufr 0,2 M glycin-HCl. Pro pH 4,5, 5,5, 6,5 byl použit 0,2 M citrát sodný a pro pH 7,5 a 8,5 byl použit pufr 0,2 M Tris-HCl.

Obrázek 16: Teplotní optimum extracelulární fytasy exprimované Pichia (X33). Stanovení bylo provedeno v 0,2 M citátovém pufru při pH 5,5.

Obrázek 17: Uvolnění volného fosforu ze sóji fytasou exprimovanou v Pichia (X33) . Pět gramů sóji bylo rozptýleno v 25 ml 0,2 M citrátu, pH 5,5 s různým množstvím enzymu. Směs byla inkubována čtyři hodiny při 37°C. Poté bylo stanoveno množství uvolněného volného fosfátu.

Obrázek 18: Časová závislost exprese aktivity extracelulární fytasy pěti transformantů Pichia pastoris obsahujících gen appA.

9« · 9·99

9 99494«

9994999 4 9 99 9 4

4 4 # 49 4 · •44 9 99 ··! «··4·»

Obrázek 19: Závislost exprese aktivity fytasy Pichia pastoris na pH média.

Obrázek 20: Analýza fytasy z E.coli overexprimované v Pichia pastoris pomoci SDS-PAGE elektroforézy. Dráha 1: Proteinový žebříček. Dráha 2 až 4: Supernatant sebraný z kultur pozitivních kolonií 23, 22, 11 ve 118 hodině po indukci.

Obrázek 21: pH optimum fytasy z E. coli overexprimované v Pichia pastoris.

Obrázek 22: Teplotní optimum fytasy z E. coli overexprimované v Pichia pastoris.

Obrázek 23: Množství volného fosfátu uvolněného ze sojové moučky fytasou z E. coli overexprimovanou v Pichia pastoris po čtyřech hodinách působení.

Detailní popis vynálezu

Předkládaný vynález zajišťuje metodu produkce fytasy v kvasinkách. Podle této metody je heterologní gen kódující protein nebo polypeptid s fytasovou aktivitou exprimován v kvasinkách.

Enzym, který katalýzuje konverzi fytínu na inositol a anorganický fosfát je obecně známý jako fytasa. Mezi mikroorganismy produkující fytasu patří bakterie jako např. Bacillus subtilis (Paver et al., J. Bacteriol. 151, 1102 (1982), který je zde zahrnut odkazem) a Pseudomona Cosgrove, Austral. J.Biol. Sci. 23: 1207 (1970), který je zde zahrnut odkazem), dále kvasinky jako např. Sacharomyces cerevisiae (Nayini et al., Lebensmittel Wissenschaft und Technologie 17: 24 (1984), který je zde zahrnut odkazem) a houby jako např. Aspergillus terreus (Yamada et al., Agric Biol. Chem. 32: 1275 (1986), který je zde zahrnut odkazem) a Aspergillus ficuum (van Gorcom et al., European Patent Application 89/202.436, který je zde zahrnut odkazem).

Fytasy jsou také endogenně přítomny v mnoha rostlinných druzích. Loewus (Plant Biology vol.9: Inositol Metabolism in Plnts (eds. D.J. Morre, W.F.Boss, F.A. Loewus), 13 (1990)) a Gellatly se spolupracovníky (Plant Physiology (supplement) 93: 562 (1990), které jsou zde zahrnuty odkazem) popisují izolaci a charakterizaci klonu cDNA fytasy získaného z bramborových hlíz. Gibson a spolupracovníci (J. Cell Biochem., 12C: L407 (1988)) a Christen se spolupracovníky (

0 ·» · 00 · · • · 0 0 ♦ · · 0 · 0 · • 0··· · 0 0 0 0 0 0 0 0 * 000 000 *** · 00 ··« ·* ··»·

J. Cell· Biochem., 12C: L402 (1988), které jsou zde zahrnuty odkazem) popsali syntézu endogenní fytasy během klíčeni semen sóji.

Je upřednostňováno, pokud je protein nebo polypeptid s fytasovu aktivitou sekretován do kultivačního média. To poté umožňuje vyšší expresi a snadnější izolaci produktu. Protein nebo polypeptid s fytasovou aktivitou je spojen se signálním sekvencí zajišťující směrování proteinu ven z buňky. Je dále upřednostňováno, pokud je signální sekvence vyštěpena z proteinu.

V upřednostňovaném provedení je heterologní gen, kódující protein nebo polypeptid s fytasovou aktivitou svázán v jediném rámci s transkripčním zesilujícím elementem.

Upřednostňované heterologní geny kódující protein s fytasovou aktivitou jsou izolovány z bakteriálních buněk. Jedním z výhodnějších genů je gen PhyA z Aspergillus niger. Gen kódující fytasu - phyA z Aspergillus niger NRRL3135 byl klonován a sekvenován (Piddington, C.S. et al., The Cloning and Sequencing of the Genes Encoding Phytase (phy) and pH 2.5-optimum Acid Phosphatase (aph) z Aspergillus niger var. Awamori, Gene, 133: 56-62 (1993), který je zde zahrnut odkazem). Hartingsveldt se spolupracovníky vnesl gen phyA do A. niger. Výsledkem bylo desetinásobné zvýšení fytasové aktivity v porovnání s divokým kmenem (Hartingsveldt et al., Cloning, Characterization and Overexpression of the Phytase Encoding Gene (phyA) of Aspergillus niger , Gene 27: 87-94 (1993), který je zde zahrnut odkazem).

Dalším vhodným heterologním genem je gen appA z E.coli. Gen, původně nazývaný jako gen kódující periplasmickou fosfoanhydridfosforylasu z E. coli (appA) obahuje 1298 nukleotidů (GeneBank accsession number: M58708). Na počátku bylo zjištěno, že tento gen kóduje v E.coli kyselou fosfatasu s pH optimem 2,5 (EcAP). Kyselá fosfatasa je monomer s molekulovou hmotností 44644 daltonů. Zralý EcAP obsahuje 410 aminokyselin (Dassa, J. et al., The Coplete Nucleotide Sequence of the Escherichia Coli Gene AppA reveals Significant Homology Between Ph 2.5 Acid Phosphatase and Glucose-1Phosphatase, J. Bacteriology. 172: 5497-5500 (1990), který je zde zahrnut odkazem). Ostanin se spolupracovníky overexprimoval appA v E. coli BL21 s použitím vektoru pT7 a aktivita kyselé fosfatasy se zvýšila přibližně 400 krát (440mU/mg protein) (Ostanin, K. et al.,

	• ♦ · i • 4 ·	• ·» · ·· «· • 4 4 · · 4 · 4 ♦ 444444 4 4 4 4 · 4 4 · 4 * 4 4 4 » 44 44 <· 4 ·
Overexpression,	Site-Directed Mutagenesis	and	Mechanism of
Escherichia Coli	Acid Phosphatase, J. Biol.	Chem.,	267: 22830-36
(1992), který je	zde zahrnut odkazem). Nebylo	známo,	že produkt genu

appA má fytasovou aktivitu.

Geny appA nebo phyA mohou být exprimovány v jakémkoliv prokaryotickém nebo eukaryotickém expresním systému. Může být použito mnoho různých hostitelských systémů a mnoho různých vektorů k expresi sekvence či sekvencí kódujících tento protein. S výhodou bude vektor obsahovat virový vektor, plasmid, kosmid nebo oligonikleotid. V první řadě musí být vektor kompatibilní s použitou hostující buňkou. Systém host vektor zahrnuje přinejmeším následující: bakterie transformované bakteriofagovou DNA, plasmidovou DNA nebo kosmidovou DNA; mikroorganismy jako např. kvasinky obsahující kvasinkové vektory; savčí buněčné systémy infikované viry (např. vakcinovým virem, adenoviry atd.); hmyzí buněčný systém infikovaný viry (např. bakulovirem) a rostlinné buňky infikované bakteriemi. Expresní elementy těchto vektorů se liší ve své síle a specifitě. V závislosti na použitém systému vektoru a hostitelského organizmu je možné použít jakýkoliv z mnoha translačních prvků.

Výhodným hostitelským organizmem k expresi appA nebo phyA jsou houby včetně kvasinek a filamentárních hub. Tyto mohou být využity jako hostitelské buňky v souvislosti s předkládaným vynálezem. Upřednostňované hostitelské buňky zahrnují rozličné kmeny Saccharomyces cerevisiae. Též mohou být použity další kvasinky jako např. Kluyveromyces, Torulaspora a Schizosaccharomyces. Ve výhodném uspořádání jsou pro overexpresi proteinu použity buňky Saccharomyces cerevisiae. Mezi filamentárními houbami jsou nejvhodnějšími hostitelskými buňkami buňky Aspergillus a Neurospora. Z kmenů Aspergillus je nejvhodnější kmenem Aspergillus niger.

V jiném výhodném uspořádání předkládaného vynálezu jsou kvasinkové kmeny methylotrofní. Methylotrofní kvasinky jsou tím druhem kvasinek, které jsou schopny používat methanol jako zdroj uhlíku k produkci potřebných zdrojů energie. Takovýto zdroj energie musí vystačit na udržení buněčných funkcí. Dále musí tyto kvasinky obsahovat gen pro expresi alkoholoxidasy. Typické methylotrofní kvasinky zahrnují členy druhů Pichia, Hansenula, Torulopsis_r Candida

99·· · 99

99 •9 ·

a Karwinskia. Tyto druhy kvasinek mohou používat methanol jako výhradní zdroj uhlíku. Nejvýhodnějším methylotrofním kvasinkovým kmenem je Pichia pastoris.

Předkládaný vynález zahrnuje také protein nebo polypeptid s fytasovou aktivitou. PhyA je exprimován v Pichia a výsledný protein má mnohem vyšší extracelulární aktivitu (okolo 65 mU/ml). Výtěžek aktivity fytasy byl přibližně 30 krát vyšší než výtěžek aktivity z buněk Saccharomyces cerevisiae transformovaných genem phyA, jedenadvacetkrát vyšší než z divokého kmene Aspergillus niger a 65000 krát vyšší než z netransformovaných buněk Pichia. pH optimum exprimované fytasy bylo 2,5 a 5,5 a teplotní optimum bylo 60°C. Podobně gen appA exprimovaný v Pichia a Saccharomyces cerevisiae vedl k proteinu majícímu mnohem vyšší extracelulární aktivitu a pH optimum (od 2,5 do 3,5), které je více požadováno.

V preferovaném uspořádáni vynálezu je protein nebo polypeptid mající fytasovou aktivitu, přičemž teplotní optimum je v rozmezí 57°C až 65°C. Ještě výhodnější uspořádání zahrnuje protein nebo polypeptid mající fytasovou aktivitu, přičemž teplotní optimum je v rozmezí 58°C až 62°C.

V ještě dalším vhodném uspořádáni je protein nebo polypeptid mající takovou fytasovou aktivitu, že po zahřívání proteinu po dobu 15 minut a teplote 80°C zůstává tato fytasová aktivita alespoň na úrovni 40% původní aktivity. Ještě výhodnější uspořádání zahrnuje protein nebo polypeptid mající takovou fytasovou aktivitu, že po zahřívání proteinu po dobu 15 minut a teplote 60°C zůstává tato fytasová aktivita alespoň na úrovni 60% původní aktivity.

Purifikovaný protein může být získán několika metodami. Protein nebo polypeptid předkládaného vynálezu je přednostně produkován v purifikované formě (přednostně o čistotě přinejmenším 80%, lépe o čistotě přinejmenším 90%) konvenčními technikami. Běžně je protein nebo polypeptid předkládaného vynálezu sekretován do růstového média rekombinantnich hostitelských buněk. Nebo je protein nebo polypeptid předkládaného vynálezu produkován, ale není sekretován do růstového média. V těchto případech je třeba k izolaci proteinu nejdříve namnožit hostiteské buňky nesoucí rekombinantní plasmid. Poté jsou tyto buňky lysovány sonikaci, teplem nebo chemickým ošetřením a homogenát je zcentrifugován tak, aby byly odstraněny zbytky buněk.

« «4 · «4·· • 4 · 4 4 · · 9 · 4 *

4« ♦ · ·44 4 »«····♦ * * «4 44 · 44«44« • 4« · ·« · ♦ Λ »9 9-f« 4

Supernatant je poté podroben sekvenčnímu srážení síranem amonným. K separaci proteinu je dále frakce obsahující protein nebo polypeptid předkládaného vynálezu podrobena gelové filtraci přes kolonu naplněnou vhodně velkým dextranem nebo polyakrylamidem.

V případě potřeby je možné frakci s požadovaným proteinem dále purifikovat pomocí HPLC.

Předkládaný vynález dále zahrnuje kvasinkové kmeny mající heterologní gen kódující protein nebo polypeptid s fytasovou aktivitou. Heterologní gen by měl být funkčně spojený s promotorem schopným zajistit expresi fytasy v kvasinkách.

Dalším aspektem vynálezu je vektor k expresi fytasy v kvasinkách. Takový vektor nese gen z jiného než hostitelského organizmu, kódující protein nebo polypeptid s fytasovou aktivitou. Gen kódující fytasu může být klonován do jakéhokoliv vektoru, který se autonomě replikuje nebo je integrován do genomu kvasinky. Počet kopií autonomě se replikujícího plasmidu např. plasmidu YEp může být vysoký, ale mitotická stabilita kvasinek může být nedostatečná (Bitter et al., Expression and Secretion Vectors for Yeas, Meth. Enzymol. 153: 516 - 44 (1987), který je zde zahrnut odkazem). Mohou obsahovat plasmidovou sekvenci 2-mu zodpovědnou za autonomní replikaci a sekvenci E. coli zodpovědnou za replikaci v E.coli. Je vhodné, aby v E. coli vektor obsahoval genetický markér pro selekci kvasinkových transformantů a gen kódující rezistenci na antibiotika vhodnou k selekci. Epizomové vektory obsahující sekvence ARS a CEN se vyskytují pouze v jedné kopii na buňku a jsou stabilnější než vektory YEp. V případě, že jsou fragmenty DNA integrovány v jedné či více kopiích do genomu kvasinky se používají integrující se vektory.

V tomto případě je rekombinantní DNA stabilní a není třeba selekce (Struhl et al., High-Frequency Transformation of Yeast: Autonomous Replication of Hybrid DNA Molecules, Proč. Nati. Acad. Sci USA 76: 1035 - 39 (1979); Powel et al., Cloning Vectors, I-IV et seq.,

Elsevier (1985); Sakai et al., Enhanced Secretin of Human Nerve Growth Factor from Saccharomyces Cerevisiae Using an Advanced δIntegration Systém, Biotechnology 9: 1382 - 85 (1991), které jsou zde zahrnuty odkazy). Některé vektory mají počátek replikace, který je funkční ve vybraných hostitelských buňkách. Přiměřený počátek replikace zahrnuje 2μ, ARS1 a 25μΜ. Vektory nesou místa pro restrikční endonukleasy pro inzerci fůznich genů, promotorových sekvenci a selekčních markérů. Vektory mohou být modifikovány vyjmutím či přidáním restrikčních míst nebo vyjmutím jiných nechtěných nukleotidů.

Gen pro fytasu může být umístěn pod kontrolu jakéhokoliv promotoru (Stetler et al., Secretion of Active, Full- and Halflenght Human Secretory Leukocyte Protease Inhibitor by Saccharomyces cerevisiae, Biotechnology 7: 55-60 (1989), který je zde zahrnut odkazem). Lze si vybrat konstitutivní nebo regulovaný promotor. Vhodné promotory pro kvasinkové vektory jsou mezi jinými promotor pro metalothionein, 3-fosfoglyceratkinasu (Hitzeman et al., J. Biol. Chem., 255: 2073 (1980, který je zde zahrnut odkazem) nebo další glykolytické enzymy (Hess et al., J. Adv. Enzyme Reg. 7: 149 (1968); Holland et al., Biochem 17: 4900 (1978), které jsou zde zahrnuty odkazem.) jako např. enolasu, glyceraldehyd-3-fosfátdehydrogenasu, hexokinasu, pyruvatdekarboxylasu, fosfofruktokinasu, glukosa-6fosfátisomerasu, 3-fosfoglyceratmutasu, pyruvátkinasu, triosofosfatisomerasu, fosfoglukosaisomerasu a glukokinasu. Další vhodné vektory a promotory pro použití při expresi v kvasinkách jsou dále popsány v EP A-73,657 (Hitzeman), který je zde zahrnut odkazem. Jinou alternativou je použití promotoru ADH2 reprimovaného glukosou, který byl popsán Russellem a spolupracovníky (J. Biol. Chem. 258: 2674 (1982)) a dále Beierem a spolupracovníky (Nátuře, 300: 724 (1982), které jsou zde zahrnuty odkazem).

Je možné vybrat regulovaný nebo konstitutivní kvasinkový promotor. Silné promotory genů jako např. fosfoglyceratkinasy (PKG), dalších genů kódujících glykolytické enzymy a genu pro alfa-faktor jsou konstitutivní. V případem že je použit konstitutivní promotor, je proudkt syntetizován během buněčného růstu. Promotor ADH2 je regulovaný etanolem a glukózou, promotory GAL-1-10 a GAL7 jsou regulovány galaktosou a glukosou, promotor PHO5 fosfátem, promotor metalothioninu mědí. Promotory proteinů tepelného šoku, mezi které patří i promotor HSP150 jsou regulovány teplotou. Mohou být použity také hybridní promotory. Regulované promotory jsou používány tam, kde je kontinuální exprese požadovaného produktu zhoubná pro hostitelské buňky. Místo kvasinkových promotorů je možné použít silné prokaryotické promotory jako je promotor T7. V tomto případě • 0

0 0 0 • ·

však musí být kvasinkový kmen transformován genem kódujícím odpovídající polymerasy. Pro ukončení transkripce jsou používány terminátory HSP150 nebo jakýkoliv funkční terminátor. Zde jsou promotory a terminátory nazývány kontrolními elementy (či prvky). Předkládaný vynález není omezen na jakýkoliv specifický vektor, promotor či terminátor.

Vektor též může obsahovat selekční markér. Selekční markéry jsou většinou geny kódující rezistenci na antibiotika nebo geny schopné komplentovat (doplnit) kvasinkové kmeny mající dobře popsanou metabolicku poruchu, jako jsou např. tryptofan nebo histidin deficientní mutanty. Mezi vhodné selekční markéry patří URA3, LEU2, HIS3, TRPÍ, HIS4, ARG4 nebo geny rezistence na antibiotika.

Vektor může mít také počátek replikace schopný replikace v bakteriální buňce. Manipulace s vektory je efektivnjší v bakteriálních kmenech. Vhodným bakteriálním počátkem replikace jsou ColEl, Ori nebo oriT.

Zaváděcí sekvence z kvasinky nebo z genu pro fytasu či jiného zdroje může být použita k podpoře sekrece exprimované fytasy do média. Předkládaný vynález není omezen na žádný specifický typ zaváděcí sekvence nebo signálního peptidů.

Mezi vhodné kvasinkové zaváděcí sekvence patří zaváděcí sekvence alfa faktoru, která může být použita k přímé sekreci fytasy. Zaváděcí sekvence alfa faktoru je často umístěna mezi sekvenci promotoru a sekvenci strukturního genu (Kurjan et al., Cell 30: 933 (1982); Bitter et al., Proč Nati. Acad. Sci USA 81: 5330 (1984);.

U.S. Patent No. 4.546.082; European published patent application No. 324.274, které jsou zde zahrnuty odkazem). Další vhodnou zaváděcí sekvencí je S. cerevisiae MF alpha 1. Alfa-faktor je syntetizován jako (pre) struktura 165 aminokyselin obsahujících signální 19 aminokyselinový prepeptid následující „zaváděcím („leader) peptidem o 64 aminokyselinách. Ten obsahuje tři N-glykosilační místa následovaná (LysArg(Asp/Glu, Ala)2-3 alpha-factor)4 (Kurjan et al., Cell 30: 933 - 43 (1982), který je zde zahrnut odkazem) . Signální (zaváděcí) část preproMF alpha 1 je široce využívána k dosažení syntézy a sekrece heterologních proteinů v S. cerevisiae. Použití signálních (zaváděcích) peptidů homologních ke kvasinkám je známé z U.S.Patent No. 4,546,082, evropské patentové přihlášky č.

• 4 ·· · ··«·

4 4 4 44 4 4 44

4·· Φ Φ Φ 4 ·«

4 4 4 Φ Φ Φ · 4 44 44

9 9 9 9 9 99

999 9 99 999 9 9 99 9 9 (European Patent Application No.) 116,201; 123,294; 123,544; 163,529 a 123,289 a DK Patent Application No. 3614/83, který je zde zahrnut odkazem. V evropské patentové přihlášce č. (European Patent Application No.) 123,289, která je zde zahrnuta odkazem, je popsáno použití prekurzoru a-faktoru ze S. cerevisiae. Použití signálního peptidů invertasy ze Saccharaomyces cerevisiae je popsáno v WO 84/01153, který je zde zahrnut odkazem. Ukázka použití signálního peptidů PH05 ze Saccharomyces cerevisiae k sekreci cizích proteinů je v německé

3614/83, která

Signální patentové přihlášce (German Patent Application) DK je zde zahrnuta odkazem.

(zaváděcí) cerevisiae (MF alpha 1 k sekrečnímu procesu v kvasinkách (americký sekvence alfa-faktoru ze Saccharaomyces nebo MF alpha 2) může být též použita heterologních proteinů

Patent No. 4,546,082, exprimovaných patent č. (U.S .

evropské patentové

Patent Application No.)

16,201;

123,294;

odkazem).

Použití přihlášky č. (European

123,544 a 163,529, které jsou zde zahrnuty fůzního proteinu sekvence DNA kódující signální (zaváděcí) sekvenci S. cerevisiae MF alpha 1 a 5'konce genu požadovaného sekretovaného proteinu bylo ukázáno. Dále bylo předvedeno další zpracování takto dosaženého proteinu. Použití myšího signálního peptidů ze slinné amylasy (nebo mutanty tohoto) k dosažení sekrece heterologních proteinů exprimovaných v kvasinkách bylo popsáno v publikvaných PCT aplikacích č. (Published PCT Application Nos.) WO 89/02463 a WO 90/10075, které jsou zde zahrnuty odkazem.

Americký patent č. (U.S. Patent No.) 5,726,038 popisuje použití signálního peptidů z kvasinkové aspartátkinasy 3, který je schopen zajistit zvýšenou sekreci proteinů exprimovaných v kvasinkách. Další zaváděcí sekvence vhodné k usnadnění sekrece rekombinantních polypeptidů z hostitelských kvasinek jsou známé znalým oboru. Zaváděcí sekvence může být modifikována blízko 3' konce zavedením jedné či více restrikčních míst. To usnadní fúzi zaváděcí sekvence se strukturním genem.

Protokoly pro transformaci kvasinek jsou známé znalým oboru. Jeden nich je popsán Hinnenem a spolupracovníky (Proč. Nati. Acad. Sci. USA 75: 1929 (1978), který je zde zahrnut odkazem. V protokolu Hinnema a spolupracovníků jsou selektovány Trp transformanty • · ·· · ·· • · · · 9 · 9 9 9 99 • · ♦ 9 · 4 4 · * ·····*· 9 9 99 9· • 9 9 9 9 9· 9

999 · 99 999 99 99 9 9 v selekčním médiu, které obsahuje 0,67% základního kvasinkového dusíkového roztoku, 0,5% kyseliny kasaminové, 2% glukosu, 10gg/ml adeninu a 20gg/ml uracilu.

Gen může být udržován na stabilním expresním vektoru, umělém chromozomu nebo integrací do chromozomu hostiteské kvasinky. Integrace do chromozomu může být dosažena klonováním genu fytasy do vektoru, který rekombinuje do kvasinkového chromozomu. Vhodné vektory mohou obsahovat nukleotidové sekvence, které jsou homologní k nukleotidovým sekvencím v kvasinkovém chromozomu. Nebo může být gen kódující fytasu umístěn mezi rekombinantní místa, jako jsou transpozomy, které mohou vnést gen do chromozomu.

Předkládaný vynález dále zahrnuje metodu produkce fytasy zajištěním izolovaného genu appA, který kóduje protein nebo polypeptid s fytasovou aktivitou a expresí tohoto genu v hostitelské buňce. Gen appA je přednostně izolován z Escherichia coli. Vhodné hostitelské buňky zahrnuji kvasinky a filamentární houby. Vhodná filamentární houba je Aspergillus niger a vhodné kvasinky jsou Saccharomyces, Kluyveromyces, Torulaspora a Schizosaccharomyces, a zvláště pak kvasinkový kmen SaccharaoToyces cerevisiae.

Předkládaný vynález dále zahrnuje metodu konverze fytinu na inositol a anorganický fosfát. Gen appA je izolován z organismu s použitím technik známých znalým oboru. Protein nebo polypeptid s fytasovou aktivitou je poté exprimován v hostitelské buňce podle tohoto genu. Výsledný protein nebo polypeptid je poté dán dohromady s fytinem. Tato technika je zvláště užitečná k ošetření fytinu v potravinách nebo krmivěch.

Vhodný gen appA je izolován z Escherichia coli.

Fytasa produkovaná v kvasinkovém systému uvolňuje fytinový fosfor z kukuřice a sóji stejně efektivně jako dnes komerčně dostupné fytasy. Oproti nim je však termostabilnější. Tento systém overexprese v kvasinkách produkující fytasu může být použit k produkci termostabilní fytasy, kterou lze použít v potravinářském průmyslu a průmyslu krmiv.

Příklady provedeni vynálezu

Přiklad 1 - Materiál a metody pro overexpresi phyA v E.coli,

S.lividans a v systému s použitím Saccharomyces.

Gen kódující fytasu, hostitelské kmeny a expresní plasmidy. Gen kódující fytasu byl laskavě darován Dr. E.J: Mulaneyem z USDA. Gen (GenBank Accession number M94550) byl obsažen v plasmidu pMD4.21 v kmeni HB101 E.coli. Fragment Sphl o velikosti 2,7 kb z DNA A. niger obsahoval kódující oblast deglykosilované fytasy a její 5' a 3' „flaking sekvence. Plasmid obsahující signální peptidovou sekvenci - Spxy - genu pro xylanasu z Aureobasidum pullulans (GenBAnk Accession number U10298) byl laskavě darován Dr. X.L.Li z University of Georgia. Kmen DH5 E.coli byl použit jako počáteční hostitel pro všechny rekombinantni plasmidy. K účelům exprese phyA v E.coli byly použity expresní vektor pET25b(+)(Novagen, Madison, WI) a expresní hostitel BL21(DE3)pLysS. Pro expresi phyA v S. lividans TK24 byl použit plasmid pSESl (Jung. E.D. et al., DNA sequences and expression in Streptomyces lividans of endoglucanase gene from Thermomonospora fusca, Appl. Environ. Microbiol. 59: 3032 - 43 (1993), který je zde zahrnut odkazem) ke konstrukci přenosového (shuttle) plasmidu (od Dr. D.B. Wilsona z Cornell University a on jej obdržel od Dr. D.A.Hopwooda z John Innes Institute, Norwich, England). K expresi phyA v kvasinkách byl použit expresní vektor pYES2 a hostitelský kmen S. cerevisiae INVScl (Invitrogen, San Diego, CA, USA).

Konstrukce plasmidových kazet a transformace. Všechny konstruované plasmidy a korespondující hostitelé jsou vyjmenovány v tabulce 1. 1,4 kb fragment PCR genu phyA byl amplifikován z pMD4, 21 za použití dvou primerů: proti směru 5'-CGG AAT TCG TCA CCT CCG GAC T - 3' (SEQ ID No.l) a po směru 5'-CCC AAG CTT CTA AGC AAA ACA CTC - 3' (SEQ ID No.2). Výsledný fragment obsahoval sekvenci kódující deglykosilovanou fytasu z A.niger, PhyA a restrikční místa EcoRI and HindlII po směru i proti směru. Po přečištěni s pomoci křtu Geneclean II (BiolOl, lne., La Jolla, CA, USA) byl fragment vnesen do pET25b(+) a výsledný konstrukt pEPl (6893 bp) byl transformován do BL21(DE3)pLysS, po počátečním ověření, v buňkách DH5oí. Exprese byla pod kontrolou promotoru T7 po kterém následovala zaváděcí sekvence (pel B) kódující 21 aminokyselin a phyA. Hostitelské buňky transformované pouze vektorem pET25(+) byly použity jako kontrola.

Tabulka 1. Expresní vektory, konstrukty a jejich hostitelské kmeny použité v této studii

Plasmid	Hostitel	Popis1	Literatura2
pET25b(+)	E. coli DH5a a BL21 (DE3)pLysS	Expresní vektor	Novagen
pEPl	E. coli BL21 (DE3)pLysS	pET25bo(+) + gen phyA	Tato publikace
PSES2	E. coli DH5a a S.lividans TK24	Expresní vektor	Jung et al.2, 1993
PSPP1	E. coli DH5a a S. cerevisiae INVScl	pSES2+Spe2+phyA	Tato publikace
PYES2	E. coli DH5oí a S. cerevisiae INVScl	Expresní vektor	Invitrogen
PYEP1	E. coli DH5a a S. cerevisiae INVScl	pYES2+Spe2+phyA	Tato publikace
PYXP1	E. coli DH5a a S. cerevisiae INVScl	pYES2+Spxy+phyA	Tato publikace
PYPP1	E. coli DH5a a S. cerevisiae INVScl	pYES2+Sphy+phyA	Tato publikace

Spe2 je signálním peptidem pro endonukleazu E2 z T. fusca (Wilson, D.B. Biochemistry and Genetics of Actinomycete Cellulases, Crit. Rev. Biotechnol. 12: 45-63 (1992), který je zde zahrnut odkazem; Spxy je signální peptid pro xylanasu z A. pullulans (Li and Ljungdahl, Cloning, Sequencing and Regulation of a Xylanase Gene from the Fungus Aureobasidium pullulans Y-2331-1, Appl. Environ. Microbil., 60: 3160 - 66 (1994); Li and Ljungdahl, Expression of Aureobasidium pullulans xynA in, and Secretion of Xylanase from, Saccharomyces cerevisiae, Appl. Environ. Microbiol., 62: 209-13 (1996), které jsou zde zahrnuty odkazem; Sphy je signální peptid pro phyA z A. niger (Hartingsveldt et al., „Cloning, Characterization and Overexpression of the Phytase-Encoding Gene (phyA) of Aspergillus Niger. Gene 127: 87-94 (1993), který je zde zahrnut odkazem).

Jung. E.D. et al., DNA sequences and expression in Streptomyces lividans of endoglucanase gene from Thermomonospora fusca, Appl. Environ. Microbiol. 59: 3032 - 43 (1993), který je zde zahrnut odkazem.

Konstrukce plasmidu pro expresi phyA v S. lividans začala PCR syntézou fragmentu obsahujícího pLT promotor a signální peptid Spe2 (Lao, G. et al., „DNA Seguences of Three Beta-1,4-endoglucanase genes From Thermomonospora fusca J. Bacteriol, 173: 3397 - 407 (1991), který je zde zahrnut odkazem).

Primery (primer proti směru: 5'-CAG CTA TGA CCA TGA TTA CGC C-3' (SEQ ID NO.3), primer po směru: 5'-CCT AGA ACG GGA ΆΤΤ CAT TGG

• · · · · · ·*« Μ • 9

9 «

CCG CC-3' (SEQ ID No.4)) obsahovaly restrikční místa Pstl a EcoRI. Fragment byl amplifikován z pBW2 (Jung. E.D. et al., DNA sequences and expression in Streptomyces lividans of endoglucanase gene from Thermomonospora fusca, Appl. Environ. Microbiol. 59: 3032 - 43 (1993), který je zde zahrnut odkazem) a poté štěpen pomoci Pstl a EcoRI. Konstrukt pEPl a plasmid pBluescript SK⁺ (Strategene, La Jolla, CA, USA) byl oproti tomu štěpen v jednom případě EcoRI a HindlII a v druhém případě Pstl a HindlII. Tři rozštěpené fragmenty byly poté purifikovány s použitím kitu Geneclean II a ligovány do jednoho rekombinantního konstruktu, který obsahoval požadovaná restrikční místa Pstl a Kpnl (z pBluescript SK⁺) , promotor pLTl, zaváděcí sekvenci endonukleasy E2 Spe2 (551 bp, Lao, G. et al., „DNA Sequences of Three Beta-1,4-endoglucanase genes From Thermomonospora fusca J. Bacteriol, 173: 3397 - 407 (1991), který je zde zahrnut odkazem) a gen phyA (1365 bp) . Po rozštěpení konstruktu pomocí Pstl a Kpnl byl výsledný fragment vnesen do expresního vektoru pSESl a vzniklý přenosový plasmid (pSPPl, 9131 bp) byl transformován do hostitelských protoplastů S. lividans podle Hopwooda a spolupracovníků (Hopwood, D.A., et al., Genetic Manipulation of Streptomyces - Ά Laboratory Manual, The John Innes Foundation, Norwich, England (1985), který je zde zahrnut odkazem). Stejně byla připravena kontrola transformací S. lividans expresním vektorem pSES2.

Byly připraveny tři různé přenosové plasmidy se třemi signálními peptidovými sekvencemi za účelem exprese phyA v kvasinkovém systému (viz tabulka 2). První plasmid vycházel z fragnmentu pSPpl štěpeného HindlII a obsahoval promotor pLT, zaváděcí sekvenci Spe2 a sekvenci kódující oblasti phyA. Fragment byl ligován do místa HindlII pYAS2 ošetřeného telecí střevní alkalickou fosfatasou. Po ověření správné orientace byl výsledný plasmid nazván pYEPl (7783 bp) . Druhý plasmid obsahoval zaváděcí peptidovou sekvenci Spxy pro gen kódující xylanasu v A. pullulans (Li, X.L. et al., „Cloning, Sequencing and Regulation of a Xylanase Gene from the Fungus Aureobasidium pullulans Y-2331-1, Appl. Environ. Microbil., 60: 3160 - 66 (1994); Li, X.L. et al., „Expression of Aureobasidium pullulans xynA in, and Secretion of Xylanase from, Saccharomyces cerevisiae, Appl. Environ. Microbiol., «

62: 209-13 (1996), které jsou zde zahrnuty odkazem) a gen phyA. Spxy byl spojen s phyA pomocí překrývajících se prodloužených konců (Horton, R.M., „In Vitro Recombination and Mutagenesis of DNA: SOEing Together Tailor-Made Genes, PCR Protocols: Current Methods and Applications, 251-61 (1993), který je zde zahrnut odkazem) ve dvou následných PCR reakcích. První byla aplifikace sekvence Spxyz pCE4 (Li, X.L. et al., „Expression of Aureobasidium pullulans xynA in, and Secretion of Xylanase from, Saccharomyces cerevisiae, Appl. Environ. Microbiol., 62: 209-13 (1996), které jsou zde zahrnuty odkazem) s použitím protisměrného primeru (5'-CGC GGA CTG CTA GCG CAC GTT CGA T-3', primer 2) (SEQ ID No.6). Dáši PCR reakcí byla amplifikace kódující oblasti phyA z pEPl s použitím přesahujícího protisměrného primeru (5'-ATC GAA CGT GCG CTA GCA GTC CCC G-3', primer 3) (SEQ ID No. 7) a primeru po směru ((5'-GCT CTA GAC ΤΑΆ GCA AAA CAC TCC-3', primer 4) (SEQ ID no. 8) s restrikčním místem Xbal. Cílem druhého PCR kroku bylo spojení dvou fragmentů vytvořených ve výše uvedených dvou PCR reakcích. K tomu byly využity, jako templatů, dva purifikované fragmenty a primery 1 a 4. Výsledný fragment obsahoval restrikční místa HindHI a Xbal a poté byl klonován do pSES2. Takto vzniklý plasmid byl pojmenován pYXPl (7219 bp). Třetí plasmid obsahoval signální peptidovou sekvenci Sphy genu phyA a kódujíícví oblast phyA s tím, že byl vyjmut intron mezi nimi (Hartingsveldt et al., Cloning, Characterization and Overexpression of the Phytase Encoding Gene (phyA) of Aspergillus niger , Gene 27: 87-94 (1993) , který je zde zahrnut odkazem) . Dva primery - 70bp protisměrný primer obsahoval signální peptid s restrikčním místem KpnI a primer po směru, který byl stejný s primerem použitým při konstrukci pYXP (primer4) - byly použity k amplifikaci požadovaného fragmentu z pEPl. Produkt PCR reakce byl štěpen KpnI a Xbal a klonován do pSES2. Výsledný plasmid byl nazván pYPPl (7176 bp). Všechny výše uvedené konstrukty byly transformovány do S. cerevisiae metodou podle Ita a spolupracovníků (Ito et al. , „Transformation of Intact Yeast Cells Trated with Alkali Cations J. Bacteriol, 153: 163 - 68 (1983), který je zde zahrnut odkazem).

> ·

Tabulka 2. Signální peptidy použité k expresi phyA v S. cerevisiae

Konstrukt a jeho velikost (bp)	Peptid	Gen	Organismus	Aktivita fytasy1 (mPU/ml)
pYEPl 7783	Spe (93 bp)	Cellulasa E2	T.	fusca	0, 80
pYXPl 7219	Spxy (102 bp)	Xylanasa A	A.	pullulans	Nedetekována
pYPPl 7176	Sphy (57 bp)	PhyA Fytasa	A.	niger	146
pSESl2 7224			S.	cerevisiae	Nedetekována

Aktivita fytasy byla detekována v supernatantu buněčné kultury Sabouraudrafinosového média 15 hodin po indukci (indukováno bylo přidáním galaktosy). Definice jednotky aktivity fytasy -viz následující text.

Expresní vektor pro S. cerevisiae použitý jako kontrola.

Růstová média a indukce genové exprese. V systému E.coli byly transformanty pěstovány v 50ml LBD média obsahujícího 50 pg/ml ampicilinu při 30°C. Jakmila veličina OD600 média dosáhla hodnoty 0,5 až 0,6 byla indukována genová exprese fytasy přidáním IPTG (isopropyl b-D-thiogalaktopyranosid) do média tak, aby výsledná koncentrace byla 1 mM. Tři hodiny po indukci byly buňky odstředěny při 800 x g, 15 min. Poté byly promyty 1 x PBS a lyžovány lysozymem. Byly připraveny rozpustná a nerozpustná buněčná frakce a vzorky obsahující 500 gg celkových proteinů (Lowry, O.H. et al., „Protein Measurement With the Polin Phenol Reagent J. Biol. Chem. 193: 26575 (1951), který je zde zahrnut odkazem) byly resuspendovány ve stejném objemu 2xSDS pufru a analyzovány pomocí SDS-PAGE (Laemmli, U.K., „Cleavage of Structural Prozteins During the Assembly of the Head of Bacteriophage T4 Nátuře (London) 227: 680-85 (1970), který je zde zahrnut odkazem).

Rekombinantní S. lividans byly pěstovány v TSB polévce s thiostreptonem (5 gg/ml) při 30°C (Jung. E.D. et al., DNA sequences and expression in Streptomyces lividans of endoglucanase gene from Thermomonospora fusca, Appl. Environ. Microbiol. 59: 3032 - 43 (1993), který je zde zahrnut odkazem). Po 72 hodinách inkubace byly buňky a médium sklizeno a připraveno pro analýzu pomocí SDS-PAGE (Wilson, D.B. Biochemistry and Genetics of Actinomycete Cellulases, Crit. Rev. Biotechnol. 12: 45-63 (1992), který je zde zahrnut odkazem).

Transformanty S. cerevisiae byly zpočátku pěstovány po dobu 48 hodin ve 4% Sabouraud-rafinosovém médiu (lOOml) bez uracilu. Sterilní galaktosa (2%) byla poté přidána k indukci exprese fytasy. Vzorky média a buněk byly odebírány v různou dobu a extracelulární i intracelulární vzorky byly připraveny podle popisu Li a Ljungdahla (Li and Ljungdahl, Expression of Aureobasidium pullulans xynA in, and Secretion of Xylanase front, Saccharomyces cerevisiae, Appl. Environ. Microbiol., 62: 209-13 (1996), který je zde zahrnut odkazem). V případě potřeby byl supernatant z frakce expresní buněčné kultury zakoncentrován pomocí koncentrátoru a s použitím membrán YM10 (MW cutoff - 10000) od firmy Amicon (Beverly, MA, USA). Ostatní média byla testována podobně.

Stanovení aktivity proteinu. Množství exprimované fytasy za rozdílných podmínek bylo kvantifikováno pomocí relativní densitometrie (s použitím přístroje IS-1000 Digital Imaging Systém, Alpha Innotech Corporation, San Leandro, CA, USA) specifických proužku na SDS-PAGE. Aktivita fytasy ve vzorcích média a buněk byla stanovena tak, jak již bylo popsáno (Piddington C.S. et al., „The Cloning and Sequencing of the Genes Encoding Phytase (phy) and pH

2.5 - optimum Acid Phosphatase (aph) from Aspergillus niger var. awamori. Gene, 133: 56 - 62 (1993), který je zde zahrnut odkazem) a uvolněný anorganický fosfát byl stanoven podle metody Chena a spolupracovníků (Chen, P.S., et al., „Microdetermination of P, Anal. Chem. 28: 1756 - 58 (1956), který je zde zahrnut odkazem). Jednotka fytasové aktivity byla definována jako množství enzymu, které uvolní jeden pmol anorganckého fosfátu z fytinu sodného za minutu při 37°C.

Analýza pomocí imur.oblotu (Wester blotu) . Rozpustná frakce z buněčné hmoty fytasou transformovaných buněk E.coli a supernatant z média transformantů S. lividans a S.cerevisiae byla připravena jako pro SDS-PAGE. Po elektroforéze byly proteiny přeneseny na nitrocelulosovou membránu (Protran nitrocellulose membrane, Schleicher & Schuell, Keene, NH, USA) v 20mM Tris-HCl (pH 8,3), 20% metanolu a 0,1% SDS s použitím Mini Trans-Blot cell, Bio-Rad Laboratories, USA) . Přenos byl prováděn přes noc při konstantním napětí 50V a počáteční teplotě pufru 4°C. Membrána byla poté analyzována pomocí Western blotu. Králičí polyklonální protilátky < ·· · ·· ·· • · 4 · 4 ·· · 4 ·4

444 444 44·

4444444 4 4 44 44 φ 444444 • 44 4 44 444 »·4444

IgG (laskavě poskytnuty Dr. A.H:J. Ullahem z USDA, ředěni 1:5000) proti purifikované nativní fytase z A. niger byly použity jako první protilátky. Blot byl zakončen s použitím kitu Immuno-Blot Assay Kit (Bio-Rad Laboratories), který obsahoval sekundární protilátky konjugované s křenovou peroxidasou.

Izolace a analýza celkové RNA. Celková RNA z transformantů E. coli a S. cerevisiae byla izolována TRIzol™ Reagentem (GIBCO BRL, Gaithersburg, MD, USA) za 3respektive 15 hodin po inkubaci. Vzorky RNA (10 gg na dráhu) byly poté separovány pomocí formaldehydové agarosové (1,5%, hm/obj) gelové elektroforézy a dále přeneseny na membránu Hyblot (National Labnet, Woodbridge, NJ, USA) (Davis et al., Basic Methods in Molecular Biology, 2nd Ed., Appleton and Lange, Norwalle, Ct. (1994), který je zde zahrnut odkazem). Byl připtraven fragment o velikosti 1,4 kb EcoRI-HindlII v plasmidu pEPl a poté značen pomocí náhodného primeru ³²P s použitím kitu na značení DNA. Následovala purifikace přes kolonu G-50 (Pharmacia Biotech., Piscataway, NJ, USA) a poté hybridizace s blotovanou RNA na membráně v hybridizační pícce (Hybaid, Middlesex, UK). Hybridizované membrány byly zviditelněny pomocí Fuj i Imaging Plate a analyzovány BioImaging analyzátorem (Kohshim Graphic Systems, Fuj i, Japan).

Přiklad 2 - Exprese phyA v E.coli.

Čtyři hodiny po indukci byl na SDS-PAGE (12,5%) zřetelný specifický proužek (okolo 55 kDa) rozpustné buněčné frakce při srovnáni s kontrolním transformovaným expresním vektorem (obr. 1 a 2). Tento proužek reprezentoval 3,8% celkových rozpustných proteinů dané frakce. Ve shodě s tím ukázala nothern analýza overexpresi mRNA phyA v transformantech s genem pro fytasu. V kontrolních buňkách nebyl pozorován žádný signál (obr. 3).

Ve snaze optimalizovat expresi fytasy byl studován vliv různých faktorů na expresi a také časová závislost exprese. Mezi tyto faktory patří: teplota inkubace (30 a 37°C) , pH média (4,0, 5,0, 6,0, 7,0, 8,0 a 9,0) anaerobicita (přidání sterilního minerálního oleje na povrh rostoucích buněk), hladina anorganického fosfátu v médiu (Dassa, E. et al., „The Acid Phosphatases with Optimum pH of

2.5 of Escherichia coli J. Biol. Chem. 257: 6667 - 76 (1982), který

0 0· 0 ·· ·· ·· 0 0 · ·· 0 0 00

0·· 000 00·

0000 0 0 0 000 0 · 0 0 00000«

000 0 ·0 »00 *· ···· je zde zahrnut odkazem) a koncentrace fytínu sodného (0,01,0,2,

0,3, 0,4 a 0,5 mM). Výsledky ukázaly, že exprese fytasy byla lineární v závislosti na čase po prvních šest hodin od indukce (obr.

4) . Poté zůstávala exprese relativně nezměněna, ačkoliv bakteriální buňky dále rostly. Z ostatních faktorů pouze pH a koncentrace fytinu významně ovlivňovaly expresi fytasy. Maxima proteinu bylo dosaženo při pH 6,0 a koncentraci fytinu sodného 0,3 mM. Za těchto podmínek se zvýšil obsah fytasy z 3,8 na 9,6% celkových rozpustných proteinů.

Fytasová ativita nebyla detekována ani v extracelulárni ani v intracelulární frakci. Toto zjištěni nebylo úplně neočekávané, protože nativní fytasa z A. niger je glykoprotein o velikosti 70 80 kDa (Hartingsveldt et al., Cloning, Characterization and Overexpression of the Phytase Encoding Gene {phyA) of Aspergillus niger , Gene 27: 87-94 (1993), který je zde zahrnut odkazem). V této studii měl protein exprimovaný v systému E. coli velikost přibližně 55 kDa. Zřejmě chybějící glykosilace proteinu a další nezbytné posttranslační modifikace během sekrece byly příčinou chybějící fytasové aktivity.

Příklad 3 Exprese phyA v S. lividans.

Heterologní geny byly exprimovány v S. lividans a výsledné produkty s enzymatickou aktivitou byly sekretovány do média (Ghangas, G.S. et al., „Cloning of the

Thermomonospora Fusca

Endoglucanase E2 Gene in Streptomyces

Lividans: Affinity

Purification and Functional Domains of the Cloned Gene Product, Appl. Environ. Microbiol. 54: 2521-26 (1988); Wilson, D.B. Biochemistry and Genetics of Actinomycete Cellulases, Crit. Rev. Biotechnol. 12: 45-63 (1992); Jung. E.D. et al., DNA sequences and expression in Streptomyces lividans of endoglucanase gene from Thermomonospora fusca, Appl. Environ. Microbiol. 59: 3032 - 43 (1993), které jsou zde zahrnuty odkazem). Podobně byl gen phyA exprimován v S. lividans a protein byl sekretován do média, jak je vidět na proužcích při analýze vzorků média metodou SDS-PAGE (obr. 5 a 6). Znamená to, že signální peptid z genu pro endonukleasu E2 z T. fusca byl schopen zajistit sekreci proteinu ven z buňky. Tento • · ·· · ·· ·· ·· « ·······« ··· ···«· · • »··· ··· ·«·· · • · ···· · · a·· · ·· ··· »···»· protein měl velikost 57 kDa a reprezentoval 16,2% celkových proteinů v médiu. Změna pH média na 6,0 a přidání 0,3 mM fytinu sodného do média zvýšila výtěžnost proteinu na 20,3 % celkových proteinů.

Protože byl protein (fytasa) sekretován do média v tak vysokých hladinách, mělo by být snadné jej purifikovat a účinně použit k mnoha účelům, jako je například produkce protilátek proti fytase. Zvýšená fytasová aktivita však opět nebyla nalezena ani v médiu ani v lyžovaných buňkách. Ačkoliv se velikost proteinu vůči proteinu exprimovanému v E. coli o trochu zvýšila (2-3%), stále zde nebyla, zřejmě z důvodů glykosilace fytasy v tomto expresním systému, nalezena žádná fytasova aktivita.

Příklad 4 - Exprese phyA v S. cerevisiae

Tři rozdílné signální peptidy byly použity ke srovnání účinnosti při zajišťování sekrece expresních proteinů ven z buněk (viz tabulka 2) . Aktivita fytasy se značně zvýšila, jestliže byly transformanty pYEPl a pYPPl pěstovány v Sabouraud.rafinosovém médiu, nezvýšila se však při stejném pěstování u transformantu pYXPl. Proužek fytasy byl zřetelný na SDS-PAGE elektroforeze po 20 hodinách od indukce (obr. 7).

Exprese transformantů pYEPl a pYPPl byla stanovena ve třech různých typech média: Sabouraud-rafinosovém (li, X.L. et al·., Expression of Aureobasidium Pullulans XynA in , and Secretion of the Xylanase From, Saccharainyces Cerevisiae, Appl. Environ. Microbiol. 62: 209 - 13 (1996), který je zde zahrnut odkazem), Sabouraudglycerolovém a modifikovaném obecném YEPD médiu. U transformantu pYEPl byla podobná fytasová aktivita exprimovaná v Sabouraudraf inosovém médiu a Sabouraudově médiu. V médiu YEPD však nebyla detekována žádná fytásová aktivita. Naproti tomu, u transformantu pYPPl se aktivita fytasy velmi lišila v závislosti na médiu. Aktivita se zvýšila až na hodnotu 375 mD/ml, jestliže bylo použito Sabouraud-glycerolové médium. V médiu YEPD se aktivita dále zvýšila až na 1675 mU/ml (viz. Tabilka 3). Ačkoliv je médium YEPD oproti Sabouraud-rafinosovému médiu o hodně levnější, výtěžek fytasy se v něm zvýšil více než desetkrát. V tomto uspořádání tedy

předpokládaný signální peptid z houbového genu pro fytasu dosáhl nejúčinějši exprese extracelulárni fytasové aktivity. Téměř všechen produkovaný protein byl sekretován do YEPD média, protože velmi málo aktivity bylo detekováno v kvasinkových buňkách. Časová závislost exprese fytasy v tomto systému je znázorněna na obr. 8.

Tabulka 3 Aktivita fytasy exprimovaná transformantem s pYPPl v různých typech média

Počet hodin po indukci (mPU/ml)¹

Médium	0	10	15
Sabouraud-rafinosovéu	22	136	146
Sabouraud-glycerolové	6	174	375
YEPD	18	1238	1675

Aktivita fytasy byla detekována v supernatantu tří médií buněčných kultur po 0, 10 a 15 hodinách po indukci přidáním galaktosy. Definice jednotky fytasové aktivity viz text.

Různé druhy mikroorganismů včetně bakterií, kvasinek a filamentárlních hub vykazuji fytasovou aktivitu. Kmen A niger NRRL3135 však produkuje aktivitu nejvyšší - 340 mU/ml(Shieh, T.R. et al., „Survey of Microorganisms for the Production of Extracellular Phytase, Appl. Environ. Microbiol. 16: 1348 - 51 (1968), který je zde zahrnut odkazem). Mezi jedenadvaceti kvasinkovými kmeny má nejvyšší fytasovou aktivitu Schwanniomyces castelli - 140 mU/ml (Lambrechts, C.et al., „Utilization of Phytate by Some Yeast, Biotechnology Letters 14: 61-6 (1992), který je zde zahrnut odkazem. Je zřejmé, že rekombinantní kvasinkový kmen transformovaný pYPPl popisovaný v této studii tvořil mnohem vyšší fytasovou aktivitu (1675 mU/ml) než má A. niger (4x) a S. castellii CBS 2863 (llx) . Maximální tvorba fytasy může být v daném systému dosažena optimalizací inkubačních podmínek a modifikací plasmidové kazety (Demolder, J.W. et al., „Efficient Synthesis of Secreted Murine Interleukon-2 by Saccharomyces Cerevisiae: Influence of 3'Untranslated Regions and Codom Usage. Gene: 111: 207 - 13 (1992), který je zde zahrnut odkazem).

Vysoká hladina exprese funkční fytasy v S. cerevisiae byla způsobena zřejmě dostatečnou glykosilací fytasového proteinu a dalšími post-translačními modifikacemi ve kvasinkách. Po zakoncentrování supernatantu média a analýze za pomocí SDS-PAGE byl zřetelný proužek o velikosti přibližně 110 kDa (viz obr. 7 a 9), což je více než velikost nativního proteinu z A. niger (Hartingsveldt et al., Cloning, Characterization and Overexpression of the Phytase Encoding Gene (phyA) of Aspergillus niger , Gene 27: 87-94 (1993), který je zde zahrnut odkazem). Specifická overexprese phyA mRNA byla potvrzena nothern analýzou (obr. 10) . Tento výsledek ukazuje, že kvasinkový systém je účinný při overexpresi aktivní extracelulární fytasy. Kvasinkový systém má několik výhod před bakteriemi nebo dalšími systémy jako např. A. niger (Hartingsveldt et al., Cloning, Characterization and Overexpression of the Phytase Encoding Gene (phyA) of Aspergillus niger , Gene 27: 87-94 (1993), který je zde zahrnut odkazem). Ten provádí během translokace proteinu přes endoplasmatické retikulum a buněčnou membránu post-translační modifkace včetně správného sbalení, glykosilace, tvorby disulfidických vazeb a proteolysy.

Sekrece proteinu je ulehčena krátkým hydrofobním signálním peptidem na N-konci prekurzorů proteinu. (Li, X.L. et al., „Expression of Aureobasidium pullulans xynA in, and Secretion of Xylanase from, Saccharomyces cerevisiae,

Appl. Environ. Microbiol., 62: 209-13 (1996), který je zde zahrnut odkazem). Proteiny sekretované kvasinkami jsou chráněny proti agregaci a degradaci proteasami. Nejdůležitější však je, že lze enzym tvořený S. cerevisiae snadno purifikovat, protože ta sekretuje normálně pouze několik proteinů. Vezmeme-li v úvahu dobře známou bezpečnost produkce kvasinek pro lidi i zvířata, zdá se, že tento systém má velký potenciál v potravinářském průmyslu a průmyslu krmiv.

Příklad 5 - Vlastnosti PhyA fytasy overexprimované v Saccharomyces cerevisiae

Fytasa overexprimovaná transformanty s plasmidem pYPPl byla zakoncentrována a použita ke studiu jejich vlastností (viz. tabulka

4). Enzym měl dvě pH optima: 2 až 2,5 a 5,0 až 5,5. V oblasti 2 až

2,5 však byla aktivita enzymu pouze 60% oproti aktivitě enzymu v oblasti 5 až 5,5. Při pH 1 nebo 8 nebyla detekována žádná aktivita. pH optimum bylo prakticky stejné jako pH optimum fytasy z A. niger (Simons et al.: „Impovement of Phosphorus Availability By Microbilab Phytase in Broilers and Pigs. Br. J. Nutr.64: 525 (1990), který je zde zahrnut odkazem), což znamená, že aktivní funkce hydrolýzy fytinu v gastrointestinálním traktu lze zcela určitě předpokládat. Teplotní optimum enzymu bylo 60°C, zatímco momentálně nejběžnější fytasa na trhu, vyráběná firmou GistBrocades, má teplotní optimum 55°C (BASF, 1996) . Při 50 až 55°C stále zůstává více než 80% aktivity, při 75 až 80°C však byla detekována již pouze malá aktivita. Při zahřátí exprimované kvasinkové fytasy, která je popsána v tomto vynálezu, na 15 minut a 37°C respektive 80°C je zbytková aktivita 100% respektive 63%. Fytasa BASF Gist-Brocades z astejného uspořádání měla po zahřátí zbytkovou aktivitu 100% respektive 52%. Rozdíly mezi těmito dvěma enzymy při kterékoliv teplotě byly signifikantní (viz tabulka 5) . Zdá se tedy, že je kvasinková fytasa teplotně stabilnější než současná, komerčně dostupná, fytasa.

Tabulka 4 Charakteristika fytasy overexprimované v kvasinkách¹ pH optimum²

pH	1,0	2,0	2,5	3,0	4,0	5, 0	5, 5	6,0	8,0
Relativní aktivita (%)	0,5e	59, 7C	64,8C	4 8, ld	81, 0b	100,0a	95, 0a	66, 3C	0,8
	±0, 2	±3	±6	±4	±5	±1	±6	±1	±4
Teplotní'optimum3
°C	25	37	45	50	55	60	75	80
Relativní aktivita (%)	24,2®	44,6d	63, 9C	83, 6b	89, 8b	100,0a	0, 6f	0, 9f
	±0, 8	±3	±8	±2	±4	±4	±0,1	±0,2

Data reprezentují průměr relativní aktivity ± standardní odchylka (n=4). Průměry s různými horními indexy jsou rozdílné (P<0,05). K analýze vlivů ošetření byl použit obecně lineární model statistické analýzy (1988) Benferroniho t-test a celkově náhodné uspořádání pro porovnání průměrů při násobném ošetření. Hladina významnosti byla nastavena na P<0,05.

Aktivita byla stanovena při 37°C (definice jednotky aktivity fytasy - viz text). Byly použtity rozdílné pufry: 0,2mM glycin-HCl pro pH 1,0 až 3,5; 0,2 mM citrát sodný pro pH 4,0 až 6,5 a 0,2 mM Tris-HCl pro pufry nad 7.

3. Teplotní optimum bylo stanoveno při pH 5,5 (0,2 mM citrát sodný).

Tabulka 5 Porovnání termostability overexprimované fytasy v kvasinkách a výroku Gist-Brocades fytase z A. niger¹'^{2 3}

Relativní aktivita, %	37°C	80°C
Kvasinková fytasa	100a±l	63b±l
Fytasa z A. niger	100x±3	52y±2
p3<		0, 3

1. Data reprezentují průměr relativní aktivity ± standardní odchylka (n=3). Průměry s různými horními indexy jsou rozdílné (P<0,05). K analýze vlivů ošetření byl použit obecně lineární model statistické analýzy (1988) Benferroniho t-test a celkově náhodné uspořádáni pro porovnání průměrů při násobném ošetření. Hladina významnosti byla nastavena na P<0,05.

2. Enzym byl zahříván po 15 minut při různé teplotě před reakcí při 37°C a pH 5,5.

3. Významnost (hodnota P) t-téstu mezi aktivitou dvou fytas při každé z nastavených teplot

Ačkoliv je nejasné jak se takovéto zvýšení termostability vztahuje k různým post-translačním modifikacím (sbalení, štěpení, glykosilace) (Li, X.L. et al., „Expression of Aureobasídium pullulans xynA in, and Secretion of Xylanase from, Saccharomyces cerevisiae, Appl. Environ. Microbiol., 62: 209-13 (1996), který je zde zahrnutý odkazem), je jistě výhodou mit termostabilnější fytasu, která je snad odolnější vůči teplotě během granulování krmivá, což je problém se současnou Gist-Brocades fytasou.

Příklad 6 - In vitro hydrolýza fytínu z kukuřice, sóji a mleté pšenice expresní kvasinkovou fytasou

Exprimovaná kvasinková fytasa uvolňovala fytinový fosfát z kukuřice a sojové moučky stejně efektivně jako fytasa GistBrocades jestliže se porovnání vztáhlo na jednotku aktivity (viz ··· · · · « ·9 • ···· 999 99999

9 9 9 9 9 99

999 9 99 999 999999 tabulka 6) . Jak lze předpokládat, byla hydrolýza fytinu závislá na čase a množství aktivity. Exprimované kvasinková fytasa byla také účinná při uvolňování fytinového fosfátu z pšeničné mouky což znamená její možné velké využití při kvašení chleba. Protože hrubě mlétá pšenice použitá v této studii obsahovala o hodně vyšší množství své vlastní fytasové aktivity než obsahuje běžně používaná pšeničná mouka, je případný efekt expresní kvasinkové fytasy na zvýšení hydrolýzy fytinu, při použití v pekárnách, o hodně vyšší. Vliv by využití kvasinkové fytasy mělo i na uvolňování stopových prvků (Halí, m.N. et al., „The Early Days of Yeast Genetics Cold Spring Harbor Laboratory Press (1993), který je zde zahrnutý odkazem).

Tabulka 6 Volný fosfát uvolněný z kukuřice, sojové moučky (SM) a hrubě mleté pšenice (HMP) overexprimovanou kvasinkovou fytasou a houbovou fytasou z A.niger in vitro¹

Kvasinková fytasa (PU/kg)	0	100	250	500	1000	250 (houbová fytasa)
		Volný fosfát	(mg/g)
Kukuřice: 1 hoď.	0,23d±0,03	0,64=+0,8	l,14b+0,18	l,46a±0,04	l,54a±0,04	l,16b+0,15
4 hoď.	0,36=+0,02	l,26b±0,04	1,60’10,03	l,66a±0,06	l,72a±0,04	1, 68’10,04
SM: 1 hoď.	0,68d±0,01	l,18=d±0,02	l,62=±0,18	2,48b±0,32	3,13’10,19	1,68=10,2
4 hoď.	0,73d±	1,67=	2,69b	3,41a	3,71a	2,78b
HMP:	3,56±0,39		4,11+0,64	4,672+0,05
1 hoď.
4 hoď.	5,63±5		6,02+0,48	6,382±0,07

Každý vzorek (5g) byl míchán ve 20 ml pufru (0,2 mM citrát sodný) při teplotě 37°C po dobu jedné nebo čtyř hodin. Supernatant byl připraven centrifugací při 800 g a 15 minut. Po přefiltrování přes filtrační papír Whatman 541 bylo v takto vzniklém vzorku stanoveno uvolňování volného fosfátu podle metody Chena a spolupracovníků (Chen, P.S. et al., „Microdetermination of P. Anal. Chem., 28: 1756 - 58 (1956), který je zde zahrnutý odkazem). Data reprezentují průměr relativní sktivity ± standardní odchylka (n=4). Průměry s různými horními indexy jsou rozdílné (P<0,05). K analýze vlivů ošetření byl použit obecně lineární model statistické analýzy (1988) - Benferroniho t-test a celkově náhodné uspořádání pro porovnání průměrů při násobném ošetření. Hladina významnosti byla nastavena • 4 44 4 4444 • 4 · · · · · · · 44 ··· · · 4 *4·

4444444 4 4 44 44

4 444444

444 4 44 444 444444 na P<0,05. U všech zkoumaných plodin existuji významné rozdíly mezi první a čtvrtou hodinou při jakémkoliv množství enzymu (jak bylo dokázáno pomocí ttestu. Průměry v řádcích s rozdílným písmenem v horním indexu se liší (P<0,05).

n=2

Byly porovnány overexprese fytasy Aspergillu niger (phyA) v Escherichia coli, Streptomyces lividans a Saccharomyces cerevisiae za účelem vývoje účinného a jednoduchého systému k ekonomické produkci fytasy. Vnitrobuněčný protein o velikosti 55 kDa a reprezentující 9,6% celkových rozpustných proteinů byl exprimován v E.coli s použitím systému s pET25b(+). Extracelulární protein o velikosti 57 kDa, reprezentující 20,3% celkových proteinů v médiu byl exprimován v S. lividans s použitím přenosového plasmidu obsahujícího promotor pLTl a zaváděcí sekvenci Spěli endonukleasy E2. Ani v jednom z výše uvedených expresních systémů nebyla detekována zvýšená aktivita fytasy, pravděpodobně proto, že protein nebyl glykosilová či jinak post-translačně modifikován. Naproti tomu byla produkována vysoká fytasová aktivita v S. cerevisiae transformované genem phyA. Tři různé zaváděcí sekvence a tři různá média byla srovnávána s cílem nalézt nejlepší expresní vektor a nej lepší podmínky. Použití signálního peptidu Sphy z genu phyA v kombinaci s YEPD médiem dávalo nejvyšší extracelulární fytasovou aktivitu.Fytasa overexprimovaná ve kvasinkách měla velikst přibližně 110 kDa a dvě pH optima: 2,0 až 2,5 a 5,5 až 6,0. Teplotní optimum bylo 60°C.

Příklad 7 - Materiál a metody pro expresi phyA v Pichia

Hostitel a vektor. Byl zakoupen EasySelectTM Pichia Expression kit od firmy Invitrogen (San Diego, CA) . Kit obsahuje hostitele a vektory potřebné k expresi genu buď intracelulárně nebo extracelulárně v kmenech Mut⁺ nebo Mut^s (Metanol je využíván normálně či málo (s-slow) ) . X33 byl použit jako kmen Mut⁺ a kmen KM71 byl použit jako Mut^s. Byly použity dva vektory: pPICZB (3,3 kb) a pPICZaA (3,6 kb). Oba pouzivaly promotor AOX1.

« · ·· · ·· ·· ·· » ···· · · · · ··· · · · « · · • ·>·· «·· · « · · 9 • · ··· ··· ·*· · ·» ··· ·· ····

Konstrukce expresního vektoru. Vliv různých signálních peptidů na expresi PhyA v systému Pichia byl sledován na dvou připravených konstruktech. První konstrukt byl připraven ligací fragmentu 1,5 kb velkého EcoRI-KpnI, obsahujícího sekvenci PhyA kódující funkční fytasu do pPICZctA. V tomto plasmidu (pICZa-phyA) byl phyA zaváděn alfa-faktorem - velmi široce používaným signálním peptidem z Saccharomyces cerevisiae. Druhý konstrukt byl připraven ligací 1,4 kb velkého fragmentu KpnI-Xbal pYPPl do vektoru (kódující oblast phyA byla zaváděna svým vlastním signálním peptidem. Který byl velmi účinný při sekreci exprimované fytasy v Saccharomyces cerevisiae) .

Transformace a exprese. Ověřené konstrukty byly linearizovány Pmel a transformovány do GS115 a KM71 pomocí EasyComp™ dodávaným v kitu. K selekci pozitivních kolonií byl použit Neocin™. Jednotlivé kolonie byly inokulovány do 10 ml MGY média a pěstovány při 30°C do doby, kdy OD₆₀₀ bylo 2-6. Poté byly buňky zcentrifugovány a resuspendovány v 10 ml MMY média obsahujícího 0,5% metanolu. Vzorky byly sbírány 12 a 24 hodin po indukci. Buňky byly odděleni od supernatantu a lysovány pomocí skleněných kuliček v homogenizačním pufru. Aktivita fytasy v supernatantu a v buňkách byla stanovena tak, jak již bylo popsáno. Ke zjištění velikosti a relativního množství exprimovaného proteinu byly provedeny SDS-PAGE a Western blot.

Příklad 8 - PhyA fytasová aktivita v Pichia

Expresní konstrukt s použitím alfa - faktoru jako signálního peptidu pro phyA byl transformován do dvou kmenů Pichia. KM71 je pomalý kmen využívající metanol, kdežto X33 je divoký typ využívající metanol účinně. Skrýning a inkubace byly prováděny v 10 ml lahvičkách při 29-30°C. U transformace KM71 mělo po indukci a 24 hodinách 19 kolonií z dvaceti extracelulární fytasu vyšší než 6 jednotek/ml supernatantu. Kolonie číslo 13 vykazovala nejvyšší aktivitu (26 jednotek/ml) po té co byla inkubována 108 hodin. Všechny kolonie transformantů X33 (20 z 20)vylazovaly více než 10 jednotek/ml poté, co byly indukovány 24 hodin. Jedna z kolonií •4 a4 •· •4 •

• ♦ 4 » jednotek

X33 byly kmenů ve «9

9·

4·

4 • 4 • 4

9999 «4 • 4>

φ · * <4···· • · • 9 9· (číslo 101) produkovala fytasovou aktivitu s hodnotou 65 /ml supernatantu. Časové závisloti exprese fytasy v KM71 a sumarizovány na obr. 11. Navzdory rozdílnosti těchto dvou využívání metanolu a proto též ve schopnosti exprese fytasy, bylo zjištěno, že alfa-faktor je korektně užíván v kvasinkových buňkách. Vedle toho téměř všechen exprimovaný protein byl sekretován do média, protože v buňce nebylo nalezeno více než 5% celkové exprimované aktivity.

Byl studován vliv anorganického fosfátu a pH média na expresi fytasy v médiích BMGY a BMMY. K pokusům bylo použito phyA rekombinantbního kmenu X33 (číslo 101) . Médium obsahující 50 mM fosfát produkovalo, 168 hodin po indukci, nejvyšší aktivitu fytasy 66 jednotek /min. Byl studován vliv různého pH tohoto pufru (3,4,5,6,7 a 8)na expresi. Jestliže bylo pH 6, pak transformant X33 produkoval 75 jednotek/ml supernatantu. Na základě koncentrace proteinů a SDS-PAGE analýzy byl odhadnut výtěžek exprese fytasy na cca 3 až 4 mg/ml.

Příklad 9 - Vlastnosti PhyA fytasy exprimované v Pichia

Molekulová hmotnost a deglykosilace expresní fytasy. Silný proužek okolo molekulové hmotnosti 95 kDa byl dobře znatelný na SDSPAGE supernatantu připraveného z média, které bylo inokulováno trans formantem z genu phyA (obr. 12) . Byl to téměř jediný zřetelný protein v supernatantu. Exprimované fytasa reagovala dobře s králičími protilátkami připravenými proti purifikované nativní fytase z A. niger. To značí, že imunoreaktivita exprimované fytasy byla v podstatě stejná jako imunoreaktivita nativní fytasy z A. niger. Po použití Endo H se snížila velikost fytasy deglykosilací na 50 kDa. Protilátky proti phyA reagovaly také s deglykosilovanou fytasou. Deglykosilace provedená za nativních podmínek navíc snížila aktivitu fytasy o 15%, z čehož vyplývá, že glykosilace byla důležitá pro aktivitu fytasy. Glykosilace dále ovlivnila termostabilitu ezymů (obr. 13).

Nothern analýza. Jak je vidět z obrázku 14, sonda phyA DNA o velikosti 1,3 kb hybridizovala s mRNA indukovaných transformantů jak

z KM71 (č.13) a X33 (č.101). Signál daly také trans formanty před indukcí. Pravděpodobně nebyla exprese phyA v tomto systému kontrolována striktně na hladině transripce.

pH a teplotní optimum a hydrolýza fytínu. Stejně jako je tomu u fytasy z A. niger, má expresní fytasa dvě pH optima - 2,5 a 5,5 (obr. 15). Teplotní optimum exprimované fytasy bylo 60°C (obr. 16) . Jestliže byla expresní fytasa inkubována se sojovými vzorky při aktivitách 100, 200, 400, 800, mU/g a teplotě 37°C, byla produkce fosfátu lineární v závislosti na možství fytasy (obr. 17).

Příklad 10 Materiál a metody pro overexpresi genu appA z E.coli v Sacharomyces cerevisiae.

Gen a protein. Tento gen, původně definovaný jako gen periplasmatické fosfoanhydridfosfohydrolasa z E. coli obsahuje 1298 nukleotidů (GeneBank accession number: M58708). Nejdříve bylo zjištěno, že gen kóduje kyselou fosfatasu s pH optimem 2,5 (EcAP) v E. coli. Kyselá fosfatasa je monomer s molekulovou hmotností 44644 daltonů. Zralé EcAP obsahuje 410 aminokyselin (Dassa, J. et „The Complete Nucleotide Sequence of the reveals Significant Homology Between pH Glucose-l-Phosphatase, J. Bacteriology který je zde zahrnutý odkazem). Ostanin overexprimoval appA v E. coli BL21 vektorem pT7 a kyselou fosfatasovou aktivitu přibližně 400x (440

Escherichia coli Gene

2,5

172:

al., appA

Acid

5497

Phosphatase and

5500 (1990), se spolupracovníky zvýšil tak její mU/mg proteinů) (Ostanin, K. et al., „Overexpression, Site-Directed Mechanism of Escherichia coli Acid Phosphatase, J. 22830 - 36 (1992), který je zde

Gen a hostitel

Mutagenesis, and

Bio. Chem.,

267:

kmen zahrnutý odkazem).

CU1869 (No. 47092) E. coli byly zakoupeny

BL21 (no.

od ATCC. Gen, insert

1,3 kb, byl transformován do kmene (Ostanin,

87441) E. coli s použitím expresního vektoru pAPPAl

K. et al., „Overexpression, Site-Directed of Escherichia coli Acid Phosphatase, J.

22830 - 36 (1992), který je zde zahrnutý odkazem).

Mechanism

Mutagenesis,

Bio.

Chem., and

267:

Hostitel v Saccharomyces (Invitrogen, San a vektor. Vektor pro overexpresi hostitel cerevisiae byl pYES2 a

Diego, CA. USA).

Konstrukce expresního vektoru. Na fragment Xbal 1,3 kb velký z pAAPAl. Tento začátku fragment genu appA byl INVScI byl izolován obsahoval gen • ·

appA se svým vlastním signálním peptidem. Poté, co byl tento fragment ligován do místa Xbal pYES2, byl takto vzniklý konstrukt (PYES2-appA) transformován do Saccharomyces cerevisiae. Fytasova aktivita však nebyla zvýšena ani v extra- ani v intra - buněčných částech v porovnání s kontroou. pAPPAl a pYPPl (PhyA a jeho signální peptid v pYES2) byly kotransformovány do kvasinkového kmene. Ovšem, znovu nebyla pozorována vyšší aktivita kvůli pAPPAl v médiu nebo v kvasinkových buňkách.

Dva primery byly syntetizovány za účelem spojení signálního peptidu genu PhyA s kódující oblastí genu appA. Jeden, 80 bp dlouhý, obsahoval signální peptid PhyA a místo KpnI na 5' konci: GGG GTA CCA TGG GCG TCT CTG TTC TAC TTC CTT TGT ATC TCC TGT CTG GAG TCA CCT CCG GAC AGA GTG AGC CGG AG (SEQ ID No.9). Druhý primer byl dlouhý 24 bp s EcoRI místem na 3' konci: GGG ATT TCA TTA CAA ACT GCA GGC (SEQ ID No. 10) . PCR proběhlo ve 25 cyklech, v režimu - 1 min. denaturace při 95°C - 1 min. annealing při 58°C a 1 min. prodlouženi řetězce při 72°C. Fragment 1,3 kb byl amplifikován, štěpen a ligován do pYES2. Poté, co byl insert potvrzen restrikčním mapováním, byl konstrukt (pYES2-SphyA-appA) transformován do INVScI litium acetátovou metodou.

Exprese. Vyselektované transformanty byly inokulovány do YEPD média. Exprese byla indukována přidáním galaktosy do kultury poté, co OD₆oo dosáhla 2 tak, jak to bylo popsáno dříve. Buňky byly sklizeny 15 až 20 hodin po indukci.

Stanovení aktivity. Kyselá fosfotasová aktivita byla stanovena při 37°C ve 25 mM glycin-HCl pufru (pH 2,5) s použitím pnitrofenylfosfátu jako substrátu (zásobní roztok - 250mM). 1,7 ml reakčního pufru bylo přidáno do 0,1 ml vzorků. Po pětiminutové inkubaci ve vodní lázni při 37°C bylo přidáno 0,2 ml vytemperovaného substrátu a zamícháno. Reakční roztok byl přenesen do vytemperované kyvety, která byla přímo v držáku spektrofotometru, a v ní byl inkubován při 37°C 2 minuty. Množství uvolněného p-nitrofenolu bylo sledováno průběžně po dobu 5 min., při vlnové délce 405nm. Z výsledků se poté vypočetla enzymová aktivita.

In vitro studie. Sojová moučka (5,0 g) byla rozmíchána ve 20 ml 20mM citrátového pufru, pH 5,5 a dále smíchána s 200 mU fytasy a inkubována při 37°C po dobu 4 hodin za neustálého míchání. Po

ochlazeni ledem po dobu 10 min. byla suspenze přenesena do centrifugačních zkumavek a centrifugována po dobu 15 min. při 15000 x g. V supernatantu byly stanoveny volné fosfáty.

Příklad 11 - Kvantifikace aktivity fytasy z overexprimovaného genu E. coli appA v Saccharomyces cerevisiae.

Intracelulární aktivita kyselé fosfatasy v genem appA overexprimované E. coli (pAPPAl) byla 440 mU/mg proteinů. Nebývalé vysoká však byla nalezena fytasova aktivita v transformovaném kmeni (větší než 4900 minimální množství kyselou fosfatasu mU/mg proteinů). V kontrole (BL21) bylo pouze fytasové aktivity. To znamená, že tento gen pro také kódoval fytasu. Sekvence appA genu byla srovnána se sekvencí genu PhyA a bylo zjištěnom že tyto sdílí 23% identiti.

dva geny

Transformace INVScI konstruktem pYES2-Sphy-appA (se signálním peptidem z PhyA) vedlo k produkci v supernatantu, která byla 2000 krát větší než typu nebo aktivita transformantu obsahujícího vlastním signálním peptidem (viz tabulka 7.) zaváděcím fytasové aktivita gen appA aktivity divokého se svým

Tabulka 7. Extracelulární fytasová aktivita v transformantech

s genem appA s	různým signálními peptidy
Konstrukt	Signální peptid	Aktivita (mU/ml)	Aktivita (mU/mg proteinů)
PYES-	appA	Nedetekovatelná	Nedetokovatelná
pYES2-SphyA-appA	PhyA	1,158	445

Vliv koncentrace anorganického fosfátu, fytinu, pH a teploty média (YEPD) na expresi fytasové aktivity pYES2-Sphy-A-appA je ukázán v tabulce 8. Nehvyšší fytasová aktivita za optimálních podmínek byla 2,286 mU/ml (633 mU/mg proteinů).

Tabulka 8. Vliv vlastností média YEPD na expresi fytasové aktivity pYES2-Sphy-A-appA v kvasinkách

Vlastnosti média	Aktivita (mU/ml)
Fosfor, mg/lOOml
0	1402
1	714
5	722
10	456
Fytinát sodný, g/lOOml
0	870
0,1	1019
1,0	1748
pH
5,0	892
7,0	996
8,0	2286
Teplota, °C
25	312
30	1037
37	996

Teplotní stabilita overexprimované extracelulární fytinové aktivity produkované kvasinkovými transformanty byla vyšší než fytasy vnitrobuněčné produkované E. coli transformované pAPPAl (viz. Tabuka 9).Zahřátí extracelulární fytasy na 80°C a 15 minut vedlo k 30% ztrátě fytasové aktivity, kdežto téměř veškerá fytasová aktivita byla ztracena jestliže stejným podmínkám byla vystavena fytasa z E. coli.

Tabulka 9. Vliv zahřívání (80°C, 15 min.) na aktivitu fytas z různých zdrojů

Fytasa	Relativní aktivita po zahřátí (%)
appA v E. coli	0,1
appA v S. cerevisiae	69
PhyA v S. cerevisiae	66
fytasa BASF	50

Srovnání fytas (200 mU) z E. coli, overexprimované AppA v kvasinkách a BASF co do schopnosti uvolňovat fosfát ze sojové moučky je ukázáno v tabulce 10.Výsledky naznačují, že fytasy ze všech tří různých zdrojů uvolňují fytinové fosfáty ze sojové moučky účinně.

Tabulka 10. Volné fosfáty uvolněné ze sojové moučky fytasami ze tří různých zdrojů.

Fytasa

Fosfor (mg/g) appA v E. coli

1,11 appA v S. cerevisiae

0, 69

BASF

0,87

Jestliže byl gen E.coli appA (kyselá fosfatasa) exprimován v Saccharomyces cerevisiae produkoval extracelulární fytasovou aktivitu v médiu jež byla více než 2000 krát vyšší než kontrola. Overexprimovaná fytasa účinně uvolňovala fytinové fosfáty ze sojové moučky a zdá se, že je termostabilnější než v současné době dostupná komerční fytasa nebo vnitrobuněčná fytasa produkvaná v E. coli stejným genem {appA).

Přiklad 12 - Metody a materiál pro overexpresi genu E. coli appA kódujícího kyselou fosfatasu / fytasu v Pichia pastoris

Gen a protein. Gen appA a hostitel, kmen E. coli CU1867 (No. 47092) byly obdrženy z ATCC. Gen, insert 1,3 kb, byl transformován do kmene BL21 (no. 87441) E. coli s použitím expresního vektoru pAPPAl (Ostanin, K. et al., „Overexpression, Site-Directed Mutagenesis, and Mechanism of Escherichia coli Acid Phosphatase, J. Bio. Chem., 267: 22830 - 36 (1992), který je zde zahrnutý odkazem).

Hostitel a vektor. Byl zakoupen EasySelect™ Pichia Expression kit od firmy Invitrogen (San Diego, CA) . Kit obsahuje hostitele a vektory potřebné k expresi genu buď intracelulárně nebo extracelulárně v divokém kmeni (X33). Byly použity dva vektory: pPICZB (3,3 kb) a pPICZoíA (3,6 kb). Oba používaly promotor A0X1.

Konstrukce expresního vektoru. Dva primery byly použity k amplifikaci genu appA z pAPPAl a dvě restrikční místa EcoRI a KpnI byly zhotoveny na 5' a 3' koncích.

Primer proti směru: GGA ATT CCA GAG TGA GCC GGA (SEQ ID No. 11)

Primer po směru: GGG GTA CCT TAC AAA CTG CA G (SEQ ID No. 12)

Templát: pAPPAl DNA izolovaná z ATCC 87441

PCR byla provedena ve 30 cyklech za následujícího uspořádání: 1 min. denaturace při 94°C, 1 min. annealing při 55°C a 1 min. prodlužování řetězce při 72°C. Fragment o veliksti 1245 párů baží byl amplifikován, štěpen EcoRI a KpnI a ligován (16°C přes noc) do pPICZ B (3,3 kb) a do pPICZaA (3,6 kb). Ligace byla potvrzena restrikčním mapováním po transformaci konstruktu do DH5a.

Transformace konstruktu do Pichia (X33). Pro každou transformaci bylo připraveno 100 pg plasmidové DNA a poté linearizován štěpením s Pmel. Po linearizaci byla DNA purifikovaná a resuspendována v 10 μΐ sterilní deionizované vody. Ke každé transformaci byla poté použita polovina této DNA. K transformaci DNA do X33 byly použity elektroporace a kit EasyComp chemical kit (Invitrogen). V případě elektroporace byly použity 2mm kyvety a Cell Manipulátor (ECM 600, Gentromics, BTX Instrument division, San Diego, CA 92121). Odpor byl 186 Ohm, nabíjecí napětí 1,5 kilovoltů a • · · • ·

Λ 9 9 9 9 999 9 99 ·99 skutečná doba nabíjení byla přibližně 7 milisekund. Elektroporované buňky byly inkubovány na YPD agarových potnách obsahujících 100 mg Zeocinu/ml při 30°C dva až čtyři dny dokud nevyrostly kolonie. V případě chemické transformace byl ybuňky pěstovány na YPDS agarovýcg plotnách obsahujících 100 mg Zeocinu/ml. Chemická metoda měla v porovnání s elektroporací nižší transformační účinnost.

Exprese. Jednotlivé kolonie byly inokulovány do 10 ml média MGY (30 ml zkumavky) a pěstovány při 28-30°C v rotačním inkubátoru (200 otáček z aminutu) (16-18 hodin) dokud hodnota OD₆₀o nedosáhla 56. Buňky byly poté odstředěny (2000 ot./min) a resuspendovány v 10 ml média BMMY (obsahujícího 0,5% metanolu) k indukci exprese. Vzorky (200 μΐ) byly sbírány každých 12 nebo 24 hodin po indukci. Metanol (100%) byl přidán v množství 100 μΐ každých 24 hodin za účelem udržení jeho koncentrace v médiu na hladině 0,5 - 1% v médiu.

Stanovení. Buňky byly odděleny z média (supernatant) a lysovány s pomocí skleněných kuliček v homogenisačním pufru. Extracelulární fytasová aktivita v supernatantu a vnitrobuněčná fytasová aktivita v lysovaných buňkách byla stanovena tak jak je popsáno dříve (0,2 M citrátový pufr, pH 5,5, při teplotě 37°C a s použitím 10 mM fytátu sodného). Kyselá fosfotasová aktivita byla stanovena při 37°C ve 25 mM glycin-HCl pufru (pH 2,5) s použitím pnitrofenylfosfátu jako substrátu (zásobní roztok - 250mM). 1,7 ml reakčního pufru bylo přidáno do 0,1 ml vzorků. Množství uvolněného p-nitrofenolu bylo sledováno průběžně po dobu 5 min., při vlnové délce 405nm. Z výsledků se poté vypočetla enzymová aktivita. Byla provedena SDS-PAGE (12%) s cílem stanovit velikost a relativní množství exprimovaného proteinu. pH optimum a teplotním optimum exprimované fytasy byly stanoveny tak, jak bylo popsáno ve výsledcích.

In vitro studie. Sojová moučka (5,0 g) byla rozmíchána ve 20 ml 20mM citrátového pufru, pH 5,5 a dále smíchána s 200 mU fytasy a inkubována při 37°C po dobu 4 hodin za neustálého míchání. Po ochlazení ledem po dobu 10 min. byla suspenze přenesena do centrifugačních zkumavek a centrifugována po dobu 15 min. při 15000 x g. V supernatantu byly stanoveny volné fosfáty.

· · · · ·

Přiklad 13 - Sledování fytasové aktivity v koloniích Phicia pastoris overexprimujících gen E. coli appA.

Divoký typ Pichia X33 tvoří jak extracelulárně (< 0,03 U/mg proteinů) tak i intracelulárně (< 0,05 U/ml) minimální množství fytasové aktivity. Buňky X33 transformované appA genem vneseným do pPICZB (bez a - faktoru a tedy by tvořily vnitrobuněčnou fytasu) nevykázaly žádné zvýšení aktivity fytasy (extracelulárni aktivita 0,2 U/ml a intracelulární aktivity 0,05 U/mg proteinů).

Transformace buněk X33 konstruktem pPIZofA-appA (se zaváděcí sekvencí α-faktoru) vedla k tvorbě extracelulárni fytasové aktivity v médiu. Na začátku bylo sledováno 72 kolonií. Pouze dvě kolonie měly po 40 hodinách od indukce aktivitu <1 U/ml. Většina kolonií měla za 40 hodin od indukce aktivitu v rozmezí 10 až 20 U/ml. Všech 70 kolonií mělo za 118 hodin od indukce fytasovou aktivitu >80 U/ml. Nejvyšší aktivita fytasy, dosud detekovaná, byla 215 U/ml ve 192 hodině po indukci (viz tabulka 11).

Tabulka 11 - Oblast extracelulárni fytasové aktivity v koloniích X33 transformovaných pIZo(A-appA 40 a 118 hodin po indukci.

Počet kolonií	40 hodin po indukci	118 hodin po indukci
2	<1 U/ml
6	1-10 U/ml
36	11-20 U/ml
28	>20 U/ml
70		80 U/ml

Aktivity fytasy a kyselé fosfatasy v transformantu, který exprimuje 215 U fytasové aktivity na ml byly porovnány s aktivitami divokého typu X33 (192 hodin po indukci) (viz tabulka 12) . Téměř všechna exprimovaná fytasa byla sekretována z buněk, což znamená, že α-faktor byl velmi účinným signálním peptidem při sekreci fytasy.

Tabulka 12 Aktivita fytasy a kyselé fosfatasy

	Divoký typ X33		pPIZaA-appA	transformant
	Extracelulární	Intracelulárni	Extracelulární	Intracelulárni
	U/ml	U/mg bílkoviny	U/ml	U/mg bílkoviny
Fytasa	0,05	0, 03	215	0,5
Kyselá fosfatasa	0,01	0, 002	5,88	0,9

Transformanty E. coli genem pro kyselou fosfatasu appA z E. coli měly intracelulárni aktivitu fytasy 5 U/mg proteinů (Ostanin,

K. et al., Overexpression, Site-Directed Mutagenesis and Mechanism of Escherichia Coli Acid Phosphatase, J. Biol. Chem., 267: 22830-36 (1992), který je zde zahrnut odkazem).

Transformant s genem PhyA v A. niger tvořil extracelulární aktivitu 7,6 U/ml (Hartingsveldt et al., Cloning, Characterization and Overexpression of the Phytase Encoding Gene (phyA) of Aspergillus niger , Gene 27: 87-94 (1993), který je zde zahrnut odkazem). Ve srovnání s těmito výsledky je expresní systémem fytasy v Pichia velmi účinným expresním systémem.

Příklad 14 Časová závislost exprese fytasy

Aktivita extracelulární fytasy v médiu se zvyšovala lineárně u téměř všech selektovaných kolonií až do 192 hodin po indukci. Obrázek 18 shrnuje změny aktivit pěti kolonií v čase 24 až 163 hodin po indukci.

Příklad 15 Vliv pH média na expresi fytasy (kolonie č. 23, aktivita 136 U/ml ve 186hodině)

Byl studován vliv rozdílných pH média na tvorbu extracelulární fytasy u transformantů. K pokusům byly použity 0,1 M fosfáty pufrovaná média. Jako kontrola bylo použito médium bez pufru ♦ ··

(pH 7,0). V médiu pufrovaném na pH 6,0 se tvořila nejvyšší fytasová aktivita (viz obr. 19).

Příklad 16 Velikost exprimované extracelulární fytasy

Na SDS-PAGE (12% gel) byl jasně zřetelný proužek u vzorku supernatantu média kultury inokulované třemi rozdílnými koloniemi (viz. obr.20). Velikost byla okolo 55 kDa, pravděpodobně byl protein částečné glykosilovaný. Protože expresní protein reprezentoval většinu viditelných proteinů v supernatantu, bylo by praktické získávat enzym bez potřeby dlouhé purifikace.

Příklad 17 pH optimum a teplotní optimum expresní extracelulární fytasy (kolonie č. 23) pH optimum expresní fytasy bylo 2,5 až 3,5 (viz obr. 21). To je významně odlišné od obou fytas - fytasy phyA i fytasy z A. niger (BASF) nebo od našich dalších expresních systémů. Toto pH optimum je ideální pro její funkci v podmínkách pH žaludku.

Teplotní optimum exprimovaného enzymu bylo 60°C (viz obr. 22).

Příklad 18 Vliv expresní fytasy na hydrolýzu fytinu a uvolnění fosfátu ze sojové moučky

Tato overexprimovaná E. coli fytasa (kolonie č. 23) účinně hydrolyzuje fytin a uvolňuje tak fosfát ze sojové moučky (viz obr. 23) . Uvolňování volného fosfátu ve směsi bylo lineární od 0 do 800 mU fytasy / g krmivá.

Příklad 19 Vliv expresní E. coli AppA fytasy exprimované

Pichia pastoris na biologickou dostupnost fytinového fosfátu u prasat odstavených od kojení • · ·

Ke zjištění nutriční hodnoty expresní E.coli fytasy exprimované Pichia při krmení prasat byla tato nová fytasa porovnávána s přidáváním anorganického fosfátu či s komerčně dostupným mikrobiálním systémem (Natuphos™, BASF Corp., Mt. Olivě, NJ, USA). Čtyřicet osm mladých, právě od kojení odstavených prasátek, bylo vybráno mezi prasnicemi, které porodily více mláďat na Cornellově výzkumné prasečí farmě (Cornell Swine Research Farm). Prasátka byla odstavena ve 21 dnu a krmena komerčním krmivém do 28 dne. Poté byla přendána po dvou do ohrádek a náhodně bylo mezi nimi zvoleno ošetření. Prasátka si zvykala dva týdny na kukuřično-sojovou základní stravu (tabulka 13).

Tabulka 13 Složení experimentální stravy pro prasata
Složka	+c %stravy	-C %strav	YP y %stravy	MP %stravy
Kukuřice	60, 5	61, 57	61, 07
Syrovátkový bílkovinný koncentrát	3	3	3	3
SBM 44%	30	30	30	30
Kukuřičný olej	3	3	3	3
Limeta	0, 8	0, 93	0,93	0,93
Fosforečnan vápenatý	1,2	0	0	0
Vitamíny a minerální látky	0,5	0,5	0,5	0, 5
směs ECAP	0	0	0,5	0
směs MP	0	0	0	0,5
Sůl	0,5	0, 5	0,5	0, 5
CSP 250	0, 5	0,5	0, 5	0, 5
Celkem	100	100	100	100
CP	20, 6	20,6	20, 6	20, 6
Ca	0,73	0,47	0,47	0,47
^celkový	0, 6	0,39	0,39	0,39

Pozn.: Všechny směsi používají kukuřici jako nosič

Doplňkové vitamíny a minerální látky: 2540 MJ (mezinárodních jednotek-IU) Vit. A, 660 MJ Vit. D, 15 MJ Vit. E, 2,2 mg Vit K,

3,3 mg riboflavinu, 13,2 mg kyseliny pantotheové, 17,6 mg niacinu, 110,1 mg cholinu, 1,98 μς B-12,

37,4 mg Mn, 0,6 mg I, 10 mg Cu, 0,3 mg Se, 100 mg Zn a 100 mg Fe na kg stravy.

Poté každá ohradka dostávala jednu ze čtyř strav. Skupina „positivní kontrola (+C) dostávala základní stravu doplňovanou fosforečnanem vápenatým. Skupina „negativní kontrola (-C) dostávala pouze základní stravu. Skupina „kvasinková fosfatasa (YP) dostávala základní stravu doplňovanou expresní E. coli fytasou v množství 1200

U/kg krmivá. Skupina „mikrobiální fytasa (MP) dostávala základní stravu doplňovanou fytasou BASF v množství 1200 U/kg krmivá. Prasátka měla volný přístup k potravě a vodě. Přírůstek váhy jednotlivých prasátek byl zaznamenáván týdně. Sežrané krmivo za den u každé ohrádky bylo také zaznamenáváno. Vzorky krevní plasmy každého z prasat byly odebírány týdně ke stanovení hladiny anorganického fosfátu v krvi. V tabulce 14 jsou výsledky tělesné váhy (body weight - BW) , průměrného denního přírůstku (average daily gain - ADG) , průměrného denního příjmu (average feed intake - ADFI), poměru krmivo/přírůstek (feed/gain - F:G) a anorganického fosfátu v plasmě (plasma inorganic phosphorus - PP).

• 4

Tabulka 14 v závislosti	Celkové na stravě	hodnoty PP, a obsahu fyté	BW, isy.	ADG, ADFI	a F:G prasat
	+C	-C		YP	MP
Počáteční
stav
PP	12,99	13,02		13, 07	13, 54
BW	11,54	11, 63		12	11,5
1. týden
PP	10,83a	6, 48c		8,59®	8,35®
BW	14	13, 83		14,29	13, 92
ADG	0,351	0,316		0,327	0,345
ADF1	0,700	0, 684		0, 697	0,697
F:G	2,04	2,20		2,18	2,13
2. týden
PP	9,7 6A	5, 64d		8,72®	7,84c
BW	18,04	17,42		17, 83	17,71
ADG	0,578	0, 512		0,506	0,542
ADF1	0,833	0, 855		0,784	0,837
F:G	1,4 6b	1, 67a		1,56“	1,55“
3. týden
PP	11A	6, 26c		8,64®	8,13®
BW	22,58	21,17		22	22,21
ADG	0, 649a	0, 536®		0,595“	0, 643“
ADF1	1,166	1, 02		1,001	1,003
F:G	1,8	1, 92		1,71	1,36
4. týden
PP	10,94a	6, 31c		9, 65®	9,2®
BW	27,54	25,29		27,79	27,38
ADG	0,708“	0, 589®		0,827A	0,738“
ADF1	0,1,395a	1, 049®		1,309a	1,273“
F:G	1, 98	1, 87		1,59	1,73

Čísla ve stejném řádku, která nesdílí společné písmeno jsou významně odlišná. Analýza rozdílů byla provedena pomocí Bonferroniho (Dunnovým) Ttestem, kde alfa=0,05 a df=20

Ke konci čtyřtýdenního experimentu byl pozorván velký nedostatek fosfátu u skupiny negativní kontrola. U všech ostatních tří skupin nebyly pozorovány náznaky nedostatku fosfátu. Je zřejmé, že ve zlepšení biologické dostupnosti fosfátu z fytinu kukuřičnosojové moučkové stravy pro prasata byla expresní E.coli fytasa

exprimované Pichia stejně, ne-li více, účinná jako komerční mikrobiální fytasa. Může tedy nahradit, u od kojení odstavených prasat, doplňování stravy anorganickým fosfátem.

Příklad 20 Vliv expresní E. coli AppA fytasy exprimované v Pichia pastoris na biologickou dostupnost železa (Fe) a fytinového fosfátu u prasat odstavených od kojení

Ke zjištění vlivu expresní E.coli fytasy exprimované Pichia na biologickou dostupnost ve stravě obsaženého, na fytin vázaného Fe, pro, od kojení odstavená, prasata, bylo vybráno dvacet anemických prasat (stáří 21 dní, 7,3 g hemoglobinu (Hb)/ dl krve). Prasata byla krmena sedm dní krmivém s nedostatkem Fe a poté byla ve věku 28 dní umístěna do metabolických klecí. Poté byla ve věku 35 dní krmena experimentální stravou po dobu pěti týdnů. Experimentální strava byla následující: základní strava s nedostatkem Fe (-C, s přidaným anorganickým fosfátem), strava s dodávaným Fe (+C) , strava s nedostatkem Fe a fosfátu a s expresní E. coli fytasou (YP) nebo s komerční mikrobiální fytasou (BASF, MP, USA) v množství 1200 U/kg krmivá. Týdně byly stanovovány: tělesná váha (BW), objem sedimentovaných buněk (PCV), Hb a anorganický fosfát v plasmě (PP) . Výsledky jsou shrnuty v tabulce 15.

Tabulka stravě a	15 Celkové hodnoty obsahu fytasy.	PCV, Hb, BW	a PP prasat v	závislosti na
	+c	-c	YP	MP
Počáteční
stav
PCV	25	25	26	24
Hb	7,73	7,22	7,85	7,08
BW	8,14	8,27	8,17	7,45
PP	7,92	7,76	7,21	7,36
1. týden
PCV	25	26	29	27
Hb	7,62	8,3	8,77	7,88
BW	9, 44	8,84	9, 63	8,57
PP	8,41	8,45	8,48	8,22
2. týden
PCV	29	26	30	28
Hb	8, 6	7,34	8,93	8,27
BW	12,32	10,13	11,91	10, 84
PP	10,28a	9, 05ab	8,89ab	8,22a
3. týden
PCV	36a	2 9b	34a	33a
Hb	ll,55a	8,2b	10,84a	9, 96ab
BW	16,77a	13b	15, 62ab	14,62ab
PP	12,14a	ll,37ab	10,25bo	9,71c
4. týden
PCV	39	34	38	36
Hb	12,99a	10,llb	12,27a	11,35ab
BW	21, 36a	17,37b	19,44ab	18,56ab
PP	10, 19a	9, 34ab	9, 4 9ab	8,8b
5. týden
PCV	40	38	40	39
Hb	13,52a	12,24b	13,64a	13,13ab
BW	26, 53	22,59	24,27	23, 43
PP	9,27a	8, 95ab	8,7 9ab	8,02n
1 Hodnoty	jsou průměry kde n=	=5. Průměry ve	stejném řádku,	které nesdílejí
společné ]	písmeno v horním indexu jsou význmě	rozdílné (P < 0,	10)
E.	coli fytasa overexprimovaná	v Pichia byla,	ve zvyšování

fytinového fosfátu a využiti Fe z kukuřično-sojové moučkové stravy ·· ··

«· ·*·· pro od kojeni odstavená prasata, přinejmenším stejně účinná jako fytasa BASF.

Ačkoliv jsou zde hlavní body vynálezu detailně popsány a vykresleny, je těm, kteří jsou znalí oboru zřejmé, že se mohou vyskytnout různé modifikace, doplňky, náhrady apod. bez toho, aby byl opuštěn duch vynálezu a jsou tak tyto stále pokládány za část vynálezu, jak je definovaný v patentových nárocích.

Seznam sekvenci <110> Cornell Research Foundation, lne.

<120> Overexprese genů fytasy v kvasikových systémech <130> 19603/1341 <140>

<141>

<150> 09/104,769 <151> 1998-06-25 <160> 12 <170> Patentln Ver. 2.0 <210> 1 <211> 22 <212> DNA <213> Umělá sekvence <220>

<223> Popis umělé sekvence:

Primer pro PCR amplifikaci a klonování <400> 1 cggaattcgt cacctccgga ct

*	·*
··	•	•	•	•
•	•	•		«
•	• ·	•	•
•	•	«	•
999	··	···	•

<210> 2 <211> 24 <212> DNA <213> Umělá sekvence <220>

<223>	Popis	umělé sekvence:	Primer	pro	PCR	amplifikaci a klonováni
<400>	2
cccaagcttc '	taagcaaaac actc				24
<210>	3
<211>	22
<212>	DNA
<213>	Umělá	sekvence
<220>
<223>	Popis	umělé sekvence:	Primer	pro	PCR	amplifikaci a klonování

<400> 3 cagctatgac catgattacg cc <210> 4 <211> 26

pro PCR amplifikaci a klonování <212> DNA <213> Umělá sekvence <220>

<223> Popis umělé sekvence: Primer <400> 4 cctagaacgg gaattcattg gccgcc <210> 5 <211> 24 <212> DNA <213> Umělá sekvence <220>

<223> Popis umělé sekvence: Primer <400> 5 cccaagcttg atcacatcca ttca <210> 6 <211> 25 <212> DNA <213> Umělá sekvence <220>

<223> Popis umělé sekvence: Primer <400> 6 cggggactgc tagcgccgt. tcgat <210> 7 <211> 28 <212> DNA <213> Umělá sekvence <220>

<223> Popis umělé sekvence: Primer <400> 7 atcgaacgtg cgctagcagc agtccccg <210> 8 <211> 24 <212> DNA <213> Umělá sekvence <220>

<223> Popis umělé sekvence: Primer pro PCR amplifikaci a klonování pro PCR amplifikaci a klonování pro PCR amplifikaci a klonování pro PCR amplifikaci a klonování <400> 8 gctctagact aagcaaaaca ctcc

<210> 9 <211> 80 <212> DNA <213> Umělá sekvence <220>

<223> Popis umělé sekvence: Primer pro PCR amplifikaci a klonováni <400> 9 ggggtaccat gggcgtctct gctgttctac ttcctttcta tctcctgtct ccggacagag tgagccggag ggagtcacct 60 <210> 10 <211> 24 <212> DNA <213> Umělá sekvence <220>

<223> Popis umělé sekvence:

Primer pro PCR amplifikaci a klonování <400> 10 gggaattcat tacaaactgc aggc

<210>	11
<211>	21
<212>	DNA
<213>	Umělá sekvence

<220>

<223>	Popis	umělé sekvence:	Primer	pro	PCR amplifikaci a	klonování
<400>	11
ggaattccag	agtgagccgg a
<210>	12
<211>	22
<212>	DNA
<213>	Umělá	sekvence
<220>
<223>	Popis	umělé sekvence:	Primer	pro	PCR	amplifikaci a	klonování

<400> 12 ggggtacctt acaaactgca cg

Claims (5)

1. Metoda produkce fytasy v kvasinkách zahrnující: zajištění heterologního genu, který kóduje protein nebo polypeptid s fytasovou aktivitou a exprese řečeného genu v kvasinkovývh kmenech.

2. Metoda dle nároku 1, kde je protein nebo polypeptid zaváděn signálním peptidem a sekretován buňkou do růstového média nebo pouze exprimován vnitrobuněčně.

3. Metoda dle nároku 2, kde je protein nebo polypeptid sekretován do růstového média a má koncentraci vyšší než 300 jednotek/ml.

4. Metoda dle nároku 1, kde je heterologní gen, který kóduje protein nebo polypeptid s fytasovou aktivitou, spojen do jednoho rámce s transkripčním zesilovacím prvkem.

5. Metoda dle nároku vektorem. 1, kde je heterologní gen nesen stabilním 6. Metoda dle nároku chromozornému. 1, kde j e heterologní gen nesen umělým 7. Metoda dle nároku 1, kde je heterologní chromozomu kvasinkového kmene. gen integrován do 8. Metoda dle nároku 1, z rostlinných buněk. kde je heterologní gen izolován 9. Metoda dle nároku 1, kde je heterologní gen izolován

z houbových buněk.

10.Metoda dle nároku 9, kde heterologní gen je gen phyA z Aspergillus niger.

··

Metoda dle nároku 1, kde je kvasinkový kmen vybrán ze skupiny obsahující Saccharomyces, Kluyveromyces, Torulaspora a Schizosaccharomyces.

Metoda dle nároku

11, kde kvasinkový kmen je Saccharomyces cerivesia.

Metoda dle nároku

10, kde kvasinkový kmen je metylotrofni kvasinkový kmen.

Metoda dle nároku

9, kde metylotrofni kvasinkový kmen je

Pichia pastoris.

Metoda dle nároku

1, kde je heterologní gen izolován z bakteriálních buněk.

Metoda dle nároku 15, kde heterologní gen je gen appA z Escherichia coli.

Metoda dle nároku 16, kde je kvasinkový kmen vybrán ze skupiny obsahující Saccharomyces, Kluyveromyces, Torulaspora a Schizosaccharomyces.

Metoda dle nároku 17, kde kvasinkový kmen je Saccromyces cerivesia.

Metoda dle nároku 15, kde kvasinkový kmen je metylotrofni kvasinkový kmen.

Metoda dle nároku 19, kde metylotrofni kvasinkový kmen je

Pichia pastoris.

Protein nebo polypeptid produkovaný metodou dle nároku 1.

Protein nebo polypeptid dle nároku 21, kde protein nebo polypeptid obsahuje signální peptid.

23. Protein nebo polypeptid dle nároku 21, kde heterologni gen je gen phyA z Aspergilus niger.

24. Protein nebo polypeptid dle nároku 21, kde heterologni gen je gen appA z Escherichia coli.

25. Protein nebo polypeptid dle nároku 21 mající fytasovou aktivitu s optimální aktivitou v oblasti teplot 57-65°C a pH 2,5 -3,5 nebo 5-5,5.

26. Protein nebo polypeptid dle nároku 25, kde teplotní oblast pro optimální aktivitu je 58 - 62°C.

27. Protein nebo polypeptid dle nároku 21, mající fytasovou aktivitu, kde si protein po zahřátí na 90°C a dobu 15 minut zachová alespoň 40% své aktivity.

28. Protein nebo polypeptid dle nároku 27, kde si protein po zahřátí na 90°C a dobu 15 minut zachová mezi 40% a 60% své aktivity.

29. Protein nebo polypeptid dle nároku 21, mající fytasovou aktivitu, kde si protein po zahřátí na 60°C a dobu 15 minut zachová alespoň 60% své aktivity.

30. Kvasinkový kmen obsahující heterologni gen, který kóduje protein nebo polypeptid s fytasovou aktivitou, a který je funkčně spojen s promotorem schopným exprese fytasy v kvasinkách.

31. Kvasinkový kmen dle nároku 30, kde heterologni gen je gen phyA z Aspergilus niger.

32. Kvasinkový kmen dle nároku 31, kde je kvasinkový kmen vybrán ze skupiny obsahující Saccharomyces, Kluyveromyces, Torulaspora a Schizosaccharomyces.

kde kvasinkový kmen je .Kvasinkový kmen dle nároku 32,

Saccharomyces cerevisiae.

.Kvasinkový kmen dle nároku 31, metylotrofní kvasinkový kmen.

.Kvasinkový kmen dle nároku 34, kmen je Pichia pastoris.

.Kvasinkový kmen dle nároku 30, appA z Escherichia coli.

kde kvasinkový kmen je kde metylotrofní kvasinkový kde heterologní gen je gen

Kvasinkový kmen dle nároku 36, kde je kvasinkový kmen vybrán ze skupiny obsahující Saccharomyces, Kluyveromyces, Torulaspora a Schizosaccharomyces.

.Kvasinkový kmen dle nároku 37, kde kvasinkový kmen je

Saccromyces cerivesia.

.Kvasinkový kmen dle nároku 36, kde kvasinkový kmen je metylotrofní kvasinkový kmen.

.Kvasinkový kmen dle nároku 39, kde metylotrofní kvasinkový kmen je Pichia pastoris.

Vektor obsahující gen z jiného organismu než jsou kvasinky, který kóduje protein nebo polypeptid s fytasovou aktivitou, promotor funkčně spojený s genem kódujícím peptid s fytasovou aktivitou, a kde je řečený promotor schopný iniciace transkripce v kvasinkách a dále obsahuje počátek replikace schopný udržet vektor v kvasinkách.

.Vektor dle nároku 41, který dále obsahuje selekční markér.

.Vektor dle nároku 42, kde je selekční markér vybrán ze skupiny zahrnující URA3, LEU2, TRPÍ, HIS3, HIS4, ARG4 a geny rezistence k antibiotikům.

«9 9 · • 99 99 ♦ 9 • · 9 • 9 9 9 9 · 9 9 9 • 9 · • »··♦ • · ·*· 9 • 9 · 9 9 99 9 9 99· • 9 9 9 · 99 9 • 9 99 ·

Vektor dle nároku 41, který dále obsahuje počátek replikace schopný replikace v bakteriální buňce.

Vektor dle nároku 44, kde počátek replikace je vybrán ze skupiny zahrnující ColEl, Ori a oriT.

.Vektor dle nároku 41, z bakteriální buňky. kde je heterologní gen izolován .Vektor dle nároku 46, kde heterologní gen je gen phyA z Aspergilus niger. .Vektor dle nároku 46, kde heterologní gen je gen appA z Escherichia coli.

.Metoda produkce proteinu nebo polypeptidu majícího fytasovou aktivitu a zahrnující: zajištění izolovaného genu appA, který kóduje protein nebo polypeptid s fytasovou aktivitou a dále expresi řečeného genu v hostitelské buňce.

.Metoda dle nároku 49, kde je gen appA izolován z Escherichia coli.

.Metoda dle nároku 49, kde je hostitelskou buňkou kvasinkový kmen nebo filamentární houba.

.Metoda dle nároku 51, kde je filamentární houbou Aspergillus niger.

.Metoda dle nároku 51, kde je kvasinkový kmen vybrán ze skupiny obsahující Saccharomyces, Kluyveromyces, Torulaspora a Schizosaccharomyces.

.Metoda dle nároku 51, kde kvasinkový kmen je Saccromyces cerivesia.

55.Metoda dle nároku 49, kde je protein nebo polypeptid zaváděn signálním peptidem a sekretován buňkou do růstového média nebo pouze exprimován vnitrobuněčně.

56. Metoda konverze fytinu na inositol a anorganický fosfát zahrnující: zajištěni genu appA; expresi proteinu nebo polypeptidu s fytasovou aktivitou z řečeného genu v hostitelské buňce a kontakt proteinu nebo polypeptidu s fytinem za účelem katalýzy konverze fytinu na inositol a anorganický fosfát.

57. Metoda dle nároku 56, kde je fytin obsažen v potravinách nebo krmivěch.

58. Metoda dle nároku 56, kde je gen appA izolován z Escherichia coli.