CZ20013268A3

CZ20013268A3 - Nové polypeptidy a polynukleotidy

Info

Publication number: CZ20013268A3
Application number: CZ20013268A
Authority: CZ
Inventors: Claudine Elvire Marie Bruck; Jean-Pol Cassart; Thierry Coche; Y De Bassols Carlota Vinals
Original assignee: Smithkline Beecham Biologicals S. A.
Priority date: 1999-03-11
Filing date: 2000-03-09
Publication date: 2002-02-13
Also published as: JP2002538787A; EP1165778A2; WO2000053748A3; HK1044794B; US7470782B2; WO2000053748A2; HUP0200366A2; PT1165778E; AU756398B2; US20060052593A1; KR20020008125A; TR200102781T2; NO20014293D0; KR100674784B1; BR0008917A; DE60031383T2; IL145047A0; ES2273670T3; CN100430478C; CN1370231A

Description

(57) Anotace:

Řešení popisuje CASB618 polynukleotidy a polypeptidy a způsoby produkce takových polypeptidů rekombinantními technikami. Řešení také popisuje způsoby pro použití CASB618 polynukleotidů a polypeptidů v diagnostice a vakcínách pro profylaktickou a terapeutickou léčbu nádorů, zejména karcinomu tlustého střeva a vaječníků, autoimunitních onemocnění a podobných stavů.

(51)lnt. Cl. :
C 12 N	15/12
C07K	14/47
C 12N	15/75
C12N	5/10
A61 K	38/17
C 07 K	16/18
G01N	33/68
G01 N	33/574

C 12 Q 1/68

Nové polypeptidy a polynukleotidy

Oblast techniky

Předkládaný vynález se týká polynukleotidů, zde označovaných jako CASB618 polynukleotidy, polypeptidů kódovaných těmito polynukleotidy (zde označovaných jako CASB618 polypeptidy), rekombinantnich materiálů a způsobů jejich přípravy. V jiném aspektu se předkládaný vynález týká způsobů použití takových polypeptidů a polynukleotidů, včetně . způsobů léčby nádorů, jako je karcinom tlustého střeva, a autoimunitních onemocnění a jiných stavů. V dalším aspektu se vynález týká způsobů pro identifikaci agonistů a antagonistů/inhibitorů za použití materiálů poskytnutých v předkládaném vynálezu, a způsobů léčby stavů asociovaných s nerovnováhou v CASB618 polypeptidů, za použití identifikovaných sloučenin. V ještě dalším aspektu se předkládaný vynález týká diagnostických testů pro detekci onemocnění asociovaných s nevhodnou aktivitou nebo koncentrací CASB618 polypeptidů.

Dosavadní stav techniky

Polypeptidy a polynukleotidy podle předkládaného vynálezu jsou důležitými imunogeny pro specifickou nebo profylaktickou f imunizaci proti nádorům, protože jsou specificky exprimovány nebo značně nadměrně exprimovány v nádorech ve srovnání s normálními buňkami a mohou být zaměřeny imunitními mechanismy specifickými pro antigen, které vedou k destrukci nádorové buňky. Mohou být také použity pro diagnostiku přítomnosti nádorových buněk. Dále, jejich nevhodná exprese může za některých okolností způsobit indukci autoimunitní, nevhodné imunitní reakce, která může být korigována vhodnou • ·· ··· ... »« ...

vakcinací za použiti stejných polypeptidů nebo polynukleotidů. Z tohoto hlediska jsou nejdůležitější antigenní a imunogenní aktivity polypeptidů podle předkládaného vynálezu. Polypeptid podle předkládaného vynálezu může mít také alespoň jednu biologickou aktivitu CASB618 polypeptidů, která z něj může činit cil pro terapeutickou nebo profylaktickou intervenci odlišnou od jeho použiti jako imunoterapeutického činidla.

i . Funkční genomika spočívá ve vysoce výkonných technologiích sekvenování DNA a v různých bioinformatických nástrojích pro identifikaci požadovaných genových sekvencí z mnoha molekulárně-biologických databází. cDNA knihovny obohacené od geny týkající se určité tkáně nebo fyziologické situace mohou být připraveny za použití nově vyvinutých strategií odečtového klonování. Dále, cDNA nacházející se v knihovnách určitých tkání a ne v jiných může být identifikována za použití vhodných elektronických skríningových metod. Vysoce výkonná genomová nebo genová biologie umožňuje nové přístupy pro identifikaci a klonování cílových genů použitelných pro vyvolání imunitní reakce pro prevenci a přípravu vakcinace pro onemocnění jako jsou nádorová onemocnění a autoimunitní onemocnění.

Podstata vynálezu z V prvním aspektu se předkládaný vynález týká CASB618 polypeptidů. Mezi takové peptidy patří izolované polypeptidy obsahující aminokyselinovou sekvenci, která má alespoň 70% identitu, výhodně alespoň 80% identitu, ještě lépe alespoň 90% identitu, ještě lépe alespoň 95% identitu a nejlépe alespoň 97-99% identitu, se SEQ ID NO: 2 v celé délce SEQ ID NO: 2. Mezi takové polypeptidy patří ty, které obsahují aminokyseliny SEQ ID NO: 2.

• ·

Mezi další peptidy patři izolované polypeptidy, ve kterých má aminokyselinová sekvence alespoň 70% identitu, výhodně alespoň 80% identitu, ještě lépe alespoň 90% identitu, ještě lépe alespoň 95% identitu a nejlépe alespoň 97-99% identitu, s aminokyselinovou sekvencí SEQ ID NO: 2 v celé délce SEQ ID NO: 2. Mezi takové polypeptidy patří ty, které obsahují polypeptid SEQ ID NO: 2.

Mezi další peptidy podle předkládaného vynálezu patří izolované polypeptidy kódované polynukleotidem obsahujícím sekvenci obsaženou v SEQ ID NO: 1.

Vynález dále poskytuje imunogenní fragment CASB618 polypeptidu, který je kontinuální částí CASB618 polypeptidu, a který má stejné nebo podobné imunogenní vlastnosti jako polypeptid obsahující aminokyselinovou sekvenci SEQ ID NO: 2. To znamená, že fragment (pokud je to nutné, tak navázaný na nosič) , může vyvolat imunitní reakci, která rozpoznává CASB618 polypeptid. Takovým imunogenním fragmentem může být, například, CASB618 polypeptid bez N-koncové vedoucí sekvence, transmembránové domény nebo C-koncové kotvící domény. Ve výhodném aspektu obsahuje imunogenní fragment CASB618 podle předkládaného vynálezu v podstatě celou extracelulární doménu polypeptidu, která má alespoň 70% identitu, výhodně alespoň 80% identitu, ještě lépe alespoň 90% identitu, ještě lépe alespoň 95% identitu a nejlépe alespoň 97-99% identitu, se SEQ ID NO: 2 v celé délce SEQ ID NO: 2.

Peptidové fragmenty obsahující epitop CASB618 budou obvykle obsahovat alespoň 7, lépe 9 nebo 10 sousedících aminokyselin ze SEQ ID NO: 2. Výhodné epitopy jsou uvedeny v SEQ ID NO: 5 až SEQ ID NO: 7.

99 9 • 9· •· · · • ·· · • ·· • · · · · · ·· •♦ •· •· •· • ·

Peptidy obsahující tyto epitopy tvoří výhodný aspekt předkládaného vynálezu. Mimotopy, které mají stejné charakteristiky jako tyto epitopy, a imunogeny obsahující takové mimotopy, které generují imunitní reakci, která je zkříženě reaktivní s epitopem CASB618 molekuly, tvoří také součást předkládaného vynálezu. Předkládaný vynález tedy zahrnuje izolované peptidy obsahující tyto epitopy samotné jakýkoliv jejich mimotop. Výrazem mimotop se označuje entita, která se dostatečně podobá přirozenému CASB618 epitopu, aby mohla být rozpoznávána protilátkami, které rozpoznávají přirozenou molekulu (Gheysen, H.M. et al., 1986, Syntetic peptides as antigens, Wiley, Chichester; Ciba foundation symposium 119: 130-149; Gheysen, H.M., 1986, Molecular Immunology 23, 7, 709-715); nebo které mohou indukovat tvorbu takových protilátek, když jsou navázány uvedené protilátky reagují s přirozenou na vhodný nosič, kde molekulou.

epitopů mohou být

Peptidové mimotopy výše definovaných navrženy pro konkrétní účel pomocí adicí, delecí nebo substitucí aminokyselin. Tak mohou být peptidy podle předkládaného vynálezu modifikovány za účelem snadnější konjugace na proteinový nosič, konjugační terminální

Například, pro některé chemické metody může být žádoucí, aby epitop obsahoval cystein. Pro proteiny konjugované na proteinový být dále žádoucí, aby obsahovaly hydrofobní konec distálně od konjugovaného konce peptidu tak, že volný nekonjugovaný konec peptidu zůstává asociovaný s povrchem proteinového nosiče, peptidu a ta zvyšuje konformaci, která je nosič může

Toto snižuje konformační stupně volnosti pravděpodobnost toho, že peptid bude mít nejvíce podobná peptidu v celé molekule.

Například mohou být peptidy pozměněny tak, aby obsahovaly Nkoncový cystein a C-koncovou amidovanou koncovku.

• · • ·

Alternativně, adice nebo substituce D-stereoizomerické formy jedné nebo vice aminokyselin může být provedena pro vytvořeni výhodného derivátu, například za účelem zvýšení stability peptidu. Odborníkům v oboru bude jasné, že takové modifikované peptidy nebo mimotopy mohou být zcela nebo částečně nepeptidové mimotopy, jejichž zbytky nejsou omezeny na 20 přirozeně se vyskytujících aminokyselin. Dále mohou být tyto peptidy cyklizovány za použití technik známých v oboru, čímž se urči taková konformace peptidu, která je nejpodobnější konformaci peptidu, když je přítomen v celé molekule. Výhodnou metodou cyklizace peptidů je adice párů cysteinových zbytků pro umožnění tvorby disulfidového můstku.

Dále bude odborníkům v oboru jasné, že mimotopy nebo imunogeny podle předkládaného vynálezu mohou být větší než výše popsané epitopy, a jako takové mohou obsahovat sekvence popsané dále. Tak mohou mimotopy podle předkládaného vynálezu obsahovat N- a/nebo C-koncová prodloužení skládající se z různého počtu přirozených zbytků. Peptidové mimotopy mohou být také retrosekvencemi přirozených sekvencí, ve kterých je orientace sekvence obrácena; nebo alternativně může sekvence zcela nebo alespoň zčásti obsahovat D-stereoizomery aminokyselin (inverzní sekvence). Také mohou mít peptidové sekvence retro-inverzni charakter, kdy je orientace sekvence obrácena a aminokyseliny jsou v D-stereoizomerických formách. Takové retro- nebo retro-inverzni peptidu mají tu výhodu, že nejsou organismu vlastní, a proto mohou překonávat problémy spojené s tolerancí imunitního systému.

Alternativně mohou být peptidové mimotopy identifikovány za použití protilátek, které se váží na epitopy podle předkládaného vynálezu, za použití technik jako je fágová zobrazovací technologie (EP 0552267 Bl) . Tato technika generuje velký počet peptidových sekvencí, které napodobují strukturu přirozených peptidů a které se proto mohou vázat na protilátky proti přirozenému peptidu, ale které nemusí mít významnou homologii sekvence s přirozeným peptidem. Tento postup má výhody v tom, že umožňuje identifikaci peptidu se zesílenými imunogenními vlastnostmi, nebo peptidu překonávajícího problémy tolerance antigenu, které mohou být ti _ , spojeny s použitím prirozene peptidove sekvence. Dále tato _t technika umožňuje identifikaci charakteru rozpoznávání každého přirozeného peptidu ve smyslu chemických vlastností sdílených rozpoznávanými mimotopovými sekvencemi.

Kovalentní navázání peptidu na imunogenní nosič může být provedeno způsoby dobře známými v oboru. Například pro přímé kovalentní navázání je možno využít karbodiimid, glutaraldehyd nebo esteru (N-[γ-maleimidobutyryloxy]-sukcinimidu) , za použití běžných komerčně dostupných heterobifunkčních spojovacích činidel, jako je CDAP a SPDP (podle návodu výrobce). Po vazebné reakci může být imunogen snadno izolován a přečištěn pomocí dialýzy, gelové filtrace, frakcionace atd.

Typy nosičů použité jako imunogeny podle předkládaného vynálezu budou známé odborníkům v oboru. Funkcí nosiče je 'í poskytnout cytokinovou pomoc při vyvolání imunitní reakce proti peptidu. Příklady nosičů, které mohou být použity v předkládaném vynálezu, jsou: přílipkový hemokyanin (KLH), sérové albuminy, jako je hovězí sérový albumin )BSA), inaktivované bakteriální toxiny jako je tetanický nebo difterický toxin (TT a DT), nebo jejich rekombinantní fragmenty (například doména 1 fragmentu C TT, nebo translokační doména DT), nebo přečištěné proteinové deriváty tuberkulinu (PPD). Alternativně mohou být mimotopy nebo epitopy přímo konjugovány na liposomové nosiče, které mohou dále obsahovat imunogeny schopné stimulovat T-lymfocyty. Výhodně je poměr mimotopů k nosiči v řádu 1:1 až 20:1 a výhodně nese každý peptid přibližně 3-15 peptidů.

V provedeni předkládaného vynálezu je výhodným nosičem Protein D z Haemophilus influenzae (EP 0594610 Bl). Protein D je IgD-vazebný protein z Haemophilus influenzae a byl paetntován Forsgrenem (WO 91/18926, udělená EP 0594610 Bl). Za některých okolnosti, například v rekombinantních systémech pro expresi imunogenu, může být žádoucí použití fragmentů proteinu D, například proteinu D l/3^£d (který obsahuje N-koncových 100110 aminokyselin proteinu D (GB 9717953.5)).

Jiným výhodným způsobem prezentace peptidů podle předkládaného vynálezu je jejich prezentace v kontextu rekombinantní fúzní molekuly. Například EP 0421635 B popisuje použití chimérických částic jaderného antigenu hepadnaviru pro prezentaci cizorodých peptidových sekvencí v částicích podobných virům. Jako takové mohou imunogeny podle předkládaného vynálezu obsahovat peptidy přítomné v chimérických částicích obsahujících jaderný antigen viru hepatitidy B. Dále mohou rekombinantní fúzní proteiny obsahovat mimotopy podle předkládaného vynálezu a proteinový nosič, jako je NS chřipkového viru. Pro jakýkoliv rekombinantně exprimovaný protein, který je součástí předkládaného vynálezu, tvoří nukleová kyselina kódující uvedený imunogen také aspekt předkládaného vynálezu.

Peptidy použité v předkládaném vynálezu mohou být snadno syntetizovány technikami syntézy na pevné fázi, které jsou dobře známé v oboru. Syntéza může být provedena za použití Tboc nebo F-moc postupů. Cyklické peptidy mohou být syntetizovány na pevné fázi za použití dobře známých F-moc postupů a polyamidové pryskyřice v plně automatizovaném přístroji. Alternativně, odborníkům v oboru budou známy nutné laboratorní postupy pro manuální provedení tohoto procesu. Techniky a postupy pro syntézu na pevné fázi jsou popsány v Solid Phase Peptide Synthesis: A Practical Approach, E. Atherton and R.C. Sheppard, IRL, Oxford University Press (1989) . Aletrnativně mohou být peptidy produkovány rekombinantně, za použití exprese nukleové kyseliny kódující mimotopy v bakteriální nebo savčí buněčné linii, a potom pomocí přečištění exprimovaného mimotopu. Techniky pro rekombinantní expresi peptidů a proteinů jsou známé v boru a jsou popsány v Maniatis, T., Fritsch, E.F. and Sambrook et al., Molecular cloning, a laboratory manual, 2. vydání, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, 1989.

Polypeptidy nebo imunogenní fragmenty podle předkládaného vynálezu mohou být ve formě zralého proteinu nebo mohou být součástí většího proteinu, jako je prekursor fúzního proteinu. Často je výhodné použít další aminokyselinovou sekvenci, která obsahuje sekreční nebo vedoucí sekvence, pro-sekvence, sekvence usnadňující přečištění, jako jsou sekvence tvořené více histidinovými zbytky, nebo další sekvence napomáhající stabilizaci během rekombinantní produkce. Dále je také možno přidat exogenní polypeptid nebo lipidovou koncovku nebo polynukleotidovou sekvenci za účelem zvýšení imunogenního potenciálu finální molekuly.

V jednom aspektu se vynález týká geneticky upravených solubilních fúzních proteinů obsahujících polypeptid podle předkládaného vynálezu, nebo jeho fragment, a různé části konstantních regionů těžkých nebo lehkých imunoglobulinových řetězců různých podtříd (IgG, IgM, IgA, IgE). Výhodným imunoglobulinem je konstantní část těžkého řetězce lidského IgG, zejména IgGi, ve kterém je fúze provedena v pantovém regionu. V konkrétním provedení může být Fc část odstraněna jednoduše pomocí štěpící sekvence, která může být odštěpena srážecím faktorem Xa. Dále se předkládaný vynález týká způsobů přípravy těchto fúzních proteinů technikami genového inženýrství a jejich použití pro vyhledávání léků, diagnostiku a terapii. Další aspekt předkládaného vynálezu se také týká polynukleotidů kódujících takové fúzní proteiny. Příklady technologie fúzních proteinů jsou uvedeny v Mezinárodní patentové přihlášce č. WO 94/29458 a WO 94/22914.

Proteiny mohou být chemicky konjugovány nebo mohou být exprimovány jako rekombinantní fúzní proteiny, což umožňuje zvýšení množství produkovaného v expresním systému ve srovnání s nefúzovanými proteiny. Fúzní partner může napomoci v dodání epitopů pro T-helper lymfocyty (imunologický fúzní partner), výhodně pro epitopy pro T-lymfocyty rozpoznávané u člověka, nebo může napomoci při expresi proteinu (zesilovač exprese) ve větším množství ve srovnání s přirozeným rekombinantním proteinem. Výhodně je fúzní partner jak imunologický fúzní partner, tak zesilovač exprese.

Mezi fúzní partnery patří protein D z Haemophillus influenzae B a nestrukturální protein chřipkového viru, NS1 (hemaglutinin). Dalším imunologickým fúzním partnerem je protein známý jako LYTA. Výhodně se použije C-koncová část molekuly. Lyta je odvozen od Streptococcus pneumoniae, který syntetizuje N-acetyl-L-alanin-amidasu, amidasu LYTA, (kódovanou lytA genem (Gene 43 (1986), str. 265-272), která je autolysinem, který specificky degraduje některé vazby v peptidoglykanovém skeletu. C-koncová doména LYTA je odpovědná za afinitu k cholinu a některým analogům cholinu, jako je DEAE. Tato vlastnost byla využita pro přípravu plasmidů exprimujících C-LYTA v E. coli použitelných pro expresi fúzních proteinů. Přečištění hybridních proteinů obsahujících C-LYTA fragment na amino konci bylo popsáno (Biotechnology 10: 795-798, 1992). Je možné použít repetitivní část Lyta molekuly, která se nachází na C-konci, od zbytku 178, například zbytků 188-305.

Předkládaný vynález také zahrnuje varianty výše uvedených polypeptidů, to znamená polypeptidy, které se odlišují od referenčních polypeptidů konzervativními aminokyselinovými substitucemi, při kterých je jeden zbytek substituován jiným zbytkem s podobnými charakteristikami. Typické substituce jsou mezi Ala, Val, Leu a Ile; mezi Ser a Thr; mezi kyselými zbytky Asp a Glu; mezi Asn a Gin; a mezi alkalickými zbytky Lys a Arg; nebo mezi aromatickými zbytky Phe a Tyr. Zejména výhodné jsou varianty, ve kterých je několik, například 5-10, 1-5, 13, 1-2 nebo 1 aminokyselin, deletováno, substituováno nebo přidáno, v jakékoliv kombinaci.

Polypeptidy podle předkládaného vynálezu mohou být připraveny jakýmkoliv vhodným způsobem. Mezi takové polypeptidy patři izolované přirozené polypeptidy, rekombinantní polypeptidy, syntetické polypeptidy nebo polypeptidy produkované kombinací těchto metod. Prostředky pro přípravu takových polypeptidů jsou dobře známé v oboru.

V dalším aspektu se předkládaný vynález týká CASB618 polynukleotidů. Mezi takové polynukleotidy patří izolované polynukleotidy obsahující nukleotidovou sekvenci kódující polypeptid, který má alespoň 70% identitu, výhodně alespoň 80% identitu, ještě lépe alespoň 90% identitu, ještě lépe alespoň 95% identitu a nejlépe alespoň 97-99% identitu,

• 4 • 4 4

4444 4·

4

4·4

4 *4 4 s aminokyselinovou sekvencí SEQ ID NO; 2 v celé délce SEQ ID

NO: 2. V tomto provedení jsou výhodné polypeptidy mající alespoň 97% identitu, ještě výhodnější jsou polypeptidy mající alespoň 98-99% identitu; a nejvýhodnější jsou ty polypeptidy, které mají 99% identitu. Mezi takové polynukleotidy patří polynukleotid obsahující nukleotidovou sekvenci uvedenou v SEQ ID NO: 1 kódující polypeptid SEQ ID NO: 2.

Dalšími polynukleotidy podle předkládaného vynálezu jsou izolované polynukleotidy obsahující nukleotidovou sekvenci, která má alespoň 70% identitu, výhodně alespoň 80% identitu, ještě lépe alespoň 90% identitu, ještě lépe alespoň 95% identitu a nejlépe alespoň 97-99% identitu, s nukleotidovou sekvencí kódující polypeptid SEQ ID NO: 2 v celém kódujícím regionu. V tomto provedení jsou výhodné polynukleotidy mající alespoň 97% identitu, ještě výhodnější jsou polynukleotidy mající alespoň 98-99% identitu; a nejvýhodnější jsou ty polynukleotidy, které mají 99% identitu.

Dalšími polynukleotidy podle předkládaného vynálezu jsou izolované polynukleotidy obsahující nukleotidovou sekvenci, která má alespoň 70% identitu, výhodně alespoň 80% identitu, ještě lépe alespoň 90% identitu, ještě lépe alespoň 95% identitu a nejlépe alespoň 97-99% identitu, se sekvencí SEQ ID NO: 1, v celé délce SEQ ID NO: 1. V tomto provedení jsou výhodné polynukleotidy mající alespoň 97% identitu, ještě výhodnější jsou polynukleotidy mající alespoň 98-99% identitu; a nejvýhodnější jsou ty polynukleotidy, které mají 99% identitu. Mezi takové polynukleotidy patří polynukleotid obsahující polynukleotid SEQ ID NO: 1, stejně jako polynukleotid SEQ ID NO: 1. Uvedený polynukleotid může být insertován do vhodného plasmidu nebo rekombinantního vektoru a může být použit pro imunizaci (viz například Wolf et al., • · · · φ · · *♦·· ·· ··· ·9· ·»

Science 247: 1465-1468 (1990); Corr et al., J. Exp. Med. 184: 1555-1560 (1996); Doe et al., Proč. Nati. Acad. Sci. 93: 85788583 (1996)). Předkládaný vynález také poskytuje polynukleotidy, které jsou komplementární k popsaným polynukleotidům.

Vynález také poskytuje fragment CASB618 polynukleotidu, který má při podání jedinci stejné imunogenní vlastnosti jako polynukleotid SEQ ID NO: 1.

Vynález také poskytuje polynukleotid kódující imunologický fragment CASB618 polypeptidů, jak je zde definován.

Nukleotidová sekvence SEQ ID NO: 1 vykazuje homologii s Homo sapiens chromosomem 15, klonem 163_P_10 map 15 (přírůstkové č. GB_HTG4:AC009700). Nukleotidová sekvence SEQ ID NO: 1 je cDNA sekvence a obsahuje sekvenci kódující polypeptid (nukleotidy 259-1219) o 320 aminokyselinách, polypeptid SEQ ID NO: 2. Nukleotidová sekvence kódující polypeptid SEQ ID NO: 2 může být identická se sekvenci kódující polypeptid obsaženou v SEQ ID NO: 1, nebo to může být sekvence jiná než sekvence obsažená v SEQ ID NO: 1, která v důsledku degenerace genetického kódu také kóduje polypeptid SEQ ID NO: 2. Polypeptid SEQ ID NO: 2 není příbuzná s jakýmkoliv jiným proteinem známé funkce, s výjimkou hypotetického 42,1 kDa proteinu c06el.3 Caenorhabditis elegans.

Předpokládá se, že výhodné polypeptid a polynukleotid podle předkládaného vynálezu budou mít, mimo jiné, podobné biologické funkce/vlastnosti jako jejich homologní polypeptidy a polynukleotidy. Dále, výhodné polypeptidy, imunologické fragmenty a polynukleotidy podle předkládaného vynálezu mají alespoň jednu aktivitu SEQ ID NO: 1 nebo SEQ ID NO: 2.

Předkládaný vynález se také týká částečných nebo jinak neúplných polynukleotidových a polypeptidových sekvenci, které byly určeny před určením příslušných kompletních sekvencí SEQ

ID NO: 1 a SEQ ID NO: 2.

V souladu s tím předkládaný vynález poskytuje izolovaný polynukleotid, který:

(a) obsahuje nukleotidovou sekvenci, která má alespoň 70% identitu, výhodně alespoň 80% identitu, ještě lépe alespoň 90% identitu, ještě lépe alespoň 95% identitu a nejlépe alespoň 97-99% identitu, se sekvencí SEQ ID NO: 3, v celé délce SEQ ID NO: 3;

(b) má nukleotidovou sekvenci, která má alespoň 70% identitu, výhodně alespoň 80% identitu, ještě lépe alespoň 90% identitu, ještě lépe alespoň 95% identitu a nejlépe alespoň 97-99% identitu, se sekvencí SEQ ID NO: 3, v celé délce SEQ ID NO: 3;

(c) je polynukleotidem SEQ ID NO: 3.

Nukleotidová sekvence SEQ ID NO: 3 je odvozena od EST (exprimovaná koncovka) sekvencí. Odborníkům v oboru je známo, EST sekvence vždy obsahují určité nukleotidové chyby (viz Adams, M.D. et al., Nátuře 377 (supp) 3, 1995). Proto jsou v nukleotidové sekvenci SEQ ID NO: 3 nevyhnutelné určité nepřesnosti.

Polynukleotidy podle předkládaného vynálezu mohou být získány, za použití standardních klonovacích a skríningových technik, z cDNA knihovny odvozené z mRNA v buňkách lidského kolorektálního karcinomu, karcinomu plic, karcinomu dělohy a fetálních tkáních (viz například Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2. vydání, Cold Spring Harbor

Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989)).

Polynukleotidy podle předkládaného vynálezu mohou být také získány z přirozených zdrojů, jako jsou knihovny genomové DNA, nebo mohou být syntetizovány za použití dobře známých a komerčně dostupných technik.

Když jsou polynukleotidy podle předkládaného vynálezu použity pro rekombinantní produkci polypeptidů podle předkládaného vynálezu, tak mohou polynukleotidy obsahovat kódující sekvenci pro zralý polypeptid samotnou; nebo kódující sekvenci pro zralý polypeptid ve čtecím rámci s jinými kódujícími sekvencemi, jako jsou sekvence kódující vedoucí nebo sekreční sekvence, pre-, pro- nebo prepro- proteinové sekvence, nebo části fúzního peptidu. Například může být kódována markerová sekvence usnadňující přečištění fúzovaného polypeptidů. V některých provedeních předkládaného vynálezu je markerovou sekvencí hexa-histidinový peptid, jak je poskytnut v pQE vektoru (Qiagen, lne.) a jak je popsán v Gentz et al., Proč. Nati. Acad. Sci. USA (1989) 86: 821-824, nebo je touto sekvencí HA koncovka. Polynukleotid může také obsahovat nekódující 5' a 3' sekvence, jako jsou transkribovné, netranslatované sekvence, sestřihové a polyadenylační signály, vazebná místa pro ribozomy a sekvence, které stabilizují mRNA.

Další provedení předkládaného vynálezu zahrnuje polynukleotidy kódující varianty polypeptidů, které obsahují aminokyselinovou sekvenci SEQ ID NO: 2, ve které bylo provedeno několik, například 5 až 10, 1 až 5, 1 až 3, 1 až 2 nebo 1, aminokyselinových substitucí, delecí nebo adicí, v jakékoliv kombinaci.

Polynukleotidy, které jsou identické nebo dostatečně identické s nukleotidovou sekvencí obsaženou v SEQ ID NO: 1, mohou být použity jako hybridizačni sondy pro cDNA a genomovou DNA, nebo jako primery pro amplifikaci nukleové kyseliny (PCR), pro izolaci kompletní cDNA a genomových klonů kódujících polypeptidy podle předkládaného vynálezu a pro izolaci cDNA a genomových klonů jiných genů (včetně genů kódujících paralogy od člověka a paralogy od jiných druhů než od člověka), které mají vysokou podobnost sekvence s SEQ ID NO: 1. Typicky jsou tyto nukleotidové sekvence ze 70% identické, výhodně z 80% identické, ještě lépe z 90% identické, nejlépe z 95% identické s referenční sekvencí. Sondy nebo primery obvykle obsahují alespoň 15 nukleotidů, lépe alespoň 30 nukleotidů a mohou mít délku alespoň 50 nukleotidů. Zejména výhodné sondy mají délku 30 až 50 nukleotidů. Zejména výhodné primery mají délku mezi 20 a 25 nukleotidy. Konkrétně, polypeptidy nebo polynukleotidy odvozené ze sekvencí z homologického živočicha mohou být použity jako imunogeny pro získání zkřížené imunitní reakce na lidský gen.

Polynukleotid kódující polypeptid podle předkládaného vynálezu, včetně homologů od jiných druhů než od člověka, mohou být získány způsobem, který zahrnuje krok vyšetřování vhodné knihovny za přísných hybridizačních podmínek pomocí značené sondy mající sekvenci SEQ ID NO: 1 nebo jejího fragmentu; a krok izolace kompletního cDNA nebo genomového klonu obsahujícího uvedenou polynukleotidou sekvenci. Takové hybridizačni techniky jsou dobře známé v oboru. Výhodnými přísnými hybridizačními podmínkami jsou inkubace přes noc při 42 °C v roztoku obsahujícím: 50% formamid, 5xSSC (150 mM NaCl, 15 mM natrium-citrát), 50 mM fosforečnan sodný (pH 7,6), 5x Denhartův roztok, 10% dextran-síran, a 20 gg/ml denaturované, rozštěpené lososí spermatické DNA; potom promytí filtrů v 0,1 x SSC při přibližně 65 °C. Tak předkládaný vynález také • · ·· • · · • · · · * * · · # ··· 4·· ·« ·«· zahrnuje polynukleotidy získatelné vyšetřováním vhodné knihovny za přísných hybridizačních podmínek se značenou sondou mající sekvenci SEQ ID NO: 1 nebo jejího fragmentu.

Odborníkům v oboru bude jasné, že v mnoha případech bude izolovaná cDNA sekvence nekompletní v tom, že region kódující polypeptid bude kratší na 5' konci cDNA.

V oboru existuje několik metod pro získání kompletní cDNA nebo pro prodloužení kratších cDNA, jako jsou například techniky na bázi rychlé amplifikace konců cDNA (RACE) (viz například Frohman et al., PNAS USA, 85: 8998-9002, 1988). Nedávné modifikace této techniky, jako je například Marathon^tmtechnology (Clontech Laboartories, lne.), významně zjednodušily vyhledávání delších cDNA. V Marathon^tm technologii se cDNA připraví z mRNA extrahované vybrané tkáně a na každý konec se liguje adaptorová sekvence. Amplifikace nukleové kyseliny (PCR) se potom provede za účelem amplifikace 'chybějícího' 5' konce cDNA za použití genově specifického a adaptor-specifického oligonukleotidového primeru. PCR reakce se potom opakuje za použití 'nested' primerů, to znamená primerů navržených tak, aby se vázaly na amplifikovaný produkt (typicky se jedná o adaptor-specifický primer, který se váže na dále 3' v adaptorové sekvenci, a genově specifický primer, který se váže dále 5' v sekvenci známého genu). Produkty této reakce mohou být potom analyzovány DNA sekvencováním a kompletní cDNA může být připravena navázáním produktu přímo na existující cDNA za zisku kompletní sekvence, nebo provedením samostatné kompletní PCR za použití nové sekvence pro návrh 5' primeru.

Rekombinantní polypeptidy podle předkládaného vynálezu mohou být připraveny způsoby dobře známými v oboru z geneticky upravených hostitelských buněk obsahujících expresní systémy. V souladu s tím se v dalším aspektu předkládaný vynález týká expresního systému, který obsahuje polynukleotidy podle předkládaného vynálezu, hostitelských buněk, které jsou geneticky upraveny pomocí takových expresních systémů, a produkce polypeptidů podle předkládaného vynálezu rekombinantními technikami. Bezbuněčné translační systémy mohou být také použity pro produkci takových proteinů za použití RNA odvozených z DNA konstruktů podle předkládaného vynálezu.

Pro rekombinantní produkci mohou být hostitelské buňky upraveny tak aby obsahovaly expresní systémy nebo jejich části pro polynukleotidy podle předkládaného vynálezu. Vloženi polynukleotidů do hostitelských buněk může být provedeno způsoby popsanými v mnoha standardních laboratorních manuálech, jako je Davis et al., Basic Methods in Molecular Biology (1986) a Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2. vydání, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989). Výhodnými metodami je, například, transfekce fosforečnanem vápenatým, transfekce zprostředkovaná DEAE-dextranem, transvekce, mikroinjekce, transfekce zprostředkovaná kationtovými lipidy, elektroporace, transdukce, vkládání fragmentů, technika genového děla nebo infekce.

Výhodně jsou proteiny podle předkládaného vynálezu exprimovány současně s thioredoxinem v trans konfiguraci (TIT). Současná exprese thioredoxinu v trans versus cis konfiguraci je výhodná proto, aby byl antigen nevázaný na thioredoxin bez potřeby proteasy. Současná exprese thioredoxinu usnadňuje solubilizaci proteinů podle předkládaného vynálezu. Současná exprese thioredoxinu také významně ovlivňuje výtěžek proteinu při přečištěni, solubilitu přečištěného proteinu a jeho kvalitu.

Reprezentativními příklady vhodných hostitelů jsou bakteriální buňky, jako jsou Streptococci, Staphylococci, E. coli, Streptomyces a Bacillus subtilis; houby, jako jsou kvasinky a buňky Aspergillus; hmyzí buňky, jako jsou Drosophila S2 a Spodoptera Sf9 buňky; živočišné buňky, jako jsou CHO, COS, HeLa, C127, 3T3, BHK, HEK 293 a Bowesovi melanomové buňky; a rostlinné buňky.

Mohou být použity různé expresní systémy, například chromosomální, episomální a virové systémy, například vektory odvozené od bakteriálních plasmidů, od bakteriofágů, od transposonů, od kvasinkových episomů, od inserčních elementů, od kvasinkových chromosomálních elementů, od virů jako je bakulovirus, papova viry, jako je SV40, virů vakcinie, adenovirů, virů drůbežích neštovic, virů pseudovztekliny a retrovirů, a vektorů odvozených z jejich kombinací, jako jsou vektory odvozené z plasmidových a bakteriofágových genetických elementů, jako jsou kosmidy a fágemidy. Expresní systémy mohou obsahovat kontrolní regiony, které regulují, stejně jako indukují expresi. Obecně může být použit jakýkoliv systém nebo vektor, který je schopen udržovat, propagovat nebo exprimovat polynukleotid za produkce polypeptidů v hostiteli. Vhodné nukleotidové sekvence mohou být insertovány do expresního systému za použití jakékoliv z dobře známých a rutinních technik, jak jsou například techniky uvedené v Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (výše). Požadovaný polypeptid může obsahovat vhodné sekreční signály umožňující sekreci translatovaného proteinu do lumen endoplasmatického retikula, periplasmatického prostoru nebo do extracelulárního prostředí. Tyto signály mohou být endogenní vzhledem • · Σ : · · · · • · « <> · · * - _Λ * * _ * _ * “ · W T · 0 A 4 « k polypeptidu, nebo se může jednat o heterologní signály.

Expresním systémem může být také rekombinantni živý mikroorganismus, jako je virus nebo bakterie. Požadovaný gen může být insertován do genomu živého rekombinantního viru nebo bakterie. Inokulace a in vivo infekce tímto živým vektorem povede k in vivo expresi antigenu a indukci imunitní reakce. Mezi viry a bakterie použitelné pro tento účel patří například: poxviry (například virus vakcinie, drůbežích neštovic, kanářích neštovic), alfaviry (Sindbis virus, Semliki Forest virus, virus venezuelské koňské horečky), adenoviry, adeno-asociované viry, picornaviry (poliovirus, rhinovirus), herpesviry (virus varicella-zoster, atd.), Listeria, Salmonella, Shigella, BCG. Tyto viry a bakterie mohou být virulentní nebo různým způsobem atenuované, aby bylo možno připravit živé vakcíny. Takové živé vakcíny také tvoři část předkládaného vynálezu.

Polypeptidy podle předkládaného vynálezu mohou být získány a přečištěny z kultur rekombinantních buněk za použití dobře známých metod, jako je srážení síranem amonným nebo ethanolem, extrakce kyselinou, aniontová nebo kationtová iontoměničová chromatografie, chromatografie na fosfocelulose, chromatografie s hydrofobní interakcí, afinitni chromatografie, hydroxyapatitová chromatografie a lektinová chromatografie. Nejlépe se pro přečištěni použije afinitní chromatografie na iontech kovu (IMAC). Dobře známé techniky pro skládáni proteinů mohou být použity pro regeneraci aktivní konformace tehdy, když je polypeptid denaturován během intracelulární syntézy, izolace a nebo přečištění.

Jiný důležitý aspekt předkládaného vynálezu se týká způsobu pro indukci, zesílení nebo modulováni imunologické reakce u «· • · 4 ··

	•	··
	•	• · • ♦	··
	•	• · ·
	•	• ·
··	···	• 4	··

savce, který zahrnuje očkováni savce fragmentem nebo celým polypeptidem podle předkládaného vynálezu, adekvátně pro produkci protilátkové a/nebo T-lymfocytárni imunitní reakce pro profylaktickou nebo terapeutickou léčbu nádorů a autoimunitních onemocnění a příbuzných onemocnění. Ještě jiný aspekt předkládaného vynálezu se týká způsobu pro indukci, zesílení nebo modulování imunologické reakce u savce, který zahrnuje podání polypeptidu podle předkládaného vynálezu pomocí vektoru nebo buňky řídící expresi polynukleotidu a kódující polypeptid in vivo, za účelem indukce takové imunitní reakce pro profylaktickou nebo terapeutickou léčbu onemocnění u uvedeného savce.

Další aspekt předkládaného vynálezu se týká imunologického/ vakcinačního prostředku (přípravku), který po podání savci indukuje, zesiluje nebo moduluje imunologickou reakci savce na polypeptid podle předkládaného vynálezu, kde uvedený prostředek obsahuje polypeptid nebo polynukleotid podle předkládaného vynálezu nebo jeho imunologický fragment, jak je zde definován. Vakcinační prostředek může dále obsahovat vhodný nosič. Protože polypeptid může být degradován v žaludku, je výhodné podat ho parenterálně (například podkožně, intramuskulárně, intravenosně nebo intradermálně). Mezi prostředky vhodné pro parenterálni podání patří vodné a non-vodné sterilní injekční roztoky, které mohou obsahovat antioxidační činidla, pufry, bakteriostatika a soluty, které činí roztok izotonickým s krví příjemce; a vodné a nevodné sterilní suspenze, které mohou obsahovat suspendační nebo zahušťovací činidla. Prostředky mohou být připraveny v jednodávkových nebo vícedávkových zásobnících, například v uzavřených ampulích a lékovkách, a mohou být uskladněny v lyofilizovaném stavu, který vyžaduje pouze přidání sterilního kapalného nosiče bezprostředně před použitím.

44 4 ···

4 4 44 44444

4444 4 444

4444 44444

4 4 4 44 4

4444 44 444 444 444

Další aspekt předkládaného vynálezu se týká in vitro indukce imunitních reakcí na fragment nebo celý polypeptid nebo polynukleotid podle předkládaného vynálezu, nebo na molekulu obsahující polypeptid nebo polynukleotid podle předkládaného vynálezu, za použití buněk z imunitního systému savce, a zpětnou infusi těchto aktivovaných imunitních buněk savci za účelem léčby onemocnění. Aktivace buněk imunitního systému se provede in vitro inkubací celého polypeptidu nebo polynukleotidu podle předkládaného vynálezu nebo molekuly obsahující polypeptid nebo polynukleotid podle předkládaného vynálezu za přítomnosti nebo nepřítomnosti různých imunomodulačních molekul. Další aspekt předkládaného vynálezu se týká imunizace savce pomocí podání buněk prezentujících antigen modifikovaných in vitro naplněním částí nebo celým polypeptidem podle předkládaného vynálezu nebo molekulou obsahující polypeptid podle předkládaného vynálezu a jejich podáním in vivo imunogenním způsobem. Alternativně mohou být buňky prezentující antigen transfektovány in vitro vektorem obsahujícím fragment nebo celý polynukleotid podle předkládaného vynálezu nebo molekulu obsahující polynukleotid podle předkládaného vynálezu, který exprimuje příslušný polypeptid, a podáním buněk in vivo imunogenním způsobem.

Vakcinační prostředek podle předkládaného vynálezu může také obsahovat adjuvantní systémy pro zesílení imunogenicity prostředku. Výhodně vyvolává adjuvantní systém přednostně reakci Thl typu.

Imunitní reakce může být obecně rozdělena do dvou krajních kategorií, kterými jsou humorální nebo buněčná imunitní reakce (které jsou tradičně charakterizovány protilátkovými a buněčnými efektorovými mechanismy ochrany, v příslušném • · ·· pořadí). Tyto typy odpovědi se označují jako odpověď Thl-typu (buněčná) a odpověď Th2-typu (humorální).

Extrémní imunitní reakce Thl typu mohou být charakterizovány tvorbou antigen-specifických, haplotypově restrihovaných T-lymfocytů, a reakcí přirozených zabiječů. U myší jsou reakce Thl typu často charakterizovány tvorbou protilátek IgG2a podtřídy, zatímco u lidí se tvoří IgGl typ protilátek. Th2-typ imunitní reakce je charakterizován tvorbou různých izotypů imunoglobulinů, u myší například IgGl, IgA a IgM.

Hlavním faktorem určujícím typ vyvolané reakce jsou cytokiny. Vysoké koncentrace cytokinů Thl typu upřednostňují indukci buněčné imunitní reakce, zatímco vysoké koncentrace cytokinů Th2 typu upřednostňují indukci protilátkové imunitní reakce na antigen.

Rozlišení mezi Thl a Th2-typem imunitní reakce není absolutní, ve skutečnosti se u jedince rozvíjí imunitní reakce, která je především Thl nebo Th2 typu. Nicméně, často je výhodné dělit cytokiny do rodin podle definice pro myší CD4+ve T-lymfocytární klony uvedené v Mosmann a Coffman (Mosmann, T.R., and Coffman, R.L., (1989), TH1 and Th2 cells:

different patterns of lymphokine secretion lead to different functional properties. Annual Review of Immunology, 7, str. 145-173). Tradičně jsou reakce Thl typu asociovány s produkcí INF-γ a IL-2 cytokinů T-lymfocyty. Jiné cytokiny často přímo asociované s indukcí imunitních reakcí Thl typu nejsou produkovány T-lymfocyty, jako například IL-12. Reakce Th2 typu jsou asociovány se sekrecí IL-4, IL-5, IL-6 a IL-13.

Je známo, že některá adjuvans pro vakcíny jsou zejména ···· · · ·· • · · · · · · ··· vhodné pro stimulaci cytokinové reakce Thl nebo Th2 typu. Tradičními nej lepšími indikátory Thl:Th2 rovnováhy imunitní reakce po vakcinaci nebo infekci jsou přímé měření produkce Thl nebo Th2 cytokinů T-lymfocyty in vitro po restimulaci antigenem, a/nebo měření poměru IgGl:IgG2 protilátkové reakce specifické pro antigen.

Výhodným adjuvans Thl-typu je takové adjuvans, které přednostně stimuluje izolované populace T-lymfocytů k produkci vysokých koncentrací cytokinů Thl typu při restimulaci antigenem in vitro, a které podporuje vznik jak CD8+ cytotoxických T-lymfocytů, tak imunoglobulinových reakcí specifických pro antigen spojených s reakcí Thl typu. Adjuvans, která jsou schopná přednostní stimulace reakce Thl typu, jsou popsána v Mezinárodní patentové přihlášce č. WO 94/00153 a WO 95/17209.

Jedním takovým adjuvans je 3-de-0-acylovaný monofosforyl lipid A (3D-MPL). Tento je známý z GB 2220211 (Ribi). Chemicky se jedná o směs 3de-0-acylovaného monofosforyl lipidu A s 4, 5 nebo 6 acylovanými řetězci a je vyráběn Ribi Immunochem, Montana. Výhodná forma 3-de-O-acylovaného monofosforyl lipidu A je popsána v Evropské patentové přihlášce 0689454 B1 (Smith Kline Beecham Biologicals SA).

Výhodně jsou částice 3D-MPL dostatečně malé pro to, aby mohly být sterilně filtrovány přes 0,22 mikronovou membránu (Evropská patentová přihláška 0689454). 3D-MPL bude přítomen v množství v rozmezí 10 μς-100 gg, lépe 25 μg-50 μg na dávku, ve které je antigen typicky přítomen v množství v rozmezí 2-50 μ9 na dávku.

Jiným vhodným adjuvans je QS21, HPLC přečištěná netoxická frakce z kůry Quillaja Saponaria Molina. Volitelně může být toto adjuvans ve směsi s 3-de-0-acylovaným monofosforyl lipidem A (3D-MPL), volitelně společně s nosičem.

Způsob pro přípravu QS 21 je popsán v US patentu č. 5057540.

Nereaktogenní adjuvantní prostředky obsahující QS21 byly popsány dříve (WO 96/33739). Bylo prokázáno, že takové prostředky obsahující QS21 a cholesterol jsou úspěšnými Thl stimulačními adjuvans, když jsou připraveny společně s antigenem.

Dalšími adjuvans, které jsou přednostní stimulátory Thl reakce, jsou imunomodulační oligonukleotidy, například nemethylované CpG sekvence, jak jsou popsány ve WO 96/02555.

Kombinace různých Thl stimulačních adjuvans, jako jsou adjuvans uvedená výše, se také berou v úvahu jako možnost pro přípravu adjuvans, které je přednostním stimulátorem Thl reakce. Například, QS21 může být připraven společně s 3D-MPL. poměr QS21:3D-MPL je obvykle v řádu 1:10 až 10:1; výhodně 1:5 až 5:1 a často 1:. Výhodný poměr 3D-MPL:QS21 pro optimální synergii je 2,5:1 až 1:1.

Výhodně obsahuje vakcinační prostředek podle předkládaného vynálezu také nosič. Nosičem může být emulze olej ve vodě nebo sůl hliníku, jako je fosforečnan hlinitý nebo hydroxid hlinitý.

Výhodné emulze olej ve vodě obsahuje metabolizovatelný olej, jako je skvalen, α-tokoferol a Tween 80. Ve výhodném provedení jsou antigeny ve vakcinačním prostředku podle • · ·· • · · • ♦ ·· ·· • » · • · předkládaného vynálezu kombinovány s QS21 a 3D-MPL v takové emulzi. Dále může emulze olej ve vodě obsahovat spán 85 a/nebo lecitin a/nebo tricaprylin.

Obvykle jsou pro podání člověku QS21 a 3D-MPL přítomny ve vakcíně v dávce 1 μς-200 gg, například 10-100 gg, lépe 10 gg-50 μς na dávku. Obvykle obsahuje emulze olej ve vodě od 2% do 10% skvalenu, od 2 do 10% α-tokoferolu a od 0,3 do 3% Tween 80.

*» Výhodně je poměr skvalenu ku alfa-tokoferolu roven nebo menší než 1, protože tím se získá stabilnější emulze. Spán 85 může být přítomen v koncentraci 1%. V některých případech může být výhodné, aby vakcíny podle předkládaného vynálezu obsahovaly také stabilizační činidla.

Netoxické emulze olej ve vodě výhodně obsahují netoxický olej, například skvalan nebo skvalen, emulgátor, například Tween 80, ve vodném nosiči. Vodným nosičem může být například fosfátem pufrovaný salinický roztok.

Mimořádně účinný adjuvantní přípravek obsahující QS21, 3DMPL a tokoferol v emulzi olej ve vodě je popsán ve WO 95/17210.

Předkládaný vynález také poskytuje polyvalentní vakcinační přípravek obsahující vakcinační prostředek podle předkládaného vynálezu v kombinaci s jinými antigeny, zejména antigeny použitelnými při léčbě nádorů, autoimunitních onemocnění a podobných stavů. Takový polyvalentní vakcinační prostředek může obsahovat Th-1 adjuvans, jak zde bylo popsáno.

Předkládaný vynález se také týká použiti polynukleotidů, ve formě primerů odvozených od polynukleotidu podle předkládaného vynálezu, a polypeptidů, ve formě protilátek nebo činidel • · ♦ · · ··· • · · · ·· · · • · · ·· · ···· ·· ··· ··· ·· · specifických pro polypeptid podle předkládaného vynálezu, jako diagnostických činidel.

Identifikace genetických nebo biochemických markérů v krvi nebo ve tkáních, které umožňují detekci velmi časných změn při kancerogenesi, může napomoci ve výběru nej lepší léčby pro pacienta. Náhradní nádorové markéry, jako je exprese *

polynukleotidů, mohou být použity pro diagnostiku různých forem nebo stadií nádorů. Identifikace úrovně exprese polynukleotidů podle předkládaného vynálezu bude užitečná jak . při stagingu nádorového onemocnění, tak při gradingu nádorové tkáně. Při stagingu se určuje pokročilost nádorů podle přítomnosti či nepřítomnosti maligní tkáně v bioptovaných oblastech. Polynukleotidy podle předkládaného vynálezu mohou napomoci ve zdokonalení stagingového procesu pomocí identifikace markérů určujících agresivitu nádorů, například pomoci detekce přítomnosti nádorů v různých místech těla. Grading nádorů popisuje to, jak přesně se nádor podobá normální tkáni stejného typu a hodnotí se podle morfologie buněk a podle jiných znaků diferenciace. Polynukleotidy podle předkládaného vynálezu mohou být užitečné ve stanovení gradingu nádorů, stejně jako mohou napomoci ve stanovení stavu diferenciace nádorových buněk.

Diagnostické testy také nabízejí proces pro diagnostiku »' nebo určení rizika vzniku nádorů, autoimunitních onemocnění a příbuzných stavů, pomocí diagnostické metody, která zahrnuje určení abnormálně vyšší nebo nižší koncentrace polypeptid nebo mRNA ve vzorku získaném od jedince. Tato metoda diagnostiky je známá jako diferenciální exprese. Exprese určitého genu se srovnává v tkáni postižené onemocněním a v normální tkáni. Rozdíl v polynukleotidů souvisejícím s genem, mRNA nebo proteinu ve dvou tkáních se porovná, například z hlediska molekulové hmotnosti, aminokyselinové nebo nukleotidové sekvence nebo relativního množství, což ukáže na změny v genu, nebo v regulačním genu, ve tkáni u člověka, která je podezřelá z postiženi onemocněním.

Snížená nebo zvýšená exprese může být měřena na úrovni RNA. PolyA RNA se nejprve izoluje ze dvou tkání a detekce mRNA kódované genem odpovídajícím diferenciálně exprimovanému polynukleotidu podle předkládaného vynálezu může být detekována, například, hybridizací in šitu ve tkáňových řezech, RT-PCR, Northernovou hybridizací obsahující polyA+ mRNA, nebo jakoukoliv jinou přímou nebo nepřímou metodou detekce RNA. Zvýšená nebo snížená exprese dané RNA ve tkáni postižené onemocněním ve srovnání s normální tkání naznačuje, že transkript a/nebo exprimovaný protein má určitou úlohu při onemocnění. Proto detekce vyšších nebo nižších koncentrací mRNA odpovídající SEQ ID NO: 1 nebo 3 vzhledem k normálním tkáním ukazuje na přítomnost nádoru u pacienta.

Úroveň exprese mRNA ve vzorku může být určena pomocí přípravy knihovny exprimovaných koncovek sekvence (EST) ze vzorku. Relativní zastoupení EST v knihovně může být použito pro hodnocení relativního zastoupení genových transkriptů ve výchozím vzorku. EST analýza testovaného vzorku může být potom porovnána s EST analýzou referenčního vzorku pro stanovení relativní úrovně exprese daného polynukleotidu.

Jiné analýzy mRNA mohou být provedeny za použití metody sériové analýzy genové exprese (SAGE) (Velculescu et al., Science (1995) 270: 484), techniky diferenciálního zobrazení (např. US 5776683) nebo hybridizační analýzy, které spočívají ve specificitě nukleotidových interakcí.

·· ·· · · ·· • · ♦ ·· '· · · · · • · · · · · · ···· ·· ··· ··· ·· ·

Alternativně může být srovnání provedeno na proteinové úrovni. Množství proteinu ve dvou tkáních může být srovnáváno za použití protilátek pro detekci polypeptidů ve Westernových hybridizacích proteinových extraktů ze dvou tkání. Úroveň exprese a subcelulární lokalizace může být také detekována imunologicky za použití protilátek k příslušnému proteinu. Další testovací techniky, které mohou být použity pro stanovení koncentrací proteinu, jako je polypeptid podle předkládaného vynálezu, ve vzorku od hostitele, jsou dobře známé odborníkům v oboru. Zvýšená nebo snížená exprese polypeptidů ve tkáni postižené onemocněním ve srovnání s expresí stejného proteinu v normální tkáni ukazuje na to, že se exprimovaný protein může podílet na vzniku onemocnění.

V testech podle předkládaného vynálezu může být diagnosa stanovena detekcí množství produktu exprese genu majícího alespoň jednu sekvenci uvedenou v SEQ ID NO: 1 nebo 3. Srovnání hladin mRNA nebo proteinů v nemocné versus zdravé tkáni může být také použito pro sledování progrese nebo remise onemocnění.

Velký počet polynukleotidových sekvencí ve vzorku může být testován za použití polynukleotidových sestav. Tyto sestavy mohou být použity pro vyšetření odlišné exprese genů a pro určení funkce genů. Například, sestavy pro polynukleotidové sekvence SEQ ID NO: 1 nebo 3 mohou být použity pro stanovení toho, zda jsou nějaké polynukleotidy odlišně exprimovány v normálních a nádorových buňkách. V jednom provedení vynálezu může být vyrobena sestava oligonukleotidových sond obsahujících nukleotidovou sekvenci SEQ ID NO: 1 nebo 3 nebo jejich fragment a tato sestava může být použita pro provedení, například, účinného skríningu genetických mutací. Metody sestav jsou dobře známé a jsou široce použitelné a mohou být ·· 4 ·44

4 · 4 4 4 4 4 4

4 4· · · ·4 • · · · 4 · *·

4 4 4 4 44

4444 · 4 444 444 444 použity pro vyřešení různých otázek molekulární genetiky, včetně genové exprese, genetické vazby a genetické variability (viz např. M. Chee et al., Science, svazek 274, str. 610-613 (1996)).

Termín diagnostika, jak je zde použit, označuje stanovení citlivosti jedince ke vzniku onemocnění, stanovení toho, zda má jedinec v současnosti onemocnění, a také prognosy jedince s onemocněním.

Předkládaný vynález se dále týká diagnostického kitu pro provedení diagnostického testu, který obsahuje:

(a) polynukleotid podle předkládaného vynálezu, výhodně nukleotidovou sekvenci SEQ ID NO: 1 nebo 3, nebo její fragment;

(b) nukleotidovou sekvenci komplementární k (a);

(c) polypeptid podle předkládaného vynálezu, výhodně polypeptid SEQ ID NO: 2 nebo jeho fragment; nebo (d) protilátku k polypeptidu podle předkládaného vynálezu, výhodně k polypeptidu SEQ ID NO: 2.

Nukleotidové sekvence podle předkládaného vynálezu jsou také použitelné pro chromosomální lokalizace. Sekvence je specifická k - a může hybridizovat na - určitou oblast v jednotlivém lidském chromosomu. Mapování relevantních sekvencí na chromosomy způsobem podle předkládaného vynálezu je významným prvním krokem v korelování těchto sekvencí s onemocněními asociovanými s určitými geny. Po lokalizaci sekvence na určitý region chromosomu se může fyzikální pozice sekvence korelovat s daty z genetické mapy.Taková data jsou uvedena, například, ve V. McKusick, Mendelian Inheritance in Man (přístupné on-line přes John Hopkins University Welch Medical Library). Vztahy mezi geny a nemocemi, které byly

• 4 · · • 4 4 • · 44	4 4 4 •	• 4 4 •	44 4 · • 4	• 4
4 · 4	•	*	4 ·
4444 44	• 4 4	• 4 4	4 ·	* 4

lokalizovány na stejný region chromosomu, jsou identifikovány pomocí analýzy vazby (současného dědění fyzikálně sousedních genů). Mohou být také určeny odlišnosti v cDNA nebo genomových sekvencích mezi postiženými a nepostiženými jedinci.

Polypeptidy podle předkládaného vynálezu nebo jejich fragmenty nebo analogy, nebo buňky exprimující takové polypeptidy, mohou být také použity jako imunogeny pro produkci protilátek imunospecifických pro polypeptidy podle předkládaného vynálezu. Termín imunospecifické znamená, že protilátky mají významně vyšší afinitu pro polypeptidy podle předkládaného vynálezu, než mají afinitu pro jiné příbuzné polypeptidy.

V dalším aspektu vynález poskytuje protilátku imunospecifickou pro polypeptid podle předkládaného vynálezu nebo její imunologický fragment, jak byl zde definován. Výhodně je protilátkou monoklonální protilátka.

Protilátky generované proti polypeptidům podle předkládaného vynálezu mohou být získány podáním polypeptidů nebo jejich fragmentů nesoucích epitopy, analogů nebo buněk zvířatům, výhodně non-lidským zvířatům, za použití běžných protokolů. Pro přípravu monoklonálních protilátek může být použita jakákoliv technika, kterou je možno získat protilátky produkované kontinuální buněčnou linií.Příklady jsou hybridomní technika (Kohler, G. and Milstein, C., Nátuře (1975) 256: 495-497), triomová technika, technika lidských Blymfocytárních hybridomů (Kozbor et al., Immunology Today (1983) 4: 72) a EBV-hybridomní technika (Cole et al., Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, 77-96, Alan R. Liss, lne., 1985).

• 4 44 4 ♦ ··4 ♦ · · ##4· · »··

444« 4 4444

4444 4 4 4 4 44

444 φ ·444

4444 44 ··· 444 44444

Techniky pro produkci jednořetězcových protilátek, jako jsou techniky popsané v US patentu č. 4946778, mohou být také použity pro produkci jednořetězcových protilátek k polypeptidům podle předkládaného vynálezu. Pro expresi humanizovaných protilátek mohou být také použity transgenni myši nebo jiné mikroorganismy, včetně jiných savců.

Výše uvedené protilátky mohou být použity pro izolaci nebo identifikaci klonů exprimujicich polypeptid nebo pro přečištění polypeptidů afinitní chromatografií. Protilátka podle předkládaného vynálezu může být také použita pro prevenci nebo léčbu nádorů, zejména karcinomu střeva a karcinomu ovaria, autoimunitních onemocnění a podobných stavů.

Jiný aspekt předkládaného vynálezu se týká způsobu pro indukci nebo modulování imunologické reakce u savce, který zahrnuje očkování savce polypeptidem podle předkládaného vynálezu, které je dostatečné pro produkci protilátkové a/nebo T-lymfocytární imunitní reakce pro chránění nebo zmírnění příznaků nebo progrese onemocnění. Ještě jiný aspekt vynálezu se týká způsobu pro indukci nebo modulování imunologické reakce u savce, který zahrnuje podání polypeptidu podle předkládaného vynálezu prostřednictvím vektoru řídícího expresi polynukleotidu a kódujícího polypeptid in vivo, za indukce takové imunologické reakce vedoucí k produkci protilátky pro ochranu uvedeného zvířete před onemocněním.

Je třeba si uvědomit, že předkládaný vynález tedy poskytuje způsob pro léčbu abnormálních stavů jako jsou, například, nádory a autoimunitní onemocnění, zejména karcinom střeva a karcinom ovaria, které souvisejí s přítomností exprese, nadměrnou expresí nebo sníženou expresí CASB618 polypeptidu.

·· ·· · · ·· ··· · · · ·9 9 9 • · ·· · ·· · • · · 9 99 9

9999 99 999 999 999

Předkládaný vynález dále poskytuje způsob pro testování sloučenin za účelem identifikace těch sloučenin, které stimulují nebo inhibují funkci CASB618 polypeptidu.. Obecně, agonisté nebo antagonisté mohou být použiti pro terapeutické a profylaktické účely pro taková onemocnění, která byla definována výše. Sloučeniny mohou být identifikovány z mnoha zdrojů, například z buněk, bezbuněčných přípravků, chemických knihoven a směsí přirozených materiálů. Takto identifikované agonistické, antagonistické nebo inhibiční sloučeniny mohou být přirozené nebo modifikované substráty, ligandy, receptory, enzymy atd., a může se jednat o polypeptid nebo o jeho strukturální nebo funkční mimetika (viz Coligan et al., Current Protocols in Immunology 1(2): kapitola 5 (1991)). Testovací metody budou známé odborníkům v oboru. Další testovací metody jsou uvedeny například v D. Bennett et al., J. Mol. Recognition, 8: 52-58 (1995); a K. Johanson et al., J. Biol. Chem. 270(16): 9459-9471 (1995) a v odkaze citovaných v uvedených publikacích.

Předkládaný vynález tedy poskytuje způsob pro skríning za účelem identifikace sloučenin, které inhibují nebo stimulují funkci polypeptidu podle předkládaného vynálezu, kterým je způsob vybraný ze skupiny zahrnující:

(a) měření vazby testované sloučeniny na polypeptid (nebo na buňky nebo na membrány nesoucí polypeptid) nebo jeho fúzní protein pomocí značkovacího činidla přímo nebo nepřímo asociovaného s testovanou sloučeninou;

(b) měření vazby testované sloučeniny na polypeptid (nebo na buňky nebo na membrány nesoucí polypeptid) nebo jeho fúzní protein za přítomnosti značeného kompetitoru;

(c) testování toho, zda testovaná sloučenina vede ke vzniku signálu generovaného aktivací nebo inhibicí polypeptidu, za použití detekčního systému vhodného pro buňky nebo buněčné »· ·♦ · ···

999 9 9 99999

999 9 999

9 9 9 9 9 9 99

9 9 9 9 99

99 9 99 999 999 999 membrány nesoucí polypeptid;

(d) smísení testované sloučeniny s roztokem obsahujícím polypeptid podle nároku 1, za vzniku směsi, měřením aktivity polypeptidu ve směsi a srovnáním aktivity směsi se standardem; nebo (e) detekování vlivu testované sloučeniny na produkci mRNA kódující uvedený polypeptid a uvedeného polypeptidu v buňkách, za použití, například, ELISA testu.

Polypeptid podle předkládaného vynálezu může být použit pro detekci membránových nebo solubilních receptorů, pokud nějaké existují, za použití standardních technik vazby na receptory, které jsou známé v oboru. Dobře známé skríningové techniky mohou být také použity pro identifikaci agonistů a antagonistů polypeptidu podle předkládaného vynálezu, které soutěží s polypeptidem podle předkládaného vynálezu o vazbu na jeho receptory, pokud nějaké existují.

V dalším aspektu se tedy předkládaný vynález týká skríningového křtu pro identifikaci agonistů, antagonistů, ligandů, receptorů, substrátů atd. pro polypeptidy podle předkládaného vynálezu; nebo sloučenin, které snižují nebo zvyšují produkci takových polypeptidů, které obsahují:

(a) polypeptid podle předkládaného vynálezu;

(b) rekombinantní buňku exprimující polypeptid podle předkládaného vynálezu;

(c) buněčnou membránu exprimující polypeptid podle předkládaného vynálezu; nebo (d) protilátku k polypeptidu podle předkládaného vynálezu; kde polypeptidem je výhodně polypeptid SEQ ID NO: 2.

Odborníkům v oboru bude jasné, že polypeptid podle předkládaného vynálezu může být také použit ve způsobu pro ·· ·* · ··· «·· · · · ···* • » · 99

9 9 9 9 9 99 9

9 9 9 9 99

9999 99 999 999 999 vývoj agonistů, antagonistů nebo inhibitorů polypeptid na bázi struktury, pomocí:

(a) určení nejprve trojrozměrné struktury polypeptidů;

(b) odvození trojrozměrné struktury pro podobně reaktivní nebo vazebná místa agonisty, antagonisty nebo inhibitoru;

(c) syntézu kandidátních sloučenin, které by se mohly vázat nebo by mohly reagovat s určenými vazebnými nebo reaktivními místy; a (d) testování toho, zda jsou kandidátní sloučeniny agonisty, antagonisty nebo inhibitory.

Genová terapie může být také použita pro endogenní produkci CASB618 polypeptidů v relevantních buňkách jedince. Pro přehled genové terapie viz kapitola 20, Gene Therapy and other Molecular Genetic-based Therapeutics Approaches (a citované odkazy) v Human Molecular Genetics, T. Strachan and A.P. Read, BIOS Scientifics Publishers Ltd. (1996).

Příprava vakcín je obecně popsána ve Pharmaceutical Biotechnology, svazek 61, Vaccine design - the subunit and adjuvant approach, Powell and Newman, Plenům Press, 1995. New Trends and Devolopments in Vaccines, Voliér et al·, University Park Press, Baltimore, Maryland, USA, 1978. Enkapsulace do liposomů je popsána, například, ve Fullerton, US patent 4235877. Konjugace proteinů na makromolekuly je popsána, například, v Likhite, US patent 4372945; a v Amor et al., US patent 4474757.

Množství proteinu v každé dávce vakcíny je vybráno tak, aby se jednalo o množství, které indukuje imunoprotektivni reakci bez významných nežádoucích účinků v typických vakcínách. Takové množství velmi závisí na konkrétním použitém imunogenu. Obecně se předpokládá, že každá dávka bude obsahovat 1-1000 pg ·«* ♦· ♦· · ··· • 9 99 9 9 9 99

9 9 9 9 9 9 9 99

9 9 9 9 9 99

9999 99 999 999 99999 proteinu, výhodně 2-100 gg, nejlépe 4-40 gg proteinu. Optimální množství pro konkrétní vakcínu může být zjištěno standardními testy, ve kterých se sledují titry protilátek a jiné reakce u jedinců. Po první vakcinaci se může jedincům podat dosycovací vakcinace přibližně za 4 týdny.

Termín izolovaný znamená pozměněný zásahem člověka ve srovnání s přirozeným stavem. Pokud se izolovaný prostředek nebo substance vyskytuje v přírodě, bude pozměněn nebo odebrán z přirozeného prostředí, nebo oboje. Například, polynukleotid nebo polypeptid přirozeně přítomný u živého zvířete není izolovaný, ale stejný polynukleotid nebo polypeptid separovaný od přirozených současně se vyskytujících materiálů je izolovaný.

Termín polynukleotid označuje jakýkoliv polyribonukleotid nebo polydeoxyribonukleotid, kterým může být nemodifikovaná RNA nebo DNA nebo modifikovaná RNA nebo DNA včetně jednořetězcových a dvouřetězcových regionů.

Termín varianta označuje polynukleotid nebo polypeptid, který se liší od referenčního polynukleotidu nebo polypeptid, ale který si zachovává základní vlastnosti. Typická varianta polynukleotidu se liší v nukleotidové sekvenci od jiného, referenčního polynukleotidu. Změny v nukleotidové sekvenci varianty mohou a nemusí měnit aminokyselinovou sekvenci polypeptidu kódovaného referenčním polynukleotidem. Změny nukleotidů mohou vést k aminokyselinovým substitucím, adicím, delecím, fúzím a zkrácením polypeptidu kódovaného referenční sekvencí, jak je popsáno dále. Typická varianta polypeptidu se liší v aminokyselinové sekvenci od jiného referenčního polypeptidu. Obecně jsou odlišnosti omezeny tak, že sekvence referenčního polypeptidu a varianty jsou si celkově velmi

9 « ·· Μ··· • · ·· · e· e

999 99 999 ♦ ♦·· 99 999 99* *· 999 podobné a v některých regionech jsou identické. Varianta a referenční polypeptid se mohou odlišovat v aminokyselinové sekvenci jednou nebo více substitucemi, adicemi, delecemi v jakékoliv kombinaci. Substituovaný nebo insertovaný aminokyselinový zbytek může a nemusí být kódovaný genetickým kódem. Variantou polynukleotidu nebo polypeptidů může být přirozená varianta, jako je alelická varianta, nebo se může jednat o variantu, která se přirozeně nevyskytuje. Přirozeně se nevyskytující varianty polynukleotidů a polypeptidů mohou být připraveny mutagenesí nebo přímou syntézou.

Identita, jak je známo v oboru, je vztah mezi dvěma nebo více polypeptidovými sekvencemi nebo dvěma nebo více polynukleotidovými sekvencemi, který je určen srovnáním sekvencí. V oboru označuje termín identita také stupeň příbuznosti mezi polypeptidovými nebo polynukleotidovými sekvencemi, který může být určen podle shody v takových sekvencích. Identita a podobnost mohou být snadno vypočteny podle známých metod, jako jsou metody popsané v (Computational Molecular Biology, Lesk, A.M. ed., Oxford University Press, New York, 1988; Biocomputing: Informatics and Genome Projects, Smith, D.W., ed., Academie Press, New York, 1993; Computer Analysis of Sequence Data, Part I, Griffin A.M. and Griffin, H.G., ed., Humana Press, New Jersey, 1994; Sequence Analysis in Molecular Biology, von Heinje, G., Academie Press, 1987; a Sequence Analysis Primer, Gribskov, M. and Devereux, J., ed., M. Stockton Press, New York, 1991; a Carillo H., and Lipman, D. SIAM J., Applied Math. 48: 1073 (1988) . Výhodné metody pro určení identity jsou navrženy pro dosažení největší shody mezi testovanými sekvencemi. Způsoby pro uren! identity a podobnosti jsou kodifikované ve veřejně dostupných počítačových programech. Výhodným počítačovým programem pro stanovení identity a podobnosti mezi dvěma ·« ·· · ··· • · · 9· · 9· • · ·· « · ·« ·»·· · · ·· · • · · * · 9· ···· Μ ··· ··· ·*· sekvencemi je, například, GCG programový balíček (Devereux, J. et al., Nucleic Acids Research 12(1): 387 (1984)), BLASTP,

BLASTN a FASTA (Atschul, S.F. et al., J. Molec. Biol. 215: 403-410 (1990). BLAST X program je veřejně dostupný z NCBI a jiných zdrojů (BLAST Manual, Altcschul, S. et al., NCBI NLM NIH Bethesda, MD 20894; Altschul, S. et al., J. Mol. Biol. 215: 403-410 (1990). Pro stanovení identity může být použit dobře známý Smith-Watermanův algoritmus.

Výhodně je použit algoritmus FASTA. Výhodné parametry pro srovnání polypeptidových nebo polynukleotidových sekvencí jsou následující parametry: Penále za mezeru: 12

Penále za délku mezery: 4

Velikost slova: 2, max. 6

Výhodné parametry pro srovnání polypeptidové sekvence za použití jiných metod jsou:

(1) Algoritmus: Needleman and Wunsch, J. Mol. Biol. 48: 443453 (1970)

Srovnávací matrice: BLOSSUM62 od Hentikoff and Hentikoff,

Proč. Nati. Acad. Sci. USA 89: 10915-10919 (1992)

Penále za mezeru: 12

Penále za délku mezery: 4

Program použitelný s těmito parametry je veřejně dostupný jako gap program od Genetics Computer Group, Madison, WI. Výše uvedené parametry jsou chybové parametry pro srovnání polypeptidů (společně s žádným penále za koncové mezery).

Výhodné parametry pro srovnání polynukleotidové sekvence j sou:

(1) Algoritmus: Needleman and Wunsch, J. Mol. Biol. 48: 44338

·· • » 9	·· •	• • · •	• •	• · 0
• •	• •	·· •
•	0 ·	•	•		•	•
·»* ·	··	• 0 ·	• t *		» *	00 1

453 (1970)

Srovnávací matrice: shody = +10, chybné páry = 0 Penále za mezeru: 50

Penále za délku mezery: 3

Program použitelný s těmito parametry je veřejně dostupný jako gap program od Genetics Computer Group, Madison, WI. Výše uvedené parametry jsou chybové parametry pro srovnání polynukleotidů.

Například, polynukleotidová sekvence podle předkládaného vynálezu může být identická s referenční sekvencí SEQ ID NO: 1, to znamená 100% identická, nebo může obsahovat určitý počet nukleotidových alterací ve srovnání s referenční sekvencí. Takové alterace jsou vybrány ze skupiny zahrnující deleci, substituci, včetně transice a trasverse, nebo inserci alespoň jednoho nukleotidu, a kde uvedená alterace se může vyskytovat na 5' nebo 3' koncích referenční sekvence nebo kdekoliv mezi těmito konci, na různých místech referenční sekvence nebo ve skupině na jednom místě referenční sekvence. Počet nukleotidových alterací je určen vynásobením celkového počtu nukleotidů v SEQ ID NO: 1 numerickým procentem identity (děleným 100) a odečtením této hodnoty od celkového počtu nukleotidů v SEQ ID NO: 1, neboli n_n Xn - (Xn · y) kde n_n je počet nukleotidových alterací, x_n je celkový počet nukleotidů v SEQ ID NO: 1 a y je, například, 0,70 pro 70%, 0,80 pro 80%, 0,85 pro 85%, 0,90 pro 90%, 0,95 pro 95% atd, a kde jakýkoliv výsledek pro x_n a y, který není celým číslem, je zaokrouhlen dolů na nejbližší celé číslo před odečtením od x_nAlterace polynukleotidové sekvence kódující polypeptid SEQ ID ♦ ♦ · ···· ·· • ··· • · » ·

NO: 2 mohou vytvářet nesmyslné, chybné nebo posunové mutace v této kódující sekvenci a tak mohou měnit polypeptid kódovaný polynukleotidem po takových alteracích.

Podobně, polypeptidová sekvence podle předkládaného vynálezu může být identická s referenční sekvencí SEQ ID NO: 2, to znamená 100% identická, nebo může obsahovat určitý počet aminokyselinových alterací ve srovnání s referenční sekvencí, takže % identity je menší než 100%. Takové alterace jsou vybrány ze skupiny zahrnující deleci, substituci, včetně konzervativní a nekonzervativní substituce, nebo inserci alespoň jedné aminokyseliny, kde uvedená alterace se může vyskytovat na amino nebo karboxylovém konci referenční polypeptidové sekvence nebo kdekoliv mezi těmito konci, na různých místech referenční sekvence nebo ve skupině na jednom místě referenční sekvence. Počet aminokyselinových alterací pro danou identitu sekvence je určen vynásobením celkového počtu aminokyselin v SEQ ID NO: 2 numerickým procentem příslušné identity (děleným 100) a odečtením této hodnoty od celkového počtu aminokyselin v SEQ ID NO: 2, neboli n_a < x_a - (x_a · y) kde n_a je počet aminokyselinových alterací, Xn je celkový počet aminokyselin v SEQ ID NO: 2 a y je, například, 0,70 pro 70%, 0,80 pro 80%, 0,85 pro 85%, 0,90 pro 90%, 0,95 pro 95% atd, a kde jakýkoliv výsledek pro x_a a y, který není celým číslem, je zaokrouhlen dolů na nejbližší celé číslo před odečtením od x_a. Alterace polynukleotidové sekvence kódující polypeptid SEQ ID NO: 2 mohou vytvářet nesmyslné, chybné nebo posunové mutace v této kódující sekvenci a tak mohou měnit polypeptid kódovaný polynukleotidem po takových alteracích.

·· ·· · · ·· • · · ·· ·· · · · ··· · · ··· ··· ·· ··· ··· ·· ···

Homolog je termín používaný oboru pro označení polynukleotidové nebo polypeptidové sekvence mající vysoký stupeň podobnosti k referenční sekvenci. Takové vztahy mohou být kvantifikovány určením stupně identity a/nebo podobnosti mezi srovnávanými sekvencemi, jak zde bylo popsáno. Do tohoto termínu také spadají termíny ortolog, který označuje

I polynukleotid nebo polypeptid, který je funkčním ekvivalentem polynukleotidů nebo polypeptidů v jiném druhu; a paralog, který je funkčně ekvivalentní sekvencí ve stejném druhu.

Popis obrázků na připojených výkresech

Obr. 1 ukazuje úrovně exprese CASB618 v párových vzorcích normálního tlustého střeva a nádoru tlustého střeva. Hodnoty jsou uvedeny v ekvivalentních hodnotách pro aktin.

N označuje normální tlusté střevo, T označuje nádor tlustého střeva.

Obr. 2A, 2B, 20 a 2D ukazují data z PCR v reálném čase pro expresi CASB618 v normálních tkáních.

Zkratky označují:

Obr. 2A: Co: tlusté střevo; Ce: čípek děložní; Bra: mozek;

BoMa: kostní dřeň, Bl: močový měchýř; Ao: aorta; AdGl:

nadledvina.

Obr. 2B: Ov: vaječník; Oe: jícen; LyNo: mízní uzlina; Lu: plíce; Li: játra; Ki: ledvina; II: ileum; He: srdce; FaTu: vejcovod.

Obr. 2C: Sp: slezina; Smln: tenké střevo; SkMu: kosterní sval;

Sk: kůže; Re: rektum; Pr: prostata; PÍ: placenta; PaThy: příštítná tělíska

Obr. 2D: Tr: průdušnice; Thy: štítná žláza; Te: varlata; St. žaludek; Spi: slezina.

Obr. 3 ukazuje SDS-PAGE gel (12,5%) E. coli AR120/pRIT15081 extraktu, s nebo bez indukce kyselinou nalidixovou; vizualizovaný monoklonální protilátkou anti-NSl. Dráha 1 je markér molekulové hmotnosti; dráha 2 ukazuje E. coli AR120/pRIT15081 3 hodiny bez indukce; dráha 3 ukazuje E. coli AR120/pRIT15081 3 hodiny s indukcí; dráha 4 ukazuje E. coli AR120/pRIT15081 4,5 hodiny bez indukce; dráha 5 ukazuje E. coli AR120/pRIT15081 4,5 hodin s indukcí.

Obr. 4 ukazuje SDS-PAGE gely přečištěného CASB618. Dráhy 1 a 8 ukazují markér molekulové hmotnosti; dráha 2 ukazuje lyžovanou buněčnou peletu; dráha 3 ukazuje přečištěný protein před dialýzou; dráha 4 ukazuje přečištěný dialyzovaný protein; dráha 6 ukazuje přečištěný dialyzovaný protein 0,22 μπι.

Příklady provedení vynálezu

Příklad 1: PCR analýza v reálném čase

RT-PCR v reálném čase (U. Gibson, 1996, Genome Research, 6: 996) se použije pro srovnání výskytu mRNA transkriptu testovaného antigenu v nádorové a normální tkáni tlustého střeva od více pacientů. Dále se tímto způsobem hodnotí hladiny mRNA testovaného genu v panelu normálních tkání.

Celková RNA z normálního střeva a z nádoru střeva se extrahuje z rychle zmrazených biopsií za použití TriPure činidla (Boehringer). Celková RNA z normálních tkání se zakoupí od Invitrogen nebo se extrahuje z rychle zmrazených biopsií za použití TriPure činidla. Póly A+ mRNA se přečistí z celkové RNA po zpracování DNAsou za použití oligo-dT magnetických korálků (Dynal). Kvantifikace mRNA se provede spektrofluormetrií (Versa Fluor, BioRad) za použití SybrlI ·· · · ·· • · ·· ·· · · · • · · · « · · · barviva (Molecular Probes). Primery pro PCR amplifikaci v reálném čase se navrhnou pomocí Perkin Elmer Express softwaru za použití chybových voleb pro TaqMan amplifikační podmínky.

Reakce v reálném čase se provedou podle standardních PCR protokolů za použití 2 ng přečištěné mRNA pro každou reakci. SybrI barvivo (Molecular Probes) se přidá pro detekci v reálném čase v ředění 1/75000. Amplifikace (40 cyklů) a detekce v reálném čase se provedou na Perkin Elmer Biosystems PE7700 systému za použití běžného nastavení přístroje. Ct hodnoty se vypočtou za použití PE7700 Sequence Detector softwaru. Dvě Ct hodnoty se získají pro každý vzorek od pacienta: nádorová Ct (CtT) a příslušná Ct normálního střeva (CtN). Ct hodnoty získané PCR v reálném čase jsou log-lineárně úměrné počtu kopií cílového templátu. Protože účinnost PCR amplifikace za běžných podmínek se blíží teoretické účinnosti amplifikace, je 2^(CtN_ctT) hodnocením relativních hladin transkriptu ve dvou tkáních (t.j. násobek nadměrné exprese mRNA v nádoru). PCR v reálném čase se provedou na biopsiích od 23 pacientů. Některé vzorky od pacientů se měří dvakrát. Úroveň nadměrné exprese mRNA se vypočte popsaným způsobem pro každého pacienta. Z této sady dat se potom vypočte průměrná hladina nadměrné exprese mRNA testovaného genu a podíl pacientů nadměrně exprimujících tento testovaný gen. Jednotlivé hodnoty se standardizují vzhledem k aktinu ve vzorku (poměr) a jsou uvedeny na obr. 1. Hodnota 1 odpovídá úrovni exprese aktinu. Výsledky jsou uvedeny v logaritmickém měřítku.

Stejným způsobem se také testovalo 81 vzorků normálních tkání, představujících 28 různých tkání. Ct hodnoty pro testovaný gen byly potom srovnávány s hodnotami pro aktin získanými ve stejném tkáňovém vzorku. Standardizované hodnoty ·· ·♦ · · ·· • · · ·· ·· ··· • · · · · · · · • · · · · · • · ··· · · · ·· jsou uvedeny na obr. 2A-D.

Výsledky PCR v reálném čase na vzorcích z normálního střeva/nádoru střeva

Pacienti nadměrně exprimující	Průměrná úroveň nadměrné
CASB618 v nádorech tlustého	exprese v nádorech tlustého
střeva	střeva (násobek)
18/23 (78%)	125

Závěr: CASB618 je nadměrně exprimován ve značném procentu nádorů ve srovnání s normálním sousedícím tlustým střevem. Je pouze marginálně exprimován v jiných normálních tkáních, zejména v jednom vzorku z prostaty.

Příklad 2: DNA mikrosestavy

DNA mikrosestavy se použily pro vyšetřování profilů exprese mRNA ve velkých souborech genů v mnoha vzorcích. Tato informace se použila pro doplnění dat získaných PCR v reálném čase a je nezávislým měřením úrovně exprese genu v normálních a nádorových tkáních.

Příklady současných technologií pro produkci DNA mikrosestav jsou: (1) Affymetrix GeneChip sestavy, ve kterých jsou oligonukleotidy syntetizovány na povrchu čipu chemickou syntézou na pevné fázi za použití fotolitografického procesu; (2) technika skvrn DNA, ve které jsou malé objemy roztoku DNA automaticky deponovány a potom imobilizovány na povrchu pevné fáze (například na skle). V obou případech se čipy hybridizují cDNA nebo cRNA, která byla extrahována z vyšetřované tkáně (například normální tkáně, nádoru atd.) a která byla značena radioaktivně nebo fluorescenčně. Značený ♦ · ·· · · ·· ·· · · · · · » · materiál se hybridizuje na čip a množství sondy navázané na každou sekvenci na čipu se určí pomocí speciálního skeneru. Pokus může být proveden s jednou fluorescenční reportérovou skupinou (nebo radioaktivní skupinou), nebo - alternativně může být proveden s použitím dvou fluorescenčních reportérových skupin. Ve druhém případě je každá ze dvou sond značena jinou reportérovou molekulou. Dva značené vzorky se potom hybridizují kompetitivně na sekvence na DNA čipu. Pro každou sekvenci na čipu se určí poměr dvou fluorescenčních signálů. Tento poměr se použije pro výpočet relativní četnosti výskytu transkriptu ve dvou vzorcích. Podrobné protokoly jsou dostupné z mnoha zdrojů, včetně DNA Microarrays: A practical approach. Schena M., Oxford University Press 1999, a WWW (http//cmgm.stanford.edu/pbrown/protocols/index.html), http://arrayit.com/DNA-Microarray-Protocols/) a specializovaných distributorů (např. Affymetrix).

Příklad 3: EST profily

Komplementárním postupem pro charakterizaci exprese antigenu ve tkáni je použití databáze exprimovaných koncovek sekvencí (EST). EST jsou malé fragmenty cDNA vyrobené ze souboru mRNA extrahované z určité tkáně nebo buněčné linie. Takové databáze v současnosti obsahují značné množství EST (1.0⁶) z několika stovek knihoven tkáňové cDNA, včetně nádorových tkání z různých typů a stadií onemocnění. Pomocí počítačových nástrojů (BLAST) se provede srovnávání CASB618 sekvence pro získání dalších informací o expresi ve tkáních.

EST distribuce CASB618

DbEST př.č.	ATG knihovna ID	Popis	Kategorie
INCBI:1113567	882 NCI	CGAP	Co3	:TC
NCBI: 1224225	937'NCI	CGAP	Co2	:TC
iŇCBI:1271870	988: NCI	ČGAP	Co12	'TC
;NCBI:1316079	889iNCI	CGAP Thv1	TA
NCBI:2035497	1079INCI	CGAP	Co8	TC
NCBI.-2048268	1079: NCI	CGAP	Co8	:TC
NCBI:2054603	1079-NCI	CGAP	Co8	TC
íŇCB1:2081390	1079-NC!	CGAP	Co8	TC
:NCBI:2129969	1079ÍNCI	CGAP	Co8	TC

ŇČBÍ:2489139___________1728;Soares Dieckgraefe : Dc

INCBl:2489206	1728:Soares Dieckqraefe	iDc
•NCBI:2600163	882 NCI CGAP Co3	TC
:NCBI:2641414	882' NCI CGAP Co3	TC
INCBI:2831741	937ÍNCI CGAP Co2	TC
ÍNCBI:2914582	910!NCI CGAP Pr22	NP
>NCBI:3111692	1728iSoares Dieckqraefe	Dc
:NCBI:3112040	1728:Soares Dieckqraefe	Dc
.NCBI :3043263	1460:NCI CGAP Pani	Tep
NCBI.-3119272	1728:Soares Dieckqraefe	Dc
:NCBI:3138950	882: NCI CGAP Co3	TC
:NCBI:3181303	1728iSoares Dieckqraefe	Dc
: NCBI :2908798	882 NCI CGAP Čo3	!TC
NCBI:2909226	937i NCI CGAP Co2	'TC

Tc: nádor tlustého střeva; Dc: tlusté střevo postižené onemocněním; NP: normální prostata; Tep: epiteliální nádor; Ta: nádor jiného typu.

Vysoký podíl EST nádoru tlustého střeva jasně ukazuje na nadměrnou expresi tohoto genu v nádorech tlustého střeva. Dále, jiné nádory (slinivky břišní, štítné žlázy) mohou také exprimovat tento gen.

Příklad 4: Northerova-Southernova hybridizace ·♦ ·· · · ·· • · β · · ·· « · ·

Omezená množství směsi nádorové a odpovídající normální cDNA tlustého střeva se amplifikovala Advantage PCR (viz výše). mRNA z různých normálních tkání se také amplifikovala za použití stejného způsobu. Amplifikovaná cDNA (1 gg) se zpracovala elektroforesou na 1,2% agarosovém gelu a přenesla se na nylonovou membránu. Membrána se hybridizovala (AlkPhos , Direct Systém) sondou připravenou za použití fragmentu testované TAA cDNA. Northernová-Southernová analýza poskytla ·. informace o velikosti transkriptu, přítomnosti sestřihových variant a množství transkriptu v normálních a nádorových ’ tkáních.

Příklad 5: Northernová analýza

Northernové membrány se připraví podle standardních protokolů za použití 1 gg polyA+ mRNA. Radioaktivní sondy se připraví za použití Ready-to-Go systému (Pharmacia).

Příklad 6: Identifikace kompletní cDNA sekvence cDNA knihovny nádoru tlustého střeva se připravily za použití Lambda Zapil systému (Stratagene) z 5 gg polyA+ mRNA. Postupovalo se podle návodu výrobce s tou výjimkou, že pro reverzní transkripci se použilo Superscriptll (Life technologies). Připravily se oligo-dT sondované a náhodně sondované knihovny. Přibližně 1,5 x 10⁶ fágů se umístilo na plotnu pro každé vyšetřování knihovny. Plaky fágů se přenesly na nylonové filtry a hybridizovaly se cDNA sondou značenou AlkPhos Direct. Pozitivní fágy se detekovaly pomocí chemiluminiscence. Pozitivní fágy se vyřízly z agarové plotny, eluovaly se v 500μ1 SM pufru a potvrdily se genově-specifickou PCR. Eluované fágy se konvertovaly na jednořetězcové M13 bakteriofágy excisí in vivo. Bakteriofág se potom přeměnil na • · ·· ·· 9 999 • · ·· · 9 99

9 9 9 ···» ♦··· ·· ··· ♦·· 99··· dvouřetězcovou plasmidovou DNA infekcí E. coli. Infikované bakterie se umístily na plotnu a provedlo se druhé kolo skríningu pomocí cDNA sondy. Plasmidová DNA se přečistila z pozitivních bakteriálních klonů a sekvencovala se na obou řetězcích.

Když nemohl být kompletní gen získán přímo z cDNA knihovny, izolovala se chybějící sekvence za použiti RACE technologie (Marathon Kit, ClonTech.). Tento postup spočívá v reversní transkripci mRNA do dvouřetězcové cDNA, ligaci spojovacích sekvencí na konce cDNA a amplifikaci požadovaného konce cDNA za použití genově-specifického primeru a jednoho ze spojovacích oligonukleotidů. Marathon PCR produkty se klonují do plasmidu (pCRII-TOPO, Invitrogen) a sekvencují se.

Získaná sekvence (SEQ ID NO: 1) má domnělý otevřený čtecí rámec o 259 aminokyselinách (SEQ ID NO: 2). Odvozená proteinová sekvence se zpracovala algoritmem pro určení předpokládané celulární lokalizace )PSORT: http://psort.nibb.ac.jp/ a TopPred: http://www.biokemi.su.se/server/toppred2/ toppred_source.html). Předpokládá se, že má 4 až 5 transmembránových segmentů; pouze jedna ze dvou použitých metod předpovídá signální sekvenci. Je přítomen potenciální motiv leucinového zipu přesahující jeden z předpokládaných transmembránových segmentů. Jsou přítomna 3 potenciální N-glykosylační místa. Subcelulární lokalizace je nejasná, nejpravděpodobnější je plasmatická membrána.

Příklad 7:

7.1 - Exprese a přečištění antigenů specifických pro nádor

Exprese v mikrobiálním hostiteli, nebo alternativně transkripce/translace in vitro, se použila pro produkci • 9 ·♦ ♦ ♦·· • · · · · · « · « • ♦ · a · ♦e · • · ♦ · « « · ·♦·· ·· ··· ···· · · antigenu podle předkládaného vynálezu pro vakcinačni účely a pro produkci proteinových fragmentů nebo celého proteinu pro rychlé přečištění a přípravu protilátek potřebných pro imunohistochemickou charakterizaci přirozeně exprimovaného proteinu nebo pro sledování přečištění.

Rekombinantní proteiny mohou být exprimovány ve dvou mikrobiálních hostitelích, E. coli a ve kvasinkách )jako je Saccharomyces cerevisiae nebo Pichia pastoris). Toto umožňuje výběr expresního systému s nej lepšími vlastnostmi pro produkci tohoto konkrétního antigenu. Obvykle bude rekombinantní antigen exprimován v E. coli a reakční protein ve kvasinkách.

Strategie exprese nejprve vyžaduje návrh primární struktury rekombinantního antigenu. Obvykle se expresní fúzní partner (EFP) umístí na N-konec pro zlepšení úrovně exprese a tento může také obsahovat region použitelný pro modulování imunogenních vlastností antigenu (imunologický fúzní partner (IFP)). Dále, na C-konec se umístí afinitní fúzní partner (AFP) usnadňující přečištění.

Když jsou rekombinantní kmeny dostupné, tak je rekombinantní produkt charakterizován hodnocením úrovně exprese a určením rozpustnosti proteinu pomocí analýzy jeho chování v surovém extraktu.

Po kultivaci na vhodném kultivačním mediu a po indukci exprese rekombinantního proteinu se celkové extrakty analyzují SDS-PAGE. Rekombinantní proteiny se vizualizují na barvených gelech a identifikující se westernovou hybridizací za použití specifických protilátek.

Srovnání různých verzí exprimovaného antigenu umožňuje výběr nej slibnějšich kandidátů pro další přečištění a imunologické hodnocení.

Exprese v E. coli AR120

Byl navržen a vyroben následující konstrukt: gen CASB618 obsahující delece N-konce a

C-konce (Δ1-74; Δ247-320) se klonoval ve vektoru pMG81 (pr PL long), s adicí IFP (NS1 DNA sekvence kódující chřipkového viru)

N-koncové aminokyseliny na N-konci, a C-koncové

1-81 NS1 proteinu histidinové koncovky (SEQ ID NO: 4) .

NS1- Met Thr Met	C 61-8
	75		246

ThrSerGly óxHIS

Získaný plasmid se označil pRIT15081. Použila se hostitelská buňka E. coli AR120 indukovatelná kyselinou nalidixovou. Indukce 3 litrů kultury E. coli v LB mediu + kanamycin se provedla přidáním kyseliny nalidixové v konečné koncentraci 60 ng/ml. Kultury se inkubovaly 4,5 hodiny při 37 °C.

Peleta získaná po odstředění indukovaných kultur se resuspendovala v 60 ml PBS pufru. Buňky se potom lyžovaly za použití Frenchova lisu. Lyzát se odstředil během 20 minut při 16000 g. V peletě jsme zjistili exprimovaný protein (obr. 3).

Přečištění se provedlo podle klasického schématu založeného na přítomnosti His afinitní koncovky v rekombinantním proteinu. V typickém přečištění se desintegrované buňky přefiltrovaly a buněčný filtrát se vnesl do kolony pro afinitní chromatografii s iontem kovu (IMAC; Ni⁺⁺NTA od Qiagen), která specificky zachycuje rekombinantní protein.

Zachycené proteiny se eluovaly 0-500 mM gradientem imidazolu (s přítomností detergentního činidla) ve fosfátovém pufru.

Schéma přečištění:

Solubilizace pelety v GuHCl 6M u

IMAC: Qiagen NTA Ni⁺⁺

Pufr pro uvedení do rovnováhy:	NaH₂PO₄ Tris NaCl GuHCl	100 mM 10 mM 150 mM 6 M	pH 8
Vzorek: peleta v GuHCl 6M
Promývací pufr:	Na₂HPO₄	100 mM	pH 6,3
	Tris	10 mM
	Močovina	8 M
Eluční pufr:	Na₂HPO₄	100 mM	pH 4,5
	Tris	10 mM
	Imidazol	500 mM
	Močovina	8 M
U
Eluovaný protein v 500 mM	imidazolu	+ 8 M močovině

Dialýza

- PBS	PH	7,5	+	sarkosyl	2%	+	6	M	močovina	1 hodina
- PBS	pH	7,5	+	sarkosyl	2%	4·	4	M	močovina	1 hodina
- PBS	pH	7,5	+	sarkosyl	2%	4·	2	M	močovina	1 hodina
- PBS	pH	7,5	+	sarkosyl JI	2%	+	0	M	močovina,	přes noc
		Zmrazení, filtrace	: 0	r	22	gm

Konečná koncentrace (1 mg/ml) se určí Lowryho proteinovým testem provedeném na konečném přečištěném materiálu (viz obr.

• *·

4) .

Transkripce/translace in vitro

Produkt CASB618 genu se charakterizuje spojenou transkripcí/translaci in vitro. Kompletní kódující sekvence klonu CASB618 se klonuje do SP72 vektoru (Promega), což je vektor umožňující transkripci in vitro. In vitro expresí za použití TNT T7 vázaného lyzátu retikulocytů (Promega kat. č. L4611) s inkorporací S35 methioninu se získá 35 kD produkt, který se zmenší na 30 kD pomocí psích pankreatických mikrosomálních membrán (Promega kat. č. Y4041). Tento výsledek naznačuje zpracování signálního peptidu odpovídajícího předpokládané velikosti 47 aminokyselin (a naznačuje, že protein je in vivo zakotven v membráně nebo secernován). V těchto pokusech se postupovalo podle návodu Promega.

7.2 Produkce protilátek a imunohistochemie

Malá množství relativně přečištěného proteinu mohou být použita pro přípravu imunologických nástrojů pro:

(a) detekci exprese pomocí imunohistochemického vyšeteřní v řezech normální nebo nádorové tkáně;

(b) detekci exprese a sledování proteinu během přečištění (ELISA, Westernová hybridizace); nebo (c) charakterizaci/kvantifikaci proteinu (ELISA).

7.2.1 Polyklonální protilátky

Imunizace

2-3 králíci se imunizují, intramuskulárně (i.m.), 3-krát ve

3-týdenních intervalech, 100 gg proteinu, který je připraven • · 99 99 9 99

999 9 999

9 9 9 ©·9

9999 99 999 999 99 v adjuvans 3D-MPL/QS21. Tři týdny po každé imunizaci se odebere vzorek krve a v séru se hodnotí titr protilátek pomocí ELISA za použití proteinu jako antigenu v potahu za použití standardního protokolu.

ELISA

96-jamkové mikroplotny (Maxisorb, Nunc) se potáhnou 5 gg proteinu během noci při 4 °C. Po 1 hodinové saturaci při 37 °C v PBS NCS 1% se přidá sériové ředění králičího séra na dobu

1,5 hodiny při 37 °C (od ředění 1/10). Po 3 promytích v PBSTween se přidá biotinylované anti-králičí sérum (Amersham) (1/5000). Plotny se promyji a na 30 minut při 37 °C se přidá streptavidin s navázanou peroxidasou (1/5000). Po promyt! se 50 μΐ TMB (BioRad) přidá na 7 minut a reakce se ukončí H2SO4, 0,2 M. OD se měří při 450 nm a střední ředění se vypočítá pomocí SoftmaxPro.

7.2.2 Monoklonální protilátky

Imunizace

BALB/c myší se imunizuje 3-krát ve 3-týdenních intervalech 5 pg přečištěného proteinu. Odběry krve se provedou 14 dnů po II a 1 týden pro III imunizaci. Séra se testují ELISA za použití přečištěných proteinů jako potahových antigenu. Podle těchto výsledků (střední ředění > 10000) se jedna myš vybere pro fúzi.

Fúze/HAT selekce

Buňky sleziny se fúzují s SP2/0 myelomovými buňkami podle standardního protokolu za použití PEG 40% a DMSO 5%. Buňky se ···· 9·9 ··· · potom umísti do 96-jamkových plotem v množství 2,5 x 10⁴-10⁵buněk/jamku a resistentní klony se selektují v HAT mediu. Supernatanty z těchto hybridomů se testují na obsahy specifických protilátek a když jsou pozitivní, tak se zpracují 2 cykly limitního ředění. Po 2 kolech skríningu se 3 hybridomy vyberou pro produkci ascitu.

7.2.3 Imunohistochemie

Když jsou dostupné protilátky, provede se imunobarvení řezů normální a nádorové tkáně za účelem stanovení:

- úrovně exprese antigenu podle předkládaného vynálezu v nádoru ve srovnání s normální tkání; nebo podílu nádorů některých typů exprimujících antigen; toho, zda jiné typy nádorů také exprimují antigen;

- podílu buněk v nádorové tkáni exprimujících antigen.

Příprava vzorku tkáně

Po odříznutí se vzorek tkáně upevní na korkový disk v OCT sloučenině a rychle se zmrazí v isopentanu předem ochlazeném kapalným dusíkem (-160 °C) . Blok se potom uchovává při -70 °C do použití. 7-10 μιη řezy se připraví v komůrce kryostatu (-20, -30 °C).

Barvení

Tkáňové řezy se suší po dobu 5 minut při teplotě okolí, fixují se v acetonu po dobu 10 minut při teplotě okolí, opět se suší a nasytí se PBS 0,5% + BSA 5% sérum. Po 30 minutách při teplotě okolí se provede přímé nebo nepřímé barvení za použití protilátek specifických pro antigen. Přímé barvení má lepší specificitu, ale menší intenzitu zbarvení, zatímco

• 4	*·	4	4	44
• 4	*	• 4	4 4	4 4	4 4
•	4 44	4	•	4 4
•	4 4	4	•	4 4
MM	44	···	• 4 4	44	4 4

nepřímé barvení je intenzivnější, ale méně specifické.

7.3 Analýza lidské buněčné imunitní reakce na antigen podle předkládaného vynálezu

Imunologické vlastnosti antigenu podle předkládaného vynálezu mohou být hodnoceny in vitro podle aktivace lidských T-lymfocytů. Všechny T-lymfocytární buněčné linie a dendritické buňky jsou získány od PBMC (mononukleárnich buněk periferní krve) zdravých dárců (výhodně HLA-A2 podtypu). HLAA2.1/K^b transgenní myši se také použijí pro skríning HLA-A2.1 peptidů.

Vzniknou linie CD8+ T-lymfocytů specifických pro nový antigen a tyto se udržují týdenní stimulací in vitro. Lytická aktivita a produkce γ-IFN CD8 liniemi v reakci na antigen nebo peptidy odvozené od antigenu se testuje za použití standardních testů.

Použity byly dvě strategie pro získání CD8+ Tlymfocytárních linií: strategie na bázi peptidu a strategie na bázi celého genu. Oba postupy vyžadují to, aby byla kompletní cDNA nově objeveného antigenu ve správném čtecím rámci klonována ve vhodném přepravním systému nebo aby byla použita pro určení sekvence HLA vazebných peptidů.

Postup na bázi peptidů

HLA-A2 vazebné peptidové sekvence se určí buď Parkerovým algoritemm (Parker, K.C., M.A. Bednarek, and J.E. Coligan, 1994, Scheme for ranking potential HLA-A2 binding peptides based on independent binding of individual peptide side-chain. J. Immunol. 152: 163 a http://bimas.dcrt.nih.gov/molbio/ hla bind/), nebo metodou podle Rammenseeho (Rammensee, Friede, Stevanovic, MHC liagnds and petide motifs: l^st listing, Immunogenetics 41: 178-228, 1995; Remmensee, Bachmann, Stevanovic: MHC ligands and peptide motifs. Landes Bioscience 1997; a http://134.2.96.221/scripts/hlaserver.dll/home.htm) . Peptidy se potom testují v HLA-A2,.l/K^b transgenním myším modelu (Vitiello et al.). Sekvence použitá pro provedení predikce je EPHB2v, která je identická s EPHB2 s další prodloužením sekvence na C-konci.

a) předpokládané vazebné epitopy HLA_A0201 alely:

a.l) HLA-A*0201 nonamery

Pozice

1

2

3

4

5

6

7

8

9

Rammenseeovo Parkerovo

SEQ ID NO

skóre*

skóre⁰

262

F

L

G

A

V

S

L

31

226.014

5

24

L

I

V

I

L

V

F

L

30

459.398

6

253

T

L

A

T

G

V

L

C

L

29

7

203

P

L

Y

G

L

A

L

28

8

149

G

L

P

D

P

V

L

Y

L

28

1107.961

9

100

G

L

V

G

L

E

G

I

28

10

53

W

L

V

R

V

L

S

L

27

226.014

11

62

F

I

G

A

E

I

V

A

V

26

101.181

12

260

C

L

F

L

G

A

V

25

105.510

13

196

V

L

S

'1'

P

A

P

L

25

134.369

14

60

s

L

F

1

G

A

E

I

V

25

15

210

L

T

G

A

F

A

L

24

210.633

16

104

G

L

E

G

i

N

I

T

L

24

17

34

L

A

s

F

L

I

L

24

18

222

F

A

L

A

8

I

S

V

23

19

216

F

A

L

F

G

V

F

A

L

23

20

192

L

S

N

V

L

S

T

23

21

138

Y

A

E

Y

A

N

A

L

23

22

n n JJ

A

L

A

S

F

L

I

23

31

F

L

A

L

A

S

F

L

23

540.469

24

21

S

V

P

L

I

V

I

L

23

25

174

H

L

A

G

H

Y

A

S

A

22

26

112

L

T

G

T

P

V

H

Q

L

22

27

97

A

R

V

G

L

V

G

L

22

28

91

S

A

R

V

T

A

R

V

22

29

73

S

A

E

W

F

V

G

T

V

22

30

27

V

I

L

V

F

L

A

L

A

22

31

308

A

L

P

D

L

K

C

I

21

32

• · • · ♦ « · ···· ♦· *·♦ ···

299	I LGDPLHKQ	21		33
258	VLCLFLGGA	21		34
217	alfgvfala	21		35
207	GLALLTTGA	21		36
40	LI L P G I R G H	21		37
16	haagfsvpl	21		38
312	DL KC. I TTNL	20		39
234	PLRLGSSAL	20		40
209	allttgaf a	20	101.099	41
26	I VI L V F L A L	20		42
17	aagfsvpll	20		43
154	VLYLAEKFT		222.964	44
244	T QYGAÁF WW		719.848	45
185	WVAFCFWLL		122.527	46

hodnocení poloviny doby disociace molekuly obsahující tuto subsekvenci

a.2) HLA A02_01 dekamery

Pozice	sekvence	Rammenseeovo Parkerovo	SEQ ID NO:
skóre*	skóre⁰
33	ALAASFLLIL	29		47
223	ALASISSVPL	26		48
111	TLTGTPVHQL	26		49
209	ALLTTGAFAL	25	458.437	50
23	PLLIV.IL VFL	25		51
272	YVRPSALRTL	24 \|	52
261	LFLGGAVVSL	24 \|	53
226	SISSVPLCPL	24		54
58	LLSLFIGAEI	24		55
191	WLLSNVLLST	23	291.716	56
61	LFIGAEIVA V	23		57
31	FLALAASFLL	23	569.949	58
16	HAAGFS VPLL	23		59
269	SLQYVRPSAL	22		60
258	VLCLFLGGAV	22		61
252	VTLATGVLCL	22		62
101	LLVGLEGINI	22		63
25	LI VILVFLAL	22		64
• 24	LLIVILVFLA	22	112.664	65
298	LILGDPLHKQ	21		66
183	TL WV AFCFWL	21	21493.266	67
149	GLPDPVLYLA	21 1,	68

«· '·*· · · ··· / · ··«· ·· · · • · *· ···· <··»· ·· a • ··· • ♦· • ·· • ·· ·· «··

145	ALEKGLPDPV	21		69
96	TARVGLLVGL	21		70
72	FSAEWFVGTV	21		71
175	LAGHYASATL	\| 20		72
148	KGLPDPVLYL	20		73
104	GLEGINITLT	20		74
52	F WLVRVLLSL	20		75
21	SVPLLIVILV	20		76
69	AVHFSAEWFV		251.039	77

⁰ hodnocení poloviny doby disociace molekuly obsahující tuto subsekvenci

Stručně, transgenní myši se imunizují HLA-A2 peptidy s adjuvans a ty, které nejsou schopné indukovat CD8 odpověď (jak je definována účinnou lýzou autologních buněk sleziny pulsovaných peptidem) se dále analyzují v lidském systému.

Lidské dendritické buňky (kultivované způsobem podle Romani et al.) se pulsují peptidy a použijí se pro stimulaci CD8 Tlymfocytů (Facs). Po několika týdenní stimulaci se CD8 linie nejprve testuje na peptidem pulsovaných autologních BLCL (EBVB transformovaných buněčných liniích). Pro ověření správného zpracování peptidu in vivo se CD8 linie testují na cDNAtransfektovaných nádorových buňkách (HLA-A2 transfektovaných LnCaP, Skov3 nebo CAMA nádorových buňkách).

Postup na bázi celých genů

CD8+ T-lymfocyty se aktivují a stimulují buď genovým dělem transfektovanými dendritickými buňkami, nebo retrovirem transdukovanými B7.1-transfektovanými fibroblasty, nebo rekombinantním pox virem (Kim et al.) nebo adenovirem (Buettrefield et al.) infikovanými dendritickými buňkami. Virem infikované buňky jsou velmi účinné pro prezentaci antigenních peptidů, protože antigen je exprimován ve vysokých • · ··· ·· · · ··· __Λ ···· ···· 58 ·······♦· ······· ···· ·· ··· ··· ·· · koncentracích, ale může být použit pouze pro vyloučení nadměrného růstu virových T-lymfocytárních linií.

Po alternované stimulaci se CD8+ linie testují na cDNA transfektovaných nádorových buňkách způsobem uvedeným výše. Specificita a identita peptidů se určí pro potvrzení jejich imunologického významu.

Odkazy:

Vitiello et al. (L. Sherman), J. Exp. Med., J. Exp. Med. 1991,

173: 1007-1015;

Romani et al., J. Exp. Med. 1994, 180: 83-93;

Kim et al., J. Immunother. 1997, 20: 276-286;

Butterfield et al., J. Immunol. 1998, 161: 5607-5613.

Všechny publikace, včetně patentů a patentových přihlášek, citované v předkládaném vynálezu, jsou zde uvedeny jako odkazy ve své úplnosti.

Seznam sekvenci <110> Vinals-Basslols, Carlotta

Bruck, Claudine

Cassart, Jean-Pol

Coche, Thierry <120 Nové sloučeniny <130 BC45225 <160 77 <170 FastSEQ pro Windows verze 3.0 <210> 1 <211> 1441 <212> DNA

C213> Lidská <400> 1 aaagtaacgg gtaccaaccc ggactcagac gcgctctccc actcggccgg cggcatgccg gcagcaagct gtgagagttc gaatggttcg gttacagccc accccagtgc aaagagaatt ctctacctgg ctggcgggac aacgtgctgc gccttcgcgc ctccgcctag gcaaccggcg cccagcgctc ggctcacctc tgtatcacca cgcaggccgg agcgctgctg tctgtaaata a ctacagacaa cagagcgttg ttcaccagcc gcgtccaggc cgtgcagcat caggcttcag tcctgctcat ttctcagtct tgggtacagt gtgtcggtcr atcaactgaa acgccgcgga cggagaagtt actacgcctc tctccacgcc tcttcggggt gctcctccgc tcctgtgcot ttcgcaccot ttatcctogg ctaacctgtg gaagcagtgc gcgcgaggco aacctttttt tgagaaatag agagcagccc cactcggtcc agccccagct gaccctgťgg cgttccactg cotgccgggg gttcataggc gaacaccaac gctcgtgggc cgagaccatt gtacgcgaac cacaccgagt ggccacgcta ggccccgctc cttcgccttg gctcaccact cttcctcgga tctggaccaa cgacccactg agggggaccc ccgccaggcc tcggacatcc tcttttgttt tttcgctcgc acctcoacgc cagccttgta tgctggcttg aacggcgtac ctcatcgrta atccgtggcc gcagaaattg acatcotaca ctggacggca gactacaacg gcactggaga agccottgcg tgggzggcgt tacggaggcc gcctccatct cagtacggcg ggggccgtgg agcgcoaagg cacaagcagg aatctggact tgggccagga gcaggcacca trtaaaaaaa cggctagaaa ttccttaacg cgcaaagaga cctgcccgcc tgccttttta ttctagtgtt actcgcgctg tggctgtgca aagccttcag ttaatattac agcagttcac aggggctgcc gcctgtacca tctgcttctg tggcactgct ctagcgtgcc ccgccttctg tgagtotcca actgcagcca ccgctctccc ccttccccgc gagctccagg gggaaagtct aaaaaaaaaa aactctgtcg gagaggtgca cgccaaggac tgcgtgcagc cccccagccc tttggctcta gttttggttg cttcagtgca cgcagcgcgc actcacaggg ctggcgtctg ggacccagtg ccagtaccac gctcctctcc gaccaccgga gctctgcccg ggtcacgctg gtatgttcgg ggagagaggg agacttaaaa cttgggacat aagggcactg cctggggcga aaaaaaaaaa

120

180

240

300

360

420

480

540

600

660

720

780

840

900

960 1020 1080 1140 1200 1260 1320 1380

1440

1441 <210> 2 <211> 320 <212> PRT <213>

Lidská <400> 2

Met Thr Leu Trp Asn Gly Val Leu Pro Phe Tyr Pro Gin Pro Arg His 15 10 15

Ala Ala Gly Phe Ser Val Pro Leu Leu Ile Val· Ile Leu Val· Phe Leu.

• · •· · · ·· • · · · · ·· · · ·

20

25 Ile Leu

Pro Leu

Gly Ser

Ile 45 Leu

30 Arg Phe

Gly Ile

His Gly

Ala Ser

Leu Ala Ala

Ser Phe

Leu Leu 40

Arg

35 Trp

Phe

Trp

Leu

Val

Arg

Val

Leu

5

50

55

60

Ala

Glu

Ile

Val

Ala

Val

His

Phe

Ser

Ala

Glu

Trp

Phe

Val

Gly

Thr

65

70

75

80

Val

Asn

Thr

Asn

Thr

Ser

Tyr

Lys

Ala

Phe

Ser

Ala

Arg

Val

Thr

8 5

90

95

10

Ala

Arg

Val

Gly

Leu

Val

Gly

Leu

Glu

Gly

Ile

Asn

Ile

Thr

Leu

100

105

110

Thr

Gly

Thr

Pro

Val

His

Gin

Leu

Asn

Glu

Thr

Ile

Asp

Tyr

Asn

Glu

115

120·

125

Gin

Phe

Thr

Trp

Arg

Leu

Lys

Glu

Asn

Tyr

Ala

Glu

Tyr

Ala

Asn

15

130

135

140

Ala

Leu

Glu

Lys

Gly

Leu

Pro

Asp

Pro

Val

Leu

Tyr

Leu

Ala

Glu

Lys

145

150

155

160

Phe

Thr

Pro

Ser

Pro

Cys

Gly

Leu

Tyr

His

Gin

Tyr

His

Leu

Ala

165

170

175

20

Gly

His

Tyr

Ala

Ser

Ala

Thr

Leu

Trp

Val

Ala

Phe

Cys

Phe

Trp

Leu

180

185

190

Leu

Ser

Asn

Val

Leu

Ser

Thr

Pro

Ala

Pro

Leu

Tyr

Gly

Leu

195

200

205

Ala

Leu

Thr

Gly

Ala

Phe

Ala

Leu

Phe

Gly

Val

Phe

Ala

Leu

25

210

215

220

Ala

Ser

Ile

Ser

Val

Pro

Leu

Cys

Pro

Leu

Arg

Leu

Gly

Ser

225

230

235

240

Ala

Leu

Thr

Gin

Tyr

Gly

Ala

Phe

Trp

Val

Thr

Leu

Ala

Thr

245

250

255

30

Gly

Val

Leu

Cys

Leu

Phe

Leu

Gly

Ala

Val

Ser

Leu

Gin

Tyr

260

265

270

Val

Arg

Pro

Ser

Ala

Leu

Arg

Thr

Leu

Asp

Gin

Ser

Ala

Lys

Asp

275

280

285

Cys

Ser

Gin

Glu

Arg

Gly

Ser

Pro

Leu

Ile

Leu

Gly

Asp

Pro

Leu

35

290

295

300

His

Lvs

Gin

Ala

Leu

Pro

Asp

Leu

Lys

Cys

Ile

Thr

Asn

Leu

305

310

315

320

<210> 3 <211> 498 <212> DNA ^<213> Lidská <400> 3 ctctagcgrg ccgctctgcc cgctcccgcc taggctcctc cgcgctcaco actcagtacg60 »’ agcgccgcct tctgggtcac gctggcaacc ggcgtcctgt gcctcttcct cggaggggcc120 gtggtgagtc tcoagtatgt tcggcccagc gctcotcgca cccttctgga ccaaagcgcc180 aaggactgca. gccaggagag agggggctca cctcrtatcc tcggcgaccc actgcacaag240 caggccgctc tcccagacct aaaatgtatc accactaacc tgtgaggggg acccaatctg300 gactccttco ocgccttggg acatcgcagg ccgggaagca gtgcccgcca ggcctgggcc360 aggagagctc caggaagggc actgagcgct gctggcgcga ggcctcggac atccgcaggc 420 accagggaaa gtctcctggg gcgatctgta aataaacctt tttttctttt gttttttaaa 480 aaaaaataaa agtcgacc498

55	<210> 4 <2L1> 262 <212> PRT
<213>	Lidská
60	<400>	4

	Met	Asp Pro	Asn	Thr	Val	Ser	Ser
	1			5
	His	Val Arg	Lys	Arg	Val	Ala	Asp
			20
5	Leu	Asp Arg	Leu	Arg	Arg	Asp	Gin
		35					40
	Thr	Leu Gly	Leu	Asp	Ile	Glu	Thr
		50				55
	Val	Glu Arg	Ile	Leu	Lys	Glu	Glu
10	65				70
	Met	Glu Trp	Phe	Val	Gly	Thr	Val
				85
	Phe	Ser Ala	Ala	Arg	Val	Thr	Ala
			100
15	Glu	Glv Ile	Asn	Ile	Thr	Leu	Thr
		115					120
%	C-lu	Thr Ile	Asp	Tyr	Asn	Glu	Gin
		130				135
	Tyr	Ala Ala	Glu	Tyr	Ala	Asn	Ala
* 20	145				150
	Val	Leu Tyr	Leu	Ala	Glu	Lys	Phe
				165
	Tyr	His Gin	Tyr	His	Leu	Ala	Gly
			180
25	Val	Ala Phe	Cys	Phe	Trp	Leu	Leu
		195					200
	Ala	Pro Leu	Tyr	Gly	Gly	Leu	Ala
		210				215
	Leu	Phe Gly	Val	Phe	Ala	Leu	Ala
30	225				230
	Pro	Leu Arg	Leu	Gly	Ser	Ser	Ala
				245
	His	His His	His	His	His
			260
35
		<210>	5
		<211>	9
		<212>	PRT
40		<213>	Lidská
		<400>	5
	Phe	Leu Gly	Gly Ala	Val	Val	Ser
	1			5
45		<210>	6
«		<211>	9
		<212>	PRT
*		<213>	Lidská
50		<400>	6
	Leu	Leu Ile	Val	Ile	Leu	Val	Phe
	1			5
		<210>	7
55		<211>	9
		<212>	PRT
		<213>	Lidská
		<40Q>	7
60	Thr	Leu Ala	Thr Gly	Val	Leu	Cys

Leu

Phe	Gin 10	Val	Asp	Cys	Phe	Leu 15	Trp
Gin 25	Glu	Leu	Gly	Asp	Ala 30	Pro	Phe
Lys	Ser	Leu	Arg	Gly 45	Arg	Gly	Ser
Ala	Thr	Arg	Ala 60	Gly	Lys	Gin	Ile
Ser	Asp	Glu 75	Ala	Leu	Lys	Met	Thr 80
Asn	Thr 90	Asn	Thr	Ser	Tyr	Lys 95	Ala
Arg 105	Val	Gly	Leu	Leu	Val 110	Gly	Leu
Gly	Thr	Pro	Val	His 125	Gin	Leu	Asn
Phe	Thr	Trp	Arg 140	Leu	Lys	Glu	Asn
Leu	Glu	Lys 155	Gly	Leu	Pro	Asp	Pro 160
Thr	Pro 170	Ser	Ser	Pro	Cys	Gly 175	Leu
His 185	Tyr	Ala	Ser	Ala	Thr 190	Leu	Trp
Ser	Asn	Val	Leu	Leu 205	Ser	Thr	Pro
Leu	Leu	Thr	Thr 220	Gly	Ala	Phe	Ala
Ser	Ile	Ser 235	Ser	Val	Pro	Leu	Cys 240
Leu	Thr 250	Thr	Gin	Tyr	Thr	Ser 255	Gly

Leu ·

• · ·

1	5
		<210>	8
		<211>	9
5		<212>	PRT
		<213>	Lidská
		<400>	8
	Pro	Leu Tyr	Gly Gly	Leu	Ala	Leu	Leu
10	1		5
		<210>	9
A		<211>	9
		<212>	PRT
15		<213>	Lidská
*·«		<400>	9
	Gly	Leu Pro	Asp Pro	Val	Leu	Tyr	Leu
	1		5
¹ 20
		<210>	10
		<211>	9
		<212>	PRT
		<213>	Lidská
25
		<400>	10
	Gly	Leu Leu	Val Gly	Leu	Glu	Gly	Ile
	1		5
30		<210>	11
		<211>	9
		<212>	PRT
		<213>	Lidská
35		<400>	11
	Trp	Leu Val	Arg Val	Leu	Leu	Ser	Leu
	1		5
		<210>	12
40		<211>	9
		<212>	PRT
«		<213>	Lidská
		<400>	12
45	Phe	Ile Gly	Ala Glu	Ile	Val	Ala	Val
	1		5
		<210>	13
•		<211>	9
50		<212>	PRT
		<213>	Lidská
		<400>	13
	Cys	Leu Phe	Leu Gly	Gly	Ala	Val	Val
55	1		5
		<210>	14
		<211>	9
		<212>	PRT
60		<213>	Lidská

• · <400> 14

	Val	Leu Leu	Ser Thr Pro	Ala	Pro	Leu
	1		5
5
		<210>	15
		<211>	9
		<212>	PRT
10		<213>	Lidská
		<4OO>	15
	Ser	Leu Phe	Ile Gly Ala	Glu	Ile	Val
	1		5
15		<210>	16
		<211>	9
		<212>	PRT
		<213>	Lidská
20		<4OO>	16
	Leu	Leu Thr	Thr Gly Ala	Phe	Ala	Leu
	1		5
		<210>	17
25		<211>	9
		<212>	PRT
		<213>	Lidská
		<400>	17
30	Gly	Leu Glu	Gly Ile Asn	Ile	Thr	Leu
	1		5
		<210>	18
		<211>	9
35		<212>	PRT
		<213>	Lidská
		<4OO>	18
	Leu	Ala Ala.	Ser Phe Leu	Leu	Ile	Leu
40	1		5
		<210>	19
		<211>	a
		<212>	PRT
45		<213>	Lidská
		<400>	19
	Phe	Ala Leu	Ala Ser Ile	Ser	Ser	Val
	1		5
50
		<210>	20
		<211>	9
		<212>	PRT
55		<213>	Lidská
		<400>	20
	Phe	Ala Leu	Phe Gly Val	Phe	Ala	Leu
	1		5
60		<210>	21

<211> 9 <212> PRT <213> I. . . ,

Lidská <400> 21

	Leu 1	Leu Ser	Asn Val 5	Leu Leu Ser	Thr
		<210>	22
10		<211>	9
		<212>	PRT
		<213>	Lidská
•		<400>	22
15	Tyr	Ala Ala	Glu Tyr	Ala	Asn	Ala	Leu
	1		5
·<
		<210>	23
		<211>	9
. 20		<212>	PRT
		<213>	Lidská
		<400>	23
	Ala	Leu Ala	Ala Ser	Phe	Leu	Leu	Ile
25	1		5
		<210>	24
		<211>	9
		<212>	PRT
30		<213>	Lidská
		<400>	24
	Phe	Leu Ala	Leu Ala.	Ala	Ser	Phe	Leu
	1		5
35
		<210>	25
		<211>	9
		<212>	PRT
40		<213>	Lidská
		<400>	25
	Ser	Val Pro	Leu Leu	Ile	Val	Ile	Leu
	1		5
45		<210>	26
		<211>	9
		<212>	PRT
		<213>	Lidská
50		<400>	26
	His	Leu Ala	Gly His	Tyr	Ala	Ser	Ala
	1		5
		<210>	27
55		<211>	9
		<212>	PRT
		<213>	Lidská
		<400>	27
60	Leu	Thr Gly	Thr Pro	Val	His	Gin	Leu

%

1	5
		<210>	28
		<211>	9
5		<212>	PRT
		<213>	Lidská
		<400>	28
	Ala	Arg Val	Gly Leu
10	1		5
		<210>	29
		<211>	9
		<212>	PRT
15		<213>	Lidská
		<400>	29
	Ser	Ala Ala	Arg Val
	1		5
20
		<210>	30
		<211>	9
		<212>	PRT
25		<213>	Lidská
		<400>	30
	Ser	Ala Glu	Trp Phe
	1
30		<210>	31
		<211>	9
		<212>	PRT
		<213:	Lidská
*7 >		<400>	31
	Val	Ile Leu	Val Phe
	1		5
		<210>	32
40		<211>	9
		<212>	PRT
		<213>
			Lidská
		<400>	32
45	Ala	Ala Leu	Pro Asp
	1		5
		<210>	33
		<211>	g
50		<212>	PRT
		<213>	Lidská
		<400>	33
	Ile	Leu Gly	Asp Pro
55	1		5

Leu

Thr

Val

Leu

Val

Ala

Gly

A_a

Lys

His

Gly

Arg

Thr

Leu

Val

Leu Ala.

Cys Ile

Lys Gin <210>

<211>

<212>

<213>

PRT

Lidská

		<400>	34
	Val	Leu Cys	Leu Phe	Leu	Gly	Gly Ala
	1		5
5		<210>	35
		<211>	9
		<212>	PRT
10		<213>	Lidská
	<400>	35
	Ala	Leu Phe	Gly Val	Phe	Ala	Leu	Ala
	1		5
15		<210>	36
		<211>	9
		<212>	PRT
		<213>	Lidská
20		<400>	36
	Gly	Leu Ala	Leu Leu	Thr	Thr	Gly	Ala
	1		5
		<210>	37
25		<211>	9
		<212>	PRT
		<213;	Lidská
		<400>	37
30	Leu	Ile Leu	Pro Gly	Ile	Arg	Gly	His
	1		5
		<210>	38
		<211>	9
1 <		<212>	PRT
		<213>	Lidská
		<400>	38
	His	Ala Ala	Gly Phe	Ser	Val	Pro	Leu
40	1		5
		<210>	39
		<211>	9
		<212>	PRT
45		<213>	Lidská
		<400>	39
	Asp	Leu Lys	Cvs Ile	Thr	Thr	Asn	Leu
.	X		5
50		<210>	40
		<211>	9
		<212>	PRT
55		<213>	Lidská
	<400>	40
	Pro	Leu Arg	Leu Gly	Ser	Ser	Ala	Leu
	1		5
60		<210>	41

<211> 9 <212> PRT ^<213^>

5	Ala 1	<400> Leu Leu	41 Thr Thr Gly Ala 5	Phe Ala
		<210>	42
10		<211>	9
		<212>	PRT
		<213>	Lidská
		<4OO>	42
15	Ile	Val Ile	Leu Val	Phe	Leu	Ala	Leu
	1		5
		<210>	43
		<211>	9
20		<212>	PRT
		<213>	Lidská
		<4OO>	43
	Ala	Ala Gly	Phe Ser	Val'	Pro	Leu	Leu
25	1		5
		<210>	44
		<211.>	9
		<212>	PRT
30		<213>	Lidská
		<400>	44
	Val	Leu Tyr	Leu Ala	Glu	Lys	Phe	Thr
	1		5
35		<210>	45
		<211>	9
		<212>	PRT
		<213>	Lidská
40		<4OO>	45
	Thr	Gin Tyr	Gly Ala	Ala	Phe	Trp	Trp
	1		5
45		<210>	4 6
		<211>	g
		<212> <213>	PRT
		Lidská
50		<400>	46
	Trp	Val Ala	Phe Cys	Phe	Trp	Leu	Leu
	1		5
		<210>	47
55		<211>	10
		<212>	PRT
		<213>	Lidská
		<400>	47
60	Ala	Leu. Ala	Ala Ser	Phe	Leu	Leu	Ile

10 <210> 48 <211> 10 <212> PRT ^<213> Lidská

Ala 1	<400> Leu Ala	48 Ser Ile Ser Ser Val 5	Pro	Leu 10
	<210	49
	<211>	10
	<212>	PRT
	<213>	Lidská
	<400>	49
Thr	Leu Thr	Gly Thr	Pro	Val	His	Gin	Leu
1		5					10
	<210>	50
	<211>	10
	<212>	PRT
	<213>	Lidská
	<400>	50
Ala	Leu Leu	Thr Thr	Gly	Ala	Phe	Ala	Leu
7		5					10
	<210>	51 .
	<211>	10
	<212>	PRT
	<213>	Lidská
	<400	51
Pro	Leu Leu	Ile Val	Ile	Leu	Val	Phe	Leu
1 4.		5					10
	<210>.	52
	<211>	10
	<212>	PRT
	<213>	Lidská
	<400>	52
Tyr	Val Arg	Pro Ser	Ala	Leu	Arg	Thr	Leu
1		5					10
	<210>	53
	<211>	10
	<212>	PRT
	<213>	Lidská
	<400	53
Leu	Phe Leu	Gly Gly	Ala	Val	Val	Ser	Leu
1		5					10
	<210>	54
	<211>	10
	<212>	PRT
	<213>	Lidská

	<400>	54
Ser	Ile Ser	Ser Val	Pro	Leu	Cys	Pro	Leu
1		5					10
	<210>	55
	<211>	10
	<212>	PRT
	<213>	Lidská
	<400>	55
Leu	Leu Ser	Leu Phe	Ile	Gly	Ala	Glu	Ile
1		5					10
	<210>	56
	<211>	10
	<212>	PRT
	<213>	Lidská
	<400>	56
Trp	Leu Leu	Ser Asn	Val	Leu	Leu	Ser	Thr

5 ίο <210> 57 <211> 10 <212> PRT ^<212> Lidská

	<400>	57
Leu	Phe Ile	Gly Ala Glu	Ile	Val	Ala	Val
1		5				10
	<210>	58
	<211>	10
	<212>	PRT
	<213>	Lidská
	<400>	58
Phe	Leu Ala	Leu Ala Ala	Ser	Phe	Leu	Leu
1		5				10
	<210>	59
	<211>	10
	<212>	PRT
	<213>	Lidská
	<400>	59
His	Ala Ala	Gly Phe Ser	Val	Pro	Leu	Leu
1		5				10
	<210>	60
	<211>	10
	<212>	PRT
	<213>	Lidská
	<400>	60
Ser	Leu Gin	Tyr Val Arg	Pro	Ser	Ala	Leu
1		5				10

<210> 61

	<211> 10 <212> PRT ^<213> Lidská
5		<400>	61
	Val	Leu Cys	Leu Phe	Leu	Gly	Gly	Ala	Val
	1		5					10
		<210>	62
10		<211>	10
		<212>	PRT
		<213>	Lidská
		<400	62
15	Val	Thr Leu	Ala Thr	Gly	Val	Leu	Cys	Leu
	1		5					10
		<210>	63
		<211>	10
20		<212>	PRT
		<213>	Lidská
		<4OO>	63
	Leu	Leu Val	Gly Leu	G J.U	Gly	Ile	Asn	Ile
25	1		5					10
		<210	64
		<211>	10
		<212>	PRT
30		<213>
			Lidská
		<400>	64
	Leu	Ile Val	Ile Leu	Val	Phe	Leu	Ala	Leu
	1		5					10
35
		<210	65
		<211>	10
		<212>	PRT
40		<213>	Lidská
		<400	65
	Leu	Leu Ile	Val Ile	Leu	Val	Phe	Leu	Ala
	1		5					10
45		<210>	66
		<211>	10
		<212>	PRT
		<213>	Lidská
50		<400	66
	Leu	Ile Leu	Gly Asp	Pro	Leu	His	Lys	Gin
	1		5’					10
		<210>	67
55		<211>	10
		<212>	PRT
		<213>	Lidská
		<400>	67
60	Thr	Leu. Trp	Val Ala	Phe	Cys	Phe	Trp	Leu

	<210> 68 <211> 10
5		<212>	PRT
		<213>	Lidská
		<400>	68
	Gly	Leu Pro	Asp Pro	Val	Leu	Tyr	Leu	Ala
10	1		5					10
		<210>	69
		<211>	10
		<212>	PRT
15		<213>	Lidská
		<400>	69
	Ala	Leu GLu	Lys Gly	Leu	Pro	Asp	Pro	Val
	1		5					10
20		<210>	70
		<211>	10
		<212>	PRT
25		<213>	Lidská
		<400	70
	Thr	Ala Arg	Val Gly	Leu	Leu	Val	Gly	Leu
	1		5					10
30		<210>	71
		<211>	10
		<212>	PRT
		<213>	Lidská
35		<400	71
	Phe	Ser Ala	Glu Trp	Phe	Val	Gly	Thr	Val
	1		5					10
		<210>	72
40		<211>	10
		<212>	PRT
		<213>	Lidská
		<400	72
45	Leu	Ala Gly	His Tyr	Ala	Ser	Ala	Thr	Leu
	1		5					10
		<210>	73
		<211>	10
50		<212>	PRT
		<213>	Lidská
		<400>	73
	Lys	Gly Leu	Pro Asp	Pro	Val	Leu	Tyr	Leu
55	1		5					10

<210 74 <211> 10 <212> PRT ^<213> Lidská

	Gly 1	<400> Leu Glu	74 Gly Ile Asn 5	Ile Thr Leu Thr 10
5
		<210>	75
		<211>	10
		<212>	PRT
10		<213>	Lidská
		<400>	75
	Phe	Trp Leu	Val Arg	Val	Leu	Leu	Ser	Leu
	1		5					10
15		<210>	76
		<211>	10
		<212>	PRT
		<213>	Lidská
20		<400>	76
	Ser	Val Pro	Leu Leu	Ile	Val	Ile	Leu	Val
	1		5					10
		<210>	77
25		<211>	10
		<212>	PRT
		<213>	Lidská
		<400>	77
30	Ala	Val His	Phe Ser	Ala	Glu	Trp	Phe	Val
	1	5	10

Informace o sekvenci

SEQ ID NO:1

AAAGTAACGGCTACAGACAGTGAGAAATAGTTTCGCTCGCCGGCTAGAAAAACTCTGTCGGTACCAACCCCA

GAGCGTTGAGAGCAGCCCACCTCCACGCTTCCTTAACGGAGAGGTGCAGGACTCAGACTTCACCAGCCCACT

CGGTCCCAGCCTTGTACGCAAAGAGACGCCAAGGACGCGCTCTCCCGCGTCCAGGCAGCCCCAGCTTGCTGG

CTTGCCTGCCCGCCTGCGTGCAGCACTCGGCCGGCGTGCAGCatgaccctgtggaacggcgtactgcctttt tacccccagccccggcatgccgcaggcttcagcgttccactgctcatcgttattctagtgtttttggctcta gcagcaagcttcctgctcatcttgccggggatccgtggccactcgcgctggttttggttggtgagagttctt ctcagtctgttcataggcgcagaaattgtggctgtgcacttcagtgcagaatggttcgtgggtacagtgaac accaacacatccracaaagccttcagcgcagcgcgcgttacagcccgtgtcggcctgctcgtgggcctggag ggcattaatattacactcacagggaccccagtgcatcagctgaacgagaccattgactacaacgagcagttc acctggcgtctgaaagagaattacgccgcggagtacgcgaacgcactggagaaggggctgccggacccagtg ctctacctggcggagaagttcacaccgagtagccctcgcggcctgraccaccagtaccacccggcgggacac tacgcc-ecggccacgctatgggtggcgttctgcttctggctcctctccaacgtgctgctctccacgccggcc ccgctctacggaggcctggcactgctgaccaccggagccttcgcgctcttcggggtcttcgccttggcctcc atctctagcgtgccgctctgcccgctccgcctaggctcctccgcgctcaccacrcagtacggcgccgccttc tgggtcacgctggcaaccggcgtcctgtgcctcttcctcggaggggccgtggtgagtctccagtatgrtcgg cccagcgctcttcgcacccttctggaccaaagcgccaaggactgcagccaggagagagggggctcaccrctt atcctaggcgacccactgcacaagcaggccgctctcccagacttaaaatgtaCcaccactaacctgtgaGGG GGACCCAATCTGGACTCCTTCCCCGCCTTGGGACATCGCAGGCCGGGAAGCAGTGCCCGCCAGGCCTGGGCC AGGAGAGCTCCAGGAAGGGCACTGAGCGCTGCTGGCGCGAGGCCTCGGACATCCGCAGGCACCAGGGAAAGT

CTCCTGGGGCGATCTGTAAATAAACCTTTTTTTCTTTTGTTTTTTAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA

A

SEQ ID NO:2

MTLWNGVLPFYPQPRHAAGcSVPLLIVILVFLALAASFLLILPGIRGHSRWFWLVRVLLSLFIGAEIVAVHF

SAEWFVGTVNTNTSYKAFSAARVTARVGLLVGLEGINITLTGTPVHQLNETIDYNEQFTWRLKENYAAEYAN

ALEKGLPDPVLYLAEKFT.PSSPCGLYHQYHLAGHYASATLWVAFCFWLLSNVLLSTPAPLYGGLALLTTGAF

ALFGVFALASISSVPLCPLRLGSSALTTQYGAAFWVTLATGVLCLFLGGAWSLQYVRPSALRTLLDQSAKD CSQERGGSPLILGDPLHKQAALPDLKCITTNL

SEQ ID NO:3

CTCTAGCGTGCCGCTCTGCCCGCTCCCGCCTAGGCTCCTCCGCGCTCACCACTCAGTACGAGCGCCGCCTTC

TGGGTCACGCTGGCAACCGGCGTCCTGTGCCTCTTCCTCGGAGGGGCCGTGGTGAGTCTCCAGTATGTTCGG

CCCAGCGCTCTTCGCACCCTTCTGGACCAAAGCGCCAAGGACTGCAGCCAGGAGAGAGGGGGCTCACCTCTT

ATCCTCGGCGACCCACTGCACAAGCAGGCCGCTCTCCCAGACTTAAAATGTATCACCACTAACCTGTGAGGG

GGACCCAATCTGGACTCCTTCCCCGCCTTGGGACATCGCAGGCCGGGAAGCAGTGCCCGCCAGGCCTGGGCC

··		•	• ·Μ R
* ·		··	♦ ·	•	•	• R
•	·«<·	•	•	•	•	•
•	R 4 ·	•	•	• 9	•	•
»	• 9	•	•	•	•	•
·♦··	··	«•4		·♦		r · ·

AGGAGAGCTCCAGGAAGGGCACTGAGCGCTGCTGGCGCGAGGCCTCGGACATCCGCAGGCACCAGGGAAAGT

CTCCTGGGGCGATCTGTAAATAAACCTTTTTTTCTTTTGTTTTTTAAAAAAAAATAAAAGTCGACC

SEQ Π) NO:4

MDPNTVSSFQVDCFLWHVRKRVAD.QELGDAPFLDRLRRDQKSLRGRGSTLGLDIETATRAGKQIVERILKEE

SDEALKMTMEWFVGTVNTNTSYKAFSAARVTARVGLLVGLEGINITLTGTPVHQLNETIDYNEQFTWRLKEN YAAEYANALEKGLPDPVLYLAEKFTPSSPCGLYHQYHLAGHYASATLWVAFCFWLLSNVLLSTPAPLYGGLA LLTTGAFALFGVFALASISSVPLCPLRLGSSALTTQYTSGHHHHHH

Claims

Patentové • · · · · · · • Jt · ··· ··♦ ·· ···

ΑΨ - 3x4$ _k

1. Izolovaný polypeptid obsahující aminokyselinovou sekvenci, která má alespoň 70% identitu s aminokyselinovou sekvencí SEQ ID NO: 2 v celé délce SEQ ID NO: 2.
2. Izolovaný polypeptid podle nároku 1, jehož aminokyselinová sekvence má alespoň 95% identitu se SEQ ID NO: 2.
3. Polypeptid podle nároku 1 obsahující aminokyselinovou sekvenci SEQ ID NO: 2.
4. Izolovaný polypeptid mající SEQ ID NO: 2.
5. Polypeptid obsahující imunogenní fragment polypeptidů podle jakéhokoliv z nároků 1 až 4, kde uvedený imunogenní fragment je schopen vyvolat imunitní reakci, která rozpoznává polypeptid se SEQ ID NO: 2.
6. Polypeptid podle jakéhokoliv z nároků 1 až 5, který je součástí většího fúzního proteinu.
7. Polypeptid podle jakéhokoliv z nároků 1 až 6, který je chemicky konjugovaný na proteinový nosič.
8. Izolovaný polynukleotid kódující polypeptid podle jakéhokoliv z nároků 1 až 6.
9. Izolovaný polynukleotid obsahující nukleotidovou sekvenci kódující polypeptid, který má alespoň 70% identitu s aminokyselinovou sekvencí SEQ ID NO: 2, v celé délce SEQ ID NO: 2; nebo nukleotidová sekvence komplementární k uvedenému izolovanému polynukleotidu.

• ·
10. Izolovaný polynukleotid obsahující nukleotidovou sekvenci, která má alespoň 70% identitu s nukleotidovou sekvencí kódující polypeptid SEQ ID NO: 2, v celém kódujícím regionu; nebo nukleotidová sekvence komplementární k uvedenému izolovanému polynukleotidů.
11. Izolovaný polynukleotid obsahující nukleotidovou sekvenci, která má alespoň 70% identitu se SEQ ID NO: 1, v celé délce SEQ ID NO: 1; nebo nukleotidová sekvence komplementární k uvedenému izolovanému polynukleotidů.
12. Izolovaný polynukleotid podle jakéhokoliv z nároků 8 až

11, jehož identita je alespoň 95%.
13. Izolovaný polynukleotid vybraný ze skupiny zahrnující:

(a) polynukleotid obsahující nukleotidovou sekvenci kódující polypeptid SEQ ID NO: 2;

(b) polynukleotid SEQ ID NO: 1; a (c) polynukleotid, který je možno získat vyšetřováním vhodné knihovny za přísných hybridizačních podmínek značenou sondou mající sekvenci SEQ ID NO: 1 nebo jejího fragmentu, kde uvedený polynukleotid kóduje protein, který má podobné imunogenní vlastnosti jako protein sekvence SEQ ID NO: 2; nebo nukleotidová sekvence komplementární k uvedenému izolovanému polynukleotidů.
14. Expresní vektor obsahující izolovaný polynukleotid podle jakéhokoliv z nároků 8-13.
15. Rekombinantní živý mikroorganismus obsahující expresní vektor podle nároku 14.
16. Hostitelská buňka obsahující expresní vektor podle nároku 14 nebo izolovaný polynukleotid podle nároků 8 až 13.
17. Způsob přípravy polypeptidu podle nároků 1 až 7 vyznačující se tím, že zahrnuje kultivaci hostitelské buňky podle nároku 16 za podmínek dostatečných pro produkci uvedeného polypeptidu; a získání polypeptidu z kultivačního media.
18. Vakcína vyznačující se tím, že obsahuje účinné množství polypeptidu podle jakéhokoliv z nároků 1 až 7 a farmaceuticky přijatelný nosič.
19. Vakcína vyznačující se tím, že obsahuje účinné množství polynukleotidu podle jakéhokoliv z nároků 8 až 13 a farmaceuticky účinný nosič.
20. Vakcína vyznačující se t i m, že obsahuje účinné množství buněk prezentujících antigen, které byly naplněny polypeptidem podle jakéhokoliv z nároků 1 až 7, nebo které byly geneticky modifikovány in vitro tak, aby exprimovaly polypeptid podle jakéhokoliv z nároků 1 až 7, a farmaceuticky účinný nosič.
21. Vakcína podle jakéhokoliv z nároků 18 až 20 vyznačující se tím, že dále obsahuje adjuvans indukující Thl reakci.
22. Vakcína podle nároku 21 vyznačující se tím, že adjuvans indukujícím Thl reakci je vybráno ze skupiny zahrnující: 3D-MPL, QS21, směs QS21 a cholesterolu a CpG oligonukleotid.

• · · · ···· ·· ··· ♦
23. Protilátka vyznačující se tím, že je imunospecifická pro polypeptid nebo jeho imunologický fragment podle jakéhokoliv z nároků 1 až 5.
24. Způsob pro identifikaci sloučenin, které stimulují nebo inhibují funkci polypeptidu podle jakéhokoliv z nároků 1 až 5 vyznačující se tím, že zahrnuje způsob vybraný ze skupiny zahrnující:

(a) měření vazby testované sloučeniny na polypeptid (nebo na buňky nebo na membrány nesoucí polypeptid) nebo jeho fúzní protein pomocí značkovacího činidla přímo nebo nepřímo asociovaného s testovanou sloučeninou;

(b) měření vazby testované sloučeniny na polypeptid (nebo na buňky nebo na membrány nesoucí polypeptid) nebo jeho fúzní protein za přítomnosti značeného kompetitoru;

(c) testování toho, zda testovaná sloučenina vede ke vzniku signálu generovaného aktivací nebo inhibicí polypeptidu, za použití detekčního systému vhodného pro buňky nebo buněčné membrány nesoucí polypeptid;

(d) smísení testované sloučeniny s roztokem obsahujícím polypeptid podle jakéhokoliv z nároků 1 až 7, za vzniku směsi, měřením aktivity polypeptidu ve směsi a srovnáním aktivity směsi se standardem; nebo (e) detekování vlivu testované sloučeniny na produkci mRNA kódující uvedený polypeptid a uvedeného polypeptidu v buňkách, za použití, například, ELISA testu.
25. Způsob pro léčbu jedince imunoprofylaxí nebo terapií vyznačující se tím, že zahrnuje in vitro indukci imunitní reakce na molekulu podle jakéhokoliv z nároků 1 až 5, za použití in vitro inkubace polypeptidu podle jakéhokoliv z nároků 1 až 7 nebo polynukleotidu podle jakéhokoliv z nároků 8 až 13 s buňkami z imunitního systému • · savce, a zpětným podáním těchto aktivovaných imunitních buněk savci za účelem léčby onemocnění.
26. Způsob podle nároku 25 vyznačující se tím, že léčeným onemocněním je karcinom tlustého střeva nebo vaj ečníků.
27. Agonista nebo antagonista polypeptid podle jakéhokoliv z nároků 1 až 5.
28. Použití sloučeniny, která je:

(a) agonistou nebo antagonistou polypeptidu podle jakéhokoliv z nároků 1 až 5;

(b) izolovaným polynukleotidem podle jakéhokoliv z nároků 8 až 13; nebo (c) molekulou nukleové kyseliny, která moduluje expresi nukleotidové sekvence kódující polypeptid podle jakéhokoliv z nároků 1 až 5;

v terapii.
29. Způsob pro diagnostiku onemocnění nebo rizika vzniku onemocnění u jedince, kde uvedené onemocnění souvisí s expresí nebo aktivitou polypeptidu podle jakéhokoliv z nároků 1 až 5, vyznačující se tím, že zahrnuje analýzu přítomnosti nebo množství uvedeného polypeptidu ve vzorku od uvedeného jedince.
30. Způsob pro diagnostiku onemocnění nebo rizika vzniku onemocnění u jedince, kde uvedené onemocnění souvisí s expresí nebo aktivitou polynukleotidu podle jakéhokoliv z nároků 8 až 13, vyznačující se tím, že zahrnuje analýzu přítomnosti nebo množství uvedeného polynukleotidu ve vzorku od uvedeného jedince.
31. Způsob podle nároku 29 vyznačující se tím, že uvedeným onemocněním je karcinom tlustého střeva nebo vaj ečníků.
32. Způsob podle nároku 30 vyznačující se tím, že uvedeným onemocněním je karcinom tlustého střeva nebo vaječníků.
33. Izolovaný polynukleotid vybraný ze skupiny zahrnující:

(a) izolovaný polynukleotid obsahující nukleotidovou sekvenci, která má alespoň 90% identitu se SEQ ID NO: 3 v celé délce SEQ ID NO: 3;

(b) izolovaný polynukleotid obsahující SEQ ID NO: 3;

(c) polynukleotid SEQ ID NO: 3.
34. Živá vakcína obsahující expresní vektor podle nároku 14 nebo rekombinantní živý mikroorganismus podle nároku 15.
35. Použití polynukleotidů podle jakéhokoliv z nároků 8 až 13 pro výrobu léku pro léčbu karcinomu.
36. Použití polynukleotidů podle jakéhokoliv z nároků 8 až 13 pro výrobu léku pro léčbu karcinomu tlustého střeva nebo vaj ečníků.
37. Použití polypeptidů podle jakéhokoliv z nároků 1 až 7 pro výrobu léku pro léčbu karcinomu.
38. Použití polypeptidů podle jakéhokoliv z nároků 1 až 7 pro výrobu léku pro léčbu karcinomu tlustého střeva nebo vaječníků.