CZ20011538A3 - Nezávisle fungující expresní kazeta, amplifikovatelný plazmidový replikon, bakteriální buňka, vakcinační vektor, podmíněně nestabilní plazmid, způsob vyvolání imunitní odpovědi, DNA a expresní plazmid - Google Patents

Nezávisle fungující expresní kazeta, amplifikovatelný plazmidový replikon, bakteriální buňka, vakcinační vektor, podmíněně nestabilní plazmid, způsob vyvolání imunitní odpovědi, DNA a expresní plazmid Download PDF

Info

Publication number
CZ20011538A3
CZ20011538A3 CZ20011538A CZ20011538A CZ20011538A3 CZ 20011538 A3 CZ20011538 A3 CZ 20011538A3 CZ 20011538 A CZ20011538 A CZ 20011538A CZ 20011538 A CZ20011538 A CZ 20011538A CZ 20011538 A3 CZ20011538 A3 CZ 20011538A3
Authority
CZ
Czechia
Prior art keywords
plasmid
promoter
expression
group
vaccine vector
Prior art date
Application number
CZ20011538A
Other languages
English (en)
Inventor
James E. Galen
Original Assignee
University Of Maryland, Baltimore
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Priority claimed from US09/204,117 external-priority patent/US6413768B1/en
Application filed by University Of Maryland, Baltimore filed Critical University Of Maryland, Baltimore
Publication of CZ20011538A3 publication Critical patent/CZ20011538A3/cs

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/02—Bacterial antigens
    • A61K39/025—Enterobacteriales, e.g. Enterobacter
    • A61K39/0275—Salmonella
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/02—Bacterial antigens
    • A61K39/025—Enterobacteriales, e.g. Enterobacter
    • A61K39/0283—Shigella
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/04—Antibacterial agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
    • C07K14/24—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Enterobacteriaceae (F), e.g. Citrobacter, Serratia, Proteus, Providencia, Morganella, Yersinia
    • C07K14/25—Shigella (G)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
    • C07K14/24—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Enterobacteriaceae (F), e.g. Citrobacter, Serratia, Proteus, Providencia, Morganella, Yersinia
    • C07K14/255—Salmonella (G)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/74—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
    • A61K2039/52—Bacterial cells; Fungal cells; Protozoal cells
    • A61K2039/521—Bacterial cells; Fungal cells; Protozoal cells inactivated (killed)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
    • A61K2039/52—Bacterial cells; Fungal cells; Protozoal cells
    • A61K2039/522—Bacterial cells; Fungal cells; Protozoal cells avirulent or attenuated
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
    • A61K2039/52—Bacterial cells; Fungal cells; Protozoal cells
    • A61K2039/523—Bacterial cells; Fungal cells; Protozoal cells expressing foreign proteins
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Saccharide Compounds (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)

Description

Předložený vynález se obecně týká expresních plazmidů stabilizovaných systémem pro udržování plazmidů (který je zde definován), schopných exprimovat protein nebo peptid, jako je antigen vhodný pro použití ve vektoru živé vakcíny, a metody pro přípravu a použití stabilizovaných plazmidů. Vynález optimalizuje udržování expresních plazmidů na dvou nezávislých úrovních: (1) odstraněním výhradní závislosti na katalytických rovnovážných letálních systémech udržování; a (2) zabudováním systému pro rozdělování plazmidů, aby bylo zabráněno náhodné segregaci expresních plazmidů, a tím zvýšeno jejich dědění a stabilita.
Dosavadní stav techniky
Bakteriální vektory živých vakcín.
Bakteriální vektory živých vakcín dopravují antigen k hostitelovu imunitnímu systému tím, že exprimují antigeny z genetického materiálu, který je obsažen v živém bakteriálním vektoru. Genetickým materiálem je v typickém případě replikon, jako je např. plazmid. Antigeny mohou zahrnovat rozmanité proteiny a/nebo peptidy bakteriálního, virového, parazitického nebo jiného původu.
Mezi živými bakteriálními vektory, které jsou v současné době zkoumány, jsou oslabené střevní patogeny (např. Salmonella typhi, Shigella, Vibrio cholerae), symbionti (např. Lactobacillus, Streptococcus gordonii) a povolené vakcinační kmeny (např. BCG). Zvláště atraktivním kmenem pro lidskou vakcinaci je S. typhi.
Oslabená Salmonela typ/?/jako živý vektorový kmen.
S. typhi je dobře snášený živý vektor, který může dopravovat do lidského imunitního systému množství nepříbuzných imunogenních antigenů. Bylo ukázáno, že živé vektory S. typhi vyvolávají tvorbu protilátek a buněčnou imunitní odpověď k exprimovanému antigenů. Mezi příklady antigenů, které jsou úspěšně dopravovány S.
* · to · · · · « · ·· · ···· > typhi patří netoxigenní, ale vysoce imunogenní fragment C tetanického toxinu a protein malarického circumsporozoitu z Plasmodium falciparum.
Pro S. typhi jsou charakteristické střevní cesty infekce, což je vlastnost, která umožňuje orální podávání vakcíny. S. typhi také infikuje monocyty a makrofágy a může proto dopravit antigeny ke specializovaným APCs.
Exprese antigenu pomocí S. typhi obecné vyžaduje zabudování rekombinantního plazmidu, kódujícího antigen. Následkem toho je stabilita plazmidu klíčovým faktorem při vývoji vysoce kvalitních oslabených vakcín S. typhi, které mají schopnost stabilně exprimovat cizí antigeny.
Kandidáti na oslabené vakcíny S. typhi, vhodné pro použití u lidí, by měli obsahovat alespoň dvě od sebe oddělené a dobře definované mutace, které nezávisle způsobují oslabení, protože pravděpodobnost in vivo reverze takové dvojité mutanty by byla zanedbatelná. Kandidát na oslabenou vakcínu S. typhi CVD 908 tyto vlastnosti má. CVD 908 obsahuje dvě nerevertující deleční mutace uvnitř genů aroC a aroD. Tyto dva geny kódují enzymy kritické pro biosyntetickou dráhu, vedoucí k syntéze chorizmátu, klíčového prekurzoru potřebného pro syntézu aromatických aminokyselin fenylalaninu, tyrozinu a tryptofanu. Chorizmát je také vyžadován pro syntézu kyseliny p-aminobenzoové; po její konverzi na kyselinu tetrahydrolistovou, je kyselina paminobenzoová konvertována na purinové nukleotidy ATP a GTP.
Nestabilita plazmidů.
I
Bakteriální buňky bez plazmidů mají tendenci se hromadit rychleji než buňky, které plazmidy obsahují. Jedním důvodem pro tuto zvýšenou rychlost hromadění je, že transkripce a translace plazmidových genů představuje metabolickou zátěž, která zpomaluje buněčný růst a dává buňkám bez plazmidů kompetitivní výhodu. Dále mohou být někdy produkty cizích plazmidových genů pro hostitelské buňky toxické.
Pro oblast živých bakteriálních vektorových vakcín je tedy žádoucí stabilní dědění plazmidů, aby bylo zajištěno úspěšné pokračování produkce antigenu, rovněž je důležité i při operacích s výrobními bioreaktory, aby se zabránilo tomu, že v bioreaktoru převládnou buňky bez plazmidů.
Stabilní dědění plazmidu obecně vyžaduje: (1) plazmid se musí replikovat v každé generaci jednou, (2) odchylky v počtu kopií musí být rychle opraveny před buněčným dělením, a (3) při buněčném dělení musí být produkty replikace plazmidu rozděleny do, obou dceřinných buněk.
.> Přestože integrace cizích genů do chromozomu zvyšuje stabilitu takových sekvencí, potřebné genetické manipulace mohou být obtížné a pokles počtu kopií heterologního genu má často za následek nedostatečnou úroveň produkce heterologního antigenu, která pak není schopna zajistit optimální imunitní odpověď. Vnášení heterologních genů na plazmidech, které se udržují v živém vektoru v mnoha kopiích, je přirozeným řešením problému počtu kopií; genetická manipulace s takovými plazmidy pro kontrolovanou expresi těchto heterologních genů je jednoduchá. Avšak výsledné plazmidy se mohou stát in vivo nestabilními, což má pak za následek ztrátu těchto cizích genů.
Systémy pro stabilizaci plazmidu.
V přírodě jsou často bakteriální plazmidy udržovány ve stabilním stavu, dokonce i když jsou obvykle přítomny ve velmi nízkém počtu kopií. Stabilní dědění přirozeně se vyskytujících plazmidů s nízkým počtem kopií může záviset na přítomnosti určitých genetických systémů, které aktivně brání vzniku potomstva bez plazmidů. Nedávný přehled systémů pro udržování plazmidů je možno nalézt v Jensen a kol., Molecular Microbiol. 17:205-210,1995 (který je zde zahrnut jako odkaz).
Rezistence k antibiotikům.
Jedním způsobem jak udržovat plazmidy, je umístit na plazmid gen pro rezistenci k antibiotikům a pěstovat buňky v médiu obohaceném o toto antibiotikum. Avšak tato metoda podléhá řadě obtíží. Přístup s rezistencí k antibiotikům je drahý, vyžadující používání drahých antibiotik a snad nejdůležitější je, že použití antibiotik ve spojení s in vivo podáváním vakcinačních vektorů nyní zakázáno U.S. Úřadem pro potraviny a léky.
Při velkoobjemových produkčních aplikacích může použití antibiotik přinést jiná omezení. Pokud se týká komerčních bioreaktorů, mohou systémy rezistence na antibiotika tato antibiotika rozložit a umožnit tak, aby v kultuře přetrvala dostatečně velká populace buněk bez plazmidů. Tyto buňky bez plazmidů nejsou produktivní a snižují výtěžek bioreaktorů.
Existuje proto v oboru potřeba systému pro udržování plazmidu, navrženého specificky pro použití v živých bakteriálních vakcinačních vektorech, které nespoléhají na rezistenci k antibiotikům a s výhodou takové, které jsou vhodné pro komerční aplikace v bioreaktorech.
• · · · ··· ··· • · ·· · ···· · ·
Funkce zajišťující segregaci plazmidů.
Plazmidy se stabilně nižším počtem kopií typicky využívají rozdělovači funkci, která aktivně rozděluje kopie plazmidu mezi dceřinnými buňkami. Příklady rozdělovačích funkcí zahrnují mimo jiné systémy pSC101, F faktoru, P1 profága a IncFII plazmidy rezistence k lékům. Takové funkce jsou zde označovány jako SEG funkce.
Funkce post-segregačního zabíjení (PSK).
Přirozeně se vyskytující PSK funkce udržující plazmidy typicky využívají dvousložkového systému toxin-antitoxin a obecně pracují takto: plazmid kóduje jak toxin tak i antitoxin. Antitoxiny jsou méně stabilní než toxiny, které mají tendenci být zcela stabilní. Ve dceřinné buňce bez plazmidů nejsou toxiny a antitoxiny dále produkovány; avšak méně stabilní antitoxiny se rychle rozloží a tím uvolní toxin pro zabití buňky.
Toxiny jsou obecně malé proteiny a antitoxiny jsou buď malé proteiny (proteinové systémy jako je phd-doc) nebo antisense RNA, které se vážou na mRNA kódující toxiny a zabraňují tak jejich syntéze (antisense systémy jako je hok-sok).
Rovnovážné letální systémy diskutované dále jsou příkladem umělé PSK funkce.
Proteinový systém pro udržování: systém phd-doc.
U proteinových PSK funkcí jsou jak toxin tak antitoxin syntetizovány z operonů, v nichž je gen kódující antitoxin umístěn proti směru přepisu od genu kódujícího toxin. Tyto operony automaticky regulují hladiny transkripce a syntéza kódovaných proteinů je na úrovni translace spojena. Antitoxin je obecně syntetizován v nadbytku, aby bylo zajištěno, že působení toxinu je blokováno. Nestabilní antitoxiny jsou konstantně rozkládány proteázami kódovanými hostitelskou buňkou, proto aby byla buňka chráněna, je vyžadována konstantní syntéza antitoxinu. Při ztrátě plazmidu nejsou antitoxiny dále produkovány, existující antitoxiny se rychle rozloží a umožní toxinu zabít hostitelskou buňku.
Systém phd-doc je příkladem proteinové PSK funkce. Systém phd-doc se přirozené vyskytuje u mírného bakteriofága P1, který lyzogenizuje Escherichia coli, jako
-100 kb plazmid. Tento udržovací lokus kóduje dva malé proteiny: toxický protein Doc, složený ze 126 aminokyselin, způsobuje pomocí neznámého mechanizmu smrt buňky poté co se zbaví plazmidu (smrt po vyléčení), a antitoxin Phd, složený ze 73 • · · · ··· · · • · · · · · · · > · · aminokyselin, který zabraňuje smrti hostitele (zabránění smrti hostitele), pravděpodobně tím, že se váže na Doc a blokuje tak jeho působení.
Phd a Doc jsou kódovány jedním transkriptem v němž se startovní ATG kodon po směru transkripce ležícího genu doc jednou bází překrývá se stop kodonem TGA genu phd, který leží proti směru transkripce. Exprese těchto dvou proteinů je proto svázána na úrovni translace tak, že syntéza Phd převyšuje syntézu toxického proteinu Doc.
Dále, transkripce tohoto operonu je automaticky regulována na úrovni transkripce tím, že se komplex proteinů Phd-Doc váže na místo, které zabraňuje přístupu RNA polymerázy k promotoru operonu, jakmile koncentrace obou proteinů dosáhne kritické úrovně. I když se Doc zdá být relativně odolný k proteolytickému napadení, Phd je ke štěpení vysoce citlivý. PSK mechanizmus plazmidem kódovaného lokusu phd-doc je proto aktivován, když bakterie spontánně tento rezistentní plazmid ztratí, což pak vede k rozložení antitoxinu Phd a následné aktivaci toxinu Doc, který způsobí smrt buňky.
Antisense systém pro udržování: systém hok-sok.
V antisense systémech pro udržování jsou antitoxiny antisense RNA, které inhibují translaci mRNA, které kódují toxiny. Jako antitoxinové peptidy jsou i antisense RNA méně stabilní než toxiny kódující mRNA. Ztráta plazmidu umožní rozložit existující antitoxiny, čímž se umožní syntéza toxinu, který zabije hostitelskou buňku.
Příkladem antisense systému pro udržování je systém hok-sok, kódovaný lokusem parB v plazmidu R1. Systém je složen ze tří genů: hok, sok a mok.
Hok je protein spojující se s membránou, který buněčnou membránu nevratně poškozuje a buňky tak zabíjí. Exprese Hok z hok mRNA vede ke ztrátě potenciálu buněčné membrány, zastavení dýchání, změnám buněčné morfologie a buněčné smrti.
Gen sok kóduje RNA působící trans, která blokuje translaci hok mRNA, čímž zabraňuje Hok v zabití hostitelské buňky, sok RNA je méně stabilní než hok mRNA a je exprimována z relativně slabého promotoru. (Gerdes a kol., Annu. Rev. Genet., 31:131, 1997) je zde zahrnut jako odkaz. Mechanizmus, kterým sok RNA blokuje translaci Hok v buňkách obsahujících plazmid, se stal zřejmým až po zjištění genu mok (zmírnění zabíjení), třetího genu lokusu parB. Otevřený čtecí rámec mok se překrývá s hok a je nezbytný pro expresi a regulaci translace hok.
Antisense sok RNA vytváří duplex s 5' koncem mok-hok mRNA, čímž způsobí že místo v mok, které se váže na ribozom, je pro ribozomy nepřístupné a současně podporuje štěpení a rozklad mRNA RNázou III. V nepřítomnosti translace mok není hok exprimován z intaktní mRNA, dokonce i když jeho vlastní místo, které se váže na ribozom není přímo zakryto sok RNA.
Když vznikne buňka bez plazmidu, nestabilní sok RNA se rozpadne mnohem rychleji než stabilní mok-hok RNA. Když je ochrana poskytovaná sok ztracena, proběhne translace Mok a Hok a buňka zahyne.
Omezení systému hok-sok je v tom, že může vzniknout významný počet buněk bez plazmidu, pokud je systém hok-sok inaktivován mutacemi uvnitř otevřeného čtecího rámce Hok.
Rovnovážné letální systémy.
V rovnovážném letálním systému (funkce PSK) je chromozomální gen, kódující důležitý strukturální protein nebo enzym, z bakteriálního chromozomu odstraněn nebo tak mutován, že gen nemůže dále fungovat. Odstraněný nebo poškozený gen je potom zaměněn plazmidem, který obsahuje plně funkční gen. Ztráta plazmidu má za následek nedostatek důležitého proteinu a smrt buňky bez plazmidu.
Rovnovážný letální systém byl úspěšně použit v S. typhimurium a byl založen na expresi genu asd, kódujícím aspartát β-semialdehyd dehydrogenázu (Asd). Asd je kritický enzym účastnící se syntézy L-aspartát^-semialdehydu, který je prekurzorem aminokyselin L-threoninu (a L-izoleucinu), L-methioninu a L-lyzinu, a rovněž kyseliny diaminopimelové, klíčové strukturní složky důležité pro tvorbu buněčné stěny u gramnegativních bakterií. Ztráta plazmidu kódujícího Asd by byla letální pro kteroukoli bakterii, neschopnou syntézy Asd z chromozomu a měla by za následek lýzu bakterie, kvůli neschopnosti správně sestavit peptidoglykanovou vrstvu své buněčné stěny.
Systém asd (funkce PSK) byl úspěšně použit v oslabeném, na S. typhimurium založeném živém vektorovém kmeni pro imunizaci myši řadou prokaryotických a eukaryotických antigenů, včetně takových rozmanitých antigenů, jako je detoxifikovaný fragment C tetanického toxinu, a LT enterotoxin, syntetických virových peptidů hepatitidy B a gametově specifických antigenů, jako je lidský spermatický antigen SP10.
Imunizace sliznic myší těmito živými vektorovými kmeny vyvolala výrazné imunitní odpovědi včetně sérového IgG a IgA sekretovaného na povrchu sliznic.
• · > Systém asd byl nedávno zaveden do oslabených vakcinačních kmenů Salmonella typhi v pokuse zvýšit stabilitu plazmidu, exprimujících syntetické virové peptidy hepatitidy B. Avšak když byli těmito živými vektorovými kmeny imunizováni dobrovolníci, nebyla zjištěna žádná imunitní odpověď na cizí antigeny.
Ve skutečnosti byla dosud ve velmi málo pracích dokumentována imunitní odpověď na cizí antigeny po imunizaci lidí pomocí oslabeného živého vektoru S. typhi, když je jejich exprese založena na stabilizovaných plazmidech. V jedné zprávě byl vakcinační kmen Ty21a vytvořen jako auxotrofní na thymidin selekcí v přítomnosti trimethoprimu na nedefinovanou mutaci v genu thyA, kódujícím thymidylát syntetázu.
Třebaže v některých případech selhání živých vektorových kmenů může být způsobeno přílišným oslabením kmene samotného, zdá se pravděpodobné, že běžné systémy zabíjení u plazmidu trpí dalšími omezeními. V těch situacích, kde byla chromozomální kopie genu inaktivována, spíše než odstraněna, může být umožněno obnovení chromozomální kopie pomocí homologické rekombinace s genovou kopií na plazmidu, pokud je použitý bakteriální kmen rekombinace schopen.
Rovnovážné letální systémy založené na produkci katalytického enzymu trpí řadou důležitých nedostatků. Zvláště protože komplementování delece chromozomálního genu vyžaduje pouze jednu kopii genu, je z podstaty věci obtížné udržet více než několik kopií expresního plazmidu. Hostitelský kmen bez plazmidu musí být pěstován ve speciálních médiích, aby byla existující metabolická nedostatečnost chemicky komplementována.
Dále mohou mít buňky bez plazmidu také prospěch z jevů zkříženého přijímání potravy, pokud tím, co omezuje růst, difúzní růstový faktor.
Existuje proto v oboru potřeba takového systému pro udržování plazmidu, který není odkázaný pouze na rovnovážný letální systém, zvláště pro použití u živých bakteriálních vakcinačních vektorů.
Podstata vynálezu
Předložený vynález se všeobecně týká stabilizovaného expresního plazmidu obsahujícího systém pro udržování plazmidu a nukleotidovou sekvenci kódující protein nebo peptid, jako je např. cizí antigen, a metod pro přípravu a použití takových stabilizovanýph expresních plazmidu. Předložený systém pro udržování plazmidu • · · • · 1 optimalizuje životaschopnost tím, že používá stabilizované expresní plazmidy s nízkým počtem kopií, schopné exprimovat vysoké hladiny heterologního antigenu jako odpověď na signál z prostředí, se kterým se setká in vivo poté, co vakcinační organizmus dosáhne vhodné ekologické niky.
V určitém provedení je stabilizovaný expresní plazmid použit u živého vakcinačního vektoru Salmonella typhi, jako je CVD 908-htrA
Vynález optimalizuje udržování expresních plazmidu na dvou nezávislých úrovních: (1) odstraněním výhradní závislosti na katalytických rovnovážných letálních systémech pro udržování; a (2) zabudováním systému pro rozdělování plazmidů, aby bylo zabráněno náhodné segregaci expresních plazmidů, a tím zvýšeno jejich dědění a stabilita. V jednom provedení, stabilizovaný expresní plazmid je rekombinačně vytvořen tak, aby exprimoval jeden nebo více antigenů, s výhodou jeden nebo více antigenu Shiga toxinu (Stx2) nebo jejich podstatných homologů, jako jsou pentamery podjednotky Shiga toxinu nebo geneticky detoxifikovaný Stx 2.
Stabilizovaný expresní plazmid s výhodou obsahuje jednu nebo více nekatalytických funkcí udržování plazmidu.
V jiném provedení, expresní plazmid obsahuje systém pro udržování plazmidu, který obsahuje alespoň jednu PSK funkci a alespoň jednu SEG funkci. Například systém pro udržování plazmidu může obsahovat dvousložkový systém pro udržování plazmidu, obsahující jednu PSK funkci a jednu SEG funkci. Jinou možností je, že systém pro udržování plazmidu může obsahovat třísložkový systém pro udržování plazmidu, obsahující PSK funkci, SEG funkci a jinou PSK. Ve výhodné alternativě systém pro udržování plazmidu obsahuje hok-sok + par + parA + phd-doc; přičemž kterákoli z uvedených funkcí může být nahrazena svým podstatným homologem.
Systém pro udržování plazmidu může být zabudován do expresních plazmidů s mnoha kopiemi, kódujících jeden nebo více proteinů nebo peptidů o které se jedná. Takové expresní plazmidy s mnoha kopiemi vytvářejí účinek genové dávky, který zvyšuje úroveň exprese proteinu nebo peptidů a který se jedná. Kde se má použít systém pro udržování plazmidu pro živé bakteriální vakcinační vektory, proteinem nebo peptidem o který se jedná, je jeden nebo více cizích antigenů.
V jednom provedení, expresní plazmid je plazmid exprimující vakcínu, který obsahuje systém pro udržování plazmidu a alespoň jeden antigen, například alespoň jeden antigen Shiga toxinu 2 (Stx2) a/nebo jeho podstatný homolog. Když je antigenem • · ·· ·· ·· ·· .· ...
' antigen Shiga toxinu 2, antigen Shiga toxinu 2 může být například buď pentamer subjednotky B nebo geneticky detoxifikovaný Stx 2.
V jiném provedení, expresní plazmid obsahuje systém pro udržování plazmidu, který obsahuje rovnovážný letální systém ssb a tento lokus ssb živého bakteriálního vektoru je inaktivován pomocí sebevražedného vektoru, který obsahuje počátek replikace citlivý k teplotě. V jiném provedení je živým bakteriálním vektorem S. typhi a sebevražedný vektor je použit pro inaktivaci lokusu ssb u S. typhi. V jiném provedení, sebevražedným vektorem je derivát pSC101, který nese sacB, který je zde popsán.
V jiném provedení poskytuje předložený vynález systém pro udržování plazmidu obsahující PSK funkci, která zahrnuje latentní, na plazmid zaměřený systém, který je založen na kontrolních mechanizmech antisense RNA, který syntetizuje letální proteiny pouze poté, co došlo ke ztrátě plazmidu.
V jednom provedení obsahuje expresní plazmid sérii expresních plazmidů, z nichž každý obsahuje samostatné genetické kazety kódující regulovanou expresi heterologních antigenů, počátek replikace a selekční markér pro získání plazmidu.
V jednom provedení expresní plazmid obsahuje systém pro udržování plazmidu, který obsahuje PSK funkci, založenou na genu ssb. V podobném provedení zde popsané mutované alely, jako je ssb-1, jsou zabudovány do expresních plazmidů, aby byl zvýšen počet kopií plazmidů pomocí nadbytečné exprese proteinů podobných SSB1, aby došlo k vytvoření požadovaných biologicky aktivních tetramerů SSB.
V jiném provedení expresní plazmid obsahuje promotor. Promotor je s výhodou indukovatelný promotor, jako je ompC promotor. V jednom provedení je indukovatelným promotorem mutovaný PompC/, nebo Po„pc3 promotor, které jsou zde popsány.
V jednom provedení expresní plazmid předloženého vynálezu obsahuje lokus pro dědění (nebo rozdělování) plazmidu; počátek replikace vybraný tak, aby poskytoval takový počet kopií, který účinně stabilizuje daný antigen; PSK funkci; a nukleotidovou sekvenci kódující antigen a promotor, který rozhodujícím způsobem kontroluje translaci antigenů a má schopnost vylepšit produkci antigenů bez usmrcení buňky.
Předložený vynález také poskytuje metodu pro použití expresního plazmidu, sestávající z transformování bakteriální buňky uvedeným expresním plazmidem a pěstováním bakteriální buňky pro produkci proteinu nebo peptidu (např. antigenů) a/nebo podání uvedené transformované buňky nebo buněčné kultury jedinci. Tam kde jsou transformované bakteriální buňky podány jedinci, jsou podány v množství ···♦ ♦ · · ·«· • ·♦♦ · · · · · · · nezbytném pro vyvolání imunitní odpovědi, která propůjčí jedinci imunitu k proteinu nebo peptidu. S výhodou je jedincem člověk, ale může to být také jiný živočich, jako je pes, kůň nebo kuře.
V jednom provedení je poskytnut expresní plazmid, který se skládá alespoň ze tří nezávisle fungujících expresních kazet, přičemž jedna kazeta kóduje protein nebo peptid o který se jedná a každá ze zbývajících kazet kóduje jinou funkci pro udržování plazmidu.
V jednom provedení je poskytnut expresní plazmid, který kóduje (1) testovaný antigen operativně vázaný k promotoru a (2) systém pro udržování plazmidu.
V jiném provedení je poskytnuta regulovatelná expresní kazeta pro testovaný antigen, která funguje tak, že jak se zvyšuje indukce antigenní exprese, na baktérii působí metabolická zátěž, která fenotypově vede k nestabilitě plazmidu, tj. je vytvořena selekční výhoda pro všechny bakterie, které mohou spontánně ztratit obtěžující plazmid. Testovaným antigenem může být zelený fluorescenční protein (GFPuv). Expresní kazeta kódující testovaný antigen může též obsahovat indukovatelný promotor, jako je např. promotor ompC, umístěný tak, že indukovatelný promotor rozhodujícím způsobem řídí translaci testovaného antigenu.
V jednom provedení je poskytnuta metoda pro vytvoření expresního plazmidu, která sestává ze syntézy expresního plazmidu, obsahujícího alespoň 3 nezávisle fungující expresní kazety, přičemž jedna kazeta kóduje protein nebo peptid o který se jedná, a každá ze zbývajících kazet kóduje jinou funkci pro udržování plazmidu.
V jednom provedení je poskytnuta metoda pro hromadné prohledávání systémů pro udržování plazmidu, která sestává z: poskytnutí jedné expresní kazety, která kóduje protein nebo peptid o který se jedná, a alespoň dvě jiné expresní kazety, přičemž každá kóduje a je schopna exprimovat jinou funkci pro udržování plazmidu v živém hostitelském bakteriálním vektoru; vložení tří expresních kazet do jednoho expresního plazmidu; transformace živého bakteriálního vektoru jedním expresním plazmidem; pěstování transformovaného živého bakteriálního vektoru; a zjištění rychlosti vznikání buněk bez plazmidu v kultuře.
V jednom provedení předložený vynález obsahuje oslabený živý bakteriální vakcinační vektor, obsahující oslabený živý bakteriální vektor, který byl transformován stabilizovaným expresním plazmidem, který obsahuje systém pro udržování plazmidu, s výhodou nekatalytický systém pro udržování plazmidu.
99 99 9 9 · · • 9 9
• · 9 9 • 9 · 9 · 9 9
• · 99 9 9 9 9· 9 9 9
9 9 * · 99 9 9 • 9 999
> V jednom provedení předložený vynález obsahuje oslabený živý bakteriální vakcinační vektor, obsahující oslabený živý bakteriální vektor, který byl transformován expresním plazmidem, který obsahuje systém pro udržování plazmidu, který obsahuje alespoň jeden systém PSK a alespoň jeden systém SEG. Oslabený živý bakteriální vektor může být např. S. typhi CVD 908-MrA
Předložený vynález také poskytuje metodu pro vakcinaci jedince, která sestává z toho, že jedinci je podáno takové množství živého bakteriálního vakcinačního vektoru, které je postačující pro vyvolání zvýšené imunitní odpovědi. Předložený vynález také poskytuje metodu pro zabránění nemoci pomocí vakcinace jedince za použití takového množství živého bakteriálního vakcinačního vektoru, které je postačující pro vyvolání ochranné imunitní odpovědi proti jednomu nebo více patogenům této nemoci. Jedincem je s výhodou člověk, ale může to být také jiný živočich, jako je pes, kůň nebo kuře. Například předložený vynález poskytuje metodu pro zabránění hemolytického uremického syndromu (HUS), způsobeného enterohemoragickou Escheríchia coli, produkující Shiga toxin 2 tak, že je jedinci podáno množství živého bakteriálního vektoru transformovaného stabilizovaným plazmidem, kódujícím alespoň jeden antigen Shiga toxin 2.
V jiném provedení předložený vynález poskytuje metodu hromadného testování účinnosti systémů pro udržování plazmidu, metodu která sestává z: poskytnutí expresních plazmidů obsahujících zde popsaný systém pro udržování plazmidu a kódující protein nebo peptid o který se jedná, uvedené expresní plazmidy mají počet kopií, který varíruje od nízkého počtu kopií (např. ~5 kopií na buňku) ke střednímu počtu kopií (např. ~15 kopií na buňku) a k vysokému počtu kopií (např. -60 kopií na buňku); transformování živých bakteriálních vektorů takovými expresními plazmidy; a testování rychlosti s jakou vznikají buňky bez plazmidu a/nebo rychlosti růstu buněk obsahujících plazmid. Modifikované počátky replikace mohou být počátky replikace z plazmidů pSC101 (nízký počet kopií), pACYC184 (střední počet kopií) a pAT153 (vysoký počet kopií). Mohou být použity nezávisle fungující plazmidové replikační kazety, což dovolí testování účinnosti jednoho nebo více systémů pro stabilizaci plazmidu, jak je zvyšován počet kopií.
V jiném provedení předložený vynález poskytuje stabilizované expresní plazmidy, vhodné pro použití v oslabených živých vektorech S. typhi, které obsahují selektovatelný markér, který může být snadno zaměněn lokusem, který nenese rezistenci k léku nebo genem kódujícím přijatelný markér rezistence k léku, jako je aph, kódující rezistenci k aminoglykozidům kanamycinu a neomycinu.
Systémy pro udržování plazmidu předloženého vynálezu poskytují vylepšenou stabilitu rekombinačních plazmidů, kterou jsou překonány problémy dosavadního stavu techniky, které se týkaly nestability plazmidu, například v bioreaktoru a při použití jako živý vektor pro vakcinaci. Plazmidy předloženého vynálezu jsou navrženy specielně pro použití pro vakcinaci, třebaže takové plazmidy jsou také vhodné pro produkci proteinu ve velkém měřítku.
Plazmidy předloženého vynálezu jsou závažným zdokonalením dosavadního stavu techniky v tom, že překonávají problémy spojené s převládnutím buněk bez plazmidů a nestabilitou plazmidů, a mají rozsáhlé uplatnění v oblastech, jako jsou průmyslová produkce proteinů a produkce oslabených živých bakteriálních vakcinačních vektorů.
Dlouho trvala potřeba řešení problémů s převládnutím buněk bez plazmidů a stabilitou plazmidů, spojené s oblastí podávání vakcíny a produkce proteinu. Předložený vynález řeší tuto dlouho pociťovanou potřebu.
Definice.
Termín systém pro udržování plazmidu (PMS) jak je zde používán, označuje nukleotidovou sekvenci obsahující alespoň jednu funkci post-segregačního zabíjení (PSK), a alespoň jeden systém pro rozdělování nebo segregaci plazmidů (SEG) a popřípadě zahrnující jakoukoli jinou funkci pro udržování plazmidu.
Termín funkce udržující plazmid jak je zde používán, označuje jakoukoli funkci posilující stabilitu plazmidu, spojenou s PMS. Termín zahrnuje jak přirozeně se vyskytující nukleotidové sekvence, kódující funkce udržující plazmid, tak rovněž nukleotidové sekvence, které jsou v podstatě homologické s takovými přirozeně se vyskytujícími funkcemi udržujícími plazmid a které si podržely funkci vykazovanou odpovídající, přirozeně se vyskytující funkcí udržující plazmid.
Termín systém post-segregačního zabíjení (PSK) je zde použit pro označení jakékoli funkce, která má za následek smrt jakékoli nově oddělené bakteriální buňky, která nezdědila plazmid o který se jedná, a speciálně zahrnuje rovnovážné letální systémy jako jsou asd nebo ssb, proteinové systémy jako je phd-doc a antisense systémy jako je hok-sok. Termín zahrnuje jak přirozeně se vyskytující nukleotidové sekvence, kódující takové PSK, tak rovněž nukleotidové sekvence, které jsou v • · · ' podstatě homologické s takovými přirozeně se vyskytujícími nukleotidovými sekvencemi a které si podržely funkci vykazovanou odpovídajícími, přirozeně se vyskytujícími nukleotidovými sekvencemi.
Termín v podstatě homologický nebo podstatný homolog v odkazu na nukleotidovou sekvenci nebo aminokyselinovou sekvenci naznačuje, že sekvence nukleové kyseliny má dostatečnou homologii při srovnání s výchozí sekvencí (např. přirozenou sekvencí), aby umožnila sekvenci vykonávat tutéž základní funkci jako odpovídající výchozí sekvence; v podstatě homologická sekvence je typicky alespoň ze 70 % sekvenčně totožná při srovnání se sekvencí výchozí, typicky alespoň z 85 % sekvenčně totožná, s výhodou alespoň z 95 % sekvenčně totožná, a nejvýhodněji z 96, 97, 98 nebo 99 % sekvenčně totožná při srovnání s výchozí sekvencí. Během specifikace je nutno mít na paměti, že kde je odkazováno na specifické nukleotidové sekvence a/nebo aminokyselinové sekvence, že takové nukleotidové sekvence a/nebo aminokyselinové sekvence mohou být zaměněny v podstatě homologickými sekvencemi.
Termíny segregační systém a/nebo rozdělující systém (oba zde označované jako SEG), jsou zde používány zaměnitelně pro označení jakékoli funkce posilující stabilitu plazmidu, která působí zvýšení frekvence úspěšného dodání plazmidu do každé nové oddělené bakteriální buňky ve srovnání s frekvencí dodání odpovídajícího plazmidu bez takového SEG systému. Systémy SEG zahrnují například systémy rozdělující rovným způsobem, párové rozdělující systémy a lokus par v pSC101. Termín zahrnuje jak přirozeně se vyskytující nukleotidové sekvence, kódující takové SEG systémy, tak rovněž nukleotidové sekvence, které jsou v podstatě homologické s takovými přirozeně se vyskytujícími nukleotidovými sekvencemi a které si podržely funkci vykazovanou odpovídajícími přirozeně se vyskytujícími nukleotidovými sekvencemi.
Termín detoxifikovaný je zde použit pro popsání toxinu, který má jednu nebo více bodových mutací, které výrazně snižují toxicitu toxinu ve srovnání s odpovídajícím toxinem bez takových bodových mutací.
Termín imunizačně účinný je zde použit pro označení imunní odpovědi, která propůjčuje imunologickou buněčnou paměť jedinci, s tím účinkem, že druhotná odpověď (k témuž nebo podobnému toxinu) je charakterizována jednou nebo více následujícími, charakteristikami: kratší lag fáze ve srovnání s lag fází, která se projeví • to 1 při odpovídající expozici, ale v nepřítomnosti předchozí imunizace; produkce protilátky, která pokračuje po delší období, než produkce protilátky při odpovídající expozici, ale v nepřítomnosti takové imunizace; změna typu a kvality produkované protilátky ve srovnání s typem a kvalitou protilátky, produkované při takové expozici v nepřítomnosti imunizace; posun ve třídě odpovědi, kdy se IgG protilátky objevují ve vyšších koncentracích a s delším přetrváváním než IgM; zvýšená průměrná afinita (vazebná konstanta) protilátek ve srovnání s průměrnou afinitou protilátek proti antigenu při takové expozici v nepřítomnosti imunizace; a/nebo jiné charakteristiky známé v oboru, které charakterizují druhotnou imunitní odpověď.
Podrobný popis vynálezu.
Živé bakteriální vakcinační vektory používají živý bakteriální vektor pro expresi genů kódujících ochranné antigeny pro bakteriální, virové nebo parazitické patogeny. Je výhodné, když ochranné bakteriální antigeny nejsou přirozenou součástí živého bakteriálního vektoru, tj. jsou heterologní. Živý bakteriální vakcinační vektor je podáván hostiteli, čímž jsou exprimované antigeny vystaveny imunitnímu systému hostitele a vyvolávají imunitní odpověď vhodného charakteru, jež propůjčuje hostiteli imunitu.
Aby bylo dosaženo zvýšené imunogenity, musí být plazmidy, které exprimují takové ochranné antigeny, stabilizovány. Podle znalostí vynálezců, žádný nyní dostupný systém pro udržování plazmidu, založený na S. typhi, nevykazuje výhodu proti přirozeně se vyskytujícím rozdělovacím mechanizmům, o nichž je známo že v jiných kmenech zvyšují stabilitu plazmidů s mnoha kopiemi.
Předložený vynález poskytuje nekatalytický systém pro udržování plazmidu pro stabilizaci expresních plazmidů, kódujících cizí antigeny v kmeni živého vakcinačního vektoru S. typhi. V jednom provedení je kmenem S. typhi CVD 908-htrA. V jiném provedení předložený vynález zdokonaluje a/nebo optimalizuje udržování expresních plazmidů tím, že poskytuje systém pro udržování plazmidu, který působí na dvou nezávislých úrovních: (1) odstraněním výhradní závislosti na katalytických rovnovážných letálních udržovacích systémech; a (2) zabudováním systému pro rozdělování plazmidů, který zabrání náhodné segregaci expresních plazmidů, a tím zvýší jejich dědění a stabilitu. Kritickým důvodem pro provádění tohoto určitého přístupu je to, že tato metoda zdokonalení udržování plazmidu neobsahuje žádné další manipulace s živým vektorovým kmenem a proto může zdokonalit imunogenitu heterologních antigenú, exprimovaných v jakémkoli živém vektorovém kmenu.
• · 4 1 Nekatalytický systém udržování pro plazmidu předloženého vynálezu zdokonaluje stabilitu expresních plazmidů s mnoha kopiemi v živém bakteriálním vakcinačním vektoru, jako je CVD 908-WrA
V jednom provedení předloženého vynálezu je vložena přirozeně se vyskytující PSK funkce hok-sok z faktoru pR1 rezistence k antibiotiku, nebo z jeho podstatného homologu, do expresních plazmidů s mnoha kopiemi. Systém hok-sok je skrytý systém založený na antisense RNA kontrolním mechanizmu, který syntetizuje letální proteiny pouze v případě, že dojde ke ztrátě plazmidu.
Předložený vynález také poskytuje systém pro udržování plazmidu, který obsahuje PSK funkci založenou na komplementaci, v níž chromozomální gen ssb, kódující podstatný nekatalytický vazebný protein, který se váže na jednovláknovou nukleovou kyselinu (SSB), vyžadovaný pro replikaci DNA, je specificky odstraněn a vložen do expresního plazmidu s mnoha kopiemi.
Předložený vynález také poskytuje zdokonalený systém pro udržování plazmidu, který obsahuje expresní plazmid kódující alespoň jeden SEG lokus a alespoň jednu PSK funkci.
Sebevražedné vektory.
Heterologní antigeny mohou být exprimovány v živých vektorových kmenech jako je CVD 908-htrA, z genů umístěných buď na plazmidu nebo integrovaných uvnitř chromozomu. Jedna technika pro integraci těchto genů do hostitelského chromozomu zahrnuje použití sebevražedných vektorů citlivých na teplotu, jako je plB307, který obsahuje na teplotu citlivý počátek replikace z pSC101 (on'101te). Předložený vynález poskytuje zdokonalený sebevražedný vektor, vhodný pro použití v CVD908 a CVD908htrA, odvozený z plB307, který umožňuje snadnější konstrukci mutačních kazet pro změnu chromozomu živého vektoru.
Zabudování těchto sebevražedných vektorů do chromozomu pomocí heterologní rekombinace má za následek teplotní inaktivaci plazmidového replikačního proteinu RepA, proteinu podstatného pro funkci ori101. Spontánní rozdělení výsledných nestabilních, částečně diploidních meziproduktů je detekováno selekcí na ztrátu genu sacB, který je obsažen na rozštěpeném sebevražedném vektoru. Gen sacB, obsažený na všech vyštěpených plazmidech kóduje enzym levansacharázu, která je letální pokud je exprimována v cytoplazmě střevních bakterií, včetně S. typhi, rostoucích v přítomnosti sacharózy. Protože rozštěpené částečné diploidy jsou selektovány pomocí • · inkubace v přítomnosti 10% sacharózy, vyštěpené plazmidy usmrtí hostitelské bakterie, pokud se spontánně nevyléčí.
Tento systém byl úspěšně použit pro integraci kazety nesoucí rezistenci ke kanamycinu do lokusu AaroC1019 v CVD908. Tyto pokusy však byly úspěšné z toho důvodu, že gen, který byl přemísťován do chromozomu S. typhi kódoval selektovatelný markér rezistence k léku. Při použití těchto časných vektorů, záměna kazety nesoucí rezistenci ke kanamycinu za neselektovatelný markér nebyla úspěšná, protože ačkoli vnášený markér se mohl integrovat do chromozomu jako částečný diploid, rozštěpení částečného diploidu a záměna genu pro rezistenci k léku nebyly nikdy detekovány.
Předložený vynález také poskytuje metodu pro použití takových sebevražedných vektorů pro inaktivaci lokusu ssb oslabených kmenů Salmonella typhi, jako je CVD908htrA.
Předložený vynález umožňuje aby takové sebevražedné vektory spustily účinnou mobilizaci genů, exprimujících proteiny nebo peptidy o které se jedná, jako jsou heterologní antigeny, v chromozomu S. typhi CVD908-/)řrA ve dvou stádiích. Například nynější vynálezce vnesl do lokusu AaroC1019 kazetu sacB-aph, která byla potom selektována pomocí kanamycinu. Vytvoření tohoto S. typhi CVD908-WM karoC1019::sacB-aph kmene produkovalo jako meziprodukt hodnotný kmen, u něhož může teoreticky být účinně vnesen jakýkoli strukturální gen do lokusu aroC pomocí výměny markérů. Gen sacB je použit proti selektovatelnému markéru, neboť umožní částečným diploidům růst v přítomnosti 10% sacharózy, čímž je selektována záměna kazety sacB-aph vnášenou kazetou s antigenem, protože rozdělení částečných diploidů přítomnosti sacharózy bude mít za následek ztrátu genu sacB, aby bylo produkováno životaschopné potomstvo. Tento pomocný kmen byl použit pro účinnou integraci netoxigenní mutanty LT-K63 tepelné labilního enterotoxinu E. coli, a vytvořen tak CVD908AaroC1019:: LT-K63.
Exprese heterologních antigenů z plazmidů.
Třebaže integrace cizích genů do chromozomů přispívá ke stabilitě takových sekvencí, genetické manipulace s tím spojené mohou být obtížné a snížení počtu kopií heterologního genu má často za následek nedostatečnou úroveň produkce heterologního antigenů, která nemůže zajistit optimální imunitní odpověď.
Naopak stabilita plazmidu je komplexní jev, který závisí na mnoha faktorech, mezi něž patří: (1) počet kopií plazmidu; (2) vhodně regulovaná exprese genů • · »’ ·· ··, • · · · »*· • ♦··· » «« • · · · · · «;
• · · · · ·· ·· ·· ·· ··· obsažených v plazmidu; a (3) selekční tlak pro zajištění vhodné segregace a dědění plazmidu.
Aby byla zajištěna stabilita, musí se plazmidy replikovat regulovaným způsobem, aby se zabránilo vzrůstu počtu jejich kopií na letální úroveň.
Mimoto musí být plazmidy segregovány během dělení rostoucí bakterie, aby bylo zajištěno, že každá dceřinná buňka obdrží alespoň jednu kopii plazmidu. Segregace může být pasivní, náhodný děj nebo aktivní proces, zahrnující syntézu nových proteinů, které pomáhají při segregaci plazmidů a jejich dědění. Úspěšné dědění náhodně segregujících plazmidů spoléhá na to, že dosti vysoký počet kopií plazmidů, náhodně se distribuujících uvnitř dělící se bakterie, skutečně zajistí zdědění alespoň jednoho plazmidu každou dceřinou buňkou.
Běžně používané plazmidové klonovací vektory, včetně derivátů pBR322 se středním počtem kopií, a plazmidů pUC s vysokým počtem kopií, jsou děděny pomocí náhodné segregace.
Aktivní segregace zahrnuje syntézu proteinů, o kterých se předpokládá, že se na takové plazmidy vážou a dále ve spolupráci s buněčnými membránami dělící se bakterie zajišťují, že každá dceřinná buňka obdrží alespoň jednu kopii plazmidu. Plazmidy používající takovéto aktivní dělící systémy jsou typicky plazmidy s velmi malým počtem kopií, jako jsou F sex faktor E. coli nebo R-faktory rezistence k antibiotikům, jako jsou pR1 a pRK2.
Předložený vynález využívá přirozeně se vyskytujících funkcí SEG pro zlepšení dědění expresních plazmidů s velkým počtem kopií, které se jinak mohou dědit náhodnou segregací, ke zvýšení stability těchto plazmidů.
Předložený vynález také využívá výhody jiných přirozeně se vyskytujících genetických systémů, v nichž dceřinné buňky, které nezdědily úspěšné expresní plazmid, budou zabity a odstraněny z rostoucí populace, tj. funkce PSK. Zabudování více než jedné kategorie z funkcí stabilizujících plazmidy je zde označováno jako systém pro udržování plazmidu. Například výsledkem zabudování jak funkce SEG, jako je lokus, zajišťující rozdělování plazmidů, tak funkce PSK do jednoho expresního plazmidu je systém pro udržování plazmidu.
Je třeba poznamenat, že gen propůjčující rezistenci k baktericidnímu antibiotiku, jako je gen aph, kódující rezistenci ke kanamycinu a neomycinu, je také považován za
PSK funkci, stejně jako rovnovážný letální systém, založený na genu asd.
·«·· • · ·· •· ·· • · · ·4 • · *· ···· «· • t «· • · · • · · ··
Φ 1 Rovnovážné letální systémy.
Jedna metoda zajištění dědění expresních plazmidů zahrnuje konstrukci PSK systému nebo jeho podstatného homologu, označovaného jako rovnovážný letální systém, pro plazmidy exprimující heterologní antigeny. V rovnovážném letálním systému založeném na plazmidů, plazmidy replikující se v cytoplazmě bakterie exprimují kritický protein, vyžadovaný bakterií pro její růst a replikaci. Ztráta takového plazmidů zruší schopnost bakterie exprimovat kritický protein a výsledkem je smrt buňky.
Systém asd byl nedávno vnesen do oslabeného vakcinačního kmene S. typhi v rámci pokusu zvýšit stabilitu plazmidů exprimujících syntetické virové peptidy hepatitidy B.
Avšak když byli těmito živými vektorovými kmeny očkováni dobrovolníci, nebyla na cizí antigen detekována žádná imunitní odpověď. Viz Tacket a kol., Infection and Immunity, 65:3381, 1997 (zahrnuto zde jako odkaz). Ve skutečnosti byla dosud v málo pracích dokumentována imunitní odpověď na cizí antigeny, jejichž exprese probíhá z plazmidů (ať stabilizovaných či nikoli), po imunizaci lidí pomocí oslabeného živého vektoru S. typhi.
Třebaže v některých případech může být selhání živých vektorových kmenů způsobeno přílišným oslabením kmene samotného, závěrem autorů vynálezu je, že PSK funkce v současné době používané u plazmidů trpí dalšími omezeními, zvláště omezeními při segregování a omezeními katalytické aktivity. Předložený vynález poskytuje vylepšené expresní plazmidy, obsahující rozšířené schopnosti segregování proto, že do nich byl zabudován alespoň jeden systém pro rozdělovaní spolu s alespoň jedním PSK systémem.
Segregační omezení.
Jedním omezením funkcí udržujících plazmid, jako je funkce asd (rovněž tak i funkce thyA) je to, že nezvyšují dědění přítomných plazmidů, které pokračují v náhodné segregaci ať již v přítomnosti, tak bez přítomnosti funkce asd. Proto jestliže přítomné expresní plazmidy nesoucí geny asd jsou děděny nestabilně, budou ztraceny, bez ohledu na požadavek bakterie na Asd.
Základní stabilita asd expresního plazmidů může být definována růstem kmenů nesoucích plazmid v přítomnosti DAP, která odstraňuje selekční tlak zajišťující, že všechny životaschopné bakterie obsahují expresní plazmid. Jestliže daný plazmid je • · 4 ·· 44 • 4 ·9 • 444 • 9 9 44 • 4 44
4444 • 44 • 4444 • 44 • 4 4·
444·
444
444 ♦ · «
44444 vnitřně nestabilní, pokud se týká jeho dědění, bude z bakterií rychle ztracen a výsledné bakterie bez plazmidů budou v nepřítomnosti růstových doplňků lyžovány; celkovým výsledkem tohoto jevu bude populace bakterií, která roste mnohem pomaleji než standardní nezměněné kmeny.
Předložený vynález vylepšuje stabilitu plazmidu zabudováním funkce SEG, což je lokus odpovědný za rozdělování, nebo podstatného homologu funkce SEG do expresního plazmidu, aby bylo zlepšeno dědění takových plazmidů aktivně se dělícími bakteriemi. Lokusy zajišťující rozdělování plazmidů se přirozeně nacházejí na virulentních plazmidech S. typhimurium. Tinge a Curtiss, Journal of Bacteriology, 172:5266, 1990 (zahrnuto zde jako odkaz) popsali, že takové lokusy rozdělující plazmidy byly zachovány mezi virulentními plazmidy S. typhimurium a že když byl restrikční fragment dlouhý 3,9 kb, kódující tento lokus, vnesen do plazmidu pACYC184 s nízkým počtem kopií (~15 kopií na buňku), pozorovaná stabilita plazmidu se zvýšila z 34 % buněk obsahujících plazmid na 99 % buněk nesoucích plazmid po 50 generacích. Nukleotidová sekvence tohoto lokusu byla později určena Cerinem a Hackettem, Plasmid, 30:30, 1993 (zahrnuto zde jako odkaz), (přístupové číslo do GenBank M97752).
Omezení katalytické aktivity.
Jiným potenciálním omezením funkce udržující plazmid, jako je funkce asd (rovněž tak i systému thyA) je jeho spoléhání na enzym s katalytickou aktivitou. Za předpokladu, že komplementace pouze jednou kopií asd genu je postačující pro odstranění auxotrofie, není jasné proč by všechny kopie plazmidu s vysokým počtem kopií měly zůstat stabilní, zvláště pokud kódují zvláště problematický heterologní antigen, který inhibuje růst bakterie.
Dále, třebaže vysoký počet kopií expresních plazmidů může exprimovat zřetelné množství daného heterologního antigenu in vitro, takové plazmidy se nemusí in vivo udržet na očekávaném počtu kopií kvůli toxicitě a mohou být ve skutečnosti přítomny v mnohem menším počtu kopií, po čemž by se dalo očekávat snížení jakékoli pozorované imunologické odpovědi, specifické pro heterologní antigen. Předložený vynález tedy poskytuje stabilně udržovaný nízký a střední počet kopií plazmidů pro expresi heterologních antigenů.
Nekatalytická ssb PSK funkce.
Potenciální omezení katalytické aktivity spojené s rovnovážnými letálními systémy jsou zde probírána v souvislosti s použitím plazmidů v S. typhi, které exprimují protein, který se váže na jednovláknovou nukleovou kyselinu (SSB), aby došlo k transkomplementování jinak letální mutace, vnesené do chromozomálního genu ssb. Podrobný přehled biochemie a metabolických rolí proteinu SSB E. coli byly uvedeny v Lohman a kol., Annual Reviews in Biochemistry 63:527, 1994 a Chase a kol., Annual Reviews in Biochemistry 55:103,1986 (jsou zde zahrnuty jako odkazy).
SSB je nekatalytický protein skládající se z 177 aminokyselin s relativní molekulovou hmotností 19 000 daltonů, který se s vysokou afinitou váže k jednovláknové DNA (ssDNA) a hraje podstatnou roli jako protein, účastnící se replikace DNA, rekombinace a opravy DNA. Biologicky podstatnou formou SSB, účastnící se vazby na ssDNA je tetramer, který se k ssDNA váže dvěma způsoby, těsně se připojuje průměrně každých 35 bází (SSb35-typ vazby) nebo 65 bází (SSbes-typ vazby). Specifické podmínky, které kontrolují preferovaný typ vazby, jsou složité a závisí na koncentracích jednomocných a dvojmocných solí v okolí, pH a teplotě, a rovněž na množství přítomného proteinu SSB. Za daných podmínek je při vysokých koncentracích SSB upřednostňován SSb35-typ vazby, zatímco za nižších koncentrací SSB je dávána přednost SSbes-typu vazby. Je však nutno zdůraznit, že při obou typech vazby je vyžadován SSB ve formě tetrameru.
Nyní byly na biochemické, fyziologické a nukleotidové úrovni charakterizovány spontánně vznikající bodové mutace v genu ssb, které jsou citlivé na teplotu; jedna taková mutanta, ssb-1, obsahuje bodovou mutaci His 55 na Tyr, a bylo zjištěno, že není schopna se správně uspořádat do tetramerů při nepermisivních teplotách a při přirozených úrovních exprese. Tyto mutované kmeny vykazují letální defekty při DNA replikaci a rekombinaci, které jsou závislé na teplotě.
Segregační frekvence plazmidů, které obsahují ssb a komplementují chromozomální mutace v ssb u bakterie E. coli, byly zkoumány v Porter a kol., Bio/Technology 8:47, 1990 (zahrnutý zde jako odkaz). Při pokusech v bioreaktorech bylo pozorováno, že segregační frekvence u kmenů obsahujících plazmidy a rostoucích v kontinuálních kulturách za neselektivních podmínek po dobu 150 hodin byla menší než 1 x 10‘7; tato segregační frekvence byla nezávislá na počtu kopií, protože jak plazmidy pACYC184 s nižším počtem kopií, tak plazmidy pUC19 s velmi vysokým ·· · · v · ·· ·· • · · · · · · · · • · ·· · · ··· · · ‘ počtěm kopií, byly udržovány se stejnou frekvencí. Je však nutno poznamenat, že použité plazmidy exprimovaly vedle proteinu SSB pouze markér lékové rezistence.
Předložený vynález poskytuje zdokonalený systém pro udržování plazmidu, který zahrnuje lokus řídící rozdělování plazmidů, takový jako je přítomný na pSC101, nebo podstatný homolog takového lokusu, a může také zahrnovat aktivní systém pro rozdělování plazmidů, nebo podstatný homolog takového lokusu, takový jako byl výše popsán pro virulentní plazmid S. typhimurium.
Předložený vynález odstraňuje závislost stability plazmidů na katalytických enzymech. V jednom provedení jsou do expresních plazmidů vneseny mutované alely podobné ssb-1, aby se zvýšil počet plazmidů s vyšším počtem kopií tím, že dojde k nadprodukci proteinů podobných SSB1, aby se vytvořily požadované biologicky aktivní tetramery SSB. V jiném provedení předložený vynález poskytuje PSK funkci, obsahující tichý plazmidový systém založený na kontrolních mechanizmech antisense RNA, který syntetizuje letální proteiny pouze potom, co došlo ke ztrátě plazmidu.
Expresní plazmidy a samostatné genetické kazety.
Předložený vynález také zahrnuje série expresních plazmidů, které jsou zde označovány jako plazmidy pGEN. Plazmidy pGEN obsahují samostatné genetické kazety kódující regulovanou expresi heterologního antigenu, počátek replikace a selektovatelný markér pro získání plazmidu. Tato série vektorů byla specielně navržena pro testování, zda nějaký systém pro udržování plazmidu může zvýšit stabilitu plazmidů, například v rámci oslabené vakcíny S. typhi.
Základní struktura těchto vektorů je představena na obrázku 1 a sekvence složeného genu pro vektor pGEN2 je představena na obrázku 4; obrázky 5 a 6 ukazují specifické složené sekvence počátků replikace v pGEN3 respektive pGEN4.
Je podstatné poznamenat, že plazmidy pGEN jsou navrženy tak, že obsahují 3 nezávisle fungující genetické kazety. Tyto kazety byly konstruovány tak, že jednotlivé složky mohou být optimalizovány záměnou podle potřeby. Proto tedy vedle zde popsaných různých systémů pro udržování plazmidu, mohou kazety testovat jiné slibné systémy nyní existující nebo které mohou být dostupné v budoucnu. Dále optimalizovaný plazmid (plazmidy) může být adaptován pro exprimování příslušných protektivních heterologních antigenů v oslabených vakcinačních kmenech pro imunizaci lidí.
• · ♦ · ··· ··· • · · · · · · · · · ·
Plazmidy pGEN poskytují regulovatelnou kazetu exprimující testovací antigen, která funguje tak, že jak se zvyšuje indukce antigenní exprese, na baktérii působí metabolická zátěž, která fenotypově vede k nestabilitě plazmidu, tj. je vytvořena selekční výhoda pro všechny bakterie, které mohou spontánně ztratit obtěžující plazmid. Tedy jedno provedení předloženého vynálezu poskytuje podmínečně nestabilní plazmid, u něhož může být testována stabilita po zabudování systémů pro udržování plazmidu.
Ve výhodném provedení obsahuje regulovaná expresní kazeta testovacího antigenu v plazmidech pGEN indukovatelný ompC promotor nebo jeho podstatný homolog, který řídí expresi detekovatelného proteinu, jako je zelený fluorescenční protein s optimalizovanými kodony (GFPuv, dostupný od Clontech), jehož nadprodukce je pro E. coli a S. typhi toxická.
Předložený vynález také zahrnuje série plazmidových replikonů, jejichž počet kopií varíruje od nízkého počtu kopií (tj. *1 až ~10, výhodné ~5 kopií na buňku) přes střední počet kopií (tj. -11 až -25, výhodně *15 kopií na buňku) až k vysokému počtu kopií (tj. -26 až -100, výhodně -60 kopií na buňku). Aby toho bylo dosaženo, byly pomocí techniky polymerázové řetězové reakce (PCR) modifikovány počátky replikace z dobře charakterizovaných plazmidů pSC101, pACYC184 a pAT153, a byly tak vytvořeny nezávisle fungující plazmidové replikační kazety. Tyto replikační kazety umožňují testování účinnosti systému pro udržování plazmidu při zvyšujícím se počtu kopií.
Předložený vynález také obsahuje selektovatelné expresní plazmidy použitelné v oslabených živých vektorech S. typhi. Tyto expresní plazmidy obsahují selektovatelný markér, který může být nakonec zaměněn buď lokusem který nenese rezistenci k léku, jako je ssb, nebo genem kódujícím přijatelný markér rezistence k léku, jako je aph, který kóduje rezistenci k aminoglykozidům kanamycinu a neomycinu.
Aby toho bylo dosaženo, byly konstruovány kazety kódující rezistenci ke karbenicilinu a tetracyklinu, jejichž transkripce byla účinně ukončena terminátorem rrnB T1T2. Podrobný popis jednotlivých složek obsažených v expresních a replikačních kazetách následuje.
Specifické složky systému pro udržování plazmidu mohou být systematicky vkládány do základních expresních replikonů, aby bylo možno zhodnotit jakýkoli individuální nebo synergický vliv těchto funkcí na stabilitu plazmidu v přítomnosti a nepřítomnosti selekce. Například funkce post-segregačního zabíjení (např. lokus hoksok) může být vložen jako kazeta EcoRI-Xhal tak, že okolní transkripce z obklopujících lokusů, jako jsou antigenní a selekční kazeta, probíhá ve směru od této kazety a nebude tak poškozovat hladiny standardního typu transkripce, které kontrolují letalitu tohoto lokusu (obrázek 7B, pGEN111).
Podobně pasivní lokus par, rozdělující plazmidy, může být vložen jako fragment BamHl-Bg/l mezi počátek replikační a selekční kazety (obrázek 70, pGEN121). Je zajímavé, že při práci vedoucí k předloženému vynálezu bylo pozorováno, že orientace lokusu par zvyšuje syntézu GFPuv na pevném médiu, když je vložen v přirozené orientaci, která se nachází v orilOI plazmidu pSC101; tato orientace byla přijata pro všechny expresní plazmidy.
Výhodným lokusem, který aktivně rozděluje plazmidy, je lokus parA, konstruovaný jako kazeta Xhol-EcoRI ze stejného plazmidu pR1 nesoucího rezistenci, z něhož byl upraven hok-sok. Aby byly zachovány hladiny přirozené transkripce a regulace uvnitř tohoto lokusu, kazeta je s výhodou umístěna uvnitř oblasti expresních plazmidu tak, že okolní transkripce probíhá od parA (obrázky 7D a 7E, pGEN193 a pGEN222).
Složky kazet exprimujících antigen a replikačních kazet
Promotor
Osoby se zkušenostmi v oboru si jsou vědomy, že do expresních kazet předloženého vynálezu může být zařazeno velké množství složek, které jsou v oboru známé, včetně velkého množství transkripčních signálů jako jsou promotory a jiné sekvence, které regulují vazbu RNA polymerázy k promotoru. Činnost promotorů je v oboru dobře známa a je popsána v Doi, Regulation of Gene Expression, Modern Microbial Genetics, strany 15 až 39 (1991) (celý jejich obsah je zde zahrnut jako odkaz). V následujícím popisu je jako příklad použit promotor ompC, avšak není to míněno jako vymezování vynálezu.
Promotorem je výhodně okolním prostředím regulovatelný promotor, kontrolovaný biologicky závažnými signály, jako je např. osmolarita. Ve výhodném provedení je promotorem ompC promotor. Gen ompC kóduje protein porin, který se včleňuje ve formě trimeru do vnější membrány bakteriální buňky. Exprese a kontrola ompC jsou složité a nedávno byly dostatečně podrobně přehledně zpracovány v Pratt a • · · · ··· ·· • · · · · ···· · « * kol.,1 Molecular Microbiology 20:911, 1996 a v Egger a kol., Genes to Celíš 2:167, 1997 (jejich obsah je zde zahrnut jako odkaz).
Syntéza proteinu OmpC je kontrolována hlavně na úrovni transkripce osmolaritou okolního prostředí tak, že zvýšení osmolarity je provázeno zvýšením transkripce ompC. Avšak zvýšení osmolarity přímo nezprostředkuje zvýšení transkripce ompC. Bakterie spíše zjišťuje okolní osmolaritu pomocí dvousložkového signálního transdukčního systému, kódovaného operonem ompB. Tento operon je složen ze dvou genů, transkribovaných v pořadí envZ-ompR. Gen envZ kóduje protein obsahující 450 aminokyselin (a.a.), obsahující dvě transmembránové oblasti, který se začleňuje do vnitřní bakteriální membrány (snad ve formě dimeru), který na N-konci obsahuje 118 a.a. dlouhou doménu citlivou na osmolaritu a vyčnívající do periplazmatického prostoru, a na C-konci 270 a.a. katalytickou doménu, vyčnívající do cytoplazmy. Katalytická doména na C-konci má jak kinázovou, tak fosfatázovou aktivitu, které jsou modulovány osmolaritou tak, že jakmile se osmolarita zvyšuje, převládá kinázová aktivita a jakmile osmolarita klesá, převládá fosfatázová aktivita.
Aktivita fosfatázy EnvZ fosforyluje zbytek kyseliny asparagové na pozici 55 v 239 a.a. cytoplazmatickém proteinu OmpR, a vytvoří tak OmpR-P. Je to modifikovaný protein OmpR-P, který se váže na ompC promotor a aktivuje transkripci pomocí RNA polymerázy; proto jakmile se osmolarita zvyšuje, zvýšení kinázové aktivity EnvZ produkuje vyšší hladiny OmpR-P, což vede k vyšší transkripci ompC. OmpR-P se váže na oblast ompC promotoru v oblasti bází -41 (vzhledem ke startovnímu místu transkripce +1) až -102, přičemž počáteční vazba OmpR-P na báze -78 až -102 je následována dalším vázáním k oblasti bází, která sahá až k bázi -41, pokud se koncentrace OmpR-P zvýší spolu s osmolaritou. Dále bylo ukázáno, že OmpR-P se váže k oblasti proti směru přepisu a bohaté na AT, sahající nazpátek k bázi -405, což dále zvyšuje transkripci ompC.
X/e výhodném provedení fragment promotoru ompC z E.coli obsahuje nukleotidy +70 až -309. Tento promotor může řídit v oslabených kmenech S. typhi transkripci genů, nesoucích rezistenci k antibiotikům, jako je kanamycin způsobem, který je citlivý na osmolaritu. Například naše pokusy ukázaly, že když byla koncentrace NaCI v tekutém růstovém médiu zvýšena z 0 mM na 300 mM, rezistence na kanamycin se zvýšila z 0 pg/ml na >800 pg/ml.
Počátek replikace.
··· · · 9 999 • ·♦ 9 9999 9 ·
Kvůli různým stupňům toxicity, spojené s různými heterologními antigeny (tj. vyšší toxicita u antigenů odvozených z parazitických organizmů jako je Plasmodium falciparum oproti téměř žádné toxicitě u fragmentu C z tetanického toxinu), předložený vynález poskytuje vektory pro živé vakcíny, které s výhodou takové antigeny exprimují z plazmidů, vyskytujících se buď v nízkém nebo středním počtu kopií. Osoby se zkušenostmi v oboru si budou vědomy, že výběr počátku replikace bude záviset na stupni toxicity, tj. počet kopií by se měl snížit, pokud se toxicita pro bakteriální kmen zvyšuje. Ve výhodném provedení jsou použité systémy (systém) pro udržování plazmidu schopny stabilizovat replikony s nízkým nebo středním počtem kopií.
Pro počátek replikace je výhodné, když dá vznik průměrnému počtu kopií, které je mezi 2 až 75. Ve výhodném provedení je počátek replikace vybrán tak, aby dal vznik průměrnému počtu kopií, které je mezi 5 až 50. Ještě výhodnější je rozsah od 5 do 30. Optimální rozsah je od 15 do 20.
V jednom provedení je použit počátek replikace z pSC101, který dává vznik přibližně 5 kopiím na ekvivalent genomu.
Lokus or/E1 určuje syntézu transkriptu dlouhého 555 bází, nazývaného RNA I a syntézu antisense transkriptu dlouhého 110 bází, nazývaného RNA II. Když je syntetizována RNA I, počáteční 5' oblast transkriptu vytváří vlásenkovou strukturu, skládající se ze tří domén, která může hybridizovat s komplementární vlásenkovou strukturou, vytvářenou RNA II, výsledkem je vytvoření dvojvláknové RNA-RNA struktury, která způsobí poškození replikace plazmidu.
Jak probíhá syntéza RNA I, při níž se vytváří transkript o délce celých 555 bází, přeskupení sekundární struktury transkriptu zničí původní 3 doménovou vlásenkovou strukturu a vytvoří alternativní vlásenkovou konfiguraci, která již dále nehybridizuje s RNa II. Vytvoření této alternativní struktury umožní transkriptu hybridizovat s jedním vláknem DNA samotného plazmidu a vytvoření RNA-DNA komplexu, který je naštípnut endogenní RNázou H a tím je spuštěna syntéza prvního DNA vlákna plazmidu a replikace plazmidu.
Replikace plazmidu je proto kontrolována syntézou RNA I, která prochází kaskádou strukturálních konfigurací, vedoucích k započetí replikace. Nezbytné proběhnutí kaskády tvarování RNA I (a výsledné započetí replikace) je přerušeno kompeticí domén s RNA II. Tento mechanizmus je v podstatě stejný v plazmidech obsahujících buď or/E1 nebo or/15A.
«··· · · · · · · • · · · · · · · · · ·
Důvodem, proč tyto dva druhy plazmidů mohou existovat společně v téže bakteriální buňce, je sekvenční rozdíl uvnitř oblasti hybridizace mezi RNA I a RNA II, tak že RNA II z or/15A nebude hybridizovat s RNA I z or/E1; tento sekvenční rozdíl také ovlivňuje stabilitu hybridu RNA l:RNA II, a vysvětluje rozdíly v počtu kopií mezi plazmidy nesoucími počátky replikace o/tE1 nebo on’15A.
Strukturální organizace konstruovaných počátků replikačních kazet pro pSC101 (or/101; -5 kopií na ekvivalent genomu), pACYC184 (derivát or/15A; ~15 kopií na ekvivalent genomu) a pAT153 (derivát or/E1; ~60 kopií na ekvivalent genomu) jsou analogické ve své struktuře a funkci.
Exprimovaný protein nebo peptid.
Při použití expresní kazety pro hromadné testování systémů pro udržování plazmidu, je výhodné exprimovat protein nebo peptid, který nemá metabolickou aktivitu. Výhodným proteinem je zelený fluorescenční protein (GFP) bioluminiscenční medúzy Aequorea victoria, protein obsahující 238 aminokyselin, který prochází posttranslační modifikací, při které se tři vnitřní aminokyseliny (65Ser-Tyr-Gly67) účastní cyklizační a oxidační reakce. Výsledný fluorofor emituje po ozáření dlouhovlnným ultrafialovým světlem o vlnové délce 395 nm modrozelené světlo s maximem při vlnové délce 509 nm. Dále je fluorescenční aktivita pozoruhodně konstantní v širokém rozmezí pH od 5,5 do 12 a při teplotách až do 72 °C.
Protože GFP nemá žádnou známou katalytickou aktivitu, úroveň pozorované fluorescence v jednotlivých bakteriích exprimujících GFP může poskytnout přímo míru úrovně transkripce genu gfp, neseného každou bakterií. Exprese proteinu GFP byla nyní kvantifikována v různých jak prokaryontních, tak eukaryontních buňkách a nevyžaduje žádné další kofaktory nebo enzymy z A. victoria. Tvorba fluoroforu je zřejmé závislá buď na všudypřítomných enzymech a kofaktorech, nebo se jedná o autokatalytický děj.
Jednotlivé bakterie exprimující GFP mohou být kvantifikovány pomocí průtokové cytometrie buď samotné nebo uvnitř makrofágů, epiteliálních buněčných linií a infikovaných živočišných tkání. Fluorescence GFP je absolutně závislá na zbytcích 2 až 232 nedenaturovaného proteinu. Nicméně výsledkem fúze nepříbuzné biologicky aktivní proteinové domény k N-konci GFP je fúzní protein s očekávanou heterologní biologickou aktivitou, který však rovněž dále fluoreskuje.
• ··
Sekvenční analýzou bylo potvrzeno (Clontech), že zde preferovaná alela gfp (tj.
gfpuv) exprimuje mutantu GFP (GFPuv) obsahující 3 aminokyselinové substituce (nezahrnující fluorofor), které 18x zvyšují fluorescenci oproti standardnímu typu GFP.
Dále bylo 5 vzácně užívaných kodonů pro arginin optimalizováno pro účinnou expresi GFP v E. coli. Protože porovnání úrovní exprese různých heterologních proteinů v E. coli a CVD908 ukázalo porovnatelnou nebo vyšší expresi v CVD908, bylo očekáváno že gfpuv bude v CVD908-hfn4 efektivně fungovat.
Kódující sekvence je vložena ve správném vztahu k promotoru, když promotor a kódující sekvence jsou uspořádány tak, že promotor řídí expresi kódující sekvence, a nakonec je produkován kódovaný peptid nebo protein. Je samozřejmé že kódující sekvence musí být také ve správném vztahu s jakýmikoli jinými regulačními sekvencemi, které mohou být přítomny.
Heterologní antigeny.
Expresní plazmidy předloženého vynálezu přednostně exprimují antigen, který je prezentován hostiteli aby vyvolal imunitní odpověď, jejímž výsledkem je imunizace a ochrana před nemocí. Třebaže jsou jako příklady antigenů úspěšně exprimovaných zde popsanými plazmidy pro exprimování vakcíny uváděny Shiga toxiny, vynález má velmi široký rozsah a zahrnuje expresi jakéhokoli antigenů, který nezničí živý bakteriální vektor a který vyvolává imunitní odpověď, když je živý bakteriální vektor obsahující uvedený expresní plazmid (plazmidy) podán hostiteli, tj. člověku nebo jinému živočichovi.
Plazmidy exprimující vakcínu, které jsou zde poskytnuty, jsou použity pro genetické transformování oslabených bakteriálních kmenů, s výhodou kmenů používaných pro lidskou vakcinaci a nejvýhodněji použité k transformaci oslabených vakcinačních kmenů S. typhi, jako je CVD908-hřn4, a s výhodou kódují buď subjednotku B z Stx2 nebo geneticky detoxifikovaný Stx2 holotoxin.
Podskupina STEC, nejčastěji označované jako enterohemoragické E. coli (EHEC) jsou schopné způsobit prudké klinické syndromy, včetně krvácivého zánětu tlustého střeva, hemolytického uremického syndromu (HUS) a trombotické trombocytopenické purpury (TTP) v malé části infikovaných jedinců, kromě vyvolávání nekrvavého průjmu u většiny ostatních.
Krvácivý zánět tlustého střeva je charakterizován vydatným krvavým průjmem, obvykle bez, horečky nebo pouze se slabou horečkou a relativním nedostatkem • · ·· ·· '·· ·» · leukocytů ve stolici, které by byly prokazatelné v průjmu. Tyto rysy odlišují krvácivý zánět tlustého střeva od úplavice způsobené Shigella, pro kterou je typické malé množství stolice s krví a hlenem, předcházená vysokou horečkou a s velkým množstvím leukocytů ve stolici, které jsou mikroskopicky detekovatelné.
HUS, potenciálně smrtelná nemoc, která nejčastěji napadá malé děti, ale může také postihnout jedince kteréhokoli věku, je charakterizována trojicí příznaků, a to mikroangiopatickou hemolytickou anémií, trombocytopenií a uremií. V severní Americe je HUS v současné době nejčastější příčinou akutního selhání ledvin u nemluvňat a malých dětí. Ve studii Siegler a kol. z 288 pacientů léčených v Utahu v letech 1970 až 1994 po průjmu na HUS, nastal prudký průběh (definovaný jako anurie trvající déle než 7 dní, oligurie trvající déle než 14 dní, nebo jiná než ledvinová poškození, jako je záchvat mrtvice) v 25 % případů a byl spojen s dětmi mladšími než 2 roky; asi jedna třetina těchto vážných případů HUS končilo smrtí (5 %) nebo vážnými následky, včetně konečného stádia nemoci ledvin (5 %) nebo chronického poškození mozku (3 až 5 %), a méně vážných chronických problémů, jako je hypertenze, vylučování bílkovin močí nebo azotemie.
TTP, která nejčastěji napadá dospělé, je charakterizována neurologickými komplikacemi jako je mrtvice, vedle trombocytopenie, hemolytické anemie a nemoci ledvin.
Daleko nejběžnéjším serotypem EHEC je O157:H7. Nicméně jiné serotypy EHEC také způsobují HUS a krvácivý zánět tlustého střeva, včetně serotypů O26:H11, O111:H8 a řady jiných. Kmeny EHEC spojené s HUS vždy vytvářejí jeden nebo více Shiga toxinů a nesou virulentní plazmid o velikosti 60 MDa. Dále většina z nich obsahuje na chromosomu ostrov patogenity (tzv. LEE), ve kterém je soubor genů kódujících schopnosti přichytit se a stáhnout se. Je běžně přijímáno, že Shiga toxiny vytvořené v EHEC hrají klíčovou roli v patogenezi krvácivého zánětu tlustého střeva a HUS.
Jak je podrobně popsáno dále, rodina Shiga toxinů se skládá ze dvou skupin toxinů, Stx1 (který je v podstatě totožný s cytotoxinem/neurotoxinem/enterotoxinem produkovaným Shigella dysenteriae typ 1, Shiga bacil) a Stx2 (který je imunologicky odlišný od Stx1 a má několik příbuzných variant). V USA převládající většina EHEC spojených s případy HUS exprimuje Stx2, buď samotný nebo ve spojení s Stx1.
♦ · 9 · ···0·· * 0·Φ · 9 999 99
00 0 0 0 0 0 Φ··0 ' Nejdůležitějším rezervoárem EHEC infekce je hovězí dobytek. Nejdůležitějším způsobem přenosu EHEC na člověka je strávení nedostatečně uvařeného hovězího masa. Méně běžně je možno infekci přičítat řadě jiných druhů potravy a jiným způsobům přenosu. Velmi důležité je, že EHEC jsou jedny z mnoha střevních bakteriálních patogenů, které mohou být jako Shigella přeneseny přímým kontaktem nebo kontaktem s kontaminovanými předměty.
Mezi většinou epidemiologů existuje velké očekávání a naděje, že ozařování masa prodávaného v USA drasticky sníží přenos EHEC na lidi, protože přeruší ten nejdůležitější způsob přenosu.
Nicméně určité rizikové skupiny, vystavené jiným způsobům přenosu EHEC nebudou mít z tohoto zásahu užitek. Například vystavení pracovníků jatek EHEC nastává v procesu zpracování masa ještě dříve, než je možno ozařování použít. Pro takové speciální skupiny jako jsou ti, pro něž riziko zůstane i po tom, co se ozařování masa stane běžným, mohou být anti-EHEC vakcíny užitečné. Předložený vynález poskytuje vakcíny proti EHEC, vhodné jako prevence infekce (v živočišných rezervoárech nebo u lidí) a pro prevenci vážných komplikací EHEC infekce tím, že je stimulován neutralizační Shiga antitoxin.
Studie s oslabeným Vibrio cholerae 01 exprimujícím B podjednotku Stx1 ukázaly, že je možno snadno vyvolat neutralizační Shiga antitoxin pomocí imunizace sliznic živými vektory. Avšak protože prakticky všechny EHEC spojené s případy HUS v USA exprimují Stx2, samotný nebo ve spojení s Stx1, je výhodné aby vakcína pro prevenci vážných komplikací EHEC infekce pomocí vyvolání protilátek neutralizujících toxin vyvolávala anti-Stx2 a rovněž Stx1. Patří do širokého rámce předloženého vynálezu poskytnout stabilizovaný plazmidový systém pro expresi antigenů Stx2, samotných nebo ve spojení s Stx1, v oslabeném živém vektoru S. typhi.
Mezi jinými antigeny, které mohou být vhodné pro podávání pomocí prostředků a metod předloženého vynálezu, je možno zahrnout například antigeny hepatitidy B, Haemophilus influenzae typu b, hepatitidy A, bezbuněčného černého kašle (acP), planých neštovic, rotaviru, Streptococcus pneumoniae (pneumokoka), a Neissera meningitidis (meningokoka). Viz Ellis a kol., Advances in Pharm., 39:393-423, 1997 (zahrnuto zde jako odkaz).
V jednom provedení antigeny kódované expresními plazmidy předloženého vynálezu jsou vakcíny proti rakovině.
• ♦toto to to to · to to • · ·· · to ♦ ·· * ·
V jiném provedení jsou antigeny kódované těmito plazmidy navrženy tak, aby vyvolaly imunitní odpověď proti vlastním antigenům, receptorům B buněk a/nebo receptorům T buněk, které jsou účastníky autoimunních nebo imunologických nemocí. Například kde vznikly nevhodné imunní odpovědi proti tkáním těla nebo antigenům z okolního prostředí, vakcíny předloženého vynálezu mohou imunizovat proti vlastním antigenům, receptorům B buněk a/nebo receptorům T buněk kvůli zmírnění odpovědí a zlepšení stavu nemocí. Tyto techniky mohou být například účinné při léčení myastenie, lupus erythematodes, revmatické artritidy, roztroušené sklerózy, alergií a astmatu.
Rodina Shiga toxinů.
Condrati v roce 1903 jako první popsal, že S. dysenteriae 1 produkovala silný exotoxin. Protože injekce tohoto toxinu vedla k paralýze zadní končetiny králíka, byl původně nazván neurotoxinem. Poté se ukázalo, že tento toxin, Shiga toxin, je letální pro určité buňky v tkáňové kultuře (tj. jednalo se o cytotoxin). Vicari a kol. a potom Keusch a kol. ukázali, že také působí jako enterotoxin.
Vědci v současné rozeznávají existenci rodiny Shiga cytotoxinů, které inhibují syntézu proteinů, což vede u citlivých buněk k buněčné smrti. Po mnoho let po objevení, že takové toxiny jsou, vedle původního Shiga toxinu produkovaného Shigella dysenteriae typ 1, produkovány určitými kmeny E. coli, byla nomenklatura této rodiny toxinů zmatená. Protože ranné zprávy popisovaly aktivitu těchto toxinů na buňkách kmene Věro (buněčná linie odvozená z epiteliálních buněk ledvin makaka zeleného), mnoho badatelů je nazývalo verotoxiny. Jiní označovali tyto toxiny exprimované v E. coli jako „podobné Shiga toxinům“.
Proteinové toxiny jsou zde společně označovány jako Shiga toxiny (Stx) a geny, které tyto toxiny kódují jsou označovány jako stx s indexem označujícím skupinu a variantu [tj. stXi je toxin produkovaný E. coli, který je v podstatě totožný s toxinem z Shigella dysenteriae typ 1 (stx), a stx2, stx2c, stx2d, stx2e jsou antigenně se lišící skupiny příbuzných toxinů].
Struktura, biochemie a antigenita Shiga toxinů jsou dobře popsány v MeltonCelsa a kol., Escherichia coli O157:H7 and Other Shiga Toxin-producing E. coli Strains, 1998; Takeda, Bacteríal Toxins and Virulence Factorsin Disease, 1995; Gyles, Canadian J. of Microbiology, 38:734, 1992; a O'Brien a kol., Current Topics in Microbiology and Immunology, 180:165, 1992 (jejich popisy jsou zde zahrnuty jako odkazy).
Tyto Shiga cytotoxiny jsou složeny z jedné katalytické podjednotky A o velikosti přibližně 32 kDa, která je nekovalentně spojena s pentamerní doménou, která se váže k receptoru, z podjednotky B, která má velikost přibližně 7,7 kDa. Tyto podjednotky jsou kódovány jedním operonem v pořadí stxA-stxB; transkripce operonů stx a stXí jsou jak v
S. dysenteríae typ 1 tak v E. coli regulovány atomy železa, ale pro žádný operon stx2 nebyly dosud určeny žádné kontrolní signály z okolního prostředí. Žádný z těchto toxinů není kódován na plazmidu; spíše jsou kódovány fágem (Stx1, Stx2, Stx2c a StxSd) nebo jsou kódovány chromozomem (Stx, Stx2e).
Jak bylo uvedeno výše, všechny členové rodiny Shiga toxinů jsou cytolytické toxiny, které inhibují v citlivých buňkách syntézu proteinů tím, že blokují vazbu na ribozómy u aminoacyl-tRNA, závislé na elongačním faktoru 1. U všech toxinů zjištěných u lidských infekcí probíhá jejich vstup do citlivých buněk pomocí endocytózy tak, že holotoxin se naváže na buněčném povrchu k potřebnému glykolipidovému receptoru globotriaosylceramidu (Gb3), který přepraví toxin do Golgiho aparátu a následuje jeho uvolnění do cytoplazmy. Shiga toxiny jsou N-glykozidázy, které depurinují jeden adenin z 28S RNA v eukaryotické 60S ribozomální podjednotce a tak inaktivují 60S podjednotku, což nakonec vede ke smrti buňky.
Existuje šest prototypových členů rodiny Shiga toxinů: Stx, Stx1, Stx2, Stx2c, Stx2d a Stx2e, které se vzájemně liší jak imunologicky, tak toxickou aktivitou. Byly zde uvedeny významné podrobnosti, aby byl poskytnut základ pro pochopení významu bodových mutací, které jsou diskutovány dále a které jsou potřebné pro genetické detoxifikování holotoxinů. Členové rodiny Shiga toxinů se vzájemně liší ve třech základních směrech, jak bylo nedávno souhrnně zpracováno v Melton-Celsa a kol., Escherichia co//0157: H7 and Other Shiga toxin-producing E.coli strains, 1998.
1) Imunologicky: Rodina Shiga toxinů je složena ze dvou sérotypů, Stx/Stx1 a Stx 2; Antiséra vzniklá proti Stx/Stx1 neneutralizuji členy Stx2 sérotypů, jak bylo jištěno cytotoxickými pokusy na buňkách Věro.
2) Strukturálně: Stx a Stx1 jsou v podstatě totožné a liší se jednou aminokyselinou v pozici 45 u zralé podjednotky A, a byla stanovena krystalická struktura holotoxinů Stx. Prototyp Stx2 je pouze z 55 % homologní s aminokyselinovými zbytky zralé podjednotky A z Stx/Stx1 a z 57 % homologní s aminokyselinovými zbytky zralé podjednotky B, což vysvětluje proč antiséra vzniklá proti Stx/Stx1 neneutralizuji členy skupiny Stx2. V rámci skupiny Stx2 je Stx2e nejvzdálenějším příbuzným, a • · • 4 i
sdílí 93 % aminokyselinové homologie se zralou podjednotkou A z Stx2 a 84 % homologie se zralou podjednotkou B; Stx2c a Stx2d jsou velmi podobné Stx2 a sdílejí 99 až 100 % homologie se zbytky zralé podjednotky A, a 97 % homologie se zbytky zralé podjednotky B.
3) Cytotoxicita: Stx2 patří mezi nejletálnější Shiga toxiny a jeho dávka LD50 je pro myši při intraperitoneálním injekčním podání 0,5 až 2 ng. U Stx1 a Stx2e je LD50 200 až 400 ng a u Stx2d je 1 až 5 ng; avšak Stx2d je neobvyklý v tom, že tento toxin může být aktivovaný myším střevním hlenem, což zvyšuje jeho toxicitu a snižuje LDso na 0,5 ng.
Místně specifická mutageneze Shiga toxinů.
V jednom provedení poskytuje vynález geneticky detoxifikovaný Shiga toxin. Detoxifikace je provedena pomocí místně specifické mutageneze, při které jsou vneseny dvě dobře definované a oddělené bodové mutace, které pozměňují kritické aminokyselinové zbytky v katalytickém místě podjednotky A. V rámci vynálezu jsou také zavedeny dvě další dobře definované a oddělené bodové mutace do podjednotky B, aby byly změněny kritické zbytky v primárním vazebném místě (tj. MÍSTO I), které se nachází ve štěrbině, vytvářené přiléhajícími podjednotkami B pentamerního kruhu holotoxinu.
Již dříve byly prováděny pokusy změnit vazebné MÍSTO II s nižší vazebnou afinitou. Avšak toto místo bylo určeno pouze v molekulárně modelovacích studiích a není ještě dosti podepřeno mutačními studiemi, které upřednostňují při vazbě receptoru Gb3 vazebné MÍSTO I. Dokonce i pokud MÍSTO II je alternativní vazebné místo s nízkou afinitou, umožňující vstup naší mutanty holotoxinu do citlivé buňky, inaktivace katalytické domény bude pořád zabraňovat smrti buňky.
Na základě porovnávání aminokyselinových sekvencí, krystalografických studií pomocí rentgenových paprsků a studií molekulárního modelování byly určeny podstatné aminokyseliny, obsažené v aktivním místě katalytické podjednotky A Stx, a byly určeny rovněž ty zbytky, které jsou obsažené ve vazebném MÍSTĚ I v podjednotce B pentameru Stx/Stx1. Závěrem vynálezců je, že aminokyseliny podstatné pro aktivní místo jsou vybrány ze skupiny zahrnující Tyr 77, Tyr 114, Glu 167, Arg 170 a Trp 203. Zbytky, o kterých se má za to, že jsou vyžadovány pro vazbu receptoru k mezeře vytvořené přilehlou podjednotkou B zahrnují Lys 13, Asp 16, Asp 17, Asp 18, Thr 21, Glu 28, Phe 30, Gly 60 a Glu 65. Tyto předpovědi pozic souhlasí s funkčními studiemi a
9
99
9
9 99
9 9 9 9 9 9 9 9 9 9
.............
* pokusy in vivo, ve kterých byly použity jednoduché a dvojité mutace, vnesené pomocí cílené mutageneze do jednotlivých domén holotoxinu. V tabulce 1 ke uveden souhrn takových mutací. Na základě těchto údajů a krystalografických předpovědí poskytuje vynález expresní plazmidy kódující Shiga toxiny, které mají dva specifické soubory bodových mutací jak v podjednotce A, tak v podjednotce B, aby byly vytvořeny nejedovaté mutanty Stx2 holotoxinů, vhodné pro použití jako vakcíny, které jsou exprimovány oslabenými živými vektory S. typhi, jako je např. CVD908-MrA.
Tabulka 1. Studie místně specifické mutageneze
Podjednotka Toxin Mutace Pokles cytotoxicity Pokles létal ity Neutralizační protilátky
A Stx1 Leu201 -+ Val + zbytky 202 až 213 žádná cytotoxicita - -
Stx1 Glu 167 -> Asp 103 - -
Stx1 Arg 170 —> Leu 103 - . - --
Stx2 Glu 167 -> Asp 103 - -
Stx2e Glu 167 -+Asp 104 - -
Stx2e Arg 170 —> Lys 10 - -
Stx2e Glu 167-+Asp Arg 170 -+ Lys 104 - -
Stx2e Glu 167 Gin 10® 104 Y
B Stx Asp 16 -> His + Asp 17 —* His žádná cytotoxicita - -
Stx Arg 33 -> Cys 108 - -
Stx Gly 60 -> Asp 10® - -
Stx1 Phe 30 -> Ala 105 10 Y
Stx2 Ala 42 -+ Thr 103-104 Y Y
Stx2 Gly 59 -+ Asp 103-104 Y Y
Farmaceutické přípravky.
Předpokládá se, že vektory živých bakteriálních vakcín předloženého vynálezu budou podávány ve farmaceutických přípravcích pro použití k vakcinování jedinců, s výhodou lidí. Takové farmaceutické přípravky mohou zahrnovat farmaceuticky účinné • 999 · 9 9 · 999 • 9 99 9 9 999 9 ·· • · · 9 9 9 · 9 9 9 9 9· • · · 9 ····9 ·· ·· 99 99 99999 nosiče, a případně mohou obsahovat jiné léčebné složky, jako jsou různá, v oboru známá adjuvans.
Nosič nebo nosiče musí být farmaceuticky přijatelné v tom smyslu, že jsou slučitelné s léčebnými složkami a nejsou nadměrně škodlivé pro své příjemce. Léčebná složka nebo složky jsou poskytovány v množství a frekvenci nezbytné pro dosažení požadovaného imunologického účinku.
Způsob podávání a dávkové formy budou ovlivňovat léčebná množství sloučenin, které jsou požadované a účinné pro vakcinační aplikaci. Materiály živého bakteriálního vektoru jsou dodávány v množství schopném vyvolat imunní reakci, která účinně zvýší pacientovu imunitní odpověď vůči exprimovanému mutovanému holotoxinu nebo jinému žádoucímu heterolognímu antigenu (antigenům). Účinné imunizační množství je takové množství, které propůjčí zvýšenou schopnost zabránit, oddálit nebo snížit prudkost projevu nemoci ve srovnání s takovouto schopností v nepřítomnosti takové imunizace. Osobě se zkušeností v oboru bude snadno zřejmé, že toto množství se bude měnit v závislosti na takových faktorech, jako je váha a zdravotní stav pacienta, typ exprimovaného proteinu nebo peptidu, typ infekčního organizmu, kterému se tímto čelí a na způsobu podání prostředků.
Způsoby podání mohou zahrnovat použití jakýchkoli vhodných způsobů a/nebo metod pro podání živých bakteriálních vakcinačních vektorů do místa v těle hostitelského živočicha, v němž jsou živé bakteriální vakcinační vektory imunostimulačně účinné.
Způsoby podávání mohou zahrnovat, mimo jiné, patenterální metody podání, jako jsou podkožní (SC) injekce, nitrožilní (IV) injekce, kožní, nitrosvalové (IM), intradermální (ID) a rovněž nepatenterální metody podání, jako jsou orální, nazální, intravaginální, pulmonární, oftalmické a/nebo rektální podávání.
Dávkové množství a vhodné dávkové formy pro prostředky, obsahující živé bakteriální vakcinační vektory předloženého vynálezu, mohou být snadno určeny osobami s běžnou zkušeností v oboru bez přílišného experimentování, za použití běžných technik pro určení titru protilátek a běžných protokolů pro zjišťování biologické účinnosti a biologické snášenlivosti. Mezi jinými faktory, dávkové množství a vhodné dávkové formy závisejí na určitém použitém antigenu, požadovaném léčebném účinku a požadovaném časovém rozsahu biologické aktivity.
' Živé bakteriální vakcinační vektory předloženého vynálezu mohou být s užitkem podávány hostitelským zvířatům s jakýmikoli jinými vhodnými farmakologicky nebo fyziologicky aktivními činidly, např. antigenními a/nebo jinými biologicky aktivními látkami.
Přípravky předloženého vynálezu mohou být ve formě např. diskrétních jednotek jako jsou kapsle, tobolky, tablety nebo pastilky, kdy každá obsahuje předem určené množství podávané struktury vektoru; nebo ve formě suspenze.
Přehled obrázků na výkresech
Obrázky 1A až 1C: Genetické mapy příkladů expresních plazmidů pGEN (pGEN2, pGEN3 a pGEN4) předloženého vynálezu.
Obrázky 2A až 2D: Genetické mapy příkladů expresních plazmidů předloženého vynálezu, založených na oriE1 (pJN72, pJN51, pJN10 a pJN12).
Obrázek 3: Histogramy průtokové cytometrie fluorescence GFP pro CVD 908hrtA, obsahujícího expresní vektory se systémem post-segregačního zabíjení hok-sok.
Obrázky 4A až 4B: Nukleotidová sekvence pGEN2 - nukleotidy 1 až 4199.
Obrázek 5: Nukleotidová sekvence pGEN3 - nukleotidy 1201 až 2400, ukazující sekvenci οπΊ 5A.
Obrázek 6: Nukleotidová sekvence pGEN4 - nukleotidy 1201 až 3850, ukazující sekvenci οπΊ 01.
Obrázky 7A až 7E: Genetické mapy příkladů expresních plazmidů pGEN předloženého vynálezu, založených na oriA15 (pGEN91, pGEN111, pGEN121, PGEN193 a pGEN222).
Obrázek 8: Histogramy průtokové cytometrie fluorescence GFP pro expresní plazmidy pGEN91, pGEN111, pGEN121, pGEN193 a pGEN222.
Příklady provedení vynálezu
Byly zkonstruovány izogenní série expresních plazmidů, které jsou složeny z jednotlivých kazet, použitelné v živých bakteriálních vakcínových vektorech, jako jsou E. coli a Salmonella. S výjimkou ribozomálních vazebných míst (RBS), klíčové genetické lokusy kontrolující započetí a ukončení transkripce, replikaci plazmidu nebo • 4 · ♦ * · · · ·· · • ♦ · 4 « · 4 · ·· · • · ·· 4 9 444 ··· • ·· 4 4 4 · · 4 « · ·· • 4 4 4 444 · ··4 •4 44 ·· ·· 44444 kódů vání exprimovaných proteinů, jsou obsaženy uvnitř definovaných restrikčních fragmentů, jak je znázorněno na reprezentativním diagramu plazmidů pGEN2 na obrázku 1A. Napřed bude vysvětlena základní struktura těchto expresních plazmidů a potom budou souhrnně uvedeny údaje, ukazující funkci každého lokusu v oslabeném vakcinačním kmeni CVD908-MrA.
Příklad 1: Struktura pGEN
Transkripce jakéhokoli heterologního antigenu, který má být exprimován v CVD908-/?řrA je primárně kontrolována indukovatelným promotorem, obsaženým v kazetě EcoRI - Bglll. Protože expresní plazmidy byly původně modelovány podle pTETn/715, časné verze obsahovalyly anaerobně aktivovaný promotor n/r15 (Pn/n5). Avšak tento promotor byl zaměněn dobře regulovatelným, osmoticky kontrolovatelným promotorem PompC, se kterým se in vitro je snadněji manipuluje pomocí změn koncentrace NaCI.
Heterologní antigeny jsou obsaženy v kazetě Bglll - >Avrll, a jsou ohraničeny na předním 5'-konci této kazety optimalizovaným RBS a na jejím zadním 3'-konci transkripčním terminátorem trpA. Počátek replikace pro tyto expresní plazmidy byl navržen jako kazeta Λν/ΙΙ - Bg/ll, která je chráněna před tím, aby do ní nezasáhla transkripce započatá v sousedících oblastech. Tyto kazety obsahují extrémně účinný derivát transkripčního terminátoru T1T2 na jednom konci a transkripční terminátor trpA z heterologní antigenní kazety na opačném konci replikační kazety.
Sousedící místa BglW a Spěl (viz obrázek 2) mezi replikační kazetou a selekční kazetou jsou zamýšlena pro vložení funkce pro udržování plazmidů, jako je lokus par z pSC101. Selekční kazety obsažené v plazmidech jsou umístěny uvnitř kazet Spěl Xbal a mohou být například použity pro kódování rezistence ke karbenicilinu (gen bia) nebo rezistence k tetracyklinu (gen tetA, viz obrázek 1).
Kazeta nesoucí rezistenci k léku může být zaměněna genem ssď, kódujícím esenciální protein, který se váže k jednovláknové DNA, ze Salmonella typhi CVD908htrA.
Sousedící místa Xba\ a EcoR\ mezi selekční kazetou a Pompc, jsou zamýšlena pro vložení dalších udržovacích funkcí, včetně lokusu PSK jako je hok-sok (viz obrázky 1 a 2) nebo dalších funkcí zajišťujících rozdělování plazmidů, jako je lokus parA z pR1 (viz obrázek 7).
Příklad 2: Modifikovaný promotor ompC
Bylo plánováno, že každý promotor kontrolující transkripci heterologního genu bude reagovat na signály biologického významu, přicházející z okolí. Pro zde popsané expresní plazmidy byla použita kazeta s promotorem ompC (POmPc) z E. coli, která je indukovatelná zvýšením osmolarity. Konstrukce této kazety byla založena na sekvenci Pompc publikované Norioka a kol. (Norioka a kol. 1986) a byla provedena pomocí syntetických primerů tak, aby došlo k vytvoření 459 pb dlouhé kazety EcoRI - Sglll, v níž bylo odstraněno přirozené RBS.
Aby bylo potvrzeno, že tento promotor je v CVD 908-WrA kontrolovatelný osmoticky, byl konstruován derivát pTETn/r15, ve kterém je Pn/r15 - toxC zaměněn kazetou, obsahující Pompc, který řídí expresi kazety aphA-2 bez promotoru, propůjčující rezistenci ke kanamycinu. Tento plazmid, označený pKompC, byl vnesen pomocí elektroporace do CVD 908-hřrA a bakterie, které plazmid získaly, byly vyhledány na médiu LB pomocí rezistence ke kanamycinu. Osmoticky regulovatelná exprese aphA-2 byla zjišťována očkováním CVD 908-hřrA(pKompC) do 50 ml doplněného živného bujónu (NB), obsahujícího zvyšující se koncentrace kanamycinu od 0 do 300 pg/ml; byla založena i paralelní sada kultur s totožnými koncentracemi přidaného kanamycinu, které ale také obsahovaly 10% sacharózu pro indukování POmPc· Kultury byly inkubovány přes noc při 37 °C a byla změřena O.D.60o. Výsledky jsou uvedeny v tabulce 2, pokus 1.
Tabulka 2 ukazuje indukci promotoru PompC, kontrolujícího expresi rezistence ke kanamycinu v oslabeném živém vektoru S. typhi CVD 908-MrA, působením osmolarity.
Tabulka 2
Pokus 11 Pokus 22
koncentrace kanamycinu (pg/ml) nízká osmolarita (O.D.600) 10% sacharóza (O.D.600) koncentrace kanamycinu (pg/ml) nízká osmolarita (O.D.600) 300 mM NaCl (O.D.600)
0 0,92 0,35 0 0,95 1,04
50 0,3 0,35 200 0,04 0,99
100 0,07 0,31 400 0,02 0,96
200 0,03 0,21 600 0,01 0,92
300 0,02 0,19 800 0,01 0,92
1 Kultura CVD908-MrA(pKompC) byla založena v bujónu LB doplněném 0,0001% (hmotnost/objem) kyseliny 2,3-dihydrobenzoové (DHB) a 50 gg/ml kanamycinu a byla inkubována po dobu 16 hodin při 37 °C, Tato počáteční kultura byla potom zředěna 1:10 čerstvým médiem a inkubována při 37 °C po dobu 2 hodin, aby vznikla očkovací kultura exponenciálně rostoucích bakterií. 50 μΙ této kultury bylo potom naočkováno do 50 ml kultur v Nutrient Broth (NB), doplněném DHB, jak bylo uvedeno výše, ale se zvyšujícími se koncentracemi kanamycinu; byla založena i paralelní sada kultur s totožnými koncentracemi přidaného kanamycinu, ale také obsahovaly 10% sacharózu pro indukování Pompc. Kultury byly inkubovány přes noc při 37 °C a byla změřena O.D.eoo· 2 Kultura CVD908-htrA(pKompC) v doplněném bujónu LB a kanamycinu byla inkubována po dobu 16 hodin při 37 °C, zředěna 1:10 čerstvým médiem a inkubována při 37 °C po dobu 2 hodin, aby vznikla očkovací kultura exponenciálně rostoucích bakterií. 100 μΙ alikvoty této kultury byly potom naočkovány do 50 ml kultur v NB bujónu, obsahujících zvyšující se koncentrace kanamycinu od 200 do 800 pg/ml; byla založena i paralelní sada kultur obsahujících 300 mM NaCI a všechny kultury byly inkubovány při 37 °C po dobu 16 hodin a byla změřena O.D.eoo·
Bez ohledu na selekční tlak kanamycinu měla přítomnost 10% sacharózy inhibiční vliv na růst CVD 908-MrA(pKompC). Avšak výsledky naznačovaly, že E. coli Pompc byl při expresi genu aphA-2 v CVD 908-htrA(pKompC) osmoticky kontrolován. Aby se toto potvrdilo, CVD 908-htrA(pKompC) byl očkován do 50 ml bujónu NB, obsahujícího zvyšující se koncentrace kanamycinu od 200 do 800 pg/ml; znovu byla založena i paralelní sada kultur obsahujících 300 mM NaCI kvůli indukci Pompc· Kultury byly inkubovány při 37 °C po dobu 16 hodin a výsledky jsou uvedeny v tabulce 2, pokus 2. Bylo potvrzeno, že exprese genu aphA-2 v CVD 908-htrA řízená PompC propůjčuje osmotickým způsobem regulovatelnou rezistenci ke kanamycinu na úrovních až do 800 pg/ml.
Kazeta s genem aph byla potom zaměněna za 756 párů bází (pb) dlouhou kazetu Bg/ll - Nhel, obsahující alelu gfpuv, která kóduje GFPuv. V průběhu vizuálního prohledávání kolonií E. coli slabě osvětlených ultrafialovým světlem, byly pro další studium vybrány jedna velmi jasně fluoreskující kolonie a další reprezentativní
-»· • · · 9 • · ·· ·· ·· • · · • · ··« ·· 9 · • · • • » •
•
·♦ • 9 M · ·
fluoreskující kolonie, a byly označeny klon 1, respektive klon 3. Po purifikaci obsažených plazmidu bylo zjištěno, že klon 1 obsahoval plazmid, který již neobsahoval místo Bg/ll, oddělující PompC a gfpuv, zatímco klon 3 očekávané místo Bg/ll obsahoval. Byla testována indukce exprese GFP když klony 1 a 3 rostly na živném agaru v přítomnosti nebo v nepřítomnosti NaCI a vizuální prohlídkou bylo zjištěno, že klon 3 vykazuje velmi malou fluorescenci když roste na živném agaru neobsahujícím NaCI, ale fluoreskuje jasně, když je vyset na živném agaru obsahujícím 300 mM NaCI (údaje nejsou uvedeny). Klon 1 však měl vyšší pozadí fluorescence, když nebyl indukován, ale při indukci pomocí 300 mM NaCI intenzivně fluoreskoval. Aby byly vyloučeny mutace uvnitř genu gfpuv, které by mohly fluorescenci ovlivnit, byla zaměněn PompC z klonu 1 za Pompc z klonu 3 a potvrzeno očekávané snížení fluorescence, jak bylo zjištěno při slabém osvětlení ultrafialovým světlem (údaje nejsou uvedeny). Bylo proto uzavřeno, že rozdíly v pozorované fluorescenci byly kontrolovány dvěma geneticky odlišnými verzemi promotoru Pompc, které byly označeny jako Pompa (vyšší transkripční hladiny s menší osmotickou kontrolou) a PompC3 (mírné transkripční hladiny s osmotickou kontrolou podobnou té, která byla pozorována u výše popsané kazety PompC - aph); plazmidy obsahující tyto expresní kazety jako pGPPompCI, respektive pGFPo/npCS.
Aby byly kvantifikovány rozdíly indukované a neindukované exprese gfpuv, kontrolované Pompcí a Pompc3, syntéza GFPuv byla monitorována jak v E. coli DH5a tak v
S. typhi CVD 908-WrA pomocí průtokové cytometrie. Tato výkonná technika má jedinečnou výhodu v tom, že umožňuje rychlé měření exprese GFPuv ve velkém množství jednotlivých bakterií a rovněž přesné určení průměrné intenzity fluorescence, způsobené syntézou GFPuv v každé analyzované bakteriální populaci. Aby se toho dosáhlo, byly pGPPompCI a pGFPon?pC3 vpraveny do bakterií pomocí elektroporace a kolonie byly izolovány růstem při 30 °C po dobu 48 hodin na doplněném 1x LB agaru, který obsahoval 100 pg/ml karbenicilinu. Izolované kolonie byly pak vypěstovány a kultury byly zmraženy jako zásobní stoky. Potom byly čerstvé kolonie naočkovány buď do doplněného živného bujónu nebo do doplněného živného bujónu obsahujícího 150 mM NaCI a pěstovány při 37 °C/250 otáček za minutu po dobu 24 hodin; rozdíl v O.D.eoo pro kteroukoli kulturu nebyl nikdy větší než 0,07. Indukce exprese gfpuv, kontrolovaná Pompci a POmPc3 byla analyzována pomocí průtokové cytometrie a výsledky jsou uvedeny v tabulce 3.
Tabulka 3 ukazuje srovnání indukce Pompci a Pompc3, kontrolujících expresi
GFPuv v hostitelských kmenech E. coli DH5a a CVD 908-hřrA.1
4· 44 ·· 4·
• · t 4 • 4 4 4 4 44
4 4 4» • 4 444 4 4 4
44 44 4 4 »4 4 4 • 4 4
Tabulka 3
Kmen nízká osmolarita (O.D.goo) průměrná intenzita fluorescence 150 mM NaCl (ΟΌ.βοο) průměrná intenzita fluorescence Indukční poměr2
DH5a 0,61 0,28 0,95 0,29 NA3
DH5a (pGFPompCI) 0,56 4,45 0,72 7,69 1,7
DH5a (pGFPompC3) 0,58 1,77 0,73 4,21 2,4
CVD 908-MrA 0,58 0,27 0,65 0,26 NA
CVD 908-MrA (pGFPompCI) 0,60 5,37 0,54 23,4 4,4
CVD 908-hfrA (pGFPompC3) 0,54 2,56 0,53 17,1 6,7
1 Všechny kmeny byly naočkovány ze mražených zásobních stoků na 2x LB agar doplněný DHB a 50 pg/ml karbenicilinu a inkubovány po dobu 36 hodin při 30 °C. Izolované kolonie byly spojeny do 300 μΙ doplněného NB bujónu, doplněného DHB a karbenicilinem, a z toho bylo 25 μΙ naočkováno do 25 ml doplněného NB bujónu buď s anebo bez 150 mM NaCl a inkubovány při 37 °C, 250 otáčkách za minutu po dobu 24 hodin. Bakterie byly potom sedimentovány, resuspendovány v 1 ml PBS pH 7,4 a poté zředěny 1:1000 do PBS pro analýzu pomocí průtokové cytometrie.
2 Definováno jako poměr průměrné intenzity fluorescence měřené po indukci pomocí 150 mM NaCl dělené základní hladinou průměrné intenzity fluorescence měřené při nízké osmolaritě.
3 NA = nelze použít.
Základní hladina exprese je pro kazetu Pompc? -gfpuv 2,5x vyšší než pro kazetu PomPc3 -gfpuv, když se jedná o expresi v DH5a a 2,1x vyšší, když se jedná o expresi v CVD 908-MrA; avšak základní hladina fluorescence detekovaná u syntézy GFPuv nikdy nepřekročila průměrnou intenzitu fluorescence 5,37, bez ohledu na to o jakého se jednalo hostitele. Jestliže budeme definovat indukční poměr jako poměr průměrné • · · · · · · ··· • · · · · ···· · · intenzity fluorescence měřené po indukci, dělené základní hladinou průměrné intenzity fluorescence, bylo pozorováno že při indukci 150 mM NaCl Pompa a Pompc3 vykazují v DH5a indukční poměry 1,7 respektive 2,4. Je překvapující, že indukční poměr pro Pompcí, když je měřen v CVD 908-htrA, byl 4,4 a vykázal maximální průměrnou intenzitu fluorescence v těchto pokusech a to 23,4. Třebaže indukční poměr pro Pompc3 v CVD 908-M/A byl 6,7, průměrná intenzita fluorescence 17,1 byla nižší než která byla naměřena pro PomPci- Na základě těchto údajů se zdá, že PomPci je nejsilnější a navíc osmoticky kontrolovatelný ze těchto dvou promotorů ompC. Pompci byl proto vybrán pro syntézu nejširšího možného spektra heterologních testovaných antigenů, aby se vyzkoušely účinky takové syntézy na stabilitu plazmidu.
Tyto údaje jasně ukazují, že když v živém vektoru kmene CVD 908-htrA řídí expresi gfpuv, jsou promotory Pompc/ a Pompc3 indukovatelné zvýšením osmolarity, třebaže základní hladina transkripce je stále v obou případech zřetelná. Výsledky pozorované za podmínek nižší osmolarity dále podporují naše pozorování, získaná při použití pevného média, a to že PomPci udržuje vyšší expresi heterologního antigenů než PomPc3. Protože bylo zmíněno, že Pompcs obsahuje u 3'-konce zamýšlené BglW místo, které nebylo zjištěno u Pompa, byla určena nukleotidová sekvence Pompcí, s tím že bude snad zjištěna bodová mutace, která by mohla vysvětlit sílu Pompa- Odchylky byly zjištěny pouze na 3'-konci kazety. Zamýšlená sekvence v této oblasti byla 5'...catataacAGATCTtaatcatccacAGGAGGatatcgtATG-3' (zleva doprava, velká písmena označují místo BglW, vazebné místo pro ribozóm, respektive startovní kodon transkripce GFPuv); skutečná sekvence se ukázala být 5'... catataacAGAT CGATCTtaaAcatccacAGGAGGAtAtctgaAT G-3' (vložené nebo změněné báze jsou označeny podtrženými velkými písmeny). Tyto změny zjištěné v sekvenci promotoru ompC1 jsou zřetelně zodpovědné pomocí neznámého mechanizmu za zvýšení pozorované síly Pompa, protože ani základní sekvence promotoru ompC, ani optimalizované vazebné místo k ribozómu nebyly spontánně změněny.
Příklad 3: Počátky replikace a selekční kazety.
Úspěch při exprimování potenciálně toxických nebo jinak problematických heterologních antigenů v CVD908-MrA závisí na počtu kopií expresních plazmidů. Dále, pozorované imunitní odpovědi k danému heterolognímu antigenů jsou ovlivněny • · ·· ·· ·· ·· • · · * ··· · • ··· · · · · · · počtem kopií genu (genů), které antigen kódují, přičemž chromozomálně exprimované antigeny vyvolávají, ve srovnání s expresí z plazmidů, slabší imunitní odpovědi.
Optimalizovaná imunitní odpověď bude záviset na expresi heterologního antigenů (antigenů) z plazmidů s vhodným počtem kopií.
Protože vhodný počet kopií pro daný heterologní antigen nemůže být a priori znám, předložený vynález poskytuje soubor expresních plazmidů, které obsahují počátky replikace onE1 (amplifikovaný z pAT153; počet kopií ~60), or/15A (amplifikovaný z pACYC184; počet kopií ~15) a οπΊ 01 (amplifikovaný z pSC101; počet kopií ~5). Všechny tyto samostatné replikační kazety jsou uloženy ve fragmentech Bg/ll-BamHI a jsou znázorněny na souboru tří plazmidů, exprimujících rezistenci k tetracyklinu, které jsou zobrazeny na obrázcích 1A až 1C.
Exprese kazety exprimující gfpuv pod kontrolou Pompc/, obsažené v těchto expresních plazmidech byla analyzována pomocí průtokové cytometrie. Tyto pokusy byly určeny k tomu, aby bylo zjištěno, zda mohou být korelovány rozdíly v úrovních pozorované fluorescence s očekávaným počtem kopií daného expresního plazmidů. Kmeny CVD908-/?trA, nesoucí pGEN2, pGEN3 a pGEN4 byly vysety na bohaté médium SuperAgar, doplněné tam kde to bylo vhodné DHB a 20 gg/ml tetracyklinu. SuperAgar byl použit proto, že to je velmi bohaté médium (3x LB agar). Plotny byly inkubovány při 30 °C, aby byla snížena toxicita syntézy GFP a aby byl bakteriím umožněn bohatý nárůst na plotnách. Izolované kolonie byly potom naočkovány do 45 ml média SuperBroth doplněného DHB a 20 gg/ml tetracyklinu tam, kde je to vhodné a inkubovány při 37 °C po dobu 16 hodin. Bakterie byly koncentrovány centrifugací a resuspendovány v 1 ml sterilního PBS, pH 7,4 a před FACS analýzou byly zředěny 1:100 v PBS pH 7,4. Bakterie byly analyzovány pomocí průtokové cytometrie, jak bylo popsáno výše, a to ve dvou nezávislých růstových pokusech a výsledky jsou uvedeny v tabulce 4 na konci tohoto oddílu.
Tyto údaje podporují závěr, že příliš vysoká exprese GFPuv v CVD908-WrA je pro bakterie toxická. Jak se teoretický počet kopií zvyšuje pro plazmidy pGEN4, pGEN3 a pGEN2, které exprimují GFPuv za stejných růstových podmínek a pomocí stejného promotoru POmPci, snižuje se procento rostoucí populace, které fluoreskuje. Očekává se, že nefluoreskující bakterie nejsou životaschopné bakterie, které zřejmě dále neobsahují expresní plazmid, protože tyto kultury byly pěstovány v přítomnosti 20 pg/ml tetracyklinu. Je však nutno poznamenat, že pokud jsou naočkovány na pevné médium • · · · · · · ··· • · · · · ···· · · a pěstovány při 37 °C po dobu 24 až 36 hodin, CVD908-hřrA(pGEN2) roste špatně a nedává vznik izolovaným koloniím, zatímco CVD908-ĎřrA(pGEN3) a CVD908Z?řrA(pGEN4) rostou zcela dobře a dávají vznik intenzivně fluoreskujícím izolovaným koloniím.
Protein GFPuv je zde použit jako reprezentant jiných problematických heterologních antigenů, u kterých by mohl být zájem zabudovat je do živých bakteriálních vektorů, jako je živý vektor založený na S. typhi; je však nutno ocenit, že GFPuv může být zaměněn jakýmkoli jiným nemetabolickým proteinovým nebo peptidovým antigenem.
Výše uvedené údaje ukazují, že třebaže expresní plazmidy se středním počtem kopií a obsahují replikony s or/E1 mohou být použity pro expresi některých antigenů, exprese antigenů s vyšší toxicitou bude úspěšněji probíhat z plazmidů s malým počtem kopií a které používají takové počátky replikace, které dávají průměrný počet kopií mezi 2 a 30, jako jsou počátky replikace or/101 nebo ori15A.
Tabulka 4
Kmen Pokus 1 Pokus 2
Procento nefluoreskujících bakterií Průměrná fluorescence nefluoreskujících bakterií (relativní jednotky) Procento fluoreskujících bakterií --Průměrná fluorescence (relativní jednotky) Procento nefluoreskujících bakterií Průměrná fluorescence nesvítících bakterií (relativní jednotky) Procento fluoreskujících bakterií Průměrná fluorescence (relativní jednotky)
CVD 908-htrA 100 0,6 0 0 100 0,3 0 0
CVD 908-htrA (pGEN2) 19,9 0,1 80,1 38,5 37,2 0,3 62,8 10,1
CVD 908-hfrA (pGEN3) 17,1 0,1 82,9 28,1 4,9 0,2 95,1 8,28
CVD 908-htrA (pGEN4) 12,1 0,1 88,0 22,4 9,4 0,3 90,6 4,25
·· ·· · · · · ·
Příklad 4: hok-sok lokus antisense post-segregačního zabíjení.
Pomocí polymerázové řetězové reakce byly amplifikovány hok-sok PSK geny, přičemž jako matrice byl v těchto reakcích použit R-plazmid pR1, nesoucí mnohočetnou antibiotikovou rezistenci. Všechny počáteční pokusy klonovat tento lokus do plazmidů s vysokým nebo středním počtem kopií byly neúspěšné. Aby došlo v průběhu subklonování k přímé selekci lokusu hok-sok, byla navržena souprava primerů pro použití v překrývajících se PCR reakcích tak, že konečným produktem byl fragment obsahující genetickou fúzi lokusu hok-sok z pR1 a genu řefA bez promotoru z pBR322, který kóduje rezistenci k tetracyklinu. Tato kazeta byla sestavena tak, že transkripce genu hok by pokračovala do feřA; dva lokusy v této kazetě byly pro případné budoucí manipulace odděleny restrikčním místem pro Xbal.
Konstrukce této kazety nejen že umožňuje přímou selekci lokusu hok-sok, ale také umožňuje potvrdit, že by funkce PSK fungovala v S. typhi CVD908-M/A. Po elektroporaci plazmidů nesoucích kazetu do kmene CVD908-hfrA, mohou být transformanty selektovány pomocí tetracyklinu. Opětné získání izolovaných kolonií znamená úspěšnou syntézu hok-tetA mRNA a úspěšnou syntézu antisense sok RNA, která zabrání translaci a syntéze Hok, který by bakterie zabil. Získání kazety hok-soktetA nebylo komplikované a byla snadno zabudována do našich expresních plazmidů, čímž byla vytvořena kazeta se selektovatelným markérem pro plazmidy pGEN2, pGEN3 a pGEN4, zobrazené na obrázcích 1A až 1C.
Poté byly započaty pokusy, které měly určit vliv hok-sok PSK funkce na stabilitu expresních plazmidů obsahujících οπΈ1 a bia markér pro rezistenci, kódující βlaktamázu, která propůjčuje rezistenci ke karbenicilinu. Kazeta hok-sok byla vložena do expresního plazmidu pTETn/r15, který je odvozen z pAT153, v němž byla kazeta Pnirt5-toxC s heterologním antigenem zaměněna naší kazetou POmPcrgfpuv, a vytvořeny tak plazmidy pJN72 (bez hok-sok) a pJN51 (s hok-sok). Další souprava plazmidů byla vytvořena záměnou Pompci za slabší promotor Pompc3, a vytvořeny tak pJN1O a pJN12; struktury těchto čtyř plazmidů, obsahujících stejné geny, jsou uvedeny na obrázku 2. Kmeny CVD908-/?řrA obsahující buď pJN72, pJN51, pJN10 nebo pJN12 byly vysety na bohaté médium SuperAgar doplněný DHB a 100 pg/ml karbenicilinu a plotny byly pěstovány jak bylo uvedeno výše pro plazmidy pGEN při 30 °C, aby byla snížena toxicita syntézy GFPuv a bakteriím umožněn na plotnách bohatý nárůst.
Izolované kolonie byly potom naočkovány do 45 ml bujónu Super, doplněného DHB a 100 pg/ml karbenicilinu a pěstovány při 37 °C po dobu 24 hodin kvůli analýze fluorescence pomocí průtokové cytometrie. Druhý nezávislý pokus byl proveden přesně tak jako pokus prvý, s výjimkou že izolované kolonie byly suspendovány v 500 μΙ bujónu Super a 250 μΙ každého z nich bylo naočkováno do páru kultur 45 ml bujónu Super, bud s nebo bez 300 mM NaCI, přidaného pro to, aby indukoval kazety Pompcigfpuv, kultury byly pěstovány při 37 °C po dobu 48 hodin a opět analyzovány pomocí průtokové cytometrie; a výsledky obou pokusů jsou uvedeny v tabulce 5. Histogramy fluorescence pro neindukované a indukované expresní plazmidy z pokusu 2 jsou uvedeny na obrázcích 3A až 3H.
Tabulka 5
Kmen Pokus 1 Pokus 2
Procento nefluoreskujících bakterií Průměrná fluorescence nefluoreskujících bakterií Procento fluoreskujících bakterií Průměrná fluorescence O.D.600 +/- 300 mM NaCI % nefluoreskujících bakterií Průměrná fluorescence nefluoreskujících bakterií Procento fluoreskujících bakterií Průměrná fluorescence
CVD 908htrA 100 0,3 0,73 - 100 0,3 0 0
CVD 908WfA (pJN72) 3,1 0,2 96,9 10,2 0,75 - 2,3 0,3 97,7 11,7
0,89 + 22,2 0,3 77,8 22,5
CVD 908WrA(pJN51) 58,1 0,3 41,9 6,29 0,62 - 56,3 0,3 43,7 18,4
0,62 + 95,4 0,3 4,6 21,0
CVD 908WrA(pJN10) 5,4 0,2 94,6 7,43 0,72 - 1,7 0,3 98,3 8,3
0,96 + 29,9 0,3 70,1 19,8
CVD 908WrA(pJN12) 18,9 0,2 81,1 6,60 0,47 - 45,2 0,3 54,8 16,4
0,68 + 95,6 0,3 4,4 13,2
Tyto výsledky průtokové cytometrie je možno vysvětlit následujícím způsobem: exprese GFPuv (nebo jiného potenciálně škodlivého heterologního antigenů) pomocí expresních plazmidů s vysokým počtem kopií, jako je pJN72, zvyšuje metabolický stres • ·· · · · · · · • · · · · · · · · · · živého vektoru CVD 908-WrA(pJN72) a zvyšuje nestabilitu plazmidu v nepřítomnosti selekce. Protože selektovatelný znak expresních plazmidů kóduje sekretovaný enzym β-laktamázu, potom s prodlužující se dobou koncentrace karbenicilinu v obklopujícím médiu klesá, selekční tlak se snižuje a zvyšuje se frekvence ztrát plazmidu; avšak protože se jedná o plazmidy s vysokým počtem kopií, relativné málo bakterií ztratí všechny své plazmidy, ale průměrný počet kopií pJN72 na jednu bakterii klesá.
Kvantifikování produkce GFPuv pomocí průtokové cytometrie u neindukované populace zdravých rostoucích CVD 908-/?řrA(pJN72) ukazuje, že většina bakterií exprimuje GFPuv a je detekováno málo nefluoreskujících buněk (obrázek 3A). Avšak zvyšující se produkce GFPuv způsobená indukcí kazety Pompcrgfpuv zvyšuje metabolický stres CVD 908-WrA(pJN72) a třebaže se produkce GFP zdvojnásobí, procento nefluoreskujících bakterií se zvyšuje, protože z populace je ztraceno více plazmidů (obrázek 3B).
V podobné populaci rostoucích CVD 908-MrA(pJN51) nese každá bakterie mnoho kopií plazmidu, kódujícího jak GFPuv tak funkci PSK. Frekvence ztráty plazmidu u pJN51 zůstává stejná jako u pJN72, ale v tomto případě jak jednotlivé bakterie ztrácejí kopie expresního plazmidu, je porušena stechiometrie 1:1 mezi hladinami mRNA hok a sok a produkce Hok vede ke smrti buňky; proto pouze ty bakterie CVD 908-hfrA(pJN51), které porostou rychle, si podrží všechny své expresní plazmidy. Není proto překvapující, že při kvantifikování produkce GFPuv pomocí průtokové cytometrie u neindukované populace zdravých rostoucích CVD 908-MrA(pJN51) je nyní detekována populace fluoreskujících bakterií, která vykazuje úroveň GFPuv fluorescence rovnou té, která byla pozorována u CVD 908-WrA(pJN72), rostoucích za podmínek indukce (obrázek 3C ve srovnání s obrázkem 3B); avšak procento nefluoreskujících bakterií se zvyšuje na více než polovinu této populace organizmů.
Zvýšení produkce GFPuv v této populaci indukcí kazety Pompcrgfpuv v CVD 908MrA(pJN51) znovu zvyšuje metabolický stres živého vektoru, ale nyní procento nefluoreskujících bakterií téměř zcela převáží nad málo fluoreskujícími bakteriemi, protože mnoho plazmidů se pravděpodobně z populace ztratilo a bakterie jsou zabity (obrázek 2D).
Dalo by se očekávat, že jestliže pro kontrolu exprese GFPuv bude použit slabší promotor, celková fluorescence populace bude snížena (ve srovnání s fluorescencí pozorovanou u podobné populace organizmů rostoucích za shodných podmínek se ·· ·· «· ·♦ ·· • · · · · · · ·· • · · · · · · · · · · • · · · 9 9 9 9 9 9 9
99- 99 99 99 999 silnějším promotorem exprimujícím GFPuv) a procento nefluoreskujících bakterií by mělo poklesnout kvůli všeobecnému poklesu syntézy GFPuv. Avšak, jak je vidět na obrázcích 3E až 3H, použití slabší kazety Pmpcrgfpuv nezlepší významně životaschopnost indukovaných bakterií, které obsahují systém zabíjení, dokonce přestože všeobecná exprese GFPuv byla omezena.
Bylo uzavřeno, že aby bylo maximalizováno procento populace živých vektorů exprimujících vybraný heterologní antigen, nepostačuje pouze zabudovat do expresního plazmidu PSK funkci, ať se jedná o markér rezistence k léku, systém asd, alternující systém ssb nebo systém zabíjení hok-sok. Dále musí být pro optimalizaci počtu kopií a expresních hladin také vylepšeny segregační frekvence těchto plazmidů, aby bylo zajištěno, že každá dceřiná buňka v aktivně rostoucí populaci zdědí alespoň jeden expresní plazmid a nebude tedy zabita a odstraněna z populace. Je tedy v rámci předloženého vynálezu poskytnout expresní plazmid obsahující funkci PSK, který má dále optimalizovaný počet kopií a/nebo expresní hladiny, což je spojeno se zabudováním jedné nebo více funkcí SEG.
Příklad 5: Systém zabíjení založený na komplementaci.
V širokém rámci předloženého vynálezu je také poskytnutí expresního plazmidu obsahujícího systém zabíjení založený na komplementaci, například systém zahrnující deleci chromozomálního lokusu ssb v CVD908-břrA pomocí homologické rekombinace a trans-komplementaci tohoto poškození pomocí plazmidů s velkým počtem kopií, které obsahují funkční ssb.
Provedení takové konstrukce vyžaduje klonování odpovídajícího úseku chromozomu S. typhi, který obsahuje gen ssb a sousedících sekvencí, do nichž mohou být vneseny specifické delece pro chromozomální mutagenezi.
Od naší počáteční přihlášky byl učiněn podstatný pokrok v sekvenování chromozomu Salmonella typhi na Sangerově centru v Londýně. Sangerovo centrum je genomové výzkumné centrum, které založil Wellcome Trust a Medical Research Council v roce 1992, aby se zdokonalily naše znalosti genomů. Mezi jinými projekty Sangerovo centrum sekvenuje 4,5 Mb genom S. typhi ve spolupráci s Gordonem Douganem z oddělení biochemie, Imperiál College, Londýn. Sekvenují kmen CT18, vysoce patogenní kmen, který je rezistentní k mnoha lékům, izolovaný z pacienta s tyfem v nemocnici Cho Quan, Ho-či-minovo město, Vietnam. O tomto kmeni je známo, ·· · · ·· · · · · • · · · ··· ··· • · · · · · · · · · · že obsahuje pVNIOO (130 kb dlouhý plazmid, nesoucí rezistenci k mnoha lékům) a latentní 80 kb plazmid. Genom je sekvenován přístupem shotgun za využití 2kb pUC knihovny, kterou si připravili z chromozomální DNA poskytnuté laboratoří profesora Dougana. Každý inzert byl sekvenován z každého konce jednou. Fáze shotgun je nyní kompletní a bylo započato se závěrem. V současné době existuje v databázi 60 kontigů dlouhých přes 1 kb; celkem 5,106 Mb sekvence, sestavené z 87,331 odečítání.
Na základě nejnovějších výsledků, zaslaných 4. října 1999, jsme určili kontig 343, který obsahuje lokus ssb S. typhi a kritické sousedící sekvence v rámci oblasti dlouhé 205,199 bází. Navrhli jsme primery 1 a 4 (uvedené dále), které budou amplifikovat fragment chromozomu S. typhi dlouhý 3535 bází, v němž je lokus ssb obklopen 1,5 kb dlouhou chromozomální sekvencí; toto symetrické obklopení je vyžadováno pro optimální frekvence crossing overu při vnášení opačné selektovatelné kazety sacB-neo a zaměnění ssb. Za použití dříve přihlášené metodologie jsme použili primery 1 a 2 pro přípravu 5'-proximální části EcoRI-Xmal kazety, dlouhé 1,5 kb, ležící proti směru přepisu od ssb. Primery 3 a 4 budou použity pro vytvoření 3'-distální části Xmal -EcoRI kazety, dlouhé 1,5 kb, ležící po směru přepisu od ssb; obě kazety dlouhé
1,5 kb budou spolu spojeny a vytvoří 3 kb dlouhý fragment EcoRI, obsahující přesně uprostřed kazety jedinečné Xmal místo. Kazeta sac-neo může být nyní snadno vložena do Xmal místa, čímž bude ukončena konstrukce mutagenizační kazety, která bude vložena do pCON (popsaný dříve v naší první přihlášce). Vyžadovaná komplementační ssb-1 kazeta bude konstruována pomocí primerů 5 a 6 jako kazeta Λ/bel pro zaměnění markérů lékové rezistence uvnitř kazet Xbal-Spel v pGEN 211, pGEN 222, pGEN 206, nebo jakékoli pozdější verzi zde podrobně popsaných expresních plazmidů.
Primer 1:
5'-gaattcGCGCGCTTCGCGATTCAGTCGCGTTCCTTCACA GCTGGCGCAGGGGCGATTACTGATGAA -3'
Primer 2:
5-cccggGAGTCTCCTGAATACGTTTCATAAATAGTGTAA ACGCGTGAGTGTACCATTTCCACGTAGC -3'
Primer 3:
5-cccggGTAAAAAACTCAAAGCGTTATTTGCATTTTCGC TATAGTTCTCGTCTGCTGAAATGCCTGGTGT -3' • · · · ·· · · · · ···· ··· » · · • · · · · · · · · · 9
Primer 4:
5'-gaattcCATTTCTATCAATAAATTACTATTAGTTTTGTCT TCTAACCAAGCCTCTATTTTATGAGTATCCTCTTCAG-3'
Primer 5:
5-gctagcATGGCCAGCAGAGGCGTAAACAAGGTGATTCT CGTTGGTAATCTGGGCCAGGACCCGGAAGTACGC -3'
Primer 6:
5'-gctagcTCAGAACGGAATGTCGTCGTCAAAATCCATTG GCGGTTCGTTAGACGGCGCTGGCGCG -3'
Příklad 6: Stabilita expresních plazmidů v nepřítomnosti selekce.
Aby byl vyvinut nekatalytický systém udržující plazmid pro zvýšení stability expresních plazmidů s velkým počtem kopií, kódujících cizí antigeny v CVD 908-htr, byly započaty pokusy, sledující stabilitu plazmidu pomocí kvantifikace exprese GFPuv pomocí průtokové cytometrie, když byly kmeny pasážovány v nepřítomnosti selekce antibiotikem. Tyto pokusy byly navrženy tak, aby položily tři základní otázky: 1) Jaký je vliv indukční hladiny P^pci na stabilitu plazmidu kódujícího heterologní antigen, jako je GFPuv? 2) Jaký je vliv počtu kopií na stabilitu plazmidu exprimujícího GFPuv? 3) Jak udržující funkce hok-sok, par a parA ovlivňují udržení plazmidu a to jak jako jednotlivé složky, tak ve vzájemné spolupráci?
Počáteční pokusy s průtokovou cytometrií byly provedeny s CVD 908-htrA, nesoucím replikony s počátky replikace buď oriE1, ori15A nebo ori101. Rychle bylo zjištěno, že replikony nesoucí vyšší počet kopií onE1 počátků replikace byly velmi nestabilní, dokonce i když kmeny rostly v přítomnosti antibiotikové selekce. Výsledky průtokové cytometrie naznačovaly, že dokonce i při růstu v přítomnosti karbenicilinu, procento bakteriálních populací, které dále neexprimovaly detekovatelný GFPuv, sahaly od přibližně 50 % u pGEN71 (obsahující hok-sok) a pGEN84 (hok-sok+par) do 62 % u pGEN211 (hok-sok+par+parA). Protože je jasné, že replikony obsahující počátek replikace or/E1 nedovolují optimální syntézu heterologního testovacího antigenu GFPuv ve většině rostoucích populací živých bakteriálních vektorů, tato série expresních plazmidů nebyla dále zkoumána.
Potom byly zkoumány CVD 908-htrA, obsahující expresní plazmidy s počátkem replikace or/15A. Kmeny byly očkovány do 25 ml kultur 1x LB + DHB (bez selekce *♦ ·· ·· ·· · • ♦ ··· · · · · ·· 9 · ··· · « « • · · · · · « « » ·♦ ·· ·· · · ··· antibiotiky), obsahujících buď 50 mM, 150 mM nebo 300 mM NaCI. Kultury byly inkubovány po dobu 24 hodin při 37 °C a 250 otáčkách za minutu, zředěny 1:1000 do čerstvého média o stejné osmolaritě a inkubovány po dalších 24 hodin; u vzorků ze všech kultur byla analyzována úroveň syntézy GFPuv pomocí průtokové cytometrie. Výsledky u první pasáže v nepřítomnosti selekce jsou uvedeny v tabulce 6 a histogramy reprezentující tyto údaje jsou ukázány na obrázku 8.
Tabulka 6 ukazuje stabilitu replikonů s počátkem replikace or/15A v CVD 908htrA, který obsahuje systémy pro udržování plazmidu o zvyšující se složitosti, pěstované bez selekce a v přítomnosti zvyšující se osmolarity.1
Tabulka 6
Kmen2 50 mM NaCI 150 mM NaCI 300 mM NaCI
O.D.eoo Procento fluoreskujících bakterií Průměrná intenzita fluorescence O s Q Ó Procento fluoreskujících bakterií Průměrná intenzita fluorescence O. D-600 Procento fluoreskujících bakterií Průměrná intenzita fluorescence
CVD QOQ-htrA 0,98 100 0,6 1,11 100 0,6 1,12 100 0,6
pGEN91 1,00 13,2 28,6 1,17 11,4 42,9 1,26 10,9 65,5
pGEN111 1,26 47,4 51,8 1,17 28,9 93,6 1,12 42,4 65,1
pGEN121 1,01 80,5 53,3 1,20 73,8 74,0 1,15 56,7 105,3
PGEN193 1,11 71,4 50,9 1,24 65,2 64,7 1,22 53,7 90,8
PGEN222 1,01 96,8 52,1 1,28 93,3 67,8 1,13 95,3 89,2
1Tyto údaje jsou uvedeny jako histogramy v obrázku 8.
2 Všechny kmeny byly naočkovány ze zmražených zásobních štoků na 2x LB agar doplněný DHB a 50 μg/ml karbenicilinu a inkubovány po dobu 36 hodin při 30 °C. Izolované kolonie byly spojeny do 300 μΙ 1x LB bujónu doplněného DHB a z toho bylo 25 μΙ naočkováno do 25 ml 1x LB bujónu, obsahujícího DHB a buď 50 mM, 150 mM nebo 300 mM NaCI; kultury byly inkubovány při 37 °C po dobu 24 hodin při 250 otáčkách za minutu. Pro získání výsledků uvedených v této tabulce byly bakterie φ Φ Φ ♦ · ♦ φ · φ · • ··· · ♦ · · · φ φ sedimentovány, resuspendovány v 1 ml PBS pH 7,4 a potom zředěny 1:1000 v PBS pro analýzu pomocí průtokové cytometrie.
Obecně platí, že jak se osmolarita zvyšuje a narůstá indukce Ρ^α, procento populace živého vektoru, které exprimuje GFPuv klesá; nicméně průměrná úroveň intenzity fluorescence vzrůstá tak, jak je očekáváno. Například v přítomnosti 50 mM NaCl 80,5 % populace CVD 908-WrA(pGEN121) exprimuje GFPuv s průměrnou intenzitou fluorescence 53,3. Jak se koncentarce NaCl zvyšuje na 300 mM, procento populace které exprimuje GFPuv klesá na 56,7 %; nicméně průměrná úroveň intenzity fluorescence vzrůstá na 105,3. Avšak je důležité, že u kmenů obsahujících pGEN222 s kompletním systémem pro udržování plazmidu (tj. hok + sok + par + parA), procento populace které exprimuje heterologní antigen zůstává přibližně 95 %, zatímco průměrná intenzita fluorescence se zvyšuje z 52,1 (50 mM NaCl) na 89,2 (300 mM NaCl). Bylo pozorováno, že po dalším pasážování těchto kmenů dalších 24 hodin v nepřítomnosti selekce antibiotiky, méně než 5 % bakterií pokračovalo exprimovat funkční GFPuv. Nátěry těchto kultur na pevné médium před průtokovou analýzou ukazovaly, že nefluoreskující bakterie zůstaly viditelné, ale byly citlivé na selekci antibiotiky. Když byly nefluoreskující bakterie roztříděny a vysety, potvrdilo se že jsou citlivé k antibiotiku a nefluoreskují, když jsou ozářeny ultrafialovým světlem, což ukazuje na ztrátu obsažených plazmidů.
Pasážovací pokus s CVD 908-WrA, obsahujícím expresní plazmidy s počátkem replikace or/101, detekoval nevýznamný pokles exprese GFPuv po pasážování kmenů po dobu 48 hodin bez selekce, a to bez ohledu na osmolaritu. Proto byly kmeny pasážovány v oddělených pokusech po dobu 96 hodin (tj. 4 x 24 hodin) v přítomnosti buď 50, 150 nebo 300 mM NaCl. Populace byly analyzovány pomocí průtokové cytometrie po třech a čtyřech pasážích a výsledky jsou zaznamenány v tabulce 7.
Tabulka 7 ukazuje stabilitu, jakou mají v CVD 908-htrA replikony on’101, které obsahují systémy pro udržování plazmidu o zvyšující se složitosti, při růstu bez selekce a v přítomnosti zvyšující se osmolarity.
Tabulka 7
Kmen (číslo pasáže)1 50 mM NaCI 150 mM NaCI 300 mM NaCI
O.D.600 Procento fluoreskujících bakterií Průměrná intenzita fluorescence § ci ó Procento fluoreskujících bakterií Průměrná intenzita fluorescence O s Q Ó Procento fluoreskujících l bakterií Průměrná intenzita fluorescence
CVD 908-htrA (#3) ND2 100 0,6 ND 100 0,5 ND 100 0,5
CVD 908-htrA (#4) 1,00 100 0,3 1,18 100 0,3 1,19 100 0,3
pGEN132(#3) ND 45,5 29,0 ND 33,2 36,9 ND 81,3 47,3
pGEN 132 (#4) 1,03 10,9 27,8 1,20 7,6 36,1 1,32 51,3 47,5
pGEN142(#3) 1,05 99,5 35,5 1,23 98,9 45,1 1,28 96,5 47,8
pGEN142(#4) 1,17 94,4 38,0 1,29 91,5 45,0 1,33 93,9 47,7
PGEN206 (#3) 1,08 98,1 36,2 1,25 94,5 42,8 1,29 95,2 47,4
pGEN206 (#4) 1,13 80,2 32,6 1,26 68,6 36,6 1,33 93,5 41,3
1 Všechny kmeny byly naočkovány ze zmražených zásobních štoků na 2x LB agar doplněný DHB a 50 gg/ml karbenicilinu a inkubovány po dobu 36 hodin při 30 °C. Izolované kolonie byly spojeny do 300 μΙ 1x LB bujónu doplněného DHB a z toho bylo 25 μΙ naočkováno do 25 ml 1x LB bujónu, obsahujícího DHB a buď 50 mM, 150 mM nebo 300 mM NaCI; kultury byly inkubovány při 37 °C po dobu 24 hodin při 250 otáčkách za minutu (definováno zde jako pasáž #1). Pro pasáž #2 bylo 25 μΙ z pasáže #1 naočkováno do 25 ml (tj zředění 1:1000) stejného média a inkubováno při 37 °C při 250 otáčkách za minutu po dobu dalších 24 hodin bez selekce. Pasáže 3 a 4 byly provedeny totožným způsobem ale poté, co byla následující pasáž provedena, buňky byly sedimentovány, resuspendovány v 1 ml PBS pH 7,4 a potom zředěny 1:1000 v PBS pro analýzu pomocí průtokové cytometrie.
2 ND = neprovedeno
Živé vektory obsahující nestabilizované replikony ori101 nakonec ztratily po 96 hodinách schopnost syntetizovat heterologní antigen. Například po 96 hodinovém růstu v přítomnosti 50 mM NaCI, pouze 10,9 % CVD 908-hfrA(pGEN132) exprimovalo GFPuv a fluoreskovalo. Jak byla koncentrace NaCI v médiu zvýšena na 150 mM, fluorescence ·· 99 99 99
9*99 99« · 9 9 • · Μ «9 999 99
99 999 99 9 · 9 9 byla detekována pouze v 7,6 % populace; při 300 mM NaCI se však překvapivé procento opét zvýšilo na 51,3 % fluoreskujících bakterií. Je pozoruhodné, že CVD 908htrA obsahující buď pGEN142 (hok-sok) nebo pGEN206 (hok-sok + parA) si podržely syntézu GFPuv ve více než 95 % populace po třech pasážích (72 hodin), bez ohledu na osmolaritu (viz tabulka 7). Procento fluoreskujících CVD 908-MrA(pGEN142) zůstalo blízko této úrovně po čtyřech pasážích (96 hodin), zatímco u CVD 908-hřrA(pGEN206) bylo slabě sníženo.
Celkově je možno říci, že tyto údaje ukazují že jak je snižován počet kopií, zvyšuje se zřetelná stabilita plazmidů a schopnost živého vektoru syntetizovat heterologní antigen jako je GFPuv; jak se v daném plazmidu hromadí systémy pro udržování plazmidu, zřetelná stabilita a syntéza antigenu se dále zvyšuje. Dále, jak se indukce Pompc/ a doprovodná produkce heterologního antigenu zvyšuje, procento rostoucí populace, které zůstává schopno syntetizovat antigen může být dramaticky sníženo.
Příklad 7: Bakteriální kmeny a podmínky kultivace.
Všechny konstrukce plazmidů byly získány z kmenů Escherichia coli DH5a nebo DH5aF'IQ (Gibco BRL). Při konstrukci genové kazety hok-sok byla použita matricová DNA pR1 izolovaná ze kmene Escherichia coli J53(pR1), který laskavě věnoval James B. Kaper. Živý vektor S. typhi CVD 908-MrA je auxotrofním derivátem standardního kmene Ty2 s delecemi v aroC, aroD a htrA (Tacket a kol. 1977b). Všechny kmeny použité pro výzkum stability plazmidu byly pěstovány na médiích doplněných kyselinou
2,3-dihydroxybenzoovou (DHB), jak bylo již drive popsáno (Hone a kol. 1991; Galen a kol. 1997). Pokud byly pěstovány na pevném médiu, byly kmeny CVD 908-WrA, nesoucí plazmid, natřeny ze zamraženého zásobního stoku (-70 °C) na 2x agar podle Luria-Bertani, obsahující (na litr) 20 g Bacto tryptonu, 10 g Bacto kvasničného extraktu a 3 g NaCI (2x LB agar) plus karbenicilin v koncentraci 50 pg/ml. Plotny byly inkubovány při 30 °C po dobu 24 až 36 hodin, aby byly získány izolované kolonie asi 2 mm v průměru; kmeny byly inkubovány při 30 °C aby byla minimalizována toxicita exprese GFPuv v CVD 908-WrA.
Pokud byly pěstovány v tekutém médiu, byly kultury inkubovány při 37 °C, při 250 otáčkách za minutu, po dobu 16 až 24 hodin. Aby byla vyzkoušena osmotická indukce promotoru ompC (Pompc) ať již v kmenech E. coli DH5a nebo CVD 908-MrA, ·· 99 ♦· ♦· · ♦··♦ 9 9 9 9 9 99
9 99 9 9 99· 9 9 9 • 9 9 9· 9 9 9 9 · 9 9 9
9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 ·· 99 99 99 99 999 kmeny byly pěstovány v živném bujónu Bacto (Difco), obsahujícím DHB a buď NaCI nebo sacharózu; kultury byly doplněny buď 50 pg/ml karbenicilinu nebo zvyšujícími se koncentracemi kanamycinu, pokud byly zkoušeny kazety Pompc-aphA-2. Pro kvantifikování syntézy GFPuv pomocí průtokové cytometrie bylo 6 až 8 izolovaných kolonií, které byly, jak bylo uvedeno výše, natřeny ze zásobních stoků na 2x LB agar, naočkováno do 25 ml média 1x LB, doplněného 50 pg/ml karbenicilinu tam, kde to bylo požadováno a zvyšujícími se koncentracemi NaCI, aby byla zvýšena indukce promotorů ompC. Kultury byly inkubovány při 37 °C a 250 otáčkách za minutu po dobu 16 až 24 hodin, poté byly sedimentovány a použity pro průtokovou cytometrii, jak je popsáno dále.
Příklad 8: Molekulárně genetické techniky
Pro konstrukci zde uváděných plazmidů byly použity standardní techniky (Sambrook a kol., 1989) Pokud není uvedeno jinak, byla v polymerázových řetězových reakcích (PCR) použita přirozená Taq DNA polymeráza (Gibco BRL). S. typhi byla pro elektroporaci rekombinantních plazmidů připravena po vypěstování v bujónu LB dle Millera (Gibco BRL), doplněném DHB; po sedimentaci bakterií byly buňky 3x promyty sterilní destilovanou vodou, která měla stejný objem jako kultivační médium, a resuspendovány ve sterilní destilované vodě do konečného objemu rovnajícího se 1/100 původního objemu kultury. Elektroporace kmenů byla provedena v přístroji Gene Pulsar (Bio-Rad), nastaveném na 2 500 V, 200 Ω a 25 pF. Po elektroporaci byly bakterie ponechány zotavit v médiu SOC a inkubovány při 37 °C a 250 otáčkách za minutu po dobu 45 minut; poté byly bakterie vysety do 1x LB média obsahujícího DHB plus 50 pg/ml karbenicilinu a inkubovány při 30 °C po dobu 24 hodin. Izolované kolonie byly potom setřeny do dolpněného 2x LB a inkubovány při 30 °C po dobu 16 hodin. Zmražené zásobní štoky byly připraveny tak, že bakterie byly uloženy do média SOC bez dalších doplňků a zmraženy na -70 °C.
Příklad 9: Konstrukce expresních vektorů
V průběhu této práce byly připraveny expresní vektory uvedené v následující tabulce 8.
• · • ·· • 0 • ··· • ··
Tabulka 8
Plazmid Velikost (kb) Odpovídající genotyp Odkaz
pTETn/r15 3,7 or/E1 toxC bia Oxer a kol. (1991)
pJN1 1,9 oriE1 bia Tato práce
pJN2 3,4 or/E1 toxC bia Tato práce
pGFPuv 3,3 pUC19o/7 gfpuv bia C lontech
pGFPompC 3,5 oriE) gfpuv bia Tato práce
pNRB1 3,5 oriE) gfpuv tet A Tato práce
pGEN2 4,2 or/E1 gfpuv tet A hok-sok Tato práce
pGEN3 4,1 or/15 A gfpuv tetA hok-sok Tato práce
pGEN4 5,6 or/101 gfpuv tetA hok-sok Tato práce
pJN5 3,1 oriE) gfpuv bia Tato práce
pJN6 3,7 or/E1 gfpuv tetA hok-sok Tato práce
pJN7 4,1 οηΈΊ gfpuv tetA hok-sok par Tato práce
pJN8 5,4 or/E1 gfpuv tetA hok-sok par A Tato práce
PGEN51 3,6 or/E1 gfpuv bia Tato práce
PGEN71 4,2 or/E1 gfpuv tetA hok-sok Tato práce
PGEN84 4,5 oriE) gfpuv tetA hok-sok par Tato práce
PGEN183 5,9 or/E1 gfpuv tetA hok-sok par A Tato práce
PGEN211 6,2 or/E1 gfpuv tetA hok-sok par par A Tato práce
PGEN91 3,5 οηΊδΑ gfpuv bia Tato práce
PGEN111 4,1 ΟΓ/Ί5Α gfpuv tetA hok-sok Tato práce
PGEN121 4,5 orí15A gfpuv tetA hok-sok par Tato práce
PGEN193 5,8 ori! 5A gfpuv tetA hok-sok par A Tato práce
PGEN222 6,2 oiťI5A gfpuv tetA hok-sok par par A Tato práce
PGEN132 4,8 orrt 01 gfpuv bia Tato práce
PGEN142 5,4 or/101 gfpuv tetA hok-sok Tato práce
PGEN206 7,1 or/101 gfpuv tetA hok-sok par A Tato práce
1) Konstrukce pJN1 a pJN2
Expresní plazmidy konstruované pro tyto studie jsou složeny ze tří základních kazet kódujících 1] expresi heterologního antigenů, 2] počátek replikace plazmidů a 3] selekční a udržovací funkce. Proto byl konstruován základní replikon, ve kterém byly tyto kazety od sebe odděleny jedinečnými restrikčními místy. Primery které byly použity při konstrukci plazmidových kazet jsou uvedeny v následující tabulce 9.
Tabulka 9
□ 1— φ E ΙΟ. o <0 >O Sekvence1 Vytvořená kazeta Přístupové číslo v GenBank Oblast homologie2 Oblast komplementarity3
1 5'-GCAGGAAAGAACATGTGAGCCTAGGGCC AGCAAAAGGCCAGGAAC-3' onE1 J01749 2463- 2507
2 3 5'-CATGACCAAAATCCCTTAACTAGTGTTTT AGATCTACTGAGCGTCAGACCCCG-3' K JJ 31973145
5'-CGGGGTCTGACGCTCAGTAGATCTAAAA CACTAGTTAAGGGATTTTGGTCATG-3' bia JJ 31453197
4 5-GCTGTCAAACATGAGAATTCTAGAAGAC GAAAGGGCCTCGTGATACGCC-3' » 17-1, 43614330
5 5'-ACAGCCTGCAGACAGATCTTGACAGCTG GATCGCACTCTGGTATAATTGGGAAGCCCT GCAAAG-3' aphA-2 V00618 1-64
6 5'-CGAAGCCCAACCTTTCATAGAAGCTAGC GGTGGATCCGAAATCTCGTGATGGCAGGTT G-3' Ji 1044- 968
7 5'-AACAAGCGTTATAGGAATTCTGTGGTAGC A-3' P ompC K00541 4-33
8 5'-ACTTTCATGTTATTAAAGATCTGTTATATG -3' w » 493- 469
9 5'-AGATCTTAATCATCCACAGGAGGCTTTCT GATGAGTAAAGGAGAAGAACTTTTCACTGG -3' gfpuv U62636 289- 317
10 5 '-GCTAGCTCATTATTTGTAGAGCTCATCCA TGC-3' « » 1008- 983
11 5'-AGATCTGAAAACTAGATCATGTTTGACAG CTTATCATCGATAAGCTTTAATGCG-3' tetA J01749 4-41
12 5-AGATCTTATCAGGTCGAGGTGGCCCGGC TCCATGCACCGCGACGCAACGCG-3 ' » » 12751234
13 5 -CGCGAATTCTCGAGACAAACTCCGGGAG GCAGCGTGATGCGGCAACAATCACACGGAT TTC-3' hoksoktetA X05813 2-48
14 5 -ATGAGCGCATTGTTAGATTTCATTTTTTTT TCCTCCTTATTTTCTAGACAACATCAGCAAG GAGAAAGG-3' » J01749 X05813 108-86, 580559
15 5'-CCTTTCTCCTTGCTGATGTTGTCTAGAAA ATAAGGAGGAAAAAAAAATGAAATCTAACAA TGCGCTCAT-3' » X05813 J01749 559580, 86-108
16 5'-GCTACATTTGAAGAGATAAATTGCACTGG ATCCTAGAAATATTTTATCTGATTAATAAGAT GATC-3', or/15A X06403 1461- 1397
17 5-CGGAGATTTCCTGGAAGATGCCTAGGAG 780-
*>· • ·
ATACTTAACAGGGAAGTGAGAG-3' 829
18 5'-GTCTGCCGGATTGCTTATCCTGGCGGAT CCGGTTGACAGTAAGACGGGTAAGCCTGTT GAT-3' or/101 X01654 44904550
19 5'-CCTAGGTTTCACCTGTTCTATTAGGTGTT ACATGCTGTTCATCTGTTACATTGTCGATCT G-3' }} 6464- 6408
20 5 '-AGGCTTAAGTAGCACCCTCGCAAGATCT GGCAAATCGCTGAATATTCCTTTTGTCTCCG AC-3' par X01654 49184858
21 5-GAGGGCGCCCCAGCTGGCAATTCTAGAC TCGAGCACTTTTGTTACCCGCCAAACAAAAC CCAAAAACAAC-3' aphA2parA V00618 X04268 38-16, 1-37
22 5 '-AGAAGAAAAATCGAATTCCAGCATGAAGA GTTTCAGAAAATGACAGAGCGTGAGCAAGT GC-3' X04268 17041644
23 5-CGAAGCCCAACCTTTCATAGAAACTAGTG GTGGAATCGAAATCTCGTGATGGCAGGTTG -3' » V00618 1044- 986
24 5'-GTTGTTTTTGGGTTTTGTTTGGCGGGTAA CAAAAGTGCTCGAGTCTAGAATTGCCAGCT GGGGCGCCCTC-3' » X04268 V00618 37-1, 16-38
1 Příslušná restrikční místa jsou podtržena a uvedena v textu; vazebná místa pro ribozom a místa startu transkripce jsou psána italikou.
2 Odpovídá sekvenci kódujícího vlákna daného genu, k němuž je primer homologní.
3 Odpovídá sekvenci nekódujícího vlákna daného genu, k němuž je primer homologní.
ΡΤΕΤ/7/Π5 (viz tabulku 8; Oxer a kol. 1991) byl předělán tak, že počátek replikace oriE1 a gen bia byly odděleny jedinečným místem Spěl. K tomuto konci byla or/E1 kazeta syntetizována PCR reakcí za použití polymerázy Vent s primery 1 a 2 a jako matrice byl použit pCVD315 (Galen a kol. 1990). Výsledný fragment dlouhý 735 pb vytvořená místa Spěl a fíg/ll ve směru 5' před promotorem, který kontroluje transkripci RNA II a vytvořené místo Avrll, vzdálené od těchto míst 675 bází. Oddělená PCR reakce byla provedena s primery 3 a 4, a byla vytvořena kazeta bia dlouhá 1234 bází, která obsahuje vytvořené místo Xbal, vytvořené ve směru 5' před původním EcoRI místem. Produkty z těchto dvou PCR reakcí byly čištěny na gelu a použity s primery 1 a 4 v překryvné PCR reakci, aby byl získán konečný 1916 bází dlouhý fragment or/E1bla, který byl sám se sebou ligován za vzniku pJN1. Fragment Ρη/Γΐ5 - toxC z pTET7?/r15 byl vyštěpen jako fragment EcoRI (parciální štěpení) - Aval, v němž byl Aval konec zatupen a vložen do mnohočetné klonovací oblasti pSL1180 (Brosius, 1989), štěpené
EcoRI a Stul; tato kazeta byla potom opětně vyštěpena jako fragment EcoRI (parciální štěpení) - Awll, a vložena do pJN1, štěpeného EcoRI a Avrll, čímž byl vytvořen pJN2 (viz tabulka 8).
2) Konstrukce pGFPompC
Aby bylo usnadněno hromadné prohledávání při hledání funkčních, osmoticky regulovaných Pompc alel z Escherichia coli, byla konstruována kazeta aphA-2, kódující rezistenci ke aminoglykozidům neomycinu a kanamycinu (Shaw a kol. 1993). Byla provedena polymerázová řetězová reakce (PCR) za použití primerů 5 a 6 a matrice plB279 (Blomfield a kol. 1991) a byl tak vytvořen produkt dlouhý 1044 pb, z něhož byl vyštěpen fragment aphA-2 BglW-Nhel bez promotoru dlouhý 903 pb, který byl použit pro záměnu kazety Bglll-Nhel toxC, kódující fragment C tetanického toxinu vpTETn/r15. Anaerobně regulovaný promotor PnM5 byl zaměněn EcoRI-8g/ll PompC alelou douhou 459 pb, zkonstruovanou pomocí primerů 7 a 8 za použití chromozomální DNA z E coli DH5a jako matrice, a tím byl vytvořen pKompC. Po tom, co byla potvrzena osmotická indukce tím, že bylo zkoušeno zvyšování rezistence ke kanamycinu při zvyšující se osmolaritě, kazeta aphA-2 byla zaměněna genem gfpuv, kódujícím alelu GFPuv, optimalizovanou na prokaryotické kodony (Clontech; Crameri a kol. 1996). Gen gfpuv byl získán PCR reakcí za použití primerů 9 a 10, přičemž jako matrice byl použit gen pGFPuv a takto připravený fragment Bglll-Nhel dlouhý 751 bází byl vložen do pKompC, čímž byl připraven pGFPompC. Kolonie byly prohledávány na funkční GFPuv a u nejjasněji fluoreskujících kolonií byla potom testována indukce fluorescence zvyšujícími se koncentracemi NaCl. Kazeta PomPci - gfpuv potom byla vyštěpena z pGFPompC jako fragment EcoRl-Nhel a vložena do derivátu pJN2, štěpeného EcoRl-Nhel a vytvořen tak pJJ4.
3) Konstrukce pNRB1, pGEN2, pGEN3 a pGEN4
Pokud se mělo zajistit, aby počet kopií nebyl ovlivněn transkripcí pocházející z promotorů, které se nalézají mimo počátek replikace, bylo nezbytné zabezpečit, aby všechny replikační kazety byly na obou koncích ohraničeny terminátory transkripce. Protože počátek replikace a antigenní kazety pJN2 jsou odděleny trp-A terminátorem, bylo nutné již pouze vložit další jeden terminátor mezi počátek replikace a kazety bia.
• 4 • « •9 •999 ···* * · 4 4 · 44 ·· ♦· ·· 99 9944«
Aby byla v budoucnu usnadněna konstrukce dalších plazmidů, byla vytvořena kazeta teW-T1T2. pYA292 (Galan a kol. 1990) byl napřed štěpen HindW a Bglll, fragment terminátoru T1T2 byl zatupen a vložen vmnohočetné klonovací oblasti plazmidu pBluescript II KA (Stratagene) do Smál místa; když byla určena vhodná orientace, byla tato kazeta opět vyštěpena jako fragment BamHl-Psfl a vložena do plB307 (Blomfield a kol. 1991) štěpeného BamHl-Pstl, a vytvořen tak pJG14. U něho bylo později sekvenční analýzou potvrzeno, že v kazetě došlo k deleci přibližně 100 pb, kterou byla odstraněna polovina terminátoru T2.
Za použití pBR322 jako matrice, byly použity primery 11 a 12 pro syntézu fragmentu tetA Bglll, dlouhého 1291 pb. Tento tetA Bglll fragment byl potom vložen do místa BamHI v pJG14 tak, že transkripce genu tet je ukončena na terminátoru T1T2, a tím byl vytvořen pJG14řeM. Nakonec byla tato kazeta tefA-T1T2 z pJG14teW vyštěpena jako fragment EcoRI-Psfl, ve kterém bylo místo Pstl odstraněno zatupením; výsledný fragment byl vložen do pJJ4, vyštěpen Spěl, zatupen a opětně štěpen EcoRI, aby došlo k záměně kazety bia a vytvořen pNRB1.
Nekatalytickou post-segregační funkcí, která měla být vložena do systémů pro udržování plazmidů u zde popsaných expresních plazmidů, je lokus hok-sok z Rfaktoru pR1, nesoucího mnohočetnou rezistenci k lékům. Počáteční pokusy získat lokus hok-sok po PCR byly neúspěšné. Proto bylo nezbytné použít překryvnou PCR reakci pro vytvoření kazety, v níž je hok-sok transkripčně fúzován ke genu tetA bez promotoru tak, že transkripce započatá z promotoru hok by pokračovala do genu tetA a jejím výsledkem by bylo vytvoření transkriptu, který by kódoval jak Hok, tak rezistenci k tetracyklinu. DNA plazmidu pR1 byla vyčištěna zE. coli J53(pR1), v níž pR1 kóduje rezistenci jak ke karbenicilinu tak k chloramfenikolu. Fragment hok-sok, dlouhý 640 pb, byl syntetizován pomocí primerů 13 a 14; v oddělené PCR reakci byl za použití primerů 15 a 12 a matrice pNRB1 získán 1245 pb dlouhý fragment tetA bez promotoru. Produkty z těchto dvou PCR reakcí byly potom použity v překryvné PCR reakci s primery 12 a 13 a vytvořen konečný fragment hok-sok-tetA, dlouhý 1816 pb. Tento fragment byl vložen jako EcoRl-Sphl fragment do pNRB1, štěpeného EcoRl-Sphl, čímž došlo k obnově genu tetA a vytvoření pGEN1.
Potom byla zkonstruována souprava tří izogenních plazmidů, lišících se pouze v počtu kopií, z nichž by byly odvozeny všechny další expresní plazmidy. Počátek replikace Bglll-Avrll v replikační kazetě v pGEN1 byl zaměněn kazetou Bg/Il-Avrll oriE1 • · ♦ · ··· » · 4 * · ·· · ···· φ « zpJN2 a byl tak vytvořen pGEN2. Replikační kazeta ΟΓ/Ί5Α byla syntetizována PCR reakcí za použití primerů 16 a 17 a matrice pACYC184, čímž byl vytvořen 629 pb dlouhý fragment BamHl-AvrlI, který byl vložen do pGEN2, štěpeného fiamHl-AvrlI a vytvořen tak pGEN3. Nakonec, replikační kazeta ori101 byla syntetizována PCR reakcí za použití primerů 18 a 19 a matrice pSC101, čímž byl vytvořen 1949 pb dlouhý fragment fiamHl-AvrlI, který byl vložen do pGEN2, štěpeného βρ/HI-Avrll a vytvořen tak pGEN4.
4) Konstrukce pJN5, pGEN51, pGEN91 a pGEN132
Základní soubor izogenních expresních plazmidů, do nichž byly postupně přidávány jednotlivé složky systému pro udržování plazmidů, byl složen zpGEN51 (obsahujícího οπΞ1), pGEN91 (obsahujícího ori15A) a pGEN132 (obsahujícího or/101). Základní replikon, z něhož byly tyto tři plazmidy zkonstruovány, byl pJN5, který byl sestaven tak, že byla z pGFPompC vyštěpena kazeta PomPc-gfpuv jako fragment EcoRINhel a byla jí zaměněna kazeta Pn/rt15-toxC v pJN2. Konstrukce pGEN51 byla potom provedena odstraněním replikační kazety z pGEN 2 jako fragment fiamHI a zaměněním počátku replikace vpJN5, štěpeném Bglll a BamHI, čímž byl obnoven gen gfpuv. Konstrukce pGEN91 a pGEN132 byla potom provedena totožným způsobem tak, že byly vystřiženy původní kazety jako fragmenty Ba/nHI zpGEN3, respektive pGEN4 (jako ukázku izogenních plazmidů založených na pGEN91 viz obrázek 7).
5) Konstrukce pJN6, pGEN71, pGEN111 a pGEN142
Lokus hok-sok byl potom vložen jako fragment Xůal-Sa/I do pJN5, štěpeného Xbal a Sa/I, čímž byl znovu obnoven gen gfpuv a vytvořen pJN6 (viz tabulka 2). Konstrukce pGEN71, pGEN111 a pGEN142 byla potom provedena přesně stejně jako u pGEN51, pGEN91 a pGEN132 tak, že byly do pJN6 vloženy ve formě BamHI fragmentů kazety s počátkem replikace z pGEN2, pGEN3, respektive pGEN4.
6) Konstrukce pJN7, pGEN84 a pGEN121
První pokus o konstrukci expresních plazmidů sor/E1 a or/15A, obsahujících systém pro udržování plazmidů, který zahrnuje jak systém post-segregačního zabíjení, tak alespoň jednu funkci zabezpečující rozdělování plazmidů do dceřiných buněk, byl proveden za použití funkce par z pSC101. Fragment BamHl-Sg/ll, dlouhý 377 pb, byl syntetizován pomocí primerů 18 a 20 a s DNA z pSC101 jako matricí; tento fragment byl vložen do pJN6 štěpeného Bglll, čímž byl vytvořen pJN7. Jako v konstrukcích popsaných výše, kazety s počátkem replikace z pGEN2 a pGEN3 byly vyštěpeny ve ·· ·* ·« «« a · · « · <
formě fragmentů BamHI a vloženy do pJN7 štěpeného Sg/ll a BamHI, čímž byly vytvořeny pGEN84, respektive pGEN121.
7) Konstrukce pJN8, pGEN183, pGEN193, pGEN206, pGEN211 a pGEN222
Konečné expresní plazmidy byly konstruovány vnesením lokusu parA pro aktivní rozdělování plazmidů do dceřinných buněk, pocházejícího z pR1. Jako v případě hoksok, počáteční pokusy získat lokus parA po PCR byly neúspěšné. Pro vytvoření kazety aph-parA bylo nezbytné použít překryvnou PCR reakci, v níž jsou geny aph a par transkribovány ve směrech od sebe a odděleny místy Xba\ a Xho\, aby bylo umožněno klonování lokusu parA. Fragment parA dlouhý 1737 pb byl syntetizován pomocí primerů 21 a 22 na matrici pR1 DNA; fragment aphA-2 dlouhý 1737 pb byl získán v oddělené PCR reakci pomocí primerů 23 a 24 na matrici plB279 DNA. Produkty z těchto dvou PCR reakcí byly potom použity v překryvné PCR s primery 22 a 23, čímž byl získán konečný fragment aphA2-parA, dlouhý 2743 pb. Tento fragment byl vložen do pJN6 jako fragment EcoRI-Spel, dlouhý 2703 pb. Kazeta parA byla potom opět vyštěpena jako fragment Xhol a opět vložena do pJN6 štěpeného Xho\, čímž byl obnoven gen gfpuv a vytvořen pJN8.
Plazmidy obsahující systém pro udržování plazmidů, který obsahuje funkci postsegregačního zabíjení hok-sok a parA, byly konstruovány vyštěpením onE1 a ori15A BamHl-Spel kazet zpGEN51, respektive pGEN91, a vložením do pJN8, štěpeného BamHI a Spěl a vytvořen tak pGEN183, respektive pGEN193. Plazmidy obsahující celý soubor udržovacích funkcí hok-sok, par a parA, byly konstruovány vložením kazet s počátkem replikace, které obsahují par, ve formě kazet BamHl-Spel zpGEN84, pGEN121 a pGEN132 do pJN8, štěpeného BamHI a Spěl, a vytvořeny tak pGEN211, pGEN222, respektive pGEN206.
Příklad 10: Kvantifikace GFPuv a udržování plazmidu
Kvantifikace GFPuv a udržování plazmidu byly zjišťovány měřením fluorescence živých vektorů, obsahujících plazmid, pomocí průtokového cytometru a separátoru buněk Epics Elitě ESP (Clontech), který obsahuje argonový laser excitující bakterie při 488 nm a který detekuje emis při 525 nm. Jak bylo popsáno výše, kultury rostoucí v 25 ml 1x LB byly centrifugovány a bakterie byly resuspendovány v 1 ml PBS. Buňky byly před určováním podílu živých buněk a průtokovou analýzou zředěny 1:1000 v PBS. Při procházení bakterií byl použit poměr přímého a bočního rozptýleného světla, měřeného
·· ·· 99 99 •
• · · · • · 9 9 • ··
• · ·· • · 999 9 • 9
·· ·· 99 • t 999
logaritmickými zesilovači. U každého vzorku bylo získáno minimálně 50 000 průchodů při rychlosti sbírání přibližně 3500 průchodů za sekundu. Průměrná intenzita fluorescence pro danou bakteriální populaci byl určen pomocí balíku analytického software od Epics Elitě. Úroveň vlastní fluorescence, určená pomocí kmenů S. typhi CVD 9Q8-htrA a E. coli DH5<x, které neobsahují plazmidy, byla použita pro stanovení údajů pro kvantifikaci jaké procento bakterií v dané populaci exprimuje GFPuv.
Závěry: Z širšího hlediska bylo předmětem výzkumu, představeného v příkladech 6 až 10, zjistit zda je možné vyvinout systém udržování plazmidu pro stabilizaci expresních plazmidů s mnoha kopiemi, které kódují cizí antigeny u kmene živého vakcinačního vektoru S. typhi, bez dalších potřebných modifikací chromozomu. Udržování expresních plazmidů bylo rozšířeno na dvou nezávislých úrovních. Zaprvé byla odstraněna závislost na rovnovážných letálních systémech udržování, které zahrnují katalytické enzymy exprimované z plazmidů s mnoha kopiemi; toho bylo dosaženo tím, že do expresních plazmidů byl vnesen systém post-segregačního zabíjení založený na nekatalytickém plazmidovém systému hok-sok, který pochází z faktoru pR1, nesoucím rezistence proti antibiotikům. Do těchto expresních plazmidů byla vnesena alespoň jedna přirozeně se vyskytující funkce, zajišťující rozdělování plazmidů, aby se potenciálně vyloučila možnost náhodné segregace takových plazmidů, čímž bylo rozšířeno jejich dědění a stabilita.
Třebaže tyto expresní plazmidy byly připravovány s úmyslem nakonec je použít pro expresi imunogenních a ochranných antigenů pro lidský imunní systém, jako testovací antigen byl vybrán GFPuv, protože jako míra stability plazmidů uvnitř živého vektoru může být použito kvantifikování jeho průměrné fluorescence v populaci rostoucích živých vektorů. Všechny expresní plazmidy obsahovaly stejnou kazetu exprimující antigen, kde byla transkripce kontrolována pomocí alely Pompc/, a translace byla optimalizována zabudováním konsenzuálního místa pro vazbu na ribozom. Protože s fluorescencí GFPuv není spojena žádná katalytická aktivita, úroveň intenzity fluorescence měřená pomocí průtokové cytometrie v jednotlivých bakteriích může přímo korelovat s dávkou genu a počtem kopií. Dále použití osmoticky regulovatelného promotoru ompC umožnilo hodnocení stability plazmidu a životaschopnosti živého vektoru, protože zvyšující se osmolarita indukovala vyšší hladiny syntézy GFPuv a pravděpodobně i vyšší úrovně metabolického stresu u živého vektoru. Jak je vidět v tabulce 2, bylo potvrzeno že alela PompC/, sestavená pro tato studia odpovídala na • « *
zvyšování osmolarity; když řídila expresi genu aph-2 pro rezistenci, rezistence k méně než 50 pg kanamycinu na mililitr byla pozorována v nepřítomnosti osmotického tlaku, avšak rezistence se zvýšila na více než 800 pg kanamycinu na mililitr v přítomnosti 300 mM NaCl. Bylo překvapující, že ačkoli alela Pompci byla sestavena z chromozomálního lokusu E. coli, zdálo se že funguje efektivněji v S. typhi. Úroveň exprese GFPuv v nepřítomnosti indukce byla stejná jak pro DH5a, tak pro CVD 908-htrA (průměrná intenzita fluorescence 4,45 oproti 5,37, tabulka 3). Avšak syntéza GFPuv se po indukci zvýšila v DH5a o 70 %, zatímco v CVD 908-M/A vzrostla o více než 300 % (průměrná intenzita fluorescence 7,69 oproti 23,4). Tento efekt nebyl omezen na alelu Pampci, ale byl stejně zřetelný při použití PompC3 (tabulka 3). Tyto údaje nesouhlasí s nedávnými pozorováními Martinez-Flores a kol. (1999), kteří popsali že genová fúze E. coli ompC - lacZ byla exprimována konstitutivné v S. typhi, a že úroveň této konstitutivní exprese byla srovnatelná s indukovanými hladinami v E. coli. Třebaže jsme určili definované místo bodových mutací na 3'-konci naší E. coli alely PompCi, které mohou vysvětlit její osmoticky kontrolované chování v S. typhi CVD 908-WrA, takové mutace nebyly v zjištěny P^ca, která také odpovídá v CVD 908-hřrA na osmolaritu. Mělo by být však poznamenáno, že genetické fúze studované Martinez-Flores a kol. zahrnovaly 1150 pb kontrolní oblasti, umístěné proti směru přepisu od E. coli 5' ompC, zatímco zde konstruované alely PompC zahrnují pouze 459 pb kontrolní oblasti, umístěné v 5'směru od ompC. Nehledě na tuto neshodu je povzbudivé, že nejvyšší hladiny regulované exprese heterologního genu jsou pozorovány v oslabeném kmeni živého vakcinačního vektoru S. typhi.
Potom byly zkoušeny příspěvky několika systémů pro udržování plazmidu ke stabilitě plazmidu v CVD 908-/itrA, rostoucím bez selekce antibiotiky. Žádná kombinace udržovacích funkcí nemohla stabilizovat plazmid obsahující počátek replikace or/E1; ve skutečnosti bylo obtížné tyto konstrukce množit dokonce i bez přítomnosti antibiotik. Tato pozorování zpochybnila princip použití plazmidů z vysokým počtem kopií pro optimalizaci exprese heterologních antigenů v cytoplazmě živých vektorů, založených na S. typhi, strategie která byla až dosud sledována jinými skupinami, zkoumajícími Salmonella jako živé vektory (Covone a kol. 1998).
Vnesení systémů pro udržování plazmidů do plazmidů obsahujících počátek replikace ori15A byl daleko více povzbuzující. Když byly živé vektory obsahující takové plazmidy pasážovány bez selekce po dobu 24 hodin při teplotě 37 °C, účinky různých • ·· kombinací udržovacích funkcí se staly zřejmé. Bez udržovacích funkcí byl replikon or/15A pGEN91 ztracen zvíce než 90 % populace, bez ohledu na úroveň indukce Pompa (viz tabulku 6 a obrázek 8). Po vnesení lokusu post-segregačního zabíjení hoksok do pGEN111, se procento baktérií exprimujících GFPuv za všech indukčních podmínek ztrojnásobilo, což potvrzuje pozorování jiných, že lokus hok-sok zvyšuje stabilitu replikonů Ο/7Ί5Α (Gerdes a kol. 1985; Gerdes, 1988; Gerdes a kol. 1997b). Bylo však stále pozorováno, že bez ohledu na indukční podmínky, více než 50 % bakteriální populace dále nefluoreskuje. Protože bylo potvrzeno, že alespoň část této nefluoreskující populace byla stále životaschopná a postrádala rezistenci proti léku, tyto údaje potvrzují dřívější zprávy (Gerdes a kol. 1986; Wu a Wood, 1994; Pecota a kol. 1997), že přítomnost lokusu post-segregačního zabíjení hok-sok není sama o sobě postačující pro zajištění, aby v rostoucí populaci nevznikaly životaschopné baktérie bez plazmidů.
Jedním možným mechanizmem který umožňuje uniknout vlivu hok-sok, jsou spontánní bodové mutace vznikající uvnitř otevřeného čtecího rámce letálního Hok, které mohou Hok konformačně inaktivovat a tedy umožní, aby došlo ke ztrátě plazmidu bez letálního následku. Tato skutečnost zdůrazňuje požadavek více mechanizmů pro zvýšení stability plazmidů obsažených v rostoucích bakteriích; když je jedna udržovací funkce inaktivována, pravděpodobnost že se současně inaktivuje jiná nezávislá udržovací funkce je zanedbatelně malá. Taková nadbytečnost udržovacích funkcí je opravdu široce rozšířena mezi přirozeně se vyskytujícími plazmidy s nízkým počtem kopií (Nordstrom a Austin, 1989). Například sex faktor F od Escherichia coli obsahuje jednu aktivní funkci pro rozdělování plazmidů (sop) a dva systémy zabíjení (ccd a flm) (Loh a kol. 1988; Golub a Panzer, 1988; Van Melderen a kol. 1994; Niki a Hiraga, 1997). Podobně plazmid pR1, nesoucí rezistenci k lékům, obsahuje aktivní funkci pro rozdělování plazmidů parA a rovněž systém post-segregačního zabíjení hok-sok·, dále nese ještě jiný, nedávno definovaný systém zabíjení kis-kid (Bravo a kol. 1987; Bravo a kol. 1988; Ruiz-Eschevarria a kol. 1995). V této práci ukazujeme, že vložení kompletnějších udržovacích systémů, složených jak z post-segregačního systému, tak ze dvou funkcí pro rozdělování plazmidů, do or/15A replikonů s vysokým počtem kopií, dramaticky zvyšuje stabilitu těchto expresních plazmidů v nepřítomnosti selekce, bez ohledu na podmínky indukce pro expresi heterologního antigenů. Avšak po pasážování bez selekce po dobu 48 hodin byly plazmidy nakonec z bakteriální populace ztraceny,
tím, že unikly letálnímu účinku Hok. Na tento problém se nedávno zaměřili Pecota a kol. (1997) kteří oznámili, že zabudování dvojitých systémů zabíjení významně zvýšilo stabilitu plazmidu ve srovnání s použitím systému hok-sok samotného; v těchto plazmidech nebyly přítomny žádné funkce pro rozdělování plazmidů. Pro optimální stabilitu expresních plazmidů s vysokým počtem kopií v živých vektorech S. typhi může být snad vyžadováno zahrnutí systému zabíjení kis-kid, aby byly více napodobeny stabilizační funkce v pR1; jakmile byly nedávno zkonstruovány kazety phd-doc PSK, testovali jsme také slučitelnost této PSK funkce v našich expresních plazmidech pGEN211, pGEN222, a pGEN206.
Porovnání kmenů obsahujících pGEN121 (or/15A replikon obsahující hok-sok + par, -15 kopií na chromozomový ekvivalent) s plazmidem pGEN142 o mnohem nižším počtu kopií (0/7’101 replikon obsahující hok-sok + par, ~5 kopií na chromozomový ekvivalent) ukazuje, že za podmínek maximální indukce PompCi s 300 mM NaCI, 57 % populace CVD 908-/rtrA(pGEN121), pasážovaný pouze po dobu 24 hodin bez selekce, fluoreskuje s průměrnou intenzitou fluorescence 105,3; u populace CVD 908M/A(pGEN142), pasážovaného po dobu 96 hodin bez selekce za stejných indukčních podmínek, 94 % bakterií analyzovaných pomocí průtokové cytometrie si stále udržuje průměrnou intenzitu fluorescence 47,7. Na základě takovýchto výsledků s GFPuv jako testovacím antigenem, je lákavé spekulovat že optimální úroveň heterologního antigenů, předložená oslabeným živým vakcinačním vektorem založeným na S. typhi lidskému imunnímu systému může být dosažena snížením počtu kopií obsaženého expresního plazmidu, snad na 5 kopií na chromozomový ekvivalent.
Účinnost vyvolání imunní odpovědi, namířené proti heterolognímu antigenů bude záviset částečně na schopnosti živého vektoru prezentovat takové antigeny imunnímu systému. Schopnost živého vektoru prezentovat antigeny bude záviset na stabilitě expresních plazmidů s vysokým počtem kopií, které kódují heterologní antigeny. Naše výsledky ukazují, že vnesení systému pro udržování plazmidu do expresních plazmidů s vysokým počtem kopií, bez další genetické manipulace s živým vektorem, zvyšuje stabilitu takových expresních plazmidů. Avšak přítomnost plazmidů s vysokým počtem kopií může také ovlivnit metabolickou zdatnost živého vektoru. To je významné, protože některé cizí antigeny, o které se jedná, vykazují na živý vektor škodlivý vliv.
Ačkoli nemáme v úmyslu být vázáni touto teorií, uzavíráme že na CVD 908-htrA, který obsahuje expresní plazmidy s vysokým počtem kopií, působí významná • · · · metabolická zátěž; jak se počet kopií a/nebo úroveň genové exprese zvyšují, zvyšuje se i metabolická zátěž. Studie s E. coli jasně stanovila, že bakterie obsahující plazmidy rostou pomaleji než bakterie bez plazmidů (Boe a kol. 1987; McDermott a kol. 1993; Wu a Wood, 1994; Pecota a kol. 1997; Summers, 1998). Bylo také ukázáno, že jak se zvyšuje počet kopií, rychlost růstu se u takových kmenů snižuje; podobně platí, že jak se indukce heterologních kmenů zvyšuje, rychlost růstu se dále snižuje (Wu a Wood, 1994; Pecota a kol. 1997). Je jasné, že spontánní ztráta plazmidu by odstranila jakoukoli metabolickou zátěž a umožnila bakteriím bez plazmidů rychle přerůst bakterie obsahující plazmidy. V elegantních studiích Wu a Wood (Wu a Wood, 1994) ukázali, že kmeny E. coli obsahující plazmidy si plazmidy udržely za podmínek, kdy exprese klonovaných genů byla nízká po dobu 100 hodin, kdy byly pasážovány za nepřítomnosti selekce; naopak za podmínek maximální indukce nastala ztráta plazmidu během 10 hodin. Je zajímavé, že když do těchto expresních plazmidů byl vložen lokus hok-sok, plazmidy byly udrženy za neindukčních podmínek po dobu 300 hodin a za indukčních podmínek po dobu 30 hodin. Dá se očekávat, že takový posun v expresi antigenů v populaci živého bakteriálního vektoru by snížil účinnost stimulace jakékoli imunitní odpovědi, specifické k cizímu antigenů. Naše analýza nás vede k závěru, že cestou k dosažení účinného multivalentního živého vakcinačního vektoru založeného na S. typhi, je optimalizovat životaschopnost pomocí stabilizovaných expresních vektorů s nízkým počtem kopií, schopných exprimovat vysoké hladiny heterologního antigenů jako odpověď na signál z prostředí, se kterým se setkají in vivo poté, co vakcinační organizmus dosáhne vhodné ekologické niky. V současné době testujeme tuto strategii za pomoci myšího intranazálního modelu, abychom zjistili imunogenitu fragmentu C tetanického toxinu exprimovaného v CVD 908-htrA našimi expresními vektory pGEN211 (or/E1), pGEN222 (on'15A) a pGEN206 (on'101), přičemž všechny tři obsahují stejné systémy pro udržování plazmidu a liší se pouze počtem kopií. Zde uvedená práce umožňuje vývoj jednodávkových, orálně podávaných živých vakcinačních vektorů založených na S. typhi, schopných indukovat ochranné imunní odpovědi proti mnoha nepříbuzným lidským patogenům.
• · ···· ··· ··· • · ·· · · ··· · I »··· · · · · · · ·· ·· ·· ·· ·· ·
Odkazy
Výsledky z následujících odkazů jsou zde zahrnuty ve své úplnosti:
Acheson, D.W.K. 1998. Nomenclature of enterotoxins. Lancet 351:1003.
Acheson, D.W.K., M.M. Levine, J.B. Kaper, and G.T. Keusch. 1996. Protective immunity to Shiga-like toxin l following oral immunization with Shiga-like toxin I B-subunit-producing Vibrio cholerae CVD 103-HgR. Infection and Immunity 64:355.
Austin, S. J. 1988. Plasmid partition. Plasmid 20:1.
Austin, S., S. Friedman, and D. Ludtke. 1986. Partition functions of unit-copy plasmids can stabilize the maintenance of plasmid pBR322 at low copy number. J Bacteriol 168: 10101013.
Barry, E.M., O.G. Gomez-Duarte, S. Chatfield, R. Rappuoli, M. Pizza, G. Losonsky, J.E. Galen, and M.M. Levine. 1996. Expression and immunogenicity of pertussis toxin S1 subunit-tetanus toxin fragment C fusions in Salmonella typhi vaccine strain CVD 908. Infection and Immunity 64:4172-4181
Barth, P.T., H. Richards, and N. Datta. 1978. Copy numbers of coexisting plasmids in Escherichia coli K-12. J Bacteriol 135: 760-765.
Bašt, D.J., J.L. Brunton, M.A. Karmali, and S.E. Richardson. 1997. Toxicity and immunogenicity of a verotoxin 1 mutant with reduced globotriaosylceramide receptor binding in rabbits. Infection and immunity 65:2019.
Baumler, A.J., J.G. Kusters, I. Stojiljkovic, and F. Heffron. 1994. Salmonella typhimurium loci involved in survival within macrophages. Infection and Immunity 62:1623.
Beaucage, S.L., C.A. Miller, and S.N. Cohen. 1991. Gyrase-dependent stabilization of pSC101 plasmid inheritance by transcriptionally active promoters. EMBOJ 10: 2583-2588.
Biattner, F.R., G. Plunkett III, C.A. Bloch, N.T. Perná, V. Burland, M. Riley, J. Collado-Vides, J.D. Glasner, C.K. Rode, G.F. Mayhew, J. Gregor, N.W. Davis, H.A. Kirkpatrick, M.A. Goeden, D.J. Rose, B. Mau, and Y. Shao. 1997, The complete genome sequence of Escherichia coli K-12. Science 277:1453.
Blomfield, I.C., V. Vaughn, R.F. Rest, and B.l. Eisenstein. 1991. Allelic exchange in Escherichia coli using the Bacillus subtilis sacB gene and a temperature-sensitive pSC101 replicon. Molecuiar Microbiology 5:1447-1457.
Boe, L. and K.V. Rasmussen. 1996. Suggestions as to quantitatíve measurements of plasmid loss. Plasmid 36:153.'
Boe, L., K. Gerdes, and S. Molin. 1987. Effects of genes exerting growth inhibition and plasmid stability on plasmid maintenance. Joumal of Bacteriology 169:4646-4650.
Bokman, S.H. and W.W. Ward. 1981. Renaturation ofAequorea green-fluorescent protein. Biochemical and Biophysical Research Communications 101:1372.
Bosworth, B.T., J.E. Samuel, H.W. Moon, A.D. O’Brien, V.M. Gordon, and S.C. Whipp. 1996. Vaccination with genetically modified Shiga-like toxin Ile prevents edema disease in swine. Infection and Immunity 64:55.
Bouvier, J., C. Richaud, W. Higgins, O. Bogler, and P. Stragier. 1992. Cloning, characterization, and expression of the dapE gene of Escherichia coli. Joumal of Bacteriology 174:5265.
Boyd, B. and C.A. Lingwood. 1989. Verotoxin receptor glycolipid in human renal tissue. Nephron 51:207.
Bravo, A., G. de Torrontegui, and R. DÍaz. 1987. Identification of components of a new stability systém of plasmid R1, ParD, that is close to the origin of replication of this plasmid. Mol Gen Genet210: 101-110.
Bravo, A., S. Ortega, G. de Torrontegui, and R. Diaz. 1988. Killing of Escherichia coli celíš modulated by components of the stability systém parD of plasmid R1. Mol Gen Genet 215: 146-151.
Brosius, J. 1989. Superpolylinkers in cloning and expression vectors. DNA 8: 759-777.
Butterton, J.R., E.T. Ryan, D.W. Acheson, and S.B. Calderwood. 1997. Coexpression of the B subunit of Shiga toxin 1 and EaeA from enterohemorrhagic Escherichia coli in Vibrio cholerae vaccine strains. Infection and Immunity 65:2127-2135
Cabello, F., K. Timmis, and S.N. Cohen. 1976. Replication control in a composite plasmid constructed by in vitro linkage of two distinct replicons. Nátuře 259: 285-290.
Calderwood, S.B., D.W.K. Acheson, G.T. Keusch, T.J. Barrett, P.M. Griffin, N.A. Strockbine, B. Swaminathan, J.B. Kaper, M.M. Levine, B.S. Kaplan, H. Karch, A.D. O'Brien, T.G. Obrig, Y. Takeda, P.l. Tarr, and I.K. Wachsmuth. 1996. Proposed new nomenclature for SLT (VT) family. ASM News 62:118.
Calderwood, S.B., F. Auclair, A. Donohue-Rolfe, G.T. Keusch, and J.J. Mekalanos. 1987. Nucleotide sequence of the Shiga-like toxin genes of Escherichia coli. Proceedings of the National Academy of Sciences USA 84:4364.
Carlinl, L.E., R.D. Porter, U. Curth, and C. Urbanke. 1993. Viability and preliminary in vivo characterization of site-specific mutants of Escherichia coli single-stranded DNA-binding protein. Molecular Microbiology 10:1067.
Carter, P.B. and F.M. Collins. 1974. Growth of typhoid and paratyphoid bacilli in intravenously infected mice. Infection and Immunity 10:816.
Cerin, H. and J. Hackett. 1989. Molecular cloning and analysis of the incompatibility and partition functions of the virulence plasmid of Salmonella typhimurium. Microbial Pathogenesis 7:85.
Cerin, H. and J. Hackett. 1993. The parVP region of the Salmonella typhimurium virulence plasmid pSLT contains four loci required for incompatibility and partition. Plasmid 30:30.
Chalfie, Μ., Y. Tu, G. Euskirchen, W.W. Ward, and D.C. Prasher. 1994. Green fluorescent protein as a markér for gene expression. Science 263:802.
« 0
Chambers, S.P., S.E. Prior, DJL Barstow, and N.P. Minton. 1988. The pMTLn/c cloning vectors. I. Improved pUC polylinker regions to facilitate the use of sonicated DNA for nucleotide sequencing. Gene 68:139.
Chang, A.C.Y., and S.N. Cohen. 1978. Construction and characterization of amplifiablé multicopy DNA cloning vehicles derived from the P15A cryptic miniplasmid. J Bacteriol 134: 1141-1156.
Chase, J.W. and K.R. Williams. 1986. Single-stranded DNA binding proteins required for DNA replication. Annual Reviews in Biochemistry 55:103.
Chase, J.W., J.B. Murphy, R.F. Whittier, E. Lorensen, and J.J. Sninsky. 1983.
Amplification of ssb-1 mutant single-stranded DNA-binding protein in Escherichia coli. Joumal of Molecular Biology 163,164:193.
Chatfield, S., K. Strahan, D. Pickard, I.G. Charles, C.E. Hormaeche, and G. Dougan. 1992. Evaluation of Salmonella typhimuríum strains harbouring defined mutations in htrA and aroA in the murine salmonellosis model. Microbial Pathogenesis 12.145.
Clark, C., D. Bašt, A.M. Sharp, P.M. St.Hilaire, R. Agha, P.E. Stein, E.J. Toone, R.J.
Read, and J.L. Brunton. 1996. Phenylalanine 30 plays an important role in receptor binding of verotoxin-1. Molecular Microbiology 19 :891.
Conradi, H. 1903. Ueber losliche,durch aseptische autolyse erhaltene giftstoffe von ruhrund Typhusbazillen. Dtsch. Med. Wochenschr. 29:26.
Covarrubias, L., L. Cervantes, A. Covarrublas, X. Soberon, I. Vichido, A. Blanco, Y.M. Kupersztoch -Portnoy, and F. Bolivar. 1981. Construction and characterization of new cloning vehicles. V. Mobilization and coding properties of pBR322 and several deletion derivatives including pBR327 and pBR328. Gene 13: 25-35.
Covone, M.G., M. Brocchi, E. Palla, W.D. da Silveira, R. Rappuoli, and C.L. Galeotti. 1998. Levels of expression and immunogenicity of attenuated Salmonella enterica serovar typhimuríum strains expressing Escherichia coli mutant heat-labile enterotoxin. Infection and ímmunity 66:224-231
Crameri, A., E.A. Whitehorn, E. Tate, and W.P. Stemmer. 1996. Improved green fluorescent protein by molecular evolution using DNA shuffling. Nat Biotechnol 14: 315-319.
Dam, M. and K. Gerdes. 1994. Partitioning of plasmid R1: ten direct repeats flanking the parA promotér constitute a centromere-like partition site parC, that expresses incompatibility. Joumal of Molecular Biology 236:1289-1298.
Dopf, J. and T.M. Horiagon. 1996. Deletion mapping of the Aequorea victoría green fluorescent protein. Gene 173:39.
Downes, F.P., T.J. Barrett, J.H. Green, C.H. Aloisio, J.S. Spika, N.A. Strockbine, and
I.K. Wachsmuth. 1988. Affinity purificatíon and characterization of Shiga-like toxin II and production of toxin-specific monoclonal antibodies. Infection and ímmunity 56:1926.
Egger, L. A., H. Park, and M. Inouye. 1997. Signál transduction via the histidyl-aspartyl phosphorelay. Genes to Celíš 2:167.
Endo, Y., K. Tsurugi, T. Yutsudo, Y. Takeda, T. Ogasawara, and K. igarashi. 1988. Site of action of a Věro toxin (VT2) from Escherichia coli O157:H7 and of Shiga toxin on eukaryotic ribosomes: RNA N-glycosidase activity of the toxins. European Journal of Biochemistry 171:45.
Forrest, B.D., J.T. Labrooy, S.R. Attridge, G. Boehm, L. Beyer, R. Morona, D.J.C. Shearman, and D. Rowley. 1989. Immunogenicity of a candidate live oral typhoid/cholera hybrid vaccine in humans. J. Infect. Dis. 159: 145.
• · · · ·· · · ♦ · ♦ · ♦ · » · · ·«· · · ··· · · ·♦ · · · · · ·
Fraser, M.E., M.M. Chernala, Y.V. Kozlov, and M.N.G. James. 1994. Crystal structure of the holotoxin tram Shigella dysenteriae at 2.5 A resolution. Nátuře Structural Biology 1:59.
Galan, J.E., K. Nakayama, and R. Curtiss III. 1990. Cloning and characterization of the asd gene of Salmonella typhimuríum: use in stable maintenance of recombinant plasmids in Salmonella vaccine strains. Gene 94:29-35.
Galen, J.E. and M.M. Levine. 1995. Improved suicide vectors for chromosomal mutagenesis in Salmonella typhi. Abstracts of the Annual Meeting of the Američan Society of Microbiology /7192:(Abstract)
Galen, J.E. and M.M. Levine. 1996. Further refinements of suicide vector-mediated chromosomal mutagenesis in Salmonella typhi. Abstracts ofthe Annual Meeting of the Američan Society of Microbiology H260:(Abstract)
Galen, J. E., O.G. Gomez-Duarte, G. Losonsky, J.L. Halpern, C.S. Lauderbaugh, S. Kaintuck, M.K. Reymann, and M.M. Levine. 1997. A murine model of intranasal immunization to assess the immunogenicity of attenuated Salmonella typhi live vector vaccines in stimulating sérum antibody responses to expressed foreign antigens. Vaccine 15:700-708.
Galen, J.E., E.R. Vimr, L. Lawrisuk, and J.B. Kaper. 1990. Cloning, sequencing, and expression of the gene, nanH, for Vibrio cholerae neuraminidase. In Advances in research on cholera and related diarrheas (Edited by Sack R. B. and Zinnake Y. Tokyo: KTK Scientific Publishers. pp. 143-153.
Gay, P., D. Le Coq, M. Steinmetz, E. Ferrari, and J.A. Hoch. 1983. Cloning structural gene sacB, which codes for exoenzyme levansucrase of Bacillus subtilis: expression of the gene in Escheríchia coli. Journal of Bacteríology 153:1424.
Gerdes, K. 1988. The parB (hok-sok) locus of plasmid R1: a generál purpose plasmid stabilization systém. Bio/Technology 6: 1402-1405.
Gerdes, K. and S. Molin. 1986. Partitioning of plasmid R1: structural and functional analysis oftheparA locus. Journal of Molecular Biology 193.269.
Gerdes, K., A.P. Gultyaev, T. Franch, K. Pedersen, and N.D. Mikkelsen. 1997. Antisense RNA-regulated programmed cell death. Annual Reviews in Genetics 31:1-31.
Gerdes, K., J.S. Jacobsen, and T. Franch. 1997b. Plasmid stabilization by postsegregational killing. GenetEng(NY) 19: 49-61.
Gerdes, K., J.E. Larsen, and S. Molin. 1985. Stable inheritance of plasmid R1 requires two different loci. J Bacteríol 161: 292-298.
Gerdes, K., P.B. Rasmussen, and S. Molin. 1986. Unique type of plasmid maintenance function: postsegregational killing of plasmid-free cells. Proč Nati Acad Sci USA 83: 3116-3120.
Gerichter, C.B. 1960. The dissemination of Salmonella typhi, S. paratyphi A, and S. paratyphi B through the organs of the white mouše by oral infection. Journal ofHygiene, Cambridge 58:307.
Gerichter, C.B. and D.L. Boros. 1962. Dynamics of infection of the blood stream and internal organs of white mice with Salmonella typhi by intraperitoneal injection. Journal of Hygiene, Cambridge 60:311.
Golub, E.I., and H.A. Panzer. 1988. The F factor of Escheríchia coli carrieš a locus of stable plasmid inheritance stm, similar to the parB locus of plasmid R1. Mol Gen Genet 214: 353357.
·· · · · · · · • · · · · · · · · · • ··· · ···· *φ • · · · · · · · · * ·« • · · · · · · · ·· • · 99 9 · · · <·.·
Gomez-Duarte, O.G., J.E. Galen, S.N. Chatfield, R. Rappuoli, L. EídeJs, and M.M. Levine. 1995. Expression of fragment C of tetanus toxin fused to a carboxyl-terminal fragment of diphtheria toxin in Salmonella typhi CVD 908 vaccine strain. Vaccine 13:1596.
Gonzalez, C., D.M. Hone, F. Noriega, C.O. Tacket, J.R. Davis, G. Losonsky, J.P. Nataro, S. Hoffman, A. Malík, E. Nardin, M. Sztein, D.G. Heppner, T.R. Fouts, A. Isibasi, and M.M. Levine. 1994. Salmonella typhi vaccine strain CVD 908 expressing the circumsporozoite protein of Plasmodium falciparum: strain construction and safety and immunogenicity in humans. Joumal of Infectious Diseases 169:927-931.
Gordon, V.M., S.C. Whipp, H.W. Moon, A.D. 0'Brien, and J.E. Samuel. 1992. An enzymatic mutant of Shiga-like toxin li variant is a vaccine candidate for edema disease of swine. Infection and Immunity 60:485.
Gottesman, S., W.P. Clark, V. de Crecy-Lagard, and M.R. Maurizi. 1993. ClpX, an alternativě subunit for the ATP-dependent Clp protease of Escheríchia coli. Joumal of Biological Chemistry 268:22618.
Green, J. Μ., B.P. Nichols, and R.G. Matthews. 1996. Folate biosynthesis, reduction, and polyglutamylation. In Escheríchia coli and Salmonella: Cellular and molecular biology. 2nd ed. F.C. Neidhardt, R. Curtiss lil, J.L. Ingraham, E.C.C. Lin, K.B. Low, B. Magasanik, W.S. Reznikoff, M. Riley, M. Schaechter and H.E. Umbarger, eds. ASM Press, Washington,D.C. p. 665.
Griffin, P.M. 1995. Escheríchia coli O157:H7 and other enterohemorrhagic Escheríchia coli. In Infections of the gastrointestinal tract. M.J. Blaser, P.D. Smith, J.l. Ravdin, H.B. Greenberg and R.L. Guerrant, eds. Raven Press, Ltd, NewYork, p. 739.
Gyles, C.L. 1992. Escheríchia coli cytotoxins and enterotoxins. Canadian Joumal of Microbiology 38:734.
Heim, R., D.C. Prasher, and R.Y. Tsien. 1994. Wavelength mutations and posttranscriptiona! autoxidation of green fluorescent protein. Proceedings ofthe National Academy of Sciences USA 91:12501.
Hiszczynska-Sawicka, E., and J. Kur. 1997. Effect of Escheríchia coli IHF mutations on plasmid p15A copy number. Plasmíd 38: 174-179.
Hoiseth, S.K. and B.A. Stocker. 1981. Aromatic-dependent Salmonella typhimuríum are non-virulent and effective as live vaccines. Nátuře 291:238.
Hone, D.M., A.M. Harris, S. Chatfield, G. Dougan, and M.M. Levine. 1991. Construction of genetically defined double aro mutants of Salmonella typhi. Vaccine 9: 810-816.
Hovde, C.J., S.B. Calderwood, J.J. Mekalanos, and R.J. Collier. 1988. Evidence that glutamic acid 167 is an active-site residue of Shiga-like toxin I. Proceedings ofthe National Academy of Sciences USA 85:2568.
Jackson, M.P., E.A. Wadolkowski, D.L. Weinstein, R.K. Holmes, and A.D. 0'Brien.
1990. Functional analysis of the Shiga toxin and Shiga-like toxin type II variant binding subunits by using site-directed mutagenesis. Joumal of Bacteriology 172:653.
Jackson, M.P., R.J. Neill, A.D. O'Brien, R.K. Holmes, and J.W. Newland. 1987. Nucleotide sequence analysis and comparison of the structural genes for Shiga-like toxin I and Shiga-like toxin II encoded by bacteriophages from Escheríchia coli. FEMS Microbiology Letters 44:109.
Jackson, M.P., R.L. Deresiewicz, and S.B. Calderwood. 1990. Mutationalanalysisofthe Shiga toxin and Shiga-like toxin II enzymatic subunits. Joumal of Bacteriology 172:3346.
Jarvis, K.G. and J.B. Kaper. 1996. Secretion of extracellular proteins by enterohemorrhagic Escheríchia coli via a putative type III secretion systém. Infection and Immunity 64:4826.
• 9 • ·
Jarvis, K.G., J.A. Giron, A.E. Jerse, T.K. McDaniel, M.S. Donnenberg, and J.B. Kaper.
1995. Enteropathogenic Escherichia colicontains a putative type III secretion systém necessary for the export of proteins involved in attaching and effacing lesion formation. Proceedings ofthe National Academy of Sciences USA 92:7996.
Jensen, R.B. and K. Gerdes. 1995. Programmed cell death in bacteria: proteic plasmid stabilization systems. Molecular Microbiology 17:205.
Jensen, R.B. and K. Gerdes. 1997. Partitioning of plasmid R1. The ParM protein exhibits ATPase activity and interacts with the centromere-like ParR-parC complex. Journal of Molecular Biology 269:505-513.
Karem, K.L., S. Chatfield, N. Kuklin, and B.T. Rouse. 1995. Differential induction of carrier antigen-specific immunity by Satmonella typhimurium live-vaccine strains after single mucosal or intravenous immunization of BALB/c mice. Infection and Immunity 63:4557-4563.
Karmali, M.A. 1989. Infection by verocytotoxin-producing Escherichia coli. Clinical Microbiological Fteviews 2:15.
Karmali, M.A., M. Petric, C. Lim, P.C. Fleming, and B.T. Steele. 1983. Escherichia coli cytotoxin, haemolytic-uraemic syndrome, and haemorrhagic colitis. Lancet //:1299.
Karmali, M.A., M. Petric, C. Lim, P. C. Fleming, G.S. Arbus, and H. Lior. 1985. The association between idiopathic hemolytic uremic syndrome and infection by verotoxin-producing Escherichia coli. Joumal of Infectious Diseases 151:775.
Karpman, D., H. Connell, M. Svensson, F. Scheutz, P. Alm, and C. Svanborg. 1997. The role of lipopolysaccharide and Shiga-like toxin in a mouše model of Escherichia coli O157:H7 infection. Joumal of Infectious Diseases 175:611.
Keusch, G.T., G.F. Grady, L.J. Mata, and J. Mclver. 1972. Pathogenesis of shigella diarrhea. 1. Enterotoxin production by Shigella dysenteriae 1. Journal of Clinical Investigation 51:1212.
Killeen, K.P., V. Escuyer, J.J. Mekalanos, and R.J. Collier. 1992. Reversion of recombinant toxoids: mutations in diphtheria toxin that partially compensate for active-site deletions. Proceeding ofthe NationalAcademy of Sciences USA 69:6207.
Kim, J.Y., H.A. Kang, and D.D. Ryu. 1993. Effects oftheparlocus on the growth rate and structural stability of recombinant cells. Biotechnoíogy Progress 9:548.
Konowalchuk, J., J.l. Speirs, and S. Stavric. 1977. Věro response to a cytotoxin of Escherichia coli. Infection and Immunity 18:775.
Langermann, S., S. Palaszynski, A. Sadziene, C.K. Stover, and S. Koenig. 1994. Systemic and mucosal immunity induced by BCG vector expressing outer-surface protein A of Borrelia burgdorferi. Nátuře 372: 552-555.
Lee, S.F., R.J. March, S.A. Halpern, G. Faulkner, and L. Gao. 1999. Surface expression of a protective recombinant pertussis toxin S1 subunit fragment in Streptococcus gordonii. Infect Immun 67: 1511-1516.
Lehnherr, H. and M.B. Yarmolinsky. 1995. Addiction protein Phd of plasmid prophage P1 is a substráte of the ClpXP serine protease of Escherichia coli. Proceedings of the National Academy of Sciences USA 92:3274.
Lehnherr, Η., E. Maguln, S. Jafri, and M.B. Yarmolinsky. 1993. Plasmid addiction genes of bacteriophage P1: doc, which causes cell death on curing of prophage, and phd, which prevents host death when prophage is retained. Journal of Molecular Biology 233:414.
• · « · • · · · • · ··
Levine, M.M., J.E. Galen, E.M. Barry, F. Noriega, S. Chatfield, M. Szteln, G. Dougan, and C.O. Tacket. 1996. Attenuated Salmonella as live oral vaccines against typhoid fever and as live vectors. Joumal of Biotechnology 44:193.
Lindgren, S.W., J.E. Samuel, C.K. Schmitt, and A.D. O'Brien. 1994. The specific activities of Shiga-like toxin type II (SLT-II) and SLT-ll-related toxins of enterohemorrhagic Escherichia coli differwhen measured by Věro cell cytotoxicity but not by mouše lethality. Infection and Immunity 62:623.
Lloyd, R.G. and K.B. Low. 1996. Homologous recombination. In Escherichia coli and Salmonella: Cellular and molecular biology. 2nd ed. F.C. Neidhardt, R. Curtiss lil, J.L.
Ingraham, E.C.C. Lin, K.B. Low, B. Magasanik, W.S. Reznikoff, M. Riley, M. Schaechter and H.E. Umbarger, eds. ASM Press, Washington,D.C. p. 2236.
Loh, S.M., D.S. Cram, and R.A. Skurray. 1988. Nucleotide sequence and transcriptional analysis of a third function (Flm) involved in F plasmid maintenance. Gene 66: 259-268.
Lohman, T.M. and M.E. Ferrari. 1994. Escherichia coli single-stranded DNA-binding protein: multiple DNA-binding modes and cooperativities. Annual Reviews in Biochemistry 63:527.
Louise, C.B. and T.G. Obrig. 1995. Specific interaction of Escherichia coli 0157:H7-derived Shiga-like toxin II with human renal endothelial cells. Journal of Infectious Diseases 172:1397.
Love, C.A., P.E. Liiley, and N.E. Dixon. 1996. Stable high-copy-number bacteriophage lambda promotér vectors for overproduction of proteins in Escherichia coli. Gene 176:49.
Lynch, A.S. and E.C.C. Lin. 1996. Responses to molecular oxygen. In Escherichia coli and Salmonella: Cellular and molecularbiology. 2nd ed. F.C. Neidhardt, R. Curtiss III, J.L.
Ingraham, E.C.C. Lin, K.B. Low, B. Magasanik, W.S. Reznikoff, M. Riley, M. Schaechter and H.E. Umbarger, eds. ASM Press, Washington,D.C. p. 1526.
Magnuson, R., H. Lehnherr, G. Mukhopadhyay, and M.B. Yarmolinsky. 1996. Autoregulation of the plasmid addiction operon of bacteriophage P1. Journal ofBiological Chemistry 271:18705.
Makoff, A.J., and A.E. Smallwood. 1988. Heterologous expression in Escherichia coli: effects of alterations in the sequence 5' to the initiation codon. Biochem Soc Trans 16: 4849.
Mangeney, M., C.A. Lingwood, S. Taga, B. Caillou, T. Tursz, and J. Wiels. 1993. Apoptosis induced in Burkitťs lymphoma cells via Gb3/CD77, a glycolipid antigen. Cancer Research 53:5314.
Marshall, J., R. Molloy, G.W.J. Moss, J.R. Howe, and T.E. Hughes. 1995. The jellyfish green fluorescent protein: a new tool for studying ion channel expression and function. Neuron 14:211.
Martinez-Flores, I., R. Cano, V.H. Bustamante, E. Calva, and J.L. Puente. 1999. The ompB operon partially determines differential expression of OmpC in Salmonella typhi and Escherichia coli. J Bacteriol 181: 556-562.
Matthews, R.G. 1996. One-carbon metabolism. In Escherichia coli and Salmonella: Cellular and molecularbiology. 2nd ed. F.C. Neidhardt, R. Curtiss III, J.L. Ingraham, E.C.C. Lin, K.B. Low, B. Magasanik, W.S. Reznikoff, M. Riley, M. Schaechter and H.E. Umbarger, eds. ASM Press, Washington.D.C. p. 600.
Maurizl, M.R., W.P. Clark, Y. Katayama, S. Rudikoff, J. Pumphrey, B. Bowers, and S. Gottesman. 1990. Sequence and structure of Clp P, the proteolytic component of the ATP-dependent Clp protease of Escherichia coli. Journal ofBiological Chemistry 265:12536.
φφφφ φ
ΦΦ ΦΦ · V φφφ·
• ΦΦΦ
McCIelland, Μ. and R. Wilson. 1998. Sample sequencing of the Salmonella typhi genome: comparison to the E. coli K-12 genome. Infection and Immunity
McDanlel, T.K., K.G. Jarvis, M.S. Donnenberg, and J.B. Kaper. 1995. A genetic locus of enterocyte effacement conserved among diverse enterobacterial pathogens. Proceedings of the National Academy of Sciences USA 92:1664.
McDermott, P.J., P. Gowland, and P.C. Gowland. 1993. Adaptation of Escherichia coli growth rates to the presence of pBR322. LettAppi Microbio! 17: 139-143.
Meacock, P.A., and S.N. Cohen. 1980. Partitioning of bacterial plasmids during cell division: a c/s-acting locus that accompiishes stable piasmid inheritance. Cell 20. 529-542.
Medaglinl, D., G. Pozzi, T.P. King, and V.A. Fischetti. 1995. Mucosal and systemic immune responses to a recombinant protein expressed on the surface of the oral commensal bacterium Streptococcus gordonii after oral colonization. Proč Nati Acad Sci USA 92: 6868-6872.
Melton-Celsa, A.R. and A.D. 0'Brien. 1998. The structure, biology, and relative toxicity for celíš and animals of Shiga toxin family members. In Escherichia coli O157:H7 and other Shiga toxin-producing E. coli strains. J.B. Kaper and A.D. O'Brien, eds. ASM Press, Washington, D.C. In press.
Mikkelsen, N.D. and K. Gerdes. 1997. Sok antisense RNA from piasmid R1 is functionally inactivated by RNaseE and polyadenylated by poly(A) polymerase I. Molecular Microbiology 26:311.
Miller, C.A., S.L. Beaucage, and S.N. Cohen. 1990. Role of DNA superhelicity in partitioning of the pSC101 piasmid. Cell 62: 127-133.
Moxley, R. A. and D. H. Francis. 1998. Overview of Animal Models. In Escherichia coli O157:H7 and other Shiga toxin-producing E. colistrains. J.B. Kaper and A.D. O'Brien, eds. ASM Press, Washington, D.C. in press.
Muhldorfer, I., J. Hacker, G.T. Keusch, D.W. Acheson, H. Tschape, A.V. Kane, A. Ritter, T. Olschlager, and A. Donohue-Rolfe. 1996. Regulation of the Shiga-like toxin II operon in Escherichia coli. Infection and Immunity 64:495.
Nakayama, K., S.M. Kelley, and R. Curtiss III. 1988. Construction of an Asd+ expressioncloning vector: stable maintenance and high level expression of cloned genes in a Salmonella vaccine strain. Bio/Technology 6: 693-697.
Nakayama, K., S.M. Kelley, and R. Curtiss III. 1988. Construction of an Asd* expression-cloning vector: stable maintenance and high level expression of cloned genes in a Salmonella vaccine strain. Bio/Technology 6:693.
Nelson, S., S.E. Richardson, C.A. Lingwood, M. Petric, and M.A. Karmali. 1994. Biological activity of verocytotoxin (VT)2c and VT1/VT2c chimeras in the rabbit model. In Recent advances in verocytotoxin-producing Escherichia Coli infections. M.A. Karmali and A.G. Goglio, eds. Elsevier Science, New York, p. 245.
Niki, H., and S. Hiraga. 1997. Subcellular distribution of actively partitioning F piasmid during the cell division cycle of E. coli. Cell 90: 951-957.
Nordstrom, K. and S.J. Austin. 1989. Mechanisme that contribute to the stable segregation of plasmids. Annual Reviews in Genetics 23:37.
Noriega, F.R., G. Losonsky, J.Y. Wang, S.B. Formal, and M.M. Leviné. 1996. Further characterization of AaroA PvirG Shigella flexneri 2a strain CVD 1203 as a mucosal Shigella vaccine and as a live-vector vaccine for delivering antigens of enterotoxigenic Escherichia coli. Infect Immun 64:23-27.
9
Norioka, S., G. Ramakrishnan, K. Ikenaka, and M. Inouye. 1986. Interaction of a transcriptional activator.OmpR, with reciprocally osmoregulated genes, ompF and ompC, of Escherichia coli. Joumal of Biological Chemistry 261:17113-17119
Nyholm, P., G. Magnusson, Z. Zheng, R. Norel, B. Binnington-Boyd, and CA. Lingwood. 1996. Two distinct binding sites for globotriaosyl ceramide on verotoxins: identification by molecular modelling and confirmation using deoxy analogues and a new glycolipid receptor for all verotoxins. Chemistry and Biology 3:263.
Nyholm, P., J.L Brunton, and C.A. Lingwood. 1995. Modelling of the interaction of verotoxin-1 (VT1) with its glycolipid receptor, globotriaosylceramide (Gb3). Intemational Journal of Biological Macromolecules 17:199.
0‘Brien, A. D. 1982. lnnate resistance of mice to Salmonella typhi infection. Infection and Immunity 38:948.
O’Brien, A.D., V.L. Tesh, A. Donohue-Rolfe, M.P. Jackson, S. Olsnes, K. Sandvig, A.A. Lindberg, and G.T. Keusch. 1992. Shiga toxin: biochemistry.genetics.mode of action, and role in pathogenesis. Current Topics in Microbiology and Immunology 180:65.
Olitsky, P.K. and I.J. Kligler. 1920. Toxins and antitoxins ofBacillus dysenteriae Shiga. Journal of Experimental Medicine 31:19.
Orosz, A., I. Boros, and P. Venetianer. 1991. Analysis of the complex transcription termination region of the Escherichia coli rrnB gene. European Joumal of Biochemistry 201:653.
Oxer, M.D., C.M. Bentley, J.G. Doyle, T.C. Peakman, I.G. Charles, and A.J. Makoff.
1991. High level heteroiogous expression in E. coli using the anaerobically-activated nirB promotér. Nucleic Acids Research 19:2889-2892.
Pallen, M.J. and B.W. Wren. 1997. The HtrA family of serine proteases. Molecular Microbiology 26:209.
Pecota, D.C., C.S. Kim, K. Wu, K. Gerdes, and T.K. Wood. 1997. Combining the hoklsok, parDE, and pnd postsegregational killer loci to enhance plasmid stability. Applied and Environmental Microbiology 63:1917-1924.
Perera, L.P., J.E. Samuel, R.K. Holmes, and A.D. 0'Brien. 1991. Mapping the minimal contiguous gene segment that encodes functionally active Shiga-like toxin II. Infection and Immunity 59:829.
Perera, L.P., J.E. Samuel, R.K. Holmes, and A.D. O'Brien. 1991. Identification of three amino acid residues in the B subunit of Shiga toxin and Shiga-like toxin type II that are essential for holotoxin activity. Journal of Bacteriology 173:1151.
Pittard, A.J. 1996. Biosynthesis of the aromatic amino acids. In Escherichia coli and Salmonella: Cellular and molecular biology. 2nd ed. F.C. Neidhardt, R. Curtiss III, J.L.
Ingraham, E.C.C. Lin, K.B. Low, B. Magasanik, W.S. Reznikoff, M. Riley, M. Schaechter and H.E. Umbarger, eds. ASM Press, Washington, D.C. p. 458.
Polisky, B. 1986. Replication control of the ColE1-type plasmids. in Maximizing gene expression. W.S. Reznikoff aňd L. Gold, eds. Butterworths, Boston, p. 143.
Porter, R.D., S. Black, S. Pannuri, and A. Carlson. 1990. Use of the Escherichia coli ssb gene to prevent bioreactor takeover by plasmidless cells. Bio/Γechnology 8:47.
Pouwels, P.H., R.J. Leer, M. Shaw, MJ. Heijne den Bak-Glashouwer, F.D. Tielen, E., Smit, B. Martinez, J. Jore, and P.L. Conway. 1998. Lactic acid bacteria as antigen delivery vehicles for oral immunization purposes. Int J Food Microbiol 41: 155-167.
·
Pratt, L.A., W. Hsing, K.E. Gibson, and T.J. Šilhavý. 1996. From acids to osmZ: mutiple factors influence synthesis of the OmpF and OmpC porins in Escherichia coli. Moiecular Microbiology 20:911.
Puente, J.L., V. Alvarez-Scherer, G. Gosset, and E. Caiva. 1989. Comparative analysis of the Salmonelia typhi and Escherichia coli ompC genes. Gene 83; 197.
Richardson, S.E., T.A. Rotman, V. Jay, C. R. Smith, L.E. Becker, M. Petric, N.F. Olivieri, and M.A. Karmali. 1992. Experimental verocytotoxemia in rabbits. Infection and Immunify 60:4154.
Ringquist, S., S. Shinedling, D. Barrick, L. Green, J. Binkley, G.D. Stormo, and L. Gold.
1992. Translation initiation in Escherichia coli: sequences within the ribosome-binding site. Moiecular Microbiology 6:1219.
Roberts, M., S. Chatfield, and G. Dougan. 1994. Salmonelia as carriers of heterologous antigens. In Novel delivery systems fororal vaccines. D.T. 0'Hagan, ed. CRC Press, Ann Arbor, p. 27-58.
Ruiz-Echevarria, M.J., G. Gimenez-Gallego, R. Sabariegos-Jareno, and R. Diaz-Orejas. 1995. Kid, a smáli protein of the parD stability systém of plasmid R1, is an inhibitor of DNA replication acting at the initiation of DNA synthesis. J Mol Biol 247: 568-577.
Rupp, W.D. 1996. DNA repair mechanisme. In Escherichia coli and Salmonelia: Cellular and moiecular biology. 2nd ed. F.C. Neidhardt, R. Curtiss III, J.L. Ingraham, E.C.C. Lin, K.B. Low, B. Magasanik, W.S. Reznikoff, M. Riley, M. Schaechter and H.E. Umbarger, eds. ASM Press, Washington, D.C. p. 2277.
Ryan, E.T., J.R. Butterton, R.N. Smith, P.A.. Carroll, T.l. Crean, and S.B. Calderwood. 1997a. Protective immunity against Cíostridium difficile toxin A induced by oral immunization with a live, attenuated Vibrio cholerae vector strain. Infect Immun 65: 2941-2949.
Ryan, E.T., J.R. Butterton, T. Zhang, M.A. Baker, S.L.J. Stanley, and S.B. Calderwood. 1997b. Oral immunization with attenuated vaccine strains of Vibrio cholerae expressing a dodecapeptide repeat of the serine-rich Entamoeba histolytica protein fused to the cholera toxin B subunit induces systemic and mucosal antiamebic and anti-V. cholerae antibody responses in mice. Infect Immun 65: 3118-3125.
Sambrook, J., E.F. Fritsch, and T. Maniatis. 1989. Moiecular cloning: A Laboratory Manual, 2nd edition. Cold Spring Harbor, New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press.
Selzer, G., T. Som, T- Itoh, and J. Tomizawa. 1983. The origin of replication of plasmid p15A and comparative studies on the nucleotide sequences around the origin of related plasmids. Cell 32:119.
Shaw, K.J., P.N. Rather, R.S. Hare, and G.H. Miller. 1993. Moiecular genetics of aminoglycoside resistance genes and familial relationships of the aminoglycoside-modifying enzymes. Microbiol Rev 57: 138-163.
Siegler, R.L. 1995. The hemolytic uremic syndrome. Pediatrie Nephrology 42:1505.
Siegler, R.L., A.T. Pavia, R.D. Christofferson, and M.K. Milligan. 1994. A 20-year population-based study of postdiarrheal hemolytic uremic syndrome in Utah. Pediatrics 94:35.
Sixma, T.K., P.E. Stein, W.G. Hol, and R.J. Read. 1993. Comparison of the B-pentamers of heat-labile enterotoxin and verotoxin-1: two structures with remarkable similarity and dissimilarity. Biochemistry 32:191.
Srinivasan, J., S.A. Tinge, R. Wright, J.C. Herr, and R. Curtiss III. 1995. Oral immunization with attenuated Salmonelia expressing human sperm antigen induces antibodies in sérum and the reproductive tract. Biology of Reproduction 53:462.
Stein, P.E., A. Boodhoo, G.J. Tyrrell, J.L. Brunton, and R.J. Read. 1992. Crystal structure of the cell-binding B oligomer óf verotoxin-1 from E. coli. Nátuře 355:748.
Stoker, N.G., N.F. Fairweather, and B.G. Spratt. 1982. Versatile low-copy-number plasmid vectors for cloning in Escherichia coli. Gene 18; 335-341.
Streatfield, S.J., M. Sandkvist, T.K. Sixma, M. Bagdasarian, W.G. Hol, and T.R. Hirst. 1992. Intermotecular interactions between the A and B subunits of heat-tabile enterotoxin from Escherichia co//promote holotoxin assembly and stability in vivo. Proceedings ofthe National Academy of Sciences USA 89:12140.
Strockbine, N.A., L.R.M. Marques, J.W. Newland, H.W. Smith, R.K. Holmes, and A.D. O’Brien. 1986. Two toxin-converting phages from Escherichia coli Ο157.Ή7 strain 933 encode antigenicaíly distinct toxins with similar biologie activities. Infection and Immunity 53:135.
Strockbine, N.A., M.P. Jackson, L.M. Sung, R.K. Holmes, and A.D. O'Brien. 1988. Cloning and sequencing ofthe genes for Shiga toxin from Shigella dysenteriae Type 1. Joumal of Bacteriology 170.1116.
Strugnell, R.A., D. Maskell, N.F. Fairweather, D. Pickard, A. Cockayne, C. Penn, and G. Dougan. 1990. Stabfe expression of foreign antigens from the chromosome of Salmonella typhimurium vaccine strains. Gene 88: 57-63.
Summers, D.K. The Biology of Plasmids, 65-91, 1996.
Summers, D.K. 1998. Timing, self-control and sense of direction are the secrets of multicopy plasmid stability. Mol Microbiol 29: 1137-1145.
Summers, D.K. and D.J. Sherratt. 1984. Multimerization of high copy number plasmids causes instability: ColE1 eneodes a determinant essential for plasmid monomerization and stability. Cell 36:1097.
Tacket, C.O., D.M. Hone, R. Curtiss III, S.M. Kelly, G. Losonsky, L. Guers, A.M. Harris, R. Edelman, and M.M. Levine. 1992. Comparison of the safety and immunogenicity of AaraCAaraD and Acyaóc/p Salmonella typhi strains in adult volunteers. Infection and Immunity 60:536.
Tacket, C.O., M. Sztein, G. Losonsky, S.S. Wasserman, J.P. Nataro, R. Edelman, D. Pickard, G. Dougan, S. Chatfield, and M.M. Levine. 1997. Safety of live oral Salmonella typhi vaccine strains with deletions in htrA and aroC aroD and immune responses in humans. Infection and Immunity 65:452-456.
Tacket, C.O., S.M. Kelley, F. Schodel, G. Losonsky, J.P. Nataro, R. Edelman, M.M. Levine, and R. Curtiss III. 1997. Safety and immunogenicity in humans of an attenuated Salmonella typhi vaccine vector strain expressing plasmid-encoded hepatitis B antigens stabilized by the Asd-balanced lethal vector systém. Infection and Immunity 65:3381-3385.
Takeda, Y. 1995. Shiga and Siga-like (Věro) toxins. In Bacterial toxins and virulence factors in disease. J. Moss, B. iglewski, M. Vaughan and A. Tu, eds. Marcel Dekker, lne. New York, p. 313.
Tauxe, R.V. 1998. Public health perspective on immunoprophylactic strategies for Escherichia coli 0157:H7: who or what would we immunize? In Escherichia coli O157:H7 and other Shiga toxin-producing E. coli strains. J.B. Kaper and A.D. O'Brien, eds. ASM Press, Washington, D.C. In press.
Tesh, V.L., J.A. Burris, J.W. Owens, V.M. Gordon, E.A. Wadolkowski, A.D. O'Brien, and J.E. Samuel. 1993. Comparison of the relative toxicities of Shiga-like toxins type I and type II for mice. Infection and Immunity 61:3392.
Thisted, T., A.K. Nielsen, and K. Gerdes. 1994. Mechanism of post-segregational killing: translation of Hok,SmB and Pnd mRNAs of plasmids R1, F and R483 is activated by 3'-end processing. EMBO Joumal 13:1950.
Thisted, T., N.S. Sorensen, and K. Gerdes. 1995. Mechanism of post-segregational killing: secondary structure analysis of the entire Hok mRNA from plasmid R1 suggests a fold-back structure that prevents translation and antisense RNA binding. Joumal ofMolecular Biology 247:B59.
Thisted, T., N.S. Sorensen, E.G. Wagner, and K. Gerdes. 1994. Mechanism of post-segregational killing: Sok antisense RNA interacts with Hok mRNA via its 5'-end single-stranded leader and competes with the 3'-end of Hok mRNA for binding to the mok translational initiation region. EMBO Joumal 13:1960.
Tinge, S.A. and R. Curtiss lit. 1990. Conservation of Salmonella typhimuríum virulence plasmid maintenance regions among Salmonella serovars as a basis for plasmid curing. Infection and Immunity 58:3084.
Tinge, S.A and R. Curtiss III. 1990. Isolation of the replication and partitioning regions of the Salmonella typhimuríum virulence plasmid and stabilization of heterologous replicons. Joumal of Bacteríology 172:5266.
Twigg, A.J., and D. Sherratt. 1980. Trans-complementable copy-number mutants of plasmid ColE1. Nátuře 283: 216-218.
Umbarger, H.E. 1978. Amino acid biosynthesis and its regulation. Annual Reviews in Biochemistry 47:533.
Valdivia, R.H. and S. Falkow. 1997. Fluorescence-based isolation of bacterial genes expressed within host celíš. Science 277:2007.
Valdivia, R.H., A.E. Hromockyj, D. Monack, L. Ramakrishnan, and S. Falkow. 1996. Applications for green fluorescent protein (GFP) in the study of host-pathogen interactions. Gene 173:47.
Van Melderen, L., P. Bernard, and M. Couturier. 1994. Lon-dependent proteolysis of CcdA-is the key control for activation of CcdB in plasmid-free segregant bacteria. Mol Microbio! 11: 1151-1157.
Vicari, G., A.J. Olitzki, and Z. Olitzki. 1960. The action of the thermolabile toxin of Shigella dysenteriae on celíš cultivated in vitro. British Joumal of Experímental Pathology 41:179.
Wada, K., Y. Wada, F. Ishibashi, T. Gojobori, and T. Ikemura. 1992. Codon usage tabulated from the GenBank genetic sequence data. Nucleic Acids Research 20:2111.
Wadolkowski, E.A., L.M. Sung, J.A. Burris, J.E. Samuel, and A.D. 0'Brien. 1990. Acute renal tubular necrosis and death of mice orally infected with Escheríchia coli strains that produce Shiga-like toxin type II. Infection and Immunity 58:3959.
Wahle, E., and A. Kornberg. 1988. The partition locus of plasmid pSC101 is a specific binding site for DNA gyrase. EMBO J 7: 1889-1895.
Wang, S. and T. Hazelrigg. 1994. Implications for bcd mRNA localization from spatial distribution of exu protein in Drosophila oogenesis. Nátuře 369:400.
Wang, Y., Z. Zhang, S. Yang, and R. Wu. 1992. Cloning of par region and the effect of par region on the stability of pUC9. Chinese Joumal of Biotechnology 8:107.
Williams, K.R., J.B. Murphy, and J.W. Chase. 1984. Characterization of the structural and functional defect in the Escheríchia co//single-stranded DNA binding protein encoded by the ssb-1 mutant gene. Journal ofBiological Chemistry 259:11804.
Wu, K., and T.K. Wood. 1994. Evaluation of the hok/sok killer locus for enhanced piasmid stability. Biotechnol Bioeng 44: 912-921.
Yamasaki, S., NI. Furutani, K. Ito, K. Igarashi, NI. Nishibuchi, and Y. Takeda. 1991. Importance of arginine at postion 170 of the A subunit of Věro toxin 1 produced by enterohemorrhagic Escherichia coli for toxin activity. Microbial Pathogenesis 11:1;
Yanofsky, C., T. Platt, I.P. Crawford, B.P. Nichols, G.E. Christie, H. Horowitz, NI. Van Cleemput, and A.M. Wu. 1981. The complete nucleotide sequence of the tryptophan operon of Escherichia coli. Nucleic Acids Res 9: 6647-6668.
Yu, J. and J.B. Kaper. 1992. Cloning and characterization of the eae gene of enterohaemorrhagic Escherichia coli. Molecular Microbiology 6:411.
Zalkin, H. and P. Nygaard. 1996. Biosynthesis of purine nucleotides. In Escherichia coli and Salmonella: Cellular and molecular biology. 2nd ed. F.C. Neidhardt, J.L. Ingraham, E.C.C. Lin, K.B. Low, B. Magasanik, W.S. Reznikoff, NI. Riley, M. Schaechter and H.E. Umbarger, eds. ASM Press, Washington, D.C. p. 561.
Zhang, X., Y. Lou, NI. Koopman, T. Doggett, K.S.K. Tung, and R. Curtiss III. 1997. Antibody responses and infertility in mice following oral immunization with attenuated Salmonella typhimurium expressing recombinant murine ZP3. Biology of Reproduction 56:33.
Zoja, C., D. Corna, C. Farina, G. Sacchi, C.A. Lingwood, M.P. Doyle, V.V. Padhye, M. Abbate, and G. Remuzzi. 1992. Verotoxin glycolipid receptors determine the localization of microangiopathic process in rabbits given verotoxin-1. Joumal ofLaboratory and Clinical Medicine 120:229.
Zurita, NI., F. Bolivar, and X. Soberon. 1984. Construction and characterization of new cloning vehicles. VII. Construction of piasmid pBR327par, a completely sequenced, stable derivative of pBR327 containing the par locus of pSC101. Gene 28:119.

Claims (153)

1. Nezávisle fungující expresní kazeta obsahující nukleotidovou sekvenci kódující:
a) počátek replikace; a
b) nukleotidovou sekvenci kódující systém pro udržování plazmidu, který obsahuje:
i) alespoň jednu funkci post-segregačního zabíjení; a ii) alespoň jednu funkci řídící rozdělování plazmidů
2. Nezávisle fungující expresní kazeta podle nároku 1, ve které je počátek replikace vybrán ze skupiny zahrnující: oriE1, ori101, ori15A a jejich deriváty.
3. Nezávisle fungující expresní kazeta podle nároku 1, ve které je funkce postsegregačního zabíjení vybrána ze skupiny zahrnující: asd, ssb, phd-doc a hoksok.
4. Nezávisle fungující expresní kazeta podle nároku 1, ve které je funkce postsegregačního zabíjení podstatným homologem přirozeně se vyskytující funkce post-segregačního zabíjení.
5. Nezávisle fungující expresní kazeta podle nároku 1, ve které funkce řídící rozdělování plazmidů obsahuje aktivní funkci, řídící rozdělování plazmidů.
6. Nezávisle fungující expresní kazeta podle nároku 1, ve které funkce řídící rozdělování plazmidů obsahuje pasivní funkci, řídící rozdělování plazmidů.
7. Nezávisle fungující expresní kazeta podle nároku 1, ve které funkcí řídící rozdělování plazmidů je lokus par z pSC101.
8. Nezávisle fungující expresní kazeta podle nároku 1, ve které funkce řídící rozdělování plazmidů obsahuje parA.
• ·· • ··· y
9. Nezávisle fungující expresní kazeta podle nároku 1, ve které funkce řídící rozdělování plazmidů je podstatným homologem přirozeně se vyskytující funkce řídící rozdělování plazmidů.
10. Amplifikovatelný plazmidový replikon obsahující nezávisle fungující expresní kazetu podle nároku 1.
11. Amplifikovatelný plazmidový replikon podle nároku 10, který dále obsahuje nezávisle fungující expresní kazetu, obsahující nukleotidovou sekvenci kódující antigen o který se jedná, jehož transkripce je kontrolována promotorem.
12. Amplifikovatelný plazmidový replikon podle nároku 11, jehož počet kopií je možno kontrolovat tak, aby varíroval v rozmezí od 0 kopií na buňku do více než 75 kopií na buňku a kde antigen o který se jedná je regulovaný testovací antigen, vhodný pro expresi v bakterii tak, že indukovatelný promotor je umístěn tak, aby kontroloval expresi nukleotidové sekvence tak, že když je zvýšena indukce promotoru, je zvýšena i exprese testovacího antigenu a je zvýšena metabolická zátěž bakterie.
13. Bakteriální buňka obsahující amplifikovatelný plazmidový replikon podle nároku
12.
14. Amplifikovatelný plazmidový replikon podle nároku 11, ve kterém je promotor odvozen od promotoru ompC.
15. Amplifikovatelný plazmidový replikon podle nároku 11, ve kterém promotorem je promotor ompC.
16. Amplifikovatelný plazmidový replikon podle nároku 11, ve kterém promotorem je fragment promotoru ompC z E. coli, zahrnující oblast nukleotidů +70 až -389.
17. Amplifikovatelný plazmidový replikon podle nároku 11, ve kterém promotorem je modifikovaný promotor ompC, který vykazuje vysoké úrovně osmoticky ··· · · · · · · • ·* « · · · · * · • · regulované exprese ve srovnání s odpovídajícím promotorem ompC bez těchto bodových mutací.
18. Amplifikovatelný plazmidový replikon podle nároku 17, ve kterém modifikovaný promotor ompC obsahuje modifikované místo Bglll.
19. Amplifikovatelný plazmidový replikon podle nároku 17, kde modifikovaný promotor ompC je bez místa Bglll.
20. Amplifikovatelný plazmidový replikon podle nároku 18, ve kterém modifikovaný promotor ompC obsahuje následující sekvenci ve směru od 5' ke 3', začínající modifikovaným místem Bglll a končící startovním kodonem ATG: AGATCX1X2TAAX3CATCCACAGGAGGATATCTGATG, kde.
c) X1 je vybrána ze skupiny zahrnující G, C a A;
d) X2 je inzert o délce od 1 do 5 nukleotidů;
e) X3 je vybrána ze skupiny zahrnující A, T, G a C.
21. Amplifikovatelný plazmidový replikon podle nároku 18, ve kterém X1 je G.
22. Amplifikovatelný plazmidový replikon podle nároku 18, ve kterém X2 má délku od 1 do 4 nukleotidů.
23. Amplifikovatelný plazmidový replikon podle nároku 18, ve kterém X2 má délku 4 nukleotidy.
24. Amplifikovatelný plazmidový replikon podle nároku 18, ve kterém X2 má délku 4 nukleotidy, které jsou nezávisle vybrané ze skupiny zahrnující A, T a C.
25. Amplifikovatelný plazmidový replikon podle nároku 18, ve kterém X2 obsahuje nukleotid nebo nukleotidovou sekvenci vybrané ze skupiny zahrnující ATCT; ATC; AT; TCT; CT; TC; A; T; C a T.
• · · · · · · · · · • · ·· < ···· · · • · · · φ · · · ♦ · · ·
26. Amplifikovatelný plazmidový replikon podle nároku 18, ve kterém X2 je vybrán ze skupiny zahrnující ATCT; ATC; AT; TCT; CT; TC; A; T; C a T.
27. Amplifikovatelný plazmidový replikon podle nároku 18, ve kterém X2 je ATCT.
28. Amplifikovatelný plazmidový replikon podle nároku 18, ve kterém X3 je A.
29. Amplifikovatelný plazmidový replikon podle nároku 11, ve kterém antigen o který se jedná, obsahuje zelený fluorescenční protein nebo jeho funkční ekvivalent.
30. Amplifikovatelný plazmidový replikon podle nároku 11, ve kterém antigen o který se jedná, obsahuje detoxifikovaný Shiga toxin a/nebo jeho podstatný homolog.
31. Amplifikovatelný plazmidový replikon podle nároku 11, ve kterém antigen o který se jedná, obsahuje detoxifikovaný Shiga toxin 2 antigen, vybraný ze skupiny zahrnující: pentamery B podjednotky Shiga toxinu 2 a geneticky detoxifikovaný Shiga toxin 2 (Stx2).
32. Amplifikovatelný plazmidový replikon podle nároku 30, ve kterém gen kódující detoxifikovaný Shiga toxin 2 má modifikované segmenty vybrané ze skupiny zahrnující:
(797) - ACA GCA GAC GCG TTA -(811); (902)- CTG AAC CTA GGG CGA “(916); (1345) - GAA TTC GCG ACC AGT -(1359); a (1435)- GAA TCA GAT TCT GGA -(1449).
33. Bakteriální buňka obsahující amplifikovatelný plazmidový replikon podle nároku
11.
34. Amplifikovatelný plazmidový replikon podle nároku 10, který dále obsahuje nezávisle fungující expresní kazetu, která obsahuje nukleotidovou sekvenci, kódující selektovatelný markér.
·* 44 ·· 44 4* • · 4 · 444 4 4 4 ·♦♦· · 4 44 4 4 ·
4 44 4 4 4 44 444 4
35. Amplifikovatelný plazmidový replikon podle nároku 34, ve kterém selektovatelný markér nepropůjčuje rezistenci k jakémukoli antibiotiku, které je obyčejně používáno při léčení lidí.
36. Amplifikovatelný plazmidový replikon podle nároku 34, ve kterém selektovatelný markér obsahuje β-laktamázu a/nebo její funkční ekvivalent.
37. Amplifikovatelný plazmidový replikon podle nároku 34, ve kterém nukleotidová sekvence kódující markér rezistence je vybrán ze skupiny zahrnující tetA, bia a jejich funkční ekvivalenty.
38. Buňka obsahující amplifikovatelný plazmidový replikon podle nároku 34.
39. Bakteriální buňka obsahující amplifikovatelný plazmidový replikon podle nároku
34.
40. Oslabený bakteriální vakcinační vektor tvořený bakteriálním druhem, obsahujícím replikon, který obsahuje:
a) nukleotidovou sekvenci kódující antigen o který se jedná; a
b) nukleotidovou sekvenci kódující systém pro udržování plazmidu.
41. Bakteriální vakcinační vektor podle nároku 40, ve kterém nukleotidová sekvence kódující antigen o který se jedná, je obsažena v nezávisle fungující genetické kazetě.
42. Bakteriální vakcinační vektor podle nároku 40, ve kterém nukleotidová sekvence kódující systém pro udržování plazmidu je obsažena v nezávisle fungujících genetických kazetách.
43. Oslabený živý bakteriální vakcinační vektor podle nároku 40, kde bakteriálním druhem je Salmonella typhi.
·· ·· ΦΦ ΦΦ • ♦ · · * · · φφφ • · ·♦ · φ ΦΦ · φ φ • · · * φ φ φ · φφφ φ
44. Oslabený živý bakteriální vakcinační vektor podle nároku 40, ve kterém replikon dále obsahuje promotor ompC nebo jeho podstatný homolog, kontrolující expresi antigenu o který se jedná.
45. Oslabený živý bakteriální vakcinační vektor podle nároku 40, ve kterém replikon dále obsahuje modifikovaný promotor ompC, kontrolující expresi antigenu o který se jedná, přičemž modifikovaný promotor ompC vykazuje ve srovnáním s nemodifikovaným promotorem ompC vyšší hladiny osmoticky kontrolované exprese.
46. Oslabený živý bakteriální vakcinační vektor podle nároku 45, ve kterém modifikovaný promotor ompC obsahuje modifikované Bglll místo.
47. Oslabený živý bakteriální vakcinační vektor podle nároku 45, ve kterém modifikovaný promotor ompC je bez kompletního Bglll místa.
48. Oslabený živý bakteriální vakcinační vektor podle nároku 46, ve kterém modifikovaný promotor ompC obsahuje následující sekvenci ve směru od 5' ke 3', začínající modifikovaným místem Bglll a končící startovním kodonem ATG: AGATCX1X2TAAX3CATCCACAGGAGGATATCTGATG, kde:
a) X1 je vybrána ze skupiny zahrnující G, C a A;
b) X2 je inzert o délce od 1 do 5 nukleotidů;
c) X3 je vybrána ze skupiny zahrnující A, T, G a C.
49. Oslabený živý bakteriální vakcinační vektor podle nároku 48, ve kterém X1 je G.
50. Oslabený živý bakteriální vakcinační vektor podle nároku 48, ve kterém X2 má délku od 1 do 4 nukleotidů.
51. Oslabený živý bakteriální vakcinační vektor podle nároku 48, ve kterém X2 má délku 4 nukleotidy.
• · ·· · · ··« · · · • · · » · · · · ··· · ·
9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 ·· ·· ·· ·· ··«
52. Oslabený živý bakteriální vakcinační vektor podle nároku 48, ve kterém X2 má délku 4 nukleotidy, které jsou nezávisle vybrané ze skupiny zahrnující A, T a C.
53. Oslabený živý bakteriální vakcinační vektor podle nároku 48, ve kterém X2 obsahuje nukleotid nebo nukleotidovou sekvenci vybrané ze skupiny zahrnující
ATCT; ATC; AT; TCT; CT; TC; A; T; C a T.
54. Oslabený živý bakteriální vakcinační vektor podle nároku 48, ve kterém X2 je vybrán ze skupiny zahrnující ATCT; ATC; AT; TCT; CT; TC; A; T; C a T.
55. Oslabený živý bakteriální vakcinační vektor podle nároku 48, ve kterém X2 je
ATCT.
56. Oslabený živý bakteriální vakcinační vektor podle nároku 48, ve kterém X3 je A.
57. Oslabený živý bakteriální vakcinační vektor podle nároku 40, ve kterém systém udržování plazmidu obsahuje:
a) alespoň jednu funkci post-segregačního zabíjení; a
b) alespoň jednu funkci zabezpečující rozdělování plazmidů.
58. Oslabený živý bakteriální vakcinační vektor podle nároku 57, ve kterém funkce post-segregačního zabíjení je vybrána ze skupiny zahrnující rovnovážné letální funkce, proteinové funkce a antisense funkce.
59. Oslabený živý bakteriální vakcinační vektor podle nároku 57, ve kterém funkce post-segregačního zabíjení je vybrána ze skupiny zahrnující asd, ssb, phd-doc, hok-sok a jejich podstatné homology.
60. Oslabený živý bakteriální vakcinační vektor podle nároku 57, ve kterém funkce řídící rozdělování plazmidů obsahuje aktivní funkci, řídící rozdělování plazmidů.
61. Oslabený živý bakteriální vakcinační vektor podle nároku 57, ve kterém funkce řídící rozdělování plazmidů obsahuje pasivní funkci, řídící rozdělování plazmidů.
• · • ·
62. Oslabený živý bakteriální vakcinační vektor podle nároku 57, ve kterém funkce řídící rozdělování plazmidů obsahuje lokus par z pSC101 a/nebo jeho podstatný homolog.
63. Oslabený živý bakteriální vakcinační vektor podle nároku 57, ve kterém funkce řídící rozdělování plazmidů obsahuje lokus parA a/nebo jeho podstatný homolog.
64. Oslabený živý bakteriální vakcinační vektor podle nároku 40, ve kterém antigenem o který se jedná je testovací antigen.
65. Oslabený živý bakteriální vakcinační vektor podle nároku 64, ve kterém testovací antigen je vybrán ze skupiny zahrnující zelený fluorescenční protein, funkční ekvivalenty zeleného fluorescenčního proteinu a podstatné homology zeleného fluorescenčního proteinu.
66. Oslabený živý bakteriální vakcinační vektor podle nároku 40, ve kterém antigenem o který se jedná je detoxifikovaný Shiga toxin.
67. Oslabený živý bakteriální vakcinační vektor podle nároku 40, ve kterém antigenem je jeden nebo více antigenů Shiga toxin 2 vybraných ze skupiny zahrnující pentamery B podjednotky Shiga toxinu 2 a geneticky detoxifikovaný Stx2.
68. Oslabený živý bakteriální vakcinační vektor podle nároku 67, ve kterém gen kódující detoxifikovaný Shiga toxin 2 má mutace vybrané ze skupiny zahrnující:
(797) - ACA GCA GAC GCG TTA -(811); (902)- CTG AAC CTA GGG CGA -(916); (1345)- GAA TTC GCG ACC AGT -(1359); a (1435)- GAA TCA GAT TCT GGA -(1449).
69. Oslabený živý bakteriální vakcinační vektor podle nároku 40, ve kterém replikon dále obsahuje nukleotidovou sekvenci, která kóduje rezistenční markér.
···· ··· · · · • · ·· · ···· · · • ·· · · · · · ··· · ···· · · · · · · • · ·· »· ·· · · ·
70. Oslabený živý bakteriální vakcinační vektor podle nároku 69, ve kterém nukleotidová sekvence, kódující rezistenční markér, je obsažena v nezávisle fungující genetické kazetě.
71. Oslabený živý bakteriální vakcinační vektor podle nároku 69, ve kterém selektovatelný markér nepropůjčuje rezistenci k jakémukoli antibiotiku, které je obyčejně používáno při léčení lidí.
72. Oslabený živý bakteriální vakcinační vektor podle nároku 69, ve kterém nukleotidová sekvence kódující markér rezistence obsahuje bia a/nebo jeho podstatný homolog.
73. Oslabený živý bakteriální vakcinační vektor podle nároku 69, ve kterém nukleotidová sekvence kódující markér rezistence obsahuje tetA a/nebo jeho podstatný homolog.
74. Podmíněně nestabilní plazmid pro zkoušení změn stability plazmidů, které vyplývají ze zabudování systémů pro udržování plazmidů, uvedený plazmid obsahuje počátek replikace, který udržuje průměrný počet kopií v rozmezí od 2 do 75 kopií a promotor řídící expresi proteinu nebo peptidu, jehož nadprodukce způsobuje metabolickou zátěž bakterie, která pak dává přednost ztrátě plazmidů.
75. Podmíněné nestabilní plazmid podle nároku 74, jehož průměrný počet kopií spadá do rozmezí 5 až 60 kopií.
76. Podmíněně nestabilní plazmid podle nároku 74, ve kterém promotorem je ompC promotor nebo jeho podstatný homolog.
77. Podmíněně nestabilní plazmid podle nároku 74, ve kterém protein nebo peptid je vybrán ze skupiny zahrnující zelený fluorescenční protein, funkční ekvivalenty • · zeleného fluorescenčního proteinu a podstatné homology zeleného fluorescenčního proteinu.
78. Podmíněně nestabilní plazmid podle nároku 74, jehož průměrný počet kopií je vybrán ze skupiny zahrnující: 5 kopií na buňku; 15 kopií na buňku a 60 kopií na buňku.
79. Podmíněně nestabilní plazmid podle nároku 74, ve kterém je počátek replikace vybrán ze skupiny zahrnující počátek replikace plazmidu pSC101, počátek replikace plazmidu pACYC184, počátek replikace plazmidu pAT153 a podstatné homology kteréhokoli z těchto počátků replikace.
80. Podmíněně nestabilní plazmid podle nároku 74, ve kterém počátek replikace je z pACYC184, který zajišťuje 5 kopií plazmidu na ekvivalent chromozomu.
81. Podmíněně nestabilní plazmid podle nároku 74, ve kterém počátek replikace je z pSC101, který zajišťuje 15 kopií plazmidu na ekvivalent chromozomu.
82. Podmíněné nestabilní plazmid podle nároku 74, ve kterém počátek replikace je z pAT153, který zajišťuje 60 kopií plazmidu na ekvivalent chromozomu.
83. Způsob vyvolání imunitní odpovědi u jedince, vyznačující se tím, že se jedinci podá živý bakteriální vakcinační vektor, obsahující bakteriální kmen, který obsahuje expresní vektor obsahující:
a) nukleotidovou sekvenci kódující antigen;
b) promotor kontrolující expresi antigenu; a
c) nukleotidovou sekvenci kódující alespoň jeden systém pro udržování plazmidu.
84. Způsob podle nároku 83, vyznačující se tím, že jedinci je podán živý bakteriální vakcinační vektor v množství účinném pro imunizaci.
85. Způsob podle nároku 83, v y z n a č u j í c í se t í m, že živým bakteriálním vektorem je oslabený druh Salmonella typhi.
86. Způsob podle nároku 83, vyznačující se tím, že a) a b) jsou obsaženy v nezávisle fungující genetické kazetě.
87. Způsob podle nároku 83, vyznačující se tím, že c) je obsažen v nezávisle fungujících genetických kazetách.
88. Způsob podle nároku 83, vyznačující se tím, že promotorem je indukovatelný promotor.
89. Způsob podle nároku 83, vy zn a č u j í c í se t í m, že promotorem je promotor ompC nebo jeho funkční ekvivalent.
90. Způsob podle nároku 83, vy zn a č u j í c í se t í m, že promotorem je modifikovaný promotor ompC, fenotypicky charakterizovaný tím, že vykazuje ve srovnání s odpovídajícím promotorem ompC, který je bez těchto bodových mutací, vyšší úrovně osmoticky kontrolované exprese.
91. Způsob podle nároku 83, vyznačující se tím, že modifikovaný promotor ompC obsahuje modifikované fíg/ll místo neboje bez kompletního fíg/ll místa.
92. Způsob podle nároku 91, vyznačující se tím, že modifikovaný promotor ompC obsahuje následující sekvenci ve směru od 5' ke 3', začínající modifikovaným místem BglW a končící startovním kodonem ATG: AGATCX1X2TAAX3CATCCACAGGAGGATATCTGATG, kde.
a) X1 je vybrána ze skupiny zahrnující G, C a A;
b) X2 je inzert o délce od 1 do 5 nukleotidů;
c) X3 je vybrána ze skupiny zahrnující A, T, G a C.
93. Způsob podle nároku 92, vyznačující se tím, že X1 je G.
94. Způsob podle nároku 92, vy zn a ču j í c í se t í m, žeX2má délku od 1 do 4 nukleotidů.
95. Způsob podle nároku 92, vyznačující se t í m, že X2 má délku 4 nukleotidy.
96. Způsob podle nároku 92, vyznačující se tím, že X2 má délku 4 nukleotidy, které jsou nezávisle vybrané ze skupiny zahrnující A, T a C.
97. Způsob podle nároku 92, vyznačující se tím, že X2 obsahuje nukleotid nebo nukleotidovou sekvenci vybrané ze skupiny zahrnující ATCT; ATC; AT; TCT; CT; TC; A; T; C a T.
98. Způsob podle nároku 92, vyznačující se tím, že X2 je vybrán ze skupiny zahrnující ATCT; ATC; AT; TCT; CT; TC; A; T; C a T.
99. Způsob podle nároku 92, vyznačující se tím, že X2 je ATCT.
100. Způsob podle nároku 92, vyznačující se tím, že X3 je A.
101. Způsob podle nároku 92, vyznačující se tím, že systém pro udržování plazmidu obsahuje:
a) alespoň jednu funkci post-segregačního zabíjení; a
b) alespoň jednu funkci zabezpečující rozdělování plazmidů.
102. Způsob podle nároku 101, vyznačující se tím, že funkce postsegregačního zabíjení je obsažena v nezávisle fungující genetické kazetě.
103. Způsob podle nároku 101, vyznačující se tím, že funkce postsegregačního zabíjení je vybrána ze skupiny zahrnující rovnovážné letální funkce, proteinové funkce a antisense funkce.
104. Způsob podle nároku 101, vyznačující se tím, že funkce postsegregačního zabíjení je vybrána ze skupiny zahrnující asd, ssb, phd-doc, hoksok a jejich podstatné homology.
105. Způsob podle nároku 101, vyznačující se tím, že funkce řídící rozdělování plazmidů je obsažena v nezávisle fungující genetické kazetě.
106. Způsob podle nároku 101, vyznačující se tím, že funkce řídící rozdělování plazmidů obsahuje aktivní funkci, řídící rozdělování plazmidů.
107. Způsob podle nároku 101, vyznačující se tím, že funkce řídící rozdělování plazmidů obsahuje pasivní funkci, řídící rozdělování plazmidů.
108. Způsob podle nároku 101, vyznačující se tím, že funkce řídící rozdělování plazmidů obsahuje lokus par zpSC101 a/nebo jeho podstatný homolog.
109. Způsob podle nároku 101, vyznačující se tím, že funkce řídící rozdělování plazmidů obsahuje lokus parA a/nebo jeho podstatný homolog.
110. Způsob podle nároku 101, vyznačující se tím, že antigen (antigeny) obsahují alespoň jeden geneticky detoxifikovaný Shiga toxin.
111. Způsob podle nároku 101, vyznačující se tím, že antigeny obsahují alespoň jeden antigen Shiga toxin 2 (Stx2) vybraný ze skupiny zahrnující pentamery B podjednotky Shiga toxinu 2 a geneticky detoxifikovaný Stx2.
112. Způsob podle nároku 83, vyznačující se tím, že nukleotidová sekvence dále obsahuje nukleotidovou sekvenci kódující selektovatelný markér, který nepropůjčuje rezistenci k jakémukoli antibiotiku, které je obyčejně používáno při léčení lidí.
• ♦ · · · · · ·· • · · · 9 · · · · * ·
113. Způsob podle nároku 112, vyznačující se tím, že nukleotidové sekvence kódující selektovatelný markér je obsažena v nezávisle fungující genetické kazetě.
114. Způsob podle nároku 83, vyznačující se tím, že jedincem je člověk.
115. Způsob podle nároku 83, vyznačující se tím, že jedincem je hovězí dobytek.
116. Způsob přípravy stabilizovaného živého bakteriálního vakcinačního vektoru, vyznačující se tím, že obsahuje živý bakteriální vektor s replikonem obsahujícím:
a) systém pro udržování plazmidu obsahující:
i) alespoň jednu funkci post-segregačního zabíjení; a ii) alespoň jednu funkci řídící rozdělování plazmidů; a
b) nukleotidovou sekvenci kódující jeden nebo více antigenů.
117. Způsob podle nároku 116, vyznačující se tím, že funkce post- segregačního zabíjení je obsažena v nezávisle fungující genetické kazetě.
118. Způsob podle nároku 116, vyznačující se tím, že funkce řídící rozdělování plazmidů je obsažena v nezávisle fungující genetické kazetě.
119. Způsob podle nároku 116, vyznačující se tím, že funkce post- segregačního zabíjení je vybrána ze skupiny zahrnující rovnovážné letální funkce, proteinové funkce a antisense funkce.
120. Způsob podle nároku 116, vyznačující se tím, že funkce postsegregačního zabíjení je vybrána ze skupiny zahrnující asd, ssb, phc-doc, hoksok a jejich podstatných homology.
121. Způsob podle nároku 116, vyznačující se tím, že funkce řídící rozdělování plazmidů je aktivní funkcí, řídící rozdělování plazmidů.
122. Způsob podle nároku 116, vyznačující se tím, že funkce řídící rozdělování plazmidů je pasivní funkcí, řídící rozdělování plazmidů.
123. Způsob podle nároku 116, vyznačující se tím, že funkce řídící rozdělování plazmidů obsahuje lokus par zpSC101 a/nebo jeho podstatný homolog.
124. Způsob podle nároku 116, vyznačující se tím, že funkce řídící rozdělování plazmidů obsahuje lokus par a/nebo jeho podstatný homolog.
125. Způsob podle nároku 116, vyznačující se tím, že jeden nebo více antigenů obsahuje alespoň jeden detoxifikovaný Shiga toxin.
126. Způsob podle nároku 116, vyznačující se tím, že jeden nebo více antigenů obsahuje jeden nebo více antigenů Shiga toxinů 2 vybraných ze skupiny obsahující pentamery B podjednotky Shiga toxinů 2 a detoxifikovaný Stx2.
127. Způsob podle nároku 125, vyznačující se tím, že gen kódující detoxifikovaný Shiga toxin 2 má mutaci vybranou ze skupiny zahrnující:
(797) - ACA GCA GAC GCG TTA -(811); (902)- CTG AAC CTA GGG CGA -(916); (1345)- GAA TTC GCG ACC AGT -(1359); a (1435)- GAA TCA GAT TCT GGA -(1449).
128. Způsob podle nároku 116, vyznačující se tím, že promotorem je modifikovaný promotor ompC fenotypicky charakterizovaný tím, že tento promotor vykazuje vyšší úrovně osmoticky regulované exprese vzhledem k odpovídajícímu promotoru ompC, který je bez těchto bodových mutací.
129. Způsob podle nároku 116, vyznačující se tím, že modifikovaný promotor ompC je bez Bglll místa.
95 • · · • · ·· ·· · · • 0·· 0000 • · ··· «00 0« <0 00 00 130. Způsob podle nároku 116, vyznačující promotor ompC obsahuje mutované Bglll místo. se tím, že modifikovaný 131. Způsob podle nároku 91, vyznačující se tím, že modifikovaný
promotor ompC obsahuje následující sekvenci ve směru od 5' ke 3', začínající mutovaným místem Bglll a končící startovním kodonem ATG: AGATCX1X2TAAX3CATCCACAGGAGGATATCTGATG, kde.
a) X1 je vybrána ze skupiny zahrnující G, C a A;
b) X2 je inzert o délce od 1 do 5 nukleotidů;
c) X3 je vybrána ze skupiny zahrnující A, T, G a C.
132. DNA obsahující modifikovaný promotor ompC fenotypicky charakterizovaný tím, že tento promotor vykazuje vyšší úrovně osmoticky regulované exprese vzhledem k odpovídajícímu nemutovanému promotoru ompC.
133. DNA podle nároku 132, ve které modifikovaný promotor ompC obsahuje mutované místo Bg/ll.
134. DNA podle nároku 133, ve které modifikovaný promotor ompC obsahuje následující sekvenci ve směru od 5' ke 3', začínající mutovaným místem Bglll a končící startovním kodonem ATG: AGATCX1X2TAAX3CATCCACAGGAGGATATCTGATG, kde:
d) X1 je vybrána ze skupiny zahrnující G, C a A;
e) X2 je inzert o délce od 1 do 5 nukleotidů;
f) X3 je vybrána ze skupiny zahrnující A, T, G a C.
135. DNA podle nároku 134, ve které X1 je G.
136. DNA podle nároku 134, ve které X2 má délku od 1 do 4 nukleotidů.
137. DNA podle nároku 134, ve které X2 má délku 4 nukleotidy.
• ·
138. DNA podle nároku 134, ve které X2 má délku 4 nukleotidy, které jsou nezávisle vybrané ze skupiny zahrnující A, T a C.
139. DNA podle nároku 134, ve které X2 obsahuje nukleotid nebo nukleotidovou sekvenci vybrané ze skupiny zahrnující ATCT; ATC; AT; TCT; CT; TC; A; T; C a T.
140. DNA podle nároku 134, ve které X2 je vybrána ze skupiny zahrnující ATCT; ATC; AT; TCT; CT; TC; A; T; C a T.
141. DNA podle nároku 134, ve které X2 je ATCT.
142. DNA podle nároku 134, ve které X3 je A.
143. DNA podle nároku 133, ve které mutované místo BglW promotoru ompC obsahuje sekvenci: AGATCG.
144. DNA podle nároku 133, ve které mutované místo BglW promotoru ompC se skládá ze sekvence: AGATCG.
145. DNA podle nároku 133, ve které modifikovaný promotor ompC obsahuje následující sekvenci ve směru od 5' ke 3' mezi mutovaným místem BglW a startovním kodonem ATG: AGATCTTAAACATCCACAGGAGGATATCTGATG.
146. DNA podle nároku 132, která dále obsahuje systém pro udržování plazmidu, obsahující:
a) alespoň jednu funkci post-segregačního zabíjení; a
b) alespoň jednu funkci řídící rozdělování plazmidů.
147. Expresní plazmid obsahující DNA podle nároku 146.
148. DNA podle nároku 132, která dále obsahuje nukleotidovou sekvenci kódující peptid nebo protein, jehož exprese je kontrolována modifikovaným promotorem.
• · 9 9 0 ♦ · 0 0 · ···· 0 0 0 0 9 9 • 9 99 9 · 999 9 9
149. DNA podle nároku 147, ve které je peptid nebo protein vybrán ze skupiny zahrnující: heterologní antigeny a zelený fluorescenční protein.
150. DNA podle nároku 147, kde je peptid nebo protein vybrán ze skupiny zahrnující: detoxifikované Shiga toxiny.
151. DNA podle nároku 147, kde je peptid nebo protein vybrán ze skupiny zahrnující: pentamery B podjednotky Shiga toxinu 2 a detoxifikovaný Stx2.
152. DNA podle nároku 132, která dále obsahuje nukleotidovou sekvenci kódující selektovatelný markér, který nepropůjčuje rezistenci k jakémukoli antibiotiku, které je obyčejně používáno při léčení lidí.
153. Expresní plazmid obsahující DNA podle nároku 152.
154. DNA podle nároku 132, která dále obsahuje počátek replikace a sekvenci terminátoru transkripce v poloze 5' vzhledem k počátku replikace, takže transkripce počátku replikace je méně poškozována, vzhledem k jejímu poškozování v nepřítomnosti takové sekvence terminátoru transkripce.
155. Expresní plazmid obsahující DNA podle nároku 132.
CZ20011538A 1998-12-02 1999-12-02 Nezávisle fungující expresní kazeta, amplifikovatelný plazmidový replikon, bakteriální buňka, vakcinační vektor, podmíněně nestabilní plazmid, způsob vyvolání imunitní odpovědi, DNA a expresní plazmid CZ20011538A3 (cs)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US09/204,117 US6413768B1 (en) 1998-12-02 1998-12-02 Expression plasmids
US15873899P 1999-10-12 1999-10-12

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CZ20011538A3 true CZ20011538A3 (cs) 2001-11-14

Family

ID=26855335

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CZ20011538A CZ20011538A3 (cs) 1998-12-02 1999-12-02 Nezávisle fungující expresní kazeta, amplifikovatelný plazmidový replikon, bakteriální buňka, vakcinační vektor, podmíněně nestabilní plazmid, způsob vyvolání imunitní odpovědi, DNA a expresní plazmid

Country Status (15)

Country Link
US (6) US6703233B1 (cs)
EP (1) EP1135025B1 (cs)
JP (1) JP2003506007A (cs)
AT (1) ATE360366T1 (cs)
AU (1) AU776562B2 (cs)
CA (1) CA2352457A1 (cs)
CZ (1) CZ20011538A3 (cs)
DE (1) DE69935927T2 (cs)
DK (1) DK1135025T3 (cs)
ES (1) ES2286905T3 (cs)
HU (1) HUP0104609A2 (cs)
NO (1) NO20012721L (cs)
NZ (2) NZ529507A (cs)
PL (1) PL349041A1 (cs)
WO (1) WO2000032047A1 (cs)

Families Citing this family (43)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US8076130B2 (en) * 1998-12-02 2011-12-13 University Of Maryland, Baltimore Plasmid maintenance system for antigen delivery
ES2286905T3 (es) * 1998-12-02 2007-12-01 University Of Maryland, Baltimore Sistema de estabilizacion de plasmidos para el suministro de antigenos.
CA2371928C (en) * 1999-02-22 2013-08-13 Microbiological Research Authority Neisserial vaccine compositions and methods
US7081244B2 (en) * 1999-02-22 2006-07-25 Health Protection Agency Neisserial vaccine compositions and methods
JP2003509046A (ja) * 1999-09-10 2003-03-11 イギリス国 組換え微生物
GB0024203D0 (en) * 2000-10-03 2000-11-15 Peptide Therapeutics Ltd Stabilisation of plasmid inheritance in bacteria
EP1917975A1 (en) 2001-11-30 2008-05-07 University of Maryland, Baltimore Novel proteins in Enteroaggregative Escherichia Coli (EAEC) useful for diagnosis and therapy of EAEC infections
GB0325494D0 (en) * 2003-10-31 2003-12-03 Sbl Vaccin Ab Expression system
GB0327056D0 (en) * 2003-11-20 2003-12-24 Cobra Biolog Ltd Plasmid maintenance
WO2005072092A2 (en) * 2003-12-12 2005-08-11 Conjugon, Inc. Systems for tightly regulated gene expression
US8137930B2 (en) 2005-10-28 2012-03-20 University Of Maryland, Baltimore Attenuated Salmonella enterica serovar paratyphi A and uses thereof
EP1941024B1 (en) * 2005-10-28 2013-07-31 University of Maryland, Baltimore Attenuated salmonella enterica serovar paratyphi a and uses thereof
US20080124355A1 (en) * 2006-09-22 2008-05-29 David Gordon Bermudes Live bacterial vaccines for viral infection prophylaxis or treatment
US8728760B2 (en) 2007-04-06 2014-05-20 University Of Maryland, Baltimore Microcin H47 plasmid selection system
EP2150616A4 (en) 2007-05-10 2011-07-27 Univ Arizona REGULATED ANTIGEN SYNTHESIS AND / OR REGULATED ATTENUATION FOR IMPROVING VACCINATE IMMUNOGENICITY AND / OR SAFETY
US20100317084A1 (en) * 2007-05-10 2010-12-16 The Arizona Board Of Regents For And On Behalf Of Arizona State University Recombinant bacteria comprising vectors for expression of nucleic acid sequences encoding antigens
EP2173914A4 (en) * 2007-07-12 2010-12-01 Univ New Jersey Med METHOD FOR THE DESTABILIZATION OF ANTITOXINES
US9040059B2 (en) 2007-10-05 2015-05-26 The Arizona Board Of Regents For And On Behalf Of Arizona State University Recombinant bacterium capable of eliciting a protective immune response against C. perfringens
JP5210675B2 (ja) * 2008-03-19 2013-06-12 株式会社東芝 不揮発性半導体記憶装置及びその製造方法
CA2726293C (en) 2008-06-03 2017-02-28 University Of Maryland, Baltimore Non-hemolytic clya for excretion of proteins
US8647642B2 (en) 2008-09-18 2014-02-11 Aviex Technologies, Llc Live bacterial vaccines resistant to carbon dioxide (CO2), acidic PH and/or osmolarity for viral infection prophylaxis or treatment
WO2010045620A1 (en) 2008-10-17 2010-04-22 The Arizona Board Of Regents For And On Behalf Of Arizona State University Recombinant bacterium capable of eliciting an immune response against streptococcus pneumoniae
US9163219B2 (en) * 2009-04-14 2015-10-20 Arizona Board Of Regents On Behalf Of Arizona State University Single expression vector for generation of a virus with a segmented genome
WO2010135563A1 (en) 2009-05-22 2010-11-25 The Arizona Board Of Regents For And On Behalf Of Arizona State University Recombinant bacterium and methods of antigen and nucleic acid delivery
US9045742B2 (en) * 2009-05-29 2015-06-02 The Arizona Board Of Regents For And On Behalf Of Arizona State University Recombinant Edwardsiella bacterium
US10046040B2 (en) 2009-11-16 2018-08-14 University Of Maryland, Baltimore Multivalent live vector vaccine against Clostridium difficile-associated disease
US9062297B2 (en) 2010-01-13 2015-06-23 The Arizona Board Of Regents For And On Behalf Of Arizona State University Yersinia pestis vaccine
WO2011091291A1 (en) 2010-01-22 2011-07-28 The Arizona Board Of Regents For And On Behalf Of Arizona State University BACTERIUM COMPRISING A REGULATED rfaH NUCLEIC ACID
WO2011150421A2 (en) 2010-05-28 2011-12-01 The Arizona Board Of Regents For And On Behalf Of Arizona State University Recombinant bacterium to decrease tumor growth
US9217152B2 (en) 2010-11-23 2015-12-22 Oslo Universitetssykehus Hf DinQ-sRNA type I toxin-antitoxin system for plasmid maintenance
WO2012087483A1 (en) * 2010-11-24 2012-06-28 The Arizona Board Of Regents For And On Behalf Of Arizona State University Recombinant bacterium comprising a toxin/antitoxin system
US9303264B2 (en) 2012-05-18 2016-04-05 The Arizona Board Of Regents For And On Behalf Of Arizona State University Photosynthetic microorganisms expressing thermostable lipase
WO2014062580A1 (en) 2012-10-15 2014-04-24 University Of Maryland, Baltimore Bacterial live vector vaccines expressing chromosomally-integrated foreign antigens
US9580718B2 (en) 2013-06-17 2017-02-28 Arizona Board Of Regents On Behalf Of Arizona State University Attenuated live bacteria with increased acid resistance and methods of use thereof
US10494421B2 (en) 2014-02-10 2019-12-03 Univercells Nv System, apparatus and method for biomolecules production
AR102547A1 (es) 2014-11-07 2017-03-08 Takeda Vaccines Inc Vacunas contra la enfermedad de manos, pies y boca y métodos de fabricación y su uso
AR102548A1 (es) 2014-11-07 2017-03-08 Takeda Vaccines Inc Vacunas contra la enfermedad de manos, pies y boca y métodos de fabricación y uso
US10676723B2 (en) 2015-05-11 2020-06-09 David Gordon Bermudes Chimeric protein toxins for expression by therapeutic bacteria
US11129906B1 (en) 2016-12-07 2021-09-28 David Gordon Bermudes Chimeric protein toxins for expression by therapeutic bacteria
US11180535B1 (en) 2016-12-07 2021-11-23 David Gordon Bermudes Saccharide binding, tumor penetration, and cytotoxic antitumor chimeric peptides from therapeutic bacteria
CA3081586A1 (en) 2017-11-03 2019-05-09 Takeda Vaccines, Inc. Zika vaccines and immunogenic compositions, and methods of using the same
CN109321591B (zh) * 2018-10-22 2021-07-13 上海海洋大学 一种重组质粒及其构建方法
EP4114918A4 (en) * 2020-03-05 2025-04-09 University of Maryland, Baltimore Live Salmonella Typhi vectors engineered for the expression of cancer protein antigens and methods of using them

Family Cites Families (18)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4735801A (en) 1982-09-07 1988-04-05 Board Of Trustees Of Leland Stanford Jr. University Novel non-reverting salmonella live vaccines
US5643771A (en) 1980-05-19 1997-07-01 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Non-reverting live bacterial vaccines
DK410783D0 (da) * 1982-09-16 1983-09-09 Benzon A Salfred Fremgangsmade til stabilisering af plasmider
US4764370A (en) * 1984-09-12 1988-08-16 Scripps Clinic And Research Foundation Vaccine utilizing an avirulent strain of Salmonella typhimurium
DK275685D0 (da) 1985-06-18 1985-06-18 Benzon As Alfred Stabilisering af biologiske systemer
ATE107697T1 (de) 1986-03-26 1994-07-15 Genexpress Aps Biologische eindämmung.
JPH04501351A (ja) * 1987-10-07 1992-03-12 ワシントン ユニバーシティ 細胞の遺伝的集団において所望の組換え遺伝子を維持する方法
US5811105A (en) 1987-12-23 1998-09-22 Glaxo Wellcome, Inc. Vaccines containing bacteria attenuated by mutations in two genes of the aromatic amino acid biosynthetic pathway
GB8912330D0 (en) 1989-05-30 1989-07-12 Wellcome Found Live vaccines
GB9007194D0 (en) 1990-03-30 1990-05-30 Wellcome Found Live vaccines
US5695983A (en) 1990-12-18 1997-12-09 The General Hospital Corporation Salmonella vaccines
US5459072A (en) 1992-02-25 1995-10-17 Regents Of The University Of Minnesota Food-grade integration vectors for industrial bacterial strains
AU6014094A (en) 1992-12-02 1994-06-22 Baylor College Of Medicine Episomal vectors for gene therapy
US5763270A (en) 1995-06-07 1998-06-09 Genemedicine, Inc. Plasmid for delivery of nucleic acids to cells and methods of use
US5824538A (en) * 1995-09-06 1998-10-20 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Army Shigella vector for delivering DNA to a mammalian cell
US5922583A (en) 1995-10-17 1999-07-13 Biostar Inc. Methods for production of recombinant plasmids
GB9621091D0 (en) * 1996-10-09 1996-11-27 Fondation Pour Le Perfectionem Attenuated microorganisms strains and their uses
ES2286905T3 (es) * 1998-12-02 2007-12-01 University Of Maryland, Baltimore Sistema de estabilizacion de plasmidos para el suministro de antigenos.

Also Published As

Publication number Publication date
US7138112B2 (en) 2006-11-21
NZ529507A (en) 2005-05-27
US20050003539A1 (en) 2005-01-06
PL349041A1 (en) 2002-07-01
NO20012721L (no) 2001-07-31
US20060030047A1 (en) 2006-02-09
CA2352457A1 (en) 2000-06-08
DE69935927T2 (de) 2008-01-10
ES2286905T3 (es) 2007-12-01
US20060030048A1 (en) 2006-02-09
WO2000032047A1 (en) 2000-06-08
AU2036400A (en) 2000-06-19
EP1135025B1 (en) 2007-04-25
EP1135025A4 (en) 2004-11-17
AU776562B2 (en) 2004-09-16
EP1135025A1 (en) 2001-09-26
DK1135025T3 (da) 2007-08-13
JP2003506007A (ja) 2003-02-18
US7125720B2 (en) 2006-10-24
US20060029616A1 (en) 2006-02-09
HUP0104609A2 (hu) 2002-03-28
DE69935927D1 (de) 2007-06-06
US20040161420A1 (en) 2004-08-19
US6703233B1 (en) 2004-03-09
WO2000032047A9 (en) 2001-04-19
US7141408B2 (en) 2006-11-28
NO20012721D0 (no) 2001-06-01
US6969513B2 (en) 2005-11-29
US6977176B2 (en) 2005-12-20
NZ511449A (en) 2004-05-28
ATE360366T1 (de) 2007-05-15

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US6969513B2 (en) Plasmid maintenance system for antigen delivery
US6936425B1 (en) Attenuated salmonella SP12 mutants as antigen carriers
EP1921149A1 (en) Microorganisms as carriers of nucleotide sequences coding for antigens and protein toxins, process of manufacturing and uses thereof
US6537558B2 (en) Methods of producing and using virulence attenuated poxR mutant bacteria
US6413768B1 (en) Expression plasmids
US20110189225A1 (en) Attenuated bacteria useful in vaccines
Yan et al. Asd-based balanced-lethal system in attenuated Edwardsiella tarda to express a heterologous antigen for a multivalent bacterial vaccine
US8728760B2 (en) Microcin H47 plasmid selection system
US8076130B2 (en) Plasmid maintenance system for antigen delivery
AU2001292051B2 (en) Stabilisation of plasmid inheritance in bacteria by preventing multimerisation
NZ529508A (en) Plasmid maintenance system for antigen delivery
MXPA01005449A (en) Plasmid maintenance system for antigen delivery