CZ20021449A3 - L-Pantolakton hydroláza a způsob přípravy D-pantolaktonu - Google Patents

L-Pantolakton hydroláza a způsob přípravy D-pantolaktonu Download PDF

Info

Publication number
CZ20021449A3
CZ20021449A3 CZ20021449A CZ20021449A CZ20021449A3 CZ 20021449 A3 CZ20021449 A3 CZ 20021449A3 CZ 20021449 A CZ20021449 A CZ 20021449A CZ 20021449 A CZ20021449 A CZ 20021449A CZ 20021449 A3 CZ20021449 A3 CZ 20021449A3
Authority
CZ
Czechia
Prior art keywords
ala
leu
gly
asp
pantolactone
Prior art date
Application number
CZ20021449A
Other languages
English (en)
Inventor
Maria Kesseler
Bernhard Hauer
Thomas Friedrich
Ralf Mattes
Original Assignee
Basf Aktiengesellschaft
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Priority claimed from DE19952501A external-priority patent/DE19952501A1/de
Priority claimed from DE10029194A external-priority patent/DE10029194A1/de
Application filed by Basf Aktiengesellschaft filed Critical Basf Aktiengesellschaft
Publication of CZ20021449A3 publication Critical patent/CZ20021449A3/cs

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/52—Genes encoding for enzymes or proenzymes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P17/00—Preparation of heterocyclic carbon compounds with only O, N, S, Se or Te as ring hetero atoms
    • C12P17/02—Oxygen as only ring hetero atoms
    • C12P17/04—Oxygen as only ring hetero atoms containing a five-membered hetero ring, e.g. griseofulvin, vitamin C
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/16—Hydrolases (3) acting on ester bonds (3.1)
    • C12N9/18—Carboxylic ester hydrolases (3.1.1)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P41/00—Processes using enzymes or microorganisms to separate optical isomers from a racemic mixture
    • C12P41/003—Processes using enzymes or microorganisms to separate optical isomers from a racemic mixture by ester formation, lactone formation or the inverse reactions
    • C12P41/005—Processes using enzymes or microorganisms to separate optical isomers from a racemic mixture by ester formation, lactone formation or the inverse reactions by esterification of carboxylic acid groups in the enantiomers or the inverse reaction

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)

Description

Oblast techniky
Tento vynález se týká proteinů, které mají enzymatickou aktivitu pro hydrolýzu L-pantolaktonu. Vynález se dále týká nukleových kyselin, které kódují tyto proteiny, konstruktů nukleových kyselin, vektorů, geneticky modifikovaných mikroorganismů a způsobu přípravy D-pantolaktonu.
Dosavadní stav techniky
D-Pantolakton je prekursor při chemické syntéze a biosyntéze pantothenové kyseliny, panthenolu a pantetheinu a jejich derivátů. Tyto látky se používají jako vitaminové doplňky v lidské dietě, v potravě pro zvířata, v lékařství, například pro hojení vředů a v kosmetice, například ve vlasové kosmetice. Ekonomický způsob syntézy enantiomerně čistého D-pantolaktonu má proto velký význam. Vedle chemických způsobů, které se dlouhou dobu používají pro přípravu D-pantolaktonu se od nedávné doby rovněž vypracovávají různé biotechnologické způsoby. Přehled o pantolaktonu a jeho chemické syntéze lze najít v Ullmannově publikaci Encyclopedia of Industrial Chemistry (sv. A27, VCH Verlaggesellschaft mbH, 69451 Weinheim, str. 559 až 566 (1996) ) .
Pro biotechnologickou syntézu pantolaktonu se používají různé strategie syntézy.
Štěpení racemátu selektivní hydrolýzou O-acetylpantolaktonu za použití lipáz nebo esteráz je popsáno Glánzerem a kol. (Enzyme Microb. Technol., 10, 689 až 690, (1988)). Štěpení racemátu tohoto typu je předmětem patentových nároků ··· ·· ·· ·«···· v patentech DE 40 05 150 a EP-A-0 507 278. Enantiomerní čistota, které lze tímto způsobem dosáhnout, je pro průmyslové využití nedostatečná.
Degussa popsal přípravu pantolaktonu za použití enzymu oxynitrilázy, která vychází z hydoxypivalaldehydu a hydrokyanové kyseliny přes opticky čistý kyanhydrin hydroxypivalaldehydu (DE 41 26 580, EP-A-0 528 256, DE 41 39 987). V této reakci lze teoreticky dostat 100% výtěžnost. Nevýhodami této reakce je velké množství enzymu, které je nutné (ekvimolární množství enzymu a substrátu) a relativně nízká enantiomerní čistota produktu (maximálně 82% ee).
JP 47019745 popisuje syntézu D-pantolaktonu za použití Arthrobakteru, Brevibakterie, Bacillu nebo Korynebakterie. V této reakci uvedené organismy konvertují racemický pantolakton na D-pantolakton metabolizací L-pantolaktonu, Nevýhodou tohoto způsobu je, že polovina prekursoru se metabolizuje a tak ztratí.
Mitsubishi Chemical Ind. a Ube Ind. nárokují způsob přípravy D-pantolaktonu z D,L-pantolaktonu (JP 6067320, JP 62294092, JPP 62294096, JP 57152895). V těchto způsobech jsou popsány hydrolázy L-pantolaktonu z kvasinek
Rhodotorula, Sporidiobolus a Sterigmatomyces. Nicméně ze současného pohledu (viz Yamada a Shimizu, Ann. Ν. Y. Acad. Sci. 672 (1992) v Enzyme Eng. XI, Clark a kol., 372 až 386; Chimia, 47, 5 až 10 (1993), JP 62187426; JP 61293384; JP 61293386; Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 27, 622 až 642 (1988), Chemical Aspects of Enzyme Biotechnology, eds. T. 0. Baldwin a kol., Plenům Press, New York, 151 až 163 (1990)), potvrzeného vlastními studiemi původců tohoto vynálezu, je pochybné zda v těchto kvasinkách probíhá přímá hydrolýza L-pantolaktonu. Spíše reakce probíhá přes ketopantolakton, který je přeměněn pomocí oxidoreduktáz ketopantoátu na fc ·
L-pantolakton. Ve vlastních studiích původců je možno detekovat ketopantolakton jako meziprodukt, z čehož vyplývá, že neprobíhá žádná přímá hydrolýza na L-pantolakton. Nevýhodou tohoto způsobu je nízká koncentrace pantolaktonu, kterou lze takto přeměnit.
Tato reakce přes ketopantolakton a oxidoreduktázy ketopantoátu byla rovněž popsána u bakterií (např. Yamada a Shimizu, viz výše; Shimizu a kol., J. Biol. Chem., 263,
12077 až 12084 (1988), Kataoka a kol., Eur. J. Biochem.,
204, 799 až 806 (1992)). Ačkoli příslušné způsoby enantioselektivní syntézy D-pantolaktonu z D,L-pantolaktonu přes ketopantolakton a ketopantoát mají výhodu vysoké výtěžnosti (teoreticky 100%, dosažená 90,5% s Rhodokokem, viz dále), jsou neekonomické pro nutné kofaktory (NADH nebo NADPH), kultivaci na energetickém substrátu (glukose) , nízký výtěžek v prostoru a čase a nízké konečné koncentrace (18,2 až 72 g/1 D-pantolaktonu). Další nevýhodou takového způsobu je to, že oba zúčastněné enzymy mají obvykle jiné optimální podmínky přeměny, což je problém, který nevzniká při použití pouze jednoho (hydrolytického) enzymu.
Fuji ve spolupráci s Yamadovou výzkumnou skupinou na Kyotské universitě vyvinul způsob enzymatického štěpení racemátu za použití fungální hydrolázy D-pantolaktonu (JP 09308-497, JP 11056356, EP-B-0 436 730, EP-B-0 504 421, EP-A-0 794 251, WO 92/06182, WO 97/10341, US 5 275 949, US 5 372 940). Enzym lze izolovat například z hub Cylindrocarpon tonkinense, Gibberella fujikuroi a Fusarium oxysporum. Hydroláza D-pantolaktonu je glykosylovaný enzym, který se skládá z 125kDa homodimeru a je závislý na Ca2+ (Ann. Ν. Y. Acad. Sci., 799, 650 až 658 (1996), Enzyme Engineering). Tento enzym je inhibován Cd2+, Hg2+, Cu2+ a EDTA (US 5 372 940). Čistění hydrolázy D-pantolaktonu popsal Shimizu a kol. Čištěný enzym vykazuje hydrolázovou aktivitu pro řadu laktonů, zvláště pro cukerné laktony (Eur.
ft
J. Biochem., 209. 383 až 390 (1992)). Jeho sekvence vykazuje nízký stupeň homologie s glukonolaktonázou ze Zymomonas mobilis (28,9%), lidskou a krysí (přesná citace, dále označováno latinským výrazem sic) paraoxonázou (25,3%) a striktosidinsyntázou z Catharanthus roseus (15,9%; EP-A-0 794 251, Kobayashi a kol., Proč. Nati. Acad. Sci., USA, 95, 12787 až 12792 (1998)). Kataoko a kol. popisují značnou závislost dosažené enantiomerní čistoty produktu na přeměně při různých hodnotách pH (Enzym. Microbiol. Technol., 19,
307 až 310 (1996) a Appl. Microbiol. Biotechnol., 44, 333 až 338 (1995)). Nižší enantiomerní čistoty se dosáhne při hodnotách pH poblíž nebo nad pH 7, protože spontánní chemická hydrolýza L-pantolaktonu roste při vyšších hodnotách pH a tím snižuje enantiomerní čistotu produktu. Hodnota pH 5 se považuje za optimální pH pro přípravu D-pantolaktonu nejvyšší enantiomerní čistoty. Nicméně při tomto pH významně klesá rychlost enzymatické reakce. Aby se dostal opticky čistý produkt, je nezbytné, aby po extrakci následovala krystalizace (Yamada, H. Chimia 47, 5 až 10 (1993)).
Nevýhodami způsobů uvedených výše je, že často vedou k produktům pouze s malou optickou čistotou a/nebo že mají jen malou výtěžnost v prostoru a čase. To vede k ekonomicky neatraktivním způsobům. Tak je zde stále značná potřeba jednoduchého, ekonomického biotechnologického způsobu přípravy D-pantolaktonu, který nemá nevýhody uvedené výše. Předpokládalo se, že tento způsob umožní, vycházeje z existující chemické syntézy, získat D-pantolakton jednoduše a s velkou výtěžností a v takové enantiomerní čistotě, že nebude potřeba žádného dalšího čištění produktu.
Podstata vynálezu
Cílem tohoto vynálezu je poskytnout jednoduchý, ekonomický způsob přípravy D-pantolaktonu. Původci zjistili,
4 9 4 9 9 4 ·· ··
0 ···· ····
4 4 4 4 9 9 9 4 4 · že tohoto způsobu se dosáhne izolovanou sekvencí nukleových kyselin, která kóduje polypeptid mající aktivitu hydrolázy L-pantolaktonu, vybranou ze skupiny:
a) sekvence nukleových kyselin, která má sekvenci zobrazenou v SEQ ID NO: 1,
b) sekvence nukleových kyselin, která je v důsledku degenerace genového kódu odvozená od sekvence nukleových kyselin zobrazené v SEQ ID NO: 1,
c) derivátů sekvence nukleových kyselin, zobrazené v SEQ ID NO: 1, které kódují polypeptidy se sekvencemi aminokyselin zobrazenými v SEQ ID NO: 2a mající nejméně 50% homologii na úrovni aminokyselin se zanedbatelným snížením enzymatického účinku polypeptidů,
d) funkčních ekvivalentů sekvencí uvedených v písmenech (a) až (c).
Tyto hydrolázy L-pantolaktonu lze najít v organismech, výhodně mikroorganismech jako jsou bakterie. Enzym nebo enzymy mají vysokou enzymatickou aktivitu k hydrolytické přeměně L-pantolaktonu na L-pantoovou kyselinu.
Tyto hydrolázy L-pantolaktonu nepřeměňují D-pantolakton, takže organismy, extrakty nebo čištěné enzymy a příslušné rekombinantní kmeny nebo proteiny lze použít k přípravě enantiomerně čistého D-pantolaktonu.
Deriváty sekvence nukleových kyselin podle tohoto vynálezu, které mají sekvenci SEQ ID NO: 1 představují například alelické varianty, které mají nejméně 50% homologii na úrovni odvozených aminokyselin, výhodněji nejméně 60% homologii, zvláště výhodně nejméně 70% homologii, ještě výhodněji nejméně 80% homologii. Homologie • · · · · · · ft • · ftft ftft · •ft · · · · ···· se určí způsobem buď podle Needlemana a Wunsche (J. Mol. Biol. 48., 443 až 453 (1970)) nebo podle Smitha a Watermana (Adv. Appl. Math., 2, 482 až 489 (1981)). Homologie mohou být výhodně vyšší v určitých oblastech sekvencí. Sekvence aminokyselin odvozená od SEQ ID NO: 1 lze najít v SEQ ID NO: 2. Alelické varianty zahrnují zejména funkční varianty, které lze získat ze sekvence zobrazené v SEQ ID NO: 1 odstraněním, vložením nebo substitucí nukleotidů, i když by mělo dojít jen k zanedbatelnému poklesu enzymatické aktivity odvozených syntetizovaných proteinů. Enzymy se zanedbatelně sníženou enzymatickou aktivitou jsou enzymy, které mají enzymatickou aktivitu nejméně 20%, výhodně 50%, zvláště výhodně 75%, ještě výhodněji 90%. Tento vynález se tak týká sekvencí aminokyselin, které jsou kódovány skupinou sekvencí nukleových kyselin popsanou výše. Vynález se týká výhodně sekvencí aminokyselin kódovaných sekvencí SEQ ID NO: 1.
Funkční ekvivalenty sekvencí uvedených pod písmeny (a) až (c) jsou nukleové kyseliny, které kódují enzymy, které hydrolyzují L-pantolakton na příslušnou kyselinu a které mají nejméně 20%, výhodně 50%, zvláště výhodně 75%, ještě výhodněji 90% aktivitu sekvence uvedené pod SEQ ID NO: 2, nejsou inhibovány EDTA (1 mM roztok) a jsou stabilní při pH 4 až (sic) 10. Navíc mají tyto funkční ekvivalenty výhodně optimum pH mezi pH 7 a 8 a teplotní optimum mezi 70 °C a 80 °C.
Deriváty rovněž znamenají homology SEQ ID NO: 1, například fungální nebo bakteriální homology, zkrácené sekvence, jednovláknovou DNA nebo RNA kódující a nekódující sekvence DNA. Homology SEQ ID NO: 1 mají na úrovni DNA homologii nejméně 50%, výhodněji nejméně 60%, zvláště výhodně nejméně 70%, ještě výhodněji nejméně 80% v celé oblasti DNA, jak ukazuje SEQ ID NO: 1.
Navíc homology SEQ ID NO: 1 znamenají deriváty, jako jsou například varianty promotoru. Promotory, které jsou ve směru k počátku řetězce od daných nukleotidů, lze modifikovat jednou nebo více nukleotidovými záměnami, vloženími i) a/nebo odstraněními i), nicméně bez poškození funkčnosti nebo aktivity promotorů. Promotory mohou mít navíc zvýšenou aktivitu modifikací jejich sekvence nebo mohou být úplně nahrazeny účinnějšími promotory dokonce z heterologních organismů.
Deriváty rovněž znamenají varianty, jejichž sekvence nukleotidů v oblasti od -1 do -200 před počátečním kodónem nebo 0 až 1000 párů baží po konečném kodónu se modifikují, aby se změnila exprese genu a/nebo exprese proteinu, výhodně aby se zvýšila.
Sekvence nukleových kyselin podle tohoto vynálezu lze v zásadě určit a izolovat ze všech organismů. SEQ ID NO: 1 nebo její homology lze výhodně izolovat z hub, kvasinek nebo bakterií. Z bakterií lze zmínit gramnegativní a grampozitivní bakterie. Nukleová kyselina (nukleové kyseliny) podle tohoto vynálezu (množné a jednotné číslo mají v této přihlášce stejný význam) jsou výhodně izolovány způsoby známými odborníkovi z gramnegativních bakterií, výhodně z alfa-proteobakterie, beta-proteobakterie nebo gamma-proteobakterie, zvláště výhodně z bakterie druhů Enterobacteriacae, Pseudomonadaceae nebo Rhizobiaceae, zvláště výhodně z bakterií rodu Agrobacterium, Pseudomonas nebo Burkholderia. Z vhodných hub lze výhodně uvést druhy Beauveria nebo Psilocybe. Příklady výhodných kvasinek lze nalézt v rodu Apiotrichum.
SEQ ID NO: 1 nebo její deriváty, homology nebo části těchto sekvencí lze izolovat například za použití běžných způsobů hybridizace nebo techniky PCR z jiných hub nebo bakterií. Tyto sekvence DNA hybridizují za standardních podmínek se sekvencemi podle tohoto vynálezu. Pro ·· · * ♦ • ·· hybridizaci je výhodné použít krátké oligonukleotidy zachovaných oblastí, například z aktivního místa, které lze určit způsoby známými zkušenému odborníkovi srovnáním s hydrolázou D-pantolaktonu (příkladem oblasti tohoto typu je takzvaný HTGT motiv). Nicméně pro hybridizaci lze rovněž použít delší fragmenty nukleových kyselin podle tohoto vynálezu nebo úplné sekvence. Tyto standardní podmínky se liší v závislosti na použitých nukleových kyselinách: oligonukleotidy, delší fragmenty nebo úplné sekvence, nebo v závislosti na tom, jaký typ nukleové kyseliny, DNA nebo RNA se (sic) použije pro hybridizaci. Tak například teplota tání pro DNA:DNA hybridy je přibližně o 10 °C nižší než teploty tání pro hybridy DNA:RNA stejné délky.
Standardní podmínky znamenají například teploty mezi 20 °C a 70 °C v závislosti na nukleové kyselině, ve vodném pufrovacím roztoku o koncentraci od 0,1 do (sic) 5x SSC (lx SSC = 0,15 M chloridu sodného, 15 mM citronanu sodného, pH 7,2) nebo doplňkově v přítomnosti 50% formamidu. Podmínky hybridizace pro DNA:DNA hybridy jsou výhodně 2,0 SSC a teploty od přibližně 20 °C do (sic) 60 °C, výhodněji 35 °C do (sic) 60 °C. Tyto teploty uvedené pro hybridizaci jsou teplotami tání vypočítané podle vzorku pro nukleovou kyselinu o délce přibližně 1000 nukleotidů a 50% obsahu G ΊΟ bez přítomnosti formamidu. Podmínky pokusu pro hybridizaci DNA jsou popsány v příslušných učebnicích genetiky, jako je například Sambrook a kol., Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory (1989) a lze je vypočítat podle vzorce, který je známý odborníkovi v oboru a který například závisí na délce nukleových kyselin, povaze hybridů nebo obsahu C -ΙΟ. Další údaje o hybridizaci může odborník v oboru najít v následujících učebnicích: Ausubel a kol. (vyd.), Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons, New York (1985); Hames a Higgins (vyd.) Nucleic Acids Hybridization: A Practical Approach, IRL Press at Oxford University Press, Oxford (1985); Brown (vyd.) Essential
Molecular Biology: A Practical Approach, IRL Press at Oxford University Press, Oxford (1991).
Konstrukt nukleových kyselin podle tohoto vynálezu představuje geny hydrolázy L-pantolaktonu, které mají sekvenci SEQ ID No: 1 a jejich deriváty a homology, které jsou funkčně spojeny s jedním nebo více regulačními signály, výhodně pro zvýšení exprese genu. Tyto regulační sekvence jsou například sekvence, ke kterým se vážou induktory nebo represory a tak regulují expresi nukleových kyselin. Navíc kromě těchto regulačních sekvencí mohou přirozené regulátory těchto sekvencí před skutečnými strukturními geny a, kde je to vhodné, je lze geneticky modifikovat tak, aby se přirozená regulace vyřadila a exprese genů zvýšila. Nicméně konstrukt nukleových kyselin může mít rovněž jednodušší strukturu, což znamená, že se nevkládají žádné další regulační signály před sekvenci SEQ ID No: 1 nebo její homology a přirozený promotor se svojí regulací se neodstranil. Místo toho se mutuje přírodní regulační sekvence tak, aby nadále nedocházelo k regulaci a zvyšuje se genová exprese. Je rovněž výhodné, aby konstrukt nukleových kyselin navíc zahrnoval jeden nebo více takzvaných enhancerových sekvencí funkčně spojených s promotorem, což umožňuje zvýšení exprese sekvence nukleových kyselin. Další výhodné sekvence lze vložit na 3' konci DNA sekvencí, jako jsou například další regulační prvky nebo terminátory. Nukleové kyseliny podle tohoto vynálezu mohou být v konstruktu přítomny v jedné nebo více kopiích. Konstrukt rovněž může zahrnovat další markéry, jako je rezistence vůči antibiotikům nebo geny doplňující auxotrofie, kde je to vhodné, pro volbu pro konstrukt.
Výhodné regulační sekvence pro způsob podle tohoto vynálezu jsou například přítomny v promotorech, jako je aphll (Tn5), trc, cos, tap, trp, lacPAI, rha, tet, trp-tet, lpp, lac, lpp-lac, laclg, T7, T5, T3, gal, trc, ara, SP6, • toto toto toto to· toto ··· ·♦«· ···« ···· ···♦ i· · lambda- PR nebo lambda-PL promotor, které se s výhodou použijí u gramnegativních bakterií. Dalšími výhodnými regulačními sekvencemi přítomnými například u grampozitivních promotorů jako u konstitutivních nebo induktibilních promotorů streptomyces aphl, ermE, mele, tipA, mcrAB, gylCAB, veg, SPO1, amy a SPO2, u kvasinkových nebo fungálních promotorů AOX1, GAL1, ADC1, MFalfa, AC,
P-60, CYC1, GAPDH, TEF, rp28, ADH. V této souvislosti jsou rčvněž výhodné promotory pyruvátdekarboxylasy a methanoloxidasy, například z Hansenula. Pro regulaci je rovněž možno použít umělé promotory.
Pro expresi se konstrukt nukleových kyselin vloží do hostitelského organismu, výhodně do vektoru, jako je například plasmid, fág nebo jiná DNA, což umožní nej lepší možnou expresi genů v hostitelském organismu. Tyto vektory představují další ztělesnění tohoto vynálezu. Příklady vhodných plasmidů jsou u E. Coli pBluescript, pBAD, pQE (systém His smyčky), pICIC223-3, pLG338, pACYC184, pBR322, pUC18, pGEM7Z, pKK223-3, pUC19, pKC30, pRep4, pHS2, pHS2, pPLc236, pMBL24, pLG200, pUR290, pIN-III113-Bl, lambdagtll nebo pBdCI nebo velmi široké množství plasmidů jako je pBBRIMCS nebo pRK293, u streptomycet a jiných aktinomycet pIJlOl, PIJ364, PMVS301, pIJ702 nebo pIJ361, u Bacillu pUBUO, pC194 nebo pBD214, u Korynebakterie pSA77 nebo pAJ667, U hub pALSl, pIL2 nebo pBB116, u kvasinek 2 μΜ (sic), pAG-1, YEp6, YEpl3 nebo pEMBLYe23 nebo u rostlin pLGV23, pGHlac+, pBIN19, pAK2004 nebo pDH51. Uvedené plasmidy představují jen malý výběr možných plasmidů. Další plasmidy jsou dobře známé odborníkovi v oboru a lze je najít například v knize Cloning Vectors (vyd. Pouwels Ρ. H. a kol., Elsevier, Amsterdam-New York Oxford (1985), ISBN 0 444 904018).
Konstrukt nukleových kyselin obsahuje výhodně pro expesi ostatních přítomných genů, navíc 3' a/nebo 5' koncové • >* ·* * • · ·♦ ♦ ♦ ** ·· ·· ♦ · · * * * * · • · ·* · « · • · · · · * ♦» »· ·· ···♦ regulační sekvence ke zvýšení exprese, které se zvolí pro optimální expresi v závislosti na zvoleném hostitelském organismu a genu nebo genech.
Tyto regulační sekvence jsou zaměřeny na to, aby umožnily specifickou expresi genů a (sic) expresi proteinu. To může například znamenat, v závislosti na hostitelském organismu, že gen je exprivován nebo nadměrně exprivován pouze po indukci nebo že je exprivován a/nebo nadměrně exprivován okamžitě.
Regulační sekvence nebo faktory mohou mít pro tento účel příznivý účinek na expresi zavedených genů a takto ji zvyšovat. Takto může hrát výhodně zvýšení regulačních prvků roli v úrovni transkripce za použití silných transkripčních signálů, jako jsou promotory a/nebo enhancery. Nicméně translaci lze rovněž zvýšit například zlepšením stability mRNA.
V dalším ztělesnění vektoru lze rovněž vektor zahrnující konstrukt nukleových kyselin podle tohoto vynálezu nebo nukleovou kyselinu podle tohoto vynálezu výhodně zavést do mikroorganismu ve formě lineární DNA a včlenit ho heterologní nebo homologní rekombinací do genomu hostitelského organismu. Tato lineární DNA může sestávat z linearizovaného vektoru, jako je plasmid nebo pouze z konstruktu nukleových kyselin nebo nukleové kyseliny podle tohoto vynálezu.
Vynález se dále týká hydrolázy L-pantolaktonu s následujícími vlastnostmi:
a) přeměna L-pantolaktonu na příslušnou kyselinu,
b) stabilita vůči pH: hydroláza L-pantolaktonu je stabilní při pH v rozmezí 4 až 10, * ♦ ♦ 44 44 44 44
9 4 9 4 4 4 9 9 9
4994 9444 4 4 4
9 4 4 4 4 4 4 · 4 · 4 • 4« 4444 4 « 4 • 44 44 44 4» 44 4444
c) optimum pH: 7,2 až 7,6,
d) optimum teplot: přibližně 70 °C až 75 °C, a
e) žádná inhibice aktivity EDTA.
Tuto hydrolázu L-pantolaktonu lze použít ve způsobu podlé tohoto vynálezu jako volný nebo imobilizovaný enzym.
Pro optimální expresi heterologních genů v organismu je výhodné modifikovat sekvence nukleových kyselin v souladu s ustáleným specifickým kodónem organismu. Ustálený kodón lze snadno určit na základě počítačové analýzy jiných známých genů příslušného organismu.
Exprese genů podle tohoto vynálezu a proteinů kódovaných těmito geny v hostitelském organismu běžně působí tomuto organismu stres. Simultánní exprese těchto genů za přítomnosti nejméně jednoho genu, který kóduje takzvaný stresový protein nebo v přítomnosti kombinace těchto genů umožňuje, aby nukleové kyseliny podle tohoto vynálezu se výhodně exprivovaly v hostitelském organismu podle tohoto vynálezu. Stresové proteiny, zvané rovněž proteiny tepelného šoku (heat shock proteins = HSP) nebo molekulární chaperony, patří mezi proteiny, které se během evoluce nejlépe zachovaly, jak u prokaryotických, tak eukaryotických organismů a lze je nalézt univerzálně u všech organismů. Klasifikují se podle své molekulové hmotnosti v kilodaltonech, např. HSP60, 70, 90 atd. Tyto stresové proteiny mají své jméno odvozené od svých vlastností, protože jsou induktabilní stresovými podmínkami, jako je příliš nízká hladina glukózy, tepelný šok, alkohol, UV záření, oxidační reakční činidla atd.
Mnoho stresových proteinů a s nimi souvisejících
• titi ·« • ti titi • ti
• ti ti • • ti ti • ti • ti
• «titi • • • ti • • ti
ti
• ti ti • • ti ti ti • ti
• •ti titi • ti ti ti titi • tititi
proteinů, které se vytvářejí jako jejich součásti, jsou zásadní pro korekci skládání, spojování, stabilizace a přenosu proteinů. Koexprese proteinů podle tohoto vynálezu za přítomnosti nejméně jednoho stresového proteinu umožňuje výhodně expresi nukleových kyselin podle tohoto vynálezu.
Tímto způsobem lze výhodně předejít jakémukoli výskytu agregace hydrolázových proteinů. To má za následek vazbu stresových proteinů na hydrofobní části proteinů a takto se předejde nesprávnému skládání proteinů a usnadňuje opravu skládání. Proteiny, které se již agregovaly nebo denaturovaly se opět disociují a správně skládají. Při plnění svých funkcí tyto stresové proteiny často spolupracují s jinými proteiny, zvanými helper proteiny (= kohortové proteiny) a tak se používá pojem chaperonové systémy, které mají výhodné účinky na expresi genů podle tohoto vynálezu (Frydaman (sic) a kol., Nátuře, 370, 111 až 117 (1994)). K účinku těchto chaperonových systémů může docházet se spotřebou ATP (= hlavní chaperonové systémy) nebo bez spotřeby ATP (= mladé chaperony). Příklady výhodných chaperonů nebo proteinů tepelného šoku jsou eukaryotické geny HSP17,5, HSP22,
HSP25, HSP27, HSP60, HSP70, HSP90, TRiC, UBI1,2,3,4 nebo jejich prokarytické homology jako je HtpG, DnaK, DnaJ,
GroES, GroEL, HtrC, ClpB, GrpE atd. Výhodnými chaperony jsou GroES, GroEL, HtpG, DnaK, DnaJ, HSP70 nebo HSP27.
Nukleové kyseliny podle tohoto vynálezu se výhodně exprivují za přítomnosti nejméně jednoho stresového proteinu a v tomto případě mohou být geny pod společnou kontrolou jednoho promotoru nebo mohou být čteny separátními promotory. Stejně tak lze jejich expresi indukovat přidáním jedné nebo více indukujících látek současně nebo odděleně. Nukleové kyseliny mohou být přítomny v jednom vektoru nebo v samostaných vektorech. Stresové proteiny lze rovněž modifikovat v hostitelském organismu genetickou manipulací tak, aby byly nadměrně exprivovány.
00
0 0 0
0 0
0«
0 0
0000
0«
00
Rovněž mohou být výhodné alternativní způsoby zvýšení obsahu nativního enzymu, jako je kultivace mikroorganismů, při které dochází k syntéze proteinu podle tohoto vynálezu při nízkých teplotách nebo renaturace za použití vysokých tlaků (výhodně l až 2 χ 108 Pa) na suspenze proteinu podle tohoto vynálezu (za přidání nebo bez přidání denaturčních látek, například hydrochloridu guanidinu).
Vhodnými rekombinantními hostitelskými organismy pro nukleové kyseliny podle tohoto vynálezu nebo konstrukt nukleových kyselin jsou principiálně všechny prokaryotické nebo eukaryotické organismy. Hostitelské organismy s výhodou používané jsou mikroorganismy, jako jsou bakterie, houby nebo kvasinky. Výhodné jsou grampozitivní nebo gramnegativní bakterie, výhodně bakterie rodů Enterobacteriaceae, Pseudomonadaceae, Rhizobiaceae, Streptomycetaceae nebo Nocardiaceae, kvasinky jako Pichia, Saccharomyces nebo Hansenula nebo houby jako Beuveria nebo Psilocybe, zvláště výhodně bakterie druhů Escherichia, Pseudomonas, Streptomyces, Nocardia, Burkholderia, Salmonella, Agrobacterium nebo Rhodococcus. Rod a druh Escherichia coli je obvzláště výhodný. Navíc lze další výhodné bakterie nalézt ve skupině alfa-proteobakterií, beta-proteobakterií nebo gamma-proteobakterií.
Hostitelský organismus nebo hostitelské organismy podle tohoto vynálezu v této souvislosti výhodně zahrnují nejméně jednu ze sekvencí nukleových kyselin, konstruktů nukleových kyselin nebo vektorů popsaných v tomto vynálezu, které kódují hydrolázy L-pantolaktonu.
Organismy používané při způsobu podle tohoto vynálezu se pěstují nebo kultivují způsobem, který je známý odborníkovi v oboru a závisí na hostitelském organismu. Mikroorganismy se běžně pěstují v tekutém mediu, které obsahuje zdroj uhlíku, obvykle ve formě cukrů, zdroj dusíku, « «φ φφ φ» ·· ·* ·· · » · ♦ ♦ * * » · • ··♦ * · ♦* 9 9 9
9 9 9 9 9 9 9 9 9
999 99 99 99 99 9999 obvykle ve formě organických zdrojů dusíku, jako je extrakt kvasinek nebo solí, jako je síran amonný, stopové prvky, jako je železo, mangan, soli hořčíku a pokud je to vhodné, vitaminy při teplotách 0 °C až 100 °C, výhodně 10 °C až (sic) 60 °C, za provzdušňování kyslíkem. Navíc lze udržovat pH nutriční tekutiny na stálé hodnotě, to znamená buď regulovat ho během kultivace, nebo to není nutné. Kultivaci lze provádět várkovým způsobem, polovárkovým způsobem nebo kontinuálhě. Nutriční látky lze zavádět při zahájení ;
fermentace nebo je lze doplňovat semikontinuálně nebo kontinuálně. Totéž platí pro induktory jako je například isopropyl thiogalaktosid, (IPTG), laktóza, arabinóza, rhamnóza a antibiotika a/nebo pro zněny teploty, které vyvolávají expresi genu podle tohoto vynálezu v závislosti na použitém promotoru. Racemický pantolakton lze přidat přímo ke kultivaci, nebo výhodně po kultivaci. Enzymy lze izolovat z organismů způsoby popsanými v příkladech nebo je lze pro reakci použít jako surový extrakt.
Hostitelské organismy výhodně obsahují 0,5 U/g DBM (= vysušené biomasy) aktivity hydrolázy L-pantolaktonu, výhodněji 4 U/g DBM, ještě výhodněji 20 až 150 U/g DBM, zvláště výhodně 40 až 60 U/g DBM.
Způsob podle tohoto vynálezu se výhodně provádí při teplotě 0 °C až (sic) 95 °C, výhodněji při teplotě 10 °C až (sic) 85 °C, zvláště výhodně při teplotě 15 °C až (sic) 75 °C.
Hodnotu pH při způsobu podle tohoto vynálezu je výhodné udržovat na hodnotách 4 až 12, výhodněji na hodnotách 6 až 9, ještě výhodněji na hodnotách 6 až 8, zvláště výhodně na hodnotách 6,5 až 7,5.
Racemický pantolakton při způsobu podle tohoto vynálezu znamená pantolakton sestávající ze směsi 50:50 dvou
• to ♦ to ·« ·· • to
toto to » to • to « • • 1
• to ·· • to • · • • •
• · • to to • · to to to
*·♦ to· to to to* • to ·«··
enantiomerů nebo jakákoli jiná směs s obohacením jedním ze dvou enantiomerů ve směsi.
Enantiomericky čistý nebo chirální pantolakton (D nebo L enantiomer) ve způsobu podle tohoto vynálezu znamenají enantiomery vykazující obohacení jedním z enantiomerů.
Způsob dosahuje výhodně enantiomerických čistot nejméně 70 % ee, výhodněji nejméně 80 % ee, ještě výhodněji nejméně 90 % ee, zvláště výhodně nejméně 98 % ee.
Pro způsob podle tohoto vynálezu lze využít rostoucí buňky, které zahrnují nukleové kyseliny, konstrukty nukleových kyselin nebo vektory podle tohoto vynálezu. Lze rovněž použít restující nebo porušené buňky. Porušené buňky znamenají například buňky, které byly učiněny permeabilními tím, že byly vystaveny působení například rozpouštědel, nebo buňky, které byly popraskány působením enzymů nebo mechanicky (například pomocí French press nebo ultrazvukem) nebo jiným způsobem. Surové extrakty získané tímto způsobem jsou velmi vhodné pro způsob podle tohoto vynálezu. Pro způsob podle tohoto vynálezu lze rovněž použít čištěné nebo částečně čištěné enzymy. Podobně vhodné jsou imobilizované mikroorganismy nebo enzymy, které lze výhodně použít při reakci.
Pokud jsou pro způsob podle tohoto vynálezu použity volné organismy nebo enzymy, odstraní se výhodně před extrakcí například filtrací nebo centifugací. Je výhodné, že toto odstranění není nutné při použití imobilizovaných organismů nebo enzymů, avšak lze ho i v tomto případě provést.
D-Pantolakton připravený způsobem podle tohoto vynálezu lze výhodně izolovat z vodného reakóního roztoku extrakcí nebo krystalizací, nebo výhodně extrakcí a krystalizací. To se provede extrakcí vodného reakčního ·» 9· 99 99 99 « 9 * 9 9 «99« · ·· 9 · ·9 9 9 9
999 9» 999 9 9
999 9 9 9 9 999 • •«•9 99 99 99 9999 roztoku organickým rozpouštědlem. Extrakci lze několikrát opakovat, aby se zvýšil výtěžek. Roztok se před extrakcí výhodně ochladí na teplotu 0 °C až 10 °C. Vodný roztok se výhodně neutralizuje na pH přibližně 6,0 až 7,0 před anebo po ochlazení, aby se volná kyselina přeměnila na sůl, protože kyselinu nelze extrahovat za podmínek reakce. Baze používaná pro neutralizaci je například uhličitan nabo jiná baze, jako je hydroxid sodný nebo hydroxid draselný. Organická rozpouštědla, která lze použít, jsou v zásadě rozpouštědla, která tvoří fázové rozhraní s vodou, pokud je vhodné, po přidání solí a do nichž může lakton přecházet z vodné fáze. Vhodnými rozpouštědly jsou rozpouštědla, která pohlcují pouze malé množství vody, tak aby jen malé množství kyseliny přešlo do rozpouštědla. Takovými rozpouštědly jsou toluen, methylenchlorid, butylacetat, diisopropylether, benzen, methyl-terc-butylether, methylisobutylketon, diethylketon nebo ethylacetat.
Po zahuštění organické fáze lze produkt obvykle dostat v dobrých chemických čistotách, to znamená v chemické čistotě více než 90%. Nicméně po extrakci rovněž může být organická fáze s produktem pouze částečně zahuštěná a produkt se dostane krystalizaci. To se výhodně provede ochlazením roztoku na teplotu 0 °C až 10 °C. Krystalizaci lze rovněž provést přímo z organického roztoku nebo z vodného roztoku. Produkt získaný krystalizaci lze opět rekrystalizovat ze stejného nebo jiného rozpouštědla. Následnou nejméně jednou krystalizaci lze výhodně dále zvýšit enantiomerickou čistotu, pokud je to potřebné.
Nicméně je možné a výhodné použít výsledný D-pantolakton přímo jako organický roztok bez krystalizace.
L-Enantiomer, který zůstal ve vodním roztoku, lze laktonizovat okyselením například kyselinou sírovou a potom extrahovat způsobem, popsaným výše. Pro laktonizaci je výhodné roztok zahřát. Získaný lakton lze po odstranění
• ·* • * #* *·
·« ♦ Φ • * « • • 1
• · ·· • • • * • •
• · · * » • Φ
··· ·· • » ·« ·· · ·
rozpouštědla racemizovat v tekutém stavu katalytickým množstvím (přibližně 1 až 5 % mol.) baze, jako je hydroxid sodný, pantoat sodný nebo methoxid sodný a lze ho recirkulovat. Výhodná racemizace a recirkulace enantiomeru, který není požadován, umožňuje způsobem podle tohoto vynálezu dostat teoretický výtěžek 98 %.
Postupy uvedenými výše lze produkt způsobem podle tohoto vynálezu izolovat s výtěžky 60 až 100 %, výhodně 80 až 100 %, zvláště výhodně 90 až 100 % podle racemického pantolaktonu použitého pro reakci. Izolovaný produkt se vyznačuje vysokou chemickou čistotou více než 90%, výhodně více než 95%, zvláště výhodně více než 98%. Navíc má produkt (sic) vysokou enantiomerickou čistotu, kterou lze dále výhodně zvýšit krystalizací, pokud je to potřeba.
Způsob podle tohoto vynálezu lze provádět várkovým způsobem, polovárkovým způsobem nebo kontinuálně.
Produkty získané tímto způsobem jsou vhodné jako výchozí surovina pro syntézu panthenolu, pantetheinu a jejich derivátů. Tyto látky a získaný enantiomericky čistý pantolakton lze použít v kombinaci s další látkou nebo samotné pro přípravu léčiv, potravinových doplňků, potravy pro zvířata nebo kosmetiky.
Následující příklady ilustrují tento vynález.
Příklady provedení vynálezu
1. Hydrolýza L-pantolaktonu pomocí Burkholderia caryophylli Lu68l
Burkholderia caryophylli Lu681 (nebo jiné kmeny uvedené v tabulkách la, lb) se kultivuje v 25 ml komplexního media (například HFP = 1% pepton, 1% trypton, 0,5%
« *0 • 0 0« 0* 0 0 « 0 • 0 40 0 0 0 0
0 004 4 0 40 « · 0
ta 00 00 «0 00 0000
dobu (5 ml 1 až 3 50 mM dny,
Tris/HCl, pH 7,0) a inkubuje s 50 mM D,L-pantolaktonu při teplotě 30 °C po dobu 3 hodin. Po odstranění těchto buněk se určí koncentrace D,L-pantolaktonu, D,L-, D- a L-pantoové kyseliny pomocí GC nebo HPLC analýzy (tab. Ia). Alternativně se přeměna provede titrací přes noc 4M hydroxidem sodným (4ml suspenze buněk, 50 mM D,L-pantolaktonu, 50 mM
Tris/HCl, pH 7,0, ve 20 ml destilované vody; tab. lb). Všechny kmeny uvedené v tabulce 1 hydrolyzují racemický pantolakton na L-pantoovou kyselinu. Hodnoty ee při vysoké přeměně (více než 45%) a tím enantioselektivita E enzymu se určí způsobem, který popsali Straathof a Jongejan, Enzyme and Microbiol. Technology 21, 559 až 571 (1997).
2. Verifikace hydrolytické aktivity
Burkholderia caryophylli Lu681 (nebo jiné kmeny uvedené v tabulce 1) se pěstuje v 25 ml komplexního media (například HFP = 1% pepton, 1% trypton, 0,5% kvasnicový extrakt, 0,3% chlorid sodný) po dobu 1 až 3 dny, zachytí se, promyje v pufru Tris-HCl (50mM, pH 7,0) a resuspenduje (5 ml 50 mM Tris/HCl, pH 7,0) a inkubuje s 50 mM ketopantolaktonu při teplotě 30 °C po dobu 3 hodin. Po odstranění těchto buněk se určí koncentrace ketopantolaktonu, ketopantoové kyseliny, D,L-pantolaktonu, D,L-, D- a L-pantoové kyseliny HPLC analýzou (tab. Ia). Všechny uvedené kmeny kromě Beauveria amorpha Lu7953 jsou schopné redukovat ketopantoovou kyselinu, vzniklou spontánní hydrolýzou ketopantolaktonu, na pantoovou kyselinu. Nicméně protože D-pantoová kyselina se vytváří u všech kmenů místo L-pantoové kyseliny popsané v příkladu 1, přeměnu pantolaktonu na L-pantoovou kyselinu nelze uskutečnit oxidačně-redukčním způsobem (přes ketopantolakton a ketopantoovou kyselinu). Neexistuje žádná závislost hydrolýzy L-pantolaktonu na kofaktorech u dialyzovaného
• *· • to ft· • to • to
• to * to · • « • • • ·
• ··♦ < · ft· • • 4
•
• · · • · • 9 to • «
• toto ·· ·· ·· toto • •to ·
surového extraktu Lu681 nebo Lu5351 ani na použití čištěných enzymů z Lu681 nebo Lu5351. Enzymatickou aktivitu tak lze připsat hydrolytickému enzymu.
3. Příprava D-pantolaktonu hydrolýzou různými přirozenými rody
a. Burkholderia caryophylli Lu681
Burkholderia caryophylli Lu681 se pěstuje v 200 ml komplexního media (například GYP = 1% D-glukosa, 0,5% polypepton, 0,5% kvasnicový extrakt) (OD600 = 6,7, DBM =
2,97 g/1), zachytí se, a promyje se. 10 ml 10-krát zahuštěné suspenze se inkubuje s 50 mM D,L-pantolaktonu v 50 mM Tris/HCl, pH 7,0 (objem lázně 20 ml) při teplotě 30 °C a titruje se 4M roztokem hydroxidu sodného na pH 7,0. Přeměna c a ee se určí po 3 a 19,5 hodinách pomocí analýzy HPLC (3 h: c = 45 %, ee = 95 %; 19,5 h: c = 59 %, ee = 89 % pro L-pantoovou kyselinu). Druhé hodnoty odpovídají D-pantolaktonu s hodnotami ee 73 % a 100 %.
b. Agrobacteríum radiobacter Lu5351
Agrobacteríum radiobacter Lu5351 se pěstuje ve 200 ml komplexního media (například HFP = 1% pepton, 1% trypton, 0,5% kvasnicový extrakt, 0,3% chlorid sodný) (OD600 = 11,5, DBM = 2,90 g/1), zachytí se, a promyje se. 10 ml 10-krát zahuštěné suspenze se inkubuje s 50 mM D,L-pantolaktonu v 50 mM Tris/HCl, pH 7,0 (objem lázně 20 ml) při teplotě 30 °C a titruje se 4M roztokem hydroxidu sodného na pH 7,0. Přeměna c a ee se určí po 3 a 19,4 hodinách pomocí analýzy HPLC (3 h: c = 20 %, ee = 93 %; 19,4 h: c = 53 %, ee = 94 % pro L-pantoovou kyselinu). Druhé hodnoty odpovídají D-pantolaktonu s hodnotami ee 21 % a 100 %.
c. Pseudomonas diminuta Lu683 • 9 « • · · • · ·· *· 99 • · β 9 • 9 9· • · · ·>· 9« » * «
9999
Pseudomonas diminuta Lu683 se pěstuje ve 200 ml komplexního media (například GYP = 1% D-glukosa, 0,5% polypepton, 0,5% kvasnicový extrakt) (OD600 =7,3 DBM =
3,78 g/l), zachytí se, a promyje se. 10 ml 10-krát zahuštěné suspenze se inkubuje s 50 mM D,L-pantolaktonu v 50 mM Tris/HCl, pH 7,0 (objem lázně 20 ml) při teplotě 30 °C a titruje se 4M roztokem hydroxidu sodného na pH 7,0. Přeměna c a ee se určí po 3 a 19,3 hodinách pomocí analýzy HPLC (3 h: c = 48 %, ee = 97 %; 19,3 h: c = 69 %, ee = 79 % pro L-pantoovou kyselinu). Druhé hodnoty odpovídají D-pantolaktonu s hodnotami ee 82 % a 100 %.
d. Apiotrichum humicola Lu3215
Apiotrichum humicola Lu3215 se pěstuje ve 200 ml komplexního media (například HFP = 1% pepton, 1% trypton, 0,5% kvasnicový extrakt, 0,3% chlorid sodný) (OD600 = 18,5, DBM = 7,34 g/l), zachytí se, a promyje se. 10 ml 10-krát zahuštěné suspenze se inkubuje s 50 mM D,L-pantolaktonu v 50 mM Tris/HCl, pH 7,0 (objem lázně 20 ml) při teplotě 30 °C a titruje se 4M roztokem hydroxidu sodného na pH 7,0. Přeměna c a ee se určí po 3 a 19,4 hodinách pomocí analýzy HPLC (3 h: c = 55 %, ee = 79 % pro L-pantoovou kyselinu). Druhá hodnota odpovídá D-pantolaktonu s hodnotami ee 84 %.
4. Izolace hydrolázy L-pantolaktonu z Burkholderia caryophylli Lu681
Burkholderia caryophylli Lu681 se pěstuje ve 14 1 komplexního media (například HFP = 1% pepton, 1% trypton, 0,5% kvasnicový extrakt, 0,3% chlorid sodný) až do hodnoty OD600 = 10 (DBM = 3 g/l), zachytí se a poruší a ze surového extraktu se čistí hydroláza L-pantolaktonu (přibližně 200 U). To se provede nejprve resuspendací buněk (1128
g hmotnosti za mokra) v pufru (1,8 1, 20 mM Tris/HCl, pH
7.4) vystavením tyčovému homogenizátoru Ultra-Turrax.
Konečný objem je 3 1. Potom se z roztoku odstraní hrubé částice přes filtrační vrstvu skleněných kuliček (0,1 až 0,2 mm, 200 ml) ve skleněné nálevce s odsáváním. Tato suspenze buněk (3,2 1) se dvakrát homogenizuje v mikrofluidizeru Z04 při 1,5 x 108 Pa. Přístroj se promyje 500 ml pufru. Spojené objemy (4 1) se podrobí nejprve precipitaci 200 ml IM roztokem chloridu manganatého (konečná koncentrace 50 mM). Hodnota PH se udržuje na 7,0 přidáním roztoku hydroxidu sodného. Precipitát se odstřeďuje při frekvenci otáček 6000 za minutu po dobu 30 minut.
Supernatant (3,1 1) se smísí s 200 ml roztoku 0,2 M EDTA (pH
7.5) . Přidání způsobí pokles pH na 5,0. Vytvořený precipitát se opět odstřeďuje při frekvenci otáček 6000 za minutu (Sorvall, 20 minut). Supernatant (3,4 1) se opět titruje na pH 7,0.
Následně se přidá 989 g síranu amonného (odpovídá 50% saturaci) a míchá se po dobu 10 minut. Zákal se odstraní odstředěním při frekvenci otáček 6000 za minutu po dobu 20 minut. Výsledný supernatant (3,7 1) se rozdělí: 1,2 1 se podrobí fenyl-Sepharose (dále sefarosové) chromatografií.
Kolona fenyl-sefarosy (Pharmacia, průměr 5 cm, výška 25 cm, objem 490 ml) se promyje 1 1 pufru A (20 mM pufr fosforečnanu sodného, pH 7,4, 40 % síranu amonného) a promyje při gradientu pufrem B (20 mM pufr fosforečnanu sodného, pH 7,4). Při průtokové rychlosti 10 ml/min dosáhne 100 % pufr B po 120 minutách a udrží se po dobu 40 minut. Aktivní frakce se shromáždí a spojí (250 ml).
Po diluci na méně než 7 mS/cm se tyto 3 1 čistí chromatografií na Q-sefarose (průměr 5 cm, výška 25 cm, 430 ml, rychlý průtok, Pharmacia). Sloupec se promyje (10 ml/min) 1 1 pufru A (20 mM pufr fosforečnanu sodného pH • ··
7,4). Použije se lineární gradient s pufrem B (pufr
A s 1 M chloridu sodného) do 100% B během 120 minut a udržuje se lineární při 100 % po dobu dalších 40 minut. Aktivní frakce se shromáždí a spojí (118 ml). Tento objem se zahustí (přes lOkD membránu Omega) a dialyzuje se s 5 1 10 mM Tris/HCl pH 7,0; konečný objem 21 ml. 6 ml z tohoto objemu se natáhne do Waters Q HR8. Sloupec se předtím vyrovná pufrem A (20 mM Mes, pH 6,0) a potom vyvíjí gradientem (1% za minutu) k pufru B (jako pufr As 0,5 M chloridu sodného). Aktivní frakce se spojí a dialyzují dvakrát s 2 1 10 mM Tris/HCl pH 7,0. Dialyzát se zakalí, a proto se odstředí (4 ml).
Tento materiál se potom separuje chromatografií na Mono P (Pharmacia, průměr 0,5 cm, objem 5 ml). Frakce Mono-P se zahustí v částech po 0,2 ml pomocí acetonové precipitace při teplotě -20 °C.
Pelety se poté dají do 0,005 ml pufru SDS bez DTT a natáhnou na SDS gel (gel Tris/glycin 12%, od Novex, přibližně 2,5 hodiny, 125 V, 50 mA, Laemmli, U.K., Nátuře, 227, 680 až 685 (1970)). Hydroláza L-pantolaktonu se určí po separaci nalezením aktivní zóny a odřízne se. To se provede krátkým mícháním gelu v pufru TBS (= 50 mM Tris, 100 mM chloridu sodného, pH 7,4) a potom preinkubací 50 ml TBS + ml roztoku α-naftylacetatu (Sigma N-8505, 0,4 g/1 v 10% acetonu) po dobu 10 minut. Potom se přidá 50 ml roztoku Fast Red TR (Sigma F-8764, 1 g/1) a gel se dále míchá při teplotě místnosti (= přibližně 23 °C). Hydroláza L-pantolaktonu je identifikovatelná jako červenohnědý proužek se zřetelnou molekulovou hmotností přibližně 36 kDa). Protein v kusech gelu, které byly odříznuty, se vystaví působení trypsinu a peptidy se sekvenují. Zbývající gel se obarví Coomassieovou modří. Získají se dvě peptidové sekvence (SEQ ID NO: 3 a 4).
5. Izolace hydrolázy L-pantolaktonu z Agrobacterium radiobacter Lu5351
Agrobacterium radiobacter Lu5351 se pěstuje ve 14 1 komplexního media (například HFP = 1% pepton, 1% trypton, 0,5% kvasnicový extrakt, 0,3% chlorid sodný) až do hodnoty OD600 = 10 (DBM = 3 g/1), zachytí se, poruší a ze surového extraktu se čistí hydroláza L-pantolaktonu (přibližně 60 U) (tabulka 2). To se provede nejprve resuspendací buněk (400 g hmotnosti za mokra) Agrobacterium radiobacter (Lu5351) v pufru (1,8 1, 20 mM Tris/HCl, pH 7,4) vystavením tyčovému homogenizátoru Ultra-Turrax (konečný objem je 2,2 1). Potom se z roztoku odstraní hrubé částice přes filtrační vrstvu skleněných kuliček (0,1 až 0,2 mm, 200 ml) ve skleněné nálevce s odsáváním. Tato suspenze buněk se dvakrát homogenizuje v mikrofluidizeru Z04 při 1,5 x 108 Pa.
Přístroj se promyje 500 ml pufru. Spojené objemy (2,7 1) se podrobí nejprve precipitaci 135 ml 1M roztokem chloridu manganatého (konečná koncentrace 50 mM). PH se udržuje na hodnotě 7,0 přidáním roztoku hydroxidu sodného. Precipitát se odstředúje při frekvenci otáček 6000 za minutu po dobu 30 minut. Supernatant (2,6 1) se smísí s 575 ml roztoku 0,2 M EDTA a pH se opět zkontroluje. Přidá se 711 g síranu amonného (odpovídá 40% saturaci) do tohoto objemu 3,15 1 a míchá se po dobu 10 minut. Zákal se odstraní odstředěním při frekvenci otáček 6000 za minutu po dobu 30 minut. Výsledný supernatant (3,3 1) se podrobí fenyl-sefarosové chromatografii.
Kolona fenyl-sefarosy (Pharmacia, průměr 5 cm, výška 25 cm, objem 490 ml) se promyje 1 1 pufru A (20 mM pufr fosforečnanu sodného, pH 7,4, 40 % síranu amonného) a eluuje při gradientu pufrem B (20 mM pufr fosforečnanu sodného, pH 7,4). Při průtokové rychlosti 10 ml/min dosáhne 100 % pufr B po 120 minutách a udrží se po dobu 40 minut. Aktivní frakce se shromáždí a spojí (350 ml, 20,9 mS).
• · · · · · · · • · ·· · · ·
Po diluci na 7 mS/cm (konečný objem 3,1 1) se provede chromatografie na Q-sefarose (průměr 5 cm, výška 25 cm, 430 ml, rychlý průtok, Pharmacia). Sloupec se promyje (10 ml/min) 1 1 pufru A (20 mM pufr fosforečnanu sodného pH 7,4). Použije se lineární gradient s pufrem B (pufr A s 1 M chloridu sodného) do 100% během 120 minut a udržuje se lineární při 100 % po dobu dalších 40 minut. Aktivní frakce se shromáždí a spojí (134 ml). Tento objem se zahustí (přes lOkD membránu Omega) a dialyzuje 3 1 10 mM Tris/HCl pH 7,0; (konečný objem 19 ml). 6 ml z tohoto objemu se natáhne do Waters Q HR8. Sloupec se předtím vyrovná pufrem A (20 mM Mes, pH 6,0) a potom vyvíjí gradientem (1% za minutu) k pufru B (jako pufr A s 0,5 M chloridu sodného). Aktivní frakce se spojí (12,5 ml) a dialyzují dvakrát 5 1 10 mM pufru octanu sodného pH 5,0. Dialyzát se zakalí, a proto se odstředí.
Supernatant se potom separuje chromagrafií na Mono P (Pharmacia, průměr 0,5 cm, objem 5 ml).
Frakce Mono-P se zahustí v částech po 0,2 ml pomocí acetonové precipitace při teplotě -20 °C. Pelety se poté dají do 0,005 ml pufru SDS bez DTT a natáhnou na SDS gel. Hydroláza L-pantolaktonu se určí po separaci nalezením aktivní zóny (viz příklad 4) a odřízne se. Hydroláza L-pantolaktonu je identifikovatelná jako hnědý proužek s odstínem do červena se zřetelnou molekulovou hmotností přibližně 36 kDa). Protein v kusech gelu, které byly odříznuty, se vystaví působení trypsinu a peptidy se sekvenují. Zbývající gel se zbarví barvivém Coomassie Blue. Získají se dvě peptidové sekvence (SEQ ID NO: 5 a 6). Sekvenování SEQ ID NO: 5 ukazuje, že první aminokyselina v sekvenci je nejasná. Pozice 1 může být představovaná tyrosinem a rovněž leucinem, zde je sekvence dvojznačná.
·· 4 4 4 4 4 ·· 4 4 4 4 •4 » · 44 4444
6. Substrátová specificita čištěné hydrolázy L-pantolaktonu z Lu681 a Lu5351
0,1 U/ml frakce čištěných enzymů z Lu681 nebo Lu5351 z píku fenylsefarosy se inkubuje v 150 mM trubičkách o pH 6,8 s různými estery a laktony. Vzorky se odebírají po 0, a 20 hodinách, reakce se zastaví odstředěním přes lOkDa membránu filtru a pomocí HPLC analýzy se určí koncentrace substrátu a příslušné kyseliny. Aktivitu ukazují tabulky 3a a 3b ve srovnání s aktivitou L-pantolaktonu.
Pro lipázový substrát, ester resorufinu s 1,2-0-dilauryl-rac-glycero-3-glutarovou kyselinou se provede pro enzym Lu681 optická zkouška na mikrotitrační destičce (Boehringer Mannheim, modifikovaná). 60 až 482 U/l enzymu se inkubuje v 45 mM dihydrogenfosforečnanu draselného pH 6,8 s 0,18 g/1 esteru resorufinu (2g/l v dioxanu + 2 % SDS + 10 % vody) při teplotě místnosti. Extinkce E se měří při 572 nm po 2 minutách a po 82 minutách. Tabulka 3c ukazuje rozdíly v extinkci a z nich vypočtenou aktivitu lipázy, která představuje asi 0,05 % aktivity hydrolázy L-pantolaktonu.
7. Inhibice a aktivace čištěné hydrolázy L-pantolaktonu Z Lu681 a LU5351
0,1 U/ml frakce čištěných enzymů z Lu681 nebo Lu5351 z píku fenyl-sefarosy se preinkubuje s různými efektorovými substancemi v 150 mM trubičkách o pH 7,0 po dobu 5 minut. Reakce se zahájí přidáním 150 mM L-pantolaktonu (1 h při 30 °C) a zastaví odstředěním přes 10 kDa membránu filtru. Pomocí HPLC analýzy se určí koncentrace D,L-, D- a L-pantoové kyseliny. Aktivitu ve srovnání se vzorkem bez přidané efektorové substance ukazují tabulky 4a a 4b. Navíc jsou čištěné enzymy z Lu681 a Lu535l nesenzitivní (více než 85% reziduální aktivita) vůči chelátujícím látkám, SH činidlům, ihibitorům proteáz, detergentům (výjimka: Lu5351 se 74% reziduální aktivitou v 1% SDS) a různým kationtům.
Zjistila se signifikantní aktivace (+20 %) s chloridem rtuťnatým (133/170 %). Navíc se zjistila kompetitivní inhibice D-pantolaktonem u rekombinantní 681 laktonázy (buňky E. coli, viz příklad 8 a následující).
8. Genová banka a screening:,, klonování hydrolázy
L-pantolaktonu z Burkholderia caryophylli Lu681
Genomová DNA z Burkholderia caryophylli Lu681 se izoluje (Qiagen, Hilden), vystaví působení EcoRI a včlení do pBluescriptKS+-vektoru, který byl rozštěpen EcoRI a defosforylován (Maniatis, T., Molecular cloning:
A laboratory manual, 1989). Ligační směs se transformuje do E. coli XLlBlue v souladu se Stratagenovými pokyny (La Jolla, Kalif.). Transformanty (sic) se umístí na LB kultivační misky s ampicilinem (100 p,g/ml), IPTG (=isopropyl-p-thiogalaktosid, 0,2 mM) a X-Gal (80 mg/1) a inkubují při 30 ° C nebo 37 °C přes noc. Bílé kolonie se přeočkují na LB kultivační misky s ampicilinem (100 μφ/ιηΐ), IPTG (0,2 mM) a X-Gal (80 mg/1) a opět inkubují přes noc. Kopie této vzorové kultivační misky se poté připraví pomocí filtrové replikace za použití sterilních mikrocelulosových filtrů na kultivačních miskách LB-ampicilin (100 mg/ml)-IPTG . Po inkubaci přes noc na této kultivační misce (viz výše) se filtr podrobí zkoušce aktivity se 150 mM L-pantolaktonu, 0,1 % nitrazinové žlutí a 10 mM Tris/HCl, pH 7,0 (3h - přes noc, 30 °C). Izoluje se klon žluté barvy (XLlBlue pKS+681).
9. Restrikční mapování a sekvenování EcoRI vložené z E. coli XLlBlue pKS+681
Plasmid DNA se izoluje v souladu s pokyny Qiagena • · · to to· * to ·· · • · ·· · · · · · to r ·· ♦ · · to· ··· · · • toto toto toto toto toto toto·· (Hilden) z E. coli XLlBlue pKS+681 a rozštěpí se restrikčními enzymy EcoRI, BamHI, Pstl a HindlII jednoduše a dvojitou digescí. Fragmentovaná DNA se analyzuje elektroforézou na agarosovém gelu na 0,8% agarosovém gelu. Velikosti získaných fragmentů se ukazují v restrikční mapě vložení 7,5 kB zobrazené na obr. 3. Ta se kompletně sekvenuje (Sanger a kol., 1977) a obsahuje mezi jiným sekvenci nukleitidů ID NO: 1. Odvozená sekvence aminokyselin (SEQ ID NO: 2) naproti tomu obsahuje peptidy YGIEGLNNLEAL a AKEDANSTIEAED (SEQ ID NO: 3 a 4), které lze najít po tryptické digescí čištěné a naplotnované hydrolázy L-pantolaktonu z Burkholderia caryophylli Lu681 a Agrobacterium radiobacter Lu5351 (viz příklady 4 a 5).
Srovnání databází (Genová banka, EMBL, SwissProt, 7. května 1999 (Sptrembel) a 5. ledna 1999 (PIR)) sekvencí nukleotidů a odvozených sekvencí aminokyselin ukazuje pouze malou homologii se skupinou hypotetických proteinů a s určitými tetracyklinovými cyklázami ze streptomycetes (tab. 5). Zejména motiv se shodnými sekvencemi HTGTHVDAP je ve velké míře zachován u všech proteinů. Navíc je zjištěna 48% homologie (38 % identických aminokyselin) s hydrolázou isatinu z Pseudomonas putida WW2 (WO 94/09175), která obsahuje obdobně motiv zmíněné sekvence. Protože není zjištěna žádná homologie s jinými laktonázami, esterázami nebo lipázami, představují nalezené hydrolázy L-pantolaktonu novou třídu enzymů. Srovnání sekvencí naznačuje vzdáleně příbuznou fylogenetickou rodinu, do které rovněž patří zmíněné hypotetické proteiny a tetracyklinové cyklázy a hydroláza isatinu.
10. Hydrolýza L-pantolaktonu E. coli XLlBlue pKS+681
Plný inokulační loop E. coli XLlBlue pKS+681 se nechá růst (přes noc, 37 °C) na LB kultivačních miskách s ampicilinem (100 μg/ml), IPTG (0,2 mM) a X-Gal (80 mg/l) ·· ·» ftft ·· • .♦ftft · · ft · • · ft 4 * • ·· · · · ft · • · «· ·* ··«· a potom se resuspenduje (OD600 = 2,5) v 0,5 ml Tris/Hcl pH 7,0 a 50 mM D,L-pantolaktonu. Příslušný vzorek E. coli XLlBlue pBleuescriptKS+ (OD600 = 2,5) je vhodným srovnáním. Po 1 hodině se buňky odcentrifuguji a HPLC analýzou se určí D,L-pantolakton, D,L-, D- a L-pantoová kyselina. Tab. 6a ukazuje aktivity a hodnoty ee pro různé vzorky. Suspenze má aktivitu > 90 U/l. Nicméně není zřejmá žádná signifikantní aktivita ve várkách s tekutými kulturami (srovnej příklad 12).
11. Expresní klonování hydrolázy L-pantolaktonu v E. coli XLlBlue pKK223-3
Na základě sekvence nukleotidů SEQ ID NO: 1 se odvodí oligonukleotidy 5'-CCGGAATTCATGTGCAACAACTGC (Pl) a 5'-CCCAAGCTTCAGACCAGGGCCAGAA (P2) jako primery pro PCR amplifikaci genu hydrolázy L-pantolaktonu za těchto podmínek: 20 mM Tris/HCl pH 8,8, 2 mM síranu hořečnatého, mM chloridu draselného, 10 mM síranu amonného, 0,1%
Triton X-100, 0,1 mg/ml BSA, 25 mM každé dNTP, 0,96 qg/ml pKS+681, Pl a P2 každý 2,2 μg/ml, 25 U/ml Pfu polymerázy (Stratagene, LaJolla, Kalif.); parametry PCR jsou tyto:
°C 1 minuta, 55 °C 1 minuta, 72 °C 2,5 minuty, 30 cyklů. Výsledný produkt PCR (0,8 kB) se rozštěpí EcoRI and HindlII a včlení do pKK223-3 (Pharmacia, Freiburg), který byl předtím rozštěpen EcoRI a HindlII a defosforylován.
Ligační směs se transformuje do E. coli XLlBlue nebo TG1 (Stratagene, La Jolla, Kalif., DSMZ, Braunschweig, DSMZ-No. 6056, Inoue a kol., Gene 96, 23 až 28, (1990)).
Transformanty (sic) se umístí na LB-amp misky a inkubují se přes noc. Provedou se filtrová replikace a následná zkouška aktivity na této transformační misce analogicky podle příkladu 8. Identifikuje se asi 100 intenzivně žlutých klonů. Deset se analyzuje minipreparací a restrikční digescí (EcoRI-HindlII, EcoRI-HindlII-BamHI) plasmidu DNA (Maniatis T., Molecular cloning: A laboratory (sic) manual, 1989).
··· «··* » ' · • · ·· · · ·· · ·
Tyto klony obsahují plasmid pKK681, který je zobrazen na obr. 4.
12. Hydrolýza L-pantolaktonu E. coli XLlBlue pKK681
E. coli XLlBlue pKK681 se nechá růst přes noc při 37 °C v LB mediu s ampicilinem (100 pg/ml) a IPTG (0,5 mM), zachytí se a promyje se v Tris/HCl pufru (50 mM, pH 7,0) a resuspenduje (3 ml 50 mM Tris/HCl pH 7,0). 0,25 ml suspenze se smísí se 150 mM L-pantolaktonu, 150 mM trubičky o pH 7,0 a 0,5 ml destilované vody a inkubuje při teplotě 30 °C po dobu 3 hodin. Souběžně se 0,25 ml suspenze smísí se 150 mM D,L-pantolaktonu, 50 mM Tris, pH 7,0, a 0,5 ml destilované vody a inkubuje po dobu 3 hodin. Navíc se 2 ml suspenze smísí se 300 mM D,L-pantolaktonu, 50 mM Tris, pH 6,8, a 20 ml destilované vody a inkubuje se za titrace 4 M hydroxidem sodným na pH 6,8 po dobu 3 hodin. Vzorky se odebírají po 1 hodině a 3 hodinách, buňky se odstraní a supernatant se zkouší na D,L-pantolakton, D,L-, Da L-pantoovou kyselinu. Tab. 6b ukazuje aktivity a hodnoty ee různých vzorků. Kultura kultivovaná přes noc (lx zahuštěná) má aktivitu 90 až 150 U/l.
Při indukci E. coli XLlBlue pKK681 v rané fázi exponenciálního růstu (OD600 = 0,6, +0,5 mM IPTG) mají příslušné buňky aktivitu přibližně 480 U/l v pozdní exponenciální fázi (OD600 = 4,1) po inkubaci při teplotě 37 °C po dobu 5 hodin.
13. Expresní klonování hydrolázy L-pantolaktonu v E. coli TG1 pDHE19
Na základě sekvence nukleotidů SEQ ID NO: 1 se odvodí oligonukleotidy 5’-CCGGAATTCATGTGCAACAACTGC (PÍ) a 5'-CCCAAGCTTCAGACCAGGGCCAGAA (P2) jako primery pro PCR amplifikaci genu hydrolázy L-pantolaktonu za těchto «« ·· 00 ·· ··
0 0 0 0 0000 000 0 0 00 0 0 » 0 000 00 000 0 0 0 0 0 00 0 0 0«
00 ·0 0 0 0000 podmínek: 20 mM Tris/HCl pH 8,8, 2 mM síranu horečnatého, mM chloridu draselného, 10 mM síranu amonného, 0,1%
Triton X-100, 0,1 mg/ml BSA, 25 mM každé dNTP, 0,96 ^g/ml pKS+681, PÍ a P2 každý 2,2 gg/ml, 25 U/ml Pfu polymerázy (Stratagene, LaJolla, Kalif.); parametry PCR jsou tyto:
°C 1 minuta, 55 °C 1 minuta, 72 °C 2,5 minuty, 30 cyklů. Výsledný produkt PCR (0,8 kB) se rozštěpí Ndel a Hindlll a včlení do pDHE19 (prof. Mattes, Stuttgart), který byl rozštěpen Ndel a Hindlll a defosforylován.
Ligační směs se transformuje do E. coli XLlBlue nebo TG1 (Stratagene, La Jolla, Kalif., DSMZ, Braunschweig, DSMZ-No. 6056, Inoue a kol., Gene 96, 23 až 28, (1990)).
Transformanty (sic) se umístí na LB-amp kultivační misky a inkubují se přes noc. Provede se filtrová replikace a následná zkouška aktivity na LB-ampicillin (100 μg/ml) / rhamnosových (2 g/X) kultivačních miskách (LB = Luria Broth) na této transformační misce analogicky podle příkladu 8. Identifikuje se asi 100 intenzivně žlutých klonů. Deset se analyzuje minipreparací a restrikční digesci (Ndel-HindlII, Ndel-HindlII-BamHI) plasmidu DNA (Maniatis T., Molecular cloning: A laboratory (sic) manual, 1989). Tyto klony obsahují plasmid pKK681, který je zobrazen na obr. 4.
14. Hydrolýza L-pantolaktonu E. coli TG1 pDHE681
E. coli TG1 pDHE681 se nechá růst při 37 °C po dobu 6 až 7 hodin ve 14 1 minimálního media se 40 g/1 glycerolu a 2,5 g/1 rhamnosy, zachytí se a promyje se v Tris/HCl pufru (50 mM, pH 7,0) a resuspenduje do 1,4 1 pufru. Aktivita jednou zahuštěné suspenze buněk ve standardní zkoušce (150 mM trubičky pH 7,0, 150 mM L-pantolaktonu, 30 °C, 1 h) je 680 až 2700 U/l nebo 60 až 160 g/DBM.
ml 10-krát zahuštěné suspenze se inkubuje s 50 mM D,L-pantolaktonu v 50 mM Tris/HCl, pH 7,0 (objem lázně 20 ml) při teplotě 30 °C a titruje se 4M roztokem hydroxidu
32 - • · · titi ti • ti ·« ti* ·· ti · ti ti • * »· • ti ·· ti «ti ti titi ti
• ti · · · titi ♦· titi titititi
sodného na pH 7,0. Přeměna a ee se určí po 0,4 a 3 hodinách pomocí analýzy HPLC (0,4 h: c = 48 %, ee = 92 %; 3 h: c = %, ee = 72 % pro L-pantoovou kyselinu). To odpovídá
D-pantolaktonu s hodnotami ee 84 % a 100 % v tomto pořadí.
15. Příprava D-pantolaktonu hydrolýzou s E. coli TG1 pDHE681 g D-pantolaktonu se rozpustí v 10 ml vody a titruje na pH 6,5 4M hydroxidem sodným. Po přidání 5 až 10 ml suspenze buněk E. coli TG1 pDHE681 (příklad 14) a doplnění na objem 20 ml vodou se reakce inkubuje při teplotě 30 °C a titraci na pH 6,8 po dobu 15 až 22 hodin. Alternativně se přidá dalších 0 až 2 ml suspenze buněk a v inkubaci se pokračuje po dobu 3 hodin, nebo se přidá 3 x 5 ml suspenze buněk a v inkubaci se pokračuje po dobu 90 hodin. Obr. 6 ukazuje průběh na základě spotřeby hydroxidu sodného. Dosažené hodnoty ee pro D-pantolakton jsou od 71 % do 97 % v závislosti na přeměně a době inkubace. Buňky z 22 ml lázně se potom odcentrifugují a promyjí 5 ml 50 mM Tris/HCl pH 7,0 a supernatanty se spojí (20 až 25 ml) a třikrát extrahují jedním objemem ethylacetátu. Organická fáze se vysuší po přidání 10 g bezvodého síranu sodného při teplotě místnosti po dobu 1 hodiny. Precipitát se odfiltruje a promyje jednou ethylacetátem a filtrát se odpařuje při teplotě 40 °C po dobu 3 hodin. Viskózní odparek se zváží a analyzuje HPLC, GC, GC-MS a H-NMR (tab. 7). Obsahuje čistý D-pantolakton (ee 71 % až 87 % po přeměně 50 % až 52 %).
Hodnota pH vodné fáze (21 ml, L-pantoat sodný) se upraví na hodnotu 1 přibližně 5 ml 3M kyseliny sírové, zahřívá na teplotu 80 °C po dobu 15 minut a smísí s 8 g bezvodého síranu sodného. Vzniklý L-pantolakton se analogicky třikrát extrahuje jedním objemem ethylacetátu, vysuší síranem sodným a odpaří. Aby se L-pantolaktonový odparek mohl opět hydrolyzovat, lze ho racemizovat zahřátím po přidání hydroxidu sodného v přítomnosti malého množství «φ φ φ ♦
φφφ φφφ φ φ φ φφφ
φφφ φ φ φ φ φφ φφφφ sodné soli L-pantoatu (180 °C, 3 hodiny).
16. Příprava D-pantolaktonu hydrolýzou pomocí hydrolázy L-pantolaktonu z kmenů E. coli
Hydroláza L-pantolaktonu se získá přímo fermentací z E. coli (TG1 pDHE681 nebo výhodněji kmeny, u kterých dochází ke koexpresi chaperonů, jako je například GroEL) pomocí porušení buněk (2 x 108 Pa v mikrofluidizeru), odstranění buněčné usazeniny (9000 g při 10 °C po dobu 20 min), desetinásobným zahuštěním pomocí metody crossflow filtrace (Hámoflow F60, Fresenius, membrána nepropouštějící částice přibližně od 10 kDa) a precipitací za horka (20 min 60 °C, 20 min teplota místnosti - 10 °C, odstřeďování) a zahustí se na specifickou aktivitu přibližně 3000 U/g proteinu. Tento 10 x homogenat má aktivitu 63 až 100000 U/l a koncentraci proteinu 20 až 30 g/l.
Racemická štěpení 2,3 M D,L-pantolaktonu (30 % hmotnostně-objemových) s homogenátem získaným precipitací za horka (16000 U/l, 6 g/l proteinu) se provádějí při teplotě 30 °C v dávkách 0,75 až 1 1 za titrace 4 až 10M hydroxidem sodným (pH 7,5) a za mírného pufrování (6 až 20mM hydrogenuhličitanem sodným). Po inkubaci přes noc se enzym separuje z roztoku obsahujícího produkt pomocí metody crossflow filtrace (Hámoflow F40, Fresenius, membrána nepropouštějící částice přibližně od 10 kDa) směsi, promyje jednou nebo dvakrát deionizovanou vodou a zahustí. Enzym se potom znovu podrobí procesu za podmínek uvedených výše. Test doby použitelnosti ukazuje zdvojení doby setrvání nutného pro dosažení hodnoty ee větší než 90 % (D-PL) 12 až 24 h po 6 d (obr. 7). Použití větších objemů by mělo umožnit snížit ztráty aktivity (například dávka 10 1 pro náplň F40).
Vyšetření směsí racemátového štěpení s homogenátem (50,8 % přeměny, 92,5 % ee) se provede extrakcí 5x1 obj.
• to* ·· ·♦ ♦ · toto toto to totototo to to·· « tototo · · ·> · · to • to ««to to · · · · « · • •to ···< ··* • toto toto ·* ·♦ ·· «toto*
MTBE. 43 % D-pantolaktonu s 91,4 % ee a 98,2% čistotou (GC^nt ; založena na 100 % racemátu). Po zahřátí (65 °C/15 min) se kyselinou sírovou (koncentrovanou, 25 ml) a novou extrakcí MTBE (5x1 obj.) se získá 53% L-pantolakton o 62,3 % ee a 98,2% čistotou (GC^nt t ). Nečistoty proteinu nebo DNA jsou nedetekovatelné standardními metodami.
* Údaje o hydroxidu sodném ode dne 6 nejsou dostupné. 50,4% přeměna, 89,8 % ee v 1390. minutě (23,17 h).
Vzorky ode dne 7 nejsou dostupné, a proto nejsou žádná analytická data.
17. Příprava D-pantolaktonu hydrolýzou imobilizovanou hydrolázou L-pantolaktonu
Hydroláza L-pantolaktonu se izoluje jako v příkladu 16 a navážena různé nosiče, jako je komerčně dostupný Eupergit C (Rohm GmbH, Darmstadt) nebo Deloxan DAPIII (Degussa, Frankfurt).
Eupergit C
Eupergit je nosič aktivovaný epoxyskupinami. Protein se tak váže hlavně kovalentně na aminoskupiny.
Homogenát se nejprve podrobí precipitaci za horka.
1,1 1 homogenátu se inkubuje v množstvích každý po 550 ml při teplotě 60 °C po dobu 30 minut a poté ochladí umístěním na led po dobu 20 minut. Tento roztok se odstřeluje (8000 otáček za minutu, GS3 rotor, 1 hodina), aby se odstranil denaturovaný protein. Supernatant se potom zahustí na náplni Hámoflow F40 a změní se pufr na pufr 20 mM HEPES, pH 7,5. Ve volbě množství proteinu na g Eupergitu není žádné omezení.
V následujícím příkladu se 7,2 g proteinu zředí ve 270 ml • φφ φφ «* ·· φφ φφφ φφφφ φ*·· φ φφφ φ · ·· φ φ φ φφ φφφ φφ φφφ φ φ φφφ φφφφ φφφ φφφ φ· φφ *φ φφ φφφφ pufru s 30 ml 1Μ pufru fosforečnanu draselného pH 7,0 a vysolí 17,5 g pevného chloridu sodného. Velké množství soli podporuje vazbu proteinu na nosič. Hodnota pH se upraví přesně na 6,8 a potom se do roztoku přidá 15 g suchého Eupergitu. Roztok se promíchává při teplotě místnosti po dobu 17 hodin. Reakční směs se potom filtruje s odsáváním přes skleněnou nálevku a nosič se promyje vodou. Vlhký materiál má hmotnost přibližně 60 g. Pro uschování se použije 10 mM fosforečnanový pufr, pH 7,5.
Deloxan DAPIII, s a bez redukce
Deloxan je silikát modifikovaný aminoskupinami. Tyto aminoskupiny mohou být aktivovány glutaraldehydem, aby vytvořily Schiffovu bázi. Přebytek aldehydu se poté vymyje a k aktivovanému nosiči se přidá protein. Volné aminoskupiny proteinu reagují s dosud volnou aldehydovou skupinou navázaného glutaraldehydu a vytvoří se druhá Schiffova baze. Protein imobilizovaný tímto způsobem je připraven k použití. Nicméně Schiffova baze je náchylná k hydrolýze, takže protein se pomalu uvolňuje z nosiče do vodního roztoku. Tomu lze předejít redukcí hydridem sodno-boritým. Tato redukce zahrnuje přeměnu Schiffovy baze na sekundární amin. Předběžnou podmínkou tohoto způsobu je, že enzym je stabilní vůči redukci hydridem sodno-boritým.
Precipitace za horka homogenátu pro imobilizaci na
Eupergit C
Aktivace
140 g Deloxanu DAPIII se promyje vodou a potom 1,5 1 0,1M pufru fosforečnanu sodného, pH 6 a 1,5 1 0,lM pufru fosforečnanu sodného, pH 7,5 a resuspenduje se. Do něj se přidá 560 ml 2,5% roztoku glutaraldehydu (pH 7,5 se upraví stejným pufrem) a nechá se reagovat 3 až 4 hodiny. Nosič se
·. 99 99 9* 99 99
9· · • • • 9 9 9 • «
9 9 99 9 9 99 9 9 9
9 9 » • 9 9 9 9 9 9
• 99 9 9 99 • 9 99 999 9
zbarví oranžově červeně. Aktivovaný nosič se potom promyje 6 1 vody a resuspenduje vil pufru fosforečnanu sodného (pH 7,5).
000 U (přibližně 2,7 g proteinu) hydrolázy L-pantolaktonu se například přidá do 40 g aktivovaného Deloxanu. Protein se inkubuje s aktivovaným nosičem při teplotě místnosti po dobu 18 hodin. Roztok se oddělí od nosiče ve skleněné nálevce s odsáváním. Nosič se několikrát promyje vodou a potom 1 1 0,lM fosforečnanového pufru, pH 7,2 a IM chloridem sodným. Polovina nosiče se odstraní (bez redukce). Druhá polovina se opět promyje vodou a potom se přidá do 0, IM pufru boritanu sodného, pH 7,2.
Redukce hydridem sodno-boritým
0,4 g hydridu sodno-boritého (0,5%) se přidá k nosiči resuspendovanému v 80 ml boritanového pufru a směs se třepe při teplotě místnosti po dobu 3 hodin. Během této doby se nosič opět zbarví světležlutě. Nosič se odfiltruje s odsáváním ve skleněné nálevce a promyje 400 ml boritanového pufru. Nosič se potom promyje 1 1 vody a potom se přenese do 20 mM fosforečnanového pufru.
Štěpení racemátu
Pro štěpení racemátu 2,3 M D,L-pantolaktonu (30 % hmotnostně-objemových) s imobilizáty se imobilizáty míchají v 40 ml dávkách při teplotě 30 °C, titrují 10 M hydroxidem sodným (pH 7,5) v 10 mM hydrogenuhíičitanu sodném až do hodnot ee pro D-pantolakton přibližně 90 % (25 až 60 hodin). Biokatalyzátor se oddělí od produktu po každé dávce filtrací (filtrace reakční směsi s odsáváním přes filtr HPLC eluentu) a pokud je to vhodné, třikrát se promyje deionizovanou vodou. Následující diagramy ukazují kultivační misky s hydroxidem sodným pro testy doby použitelnosti u míchané směsi.
·* • ♦ • ·» ·* •» · · · · · • ··· · · ·· ·· * • · · · * · · · · · · · • · · ··*» · · 9
999 99 99 99 99 9999
Tabulka la
Tvorba kyseliny pantoové | Přímá hydrolýza (+) nebo (3 h) | jiná oxid.-red. (-)
1 Lu č.| Rod 1 | Druh 1 1 1 |PA |PA I áspec Ί 1 1 | ee | ee |
1 1 |mM |g/l| (sic. μ μ 1
1 1 1 J 1 1 1 1 1 1 (u/g) |neupr.|upr. | 1 1 1
22| Agrobacterium|tumefaciens 1 1 1 |5,6|0,8| 1,5 1 1 1 1 94,6 | 97,0 | +
5351| Agrobacterium]radiobacter |4,8|0,7| 1,6 | 97,3 |100,0 | +
3215| Apiotrichum |humicola |7,9|1,2| 1,5 | 82,0 | 77,8 | +
7953( Beauveria |amorpha |5,9|0,9| 1,0 | 68,5 | 72,1 | +
680| Burkholderia |solanacearum]2,110,31 0,5 | 70,3 | 80,9 | +
681| Burkholderia |caryophylli |6,7|l,0| 2,0 1 96,0 | 98,7 | +
683| Pseudomonas |diminuta |6,O|O,9| 1,1 | 98,0 |1OO,O | +
863| Pseudomonas |sp. |7,3|1,1| 1,9 1 92,0 | 94,0 1
4314| Psilocybe |coprohila |2,4|0,4| 0,5 | 65,3 | 74,3 | +
1 1_I 1(sic) J 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1
PA - pantoová kyselina ee hodnoty se vztahují k tvorbě (L)-pantoové kyseliny ee - nadbytek enantiomeru, upr. - ee upraveny odečtením pantoové kyseliny vzniklé chemickou hydrolýzou (slepá zkouška) • 00 0* 4* 00 00 ·«« 0 00 « »00 0
000» 0 040 0 0 0
000 00 0 0 * 0 0 • 00 0000 000 000 00 00 00 00 0000
Tabulka lb
1-1- |Lu č,| Rod I I 1 | Druh I 1 | Tvorba kyseliny pantoové J -,
1 1 1 1 lil 1 |ee $ |ee š |t (min)| 1 přeměna | E (upr.) |
i 1 I I 1 |upr. | | 1 II 1 * 1 I
1 1 | 22| Agrobacteriun 1___L 1 i(tumefaciens j III 1 (90,2 (94,5 | 1352 ( III 1 1 6,8 | 38 (
1 1 1 | 535l| Agrobacterium(radiobacter l_1_I III 1 (93,8 )96,5 ( 1161 | III 1 52,5 (více než 229 | i_1
1 1 | 3215| Apiotrichum I I Ί |humicola I III 1 |79,4 |79,1 ( 91 | III 1 54,0 | I 29 |
1 1 | 7953j Beauveria I I 1 |amorpha i III 1 )31,3 )33,8 | 288 | J 1_1_L 1 20,6 | I 3 1
1 ! | 680| Burkholderia I I Ί1 | | r |solanacearum|78,1 |81,3 | 1318 | J 1_1_1_L 1 54,1 | 37 |
1i | 68l| Burkholderia 1 I I |caryophylli 1 1 1 1 Γ )94,7 )97,6 | 187 j III 1 1 44,6 | 1 198 |
1 1 | 683| Pseudomonas I I 1 |diminuta I lil 1 )96,3 |98,7 | 185 | III 1 1 48,5 ( 1 524 |
| 863| Pseudomonas I I 1 |sp. I I II 1 |89,5 )91,9 | 1256 | III 1 1 47,9 | | 64 |
| 4314| Psilocybe 1_I 1 | coprophila J III 1 )42,6 (49,7 ( 1063 | .1 ... 1_1 L 1 15,6 | 1 3 1
ee hodnoty se vztahují k tvorbě (L)-pantoové kyseliny ee - nadbytek enantiomerů;
E - enantioselektivita;
upr. - ee upraveny odečtením pantoové kyseliny vzniklé chemickou hydrolýzou (slepá zkouška) *9 • n ·· * • 999
9 9
9
99 • 9 · • 9
9»
9 · 9 9
9 9 ·
99
9999
Tabulka 2 Čištění hydrolázy L-pantolaktonu z Lu5351
P 44 (ti • υ ω a ω [U/g prot.] J 1 1 1 1 1 σ\ ·\ σ» ο 1. η- ιη ♦ν τ—1 rH «X rH τΗ σ» X r—( η CN I ο 00 Γ-
& 0) ο 00 r- τ-Η ΓΟ γΗ
>N · r—n •χ κ *χ 9. ν Κ.
►Φ -P <*P 1 1 1 1 1 ο σ> 00 ο I ο
+> 0 uu ο τ-Η σ\
'>1 P τ—1 r~i
> β
γΗ m rH
* * i—1 00 σι m CN
44 -P n—i ιη ιη Ό CN ο ο
rH 0 tn 1 1 1 1 1 •χ V •χ fcfc 1 •κ
<D P U—J m C0 «3· rH ο ο
U β τΗ r-t τ—1
tí
Ή <—fc ΓΝ CN CN kO η
0 r-i ιη m CN CO co ιη
4J \ 1 1 1 1 1 •χ •χ *χ \ 1 χ
0 P tn 00 ο «Ή Γ Γ- ο ο
CM
44 0) >N
o ιη co C0 ο ο ο co 00 CN
>Q) · r·^ *χ •χ •χ. κ. X •χ •χ κ. •X *χ
Jj u dP 1 o Γ' ο ο ιη ο ΙΟ 00 fctf ιη ιη
'ÍX44 > (ti o rH CN kO CN Γ* C0 co ιη ιη γ·*·» 531 C0 CN
'(ti
>
0 44 · co 00 σ τΗ ιο r—1 Ό σ» σι ο C0 Γ·
H +J P v X v X κ *χ •χ 9. «. •χ
Φ l..il kO 00 Γ* ιη kO σ> i—i co ο Γ** rd
O (ti m CN r* ο rH ιη γΗ CN ιΗ CN rH rH
(ti
+> x-s
•H > r—1 X o O ιη CN co Γ- ο r-~ o ιη ο η
V X ·< fcx «χ •χ. X «χ •x •χ. •χ- •χ.
CN o L0 CN η- - CN ο r* co ιη rH
«Ρ CN ID ιη 00 (· rH co 00 Ο
kO
CN
• 3· Μ1 Ό CN «3· kO CN <rH
TO x·—. O fctf 00 00 00 Ο t—i τΗ ο ο
Λ rH •x •x •χ r-. κ. κ •χ Bx· •χ •fc
O 00 rd rH τ—Ί τΗ γΗ r—1 CN O ο ο ο
CN
β 44 44 Ή £ β β Λί 'Η Ή β φ 44
>Φ >Φ φ 0 44 β>Φ β -Ρ β β β . I & ΚΗ
X 0) P β (ti β φ >ω β ρ β Φ 3 Ν Λ 'Φ «Η Ή β Φ β Ν Λ 'β <Η Ή ' >Φ β Ρ 0 ,β ο β Ρ β β Φ Ο Ρ Ή β β <4-1 φ ω 0 Ρ β M-l I ιβ <Μ β Ρ β β β 1 X
H •p ο β Ή β 'β1 Í0 φ >Ν Φ Ό φ
> β β Φ β Φ Λ 1 0 «μ Ή •Ρ ω β ω \Ρ 1 Ό
Φ 44 .>ω > >ω β β ·’ β β (0 1 ι—1 -Ρ Η 44|(β X φ TS Ρ φ β ν β. Ρ
g Ό >Φ -β Ρ β Ρ β φ C · >1 β >ιΉ|η Φ
P Φ β ρ & Ρ Oj φ Ρ >w Η φ §·“ wg β β β βφ β
Φ Ě 1 >Ρ β Λ Λ >0 rPd 1 ( 0 β 1 Ν β Φ 44 β>Φ - φ β β Ρ , β 0 ω β φ fe 1 φ /ω ΐι £Χ ,! '** β Μ
&4>Φ - *__; - -»*Ά d, gp
CO Λ
• ·* •fr »·
• · • • • · • • •
• ··· 9 • *· a •
• · » • • • · • •
ti · ·· * O ·· ·· ···
Tabulka 3a Substrátová specificita hydrolázy L-pantolaktonu z Lu681
Substrát Koncentrace (mM) Aktivita
S—Pantolabton' 150 ++
D—P ant o 1 ale tq,n< 150 —
γ—Butyrolafcton. 150 b
γ—Valerolafcton 150 +
δ-Valerolafcton. 50 +
ε-fcaprolalcton^ 150 ++
(+/—)δ—Delcanolafcton 15 —
δ—Nonalafcton 75 +
Ethyl- D (+) — lafet ať 150
Ethyl-(L) (-)-lafctate 150 ++
D-Galafctono—γ—lafcton,' 150 +
L-Galafctono—γ—lafcton.' 150 ++
L—( + )—Gulono—γ—lafcton . 150 ·+
D—(—)—Gulono—γ—lafctonc 150 +
--ester l,2-o-ailauryl-rac-~........ -glycero-3-glutarové kyseliny s resorufinem 0,25 (+)
5-hydroxy-2-kumaranon 2,5 +
alfa-naftylacetat 2,5 (+)
Isatin 10 +
++Í > 50 U/l
+ : > 5 U/l
( + )·· > 0f5 U/l
__ · · < 0,5 U/l
• · · • ft» ·· •ft ·· • · · · • · ·· • · · ·· ftft • · · » · ft· • · · ·· ····
Tabulka 3b Substrátová specificita hydrolázy L-pantolaktonu z Lu5351
Substrát Koncentrace (mM) Aktivita
S—Pantolafcton* 150 ++
D—Pant o lafet on<- 150 ( + )
γ—Butyrolafetom 150 ++
γ—Valerolafctonc- 150 ++
δ—Valerolafetone 50
ε-feaprolafcton' 150 ++
(+/—) δ—Defcanolafeton, 15 ++
δ—Nonalafcton.. 75 ++
Ethyl-D(+)— lafetatv 150 +
Ethyl-L(-)— lafet ať 150 ++
D-Galafctono—γ—lafcton'. 150 ++
L—Ga 1 afct ono—γ—1 afc t on 150 ++
L— (+)-Gul ono—γ—lafet on< 150 ++
D—(—)—Gulono—y—lafeton. 150
1B uj JL JL f Cl 1J- dUil jý JL J- C -glycero-3-glutarové kyseliny s resorufinem 0;25 (+)
Dihydrofcumarin 2r 5 +
alfa-naftylacetat 2,5 (+)
Isatin 10 <+)
++: >50 U/l +: >5 U/l (+): > 0,5 U/l < 0^5 U/l
Tabulka 3c Lipázová aktivita čištěné hydrolázy L-pantolaktonu z Lu681
L-PL Aktivita ΔΕ (λ=572) Lipázová aktivita [U/l] Aktivita [%]
481,82 0,50 0,19 0r04
240,91 0,40 0,15 0,06
120,45 0,18 0,07 0r05
60,23 0,05 0,02 0,03
Tabulka 4a “Účinek různých přidaných látek na aktivitu hydrolázy L-pantolaktonu z Burkholderia caryophylli Lu681 při standardní zkoušce
Látka Koncentrace [mM] Relativní aktivita
žádná přidaná — 100%
EDTA 1 97%
ÍKysel; ........... Lna citrónová pH 6,4 30 97%
o-fenanthrolin 1 95%
HgCl2 1 133%
pCMBS 1 108%
DTT 1 99%
PMSF 1 113%
DIFP 1 115%
Pepstatin 1 117%
h2o2 1% 95%
KCN 1 102%
KC1 1 99%
NH4C1 1 100%
MgCl2 1 99%
CaCl2 1 101%
MnCl2 1 100%
CoCl2 1 97%
FeCl2 1 104%
NiCl2 1 96%
ZnCl2 1 113%
SDS 1% 102%
CHAPS 0,1% 104%
Triton 0,1% 104%
Isopropanol 10% 93%
Acetonitril 10% 119%
MeOH 10% 100%
- 43 * ·· · · toto ·· · · ·· · ·«·· · · · « o··· · ··· · · ·
Tabulka 4b Účinek různých přidaných látek na aktivitu hydrolázy L-pantolaktonu z Agrobacteríum radiobacter Lu5351 při standardní zkoušce
Látka Koncentrace [mM] Relativní aktivita
žádná přidaná — 100%
EDTA 1 97%
DIFP 1 92%
CHAPS 0,1% 100%
SDS 1% 74%
pCMBS 1 112%
DTT 1 106%
HgCl2 1 170%
FeCl2 1 108%
ZnCl2 1 99%
MgCl2 1 114%
CaCl2 1 105%
pCMBS = p-chlormerkuribifenylsulfonová (sic) kyselina
DTT = dithiothreitol
SDS = dodecylsulfát sodný
EDTA = ethylendiamintetraoctová kyselina
DIFP = diisopropyl-fluorofosfat
CHAPS = ([3-cholamidopropyl]dimethylamonio)-l-propansulfonat
Λ · · • ti • · ·· ·· ·· ·β * ti ti 9 ti · ti • · · titi «
>Ί
N a
'(0 β
ι—1 Cp
0 L
Ό g
>1 β
Λ 44
C Ν '>1
•H >
rH 0) Φ
ω ι—1
>1 Ό
Λ! Ο
0 a
β •Η rd
β CO
<0 Ό
φ β (β
ϋ β Ν
Φ ο
U1 -μ ιη
φ β -μ
Ή Γ—I •Η
σ» Ο <μ
0 μ μ
ι—ι C ω
0 ιϋ φ
g 0 a Λ
ffi i β
in (O 44 i—i β Λ (O H
Bestfit identita (% aa) U0 4. Γ*· ΓΟ τ—4 *. Ο CO ιη fe. i—i ω CM fe. CM co CO ο CO τ—1 fc—. CM CO σ> CM CO O in co O fe <h CM ιη ·<. Γ co ΓΜ ’ fe ιη C0 τ—1 Κ ΓΜ C0
Φ
•Η ι »
μ ίρ'ζ? •Η 0 Ό ι—4 ο Γ*· σ r—1 ο τ—4 co O Κ0 V0 ο
(Η Η Λ fe- Τ' fe- fe. v. «— fe *· S.
JJ π 00 m rH ιη CN CM CO o CM \0 *3* CN
ω g * Φ 0 *3·· *31 *31 Ό> ”3< *3* »3· η· *3·
« μ ,
β
μ
ýs «3· 00 m Ch CO 00 CO cH r- 10 Ch C0
fe- fe- kb- fe- JL-. fe- ·— <-. 4U ti. «4
Γ— σ CO ι—4 10 σ ιο CO cn CN *3« σ
a φ β t ζ, ϋ ·Η η CM CM C0 CM CN CM CN CN m co CM
ogie a) σ> 10 *3* ιη <o CO co O t- CN Ό
Η ·». fe_ fe^. fe- fe— tib. fe- fe.
Π Γ- CN Γ* ιη ιη σ\ CO tH fO CN co Ch
&S * β 0 «* cn ^j· η cn cn cn cn η· n· <η
ο μ
η
1 -Η β
ω § ο ιη m β β B
μ 0 3 •H β Φ
η μ 1—4 β Λ μ β β ϋ O
β ο β ε 0 ω β c c •Η β β
ϋΐ c μ ο •Η ι—4 β >1 β β μ i—4 β
•Η 0 β μ μ &> 02 ω O •H •H Φ τ—i Φ
β £ β Φ •Η 0 β β o H r—4 U “H β
β Ο β ο ε Λ μ Φ Ό •Η μ β β β cn *Η
φ Ό Ό ε β β β ·η μ o μ μ Φ μ μ
Μ S ·Η μ ϋ μ ε μ tn θ' φ μ μ a β σ
η Φ μ Φ -Η ο μ c ·
<0 β • μ μ • • μ β • >, a a » • • 4
pm a ε μ a S &Η <ί μ cn ω β μ cn cn cn
Φ · ιη
ierenc :σ. Νο c* ΜΟ r** Ο σ) *3* r- ιη 03 ο m ο
σ» Ο Μ ro σ <0 O) co i—1 ο 00 σ
CM 00 *3· CO Ch *3» rH ιη •3« ι-l
<-4 σ ο CN σ σ> in 10 m 00 »o •Φ
ο Ρ* Γ·* V0 co r- o ο V0 00 ιη
'τ'ΐ V φ < ο η D Ε ο ω «2 Η ΕΗ ο o σ
£
β
'>1 'ίΰ »> > 0
□molog 44 ο c
β Ν 'β β υ •Η -Ρ G Τ3 Ή μ β : ť|i Ν ι •r4 i—1 44
Η C φ ·Η >Ί β
0 ·Η μ Φ 44 'β >ιμ 1—1 CÍ ϋ ν
Ε μ μ 0 μ β 'β
Ό β a 0 μ μ &
>ί ω >. μ Ο >1 a ω μ c
« ·Η w a Φ >1 Η ω §
β σ ιο CN
Η
00
‘ Ο <
4“ „ •ď
ω Ο
•Η Ě4 cn
>μ a CM ι
a 1 CO
Ή Φ C σ)
Ο Φ t—i
.·Η >Ν
N O ft O Η Λ
Méédléman £ Wunseh (1970), J. Mol. Biol. 48, 443-453 5 Smith & Waterman (1981), Adv. Appl. Math. 2, 482-489 · · ·· · ♦ to ·« • · « • · « *·· · · · ·» • ♦ « • ·· rd n
X •Η rH ο
ο β Ο -Ρ 44 (0 Γ—} ο
-μ ctí a
I
Pl >ι Ν 'Ctí ι—1
Ο μ
Ό >ι
Λ ω
ω
Φ μ
Ά χ
ctí
1—1
0
μ
Ρ
β
0 44 >ή 44
Ή >ω
β β
> 0
•Η 44
-Ρ Ν
ctí
Φ >1
Φ 44
β β
Ή
β
+ Ό
ω 0
X a
a
φ 2 Η W (Ο tO
Ctí 44 I—I β Λ ctí Η ctí
Η
C0 tO +
ω «
a φ
β πΗ
CQ
ΡΙ
X ctí
Ο* • • •
κ η Ό Ό
σι • • •
ο· β β β
m ιη C0
«* » ·*
CN ΓΟ <Ν ο
σι Ο
γΗ
tn τΗ σ\ CN
m 03 C— Ο
·«. •μ to·· to*
tn ο Γ~ ο
ιη ιη ιη ιη
·* ·* tow* ·*.
03 03 03 03
<*
ο ο ο ο
*. ·» to* ·«
Γ- θ' θ' θ'
33 33 33 33
Ο, β< a a
Γ—, (—1
. υ 0 ϋ ο
•Η •Η Ή •Η
ω cn cn cn
·—* U-U UJ
μΐ Pl μι μι
υ U υ U
33 33 33 33
\
η cn cn cn
•Η •rl •Η •Η
Μ μ Ρ Μ
Εη ΕΗ Εη Εμ
S S S S
rH ιΗ ι-Ί Μ
κ. ·» Α.
Μ τΗ i—1 γΗ
V. \
β) Ρ μι μι
Οι I Ϊ ϊ 0ι I
Η Η h. Η κ α κ
ο ο ο ο
2* S S η 2 ω
g g β Qj ε α
ω 03
ο ο ο Ο
ο ο Ο ί» Ο «#>
η ω ΓΟ τΗ η r-t
Μ γΗ
00 C0
to to
+ + + +
ω ω ω ca
X X X X
a a a a
γΗ
C0 <0
X
X a
φ 2 i—I (S γΗ η!
X rf!
ϊ
--0
Ο
Χ3 η
Ρμ
Ρμ σ>
>η >« β
ο
Ν >1 β
Ή β
Ό
Ο a
ctí
X μ
'(Ο >
Μ ιη* σι tO
V to
Ί.
a ιη φ
CU •Η
Ρ4 m
s τΗ σι
CN σι tn *» to to
v.
tn t· v
to
Λ l—I o
•H μ
EH 33 O ctí E S
ο ο S
ιη ο tn **
ιη
*» r-t *.
μ) μι
a a
1 μΐ 1
η) a μι
β
Φ >υ
P
Ó
Φ
C
CN o
β l · · • · ·· · ·
Tabulka 7a
Zpracování D-pantolaktonu
Celkový výtěžek 69,00 %
Čistota (GC-MS) > 98,00 %
Čistota (H-NMR) > 95,00 %
Obsah vody < 0,40 %
Tabulka 7b
Zpracování L-pantolaktonu
Celkový výtěžek 85,00 %
Čistota (GC-MS)* > 95,00 %
Čistota (H-NMR) > 97,00 %
Obsah vody

Claims (20)

  1. PATENTOVÉ NÁROKY
    1. Izolovaná sekvence nukleové kyseliny, která kóduje polypeptid, který má aktivitu hydrolázy L-pantolaktonu, zvolená ze souboru:
    a) sekvence nukleové kyseliny, která má sekvenci zobrazenou v SEQ ID NO: 1,
    b) sekvence nukleových kyselin, které jsou v důsledku degenerace genetického kódu, odvozené od sekvence nukleové kyseliny zobrazené v SEQ ID NO: 1,
    c) derivátů sekvence nukleové kyseliny, zobrazené v SEQ ID NO: 1, které kódují polypeptidy se sekvencemi aminokyselin zobrazenými v SEQ ID NO: 2a mající nejméně 50% homologii na úrovni aminokyselin se zanedbatelným snížením enzymatického účinku polypeptidů,
    d) funkčních ekvivalentů sekvencí uvedených v písmenech (a) až (c).
  2. 2. Sekvence aminokyseliny, která je kódována sekvencí nukleové kyseliny podle nároku 1.
  3. 3. Sekvence aminokyseliny podle nároku 2, která je kódována sekvencí zobrazenou v SEQ ID NO: 1.
  4. 4. Konstrukt nukleové kyseliny, který zahrnuje sekvenci nukleové kyseliny podle nároku 1, kde je sekvence nukleové kyseliny spojena s jedním nebo více regulačními signály.
  5. 5. Vektor, který zahrnuje sekvenci nukleové kyseliny podle nároku 1 nebo konstrukt nukleové kyseliny podle nároku 4.
    « · • * *4 4 • 44
    4 4 4
    4 4 4
    4 4
    4 4 4
    4 4
    4 4 • 4
    4 4 4 4 « *
  6. 6. Mikroorganismus, který zahrnuje alespoň jednu sekvenci nukleové kyseliny podle nároku 1, alespoň jeden konstrukt nukleové kyseliny podle nároku 4 nebo vektor podle nároku 5.
  7. 7. Mikroorganismus podle nároku 6, kterým je gramnegativní bakterie.
  8. 8. Mikroorganismus podle nároku 6 nebo 7, kterým je bakterie ze souboru alfa-proteobakterií, beta-proteobakterií nebo gamma-proteobakterií.
  9. 9. Mikroorganismus podle kteréhokoli z nároků 6 až 8, kterým je bakterie ze souboru Enterobacteriaceae, Pseudomonadaceae nebo Rhizobiaceae.
  10. 10. Mikroorganismus podle kteréhokoli z nároků 6 až 9, kterým je bakterie z rodu Agrobacterium, Pseudomonas, Burkholderia, Salmonella nebo Escherichia.
  11. 11. Hydroláza L-pantolaktonu, která má tyto vlastnosti:
    a) přeměňuje L-pantolakton na příslušnou kyselinu,
    b) stabilita vůči pH: hydroláza L-pantolaktonu je stabilní při pH v rozmezí 4 až 10,
    c) optimum pH: 7,2 až 7,6,
    d) optimum teplot: přibližně 70 °C až 75 °C a
    e) žádná inhibice aktivity EDTA.
  12. 12. Způsob přípravy D-pantolaktonu, vyznačuj ící se t í m, že zahrnuje tyto reakční stupně:
    a) přeměna racemického pantolaktonu za přítomnosti hydrolázy r
    L-pantolaktonu podle nároku 11 nebo hydrolázy
    L-pantolaktonu, která má sekvenci aminokyselin podle nároku 2 nebo mikroorganismu podle nároku 6 na D-pantolakton a L-pantoovou kyselinu a
    b) odstranění D-pantolaktonu.
  13. 13. Způsob podle nároku 12,vyznačující se tím, že L-pantoová kyselina získaná v reakčním stupni (b) se racemizuje a recirkuluje do reakčního kroku (a).
  14. 14. Způsob podle nároku 12 nebo 13,vyznačuj ící se t i m, že přeměna racemického pantolaktonu se provede za přítomnosti imobilizované hydrolázy L-pantolaktonu podle nároku 11 nebo imobilizované hydrolázy L-pantolaktonu, která má sekvenci aminokyselin podle nároku 2.
  15. 15. Způsob podle nároku 12 nebo 13, vyznačuj ící se t i m, že přeměna racemického pantolaktonu se provede za přítomnosti rostoucího, restujícího nebo porušeného mikroorganismu podle nároku 6.
  16. 16. Způsob podle nároku 12 nebo 15, vyznačující se t i m, že mikroorganismus je imobilizován.
  17. 17. Způsob podle kteréhokoli vyznačující se reakčním roztoku při pH 4 až
  18. 18. Způsob podle kteréhokoli vyznačující se teplotě 0 °C až 95 °C.
    z nároků 12 až 16, tím, že se provádí ve vodném
    12.
    z nároků 12 až 17, tím, že se provádí při
  19. 19. Způsob podle nároku 12 nebo 13, vyznačující se t i m, že D-pantolakton se odstraní extrakcí.
    *
    9 ·
    - 50 .ί
    9 ♦ • 9 9 9
  20. 20. Způsob podle kteréhokoli z nároků 12 až 18, vyznačující se tím, že D-pantolakton má optickou čistotu nejméně 90 % ee.
    )
    Seznam sekvencí <211> 810 <212> DNA <213> Burkholderia caryophylli <220>
    <221> CDS <222> (1)..(810) <223> Lu681 • · torf to to • · · ♦ V·· to • **· W • · · * * · · *· »· ♦» ýl/Uví--1ÍYí Qo ♦ » ·*· · <400> 1
    atg tgc aac aac tgc gtg atc gag aac gta aaa aag aac atg ctt tea 48 Met 1 Cys Asn Asn Cys 5 Val Ile Glu Asn Val Lys Lys Asn Met Leu Ser 10 15 cgg cgc ctg ctg ttc aag ggc get gcg gca ggt ttg acg gcc atg acg 96 Arg Arg Leu Leu Phe Lys Gly Ala Ala Ala Gly Leu Thr Ala Met Thr 20 25 30 gca ggc agt ctg get tcc ccg gcg ctt gcg caa tcg ccc cgg cag gtc 144 Ala Gly Ser Leu Ala Ser Pro Ala Leu Ala Gin Ser Pro Arg Gin Val 35 40 45 gtt gat ctc act cac acc tat gat tcc gca ttt ccc acc ttc gat ggc 192 Val Asp Leu Thr His Thr Tyr Asp Ser Ala Phe Pro Thr Phe Asp Gly 50 55 60 aaa ccg ggc ata gaa tat gag tgg gca gcg cag atc gcc aaa gac ggc 240 Lys Pro Gly Ile Glu Tyr Glu Trp Ala Ala Gin Ile Ala Lys Asp Gly 65 70 75 80 tat cag ctc cgc aaa ctc acc atc tac gaa cat acc ggc acc cat atc 288 Tyr Gin Leu Arg Lys Leu Thr Ile Tyr Glu His Thr Gly Thr His Ile 85 90 95 gat gcg cct ttc cac ttc age gcc gat ggc gcg age gtc gac caa ctg 336 Asp Ala Pro Phe His Phe Ser Ala Asp Gly Ala Ser Val Asp Gin Leu 100 105 110 gag ccg cag aaa ctt gtc get ccg ctt gtc atc gtc gac atc acc gag 384 Glu Pro Gin Lys Leu Val Ala Pro Leu Val Ile Val Asp Ile Thr Glu 115 120 125 cgc gcc aaa gag gat gcc aat tcc acc att gaa gcc gaa gac atc gag 432 Arg Ala Lys Glu Asp Ala Asn Ser Thr Ile Glu Ala Glu Asp Ile Glu 130 135 140 cgc tgg ata tet gcg aat ggc gac atc ccg aca ggt gca atc gtg get 480 Arg Trp Ile Ser Ala Asn Gly Asp Ile Pro Thr Gly Ala Ile Val Ala 145 150 155 160
    • ·
    tta Leu ege tcc gga Gly tgg gca Trp Ala 165 acc aaa gtg aag agt ccc tea ttc ege aat Lys Ser Pro Ser Phe Arg Asn 528 Arg Ser Thr Lys Val 170 175 gac gaa gcc gga caa ttc gcc ttc ccc ggt ttc ggc aaa tcg gcg acc 576 Asp Glu Ala Gly Gin Phe Ala Phe Pro Gly Phe Gly Lys Ser Ala Thr 180 185 190 gac ctt ctg ctg aag ctc gac acc gtc gcc att ggc gtc gac aca ctt 624 Asp Leu Leu Leu Lys Leu Asp Thr Val Ala Ile Gly Val Asp Thr Leu 195 200 205 tet ctg gat ccg ggc aac tcc gca gat ttc gcg gtt Cac aat tcc tgg 672 Ser Leu Asp Pro Gly Asn Ser Ala Asp Phe Ala Val His Asn Ser Trp 210 215 220 ctg cca gca gga ege tac ggt atc gaa gga ctg aac aac ctc gag get 720 Leu Pro Ala Gly Arg Tyr Gly Ile Glu Gly Leu Asn Asn Leu Glu Ala 225 230 235 240 ctg ccg gtc aag gga gcg acc ata atc gtc ggc gcg ccg gca cac ege 768 Leu Pro Val Lys Gly Ala Thr Ile Ile Val Gly Ala Pro Ala His Arg 245 250 255 ggc gga acg ggc ggc cca gcc cgt att ctg gcc ctg gtc tga 810 Gly Gly Thr Gly Gly Pro Ala Arg Ile Leu Ala Leu Val 260 265 270
    <210> 2 <211> 269 <212> PRT <213> Burkholderia caryophylli <400> 2
    Met 1 Cys Asn Asn cys 5 Val Ile Glu Arg Arg Leu Leu 20 Phe Lys Gly Ala Ala Gly Ser 35 Leu Ala Ser Pro Ala 40 Val Asp 50 Leu Thr His Thr Tyr 55 Asp Lys 65 Pro Gly Ile Glu Tyr 70 Glu Trp Tyr Gin Leu Arg Lys Leu Thr Ile
    Asn Val Lys Lys Asn Met Leu Ser 10 15
    Ala Ala Gly Leu Thr Ala Met Thr 25 30
    Leu Ala Gin Ser Pro Arg Gin Val 45
    Ser Ala Phe Pro Thr Phe Asp Gly 60
    Ala Ala Gin Ile Ala Lys Asp Gly 75 80
    Tyr Glu His Thr Gly Thr His Ile
    4 # φ » * 4 4 » · ί »»
    85 90 95
    Asp Ala Pro Phe His Phe Ser Ala Asp Gly Ala Ser Val Asp Gin Leu 100 105 110 Glu Pro Gin Lys Leu Val Ala Pro Leu Val Ile Val Asp Ile Thr Glu 115 120 125 Arg Ala Lys Glu Asp Ala Asn Ser Thr Ile Glu Ala Glu Asp Ile Glu 130 135 140 Arg Trp Ile Ser Ala Asn Gly Asp Ile Pro Thr Gly Ala Ile Val Ala 145 150 155 160 Leu Arg Ser Gly Trp Ala Thr Lys Val Lys Ser Pro Ser Phe Arg Asn 165 170 175 Asp Glu Ala Gly Gin Phe Ala Phe Pro Gly Phe Gly Lys Ser Ala Thr 180 185 190 Asp Leu Leu Leu Lys Leu Asp Thr Val Ala Ile Gly Val Asp Thr Leu 195 200 205 Ser Leu Asp Pro Gly Asn Ser Ala Asp Phe Ala Val His Asn Ser Trp 210 215 220 Leu Pro Ala Gly Arg Tyr Gly Ile Glu Gly Leu Asn Asn Leu Glu Ala 225 230 235 240 Leu Pro Val Lys Gly Ala Thr Ile Ile Val Gly Ala Pro Ala His Arg 245 250 255 Gly Gly Thr Gly Gly Pro Ala Arg Ile Leu Ala Leu Val
    260 265 <210> 3 <211> 12 <212> PRT <213> Burkholderia caryophylli <400> 3
    Tyr Gly Ile Glu Gly Leu Asn Asn Leu Glu Ala Leu 15 10 <210> 4 <211> 13 <212> PRT <213> Burkholderia caryophylli
    9 9 * 9· • 4 4
    4 ·
    1 * < 9 • 9
    9 · • 9 • 9
    9 9 •
    »9 99 <400> 4
    Ala Lys Glu Asp Ala Asn Ser Thr Ile Glu Ala Glu Asp I 5 10 <210> 5 <211> 13 <212> PRT <213> Burkholderia caryophylli <400> 5
    Tyr Leu Gly Ile Glu Gly Leu Asn Asn Leu Glu Ala Leu 1 5 10 <210> 6 <211> 10 <212> PRT <213> Burkholderia caryophylli <400> 6
    Ala Lys Glu Asp Ala Val Ser Thr Ile Glu 15 10 *9
    9» •
    • 9 *
    9 9
    9 9
    9 ·
    9 9
    9 · • 9
    4 9
    9 9 * ·
    9 9
    9 9 *9 99
    9 · · . 9
    9 9 9 * 9 « 9 • · 9
    -99 »999 tn s
    o a
    ω d
    o a
    '>1 a
    φ i—I tn a
    φ rH ω
    co kO hydrolasu L-pantolaktonu z Burkholderia
    a i—1 CO >1 <0 +» d 0 tl H a •H φ i—1 +> i-l >) g ti 9-1 d a g 0 • •rl >1 ř“1 +J -ta a (0 o o 0
    ♦ · * * • ·· ♦ • « « ♦ · »« · · ♦ · · «*«
    Vi 2 A4 O a '>1 a Φ ω rH in o
    i a '>1 h a in a) r> H in ω hydrolasu L-pantolaktonu z Agrobacterium o
    L H a in n
    řh in b d 0 h rH a J-l φ Φ +> 4-> ϋ g ctí g Λ t 1 β 0 * •rl H !—1 b Ό -Q a (tí O o M
    o co o
    VO o
    N<
    O
    CN o
    n
    V)
    Lf) o
    CN
    O o
    Teplota/°C (=T/°C) in
    CN ♦
    ♦ < »
    1 · ♦· . · · * • « · ·_ *
    «« • * ·· • « « « ·· ·· ·♦ • t « e • » · • « ♦ • · · ♦♦ ♦·<♦ c
    o
    4->
    X <0 rH o
    +J c
    (0 ft
    I
    Pl
    β H ω CO (0 VD rH β 0 Μ Ό Ή >1 i—1 ί3 rH 0 >1 Λ L ft ft 0 ® >1 L ft (0 >1 4-> 0 (0 0 •H C
    «5 í-i
    O
    Ό 0) 0 Ό Λ rH g 0 J3 44 g •H 0 +J m ft O N
    &
    vo in sp n cm τ-t o «
    • 4*
    4 4
    4 4
    4 4 > *4 «4 « • 44
    4 4 «
    4 4 I ‘ 44
    4 4
    4444
    β β 0 £ (d rH 0 +J β (0 a 1 Pl Η Ó ιη η U3 ιη id β rH |β 0 μ Ρ Ό 0) -μ Λ 0 0 β Λ Η Ο Ρ. •Η W TJ (0 Pí Ρ >< β +J β 0 •Η β Ρ Ό φ 0 •μ Λ 0 β φ Λ CVJ β 0 β Ρ » Ή CP 5-1 -μ < Ρί θ ο Ν
    Cb us in n cm t-h o
    Obr. 3
    Restríkční mapa pKS-l- 681 » ·*- ·* ·« «« ·· ·** « * · 9 * » · 9 • · · · · · <« 9 9 · ♦ » ♦ «·«« · · « ·♦♦ ·« 9» 9 9 ·♦'«···
CZ20021449A 1999-10-29 2000-10-20 L-Pantolakton hydroláza a způsob přípravy D-pantolaktonu CZ20021449A3 (cs)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
DE19952501A DE19952501A1 (de) 1999-10-29 1999-10-29 L-Pantolacton-Hydrolase und ein Verfahren zur Herstellung von D-Pantolacton
DE10029194A DE10029194A1 (de) 2000-06-19 2000-06-19 L-Pantolacton-Hydrolase und ein Verfahren zur Herstellung von D-Pantolacton

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CZ20021449A3 true CZ20021449A3 (cs) 2002-10-16

Family

ID=26006072

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CZ20021449A CZ20021449A3 (cs) 1999-10-29 2000-10-20 L-Pantolakton hydroláza a způsob přípravy D-pantolaktonu

Country Status (17)

Country Link
US (1) US6998258B1 (cs)
EP (1) EP1224296A1 (cs)
JP (1) JP2003530080A (cs)
KR (1) KR20020043254A (cs)
CN (1) CN1384880A (cs)
AU (1) AU782517B2 (cs)
BR (1) BR0015114A (cs)
CA (1) CA2389064A1 (cs)
CZ (1) CZ20021449A3 (cs)
EE (1) EE200200225A (cs)
HU (1) HUP0203704A3 (cs)
IL (1) IL148973A0 (cs)
MX (1) MXPA02003417A (cs)
NO (1) NO20021931L (cs)
PL (1) PL355487A1 (cs)
RU (1) RU2002114044A (cs)
WO (1) WO2001032890A1 (cs)

Families Citing this family (86)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20030194798A1 (en) * 2001-05-24 2003-10-16 Surber Mark W. Minicell compositions and methods
PT1570060E (pt) 2002-12-02 2007-09-13 Basf Ag ''sistema de expressão indutível de l-ramnose''
WO2004085651A2 (en) * 2003-03-28 2004-10-07 Dsm Ip Assets B.V. Pantolactone hydrolase
WO2007131750A1 (en) * 2006-05-16 2007-11-22 Dsm Ip Assets B.V. Process for the production of panthenol
SG174013A1 (en) * 2006-07-27 2011-09-29 Wyeth Corp High-cell density fed-batch fermentation process for producing recombinant protein
US9168392B1 (en) 2008-05-22 2015-10-27 Vladimir Balakin Charged particle cancer therapy system X-ray apparatus and method of use thereof
US8436327B2 (en) * 2008-05-22 2013-05-07 Vladimir Balakin Multi-field charged particle cancer therapy method and apparatus
US8642978B2 (en) * 2008-05-22 2014-02-04 Vladimir Balakin Charged particle cancer therapy dose distribution method and apparatus
US8399866B2 (en) 2008-05-22 2013-03-19 Vladimir Balakin Charged particle extraction apparatus and method of use thereof
US10548551B2 (en) 2008-05-22 2020-02-04 W. Davis Lee Depth resolved scintillation detector array imaging apparatus and method of use thereof
US9616252B2 (en) 2008-05-22 2017-04-11 Vladimir Balakin Multi-field cancer therapy apparatus and method of use thereof
US10092776B2 (en) 2008-05-22 2018-10-09 Susan L. Michaud Integrated translation/rotation charged particle imaging/treatment apparatus and method of use thereof
US9095040B2 (en) 2008-05-22 2015-07-28 Vladimir Balakin Charged particle beam acceleration and extraction method and apparatus used in conjunction with a charged particle cancer therapy system
US8129699B2 (en) 2008-05-22 2012-03-06 Vladimir Balakin Multi-field charged particle cancer therapy method and apparatus coordinated with patient respiration
US9177751B2 (en) 2008-05-22 2015-11-03 Vladimir Balakin Carbon ion beam injector apparatus and method of use thereof
US10070831B2 (en) 2008-05-22 2018-09-11 James P. Bennett Integrated cancer therapy—imaging apparatus and method of use thereof
US9737734B2 (en) 2008-05-22 2017-08-22 Susan L. Michaud Charged particle translation slide control apparatus and method of use thereof
US8969834B2 (en) 2008-05-22 2015-03-03 Vladimir Balakin Charged particle therapy patient constraint apparatus and method of use thereof
US8598543B2 (en) * 2008-05-22 2013-12-03 Vladimir Balakin Multi-axis/multi-field charged particle cancer therapy method and apparatus
US8373143B2 (en) * 2008-05-22 2013-02-12 Vladimir Balakin Patient immobilization and repositioning method and apparatus used in conjunction with charged particle cancer therapy
US9579525B2 (en) 2008-05-22 2017-02-28 Vladimir Balakin Multi-axis charged particle cancer therapy method and apparatus
US8374314B2 (en) 2008-05-22 2013-02-12 Vladimir Balakin Synchronized X-ray / breathing method and apparatus used in conjunction with a charged particle cancer therapy system
US8368038B2 (en) 2008-05-22 2013-02-05 Vladimir Balakin Method and apparatus for intensity control of a charged particle beam extracted from a synchrotron
US9782140B2 (en) 2008-05-22 2017-10-10 Susan L. Michaud Hybrid charged particle / X-ray-imaging / treatment apparatus and method of use thereof
US8089054B2 (en) 2008-05-22 2012-01-03 Vladimir Balakin Charged particle beam acceleration and extraction method and apparatus used in conjunction with a charged particle cancer therapy system
US9737272B2 (en) 2008-05-22 2017-08-22 W. Davis Lee Charged particle cancer therapy beam state determination apparatus and method of use thereof
US8519365B2 (en) * 2008-05-22 2013-08-27 Vladimir Balakin Charged particle cancer therapy imaging method and apparatus
US9737733B2 (en) 2008-05-22 2017-08-22 W. Davis Lee Charged particle state determination apparatus and method of use thereof
US9044600B2 (en) * 2008-05-22 2015-06-02 Vladimir Balakin Proton tomography apparatus and method of operation therefor
US8710462B2 (en) * 2008-05-22 2014-04-29 Vladimir Balakin Charged particle cancer therapy beam path control method and apparatus
US9056199B2 (en) 2008-05-22 2015-06-16 Vladimir Balakin Charged particle treatment, rapid patient positioning apparatus and method of use thereof
US8569717B2 (en) * 2008-05-22 2013-10-29 Vladimir Balakin Intensity modulated three-dimensional radiation scanning method and apparatus
US8637833B2 (en) 2008-05-22 2014-01-28 Vladimir Balakin Synchrotron power supply apparatus and method of use thereof
US8975600B2 (en) 2008-05-22 2015-03-10 Vladimir Balakin Treatment delivery control system and method of operation thereof
US8288742B2 (en) * 2008-05-22 2012-10-16 Vladimir Balakin Charged particle cancer therapy patient positioning method and apparatus
US9744380B2 (en) 2008-05-22 2017-08-29 Susan L. Michaud Patient specific beam control assembly of a cancer therapy apparatus and method of use thereof
US9937362B2 (en) 2008-05-22 2018-04-10 W. Davis Lee Dynamic energy control of a charged particle imaging/treatment apparatus and method of use thereof
US10684380B2 (en) 2008-05-22 2020-06-16 W. Davis Lee Multiple scintillation detector array imaging apparatus and method of use thereof
US8624528B2 (en) * 2008-05-22 2014-01-07 Vladimir Balakin Method and apparatus coordinating synchrotron acceleration periods with patient respiration periods
US8309941B2 (en) * 2008-05-22 2012-11-13 Vladimir Balakin Charged particle cancer therapy and patient breath monitoring method and apparatus
US9682254B2 (en) 2008-05-22 2017-06-20 Vladimir Balakin Cancer surface searing apparatus and method of use thereof
US8188688B2 (en) 2008-05-22 2012-05-29 Vladimir Balakin Magnetic field control method and apparatus used in conjunction with a charged particle cancer therapy system
US8373145B2 (en) * 2008-05-22 2013-02-12 Vladimir Balakin Charged particle cancer therapy system magnet control method and apparatus
US9155911B1 (en) 2008-05-22 2015-10-13 Vladimir Balakin Ion source method and apparatus used in conjunction with a charged particle cancer therapy system
US10143854B2 (en) 2008-05-22 2018-12-04 Susan L. Michaud Dual rotation charged particle imaging / treatment apparatus and method of use thereof
US10029122B2 (en) 2008-05-22 2018-07-24 Susan L. Michaud Charged particle—patient motion control system apparatus and method of use thereof
US7939809B2 (en) * 2008-05-22 2011-05-10 Vladimir Balakin Charged particle beam extraction method and apparatus used in conjunction with a charged particle cancer therapy system
US9910166B2 (en) 2008-05-22 2018-03-06 Stephen L. Spotts Redundant charged particle state determination apparatus and method of use thereof
US8198607B2 (en) * 2008-05-22 2012-06-12 Vladimir Balakin Tandem accelerator method and apparatus used in conjunction with a charged particle cancer therapy system
US20090314960A1 (en) * 2008-05-22 2009-12-24 Vladimir Balakin Patient positioning method and apparatus used in conjunction with a charged particle cancer therapy system
US8907309B2 (en) 2009-04-17 2014-12-09 Stephen L. Spotts Treatment delivery control system and method of operation thereof
US8718231B2 (en) 2008-05-22 2014-05-06 Vladimir Balakin X-ray tomography method and apparatus used in conjunction with a charged particle cancer therapy system
US9855444B2 (en) 2008-05-22 2018-01-02 Scott Penfold X-ray detector for proton transit detection apparatus and method of use thereof
US8378321B2 (en) * 2008-05-22 2013-02-19 Vladimir Balakin Charged particle cancer therapy and patient positioning method and apparatus
US8373146B2 (en) * 2008-05-22 2013-02-12 Vladimir Balakin RF accelerator method and apparatus used in conjunction with a charged particle cancer therapy system
US8178859B2 (en) 2008-05-22 2012-05-15 Vladimir Balakin Proton beam positioning verification method and apparatus used in conjunction with a charged particle cancer therapy system
US8378311B2 (en) 2008-05-22 2013-02-19 Vladimir Balakin Synchrotron power cycling apparatus and method of use thereof
US9974978B2 (en) 2008-05-22 2018-05-22 W. Davis Lee Scintillation array apparatus and method of use thereof
US9981147B2 (en) 2008-05-22 2018-05-29 W. Davis Lee Ion beam extraction apparatus and method of use thereof
US9498649B2 (en) 2008-05-22 2016-11-22 Vladimir Balakin Charged particle cancer therapy patient constraint apparatus and method of use thereof
US8625739B2 (en) 2008-07-14 2014-01-07 Vladimir Balakin Charged particle cancer therapy x-ray method and apparatus
US8627822B2 (en) * 2008-07-14 2014-01-14 Vladimir Balakin Semi-vertical positioning method and apparatus used in conjunction with a charged particle cancer therapy system
US8229072B2 (en) * 2008-07-14 2012-07-24 Vladimir Balakin Elongated lifetime X-ray method and apparatus used in conjunction with a charged particle cancer therapy system
WO2010139719A2 (de) 2009-06-05 2010-12-09 Basf Se Biokatalytische herstellung von ambroxan
US10086214B2 (en) 2010-04-16 2018-10-02 Vladimir Balakin Integrated tomography—cancer treatment apparatus and method of use thereof
US9737731B2 (en) 2010-04-16 2017-08-22 Vladimir Balakin Synchrotron energy control apparatus and method of use thereof
US10376717B2 (en) 2010-04-16 2019-08-13 James P. Bennett Intervening object compensating automated radiation treatment plan development apparatus and method of use thereof
US10188877B2 (en) 2010-04-16 2019-01-29 W. Davis Lee Fiducial marker/cancer imaging and treatment apparatus and method of use thereof
US10556126B2 (en) 2010-04-16 2020-02-11 Mark R. Amato Automated radiation treatment plan development apparatus and method of use thereof
US10638988B2 (en) 2010-04-16 2020-05-05 Scott Penfold Simultaneous/single patient position X-ray and proton imaging apparatus and method of use thereof
US10555710B2 (en) 2010-04-16 2020-02-11 James P. Bennett Simultaneous multi-axes imaging apparatus and method of use thereof
US10625097B2 (en) 2010-04-16 2020-04-21 Jillian Reno Semi-automated cancer therapy treatment apparatus and method of use thereof
US10751551B2 (en) 2010-04-16 2020-08-25 James P. Bennett Integrated imaging-cancer treatment apparatus and method of use thereof
US11648420B2 (en) 2010-04-16 2023-05-16 Vladimir Balakin Imaging assisted integrated tomography—cancer treatment apparatus and method of use thereof
US10518109B2 (en) 2010-04-16 2019-12-31 Jillian Reno Transformable charged particle beam path cancer therapy apparatus and method of use thereof
US10349906B2 (en) 2010-04-16 2019-07-16 James P. Bennett Multiplexed proton tomography imaging apparatus and method of use thereof
US10589128B2 (en) 2010-04-16 2020-03-17 Susan L. Michaud Treatment beam path verification in a cancer therapy apparatus and method of use thereof
US10179250B2 (en) 2010-04-16 2019-01-15 Nick Ruebel Auto-updated and implemented radiation treatment plan apparatus and method of use thereof
US8963112B1 (en) 2011-05-25 2015-02-24 Vladimir Balakin Charged particle cancer therapy patient positioning method and apparatus
US8933651B2 (en) 2012-11-16 2015-01-13 Vladimir Balakin Charged particle accelerator magnet apparatus and method of use thereof
KR20180006970A (ko) 2015-06-19 2018-01-19 바스프 에스이 판토락톤의 제조
US9907981B2 (en) 2016-03-07 2018-03-06 Susan L. Michaud Charged particle translation slide control apparatus and method of use thereof
US10037863B2 (en) 2016-05-27 2018-07-31 Mark R. Amato Continuous ion beam kinetic energy dissipater apparatus and method of use thereof
EP3867391A1 (en) 2018-10-18 2021-08-25 Basf Se Method for the production of acrylic acid or salts thereof
EP3748009A1 (en) * 2019-06-07 2020-12-09 DSM IP Assets B.V. Synthesis of (r)-pantolactone acetate
CN110452861B (zh) * 2019-07-10 2021-02-09 杭州师范大学 一种基因重组工程菌及其在催化合成d-泛酰内酯中的应用

Family Cites Families (12)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS5572182A (en) * 1978-11-28 1980-05-30 Sagami Chem Res Center Optical resolution of pantolactone
JPH0667320B2 (ja) * 1986-06-13 1994-08-31 三菱化成株式会社 Ｄ−パントラクトンの製造法
JPH0655156B2 (ja) * 1986-06-13 1994-07-27 三菱化成株式会社 Ｄｌ−パントラクトンの光学分割法
JP2844354B2 (ja) 1989-08-03 1999-01-06 富士薬品工業株式会社 Ｄ―パントラクトンの製造法
DE4005150A1 (de) 1990-02-17 1991-08-22 Hoechst Ag Verfahren zur enzymatischen racematspaltung von pantolacton
JP3011449B2 (ja) 1990-10-05 2000-02-21 富士薬品工業株式会社 Ｄ―パントラクトン加水分解酵素およびその製造法
AU647603B2 (en) 1991-04-02 1994-03-24 Hoechst Aktiengesellschaft An immobilized biocatalyst, its preparation and use for ester synthesis in a column reactor
DE4126580A1 (de) 1991-08-12 1993-02-18 Degussa D-2,4-dihydroxy-3,3-dimethylbutansaeurenitril, seine herstellung und verwendung
KR100266037B1 (ko) 1992-10-15 2000-09-15 에모토 간지 금속대의 연속침탄방법
AU1810197A (en) * 1995-09-13 1997-04-01 Fuji Yakuhin Kogyo Kabushiki Kaisha D-pantolactone hydrolase and gene encoding the same
CN1354795A (zh) 1998-11-10 2002-06-19 诺沃奇梅兹生物技术有限公司 具有内酯水解酶活性的多肽和编码该多肽的核酸
US6395529B1 (en) * 1998-11-10 2002-05-28 Novozymes Biotech, Inc. Polypeptides having lactonohydrolase activity and nucleic acids encoding same

Also Published As

Publication number Publication date
NO20021931D0 (no) 2002-04-24
EP1224296A1 (de) 2002-07-24
MXPA02003417A (es) 2002-08-20
US6998258B1 (en) 2006-02-14
BR0015114A (pt) 2002-07-16
CA2389064A1 (en) 2001-05-10
IL148973A0 (en) 2002-11-10
AU1141601A (en) 2001-05-14
KR20020043254A (ko) 2002-06-08
PL355487A1 (en) 2004-05-04
NO20021931L (no) 2002-04-24
HUP0203704A2 (hu) 2003-03-28
JP2003530080A (ja) 2003-10-14
CN1384880A (zh) 2002-12-11
RU2002114044A (ru) 2004-03-27
AU782517B2 (en) 2005-08-04
EE200200225A (et) 2003-06-16
WO2001032890A1 (de) 2001-05-10
HUP0203704A3 (en) 2006-03-28

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CZ20021449A3 (cs) L-Pantolakton hydroláza a způsob přípravy D-pantolaktonu
Zhang et al. Cloning and biochemical properties of a highly thermostable and enantioselective nitrilase from Alcaligenes sp. ECU0401 and its potential for (R)-(−)-mandelic acid production
WO2008046328A1 (en) A levorotatory lactonohydrolase producing strain and its use for producing chiral oxyacid
You et al. Characterization of a newly synthesized carbonyl reductase and construction of a biocatalytic process for the synthesis of ethyl (S)-4-chloro-3-hydroxybutanoate with high space-time yield
CN107532185B (zh) 羟基-l-哌可酸的制造方法
WO2010024445A1 (ja) 光学活性なアミン誘導体を製造するための方法
Zhang et al. Characterization of a new nitrilase from Hoeflea phototrophica DFL-43 for a two-step one-pot synthesis of (S)-β-amino acids
Wang et al. Discovery of a new NADPH-dependent aldo-keto reductase from Candida orthopsilosis catalyzing the stereospecific synthesis of (R)-pantolactone by genome mining
Wang et al. A novel nitrilase from Rhodobacter sphaeroides LHS-305: cloning, heterologous expression and biochemical characterization
Zhu et al. Development of an Escherichia coli whole cell catalyst harboring conjugated polyketone reductase from Candida glabrata for synthesis of d-(−)-pantolactone
JP5919192B2 (ja) βアミノ酸の調製
Sun et al. Biocatalysis of heterogenously-expressed d-lactonohydrolases and its efficient preparation of desirable d-pantoic acid
Wang et al. Functional characterization of salt‐tolerant microbial esterase WDEst17 and its use in the generation of optically pure ethyl (R)‐3‐hydroxybutyrate
CN102329745B (zh) 高稳定性耐有机溶剂脂肪酶产生菌及脂肪酶和其基因与应用
US12473578B2 (en) Carbonyl reductase, nucleic acid encoding same, and method for producing optically active compound using same
CN103215238B (zh) 一种海洋细菌酯酶及其制备方法与应用
US10087473B2 (en) Method for manufacturing cis-5-hydroxy-L-pipecolic acid
Peng et al. Co-expression of an organic solvent-tolerant lipase and its cognate foldase of Pseudomonas aeruginosa CS-2 and the application of the immobilized recombinant lipase
KR100463966B1 (ko) 시아노카르복실산 에스테르로부터 디카르복실산모노에스테르의 제조
WO2018108966A1 (en) Arylalkylamine n-acetyltransferase and uses thereof
JP4729919B2 (ja) 微生物の培養方法及び光学活性カルボン酸の製造方法
CN108060186B (zh) 一种对硝基苄醇丙二酸单酯的生物制备方法
Liang et al. Functional characterization of a novel microbial esterase identified from the Indian Ocean and its use in the stereoselective preparation of (R)-methyl mandelate
Chen et al. Biocatalytic properties of a recombinant Fusarium proliferatum lactonase with significantly enhanced production by optimal expression in Escherichia coli
CN101268197A (zh) 用于将芳香卤代二腈转化为卤代氰基羧酸的新方法