CZ303468B6 - Imunogenní smes a farmaceutická smes - Google Patents

Abstract

Polypeptidy a polynukleotidy CASB7439, imunogenní smesi s jejich obsahem a zpusoby výroby techto polypeptidu rekombinantními technikami. Tyto látky jsou použitelné pri diagnóze a jako vakcíny pro prevenci a lécení rakovin, zvlášte kolorektálních rakovin, autoimunitních onemocnení a souvisejících stavu.

Description

Imunogenní směs a farmaceutická směs

Oblast techniky

Předkládaný popis se týká farmaceutických směsí a způsobu indukce imunitní odpovědi proti antigenům souvisejícím s tumory. Popis se zvláště týká polynukleotidů, které jsou zde označovány jako polynukleotidy CASB7439, jimi kódovaných polypeptidů (označovaných zde jako polypeptidy CASB7439), rekombinantních materiálů a způsobů jejich výroby. V dalším provedení se popis týká způsobů použití těchto polypeptidů a polynukleotidů včetně léčby rakoviny, zvláště kolorektální rakoviny, a autoimunitních onemocnění a jiných příbuzných stavů. V dalším provedení se popis týká farmaceutických směsí s obsahem polypeptidů a polynukleotidů CASB7439, způsobů jejich výroby a jejich použití v lékařství. Další provedení popisu se týká způsobů identifikace sloučenin s agonistickými a antagonistickými/inhibiěními účinky s použitím materiálů poskytovaných popisem a léčení stavů souvisejících s nerovnovážnou polypeptidu CASB7439 s uvedenými sloučeninami. Ještě další provedení popisu se týká diagnostických testů pro detekci onemocnění souvisejících s nevhodnou aktivitou nebo hladinou polypeptidu CASB7439.

Podstata vynálezu

Předpokládá se, že polypeptídy a polynukleotidy podle předkládaného popisu jsou důležité imunogeny pro specifickou preventivní nebo léčebnou imunizaci proti tumorům, protože jsou specificky exprimovány nebo se dosahuje jejich velmi vysoké exprese v tumorech ve srovnání s normálními buňkami, a mohou být tedy zacíleny imunitními mechanismy specifickými pro antigen, vedoucími k destrukci tumorové buňky. Mohou být také použity pro diagnostiku výskytu tumorových buněk. Jejich nesprávná exprese za určitých okolností může dále způsobit indukci autoimunitních, nesprávných imunitních odpovědí, které by mohly být korigovány vhodnou vakcinací s použitím stejných polypeptidů nebo polynukleotidů. V tomto ohledu jsou pro účely předkládaného popisu nej důležitější antigen ní a imunogenní biologické aktivity polypeptidu podle předkládaného popisu. Polypeptíd podle předkládaného popisu může také mít alespoň jednu další biologickou aktivitu polypeptidu CASB7439, které by tento polypeptíd učinila vhodným cílem pro terapeutický nebo preventivní zásah odlišný od zásahu souvisejících s imunitní odpovědí.

V prvním provedení se předkládaný popis týká polypeptidů CASB7439. Tyto peptidy zahrnují izolované polypeptídy obsahující aminokyselinovou sekvenci, která má alespoň 70% identitu, s výhodou alespoň 80% identitu, výhodněji alespoň 90% identitu, ještě výhodněji alespoň 95% identitu, nejvýhodněji alespoň 97 až 99% identitu se sekvencí SEQ ID No: 2, SEQ ID NO: 10, SEQ ID No: 12 nebo SEQ ID No: 14 po celé délce SEQ ID No: 2, SEQ ID No: 10, SEQ ID No: 12 nebo SEQ ID No: 14, s podmínkou, že uvedený izolovaný polypeptíd není sekvence SEQ ID No: 2, SEQ ID NO: 12 nebo SEQ ID No: 14. Takové polypeptídy zahrnují polypeptídy obsahující aminokyseliny ze SEQ ID No: 10.

Mezi další peptidy podle předkládaného popisu patří izolované polypeptídy, u kterých má aminokyselinová sekvence alespoň 70% identitu, s výhodou alespoň 80% identitu, výhodněji alespoň 90% až 99% identitu, ještě výhodněji alespoň 95% identitu, nejvýhodněji alespoň 97 až 99% identitu s aminokyselinovou sekvencí SEQ ID No: 2, SEQ ID No: 10, SEQ ID No: 12 nebo SEQ ID No: 14 po celé délce SEQ ID No: 2. SEQ ID No: 10, SEQ ID No: 12 nebo SEQ ID No: 14, s podmínkou, že takovým izolovaným polypeptidem není SEQ ID No: 2, SEQ ID No: 12 nebo SEQ ID No: 14. Tyto polypeptídy zahrnují polypeptídy SEQ ID No: 10.

Výše uvedené polypeptídy se s výhodou vyrábějí rekombinantním způsobem. Nejvýhodněji se polypeptídy podle popisu čistí, ajsou v podstatě prosté jakýchkoli jiných proteinů nebo kontaminujícího materiálu pocházejícího z hostitele.

- 1 CZ 303468 B6

Další peptidy podle předkládaného popisu zahrnují izolované polypeptidy kódované polypeptidem obsahujícím sekvenci obsaženou v SEQ ID No: 1.

Popis také poskytuje imunogenní fragment polypeptidu CASB7439, který je souvislou částí polypeptidu CASB7439, a který má stejné nebo podobné imunologické vlastnosti jako polypeptid obsahující aminokyselinovou sekvenci SEQ ID No: 2, SEQ ID No: 10, SEQ ID No: 1 nebo SEQ ID No: 14. Jinak řečeno, fragment (v případě potřeby navázaný na nosič nebo část většího fúzního proteinu) je schopen vyvolat imunitní odpověď rozpoznávající polypeptid CASB7439. Takový imunogenní fragment může například zahrnovat polypeptid CASB7439 postrádající N-koncovou vedoucí sekvenci, transmembránovou doménu nebo C-koncovou ukotvovací doménu. Ve výhodném provedení obsahuje imunogenní fragment polypeptidu CASB7439 v podstatě veškerou extracelulámí doménu polypeptidu, který má alespoň 70% identitu, s výhodou alespoň 80% identitu, nejvýhodněji alespoň 97 až 99% identitu se SEQ ID No: 2, SEQ ID No: 10, SEQ ID No: 12 nebo SEQ ID No: 14 po celé délce sekvence SEQ ID No: 2, SEQ ID No: 10, SEQ ID No: 12 nebo SEQ ID NO: 14. Imunogenní fragment podle popisu obsahuje s výhodou alespoň jeden epitop.

Peptidové fragmenty obsahující epitop CASB7439 budou typicky obsahovat alespoň 7, s výhodou 9 nebo 10 za sebou následujících aminokyselin ze SEQ ID No: 2. Výhodné epitopy jsou ukázány v SEQ ID No: 16 až SEQ ID No: 33.

Peptidy obsahující tyto epitopy tvoří výhodné provedení předkládaného popisu. Součástí předkládaného popisu jsou také mimotopy, které mají stejné vlastnosti jako tyto epitopy, a imunogeny obsahující tyto mimotopy, jestliže vyvolávají imunitní odpověď křížově reagující s epitopem v kontextu molekuly CASB7439.

Předkládaný popis proto zahrnuje izolované peptidy zahrnující tyto epitopy jako takové, a jakýkoli jejich mimotop. Význam mimotopu je definován jako jednotka, která je dostatečně podobná nativnímu epitopu CASB7439, aby mohla být rozpoznána protilátkami, které rozpoznávají nativní molekulu; (Gheysen, Η. M., a další, 1986, Synthetic peptides as antigens. Wíley, Chichester, Ciba Foundation symposium 119, str. 130 až 149; Gheysen, Η. M., 1986, Molecular Immunology, 23, 7, 709 až 715); nebo jsou schopné vyvolávat tvorbu protilátek při navázání na vhodný nosič, kde tyto protilátky křížově reagují s nativní molekulou.

Peptidové mimotopy výše uvedených epitopů mohou být navrženy pro konkrétní účel adicí, delecí nebo substitucí zvolených aminokyselin. Peptidy podle předkládaného popisu mohou být tedy modifikovány pro účely snadné konjugace k proteinovému nosiči. U některých metod chemické konjugace může být například výhodné, aby byl do epitopu zahrnut koncovým cystein. Pro peptidy konjugované od konjugovaného konce peptidu obsahovaly hydrofobní zakončení, takže volný nekonjugovaný konec peptidu zůstává asociován s povrchem nosného proteinu. To omezuje konformační stupeň volnosti peptidu, a tak zvyšuje pravděpodobnost, že pepit bude předkládán v konformaci, která nejblíže napodobuje konformaci peptidu, tak jak se nalézá v kontextu úplné molekuly. Peptidy mohou být například změněny tak, aby obsahovaly N-koncový cystein a C-koncový hydrofobní amidovaný konec. Alternativně se může provést adice nebo substituce Dstereoisomemí formy jedné nebo více aminokyselin, aby se vytvořil výhodný derivát, který má například zvýšenou stabilitu peptidu. Odborníkům v oboru bude zřejmé, že tyto modifikované peptidy nebo mimotopy by mohyl být zcela nebo zčásti nepeptidové mimotopy, jestliže jsou složeny aminokyselinovým zbytkům nespadajících mezi 20 v případě se vyskytujících aminokyselin. Polypeptidy mohou být navíc cyklizovány v oboru známými způsoby, aby došlo k omezení peptidu na konformaci, která úzce napodobuje tvar peptidové sekvence v kontextu úplné molekuly. Výhodný způsob cyklizace peptidu zahrnuje přidání páru cysteinových zbytků umožňujících vytvořením disulfidického můstku.

Odborníkům v oboru bude dále zřejmé, že mimotopy nebo imunogeny podle předkládaného popisu mohou mít větší velikost než výše uvedené epitopy, a jako takové mohou obsahovat popi- 2 CZ 303468 B6 sované sekvence. Mimotopy podle předkládaného popisu mohou obsahovat přídavek N a/nebo C-koncových prodloužení tvořených řadu jiných v případě se vyskytujících zbytků na jednom nebo obou koncích. Peptidové mimotopy mohou být také retrosekvence přírodních sekvencí v tom, že je obrácená orientace sekvence; nebo mohou být sekvence úplně nebo alespoň z části tvořeny D-stereoisomemími aminokyselinami (sekvence inverso). Peptidové sekvence mohou mít také charakter retro-inverso tím, že mají obrácenou orientaci sekvence a obsahují aminokyseliny ve formě D-stereoisomerů. Tyto retro nebo retro-inverso peptidy mají výhodu v tom, že nejsou vlastními peptidy organismu, a nedochází tedy u nich k problémům tolerance s vlastním imunitním systémem.

Peptidové mimotopy mohou být alternativně identifikovány s použitím protilátek, které jsou samy schopné vázat se na epitopy podle předkládaného popisu, použitím technik jako je exprese na povrchu fága (phage display technology, EP 0 552 267 Bl). Tato technika poskytne velký počet peptidových sekvencí s podobnou strukturu jako mají nativní peptidy sekvenci s podobnou strukturou jako mají nativní peptidy, kteréjsou proto schopné vázat se na protilátky proti nativnímu peptidu, ale nemusí nezbytně sdílet významnou sekvenční homologii s nativním peptidem. Tento přístup může mít významné výhody v tom, že umožní identifikaci peptidu se zlepšenými imunogenními vlastnostmi, nebo je možno předejít možným problémům s tolerancí vlastních antigenů, které mohou být spojeny s použitím nativní peptidové sekvence. Navíc tato technika umožňuje identifikaci souboru rozpoznávacích vlastností pro každý nativní peptid z hlediska sdílených chemických vlastností mezi rozpoznávanými sekvencemi mimotopů.

Kovalentní vazba peptidu na imunogenní nosič může být provedena způsobem známým v oboru. Tak např. pro přímou kovalentní vazbu je možno používat karbodiimid, glutaraldehyd nebo (N25 [γ-maleimidobutyryloxyjsukcinimidester, s použitím běžně komerčně dostupných heterobifunkčních propojovacích skupin jako je CDAP a SPDP (podle doporučení výrobců). Po provedení vazebných reakcí může být imunogen snadno izolován a čištěn pomocí dialýzy, gelové filtrace, frakcionace atd.

Typy nosičů používaných u imunogenů podle předkládaného popisu budou odborníkovi v oboru zřejmé. Funkcí nosiče je poskytnutí cytokinové pomoci pro zvýšení indukce imunitní odpovědi proti peptidu. Nevyěerpávající seznam nosičů, které mohou být v rámci předkládaného popisu použity, zahrnuje: hemocyanin z měkkýše Megathura crenulata (Keyhole limpet Haemocyanin, KLH), sérové albuminy jako je bovinní sérový albumin (BSA), inaktivované bakteriální toxiny jako jsou toxiny tetanu nebo záškrtu (BSA), inaktivované bakteriální toxiny jako jsou toxiny tetanu nebo záškrtu (TT a DT) nebo jejich rekombinantní fragmenty (např. doména 1 fragmentu C TT nebo trans lokační doména DT), nebo čištěný proteinový derivát tuberkulinu (PPD). Mimotopy nebo epitopy mohou být alternativně přímo konjugovány k liposomovým nosičům, které mohou navíc obsahovat imunogeny schopné poskytnou pomocí T-buněk. Poměr mimotopů k nosiči je s výhodou řádově 1 : 1 až 20 : 1, a s výhodou by každý nosič mohl nést mezi 3 až 15 peptidy.

V jednom provedení popisu je výhodným nosičem protein D z Haemophilus influenzae (EP 0 594 610 Bl). Protein D je protein vázající IgD z Haemophilus influenzae, který byl patentován Forsgrenem (WO 91/18926, udělený EP 0 594 610 Bl). Za určitých okolností, například v rekombinantních imunogenních expresních systémech, může být vhodné používat fragmentů proteinu D, např. protein D l/3^rd (obsahující N-koncových 100 až 110 aminokyselin proteinu D (GB 9717953.5)).

Další výhodný způsob předkládání peptidů podle předkládaného popisu je ve formě rekombi50 nantní fúzní molekuly. Například EP 0 421 635 B popisuje použití chimémích antigenních částic jádra hepadnaviru pro předkládání cizích peptidových sekvencí ve formě částic podobných viru.

Imunogeny podle předkládaného popisu mohou v této formě obsahovat peptidy předkládané ve formě chimérních částic složených z antigenu jádra hepatitidy B. Navíc mohou rekombinantní fúzní proteiny obsahovat mimotopy podle předkládaného popisu a nosný protein, jako je NS1

-3 CZ 303468 B6 viru chřipky. Pro každý rekombinantně exprimovaný protein, který tvoří součást předkládaného popisuje součástí předkládaného vynálezu také nukleová kyselina kódující uvedený imunogen.

Peptidy používané v předkládaném popisu mohou být snadno syntetizovány postupy syntézy na pevné fázi, které jsou dobře známé v oboru. Vhodná syntéza se může provádět s využitím postupů „T-boc“ nebo „F—moc“. Cyklické peptidy mohu být syntetizovány syntézou na pevné fázi s použitím dobře známého postupu „F-moc“ a polyamidové pryskyřice na zcela automatizovaném zařízení. Odborníkům v oboru jsou alternativně známé nezbytné laboratorní postupy pro ruční provádění syntézy. Způsoby a postupy pro syntézu na pevné fázi se popisují v publikaci Solid Phase Peptide Synthesis: A Practical Approach, E. Atherton a R.C. Sheppard, Publl. IRL, Oxford University Press (1989). Peptidy mohou být alternativně produkovány rekombinantními metodami včetně exprese molekul nukleové kyseliny kódujících mimotopy v bakteriální nebo savčí buněčné linii, s následnou purifikaci exprimovaného mimotopu. Způsoby rekombinantní exprese peptidů a proteinů jsou v oboru známé a popisují se v publikaci Maniatis, T., Fritsch, E. F. a Sambrook a další, Molecular cloning, a laboratory manual, 2. ed.; Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York (1989).

V dalším provedení popisu se poskytuje způsob výroby zde popisovaného polypeptidu. Způsob podle popisu se může provádět běžnými rekombinantními technikami, které se popisují v publikaci Maniatis a další, Molecular Cloning - A Laboratory Manual; Cold Spring Harbor, 1982 až 1989. Poskytuje se tedy způsob výroby polypeptidu podle popisu, který zahrnuje kultivaci hostitelské buňky za podmínek dostatečných pro produkci uvedeného polypeptidu, a izolaci polypeptidu z kultivačního média. Způsob podle popisu může s výhodou zahrnovat následující kroky:

i) připraví se replikační nebo integrační expresní vektor, který je schopen v hostitelské buňce exprimovat polymer DNA obsahující nukleotidovou sekvenci kódující protein nebo jeho imunogenní derivát;

íi) provede se transformace hostitelské buňky tímto vektorem;

iti) tato transformovaná hostitelská buňka se kultivuje za podmínek umožňujících expresi uvedeného polymeru DNA za získání proteinu; a iv) získaný protein se izoluje.

Polypeptidy nebo imunogenní fragmenty podle popisu mohou být ve formě „zralého“ proteinu nebo mohou být součástí většího proteinu jako je prekurzor nebo fúzní protein. Často je výhodné přidat další aminokyselinovou sekvenci, která obsahuje sekvenční nebo vedoucí sekvence, prosekvence, sekvence napomáhající čištění jako jsou vícečetné histidinové zbytky, nebo další sekvenci zvyšující stabilitu v průběhu rekombinantního způsobu výroby. Navíc je také možné přidávat exogenní polypeptid nebo lipidové zakončení nebo polynukleotidové sekvence pro zvýšení imunogenní schopnosti hotové molekuly.

V jednom provedení se popis týká rozpustných fúzních proteinů získaných metodami genetického inženýrství, které obsahují polypeptid podle předkládaného vynálezu, nebo jeho fragment, a různé části konstantních oblastí těžkých nebo lehkých řetězců imunoglobulinů různých podtříd (IgG, IgM, IgA, IgE). Jako imunoglobulin je výhodná konstantní část těžkého řetězce lidského IgG, zvláště IgG 1, kde fúze probíhá v patentové oblasti. V jednom konkrétním provedení může být část Fc jednoduše odstraněna zavedením štěnicí sekvence, která může být rozštěpena faktorem srážlivosti krve Xa. Popis se dále týká způsobů připraví těchto fúzních proteinů metodami genetického inženýrství a jejich použití pro screening léčiv, diagnózu a terapii. Zvláště výhodné provedení popisu se týká použití polypeptidu nebo polynukleotidu při výrobě vakcíny pro imunologickou terapii pacienta trpícího karcinomem nebo citlivého ke karcinomu, zvláště rakovinou tlustého střeva nebo jinými tumory souvisejícími s tlustým střevem nebo onemocněními souvisejícími s tlustým střevem. Další provedení popisu se také týká polynukleotidů kódujících tyto fúzní proteiny. Příklady technologie fúzních proteinů je možné nalézt v mezinárodních patentových přihláškách WO 94/29458 a WO 94/22914.

-4CZ 303468 B6

Proteiny mohou být chemicky konjugovány nebo exprimovány ve formě rekombinantních fúznich proteinů umožňujících produkci zvýšených hladin proteinů v daném expresním systému ve srovnání s nefúzovaným proteinem. Fúzní partner může napomáhat při poskytování T-pomocných epitopů (imunologický fúzní partner), s výhodou T-pomocných epitopů rozpoznávaných člověkem nebo napomáhat při expresi proteinu (složka zesilující expresi) ve vyšších výtěžcích než u nativního rekombinantního proteinu. Fúzní partner bude s výhodou jak imunologický fúzní partner, tak i partner zesilující expresi.

Mezi fúzní partnery je možno zahrnout protein D z Haemophilus influenzae B. a nestruktumí io protein chřipkového viru NS1 (hemaglutinin). Dalším imunologickým fúzním partnerem je protein známý jako LYA. S výhodu se používá C-koncová část molekuly. Protein Lyta je odvozen z bakterie Streptococcus pneumoniae, která syntetizuje N-acetyl-L-alaninamidázu, amidázu

LYTA (kódovanou genem lytA){Gene, 43 (1986) str. 265 až 272}, což je autolysin specificky degradující některé vazby v peptidoglykanové kostře. C-koncová doména proteinu LYTA je odpovědný za afinitu k cholinu nebo některým analogům cholinu, jako je DEAE. Tato vlastnost byla využívána pro vývoj plasmidu E. coli exprimujících C-LYTA použitelných pro expresi fúzních proteinů. Byla také popsána purifikace hybridních proteinů obsahujících fragment C-LYTA na aminovém konci {Biotechnology: 10 (1992) str. 795 až 798}. Je možné používat opakující se část molekuly Lyta, která se nachází na C-konci počínaje zbytkem 178, např. zbytky 188 až 305.

Předkládaný popisu také zahrnuje xonogenní formy (označované také orghologní formy) výše uvedených polypeptidů, kde tyto xenogenní formy označují antigen s podstatnou sekvenční identitou s lidským antigenem (označovaný také jako autologní antigen), který slouží jako referenční antigen, ale který je odvozen z různých druhů odlišných od člověka. V této souvislosti se pod25 statná identita týká souhlasu aminokyselinové sekvence s jinou aminokyselinovou sekvencí nebo souhlasu polynukleotidové sekvence s jinou polynukleotidovou sekvencí, jestliže jsou tyto sekvence uspořádány pro dosažení nej lepší shody s kterýmkoli z řady proteinů požitých pro uspořádání sekvence známých v oboru. Podstatnou identitou se míní alespoň 70 až 95%, s výhodou alespoň 85 až 95 %, nejvýhodněji alespoň 90 % až 95 % sekvenční identita mezi porovnávanými sekvencemi. Podle popisu bude tedy xenogenní polypeptidem CASB7439 polypeptid CASB7439, který je xenogenní vzhledem k lidskému CASB7439, tedy jinými slovy polypeptid izolovaný z jiného druhu než je člověk. Ve výhodném provedení je tento polypeptid izolován z myši, krysy, vepře nebo opice rhesus, nejvýhodněji z myši nebo krysy. Předkládaný popis tedy také poskytuje způsob indukce imunitní odpovědi proti lidskému CASB7439 s aminokyselinovou sekvencí uvedenou v kterékoli ze sekvence SEQ ID No: 2, nebo SEQ ID No: 10 u člověka, který zahrnuje podávání účinné dávky směsi obsahující popsanou xenogenní formu CASB7439 pacientovi. Ve výhodném provedení zahrnuje způsob indukci imunitní odpovědi proti lidskému CASB7439 použitím xenogenního CASB7439 izolovaného z myši, potkana, vepře nebo pice rhesus. Další výhodný způsob indukce imunitní odpovědi podle předkládaného popis používá anti gen ní směs obsahující živý virový expresní systém, který exprimuje uvedený xenogenní antigen. Výhodný xenogenní polypeptid CASB7439 má sekvenci uvedenou v SEQ ID No: 12 (myš) nebo v SEQ ID No: 14 (krysa).

Izolovaný xenogenní polypeptid CASB7439 bude obecně sdílet podstatnou podobnost sekvence, a zahrnuje izolované polypeptidy obsahující aminokyselinovou sekvenci s alespoň 70% identitou, s výhodou alespoň 80% identitou, výhodněji alespoň 90% identitou, ještě výhodněji alespoň 95% identitou, nej výhodněji alespoň 97 až 99% identitou se SEQ DI No: 12 nebo SEQ ID NO: 14 po celé délce SEQ ID No: 12 nebo SEQ ID NO: 14. Xenogenní polypeptid bude tedy obsahovat imunogenní fragment polypeptidu SEQ ID NO: 12 nebo SEQ ID No: 14, ve kterém je imuno50 gen ní aktivita imunogenního fragmentu v podstatě stejná jako v případě polypeptidu SEQ ID

NO: 12 nebo SEQ ID No: 14. Navíc může být xenogenní polypeptid CASB7439 fragment o délce alespoň přibližně 20 za sebou následujících aminokyselin, s výhodou přibližně 30, výhodněji přibližně 50, ještě výhodněji přibližně 100, nejvýhodněji přibližně 150 za sebou následujících aminokyselin zvolených z aminokyselinových sekvencí ukázaných v SEQ ID No: 12 nebo v SEQ ID No: 14. Xenogenní fragmenty CASB7439 si budou zvláště zachovávat určité funkční

-5CZ 303468 B6 vlastnosti, s výhodou imunologickou aktivitu, větší molekuly uvedené v SEQ ID No: 12 nebo SEQ ID No: 14, a budou použitelné ve zde popisovaných způsobech (např. ve farmaceutických směsích a vakcínách, při diagnóze atd.). Fragmenty budou zvláště schopné vyvolávat imunitní reakci vůči lidskému protějšku, jako je tvorba zkříženě reagujících protilátek, které budou reagovat s autologní lidskou formou CASB7439 uvedenou v kterékoli ze SEQ ID NO: 2. V konkrétním provedení může být xenogenní polypeptid podle popisu součástí většího fúzního proteinu obsahujícího xenogenní polypeptid CASB7439 nebo jeho fragment a heterologní protein nebo část proteinu působí jako výše popsaný fúzní partner.

Předkládaný popis také zahrnuje varianty výše uvedených polypeptidů, tj. polypeptidy, které se od referenčních polypeptidů odlišují konzervativními substitucemi aminokyselin, při kterých je zbytek substituován jiným zbytkem s podobnými vlastnostmi. Typicky jsou takovými substitucemi vzájemné substituce mezi Ala, Val, Leu a Lle; mezi Ser a Thr; mezi kyselými zbytky Asp a Glu; mezi Asn a Gin; a mezi bazickými zbytky Lys a Arg; nebo aromatickými zbytky Phe a Tyr. Zvláště výhodné jsou varianty, ve kterých byly provedeny substituce, delece nebo adice 5 až 10, 1 až 5, I až 3, 1 až 2 nebo 1 aminokyseliny v jakékoli kombinaci.

Polypeptidy podle předkládaného popisu se mohou připravovat jakýmkoli vhodným způsobem. Mezi takové polypeptidy patří izolované v případě se vyskytující polypeptidy, rekombinantně vyráběné polypeptidy, synteticky produkované polypeptidy nebo polypeptidy produkované kombinací těchto způsobů. Způsoby výroby těchto polypeptidů jsou v oboru dobře známé.

V dalším provedení se předkládaný popis týká póly nukleotidů CASB7439. Mezi tyto polynukleotidy patří izolované póly nukleotidy obsahující nukleotidovou sekvenci kódující polypeptid s alespoň 70% identitou,1 s výhodou alespoň 80% identitou,1 výhodněji s alespoň 90% identitou, ještě výhodněji s alespoň 95% identitou s aminokyselinovou sekvencí SEQ ID No: 2 nebo SEQ ID NO: 10, po celé délce SEQ ID NO: 2 nebo SEQ ID No: 10. V této souvislosti jsou velmi výhodné kódované polypeptidy s identitou alespoň 97 %, přičemž ještě výhodnější jsou polypeptidy s 98 až 99% identitou a nej výhodnější jsou polypeptidy s alespoň 99% identitou.

Další póly nukleotidy podle předkládaného popisu zahrnují izolované polynukleotidy obsahující nukleotidovou sekvenci, která má alespoň 70% identitu, s výhodou alespoň 80% identitu, výhodněji alespoň 90% identitu, ještě výhodněji alespoň 95% identitu, s nukleotidovou sekvencí kódující polypeptid SEQ ID No: 2 nebo SEQ ID No: 10 po celé délce kódující oblasti. V této souvislosti jsou výhodné polynukleotidy s alespoň 97% identitou, přičemž výhodnější jsou polypeptidy s alespoň 98 až 99% identitou a nej výhodnější jsou polypeptidy s alespoň 99% identitou.

Mezi další polynukleotidy podle předkládaného popisu patří izolované polynukleotidy obsahující nukleotidovou sekvenci, která má alespoň 70% identitu, s výhodou alespoň 80% identitu, výhodněji alespoň 90% identitu, ještě výhodněji alespoň 95% identitu se SEQ ID No: 1, SEQ ID No: 8 nebo SEQ ID No: 9, po celé délce uvedených sekvencí, nebo s kódující sekvencí SEQ ID NO: 1, SEQ ID No: 8 nebo SEQ ID No: 9 po celé délce uvedené kódující sekvence SEQ ID No: 1, SEQ ID NO: 8 nebo SEQ ID No: 9. V této souvislosti jsou velmi výhodné polynukleotidy s alespoň 97% identitou, přičemž ještě výhodnější jsou polynukleotidy s alespoň 98 až 99% identitou a nej výhodnější jsou polynukleotidy s alespoň 99% identitou. Tyto polynukleotidy zahrnují polynukleotidy obsahující polynukleotid se SEQ ID No: l, SEQ ID No: 8 nebo SEQ ID No: 9, stejně jako polynukleotid se SEQ ID No: 1, SEQ ID No: 8, SEQ ID No: 9, nebo kódující oblast SEQ ID NO: 1, SEQ ID No: 8 nebo SEQ ID No: 9.

Předkládaný popis také poskytuje nukleovou kyselinu kódující výše uvedené xenogenní proteiny podle předkládaného vynálezu a jejich použití v lékařství. Ve výhodném provedení má xenogenní polynukleotid CASB7439 pro použití ve farmaceutických směsích sekvenci uvedenou v SEQ ID No: 13 (myš) nebo v SEQ ID No: 15 (potkan). Izolované xenogenní polynukleotidy CASB7439 podle popisu mohou být jednořetězcové (kódující nebo nekódující řetězce) nebo dvoj řetězcové, a může jít o molekulu DNA (genomové, cDNA nebo syntetické) nebo molekuly RNA. V poly-6CZ 303468 B6 nukleotidu podle předkládaného popisu mohou, ale nemusí být přítomny další kódující nebo nekódující sekvence. V jiných souvislostech provedeních poskytuje předkládaný popis varianty polynukleotidu, které mají podstatnou identitu se sekvencemi popisovanými v SEQ ID No: 13 nebo v SEQ ID NO: 15, např. sekvence obsahující alespoň 70% identitu, s výhodou alespoň 75, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98 nebo 99% nebo vyšší sekvenční identitu ve srovnání s polynukleotidovou sekvencí podle předkládaného vynálezu s použitím zde popisovaných metod (např. analýza BLAST s použitím standardních parametrů). V příbuzném provedení bude izolovaný xenogenní polynukleotid podle popisu obsahovat nukleotidovou sekvenci kódující polypeptid s alespoň 90%, s výhodou 95% a vyšší identitou s aminokyselinovou sekvencí SEQ ID No: 12 nebo SEQ ID No: 14, po celé délce SEQ ID No: 12 nebo SEQ ID NO: 14 nebo nukleotidovou sekvenci komplementární s uvedeným izolovaným póly nukleotidem.

Popis také poskytuje polynukleotidy, které jsou komplementární ke všem výše popsaným polynukleotidům.

Uvedené polynukleotidy mohou být vloženy do vhodného plasmidu, rekombínantního vektoru založeného na mikroorganismu nebo rekombínantního živého mikroorganismu a použití pro imunizaci (viz např. Wolfi a další, Science 247: 1465 až 1468 (1990); Corr a další J. Exp. Med. 184: 1555 až 1560 (1996); Doe a další, Proč. Nati. Acad. Sci. 93: 8578 až 8583 (1996)). Předkládaný popis tedy poskytuje expresní vektor nebo rekombinantní živý mikroorganismus obsahující uvedené polynukleotidy, jak bylo definováno výše.

Popis také poskytuje fragment polynukleotidu CASB7439, který má při podání pacientovi stejné imunogenní vlastnosti jako polynukleotid SEQ ID No: 1, SEQ ID No: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 13 nebo SEQ ID No: 15.

Popis také poskytuje polynukleotid kódující imunologický fragment polypeptidů CASB7439 jak bylo definováno výše.

Tylo fragmenty¹ mají míru imunogenní aktivity alespoň 50% s výhodou alespoň přibližně 70 % a výhodněji alespoň přibližně 90% ve srovnání s mírou imunogenní aktivity polypeptidové sekvence uvedené v SEQ ID No: 2 nebo SEQ ID NO: 10, nebo polypeptidové sekvence kódované polynukleotidovou sekvencí SEQ ID No: 1, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 13 nebo SEQ ID No: 15.

Polypeptidové fragmenty podle popisu obsahují s výhodou alespoň přibližně 5, 10, 15, 20, 25, 50 nebo 100 za sebou následujících aminokyselin nebo více, včetně všech mezilehlých délek uvedené polypeptidové kompozice, jako jsou sekvence v SEQ ID No: 2 nebo SEQ ID No: 10, nebo kódovaného polynukleotidovou sekvencí uvedenou v SEQ ID NO: 1, SEQ ID No: 8, SEQ ID No: 9, SEQ ID NO: 13 nebo SEQ ID No: 15:

Nukleotidová sekvence SEQ ID No: I je sekvence cDNA, která obsahuje sekvenci kódující polypeptid (nukleotidy 45 až 1126), která kóduje polypeptid o délce 193 aminokyselin, tj. polypeptid SEQ ID NO: 2. Nukleotidová sekvence kódující polypeptid SEQ ID No: 2 může být identická s kódující sekvenci polypeptidů obsaženou v SEQ ID NO: 1, nebo může jít o jinou sekvenci než je sekvence obsažená v SEQ ID No: 1, která rovněž kóduje, v důsledku regenerace genetického kódu, polypeptid SEQ ID NO: 2. Polypeptid SEQ ID No: 2 je strukturně příbuzný s jinými proteiny ze skupiny označované „human Acheate Schute homologue 2“ (HASH2) (přístupové číslo NP-005161 a AAB86993).

Gen „Human Achaete Scute homologue 2“ (HASH2), oficiálně nazývaný lidský ASCL2 (Achaete Scute complex like 2) je homolog genů Drosophila Achaete a Scute. Lidský ASCL2 je exprimován pouze v extraví ložních trofoblastech vyvíjející se placenty, a je mapován na chromosomu lpi5 v blízkosti IGF2 a H19. Myší gen „achaete-schute homologe-2“ (MASH2) kóduje transkripční faktor, který má úlohu při vývoji trofoblastu. Gen Mash2 přechází na myš z otce, a

-7CZ 303468 B6 nedostatečná exprese ASCL2 při nemaligní hydatidiformní (androgenetické) mole u člověka ukazuje, že lidský Ascl2 přechází také u člověka.

Alders et al.: „The human Achaete-Schute homologue 2 (ASCL2, HASH2) maps to chromosome 11 p 15.5, close to IGF2 and is expressed in extravillus trophoblasts“, Human Molecular Genetics Vol. 6(6), 859 až 867, 1997 popisuje, že Mash2 je exprimován pouze v extrav i ložních trofoblastech vyvíjející se placenty.

Geny ASCL2 patří do základní třídy transkri pěních faktorů s motivem „helix-smyčka-helix“ („helix-loop-helix“, BHLH). Aktivují transkripci vazbou na E box (5‘-CANNTG-3⁴). Pro účinnou vazbu na DNA je nutná dimerizace s jinými proteiny BHLH.Účastní se determinace nervových prekurzorů v periferním nervovém systému a centrálním nervovém systému u drosophila melanogaster, a pravděpodobně také u savců.

Komplementární řetězec nukleotidové sekvence SEQ ID NO: 1 je polynukleotidová sekvence SEQ ID No:6. Tento řetězec také obsahuje dvě další sekvence kódující polypeptidy. První sekvence kódující polypeptid (nukleotid 1184 až 399 SEQ ID No: 1, nukleotid 608 až 1393 SEQ ID NO: 6) kóduje polypeptid o délce 262 aminokyselin, tedy polypeptid SEQ ID No: 3. Druhá sekvence kódující polypeptid (nukleotid 840 až 262 SEQ ID No: 1, nukleotid 952 až 1530 SEQ ID No: 6) kóduje polypeptid o délce 193 aminokyselin, tedy polypeptid SEQ ÍD No: 11. Nukleotidová sekvence kódující polypeptidy SEQ ID No: 3 a SEQ ID NO:11 může být identická se sekvencí kódující polypeptidy ze SEQ ID No: 6, nebo může jít o jinou sekvenci než obsaženou v SEQ ID No: 6, která v důsledku degenerace genetického kódu kóduje také polypeptidy SEQ ID NO: 3 a 11. Polypeptid SEQ ID NO: 3 je strukturně příbuzný jiným proteinům skupiny koaktivátorů sestřihu „splicing coactivator protein family“, která má homologní a/nebo strukturní příbuznost s podjednotkou splicing coactivator subunit srm300 Homo Sapiens (přístupové číslo genbank AAF21439). Polypeptid SEQ ÍD No: 11 není příbuzný jakémukoli jinému známému proteinu. Polypeptidové sekvence uvedené v SEQ ID No: 3 a SEQ ID No: 11, a polynukleotidové sekvence uvedené v SEQ ID NO: 6 jsou nové a tvoří rovněž součást popisu.

Výhodné polypeptidy a polynukleotidy podle předkládaného popisu budou mít podle očekávání mj. podobné biologické funkce/vlastnosti jako s nimi homologní polypeptidy a polynukleotidy. Navíc mají výhodné polypeptidy, imunologické fragmenty a polynukleotidy podle předkládaného popisu podle potřeby alespoň jednu aktivitu kterékoli ze sekvencí SEQ ID NO: 1 a SEQ ID NO: 2.

Předkládaný popis se také týká částečných nebo jinak neúplných polynukleotidových a polypeptidových sekvencí, které byly identifikovány jako první před zjištěním odpovídajících úplných sekvencí SEQ ID No: 1 a SEQ ID No: 2.

Předkládaný popis dále poskytuje polypeptid, který:

(a) obsahuje aminokyselinovou sekvenci, která má alespoň 70% identitu, s výhodou alespoň 80% identitu, výhodněji alespoň 90% identitu, ještě výhodněji alespoň 95% identitu a ještě výhodněji alespoň 97 až 99% identitu se SEQ ID No: 2 po celé délce SEQ ID No: 2;

(b) má aminokyselinovou sekvenci, která má alespoň 70% identitu, s výhodou alespoň 80% identitu, výhodněji alespoň 90% identitu, ještě výhodněji alespoň 95% identitu a ještě výhodněji alespoň 97 až 99% identitu s aminokyselinovou sekvencí SEQ ID No: 2 po celé délce SEQ ID No: 2; a (c) obsahuje aminokyselinovou sekvenci SEQ ID NO: 2.

Polynukleotidy podle předkládaného popisu mohou být získány s použitím standardních metod klonování a screeningu, z knihovny cDNA odvozené z mRNA v buňkách lidské rakoviny tlustého střeva (např. Sambrook a další, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2, ed., Cold Spring

Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY (1989)). Polynukleotidy podle popisu mohou

-8CZ 303468 B6 být také získány z přirozených zdrojů jako jsou knihovny genomové DNA, nebo mohou být syntetizovány s použitím dobře známých a komerčně dostupných metod.

Jestliže se polynukleotidy podle předkládaného popisu používají pro rekombinantní produkci polypeptidů podle předkládaného popisu, polynukleotid může obsahovat kódující sekvenci zralého polypeptidu jako takovou; nebo kódující sekvenci zralého polypeptidu ve čtecím rámci s jinými kódujícími sekvencemi, jako sekvencemi kódujícími úrovní nebo sekreční sekvence, sekvenci pre- nebo pro- neb preproproteinu, nebo jiné části fúzního peptidu. Může být kódována například markerová sekvence, která umožní vyčištění fúzovaného proteinu. V některých výhodných provedeních tohoto aspektu popisuje markerovou sekvencí hexahistidinový peptid, jak je poskytován ve vektoru pQE (Qiagen, lne.) popisován v Gentz a další, Proč. Nati. Acad. Sci. USA (1989)86: 821 až 824, nebo sekvence HA tágu. Polynukleotid může také obsahovat nekódující 5‘- a 3‘-sekvence, jaké jsou přepisované, nepřekládané sekvence, sestřihové a polyadenylační signály, vazebná místa ribosomů a sekvence stabilizující mRNA.

Další provedení předkládaného popisu poskytuje polynukleotidy kódující polypeptidové varianty, které obsahují aminokyselinovou sekvenci SEQ ID No: 2, SEQ ID No: 13 nebo SEQ ID No: 15, a ve kterých byla provedena substituce, delece nebo adice několika například 5 až 10, 1 až 5, l až 3, 1 až 2 nebo jednoho aminokyselinového zbytku v jakékoli kombinaci.

Polynukleotidy, které jsou identické nebo jsou dostatečně identické s nukleotidovou sekvencí obsaženou v SEQ Dl No: 1 nebo SEQ ID No: 6, mohou být použity jako hybridizační klony pro cDNA a genomovou DNA nebo jako primery pro amplifikační reakce (PCR) nukleových kyselin, pro izolaci úplných cDNA a genomových klonů kódujících polypeptidy podle předkládaného popisu, a pro izolaci cDNA a genomových klonů jiných genů (včetně genů kódujících paralogy z lidských zdrojů a orghology a paralogy z jiných než lidských zdrojů), které mají vysokou sekvenční podobnost se SEQ ID No: 1 nebo SEQ ID No: 6. Tyto nukleotidové sekvence jsou s výhodou ze 70 identické, s výhodou z 80% identické, výhodněji z 90% identické, nejvýhodněji z 95 % identické s referenční sekvencí. Sondy nebo primery budou obecně obsahovat alespoň 15 nukleotidů, s výhodou alespoň 30 nukleotidů, a mohou obsahovat alespoň 50 nukleotidů. Zvláště výhodné sondy budou obsahovat mezi 30 a 50 nukleotidy. Zvláště výhodné primery budou obsahovat mezi 20 a 25 nukleotidy. Polypeptidy nebo polynukleotidy odvozené ze sekvencí z homologních zvířecích zdrojů by mohly být konkrétně použity jako imunogeny pro získání zkřížené imunitní odpovědi proti lidskému genu.

Polynukleotid kódující polypeptid podle předkládaného popisu, včetně homologů z druhu jiných než člověk, mohou být získány způsobem zahrnujícím kroky screeningu vhodné knihovny za stringentnich podmínek hybridizace, pomocí značené sondy se sekvencí SEQ ID No: I nebo SEQ ID No: 6 nebo fragmentem této sekvence; a izolaci úplné cDNA a genomových klonů obsahujících tuto polynukleotidovou sekvenci. Tyto způsoby hybridizace jsou dobře známé odborníkům v oboru. Mezi výhodné podmínky stringentní hybridizace patří inkubace přes noc při 42 °C v roztoku obsahujícím 50% formamid, 5x SSC (150 mM NaCl, 15 mM citrát trojsodný), 50 mM fosforečnan sodný (pH 7,6), 5 x Denhardtův roztok, 10% síran dextranu a 20 pg/ml denaturované, střižnými silami zpracované DNA lososího spermatu; s následným promytím filtrů v 0,1 x SSC při přibližně 65 °C. Předkládaný popis tedy také zahrnuje polynukleotidy získatelné sereeningem vhodné knihovny ze stringentnich podmínek hybridizace, značenou sondou se sekvencí SEQ ID No: 1 nebo SEQ ID No: 6 nebo jejího fragmentu.

Odborníkovi v oboru dobře zřejmé, že v mnoha případech bude izolovaná sekvence cDNA neúplná v tom, že kódující oblast polypeptidu je zkrácená na 5‘-konci cDNA.

Existuje několik způsobů, které jsou odborníkům v oboru dobře známé, pro získání cDNA s úplnou délkou, nebo pro prodloužení zkrácených cDNA, jako jsou například způsoby založené na metodě Rapid Amplification of cDNA ends (RACE) viz např. Frohman a další, DNAS, USA 85,

8998 až 9002, 1988). Nedávno provedené modifikace tohoto způsobu, jejich příkladem je např.

-9CZ 303468 B6 technologie Marathon¹¹⁰ (Clontech Laboratories lne.), poskytují podstatně zjednodušené vyhledávání delších cDNA. Pri postupu podle technologie Marathon™ se z mRNA extrahované ze zvolené tkáně připravily cDNA a na oba konce byla ligována „adaptorová“ sekvence. Potom se provede amplifikace nukleové kyseliny (PCR) pro amplifikaci „chybějícího“ 5‘-konce cDNA s použitím kombinace oligonukleotidových primerů specifických pro gen a specifických pro adaptor. Reakce PCR se potom opakuje s použitím vnitřních primerů („nested“ primers), tj. příměrů navržených tak, aby teplotně hybridizovaly s amplifikovaným produktem (typicky primer specifický pro adaptor, který teplotně hybridizuje dále ve směru 3‘ v adaptorové sekvenci a primer specifický pro gen, kteiý ve známé genové sekvenci teplotně hybridizuje dále ve směru 5‘. ío Produkt této reakce může být potom analyzován sekvenováním DNA a cDNA s úplnou délkou může být zkonstruována buď navázáním produktu přímo na existující cDNA za získání úplné sekvence, nebo provedením oddělené PCR s úplnou délkou s použitím nové sekvenční informace pro návrh 5'-primeru.

Rekombinantní polypeptidy podle předkládaného popisu mohou být připraveny způsoby dobře známými v oboru z hostitelských buněk získaných metodami genetického inženýrství obsahujících expresní systémy. Podle dalšího provedení se předkládaný popis týká expresního systému, který obsahuje polynukleotid podle předkládaného popisu, hostitelských buněk získaných metodami genetického inženýrství a obsahujících tyto expresní systémy, a produkce polypeptidů podle popisu rekombinantními technikami. Pro výrobu takových proteinů mohou být také použity bezbuněčné translační systémy využívající RNA odvozené z konstruktů DNA podle předkládaného popisu.

Pro rekombinantní produkci mohou být buňky modifikovány metodou genetického inženýrství tak, aby obsahovaly expresní systémy nebo jejich části pro polynukleotidy podle předkládaného popisu. Zavedení polynukleotidu do hostitelských buněk může být uskutečněno způsoby popisovanými v mnoha standardních laboratorních příručkách, jako je Davis a další, Basic Methods ín Molecular Biology (1986) a Sambrook a další, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2. ed„ Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY (1989). Takové výhodné metody jsou například transfekce pomocí fosforečnanu vápenatého, transfekce zprostředkovaná DEAEdextranem, transvekce, mikroinjekce, transfekce zprostředkovaná kationtovými lipidy, elektroporace, transdukce, vnášení škrabáním, balistické vnášení nebo infekce.

Proteiny podle popisu se s výhodou exprimují společně s thioredoxinem in trans (TIT). Koex35 prese thioredoxinu in trans proti in cis je výhodná tím, že umožní přípravu antigenu prostého thioredoxinu bez nutností použití proteázy. Společná exprese s thioredoxinem usnadňuje sol ubil izaci proteinů podle vynálezu. Společná exprese s thioredoxinem má také významný vliv na výtěžky čištění proteinu, na rozpustnost vyčištěného proteinu a jeho jakost.

Reprezentativní příklady vhodných hostitelů zahrnují bakteriální buňky, jako je streptokoky, stafylokoky, kmeny E. coli, streptomycely a buňky Bacillus subtilis; houbové buňky jako jsou kvasinkové buňky a buňky Aspergillus; hmyzí buňky jako jsou buňky Drosophila S2 a Spodoptera Sf9; živočišné buňky jako jsou buňky CHO, COS, HeLa, Cl27, 3T3, BHK, HEK 293 a Bowesova melanomu; a rostlinné buňky.

Je možno použít celé řady expresních systém, například chromosomální, eposomální a od virů odvozené systémy, například vektory odvozené z bakteriálních plasmidů, z bakteriofágů, z transpozonů, z kvasinkových epízomů, z inzerčních elementů, z kvasinkových epizom, z inzerčních elementů, z kvasinkových chromosomálních elementů, z virů jako jsou bakuloviry, papovaviry, jako SV40, viry vakcinie, adenoviiy, viry drůbežích neštovic, viry pseudorabies a retroviry, a vektory odvozené z jejich kombinací, jako jsou vektory odvozené z genetických prvků plasmidů a bakteriofágů, jako jsou kosmidy a řágmidy. Expresní systémy mohou obsahovat řídicí oblasti, které regulují stejně jako poskytují expresi. Může být obecně použit jakýkoli systém nebo vektor, který může udržovat, podmnožovat nebo exprimovat polynukleotid pro produkci polypeptidů v hostiteli. Vhodná nukleotidová sekvence může být vložena do některého expresního systému

- 10CZ 303468 B6 pomocí rady známých a rutinních technik, které se například uvádějí v publikaci Sambrook a další, Molecular Cloning, A Laboratory Manual (výše). Do požadovaného polypeptidů mohou být vloženy vhodné sekreěnt signály pro umožnění sekrece předkládaného proteinu do lumen endoplasmatického retikula, periplasmatického prostoru nebo extracelu lamího prostředí. Tyto signály mohou být vzhledem k polypeptidů, endogenní, nebo může jít o heterologní signály.

Expresní systém může také být rekombinanční živý mikroorganismus, jako je virus nebo bakterie. Sledovaný gen může být vložen do genomu živého rekombinantního viru nebo bakterie. Zaočkování a infekce in vivo tímto živým vektorem povede k expresi antigenu in vivo a indukci imunitních odpovědí.

V některých provedeních se tedy polynukleotidy kódující imunogenní polypeptidy podle předkládaného popisu zavádějí do vhodných savčích hostitelských buněk pro expresi s použitím kteréhokoli zrady známých systémů založených na virech. Vjednom ilustrativním provedení poskytují retroviry pohodlnou a účinnou platformu pro systémy dodávání genů. Zvolená nukleotidová sekvence kódující polypeptid podle předkládaného popisu může být vložena do vektoru a do retrovirálních částic použitím způsobů známých v oboru. Rekombinantní virus může být potom izolován a vložen do pacienta. Byla popsána řada ilustrativních retrovirových systémů (např. patent US 5 219 740; Miller a Rosman (1989) Bio Techniques 7: 980 až 990; Miller, A.D. (1990) Human Gene Therapy 1: 5 až 14; Scarpa a další (1991) Virology 180: 849 8 2; Bums a další, Proč. nalt. Acad. Sci. USA 90: 8033 8037; a Boris-Lawrie a Temin (1993) cur. Opin. Genet. Develop. 3: 102 až 109).

Bylo dále popsáno velké množství ilustrativních systémů založených na adenovirech. Na rozdíl od retrovirů, které se integrují do genomu hostitele, zůstávají adenoviry přítomné extrachromosomálně, takže je minimalizováno riziko spojené s inzerční mutagenezí (Haj-Ahman a Graham (1986), J. Viro. 57: 267 až 274; Bett a další (1993), J, Vurik, 67: 5911 až 5921; Mittereder a další (1994), Human Gene Therapy 5: 717 až 729; Seth a další (1994), J. Virol. 68: 933 až 940; Barr a další (1994), Gene Therapy 1: 51 až 58; Berkner, K.L. (1988), BioTechniques 6: 616 až 629; a Rich a další (1993), Human Gene Therapy 4: 461 až 476).

Pro dodávání polynukleotidu byly také vyvinuty vektorové systémy na bázi viru asociovaného s adenovirem (AAV). Vektory AAV mohou být snadno konstruovány s použitím v oboru známých způsobů, viz např. patent US 5 173 414 a US 5 139 941; mezinárodní přihláška No: WO 92/01070 a WO 93/03769; Lebkowski a další (1988), Molec. Cell Biok. 8: 3988 až 3996; Vincent a další (1990), Vaccines 90 (Cold Spring Harbor Laboratory Press); Carter, B. J. (1992), Current Opinion in Biotechnology 3: 533 až 539; Muzyczka, N. (1992), Current Topics in Microbiol. and Immunol. 158: 97 až 129; Kotin, R. M. (1994), Human Gene Therapy 5: 793 až 801; Shelling a Smith (1994), Gene Therapy 1: 165 až 169; a Zhou a další (1994), J. Exp. Med. 179: 1867 až 1875.

Mezi další virové vektory použitelné pro dodávání molekul nukleových kyselin kódujících polypeptidy podle předkládaného popisu přenosem genů patří vektory odvozené ze skupiny poxvirů, jako je virus vakcinie a ptačí poxviry. Rekombinanty viru vakcinie exprimující nové molekuly mohou být například zkonstruovány následovně. Do vhodného vektoru se nejprve vloží DNA kódující polypeptid tak, že sousedí s promotorem vakcinie a obklopujícími sekvencemi DNA vakcinie, jako je sekvence kódující thymidinkinázu (TK). Tento vektor se potom použije pro transfekcí buněk, které jsou současně infikovány vakcinií. Homologní rekombinace slouží pro vložení promotoru vakcinie plus genu kódujícího sledovaný polypeptid do virového genomu. Selekce výsledného rekombinantu TK.sup.(-) může být provedena kultivací buněk v přítomnosti 5-bromdeoxyuridinu a odpíchnutím virových plaků, které jsou na nej rezistentní.

Infekění/transfekční systém založený na vakcinii může být pohodlně použit pro získání inducibilní, přechodné exprese nebo koexprese jednoho nebo více zde popisovaných polypeptidů v hostitelských buňkách organismu. V tomto konkrétním systému jsou buňky nejprve infikovány in vitro rekombinantou viru vakcinie, která kóduje DNA polymerázu bakteriofága T7. Tato polymeráza má výlučnou specifitu v tom, že přepisuje pouze templáty nesoucí promotory T7. Po infekci se buňky transfekují sledovaným polynukleotidem nebo póly nukleotidy pod řízením T7 promotoru. Polymeráza exprimovaná v cytoplasmě z rekombinanty viru vakcinie přepisuje transfekovanou DNA do RNA, která je potom překládacími mechanismy hostitele předkládána do polypeptidu. Tento způsob poskytuje vysokou, přechodnou produkci velkých množství RNA a jejích translačních produktů v cytoplasmě, viz např. Elroy-Stein a Moss, Proč. Nati. Acad. Sci USA (1990) 87: 6743 až 6747; Fuerst a další, Proč. Nati. Acad. Sci. USA (1986) 83: 8122 až 8126.

Pro dodávání sledovaných kódujících sekvencí mohou být také alternativně použity ptačí poxviry, jako jsou viry drůbežích neštovic a kanárčích neštovic. Je známo, že rekombinantní ptačí poxviry, které exprimují imunogeny ze savčích patogenů, propůjčují ochrannou imunitu při podání druhů odlišných od ptáků. Použití vektoru ptačích neštovic je zvláště vhodné u lidí a jiných savčích druhů, protože rod viru ptačích neštovic se může produktivně replikovat pouze ve vnímavých druzích ptáků, a proto není infekční v savčích buňkách. Způsob produkce rekombinantních virů ptačích neštovic je v oboru znám a zahrnuje genetickou rekombinaci, jak se popisuje výše pro produkci virů vakcinie, viz např. WO 91/12882; WO 89/03429; a WO 92/03545.

Pro dodání polynukleotidových směsí podle předkládaného popisu může být také použit kterýkoli z řady alfavirových vektorů, jako jsou vektory popisované v patentech US 5 843 723; US 6 015 686; US 6 008 035 a US 6 015 694. Mohou být také použity určité vektory založené na venezuelské encefalitidě koní (VEE), přičemž ilustrativní příklady těchto vektorů je možno nalézt v patentech US 5 505 947 a US 5 643 576,

Pro dodávání genů podle popisu mohou být navíc použity vektory založené na molekulárních konjugátech, jako jsou adenovirové chimémí vektory popsané v Michael a další, J. Biol. Chem. (1993) 268: 6866 až 6869 a Wagner a další, Proč. Nati. Acad. Sci. USA (1992) 89: 6099 až 6103.

Další ilustrativní informace o těchto a dalších známých dodávacích systémech na bázi virů je možno nalézt například ve Fisher-Hoch a další, Prie. Nati. Acad. Sci. USA 86: 317 až 321, 1989; Flexner a další, Ann, NY, Acad. Sci.,569: 86 až 103, 1989; Flexner a další, Vaccine 8: 17 až 21, 1990; patent US 4 603 112, US 4 769 330 a US 5 017 487; WO 89/01973; patent US 4 777 127; GB 2 200 651; EP 0 345 22; WO 91/02805; Beckner, Biotechniques 6: 616 až 627, 1988; Rosenfeld a další, Science 252: 431 až 434, 1991; Kolls a další, Proč. Nati. Acad. Sci, USA, 91: 215 až 219, 1994; Kass-Eisler a další, Proč. Nati. Acad. Sci. USA 90: 114898 až 11502, 1993; Guzman a další, Circulation 88: 2838 až 2848, 1993; a Guzman a další, Cir. Res. 73: 1202 až 1207, 1993.

Výše popisované rekombinantní živé organismy mohou být virulentní nebo různými způsoby oslabené, aby byly získány živé vakcíny. Takové živé vakcíny tvoří také součást vynálezu.

V některých provedeních může být polynukleotíd integrován do genomu cílové buňky. Tato integrace může probíhat ve specifickém umístění a orientaci prostřednictvím homologní rekombinace (náhrada genu) nebo může integrace probíhat v náhodném, nespecifickém umístění (zesílení genu). V ještě dalším provedení může být polynukleotíd stabilně udržován v buňce ve formě odděleného episomálního segmentu DNA. Tyto polynukleotidové segmenty nebo episomy kódují sekvence dostačující pro umožnění udržení a replikace nezávisle nebo v synchronizaci s cyklem hostitelské buňky. Způsob, jakým se expresní konstrukt dodá do buňky, a kde v buňce polynukleotíd zůstane závisí na typu použitého expresního konstruktu.

V dalším provedení podle vynálezu se polynukleotíd podává/dodává jako Čistá, naked DNA, např. jak se popisuje v Ulmer a další, Science 259, 1745 až 1749, 1993 a v souhrnném článku Cohen, Science 259: 1691 až 1692, 1993. Příjem čisté DNA může být zvýšen potažením DNA na biodegradovatelné kuličky, které jsou účinně transportovány do buněk.

- 12 CZ 303468 B6

V ještě dalším provedení může být směs podle předkládaného vynálezu dodávána prostřednictvím bombardování částice, přičemž dosud byly popsány řada takových způsobů, V jednom ilustrativním příkladu je možno dosáhnout urychlení částic hnaných plynem v zařízeních, která jsou vyráběna firmou Powderject Pharmaceuticals PLC (Oxford, UK) a Powderject Vaccines Inc.

(Madison, WI), přičemž některé případy těchto zařízení se popisují v patentech US 5 846 796; US 6 010 478; US 5 865 796; US 5 584 807; a patentu EP 0 500 799. Tento přístup nabízí dodávání bez použití jehly, kde se směsi ve formě suchého prášku mikroskopických Částic, jako jsou částice polynukleotidu nebo polypeptidů, urychlují na vysokou rychlost proudem plynného helia vytvářeného v ručním zařízení, které žene částice na cílovou tkáň.

V dalším provedení jsou zahrnuta jiná zařízení a způsoby, které mohou být použitelné pro bezjehlové vstřikování směsí podle předkládaného popisu proudem plynu, například zařízení poskytovaná firmou Bioject, Ind. (Portland, OR), přičemž některé další příklady se popisují v patentech US 4 790 824; US 5 064 413; US 5 312 335; US 5383 851; US 5 399 163; US 5 520 639 a US

5 993 412.

Poíypeptidy podle předkládaného popisu mohou být izolovány a čištěny z rekombinantních buněčných kultur dobře známými způsoby včetně srážení síranem amonným nebo ethanolem, extrakcí kyselinami, aniontové nebo kationtové iontoměničové chromatografie, chromatografie na fosfocelulóze, chromatografie založené na hydrofobních interakcích, afinitní chromatografie, chromatografie na hydroxyl apatitu a lektinové chromatografie. Nej výhodněji se pro čištění používá afinitní chromatografie s kovovými ionty (IMAC). Známé způsoby pro skládání proteinů do aktivní konformace (refolding) mohou být použity pro regeneraci aktivní konformace v případě, kdy je polypeptid v průběhu intracelulámí syntézy, izolace a/nebo čištění denaturován.

Další důležité provedení popisu se týká způsobu indukce, zesílení nebo modulace imunologické odpovědi u savce, který zahrnuje zaočkování savce fragmentem polypeptidů nebo úplným polypeptidem nebo polynukleotidem podle popisu, dostatečným pro produkci protilátky a/nebo pro vyvolání T-buněčné imunitní odpovědi pro imunoproťylaxi nebo pro léčení rakoviny, zvláště kolorektální rakoviny, a autoimunitního onemocnění a souvisejících stavů. V ještě dalším provedení se vynález týká způsobu indukce, zesílení nebo modulace imunologické odpovědi u savce, který zahrnuje podání polypeptidů podle předkládaného popisu prostřednictvím vektoru nebo buněčně směrované exprese polynukleotidu kódujícího polypeptid in vivo s cílem indukovat takovou imunologickou odpověď, která poskytne imunitní reakce pro prevenci nebo léčení uve35 děného savce.

Další provedení popisu se týká imunologické/vakcinační směsi a jeho použití v lékařství. Tyto směsi, jestliže se zavedou do savčího hostitele, indukují, zesilují nebo modulují imunologickou odpověď, v tomto savci na polypeptid podle předkládaného popisu, přičemž směs obsahuje poly40 peptid nebo polynukleotid nebo polynukleotid podle popisu, nebo jeho imunologický fragment, jak bylo definováno výše, Imunogen ní směs podle předkládaného popisu obsahuje zvláště bezpečné a účinné množství polypeptidů CASB7439 nebo jeho imunogenního fragmentu, přičemž polypeptid CASB7439 je zvolen ze skupiny zahrnující SEQ ID No: 2, SEQ ID No: 10, SEQ ID No: 12 nebo SEQ ID No: 14. V dalším provedení obsahuje imunogenní směs bezpečné a účinné množství polynukleotidu kódujícího CASB7439 nebo jeho fragment, přičemž polynukleotid kódující CASB7439 je zvolen ze skupiny SEQ ID No: 1, SEQ ID No: 8, SEQ ID No: 9, SEQ ID No: 13 nebo SEQ ID No: 15.

Směs pro vakcinaci podle popisu může dále obsahovat vhodný tj. farmaceuticky přijatelný nosič.

Protože polypeptid se může v žaludku rozkládat, s výhodou se podává parenterálně (např. subkutánní, intramuskulámí, intravenózní nebo intradermální injekcí). Mezi formulace vhodné pro parenterální podávání patří vodné a nevod né sterilní injekční roztoky, které mohou obsahovat antioxidanty, pufry, bakteriostatické látky a rozpouštěné látky, které umožňují dosažení osotonického stavu vzhledem ke krvi příjemce; a vodné a ne vodné sterilní suspenze, které mohou obsahovat suspendující směsi nebo zahušťující směsi. Tyto formulace mohou být předkládány

- 13CZ 303468 B6 v zásobnících pro jednotkovou dávku nebo pro větší počet dávek, například v uzavřených ampulích a lahvičkách, a mohou být uchovávány v lyofílÍzovaném stavu, který vyžaduje pouze přidání sterilního kapalného nosiče bezprostředně před použitím.

Další provedení popisu se týká indukce in vitro imunitních odpovědí na fragment nebo celý polypeptid nebo polynukleotid podle předkládaného popisu, nebo molekulu obsahující polypeptid nebo polynukleotid podle předkládaného popisu, s použitím buněk imunitního systému savce, a reinfuze těchto aktivovaných imunitních buněk savce pro léčení onemocnění. Aktivace buněk imunitního systému se dosahuje inkubací in vitro s celým polypeptidem nebo polynukleotidem podle předkládaného popisu nebo molekulou obsahující polypeptid nebo polynukleotid podle předkládaného popisu v přítomnosti nebo nepřítomnosti různých imunomodulačních molekul. Další provedení popisu se týká imunizace savce podáváním buněk prezentujících antigen modifikovaných vnesením části úplného polypeptidu podle předkládaného popisu nebo molekuly obsahující polypeptid podle předkládaného popisu in vitro, a imunogenní podání in vivo. Buňky předkládající antigen mohou být alternativně transfekovány in vitro vektorem obsahujícím fragment nebo úplný polynukleotid podle předkládaného popisu, nebo molekulu obsahující polynukleotid podle předkládaného popisu, např. pro dosažení exprese odpovídající polypeptidu, a mohou být podány imunogenním způsobem in vivo. Farmaceutické směsi podle popisu budou tedy obsahovat účinné množství buněk prezentujících antigen, modifikovaných vnesením polypeptidu CASB7439 in vitro, nebo geneticky modifikovaných in vivo pro expresi polypeptidu CASB7439, a farmaceuticky přijatelný nosič.

Podle dalšího provedení budou obsahovat zde popisované farmaceutické/imunogenní směsi jednu nebo více imunostimulačních látek navíc k imunogennímu polynukleotidů, polypeptidu, protilátce, T-buňce a/nebo buňce předkládající antigen (APC) podle popisu. Poskytuje se tedy způsob produkce uvedené imunogenní směsi, který zahrnuje míšení polypeptidu CASB7439 nebo polynukleotidu kódujícího CASB7439 s vhodnou adjuvantní/imunostimulační látkou, redivem nebo jiným farmaceuticky přijatelným nosičem. Imunostimulační látka označuje v podstatě jakoukoli látku, která zvyšuje nebo zesiluje imunitní odpověď (zprostředkovanou protilátkami a/nebo buňkami) na vnější antigen. Jedním výhodným typem imunostimulační látky je adjuvans. Mnohá adjuvans obsahují látku navrženou pro ochranu antigenu před rychlým odbouráváním, jako je hydroxid hlinitý nebo minerální olej, a stimulátor imunitních odpovědí jako je lipid A a proteiny odvozené od Bortadella pertussis nebo Mycobacterium tuberculosis. Některá adjuvans jsou komerčně dostupná, například Freundovo nekompletní adjuvans a kompletní adjuvans (Difco Laboratories, Detroit, MI); Merckovo adjuvans 65 (Merck and Company, Inc., Rahway, NJ); AS-2 (Smith Kline Beecham, Philadelphia, PA); soli hliníku jako je gel hydroxidu hlinitého (alum) nebo fosforečnan hlinitý; soli vápníku, železa nebo zinku; nerozpustná suspenze acylovaného tyrosinu; acylované cukry; kationtově nebo aniontově derivát i zo vaně póly sacharidy; polyfosfazeny; biodegradovatelné mikrokuličky; monofosforyl lipid A a quil A. Jako adjuvans mohou být také použity cytokiny, jako je GM-CSF, interleukin-2, -7, -12 a jiné podobné růstové faktory.

V rámci některých provedení popisu je adjuvantní směs s výhodou takový, který indukuje imunitní odpověď převážně typu Thl. Vysoké hladiny cytokinů typu Thl (např. IFN-γ, TNF-α, 1L2 a IL-12) zvyšují indukci buňkami zprostředkovaných imunitních odpovědí na podávaný antigen. Naopak vysoké hladiny cytokinů typu Th2 (např. IL-4, IL-5, IL-6 a 1L—10) podporují indukci humorálních imunitních odpovědí. Po aplikaci vakcíny jak se zde popisuje bude u pacienta podporována imunitní odpověď, která zahrnuje odpovědi typu Thl a Th2. Ve výhodném provedení, ve kterém je odpověď¹ převážně typu Thl, bude stoupat hladina cytokinů typu Thl ve větší míře, než hladina cytokinů typu Th2. Hladiny těchto cytokinů mohou být snadno zjišťovány použitím standardních testů. Přehled skupin cytokinů lze nalézt v článku Mosmann a Coffman, Ann. Rev. Immunoí 7: 145 až 73, 1989.

Některá výhodná adjuvans pro vyvolání odpovědi převážně typu Thl zahrnují například kombinaci monofosforyllipidu A, s výhodou 3-de-O-acy(ováného monofosforyllipidu A, se solí hliní- 14CZ 303468 B6 ku. Adjuvans MPL^(R) jsou dostupná od firmy Corixa Corporation (Seattle, Wa, Viz např. patenty US 4 436 727; US 4 877 611; US 4 866 034 a US 4 912 049). Také oligonukleotidy obsahující CpG (ve kterých je dinukleotid CpG nemethylováný) indukují převážně odpovědi typu Thl. Tyto oligonukleotidy jsou dobře známé a popisují se například ve WO 96/02555, WO 99/33488 a patentech US 6 008 200 a US 5 856 462. Jsou také popsány imunostimulační sekvence DNA, například autory Sáto a další, Science 273; 352, 1996. Další výhodné adjuvans zahrnuje saponin jako je Quil A nebo jeho deriváty včetně QS21 a QS7 (Aquila Biopharmaceuticals lne. Framingham, MA); Escin; Digitonin; nebo saponiny Gypsophila nebo Chenopodium quinoa. Další výhodné formulace obsahují v adjuvantních kombinacích podle předkládaného popisu více než jeden saponin, například kombinace alespoň dvou látek z následujících skupin QS21, QS7, Quil A, β-escin nebo digitonin.

Saponinové formulace mohou být alternativně kombinovány s vakcinaěními vehikuly složenými z chitosanu nebo jiných polykationtových polymerů, polylaktidů a kopolymemích polylaktid/glykolidových částic, polymemích matric na bázi poly-N-acetylglucosaminu, částic složených z polysacharidů nebo chemicky modifikovaných póly sacharidů, liposomů a lipidických částic, částic složených z glycerolových monoesterů apod. Saponiny mohou být také formulovány v přítomnosti cholesterolu za vytvoření ěásticových struktur jako jsou liposomy ISCOM. Saponiny mohou být dále formulovány v přítomnosti cholesterolu za vytvoření ěásticových struktur jako jsou liposomy ISCOM. Saponiny mohou být dále formulovány spolu s polyoxyethylenovým etherem nebo esterem, bud’ v roztoku neobsahujícím částice nebo suspenzi, nebo v částicové struktuře jako je pauc i lamelami liposom nebo ISCOM. Saponiny mohou být také formulovány s pomocnými látkami jako je Carbopol^(R) pro zvýšení viskozity, nebo mohou být formulovány jako suchý prášek s práškovou pomocnou látkou jako je laktóza.

V jednom výhodném provedení obsahuje adjuvantní systém kombinaci monofosforyllipidu A a derivátu saponinu, jako je kombinace adjuvans QS21 a 3D-MPL^tR), jak se popisuje ve WO 94/00153, nebo méně reaktogenní směs, kde je QS21 ve směsi s cholesterolem, jak se popisuje ve WO 96/33739. Jiné výhodné formulace obsahují emulzi typu olej ve vodě a tokoferol. Další zvláště výhodná adjuvantní formulace obsahující QS21, 3D-MPL^(R) a tokoferol v emulzi typu olej ve vodě se popisuje ve WO 95/17210.

Další adjuvantní systém se zvýšenou účinností obsahuje kombinaci oligonukleotidu obsahujícího CpG a saponinový derivát, zvláště kombinace CpG a QS21, jak se popisuje ve WO 00/09159. Formulace s výhodou dále obsahuje emulzi typu olej ve vodě a tokoferol.

Další ilustrativní adjuvans pro použití ve farmaceutických směsích podle vynálezu zahrnují Montanide ISA 720 (Seppic, Francie), SAF (Chiron, Califomia, Spojené Státy), ISCOMS (CSL), MF-59 (Chiron), a řadu adjuvans SBAS (např. SBAS-2 nebo SBAS-4, firmy SmithKline Beecham, Rixensart, Belgie), Detox (Enhanzyn^tR)) (Corixa, Hamilton, MT), RC-529 (Corixa, Hamilton, MT) a jiné aminoalkylglukosaminin-4-fosfáty (AGP), jako jsou látky popisované v US patentových přihláškách 08/853,826 a 09/074,720, jejichž obsah se zařazuje odkazem, a polyoxyethylenetherová adjuvans popisovaná ve WO 99/052549A1.

Další výhodná adjuvans zahrnují adjuvantní molekuly obecného vzorce (I):

HO(CH₂CH₂O)_n-A-R kde, n je 1 až 50, A je vazba nebo -C(O)-, Rje Ci_₅₀- alkyl nebo fenyl-Ci-50-alkyl.

Jedno provedení předkládaného popisu zahrnuje vakcinační směs obsahující polyoxyethylenether obecného vzorce (I), kde malé n je mezi 1 a 50, s výhodou 4 až 24, nejvýhodněji 9; složka Rje

Ci-50-, s výhodou C₄-C₂o-alkyl a nejvýhodněji C_]2-alkyl, a A je vazba. Koncentrace polyoxyethylenetherů by měla být v rozmezí 0, 1 až 20%, s výhodou 0,1 až 10%, a nej výhodněji v rozmezí 0,1 až 1 %. Výhodné polyoxyethylenethery jsou zvoleny z následující skupiny: poly- 15CZ 303468 B6 oxyethylen-9-1 aury I ether, polyoxyethylen-9-stearylether, polyoxyethylen-35-laurylether, a polyoxyethylen-23-laurylether. Polyoxyethylenethery jako je polyoxyethylenlaurylether se popisují v Merckově indexu (12. vydání: položka 7717). Tyto adjuvantní molekuly se popisují ve WO 99/52549.

Polyoxyethylenether obecného vzorce (I) výše může být v případě potřeby kombinován s jiným adjuvans. Výhodná adjuvantní kombinace například navíc CpG, jak se popisuje v patentové přihlášce GB 9820956.2.

Ve vakcíně podle popisuje také s výhodou přítomen nosič. Nosič může být emulze typu olej ve vodě, nebo sůl hliníku, jako je fosforečnan hlinitý nebo hydroxid hlinitý.

Výhodná emulze typu olej ve vodě obsahuje metabolizovatelný olej, jako je skvalen, alfa-tokoferol a Tween 80. Ve zvláště výhodném provedení jsou antigeny ve vakcíně podle vynálezu kombinovány s QS21 a 3D-MPL v emulzi podobného typu.Emulze typu olej ve vodě může navíc obsahovat spán 85 a/nebo lecitin a/nebo trikaprylin.

Pro podání člověku budou QS21 a 3D-MPL ve vakcíně typicky přítomny v množství v rozmezí do I do 200 pg, jako je až 100 pg, s výhodou 10 a 50 pg na dávku. Emulze typu olej ve vodě bude typicky obsahovat od 2 do 10 % skvalenu, od 2 do 10 % alfatokoferolu a od 0,3 do 3 % tweenu 80. Poměr skvalen : alva-tokoferol je s výhodou menší nebo roven než 1, čímž se dosáhne stabilnější emulze. Spán 85 může být také přítomen v množství 1 %, V některých případech může být výhodné, jestliže vakcíny podle předkládaného vynálezu dále obsahují stabilizátor.

Netoxické emulze typu olej ve vodě obsahují s výhodou netoxický olej, například skvalan nebo skvalen, emulgátory, například Tween 80, ve vodném nosiči. Vodný nosič může být například fyziologický roztok s fosfátovým pufrem.

Zvláště účinná adjuvantní formulace obsahující QS21,3D-MPL a tokoferol v emulzi typu olej ve vodě se popisuje ve WO 95/17210.

Předkládaný popis také poskytuje polyvalentní vakcínu obsahující vakcinační formulaci podle popisu v kombinaci s jinými antigeny, zvláště antigeny použitelnými pro léčení rakoviny, zvláště kolorektální rakoviny, autoimunitních onemocnění a souvisejících stavů. Taková polyvalentní vakcína může obsahovat adjuvans indukující odpověď TH-1, jak byl popsáno výše.

Podle dalšího provedení popis je zde popisovaná imunogenní směs hostiteli dodáván prostřednictvím buněk předkládajících antigen (APC), jako jsou dendritické buňky, makrofágy, B-buňky, monocyty a jiné buňky, které mohou být získány metodami genetického inženýrství pro dosažení jejich účinnosti jako APC. Tyto buňky mohou nebo nemusí být geneticky modifikovány pro zvýšení kapacity pro předkládání antigenu, pro zvýšení aktivace a/nebo udržení T-buněčné odpovědi, pro dosažení antitumorových účinků jako takových, a/nebo pro dosažení imunologické kompatibility s příjemcem (například souhlasný haplotyp HLA). APC se mohou obecně izolovat z celé řady biologických kapalin a orgánů, včetně tumorových a peritumorových tkání, a může mít o autologní, alogenní, syngenní nebo xenogenní buňky.

Některá výhodná provedení podle předkládaného popisu používají jako buňky předkládající antigen dendritické buňky nebo jejich prekurzory. Dendritické buňky jsou vysoce účinné APC (Banchereau a Steinman, nátuře, 392: 245 až 251, 1998) a bylo ukázáno, že jsou účinné jako fyziologické adjuvans pro vyvolání preventivní nebo léčebné antitumorové imunity (víz Timmerman a Levý, Ann. Rev. Med. 50: 507 až 529, 1999). Dendritické buňky mohou být obecně izolovány na základě jejich typického tvaru (hvězdičkový tvar in šitu s vyznačenými cytoplasmatickými výběžky (dendrity) viditelnými in vitro), jejich schopnosti přijímat, zpracovávat a předkládat antigeny s vysokou účinností a jejich schopnosti aktivovat odpovědi naivních Tbuněk. Dendritické buňky mohou být samozřejmě genetickým inženýrstvím upraveny, které se

- 16CZ 303468 B6 normálně na dendritických buňkách in vivo nebo ex vivo nenacházejí, přičemž takové modifikované dendritícké buňky rovněž spadají do rámce předkládaného popisu. Jako alternativa k dendritickým buňkám mohou být v rámci vakcíny použity sekrenované váčky dendritických buněk obsahující antigen (nazývané exosomy) (vz Zitvogen a další, Nátuře Med. 4: 594 až 600,

1998).

Dendritícké buňky a jejich prekurzory mohou být získány z periferní krve, kostní dřeně, buněk infiltrují tumor, buněk infiltrujících tkáně v okolí tumorů, lymfatických uzlin, sleziny, kůže, krve nebo jakékoli jiné vhodné tkáně nebo kapaliny. Dendritícké buňky se mohou například diferenio covat ex vivo přidáním kombinace cytokinů jak je GM-CSF, IL-4, IL—13 a/nebo TNFa ke kulturám monocytů sklizených z periferní krve. Alternativně lze CD34-pozitivní buňky sklizené z periferní krve, pupeěníkové krve nebo kostní dřeni diferencovat na dendritícké buňky přidáním kombinací GM-CSF, IL-3, TNFa, ligandů, CD4Q, LPS, ligandů flt3 a/nebo jiných složek indukujících diferenciaci, zrání a proliferaci dendritických buněk, do média.

Dendritícké buňky se obvykle kategorizují jako nezralé a zralé buňky, což poskytuje jednoduchý způsob rozlišení mezi těmito dvěma dobře charakterizovanými fenotypy. Toto zařazení by však nemělo vylučovat všechny možné mezistupně diferenciace. Nezralé dendritícké buňky jsou charakterizovány jako A PC s vysokou schopností přijímat a zpracovat antigen, což koreluje s vysokou expresí receptorů Fcy a mannózového receptorů. Zralý fenotyp je typicky charakterizován nižší expresí těchto markérů, ale vysokou expresí molekul buněčného povrchu odpovědných za aktivaci T-buněk, jako jsou MHC třídy I a II, adhezní molekuly (např. CD54 a CD11) a kostimulační molekuly (napr. CD40, CD80, CD86 a 4-IBB).

APC mohou obecně transfekovány póly nukleotidem podle popisu (nebo jeho částí nebo jinou variantou), takže je kódovaný polypeptid nebo jeho imunogenní část exprimován na buněčném povrchu. Taková transfekce může probíhat ex vivo, a farmaceutická směs s obsahem takových transfekováných buněk může být potom použit k léčebným účelům, jak se popisuje v této přihlášce. Alternativně může být pacientovi podáno vehikulum dodávající gen, jehož cílem je den30 dritická nebo jiná buňka předkládající antigen, což vede ktransfekci probíhající in vivo. Transfekce může například dendritických buněk in vivo a ex vivo může být například prováděna použitím jakýchkoli v oboru známých metod, jako jsou metody popisované ve WO 97/24447, nebo způsob gene gun popisovaným v článku Mahvi a další. Immunology and cell Biology 75: 456 až 460, 1997. Vnášení antigenu do dendritických buněk se dá dosáhnout inkubací dendritic35 kých buněk nebo jejich prekurzorových buněk s tumorovým polypeptidem, DNA (samostatně nebo v rámci plasmidového vektoru) nebo RNA; nebo rekombinantní bakterií nebo virem exprimujícími antigen (například vektory na bázi vakcinie, drůbežích neštovic, adenoviru nebo lentiviru). Před vložením může být polypeptid kovalentně navázán na imunologického partnera poskytujícího pomoci T-buněk (například nosná molekula). Alternativně může být k dendritícké buňce pulsně přidán nekonjugovaný imunologický partner, odděleně nebo v přítomnosti polypeptidu.

Zatímco ve farmaceutických směsích podle popisu může být použit jakýkoliv vhodný nosič známý odborníkům v oboru, typ nosiče se bude typicky lišit v závislosti na způsobu podávání.

Směsi podle předkládaného popisu mohou být formulovány pro jakýkoli vhodný způsob podávání, včetně například místního, orálního, nazálního, slizničního, intravenózního, intrakraniálního, intraperitoneálního, subkutánního a intramuskulárního podání.

Nosiče pro použití s těmito farmaceutickými směsi jako biologicky kompatibilní a mohou být také biologicky degradovatelné. V některých provedeních poskytuje směs s výhodou relativně konstantní hladinu uvolňování účinné složky. V jiných provedeních však může být žádoucí vysoká rychlost uvolňování bezprostředně po podání. Formulace takových směsí spadá do znalosti odborníka v oboru při použití známých technologií. Ilustrativní nosiče použitelné v této souvislosti zahrnují mikročástice poly(aktid-ko-glykolid), polyakrylát, latex, škrob, celulóza, dextran apod. Mezi jiné ilustrativní nosiče se zpožděným uvolňováním patří supramolekulární biologické

- 17CZ 303468 B6 vektory, které obsahují jiné než kapalné hydrofilní jádro (například zesítěny polysacharid nebo oligosacharid) a popřípadě vnější vrstvu obsahující amfifilní sloučeninu jako je fosfolipid (viz např, patent US 5 151 254 a PCT přihlášky WO 94/20078, WO/94/23701 a WO 96/06638). Množství účinné sloučeniny obsažené v směsích s prodlouženým uvolňováním závisí na místě implantace, rychlosti a očekávaném trvání uvolňování a povaze stavu, který se léčí, nebo proti němuž se provádí prevence.

V dalším ilustrativním provedení se jako nosiče pro směsi podle popisu používají biologicky degradovatelné mikrokuličky (např. polylaktát polyglykolát). Vhodné biologicky degradovatelné mikrokuličky se popisují např, v patentech US 4 897 268; U 5 075 109; US 5 928 647; US 5 811 128; US 5 820 883; US 5 853 763; US 5 814 344, US 5 407 609 a US 5 942 252. V mnoha použitích budou také použitelné nosné systémy založené na modifikovaném jaderném proteinu hepatitidy B, jako se popisuje ve WO/99 40934 a tak uvedených odkazech. Další ilustrativní nosný/dodávací systém využívá nosič obsahující proteinové komplexy ve formě částic, které se například popisují v patentu US 5 928 647, kteréjsou schopné indukovat odpovědi cytotoxických T-Iymfocytů omezené na třídu I u hostitele.

Farmaceutické směsi podle popisu budou často dále obsahovat jeden nebo více pufrů (například neutrální pufrovaný fyziologický roztok nebo fyziologický roztok s fosfátovým pufrem), sacharidy (např. glukóza, mannóza, sacharóza nebo dextrany), mannitol, proteiny, polypeptidy nebo aminokyseliny jako je glycin, antioxidanty, bakteriostatické látky, chelatační látky jako je EDTA nebo glutathion, adjuvans (např. hydroxid hlinitý), rozpuštěné látky pro dosažení isotonicity směsi, jeho hypotonicity nebo slabé hypertonicity vzhledem ke krvi příjemce, suspendující látky, zahušťovadla a/nebo ochranné látky. Směsi podle předkládaného popisu mohou být alternativně formulovány jako lyofilizát.

Popisované farmaceutické směsi mohou být ve formě jednotkové dávky nebo zásobníků pro více dávek, jako jsou uzavřené ampule nebo lahvičky. Tyto zásobníky jsou typicky uzavřeny tak, aby byla uchována stability a stabilita směsi až do použití. Obecně mohou být formulace uchovávány ve formě suspenzí, roztoků nebo emulzí v olejových nebo vodných vehikulech. Farmaceutická směs může být alternativně uchováván v lyofilizovaném stavu vyžadujícím pouze přidání sterilního kapalného nosiče bezprostředně před použitím.

Vytváření vhodných dávkovačích a léčebných režimů pro použití konkrétních popisovaných směsí včetně například orálního, parenterálního, intravenózního, intranazálního a intramuskulárního podávání, je dobře známé v oboru, přičemž některé z těchto forem budou pro ilustraci stručně diskutovány dále.

V některých aplikacích mohou být farmaceutické směsi popisované v tomto popisu podávány živočichovi orálně. Tyto směsi mohou být proto formulovány s inertním ředivem nebo s asimilovatelným jedlým nosičem, nebo mohou být uzavřeny v tvrdých nebo měkkých želatinových kapslích, nebo mohou být lisovány do tablet, nebo mohou být přidávány přímo do potravy nebo diety.

Účinné sloučeniny mohou být přidány k pomocným látkám a použity ve formě tablet pro polykání, bukálních tablet, pastilek, kapslí, elixírů, suspenzí, sirupů, oplatek apod. (viz např. Mathiowitz a další, Nátuře 1997, 27. března; 386 (6623); 410 až 4; Hwang a další, Crit. Rev. Ther. Drug Carrier Syst. 1998; 15 (3): 243 až 84; patent US 5 641 515; patent US 5 580579 a patent US 5 792 451). Tablety, pastilky, pilulky, kapsle apod. mohou také obsahovat kteroukoli z řady dalších složek, například pojivo jako je tragakantová guma, akácie, kukuřičný škrob nebo želatina; pomocné látky jako je fosforečnan vápenatý; rozvolňovadlo jako je kukuřičný škrob, bramborový škrob, kyselina alginová apod.; kluznou látku jako je stearan horečnatý; a sladidlo jako je sacharóza, laktóza nebo sacharin, nebo ochucovací směs jako je máta, libavka nebo třešňová příchuť. Jestliže je dávkovou jednotkou kapsle, může obsahovat navíc k materiálům výše uvedeného typu kapalný nosič. Různé další materiály mohu být přítomny jako povlaky nebo pro jinou modifikaci

- 18CZ 303468 B6 fyzikální formy dávkové jednotky. Například tablety, pilulky nebo kapsle mohou být potaženy šelakem, cukrem, nebo oběma. Kterýkoli materiál použitý při přípravě jakékoli jednotkové dávkové formy by měl být samozřejmě farmaceuticky čistý a v použitých množstvích v podstatě netoxický, Účinné sloučeniny mohou být navíc přidány do směsi s prodlouženým uvolňováním.

Tyto formulace budou typicky obsahovat alespoň přibližně 0,1 % účinné sloučeniny nebo více, i když procento účinné látky nebo látek se může samozřejmě měnit a může být mezi přibližně 1 nebo 2 % a přibližně 60 nebo 70 % nebo více, vztaženo na hmotnost nebo objem celkové směsi. Množství účinné složky nebo účinných složek v každém terapeuticky použitelné směsi se může io přirozeně připravit tak, aby jakákoli daná jednotková dávka sloučeniny poskytla vhodné dávkování. Odborník v oboru přípravy takových směsí bude brát v úvahu faktory jako je rozpustnost, biologická dostupnost, biologický poločas, způsob podávání, skladovatelnost, stejně jako další farmakologické předpoklady.

Pro orální podávání mohou být směsi podle předkládaného popisu alternativně přítomny spolu s jedním nebo více pomocnými látkami ve formě ústní vody, směsi na čištění zubů, bukální tablety, ústního spreje nebo sublingvální směsi podávané ústy. Účinná složka může být alternativně přidána do ústního roztoku jako je roztok obsahující boritan sodný, glycerol a hydrogenuhliěitan draselný, nebo dispergována ve směsi na čištění zubů, nebo přidána v terapeuticky účin20 ném množství do směsi, která může obsahovat vodu, pojivá, abraziva, příchuti, směsi udržující pěnivost a vlhkost. Směsi mohou být alternativně ve formě tablety nebo roztoku, které mohou být vloženy pod jazyk nebo jinak rozpuštěny v ústech.

Za některých okolností bude žádoucí dodávat zde popisované farmaceutické směsi parenterálně, intravenózně, intramuskulámě nebo i intraperitoneálně. Tyto přístupy jsou odborníkům v oboru dobře známy, a některé z nich se dále popisují například v patentu US 5 543 158; patentech US 5 641 515 patentu US 5 399 363. V některých provedeních mohou být účinné sloučeniny ve formě volné báze nebo farmakologicky přijatelných solí připraveny ve vodném roztoku vhodně smíšeném s povrchově aktivní látkou, jako je hydroxypropylcelulóza. Mohou být také připraveny ao disperze v glycerolu, kapalných polyethylenglykolech ajejich směsích a v olejích. Za obvyklých podmínek skladování a použiti budou tyto směsi obecně obsahovat ochrannou látku, aby se zabránilo růstu mikroorganismů.

Mezi ilustrativní farmaceutické formy vhodné pro injekce patří sterilní vodné roztoky nebo dis35 perze a sterilní prášky pro přípravu sterilních injekčních roztoků nebo disperzí před použitím (např. viz patent US 5 466 468). Ve všech případech musí být forma sterilní a musí být do té míry kapalná, aby ji bylo možno snadno podávat stříkačkou. Musí být stabilní za podmínek výroby a skladování a musí být chráněna proti kontaminujícímu působení mikroorganismů, jako jsou bakterie a houby. Nosičem může být rozpouštědlo nebo disperzní médium obsahující např. vodu, ethanol, polyol (např. glycerol, propylenglykol a kapalný polyethylenglykol apod.). vhodné směsi těchto látek a/nebo rostlinné oleje. Vhodná tekutost může být udržena například použitím povlaku jako je lecitin, dodržením požadované velikosti částic v případě disperze a/nebo použitím povrchově aktivních látek.Působení mikroorganismů je možno zabránit různými antibakteriálními a antifungálními směsmi, jako jsou např. parabeny, chlorbutanol, fenol, kyselina sorbová, thimerosal apod. V mnoha případech bude výhodné přidat isotonické směsi, např. cukry nebo chlorid sodný. Prodloužená absorpce injekčních směsí může být získána použitím směsí nebo činidel zpožďujících absorpci, jako je například monostearan hlinitý a želatina.

V jednom provedení pro parenterální ve formě vodného roztoku by měl být roztok v případě potřeby vhodně pufrován a kapalné ředivo by mělo být nejprve přivedeno do isotonického stavu přidáním dostatečného množství fyziologického roztoku nebo glukózy. Tyto vodné roztoky jsou zvláště vhodné pro intravenózní, intramuskulami, subkutánní a intraperitoneální podávání. V této souvislosti bude odborníkovi v oboru na základě předkládaného popis zřejmé, jaké sterilní vodné rozpouštědlo má být použito. Například jedna dávka může být rozpuštěna v 1 ml isotonického roztoku NaCl a buď přidána k 1000 ml kapaliny pro podkožní infuze, nebo vstříknuta na navrže- 19CZ 303468 B6 ném místě ínfuze (viz např. Remingtonů Pharmaceuticals Sciences,, 15. vyd., str, 1035 až 1038 a 1570 až 1580). Některé variace v dávkování budou nezbytné na základě stavu léčeného pacienta. Pro podávání člověku budou směsi samozřejmě splňovat standardy na sterilitu, pyrogenicitu, obecnou bezpečnost a čistotu, jak je například požadováno organizací FDA Office of Biologics standards.

V dalším provedení popisu mohou být popisované směsi formulovány v neutrální formě nebo ve formě soli. Jako příklady farmaceuticky přijatelných solí je možno uvést například adiční soli s kyselinami (vytvořené s volnými aminovými skupinami proteinu), které jsou vytvořeny s anorio ganickými kyselinami jako je například kyselina chlorovodíková nebo fosforečná, nebo organickými kyselinami jak oje kyselina octová, šťavelová, vinná, mandlová apod. Soli vytvořené s volnými karboxylovými skupinami mohou být odvozeny od anorganických bází, jako jsou například hydroxidy sodný, draselný, amonný, vápenatý nebo železitý, a organických bází jako ísopropylamin, trimethylamin, histidin, prokain apod. Po přípravě budou roztoky podávány způsobem kompatibilním s druhy, dávkové formy a v množství, které je terapeuticky účinné.

Nosiče mohou dále zahrnovat kterákoli rozpouštědla, disperzní média, vehikula, povlaky, řediva, an ti bakteriální a antifungální směsi, látky upravující isotonický stav a látky zpožďující absorpci, pufry, nosné roztoky, suspenze, koloidy apod. Použití těchto médií a směsí pro farmaceuticky účinné látky je v oboru dobře známé. V léčebných směsích může být použito jakékoli běžné médium nebo směs, pokud není nekompatibilní s účinnou složkou, Do směsí mohou být také přidány další účinné látky. Výraz farmaceuticky přijatelný se týká molekul a směsí, které nevytvářejí alergickou nebo podobnou nežádoucí reakci při podání člověku.

V někteiých provedeních mohou být farmaceutické směsi dodány ve formě intranazálních sprejů, inhalací a/nebo jiných vehikul pro aerosolové podávání. Způsoby dování genů, nukleových kyselin a peptidových směsí přímo do plic pomocí nosních aerosolových sprejů byly popsány například v patentu US 5 756 353 a patentu US 5 804 212. Podobně podávání léčiv s použitím intranazálních pryskyřičných mikročástic (Takenaga a další, J. Controlled Release 1998, 2. března; 52 (1 až 2): 81 až 7) a lysofosfatidyl-glycerolových směsí (patent US 5 725 871) jsou rovněž dobře známé v oboru farmacie. Podobně dodávání léčiv přes sliznice ve formě matrice na polytetrafluroetheylenovém nosiči se popisuje v patentu US 5 780 045.

V některých provedeních se pro zavádění směsí podle předkládaného popisu do vhodných hosti35 telských buněk/organismů používá liposomy, nanokapsle, mikročástice, lipidové částice, měchýrky apod. Směsi podle předkládaného popisu mohou být formulovány zvláště pro dodávání buď zapouzdřené v lipidické částici, liposomu, měchýřku, nanosféře nebo nanočástici, nebo vjiné formě. Alternativně mohou být směsi podle předkládaného popisu navázány kovalentně nebo nekovalentně na povrch těchto nosných vehikul.

Tvorba a použití liposomových a liposomům podobných preparátů jako možných nosičů léčiv je odborníkům v oboru obecně známá (viz např. lacis, Trends Biotechnol, 1998 červenec; 16(7): 307 až 21; Takakura, Nippon Rinsho 1998 březen; 56 (3): 691 až 5; Chadran a další, Indián J. Exp. Biol. 1997 srpen; 35 (8): 801 až 9; Margalit, Crit. Rev. Ther. Drug Carrier Syst. 1995; 12 (2 až 3): 233 až 61; patent US 5 567 434; patent US 5 552 157; patent US 5 565 213; patent US 5 738 868 a patent US 5 795 587, kde každý z těchto dokumentů se zařazuje ve svém celku odkazem.

Liposomy se úspěšně používaly s řadou typů buněk, které jsou obtížně transfektovatelné jinými postupy, včetně suspenzí T-buněk, primárních hepatocytových kultur a buněk PC 12 (Renneisen a další, J. Biol. Chem. 1990 září 25; 265 (27): 16337 až 42; Muller a další, DNA Cell Biol. 1990 duben; 9 (3): 221 až 9). Navíc se v případě liposomů nevyskytují omezení v souvislosti s délkou DNA, která jsou typická pro dodávací systémy založené na virech. Liposomy se úspěšné používaly pro zavádění genů, různých léčiv, radioterapeutických směsí, enzymů, virů, transkřípěních faktorů, alosterických efektorů apod,, do řady kultivovaných buněčných linií a živočichů. Navíc

-20CZ 303468 B6 se zdá, že použití liposomů není spojeno s autoimunitními reakcemi nebo nepřijatelnou toxicitou po systémovém podání. V některých provedeních jsou liposomy vytvořeny z fosfolipidů, které jsou dispergovány ve vodném médiu a spontánně tvoří mu 1ti lamě lamí soustředné dvoj vrstev né váčky (nazývané také multilamelární váčky nebo vezikula, MLV).

V dalších provedeních poskytuje popis alternativně farmaceuticky přijatelné formulace směsí podle předkládaného popisu ve formě nanokapslí. Nanokapsle mohou obecně stabilním a reprodukovatelným způsobem zachytit sloučeniny (viz např. Quintanar-Guerrero a další, Grun, Dev. Ind. Pharm. 1998, prosinec; 24(12): 1113 až 28). Aby bylo zabráněno nežádoucím účinkům intracelulámího přesycení polymerem, mohou být tyto ultrajemné částice (o velikosti okolo 0,1 pm) navrženy s použitím polymerů schopných degradace in vivo. Tyto částice mohou být vyráběny například jak se popisuje v Couvreur a další, Crit. Rev. Ther, Drug Carrier Syst. 1988; 5 (1): 1 až 20; Muhlen a další, Eur. J. Pharm. Biopharm. 1998, březen; 45 (2): 149 až 55; Zambaux a další, J. Controller Release, 1998, 2. ledna; 50 (1 až 3): 31 a 40; a patent US 5 145 684.

Popis se také týká použití polynukleotidu ve formě primerů odvozených od póly nukleotidů podle předkládaného popisu a polypeptid ve formě protilátek nebo činidel specifických pro polypeptid podle předkládaného popisu, jak diagnostických činidel.

Identifikace genetických nebo biochemických markérů v krvi nebo tkáních, která umožní detekci velmi časných změn v biochemických reakcích spojených s karcinogenezí, bude pomáhat při zjištění nej lepších způsobů léčení pacienta. Pro diagnózu různých forem a stavů rakoviny mohou být použity náhražkové tumorové markéry, jako je exprese polynukleotidů. Identifikace míry exprese polynukleotidů podle popisu bude použitelná jak při určení stadia rakovinného onemocnění (staging), tak i pro určení povahy rakovinné tkáně z hlediska zhoubnosti (gráding). Určení stadia onemocnění monitoruje vývoj onemocnění a určuje přítomnost nebo nepřítomnost maligní tkáně v oblastech vyšetřovaných biopsií. Polynukleotidy podle popisu mohou pomáhat přesnému určení stadia identifikací markérů pro agresivitu rakoviny, například přítomnost v různých částech těla. Zjištění povahy rakoviny z hlediska zhoubnosti popisuje, jak blíže napodobuje tumor normální tkáň stejného typu, a zjišťuje se na základě morfologie buněk a jiných markérů diferenciace. Polynukleotidy podle popisu mohou být použitelné při zjišťování povahy tumoru z hlediska zhoubnosti, protože mohou napomáhat při zjišťování diferenciace buněk tumoru.

Snížená nebo zvýšená exprese může být měřena jako hladina RNA. Ze dvou tkání se nejprve izoluje polyA RNA a detekce mRNA kódované genem odpovídajícím odlišné exprimovanému polynukleotidu podle popisu může být provedena například hybrid i žací tkáňových řezů in sítu, PCR s reverzní transkriptázou, Northemovým přenosem s použitím póly A + mRNA nebo jakýmkoli jiným přímým nebo nepřímým způsobem detekce RNA. Zvýšená nebo snížená exprese určité RNA v postižené tkáni ve srovnání s normální tkání ukazuje, že transkript a/nebo exprimovaný protein hraje při onemocnění nějakou úlohu. Detekce vyšší nebi nižší hladiny mRNA odpovídající SEQ ID No: 1 proti normální hladině ukazuje na přítomnost rakoviny u pacienta.

Míra exprese mRNA ve vzorku může být zjištěna vytvořením knihovny sekvencí s expresní adresou (EST) ve vzorku. Relativní zastoupení EST v knihovně je možno použít pro zjištění relativního zastoupení genového transkriptu ve výchozím vzorku. Analýza EST může být potom narovnána s analýzou EST referenčního vzorku, aby bylo možno zjistit relativní míry exprese sledovaného polynukleotidu.

Jiné analýzy mRNA mohou být prováděny použitím metody sériové analýzy genové exprese (SAGE) (Velculescu a další, Science (1995) 270: 484), metodou differential display (např. US 5 776 683) nebo hybridizační analýzou založenou na specificitě nukleotidových interakcí.

Porovnávání může být alternativně prováděno na úrovni proteinů. Velikosti proteinů ve dvou tkáních mohou být porovnávány použitím protilátek pro detekci polypeptidů ve westernových

-21 CZ 303468 B6 přenosech proteinových extraktů z těchto dvou tkání. Hladiny exprese a subcelulární lokalizace mohou být také detekovány imunologicky s použitím protilátek proti odpovídajícímu proteinu. Další testovací techniky, které mohou být použity pro určení hladin proteinu jako je například polypeptid podle předkládaného popisu ve vzorku odvozeném od hostitele, jsou odborníkům v oboru dobře známé. Zvýšená nebo snížená hladina exprese peptidu v nemocné tkáni ve srovnání s hladinou exprese stejného proteinu v normální tkání ukazuje, že exprimovaný protein se může účastnit průběhu onemocnění.

Diagnóza, jak se zde používá, zahrnuje zjištění vnímavosti pacienta na onemocnění, zjištění, zda pacient v současnosti trpí onemocněním a také prognózy pacienta postiženého onemocněním.

Poíypeptidy podle popisu nebo jejich fragmenty nebo analogy, nebo buňky, kteréje exprimuji, mohou být také použity jako imunogeny pro produkci protilátek imunospecifických pro polypeptidy podle předkládaného popisu. Termín imunospecifický znamená, že protilátky mají podstatně vyšší afinitu k polypeptidem podle popisu, než k jiným příbuzným polypeptidům podle stavu techniky.

V dalším provedení poskytuje popis protilátku imunologicky specifickou pro polypeptid podle popisu, nebo její imunologický fragment, jak bylo definováno výše. Protilátkou je s výhodou monoklonální protilátka.

Protilátky vytvořené proti polypeptidům podle předkládaného popisu mohou být získány podáváním polypeptidů nebo fragmentů nesoucích epitopy, analogů nebo buněk živočichovi, s výhodou živočichovi odlišnému od člověka, s použitím rutinních protokolů. Pro přípravu monoklonálních protilátek může být použita jakákoli technologie, která poskytne protilátky vytvořené kontinuálními kulturami buněčných linií. Mezi příklady patří hybridomové technologie (Kohler, G. a Milstein, C., Nátuře (1975) 256: 495 až 497), triomová technologie, technologie hybridomů lidských B-buněk (Kozbor a další, Immunology Today (1983) 4: 72) a technologie EBV-hybridomů (Cole a další, Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, 77 až 96, Alan R., Liss, Inc., 1985).

Způsoby produkce jednořetězcových protilátek, jako jsou postupy popisované v patentu US 4 946 778, mohou být také upraveny pro poskytnutí jednořetězcových protilátek proti polypeptidům podle předkládaného popisu. Pro expresi humanizovaných protilátek mohou být také použity transgenní myši nebo jiné organismy, včetně jiných savců.

Výše popisované protilátky mohou být použity pro izolaci nebo identifikaci klonů exprimujících polypeptid nebo pro čištění polypeptidů afinitní chromatografií. Protilátka podle popisu může být také použita pro prevenci nebo léčení rakoviny, zvláště kolorektální rakoviny, autoimunitních onemocnění a souvisejících stavů.

Další provedení popisu se týká způsobu indukce nebo modulace imunologické odpovědi u savce, který zahrnuje zaočkování savce polypeptidem podle předkládaného popisu, vhodným pro produkci protilátky, a/nebo vyvolání T-buněčné odpovědi, pro ochranu nebo pro zmírnění příznaků nebo zastavení postupu onemocnění. Ještě další provedení popisu se týká způsobu indukce nebo modulace imunologické odpovědi u savce, který zahrnuje dodání polypeptidů podle předkládaného popisu pomocí exprese polynukleotidu kódujícího polypeptid prostřednictvím vektoru in vivo s cílem indukovat takovou imunologickou odpověď, která poskytne protilátku pro ochranu uvedeného živočicha před onemocněním.

Bude zřejmé, že předkládaný popis poskytuje způsob léčení abnormálních stavů, jako je například rakovina a autoimunitní onemocnění, zvláště kolorektální rakovina, souvisejících buď s přítomností, nebo nadměrným množstvím nebo nesprávnou expresí polypeptidů CASB7439 nebojeho aktivity. Další abnormální stavy týkající se exprese CASB7439, jejichž léčba je cílem popisu, se týkají chronické lymfocytické leukemie a tumorů zárodečných buněk.

_ 99 _

Genová terapie může být také použita pro uskutečnění endogenní produkce polypeptidu CASB7439 v příslušných buňkách jedince. Přehled týkající se genové terapie lze nalézt v kapitole 20, Gene Therapy and other Molecular Genetic-base Therapeutic Approaches (a tam uvedených odkazech), v publikaci Human Molecular Genetics, T. Strachan a A. P. Read, BIOS Scienti5 ficPublishers Ltd. (1996).

Příprava vakcín se obecně popisuje v publikaci Pharmaceutical Biotechnology, díl 61 Vaccine Design - the subunit and adjuvant aproach, editech by Powell a Newman, Plenům Press, 1995. New Trends and Developments In Vaccines, edited by Voliér a další, University Park press, Balio timore, Maryland, USA, 1978. Zapouzdření do liposomů se popisuje např. v patentu Fullerton, patent US 4 235 877. Konjugace proteinů k makromolekulám se popisuje např. v Likhite, patent

US 4 372 945 a Armor a další, patent US 4 474 757.

Množství proteinu v každé dávce vakcíny se volí jako množství, které indukuje imunoprotektivní odpověď v typických vakcínách bez významných nepříznivých vedlejších účinků. Toto množství se bude lišit v závislosti na konkrétním použitém imunogenu. Obecně se očekává, že každá dávka bude obsahovat 1 až 1000 pg proteinu, s výhodou 2 až 100 pg, nejvýhodněji 4 až 40 pg. Optimální množství pro určitou vakcínu je možno zjistit na základě standardních studií zahrnujících sledování titrů protilátek a jiných reakcí pacienta. Po počáteční vakcinaci mohou pacienti dostat zesilovací dívku po přibližně čtyřech týdnech.

Termín izolovaný” znamená změněný zásahem člověka ve srovnání s přírodním stavem. Jestliže se izolovaná směs nebo látka vyskytuje v přírodě, musí být změněna a/nebo vyjmuta z původního prostředí. Například polynukleotid nebo polypeptid přirozeně přítomný v živém zví25 řeti není izolovaný, ale stejný polynukleotid nebo polypeptid oddělený od okolních materiálů přítomných v místě jeho přirozeného výskytu je izolovaný v používaném smyslu tohoto termínu.

Termín polynukleotid obecně označuje jakýkoli polyribonukleotid nebo polydeoxyribonukleo30 tid, který může být nemodifikovaná RNA nebo DNA nebo modifikovaná RAN nebo DNA, včetně jednořetězcových a dvouřetězcových oblastí.

Termín varianta se týká polynukleotidu nebo polypeptidu, který se liší od referenčního polynukleotidu nebo polypeptidu, ale zachovává si podstatné vlastnosti. Typická varianta polynukleo35 tidu se od jiného, referenčního polynukleotidu liší nukleotidovou sekvencí. Změny nukleotidové sekvence varianty mohou nebo nemusí změnit aminokyselinovou sekvenci polypeptidu kódovaného referenčním polynukleotidem. Změny nukleotidů mohou vést k substitucím, adicím a delecím aminokyselin a zkrácením a fúzím v polypeptidu kódovaném referenční sekvencí, jak bude diskutováno dále. Typická varianta polypeptidu se odlišuje od jiného, referenčního polypeptidu aminokyselinovou sekvencí. Obecně jsou rozdíly limitované, takže sekvence referenčního polypeptidu a varianty jsou celkově blízce příbuzné, a v mnoha oblastech identické. Varianta a referenční polypeptid se mohou lišit v aminokyselinové sekvenci o jednu nebo více substitucí, adicí a delecí v jakékoli kombinaci. Substituované nebo vložené aminokyselinové zbytky mohou nebo nemusí být zbytky kódované genetickým kódem. Varianta polynukleotidu nebo polypeptid se může vyskytovat v přírodě, jak například alelická varianta, nebo se v přírodě vyskytovat nemusí. Varianty polynukleotidu a polypeptidu, které se v přírodě nevyskytují, se mohou připravit technikami mutageneze nebo přímé syntézy.

Identita ve smyslu známém v oboru je vztah mezi dvěma nebo více polypeptidovými sekven50 cemí nebo dvěma nebo více polynukleotidovými sekvencemi zjištěný porovnáním sekvencí. Termín identita také v oboru znamená stupeň příbuznosti sekvence mezi polypeptidovými nebo polynukleotidovými sekvencemi, zjištěný porovnáním řetězců těchto sekvencí. Identita a podobnost může být snadno vypočítána známými způsoby, včetně bez omezení způsobů popisovaných v Computational Molecular Biology, Lesk, A. M„ ed., Oxford University Press, New

York, 1988; Biocomputing: Informatics and genome Projects, Smith, D.W., ed., Academie Press,

-23CZ 303468 B6

New York, 1993; Computer Analysis of Sequence Data, Část 1, Griffin, A. M. a Griffin, H. G., ed., Humana Press, New Jersey, 1994; Sequence Analysis in Molecular Biology, von Heinje, G., Academie Press, 1987; a Sequence Analysis Primer, Gribskov, M. a Devereux, J., ed., M. Stockton press, New York, 1991; a Carillo, H., a Lipman, D., S1AM J. Applied Math., 48: 1073 (1988). Výhodné způsoby pro zjištění identity jsou navrženy tak, aby poskytly nejvyšší souhlas mezi testovanými sekvencemi. Způsoby zjištění identity a podobnosti jsou stanoveny ve veřejně dostupných počítačových programech. Výhodné počítačové metody pro zjištění identity a podobnosti mezi dvěma sekvencemi zahrnují bez omezení programový balík GCG (Devereux, J., a další, Nucleic Acids Research 12(1): 387 (1984)), BLATP, BLASTN, a FASTA (Atschul, S.F. a io další J. Molec. Biol. 215: 403 až 410 (1990). Program BLAST X je veřejně dostupný v organizaci CNBI a u jiných zdrojů (BLAST Manual, Altschul, S., a další NCBI NLM N1H Bethesda, MC 20894; Altschul, S., a další, J. Mol. Biol. 215: 403 až 410 (1990). Pro zjištění identity může být také použit známý Smith-Waterman algoritmus.

Výhodný použitý algoritmus je FASTA. Výhodné parametry pro porovnání polypeptidové nebo polynukleotidové sekvence s použitím tohoto algoritmu jsou následující:

Trestné body za mezeru (Gap Penalty): 12

Trestné body za prodloužení mezery (Gap Extension Penalty): 4 Velikost slova: 2, max 6

Výhodné parametry pro porovnání polypeptidové sekvence s jinými metodami jsou následující:

1) Algoritmus: Needleman a Wunsch, J. Mol. Biol. 48: 443 až 453 (1970)

Srovnávací matrice: BLOSSUM 62 podle Hentikoff a Hentikoff, Proč. Nati. Acad. Sci. USA, 89:

10915 až 10919(1992)

Trestné body za mezeru (Gap Penalty): 12 Trestné body za délku mezery (Gap Length Penalty):

Program je dostupný jako program „gap“ u firmy Genetics Computer Group, Madison WI. Uve30 děné parametry jsou nastavené jako výchozí pro porovnávání polypeptidů (také bez trestných bodů za koncové mezery).

Výhodné parametry pro porovnání polynukleotidové sekvence jsou následující:

1) Algoritmus: Needleman a Wunsch, J. Mol. Biol. 48: 443 až 453 (1970)

Srovnávací matrice: souhlas = +10, nesouhlas = 0 Trestné body za mezeru (Gap Penalty): 50 Trestné body za délku mezery (Gap Length Penalty): 3

Program je dostupný jako program „gap“ u firmy Genetics Computer Group, Madison WI. Uve40 děné parametry jsou nastavené jako výchozí pro porovnávání polynukleotidů.

Uvedená polynukleotidová sekvence může být například identická s referenční sekvencí SEQ ID No: 1, tj. 100% identická, nebo může obsahovat při porovnání s referenční sekvencí až do určitého celočíselného počtu nukleotidových změn, přičemž tyto změny jsou zvoleny ze skupiny ales45 poň jedné delece, substituce, včetně tranzice a transverze, nebo inzerce nukleotidů, a kde uvedené změny se mohou vyskytovat v 5' nebo 3' koncových polohách referenční nukleotidové sekvence nebo v kterémkoli místě mezi těmito koncovými polohami, rozprostřeny buď individuálně mezi nukleotidy v referenční sekvenci, nebo v jedné nebo více souvislých skupinách v rámci referenční sekvence. Počet nukleotidových změn je určen vynásobením celkového počtu nukleotidů v SEQ ID No: 1 celým číslem definujícím procento identity vyděleným 100 a odečtením výsledku od uvedeného celkového počtu nukleotidů v SEQ ID No: 1, neboli:

-24CZ 303468 B6 n_n < X_n - (Xn · y), kde n_n je počet nukleotidových změn, x_n je celkový počet nukleotidů v SEQ ID No: 1, y je například 0,70 pro 70 %, 0,80 pro 80 %, 0,85 pro 85 %, 0,90 pro 90 %, 0,95 pro 95 %, atd., kdejaký5 kol i neceločíselný výsledek pro x_n a y je zaokrouhlen dolů na nejbližší celé číslo před jeho odečtením od x„. Změny polynukleotidové sekvence kódující polypeptid SEQ ID No: 2 mohou v této kódující sekvenci vytvořit mutace typu nonsense, missense nebo frameshift a tím změnit polypeptid kódovaný polynukleotidem po těchto změnách.

io Polypeptidová sekvence podle popisu může být podobně identická s referenční polypeptidovou sekvencí SEQ ID No: 2, tj. může být 100% identická, nebo může obsahovat až do určitého celočíselného počtu změn aminokyselin ve srovnání s referenční sekvencí, takže identita je nižší než 100 %. Uvedené změny jsou zvoleny ze skupin alespoň jedné delece, substituce, včetně konzervativní a nekonzervativní substituce, nebo inzerce aminokyselin, a kde uvedené změny se mohou vyskytovat v amino- nebo karboxy koncových polohách referenční polypeptidové sekvence nebo kdekoli mezi těmito koncovými polohami, rozptýlené bud’ jednotlivě mezi aminokyselinami v referenční sekvenci, nebo ve formě jedné nebo více souvislých skupin v rámci referenční sekvence. Uvedený počet aminokyselinových změn se určí vynásobením celkového počtu aminokyselin v SEQ ID No: 2 celým číslem definujícím procento identity vyděleným 100 a potom ode20 čtením výsledku od celkového počtu aminokyselin v SEQ ID No: 2, neboli:

n_a < x_a - (x_a · y), kde n_a je počet aminokyselinových změn, x_a je celkový počet aminokyselin v SEQ ID No: 2, y je například 0,70 pro 70 %, 0,80 pro 80 %, 0,85 pro 85 %, atd., a kde jakýkoli neceločíselný výsledek x_a a y je zaokrouhlen dolů na nejbližší celé číslo před jeho odečtením od x_a.

„Homolog“ je obecný termín, který se v oboru používá pro označení polynukleotidové nebo polypeptidové sekvence s vysokým stupněm sekvenční příbuznosti ke sledované sekvenci. Tato příbuznost může být kvantifikována stanovením stupně identity a/nebo podobnosti mezi porovnávanými sekvencemi, jak bylo popsáno výše. Do tohoto obecného termínu spadají termíny „ortholog“, což je polynukleotíd nebo polypeptid, který je funkčním ekvivalentem polynukleotidu nebo polypeptidu v jiném druhu, a „paralog“, což je funkčně podobná sekvence uvažovaná v rámci stejného druhu.

Přehled obrázků na výkresech

Obr. 1 ukazuje údaje z PCR v reálném čase s použitím sondy Taqman. Legenda je následující:

Ad_GI: nadledvina; Bl: měchýř; BOMa. kostní dřeň; Ce: čípek; Co: tlusté střevo; Fa_Tu: vejcovod; II: ileum; Sk: kůže; Li: játra; Lu: plíce; Ly_No: lymfatická uzlina; Oe: jícen; Pa_Thy: příštítná žláza; Pl: placenta; Pr: prostata; Re: rektum; Sk: kůže; Sk_Mu: kostní sval; Sm_ln: tenké střevo; Sp: slezina; Te: testis; Thy: štítná žláza; Tr: trachea.

Obr. 2 ukazuje expresi PCR v reálném čase použitím protokolu Sybr. Legenda je následující: Ad_Gl: nadledvina; Bl: měchýř; BO_Ma: kostní dřeň; Ce: čípek; Co: tlusté střevo; Fa_Tu: vejcovod; II: ileum; Sk: kůže; Li: játra; Lu: plíce; LyNo: lymfatická uzlina; Oe: jícen; Pa_Thy: příštítná žláza; Pl: placenta; Pr: prostata; Re: rektum; Sk: kůže; Sk_Mu: kostní sval; Sm_In: tenké střevo; Sp: slezina; Te: testis; Thy: štítná žláza; Tr: trachea; He: srdce.

Obr. 3 ukazuje SDS-PAGE buněčného extraktu z kmene exprimujícího CASB7439 s použitím barvení Coomassie blue. Dráha 1 ukazuje markéry molekulové hmotnosti, dráha 2 je buněčný extrakt indukovaný 5 h při 39 °C, dráha 3 ukazuje supematant extraktu indukovaných buněk, a dráha 4 ukazuje centrifugát extraktu indukovaných buněk.

-25 CZ 303468 B6

Obr. 4 ukazuje analýzu westernovým přenosem exprimovaného proteinu NS1-CASB7439. Na gel je nanesen buněčný extrakt z kmene exprimujícího CASB7439 aa vyvíjení se provádí monoklonální protilátkou proti NS1.

Obr. 5 ukazuje SDS-PAGE proteinu CASB7439 po vyčištění s použitím barvení Coomassie blue. Dráhy 1 a 5 jsou markéry molekulové hmotnosti; dráhy 2, 3, 4 obsahují 2 μΙ, 4 μΙ a 6 μΐ vyčištěného proteinu.

Obr. 6 ukazuje analýzu westernovým přenosem proteinu CASB7439 po vyčištění s vyvoláním monoklonální protilátkou proti polyhistidinu.

Příklady provedení vynálezu

Příklad I

Analýza RT-PCR v reálném čase

Analýza RT-PCR v reálném čase (U. Gibson, 1996, Genome Research: 6, 996) se používá pro porovnání množství transkriptů mRNA testovaného antigenu v odpovídajících tumorových a normálních tkáních tlustého střeva od většího počtu pacientů. Navíc je možno tímto způsobem vyhodnotit hladiny mRNA testovaného genu v souboru normálních tkání.

Celková RNA z normální tkáně a tumorové tkáně tlustého střeva se extrahuje z rychle zmrazených biopsií s použitím činidla TriPure (Boehringer). Celková RNA z normálních tkání může být získána od firmy InVitrogen nebo se extrahuje z rychle zmrazených biopsií použitím činidla TriPure. Poly-A+ mRNA se vyčistí z celkové RNA po štěpení DNAázou s použitím oligo-dT magnetických kuliček (Dynal). Kvantifikace mRNA se provede spektrofluorimetricky (VersaFluor, BioRad) s použitím barviva SybrlI (Molecular Probes). Primery pro amplifikaci PCR v reálném čase jsou navrhovány pomocí softwaru Perkin-Etmer Primer Express s použitím přednastavených podmínek pro podmínky amplifikace TaqMan.

Reakce v reálném čase se provádějí podle standardních protokolů PCR s použitím 2 ng čištěné mRNA pro každou reakci. Pro detekci v reálném čase se přidá barvivo SybrI (Molecular Probes) s konečným ředěním 1/75000. Amplifikace (40 cyklů) a detekce v reálném čase se provádí na systému Perkin-Elmer Biosystems PE7700 s obvyklým nastavením přístroje. Hodnoty Ct se vypočtou s použitím softwaru PE7700 Sequence Detector software. Pro každý vzorek pacienta se získá několik hodnot Ct: pro vzorek pacienta se získají hodnoty tumoru Ct(CtT) a odpovídající hodnoty normálního tlustého střeva Ct(CtN) pro sledovaný TAA, a pro skupinu vzorků normální tkáně se získá CtXY pro každou normální tkáň XY. Další hodnota Ct(CtA) se vypočte pro všechny vzorky také pro aktinový gen jako vnitřní standard. Alternativně je možno monitorovat amplifikaci PCR v reálném čase použitím sondy Taqman. Amplifikace (40 cyklů) se provádí na systému Perkin-Elmer Biosystems PE7700 s obvyklým nastavením přístroje. Hodnoty Ct se vypočtou s použitím softwaru PE770 Sequence Detector software. Z každé tkáně se získají hodnoty Ct pro cílovou mRNA (CtX) a pro aktinovou mRNA (CtA).

Protože účinnost amplifikace PCR za převládajících podmínek experimentu je blízká teoretické účinnosti amplifikace, 2^{tCtN/XY C,A)} je odhadem relativních hladin transkriptů TAA ve vzorku standardizovaných na hladinu aktinového transkriptů. Hodnota 1 tedy udává, že sledovaný antigen a aktin mají stejnou hladinu exprese.

Reakce PCR v reálném čase byly nejprve prováděny na tumoru tlustého střeva a odpovídajícím normálním tlustém střevu ze vzorků 12 pacientů získaných biopsií. Reakce byly potom prováděny na úplnějším souboru dat po celkem 18 pacientů (v tomto souboru jsou zahrnuta data prv-26CZ 303468 B6 nich 12 pacientů). V tomto souboru dat byla provedena duplikovaná stanovení pro 6 z těchto 18 pacientů. Bylo testováno šest dalších pacientů a výsledky byly přidány k původním osmnácti. Statistiky konečného souboru jsou ukázány v tabulce 3, a ilustrovány na obr. 1.

Stejným postupem byla také testována řada 48 vzorků normálních tkání reprezentujících 29 odlišných tkání (analyzované normální tkáně jsou uvedeny v tabulce 3). Hladiny transkriptů TAA jsou vypočteny postupem popsaným výše. Z tohoto souboru dat byl také vypočten podíl pacientů s nadměrnou expresí sledovaného antigenu stejně jako průměrná nadměrná exprese transkriptů ve srovnání s normálními tkáněmi. Výsledky jsou ilustrovány v obr. 1.

o

Tabulka 1

Výsledky testu exprese PCR v reálném čase pro CASB7439: soubor údajů pro 12 pacientů

% pacientů s vyšší hladinou mRNA v odpovídajícím tumoru tlustého střeva (pozitivní pacienti)	92 %
% pacientů s alespoň trojnásobné vyšší hladinou mRNA v odpovídajícím tumoru tlustého střeva	92 %
% pacientů s alespoň desetinásobně vyšší hladinou mRNA v odpovídajícím tumoru tlustého střeva	92 %
% pacientů s alespoň trojnásobně nižší hladinou mRNA v odpovídajícím tumoru tlustého střeva	8 %
průměrná hladina mRNA odpovídajícího normálního tlustého střeva (vztaženo na aktin)	0,0026
průměrná hladina mRNA odpovídajícího tumoru tlustého střeva	0,265
u pozitivních pacientů (vztaženo na aktin)
průměrný násobek nadměrné exprese mRNA	2028
medián násobku nadměrné exprese mRNA	115
průměrná hladina mRNA v normálních tkáních	0,0079
medián hladiny mRNA v normálních tkáních	0,0016
průměrná hladina mRNA v normálních tkáních	0,0064
medián hladiny mRNA v normálních tkáních	0,0017
% pacientů s hladinou mRNA vyšší než průměrná hladina v normálních tkáních	92 %
% pacientů s hladinou mRNA více než desetinásobné vyšší než průměrná hladina v normálních tkáních	75 %
normální tkáně s vyšší hladinou mRNA než je medián hladiny mRNA pro normální tkáně	žádné

-27CZ 303468 B6

Tabulka 2

Výsledky testu exprese PCR v reálném čase pro CASB7439: soubor údajů pro 18 pacientů

% pacientů s vyšší hladinou mRNA v odpovídajícím tumoru tlustého střeva (pozitivní pacienti)	89 %
% pacientů s alespoň trojnásobné vyšší hladinou mRNA v odpovídajícím tumoru tlustého střeva	89 %
% pacientů s alespoň desetinásobně vyšší hladinou mRNA v odpovídajícím tumoru tlustého střeva	78 %
% pacientů s alespoň trojnásobně nižší hladinou mRNA v odpovídajícím tumoru tlustého střeva	5 %
průměrná hladina mRNA odpovídajícího normálního tlustého střeva (vztaženo na aktin)	0,005
průměrná hladina mRNA odpovídajícího tumoru tlustého střeva u pozitivních pacientů (vztaženo na aktin)	0,152
průměrný násobek nadměrné exprese mRNA	1100
medián násobku nadměrné exprese mRNA	60
průměrná hladina mRNA v normálních tkáních	0,0065
medián hladiny mRNA v normálních tkáních	0,0015
průměrná hladina mRNA v normálních tkáních	0,005
medián hladiny mRNA v normálních tkáních	0,0015
% pacientů s hladinou mRNA vyšší než průměrná hladina v normálních tkáních	94 %
% pacientů s hladinou mRNA vice než desetinásobně vyšší než průměrná hladina v normálních tkáních	94 %
normální tkáně s vyšší hladinou mRNA než je medián hladiny mRNA pro normální tkáně	žádné

-28CZ 303468 B6

Tabulka 3

Výsledky testu exprese PCR v reálném čase pro CASB7439: soubor údajů pro 24 pacientů

% pacientů s hladinou transkriptu CASB7439 vyšší v tumorové tkáni tlustého střeva než sousední normální tkáni tlustého střeva (pozitivní pacienti)	92 %
% pozitivních pacientů s alespoň desetinásobné vyšší hladinou transkriptu CASB7439 v tumoru tlustého střeva než v okolní normální tkáni tlustého střeva	75 %
průměrný násobek nadměrné exprese transkriptu v tumorech pozitivních pacientů	1289
% pacientů s hladinou transkripce CASB7439 vyšší v tumorové tkání tlustého střeva než v průměrné normální tkáni	96 %
% pacientů s hladinou transkripce CASB7439 alespoň desetinásobně vyšší v tumorové tkáni tlustého střeva než v průměrné normální tkáni	62,5 %
normální tkáně, ve kterých je exprese transkriptu CASB7439 stejná jako hladina tumorového transkriptu v tumorech	žádné

Reakce PCR v reálném čase byty také prováděny použitím protokolu Taqman (jak je popsáno výše) na tumoru tlustého střeva a sousední normální tkáni tlustého střeva na bioptických vzorcích šesti pacientů. Pro každý vzorek byla provedena třikrát opakovaná měření a pro další výpočty byl ío použit jejich průměr. Výsledky jsou uvedeny v obr. 1. Navíc bylo stejným způsobem testováno také 36 vzorků normální tkáně reprezentujících 28 různých tkání (viz tabulka 5).

Výsledky jsou ukázány v obr. 2.

-29CZ 303468 B6

Tabulka 4

Výsledky exprese CASB7439 PCR v reálném čase s použitím sondy Taqman

Počet vzorků tumorů od různých pacientů	6
% pacientů s hladinou transkriptů CASB7439 vyšší v tumorové tkáni tlustého střeva než sousední normální tkáni tlustého střeva (pozitivní pacienti)	100 %
% pozitivních pacientů s alespoň desetinásobně vyšší hladinou transkriptů CASB7439 v tumoru tlustého střeva než v okolní normální tkáni tlustého střeva	83 %
průměrný násobek nadměrné exprese transkriptů v tumorech pozitivních pacientů	109
% pacientů s hladinou transkripce CASB7439 vyšší v tumorové tkáni tlustého střeva než v průměrné normální tkáni	100 %
% pacientů s hladinou transkripce CASB7439 alespoň desetinásobně vyšši v tumorové tkáni tlustého střeva než v průměrné normální tkáni	100 %
normální tkáně, ve kterých je exprese transkriptů CASB7439 stejná jako hladina tumorového transkriptů v tumorech	žádné

Tyto výsledky jasně ukazují, že transkript CASB7439 je nadměrně exprimován v kolorektálních tumorech ve srovnání se sousední normální tkání tlustého střeva a všemi výše uvedenými norio málními tkáněmi. U více než 90 % pacientů dochází k silně zvýšené expresi transkriptů

CASB7439 v tumoru v porovnání se sousední normální tkání tlustého střeva. Průměrný násobek zvýšení exprese transkriptů CASB7439 v kolorektálních tumorech ve srovnání s jinými normálními tkáněmi je alespoň 100. Navíc více než 90 % pacientů má zvýšenou expresi transkriptů CASB7439 v kolorektálních tumorech v porovnání s jinými normálními tkáněmi, přičemž u 60 % z nich je zvýšení exprese alespoň desetinásobné.

-30CZ 303468 B6

Tabulka 5

Seznam normálních tkání použitých pro analýzu exprese transkriptů CASB7439

Tkáň	Zkratka
Nadledvina	Ad_Gl
Aorta	Ao
Močový měchýř	51
Kostní dřeň	Bo_Ma
Mozek	Bra
čípek	Ce
Tlusté střevo	Co
Vejcovod	Fa_Tu
Srdce	He
Heum	II
Ledvina	Kj
Játra	Li
Plíce	Lu
Lymfatícká uzlina	Ly_No
Jícen	Oe
Pří Štítná žláza	Pa_Thy
Rektum	Re
Kůže	Sk
Kosterní sval	Sk_Mu
Tenké střevo	Smjn
Slezina	Sp
Žaludek	St
Štítná žláza	Thy
PrůduSnice	Tra
Vaječník	Ov
Placenta	Pl
Prostata	Pr
Varle	Te

Příklad 2

Testování souborů cDNA metodou diferenciálního screeningu

Identifikace genů asociovaných s tumory v knihovně cDNA se provádí metodou diferenciálního screeningu.

Ze 100 μί kultur pěstovaných přes noc se extrahuje celková bakteriální DNA. Bakterie se lyžují guanidiumisothiokyanátem a bakteriální DNA se čistí afinitní metodou s použitím magnetického skla (Boehrinerg). Plasmidové inzerty se izolují z bakteriální DNA amplifikační metodu Advantage PCR amplification (Clontech). Produkty PCR se natečkují na dvě nylonové membrány za vytvoření souborů cDNA s vysokou hustotou pomocí zařízení Btomek 96 HDRT tool (Beekmkan). Natečkovaná cDNA se ponechá kovalentně navázat na membránu působením UV záření. První membrána se hybridízuje se směsnou sondou cDNA připravenou z tumoru jediného pacienta. Druhá membrána se hybridízuje s ekvivalentním množstvím smíšené sondy cDNA připravené z normálního tlustého střeva stejného pacienta. Sonda cDNA se připraví amplifikaci PCR jak bylo popsáno výše a označí se pomocí systému AlkPhos Dírect System (Amersham). Podmínky hybridizace a střingentni promytí se provádí s použitím AlkPhos Direct kit. Hybridizovaná sonda se detekuje chemiluminiscencí. Intenzity hybridizace pro každý fragment cDNA na obou přenosech se měří filmovou senzitometrií nebo přímým měřením (BioRad Fluor-S Max). Poměr hybridizačních intenzit tumorové a normální tkáně (T/N) se vypočte pro každý gen pro zjištění stupně zvýšení exprese v tumoru. Sledují se geny, které mají podstatně zvýšenou expresi v tumorech tlustého střeva. Signifíkance je definována arbitrámě jako jedna standardní odchylka distribuce frekvence T/N, Experimenty metodou diferenciálního screeningu se opakují s použitím RNA z většího počtu pacientů (>18) pro odhadnutí četnosti tumorů se zvýšenou expresí v populaci pacientů. Soubory DNA se navíc hybridizují se smíšenými sondami cDNA z normálních tkání jiných než tlusté střevo (viz seznam výše) po určení hladiny exprese sledovaného genu v těchto tkáních.

Příklad 3

Mikrosoubory DNA

Mikrosoubory DNA (DNA micro-arrays, též mikročipy) se používají pro zjišťování profilů exprese mRNA ve velkých souborech genů ve velkém počtu vzorků. Tato informace se používá pro doplnění údajů získaných PCR v reálném čase a poskytuje nezávislé měřítko hladin genové exprese v tumorech a normálních tkáních.

Příklady běžných technologií pro produkci míkrosouborů DNA zahrnují 1) soubory Afíymetrix „OeneChip“, ve kterých se oligonukleotidy syntetizují na povrchu čipu chemickou syntézou na pevné fázi použitím fotolitografického procesu, 2) technologií tečkování DNA, při které se pomocí robotu ukládají malé objemy roztoku DNA a potom se imobilizují na povrchu pevné fáze (například skla). V obou případech se čipy hybridizují s cDNA nebo cRNA, které byly extrahovány z tkáně, o kterou jde (například normální tkáň, tumor atd.) a značeny radioaktivně nebo pomocí fluorescenční reportérové molekuly. Značený materiál se hybridízuje k Čipu a množství sondy navázané ke každé sekvenci na čipu se určí pomocí speciálního skeneru. Tento experiment může být konfigurován s jediným fluorescenčním reportérem (nebo radioaktivitou), nebo může být alternativně prováděn použitím dvou fluorescenčních reportérů. V tomto druhém případě se každý ze dvou vzorků značí jednou z reportérových molekul. Dva označené vzorky se potom kompetitivně hybridizují k sekvencím na čipu DNA. Pro každou sekvenci na čipu se stanoví poměr fluorescenčních signálů. Poměr se použije pro výpočet relativního množství transkriptu ve dvou vzorcích. Podrobné protokoly jsou dostupné z řady zdrojů včetně „DNA Microarrays: A practical approach. Schena M. Oxford University Press 1999“ a internetu (http://cmgm.stanford.-32CZ 303468 B6 edu/pbrown/protocols/i ndex.html), http://arrayit.com/DNA-Microarray-Protocols/) a specializovaných distributorů (např. Afymetrix).

Příklad 5

Analýzy northem-Southemovým přenosem

Omezená množství cDNA směsné tumorové tkáně a odpovídající normální tkáně tlustého střeva ío se amplifikují PCR Advantage (viz výše). Mediátorová RNA z většího počtu normálních tkání se rovněž amplifikuje použitím stejného postupu. Amplifikovaná cDNA (1 gg) se čistí elektroforézou na 1,2 % agarózovém gelu a převede se na nylonovou membránu. Tato membrána se hybridizuje (AlkPhos Direct System) se sondou připravenou použitím fragmentu testované TAA cDNA. Northem-Southemova analýza poskytne informace o velikosti transkriptu přítomnosti rozštěpených variant a zastoupení transkriptu v tumorové a normální tkáni.

Příklad 6

Analýza northemovým přenosem

Northemové přenosy se připravují podle standardních protokolů s použitím 1 gg póly A+ mRNA. Radioaktivní sondy se připravují s použitím systému Ready-to-Go (Pharmacia).

Příklad 7

Experimentální identifikace úplné sekvence cDNA

Byly zkonstruovány knihovny cDNA tumoru tlustého střeva použitím systému Lambda Zap II systém (Stratagene) z 5 gg polyA+ mRNA. Použije se protokolu doporučeného výrobcem s tím rozdílem, že při kroku reverzní transkripce se použije Superscriptll (Life Technologies). Zkonstruují se knihovny s primery oligo dT a náhodnými primery. Pro každý screening knihovny se vyseje přibližně 1,5 χ 10⁶ nezávislých fágů. Fágové plaky se převedou na nylonové filtry a hybri35 dizují se s použitím sondy cDNA označené systémem AlkPhos Direct. Pozitivní fágy se detekují chemiluminiscencí. Pozitivní fágy se vyříznou z agarové plotny, eluují se v 500 gl SM pufru a přiřazení se potvrdí PCR pro specifický gen. Eluované fágy se převedou do jednořetězcového bakteriofága M13 vyříznutím in vivo. Bakteriofág se potom převede do dvojřetězcové plasmidové DNA infekcí E. coli. Infikované bakterie se vysejí a provede se druhé kolo screeningu s použitím sondy cDNA. Plasmidová DNA se vyčistí z pozitivních bakteriálních klonů a provede se sekvence obou řetězců.

Jestliže se gen šupinou délkou nemůže získat přímo z knihovny cDNA, chybějící sekvence se izoluje použitím technologie RACE (Marathon Kit, ClonTech). Tento přístup se zakládá na reverzní transkripci mRNA do dvojřetězcové cDNA, navázáním linkerů na konce cDNA a amplifikací požadovaného konce cDNA s použitím primerů specifického pro gen a jednoho z linkerových oligonukleotidů. Produkty získané metodou Marathon PCR se klonují do plasmidu (pCRII-TOPO, InVitrogen) a sekvenují.

Použitím tohoto postupu byl získán polynukleotid SEQ ID No: 1.

Příklad 8

Profily EST

-33CZ 303468 B6

Komplementární přístup k charakterizaci experimentálního antigenu z hlediska exprese je použití databáze lidských sekvencí s expresní adresou „Expressed Sequence Tags“ (EST). EST jsou malé fragmenty cDNA připravené ze souboru mRNA extrahovaných z příslušné tkáně nebo buněčné linie. Tato databáze v současnosti poskytuje velké množství EST (10⁶) z několika set knihoven tkáňové cDNA, včetně tumorových tkání z různých typů a stavů onemocnění. Pomocí nástrojů pro zpracování informací (BLAST) se provádí srovnávací průzkum sekvence CASB7439 s cílem získat další pohled na expresi ve tkáních.

io Distribuce EST CASB7439

Přístupové číslo EST v GenBank	EST z knihovny tkáňové cDNA
C00634	Dospělý člověk (K.Okubo)
AA468668	NCI_CGAP_Co3
AA565752	NCLCGAP_Co11
AA565766	NCI_CGAP_Co11
AA565767	NCI CGAP_Co11
AI337239	NCI_CGAP_Co16
AI337448	NCI_CGAP_Co16
AI393930	NCI_CGAP_CLL1
AI473673	NCI_CGAP_Co14
AI632444	NCI_CGAP_GC6
AI861937	NCI_CGAP_Co16
AI825214	NCI_CGAP_GC6
AW080652 _	NCI_CGAP_Coí9
AW083899	NCI_CGAP_Co19
AW206058	NCI_CGAP_Sub3
AW237006	NCI_CGAP_GC6
AW364626	DT0036
AW449612	NCI_CGAP_Sub5

Tyto sekvence EST mají vynikající shou s CASB7439. Seznam obsahuje devět sekvencí EST ze čtyř knihoven odlišných tumorů tlustého střeva, jednu sekvenci EST z jedné knihovny normální tkáně tlustého střeva, tři sekvence EST z jedné knihovny tumoru zárodečných buněk, jednu sekvenci EST z jedné knihovny buněk s chronickou lymfocytámí leukémií, dvě sekvence EST ze dvou knihoven smíšených tumorů, dvě sekvence EST z knihoven neznámého typu. Tak je jasně ukázáno podle očekávání, že CASB7439 má v tumorových tkáních, zejména tkáních kolorektálních tumorů, zvýšenou expresi ve srovnání s normálními tkáněmi.

-34CZ 303468 B6

Příklad 9

9.1 Exprese a čištění antigenů specifických pro tumor

Exprese v mikrobiálních hostitelích nebo alternativně transkripce/translace in vitro se používají pro produkci antigenů podle vynálezu pro vakcinační účely a pro získání proteinových fragmentů nebo úplného proteinu pro rychlé čištění a vytváření protilátek nezbytných pro imunohistochemickou charakterizaci přirozeně exprimováného proteinu nebo pro sledování postupu čištění.

io Rekombinantní proteiny mohou být exprimovány ve dvou mikrobiálních hostitelích, E. coli a v kvasince ((jako je Saccharomyces cerevisiae nebo Pichia pastoris). To umožňuje volbu expresního systému, který má pro produkci příslušného antigenů nej lepší vlastnosti. Obecně bude rekombinantní antigen exprimován v E. coli a reagenční protein v kvasinkách.

Strategie exprese zahrnuje nejprve návrh primární struktury rekombinantního antigenů. Obecně se expresní fúzní partner (EFP) umístí na N-konec pro zvýšení hladin exprese, která by také mohla zahrnovat oblast využitelnou pro modulaci imunogenních vlastností antigenů, imunitního fúzního partnera (IFP), Navíc je na C-konci zahrnut afínitní fúzní partner (AFP) využitelný pro umožnění dalšího čištění.

Jak je uvedeno výše, je možno porovnávat několik konstruktů: pro rychlou expresi a čištění stejně jako pro tvorbu protilátek proti CASB7439 se navrhuje vytvářet v buňkách E. coli úplný protein CASB7439 s NS1 jako EFP a histidinovým zakončením jako AFP.

K tomuto účelu se navrhují dva konstrukty.

Konstrukt 1: Úplná sekvence cDNA CASB7439 standardního typu fúzovaná s NS1 cDNA a EFP a s cDNA kódující histídinové zakončení jako AFP (SEQ ID No: 8). Zakódovaná sekvence fúzního proteinu je označena jako SEQ ID No: 10, ³⁰

Konstrukt 2: Úplná cDNA mutovaného proteinu CASB7439 fúzovaná sNSl cDNA jako EFP a s cDNA kódující histidinový konec jako AFP (SEQ ID No: 9). Navrhuje se, aby bylo prvních padesát kodonů cDNA nativního CASB7439 nahrazeno kodony specifickými pro E. coli, aby bylo možno zvýšit schopnost exprese CASB7439 v hostitelské E. coli. Zakódovaná sekvence fúzního proteinu je označena SEQ ID No: 10.

Schéma proteinu CASB7439 je ukázáno dále:

N-konec | NS1 l - | CASB7439 | HIS C-konec

80 1 194 „NSl“ je N-koncový fragment (80 aminokyselin) chřipkového proteinu NSl. „HIS“ je polyhistidinové zakončení.

Jako rekombinantní kmen se použije AR58: Kryptický λ lysogen odvozený zN99 s fenotypem gal Ε::Τηιο_ιΔ-8(_ίΛ/Ι>-^/),Δ-Ηl(_L,_m ^),N\ a c!857 (Proč. Nati. Acad. Sci. USA díl 82, str. 88 - 92, leden 1985, Biochemistry).

Jakmile jsou dostupné rekombinantní kmeny, rekombinantní produkt se charakterizuje vyhodnocením míry exprese a předpovědí další rozpustnosti proteinu analýzou chování surového extraktu.

Po růstu na vhodném kultivačním médiu a indukci exprese rekombinantního proteinu se úplné extrakty analyzují SDS-PAGE. Rekombinantní proteiny se zviditelní na obarvených gelech a identifikují analýzou westernovým přenosem s použitím specifických protilátek.

-35CZ 303468 Bó

Plasmid název:

řep 1 ikon:

selekční markér:

promotor:

insert:

TCM281 pMBl Kan PL long

NSl-C74-39-His pR.IT.. 15143

Exprese rekombinantního proteinu z konstruktu 1

Bakterie byly pěstovány v médiu LB + 50 pg/ml Kan při 30 °C. Při dosažení OD kultury 0,5 (620 nm) byla kultura zahřáta na 39 °C a po 5 h indukce byly buňky sklizeny.

Extract preparation

Zakoncentrovaný buněk: 50 x v pufru PBS + kompletní.,.

Rozbití: french press 3 x

Centrifugace: 30 min pri 14 000 g

Komentář: >90% v supematantu buněčného extraktu

Analýza buněčného extraktu byla provedena na 12,5% gelu SDS PAGE, který byl barven Coomassie blue. Byla také provedena analýza westernovým přenosem použitím komerční monoklonální protilátky proti polyhistidinovému konci (Quiagen). Získané gely (obr. 3 a 4) ukazují, že protein je exprimován a je viditelný v supematantu buněčného extraktu.

Schéma purifikace je založeno na klasickém přístupu s využitím histidinového afinitního zakončení přítomného v rekombinantním proteinu. Při typickém uspořádání experimentu se rozbité buňky zfiltrují a bezbuněčné extrakty se nanesou na afínitní kolonu Ion Metal Affinity Chromatography (IMAC; Ni⁺⁺NTA, Qiagen), která specificky zachytí rekombinantní protein. Zachycené proteiny se eluují 0 až 500 mM imidazolovým gradientem (v případě potřeby v přítomnosti detergentu) ve fosfátovém pufru. Supematant ze sklizené kultury byl denaturován v 6M močovině, 100 mM NaH₂PO₄, 10 mM Tris, pH 8, a nanesen na chromatografie kou kolonu IMAC Qiagen NTA Ni⁺⁺ za následujících podmínek:

Ekvilibrační pufr: NaH₂PO₄ lOOmM pH 8 mM 6M

Tris močovina

Vzorek: supematant v močovině 6M, 100 mM NaH₂PO₄, 10 mM Tris

Promývací pufry: l)NaH₂PO₄ Tris

100 mM pH 8 močovina imidazol 2) NaH₂PO₄

Tris mM 6M mM

100 mM pH 8 močovina imidazol lOmM 6 mM 50 mM

Eluční pufr: NaH₂PO₄

Tris močovina imidazol

100 mM pH 5,5 lOmM

6M

500 mM

36CZ 303468 B6

Eluovaný protein v pufru 500 mM imidazol + 6M močovina se dialyzuje za následujících podmínek:

- PBS pH 7,2 + sarkosyl 0,5% + 4M močovina

- idem při koncentraci močoviny 2M 2 h

- idem při koncentraci močoviny OM 2 h

Získaný materiál se zmrazí a uloží. Zjištění množství proteinu bylo prováděno pomocí Lowryho testu (0,9 mg/1,2 ml). Čistota byla zjišťována na 12,5% gelu SDS-PAGE s barvením Coomasie blue (obr. 5) a přítomnost rekombínantního proteinu byla ověřena westernovým přenosem s pouio žitím monoklonální protilátky proti polyhistidinu (obr. 6).

Srovnávací vyhodnocení různých verzí exprimovaného antigenu umožní selekci nej v hodnější ho kandidáta, který je vhodný pro další čištění a imunologické hodnocení.

9.2 Produkce protilátek a imunohistochemické testy

Malá množství relativně vyčištěného proteinu mohou být použita pro vytvoření imunologických nástrojů pro dosažení

a) imunohistochemické detekce exprese v řezech normální nebo rakovinné tkáně;

b) detekce exprese a sledování proteinu v průběhu čištění (ELISA/westernový přenos); nebo

c) charakterizace/kvantifikace vyčištěného proteinu (ELISA).

9.2.1 Polyklonální protilátky

Imunizace

Králíci se intramuskulámě (i.m.) 3 x imunizují v intervalech tří týdnů 100 pg proteinu formulovaného vadjuvans 3D-MPL/QS21. O tři týdny po každé imunizaci se odebere vzorek krve a zjistí se titr protilátky v séru metodou ELISA s použitím proteinu jako potahovacího antigenu a standardního protokolu.

ELISA

96-jamkové mikrodesticky (maxisorb Nunc) se potahují 5 pg proteinu přes noc při 4 °C. Po 1 h saturace při 37 °C PBS NCS 1% se přidávají sériová ředění králičího séra a inkubuje se 1 h 30 min při 37 °C (počáteční ředění 1/10). Po třech promytích v pufru PBS Tween se přidá biotinylo40 váná protilátka proti králičímu séru (Amersham) (1/5000). Destičky se promyjí a přidá se streptavidin s navázanou peroxidázou (1/5000) na 30 min při 37 °C. Po promytí se přidá 50 pl TMB (BioRad) na 7 min a reakce se potom zastaví 0,2M H₂SO. OD se může měřit při 450 nm a střední ředění se počítají softwarem SoftmaxPro.

9.2.2 Monoklonální protilátky

Imunizace

Pět myší BALB/c se imunizuje 3 x v intervalu tří týdnů 5 pg čištěného proteinu. Krev se odebírá

14 dnů po druhé imunizaci a jeden týden po třetí imunizaci. Séra se testují metodou ELISA na čištěném proteinu použitém jako potahovací antigen. Na základě těchto výsledků (střední ředění >10 000) se pro fúzi vybere jedna myš.

-37CZ 303468 B6

Fúze/selekce HAT

Provede se fúze ledvinových buněk s myelomem SP2/0 podle standardního protokolu použitím PEG 40% a DMSO 5%. Buňky se potom naočkují do 96-jamkových destiček v koncentraci 2,5 x 10⁴ až 10⁵ buněk/jamku a provede se selekce rezistentních klonů v médiu HAT. Supematant z těchto hybridomů se testuje na obsah specifických protilátek a v případě pozitivního výsledku se provedou dva cykly limitovaného ředění. Po dvou cyklech screeningu se tri hybridomy zvolí pro produkci v ascitu.

9.2.3 Imunohistochemické testy

Když jsou k dispozici protilátky, provede se imunologické barvení na řezech normální a rakovinné tkáně, aby bylo možno zjistit:

° míru exprese antigenu podle vynálezu v rakovinné tkáni ve srovnání s normální tkání, nebo ⁰ podíl určitých typů rakoviny, které exprimují antigen, ⁰ zda jiné typy rakoviny rovněž exprimují antigen ⁰ podíl buněk v rakovinné tkáni, které exprimují antigen.

Příprava vzorku tkáně

Po vyříznutí se vzorek tkáně upevní na korkový disk ve sloučenině OCT a rychle se zmrazí v isopentanu, který se předtím podchladí v kapalném dusíku (-160 °C). Blok se potom konzervuje až do použití při -70 °C. V krystalické komoře se provedou řezy o tloušťce 7 až 10 μιη (-20, -30 °C).

Barvení

Řezy tkání se suší 5 min pri teplotě laboratoře, fixují v acetonu 10 min pri teplotě laboratoře, znovu suší a nasytí pufrem PBS s 0,5 % BSA a 5 % sérem. Po 30 min pri teplotě laboratoře se provede bud’ přímé, nebo nepřímé barvení s použitím protilátek specifických pro antigen. Přímé barvení vede k lepší specificitě, ale nižší intenzitě barvení, zatímco nepřímé barvení poskytne intenzivnější, ale méně specifické barvení.

9.3 Analýza lidských buněčných imunistních odpovědí na antigen podle popisu

Imunologické vlastnosti antigenu podle popisu mohou být testovány in vitro primingem na lidských T-buňkách. Všechny linie T-buněčných lymfocytů a dendritické buňky se odvozují od buněk PBMC (mononukleámí buňky periferní krve) zdravých dárců (s výhodou subtypu HLAA2), Pro screening peptidů HLA-A2.1 se také používá model transgenní myši HLA-A2.1/Kb.

Vytvoří se nově objevené linie pro antigen specifických CD8+ T-buněk, které se udržují týdenní stimulací in vitro. Lytická aktivita a produkce γ-IFN CD8+ buněčných linií jako odpověď na antigen nebo peptidy odvozené od antigenu se testují s použitím standardních postupů.

Používají se dvě strategie pro vytvoření linií CD8+ T-buněk: přístup založený na peptidech a přístup založený na úplném genu. Oba přístupy vyžadují úplnou cDNA nově objeveného antigenu buď klonovanou ve správném čtecím rámci do vhodného dodávacího systému, nebo použitou pro předpovězení sekvence peptidů vázajících HLA.

Přístup založený na peptidech

Transgenní myši se imunizují adjuvantními peptidy HLA-A2, přičemž peptidy neschopné indukovat odpověď CD8+ (definovanou jako účinný lyže autologních slezinných buněk po krátkodobém přidání peptidů) se budou dále analyzovat v lidském systému.

-38CZ 303468 B6

K lidským dendritickým buňkám (kultivovaným metodou podle Romani a další) se krátkodobě přidají peptidy a použijí se pro stimulaci CD8+ T buněk (podle Facse). Po několika týdenních stimulacích se nejprve linie CD8+ testují na autologních BLCL (buněčné linie transformované

EBV-B) po krátkodobém přidání peptidu. Pro ověření správného zpracování peptidu in vivo se buněčné linie CD8+ testují na tumorových buňkách transfekovaných cDNA (tumorové buňky LnCaP, Skov nebo CAM A transfekované HLA-A2).

Přístup založený na úplném genu

JO

Linie CD8+ T-buněk se budou stimulovat buď dendritickými buňkami transfekovanými metodou gene-gun, retrovirálně transdukovanými B7.1-transfekovanými fibroblasty, rekombinantními poxviry nebo dendritickými buňkami infikovanými adenovirem. Buňky infikované virem mají vysokou účinnost pro předkládání antigenních peptidů, protože antigen je exprimován ve velkém množství, ale mohou být použity pouze jednou, aby je nepřerostly linie virových T-buněk.

Po střídavých stimulacích se linie CD8+ testují na tumorových buňkách transfekováných cDNA, jak bylo uvedeno výše. Zjistí se spécificita a identita peptidu pro potvrzení imunologických vlastností.

Odpověď CD4+ T-buněk

Podobným způsobem může být také testována imunitní odpověď CD4+ T-buněk. CD4+ Tbuňky se vytvářejí použitím dendritických buněk, do kterých byl vložen rekombinantní vyčištěný protein nebo s použitím peptidů pro stimulaci T-buněk.

Předpovězené epitopy (nonamery a dekamery) vázající se na alely HLA

Peptidové sekvence vázající se na HLA třídy I se předpovídají buď s použitím Parkerova algo30 ritmu (Parker, K. C., M. A. Bednarek, a J. E Coligan, 1994, Scheme for ranking potential HLAA2 binding peptídes based on independent binding of individual peptide side-chaíns, J. ImmunoL 152: 163, a http://bimas.dcrt.nih.gov/molbio/hla_blind/), nebo metodou podle Rammensee (Rammensee, Friede, Stevanovic, MHC ligands and peptide motifs: l^st listing, ímmunogenetics 41, 178 až 228,

1995; Rammensee, Bachmann, Stevanovic: MHC ligands and peptide motifs. Landes Bioscience

1997, a http://l 34.2.96.221/scripts/hlaserver.dll/home.htm). Potom se provede screening peptidů v modelu transgenních myší HLA-A2,l/Kb (Vitiello a další). Peptidové sekvence vázající se na HLA třídy II se předpovídají použitím algoritmu Tepitope, s parametrem score cut-off nastave40 ným na 6 (Stumiolo, Hammer a další, Nátuře Biotechnology, 1999, 17; 555 až 561).

Následující tabulky shrnují předpovězené epitopové sekvence třídy I a II:

HLA-A 0201: dekamery
Pořad!	Poloha počátku	Výpis zbytku subsekvence	Hodnocení podle Parkera’	SEQ ID:
1	64	KLVNLGFQAL	142,060	SEQ ID No: 16

Odhad poločasu disociace molekuly obsahující uvedenou subsekvenci

-39CZ 303468 B6

HLA-A 0201: nonamery
Pořadí	Poloha počátku	Výpis zbytku subsekvence	Hodnocení podle Parkera’	SEQ ID:
1	182	ELLDFSSWL	507,976	SEQ ID No: 17
2	104	RLLAEHDAV	126,098	SEQ ID No: 18
3	€4	KLVNLGFQA	100,850	SEQ ID No: 19

Odhad poločasu disociace molekuly obsahující uvedenou subsekvenci

HLA-A 24: nonamery
Pořadí	Poloha počátku	Výpis zbytku subsekvence	Hodnocení podle Parkera”	SEQ ID:
1	97	EYIRALQRL	360,000	SEQ ID No: 20

Odhad poločasu disociace molekuly obsahující uvedenou subsekvenci

HLA-A 24: dekamery
Pořad!	Poloha počátku	Výpis zbytku subsekvence	Hodnocení podle Parkera’	SEQ ID:
1	97	EYIRALQRLL	360,000	SEQ ID No: 21

Odhad poločasu disociace molekuly obsahující uvedenou subsekvenci

HLA-B 7: dekamery
Pořadí	Poloha počátku	Výpis zbytku subsekvence	Hodnocení podle Parkera”	SEQ ID:
1	111	AVRNALAGGL	600.000	SEQ ID No: 22

Odhad poločasu disociace molekuly obsahující uvedenou subsekvenci

HLA-B 4403; dekamery
Pořadí	Poloha počátku	Výpis zbytku subsekvence	Hodnoceni podle Parkera”	SEQ ID:
1	156	SEPGSPRSAY	360,00	SEQ ID No: 23
2	89	VETLRSAVEY	180,00	SEQ ID No: 24

Odhad poločasu disociace molekuly obsahující uvedenou subsekvenci

-40CZ 303468 B6

HLA-DRB1M501: nonamery
Pořadí	Poloha počátku	Výpis zbytku subsekvence	Hodnocení Tepitope	SEQ ID:
1	99	IRALQRLLA	5,6	SEQ ID No: 25

HLA-DRBV1501: nonamery
Pořadí	Poloha počátku	Výpis zbytku subsekvence	Hodnocení Tepitope	SEQ ID:
1	99	IRALQRLLA	4,6	SEQ ID No: 25

HLA-DRB1 *0402: nonamery
Pořadí	Poloha počátku	Výpis zbytku subsekvence	Hodnocení Tepitope	SEQ ID:
1	120	LRPQAVRPS	5,4	SEQ ID No: 26

HLA-DRB1*1101: nonamery
Pořad!	Poloha počátku	Výpis zbytku subsekvence	Hodnocení Tepitope	SEQ ID:
1	99	IRALQRLLA	4,8	SEQ ID No: 25

HLA-DRB1 *11 02: nonamery
Pořadí	Poloha počátku	Výpis zbytku subsekvence	Hodnocení Tepitope	SEQ ID:
1	120	LRPQAVRPS	6,2	SEQ ID No: 26

HLA-DRB1*1501: nonamery
Pořadí	Poloha počátku	Výpis zbytku subsekvence	Hodnoceni Tepitope	SEQ ID:
1	99	IRALQRLLA	5,8	SEQ ID No: 25

-41 CZ 303468 B6

HLA-DRB1*1106: nonamery
Pořadí	Poloha počátku	Výpis zbytku subsěkvence	Hodnocení Tepitope	SEQ ID:
1	99	IRALQRLLA	5,8	SEQ ID No: 25

HLA-DRBV1301: nonamery
Pořad!	Poloha počátku	Výpis zbytku subsekvence	Hodnoceni Tepitope	SEQ ID:
1	120	LRPQAVRPS	6,6	SEQ ID No: 26
2	73	LRQHVPHGG	4,9	SEQ ID No: 27
3	31	LLRCSRRRR	4,4	SEQ ID No: 33

HLA-DRBV1302: nonamery
Pořadí	Poloha počátku	Výpis zbytku subsekvence	Hodnoceni Tepitope	SEQ ID:
1	120	LRPQAVRPS	5,6	SEQ ID No: 26

HLA-DRB1*1301: nonamery
Pořadí	Poloha počátku	Výpis zbytku subsekvence	Hodnoceni Tepitope	SEQ ID:
1	120	LRPQAVRPS	6,2	SEQ ID No: 26
2	73	LRQHVPHGG	4,8	SEQ ID No: 27
3	31	LGFQALRQH	4,6	SEQ ID No: 28

HLA-DRBV1301: nonamery
Pořadí	Poloha počátku	Výpis zbytku subsekvence	Hodnocení Tepitope	SEQ ID:
1	99	IRALQRLLA	4,8	SEQ ID No: 25

-42 CZ 303468 B6

HLA-DRB1*13O1: nonamery
Pořadí	Poloha počátku	Výpis zbytku subsekvence	Hodnoceni Tepítope	SEQ ID:
1	112	VRNALAGGL	5.1	SEQ ID No: 29
2	98	YIRALQRLL	4,8	SEQ ID No: 30
3	65	LVNLGFQAL	4,5	SEQ ID No: 31

HLA-DRB1*1301: nonamery
Pořadí	Poloha počátku	Výpis zbytku subsekvence	Hodnoceni Tepítope	SEQ ID:
1	96	VEYIRALQR	4,3	SEQ ID No: 32

-43CZ 303468 B6

Informace o sekvencích

SEQDDNOíl

GTACCTTGCTTTGGGGGCGCACTAAGTACCTGCCGGGAGCAGGGGGCGCACCGGGAACTCGCAGATTTCGCC AGTTGGGCGCACTGGGGATCTGTGGACTGCGTCCGGGGGATGGGCTAGGGGGACATGCGCACGCTTTGGGCC TTACAGAATGTGATCGCGCGAGGGGGAGGGCGAAGCGTGGCGGGAGGGCGAGGCGAAGGAAGGAGGGCGTGA GAAAGGCGACGGCGGCGGCGCGGAGGAGGGTTATCTATACATTTAAAAACCAGCCGCCTGCGCCGCGCCTGC GGAGACCTGGGAGAGTCCGGCCGCACGCGCGGGACACGAGCGTCCCACGCTCCCTGGCGCGTACGGCCTGCC ACCACTAGGCCTCCTATCCCČSSGCTCCAGACGACCTAGGACGCGTGCCCTGGGGAGTTGCCTGGCGGCGCC gtgccagaagcccccttggggcgccacagttttccccgtcgcctccggttcctctgcctgcaccttcctgcg GCGCGCCGGGACCTGGAGCGGGCGGGTGGATGCAGGCGCGatggacggcggcacactgcccaggtccgcgcc ccctgcgccccccgtccctgtcggctgcgctgcccggcggagacccgcgtccccggaactgttgcgctgcag ccggcggeggegac cggeeaecgcaga gaccggaggeggegca gcggccgt agc gcgg egc&a t gagcgcga gcgcaacegcgtgaagctggtgaacttgggcttccaggcgctgcggcagcacgtgccgcacggcggcgccag caagaagctgagcaaggtggagacgctgcgctcagccgtggagtacatccgcgcgctgcagcgcctgctggc cgagcacgaegccgtgcgcaacgcgctggcgggagggctgaggccgcaggccgtgcggccgtctgcgccccg cgggccgceagggaccaccccggtcgccgcctcgccctcecgcgcttcttcgtccccgggcegcgggggcag ct cggagcccggct ccccgcgc t ccgcctact cgt cggacgacagcggctgcga aggcgcgct g agt cc tgc ggagcgcgagctactcgacttctccagctggttagggggctactgaGCGCCCTCGACCTATGAGCCTCAGCC CCGGAAGCCGAGCGAGCGGCCGGCGCGCTCATCGCCGGGGAGCCCGCCAGGTGGACCGGCCCGCGCTCCGCC CCCAGCGAGCCGGGGACCCACCCACCACCCCCCGCACCGCCGACGCCGCCTCGTTCGTCCGGCCCAGCCTGA CCAATGCCGCGGTGGAAACGGGCTTGGAGCTGGCCCCATAAGGGCTGGCGGCTTCCTCCGACGCCGCCCCTC CCCACAGCTTCTCGACTGCAGTGGGGCGGGGGGCACCAACACTTCGAGATTTTTCCGGAGGGGAGAGGATTT TCTAAGGGCACAGAGAATCCATTTTCTACACATTAACTTGAGCTGCTGGAGGGACACTGCTGGCAAACGGAG acctatttttgtacaaagáacccttgacctcgggcgtaataaagatgacctggacccctgcccccactatct ggagttttccatgctggccaagatctggacacgagcagtccctgaggggcggggtccctggcgtgaggcccc cgtgacagcccaccctggggtgggtttgtgggcactgctgctctgctagggagaagcctgtgtggggcacac ctcttcaagggagcgtgaactttataaataaatcagttctgtttaaaaaaaaaaaaaaaaaaa

SEQIDNO:2

MDCGTLPRSAPPAPPVPVGCAARRRPASPELI.RCSaRRRPATAETGGGAAAVARRMERERNRVKLVNLGFQA

LRQHVPHGGASKKLSKVETLRSAVEYIFALQRL1AEHDAVRNALAGGLRPQAVRPSAPRGPPGTTPVAASPS

RASSSPGRGGSSEPGSPRSAYSSDDSGCEGALSPAERELLDFSSWLGGY

SEQ ro NO:3

MSAPAARSASOAKAHRSRALSSPLTSWRSRVARAPQDSARLRSRCRPTSRRNAGSRAPSCPROPGTKKRGR ARRRPGMSLAARGAQTAARPAASALPPARCARRRARPAGAAARGCTPRLSAAS P PCSASCWRRRAARAAAA PGS PSSPASRGCARAHCAALRPLRRLRSLRWP VAAAGCSATVPGTRVSAGQRSRQGRGAQGARTWAVCRR P SRLHPPARSRSRRAAGRCRQRNRRRRGKLWRPKGASGTAPPGMSPGHAS

-44CZ 303468 B6

SIQ W NO;4 gtaccttgctttgggggcgcactaagtacctgccgggagcagggggcgcaccgggaactcgcagatttcgcc agttgggcgcactggggatctgtggactgcgtccgggggatgggctagggggacatgcgcacgctttcggcc TTACAGAATGTGATCGCGCCGAGGGGGAGGGCCGAAGCGTGGCGGGAGGGCGAGGCGAAGGAAGGAGGGCGT GAGAAAGGCGACGGCGGCGGCGCGGAGGAGGGTTATCTATACATTTAAAAACCAGCCGCCTGCGCCGCGCCT GCGGACACCTGGGAGAGTCCGGCCGCACGCGCGGGACACGAGCGTCCCACGCTCCCTGGCGCGTACGGCCTG CCACCACTAGGCCTCCTATCCCCGGGCTCCAGACGACCTAGGACGCGTGCCCTGGGGRGTtGCCTGGCGGCG CCGTGCCAGAAGCCCCCTTGGGGCGCCACAGTTTTCCCCGTCGCCTCCGGTTCCTCTGCCTGCACCTTCCTG CGGCGCGCCGGGACCTGGAGCGGGCGGGTGGATGCAGGCGCG* t ggacggcggca cac t gcccaggtccgcg -cccctgcgccccccgtccctgt cgget gcgc t gcecggcggagac ccgcg t c ecc ggaact gt t gcgct gc agccggcggcggcgaccggccaccgcagagaccggaggcggcgcagcggccgtagcgcggcgcaatgagcgc g agcgcaaccgcgt gaagct ggt gaact t gggc tt ceaggcgct gcggcagcacg t gccgcacggcggcgce agcaagaagctgagcaaggtggagacgctgcgctcagecgtggagtacatccgcgcgctgcagcgcctgctg gcegagcacgacgccgtgegcaacgcgctggcgggagggctgaggeegcaggccgtgcggccgtctgcgccc cgcgggccgccagggaccaccccggtcgccgcctcgccctcccgcgcttcttcgtccccgggcegcgggggc agctcggagcceggctccccgcgttccgcetactegtcggacgacagcggctgcgaaggcgcgctgagtcct gcggagcgcgagctactcgacttctccagctggttagggggctactgaGCGCCCTCGACCTAATAAGCCTCA AGCCCCGGAAACCCGAGCGAACGGGCCGGCGCGCTTCATCGCCGGGGAAGCCCGCCAAGGTGGACCGGGCCC □CGCTCCGCCCCCAGCGAGCCGGGGACCCACCCňCCACCCCCCGCACXGCCGACGCCGCCTCGTTCGTCCGG CCCAGCCTGACCAATGCCGCGGTGGAAACGGGCTTGGAGCTGGCCCCATAAGGGCTGGCGGCtTCCTCCGAC GCCGCCCCTCCCCACAGCTTCTCGACTGCAGTGGGCCGGGGGGCACCAAGKCTTGGAGAÍTTTTCCGGAGGG GAGAGGATTTTCTAAGGGGACAGAGAATCCATTTTCTACACATTAACrrGAGCTGCTGGAGGGACACTGCTG GCAAACGGAGACCTATTTTTGTACAAAGAACCCTTGACCTGGGGCGTAATAAAGATGACCTGGACCCCTGCC CCCACTATCTGGAGTTTTCCATGCTGGCCAAGATCTGGACACGAGCAGTCCCTGAGGGGCGGGGTCCCTGGC GTGAGGCCCCCGTGACAGCCCACCCTGGGGTGGGTTTGTGCGCACTGCTGCTCTGCTAGGGAGAACCCTGTG tggggcacacctcttcaagggagcgtgaactttataaataaatcagttctgtttaaaaaaaaaaaaaaaaaa AAAACCGAGGGGGGGCCCGGAGCCAACAAA

SEQ1DNO:5

GGTAAACAJGAACTGATTTATTTAXAAAGTTCACCSCrCCXTTGAAGAGGTGTGCCCCACACAGGCTTCTCCC

TAQCAQAGCAQCAGTGCCCACAAACCCACCCCAGCíGTGGGCTGTCACQGGGGCCTCACCJCCAGGGACCCCQ

GOTCATCTTTATTACGCCCCAGCrrcAAOGOTTCrTTGTACAAAAAlaGGTCTCOGTTTGCCAfiCAOTGTCC

CTCCAGCAGCTCAAGTTAATGTGTAjQAAAATGGATTCTCTGTGCCdTAGAAAATCCTCTCCCCTCCGGAA

AAATCTCCAAťJTGTTGGTGCCCCCCGCCCCACTOCAGTCGAQAAOCTQTGGOGAGGGGCGGCQTCGGAGGA

AGCCGOVGCCCATTrATGOGGCCAGCTCCAAGCCCGTTTCCACCGCGGCATTGGTCAGGCrGGGCGGACGAA cgaggcggcgtcggcggtgcggogggtogtgggtgggtccccggctcgctgggggcggagcagcgggccgg

TCCACCTOOCOOGCTCCCC

-45 CZ 303468 B6

SEQIDNO:6

TTTTTTTTTTTTTTTTTTTAAACAGAACTGATTTATTTATAAAGTTCACGCTCCCTTGAAGAGGTGTGCCCC acacaggcttctccctagcagkgcagcagtgcccacaaacccaccccagggtgggctgtcacgggggcctca

CGCCAGGGACCCCGCCCCTCAGGGACTGCTCGTGTCCAGATCTTGGCCAGCATGGAAAACTCCAGATAGTGG gggcaggggtccaggtcatctttattacgccccaggtcaagggttctttgtacaaaaataggtctccgtttg

CCAGCAGTGTCCCTCCAGCAGCTCAAGTTAATGTGTAGAAAATGGArTCTCTGTGCCCTTAGAAAATCCTCT

CCCCTCCGGAAAAATCTCCAAGTGTTGGTGCCCCCCGCCCCACTGCAGTCGAGAAGCTGTGGGGAGGGGCGG

CGTCGGAGGAAGCCGCCAGCCCTTATGGGGCCAGCTCCAAGCCCGTTTCCACCGCGGCATTGGTCAGGCTGG

GCCGGACGAACeAGGCGGCGTCGGCGGTGCGGGGGGTGGTGGGTGGGTCGCCGGCTCGCTGGGGGGGGAGCG

CGGGCCGGTCCACCTGGCGGGCTCCCCGGCGATGAGCGCGCCGGCCGCTCGCTCGGCTTCCGGGGCTGAGGC

TCATAGGTCGAGGGCGCTCAGTAGCCCCCTAACCAGCTGGAGAAGTCGAGTAGCTCGCGCTCCGCAGGACTC

AGCGCGCCTTCGCAGCCGCTGTCGTCCGAC6AGTAGGCGGAACGCGGGGAGCCGGGCTCCGAGCTGCCCCCG

CGGCCCGGGGACGAAGAAGCGCGGGAGGGCGAGGCGGCGACCGGGGTGGTCCCTGGCGGCCCGCGGGGCGCA

GACGGCCGCACGGCCTGCGGCCTCAGCCCTCCCGCCAGCGCCTTGCGCACGGCGTCGTGCTCGGCCAGCAGG

CGCTGCAGCGCGCGGATGTACTCCACGGCTGAGCGCAGCGTCTCCACCTTGCTCAGCTTCTTGCTGGCGCCG

CCGTGCGGCACGTGCTGCCGCAGCGCCTGGAAGCCCAAGTTCACCAGCTTCACGCGGTTGCGCTCGCGCTCA

TTGCGCCGCGCTACGGCCGCTGCGCCGCCTCCGGTCTCTGCGGTGGCCGGTCGCCGCCGCCGGCTGCAGCGC aacagttccggggacgcgggtctccgccgggcagcgcagccgacagggacggggggcgcagggggcgcggac ctgggcagtgtgccgccgtccatcgcgcctgcatccacccgcccgctccaggtcccggcgcgccgcaggaag gtgcaggcagaggaaccggaggcgacggggaaaactgtggcgccccaagggggcttctggcacggcgccgcc aggcaactccccagggcacgcgtcctaggtcgtctggagcccggggataggaggcctagtggtggcaggccg tacgcgccagggagcgtgggacgctcgtgtcccgcgcgtgcggccggactctcccaggtctccgcaggcgcg gcgcaggcggctggtttttaaatgtatagataaccctcctccgcgccgccgccgtcgcctttctcacgccct ccttccttcgcctcgccctcccgccacgcttcgccctccccctcgcgcgatcacattctgtaaggcccaaag cgtgcgcatgtccccctagcccatcccccggacgcagtccacagatccccagtgcgcccaactggcgaaatc tgcgagttcccggtgcgccccctgctcccggcaggtacttagtgcgcccccaaagcaaggtac

SEQIDNO:?

mcrkwilcalrkssplrknlqvlvppaplqsrscgbgrrrrxppalmgpafsffpprhwsgwagrtrrrrr CGGWWVGPRIAGaaARARSTLAGFPODBARRFVRSe«iaLRLIJlSRALSSPI.TSWRSRVA»AFGDSARLRS RCRPTSRKHAeSRAPSCPRGPGTlCKRGRARRRPaHSLAARQAOTAARPAASALPPARCARRRARPAGAAAR GCTPRL3AAS PPCSAfiCMRRRAARAAAAPGS PSS PASRGCARAHCAALRPLRRIAS LRHPVAAAGCSATVP gtrvsagqrsrqgrgaqgartwavcrrpsrlhpparsrsrraagrcrqrnrrrrgklwrpkgasgtappgn

SPGHAS

SEQ n> NO; 8

ATGGATCCAAACACTGTGTCAAGCTTTCAGGTAGATTGCTTTCTTTGGCATGTCCGCAAACGAGTTGCAGAC CAAGAACTAGGTGATGCCCCATTCCTTGATCGGCTTCGCCGAGATCAGAAATCCCTAAGAGGAAGGGGCAGC ACcCTCGGTCTGGACATCGAGACAGCCACACGTGCTGGAAAGCAGAT AG t GGAGCGGAt t c t GAAAGÁAGAA TCCGATGAGGCACTTAAAATGACCATGGACGGCGGCACACTGCCCAGGTCCGCGCCCCCTGCGCCCCCCGTC CCTGTCGGCTGCGCTGCCCGGCGGAGACCCGCGTCCCCGGAACTGTTGCGCTGCAGCCGGCGGCGGCGACCG GCCACCGCAGAGACCGGAGGCGGCGCAGCGGCCGTAGCGCGGCGCAATGAGCGCGAGCGCAACCGCGTGAAG ctggtgaacttgggcttccaggcgctgcggcagcacgtgccgcacggcggcgccagcaagaagctgagcaag gtggagacgctgcgctcagccgtggagtacatccgcgcgctgcagcgcctgctggccgagcacgacgccgtg cgcaacgcgctggcgggagggctgaggccgcaggccgtgcggccgtctgcgccccgcgggccgccagggacc accccggtcgccgcctcgccctcccgcgcttcttcgtccccgggccgcgggggcagctcggagcccggctcc ccgcgttccgcctactcgtcggacgacagcggctgcgaaggcgcgctgagtcctgccgagcgcgagctactc GACTTCTCCAGCTGGTTAGGGGGCTACactagtggccaccatcaccatcaccattaa

-46CZ 303468 B6

SEQ Π> NO:9

ATGGATCCAAAaKCTGTGTCAAGCTTTCAGGTAGATTGCTTTCTTTGGCATGTCCGCAAACGAGTTGCAGA

CCAAGAACTAGGTGATGCCCCATTCCTTQATCGGCTTCGCCGAGATCAGAAATCCCTAAGAGGAAGGGGCA

GCACCCTCGGTCTQGACATCGAGACAGCCAGACGTGCTGGAAAGCAGATAGTGGAGCGGATTCTGAAAGAA

GAATCCGATGAQGCACTTAAAATGACCATGGACGGCGGCACCCTGCCGCGTTCCGCGCCGCCGGCGCCGCC

AGTTCCGGTTGGCTGCGCTGCCCGTCGCCGTCCCOCGTCCCCGGAACTGCTaCGCTGCAGCCGTCGCCOTC

GCCCGGCCACCGCAGAGACCGGAGGGGGCGCAGCGGCCGTAGCGCGGCGCAATQAGCGCGAGCGCAACCGC

GTGAAGCTGGTGAACrTGGGCTTCCAGGCGCTGCGGCAGCACGTGCCGCACGGCGGCGCCAGCAAGAAGCT

GAGCAAGGTGGAGACGCTGCQCTCAGCCGTGGAGTACATCCGCGCGCTGCAGCGCCTGCTGGCCGAGCACG

ACGCCeTGCGCAACGCGCTOGCGGGAGGGCTGAGGCCGCAGGCCaTGCGGCCCTCTGCaCCCCGCGGGCCa

CCAGGGACCACCCCGGTCCCCGCCTCGCCCTCCCGCGCTTCrrCGTCCCCGGGCCGCGGGGGCAGCTCGGA

GCCCGaCTCCCCGCGTTCCGCCTACTCGTCGOACGACAGCGGCTGCGAAGGCGCGCTGAGTCCTGCGGAGC

GCGACCTACTCGACTTCTCCAGCTGGTTAGGGGGCTACACTAGTGGCCACCATCACCATCACCATTAA

SEQ Π) ΝΟΐΙΟ

MDPNTVSSFQVDCFLWHVRKRVADQELGDAPFLDRLRRDQKSLRGRGSTLGUJIETATRAGKQIVERILKSE SDEALKMTMDGGTLPR5APPAPPVPVGCAARRRPASPELLRCSRRRRPATAETGGGAAAVARRHERERNRVK LVNLG FQALRQHVPHGGASKKLS KVETLRS AVE YIRALQRLLAEHOAVRNALAGGLRPQAVRPSAPRG P PGT TPVAASPSRASSSPGRGGSSEPGSPRSAYSSDDSGCEGALSPAERELLDFSSWLGGYTSGHttHHHH

SEQ ID NO: 11

MYSTAERSVSTLLSFLLAPPCGTCCRSAWKPKFTSFTRLRSRSLRRATAAAPPPVSAVAGRRRRLQRNSSG

DAGLRRAAQPTGTGGAGGADLGSVPPSIAPASTRPLQVPARRRKVQAEEPEATGKTVAPQGGFWHGAARQL

PRARVLGRLBPGDRRPSGGRPYAPGSVGRSCPARAAGLSQVSAGAAQAAGF

SEQ ED NO: 12

MEAHLDWYGVFaLQBASDACPRESCSSALPEARBGANVHFPPHPVPREHFSCAAPELVAGAQGLHASLMDG GALPRLMPTSSaVAOACAARRRQASPELLRCSRRRRSGATEASSSSAAVARRKERBRNRVKLVNLGFQALR QHVPHGGANKKLSKVETLRSAVEYIRALQRLLAKHDAVRAALAGGLLTPATPPSDECAQP SASPASASLSC AST3PS PDRLGCSEPTS PRSAYSSEESSCBGELSPMEQELLDFSSWLGGY

-47CZ 303468 B6

SEQ Π) NO: 13

GCCCGOAGCATGGAAGCACGTCAGCTAGGCCATGAACTGCACCCGGGAQGGGTGGGGGTGGAAGCGCACGG

TGTCAGCTTTGCAGAATGTGTACACCAAGGGGAGGGCGAGGCGAAGGAAGGAGGGCGTAAGAAAQGAGGCG

GTGGCGGGGCGGAGGAGATTATCTATACTTTTTAAAAAAAAGGAGCCTCTTAGCCGCGTAAAGGAGACTTa

GG<3AGCGCCTGACAGCACGCGCGGGACACGAGAGTACCZACGCTTCCCTACTCTTTTCAGACCTTGACTGGT

ACGGGGTCCCAGGACTGCAGGAGGCCAGCGACGCGTGCCCTAGGGAGTCCTGCAGCAGTGCCCTGCCTGAG

GCCCGTGAAGGTGCAAAOTrCCACTTCCCACCGCACCCGGTrCCTCaCGAaCACrTTTCCTGTGCCGCACC

AaAACTCGTAGCAGGGGCCCAaGGGCTGAATGCAAGCTTGATGGACGGCOGCGCGCTGCCCAGACTCATt3C

CCACCTCGTCTGaftGTCGCrGGAGCCTGCeCTOCTCGaCGGASACAAGCGTCTCCGGAATTGCTGCGCTGC

AGCCGGCGGCGGCGATCTGGAGCAACCeAGGCCAGCAGCAGCTCGGCGTCCGTGaCACGCCGCAATGAGCG

CGAGCGCAACCGa3TAAAGCTGGTAAACTTGGGCTTCCAGGCGCTGa3GCAGCACGTGCCGCACGGCGGCG

CCAAGAAGAACCTGAGTAAGGTGGAGACGCTGCGCTCCGCGGTAGAGTACATTCGTGCGCTGCAOCGGCTG

CTCGCAGAfK^aZACACGGTGCGeCCGGMGCTCGCTGGGGeGCTGTTAACACCCGCTACTCCGCCGTCCeA tgagtgúacgcagccctctgcctcccctgccagcgggtctctgtcctgcgcctctacgtctccgtcccgga

CCCTQGGCTGCTCTGAGCCTACCTCCCCGCGCTCCGCCTKCTCGTCGGAGGAAAGCAGCTGCGAGGGAGAjG

CTAAGCCCGATGGAGCAGGAGCTGCTTGACTTTTCCAGTTGGTTAGGGGGCTACTGA

SEQ ID NO: 14

MESHFNWYGVPRLQKASDACPRESCSSALPEAREGANVHFPPHPVPRBHFSCGAPKPVAGAPALNASLMDa

GALPÍLLVPTSSGVAaACTARRRPPSPKLLRCSRRaRSaATEASSSSAAVARRNHRERNRVKLVNLGFQALR

QHVPHGOANKXLSXVBTLRSAVBYIRALORLLAEHDAVRAALSGGLI/rPATRPSDVCTQPSASPASASLSC

TSTSPDRLGCSEPASPRSAY3SEDSSCEaBTYPMGQMFDFSNWLGGY

SEQ Π) NO: 15

TTCACCCGGCTGCAAGCGCTAGGTGTACGGAGACCTGGCAeCTCTTGaGGCTTAAGGACTGAGCTtCCAGAO

CCGGTGGAGGTTCCTGTGGAGTACATTCGGACCCTCTCACAGCCCCCGAGAGTGCGGGACGTGCGGAGCGC

AGrrcaGGATCTGCACTCaAGGACTTOTCGAGGACGCATrAAGCTAAGCATCTGCTCGGAGCATGGAATCG

CACTTTAACTGGTACGGGGTCCCAAGGCTCCAGAAGGCTAGCGACGCGTGCCCTAOGGAATCCTGCAGCAG

TGCCCTGCCTQAGGCCCGTGAAGGTGCGAACGTCCACTTCCCACCGCACCCGGTTCCTCGCGAGCACnTr

CCTGTOGCGCACCGAAACCCGTAGCGGGGGCCCCGGCGCTGAATGCAAGCTTGATGGACGGCGGCGCGCTG

CCCAGACTCGTGCCCACCTCGTCTGGAGTCGCTCGAGCXTGCACTGCTCGGCGGAaACCCCCGTCCqCGGA actgcttcgctgcagccgacggcggcgatcgggagcaaccgaggccagcagcagctcggcggccgtggcac

GCCGCAATGAGCGTGAGCGCAACCGCGTAAAGCTGGTAAACTFGGGCTTCCAGGCGCTGCGGCAGCACaTG

CCGCACGGCGGCGCCAACAAGAAGCTGAGTAAGGTGGAGACGCTGCGCTCCGCGGTAGAGTACATCCGTGC aCTCCAGCGGCTGCTAGCAGAGCACGACGCGGTGCGTGCTGCaCTCTCTGGGGGTCTATTAACACCCaCTA

CTCGGCCaTCCGATGTGTGCACGCAGCCCTCCGCCTCCCCTGCCAGCGCaTCTCTGTCCTGCACCrCTACA

TCCCCAGACCGCCTAGGCTGCTCCGAGCCTGCCTCTCCGCGCTCCGCCTACTCGTCGGAGGACAGCAGCTG cgagggagagacttacccgatggggcagktgtttgacttttccaattggttaoggggctactgagcacccc acacccctaagctgcgtccctgggtgtoccctggtggacctkcctgcgtttcttgcccaggaaacctgggc

CCATGCCTTACCCATGCTGTCTAGT^AGCCTGACCAAATGCCAAGTACTGACCTCTGCTCaaCCTCCACG

CCGCGGAATGACATCTrcCATCTCCCAGTCCTrGCCGAACCAGGACTTGGAAATTTCTCAGaAGAAAGAAT

TTTACAATGAC^TCTGCTTTTTATCAAriAACTTGAACTCCrGaAGGACTCTGCTGAAAATATGAAGAAT tatttttatacaaaggatccttaagcttggaocacaataaagatgacctctgtctctcacccccactgtct

AGAACTTTCCAACCTGGCCAAAlGTaTGGACaaGTCGGGCCCTGAaaeCAAGATGCCTaGCTGCACCCTTCT

TCCTCTTCCaAAGCCTATCCTOACaCTGATGTTTGGCCAGTGTGGGAACCCTGCTATTGCAAAGTGTACTA

TTCTATAAAAGTTOTTTTTCATTGGAAAGGAATTC

-48CZ 303468 B6

SEQ Π> NO:16 KLVNlGFQAL

SEQ ID NO: 17 ELLDFSSWL

SEQ Π> NO: 18 RLLAEHDAV

SEQ ID NO: 19 KLVNLGFQA

SEQIDNO:20

EYIRALQRL

SEQ W NO.21 EYIRALQRLL

SEQIDNO:22

AVRNALAGGL

SEQ ID NO:23 SEPGSPRSAY

SEQ Π> NO:24 VETLRSAVEY

SEQ Π) NO:25 IRALCRLLA

SEQ ID NO:26 LRPQAVRPS

SEQ ID NO:27 LRQHVPHGG

SEQ ID NO:28 LGFQALRQH

SEQ W NO: 29 VRMALAGGL

-49CZ 303468 B6

SEQIDNO:30 yiralqrll

SEQIDNO:31

LVMLGFQAL

SEQIDNOí32

VBYIRALQR

S£QXDNOď3

LLRCSRRRR

Výpis sekvencí <110> SmithKline Beecham Biologicals s.a.

< 120> Novel Compounds <13O> BC45300 <160> 32 < 170> FastSEQ for Windows Version 3.0 <210> 1 <211> 1791 <212> DNA <213> Human <400> 1 gtaccttgct ttgggggcgc actaagtacc tgccgggagc agggggcgca ccgggaactc 60 gcagacttcg ccagttgggc gcactgggga tctgtggact gcgtccgggg gatgggctag 120 ggggacatgc gcacgctttg ggccttacag aatgtgatcg cgcgaggggg agggcgaagc ISO gtggcgggag ggcgaggcga aggaaggagg gcgCgagaaa ggcgacggcg gcggcgcgga 240 ggagggttat ctatacattt aaaaaccagc cgcctgcgcc gcgcctgcgg agacctggga 300 gagtccggcc gcacgcgcgg gacacgagcg tcccacgctc cctggcgcgt acggcctgcc 360 accactaggc ctcctatccc cgggctccag acgacctagg acgcgtgccc tggggagctg 420 cctggcggcg ccgtgccag· agcccccttg gggcgccaca gttttccccg tcgcctccgg 480 ttcctctgcc tgcaccttcc tgcggcgcgc cgggacctgg agcgggcggg tggatgcagg 540 cgcgatggac ggcggcacac cgcccaggtc cgcgeececc gcgecccccg tccctgtcgg 600 ctgcgctgcc cggcggagac ccgcgtcccc ggaactgttg cgctgcagcc ggcggcggcg 660 accggccacc gcagagaccg gaggcggcgc agcggccgta gcgcggcgca atgagcgcga 720 gcgcaaccgc gtgaagctgg tgaacttggg cttccaggcg ctgcggcagc acgtgccgca 780 cggcggcgcc agcaagaagc tgagcaaggt ggagaegctg cgctcagccg tggagtacat 840 ccgcgcgctg cagcgcctgc cggccgagca cgacgccgtg cgcaacgcgc tggcgggagg 300 gccgaggccg caggccgtgc ggccgtctgc gceccgcggg ccgccaggga ccaccccggt 960 cgccgcctcg ccctcccgcg cttcttcgtc cccgggccgc gggggcagct cggagcccgg 1020 ctccccgcgt tccgcctact cgtcggacga cagcggctgc gaaggcgcgc tgagtectgc 1080 ggagcgcgag ctactcgact tctccagctg gttagggggc tactgagcgc cctcgaccta 1140 tgagccccag ccccggaagc cgagcgagcg gccggcgcgc tcatcgccgg ggagcccgcc 1200 aggtggaccg gcccgegctc cgcccccagc gagccgggga cccacccacc accccccgca 1260 ccgccgacgc cgcctcgttc gtccggccca gcctgaccaa tgccgcggtg gaaacgggct 1320 cggagctggc cccacaaggg ctggcggctt cctccgacgc cgcccctccc cacagcttct 1380 cgaccgeagc ggggcggggg gcaccaacac ttggagattt ttccggaggg gagaggattt 1440 tccaagggca cagagaatcc attttctaca cattaacttg agctgctgga gggacactgc 1500 tggcaaacgg agacctattt ttgtacaaag aacccttgac ctggggcgta ataaagatga 1560 cctggacccc tgcccccact atctggagtt ttccatgctg gccaagatct ggacacgagc 1620 agtccctgag gggcggggtc cctggcgtga ggcecccgtg acagcccacc ctggggtggg 1680 tttgtgggca ctgctgctct gctagggaga agcctgtgtg gggcacacct cttcaaggga 1740 gcgtgaactt tataaataaa tcagttctgt ttaaaaaaaa aaaaaaaaaa a 1791 <210> 2 <211> 193

-50CZ 303468 B6 <212> PRT <213> Human <400> 2

Met Asp Cly Gly Thr Leu Pro Arg Ser Ala Pro Pro Ala Pro Pro Val

10 15

Pro Val Cly Cys Ala Ala Arg Arg Arg Pro Ala Ser Pro Glu Leu Leu 20 25 30

Arg Cys Ser Arg Arg Arg Arg Pro Ala Thr Ala Glu Thr Gly Gly Gly 35 40 45

Ala	Ala Ala Val Ala Arg Arg Asn
50	35
Leu 65	Val Asn Leu Gly	Phe Gin Ala 70
Gly	Ala Ser Lys Lys 95	Leu Ser Lys
Glu	Tyr Ile Arg Ala 100	Leu Gin Arg
Arg	Asn Ala Leu Ala 115	Gly Gly Leu 120
Ala	Pro Arg Gly Pro 130	Pro Gly Thr 135
Arg 145	Ala Ser Ser Ser	Pro Gly Arg 150
Pro	Arg Ser Ala Tyr 165	Ser Ser Asp
Ser Pro Ala Glu Arg ISO Tyr <210> 3 <211> 262 <212> PRT <213> Human <400> 3	Glu Leu Leu
Met 1	Ser Ala Pro Ala 5	Ala Arg ser
Ser	Arg Ala Leu Ser 20	Ser Pro Leu
Arg	Ala Pro Gin Asp 35	Ser Ala Arg 40
Ser	Arg Arg Asn Ala 50	Gly Ser Arg 55
Gly 65	Thr Lys Lys Arg	Gly Arg Ala 70
Ala	Ala Arg Gly Ala 85	Gin Thr Ala
Pro	Pro Ala Arg Cys 100	Ala Arg Arg
Ala	Arg Gly Cys Thr 115	Pro Arg Leu 120
Ala	Ser Cys Trp Arg 130	Arg Arg Ala 135
Ser 145	Pro Ser Ser Pro	Ala Ser Arg 150
Ala	Leu Arg Pro Leu 165	Arg Arg Leu
Ala	Ala Gly Cys Ser 180	Ala Thr Val
Gin	Arg Ser Arg Gin 195	Gly Arg Gly 200
Val	cys Arg Arg Pro 210	Ser Arg Leu 215
Arg 225	Arg Ala Ala Gly	Arg Cys Arg 230
Lys Ser	Leu Trp Arg Pro 245 Pro Gly His Ala	Lys Gly Ala Ser

Glu	Arg	Glu	Arg 60	Asn	Arg	Val	Lys
Leu	Arg	Gin 75	HiS	Val	Pro	His	Gly 80
val	Glu 90	Thr	Leu	Arg	Ser	Ala 95	Val
Leu 105	Leu	Ala	Clu	His	Asp 110	Ala	Val
Arg	Pro	Gin	Ala	val 125	Arg	Pro	Ser
Thr	Pro	Val	Ala 140	Ala	Ser	Pro	Ser
Gly	Gly	Ser 155	Ser	Glu	Pro	Gly	Ser 160
Asp	Ser 170	Gly	Cys	Glu	Gly	Ala 175	Leu
Asp 195	Phe	Ser	Ser	Trp	Leu 190	Gly	Gly

Ala	Ser 10	Gly	Ala	Glu	Ala	His 15	Arg
Thr 25	Ser	Trp	Arg	Ser	Arg 30	Val	Ala
Leu	Arg	Ser	Arg	Cys 45	Arg	Pro	Thr
Ala	Pro	Ser	Cya 60	Pro	Arg Gly	Pro
Arg	Arg	Arg 75	Pro	Gly Trp	Ser	Leu 90
Ala	Arg 90	Pro	Ala	Ala	Ser	Ala 95	Leu
Arg 105	Ala	Arg	Pro	Ala	Gly 110	Ala	Ala
ser	Ala	Ala	Ser	Pro 125	Pro	Cys	Ser
Ala	Arg	Ala	Ala 140	Ala	Ala	Pro	Gly
Gly	Cys	Ala 155	Arg	Ala	His	Cys	Ala 160
Arg	Ser 170	Leu	Arg	Trp	Pro	Val 175	Ala
Pro 195	siy	Thr	Arg	val	ser 190	Ala	Gly
Ala	Gin	Cly	Ala	Arg 205	Thr	Trp	Ala
HiS	Pro	Pro	Ala 220	Arg	Sec	Arg	Ser
Gin	Arg	Asn 2 35	Arg	Arg	Arg	Arg	Gly 240
Ser	Gly 250	Thr	Ala	Pro	Pro	Gly 255	Asn

260

-51 CZ 303468 B6

<210>	4
<211>	1830
<212>	DNA
<213>	Human
<400>	4

gtaccttgct ttgggggcgc actaagtacc tgccgggagc agggggcgca ccgggaactc 60 geagatttcg ccagttgggc gcactgggga tctgtggact gcgcecgggg gatgggctag 120 ggggacatgc gcacgctttg ggccttacag aatgtgaccg cgccgagggg gagggccgaa 180 gcgtggcggg agggcgaggc gaaggaagga gggcgtgag· aaggcgacgg cggcggcgcg 240 gaggagggtt atctatacat ttaaaaacca gccgcctgcg ccgcgcctgc ggagacctgg 300 gagagtccgg ccgcacgcgc gggaeacgag cgtcccacgc tccctggcgc gtacggcctg 360 ccaccactag gcctcctatc cccgggctcc agacgaccta ggacgcgtgc cctggggagt 420 cgcctggcgg cgccgtgcca gaagccccct tggggegcca cagttttcce cgtcgcctcc 480 ggttcctctg cctgcacctc cctgcggcgc gccgggacct ggagcgggcg ggtggatgca 540 ggcgcgacgg acggcggcac actgcccagg tccgcgecec ctgcgccccc cgtccctgtc 600 ggccgcgetg cccggcggag acecgcgtcc ccggaactgt tgcgctgcag ccggcggcgg €60 cgaccggcea ccgcagagac cggaggeggc gcagcggccg cagcgcggcg caaegagcgc 720 g&gcgcaacc gcgtgaagct ggtgaacttg ggcttccagg egctgcggca gcacgtgccg 780 cacggcggcg ccagcaagaa gctgagcaag gtggagaegc tgcgctcagc cgtggagtac 840 acccgegcgc tgcagcgcct gctggccgag cacgacgccg tgcgcaacgc getggcggga 900 gggccgaggc cgcaggccgt gcggecgtct gcgccccgcg ggccgccagg gaccaccccg 960 gtcgccgcct cgccctcccg cgcttcttcg cccccgggcc gcgggggcag ctcggagcec 1020 ggctccecgc gttccgccta ctcgtcggac gacagcggct gcgaaggcgc gctgagtcct 1080 gcggagcgcg agctactcga cttctccagc tggttagggg gctactgagc gccctcgacc 1140 taataagcct caagccccgg aaacccgagc gaacgggccg gcgcgcttca tcgccgggga 1200 agcccgccaa ggtggaccgg gcccgcgctc cgcccccagc gagccgggga cccacecacc 1260 accceccgca ccgccgacgc cgcctcgttc gtceggccea gectgaccaa tgccgcggtg 1320 gaaacgggct tggagctggc cccataaggg ctggcggctt cctccgacgc cgcccctccc 1380 eacagcttet cgactgcagt ggggeggggg gcaccaacac ttggagattt ttccggaggg 1440 gagaggattt tctaagggca cagagaaccc attttctaca cattaacttg agctgctgga 1500 gggacactgc tggcaaacgg agacctactt ttgtaeaaag aacccttgac ccggggcgta 1560 acaaagacga cctggaecee tgcccccact atctggagtt ttccatgctg gccaagatct 1620 ggacacgagc agtccccgag gggcggggtc cctggcgtga ggcccccgtg acagcce&cc 1680 ctggggtggg tttgtgggca ctgctgctct gctagggaga agcetgtgtg gggcacacct 1740 cttcaaggga gcgtgaactt tataaataaa tcagttctgt ttaaaaaaaa aaaaaaaaaa 1800 aaaaccgagg gggggcccgg agccaacaa* 1830 <210> 5 <211> 5873 ío <212> DNA <213> Human <40Q> 5 ggcaaacaga actgatttat ttataaagtc cacgctccct tgaagaggtg tgccccacac 60 aggcttctcc ctagcagagc agcagtgccc acaaacccac cccagggtgg gctgtcacgg 120 gggccteacg ccagggaccc cgcccctcag ggactgctcg tgtccagatc ttggccagca 180 tggaaaactc cagatagtgg gggcaggggt ccaggtcatc Cttattacgc cccaggtcaa 240 gggttctttg tacaaaaata ggtctccgtt tgccagcagt gtccctccag cagctcaagt 300 taatgtgtag aaaatggact ctctgtgecc ttagaaaatc ctctcccctc cggaaaaacc 360 tccaagtgtt ggtgcccccc gccceactgc agtcgagaag ctgtggggag gggcggcgtc 420 ggaggaagcc gcagcccatt atggggccag ctccaagccc gtttccaccg cggcattggt 480 caggctgggc ggacgaacga ggcggcgtcg gcggtgcggg gggcggtggg tgggtccccg 540 gctcgctggg ggcggagcag cgggccggtc cacctggcgg gctcccc 587 <210> 6 15 <211> 1791 <212> DNA <213> Human <400> 6 tttttttttt ttttttttta aacagaactg atttatttat aaagttcacg ctcccttgaa 60 gaggtgtgcc ccaeacaggc ttctccctag cagagcagca gtgcccacaa acccacccca 120 gggtgggctg tcacgggggc cteacgccag ggaccccgcc cctcagggac tgctegtgtc ISO cagatcttgg ccagcatgga aaactccaga cagtgggggc aggggtccag gtcatcttta 240 ttacgcecca ggtcaagggt tctttgtaca aaaacaggtc tccgtttgcc agcagtgccc 300 ctce&geage tcaagttaat gtgtagaaaa tggattctct gtgcccttag aaaatcctct 360 cccctccgga aaaatctcca agtgttggtg ccceccgcce caetgcagte gagaagctgt 420 ggggaggggc ggcgtcggag gaagccgcca gcecttatgg ggccagctcc aagcccgttt 480 ccaccgcggc actggtcagg ctgggccgga cgaacgaggc ggcgtcggcg gtgcgggggg 540 tggcgggtgg gtccccggct cgctgggggc ggagcgcggg ccggtecacc cggcgggctc 600 cceggcgatg agegcgocgg ccgctcgcce ggettccggg gctgaggccc ataggtcgag 660 ggcgctcagt agccccctaa ceagccggag aagtcgagca gctcgcgccc egcaggaccc 120 agcgcgecct cgcagccgcc gtcgtccgac gagtaggcgg aacgcgggga gccgggctcc 7Θ0 gagctgcccc cgcggcccgg ggacgaagaa gcgcgggagg gcgaggcggc gaccggggtg Θ40 gtccccggcg gcccgcgggg cgcagacggc cgcacggcct gcggcctcag cccccccgcc 900 agcgcgctgc gcacggcgtc gtgctcggcc agcaggcgct gcagcgcgcg gatgtactcc 960 acggctgagc gcagcgtctc caccttgctc agcttcttgc tggcgccgcc gtgcggcacg 1020 tgctgccgca gcgcctggaa gcccaagttc accagcttca cgcggttgcg ctcgcgctca 1080 ttgcgccgcg ctacggeege tgcgccgcct ccggtctctg cggtggccgg ccgccgccgc 1140 cggctgcagc gcaacagtcc cggggacgcg ggtctccgcc gggcagcgca gccgacaggg 1200 acggggggcg cagggggcgc ggacctgggc agtgtgccgc cgtccategc gcctgcatcc 1260 acccgcoogc tccaggtccc ggcgcgccgc aggaaggtgc aggcagagga accggaggcg 1320 acggggaaaa ctgtggcgcc ccaagggggc ttctggcacg gcgccgccag gcaactcccc 1380 agggcacgcg tcctaggtcg tctggagcce ggggatagga ggcctagtgg tggcaggccg 1440 tacgcgccag ggagegtggg acgctcgtgt cccgcgcgtg cggccggact ctcccaggtc 1500 tccgcaggeg cggcgcagge ggetggtttt taaatgtata gataaccctc ctccgcgccg 1560 ccgccgccgc ctttctcacg ccctccttcc ttcgcctcgc cctcccgcca cgcttcgccc 1620 tccccctcgc gcgatcacat cctgtaaggc ccaaagcgtg cgcatgtccc cctagcccat 1680 cccccggacg cagtccacag atccccagtg cgcccaactg gcgaaatctg cgagttcccg 1740 gtgcgccccc tgctcccggc aggtacttag tgcgccccca aagcaaggta c 1191

<210>	7
5	<211> <212> <213>	361 PRT Human
	<400>	7

Met Cya Arg tys Trp Ile Leu Cys Ala Leu Arg tys Ser Ser Pro Leu

1 Arg

tys

Asn

Leu

5 Gin

Val

Leu

val

Pro

10 Pro

Ala

Pro

Leu

Glu

15 Ser

Arg

Ser

Cya

Gly

20 Glu

Gly Arg Arg

25 Arg Arg

tys

Pro

Pro

Ala

30 Lau

Met

Gly

Pro

Ala

35 Pro

Ser

Pro

Phe

Pro

40 Pro

Arg

His

Trp

Ser

45 Gly Trp

Ala

Gly

Arg

50 Thr

Arg

Arg

Arg

Arg

55 Arg

Cya

Gly

Gly

Trp

60 Trp

Val

Gly

Pro

Arg

65 Leu

Ala

Cly

Gly Gly

70 Ala

Arg

Ala

Arg

Ser

75 Thr

teu

Ala

Gly

Phe

80 Pro

Gly Asp

Glu

Ala

BS Arg

Arg

Pro

Val

Arg

90 ser

Gly

Phe

Arg

Gly

95 teu

Arg

Leu

Ile

Arg

100 Ser

Arg

Ala

Leu

Ser

105 Ser

Pro

teu

Thr

Ser

110 Trp

Arg

Ser

Arg

Val

115 Ala

Arg

Ala

Pro

Gin

120 Asp

Ser

Ala

Arg

teu

125 Arg

ser

Arg

Cys

Arg

130 Pro

Thr

ser

Atg

Arg

135 Asn

Ala

Gly

Ser

Arg

140 Ala

Pro

Ser

Cys

Pro

145 Arg

Gly

Pro

Gly

Thr

150 Lys

Lys

Arg

Gly Arg

155 Ala

Arg

Arg

Arg

Pro

160 Gly

Trp

ser

Leu

Ala

165 Ala

Arg Gly

Ala

Gin

170 Thr

Ala

Ala

Arg

Pro

175 Ala

Ala

Ser

Ala

teu

180 Pro

Pro

Ala

Arg

Cys

185 Ala

Arg

Arg

Arg

Ala

190 Arg

Pro

Ala

Gly

Ala

195 Ala

Ala

Arg

Gly

Cys

200 Thr

Pro

Arg

teu

Ser

20S Ala

Ala

Ser

Pro

Pro

210 cys

Ser

Ala

Ser

Cys

215 Trp

Arg

Arg

Arg

Ala

220 Ala

Arg

Ala

Ala

Ala

225 Ala

Pro

Gly

Ser

Pro

230 Ser

Ser

Pro

Ala

Ser

235 Arg

Gly

Cys

Ala

Arg

240 Ala

HIS

Cys

Ala

Ala

245 Leu

Arg

Pro

teu

Arg

250 Arg

Leu

Arg

Ser

teu

255 Arg

Trp

Pro

Val

Ala

260 Ala

Ala

Gly

Cys

Ser

265 Ala

Thr

Val

Pro

Gly

270 Thr

Arg

Val

Ser

Ala

275 Gly

Gin

Arg

Ser

Arg

280 Gin

Gly

Arg

Gly

Ala

2S5 Gin

Gly

Ala

Arg

Thr

290 Trp

Ala

val

Cys

Arg

295 Arg

Pro

Ser

Arg

Leu

300 l Hia

i Pro

Pro

i Ala

Arg

305 Ser

Arg

Ser

Arg

Arg

310 Ala

Ala

Gly Arg

Cys

315 Arg

1 r Gin Arg

Asn

t Arg

320 i Arg

Arg

Arg

Gly

Lys

325 Leu

Trp

Arg

Pro

tys

330 Gly

Ala Ser Gly

335 Thr Ala

1 i Pro

Pro

Gly

Asn

340 Ser

Pro

Gly

His

Ala

345 Ser

350

355 360

-53CZ 303468 B6 <210> 8 <211> 849 <212> DNA <213> Influenza virus & human <400> 8 atggatccaa cgagttgcag aaatccctaa ggaaagcaga atggacggcg gctgccegge gccaccgcag aaccgcgega ggcgccagca gcgctgcagc aggccgcagg gcetcgccct ccgcgttccg cgcgagctac caccactaa acactgtgtc accaagaact gaggaagggg tagtggagcg gcacactgce ggagacccgc agaccggagg agctggtgaa agaagetgag gcctgctggc ccgtgcggcc cccgcgcttc cctactcgtc tcgacttctc aagctttcag aggtgatgcc cagcaccctc gattctgaaa caggtecgcg gtccccggaa cggcgeagcg ettgggette caaggtggag cgagcacgac gtctgcgccc ttcgtccccg ggacgacagc cagctggtta gtagattgct ccattccttg ggtctggaca gaagaatccg ccccctgcgc ctgttgcgct gccgtagcgc caggcgctgc aegctgcgct gccgtgcgca cgcgggccge ggccgcgggg ggctgcgaag gggggctaca ttctttggca atcggcttcg tcgagacagc atgaggcact eccecgtcec gcagccggcg ggcgcaatga ggeagcacgt cagccgtgga acgcgctggc cagggaccac gcagctcgga gcgcgctgag ctagrggcca tgtccgcaaa ccgagatcag cacacgtgct taaaatgacc tgccggctgc gcggcgaccg gcgcgagcgc gccgcacggc gtacacccgc ggqagggctg cccggtcgcc gcccggctcc tcctgcggag ccatcaccat €0

120

190

240

300

360

420

490

540

600

660

720

790

940

949

<210>	9
<211>	849
<212>	DNA
<213>	Influenza virus & human

<400> 9 atggatccaa cgagttgcag aaatccctaa ggaaagcaga atggacggcg gctgcccgtc gccaccgcag aaccgcgega ggcgccagca gcgctgcagc aggccgcagg gcetcgccct ccgcgttccg cgcgagctac caccattaa acactgtgtc accaagaact gaggaagggg tagtggagcg gcaccctgcc gccgtcccgc agaccggagg agctggtgaa agaagetgag gcctgctggc ccgtgcggcc cccgcgcttc cctactcgtc tcgacttctc aagctttcag aggtgatgcc cagcaccctc gattctgaaa gcgttccgcg gtccccggaa cggcgeagcg ettgggette caaggtggag egagcaegac gtctgcgccc ttcgtccccg ggacgacagc cagctggtta gtagattgct ccattccttg ggtctggaca gaagaatccg ccgccggcgc ctgctgcget gccgtagcgc caggcgctgc acgctgcgct gccgtgcgca cgcgggccgc ggccgcgggg ggctgcgaag gggggctaca ttctttggca atcggcttcg tcgagacagc atgaggcact egccagttcc gcagccgtcg ggcgcaatga ggeagcacgt cagccgtgga acgcgctggc cagggaccac gcagctcgga gcgcgctgag ctagtggcca tgtccgcaaa ccgagatcag cacacgtgct taaaatgacc ggttggctgc ccgtcgcccg gcgcgagcgc gccgcacggc gtaeatecgc gggagggctg cccggtcgcc gcccggctcc tcctgcggag ccatcaccat

120

ISO

240

300

360

420

490

540

600

660

720

780

940

949 <210> 10 <211> 282 <212> PRT <213> Influenza virus & human <400 10

Met

Asp

Pro

Asn

Thr

Val

Ser

Ser

Phe

Gin

Val

Asp

Cys

Phe

Leu

Trp

1

5

10

15

His

val

Arg

Lya

Arg

Val

Ala

Asp

Gin

Glu

Leu

Gly

Asp

Ala

Pro

Phe

20

25

30

Leu

Asp

Arg

Leu

Arg

Arg

Asp

Gin

Lys

Ser

Leu

Arg

Gly

Arg

Gly

Ser

35

40

45

Thr

Leu

Gly

Leu

Asp

Ile

Glu

Thr

Ala

Thr

Arg

Ala

Gly

Lys

Gin

Ile

- 54 CZ 303468 B6

50	35	60
Val Glu Arg	lle Leu Lys Glu Glu Ser	Asp Glu Ala Leu Lys Met Thr
65	70	75 80
Met Asp Gly	Gly Thr Leu Pro Arg Ser	Ala Pro Pro Ala Pro Pro Val
	85	90 95
Pro Val Gly	Cys Ala Ala Arg Arg Arg	Pro Ala Ser Pro Glu Leu Leu
	100 105	110
Arg Cys Ser	Arg Arg Arg Arg Pro Ala	Thr Ala Glu Thr Gly Gly Gly
115	120	125
Ala Ala Ala	Val Ala Arg Arg Asn Glu	Arg Glu Arg Asn Arg Val Lys
130	135	140
Leu Val Asn	Leu Gly Phe Gin Ala Leu	Arg Gin His Val Pro His Gly
145	150	155 160
Gly Ala Ser	Lys Lys Leu Ser Lys Val	Glu Thr Leu Arg Ser Ala Val
	165	170 175
Glu Tyr lle	Arg Ala Leu Gin Arg Leu	Leu Ala Glu His Asp Ala Val
	180 185	190
Arg Asn Ala	Leu Ala Gly Gly Leu Arg	Pro Gin Ala Val Arg Pro Ser
195	200	205
Ala Pro Arg	Gly Pro Pro Gly Thr Thr	Pro Val Ala Ala Ser Pro Ser
210	215	220
Arg Ala Ser	Ser Ser Pro Gly Arg Gly	Gly Ser Ser Glu Pro Gly Ser
225	230	235 240
Pro Arg Ser	Ala Tyr Ser Ser Asp Asp	ser Gly Cys Glu Gly Ala Leu
	245	250 255
Ser Pro Ala	Glu Arg Glu Leu Leu Asp	Phe Ser Ser Trp Leu Gly Gly
	260 265	270
Tyr Thr Ser	Gly His His His His His	His

275 280 <210> 11 <211> 193 <212> PRT <213> Human <400> 11

Met Tyr ser Thr Ala Glu Arg	Ser Val Ser Thr Leu	Leu Ser	Phe	Leu
1 5	10		15
Leu Ala Pro Pro Cys Gly Thr	Cys Cys Arg Ser Ala	Trp Lys	Pro	Lys
20	25	30
Phe Thr Ser Phe Thr Arg Leu	Arg Ser Arg Ser Leu	Arg Arg	Ala	Thr
35	40	45
Ala Ala Ala Pro Pro Pro Val	Ser Ala Val Ala Gly Arg Arg	Arg	Arg
50 53	60
Leu Gin Arg Asn Ser Ser Gly	Asp Ala Gly Leu Arg	Arg Ala	Ala	Gin
65 70	75			90
Pro Thr Gly Thr Gly Gly Ala	Gly Gly Ala Asp Leu	Gly Ser	Val	Pro
35	90		95
Pro Ser lle Ala Pro Ala Ser	Thr Arg Pro Leu Gin	val Pro	Ala	Arg
100	105	110
Arg Arg Lys Val Gin Ala Glu	Glu Pro Glu Ala Thr	Gly Lys	Thr	Val
115	120	125
Ala Pro Gin Gly Gly Phe Trp	His Gly Ala Ala Arg	Gin Leu	Pro	Arg
130 135	140
Ala Arg Val Leu Gly Arg Leu	Glu Pro Gly Asp Arg	Arg Pro	Ser	Gly
145 150	155			160
Gly Arg Pro Tyr Ala Pro Gly	Ser Val Gly Arg Ser	Cys Pro	Ala	Arg
165	170		17S
Ala Ala Gly Leu Ser Gin Val	Ser Ala Gly Ala Ala	Gin Ala	Ala	Gly
180	185	190

Phe
<210>	12
<211>	263
<212>	PRT
<213>	Mouše

<400> 12

Mae 1

Glu

Ala

His

Leu 5

Asp

Trp

Tyr

Gly

val 10

Pro

Gly

Lau

Gin

Glu 15

Ala

Ser

Asp

Ala

cya 20

Pro

Arg

Glu

Ser

Cys 25

Ser

ser

Ala

Leu

Pro 30

Glu

Ala

Arg

Glu

Gly 35

Ala

Asn

Val

His

Phe 40

Pro

Pro

His

pro

Val 45

Pro

Arg

Glu

His

Phe 50

Sex

Cys

Ala

Ala

Pro 55

Glu

Lau

Val

Ala

Gly 60

Ala

Gin

Gly

Leu

Asn 65

Ala

Sar

Leu

Met

Asp 70

Gly

Gly

Ala

Leu

Pro 75

Arg

Lau

Met

Pro

Thr 90

Sar

ser

Gly

Val

Ala 95

Gly

Ala

Cys

Ala

Ala 90

Arg-Arg Arg

Gin

Ala 95

Ser

Pro

Glu

Leu

Leu 100

Arg

Cys

Sar

Arg

Arg 105

Arg

Arg

Ser

Gly

Ala 110

Thr

Glu

Ala

Ser

Ser 115

Ser

Ser

Ala

Ala

Val 120

Ala

Arg

Arg

Asn

Glu 125

Arg

Glu

Arg

Asn

Arg 130

Val

Lys

Leu

Val

Asn 135

Leu

Gly

Phe

Gin

Ala 140

Lau

Arg

Gin

His

Val 145

Pro

His

Gly

Gly

Ala 150

Asn

Lys

Lys

Leu

Sar 155

Lys

Val

Glu

Thr

Lau 160

Arg

Ser

Ala

val

Glu 165

Tyr

Ile

Arg

Ala

Leu 170

Gin

Arg

Leu

Lau

Ala 175

Glu

His

Asp

Ala

Val 190

Arg

Ala

Ala

Leu

Ala 195

Gly Gly

Leu

Leu

Thr 190

Pro

Ala

Thr

Pro

Pro 195

Ser

Asp

Glu

Cys

Ala 200

Gin

Pro

sar

Ala

Ser 205

Pro

Ala

Ser

Ala

ser 210

Leu

Ser

Cys

Ala

Sar 215

Thr

Sar

Pro

sar

Pro 220

ASP

Arg

Lau

Gly

Cys 225

Ser

Glu

Pro

Thr

Ser 230

Pro

Arg

Sar

Ala

Tyr 235

Sar

Ser

Glu

Glu

Ser 240

Ser Ser

Cys Ser

Glu Trp

Gly Leu 260

Glu 245 Gly

Leu Gly

Sar Tyr

Pro

Mat

Glu 250

Gin

Glu

Leu

Lau

Asp 255

Phe

<210>	13
<211>	1051
<212>	DNA
<213>	Mouše
<400>	13

gcccggagca tggaagcacg tcagctaggc catgaactgc acccgggagg ggtgggggtg gaagcgcacg gtgtcagctt tgcagaatgt gtacaccaag gggagggcga ggcgaaggaa ggagggcgta agaaaggagg cggtggcggg gcggaggaga ttatctatac tttttaaaaa aaaggagcct cctagcegcg caaaggagac ttggggagcg cctgacagca cgcgcgggac aegagagtac cacgcttccc tactettttc agacettgac tggtacgggg tcccaggact gcaggaggcc agcgacgcgt gccetaggga gtcctgcagc agegccctgc ctgaggcccg cgaaggtgca aacgtccact tcccaccgca cccggttcct cgcgagcact tttcctgtgc cgeaccagaa etegtagcag gggcccaggg gctgaatgca agcttgatgg acggcggcgc gctgcccaga etcatgccca cctcgtctgg agtcgctgga gcctgcgctg ctcggcggag acaagcgtct ccggaattgc tgcgctgcag ccggcggcgg cgatctggag caaccgaggc cagcagcagc tcggcgtccg tggcacgccg caatgagcgc gagcgcaacc gcgtaaagct ggtaaacttg ggcctccagg cgctgcggca gcacgtgccg cacggcggcg ccaacaagaa gccgagtaag gcggagacgc tgcgctccgc ggtagagtac attcgtgcgc tgcagcggct gctcgcagag cacgacacgg tgcggccggn gctcgctggg gggctgttaa cacccgctac tccgccgtcc gatgaqtgca cgcagccctc tgcctcccct gccagcgggt ctctgtcctg cgcctctacg tctccgtccc ggaccctggg ctgctctgag cctacccccc cgcgctccgc ctactcgtcg gaggaaagca gctgcgaggg agagctaagc ccgatggagc aggagctgct tgacttttcc agttggttag ggggctactg a

120

180

240

300

360

420

480

540

600

660

720

780

840

900

960

1020

1051

<210>	14
<21 1>	260
<212>	PRT
<213>	Rat
<400>	14

Met Glu Ser His Phe Asn Trp Tyr Gly Val Pro Arg Leu Gin Lys Ala 15 10 15

Ser Asp Ala Cys Pro Arg Glu Ser Cys Ser Ser Ala Leu Pro Glu Ala 20 25 30

Arg Glu Gly Ala Asn Val His Phe Pro Pro Hle Pro Val Pro Arg Glu 35 40 45

His Phe Ser Cys Cly Ala Pro Lys Pro val Ala Gly Al* Pro Ala Leu

55 60

Asn Ala Ser Leu Het Asp Gly Gly Ala Leu Pro Arg Leu Val Pro Thr

70 75 80

Ser - Ser Gly Val Ala Gly Ala Cys Thr-Ala Arg Arg Arg Pro Pro Ser

90 95

Pro Glu Leu Leu Arg Cys ser Arg Arg Arg Arg Ser Gly Ala Thr Glu

100 105 110

Ala Ser Ser Ser Ser Ala Ala Val Ala Arg Arg Asn Glu Arg Glu Arg

115 120 125

Asn Arg Val Lys Leu Val Asn Leu Gly Phe Gin Ala Leu Arg Gin His

130 135 140

Val Pro His Gly Gly Ala Asn Lys Lys Leu Ser Lys Val Glu Thr Leu

145 150 155 160

Arg Ser Ala Val Glu Tyr Ile Arg Ala Leu Gin Arg Leu Leu Ala Glu

165 170 175

His Asp Ala val Arg Ala Ala Leu Ser Gly Gly Leu Leu Thr Pro Ala

180 185 190

Thr Arg Pro Ser Asp Val Cys Thr Gin Pro Ser Ala Ser Pro Ala Ser

195 200 205

Ala Ser Leu Ser Cys Thr Ser Thr Ser Pro Asp Arg Leu Gly Cys Ser

210 215 220

Glu Pro Ala Ser Pro Arg Ser Ala Tyr Ser Ser Glu Asp Ser Ser Cys

225 230 235 240

Glu Gly Glu Thr Tyr Pro Met Gly Gin Met Phe Asp Phe Ser Asn Trp

245 250 255

Leu Gly Gly Tyr 260 <210> 15 <21l> 1526 <212> DNA <213> Rat <400> 15 ttcaccegge tgcaagcgot aggtgtacgg agacctggea gctcttgggg cttaaggact 60 gagcrccaga gccggtggag gttcctgtgg agtacattcg gaccctctca cagcccccga 120 gagtgcggga cgtgcggagc gcagttcggg atctgcactc gaggacttgt cgaggacgca 180 ttaagctaag catctgetcg gagcatggaa tcgcacttta actggtacgg ggtcccaagg 240 ctceagaagg ctagcgacgc gtgccctagg gaatcctgca geagtgccct gcctgaggcc 300 cgtgaaggtg cgaacgtcca cttcccaccg cacccggttc ctcgcgagca cttttcctgt 360 ggcgcaccga aacccgtagc gggggccccg gcgctgaatg caagcttgat ggacggcggc 420 gcgctgccca gactcgtgcc cacctcgtct ggagtcgctg gagcctgeac tgcteggegg 480 agacccccgt ccccggaact gcttcgctgc agccgacggc ggcgatcggg agcaaccgag 540 gccagcagca gctcggcggc cgtggcacgc cgeaatgagc gtgagcgcaa ccgcgtaaag 600 ctggtaaact tgggcttcca ggcgctgcgg cagcacgtgc cgcacggcgg cgccaacaag 660 aagctgagta aggtggagac gctgcgetcc gcggtagagt acatccgtgc gctgeagegg 720 ctgctagcag agcacgacgc ggtgcgtgct gcgctctctg ggggtctatt aacacccgct 780 actcggccgt ccgatgtgtg cacgcagccc tccgcctccc ctgccagcgc gtctctgtcc 940 tgcacctcta catccccaga ccgcctaggc tgctccgagc ctgcctctcc gcgctccgcc 900 tactcgtcgg aggacagcag etgcgaggga gagacttace cgacggggca gacgtttgac 960 ttttccaatt ggttaggggg ctactgagca ccccacaccc ctaagctgcg tccctgggtg 1020 tcccctggtg gacctacctg cgtttcttgc ccaggaaacc tgggcccatg ccttacccat 1080 gctgtctagt gcagcctgac caaatgccaa gtactgacct ctgctcggcc tccacgccgc 1140 ggaatgacat ctteeatctc ccagteettg ccgaaccagg acttggaaat ttetcaggag 1200 aaagaatttt acaatgacaa tctgcttttt atcaattaac ttgaactgct ggaggactct 1260 gctgaaaata tgaagaatta tttttataca aaggatcctt aagcttggag cacaataaag 1320 atgacctctg tctctcaccc ccactgtcta gaactttcca acctggccaa agtgtggacg 1380 ggtcgggccc tgagggeaag atgcctggct gcacccttet teetctcecg aagcctatcc 1440 tgacgctgat gtttggccag tgtgggaacc ctgctattgc aaagtgtact attctataaa 1500 agttgttttt cattggaaeg gaatte 1526 <210> 16 io <211> 10 <212> PRT

-57CZ 303468 B6 <213> Human <400> 16

Lys Leu Val Asn Leu Gly Phe Gin Ala Leu 15 10 <210> 17 <211> 9 <212> PRT <213> Human <400> 17

Glu Leu Leu Asp Phe Ser Ser Trp Leu i 5 <210> 18 <211> 9 <212> PRT <213> Human <400> 18

Arg Leu Leu Ala Glu His Asp Ala Val 1 5 <210> 19 <211> 9 <212> PRT <213> Human <400> 19

Lys Leu Val Asn Leu Gly Phe Gin Ale 1 5 <210> 20 <211> 9 <212> PRT <213> Human <400> 20

Glu Tyr Ile Arg Ala Leu Gin Arg Leu 1 5 <210> 21 <211> 10 <212> PRT <213> Human <400> 21

Glu Tyr Ile Arg Ala Leu Gin Arg Leu Leu 1 5 10 <210> 22 <211> 10 <212> PRT <213> Human <400> 22

Ala Val Arg Asn Ala Leu Ala Gly Gly Leu 1 5 10 <210> 23 <211> 10 <212> PRT <213> Human

-58CZ 303468 B6

<400> 23 Ser Glu Pro Gly Ser Pro Arg Ser Ala Tyr
1	s	10
<210>	24
<211>	10
<212>	PRT
<213>	Human
<400>	24
Val Glu Thr Leu Arg Ser Ala	Val Glu Tyr
1	5	10
<210>	25
<211>	9
<212>	PRT
<213>	Human
<400	25
lle Arg Ala Leu Gin Arg Leu	Leu Ala
1	5
<210>	26
<211>	9
<212>	PRT
<213>	Human
<400>	26
Leu Arg	Pro Gin Ala Val Arg	Pro Ser
1	5
<210>	27
<211>	9
<212>	PRT
<213>	Human
<400>	27
Leu Arg Gin His Val Pro His	Gly Gly
1	5
<210	28
<211>	9
<212>	PRT
<213>	Human
<400>	28
Leu Gly Phe Gin Ala* Leu Arg	Gin His
1	5
<210>	29
<211>	9
<212>	PRT
<213>	Human
<400>	29
Val Arg Asn Ala Leu Ala Gly	Gly Leu
1	5
<210>	30
<211>	9
<212>	PRT
<213>	Human
<400>	30

-59CZ 303468 B6

Tyr II· Arg Ala Leu Gin Arg Leu Leu 1 5 <210> 31 <211> 9 <212> PRT <213> Human <400> 31

Leu Val Asn Leu Gly Phe Gin Ala Leu 1 5 <210> 32 <211> 9 io <212> PRT <213> Human <400> 32

Val Glu Tyr Ile Arg Ala Leu Gin Arg 1 5 <210> 33 <211> 9 <212> PRT <213> Human <400> 33

Leu Leu Arg Cys Ser Arg Arg Arg Arg 1 5

Claims (10)

1. Imunogenní směs obsahující polypeptid CASB7439, který obsahuje aminokyselinovou sekvenci, která má alespoň 70% identitu s aminokyselinovou sekvencí SEQ ID NO: 2 nebo SEQ ID NO: 10 po celé délce SEQ ID NO: 2 nebo SEQ ID NO: 10, nebo imunogenní fragment poly30 peptidu CASB7439, kde fragment obsahuje aminokyselinovou sekvenci jedné nebo více ze SEQ ID NO: 16 až SEQ ID NO: 33, a farmaceuticky přijatelný nosič, pro použití v lékařství.

2. Imunogenní směs obsahující polynukleotid kódující polypeptid CASB7439 nebo jeho fragment podle nároku 1, kde polynukleotid je zvolený ze skupiny obsahující SEQ ID NO:8 a SEQ

35 ID NO: 9; a farmaceuticky přijatelný nosič, pro použití v lékařství.

3. Imunogenní směs obsahující účinné množství buněk prezentujících antigen, modifikovaných vnesením in vitro polypeptidů CASB7439 podle nároku 1, nebo geneticky modifikovaný in vitro pro expresi polypeptidů CASB7439 podle nároku 1, a farmaceuticky účinný nosič.

4. Farmaceutická směs obsahující polypeptid CASB7439, který obsahuje aminokyselinovou sekvenci, která má alespoň 70% identitu s aminokyselinovou sekvencí SEQ ID NO: 2 nebo SEQ ID NO: 10 po celé délce SEQ ID NO: 2 nebo SEQ ID NO: 10, nebo imunogenní fragment CASB7439, kde fragment obsahuje aminokyselinovou sekvenci jedné nebo více ze SEQ ID NO:

45 16 až SEQ ID NO: 33, a farmaceuticky přijatelný nosič, pro použití v lékařství.

-60CZ 303468 B6

5. Farmaceutická směs obsahující polynukleotid kódující polypeptid CASB7439 nebo jeho fragment podle nároku 4, kde polynukleotid je zvolený ze skupiny obsahující SEQ ID NO: 8 a SEQ ID NO: 9; a farmaceuticky přijatelný nosič, pro použití v lékařství.

5

6. Farmaceutická směs obsahující účinné množství buněk prezentujících antigen, modifikovaných vnesením in vitro polypeptidů CASB7439 podle nároku 4, nebo geneticky modifikovaných in vitro pro expresi polypeptídu CASB7439 podle nároku 4, a farmaceuticky účinný nosič.

7. Imunogenní nebo farmaceutická směs podle nároku 1 nebo 4, která dále obsahuje adjuvans io indukující TH-1.

8. Imunogenní nebo farmaceutická směs podle nároku 7, ve které adjuvans indukující ΤΗ—I je zvoleno ze skupiny adjuvans obsahující: 3D-MPL, QS21, směs QS21 a cholesterolu a oligonukleotid CpG nebo směs dvou nebo více uvedených adjuvans.

9. Použití farmaceutické nebo imunogenní směsi podle kteréhokoli z nároků 1 až 8, při výrobě vakcíny pro imunoterapeutické léčení pacienta trpícího karcinomem nebo citlivého na karcinom, ve kterém karcinom je rakovina kolonu, nebo jiné tumory asociované skolonem, nebo jiná onemocnění asociovaná s kolonem.

10. Farmaceutická nebo imunogenní směs podle kteréhokoli z nároků 1 až 8, pro použití při imunoterapeutickém léčení pacienta trpícího karcinomem nebo citlivého na karcinom, ve kterém karcinom je rakovina kolonu nebo jiné tumory asociované skolonem, nebo jiná onemocnění asociovaná s kolonem.