CZ20022502A3

CZ20022502A3 - Elongázový gen a způsob přípravy polynenasycených mastných kyselin

Info

Publication number: CZ20022502A3
Application number: CZ20022502A
Authority: CZ
Inventors: Ernst Heinz; Thorsten Zank; Ulrich Zähringer; Jens Lerchl; Andreas Renz
Original assignee: Basf Aktiengesellschaft
Priority date: 2000-02-09
Filing date: 2001-02-08
Publication date: 2002-10-16
Also published as: DK1254238T3; AU3924401A; IL150414A0; JP2003523746A; MXPA02007078A; US7544859B2; PL207026B1; CA2399349C; NO20023757L; HUP0300081A2; AR030051A1; HUP0300081A3; WO2001059128A2; AU2001239244B2; DE50115107D1; CA2399349A1; CN1398300A; CN1247784C; EE200200443A; US20080160054A1

Description

Vynález se týká nového elongázového genu se sekvencemi uvedenými v sekvenci SEQ ID Ν0=1, SEQ ID NQ = 3, SEQ ID NO-'5, SEQ ID NO:?, SEQ ID Ν0 = 9 a SEQ ID 140=11. nebo jeho homologů, derivátů nebo analogů pro genový konstrukt obsahující tento gen nebo jeho homology, deriváty nebo analogy a jeho použití. Vynález se také týká vektorů nebo transgenních organizmů obsahujících elongázový gen se sekvencemi uvedenými v sekvenci SEQ ID 140=1, SEQ ID ND=3, SEQ ID N0 = 5, SEQ ID N0 = 7, SEQ ID N0 = 9 a SEQ ID NO:11 nebo jejich homologů, derivátů nebo analogů. Vynález se rovněž týká použití elongázových genových sekvencí samotných nebo v kombinaci s dalšími elongázami a/nebo s dalšími geny pro biosyntézu mastných kyselin. Vynález se týká nového elongázového genu se sekvencí SEQ ID N0^:l nebo jeho hornologfl, derivátů nebo analogů.

Vynález se také týká způsobu přípravy polynenasycených mastných kyselin a způsobů zavádění DNA do organizmů, které produkují velké množství olejů, zvláště olejů s vysokým obsahem nenasycených mastných kyselin. Zvláště se vynálezu týká přípravy oleje a/nebo mastné kyseliny s vyšším obsahem polynenasycených mastných kyselin s alespoň dvěma dvojnými vazbami a/nebo přípravy triacyIglycerolu s vysokým obsahem polynenasycených mastných kyselin s alespoň dvěma dvojnými vazbami.

Dos a vadil í s tav tec hn i ky

Určité produkty a vedlejší produkty přírodně se vyskytujících metabolických procesů v buňkách se mohou využít v širokém spektru průmyslových odvětví, jako jsou průmysl živočišné výživy, průmysl potravinářský, kosmetický a farmaceutický. Tyto molekuly, které se zde společně označují jako jemné chemikálie zahrnují také lipidy a mastné kyseliny, přičemž příkladem této třídy jsou polynenasycené mastné kyseliny. Folynenasycené mastné kyseliny (PUFA) se například přidávají do dětské výživy ke zvýšení její výživné hodnoty. Například mají PUFA pozitivní vliv na hladinu cholesterolu v krvi lidí a jsou proto vhodné pro ochranu proti onemocnění srdce. Jemné chemikálie a polynenasycené mastné kyseliny (PUFA) se mohou izolovat z živočišných zdrojů, například z ryb, nebo z mikroorganizmů. Kultivace mikroorganizmů umožňuje produkovt a izolovat velká množství žádaných molekul.

Jakožto obzvláště vhodné mikroorganizmy pro přípravu PUFA se uvádějí kmeny Thraustochytria nebo Schizochytria, řasy jako Phaeodactylura tricornutum nebo druhy Crypthecodinium, Cillata jako Stylonychia nebo Colpidium, houby jako Mortierella, Entomophthora nebo Mucor. Četné mutantní kmeny příslušných mikroorganizmů, které produkují řadu žádaných sloučenin, včetně PUFA, byly vyvinuty selekcí kmenů. Touto selekcí kmenů za účelem zlepšení produkce určité molekuly je však časově náročná a obtížná operace. Nedostatkem je rovněž skutečnost, že se definovaným mikroorganizmem může produkovat pouze secifická nenasycená mastná kyselina nebo pouze specifické spektrum mastných kyselin.

Jemné chemikálie se také mohou vhodně vyrábět ve velkém měřítku prostřednictvím produkce rostlin, které se vyvíjely tak, že produkují shora uvedené PUFA. Jakožto rostliny zvláště vhodné k tomuto účelu se uvádějí olejniny, které obsahují velké množství lipidových sloučenin, jako jsou řepka olejka, kanola, len, sója, slunečnice, brutnákovité a pupalka dvouletá. Jsou však vhodné i jiné kulturní rostliny, které obsahují oleje nebo lipidy a mastné kyseliny, jak bude níže ještě podrobně uvedeno. Běžné pěstování rostlin vedlo k vývoji řady rostlinných mutantň, které produkují celé spektrum žádaných lipidů a • *· ·* ···· ·· ·· • ••9 ·· · ···· • · · · · · · · · • · · · · · · · · • · · · · ·· * ······ mastných kyselin, kofaktorů a enzymů. Avšak opět selekce nových variant rostlin se zlepšenou produkcí určité molekuly je časově náročný a obtížný proces nebo dokonce je nemožná, pokud se příslušná sloučenina přírodně v rostlině nevyskytuje, jak je tomu v případě polynenasycených mastných kyselin se 20 atomy uhlíku a mastných kyselin se 22 atomy uhlíku a mastných kyselin s delšími uhlíkovými řetězci.

Podstata vynálezu

Podstatou vynálezu je izolovaná nukleová kyselina odvozená z rostlin a z řas a kódující polypeptid, která elonguje mastné kyseliny se 16, 18 nebo 20 atomy uhlíku alespoň se dvěma dvojnými vazbami ve skeletu mastné kyseliny o alespoň dva atomy uhlíku.

Podstatou vynálezu je také genový konstrukt zahrnující izolovanou nukleovou kyselinu, přičemž je nukleová kyselina funkčně vázána na jeden nebo na několik regulačních signálů.

Podstatou vynálezu je také aminokyselinová sekvence, která se zakódovává izolovanou sekvencí nukleové kyseliny nebo genovým konstruktem.

Vynález se také týká mikroorganizmu, který zahrnuje alespoň jednu nukleovou kyselinu, genový konstrukt nebo vektor podle vynálezu.

Vynález se také týká přípravy polynenasycených mastných kyselin PUPA a olejů, lipidů nebo mastných kyselin produkovaných tímto způsobem.

Vynález se také týká kitu, který obsahuje nukleovou kyselinu, genový konstrukt a další složky podle vynálezu.

Vynález se konečně také týká způsobu identifikace antagonistu nebo agonistu elongace podle vynálezu.

Vynález se tedy týká nových molekul nukleové kyseliny, které jsou vhodné pro identifikaci a izolaci elongázových genů PUPA biosyntézy a kterých lze použít pro modifikaci olejů, mastných kyselin, lipidů, sloučenin odvozených od lipidů a hlavně pro přípravu polynenasycených mastných kyselin, jelikož se jeví velká potřeba nových genů, které kódují enzmymy, které se podílejí na biosyntéze nenasycených mastných kyselin a které umožňují jejich přípravu v průmyslovém měřítku. Zvláště jsou žádoucí enzymy pro biosyntézu mastných kyselin, které umožňují elongaci polynenasycených mastných kyselin, zvláště se dvěma nebo s několika dvojnými vazbami v molekule. Nukleové kyseliny podle vynálezu kódují enzymy, které mají tuto žádanou schopnost.

Mikroorganizmy jako Phaeodactylum, Colpidium, Mortierella, Entomophthora nebo Mucor, Crypthecodinium a jiné řasy, houby a rostliny, zvláště kulturní olejnaté rostliny se využívají obecně pro průmyslovou výrobu velkého množství jemných chem i ká1 i í v provozu ím měř i tku.

Jsou k dispozici klonovací vektory a techniky pro genetickou manipulaci shora uvedených mikroorganizmů a Cil iata (světový patentový spis WO 98/01572 a WO 00/23604) nebo řasy a podobné mikroorganizmy jako Phaeodactylum tricornutum, které popsal Falciatore a kol. (Marině Biotechnology 1(3), str.239 až 251, 1999 a uvedená literatura) a Dunahay a kol. (Genetic transformation of diatoms, J. Phycol. 31, str. 1004 až 1012, 1995 a uvedená literatura). Molekuly nukleové kyseliny podle vynálezu se mohou použít pro rekombinantní modifikace těchto organizmů, takže se stávají lepšími a účinnějšími producery jedné nebo několika jemných chemikálií zvláště nenasycených mastných kyselin- Tato zlepšená produkce nebo účinnější produkce jemných chemikálií může být způsobena přímým působením nebo manipulací genu podle vynálezu nebo nepřímým působením takové manipulace.

Mechy a řasy jsou jedinými známými rostlinnými systémy, které produkují závažná množství polynenasycených mastných kyselin, jako jsou kyselina arašídová, CARA) a/nebo eikosapentanová CEPA) a/nebo dokosahexanová CDHA) kyselina. Mechy obsahují PUFA v membránových lipidech, zatímco řasy, organizmy příbuzné řasám a některé houby také kumulují závažná množství PUFA v triacylglyeerolové frakci. Molekuly nukleové kyseliny, které se izolují z takových kmenů, které také kumulují PUFA v triacylglycerolových frakcích, jsou zvláště vhodné pro modifikaci lipidu a PUFA produkčních systémů v hostitelích zvláště v mikroorganizmech, jako jsou shora uvedené mikroorganizmy, a v rostlinách, jako jsou olejnaté rostliny, například řepka olejka, canola, lněné semínko, sója, slunečnice, brutnákovité, rostliny produkující ricinový olej, olejová palma, safran CCarthamus tinctorius), kokos, podzemniee nebo kakaové boby. Nukleové kyseliny z mikroorganizmů, kumulujících triacylglycerolovou frakci, se také mohou využít pro identifikaci takových sekvencí DNA a enzymů v jiných druzích, které jsou vhodné pro modifikaci biosyntézy PUFA prekurzorových molekul v příslušných organizmech. Mikroorganizmy, které kumulují PUFA, jako ARA, EPA a DHA v triacylgflycerolech, jsou zvláště mikroorganizmy jako Crypthecodinium cohnii a Thraustochytrium species. Thraustochytria jsou také těsně příbuzné s kmeny Schizochytria ve smyslu fylogenetiky. Právě ačkoliv tyto organizmy nejsou úzce příbuzné mechům, jako je Physcomítřella, sekvenční podobnosti . DNA sekvence, zvláště polypeptidová hladina, se může pozorovat do té míry, že se molekuly DNA mohou identifikovat, izolovat a charakterizovat funkčně v heterologových hybridizačnich pokusech, řazeních sekvencí a pokusech za použití polymerázových řetězových reakcí i z organizmů, které jsou vzdáleně příbuzné z hlediska evoluce. Zvláště se mohou odvozovat kon6 senzní sekvence, které jsou vhodné pro heterologový skríning nebo pro funkční komplementaci a predikci genových funkcí v třetích druzích. Shopnost identifikace takových funkcí, například k predikci suhstátové specifleity enzymů, může mít proto velký význam. Kromě toho molekuly nukleové kyseliny mohou působit, jako referenční sekvence pro mapování příbuzných genomů nebo pro odvozování PCR primerů.

Nové molekuly nukleové kyseliny kódují proteiny označované zde PUFA-specifické elongázy (PSE). Tyto PSE mohou například vyvíjet funkci, která se podílí na metabolizmu (například na biosyntéze nebo na odbourání) sloučenin potřebných pro syntézu lipidu nebo mastné kyseliny, jako jsou PUFA, nebo se podílí na transmembránovém transportu jedné nebo několika kompozic lipid/mastná kyselina buď v buňce nebo mimo buňku.

Toto nové použití detailněji ukazuje izolaci takových nových elongázových genů. Nejdříve byly izolovány elongázové geny, které jsou vhodné pro produkci polynenasycených mastných kyselin s dlouhým řetězcem, mající více než 18 nebo 20 atomů uhlíku v uhlíkovém skeletu mastné kyseliny a/nebo alespoň dvě dvojné vazby v uhlíkovém řetězci, odvozované od typických organizmů, které obsahují vysoké množství PUFA v triacylglycerolové frakci. To znamená buď PSE gen nebo PSE protein nebo PSe geny nebo PSE proteiny. Zveřejněné přihlášky vynálezu, patentové spisy a publikace nepopisují funkčně aktivní PSE gen, právě ačkoliv různé patentové spisy popisují elongaci nasycených mastných kyselin s krátkou nebo se střední délkou řetězce (světový patentový spis číslo WO 98/46776 a americký patentový spis číslo US 5 475099) nebo elongaci nebo produkci mastných kyselin s dlouhým řetězcem, které však nemají více než jednu dvojnou vazbu nebo vedou k voskovým esterům mastné kyseliny s dlouhým řetězcem (světový patentový spis číslo WO 98/54954, WO 96/13582, WO 95/15387). Vynález se týká izolace nových elongáz s novými vlastnostmi. Jestliže se vychází ze sekvence • · • · ·· » « φ * · · φ • φ « • · ΦΦΦ· v SEQ ID Ν0=1, je možné nalézti nové nukleové kyseliny, které kódují elongázy, které elongují nenasycené mastné kyseliny.

Světové patentové spisy VO 99/64616, WO 98/46763, WO 98/ 46764, VO 98/46765 popisují produkci PUFA v transgenových rostlinách a demonstrují klonování a funkční expresi odpovídajících desaturázových aktivit, zvláště z hub, nedemonstrují však PSE kódující gen a žádné funkční PSE aktivity. Exprese desaturázových aktivit vede k posunu ve spektru mastných kyselin v transgenových rostlinách, nepozoruje se však žádné zvýšení obsahu nenasycených mastných kyselin. Produkce trienové kyseliny s 18 atomy uhlíku byla demonstrována a nárokována se zřetelem na gama-1inolenovou kyselinu avšak produkce polynenasycených mastných kyselin s velmi, dlouhým řetězcem Cse 20 atomy uhlíku a s delším uhlíkovým řetězcem a trienových kyselin a vyšších nenasycených typů) až dosud demonstrována nebyla.

Pro přípravu PUFA s dlouhým řetězcem se musí polynenasycené mastné kyseliny s 16 nebo s 18 atomy uhlíku elongovat o alespoň dva atomy uhlíku enzymatickou aktivitou elongázy. Nukleová kyselinová sekvence SEQ ID NO-1 podle vynálezu kóduje první rostlinnou elongázu, která je schopná elongovat mastné kyseliny s 16 nebo s 18 atomy uhlíku s alespoň dvěma dvojnými vazbami ve skeletu kyseliny o alespoň dva atomy uhlíku. Po elongačním cyklu vede tato enzymová aktivita k mastným kyselinám se 20 atomy uhlíku a po dvou, třech a čtyřech cyklech elongace k mastným kyselinám se 22, 24, nebo 26 atomy uhlíku. Mohou se také syntetizovat PUFA s delším řetězcem pomocí jiných elongáz, kterých se vynález týká CSEQ ID NQ:3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID N0--7, SEQ ID N0=9 a SEQ ID NQ:11). Tyto elongázy se mohou používat jednotlivě, násobně nebo například v adici k PUFA elongáze z mechu Physcomitřel1a patens CSEQ ID Ν0=1) pro zvýšení obsahu PUFA při novém způsobu přípravy PUFA. Aktivita elongáz podle vynálezu vede s výhodou k mastným kyselinám se 20 atomy uhlíku s alespoň dvěma dvojnými vazbami v molekule • · mastné kyseliny, s výhodou se třemi nebo čtyřmi dvojnými vazbami, zvláště s výhodou se třemi dvojnými vazbami v molekule mastné kyseliny a/nebo vede k mastným kyselinám se 22 atomy uhlíku s alespoň dvěma dvojnými vazbami v molekule mastné kyseliny, s výhodou se čtyřmi, pěti nebo šesti dvojnými vazbami, zvláště s výhodou s pěti nebo šesti dvojnými vazbami v molekule mastné kyseliny. Když proběhne elongace enzymem podle vynálezu, mohou se provádět další desaturační stupně k získání mastných kyselin s vysokou nenasyceností. Produkty elongázové aktivity a další desaturaee, která je možná, vedou k výhodným PUFA s vyšším stupněm desaturaee, jako jsou kyselina dokosadienová, arašidonová, omega6-eikosatriendihomo-gama linolenová, eikosapentaenová, omega3-eikosatrienová, omegaS-eikosatetraenová, dokosapentaenová nebo dokosahexaenová kyselina- Jako substráty enzymové aktivity podle vynálezu se uvádějí příkladně kyselina taxolová, 7,10,13-hexadekatrienová, 6,9-oktadekadienová, linolová, linolenová, α-1 inolenová nebo gama-linolenová nebo stearidonová kyselina avšak také kyselina arašidonová , eíkosatetraenová, dokosapentaenová a eikosapentaenová kyselina. Výhodnými substráty jsou kyselina linolová, a/nebo gama- 1 inolenová a/nebo «-linolenová kyselina avšak také kyselina arašidonová, eíkosatetraenová, dokosapentaenová a eikosapentaenová kyselina- Obzvláště výhodnými jsou kyselina arašidonová, dokosapentaenová a eikosapentaenová kyselina. Mastné kyseliny se 1.6 nebo 18 atomy uhlíku s alespoň dvěma dvojnými vazbami ve skeletu mastné kyseliny se mohou elongovat enzymatickou aktivitou podle vynálezu ve formě volné mastné kyseliny nebo ve formě esterů, jako jsou fosfolipidy, glykolipidy, sfingolipidy, fosfoglyceridy, monoacylglycerol, diacylglycerol nebo triacylglycerol- Zvláštní význam pro výživu lidí má konjugovaná linolová kyselina CLA. Označením CLA se míní zvláště mastné kyseliny jako C18-2^9c1®^1ltrans nebo isoraer C18-Slotrans,12cis který se může desat-urovat nebo elongovat po absorpci tělem díky lidskému enzymovému systému a může přispívat k podpoře zdraví. Elongázy podle vynlezu umožňují také elongaci těchto • »♦ · • · • · · · · ·· · · · konjugovaných mastných kyselin, které mají alespoň jednu dvojnou vazbu v molekule a tak činit dostupnými takové zdraví podporující mastné kyseliny pro lidskou výživu. Jakožto další příklady konjugovaných mastných kyselin se uvádějí kyselina a-parinarová, eleostearová a kalendulová kysel ina.

Klónováním vektorů pro použití v rostlinách a v transformaci rostlin, známým z literatury CPlant Molecular Biology and Biotechnology [CRC press, Boča Raton, Florida], kapitola 6/7, str. 71 až 119, 1993; F.F. Whit-e, Vectors for Gene

Transfer in Higher Plants, Transgenic Plants, sv. 1, Engineering and liti 1 izat,ion, vyd. Kung a R. Vu, Academie Press, str. 15 až 3B, 1993; B. Jenes a kol., Techniques for Gene Ttransfer, Transgenic Plants, sv. 1, Engineering and IJtilization, vyd. Kung a R. Vu, Academie Press, str. 128 až 143, 1993; Potrykus, Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Molec. Biol- 4.2, str. 205 až 225, 1991) se mohou použít nukleové kyseliny podle vynálezu pro rekombinantní modifikace širokého spektra rostlin takže se stanou lepšími, účinnějšími nebo modifikovanými producery jednoho nebo několika produktů odvozených od lipidů, například PlIFA. Tato zlepšená produkce nebo produkční účinnost produktu odvozeného od lipidu, jako PUFA může být způsobena přímým působením manipulace nebo nepřímým působením této manipulace.

Je známa řada mechanizmů, kterými modifikace PSE proteinu podle vynálezu může přímo ovlivnit výtěžek, produkci a/nebo produkční účinnost jemné chemikálie z olejnin nebo z mikroorganizmů se zřetelem na modifikovaný protein. Počet nebo aktivita PSE proteinu nebo PSE genu se může zvýšit, takže se produkuje větší množství těchto sloučenin de novo, jelikož organizmy nemají tuto aktivitu a schopnopst bíosyntézy před zavedením příslušného genu. Rovněž použití různých divergentních sekvencí, to je sekvencí, které se liší od DNA sekvenční hladiny, mohou být. výhodné v této souvislosti.

Zavádění PSE genu nebo plurality PSE genů do organizmu nebo do buňky může nejen zvýšit biosyntézní pochod k získání konečného produktu, může však také zvýšit nebo vytvořit de novo odpovídající triacylglycerolovou kompozici. Rovněž počet, nebo aktivita jiných genů, které jsou zahrnuty v dodání živin potřebných pro biosyntézu jedné nebo několika jemných chemikálií (například mastných kyselin, polárních nebo neutrálních lipidů), se může zvýšit, takže koncentrace těchto prekurzorů, kofaktorů nebo meziproduktů se zvýší v buňkách nebo ve skladovacích orgánech, takže se dále zvýší schopnost buněk produkovat PUFA, jak se níže vysvětlí. Mastné kyseliny a lipidy jsou jako takové žádoucími jemnými chemikáliemi: optimalizace aktivity nebo zvýšení počtu jedné nebo několika PSE, které jsou zahrnuty v biosyntéze těchto sloučenin nebo destrukce aktivity jedné nebo několika PSE, které jsou zahrnuty v odbourání těchto sloučenin, mohou umožňovat zvýšení výtěžku, produkce a/nebo produkční účinnosti molekul mastných kyselin a molekul lipidů z rostlin nebo z mikroorganizmů.

Mutageneze PSE genu podle vynálezu může vést také k PSE proteinu, který modifikuje aktivity, které přímo nebo nepřímo ovlivňují produkci jedné nebo několika žádaných jemných chemikálií. Například počet nebo aktivita PSE genu podle vynálezu se může zvýšit, takže normální metabolické odpadní produkty nebo vedlejší produkty buňky ( jejichž množství se může zvýšit se zřetelem na nadprodukci žádané jemné chemikálie) se převede účinným způsobem před destrukcí jiných molekul nebo procesů v buňce (což by snižovalo buněčnou životnost) nebo by narušovalo biosyntézní pochod jemné chemikálie (a tak snižovalo výtěžek, produkci nebo produkční účinnost žádané jemné chemikálie). Kromě toho poměrně velká intracelulární množství žádané jemné chemikálie jako takové mohou být pro buňku toxická nebo mohou interferovat s enzymatickým mechanizmem zpětné vazby, jako je allosterická regulace; například by mohla zvyšovat alokaci PUFA do triacylglycerolové frakce se zřetelem na zvý11 • · · • · senou aktivitu nebo počet. jiných enzymů nebo detoxifíkaci enzymů v následující cestě PUFA; životnost buněk semen se může zvýšit, což vede k: lepšímu vývoji buněk v kultuře nebo v semenech, která produkují žádanou jemnou chemikálii. Nebo se PSE gen podle vynálezu může? manipulovat tak, že se produkují odpovídající množství různých lipidových molekul a molekul mastných kyselin. To může mít rozhodující vliv na složení lipidu buněčné membrány a generovat nové oleje vedle PUFA, které se syntetizují de novo. Jelikož má každý typ lipidu odlišné fyzikálkní vlastnosti, změna složení lipidu membrány podstatně modifikuje membránovou fluiditu. Změny membránové fluidity mohou mít vliv na transport molekul membránou a na integritu buňky, což opět má rozhodující vliv na produkci jemných chemikálií- I v rostlinách mohou tyto změny mít také vliv na jiné vlastnosti, jako jsou tolerance k abiotickým a biotickým stresovým situac ím.

Biotická a abiotická stresová tolerance je obecná vlastnost, kterou je žádoucí vnést do širokého spektra rostlin, jako jsou kukuřice, pšenice, žito, oves, triticale, rýže, ječmen, sója, podzemnice, bavlník, řepka olejka a canola, maniok, pepř, slunečnice a aksamitník, rostliny Solanaceae jako brambory, tabák, lilek a rajče, Vicia species, hrách, vojtěžká, keřovité rostliny (kávovník, kakaovník, čajovník), Salix species, stromy (olejová palma, kokosová palma), víceleté trávy a píce. Podle vynálezu jsou tyto rostliny také výhodnými cílovými rostlinami pro genetické inženýrství. Obzvláště výhodnými rostlinami pro účely vynálezu jsou olejniny jako sója, podzemnice, řepka olejka, canola, slunečnice, světlice, stromy (olejová palma, kokosová palma), nebo obilniny jako kukuřice, pšenice, žito, oves, triticale, rýže, ječmen, vojtěžká nebo keřovité rostliny (kávovník, kakaovník, čajovník).

Vynález se také týká izolovaných molekul nukleové kyseliny (například cDNA) obsahujících nukleotidové sekvence, které fc fcfc ·· ···· ·· fcfc • * · · ·♦ ♦ ♦ · * · • fcfc ··· ·· · • fcfc · · · · · · • fcfc · · fc· · ·· fc··· kódují PSE nebo některé PSE nebo jejich biologicky aktivní části, nebo framenty nukleové kyseliny, které jsou vhodné jako primery nebo hybridizační sondy pro detekci nebo zesílení PSE kódujících nukleových kyselin (například DNA nebo mRNA). Podle zvláště výhodného provedení molekula nukleové kyseliny zahrnuje jednu z nukleotidových sekvencí ze souboru zahrnujícího: SEQ ID NO=1, SEQ ID N0’-3, SEQ ID Ν0 = 5, SEQ ID NQ:7, SEQ ID NQ:

a SEQ ID NO=11 nebo kódující region nebo komplement jedné z těchto nukleotidových sekvencí. Podle jiného výhodného provedení izolovaná molekula nukleové kyseliny podle vynálezu zahrnuje nukleotidovou sekvenci, která hybridizuje s nukleotidovou sekvencí ze souboru zahrnujícího: SEQ ID NQ:1, SEQ ID NO:3, SEQ ID N0--5, SEQ ID NQ:?, SEQ ID NQ:9 a SEQ ID NO: 11 nebo s její částí nebo která má s ní alespoň přibližně 50¾. s výhodou alespoň přibližně 60¾. ještě výhodněji alespoň přibližně 70¾. 80¾ nebo 90¾ a ještě výhodněji alespoň přibližně 95¾. 96¾. 97¾. 98¾. 99¾ nebo vyšší homologii- Podle jiného výhodného provedení izolovaná molekula nukleové kyseliny kóduje jednu aminokyselinovou sekvenci ze souboru zahrnujícího: SEQ ID NQ:2, SEQ ID N0 = 4, SEQ ID NQ:&, SEQ ID N0--8, SEQ ID NO: 10 a SEQ ID NO:12. s výhodou výhodný PSE gen podle vynálezu má také alespoň jednu PSE zde popisovanou aktivitu.

Podle dalšího provedení vynálezu kóduje izolovaná molekula nukleové kyseliny protein nebo jeho část, protein nebo jeho část obsahující aminokyselinovou sekvenci, která má dostatečnou homologii s aminokyselinovou sekvencí ze souboru zahrnujícího: SEQ ID N0:2, SEQ ID NCC4, SEQ ID NQ:6, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO: 10 a SEQ ID NO:12, přičemž si protein nebo jeho část uchovává PSE aktivitu. S výhodou protein nebo jeho část, který je kódován molekulou nukleové kyseliny, si podržuje schonost podílet se na metabolizmu žádaných sloučenin pro syntézu buněčných membrán rostlin nebo na transportu molekul touto membránou. Podle jednoho provedení vynálezu má protein, kódovaný molekulou nukleové kyseliny, alespoň přibližně 50¾.

·· »«»· • ··

9 9 9 9 • ·· · ·

9 9 9 9 9 9

9 9 9 9 9

999 99 99 9

99

9 9 9

9 9

9999 s výhodou alespoň přibližně 60%, ještě výhodněji alespoň přibližně 70%, 80% nebo 90% a ještě výhodněji alespoň přibližně 95%, 96%, 97%, 98%, 99% nebo vyšší homologii s aminokyselinovou sekvenci ze souboru zahrnujícího: SEQ ID N0^;2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:8, SEQ ID N0= 10 a SEQ ID NO=12. Podle dalšího výhodného provedení je proteinem protein s plnou délkou, jehož část je v podstatě homologická s kompletní aminokyselinovou sekvencí ze souboru zahrnujícího: SEQ ID NO:2, SEQ ID NQ:4, SEQ ID Ν0=6, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO: 10 _a SEQ ID NO:12 (která je v důsledku otevřeného čtecího rámce ukázána v sekvenci ze souboru zahrnujícího: SEQ ID N0=l, SEQ ID N0:3, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:7, SEQ ID N0=9 a SEQ ID NQ:11) a která se může izolovat v plné délce způsoby a pokusy běžnými pro pracovníky v oboru.

Podle jiného provedení izolovaná molekula nukleové kyseliny pochází z Phytophthora infestans, z Physcomitřel 1a patens, z Crypthecodiniura cohnii nebo z Thraustochytria a kóduje protein (například PSE fuzní protein) obsahující biologicky aktivní doménu, která má alespoň 50% nebo vyšší homologii s aminokyselinovou sekvencí sekvence SEQ ID NO: 2, SEQ l'D N0 = 4, SEQ ID NO:6, SEQ ID N0=8, SEQ ID N0= 10 a SEQ ID NO:12 _a ponechává si schopnost podílet se na metabolizmu žádaných sloučenin pro syntézu buněčných membrán rostlin nebo na transportu molekul touto membránou, nebo která má alespoň jednu elongační aktivitu vedoucí k PUFA, jako jsou ARA, EPA nebo DHA nebo jejich prekursorové molekuly nebo jednu z aktivit uvedených v tabulce I, a zahrnuje také heterologové sekvence nukleové kyseliny, které kódují heterologový polypeptid nebo regulační proteiny.

sem dočteno

V tabulce je profil mastných kyselin pěti transgenových kvasnicových kmenů v mol procentech. Podíly přidané a absorbované gama linolenové kyseliny jsou zdůrazněny tučným vytištěním, elongované produkty jsou podtrženy a elongovaná kyseliny gama-1 inolenová je zdůrazněna vytištěním tučně (poslední řádek14

9

9· ···· 9« ··

9 9 9 9 9 9

9 9 9 9 9

Mastné kysyeliny	pYES2	pY2PSEla	pY2PSElb	pY2PSElc	pY2PSEld

	16:0	17,0	17,6	16,4	16,3	17,6
	16:1Δ⁹	28,0	26,8	28,0 6,4 27,0	27,9	25_fl
	18:0	6,5 25,9 22,6	6.0	5,6	6,1
	18:1Δ⁹	23,5	25.2	21,4
	18:3Δ⁶'⁹'¹²	15,7	13,2	16,4	22,8
	20:3Δ^8ί11'¹⁴	10,3	9,0	8,6	7,1
	18:3Δ⁶'⁹'¹²- Elongace	-	39,6	40,5	34,4	23.7

ϊ

Podle jiného provedení má izolovaná molekula nukleové kyseliny alespoň 15 nukleotidů ve své délce a hybridizuje za přísných podmínek s molekulou nukleové kyseliny obsahující nukleotidovou sekvenci SEQ ID NCPl, SEQ ID N0 = 3, SEQ ID N0 = 5, SWQ ID NO:?. SEQ ID N0=9 a SEQ ID Ν0=11. Izolovaná molekula nukleové kyseliny odpovídá s výhodou přírodně se vyskytující molekule nukleové kyseliny. Ještě výhodněji kóduje izolovaná molekula nukleové kyseliny přírodně se vyskytující Crypthecodinium, Phytophthora nebo Thraustochytrium PSE nebo jejich biologicky aktivní podíl.

Vynález se také týká vektorů, například rekombinantních expresních vektorů, obsahujících alespoň jednu nukleotidovou molekulu podle vynálezu a hostitelské buňky, do kterých jsou tyto vektory zavedeny, zvláště mikroorganizmy, rostlinné buňky, rostlinné tkáně, rostlinné orgány nebo nedotčené rostliny. Podle jednoho provedení vynálezu může hostitelská buňka ukládat jemné chemikálie, zvláště PUFA; k izolaci žádané sloučeniny se buňky sklidí. Sloučeniny (oleje, lipidy, triacylglyceridy, mastné kyseliny) nebo PSE se mohou izolovat z prostředí nebo z hostitelské buňky, kterými v případě rostlin, jsou buňky obsahující nebo skladující jemné chemikálie, nejvýhodněji buňky skladujících tkání, jako jsou semenné obaly, hlízy, epidermové buňky a semenné buňky.

Vynález se také týká geneticky modifikovaných rostlin, • ·« 99 ··«· 9« ·· ·♦ 9 · · · · 9 9 9 9

99 · · 9 · · 9

999 99 99 9 9 • 9 9 999 999

999 99 99 9 999999 s výhodou shora uvedených olejnin, zvláště řepky olejky, lněného semínka nebo rostliny Physcomitřel1a patens, do kterých byl zaveden PSE gen. Podle jednoho provedení genom řepky olejky, lněného semínka nebo rostliny Physcomitřel 1a patens je modifikován zavedením jakožto transgenu molekuly nukleové kyseliny podle vynálezu kódující divoký typ nebo mutovanou PSE sekvenci. Podle jiného provedení vynálezu se modifikuje endogenní PSE gen v genomu donorového organizmu Physcomitřel 1a patens, Phytopht-hora infestans, Crypthecodinium nebo Thraust-ochytrium, takže se funkčně naruší, například homologovou rekombinací s modifikovaným PSE genem nebo mutagenezí a detekcí DNA sekvencemi. Podle výhodného provedení rostlinný organizmus patří do rodu Physcomitřella, Ceratodon, Funaria, řepka olejka nebo lněné semínko, přičemž jsou výhodnými Phys- comitrella, řepka olejka nebo lněné semínko. Podle výhodného provedení vynálezu se Physcomitřella, řepka olejka nebo lněné semínko také používá k produkci žádané sloučeniny, jako jsou lipidy nebo mastné kyseliny, přičemž se PUFA uvádějí jakožto zvláště výhodné .

Podle dalšího výhodného provedení se mechu Physcomit.re 1 la patens může používat pro demonstraci funkce elongázového genu za použití homologové rekombinace na bázi zde popisovaných nuk1eových kyše1 in.

Vynález se rovněž týká izolovaného PSE genu nebo jeho části například jeho biologicky aktivní části. Podle výhodného provedení izolovaný PSE nebo jeho část se mohou podílet na metabo li zrnu žádaných sloučenin pro syntézu buněčných membrán v mikroorganizmu nebo v rostlinné buňce nebo na transportu molekul jejich membránami. Podle dalšího výhodného provedení vynálezu izolovaný PSE nebo jeho část má dostatečnou homologii s aminokyselinovou sekvenci SEQ ID N0=2, SEQ ID NQ:4, SEQ II) NO:6, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:10 _a SEQ ID NO:12 pro tento protein nebo jeho část k udržení schopnosti podílet se na metabo16

• «4	4«	• ·*» 4	··	• 4
• · · *	-·	• ·	•	•	• ·
• ··	•	• ·	•	•	•
! » · ¹	•	• ·	«	•	•
• · · * ·	«4		• ·		·««·

lizinu sloučenin potřebných pro syntézu buněčných membrán v mik roorganizrnech a v rostlinných buňkách nebo na transportu molekul jejich membránami.

Vynález se také týká izolovaných preparací PSE. Podle výhodného provedení zahrnuje PSE gen aminokyselinovou sekvenci SEQ ID NO:2, SEQ ID NQ:4, SEQ ID NO:6, SEQ ID Ν0 = 8, SEQ ID NO10 a SEQ ID NQ:12. Podle dalšího výhodného provedení se. vynález týká izolovaného proteinu v plné délce, který je v podstatě homologový s kompletní aminokyselinovou sekvencí SEQ ID NO: 2, SEQ ID N0=4, SEQ ID NQ:6, SEQ ID N0 = 8, SEQ ID NO=10 a SEQ ID NQ:12 (které se kódují otevřenými čtecími rámci v SEQ ID Ν0-Ί, SEQ ID NO-'3, SEQ ID NO-'5, SEQ ID NO'-7. SEQ ID NO - 9 a SEQ ID NO:11. Podle dalšího provedení vynálezu má protein alespoň přibližně 50%, s výhodou alespoň přibližně 60%, ještě výhodněji alespoň přibližně 70%, 80% nebo 90% a ještě výhodněji alespoň přibližně 95%, 96%, 97%, 98%, 99% nebo vyšší homologi i s aminokyselinovou sekvencí ze souboru zahrnujícího: SEQ ID NO:2, SEQ ID N0:4, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO: 10 a SEQ ID NO:12. Podle dalšího výhodného provedení vynálezu izolovaný PSE zahrnuje aminokyselinovou sekvenci, která má alespoň 50% homologii. s aminokyselinovou sekvencí ze souboru zahrnujícího: SEQ ID N0=2, SEQ ID NQ:4, SEQ ID N0=6, SEQ ID N0:8, SEQ ID NO: 10 a SEQ ID N0=12 a která se mflže podílet na metabolizmu žádaných sloučenin pro syntézu mastných kyselin v mikroorganizmech a v rostlinné buňce nebo na transportu molekul jejich membránami nebo má alespoň jednu elongační aktivitu pro PUFA, přičemž se elongace s výhodou zaměřuje na desaturované řetězce se 16 nebo 18 nebo 20 atomy uhlíku se dvojnými vazbami alespoň ve dvou polohách.

Nebo mflže izolovaný PSE zahrnovat aminokyselinovou sekvenci která se kóduje nukleotidovou sekvencí hybridizující s nukleotidovou sekvencí SEQ ID NQ:1, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:9 _a SEQ ID NO:11 například za

přísných podmínek nebo která má s ní alespoň přibližně 50%, s výhodou alespoň přibližně 60%, ještě výhodněji alespoň přibližně 70%, 80% nebo 90% a ještě výhodněji alespoň přibližně

95%, 96%, 97%, 98%, 99% nebo vyšší homologii. Je také výhodné pro výhodnoé PSE formy, aby měly shora popsané PSE aktivity.

PSE polypeptid nebo jeho biologicky aktivní část se může funkčně vázát na ne-PSE polypeptid za vytvoření fúzního proteinu. Podle výhodného provedení má tento fúzní protein aktivitu, která se liší od samotného PSE. Podle jiného výhodného provedení se tento fúzní protein podílí na metabolizmu sloučenin, které jsou potřebné pro syntézu lipidů a mastných kyselin, kofaktérů a enzymů v mikroorganizmech a v rostlinách nebo na transportu molekul těmito membránami- Podle zvláště výhodných provedení moduluje zavedení tohoto fúzního proteinu do hostitelské buňky produkci žádané sloučeniny buňkou. Podle váhodného provedení mohou tyto fůzní proteiny také obsahovat Δ4-, Δ5-, nebo /16-, Δ8-, Δ15-, Δ17- nebo Δ 3 9-desaturázové aktivity samotné nebo v kombinaci.

Vynález se také týká způsobu produkce jemných chemikálií. Tento způsob je založen buď na kultivaci vhodných mikroorganizmů nebo na kultivaci rostlinných buněk, rostlinných tkání, rostlinných orgánů nebo neporušených rostlin zahrnujících nukleotidovou sekvenci SEQ ID N0=l, SEQ ID NQ=3, SEQ ID MO-5, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:9 _a SEQ ID NO=11 nebo jejich homology, deriváty nebo analogy nebo genový konstrukt, který zahrnuje sekvenci SEQ ID NQ:1, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:9 a SEQ ID N0= 11 nebo jejich homology, deriváty nebo analogy nebo vektor obsahující tyto sekvence nebo genový konstrukt, který se podílí na expresi PSE molekuly nukleové kyseliny podle vynálezu, takže se produkují jemné chemikálie. Podle výhodného provedení zahrnuje způsob stupeň získání buňky obsahující takovou sekvenci elongázové nukleové kyseliny podle vynálezu, přičemž je buňka transformována sekvencí elongázové

nukleové kyseliny, genovým konstruktem nebo vektorem, přičemž dochází k expresi PSE nukleové kyseliny podle vynálezu. Podle dalšího provedení zahrnuje tento proces dále stupeň získání jemné chemikálie z kultury. Podle zvláště výhodného provedení spadá buňka do řádu Ciliata, mikroorganizmů, jako jsou houby, nebo rostlin, zvláště olejnin, přičemž mikroorganizmy a olejniny jsou zvláště výhodné.

Vynález se také týká způsobu modulace produkce molekuly mikroorganizmem. Tyto způsoby zahrnují kombinaci buňky se substancí, která moduluje PSE aktivity nebo expresi PSE nukleové kyseliny, takže se s buňkou spojená aktivita modifikuje se zřetelem na stejnou aktivitu v nepřítomnosti takové substance. Podle výhodného provedení metabolická cesta nebo dvě metabolické cesty buňky pro lipidy a mastné kyseliny, kofaktory a enzymy je nebo jsou meodulovány nebo transport sloučenin těmito membránami je modulován tak, že se tímto mikroorganizmem zlepší výtěžek nebo produkční rychlost žádané jemné chemikálie. Substancí, která moduluje PSE aktivitu, může být substance, která stimuluje PSE aktivitu nebo exprasi PSE nukleové kyseliny nebo která se může používat jako meziprodukt, v biosyntéze mastné kyseliny. Jakožto příklady substancí, které stimulují PSE aktivitu nebo expresi PSE nukleových kyselin se například uvádějí malé molekuly, aktivní PSE a nukleové kyseliny kódující PSE, které se zavedou do buňky. Jakožto příklady substancí, které inhibují PSE aktivitu nebo PSE expresi se uvádějí malé molekuly a/nebo antimediátorové PSE modulované nukleové kyseliny.

Vynález se také týká způsobu modulace výtěžku žádané sloučeniny z buňky, která zahrnuje zavedení do buňky divokého typu nebo mutantu PSE genu, který je buď držen na separovaném plasmidu nebo je integrován do genomu hostitelské buňky. V případě -integrace do genomu, může být integrace náhodná nebo k ní dochází rekombinací, takže se nativní gen nahradí kopií, která

se zavádí za modulování produkce žádané sloučeniny buňkou nebo za použití genového intronu, takže se gen funkčně váže na funkční expresní jednotku obsahující alespoň jednu sekvenci, která zajišťuje expresi genu a alespoň jednu sekvenci, která zajišťuje polyadenylaci funkčnosti transkribovaného genu.

Podle výhodného provedení se modifikuje výtěžek. Podle dalšího provedení se zvyšuje výtěžek žádané chemikálie za snížení výtěžku nežádoucích sloučenin, které mohou mít negativní působení. Podle zvláště výhodného provedení je žádanou jemnou chemikálií lipid nebo mastná kyselina, kofaktor nebo enzym. Podle obzvláště výhodného provedení vynálezu je touto chámikalií polynenasycená mastná kyselina předevšímm ze souboru zahrnujícího arašidonovou kyselinu CARA), eikosapentaenovou kyselinu CEPA) nebo dokosahexaenovou kyselinu CDHA).

Vynález blíže obsáhnuje následující podrobný popis.

Vynález se týká PSE nukleových kyselin a PSE proteinových molekul, které se podílejí na metbolizmu lipidů a mastných kyselin, PUFA, kofaktorfi a enzymů mechu Physcomitrella patens, Phytophthora infestans, Crypthecodinium nebo Thraustochytrium nebo na transportu lipofilních sloučenin membránami. Sloučeniny podle vynálezu se mohou používat pro modulaci produkce jemných chemikálií z organizmů, například z mikroorganizmů, jako jsou ciliates, houby, kvasinky, bakterie, řasy a/nebo z rostlin, jako jsou kukuřice, pšenice, žito, oves, triticale, rýže, ječmen, sója, podzemnice, bavlník, druhy Brassica, jako jsou řepka olejka, canola a tuřín, pepř, slunečnice, brutnák lékařský, pupalka dvouletá a aksamitník, rostliny Solanaceae jako jsou brambory, tabák, lilek a rajče, Vicia species, hrách, casava, vojtěžka, z keřovitých rostlin Ckáva, kakao, čaj), Salix species, ze stromů Colejová palma, kokosová palma) a z trvalé trávy a z pícniny buď přímo (například v případě, kdy nadexpresí nebo optimalizací biosyntézy mastné kyseliny se • ·· · · ···· ·· ·· • ••4 · · · · · · · protein přímo podílí na výtěžku, produkci a/nebo produkční účinností mastné kyseliny z modifikovaných organizmů), nebo mohou mít nepřímý vliv, který nicméně vede ke zvýšení výtěžku, produkce a/nebo produkční účinnosti žádané sloučeniny nebo k poklesu nežádaných sloučenin (například v případě, když modulace lipidu nebo mastné kyseliny, kofaktoru a enzymového metabol i zrnu vede ke změně výtěžku, produkce a/nebo produkční účinnosti nebo složení žádaných sloučenin v buňkách, což má opět vliv na produkci jedné nebo několika jemných chemikálií). Jednotlivá hledika vynálezu jsou následně podrobněji vysvětlena .

I. Jemné chemikálie a PUFA

Výraz jemné chemikálie je v oboru znám a zahrnuje molekuly, které se mají produkovat organizmem a kterých se používá v různých průmyslových odvětvích, jako jsou například, tedy bez záměru na jakémkoliv omezení, průmysl framaceutický, zemědělský, potravinářský a kosmetický. Tyto sloučeniny zahrnují například lipidy, mastné kyseliny, kofaktory a enzymy (jak popisuje například Kuninaka A., Nucleotides and related compounds, str. 561 až 612, Biotechnology, svazek 6, 1996, Rehm a kol., vyd.= VCH Veinheim a připojené citace), lipidy, nasyceně a nenasycené mastné kyseliny (například arašidonová kyselina), vitaminy a kofaktory (Ullman's Encyclopedia of Industrial Chemistry, svazek A2? , Vitamins, str. 443 až 613, 1996: VCH Veinheim a připojené citace); a Ong A.S., Niki E. &. Packer L. (1995) Nutrition, Lipids, Health and Disease Proceedings of the UNESCQ/Confederation of Sciéntific an Technological Associations in Malaysia a the Society for free radica1 Research Asia, 1 až 3 září 1994, Penang, Malaysia, ADCS Press (1995), enzymy a všechny jiné chemikálie, které popsal Gutcho (Chemicals by Fermantation, 1983, Noyes Data Corporation, ISBN: 0818805086 a připojené citace. Metabolizraus a použití určitých jemných chemikálií jsou následně blíže objasněny.

9 9 9 9 9 9 9 9 ·9 ·*

9 9 9 9 · 9 · «9 9 • •9 · · 9 9 9 99 9999

Kombinace různých prekursorových molekul a biosyntézních enzymů vede k produkci různých molekul mastných kyselin, které mají rozhodující vliv na složení membrány. Je možno konstatovat, že PUFA se nejen začleňují do triacylglycerolu, avšak také do membránových lipidů.

Syntéze membrány je dobře charakterizovaný proces, ve kterém je zahrnut počet složek včetně lipidů jakožto část dvouvrstvové membrány. Produkce nových mastných kyselin jako PUFA, nůže proto generovat nové vlastnosti membránových funkcí uvnitř buňky nebo organizmu.

Buněčné membrány mají nejrůznější funkce v buňce. Především a nejvíce membrána delimituje obsahy buňky z okolí a tak dodává buňce integritu- Membrány také mohou působit jako beriery proti, vlivu nebezpečných a nežádoucích sloučenin nebo proti ztrátě žádaných sloučenin.

Podrobně popsali membrány a jejich působení Bamberg a kol., Charge transport of ion pumps on lipid bilayer membranes, Q. Rev. Biophys 26, str. 1 až 26, 1993: Gennis R.B., Pores, Channels and Transportére, Biomembranes, Moleular Structure and Function, Springer, Heidelberg, str. 270 až 322, 1989; a Nikaido H. a Saier H., Transport proteins in bacteria^: common themes ín their design, Science 258, str. 936 až 942, 1992; a citace v uvedených publikacích.

Syntéza lipidů se může rozdělit na dvě části: syntéza mastných kyselin a jejich vázání na sn-glycerol-3-fosfát a adice nebo modifikace polární hlavové skupiny. Zpravidla lipidy, používané v membránách, zahrnují fosfolipidy, glykolipidy, sphingolipidy a fosfoglyceridy. Syntéza mastných kyselin začíná konverzí acetyl-coa buď na malonyl-CoA acetylCoA karboxylázou nebo acetyl-ACP acetyltransacylázou. Po kondenzační reakci tyto dvě produktové molekuly spolu vytvářejí acetoacetyl-ACP,

který se převádí řadou kondenzačních, redukčních a dehydratačních reakcí na molekulu nasycené mastné kyseliny s žádanou délkou řetězce. Produkce nenasycených mastných kyselin z těchto molekul se katalýzuje specifickými desaturázami buď aerobicky molekulárním kyslíkem nebo anaerobicky (syntéza mastných kyselin v mikroorganizmech: F.C. Neidhardt a kol., E. coli and Salmonella. ASM Press, Washington, D.C., str. 612 až 636, 1996 a připojená literatura; Lengeler a kol., (vyd.) Biology of procaryotes. Thieme, Stuttgart, New York, 1999 a připojená literatura; a Magniuson K. a kol., Microbiological Reviews 57, str. 522 až 542, 1993 a připojená literatura).

Jakožto příklady prekursorů pro PUFA biosyntézu se uvádějí linolová a linolenová kyselina. Tyto mastné kyseliny s 18 atomy uhlíku musejí být elongovány na 20 nebo 22 atomů uhlíku k získání mastných kyselin s řetězcem typu eikosa a dokosa.

Různé desaturázy jako enzymy, mající á. 6-desaturázovou, A 5-desaturázovou a A 4-desat.urázovou aktivitu, mohou vést ke kyselině arašidonové, eikosapentaenové a dokosahexaenové a různé jiné PUFA s dlouhým řetězcem se mohou extrahovat a používat pro různé účely v potravinářství jako potrava a v kostimetickém a ve framaceutickém průmyslu.

Pro produkci PUFA s dlouhým řetězcem se pólynenasycené mastné kyseliny se 16, 18 nebo 20 atomy uhlíku musí, jak shora uvedeno, elongovat alespoň o dva atomy uhlíku enzymatickou aktivitou elongáz. Sekvence nukleové kyseliny podle vynálezu kódují první mikrobiální elongázy z typických producentů obsahujících PUFA v triacy1glycerolové frakci, přičemž elongázy jsou schopné elongovat mastné kyseliny s 16 nebo s 18 nebo se 20 atomy uhlíku s alespoň dvěma dvojnými vazbami na mastné kyseliny o alespoň dva atomy uhlíku, nebo které je mohou konvertovat například sekvenciálně v následnosti převáděním mastné kyseliny s 16 nebo s 18 atomy uhlíku na mastnou kyselinu se 20

- 23 ·» ··

I · · « dvěma dvojnými vazbami kyselinám se 20 atomy atomy uhlíku a pak mastnou kyselinu se 20 atomy uhlíku na mastnou kyselinu se 22 nebo s vyšším počtem atomů uhlíku obsahující jednotky se 2 atomy uhlíku. Po jednom elongačním cyklu tato enzymová aktivita vede k mastným kyselinám se 20 atomy uhlíku, po dvou, třech a čtyřech elongačních cyklech k mastným kyselinám se 22, 24 nebo 26 atomy uhlíku. Delší PUFA se rovněž mohou syntetizovat za použití elongáz podle vynálezu. Aktivita elongáz podle vynálezu s výhodou vede k mastným kyselinám se 20 a/nebo 22 atomy uhlíku s alespoň v molekule mastné kyseliny, k mastným uhlíku s výhodou se třemi, čtyřmi nebo pěti dvojnými vazbami, zvláště s výhodou se třemi dvojnými vazbami v molekule mastné kyseliny, k mastným kyselinám se 22 atomy uhlíku s výhodou se třemi, čtyřmi, pěti nebo šesti dvojnými vazbami, zvláště s výhodou se pěti nebo šesti dvojnými vazbami v molekule mastné kyseliny. Po elongaci enzymem podle vynálezu se mohou provádět další desaturační stupně. Proto produkty elongázových aktivit a další desaturace mohou vést k výhodným PUFA s vyšším stupněm desaturace, jako jsou kyselina dokosadienová, arašidonová, o36-eikosatriendihomo-gama-1inolenová, eikosapentaenová, oJ 3-eikosatrienová, í>J3-eikosatetraenová, dokosapentaenová nebo dokosahexaenová kyselina. Jakožto příklady substrátů enzymové aktivity podle vynálezu se uvádějí kyselina taxolová, 7,10,13-hexadekatrienová, 6,9-oktadekadienová, linolová, gama-1inolenová, 1inolenová, α-1inolenová, arašidonová, eikosapentaenová nebo stearidonová kyselina. Výhodnými substráty jsou kyselina linolová, gama-1inolenová, a/nebo α-1inolenová nebo arašidonová, eikosatetraenová nebo eikosapentaenová kyselina. Mastné kyseliny se 16 nebo s 18 nebo se 20 atomy uhlíku, které mají alespoň dvě dvojné vazby v molekule mastné kyseliny se mohou elongovat enzymovou aktivitou podle vynálezu nebo ve formě esteru, jako jsou fosfolipidy, glykolipidy, sfingolipidy, fosfoglyceridy, monoacylglycerol, diacylglycerol nebo triaeylglycerol.

• · · ·« ·«·· · · ·« • · · * · · · ···· • · · · · · ·· · • · · ··· ··· ··· ·· ·· · ·· ····

Mastné kyseliny musejí být následně transportovány na různé lokace a včleněny do triacylglycerolového zásobního lipidu, Jiným důležitým stupněm v syntéze lipidů je transfer mastných kyselin do polárních hlavových skupin, například acyltransferázou glycerolmastné kyseliny (Frentzen, Lipid 100 (4-5), str. 161 až 166, 1998).

Existuje četná lítratura týkající se biosyntézy rostlinných mastných kyselin, desaturace, lipidového metabolizmu a transportu mastných sloučenin membránou, 0-oxídace, modifikace mastné kyseliny a kofaktorů, skladování triacyIglyeerolu a souborů včetně ještě v takové literatuře připomínaných odkazů (Kinney, Genetic Engineering, vyd. JK Setlow, 19, str. 149 až 166, 1997; Ohlrogge a Browse, Plant Cell 7, str. 957 až 970, 1995; Shanklin a Cahoon, Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol. 49, str. 611 až 641, 1998; Voelker, Genetic Engineering, vyd. JK Setlow, 18, str. 111 až 113, 1996; Gerhardt, Progr. Lipid Res. 31, str. 397 až 417, 1992; Guhnemann-Scháfer & Kindl, Biochim. Biophys Acta 1256, str. 181 až 186, 1995; Kunau a kol., Progr. Lipid Res. 34, str. 267 až 342, 1995; Stymne a kol., Biochemistry and Molecular Biology of Membrane and Storage Lipids of Plants, vyd. Murata a Somerville, Rockville, American Society of Plant Physiologists, str. 150 až 158, 1993; Murphy &. Ross, Plant Journal 13(1), str. 1 až 16, 1998).

Vitaminy, kofaktory a produkty pro výživu“ (“nutraceuticals), jako jsou PUFA, zahrnují skupinu molekul, které vyšší živočichové již nemohou syntetizovat, a proto je musí přijímat, nebo které vyšší živočichové již nemohou syntetizovat v dostatečné míře, a proto je musí přijímat, přesto, že jsou ochotně syntetizovány jinými organizmy, jako jsou například bakterie. Biosyntéza těchto molekul v organizmech, které jsou schopny je produkovat, jako jsou bakterie, je již více nebo méně charakterizována (Ullmann's Encyclopedia of Industrial Chemistry, Vitamins, svazek A27, str. 443 až 613, VCH Vein* ·· ·« *··* ·· 99

9 9 9 9 9 9 9 9 9

99 999 99 9

9 9 9 9 9 9 9 9

99999 999 99 9999 heirn, 1996; Michal G. Biochemical Pathways^: ftn Atlas of Biochemistry and Molecular Biology, John Wilvy & Sons 1999; Ong A.S., Niki E. & Packer L., Nutrition, Lipids, Health and Diseases Proceedings of the UNESCO/Confederation of Scientific and Technological Associations in Malaysia and the Society for free radical Research Asia, 1 až 3 září 1994, Penang, Malaysia, AOCS Press Champaign, IL X, 374 stran, 1994).

Shora uvedené molekuly jsou buď biologicky aktivními molekulami jako takové nebo jsou prekursory biologicky aktivních látek, které působí buď jako nosiče elektronů nebo jako meziprodukty v multiplicitních metabolických cestách. Kromě své nutriční hodnoty mají tyto sloučeniny také výzmnanou hodnotu jako barviva, antioxidanty nebo katalyzátory nebo jiné zpracovatelské pomocné látky Cpřehled struktury, aktivity a průmyslové využitelnosti těchto sloučenin je například v publikaci Ullmann's Encyclopedia of Industrial Chemistry, svazek A27, str. 443 až 613, VCH Weinheim, 1996) cené mastné kyseliny mají různé funkce a zdraví charakteristiky, například v případě koronárních nemocí srdce, mechanizmu zánětů a dětské výživy CSimopoulos, Am. J. Clin.

560 až 569, 1999; Takahata a kol., 62(11), str a Winther,

Vit.amins , Polynenasypodporující

Nutr. 70 C3. doplněk), str.

B i ose. B i otechno1. B i ochem. a Winther, 1998; Willich Wochenschrift 120C7), od str

229, 1995).

2079 až 2085, Willich Deutsche Midizinische

II. Elementy a způsoby podle vynálezu

Vynález alespoň zčásti je založen na objevu nových molekul, označovaných zde jako molekuly PSE nukleové kyseliny a PSE proteinu, které ovlivňují produkci buněčných membrán v organizmech, jako jsou Physcomitřel 1a patens, Crypthecodinium cohnil, Phytophthora infestans, Thraustochytrium a/nebo Ceratoton purpureus, například mají vliv na pohyb molekul těmito membránami. Podle jednoho provedení vynálezu se PSE molekuly

• 9«	• 9	»«9··		9«
9 9 9 *	9	» 9	9	9	9 9
9 9 9	9	9 ·	•	9	9
• 9 9	9	9 ·	9	•	9
• 9 9 «9	• 9	9			• 909

podílejí na metabolizmu sloučenin potřebných pro syntézu buněčných membrán v organizmech, jako jsou mikroorganizmy a rostliny, nebo nepřímo působí na transport molekul těmito membránami. Podle výhodného provedení vynálezu má aktivita PSE molekul podle vynálezu pro regulaci produkce membránových komponent a membránového transportu vliv na produkci žádané jemné chemikálie organizmem. Podle zvláště výhodného provedení vynálezu se aktivita PSE molekul podle vynálezu moduluje, takže výtěžek, produkce a/nebo produkční účinnost raetabolické cesty mikroorganizmu nebo rostlin, která se reguluje PSE podle vynálezu se moduluje a účinnost transportu sloučenin membránami se modifikuje, což buď přímo nebo nepřímo moduluje výtěžek, produkci a/nebo produkční účinnost žádané jemné chemikálie mikroorgani zrny nebo ros tli nam i.

Výraz PSE nebo PSE polypeptid zahrnuje proteiny, které se podílejí na metabolizmu sloučenin potřebných pro syntézu buněčných membrán v organizmech, jako jsou například mikroorganizmy nebo rostliny, nebo na transportu molekul těmito membránami. Příklady PSE jsou uvedeny v sekvencích, jako jsou SEQ ID NO=1, SEQ ID N0=3, SEQ ID N0=5, SEQ ID NO-7, SEQ ID NO=9 a SEQ ID NO:11 nebo jejich homology, deriváty nebo analogy. Výrazy PSE nebo PSE nukleové kyselinové sekvence zahrnují sekvence nukleové kyseliny, které kódují PSE a jejichž část může být kódujícím regionem a také odpovídají 5'- a 3'- netransletovaným sekvenčním regionům. Příklad PSE genů jsou sekvence v SEQ ID NO^:1, SEQ ID Ν0=3, SEQ ID NO:5, SEQ ID NQ:7, SEQ ID NO:9 a SEQ ID NO:11. Výrazy produkce a produktivita jsou v oboru známé a zahrnují koncentraci fermentačního produktu (například žádané jemné chemikálie), který se vytvoří v určité době a v určitém fermentačním objemu (mapříklad 3. kg produktu za hodinu v 1 litru). Výraz produkční účinnost zahrnuje dobu potřebnou pro dosažení určitého množství produktu (například dobu potřebnou buňkou k ustanovení určitého prosazení jemné chemikálie). Výrazem výtěžek nebo výtěžek produkt/uh1ík je v oboru znám a zahrnuje účinnost, se kterou se uhlíkatý zdroj převádí na produkt (například na jemnou chemikálii). Zpravidla se vyjadřuje jako například 1 kg produktu na 1 kg zdroje uhlíku. Se vzrůstajícím výtěžkem nebo produkcí sloučeniny vzrůstá množství získaných molekul nebo hodných molekul této sloučeniny ve specifickém množství kultury v definované době. Výrazy biosynt-éza nebo biosyntézní cesta jsou v oboru známy a zahrnují syntézu sloučeniny, s výhodou organické sloučeniny, buňkou z meziproduktů, například několikastupňovým procesem, který podléhá přísné regulaci- Výraz katabolizmus a katabolická cesta je v oboru znám a zahrnuje štěpení sloučeniny, s výhodou organické sloučeniny, buňkou na katabolity (obecně menší nebo méně komplexní molekuly) například v několikastuňovém procesu, který podléhá přísné regulaci. Výraz metabolizmus je v oboru znám a zahrnuje souhrn biochemických reakcí, ke kterým dochází v organizmu. Metabolizmus určité sloučeniny (například metabo1izmus mastné kyseliny) tak zahrnuje souhrn biosyntézních, modifikačních a katabolických cest sloučeniny v buňce, které jsou relevantní pro sloučeninu.

Podle jiného provedení vynálezu PSE molekuly podle vynálezu mohou modulovat produkci žádané molekuly, jako je jemná chemikálie, v mikroorganizmech nebo v rostlinách. Existuje řada mechanizmů, kterými modifikace PSE podle vynálezu mohou přímo ovlivňovat, výtěžek, produkci a/nebo produkční účinnost jemné chemikálie z kmene mikroorganizmu nebo z kmene rostliny obsahující tento modifikovaný protein. Počet nebo aktivita PSE, podílejících se na transportu molekul jemné chemikálie uvnitř nebo vně buňky, se může zvyšovat, takže se větší množství těchto sloučenin transportuje membránami, ze kterých se mohou získat a konvertovat snadněji na každou jinou sloučeninu. Kromě toho mastné kyseliny, triacylglyceroly a/nebo lipidy jsou žádoucími jemnými chemikáliemi jako takové; optimalizace aktivity nebo zvýšení počtu jedné nebo několika PSE podle vynálezu, které se podílejí na biosyntéze těchto sloučenin, nebo

·· · · • · · fc • · « • · ♦ • · · • · · · · · interferencí s aktivitou jedné nebo několika PSE, které se podílejí na katabolizmu těchto sloučenin, umožňují zvyšovat výtěžek, produkci a/nebo produkční účinnost molekul mastné kyseliny a molekul lipidů z organizmu, jako jsou mikroorganizmy nebo ros tli ny.

Mutagenze PSE genu podle vynálezu může také zvyšovat PSE s modifikovanými aktivitami, což nepřímo ovlivňuje produkci jedné nebo několika žádaných jemných chemikálií z mikroorganizmů nebo z rostlin. Například PSE podle vynálezu, která se podílí na exportu odpadních produktů, může vyvíjet velký počet aktivit nebo vyšší aktivitu, takže normální metabolické odpadní produkty buňky (jejichž počet se může zvýšit na nadprodukci se zřetelem na žádanou chemikálii) se exportuje účinněji před tím, než může poškodit molekuly v buňce (které by snížily životnost buňky) nebo nerušovat biosyntézní cestu jemných chemikálií (což by snižovalo výtěžek, produkci nebo produkční účinnost žádané jemné chemikálie). Relativně velká intracelulární množství žádané jemné chemikálie samotná mohou být dále toxická pro buňku, takže zvýšení aktivity nebo počtu transportérů schopných exportovat tyto sloučeniny z buňky vede ke zvýšení životnosti buňky v kultuře, což opět vede k vyššímu počtu buněk v kultuře, které produkují žádanou jemnou chemikálii. PSE podle vynálezu se také mohou manipulovat tak, že se produkuje odpovídající množství různých lipidových molekul a molekul mastné kyseliny. To může mít podstatný vliv na složení lipidu v buněčné membráně- Jelikož má každý lipidový typ různé fyzikální vlastnosti, modifikace lipidového složení membrány může značně modifikovat fluiditu membrány. Modifikace fluidity membrány může ovlivnit transport molekul membránou a buněčnou integritu, což může podstatně ovlivnit produkci jemných chemikálií z mikroorganizmů a z rostlin v provozní fermentační kultuře. Rostlinné membrány přinášejí specifické vlastnosti, například toleranci k vysokým a k nízkým teplotám, k soli, k období sucha a k patogenům, jako jsou bakterie a houby. Modulace

složek membrán může mít proto rozhodující vliv na schopnost rostliny přežít za shora uvedených stresových podmínek. To může být prostřednictvím zněm signálních kaskád nebo přímou cestou modifikovaného složení membrány CChapman, Trends in Plant Science 3C11), str. 419 až 426, 1998) a signálních kaskád (Wang, Plant Physiology 120, str. 645 až 651, 1999) nebo ovlivněním tolerance k nízkým teplotách (světový patentový spis číslo WO 95/18222).

Isolované sekvence nukleové kyseliny podle vynálezu jsou obsaženy například v genomu kmene Thraustochytrium, který je dostupný v kolekci kultur American Type Culture Collection (ATCC) jako kmen číslo ATCC26185 CThraustochytrium), nebo v případě organizmu Crypthecodinium, který je dostupný v organizaci Provasoli-Gui1lard National Center for Culture of Marině Phytoplankton CCCMP) West Boothbay Harbour, ME, Sp. st. a.) jako kmen číslo CCPM316. V případě Phytophthora infestans jsou molekuly uvedené nukleové kyseliny izolovány ze kmene ATCC 48886.

Ňukleotidové sekvence izolované cDNA mikroorganizmů Physcomitřella, Crypthecodinium, Phytophthora infestans nebo Thraustochytrium a dedukované aminokyselinové sekvence Physcomitrella patens PSE jsou ukázány v sekvencích SEQ ID N0=l až SEQ ID NO: 12. Prováděly se počítačové analýzy, které klasifikovaly nebo identifikovaly tyto ňukleotidové sekvence jakožto sekvence, které kódují proteiny podílející se na metabolizmu složek buněčné membrány nebo podílející se na transportu sloučenin buněčnými membránami nebo na biosyntéze PUFA- EST s databázovým vstupem číslo PP001019019F, CCOO104204IR, PI001002014R, TC002034029R, TC002034029R-11 a TCOO2O14O93R v databázi vynálezce představuje sekvence v SEQ ID N0=l, SEQ II) NO: 3, SEQ ID NO:5, SEQ ID NQ:7, SEQ ID NO:9 a SEQ ID N0:íl. Podboným způsobem parciální polypeptidy byly označeny PP001019019F, CC001042041R, PI001002014R, TC002034029R, TC002034Q29R-1Í a • · · ·

TC002014093R a představují sekvence podle vynálezu v SEQ ID N0=2, SEQ ID NQ:4, SEQ ID N0:6, SEQ ID N0:8, SEQ ID N0=10 a SEQ ID NO: 12 podle tabulky II. Kompletní frament-ový insert EST TC002034029R se sekvencuje a vede k SEQ ID NO:3, která je kompletní sekvencí TC002034029R. TCQ02034029R-11 popisuje sekvenci plné délky elongázy z mikroorganizmu Thraustochytrium. Jména zbylých klonů jsou obdobná. Tedy odpovídající genová jména jsou přidělena k různým klonům. Zkratka: Tc = Thraustochytrium., Cc = Crypthecodinium, Pp = Physcomitrella patens a P = Phytophthora infestans.

Tabulka II

Jméno/EST jméno	Genové jméno	Polypeptid SEQ ID NO	Nukleová kyselina SEQ ID NO
FP001019019F	Pp PSE1	2	1
TC002034029R,	Tc__ PS El	4	3
TC002Q14093R	Tc PSE2	6	5

CC001042041R,	Cc	PSE1	8	7
TC002034029R-11	Pc,	PSE1 1	10	9
PI001002014R,	Pi	PSE1	12	11

Vynález se také týká proteinů s aminokyselinovou sekvencí, která je v podstatě homologická s aminokyselinovou sekvencí SEQ ID N0:2, SEQ ID N0:4, SEQ ID N0:6, SEQ ID N0:8, SEQ ID NO:10 a SEQ ID NO:12. Podle vynálezu protein s aminokyselinovou sekvencí, která je v podstatě homologická s vybranou ami31

nokyselinovou sekvencí má alespoň 50% homologii s vybranou aminokysellnovou sekvencí například kompletní zvolenou aminokyselinovou sekvenci. Protein s aminokyselinovou sekvencí, která je v podstatě homologická s aminokyselinovou sekvencí může mít alespoň přibližně 50% až 60%, s výhodou alespoň 60% až 70%, ještě výhodněji alespoň přibližně 70% až 80%, 80% až 90% nebo 90% až 95% a ještě výhodněji alespoň přibližně 96%, 97%, 98%, 99% nebo vyšší homologii s vybranou aminokyselinovou sekvencí.

PSE podle vynálezu nebo její biologicky aktivní část. nebo její fragment se mohou podílet na metabolizmu sloučenin potřebných pro syntézu buněčných membrán v mikroorganizmech nebo v rostlinách nebo na transportu molekul těmito membránami nebo má jednu nebo několik aktivit potřebných pro elongaci PlJFft se 16 nebo lít nebo 20 atomy uhlíku, takže se získají PUFA s 20, s 22 nebo s 24 a dalšími atomy uhlíku.

Různá hlediska vynálezu jsou podrobněji popsána v následu j íc í ch podod í1ech.

A. izolované molekuly nukleové kyseliny

Jedno provedení vynálezu zahrnuje izolované nukleové kyseliny odvozené od PUFA produkujících mikroorganizmů a kódujících polypeptidy, které elongují mastné kyseliny se 16 nebo 18 atomy uhlíku s alespoň dvěma dvojnými vazbami v mastné kyselině o alespoň dva atomy uhlíku nebo které elongují mastné kyseliny s 20 atomy uhlíku s alespoň dvěma dvojnými vazbami v mastné kyselině o alespoň dva atomy uhlíku.

Další provedení vynálezu zahrnuje izolované mastné kyseliny zahrnující nukleotidové sekvence kódující polypeptidy, které elongují mastné kyseliny se 16, 18 nebo 20 atomy uhlíku s alespoň dvěma dvojnými vazbami v mastné kyselině ze souboru zahrnuj ícího • · · ·

a) nukleové kyselinové sekvence uvedené v SEQ ID Ν0=1, SEQ ID HO-3, SEQ ID NO-’5, SEQ ID N0 = 7, SEQ ID NO-' 9 a SEQ ID NO:11,

b) nukleovou kyselinovou sekvenci, která podle degenerace genetického kódu je odvozena z jedné sekvence uvedené v SEQ ID NO: 1, SEQ ID N0:3, SEQ ID NQ:5, SEQ ID N0--7, SEQ ID NO:9 _a SEQ ID NO=11,

c) deriváty sekvencí uvedené v SEQ ID NO-'l, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO:5, SEQ ID N0=7, SEQ ID NO:9 _a SEQ ID NO:11, které kódují polypeptidy aminokyselinové sekvence uvedené v SEQ ID N0--2, SEQ ID N0:4, SEQ ID NQ:6, SEQ ID NQ:8, SEQ ID N0:10, a SEQ ID ND=12 a které mají alespoň 50^ homologii se zřetelem na aminokyseliny bez podstatného snížení enzymatického působení polypeptidůShora uvedené nukleové kyseliny podle vynálezu, které působí jako elongázy se 16, 18 nebo 20 atomy uhlíku jsou odvozeny od organizmů, jako jsou ciliates, houby, řasy, rostliny nebo dinobičíkovci, které jsou schopny syntetizovat mastné PHFA s výhodou z rostlin nebo z řas, zvláště z organizmů rodu Phytophthora, Crypthecodinium, Thraustochytrium nebo Schizochytrium, ještě výhodněji z organizmů Phytophthora infestans, Physcomi třel la patens, Crypthecodinium cohnii nebo Thraustochytrium sp., Schizochytrium sp. nebo z úzce příbuzných organizmů.

Vynález se týká izolovaných nukleových kyselinových molekul, které kódují PSE polypeptidy nebo jejich biologicky aktivní části a fragmentů nukleových kyselin, které jsou dostatečné pro použití jako hybridizační sondy nebo primery pro identifikaci nebo zesílení PSE kódující nukleové kyseliny (například PSE DNA). Výraz molekula nukleové kyseliny zde zahrnuje DNA molekuly (například cDNA nebo genomovou DNA) a RNA molekuly (například mRNA) a DNA a RNA analogy, které se • · · · * * · · · «· · · · · • ·· · « • * · · * · 9 • · 9 · · « • · · *· · « « generují prostřednictvím nukleoditových analogů. Tento výraz rovněž zahrnuje netranslatovanou sekvenci na 3' a 5' zakončení kódujícího genového regionu: alespoň přibližně 100 nukleotidů sekvence ve směru 5' zakončení kódujícího regionu a alespoň přibližně 20 nukleotidů sekvence ve směru 3' zakončení kódujícího genového regionu. Molekula nukleové kyseliny může být jednořetězcová nebo dvouřetězcová, s výhodou je to však dvouřetězcová DNA. Izolovaná molekula nukleové kyseliny je oddělena od ostatních molekul nukleové kyseliny, které jsou obsaženy v přírodním zdroji nukleových kyselin. Izolovaná“ nukleová kyselina s výhodou nemá žádné sekvence, které přirozeně lemují nukleovou kyselinu v genomové DNA organizmu, ze kterého je nukleová kyselina odvozena (například sekvence na 5' a 3' zakončení nukleové kyseliny). Podle různých provedení izolovaná molekula nukleové kyseliny může obsahovat například méně než přibližně 5 kb, 4 kb, 3 kb, 2 kb, 1 kb, 0,5 kb nebo 0,1 kb nukleoditových sekvencí, které přírodně lemují molekulu nukleové kyseliny v genomové DNA buňce, ze které je nukleová kyselina odvozena (například buňka Physcomitřella patens). Izolovaná molekula nukleové kyseliny , například molekula cDNA, může být nadto prostá jiného buněčného materiálu nebo kultivačního prostředí, pokud je generována rekombinantními technikami nebo může být prostá chemických prekurzorů nebo jiných chemikálkí, pokud je chemicky syntetizována.

Molekula nukleové kyseliny podle vynálezu, například molekula nukleové kyseliny s nukleotidovou sekvencí SEQ ID NQ: 1, SEQ ID N0=3, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:9 _a SEQ ID NO:11 nebo její část se může izolovat o sobě známými způsoby molekulární biologie a obsaženou sekvenční informací. Tedy například homologová sekvence nebo homologové, konzervované sekvenční regiony na DNA nebo aminokyselinové úrovni se mohou identifikovat pomocí přiřazených algoritmů. Například Phytophthora, Physcomitřella, Crypthecodinium nebo Thraustochytrium cDNA se mohou izolovat z knihovny Phytophthora, Physeomitrel34 • 4 · ·· · 4 • 4«

4 » • 4 4 • 44 (*· tf * tf ·· 4tf • » · 4 »4 · • 4 ·

4«

4 · · 4 4 la, Crypthecodinium nebo Thraustochytrium za použití kompletních sekvencí SEQ ID NO=1, SEQ ID NQ:3, SEQ ID NCBS, SEQ ID NO:7, SEQ ID Ν0=9 a/nebo SEQ ID NQ:11 nebo jejich částí jako hybridizační sondy a o sobě známými hybridizačními způsoby (jako například popsal Sambrook a kol., Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 2. vydání, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989). Nadto molekula nukleové kyseliny obsahující kompletní sekvenci SEQ ID NO=1, SEQ ID NQ:3, SEQ ID NQ:5, SEQ ID NQ:7, SEQ ID NO:9 a SEQ ID NQ:11 nebo její část se může izolovat polymerázovou řetězovou reakcí, když se používají oligonukleotidové primery, které se generují na základě této sekvence nebo jejich částí, zvláště regionu okolo motivu His-box SEQ ID N0:2, SEQ ID NQ:4, SEQ ID NQ:6, SEQ ID N0=8, SEQ ID NCDÍO a SEQ ID NQ:12 nebo jejich modifikací na jednotlivé, definované aminokyseliny (například molekula nukleové kyseliny obsahující kompletní sekvenci SEQ ID Ν0=1, SEQ ID NQ--3, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:?, SEQ ID N0:9 a SEQ ID NO: 11 nebo její část se může izolovat polymerázovou řetězovou reakcí, když se používají oligonukleotidové primery, které se generují na základě téže sekvence SEQ ID NO: 1, SEQ ID NQ:3, SEQ ID NQ:5, SEQ ID NO:7, SEQ ID N0=9 a SEQ ID NO:11. Pro tento účel jsou zvláště vhodné parciální sekvence podle obr. 10. Například mRNA se může izolovat z buněk (například za použití guanidiniumthiokyanátové extrakce, kterou popsal Chirgwin a kol., Biochemistry 18, str. 5294 až 5299, 1979) a cDNA se může generovat za použití reverzní transkriptázy (například Moloney MLV reverzní transkriptázou, obchodním produktem společnosti Gibco/BRL, Bethesda, MD nebo AMV reverzní transkriptázou, obchodním produktem společností Seikagaku America, lne., St. Petersburg, Fl). Syntetické oligonukleotidové primery pro zesílení polymerázovou řetězovou reakcí se mohou generovat na základě jedné nukleotidové sekvence uvedené v SEQ ID N0=l, 3, 5, 7, 9 nebo 11 nebo za použití aminokyselinových sekvencí podle obr. 10. Nukleové kyselina podle vynálezu se může zesílit za použití cDNA nebo za použití genomové DNA jako matrice a vhodných oligonukleotidových primerů o sobě známými způsoby PCR zesílení. Nukleové kyselina, takto zesílená, se může klónovat do vhodného vektoru a charakterizovat prostřednictvím DNA sekvenční analýzy. Oligonukleotidy, které odpovídají PSE nukleotidové sekvenci, se mohou generovat o sobě známými syntézními způsoby například za použití automatického DNA syntetizéru.

cNDA uvedená v SEQ ID NOU, SEQ ID NO -3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:9 a SEQ ID NO:11 zahrnuje sekvence, které kódují PSE (to je kódující region”) a také 5' -netranslatované sekvence a 3'-netranslatované sekvence. Nebo molekula nukleové kyseliny může zahrnovat pouze kódující region jedné sekvence ze souboru sekvencí SEQ ID NOU, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:9 a SEQ ID NOU1 nebo může obsahovat kompletní genomové fragmenty izolované z genomové DNA.

Sekvence SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO ·· 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID N0:8, SEQ ID NO: 10 _a SEQ ID N0U2 se identifikují stejným EST číslem jako sekvence SEQ ID NOU, SEQ ID NO: 3, SEQ IC NO = 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9 a SEQ ID NO ' 11 pro snadnou korelaci.

Podle dalšího provedení vynálezu zahrnuje izolovaná molekula nukleové kyseliny podle vynálezu molekulu nukleové kyseliny, která je komplementem jedné nukleotidové sekvence ze souboru zahrnujícího SEQ ID NOU, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO=7, SEQ ID NO: 9 a SEQ ID NOU1 nebo jejich části Molekula nukleové kyseliny, která je komplementární s jednou nukleotidovou sekvencí ze souboru zahrnujícího SEQ ID NOU, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO=7, SEQ ID NO:9 _a SEQ ID NO U 1 je dostatečně komplementární, pokud je schopná hybridizovat s jednou sekvencí ze souboru zahrnujícího SEQ ID NOU, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:9 a SEQ ID NOU1, vedoucí ke stabilnímu duplexu.

• ·· ♦ · · ♦ • «· ·· ·» • « 9 9 • · « • « <>

• 9 · » · · · ♦ ·

Homology nových elongázových nukleových kyselinových sekvencí se sekvencí SEQ ID NO:1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:7, SEQ ID NOs9 a SEQ ID NO:11 se míní například allelické varianty, které mají alespoň přibližně 50% až 60%, s výhodou alespoň 60% až 70%, ještě výhodněji alespoň přibližně 70% až 80%, 80% až 90% nebo 90% až 95% a ještě výhodněji alespoň přibližně 95%, 96%, 97%, 98%, 99% nebo vyšší homologii s nukleotidovou sekvencí ze souboru sekvencí SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:9 _a SEQ ID NO:11 nebo s jejich homology, deriváty, analogy nebo částmi. Podle výhodného provedení zahrnuje izolovaná molekula nukleové kyseliny podle vynálezu nukleotidovou sekvenci, která hybridizuje s jednou z nukleotidových sekvencí ze souboru sekvencí SEQ ID NOU, SEQ ID NO=3, SEQ ID NO=5, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:9 a SEQ ID NO·· 11 nebo s jejich částmi za přísných podmínek. Allelické varianty zahrnují zvláště funkční varianty, které se mohou získat deleci, inzercí nebo substitucí nukleotidů z/do sekvence ze souboru sekvencí SEQ ID NO = 1 , SEQ ID NO: 3, SEQ ID N0:5, SEQ ID NO=7, SEQ ID NO:9 a SEQ ID NO:11, přičemž se však pro enzymovou aktivitu rezultujícího proteinu, který se syntetizuje, dbá na to, aby byla s výhodou zachována pro inzerci jednoho nebo několika genů. Proteiny, které si podržují enzymatickou aktivitu elongázy se míní proteiny, které kódují alespoň 10 %, s výhodou alespoň 20 %, ještě výhodněji alespoň 30 % a především alespoň 40 % původní enzymatické aktivity ve srovnání s proteinem kódovaným sekvencemi SEQ ID NO = 2, SEQ ID NO:4, SEQ ID N0:6, SEQ ID Ν0 = 8, SEQ ID NO:10 _a SEQ ID NO:12. Elongázami, které si uchovávají shora uvedené aktivity, jsou elongázy, jejichž enzymatická aktivita není v podstatě snížena.

Homology sekvencí SEQ ID N0=l, SEQ ID NO : 3, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:7, SEQ ID HO: 9 a SEQ ID NO:11, se také míní například bakteriální, houbové a rostlinné homology, useknuté sekvence, jednořetězcové DNA nebo RNA kódující nebo nekódující DNA sekvence.

SEQ ID NO:5, také míní de• 4 4 » • 4 4 • 44 44

Homology sekvencí SEQ ID NOU, SEQ ID N0:3,

SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:9 _a SEQ ID NO:11, _se riváty například promotorové varianty. Promotory ve směru nukleotidových sekvencí mohou modifikovat jednu nebo několik nukleot i dových substitucí inzercí nebo inzercemi a/nebo delecí nebo delecerni avšak bez narušení funkcionality nebo aktivity promotorů. Je dále mošně zvýšit aktivitu promotorů modifikací jejich sekvence nebo nahradit je dokonale aktivnějšími promotory právě z heterologového organizmu.

Molekula nukleové kyseliny podle vynálezu může nejen obsahovat část kódujícího regionu ze sekvencí SEQ ID NOU, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO=7, SEQ ID NO: 9 a SEQ ID NO U 1, například frament, kterého se může použít jako sondy nebo primeru nebo fragment, který kóduje biologicky aktivní segment PSE. Nukleotidové sekvence, stanovené z klonování PSE genu Physcomitre11 a patens, Phytophthora infestans, Thraustochytrium a Schizochytrium, umožňují generovat sondy a priaery, které jsou určeny pro identifikaci a/nebo klónování PSE homologů v jiných buněčných typech a organizmech a PSE homology z jiných mechů nebo podobných druhů. Sonda/primer zpravidla obsahují v podstatě vyčištěný oligonukleotid. 01igonukleotid zpravidla obsahuje nukleotidový sekvenční region, který hybridi zuje za přísných podmínek s alespoň přibližně 12, s výhodou alespoň s přibližně 16 a především s alespoň přibližně 25, 40, 50 nebo 75 následnými nukleotidy řetězce majícího smysl ze sekvencí ze souboru zahrnujícího SEQ ID NOU, SEQ ID N0^;3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO '9 a SEQ ID NO ·’11 nebo řetězce nemajícího smysl ze sekvencí ze souboru zahrnujícího SEQ ID NOU, SEQ ID NO·’3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO -7, SEQ ID NO 9 a SEQ ID NO:11 nebo jejich homology, deriváty a analogy nebo jejích přírodně se vyskytujícími mutanty. Primery založené na nukleotidové sekvenci SEQ ID NOU, SEQ ID N0:3, SEQ ID N0:5, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO9 a SEQ ID NO:11 se mohou používat při PCR reakcích pro klónování PSE homologů. Sondy založené na PSE • « nukleotidových sekvencích se mohou používat pro detekci transkriptů nebo genomových sekvencí, které kódují stejné nebo homol ogové proteiny. Podle výhodného provedení zahrnuje sonda přídavně navázanou značkovací skupinu, například radioisotop, fluorescenční sloučeninu, enzym nebo enzymový kofaktor. Tyto sondy se mohou používat jako součásti testovacího kitu pro genomové signální znaky pro identifikaci buněk, které chybně expresu j í PSE, třeba měřením množství PSE kódující nukleové kyseliny ve vzorku buňky, například měřením PSE mRNA hladiny nebo pro stanovení, zda je genomový PSE gen mutován nebo deletován.

Podle jednoho provedení vynálezu molekula nukleové kyseliny podle vynálezu kóduje protein nebo jeho část, která zahrnuje aminokyselinovou sekvenci, která je dostatečně homologová s aminokyselinovou sekvencí SEQ ID NO^:2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO-6, SEQ ID N0--8, SEQ ID N0=10 a SEQ ID NO: 12 pro protein nebo jeho část k udržení schopnosti podílet se na metabolismu sloučen iny potřebné pro syntézu buněčné membrány v mikroorganismech nebo v rostlinách nebo na transportu molekuly těmito membránami. Výraz dostatečná homologie se zde vztahuje na proteiny nebo jejich část, jejichž aBinokyselinové sekvence mají minimální počet aminokyselinových zbytků (například aminokyselinový zbytek s podobným postranním řetězcem, jako aminokyselinový zbytek v jedné ze sekvencí SEQ ID NO:2 až 12), které jsou identické nebo ekvivalentní s aminokyselinovou sekvencí SEQ ID N0=2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID N0=6, SEQ ID NO‘8, SEQ ID NO:10 _a SEQ ID NO:12, takže se protein nebo jeho část může podílet na metabolizmu sloučenin potřebných pro syntézu buněčných membrán v mikroorganizmech nebo v rostlinách nebo na transportu molekul těmito membránami. Jak shora uvedeno, proteinové složky těchto metabolických cest pro membránové složky nebo pro membránový transportní systém mohou mít význam pro produkci a sekreci jedné nebo několika jemných chemikálií. Příklady těchto aktivit jsou zde popsány. Tak se funkce PSE“ podílí buď přímo nebo nepřímo na výtěžku, produkci a/nebo produkční účinnosti jedné nebo několika jemných chemikálií.

Příklady PSE substrátových specifik katalytické účinnosti jsou uvedeny v tabulce I.

♦ fc · *· ·· • * fc · • · « • fc » · • · · • · · · fc ·

Podle dalšího provedení vynálezu deriváty molekul nukleové kyseliny podle vynálezu kódují proteiny, které mají alespoň přibližně 50% až 60%, s výhodou alespoň 60% až 70%, ještě výhodněji alespoň přibližně 70% až 80%, 80% až 90% nebo 90% až 95% a ještě výhodněji alespoň přibližně 96%, 97%, 98%, 99% nebo vyšší homologii s kompletní aminokyselinovou sekvencí ze souboru sekvencí SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:6, SEQ ID N0:8, SEQ ID Ν0=10 a SEQ ID N0:12. Homologie aminokyselinové sekvence se stanovuje v celém sekvenčním regionu programem PileUP (J. Mol. Evolution 25, str. 351 až 360, 1987; Higgins a kol., CABIOS, 5, str. 151 až 153, 1989) nebo BESTFIT nebo GAP (Henikoff S. a Henikoff J.G., Amino acid substitution matrices from protein blocks, Proč. Nati. Acad. Sci. USA 89, str. 10915 až 10919, 1992).

Částmi proteinu, kódované molekulami nukleové kyseliny podle vynálezu, jsou s výhodou biologicky aktivní části jedné z PSE. Zde používaný výraz “biologicky aktivní části PSE zahrnuje segment, například doména/motiv, PSE, který se podílí na metabolizmu žádaných sloučenin pro syntézu buněčné membrány v mikroorganizmech nebo v rostlinách nebo na transportu molekul membránami mikroorganizmu, nebo jehož aktivity jsou uvedeny v tabulce I. Provádí se zkouška enzymatické aktivity ke stanovení, zda se PSE nebo její biologicky aktivní část může podílet na metaboliznu žádaných sloučenin pro syntézu buněčné membrány v mikroorganizmech nebo v rostlinách nebo na transportu molekul těmito membránami. Tyto zkušební způsoby jsou podrobně popsány v příkladu 8 příkladové části a jsou známy pracovníkům v oboru.

Přídavné fragmenty nukleové kyseliny, které kódují bio40

4» «· • · 4 • 4 ♦44 4

4 4 • * 44 4 logicky aktivní segmenty PSE, se mohou generovat i20lácí části jedné z těchto sekvencí SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:10 _a SEQ ID NO:12, expresí kódovaného segmentu PSE nebo peptidů (například rekombinantní expresí in vitro) a stanovením aktivity zakódované části PSE nebo peptidů

Vynález zahrnuje také molekuly nukleové kyseliny, které se liší od jedné z nuk1eotidových sekvencí ze souboru SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:9 a SEQ ID NO:11 (nebo jejich části) se zřetelem na degeneraci genetického kódu a které takto kódují stejnou PSE jako PSE zakódovanou nukleotidovou sekvencí ze souboru SEQ ID N0-'l, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO:9 _a SEQ ID NO11, Podle jiného provedení izolovaná molekula nukleové kyseliny podle vynálezu má nukleotidovou sekvenci, která kóduje protein s aminokyselinouvou sekvencí ze souboru zahrnujícího SEQ ID N0^;2, SEQ ID N0:4, SEQ ID N0:6, SEQ ID N0:8, SEQ ID NO:10 _aSEQ ID NO:12. Podle dalšího provedení molekula nukleové kyseliny podle vynálezu kóduje PSE protein v plné délce, který je v podstatě homologický s aBinokyselinovou sekvencí 2e souboru SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO = 8, SEQ ID NO·’10 a SEQ ID NO: 12 (která je zakódována otevřeným čtecím rámcem v sekvencích ze souboru SEQ ID N0:l, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO=5, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:9 a SEQ ID NO:11) a která se může identifikovat a izolovat o sobě známými způsoby.

Kromě PSE nukleotidových sekvencí ze souboru SEQ ID Ν0=1, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO-7, SEQ ID NO = 9 a SEQ ID NO=11 je pracovníkům v oboru zřejmé, že mohou existovat DNA sekvenční polymorfizmy, které vedou ke změně aminokyselinových sekvencí PSE v rámci populace (například populace Physcomitrella, Phytophthora, Crypthecodinium nebo Thraustochytrium). Tyto genetické polymorfizmy v PSE genu mohou existovat mezi individui v populaci v důsledku přírodní variace. Výrazem gen a rekombinantní gen se zde vždy míní molekuly nukleové

• Μ» ·· 99 • · 9 9 • 9 9

9 9 • · 9

9999 kyseliny, které otvírají čtecí rámec, který kóduje PSE, s výhodou Phytophthora, Physcomitřel 1a, Crypthecodinium nebo Thraustochytrium PSE. Tyto přírodní varianty zpravidla způsobují 1 až 5% varianci v nukleotidové sekvenci PSE genu. Všechny tyto nukleotidové variance a rezultující aminokyselinové polymorfizmy v PSE, které mohou být následkem přírodní variace a nemění funkční aktivitu PSE spadají rovněž do rozsahu vynálezu.

Molekuly nukleové kyseliny, které odpovídají přírodním variantám a ne-Physcomitřellové, ne-Phytophthorové, ne-Crypthecodiniové nebo ne-Thraustochytriové homology, deriváty a analogy cDNA organizmů Physcomitre11a, Phytophthora, Crypthecodinium nebo Thraustochytrium se mohou izolovat o sobě známými hybridizačnimi způsoby za přísných hybridizačnich podmínek se zřetelem na své homology se PSE nukleovou kyselinou Physcomitrella, Phytophthora, Crypthecodinium nebo Thraustochytrium zde uvedenenou za použití cDNA nebo její části organizmů Physcomitrella, Phytophthora, Crypthecodinium nebo Thraustochytrium jakožto hybridizační sondy. Podle jiného provedení vynálezu izolovaná molekula nukleové kyseliny podle vynálezu má minimální délku 15 nukleotidů a hybridizuje za přísných podmínek s molekulou nukleové kyseliny, která zahrnuje nukleotidovou sekvenci SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:9 a SEQ ID NO:11. Podle jiného provedení vynálezu má nukleová kyselina podle vynálezu minimální délku 25, 50, 100, 250 nebo více nukleotidů. Výrazem “hybridizuje za přísných podmínek” se vždy míní podmínky hybridizace a promývání, za kterých nukleotidové sekvence mají alespoň 60% homologii s ostatními, zpravidla navzájem hybridizujičími. Podmínky jsou s výhodou takové, že sekvence, která má alespoň přibližně 65% a výhodněji alespoň přibližně 70% a nejvýhodněji alespoň přibližně 75% nebo vyšší homologii s ostatními zpravidla hybridizuje s ostatními. Tyto přísné podmínky jsou pracovníkům v oboru známy a jsou dostupné v návodech (Current Protocols in Mo42 ··« · *♦ ·♦ » * · « lecular Biology, John Wiley & Sons, N.Y., 6.3.1-6.3.6, 1989).

Výhodný, nikoliv však omezující příklad přísných hybridizadních podmínek jsou hybridizace v 6 x chlorid sodný/citrát sodný (sodium chlorid/sodium citrát = SSC) při teplotě přibližně o

Ca následné promytí v jednom nebo v několika stupních v 0,2 x SSC, O,1 % SDS při teplotě 50 až 65 C. Pracovníkům v oboru je známo, že se hybridizační podmínky liší v závislosti na typu nukleové kyseliny, například v přítomnosti organických rozpouštědel, se zřtelem na teplotu a koncentraci pufru. Například je teplota za standardních hybridizačních podo mínek v závislosti na typu nukleové kyseliny 42 až 58 C ve vodném pufru za koncentrace O,1 až 5 x SSC (hodnota pH 7,2). V přítomnosti organického rozpouštědla ve shora uvedeném pufru, například 50% formamidu, je teplota za standardních podmío nek přibližně 42 C. Jako hybridizační podmínky pro DNA:DNA hybridy se jako výhodné uvádí například 0, 1 x SSC a 20 až 45 o

až 45 C. Hybridizační podmínky pro hybridy o

výhodou například 0, 1 x SSC a 30 až 55 C, o

C. Shora uvedené hybridizacní podmínky se

C, zvláště 30 DNA=RNA jsou s zvláště 45 až 55 stanovují naříklad pro nukleovou kyselinu přibližně v délce 100 bp (párů bází) a obsahu G + C 50 % v nepřítomnosti formamidu. Pracovníkům v oboru je známo, jak se mohou stanovit potřebné hybridizačni podmínky se zřetelem na příručky, jako je shora uvedená publikace Sambrook a kol. (Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory, 1989; Hames and Higgins, “Nucleic Acids Hybridization: A practical Approach, IRL Press at Oxford University Press, Oxford (vyd.) 1985; Brown, Essentíal Molecular Biology“, A practical Approach, IRL Press at Oxford University Press, Oxford (vyd.) 1991).

S výhodou izolovaná molekula nukleové kyseliny podle vynálezu, která hybridizuje za přísných podmínek se sekvencí SEQ

ID N0:l, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:9 a

SEQ ID NO:11 odpovídá přírodně se vyskytující molekule nukleové kyseliny. Výrazem přírodně se vyskytující molekule nukle43 ·· ···· ···· ové kyseliny se zde míní RNA nebo DNA molekula, s nukleotidovou sekvencí, která se vyskytuje v přírodě (npříklad která kóduje přírodní protein). Podle jednoho provedení vynálezu nukleová kyselina kóduje přírodně se vyskytující Physcomitřel 1a patens PSE, Phytophthora infestans PSE, Crypthecodinium cohnii PSE, nebo Thraustochytrium PSE.

Kromě přírodně se vyskytujících variant PSE sekvence, která může existovat v populaci, je pracovníkům v oboru známo, že lze také zavést změny prostřednictvím mutace do nukleotidové sekvence SEQ ID NQ:1, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:9 a SEQ ID NO:11, které vedou ke změně aminokyselinové sekvence zakódované PSE bez nepříznivého ovlivnění funkcionality PSE proteinu. Například nukleotidové substituce, které zavádějí do aminokyselinových substitucí neesenciálni aminokyselinové zbytky se mohou generovat v sekvenci SEQ ID NOH, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:9 a SEQ ID NO:11. Neesenciálním aminokyselinovým zbytkem je zbytek, který se může měnit v sekvenci divokého typu jedné z PSE (SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:8, SEQ ID NOHO a SEQ ID NO:12) bez změny aktivity PSE, zatímco esenciálni aminokyse1 inový zbytek je žádaný pro PSE aktivitu. Jiné aminokyselinové zbytky (například aminokyselinové zbytky, které se nekonzervuji, nebo se jen semikonzervuj i v doméně se PSE) nemusí být však esenciální pro aktivity, a proto se pravděpodobně mohou zaměnit bez změn PSE aktivity.

Vynález se také týká molekul nukleové kyseliny, které kóduje PSE obsahující zaměněné aminokyselinové zbytky, které nejsou esenciální pro aktivitu PSE. Tyto PSE se liší od sekvence SEQ ID N0:2, SEQ ID N0:4, SEQ ID N0:6, SEQ ID N0:8, SEQ ID NQ:10 a SEQ ID N0H2 se zřettelem na aminokyselinovou sekvenci za udržení alespoň jedné PSE aktivity zde popsané. Podle jednoho provedení vynálezu izolovaná molekula nukleové kyseliny zahrnuje nuleotidovou sekvenci kódující protein, protein ··»· zahrnuje aminokyselinovou sekvenci s alespoň přibližně 50% homo log i í s aminokyselinovou sekvencí SEQ ID NO:2, SEQ ID NO = 4, SEQ ID N0^;6, SEQ ID Ν0 = 8, SEQ ID N0=10 a SEQ ID N0=12 a schopnou podílet se na metabolizmu sloučenin potřebných pro syntézu buněčných membrán v organizmech Phytophthora, Physcomitrella, Crypthecodinium nebo Thraustochytrium nebo na transportu molekul těmito membránami. Protein, kódovaný molekulou nukleové kyseliny, má s výhodou alespoň přibližně 50% až 60% homologi i s jednou ze sekvencí zahrnující SEQ ID NO = 2, SEQ ID N0:4, SEQ ID N0:6, SEQ ID N0 = 8, SEQ ID NO:1O a SEQ ID NO'· 12, výhodněji alespoň přibližně 60% až 70% homologi i s jednou ze sekvencí zahrnující SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:6, SEQ ID N0^;8, SEQ ID NO:10 _a SEQ ID NO:12 _a ještě výhodněji alespoň přibližně 70% až 80%, 80 až 90%, 90% až 95% homologii s jednou ze sekvencí zahrnující SEQ ID Ν0=2, SEQ ID N0=4, SEQ ID N0=6, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:10 _a SEQ ID NO:12 _a nejvýhodněji alespoň přibližně 96%, 97%, 98% nebo 99% homologii s jednou ze sekvencí zahrnující SEQ ID N0=2, SEQ ID N0:4, SEQ ID N0=6, SEQ ID N0:8, SEQ ID NO:10 _a SEQ ID N0:12.

Ke stanovení procentové homologie se dvěma aminokyselinovými sekvencemi (například jedné se sekvencí ze souboru zahrnujícího SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:10 _a SEQ ID N0=12 a jejich mutované formy) nebo dvou nukleových kyselin jsou sekvence psány jedna pod druhou k umožnění optimálního srovnání (například mezery mohou být zavedeny do sekvence proteinu nebo nukleové kyseliny k vytvoření optimálního vyrovnání s jiným proteinem nebo s jinou nukleovou kyselinou). Potom se porovnávají aminokyselinové zbytky nebo nukleotidy na odpovídajících aminokyselinových pozicích nebo nukleotidových pozicích. Jestliže je pozice v sekvenci (například jedna ze sekvencí SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO-6, SEQ ID NQ:8, SEQ ID NO:10 _a SEQ ID NO:12) okupována stejným aminokyselinovým zbytkem nebo stejným nukleotidem jako odpovídající pozice v jiné sekvenci (například mutovaná forma • · · · · φ ··· *·· ·· ·· « · < ···· sekvence ze souboru zahrnujícího SEQ ID NO=2, SEQ ID NO:4, SEQ ID N0 = 6, SEQ ID N0:8, SEQ ID NOHO a SEQ ID NO: 12) j_e molekula homologická v této pozici (tedy homologie aninokyseliny nebo nukleové kyseliny zde odpovídá identitě aminokyseliny nebo nukleové kyseliny). Procentová homologie mezi dvěma sekvencemi je funkcí počtu identických pozic, na kterých se sekvence podílejí (procento homologie se tedy rovná počtu identických ροζic/ce1kový počet pozic x 100).

Izolovaná molekula nukleové kyseliny, která kóduje PSE, která je homologická s proteinovou sekvencí SEQ ID NO:2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO = 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NOHO a SEQ ID NO:12 ge může generovat zavedením jedné nebo několika nukleotidových substitucí, adicemi nebo delečemi do nukleotidové sekvence SEQ ID NOH, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO:?, SEQ ID NO: 9 a SEQ ID Ν0Π1, takže jedna nebo několik aminokyselinových substitucí, adicí nebo delecí se zavede do kódovaného proteinu. Mutace se může zavádět do jedné ze sekvencí SEQ ID NOH, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO:?, SEQ ID NO 9 a SEQ ID NO Π1 o sobě známými způsoby, jako jsou místně řízená mutagenéze a PCR zprostředkovávaná mutagenéze. S výhodou se konzervativní aminokyselinové substituce generují na jednom nebo na několika předpověděných aminokyselinových antismyslových zbytcích. V konzervativní aminokyselinové substituce se vyměňuje aminokyselinový zbytek za aminokyselinový zbytek s podobným postranním řetězcem. Rodiny aminokyse1 i nových zbytků s podobnými postranními řetězci byly definovány ve speciálním oboru. Tyto rodiny zahrnují aminokyseliny s bazickými postranními řetězci (například lysin, arginin, histidin), s kyselými postranními řetězci (například kyselinu asparagovou, glutamovou), s polárními postranními řetězci bez náboje (například glycin, asparagin, glutamin, serin, threonin, tyrosin, cystein), s nepolárními postranními řetězci (například alanin, valin, leucin, isoleucin, prolin, fenylalanin, methionin, tryptofan), s p-rozvětveným i postranními řetězci (například φφ * · φ φ φφ φ · φ φφφ φ φ φ · φ

Φ· φφ • Φ «φφφ ♦ * φφ ► Φ Φ 1 threonin, váliη, isoleucin) a s aromatickými postranními řetězci (například tyrosin, fenylalanin, tryptofan, histidin). Předpověděnýaminokyselinový neesenciální zbytek v PSE se tak s výhodou zaměňuje za jiný aminokyselinový zbytek z téže rodiny s postranním řetězcem. Jako alternativa podle jiného provedení vynálezu se mohou mutace zavádět statisticky na všechny nebo na část PSE kódujících sekvencí, například saturační mutagenezí a získané mutanty se mohou skrínovat se zřetelem na PSE asktivitu zde popisovanou k identifikaci mutantů, které si udržují PSE aktivitu. Po mutagenezi jedné ze sekvencí SEQ ID NOU, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9 _a SEQ ID N0U1 se zakódovaný protein může expresovat rekombinantně a aktivita proteinu se může stanovovat například zkouškou zde popsanou (v příkladech praktického provedení).

Kromě molekul nukleové kyseliny, které kódují shora popsané PSE, se vynález také týká izolovaných molekul nukleové kyseliny k nim antismyslným“. Antismyslová nukleová kyselina zahrnuje nukleotidovou sekvenci, která je komplementární k nukleové kyselině “mající smysl“, která kóduje protein, například ke kódujícímu řetězci dvouřetězcové cDNA molekuly nebo komplementární s mRNA sekvencí. Antismyslová nukleová kyselina se může vázat na nukleovou kyselinu mající smysl vodíkovými vazbami. Antismyslová nukleová kyselina může být komplementární s kompletem PSE - kódující řetězec nebo pouze s jeho částí. Podle jednoho provedení vynálezu molekula nukleové kyseliny je “antismyslová ke kódujícímu regionu kódujícího řetězce nukleotidové sekvence kódující PSE. Výraz kódující region se týká regionu nukleotidové sekvence, která zahrnuje kodony, které jsou translatované do aminokyselinových zbytků (například celý kódující region, který startuje a končí se stop kodonem, to je posledním kodonem před stop kodonem). Podle dalšího provedení antismyslová molekula nukleové kyseliny je antismyslový až nekódující region“ kódujícího řetězce nukleotidové sekvence kódující PSE. Výraz nekódující řetězec se týká

	fcfc « ·	• fc « ·	fc* · · fc	fcfc -» ·	• fc • fc
	fc ·	fc fc	fc	• ·	•
• *	fcfc	fc*	•	fc ·	• fcfc·

5' a 3’ sekvenci, které lemují kódující region a nejsou translatované do aminokyselin (to je, které jsou také končeny 5’- a 3'- netranslatovánými regiony).

Zde popisované PSE-kódující sekvence kódujícího řetězce (například sekvence ze souboru sekvencí zahrnujícího SEQ ID NO: 1 , SEQ ID NO = 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO··?, SEQ ID NO: 9 a SEQ ID NO:11) antismyslové nukleové kyseliny podle vynálezu se mohou označovat podle pravidel Watson-Crickova párování bázi. Antismyslová molekula nukleové kyseliny může být komplementární ke všem kódujícím regionům PSE mRNA, avšak výhodněji je to oligonikleotid, který je ”antismyslový pouze k části kódujícího nebo nekódujícího regionu PSE mRNA. Například anti smyslový oligonukleotid může být komplementárnáí k regionu okolo translačního startu PSE mRNA, Antismyslový oligonukleot,id může mít délku například přibližně 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45 nebo 50 a více nukleotidů. Ant ismyslový oligonukleotid má s výhodou ve své délce 15 až 25 nukleotidů. Antismyslový oligonukleotid podle vynálezu se může kontruovat způsobem v oboru známým za použití chemických syntěžních a enzymatických lígačních reakcí. Například antismyslová nukleová kyselina (například antismyslový oligonukleotid) se může syntetizovat chemicky za použití přírodně se vyskytujících nukleotidů nebo různě modifikovaných nukleotidů, které zvyšují biologickou stabilitu molekul nebo zvyšují fyzikální stabilitu duplexu vytvořeného nezi nukleovou kyselinou antismyslovou a mající smysl; například se mohou použít fosforthioátové deriváty a akridinem substituované nukleotidy. Jakožto příklady modifikovaných nukleotidů, kterých se může použít pro generaci antismyslové nukleové kyseliny, se uvádějí: 5-fluoruracyl, 5-bromuracyl, 5-chloruracyl, 5-joduracyl, hypoxanthin, xanthin, 4-acetylcytosin, 5-(karboxyhydroxylmethyl)uracyl, 5-(karboxymethylaminomethyl-2-thiouridin, 5-(karboxymethylaminomethyluracyl, dihydrouracyl, p-D-galaktosylkveosin, inosin, 6N-isopentenyladenin, 1-methylguanin, 1-methylinosin, 2, 2-dimethylguanin, 2-raethyladenin, 2·· **·· «fr ·· w · · · · » · • * · « · w • » · ·» · « · • * · · · · ·· ·*<«

N6-adenin. 7- 48 * *·

9· 9 t • ** • · · « • » · ·«· ··

-methy 1 guanin, 3 -methy 1 cy tas in, 5-methy 1 cytas in,

-methylguanin, 5-methylaminamethyluracyl, 5-methoxyaminoiiiethy1-2-thiouracy1, (S-D-nannosylkveosin, 5’ -methoxykarboxyraethyluracyl, 5-methoxyuracy1, 2-methylthio-6N-isopentyladenin, uracy1-5-oxyoctová kyselina Cv), xybutoxin, pseudouraeyl, kveosin, 2-thioeytosin, 5-methy1-2-thiouracy1, 2-thiouracyl, 4-thiouracyl, 5-methyluracyl, methyluracyl-5-oxyacetát, uracyl-5-oxyoctová kyselina Cv), 5-methyl-2-thiouracy1, 3-C3-amino-3~N-2-karboxypropy1)uracy1, Cacp3)w a 2,6-diaminopuriun. Nebo se antismyslová nukleová kyselina může generovat biologicky za použití expresního vektoru, do kterého se subklonovanou nukleovou kyselinou v antismyslové orientaci Cto je RNA, která je transkribována nukleovou kyselinou zavedenou v anti smyslové orientaci se zřetelem na cílovou příslušnou nukleovou kyselinu, která je transskibována ve větším detailu v následující subsekc i).

Antismyslová molekula nukleové kyseliny podle vynálezu se zpravidla dodává do buňky nebo se generuje in sítu, takže hybrid izuje s buněčnou mRNA nebo se váže s buněčnou mRNA a/nebo s genomovou DNA kódující PSE, takže inhibuje expresi proteinu například inhibicí transkripce a/nebo translace. Hybridizace se může uskutečnit běžnou nukleotidovou komplementaritou za vytvoření stabilního duplexu nebo například v případě atismys1ové mo1eku1y nuk1eové kysel i ny, která váže duplicí ty DNA, specifickou interakcí v širokém rozštěpu dvojité šroubovice. Antismyslová molekula se může modifikovat takovým způsobem, že se specificky váže na receptor nebo na antigen expresovaný na selektovaném buněčném povrchu, například vázáním antismyslové molekuly nukleové kyseliny na peptid nebo protilátku, přičemž každý z nich se váže na buněčný povrchový receptor nebo na antigen. Buňky se také mohou vybavovat antismyslovou molekulou nukleové kyseliny za použití zde popsaných vektorů. Vektorové konstrukty, ve kterých je antismyslová molekula nukleové kyseliny pod kontrolou přísně prokaryotického, vírového nebo euka49 • ·· ·« ···· ·· · * ···· ·· · · · · · ··· · » · ·♦ · ·· ··· · · β · * * • · · ··· · · · ···«· ·· · ······ riotického promotoru, včetně rostlinného promotoru, jsou výhodné pro dosažení dostatečné intracelulární koncentrace antismyslových molekul.

Podle dalšího provedení vynálezu antismyslovou molekulou nukleové kyseliny je molekula m-anornerní nukleové kyseliny. Molekula ot-anomerní nukleové kyseliny vytáří specifické dvouřetězcové hybridy s komplementární RNA, řetezce jsou navzájem paralelní na rozdíl od běžných β-jednotek (Gautier a kol., Nucleic Acid Res. 15, str. 6625 až 6641, 1987). Antismyslová molekula nukleové kyseliny může zahrnovat 2' -o-methylribonukleotid (Inoue a kol., Nucleic Acid Res. 15, str. 6131 až 6148, 1987) nebo chimerní RNA-DNA analogon (Inoue a kol., FEBS Lett. 215, str. 327 až 330, 1987).

Podle dalšího provedení antismyslovou molekulou nukleové kyseliny podle vynálezu je ribozym. Ribozymy jsou katalytické RNA molekuly s ribonukleázovou aktivitou, která může štěpit jednořetězcovou nukleovou kyselinu, jako je mRNA, ke které mají komplementární region. Ribozymy, například s kladívkovou hlavou, které popsal Haselhoff a Gerlach (Nátuře 334, str. 585 až 591, 1988), se mohou používat pro katalytické štěpení PSE mRNA transkriptů k inhibici granslace PSE mRNA. Ribozym se spécifičitou pro PSE kódující nukleovou kyselinu se může označovat na základě nukleotidové sekvence PSE cDNA zde popsané (to je 38°Ck21__g07wd v SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:9 a SEQ ID NO:11) nebo na základě heterologové sekvence, která se má izolovat způsobem podle vynálezu. Například se může konstruovat derivát TetrahymenaL-19-IVS RNA, jehož nukleotidová sekvence aktivního místa je komplementární s nukleotidovou sekvencí, která se má odštěpit v PSE kódující mRNA (například Cech a kol., americký patentový spis číslo US 4 987071 a Cech a kol., americký patentový spis číslo US 5 116742). Nebo se může používat PSE mRNA pro selekci katalytické RNA se specifickou ribonukleázovou aktivitou ze soubo50

ru RNA molekul (Bartel D. a Szostak J.W., Science 261, str. 1411 až 1418, 1993).

Nebo se exprese PSE genu může inhibovat řízením nukleotidových sekvencí, které jsou komplementární s regulačním regionem PSE nukleotidové sekvence (například PSE promotor a/nebo zesilovač transkripce) takovým způsobem, že se vytváří trojitá šroubovieová struktura, která inhibuje transkripci PSE genu v cílovýých buňkách (Helene C., Anticancer Drug. Res. 6(6), str. 569 až 584, 1991; Helene C. a kol., Ann. N. ν'Acad. Sci. 660, str. 27 až 36, 1992; a Maher L.J., Bioassays 14(12), str. 807 až 815, 1992).

B. Genový konstrukt

Vynález se také týká nového genového konstruktu obsahujícího izolovanou nukleovou kyselinu odvozenou od Physcomitrella, Phytophthora, Crypthecodinium nebo Thraustochytrium a kódující polypeptid, který elonguje mastné kyseliny s 3.6, s 18 nebo se 20 atomy uhlíku s alespoň dvěma dvojnými vazbami ve skeletu mastné kyseliny o alespoň dva atomy uhlíku, nebo který obsahuje genovou sekvenci SEQ ID N0=l, SEQ ID N0^:3, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO 9 a SEQ ID NO 11, její homology, deriváty nebo analogy, které se váží na jeden nebo na několik regulačních signálů s výhodou pro zvýšení genové exprese. Jakožto příklady takových regulačních sekvencí se uvádějí sekvence, které se váží na induktory nebo represory, a tak regulují expresi nukleové kyseliny. Tyto nové regulační sekvence, přírodní regulace těchto sekvencí před aktuálními strukturálními geny může být vždy přítomná, pokud je geneticky vhodně modifikována, takže se přírodní regulace může vypnout a exprese genu se podpoří. Genový konstrukt může mít však také jednodušší strukturu, to znamená, že se nezavádějí přídavné regulač ní signály dříve než sekvence SEQ ID N0=l, SEQ ID NO:3, SEQ ID N0:5, SEQ ID N0 = 7, SEQ ID NO 9 a SEQ ID NO 1.1 nebo jejich ho51

• » • · · · · · mology a přírodní promotory s jejich regulací nejsou deletovány. Místo toho se mutuje přírodní regulační sekvence takovýmto způsobem, že regulace již neexistuje a genová exprese se podpoří . Genový konstruk může dále s výhodou zahrnovat jeden nebo několik tak zvaných zesilovačů transkripce sekvencí, které se funkčně vážou na promotor a které umožňují zvýšení exprese sekvence nukleové kyseliny. Je také možné přídavně začleňovat výhodné sekvence na 3’ zakončení sekvencí DNA například další regulátorové prvky nebo terminátory. Elongázové geny mohou být obsaženy v jedné nebo v několika kopiích v genovém konstruktu. Pro inzerci dalších genů do organizmu je výhodné, pokud jsou další geny obsaženy v genovém konstruktu.

Výhodné regulační sekvence pro nový proces existují například v promotorech, jako jsou cos, tac, trp, tet, . trp-ted, lpp, lac, Ipp-lac, láci**, T7, T5, T3, gal, trc, ara,

SP6, Á Pr nebo X Pl promotor a s výhodou se používají v gramnegativních bakteriích. Regulační sekvence dále s výhodou existují v gram-pozitivních promotorech amy a SP02, v kvasinkových nebo v houbových promotorech ADC1, MFof, AC, P-6O, CYC1 , GAPDH, TEF, rp28, ADH nebo v rostlinných promotorech CaMV/35S (Franck a kol., Cell 21, str. 285 až 294, 1980), PRP1 (Ward a kol., Plant. Mol. Biol, 22, 1993), SSU, OCS, 1ib4, usp, STLS1, B33, nos nebo v ubiquitinovém nebo v phaseolinovém promotoru. V této slouvislosti jsou vhodné také indukovatelné promotory, například promotory popsané v literatuře (evropský patentový spis číslo EP-A-0 388186 (benzylsulfonamid-indukovatelný); Gatz a kol., Plant J. 2, str. 397 až 404, 1992 (tetracyklin-indukovatelný); evropský patentový spis číslo EP-A-0 335528 (abscisová kysel ina-indukovatelná); nebo světový patentový spis číslo W0 93/21334 (ethanol- nebo cyklohexanol- indukovatelný). Jinými vhodnými rostlinnými promotory jsou cytosolická FBPáza nebo bramborový ST-LSI promotor (Stockhaus a kol., EMBO J. 8, str. 2445, 1989) Glycin max fosforibosylpyrofosfátamidotransferázový promotor (Genbank Accesion NO. U8799) nebo pro ·· · · · · · · · · · • ·· · · · · · · • · · · · · · · · ····· »e · ······ nodus specifický promotor (popsaný v evropském patentovvém spise číslo EP-A-0 249676). Zvláště výhodnými promotory jsou promotory, které umožňují expresi ve tkáních, které jsou zahrnuty v biosyntéze mastných kyselin. Mimořádně výhodné jsou pro semena specifické promotory, jako jsou promotory usp, LEB4, faseolin nebo napin. Dalšími výhodnými jsou pro semena specifické promotory, kterých se může používat jako monokotů nebo dikotů, které jsou popsány v americkém patentovém spise číslo US 5 608152 (řepky olejky napin promotor), ve světovém patentovém spise číslo WO 98/45461 (Arabidopsis phaseolin promotor), v merickém patentovém spise číslo US 5 504200 (Phaseolus vulgaris phaseolin promotor), ve světovém patentovém spise číslo WO 91/13980 (Brassica BCe4-promotor) a v další literatuře (Baeumlein a kol., Plant J. 2, 2, str. 233 až 239, 1992 (luštěninový LEB4 promotor), přičemž jsou tyto promotory vhodné pro dikoty. Pro monokoty jsou vhodné například následující promotory: pro ječmen lpt-2 nebo lpt-1 promotor (světový patentový spis číslo WO 95/15389 a W0 95/23230), ječnenový hordě i nový promotor a jiné vhodné promotory popsané ve světovém patentovém spise číslo W0 99/16890.

V podstatrě je možné použít všrchny přírodní promotory s jejich regulačními sekvencemi, shora zmíněnými, pro nový způsob. Je také možné a výhodné přídavně použít syntetických promotorů.

Genový konstrukt může také zahrnovat další geny, které se mají zavést do organizmů. Je možné a výhodné zavádět do hostitelských organizmů a expresovat v nich regulační geny, jako jsou geny pro induktory, represory a enzymy, které v důsledku své enzymatické aktivity se podílejí na regulaci jednoho nebo několika genů biosyntetické cesty. Tyto geny mohou být heterologového nebo homologového původu. Včleněné geny mohou mít svůj vlastní promotor nebo mohou být pod kontrolou promotoru sekvence SEQ ID HOU, SEQ ID NO = 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID • ·· · · ···· ·· ·· • · · · ·· · · · · · • «· · · · * · · «·· ··· · · ♦ ····· 99 · ······

Ν0·'7, SEQ ID Ν0·’9 a SEQ ID NO·'11 nebo jejich homologů, derivátů nebo analogů.

K expresování jiných genů, které jsou obsaženy, zahrnuje genový konstrukt s výhodou další 3’ - a/nebo 5’ -koncové regulační sekvence pro podporu exprese a tyto sekvence jsou vybrány pro optimální expresi jako funkce vybraného hostitelského organizmu a genu nebo genů.

Jak shora uvedeno, úkolem těchto regulačních sekvencí je umožnit specifickou expresi genů a expresi proteinu. V závislosti na hostitelském organizmu to může například znamenat, že se gen expresuje nebo nadexpresuje pouze po indukci nebo že se expresuje a/nebo nadexpresuje bezprostředně.

Regulační sekvence nebo regulační faktory mohou mít výhodné působení na expresi genů, které se zavedly, a tak je podpořit. Při tomto způsobu je možné, že se regulační elementy s výhodou podporují na transkripční úrovni za použití silných transkripčních signálů, jako jsou promotory a/nebo zesilovače trankripce. Je však dále také možné podporovat translaci například zlepšením stability mRNA. Sekvence nukleové kyseliny podle vynálezu jsou s výhodou klonovány do genového konstruktu («expresní kaseta, konstrukt nukleové kyseliny) spolu s alespoň jedním reportérovým genem a tento genový konstrukt se zavádí do organizmu prostřednictvím vektoru nebo přímo do genomu. Tento reporterový gen má umožnit snadnou zjisti tel nost prostřednictvím zkoušek růstu, fluorescence, chemiluminescence, bioluminescence nebo resistence nebo fotometrickým měřením. Jakožto příklady reportérových genů se uvádějí geny pro resistenei k antibiotikům nebo herbicidům, hydro1ázové geny, fluorescenceční proteinové geny, bioluminescenční geny, geny metabolizmu cukru nebo nukleotidu nebo biosyntézní geny, jako jsou Ura3 gen, Ilv2 gen, luciferázový gen, β-galaktosidázový gen, gfp geny, 2-deoxyglukózo-6-fosfátfosfatázový • · · * · · ·· · ·· ·· • · · · ·· * * « · ··· · · · ··· • · · ·· · · · · · · · · · gen, β-g1ukuronidázový gen, β-laktamázový gen, neoiycinfosfotransferásový gen, hygromycinfosfotransferázový gen nebo gen resistance BASTA (=glufosinát). Tyto geny umožňují, aby byla transkripční aktivita a tak exprese genu snadněji měřena a kvantifikována. To umožňuje identifikaci pozic v genomu, který vykazuje odlišnou produktivitu.

Sekvence nukleové kyseliny podle vynálezu ze souboru zahrnujícího SEQ ID NOU, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO = 7, SEQ ID NO:9 a SEQ ID NO:11, které kódují elongázy, mohou být obsaženy v expresní kazetě ( = genový konstrukt) v jedné nebo v několika kopiích.

Expresní kazeta <= genový konstrukt, konstrukt nukleové kyseliny) může přídavně obsahovat alespoň jednu další nukleovou kyselinu, která kóduje gen, s výhodou z biosyntézy mastné kyseliny, aby byl zaveden do hostitelského organizmu. Tyto geny mohou být odděleně regulovány nebo v témše regulačním regionu jako geny pro elongázu podle vynálezu. Tyto geny jsou například další biosyntézní geny s výhodou biosyntézy mastné kyseiny, což umožňuje zvýšenou syntézu. Příkadně se uvádějí geny pro Δ19-, 417-, Λ15-, ζ>12-, Λ9-, Δ8-, Δ6-, Zk5-, A4-desaturázu, pro různé hydroxylázy, ZÓ12-acetylenázu, acyl-ACP thioesterázu, β-ketoacyl-ACP syntházu nebo pro β-ketoacyl-ACP reduktázy. Desaturázové geny jsou s výhodou používány v konstruktu nukleové kyseliny. Tyto geny opět mohou být obsaženy v genovém konstruktu v jedné nebo v několika kopiích.

C. Rekombinantní expresní vektory a hostitelské buňky

Vynález se také týká vektorů, s výhodou expresních vektorů, obsahujících nukleovou kyselinu podle vynálezu nebo genový konstrukt podle vynálezu, které kódují PSE (nebo její část). Výrazem vektor se zde vždy míní molekula nukleové kyseliny, která může nést jinou nukleovou kyselinu, na kterou je ligová55 na. Jedním typem vektoru je “plasmid, který představuje okrouhlou dvouřetěscovou DNA smyčku, do které mohou být 1igovány přídavné DNA segmenty. Dalším typem vektoru je virový vektor, přičemž je možné, že jsou přídavné segmenty DNA 1igovány do virového genomu. Určité vektory jsou schopny autonomní replikace v hostitelské buňce, do které byly zavedeny (například bakteriální vektory s bakteriálním původem replikace a episomální savčí vektory). Jiné vektory (například episomálni savčí vektory) jsou integrovány do genomu hostitelské buňky po zavedení do hostitelské buňky a tak replikovány spolu s hostitelským genomem. RŮ2né vektory mohou řídit exresi genů, do kterých jsou funkčně vázány. Tyto vektory se označují jako “expresní vektory. Zpravidla expresní vektory, které jsou vhodné pro rekombinantní DNA techniky, mají formu plasmidů. V popisovaném případě se výrazy plasmid“ a “vektor“ mohou užívat zaměnitelně, jelikož je plasmid nejčastěji používanou formou vektoru. Vynález však zahrnuje tyto jiné formy expresních vektorů, například virové vektory (pro například replikaci deficientních retrovirů, adenovirů a adeno příbuzných virů), které mají podobné funkce. Výraz vektor také zahrnuje jiné vektory známé pracovníkům v oboru, jako jsou fágy, viry jako SV40, CMV, baculovirus, adenovirus, transposony, IS elementy, plasmidy, fagemidy, kosmidy, lineární nebo kruhové DNA a RNA.

Rekombinantní expresní vektory podle vynálezu zahrnují nukleovou kyselinu podle vynálezu nebo genový konstrukt podle vynálezu ve formě, která je vhodná pro expresi nukleové kyseliny v hostitelské buňce, čímž se míní, že rekombinantní expresní vektory zahrnují jednu nebo několik regulačních sekvencí, vybraných ná bázi hostitelské buňky k použití pro expresi, která je nebo které jsou funkčně vázány na sekvenci nukleové kyseliny, která se má expresovat. V rekombinantníffi expresním vektoru,funkčně vázaném“ se míní, že je příslušná nukleotidové sekvence vázána na regulační sekvenci nebo na regulační sekvence takovým způsobem, že je možná exprese nukleo56 φ φφ ······ Φ· ··

ΦΦΦ· ·* · · * · *

ΦΦΦ ··· · · · φ φ φ φ · φ · · · · φ • · · ΦΦΦ · · · • ΦΦ φφ ·· ♦ ·· ΦΦΦ· tidové sekvence a ty jsou navzájem vázány, takže obě sekvence splňují předurčenou funkci, která je sekvenci připisována (například ve in vitro transkripčním/translačním systému nebo v hostitelské buňce, pokud se vektor do hostitelské buňky zavede). Výraz regulační sekvence zahrnuje promotory, zesilovače transkripce a jiné expresní kontrolní prvky (například polyadenylační signály). Tyto regulační sekvence popsal například Goeddel (Gene Expression Technology: Methods in Enzyme logy 185, Academie Press, San Diego, CA, 1990) nebo Gruber a Crosby (Methods in Plant Molecular Biology and Biotechnology, CRC Press, Boča Raton, Florida, vyd.: Glick and Thompson, kapitola 7, str. 89 až 108 a připojená literatura). Regulační sekvence zahrnují sekvence, které řídí konstitutivní expresi ňukleotidové sekvence v četných typech hostitelských buněk a které řídí přímou expresi ňukleotidové sekvence pouze v určitých hostitelských buňkách za určitých podmínek. Pracovníkům v oboru je známo, že konstrukce expresního vektoru může záviset na četných faktorech, jako jsou například volba hostitelské buňky, která se má transformovat, a rozsah, kterým se žádaný protein expresuje. Expresní vektor podle vynálezu se může zavádět do hostitelské buňky za účelem produkce proteinů nebo peptidů, včetně fúzních proteinů nebo fúzních peptidů, které se kódují nukleóvými kyselinami, jak je zde popsáno (například PSE, mutantové formy PSE a fůzní proteiny). Rekombinantní expresní vektory podle vynálezu mohou být určeny pro expresi PSE v prokaryotických nebo eukaryotických buňkách. Například se PSE geny mohou expresovat v bakteriálních buňkách, například C glutamicum, ve hmyzích buňkách (za použití baculovirových expresních vektorů), v kvasnicích a v jiných houbových buňkách (Romanos M.A. a kol., Foreign gene expression in yeast: a review, Yeast 8, str. 423 až 488, 1992; van den Hondě1 C.A.M. J.J. a kol., Heterologous gene expression in filamentous fungi, More Gene Man i pul at ions in Fungi, J.W. Bennet Se L.L. Lasure, vyd., str. 396 až 428= Academie Press: San Diego, 1991; van den Hondě1 C.A.M,J.J. & Punt P.J., “Gene transfer Systems

3, str. 239 až 251, Holotrichia, Spirotrilemnae, způsobů popsaných ve světovém 01572 a buněk mnohabuněčných and vector development for filamentous fungi, Applied Molecular Genetios of Fungi, Peberdy J.F. a kol., vyd. str. 1 až 28, Cambridge University Press·' Cambridge, 1991) v řasách (Falci atore a kol., Marině Biotechnology 1

1999), v ciliátech následujících typů:

chia, Peritrichia, Suctoria, Tetrahymena, Paramecium, Colpidium, Glaucoma, Platyophrya, Potomacus, Pseudocohni1embus, Euplotes, Engelmaniella a Stylonychia, zvláště rodu Stylonychia za použití vektorů a následujících transformačních patentovém spise číslo WO 98/ rostlin (Schmidt R. a Willraít2er

L., High efficiency Agrobacterium tumefaciens-mediated Transformation of Arabidopsis thaliana leaf and cotyledon explants“ Plant Cell Rep., str. 583 až 586, 1988; Plant Molecular Biology and Biotechnology, C Press, Boča Raton, Florida, kapitola 6/7, str. 71 až 119, 1993; F.F. White, B. Jenes a kol., Techniques for Gene Transfer“, Transgenic Plants, svazek 1, Engineering and Uti lízat ion, vyd. : Kung a R. Wu, str. 128 až 143, 1993; Potrykus, Annu. Rev,

Academie Press, Plant Physiol.

Plant Molec. Biol. 42, str. 205 až 225, 1991 a připojené odkazy na literaturu) nebo v savčích buňkách. Vhodné hostitelské buňky popsal také Goeddel (Gene Expressi on Technology: Methods in Enzymology 185, Academie Press, San Diego, CA, 1990). Jako alternativa se rekombinantní expresní vektor může transkribovat a translatovat in vitro, například za použití T7 promotorové regulační sekvence a T7 polymerázy.

V prokaryotech se proteiny zpravidla expresují za použití vektorů obsahujících konstitutivní nebo zaveditelné promotory, které řídí expresi fúzních proteinů nebo nefúzních proteinů. Fúzní vektory přidávají řadu aminokyselin do kódovaného proteinu, zpravidla na aminozakončení rekombinantního proteinu, avšak také na C zakončení, nebo fúzují se vhodnými regiony v proteinech. Tyto fúzní vektory mají zpravidla tři účely: 1) podporují expresi rekombinantního proteinu, 2) zvyšují solubi58

9 ·

9

9· 9999 libu rekombinantního proteinu, 3) poporují čištění rekorabinantního proteinu působením jako ligand v afinitním čištění, například prostřednictvím tak zvaných his konečků. V případě fúzních expresních vektorů se často zavádí místo proteolytického štěpení v místě, kde jsou vázány, fúzní jednotka a rekombinantní protein, takže se rekombinantní protein může oddělit od fúzní jednotky po čištění fúzního proteinu. Tyto enzymy a jejich odpovídající rozpoznávací sekvence zahrnují faktor Xa, thrombin a enterokinázu.

Jakožto typické expresní vektory se příkladně uvádějí pGEX (Pharmacia Biotech lne. , Smith D.B. a Johnson K.S., Gene 67, str. 31 až 40, 1988), piíAL (New England Biolabs, Beverly, ÍÍA) a pRIT5 (Pharmacia, Piscataway, NJ), přičemž je glutathion S-transferáza (GST), maltóz-E-vázající protein nebo protein A fúzován na rekombinantní cílový protein. Podle jednoho provedení je PSE kódující vektor klónován do pGES expresního vektoru pro generaci vektoru kódujícího fúzní protein, který zahrnuje od N-zakončení do C zakončení GRT-thrombin štěpící místo-X-protein. Fúzní protein se může čistit afinitní chromatografií za použití glutathion agarové pryskyřice. Rekombinantní PSE, který není fúzován s GST, se může získat štěpením fúzního proteinu thrombinem.

Jakožto příklady indukovatelného nefúzních E.coli expresních vektorů se uvádějí pTrc (Amann a kol., Gene 69, str. 301 až 315, 1988) a pET lid (Studier a kol., Gene Expressi on Technology: Methods in Enzymology 185, Academie Press, San Diego, Calífornía, str. 60 až 89, 1990). Štítová genová exprese pTrc vektoru je založena na transkripci hostitelské RNA polymerázy z hybridního trp-lac fúzního promotoru. Cílová genová exprese z pET lid vektoru je založena na transkripci z T7-gnlO-lac fúzního promotoru, který je zprostředkován koexpresní virovou RNA polymerázou (T7 gnl). Tato virová polymeráza je vybavena hostitelskými kmeny BL21 (DE3) a/nebo HMS174 (DE3) • 99 ·· 9999 99 99

9999 99 9 9999

99 9 9 9 9 9 9

9 9 9 9 9 9 9 9 9 9

9 9 9 9 9 9 9 9

9 99 9 9 9 99 9999 rezidentním profágem, který uchovává T7 gnl gen za transkripční kontroly lacUVS promotoru.

Jiné vektory, které jsou vhodné pro prokaryotické organizmy jsou pracovníkům v oboru známy: jakožto tyto vektory se příkldně uvádějí v E. coli pLG338, pACYC184, pBR série jako pBR322, PUC série jako PUC18 nebo PUC19, M113mp série, pKC30, pRep4, PHS1, pHS2, pPLc236, pMBL24, pLG200, pUR29G, pIN-III¹¹³-Bl, pgtll nebo pBdCI, ve Streptoffiyces píJI01, PIJ364, pIJ702, pIJ361 , v Bacillu PUBUO, pC194 nebo pBD214, v Corynebacterium pSA77 nebo pAJ667.

Strategií maximalizace exprese rekombinantního proteinu je expresovat protein v hostitelské bakterii, jejíž shopnost štěpit rekombinantní protein proteolyticky je narušena (Gotesman S., Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academie Press, San Diego, California, str. 119 až 128, 1990). Další stratetgií je modifikovat sekvenci nukleové kyseliny, která se má zavést sekvencí nukleové kyseliny do expresního vektoru, takže jednotlivými kodony pro každou aminokyselinu jsou kodony, které se s výhodou používají v bakterii vybrané pro expresi, například C. glutamicum (Hada a kol,, Nucleic Acíd Res. 20, str. 2111 až 2118, 1992), Kodifikace těchto sekvencí nkleové kyseliny podle vynálezu se provádí o sobě známými způsoby pro syntézu DNA.

Vynález se také týká PSE expresního vektoru, kterým je kvasinkový expresní vektor. Jeko příklady vektorů pro expresi do kvasinek S. cerevisiae se uvádějí pYepSecl (Baldari a kol., Embo J. 6, str. 229 až 234, 1987), pMFa (Kurjan a Herskowitz, Cell 30, str. 933 až 943, 1982), pjRY88 (Schultz a kol., Gene 54, str. 113 až 123, 1987) a pYES2 (Invitrogen Corporation, San Diego, CA). Vektory a způsoby pro konstrukci vektorů, které jsou vhodné pro použití v jiných houbách, jako jsou filamentní houby, které podrobně popsal van den Hondě1 C.A.M.J.J.

• ··	·· 9«··	• 9 99
• 99 9	• 9 ·	• · · 9

• · ·	• · 9	• · 9
• · · · 9	9 9 ·	• · * 9 9 9

& Punt P.J. (Gene transfer systems and vector development for filamentous fungi, Applied Molecular Genetics of Fungi, Peberdy J.F. a kol., vyd. str. 1 aá 28, Cambridge University Press: Cambridge, 1991) nebo 3.W. Bennet & L.L.Lasure (More Gene Manipulations in Fungi, str. 396 až 428, Academie Press: San Diego). Dalšími vhodnými kvasinkovými vektory jsou například pAG-1, YEp6, YEpl3 nebo pEMBLYe23.

Nebo se PSE podle vynálezu může expresovat ve hmyzích buňkách, za použití baculovirových expresních vektorů. Baculovirové vektory, které jsou vhodné pro expresní proteiny v kultuře hmyzích buněk (například buněk Sf9) zahrnují pAc série (Smith a kol., Mol. Cell Biol. 3, str. 2156 až 2165, 1983) a pVL série (Lucklow a Summers, Virology, 170, str. 31 až 39, 1989).

Shora uvedené vektory jsou krátkým přehledem možných vhodných vektorů. Pracovníkům v oboru jsou známy další plasmidy a jsou popsány v literatuře (například Cloning Vectors, (vyd.) Pouwels P.H. a kol., Elsevier, Amsterdam-New York-Oxford, ISBN O 444 904018, 1985).

Podle ještě dalšího provedení nukleová kyselina podle vynálezu se expresuje v savčích buňkách za použití savčího expresního vektoru. Jakožto příklady savčích expresních vektorů se uvádějí pCDMS (Seed B, Nátuře 329, str. 840, 1987) a pMT2PC (Kaufman a kol., EMBO J. 6, str. 187 až 195, 1987). Při použití v savčích buňkách kontrolní funkce expresního vektoru jsou často vybaveny virovými regulačními elementy. Promotory, které se obvykle používají, jsou odvozeny například od polyoma, adenoviru2, cytomegaloviru a opičího viru 40. Jiné vhodné expresní systémy pro prokaryotické a eukaryotické buňky jsou popsány v literatuře (kapitola 16 a 17, Sambrook J., Fritsch E.F. a Maniatis T., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2. vydání, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor

····

Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989).

Podle jiného provedení vynálezu může rekombinantní savčí expresní vektor řídit expresi nukleové kyseliny s výhodou ve specifickém buněčném typu (například pro tkáň specifické regulační elementy pro expresi nukleové kyseliny. Pro tkáň specifické regulační elementy jsou v oboru známy. Jakožto příklady, tedy nikoliv jako jakékoliv omezení, vhodných pro tkáň specifických regulačních promotorů se uvádějí albuminový promotor (specifický pro játra, Pinkert a kol., Genes Dev. 1, str. 268 až 277, 1987), lymfoidní specifické promotory (Calame a Eaton,

Adv. Immunol. 43, str. 235 až 275, 1988), zvláště promotory

T-buněčných receptorů (Winoto a Baltimore, Embo J. 8, str. 729 až 733, 1989) a immunoglobuliny (Banerji a kol., Cell 33, str.

729 až 740, 1983: Qeen a Baltimore, Cell 33, str. 741 až 748,

1983), neuron-spécifické promotory (například neurofilamentový promotor: Byrne a Ruddle, PNAS 86, str. 5473 až 5477, 1989), pro pankreas specifické promotory (Edlund a kol., Science 230, str. 912 až 916, 1985) a pro prsní žlázu specifické promotory (například mléčné sérové promotory; americký- patentový spis číslo US 4 873316 a evropský- patentový spis EP-A-0 264166) . Zahrnuty jsou promotory regulující vývoj, například muší hox promotory (Kessel a Gruss, Science 249, str. 374 až 379, 1990) a fetoproteinový promotor (Campes a Tilghman, Genes Dev. 3, str. 537 až 546, 1989).

Podle dalšího povedení vynálezu PSE podle vynálezu mohou být expresovány jednobuněčné rostlinné buňky (mapříklad řasy) (Falciatore a kol., Marině Biotechnology 1(3), str. 239 až 251, 1999 a připojené odkazy na literaturu) a rostlinné buňky z vyšších rostlin (například spermatophyty jako jsou plodiny). Jakožto příklady rostlinných expresních vektorů se uvádějí expresní vetory podrobně popsané v literatuře (Becker D., Semper E., Schell J. a Masterson R. (New plant binary vectors with selectable markers located proximal to the left border,

4« 99·· ·· ·· · · · · · · ·· * · · · · * ····«· · · · ·

Plant Mol. Biol. 20, str. 1195 až 1197, 1992; Bevan M.W., Dináry Agrobacterium vectors for plant transformation, Nucl. Acid Res. 12, str, 8711 až 8721, 1984; Vectors for Gene Transfer in Higher Plants, Transgenic Plants, svazek 1, Engineering and Utilization, vyd. Kung a R. Wu, Academie Press, str. 15 až 38, 1993). Další vhodné rostlinné vektory jsou popsány v literatuře (například Methods in Plant Molecular Biology and Biotechnology (CRC Press), kapitola 6/7, str. 77 až 119, 1993). Výhodnými vektory jsou tak zvané kyvadlové vektory nebo binární vektory, které se replikují v E. coli a v Agrobacteriu.

Rostlinná expresní kazeta s výhodou obsahuje regulační sekvence, které řídí genovou expresi v rotlinných buňkách a které jsou funkčně vázány, takž každá sekvence nůže plnit svoji funkci, jako například transkripční ukončení, například polyadenylačních signálů. Výhodnými polyadenylačnfmi signály jsou signály odvozené od organizmu Agrobacterium tumefaciens T-DNA jako gen 3 nebo Ti plasmid pTIACHS, který je znám jako oktopinsyntáza (Gielen a kol., EMBO J. 3, od str. 835, 1984) nebo její funkční ekvivalent, jsou však vhodné také jiné terminátory, které jsou funkčně aktivní v rostlinách.

Jelikož rostlinná genová exprese je velmi často neomezená na transkripční úroveň, obsahuje rostlinná expresní kazeta s výhodou jiné fukčně vázané sekvence, například zesilovač translace, například nadprodukční sekvenci, která obsahuje vedoucí sekvenci 5'-netranslatovaného viru tabákové mozajky viru, který zvyšuje poměr protein/RNA (Gallie a kol., Nucl. Acids Research 15, str. 8693 až 8711, 1987).

Exprese rostlinného genu musí být funkčně vázána na vhodný promotor, který ovlivňuje genovou expresi specifickým způsobem pro buňku nebo pro tkáň s přesným načasováním. Výhodnými jsou promotory, které vedou ke konstitutivní expresi (Benfey a kol., EMBO J. 8, str. 2195 až 2202, 1989), například odvozené

9« ·4·* • » 4 « 4 « • *4 • 4 · » • ·« • · 4 • 4 »

4*4 ·· • 4 · «

*4 «4 · « · • 4 » • · · · · * « 44« 4 z rostlinných virů, jako je 35S CAMV (Franck a kol., Cell 21, str. 285 až 294, 1980), 19S CaMV (také americký patentový spis číslo US 5 352605 a světový patentový spis číslo WO 84/02913) nebo rostlinné promotory jako Rubisco malý podjednotkový promotor (americký patentový spis číslo US 4 962028).

Jinými sekvencemi, které jsou výhodné pro funkční vázání v rostlinných genových expresních kazetách, jsou cílové sekvence, které jsou potřebné pro zacílení genového produktu do jeho odpovídajícího buněčného prostoru (pro přehled Kermode, Crit. Rev. Plant Sci. 15, 4, str. 285 až 423, 1996 a uvedené odkazy na literaturu) napříkad do vakuoly, do jádra, do všech typů plastidů jako jsou amyloplasty, chloroplasty, chromoplasty, extracelulární oblast, mitochondrie, endoplasmové reticulum, elaioplasty, peroxisomy a do jiných prostorů v rostlinných buňkách.

Rostlinná genová exprese se také může usnadňovat chemicky indukovatelnými promotory (pro přehled Gatz, Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol. 48, str. 89 až 108, 1997).

Chemicky indukovatelné promotory jsou zvláště vhodné, jestliže je žádoucí, aby genová exprese probíhala specifickým způsobem se zřetelem na načasování. Jakožto příklady takových promotorů se uvádějí salicylovou kyselinou indukovatelný promotor (světový patentový spis číslo W0 95/19443), tetracyk- línem indukovatelný promotor (Gatz a kol., Plant J. 2, str. 397 až 404, 1992) a ethanolem indukovatelný promotor.

Jinými vhodnými promotory jsou promotory, které odpovídají biotickým nebo abiotickým stresovým podmínkám, například patogenem indukovaný PRP1 genový promotor (Ward a kol., Plant. Mol. Biol. 22, str. 361 až 366, 1993), tepelně indukovatelný rajčatový ce-amylázový hspSO promotor (americký patentový spis číslo US 5 187267) , nízkotepelně indukovatelný bramborový oc-amylázový promotor (světový patentový spis číslo W0 96/12814) • · • · ···« · · 4 · • · * · ·· « ···· ••••4 ·· · ······ nebo poranění® indukovatelný pinii promotor (evropský patentoý spis číslo EP-A-0 375091).

Obzvláště výhodnými jsou promotory, které vedou ke genové expresi v tkáních a v orgánech, ve kterých dochází k biosyntéze lipidu a oleje, v rostliných buňkách, jako jsou endospermové buňky, a v buňkách vyvíjejícího se embrya. Jakožto vhodné promotory se uvádějí řepkové napinové genové promotory (americký patentový spis číslo US 5 608152), promotor Vicia faba USP (Baeumlein a kol., Mol Gen Genet, 225 (3), str. 459 až 467, 1991), promotor Arabidopsis oleosin (světový patentový spis číslo WO 98/45461), promotor Phaseolus vulgaris phaseolin (americký patentový spis číslo US 5 504200), promotor Brassica Bce4 (světový patentový spis číslo W0 91/13980) nebo luštěninový B4 promotor (LeB4: Baeumlein a kol., Plant Journal 2(2), str. 233 až 239, 1992) a promotory, které vedou k semenové specifické expresi v jednoděložných, jako jsou například kukuřice, ječmen, pšenice, šito, rýže. Významnými vhodnými promotory jsou ječmenný lpt2 nebo Iptl genový promotor (světový patentový spis číslo W0 95/15389 a W0 95/23230) nebo promotory popsané ve světovém patentovém spise číslo W0 99/16890 (promotory z ječmenného hordě inového genu, z rýžového glute1 inového genu, z rýžového orizinového genu, z rýžového prolaminového genu, ze pšeničného gliadinového genu, ze pšeničného glutelinového genu, z kukuřičného seinového genu, z ovesného flutelinového genu, z čirokového kasirinového genu a z žitného seca1inového genu.

Obzvláště vhodnými jsou také promotory, které vedou k plášti dové specifické expresi, jelikož plastidy jsou prostory, ve kterých se syntetizují prekurzory a některé konečné produkty lipidové biosyntézy. Vhodné promotory, například promotor polymer ázy virové RNA, jsou popsány ve světovém patentovém spise číslo W0 95/16783 a W0 97/06250 a Arabidopsis clpP promotor je popsán ve světovém patentovém spise číslo W0 99/46394.

Vynález se také týká rekombinantního expresního vektoru zahrnujícího DNA molekulu podle vynálezu, která se klónuje do expresního vekteru v antismyslové orientaci, to je DNA molekula se funkčně váže na regulační sekvenci tak, že umožňuje expresi (transkripcí DNA molekuly) RNA molekuly, která je antismyslová ke PSE mRNA. Mohou se volit regulační sekvence, které jsou funkčně vázány na nukleovou kyselinu klónovanou do antismyslové orientace a které řídí kontinuální expresi antismyslové RNA molekuly v multiplícitě buněčných typů, například virové promotory a/nebo zesilovače nebo se mohou volit regulační sekvence, které řídí konstitutivní, pro tkáně specifickou nebo pro buňku specifickou expresi antismyslové RNA. Anti smyslový expresní vektor může být obsažen ve formě rekominantního plasmidu, fágemidu nebo zeslabeného viru, ve kterých se antismyslové nukleové kyseliny produkují za řízení vysoce účinného regulačního regionu, jehož aktivita se může stanovit podle buněčného typu, do něhož se má zavádět vektor. V literatuře je vysvětlení regulace genové exprese prostřednictvím antismyslových genů (Wintraub H. a kol., Antisense-RNA as a molecular tool for genetic analysis, Reviews - Trends in Genetics, svazek 1(1), 1986).

Vynález se také týká hostitelských buněk, do kterých se zavádí rekombinantní expresní vektor podle vynálezu.. Výrazy hostitelská buňka a rekombinantní hostitelská buňka se zde vždy používají zaměnitelně. Přirozeně se tyto výrazy týkají nejen zvláštní cílové buňky ale také progenu nebo potenciálního progenu této buňky. Jelikož může docházet ke specifickým modifikacím v následných generacích se zřetelem na iutace nebo na působení okolí, nejsou tyto progeny nutně identické s mateřskou buňkou, avšak nevybočují z rozsahu používaného podle vynálezu.

Hostitelskou buňkou může být prokaryotická nebo eukaryotická buňka. Například se může PSE expresovat v bakteriálních ·· · · · · · buňkách, jako jsou C. glutamicum, hmyzí buňky, houbové buňky nebo savčí buňky (například vaječníkové buňky čínského křečka [Chinese hamster ovary] CHO nebo COS buňky), řasy, ciliates, rostlinné buňky, houby nebo jiné mikroorganizmy, jako je C-glutamicum. Další hostitelské buňky jsou známy pracovníkům v oboru.

Vektor DNA se může zavádět do prokaryotických nebo do eukaryotických buněk o sobě známými transformačními nebo transfekčními způsoby. Zde používané výrazy transformace“ a transfekce, konjugace a transdukce zahrnují souhrn známých způsobů v oboru pro zavádění cizí nukleové kyseliny (například DNA) do hostitelské buňky, včetně kalcíumfosfátové nebo kalciumchloridové koprecipitáce, DEAE-dextranem zprostředkovávaného transfekce, lipofekce, přírodní kompetence, chemicky zprostředkovávaného transferu, elektroporace nebo bombardování částicemi. Způsoby pro tranformaci nebo fransfekci hostitelských buněk, včetně rostlinných buněk popsal Sambrook J. a kol. (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2. vydání, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989) a jak je popsáno v dalších laboratorních příručkách (například Methods in Molecular Biology, svazek 44, Agrobacterium protocols, vyd. Gartland and Davey, Humana Press, Totowa, New Jersey, 1995).

stabilních transfekčních savčích buňkách je známo, že pouze minorita těchto buněk integruje cizí DNA do svého genomu v závislosti na použitém expresním vektoru a na použité transfekční technice. K identifikaci a selekci těchto integrantů gen, který kóduje selektovatelný signální znak (=marker) (například odolnosti k antibiotikům) se zpravidla zavádí do hostitelských buněk spolu s příslušným genem. Výhodné selektovatelné markéry zahrnují markéry, které dodávají odolnost k drogám, jako je G418, hygromycin a methotrexát nebo v rostlinách zahrnují markéry, které dodávají odolnost proti herbicidu, ja67

ko je glyfosfát nebo glufosinát. Vhodnými markéry jsou například markerysignální znaky, které kóduji geny, které jsou zahrnuty v biosyntézním pochodu, například cukry nebo aminokyseliny, jako je β-galaktosidáza, ura3 nebo ilv2. Markéry, které kódují geny, jako jsou luciferáza, gfp nebo jiné fluorescenční geny, jsou rovněž vhodné. Tyto markéry se mohou používat v mutantech, ve kterých tyto geny nejsou funkční, jelikož byly deletovány například o sobě známými způsoby. Dále se mohou zavádět markéry, které kódují nukleovou kyselinu, která kóduje selektovatelný signální znak do hostitelské buňky na tentýž vektor, jako je vektor, který kóduje PSE nebo se mohou zavádět na separátní vektor. Buňky, které byly stabilně transfektovány zavedenou nukleovou kyselinou, se mohou identifikovat například drogovou selekcí (například buňky, které mají integrovaný selektovatelný markér přežívají, zatímco ostatní buňky umírají).

Pro generaci homologově rekombinantního mikroorganizmu se generuje vektor, který obsahuje alespoň jeden segment PSE genu, do kterého se zavedla delece, adice nebo substituce k modifikaci PSE genu a tím například k narušení funčnosti. PSE genem je s výhodou Physcomitřel 1a, Phytophthpora, Crypthecodinium, nebo Thraustochytriura PSE gen, může se však také použít homolog nebo analog z jiných organizmů, dokonce i ze savčích, z houbových nebo ze hmyzích zdrojů. Podle výhodného provedení je vektor konstruován tak, aby byl endogenní PSE gen funkčně narušen (to je, aby již nekódoval funkční protein, také ukončený knock-out vektor) po homologové rekombinací. Nebo se vektor může konstruovat tak, že endogenní PSE geny se mutují nebo se modifikují jinak po homologové rekombinací za stále zakódovaného funkčního proteinu (například protisměrový regulační region může být modifikován tak, že vede k modifikaci exprese endogenní PSE). Ke generaci bodu mutace cestou homologové rekombínace se rovněž mohou použít DNA-RNA hybridy, které jsou rovněž známy jako chimeraplasty a které popsal Cole-Strauss a kol. (Nucleic Acid Research 27(5), str. 1323 až 1330, 1999; a • · · · · ·

· * · · · · · • · · · · • · · · · · • · · 4 « ··· 44 «··

Kmiec, Gene 247, 1999).

Therapy, American Scientist,

87(3), str

240 až

Vektor pro homologové rekombinace, modifikovaný segment PSE genu je lemován na svém 5’ a 3' zakončení přídavnou nukleovou kyselinou PSE genu, takže je možná homologová rekombinace mezi exogenním PSE genem, který je obsažen na vektoru a endogenním PSE genem v mikroorganizmu nebo v rostlině. Přídavná lemující PSE nukíeová kyselina je dostatečně dlouhá pro úspěšnou homologovou rekombinaci s endogenním genem. Zpravidla několik stovek párů bází až kilobáze lemující DNA (jak na 5’ tak na 3' zakončení) jsou obsaženy ve vektoru (deskripci vektorů pro homologovou rekombinaci popsal Thomas K.R. a Cepecchi M.R., Cell 51, str. 503, 1987; nebo rekombinaci Physcomitrella patens na cDNA bázi popsal Strepp a kol., Proč. Nati. Acad. Sci. USA 95(8), str. 4368 až 4373, 1998). Vektor se zavádí do mikroorganizmu nebo do rostlinné buňky (například prostřednictvím polyethylenglykolem zprostředkované DNA) a buňky, do kterých je PSE gen zaveden, podléhají homologové rekombinaci s endogenním PSE genem a jsou selektovány o sobě známými způsoby v oboru.

Podle jednoho provedení vynálezu se generuje rekombinantní organizmus, například mikroorganiuzmus rotlin, který obsahuje selektované systémy, které umožňují regulovat expresi zavedeného genu. Inkluze PSE genu do vektoru, když je uveden pod kontrolu lac-operonu, umožňuje například expresi PSE genu jen v přítomnosti IPTG. Tyto regulační systémy jsou v oboru známy.

Hostitelská buňka podle vynálezu, například prokaryotická nebo eukaryotická hostitelská buňka, rostoucí buď v kultivačním prostředí nebo na poli, se může použít pro produkci (to je expresi) PSE. V rostlinách alternativní způsob se může přídavně použít přímým transferováním DNA do vyvíjejících se kvě69 * ·· ·· 9 9 9 9 9 9 9 9

9 9 9 9« 9 ·*«· ••9 9 9 9 < · « • 9 999 ·< 9 * » •99 999 999 • 99 99 «9 9 ·· 999 9 tů elektroporací nebo ftgrobacberiem zprostředkovávaného genového přenosu. Vynález se proto také týká způsobu produkce PSE za použití hostitelských buněk podle vynálezu. Podle jednoho provedení zahrnuje způsob růst hostitelské buňky podle vynálezu (do které rekombinantní expresní vektor kódující PSE byl zaveden nebo do jejíhož genomu gen kódující divoký typ nebo modifikovaná PSE byly zavedeny) je vhodným prostředím, pokud se má produkovat PSE. Podle dalšího provedení zahrnuje způsob izolaci PSE ze prostředí nebo z hostitelské buňky.

jejich části. Výraz di. S výhodou se zvláště s výhodou houby nebo použ í va j í

Hostitelské buňky, které jsou v podstatě vhodné pro přijímání nukleové kyseliny podle vynálezu, nový genový produkt podle vynálezu nebo vektor podle vynálezu jsou vždy prokaryotické nebo eukaryotické organizmy. Hostitelské organizmy, kterých se s výhodou používá, jsou organizmy jako bakterie, houby, kvasinky, živočišné buňky nebo rostlinné buňky. Dalšími výhodnými organizmy jsou živočichové, s výhodou rostlíny nebo 'živočich v tomto případě nezahrnuje lihouby, kvasinky nebo rostliny, rostliny a především rostliny, jako jsou olejniny, které obsahují velké množství lipidových sloučenin, jako jsou řepka olejka, pupalka dvouletá, rostlina ricinového oleje, canola, podzemnice, lněné semínko, sója, světlice, slunečnice, brutnák lékařský, olejová palma, kokosová palma nebo rostliny, jako jsou kukuřice, pšenice, žito, oves, triticale, rýže, ječmen, bavlník, cassava, pepř, aksamitník, rostliny Solanaceae, jako jsou brambory, tabák, lilek a rajče, Vicia species, hrách, vojtěžka, keřovité rostliny (káva, kakao, čaj), Salix species, stromy (olejová palma, kokosová palma) a trvalé trávy a píce. Obzvláště výhodnými rostlinami pro účely vynálezu jsou sója, podzemnice, řepka olejka, canola, rošt ina ricinového oleje, lněné semínko, pupalka dvouletá, slunečnice, světlice a stromy (olejová palma a kokosová palma).

Obzvláště s výhodou se vynález týká rostlinných buněk, které obsahují polynukleotid podle vynálezu nebo vektor podle vynálezu. Přednost se dále dává transgenickým rostlinám nebo rostlinné tkáni, která obsahuje rostlinnou buňku podle vynálezu. Vynález se dále týká těch částí rostlin pro účely vynálezu, které se mohou sklízet a materiálu vhodného pro propagaci transgenních rostlin podle vynálezu, obsahujících buď rostlinné buňky podle vynálezu, které expresuji nukleovou kyselinu podle vynálezu nebo obsahujících buňky, které mají zvýšenou zvýšený obsah proteinu podle vynálezu. V zásadě se mohou sklízet všechny části rostlin, zvláště například květy, pyl, plody, semenáčky, kořeny, listy, semena, hlízy a stonky. Propagační materiál zahrnuje například semena, plody, semenáčky, hlízy, řízky a rhizomy.

D. Izolovaná PSE

Vynález se také týká izolovaných PSE a jejich biologicky aktivních částí. Izolovaný nebo “čištěný protein nebo jeho biologicky aktivní část je v podstatě prostý buněčného materiálu, pokud je produkován rekombinantními DNA způsoby, nebo je prostý prekurzorů nebo jiných chemikálií, pokud je syntetizován chemicky. Výraz v podstatě prostý buněčného materiálu zahrnuje PSE preparáty, ve kterých je protein oddělen od buněčných složek buněk, ve kterých se vyprodukoval přírodně nebo rekombinantně. Podle jednoho provedení vynálezu zahrnuje výraz v podstatě prostý buněčného materiálu PSE preparáty s méně než přibližně 30 % (vztaženo na suchou hmotnost) ne-PSE (označované zde také jako znečišťující protein) výhodněji méně než přibližně 20 % ne-PSE a ještě výhodněji méně než přibližně 10 % ne-PSE a zcela přednostně méně než přibližně 5 % ne-PSE. Jestliže se PSE nebo její biologicky aktivní část produkuje rekombinantní technologií, je také v podstatě prostá kultivačního prostředí, to znamená, že kultivační prostředdí je obsaženo v množství menším než přibližně 20 %, výhodněji menším • · · * · · · · · · · β · • · · · ·· · · φ « « • φφ · · * · · · • φ φ · φ φ φ ' · · φ • φφ · · · φφφ • ••ΦΦ · · · ··«··· než přibližně 10 % a ještě výhodněji ménším než přibližně 5 %, vztaženo na objem preparátu. Výraz v podstatě prostý prekurzorů a jiných chemikálií zahrnuje PSE preparáty, ve kterých je protein oddělen od chemických prekursorů nebo jiných chemikálií, kterých se používá při syntéze proteinu. Podle jednoho provedení vynálezu výraz v podstatě prostý prekurzorů a jiných chemikálií zahrnuje PSE preparáty, obsahující méně než přibližně 30 % (vztaženo na suchou hmotnost) chemických prekurzorů nebo ne-PSE chemikálii, výhodněji méně než přibližně 20 % chemických prekurzorů nebo ne-PSE chemikálií a ještě výhodněji méně než přibližně 10 % chemických prekurzorů nebo ne-PSE chemikálií, a zcela přednostně méně než přibližně 5 % chemických prekurzorů nebo ne-PSE chemikálií. Podle výhodného provedení izolované proteiny nebo jejich biologicky aktivní části neobsahují žádné znečišťující proteiny ze stejného organizmu, ze kterého PSE pochází. V případě proteinu podle vynálezu, který obsahuje sekvenci uvedenou v SEQ ID NO=10 nebo které jsou kódovány genem, který obsahuje SEQ ID NO=9, se počítá s tím, že sekvence startuje se dvěma Met. Při translaci odpovídající kódující sekvence nukleové kyseliny to může vést k expresi dvou derivátů proteinu podle vynálezu za startování s prvním nebo se druhým Met. Expresní míra mezi dvěma deriváty může kolísat mezi 0 a 1 v závislosti na typu exprese nebo hostitelského organizmu. Vynález zahrnuje PSE obsahující oba zmíněné deriváty, nebo pouze jeden z těchto derivátů. Oba deriváty mohou mít například odlišné aktivity, lokalizace, poločas a regulační mechanismy. Tyto proteiny se zpravidla produkují rekombinantní expresí, například PSE organizmů Physcomitřella, Phytophthora, Crypthecodinium nebo Thraustochytrium v rostlinách, jako je Physcomitřella patens, nebo ve shora uvedených rostlinách nebo v mikroorganizmech, jako jsou například bakterie jako E. coli, Bači 11us subtilis, C. glutamicum, v houbách, jako jsou Mortiérella, ve kvasinkách jako jsou Saccharomyces nebo v ciliátech, jako je Colpidium nebo v řascách, jako je Phaeodactylum.

• · ♦ · ♦ · • 99 • 9 9 · · *

9 9 9 9

9 9 9 9 9 • 9 9 9 9

999 99 99

99 • · 9 9 9

9 9

9 9 •· 999»

Isolované PSE podle vynálezu nebo jejich části se také mohou podílet na metabolismu požadovaných sloučenin pro syntézu buněčných membrán v organismech Physcomitřel 1a, Phytophthora, Crypthecodinium nebo Thraustochytrium nebo na transportu molekul těmito membránami. Podle výhodného provedení sahrnuje protein nebo jeho část aminokyselinovou sekvenci, která má dostatečnou homologii s aminokyselinovou sekvencí se souboru zahrnujícího SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO=6, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:10 a SEQ ID N0=12 pro protein nebo jeho část k udržení schopnosti podílet se na metabolismu sloučenin potřebných pro syntézu buněčných membrán v organismech Physcomitřel 1a, Phytophthora, Crypthecodinium nebo Thraustochytrium nebo na transportu molekul těmito membránami. Částí proteinu je s výhodou biologicky aktivní část zde popisovaná. Podle dalšího výhodného provedení vynálezu má PSE podle vynálezu jednu z aminokyselinových sekvencí se souboru zahrnujícího SEQ ID N0:2, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:6, SEQ ID N0:8, SEQ ID NO:10 _a SEQ ID NO:12. Podle dalšího výhodného provedení vynálezu má PSE aminokyselinovou sekvenci, která je zakódovaná nukleotidovou sekvencí, která hybridisuje s nukleotidovou sekvencí SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO=5, SEQ ID NO=7, SEQ ID NO:9 a SEQ ID NO:11, například za přísných podmínek. Podle ještě dalšího výhodného provedení vynálezu má PSE aminokyselinovou sekvenci, která je zakódovaná nukleotidovou sekvencí, která má alespoň přibližně 50% až 60%, s výhodou alespoň 60% až 70%, ještě výhodněji alespoň přibližně 70% až 80%, 80% až 90% nebo 90% až 95% a ještě výhodněji alespoň přibližně 96%, 97%, 98%, 99% nebo vyšší homologii s jednou z aminokyselinových sekvencí ze souboru zahrnujícího SEQ ID N0=2, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:6, SEQ ID N0:8, SEQ ID N0=10 _a SEQ ID NO:12. Výhodná PSE podle vynálezu obsahuje s výhodou také alespoň jednu ze zde popisovaných PSE aktivit. Například zahrnuje výhodná PSE podle vynálezu aminokyselinovou sekvenci kódovanou nukleotidovou sekvencí, která hybridizuje se nukleotidovou sekvencí ze souboru zahrnujícího SEQ ID NO=i, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO = 5, SEQ • * • ♦· · • · • · · ♦ ·· · 4» • · ♦ f · • · · · • ·· ·· ·· ·· • · · ♦ • · · ♦ · · · • · · • · · · · ·

ID NO:7, SEQ ID NO=9 a SEQ ID NO:11, například za přísných podmínek a která se může podílet se na metabollzmu sloučenin potřebných pro syntézu buněčných membrán v organizmech Physcomi třel la, Phytophthora, Crypthecodinium nebo Thraustochytri um nebo na transportu molekul těmito membránami a je schoopná elongovat jednu nebo několik polynenasycených mastných kyselin s alespoň dvěma dvojnými vazbami a řetězcem obsahujícím 16 nebo 18 atomy uhlíku.

Podle dalšího provedení vynálezu je PSE v podstatě homologová s aminokyselinovou sekvencí SEQ ID N0^:2, SEQ ID NO = 4, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:10 _a SEQ ID NO:12 a podržu je si funkční aktivity proteinu jedné ze sekvencí zahrnující SEQ ID N0:2, SEQ ID N0:4, SEQ ID N0:6, SEQ ID N0:8, SEQ ID NO:10 _a SEQ ID NO:12, jejíchž aminokyselinová sekvence se liší se zřetelem na přírodní variaci nebo mutagenézi, jak je shora podrobně popsáno v subsekci I. Podle dalšího provedení vynálezu je PSE proteinem, který obsahuje aminokyselinovou sekvenci, která má alespoň přibližně 50% až 60%, s výhodou alespoň přibližně 60% až 70%, ještě výhodněji alespoň přibližně 70% až 80%, 80% až 90% nebo 90% až 95% a ještě výhodněji alespoň přibližně 96%, 97%, 98%, 99% nebo vyšší homologii s kompletní aminokyselinovou sekvencí ze souboru zahrnujícího SEQ ID NO:2, SEQ ID NO=4, SEQ ID NO=6, SEQ ID NO=8, SEQ ID NO:10 _aSEQ ID NO:12 _a ná alespoň jednu ze zde popisovaných PSE aktivit. Podle dalšího provedení se vynález týká kompletního proteinu organizmu Physcomitřella, Phytophthora, Crypthecodinium nebo Thraustochytrium, který je v podstatě homologový s kompletní aminokyselinovou sekvencí SEQ ID N0=2, SEQ ID N0:4, SEQ ID N0=6, SEQ ID N0:8, SEQ ID N0=10 a SEQ ID N0=12.

Biologicky aktivní část PSE zahrnuje peptidy, které zahrnují aminokyselinovou sekvencí odvozenou od aminokyselinové sekvence PSE, například aminokyselinovou sekvenci ze souboru zahrnujícího SEQ ID N0:2, SEQ ID NOM, SEQ ID NQ:6, SEQ ID ·· ♦ ♦ 9 9 9 9 9 9 9

99 · · » ·· · • · 9 9 9 9 9 9 9

999 99 99 · ····

NO=8, SEQ ID NO:10 _a SEQ ID NO:12 nebo aminokyselinovou sekvenci proteinu, který je homologový se PSE, jehož peptidy mají méně aminokyselin než PSE plné délky nebo protein plné délky, který je homologový se PSE a mají alespoň jednu aktivitu PSE. Biologicky aktivní části (peptidy, například peptidy s délkou například 5, 10, 15, 20, 30, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 50, 100 nebo více aminokyselin) obsahuji zpravidla doménu nebo motiv s alespoň jednou aktivitou PSE. Kromě toho jiné biologicky aktivní části, ve kterých jsou jiné regiony proteinu deletovány, se mohou generovat rekombinantními technikami a studovat se zřetelem na jednu nebo na několik zde popisovaných aktivit. Biologicky aktivní části PSE s výhodou zahrnují jednu nebo několik vybraných domén/motivů nebo jejích částí s biologickou akt i vi tou.

Některé takové domény nebo motivy se mohou identifikovat sekvenční analýzou, například za použití způsobů využívajících počítače.

Zjistilo se, že sekvence podle vynálezu obsahují například KK motivy.

V literatuře (Kermode, Critical Reviews in Plant Science 15 (4), str. 285 až 423, 1996) jsou popsány KK motivy, podvojný lysin, který byl hlavně nalezen jako KKXX nebo K X K XXX motiv a který ovlivňuje recyklování z ER na aparatuře Golgi a tak dobu prodlevy proteinu a jeho enzymové aktivity v určitých lokacích, zvláště ER.

Podvojné lysinové motivy byly rovněž zjištěny například v 12-desaturázách (Arondel a kol., Science 258, str. 1353, 1992) a jsou také obsaženy v elongázách podle vynálezu. Byly popsány zvláště motivy, které se mohou lokalizovat na C-zakončení. V sekvencích podle vynálezu je výrazná akumulace lyzinů na C-zakončeních.

KQKGAKTE

KTKK.A

KKSTPAAKKTN

KHLK

Mechová elongáza PSE1 ' C-zakončení SEQ ID NO-2:

SEQ ID NO:4:

SEQ ID NO:6^:

Jsou možné genové variace.

Existují Lys radikály, které ovlivňují cílení, adresování a lokalizaci na nebo v ER. Maskování této sekvence, modifikace nebo prostorová modifikace v sousedství konce nebo C-zakončeni například fúzí se GFP zeleným fluorescenčním proteinem se může využít k ovlivnění kompartmentaližace.

PSE se s výhodou produkují rekombinantními DNA způsoby. Například se molekula nukleové kyseliny, kódující protein, klónuje do expresního vektoru (jak shora popsáno), expresní vektor se zavádí do hostitelské buňky (jak shora popsáno) a PSE se expresuje v hostitelské buňce. PSE se pak může izolovat z buněk vhodným způsobem čištění za použití o sobě známých způsobů čištění proteinu. Nebo se pro rekombinantní expresi PSE, PSE polypeptid nebo PSE peptid může syntetizovat chemicky o sobě známými způsoby peptidové syntézy. Nativní PSE se může isolovat z buněk (například z endotelových buněk) například za použití anti-PSe protilátky shromáždit o sobě známými způsoby za použití PSE podle vynálezu nebo jeho framentu.

Vynález se také týká chimérních PSE proteinů nebo PSE fúzních proteinů. Zde používaný výraz chimérní PSE protein“ nebo PSE fúzní protein“ zahrnuje PSE polypeptid, který je funkčně vázán na ne-PSE polypeptid. PSE polypeptidem se míní polypeptid s aminokyselinovou sekvencí, která odpovídá PSE, zatímco ne-PSE polypeptidem“ se míní polypeptid s aminokyselinovou sekvencí, která odpovídá proteinu, který je v podstatě nehoeologový se PSE, například proteinu, který se liší od PSE a který pochází z téhož nebo z jiného organizmu. V souvislosti ♦ · 9999 •9 99 ► * · I

9 9 9 •9 9999 s fúzním proteinem se výrazem funkčně vázaný míní, že PSE polypeptid a ne-PSE polypeptid navzájem fúzují tak, že obě sekence splňují předem stanovenou funkci, která není připisována použité sekvenci. Ne-PSE polypeptid může fúzovat na N-zakončení nebo na C-zakončeni PSE polypeptidu. Podle jednoho provedení vynálezu je fúzním proteinem například GST-PSE fúzní protein, ve kterém je PSE sekvence fúzována na C-zakončení GST sekvence. Fúzní proteiny mohou usnadňovat čištění rekombinantních PSE. Podle dalšího provedení vynálezu je fúzním proteinem PSE, která má heterologovou signální sekvenci na svém N-zakončení. V určitých hostitelských buňkách (například v savčích hostitelských buňkách) se může exprese a/nebo sekrece PSE zvyšovat použitím heterologové signální sekvence.

Chimérní PSE protein nebo PSE fúzní protein podle vynálezu se produkuje o sobě známými rekombinantními DNA technikami. Například DNA fragmenty, které kódují různé polypeptidové sekvence, se 1igují navzájem ve správném čtecím rámci za použití běžných technik, například za použití zarovnaného konce nebo kohézního konce pro ligaci, restrikci enzymového štěpení pro vytvoření stabilních konců, naplnění kohézních konců jak požaduje ošetřování alkalickou fosfatázou k předcházení nežádoucích vazeb a enzymatické ligace. Podle dalšího provedení vynálezu se může fúzní gen syntetizovat o sobě známými zůsoby včetně použití DNA syntetizérů. Nebo se může provádět PCR zesílení genových fragmentů za použití kotvicích primerů, které generují komplementární převisy mezi postupnými genovými fragmenty, které se následleně mohou hybridizovat a zesilovat za zvýšení chimérní genové sekvence (například Current Protocols in Molecular Biology, vyd. Ausubel a kol., John Wiley & Sons, 1992). Velký počet expresních vektorů, které již kódují fúzní jednotku (například GST polypeptid), je obchodně dostupný. PSE kódující nukleová kyselina se může klónovat do takových expresních vektorů, takže se fúzní jednotka váže ve správném čtecím rámci na PSE protein.

PSE homology se mohou generovat mutagenezí například specifickým bodem mutace nebo odříznutím PSE. Zde používaný výraz Homology se týká odlišné formy PSE, která působí jako agonist nebo jako antagonist PSE aktivity. PSE agonist si může v podstatě uchovávat stejnou aktivitu, jako má PSE nebo něco z jejích biologických aktivit. PSE antagonist může inhibovat jednu nebo několik aktivit přírodně se vyskytující PSE formy, například konkurenční vázání na element proti směru nebo po směru metabolické kaskády pro složky buněčné membrány, které zahrnují PSE nebo vázáním na PSE, která zprostředkovává transport sloučenin buněčnými membránami a tak brání translokaci.

Podle jiného provedení vynálezu PSE homology se mohou identifikovat skríningem kombinatorní knihovny mutantů, například seříznutých mutantů, PSE se zřetelem na PSE agonistovou nebo PSE antagonistovou aktivitu. Podle jednoho provedení vynálezu zpestřená knihovna PSE variant se generuje na úrovni nukleové kyseliny kombinatorní mutagenezí a kóduje se zpestřenou genetickou knihovnou. Zpestřená genetická knihovna PSE variant se může generovat například enzymativkou ligací směsi syntetických oligonukleotidů do genových sekvencí takže degenerátový soubor potenciálních PSE sekvencí se může expresovat jakožto individuální polypeptidy nebo jako soubor větších fúzní ch proteinů (například pro fágový displej), který obsahuje tento soubor PSE sekvencí. Existují četné způsoby, kberých je možno použít pro generaci knihoven potenciálních PSE homologů z degenerované oligonukleotidové sekvence. Chemická syntéza degenerované genové sekvence se může provádět za použití syntetizéru DNA a syntetický gen se tak může ligovat do vhodného expresního vektoru. Použití degenerovaného souboru genů umožňuje, aby byly všechny sekvence, které kóduje žádaný soubor potenciálních PSE sekvencí ve formě směsi. Způsoby syntézy degenerovaných oligonukleotidů jsou v oboru známy (například Narang S.A., Tetrahedron 39(3), 1983; Itakura a kol., Annu. Rev. Biochem. 53, str, 323, 1984); Itakura a kol., Science 198, str ·♦ ··· ··» • · ·· · ···*«*

1056, 1984: Ike a kol., Hucleic Acids Res. 11, str. 477, 1983).

Knihoven PSE fragmentů se může použít pro zpestřenou populaci PSE fragmentů pro skríning a pro následnou selekci homo logů PSE. Podle jednoho provedení vynálezu knihovna fragmentů kódujících sekvence se může generovat zpracováním dvoušřoubovicového PCR fragmentu kódujícího PSE sekvenci nukleázou za podmínek, při kterých dochází pouze přibližně k jednomu lomu dvouřetězce na molekulu, k denaturací dvouřetězcové DNA, k renaturaci DNA vytvořením dvouřetězcové DNA, která zahrnuje páry se smyslem a antismyslem různých produktů s dvouřetězcovým lomem, odstranění jednořetězcových sekcí z nově vytvořených duplicit zpracováním SI nukleázou a ligaci rezultující fragraentové knihovny do expresního vektoru. Tento způsob umožňuje odvozovat expresní knihovnu, která kóduje N-koncové, C-koncové a interní fragmenty různě velkých PSE.

Byly vyvinuty četné způsoby pro skrínován! genových produktů v kombinatorních knihovnách, které se generovaly bodovou mutací nebo transdukcí a pro skríning cDNA knihoven pro genové produkty se selektovanými vlastnostmi. Tyto způsoby se mohou přizpůsobit pro rychlý skríning genetických knihoven, které se generovaly kombi natorní mutagenezí PSE homologů. Nej častější způsob skrínování velkých genetických knihoven, které se mohou podrobovat vysoce výkonné analýze zpravidla zahrnuje klonování genetických knihoven do replikováteIných expresních vektorů, transformování vhodných buněk rezultující vektorovou knihovnou, a expresi kombinatorních genů za podmínek, při které detekci žádané aktivity usnadňuje izolaci vektoru kódujícího gen, jehož produkt se má stanovovat. Rekurzivní souborová mutagenéze (REM), nový způsob zvyšování frekvence funkčních mutantů v knihovnách, se může použít v kombinaci se skrinovacími zkouškami pro identifikaci PSE homologů (Arkin a Yourvan, Proč. Nati. Acad. Sci. USA 89, str. 7811 až 7815, 1992; Delgrave a kol., Protein Engineering 6(3), str. 327 až 331,

- 79 • 4 444444 44 ># ·· ·· 4 4444 • 4 4 4 4 4 4 4 • 4 4 4 4 4 444 4

444 444 ··· 44 4 444444

1993). Kombinace shora uvedených způsobů se s výhodou také může používat.

Další známý způsob modifikace katalytických vlastností enzymů nebo genů je kódujících je genové přeskupení (gen shuffling) (například světový patentový spis číslo WO 97/ 20078 nebo WO 98/13487), které je kombinací genových fragmentů, přičemž tyto nové kombinace mohou být přídavně obměňovány chybnými polymerázovým i řetězovými reakcemi za vytvoření vysoké sekvenční rozmanitosti, která se zkouší. Avšak předpožadavek pro použití takového přístupu je vhodný skrinovaci systém pro testování získané genové rozmanitosti se zřetelem na funkci onal i tu.

Skrinovaci způsob, který identifikuje na PUFA závislou enzymovou aktivitu nebo aktivity je předpožadavkem zvláště pro skríning elongázových aktivit. Se zřetelem na elongázové aktivity se spécificitou pro PUFA se může využít toxicita arašidonové kyseliny v přítomnosti toxického metabolitu (v tomto případě salicylové kyseliny nebo derivátů salicylové kyseliny) ve species ttucor, která se může transformovat žádanými genovými konstrukty o sobě známými transformačními způsoby (Eroshin a kol., Mikrobíologia, svazek 65, číslo 1, str, 31 až 36, 1996) pro provádění na růstu založeného primárního skríningu. Rezultující klony se mohou analyzovat na své lipidové složky způsobem plynové chromatografie a hmotové spektroskopie za účelem identifikace povahy a kvality výchozích látek a produktů.

Podle dalšího provedení vynálezu zkoušky založené na buňkách se mohou využit pro analýzu zpestřené PSE knihovny za použití dalších způsobů v oboru o sobě známých.

Vynález se dále týká protilátky, která se specificky váže na polypeptid podle vynálezu nebo na jeho část, například • 99 9» 0999 99 9*

9999 99 9 9 » 9 9 • 99 999 999 ••999 99 9 ·*··«· epitopy takového proteinu. Protilátka podle vynálezu se může izolaci jiných elongáz, zvláště monoklonálními protilátkami, syntetickými protilátkami a jako jsou například Fab, Fv protilátky se mohou připravyužívat k identifikaci a k PSE. Tyto protilátky mohou být polyklonálními protilátkami nebo také fragmenty těchto protilátek, nebo scFV fragmenty. Monoklonální vovat například způsoby, které popsal Kohler a Milstein (NatuEnzymol. 73, 1981).

také připravovat na& Lané (Antibodies, Spring Harbor, 1988).

re 256, str. 485, 1975) a Galfro (Meth.

Protilátky a jejich fragmenty se mohou příklad způsobem, který popsal Harlow a Laboratory Manual, CSH Press, CoId

Tyto protilátky se mohou používat ke srážení a k lokalizaci, například proteiny podle vynálezu, nebo k monitorování syntézy těchto proteinů, například rekombinantní organizmy, a k identifikaci sloučenin, které navzájem působí s proteiny podle vynálezu. V mnoha případech je vázání protilátek na antigeny ekvivalentní vázání na jiné ligandy a antiligandy.

Vynález se dále týká způsobu pro identifikaci agonistu nebo antagonistu elongáz, zvláště PSE, při které

a) uvádějí se do styku buňky, které expresu)í polypeptid podle vynálezu, s kandidátskou substancí,

b) testuje se PSE aktivita,

c) porovnává se PSE aktivita se standardní aktivitou v nepřítomnosti kandidátské substance, přičemž PSE aktivita, která je vyšší než standard, naznačuje, že kandidátská substance je agonistem a přičemž PSE aktivita, která je nižší než standard, naznačuje, že kandidátská substance je antagonistem.

Kandidátskou substancí se míní substance, která se chemicky syntetizuje nebo se produkuje mikrobiologicky a je obsa81

4 44	4 4	444»	• 4	«4
• 4 4 *	4	• 4	4 4	• 4
• ··	4	• 4	4 4	•
				4
• · ·	4	4 4	• 4	4
• 44 «4	• 4	4	• ·	4444

žena například v buněčných extraktech například rostlin, živočichů nebo mikroorganismů. Taková substance může být ze stavu techniky známá, avšak dosud o ní nebylo známo, že zvyšuje nebo potlačuje aktivitu PSE. Reakčni směsí mohou být buněk prosté extrakty nebo mohou obsahovat buňku nebo buněčnou kulturu. Vhodné způsoby jsou pracovníkům v oboru známy a obecně jsou popsány (například Alberts, Molecular Biology of the cell, 3. vydání 1994, například kapitola 17). Substance se mohou přidávat například do reakčni směsi nebo do kultivačního prostředí nebo se mohou injektovat do buněk nebo nastřlkávat na rostlinu.

Pokud vzorek, který obsahuje substanci aktivní při způsobu podle vynálezu, se identifikuje, je možné buď substancí přímo z originálního vzorku izolovat nebo rozdělit vzorek na různé skupiny, například pokud sestává z velkého počtu různých složek, ke snížení počtu různých substancí ve vzorku a potom opakovat způsob podle vynálezu s takovým podvzorkem původního vzorku. V závislosti na komplexitě vzorku se popsané stupně mohou opakovat několikrát, s výhodou pokud se vzorek identifikuje způsobem podle vynálezu a obsahuje pouze malý počet substancí nebo pouze jedinou substanci. Substance, identifikovaná způsobem podle vynálezu nebo její derivát, se s výhodou formuluje dále, aby byla vhodná pro použití při pěstování rostlin nebo rostlinných buněk nebo tkáňové kultury.

Jakožto substance, které se mohou identifikovat a testovat způsobem podle vynálezu, se uvádějí například: expresní knihovny například cDNA expresní knihovny, peptidy, proteiny nukleové kyseliny, protilátky, malé organické substance, hormony, PNA (Milner, Nátuře Medicín 1, str. 879 až 880, 1995: Hupp, Cell. 83, str. 237 až 245, 1995: Gibbs, Cell. 79, str. 193 až 198, 1994: a připojená literatura). Tyto substance mohou být také funkčními deriváty nebo analogy známých inhibitorů nebo aktivátorů. Způsoby pro přípravu chemických derivátů «< »»·· • 9 »· *« 9 · 9 9 · 4 · · · • 90 9 9 9 9 W « • 99 4 9* · · i • «•99 »9 9 90994· nebo analogů jsou pracovníkům v oboru známy. Známé deriváty a analogy se mohou testovat způsoby známými ze stavu techniky. Je dále možné používat konstrukce za použití počítače nebo peptidomimetik pro přípravu vhodných derivátů a analogů. Používané buňky nebo tkáně pro zůsob nebo pro způsoby podle vynálezu jsou s výhodou hostitelské buňky, rostlinné buňky nebo rostlinné tkáně podle vynálezu shora popsané.

Vynález se také týká substance, která se identifikuje způsobem podle vynálezu pro účely vynálezu. Substancí je například homolog PSE podle vynálezu. Homology PSE se mohou generovat mutagenezí například bodovou mutagenezí, například bodobou mutací nebo delecí PSE. Výrazem homolog se v tomto případě míní variantová forma PSE, která působí jako agonist nebo jako antagonist na PSE aktivitu. Agonist může mít v postatě stejnou nebo částečnou biologickou aktivitu jako PSE. Antagonist PSE může inhibovat jednu nebo několik aktivit přírodně se vyskytujících forem PSE, například vázat konkurenčně člena ve směru nebo proti směru metabolické cesty syntézy mastné kyseliny včetně PSE, nebo vázat se na PSE a snižovat nebo inhibovat aktivitu při procesu.

Vynález se také týká protilátky nebo jejího fragmentu, zde popsaného, který inhibuje aktivitu PSE podle vynálezu.

Vynález se také týká protilátky, která specificky rozpoznává nebo se váže na shora uvedený agonist nebo antagonist podle vynálezu.

Vynález se také týká kompozice, která obsahuje protilátku, stop nebo anti smyslovou molekulu identifikovanou způsobem podle vynálezu.

- 83 • · · fc

E. Použití procesů/způsobů podle vynálezu

Molekuly nukleové kyseliny, proteiny, proteinové homology, fúzní proteiny, protilátky, primery, vektory a hostitelské buňky zde popsané se mohou používat v jednom nebo v několika dále uvedených způsobů: identifikace organizmu Physcomitre11a patens, Crypthecodinium, Phytophthora infestans nebo Thraustochytrium a příbuzných organizmů, genomové napování organizmů, které se týká organizmů Physcomitřella patens, Crypthecodinium, Phytophthora infestans nebo Thraustochytrium, identifikace a lokalizace sekvencí organizmů Physcomitřella patens, Crypthecodinium, Phytophthora infestans nebo Thraustochytrium, které jsou předmětem zájmu, evoluční studie, stanovení PSE proteinových regionů potřebným pro funkci, modulace PSe aktivity, modulace metabolizmu jedné nebo několika složek buněčné membránový, modulace transmembránového transportu jedné nebo několika sloučenin a modulace buněčné produkce žádané sloučeniny, například jemné chemikálie. PSE molekuly nukleové kyseliny podle vynálezu mají četná použiti. Především se mohou použít pro identifikaci organizmu jako jsou Physcomitre11 a, Crypthecodinium, Phytophthora nebo Thraustochytrium a těsně příbuzných organizmů. Mohou se také použít pro identifikaci přítomnosti organizmů Physcomitřella, Crypthecodinium, phthora nebo Thraustochytrium nebo směsné populaci mikroorganizmů. Vynález se týká sekvencí nukleové kyseliny genů Physcomi třel 1a, Crypthecodinium, Phytophthora nebo Thraustochytrium: přítomnost nebo nepřítomnost těchto organizmů se může stanovit skrínováním extrahované genomové DNA kultury uniformní nebo smíšené populace mikroorganizmů za přísných podmínek se sondou pokrývající region genu Physcomitřella, Crypthecodinium, Phytophthora nebo Thraustochytr i um, který je jedinečný pro tento organizmus nebo část tohoto genu. Organizmy Physcomitřel 1a, Crypthecodinium, Phytophthora nebo Thraustochytrium se používají pro provozní výrobu polynenasycených kyselin. Nukleové kyseliny podle vynálezu

Phytopříbuzných organizmů ve zvláště jsou vhodné pro výrobu PUFA také v jiných organizmech, pokud je záměren rezultující PUFA začlenit do triacylglycerolové frakce,

Molekuly nukleové kyseliny a proteinu podle vynálezu mohou působit jako signální znaky pro specifické regiony genomu. Jsou vhodné nejen pro mapování genomu avšak také pro funkční studie proteinů organizmů Physcomitřel 1a, Crypthecodinium, Phytophthora nebo Thraustochytrium, Pro identifikaci genomového regionu, do kterého určitý DNA vázající protein genomu organizmů Physcomitre11a, Crypthecodinium, Phytophthora nebo Thraustochytrium se může například fragmentovat a fragmenty se mohou inkubovat s DNA vázajícím proteinem. Fragemnty, vázající protein, se mohou přídavně skrínovat s molekulami nukleové kyseliny podle vynálezu, s výhodou se snadno zjistitelnými signální znaky: vázání takové molekuly nukleové kyseliny na genomový fragment umožňuje lokalizaci fragmentu na genomové mapě organizmů Physcomi třel 1a, Crypthecodinium, Phytophthora nebo Thraustochytrium a pokud se to provádí opakovaně s různými enzymy, usnadňuje rychlé stanovení sekvence nukleové kyseliny, na kterou se protein váže. Molekuly nukleové kyseliny podle vynálezu mají dostatečnou homologii se sekvencemi příbuzných species pro tyto molekuly nukleové kyseliny, takže mohou působit jako signální znaky pro konstrukci genomové mapy houb a řas.

Molekuly PSE nukleové kyseliny podle vynálezu jsou také vhodné pro evoluční studie proteinové struktury. Metabolické a transpirtní procesy, ve kterých jsou molekuly podle vynálezu zahrnutým se využívají pro velké množství prokaryotických a eukaryotických buněk; evoluční stupeň vztahu organizmů se může stanovit porovnáním sekvencí molekul nukleové kyseliny podle vynálezu s molekulami, které kódují podobné enzymy z jiných organizmů. Takové porovnání umožňuje stanovit, ktreré ze sekvenčních regionů jsou konzervovány a které nejsou konzervovány, což může pomáhat, při stanovování regionů proteinu, který jsou podstatné pro enzymovou funkci. Tento typ stanovení je užitečný pro proteinové inženýrské studie a může poskytovat klíč, jak velká mutageneze proteinu je přijatelná bez ztráty jeho funkce.

Manipulace molekul nukleové kyseliny podle vynálezu může vést k produkci PSE s funkčními odlišnostmi od divokého typu PSE. Účinnost nebo aktivita těchto proteinů se může zlepšit; mohou být obsaženy v buňce ve větším množství, než je obvyklé; nebo se jejich účinnost a aktivita může zmenšit. Zlepšení účinnosti nebo aktivity znamená například, že enzym má vyšší selektivitu a/nebo aktivitu, s výhodou aktivitu, která je alespoň o 10 % vyšší, s výhodou alespoň o 20 % vyšší, a ještě výhodněji alespoň o 30 % vyšší, než je aktivita původního enzymu.

Je řada mechanizmů, kterými modifikace PSE podle vynálezu, obsahující takový modifikovaný protein, může přímo ovlivňovat výtěžek, produkci a/nebo produkční účinnosti jemných chemikálií. Získání jemných chemikálií z kultur ciliates, řas nebo hub v provozním měřítku se výrazně zlepší, když buňky sekretují žádané sloučeniny, jelikož se tyto sloučeniny snadněji izolují z kultivačního prostředí (na rozdíl od extrakce z biomas kultivovaným buněk). Čištění se tedy může zlepšit, jestliže buňky ukládají sloučeniny in vivo ve specializovaných prostorách s typem koncentračního mechanizmu. V rostlinách, které expresují PSE, může vést zvýšený transport k lepšímu rozdělení v rostlinné tkáni a v rostlinných orgánech. Zvýšení počtu nebo aktivity transportujících molekul, které exportují jemné chemikálie z buňky, může umožnit zvýšení množství produkované jemné chemikálie, která je obsažena v extracelulárním prostředí, čímž se usnadňuje sklízení a čištění, nebo v případě rostlin účinnější distribuce. Na rozdíl od toho jsou žádoucí zvýšená množství kofaktorů, prekursorových molekul a mezi• ·* ·

produktů pro vhodné biosyntézní cesty pro účinnou nadprodukci jedné nebo několika jemných chemikálií. Zvýšení počtu a/nebo aktivity transportních proteinů, zahrnutých v dodávání živin, jako jsou zdroje uhlíku (to je cukrů), zdroje dusíku (to jsou aminokyseliny, amoniové soli), fosfátu a síry, může zlepšit produkci jemných chemikálií v důsledku eliminace všech omezení živin dostupných v biosyntézních procesech. Mastné kyseliny jako PUFA a lipidy, obsahující PUFA, jsou samotné žádoucí jemné chamikálie. Optimalizace aktivity nebo zvýšení počtu jedné nebo několika PSE podle vynálezu, zahrnutých v biosyntéze těchto sloučenin, nebo narušení aktivity jedné nebo několika PSE podle vynálezu, zahrnutých v odbourání těchto sloučenin, může tak zvyšovat výtěžek, produkci a/nebo podukční účinnost molekul mastných kyselin a lipidů v organizmech, jako jsou ciliates, řasy, rostliny, houby, kvasinky nebo mikroorganizmy.

Manipulace jednoho nebo několika PSE genů podle vynálezu může vést podobně k PSE s modifikovanými aktivitami, které nepřímo ovlivňují produkci jedné nebo několika žádaných jemných chemikálií z organizmů, jako jsou řasy, rostliny, ciliates nebo houby. Normální biochemické metbolické procesy vedou například k produkci četných odpadních produktů (například peroxid vodíku a jiné reaktivní kyslikaté sloučeniny), které mohou aktivně narušit tyto metabolické procesy (například peroxynitrit, jak známo, nitrátuje tyrozinové postranní řetězce, tak inaktivuje některé enzymy s tyrosinem v aktivním centru; Groves J.T., Curr. Opin, Chem. Biol. 3(2), str. 226 až 235, 1999). Jakkoliv se tyto odpadní produkty normálně exkretují, používané buňky pro fermentační produkci v provozním měřítku se optimalizují pro nadprodukci jedné nebo několika jemných chemikálií a může se tak produkovat více odpadních produktů, než je běžné v případě buněk divokého typu. Optimlizace aktivity jedné nebo několika PSE podle vynálezu, která se podílí na exportu odpadních molekul, umožňuje zlepšení životnosti buňky a udržení její účinné matabolické aktivity. Také obsah

·· ·· • · · * • · · « · · • · · · · · vysokého intracelulárního množství žádané jemné chemikálie může být ve skutečnosti pro buňku toxický, takže se životnost buňky může zlepšit zvýšením schopnosti buňky sektretovat takové sloučeniny.

PSE podle vynálezu se může manipulovat takovým způsobem, že se modifikují relativní množství různých molekul lipidu a mastné kyseliny. To může mít rozhodující vliv na složení lipidu bunčné membrány. Jelikož takový typ lipidu má různé fyzikální vlastnosti, modifikace lipidového složení membrány může výrazně modifikovat membránovou fluiditu. Změny membránové fluidity mohou ovlivňovat transport molekul membránou, jak shora vysvětleno, mohou ovlivňovat export odpadních produktů nebo produkovaných jemných chemikálií nebo import potřebných živin. Tyto změny fluidity membrány mohou také mít rozhodující vliv na integritu buňky; buňky se srovnatelně slabšími membránami jsou citlivější na abiotické a biotické stresové podmínky, které mohou poškozovat nebo usmrcovat buňku. Manipulace PSE, které se podílejí na produkci mastných kyselin a lipidů pro syntézu membrán, takže produkované membrány mají membránové složení, které je citlivější na okolní podmínky, převažující v kulturách používaných pro produkci jemných chemikálií, má umožňovat většímu počtu buněk přežívat a množit se. Velká množství produkujících buněk se sama o sobě projevují vyššími výtěžky, vyšší produkcí a vyšší produkční účinností jemných chemikálií z kutury.

Shora zmíněné mutagenézní strategie pro PSE záměrné pro zvýšení výtěžku jemných chemikálií nejsou konstruovány jako omezení; variace těchto strategií jsou pracovníkům v oboru známy. Za využití těchto mechanizmů a za použití zde popisovaných mechanizmů molekuly nukleové kyseliny a proteinu podle vynálezu se mohou používat pro generaci řas, ciliates, rostlin, živočichů, hub a jiných mikroorganizmů, jako je C. glutamicum, které expresují mutované PSE molekuly nukleové kyseliny

a proteinu, takže se výtěžk, produkce a/nebo podukční účinnost žádaných sloučenin zlepšuje. Touto žádanou sloučeninou může být jakýkoliv přírodní produkt z organizmů, jako jsou řasy, ciliates, rostliny, živočichové, houby nebo bakterie, které zahrnují konečné rodukty biosyntézní cesty a meziprodukty přírodně probíhající metabolické cesty, a také molekuly, které se přirozeně nevyskytují v metaboliznu těchto buněk, avšak jsou produkovány buňkami podle vynálezu.

Dalším provedením vynálezu je způsob produkce PUFA, při kterém se kultivuje organizmus obsahující nukleovou kyselinu podle vynálezu, genový konstrukt podle vynálezu nebo vektor podle vynálezu, který kóduje polypeptid, který elonguje mastné kyseliny se 16, s 18 nebo se 20 atomy uhlíku, obsahující alespoň dvě dvojné vazby ve sketelu molekuly mastné kyseliny o alespoň dva atomy uhlíku za podmínek, při kterých se PUFA produkují v organizmu. PUFA, produkované tímto způsobem, se izolují sklízením organizmů bud' z kultivačního prostředí, ve kterém rostly nebo z pole a rozrušením a/nebo extrakcí ski izeného materiálu organickým rozpouštědlem. Olej, který obsahuje lipidy, fosfolipidy, sphingolipidy, glykolipidy, triacylglyceroly a/nebo volné mastné kyseliny s vyšším obsahem PUFA, se může ízolovat z takového rozpouštědla. Volné mastné kyseliny s vyšším obsahem PUFA se mohou izolovat zásaditou nebo kyselou hydrolýzou lipidů, fosfolipidů, sphingolipidů, glykolipidů, triacylglycerolů. Vyšším obsahem PUFA se míní obsah alespoň o 5%, s výhodou alespoň o 10 %, ještě výhodněji alespoň o 20 % a zvláště výhodně alespoň o 40 % než v případě původních organizmů, které neobsahují zakódovanou přídavnou nukleovou kyselinu kódující elongázovou aktivitu podle vynálezu.

PUFA, produkované tímto způsobem, jsou s výhodou molekuly mastné kyseliny mající 18, 20 nebo 22 atomů uhlíku a alespoň dvě dvojné vazby v molekule mastné kyseliny, s výhodou tři, čtyři pět nebo šest dvojných vazeb, především tři nebo pět • · · • « φφ·· dvojných vazeb. Tyto molekuly mastné kyseliny se 16, s 20 nebo se 22 atomy uhlíku se mohou izolovat z organizmů ve formě oleje, lipidu nebo volné mastné kyseliny. Příklady vhodných organizů jsou shora uvedeny. Výhodnými organizmy jsou mikroorganizmy, živočichové nebo rostliny, zvláště s výhodou rostliny nebo řasy, především transgenické rostliny.

Jedním provedením vynálezu jsou oleje, lipidy, mastné kyseliny nebo jejich frakce, které se získaly shora uvedeným způsobem, zvláště s výhodou kompozice oleje, lipidu nebo mastné kyseliny obsahující PUFA a pocházející 2 transgenických rostlin.

Jedním provedením vynálezu jsou oleje, lipidy, mastné kyseliny nebo jejich frakce, které se získaly způsobem podle vynálezu. Jiným provedením vynálezu jsou kompozice oleje, lipidu nebo mastné kyseliny obsahující PUFA, produkované způsobem podle vynálezu a odvozené z transgenických rostlin, které obsahují nukleovou kyselinu, genový konstrukt nebo vektor podle vynálezu.

Dalším provedením vynálezu je použití kompozic oleje, lipidu, mastné kyseliny v krmivěch, v potravinách, v kosmetických nebo ve farmaceutických prostředcích.

Dalším provedením vynálezu je kit obsahující nukleovou kyselinu podle vynálezu, genový konstrukt podle vynálezu, aminokyselinovou sekvenci podle vynálezu, antismyslovou molekuly nukleové kyseliny podle vynálezu, antilátku a/nebo kompozici podle vynálezu, antagonist nebo agoníst připravený způsobem podle vynálezu a/nebo oleje, lipidy a/nebo mastné kyseliny podle vynálezu nebo jejich frakce. Kit může také obsahovat hostitelské buňky, organizmy nebo rostliny podle vynálezu nebo jejich části, části rostlin podle vynálezu, které se mohou sklízet nebo propagační materiál nebo jiný antagonist nebo ·* ·· • » · · • · · • · · * • · · ·« ···· ·· ·· » · · · ♦» · » t · « · · • · · · agonist podle vynálezu. Složky kitu podle vynálezu se mohou ukládat do vhodných obalů například spolu s pufrem nebo v pufru nebo v jiných rozpouštědlech. Jedna nebo několik shora zmíněných složek se může balit do jednoho a téhož obalu. Přídavně nebo alternativně jedna nebo několik zmíněných složek se například může absorbovat na pevném povrchu, například na nitrocelulózovém filtru, na skleněné destičce, na štěpinách, na nylonových membránách nebo na mikrotitračních destičkách. Kitu se může používat pro kterýkoliv shora popsaný způsob a shora popsané provedení, například pro produkci host i telkých buněk, transgenických rostlin, pro detekci homologových sekvencí, pro identifikaci antagonistů a agonistů. Kit může obsahovat instrukce ke svému použití v případě shora uvedených účelů.

Následující příklady praktického provedení vynález podrobně objasňují, nijak však neomezují. Vynález objasňují také připojené obrázky.

Seznam obrázků na výkresech

Obr. 1 Seřazení kvasinkového elolpeptidu (horní řádek) s Physcomitřella patens PpPSEl

Obr.	2a	až 2e GC analýza	FAME
Obr.	3a	DMOX derivát cis	6,9,13 lg:3
Obr.	3b	Hmotové spektrum	DMOX derivátu cis	6,9,13 ig:3
Obr.	4a	DMOX derivát cis	s , i i, 14 20:3
Obr.	4b	Hmotové spektrum	DMOX derivátu cis	S,íl,14 20:3

Obr. 5 Výsledek porovnání peptidové sekvence Pp_PSEl

Φ · · · · · » · · » · ·

«φ • « • · s nalezenou sekvencí

Obr. 6 Seřazení peptidové sekvence Pp_PSEl s nalezenou sekvencí

Obr. 7 souboru sekvencí virtuálně úplného elongázového polypept i du

Obr. 8

Obr. 9

Obr. 10

Seřazení polypeptidové sekvence PpPSEl a Tc_PSE2

Porovnání polypeptidové sekvence CC_PSE1 s Tc_PSE2

Sekvenční motivy

Příklady provedení vynálezu

Příklad 1

Obecné způsoby

a) Obecný způsob klonování

Provádějí se způsoby klonování, jako například restrikční štěpení, elektroforéza agarového gelu, čištění fragmentů DNA, převod nukleových kyselin na nitrocelulózové a nylonové membrány, vazba fragmentů DNA, transformace Escherichía coli a kvasnicových buněk, pěstování bakterií a sekvenční analýza rekombinantních DNA, podle návodů popsaných v literatuře (Sambrook a kol.. Cold Spring Harbor Laboratory Press:ISBN 0-87969-309-6, 1989; Kaiser, Michael is a Mitchell Methods of Yeast

Genetics, Cold Spring Harbor Laboratory Press: ISBN 0-87969-451-3, 1994). Transformace a pěstování řas, jako je Chlorella nebo Phaeodactylum se provádějí rovněž způsobem popsaným v literatuře (El-Shekh: Biologia Plantarum 42, str. 209 až 216, 1999; Apt a kol., Molecular and General Genetics 252 (5), str.

9 9 · 9 9 9 99 • 9 · · 9 9 · ··♦♦ • 99 9 · * * · - *

999 <99 999 •999· 99 9 9·····

872 až 879, 1996.

b) Chemikálie

Pokud není v textu uvedeno jinak, používá se chemikálií dostupných v analytické kvalitě od firem Fluka (Neu-Ulm), Merck (Darmstadt), Roth (Karlsruhe), Serva (Heidelberg) a Sigma (Deisenhofen). Roztoky se připravují za použití čisté vody prosté pyrogenů, označované v dalším textu jako voda (HaO) (obchodní produkt Milí i-Q vater systém vater purification unit společnosti Millípore, Eschborn). Restrikční endonukleásy, DNA-modífikující enzymy a kity molecular biology kits jsou obchodní produkty společnosti AGS (Heidelberg), Amersham (Brunswick), Biometra (Góttingen), Boehringer (Mannheim), Genomed (Bad Oeynhausen), New England Biolabs (Schwalbach/Taunus), Novagen (Madison, Wisconsin, Sp. st. a.), Perkin-Elmer (Weiterstadt), Pharmacia (Freíburg), Qiagen (Hilden) a Tratagene (Amsterdam, Nizozemsko). Pokud není uvedeno jinak, používá se chemikálií podle instrukcí výrobce.

c) Buněčný materiál

Uvedené studie se provádějí za použití kmene Thraustochytr i um, který je uchováván organizací American Type Culture Collection (ATCC) s číslem kmene ATCC26185 (Thraustochytrium), nebo v případě Crypthecodinium organizací Provasoli-Gui1lard National Center for Culture of Marině Phytoplankton ((CCMP) West Boothbay Harbour, ME, Sp. St. A.) pod číslem CCMP316. Řao sy se pěstují ve tmě při teplotě 25 C ve skleněných trubicích, do kterých se vzduch vhání zespodu. Alternativně se pěstují Thraustochytrium podle návodu, který podrobně popsali Singh & Ward (Advances in Microbiology 45, str. 271 až 311, 1997).

Kultivačním prostředím pro Crypthecodinium je f/2 culture

44··

4444 medium doplněné 10% organickým prostředím společnosti Guillard,

R.R.L. (Culture of phytoplankton for feeding Marině invertebrates, Smith W.L. a Chanley M.H. (vydavatelé) Culture of raarine Invertebrate animals, NY Plenům Press, str.29 až 60, 1975).

Obsahuje

995,5 ml (umělé) slané vody;

ml dusičnanu sodného (75 g/1), 1 ml natriumdíhydrogenfosforečnanu (5 g/1), 1 ml roztoku stopového kovu, 1 ml Tris/HCl o hodnotě pH 8,0, 0,5 ml f/2 vitaminového roztoku;

roztok stopového kovu: NaaEDTA (4,36 g/1), chlorid šelezitý (3, 15 g/ 1) ;

primární stopové kovy: síran měďnatý (10 g/1), síran zinečnatý (22 g/1), chlorid kobaltnatý (10 g/1), chlorid manganatý (18 g/1), molybdenan sodný (6,3 g/1):

f/2 vitaminový roztok: biotin 10 mg/1, thiamin 200 mg/1, vitamin B12 0,1 mg/ 1 :

orgabické prostředí: octan sodný (lg/1), glukóza (6 g/1), sukcinát sodný (3 g/1), Bacto-trypton (4 g/1), kvasnicový extrakt (2 g/ 1) .

d) Mechový materiál ( = rostlinný materiál):

Pro tuto studii bylo použito rostlin druhu Physcomi třel 1a patens (Hedw.) B.S.G. ze sbírky oddělení genetických studií uni verši ty v Hamburgu. Jsou odvozeny od kmene 16/14, který sklidil H.L.K. Whitehouse (Gransden Wood, Huntingdonshíre, Anglie) a vypěstoval Engel (Am. J. Bot. 55, str. 438 až 446, 1968) ze spór. Proliferace rostlin se provedla pomocí spór a regenerací gametophyt. Protonema, vyvinutá z haploidních spór do chloroplastem bohaté chloronemy a o chloroplast ochuzená cauloněma, vyklíčila po přibližně 12 dnech. Tyto klíčky vyrostly do gametophor s antherídia a archegonia. Oplodněním se získal diploidním sporophyt s krátkou štětinou a spórovou tobolkou, ve které dozrály meiospóry.

• 4« ·

···«

e) Kult i vace rostl i n

Rostliny se pěstují v inkubátoru s řísenýffi prostředím při o

teplotě vzduchu 25 Ca s intensitou světla 55 gfflol.s¹.m^-2(bílé světlo: fluorescenční lampa Philips TL 65W/25) a s režimem světlo/tma 16/8 hodin. Mech se pěstuje jednak v mokré kultuře sa použití modifikovaného pupenového prostředí, které popsal Reski a Ábel (Planta 165, str. 354 až 358, 1985) jednak na pevném pupenovém prostředí s použitím 1% oxoidového agaru (Unipath, Bassingstoke, Anglie).

Protonemata použitá k isolování RNA a DNA se pěstuje ve provzdušňovaných kapalných kulturách. Protonemata se rozmělňuje každých 9 dní a přenáší se do čerstvého kultivačního prostředí .

f) Kultivace Phytophthora infestans

Napřed se připraví knihovna cDNA Phytophthory infestans. K tomu je mošno získat kmen ATCC 48886 ze sbírky American Type

Jako varianta kultiATCC 48886, se spóry destilovanou vodou a

Culture Collection Rookville, Sp. st. a. vačního protokolu předepsaného pro kmen Phytophthory promyji studenou, dvakrát ponechají v ledničce šest hodin k navození sporulace. Materiál se pak přenese do prostředí hrachu. Za tímto účelem se udržuje 150 g hluboce zmraženého hrachu (Iglú získatelné z místních supermarketů) v autoklávu za sterilních podmínek a 1 litru vody po dobu 20 minut. Materiál se pěstuje ve 100 ml-baňkách při teplotě místnosti na oběhovém šejkru (200 otáček za minutu). Po dvou dnech obsah baněk zfiltruje a zbytek na filtru se rozetře v suchém dusíku pomocí hmoždíře a paličky a po následujících čtyřech dnech se proces opakuje vždy ve dvou baňkách.

• · · • « • · • ·

Příklad 2

Izolace celé DNA z rostlin a z mikroorganismů jako je Thraustochytr i um a Crypthecodinium pro hybridizační pokusy

Podrobnosti o izolaci celkové DNA se týkají zpracování rostlinného materiálu s čerstvou hmotností 1 g.

Pufr CTAB: 2% (hm/obj) N-acetyl-N,N,N-trimethylamonmiumbromid (CTAB): 100 mM Tris-HCl, pH 8,0, 1,4 M NaCI, 20 mM EDTA.

N-Laurylsarkosinový pufr: 1Q% (hm/obj) N-laurylsarkosin, ÍOO mM Tris-HCl, pH 8,0, 20 mM EDTA.

Rostlinný materiál nebo materiál buněk Crypthecodinium nebo Thraustochytrium se trituruje v prostředí kaplného dusíku ve hmoždíři na jemný prášek a přenese se do 2 ml Eppendorfových baněk. Zmrazený rostlinný materiál se pokryje vrstvou 1 ml rozkladového pufru ( 1 ml pufru CTAB, 100 ml N-laurylsarkosínového pufru, 20 ml /3-metkaptoethanolu a 10 ml roztoku proteinázy K, 10 mg/ml) a inkubuje se jednu hodinu při teplotě 60

C za stálého protřepávání. Získaný homogenizát se rozdělí do dvou Eppendorfových baněk (2 ml) a extrahuje se dvakrát protřepávání· se stejným objemem alkoholového roztoku chroroform/ isoamylalkohol (24:1). K oddělení fází se použije odstředění při 8000 g a při teplotě místnosti (= teplota místnosti = -23

C) vždy po dobu 15 minut. DNA se pak vysráží při teplotě -70 ’ C po dobu 30 minut s použitím ledového isopropano1u. Vysrážená DNA se nechá usadit při teplotě 4 Ca odstředění při 10000 g po dobu 30 minut a resuspenduje se ve 180 ml TE pufru (Sambrook a kol., Cold Spring Harbor Laboratory Press:ISBN 0-87969-309-6, 1989). K dalšímu čištění se DNA zpracuje chloridem sodným (konečná koncentrace 1,2M) a znovu se vysráží 30 minut při teplotě -70 C za použití dvojnásobného množství absolutního ethanolu. Po promytí 70% ethanolem se DNA usuší a pak se ♦ 4»· • 4 ·· • · · ¹ vyjme do 50 ml vody + RNase (konečná koncentrace 50 mg/ml).

o

DNA se rozpustí přes noc při teplotě 4 Ca štěpení pomocí o

RNase se pak provádí jednu hodinu při teplotě 37 C. DNA se uskladní při teplotě 4 C.

Příklad 3

Izolace celkové RNA a poly(A)⁺-RNA z rostlin a mikroorganizmů (Crypthecodinium a Thraustochytrium)

Celková RNA se izoluje z rostlinných materiálů jako je lněné semínko a řepka olejka způsobem, který popsal Logemann a kol. (Anal. Biochem. 163, str. 21, 1987). Celková RNA z mechu může být získána z protonemové tkáně způsobem GTC (Reski a kol., Mol. Gen. Genet. 244, str. 352 až 359, 1994).

Izolace RNA z Crypthecodinium a Thraustochytrium

Zmrazené vzorky řas (-70 C) se triturují v ledově studeném hmoždíři v prostředí tekutého dusíku na jemný prášek. Dva objemy homogenizačního prostředí (12,024 g sorbitolu, 40,0 ml Tris-HCl, pH 9 (0,2 M) , 12,0 ml 5M NaCl (0,3 M) , 8,0 ml 250 mM EDTA, 761,0 mg EGTA, 40,0 ml 10% SDS se vnesou do 200 ml vody a hodnota pH se upraví na 8,5) a do prášku zmrazených buněk se přidají 4 objemy fenolu s 0,2 % merkaptoethanolu při teplotě o

až 50 C za opatrného míchání. Přidají se dva 2 objemy chloroformu a směs se míchá intenzivně 15 minut. Směs se odstřeďuje 10 minut při 10 000 g a vodná fáze se extrahuje systémem fenol/chloroform (2 objemy/2 objemy) a pak chloroformem.

Výsledný objem vodné fáze se zpracuje 1/20 objemu 4M octanu sodného (pH 6) a 1 objemem (ledově studeného) isopropanoo lu a nukleové kyseliny se vysrášejí při teplotě -20 C. Směs se odstřeďuje 30 minut při 10 000 g a supernatant se odsaje. Následuje promytí 70% ethanolem a další odstředění. Sediment «» »»♦· ·* »» > * · <

se vyjme do Tris borátového pufru (80 mM Tris borátový pufr, 10 mM EDTA, pH 7,0). Supernatant se pak zpracuje 1/3 objemem 8M chloridu lithného, míchá se a inkubuje 30 minut při teplotě o

C. Po opětném odstředění se sediment promyje 70% ethanolem, odstředí se a sediment se rozpustí ve vodě prosté RNázy.

Poly(A)⁺-RNA se izoluje pomocí Dyna Beads^R (Dynal, Oslo, Norsko) podle protokolu výrobce.

Po stanovení koncentrace RNA nebo polyíA)+-RNA se RNA vysráží přidáním 1/10 objemu 3M otanu sodného, hodnota pH 4,6 a o

dvou objemů ethanolu a uskladní se při teplotě -70 C.

Pro analýzu se oddělí podíly RNA o hmotnosti 20 yg ve formaIdehydu obsahujícím 1,5 % agarového gelu a přenesou se na nylonové membrány (Hybond, Amersham). Provede se detekce specifických transkriptů způsobem, který popsal Amasino (Anal. Blochem. 152, str. 304, 1986)

Izolace celkové RNA a poly-(A)⁺ RNA z Phytophthora infestans

Za použití kitu (RNeasy Plant Total RNA kit, Quiagen, Milden) se získá úplná RNA a v ní obsažený pufr podle instrukcí výrobce. Z takto získané úplné RNA se izoluje poly-(A)⁺ RNA za použití Póly Attract v systému RNA Isolatíon System III (společnost Promega, Heidelberg) podle instrukcí výrobce.

Příklad 4

Konstrukce knihovny cDNA

Ke zkonstruování knihovny cDNA z Physcomitre11a Crypthecodinium a Thraustochytrium se provede analýza prvního kmene za použití reverzní transkriptázy myšího viru leukemie (Roche, Mannheim, Německo) a primerů oligo-d(T), zatímco syntéza dru-

·««· hého kmene se provede inkubací s DNA polymerázou I, Klenowův e

enzym, a štěpením s RNAse H při teplotě 12 C (dvě hodiny), 16 o o

C (jednu hodina) a 22 C (jednu hodina). Reakce se ukončí ine kubací při teplotě 65 C (10 minut), načež se materiál přenese na led. Připraví se dvouřetězcové DNA molekuly s tupými konci za použití T4 DNA polymerázy (Roche, Mannheim) při teplotě 37 o

C (30 minut). Nukleotidy se vyjmou extrakcí systémem fenol/ chloroform a za použití sloupců Sephadex G50. Adaptery EcoRI/ Xhol (Pharmacia, Freiburg, Německo) se vážou na konce cDNA pomocí ligázy T4 DNA (Roche, 12 C, přes noc), oddělí se Xhol a β

fosforylují se inkubací s polynukleotidkinázou (Roche, 37 C, 30 minut). Tato směs se podrobí separaci na agarovém gelu s nízkou teplotou tání. Z gelu se eluují molekuly DNA v množství více než 300 párů bází, extrahují se fenolem, zkoncentrují se na sloupcích Elutip D (Schleicher a Schul 1, Dassel, Německo), vážou se na ramena vektoru a zabalí se do lambda-ΖΑΡΙI fágů a lambda-ZAP-expresních fágů za použití křtu Gigapack Dold kit (Stratagene, Amsterdam, Nizozemsko) za použití výrobcova materiálu a podle jeho instrukcí.

Konstrukce knihovny cDNA pro Phytophthora infestans se provede j ak shora popsáno.

Příklad 5

Sekvencování DNA a analysa pomocí počítače

K sekvencování DNA se použije knihoven cDNA popsaných v příkladu 4 o sobě známými způsoby, zejména způsobem ukončování řetězce za použití kitu ABI PRISM Big Dye Terminátor Cycle Sequencing Ready Reaction Kit (Perkín-Elmer, Heiterstadt, Německo). Po přípravě plasmidu z knihoven cDNA se sekvencují individuální nahodilé klony cestou in-vivo hmotovou excisí po retransformování DH10B na agarových destičkách (podrobnosti o materiálu a protokolu: Stratagene, Amsterdam, Nizozemsko).

····

PÍasmidová DNA se připraví z kultur E.coli rostoucích přes noc v živném roztoku Luria doplněném ampicillínem (Sambrook a kol., Cold Spring Harbor Laboratory Press: ISBN 0-87969-309-6, 1989) za použití jednotky moci Qiagen DNA preparát ion robot (Qiagen, Hilden) podle návodu výrobce. Použije se sekvencování primerů s následujícími nukleotidovými sekvencemi:

5'-CAGGAAACAGCTATGACC-3 '

5'-CTAAAGGGAACAAAAGCTG-3 '

5'-TGTAAAACGACGGCCAGT-3'

Sekvence se zpracují a zaznamenají za použití programu EST-ΜΑΧ standard software package”, (obchodní produkt společnosti Bio-Max, Mnichov, Německo). S využitím komparativních algoritmů a za použití hledači sekvence, se vyhledají homologické geny pro použití BLAST programu (Altschul a kol. “Gapped BLAST and PSI-BLAST: a new generation of protein database search programs”, Nucleic Acids Res. 25, str. 3389 až 3402, 1997). Jedna sekvence z Crypthecodinium a z Thraustochytrium s homology s hledanou sekvencí mechové elongázy Physcomi třel 1 a patens je charakterizována podrobněji.

Příklad 6 a

Identifikace genu TC_PSE1 a Tc_PSE2 (Tc=Thraustochytrium) a genu Cc_PSEl a Cc_PSE2 (Cc = Crypthecodinium cohnii) porovnáním s Physcomitre11a patens genu Pp_PSEl .

Plná délka sekvence Pp_PSEl mechové elongázy podle vynálezu (jméno: viz též tabulku II) se použije pro porovnání sekvencí v pátracím algoritmu TBLASTN·’

MEWERFYGE LDGKVSQGVN ALLGSFGVEL TDTPTTKGLP LVDSPTPIVL GVSVYLTIVI GGLLWIKARD LKPRASEPFL LQALVLVHNL FCFALSLYMC VGIAYQAITW RYSLWGNAYN PKHKEMAILV YLFYMSKYVE FMDTVIMILK RSTRQISFLH VYHHSSISLI WWAIAHHAPG GEAYWSAALN SGVHVLMYAY ÝFLAACLRSS PKLKNKYLFW GRYLTQFQMF QFMLNLVQAY YDMKTNAPYP QWLIKILFYY MISLLFLFGN FYVQKYIKPS DGKQKGAKTE.

100 ·· ·· * ·

·· · ·· ····

Úplná nukleotidová sekvence mechové elongázy Pp_PSEl CDNA se skládá z přibližně 1200 bp. Obsahuje otevřený čtecí rámec 873 bp, který kóduje 290 aminokyselin s vypočtenou molekulovou hmotností 33,4 Da. Proteinová sekvence má pouze 38,5% identitu a 48,3% podobnost s genovým produktem Saccharomyces cerevisiae například s genovým produktem Saccharomyces cerevisiae PSE1, kterého je třeba v kvasnicích k prodloužení řetězce mastných kyselin se střední délkou řetězce (Toke & Martin, Isolation and characterization of gene affecting fatty acid elongation in Saccharomyces cerevisae. Journal of Biologícal Chemístry 271, str. 18413 až 18422, 1996).

Sekvence EST CC001042041R, TC002034029R a TC002014093R byly zprvu považovány za cílový gen mezi jinými genovými kandidáty díky zpočátku slabým homologiím s elongázou Physcomitrella patens (tabulka II), genu PSE1. Na obr. 5 je výsledek porovnání peptidové sekvence Pp_PSEl s nalezenou sekvencí. Je to část nukleové kyseliny SEQ ID NO:3 podle vynálezu (genové jméno TcPSEl, číslo datatbáze podle vynálezu TC 002034029R). Písmena značí identické aminokyseliny, zatímco symbol + značí chemicky podobnou aminokyselinu. Identity a homologie všech nalezených sekvencí podle vynálezu jsou souhrnně uvedeny v tabulce III.

Sekvencování úplného fragmentu cDNA z klonu TC002034029R vede k sekvenci 693 párů bází začínající první bází v otevřeném čtecím rámci. Sekvence kóduje polypeptid 195 aminokyselin v SEQ ID NO:4 _s koncovým kódonem v poloze párů bází translatováné se SEQ ID NO:3 v podlaze párů bází 586 až 588. Klon TC002014093R představuje virtuálně úplný elongásový polypeptid, jak možno vidět ze souboru sekvencí na obr. 7. Řádky znamenají identické aminokyseliny, zatímco sloupce a tečky znamenají chemicky zaměnitelné, tedy chemicky ekvivalentní aminokyseliny. Seřazení je provedeno pomocí Hen ikoff & Henikoffovy substituční matrice BL0SUM62 aminokyselin (Amino acid substi-

tution matrices from protein blocs. Proč. Nati. Acad. Sci, USA 89, str. 10915 až 10919, 1992). Použité parametry: Gap

Keight=8, Average match·’ 2.912, Length Weight:2, Average Mismatch:-2.003.

Kromě toho je druhá EST identifikována seřazením sekvencí. Seřazení peptidové sekvence Pp_PSEl s nalezenou sekvencí je na obr. 6 . I když je homologie mezi volenými parametry omezena na několik aminokyselin, jde o vysoce konzervovaný region specifických elongáz PUFA. Sekvence úplného klonovaného fragmentu je proto stanovena.

Sekvencování úplného fragmentu cDNA klonu TC002O14093R vede k sekvenci 955 párů bází začínající první bázi v otevřeném čtecím rámci. Jde o SEQ ID N0-’5 podle vynálezu. Sekvence kóduje polypeptid 297 aminokyselin se stop kódonem v poloze 892 až 894 párů bází podle vynálezu v SEQ ID NO '€>.

Crypthecodiniuffl cohnii EST CC001042041R, které kóduje gen Cc_PSEl se identifikuje pomocí sekvence PpPSEl. Izolovaná EST CC001042041R označovaná podle vynáoezu jako SEQ ID NO:7, je dlouhá 708 párů bází a má otevřený čtecí rámec 642 párů bází z první báze, která kóduje 214 aminokyselin a má stop kódon v poloze 643 až 645. Sekvece aminokyselin až do stop kódonu je podle vynálezu SEQ ID NO:8.

Vedle podobnosti s produktem genu PSE1 může být podobnost s elongázou Saccharomyces cerevisiae (viz též IP), které je třeba v kvasnicích k prodloužení řetězce mastných kyselin se střední délkou řetězce (Toke & Martin, Isolation and characterižation od gene affecting fatty acid elongation in Saccharomyces cerevisae. Journal of Biologi ca1 Chemistry 271, str. 18413 až 18422, 1996). Tabulka III ukazuje identity a homologie elongáz podle vynálezu s ostatními elongázami a s elongázami Physcomitre11a patens a s kvasnicovými elongázami. Data • · · · · · jsou získána pomocí GAP programu jako subprogramu násleujících softwarů: Hisconsin Package Veršion 10,0 (Genetics Computer

Group (GCG), Madison, Wisc., Sp. st. a.).

Tabulka III

Identi- ty/ homology	Tc_PSEl	TC_PSE2	Pp_PSEl	Sce elo IP
CcJPSEl	47.1% / 40.2%	50.6% / 43.5%	38.5% / 29.4%	45.1% / 33.5%
Tc_PSEl	100 / 100	n.d.	43.2% / 32.7%	41.9% / 29.9%
TC_PSE2	41.7% / 29.5%	100 / 100	39.2% / 30.0	35.4% / 27.8%

Zejména může být použito příkladů 5 až 10 k odvození následujících sekvenčních motivů jako regionů s vysokou homologií a odpovídajících dohodnutých sekvencí, z nich odvozených, které při zpětné translaci aminokyselin do kódonů se třemi páry bází vedou k oligonukleotidům, kterých lze využít k izolaci nových elongáz pomocí polymerázové řetězcové reakce. Jsou to hlavně sekvenční motivy znázorněné na obr. 10. Těchto motivů je možno použít k odvození oligonukleotidů, které, v kombinaci se dvěma oligonukleotidy, mohou být použity v pokusech PCR k izolování dalších elongázových fragmentů. K tomu je nutno zkonstruovat a syntetizovat jeden oligonukleotid hodící se k běžně definovanému kmeni 5-3 a druhý oligonukleotid ladící s oligonukleotidovým kmenem 3-5 ve směru. To vede k definovatelnému počtu příměrových kombinací, který je omezen permutací možných variant.

V této souvislosti je možno využít také primerů oligo-dT a jejich variant, například poslední bází umožňující specifičnost pro transkripční soubor, jako je napřiklaď oligo dT (12-20) X, kde X může být G, C nebo T. Také oligo dT (12-20) druhé báze XY je možno použít, kde X může být G, C a/nebo A,

- 103 ··· · ·· ·· > ♦ · <

zatímco Y může být A, G, C nebo T.

Uvedené sekvence umožňují odvodit 17 až 20 oligonukleotidů, kterých je možno použít k izolování genových fragmentů měněním příměrových kombinací a parametrů pokusů, jako jsou teplotní propgram, koncentrace iontů hořčíku a podobné parametry. Výsledné fragmenty je možno klonovat do vhodných vektorů a sekvence rezultujicích klonů může být určena běžnými způsoby k definování nových elongáz.

Příklad 6b

Izolace klonu cDNA z Phytophthora infestans

Klon cDNA označený PI001002014R z Phytophthora infestans se identifikuje z cDNA sekvencovaných nahodile, použitím homoz Physcomitre11a patens mechu (ATCCC dohodnutý motiv MyxYYF znázorněný na elongáz PUFA, které byly dosud identifikovány, je threoninový radikál nalezen jako variabilní aminokyselina x. Této další variace je možno použít k odvození primerů PCR.

logi i k elonáze PUFA 48886). Klón obsahuje obr. 8, kde odlišně od

Příklad 7

Identifikace genů pomocí hybridizace (TC002034029R-11 iGentCPCE1)

Genových sekvencí je možno použít k identifikaci homologových nebo heterologových genů z knihoven cDNA nebo z genomových knihoven .

Homologové geny (například klony cDNA v úplné délce, které jsou homologové, nebo homology) mohou být izolovány pomocí hybridizace nukleové kyseliny, s použitím například knihoven ·» ··

- 104 ·· ···· cDNA; Způsobu může být použito zejména k izolování funkčně aktivních genů v plné délce SEQ ID NOU, SEQ ID N0:3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID N0:7, SEQ ID NO: 9 a SEQ ID NO=11. V závislosti na frekvenci sledovaného genu se nanese 100000 až 1 00000Q rekombinantních bakteriofágů a přenesou se na nylonovou membránu. Po denaturaci alkálií je DNA imobi1izována na mebráně, například UV zesítěním. Hybridizace se provádí za vysoce přísných podmínek. Hybridizace a promytí probíhá ve vodném roztoku 0 s iontovou sílou 1M NaCl při teplotě 68 C. Hybridizačni vzorky se generuji například značením radioaktivním (³²P-) nick transkripcí (High Prime, Roche, Mannheim, Německo). Signály se snímají autoradiograficky.

Parciální homologové nebo heterologové geny, které mají vztah nejsou však identické, se mohou identifikovat obdobně jako shora popsáno za použití mírně přísných podmínek hybridizace a promývání. Pro vodnou hybridizaci se iontová přísnost zpravidla udržuje při 1 M chloridu sodném a teplota se sníží postupně na 68 až 42 C.

Izolace genových sekvencí, která jedině exhibuje homologie s individuální doménou například s 10 až 20 aminokyselinami se může provádět za použití syntetických, radioznačených o1igonukleotidových sond. Radioznačené oligonukleotidy se generují fosforylací 5' zakončení dvou komplementárních oligonukleotidů za použití T4 polynukleotidkinázy. Komplementární oligonukleotidy se hybridizují a ligují navzájem za zvyšování konkatemerů. Doušroubcovicové konkatemery se radioaktivně značí například zlomovou transkripcí. Hybridizace se zpravidla provádí za mírně přísných podmínek za použití vysokých koncentrací oligonikleotidů.

igonukleotidový hybridizační roztok x SSC ·» ····

- 105 ·· ····

0,01 M fosforečnan sodný lmM EDTA (hodnota pH 8)

0,5 % SDS

100 íig/ml denaturovaného lososového sperma DNA

0,1 % sušeného nízkotučného mléka

V průběhu hybridisace se teplota postupně sníží na 5 až

O

C pod vypočtenou oligonukleotidovou teplotu nebo na teolotu místnosti (pokud není uvedeno jinak, teplota místnosti -23 o

C ve všech pokusech), následují stupně proraývání a autoradiografíe. Promývání se provádí za mimořádně nízké přísnosti, například třemi promývacími stupni za použití 4 x SSC. Podrobnosti jsou popsány v literatuře (Sambrook J.a kol., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory

Press, 1989: nebo Ausubel F.M. a kol., Current Protocols in Molecular Biology, John Wilwy & Sons, 1994).

Klon TC002034029R-11 genového jména Tc_PCEl_l je sekvence plné délky elongázy z organizmu Thraustochytrium a proto delší než klon TC002034029R ze sekvence SEQ ID NO:4. Klon se izoluje hybridizačním způsobem, jak shora popsáno (příklad 7). Je to DNA sekvence délky 1050 párů bází, kódující 271 aminokyselin majících startovací kodon v pozici párů bází 43-45 a stop kodon v pozici párů baází 856-858.

Příklad 8

Identifikace cílových genů skrínováním expresních knihoven za použití protilátek

Pro generaci rekombinantního proteinu například v E. coli se používají CDNA sekvence (napříklaad systém Qiagen QIAexpress pQE). Rekombinantní proteiny se pak afinítně čistí zpravidla afinitní Ni-NTA chromatografií (Qiagen). Rekombinantní proteiny se pak používají pro zvýšení specifických protilátek • · > <

• ·

- 106 ·· ···· ·· ·· • · · !

> · <

«* ···· například za použití o sobě známých technik pro imunizaci králíků. Protilátky se pak afinitně čistí za použití Ni-NTA sloupce, který je předem nasycen rekombinantním antigenem (Gu a kol., BioTechniques 17, str. 257 až 262, 1994). Protilátka se pak používá pro skrínování exprese cDNA knihoven imunologickým skrínováním popsaným v literatuře (Sambrook J. a kol., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989: nebo Ausubel F.M. a kol., Current Protocols in Molecular Biology“ John Wilwy & Sons, 1994).

Příklad 9

Plasmidy pro transformaci rostlin

Binární vektory jako pBinAR se mohou používat pro transformaci rostlin (Hofgen a Willmitzer, Plant Science 66, str. 221 až 230, 1990). Binární vektory se mohou konstruovat ligací cDNA ve smyslové nebo v antismyslové orientaci do T-DNA. 5' cDNA, rostlinný promotor aktivuje cDNA transkripci. Polyadenylační sekvence je umístěna na 3' cDNA.

Pro tkáň specifické exprese se může dosáhnout za použití pro tkáň specifického promotoru. Například pro semeno specifické exprese se může dosáhnout klónováním do napinu nebo LeB4 nebo USP promotoru 5’ cDNA. Může se také použít jakýkoliv jiný pro semeno specifický promotorový element. Promotor CaMV-35S se může použít pro konstitutivní expresi ve všech rostlinách.

Expresovaný protein se může cílit do buněčného prostoru za použití signálního peptidu, například pro plastidy, mitochondrie nebo endoplasiatické ret iculum (Kermode, Crit. Rev. Plant Sci. 15, 4, str. 285 až 423, 1996). Signální peptid se klónuje do 5' ve správném čtecím rámu s cDNA k dosažení subcelulární lokalizace fúzního proteinu.

·· ···>

- 107 ·· ·· . . . « • · · • · · • · · ·· ····

Příklad 10

Transformace Agrobacteria

Agrobacteriei zprostředkovávaná transformace rostlin se může provádět například za použití kmene Agrobacterium tumefaciens GV3101 <pmP90) (Konz a Schell, Mol. Gen. Genet. 204, str. 383 až 396, 1986) nebo LBA4404 (Clontech). Transformace se může provádět o sobě známými transformačními způsoby (Deblaere a kol., Nucl. Acids. Tes. 13, str. 4777 až 4788, 1984).

Příklad 11

Transformace rostlin

Agrobacteriem zprostředkovávaná transformace rostlin se může provádět o sobě známými způsoby transformace a regenerace (Gelvin Stilton B., Schilperoort Robert A., Plant Molecular Biology Manual, 2. vydání, Dordrecht: Kluwer Academie Publ., sekce, Rinngbuc Zentrale Signatur: BT11-P ISBN 0-7923-2731-4; Glick Bernard R., Thompson John E., Methods in Plant Molecular Biology and Biotechnology, Boča Raton= CRC Press, 360 stran, 1993, ISBN 0-8493-5164-2).

Například řepka olejka se může transformovat za použití kotyledonové nebo hypokotyledonové transformace (Moloney a kol., Plant Cell Report 8, str. 238 až 242, 1989; De Block a kol., Plant Physiol. 91, str. 694 až 701, 1989). Použití antibiotik pro selekci agrobakteria a rostlin závisí na binárním vektoru a na agrobakteriálním kmenu použitém pro transformaci. Selekce řepky olejky se zpravidla provádí za použití kanamycinu jako selektovatelného signálního znaku.

Agrobacteriem zprostředkovávaný genový transfer v lněném

108 «« ·*·· semínku (Línům usitatissimum) se může rovádět například za použití způsobu, který popsal Mlynářova a kol., (Plant Cell Report 13, str. 282 až 285, 1994).

Transformace sojy se může provádět například způsobem, který je popsán v evropském patentovém spise číslo EP-A-O 424047 (Pioneer Hi-Bred International) nebo v evropském patentové· spise číslo EP-A-0 397687, a v amerických patentových spisech číslo US 5 376543 a US 5 169770 (Univerzity of Toledo).

Rostl i novou transkripci za užití bombardování částicemi, zprostředkovávanou polyethylenglykolem DNA absorpcí nebo technikou si 1 ikonkarbonátového vlákna popsal Freeling a. Walbot (The maíse handbook, ISBN 3-540-97826-7, Springer Verlag New York, 1993).

Příklad 12

Plasmidy pro transformaci rostlin

Binární vektory, jako pBinAR, se mohou použít pro transformaci rostlin (Hofgen a Willmitzer, Plant Science 66, str. 221 až 230, 1990). Binární vektory se mohou konstruovat, ligací cDNA ve smyslové nebo v antismyslové orientací do T-DNA. 5' cDNA rostlinný promotor aktivuje cDNA transkripci. Polyadenylační sekvence je lokalizovaná na 3' cDNA. Pro tkáň specifické exprese se může dosáhnout za použití pro tkáň specifického promotoru. Například pro semeno specifické exprese se může dosáhnout któnováním do napinu nebo do LeB4 nebo USP promotoru 5' cDNA. Jakýkoliv jiný pro semeno speckfický promotorovy element se rovněž může použít. Promotor CaMV-35S se může použít pro konstitutivní expresi v každé rostlině. Zvláště geny kódující elongázy a desaturázy se mohou klónovat do binárního vektoru konstrukcí četných expresních kazet v následnosti k imitaci metabolické cesty v rostlině.

109

V expresní kasetě se expresovaný protein může cílit do buněčného prostoru za použití signálního peptidu, například plast idu, mitochondrie nebo endoplasmatického ret icula (Kermode, Crit. Rev. Plant Sci. A5, 4, str. 285 až 423, 1996). Signální peptid se klónuje 5’ ve správném čtecím rámci s cDNA k dosažení subcelulární lokalizace fůzního proteinu.

Příklad 13

In vivo isutageneze

In vivo mutageneze mikroorganizmů se může provádět vedením plasmidu DNA (nebo jiného vektoru DNA) cestou E. coli nebo jiných mikroorganizů (například Bacillus spp nebo kvasinky jako Saccharomyces cerevisiae), ve kterých schopnost podržení integrity gnetické informace je narušena. Konvenční mutátorové kmeny mají mutace v genech pro DNA opravného systému (například mutHLS, mutD, mutT, Rupp W.D., DNA řepair mechanisms in: Escherichia coli and Salmonella, str. 2277 až 2294, ASM: Washington, 1996). Tyto kmeny jsou pracovníkům v oboru známy. Použití těchto kmenů objasnil například Greener A. a Callahan M. (Strategies 7, str. 32 až 34, 1994). Mutované DNA molekuly se s výhodou transferují do rostlin po té, co byly mikroorganizmy selektovány a testovány. Transgenní rostliny se generují podle různých příkladů uváděných zde ve stati příkladů praktického využ i t í.

Příklad 14

Studie exprese rekombinantního genového produktu v translatovaných organizmech

Aktivita rekombínantního genového produktu v transformovaném hostitelkém organizmu se měří na transkrípční a/nebo translační úrovní.

110

Vhodným způsobem stanovení množství transkripce genu (které indikuje množství RNA dostupné pro translaci genového produktu) se provádí na northern blot, jak je níže objasněno (Ausubel a kol., Current Protocols in MoOlecular Viology, Wiley'· New York 1988 a shora uvedené příklady), přičemž primer, který je určen tak, aby se vázal na příslušný gen, se značí detekovatelným značením (například radioaktivitou nebo chemiluminescencí) takže, když celá RNA kultury organizmu se extrahuje, separuje na gel, transferuje na stabilní matrici a inkubuje touto sondou, váže se a rozsah vázání sondy indikuje přítomnost jakož také množství mRNA pro tento gen. Informace indikuje stupeň stranskripce transformovaného genu: celková buněčná RNA se může připravit z buněk, tkání nebo orgánů četnými způsoby, které jsou všechny pracovníkům v oboru známy, jako je například Bormannúv způsob (Bormann E.R. a kol., Mol. Microbiol . 6, str. 317 až 326, 1992).

Hybridizace Northern

Pro RNA hybridizaci 20 yg celkové RNA nebo 1 jjg poly(A)⁺-RNA se oddělí gelovou elektroforézou v 1,25% agarovém gelu za použití formaIdehydu způsobem, který popsal Amasino (Anal. Biochem. 152, str. 304, 1986),transferovaného na nylonové membrány s pozitovním nábojem (HybondN*, Amersham, Brunswick) kapilární atrakcí za použití ÍO x SSC, imobi 1 izovaného UV světlem a předhybridizovaného po dobu tří hodin při teplotě 68 C za použití hybridizačního pufru (10% dextransulfát (hmotnost/objem), 1 M NaCl, 1 % SDS, 100 mg herinkového sperma DNA). Sonda DNA se značí za použití značícího kitu Highprime DNA (Roche, Mannheim, Německo) v předhybridizačnim stupni za použití a-³²P-dCTP (Amersham, Brunswick, Německo). Hybridizace se provádí po přidání značené DNA sondy v témže pufru při teplotě 68 °C přes noc. Promývací stupeň se provádí dvakrát po dobu 15 minut za použití 2 x SSC a dvakrát po dobu 30 minut za použití 1 x SSC, 1 % SDS při teplotě 68 C. Utěsněné fltry se

111 • fc· · · i »·♦ ·«··· ·· · ♦····· e

exponují při teplotě -70 C po dobu jednoho až 14 dní.

O sobě známé způsoby, jako je například Western blot (například Ausubel a kol., Current Protocols in Molcular Biology, Wiley: New York, 1988) se mohou použít pro studium přítomnosti nebo relativního množství proteinu translaťovaného touto mRNA. Podle tohoto způsobu se extrahují celkové buněčné proteiny, dělí se gelovou elektroforézou, transferují se na matrici, jako je nitrocelulóza, a inkubují se se sondou, jako je protilátka, která specificky váže žádaný protein. Tato sonda je zpravidla vybavena chemoluminiscenčním nebo kolorimetrickým značením, které se může snadno zjišťovat. Přítomnost a množství přítomného značení naznačuje přítomnost a kvanatitu žádaného mutovaného proteinu obsaženého v buňce.

Příklad 15

Analýza vlivu rekombinantních proteinů na produkci žádaného, produktu

Vliv genetické modifikace v rostlinách, houbách, řasách, ciliates nebo na produkci žádané sloučeniny (jako je například mastná kyselina) se může stanovit růstem modifikovaných organizmů nebo modifikovaných rostlin za vhodných podmínek (například shora popsaných) a analýzou prostředí a/nebo buněčných složek se zřetelen na zvýšenou produkci žádaného produktu (to je lipidů nebo mastné kyseliny). Tyto analytické způsoby jsou pracovníkům v oboru známy a zahrnují spektroskopii, chromatografi i v tenké vrstvě, různé zabarvovací způsoby, enzymatické a mikrobiologické způsoby a analytickou chromatografii, jako je vysokovýkonná kapalinová chromatografie (například Ullman, Encyclopedia of Industrial Chemistry, svazek A2, str. 89 až 90 a 443 až 613, VCH Weinheira, 1985; Fallon A. a kol., Application of HPLC in Biochemistry, Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology, svazek 17,

112

1987; Rehm a kol., Biotechnology, svazek 3, kapitola III, Product recovery and purification str. 469 až 714, VCH Weinheim, 1993; Belter P.A. a kol., Bioseparations: downstream Processing for Biotechnology, John Wiley & Sons, 1988; Kennedy J.F. a Cabral J.M.S., Recovery Processes for biological Materials John Wiley & Sons, 1992; Shaeiwitz J.A. a Henry J.D. Biochemical Separatíons, Ullmann's Encyclopedia of Industrial Chemistry, svazek B3, kapitola 11, Vol. 1-27, VCH Weinheim 1988; a Dechow F.J., Separation and purification techniques in biotechnology, Hoyes Publications 1989).

Kromě shora uvedených způsobů se rostlinné lipidy extrahují z rostlinného materiálu způsobem, který popsal Cahoon a kol. (Proč. Nati. Acad. Sci USA 96 (22), str. 12935 aá 12940, 1999) a Browse a kol. (Analytic Biochemistry 152, str. 141 až 145, 1986). Kvalitativní a kvantitativní analýza lipidu nebo mastné kyseliny je popsána v literatuře (Christie William W., Advances in Lipid Methodology, Ayr/Skotsko: Oily Press (Oily Library; 2); Christie William W., Gas ChromatoLipids, A Practical Guide - Ayr/Skotsko: Oily

Press, 1989, Repr. 1992 IX, 307 stran (Oily Press Lipid Library; 1);, “Progress in Lipid Research, Oxford: Pergamon Press, (1952), 16 (1977) pod názvem: Progress in Chemistry and Fats and Other Lipids CODEN).

Press Lipid graphy and

Kromě zjišťování konečného produktu při fermentaci je také možné zjišťovat jiné složky metabolické cesty, které se používají pro výrobu žádané sloučeniny, jako meziprodukty a vedlejší produkty ke stanovení celkové produkční účinnosti sloučeniny. Analytické způsoby zahrnují měření množství živiv v prostředí (například cukrů, glycidů, zdrojů dusíku, fosfátu a jiných iontů), složení biomasy a růstu, analýzu produkce běžných metabolitů biosyntetické cesty a měření plynů, které se vyvíjejí při fermentaci. O sobě známé způsoby pro tato měření jsou popsány v literatuře (Applied Microbial Physiology; A practi• · ·

113 cal Approach, P.M. Rhodes and P.F. str. 131 aš 163 a 165 aš 192 (ISBN odkazy na literaturu).

Stanbury, vyd 0199635773, a

IRL Press, tam uvedené

Jakožto příklad se uvádí analýza mastných kyselin (zde označovaných jako FAME, [fatty acíd methyl ester3; GC/MS, plynově-kapal inová chromatografie/hmotová spektrometrie; TAG, triacylglycerol; TLC, chromatografie v tenké vrstvě).

Jednoznačná detekce přítomnosti produktů mastných kyselin je možná analýzou rekombinantních organizmů o sobě známými analytickými způsoby: GC, GC/MS nebo TLC, které popsal Christie William W. (Advances on Lipid Methodology, 4. vydání: Christie Oily Press, Dundee, str. 119 aš 169, 1997 a připojené odkazy na literatur; gas chromatography/ mass spectrometry methods, Lipide 33, str. 343 až 353, 1998).

Analyzovaný materiál se může rozrušit sonizací, mletím ve skleněném mlýnu, kapalným dusíkem a mletím nebo jinými použitelnými způsoby. Po rozrušení se materiál musí odstředit. Sediment se resuspenduje v destilované vodě, udržuje se zahříváním na teplotě 100 C po dobu jedné hodiny, ochladí se ledem a opět se odstředí, následně se extrahuje O,5 M kyselinou sírovou v methanolu s 2 % dimethoxypropanu po dobu jedné hodiny při teplotě 90 C, čímž dojde k hydrolýze olejových a lipidových sloučenin za získání transmethylováných lipidů. Tyto methylestery mastné kyseliny se extrahují petroletherem a nakonec se podrobují plynové chromatografi i za použití kapilárního sloupce (Chrompack, WCOT Fused Silica, CP-Wax-52 CB, 25 μι, 0,32 mm) za teplotního gradientu 170 aš 240 C po dobu 20 miβ nut a 5 minut při teplotě 240 C. Identita rezultujícího methylesteru mastné kyseliny se musí definovat za použití standardů, které jsou obchodně dostupné (Sigma).

V případě mastných kyselin, pro které nejsou dostupné

114 • to · to .1 • to to • · to · • to •to toto · ·· • · « · • to · • · to to · · ··· ·· ·· · ···· žádné standardy, se identita musí doložit derivat isací následovanou analýzou GC/MS. Například lokalizace mastných kyselin se trojnou vazbou se musí demonstrovat GC/MS ná- sledovanou derívatizací se 4,4-diraethoxyoxazolinovými deriváty (Christie, 1998, vis shora).

Příklad 16

Expresní konstrukty v heterologových mikrobiálních systémech

Kmeny, podmínky růstu a plasmidy

Kmen Escherichia coli XL1 Blue MRF' kan (Stratagene) se používá pro subklonování nových Physcomi třel 1a patens elongáz, například PpPSEl. Pro funkční expresi tohoto genu se použil

INVSc 1 (Invitrogen Co.). E. 37 C v půdě Luria-Bertini (LB, Popřípadě se přidává ampicillin agar pro pevné LB prostřeo teplotě 30 C buď v prostinimálním prostředí bez uracilu kmen Saccharomyces cerevisiae coli se kultivuje při teplotě Duchefa, Haarlem, Holandsko).

(100 mg/1) a 1,5% (hmotnost/objem) dí. S. cerevisiae se kultivuje při ředí YPG nebo v kompletním (CNdum, Ausubel F.M., Brent R., Kingston R.E., Moore D.D., Seidman J.G., Smith J.A., Struhl K., Albright L.B., Coen D.M. a Varki A., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York, 1995) spolu se 2 % (hmotnost/objem) buď rafinózy nebo glukózy. Do pevného prostředí se přidají 2 % (hmotnost/objem) Bato™ agaru (Difco). Použitými plasfflidy pro klonování a expresi jsou PUC18 (Pharmacia) a pYES2 (Invitrogen

Co. ) .

Příklad 17

Klónování a exprase PUFA-spécifických elongáz organismů Physcom i tre 11 a, Crypthecodinium a Thraustochytrium

115 • · · ·

Geny o plné délce sekvencí podle vynálezu se mohou izolovat způsobem popsaným v příkladu 7 a zpracovávat, jak níže uvedeno. Se zřetelem na použití jsou uvedeny konkrétní příklady exprese.

A. Elongace mastných kyselin elongázou Pp_PSEl z mechu

Pro expresi kvasinek P. patens cDNA klony PpPSEl (sekvenční jméno dřívější databáze:08ckl9b07, nové jméno: pp001019019f), které kódují PUFA specifický elongázový gen (PSE1) se nejdříve modifikuje tak, že se získá BamHI restrikční místo a konsenzní sekvence kvasinek pro vysoce efektivní translaci (Kozák M., Point mutation define a sequence flanking the AUG initiator codon that modulates translation by eukaryotic ribosomes, Cell 44, str. 283 až 292, 1986) po startujícím kodonu a BamHI restrikční místo se získá lemováním stop kodonu. K zesílení otevřeného čtecího rámce se syntetizuje priměrový pár, který je komplementární na své 5’ a 3’ zakončení.

Gen sekvence podle vynálezu v SEQ ID NO:1 se klnuje do pYES polymerázovou řetězovou reakcí, čímž se vytvoří plasmid pYPpPSE 1

Následující oligonukleotidy se používají pro PCR experiment :

Ppex6: ggatccacataatggaggtcgtggagagattc

Ppex6r: ggatcctcactcagttttagctccttttgc

Reakce PCR se provádí s palsmidem DNA klonu PP001019019F jakožto matricí v jednotce thermocycler (Biometra) s Pfu DNA (Stratagene) polymerázou a za následujícího teplotního programu: 3 minuty při teplotě 96 C, následně 25 cyklů 30 sekund při teplotě 96 C, 30 sekund při teplotě 55 C a 1 minuta při

O ^e teplotě 72 C, 1 cyklus po dobu 10 minut při teplotě 72 C.

116 « ·« ·« ···« * · ·· ♦ · « R · « * 4 »« *

R ·· · R · « · » • · 9 * · 9 · « ♦ ····· · · · »»♦♦··

Správná velikost zesíleného DNA fragmentu se potvrdí agarovou TBE gelovou elektroforézou. Zesílená DNA se extrahuje z gelu za použití QIAquick gelového extrakčního kitu (Quiagen) a zpočátku se klonuje do PUC18 za použití kitu Sure Cloně Ligation Kit (Pharmacia). Takto klonovaný fragment se odřízne s BamHI a liguje se do pYES, čímž vznikne pYPpPSEl. Fragmentová orientace se zkouší za použití HindlII. Po transformaci E. coli XL1 Blue MRF' kan se provádí mikropreparace DNA (Riggs M.G. & McLachlan A., A simplified screening proceduře for large number of plasmid mini-preparátion. BioTechniques 4, str. 310 až 313, 1986) transformantů a pozitivní kmeny se identifikují restrikční analýzou BamHI. Sekvence PCR produktu se potvrdí resekvencováním za použití kitu ABI PRISM Big Dye Terminátor Cycle Sequencing Ready Reaction Kit (Perkin-Elmer, Weiterstadt).

Jeden klon se nechá růst za použití extrakčního kitu Nucleobond ^R AX 500 plasmidu DNA (Macherey-Nagel, Dúringen) pro maxi preparaci DNA.

Saccharomyces INVScl se transformuje za použití pYPp_PSEl nebo pYES2 jako kontroly podle modifikovaného PEG/1 ithiumacetátového protokolu (Ausubel a kol., 1995). Po selekci na CMdum-agarových destičkách se 2 % glukózy se selektují transformanty pro další kultivaci a funkční expresi jak shora uvedeno, a zavádějí se různé mastné kyseliny do prostředí.

i)

Lipidové vzory kvasinek transformovaných za použití pYES plasmidu bez inzerce fragmentu nebo které expresují Pp-PSEl gen (hodnoty v mol procentech) po zavedení 250 um hexadekatrienové kyseliny (16=3 ·^1Οσ'^13c).

117 ·

• « ·· • * · » • · < 4 « · 4 • 44 • « · • * ·»··

Tabulka IV

PYES2	PYES2	pYPp PSEl	PYPp PSEl
16:0	11,8%	16:0	11,1%
16:1	28,7%	16:1	23,9%
16:3^c,ioc,i3c	9,2%	16:3^a7c»ioc,i3c	12,0%
18:0	10,6%	18:0	8,6%
18:l^A9c	34,9%	18:1^Δ9=	20,6%
18:l^Allc		18:l^nc	1,4%
18:3 ^A9e42c,i5c	3,7%	18 :3^, 12c, 15c	21,4%

i i)

Lipidové vzory kvasinek transformovaných za použití pYES plasmidu bez inzerce fragmentu nebo které expresují Pp-PSEl gen (hodnoty v mol procentech) po zavedení 500 um pi nolenové kyše1 i ny (18:3 < 9c,12c y

Tabulka V

PYES2	PYES 2	pYPp PSEl	PYPp PSEl
16:0	18,3%	16:0	16,9%
16:l^Á9c	16,0%	16:1^A®=	15,3%
18:0	8,6%	18:0	8,4%
18:1^Á9=	16,7%	18:1 ^A®=	17,5%
18:l^Állc	0,7%	18:1 ^Ali=	²/^θ%..........
18:3^=4=420	39,8%	18:3^=,9=420	32,6%
20:3 ^A/=4ic,i4c	0%	20:3 ^Δ/=4ΐο,ΐ4ο	5,1%

iii)

Lipidové vzory kvasinek transformovaných za použití pYES plasmidu bez inzerce fragmentu nebo které expresují Pp-PSEl gen (hodnoty v mol procentech) po zavedení 500 pm stearidonové kyše1 i ny (18:4 A 6σ,9o,12c >15c)_

118 • · • · 9 ·

9 · '· 9 ·

999 99 9* · ♦ · 9 9 » « · «9 t « 9

9· 9999

Tabulka VI

PYES2	pYES2	pYPp PSEl	PYPp PSE1
16:0	15,2%	16:0	15,6%
16:1^Δ9=	13,1%	Ϊ6:1^Δ9=	14,9%
18:0	12,3%	18:0	10,7%
18:1^Δ9=	12,9%	18:l*9c	14,0%
	0,7%	ΓΪ8:1 ^Διΐο	1,2%
18:3^A6c'9^c42c,i5c	45,4%	18:3^a®^c'^9c»12c,15c	23.8%
20:4 A8c,11c,14c,17c	0^4%	20:4 ^Á8c,11c,14c,17c	19,8%

iv)

Lipidové vzory kvasinek transformovaných za použití pYES plasmidu bez inzerce fragmentu nebo které expresují Pp-PSEl gen (hodnoty v mol procentech) po zavedení 500 pm linolové kysel iny (18:2 >^12c).

Tabulka VII

pYES2	pYES2	pYPpJPSEl	PYPp PSEl
16:0	7,9%	16:0	8,7%
16:l^Á9c	1,2%	16:l^Á9c ~	1,3%
18:0	5,3%	18:0	5,1%
18:1*9°	1,3%	18:l^Á9c	1,3%
lg;2^a9c,12c	83,9% ^Ί	13;2^δ9ο,12ο	80,4%
20·2^Δΐί°'¹⁴°	0y5%	20:2*^llc'^14c	3/2%

B) Elongace mastných kyselin elongázou Thraustochytrium

Pro expresi v kvasinkách se Thraustochytrium cDNA klon sekvence SEQ ID N0=3 (TcPSE2), který kóduje PUFA specifický elongázový (PSE) gen nejdříve modifikuje tak, že tvoří funkčně aktivní polypeptid. K tomuto účelu se N-zakončení proteinu elonguje na úrpvni DNA 43 páry bází za chybění několika bází elongázy Physcomitřella patens. Je však také možné pouze přidat startující kodonve správném čtecím rámci pro sekvenci.

4* ·· • 4 4 4 4 · 4 · · ·

44 » 4 4 4 9 • ••••«9 · * · ·

49· 4 4 4 444 ••4 44 44 4 ·· 4444

119

Následující oligonukleotidy se používají pro PCR experiment ^: pTCPSE2-5':

aaaggatccacataatggaggtcgtggagagattctacggtgagttggatggga agGTCATTTCGGGCCTCGACC pTCPSE2-3': aaggatccctgagttttagctcccttttgctttcc

Oba nukleotidy obsahují BamHI restrikční místo a kvasinkovou konsenzovou sekvenci pro vysoce účinnou translaci (Kozák Μ., Point mutations define a sequence flanking the RUG initiator codon that modulates translat ion by eukaryotic ribosomes, Cell, 44, str. 283 až 292, 1986).

PCR reakce se provádí s plamidem DNA jakožto matricí v jednotce thermocycler (Biometra) s Pfu DNA (Stratagene) polymerázou a za následujícího teplotního programu: 3 minuty 96

C následované 25 cykly trvajícími 30 sekund při teplotě 96 C, 30 sekund při teplotě 55 C a 3 minuty při teplotě 72 C, cyklus trvající 10 minut při teplotě 72 Ca stop při teplotě 4 °C.

Správná velikost zesíleného DNA fragmentu se potvrdí agarovou TBE gelovou elektroforézou. Zesílená DNA se extrahuje z gelu za použití QIAquick gelového extrakčního kitu (Quiagen) a zpočátku se klonuje do PUC18 za použití kitu Sure Cloně Ligation Kit (Pharmacia) a liguje se do Smál restrikčního místa defosforylováného vektoru PUC18 za použití kitu Sure Cloně Ligation Kit (Pharmacia) za získání PUC-hybrid-TcPSE2. Po transformaci E. coli XL1 Blue MRF’ kan se provádí minipreparace DNA (Riggs M.G. & McLachlan A., A simplified screening proceduře for large number of plasmid mini-preparátion. BioTechniques 4, str. 310 až 313, 1986) transformantů resistentních k 24 ampicillinu a pozitivní klony se identifikují restrikční analýzou BamHI. Sekvence klónovaného PCR produktu se potvrdí resekvencováním za použití kitu ABI PRISM Big Dye Ter120 • · · · · · ♦ · 9 « · 9 • · »

·· ·· 99

9 9 9

9 * «

♦ ·Φ · • ♦ · 9 · 9

999 99 99 9 minator Cycle Sequencing Ready Reaction Kit (Perkin-Elmer, Weiterstadt).

PÍasmid DNA pUC-PSEl a PUC-hybrid-TcPSE2 se nejdříve štěpí za použití BamHI a získané fragmenty se ligují do BamHI restrikčního místa defosforylováného systému kvasinky/E.coli kyvadlového vektoru pYES2 za získání pY2 hybrid-Tc_PSE2.

Po transformaci E. coli a DNA minipreparaci z transformantů se hodnotí orientace DNA fragmentu ve vektoru štěpením s HindlII. Jeden klon se nechá růst za použití extrakčního kítu Nucleobond^R AX 500 plasmid DNA extractíon kit (MachereyNagel, Dilringen) pro DNA maxipreparaci. Saccharomyces INVScl se tranformuje za použití pY2PSEl, pYES2, pY2-hybrid-Tc_PSE2 a pYES2 za použití modifikovaného PEG/1 ithiumacetátového protokolu (Ausubel a kol., 1995). Po selekci na CMdum agarových destičkách s obsahem 2 % glukózy se vždy selektují čtyři

PY2PSE1 transformanty (pY2PSEla-d), _PY2-hybrid-Tc_PSE2 transformanty (pY2-hybrid-Tc_PSE2 la-d) a jeden pYES2 transformant pro účely další kultivace a funkční exprese.

Funkční exprese elongázové aktivity v kvasinkách

Předkultura:

Naočkuje se 20 ml kapalného prostředí CMdum se 2 % (hmotnost/objem) rafinózy transgenickými kvasinkovými klony (pY2-hybrid-Tc_PSE2 la-d, pYES2) a kultivuje se po dobu tří dnů při teplotě 30 C, za počtu otáček 400/min až do dosažení optické hustoty 600 nm (0D&oo) 1,5 až 2.

Hlavní kultura:

Pro expresi se 20 ml kapalného prostředí CMdum se 2 % rafinózy a 1 % (objem/objem) Tergitolu NP-40 doplní substráty

121 » ·· · • ·· »· · · ♦ * • 94 494 • 4 4 4 9 ·9

9 9 9 · · ·♦· ♦· · * · • · ·* • « 9 ·

9 9

9 9 · ··· · mastné kyseliny na konečnou koncentraci 0,003% (hmotnost/objem) . Prostředí se naočkuje předkulturou ODeoo 0,05. Exprese se navodí na dobu 16 hodin při ODeoo 0,02 sa použití 2 % (hmot nost/objem) galaktózy, načež se kultury sklidí při ODeoo 0,8 až 1,2.

Analýza mastných kyselin

Veškeré mastné kyseliny se extrahují z kvasinkových kultur a analyzují se plynovou chromatografií. Získají se buňky z 5 ml kultury odstředěním (1000 x g, 10 minut při telotě 4 o

C) a promyj í se jednou 100 mil hydrogenuhl iči taném sodným, hodnota pH 8,0, k odstranění zbytkového prostředí a mastných kyselin. Pro přípravu methylesteru mastné kyseliny (FAME) se buněčný sediment zpravovává po dobu jedné hodiny při teplotě

D

Cl M methanolovou kyselinou sírovou a 2 % (objem/objem) dimethoxypropanu. FAME se extrahují dvakrát 2 ml petroletheru, promyjí se jednou 100 mM hydrogenuhličitaném sodným, hodnota pH 8,0 a jednou destilovanou vodou a vysuší se síranem sodným. Organické rozpouštědlo se odpaří v proudu argonu a FAME se rozpustí v 50 ju 1 petroletheru. Vzorky se separují na kapilárním sloupci ZEBROU ZB Wax (30 m, 0,32 mm, 0,25 ym: Phenomenex) v plynovém chromatovrafu Hewlett Packard 6850 vybaveném plamenovým ionizačním detektorem. Teplota v pícce se programuO O je od 70 C (na jednu hodinu) až na 200 C při rychlosti zvyβ β šování teploty o 20 C za minutu, pak na 250 C (s prodlevou na této teplotě 5 minut) při rychlosti zvyšování teploty o 5 °C za minutu a konečně na 260 C při rychlosti zvyšování teploty o 5 C za minutu. Jako nosičového plynu se používá dusíku

D (4,5 ml/min při teplotě 70 C). Mastné kyseliny se identifikují porovnáním s retenční dobou FAME standardů (Sigma).

Vzory mastných kyselin pěti transgenických kvasinkových kmenů jsou uvedeny v mol procentech v tabulce I.

122 φ *

Množství gama-1 inol©nových kyselin, která se přidala a uchopila, jsou zdůrazněna číslicemi vytištěnými výrazně, elongovaných produktů červeně a elongované gama linolenové kyseliny čísly vytištěnými výrazně (poslední řádek).

Na obr. 2a až 2e je GC analýza FAME, přičemž z celkových pYES2 (i/kontorla) a pY2PSEl transformovaných za použi t í PY2PSE1D). Pro analýzu se lipidů kvasinek transformovaných (ii-iv c+d) v každém případě pY2PSEíA, PY2PSE1B, pY2PSElC, transgenické kvasinky kultivují v přítomnosti gama-18:3. V tabulce I jsou jejich vzory mastné kyseliny v mol %. Absorpce gama-18:3 je zdůrazněna číslicemi vytištěnými výrazně, produkt elongace dihomo-gama- 1 inolenová kyselina ( 20 : 3 /s. 8, 11 , 14) je podtržen a množství gama-183-elongačního produktu (také v % mol) je zdůrazněno číslicemi vytištěnými výrazně (poslední řádek). Struktura a hmotová spektra DMOX derivátu cls-^6,9,12, C18:3 je na obr. 3a+b. Struktura a hmotová spektra DMOX derivátu 8,11,14 C20:3 je na obr. 4a+b.

Výsledky dokládají, že gama-18:3 byly včleněny do všech transgenických kvasinek ve velkém množství. Všechny čtyři kvasinkové klony, které byly transformované pY2PSEl mají přídavný pík v plynovém chromatogramu, který se identifikuja jako 20=3 Δ8,11,14 porovnáním s retenční dobou. Plynová chromatografie/ hmotová spektroskopie může poskytovat další důkaz k potvrzení této identity. Procento elongace gma-18:3 je 23,7 aš 40,5 %, jak je zřejmé z tabulky I. Kromě toho se nepozoruje žádná výrazná elongace kyseliny palmitové (16:0) palmitolejové (16·’1), stearové (18:0) nebo olejové (18=1 9).

Identifikované produkty dokládají, že nukleotidová sekvence PpPSEl kóduje 6-selektivní elongázu mastné kyseliny z mechu Physcomitřel 1a patens, která vede k vytváření nových mastných kyselin v transgenických kvasinkách.

123

·· ♦♦* · • ♦ · 4 • 44 ·

4 444 4

Množství substrátů mastných kyselin, které se adu j í a uchopují se může stanovit shora uvedenými způsoby, takže kvantita a kvalita elongázové reakce se může zjistit.

Struktura a hmotová spektra DMOX derivátů rovněž dokládají příslušnou posoci dvojné vazby.

Mohou se provádět další krmné pokusy s širokým oborem jiných mastných kyselin (například kyselina arašidonová, eikosapentaenová) k podobnému potvrzení substrátové selektivity této elongázy.

Příklad 18

Izolace žádaného produktu z trsansformovaných organizmů obecně

Žádané produkty se získají z rostlinného materiálu nebo z organizmů jako jsou houby, řasy, ciliates, živočišné buňky nebo ze supernatantu shora popsaných kultur různými způsoby známými ze stavu techniky. Pokud se žádaný produkt nesekretuje z buněk, mohou se buňkly sklízet z kultur pomalým odstřeďováním a buňky se mohou lyžovat o sobě známými způsoby například mechanickou silou nebo sonizací. Rostlinné orgány se mohou oddělovat mechanicky z jiných tkáni nebo z jiných orgánů. Po homogenizaci se buněčné zbytky vyjmou z odstředivky a supernatantová frakce, která obsahuje rozpustné proteiny, se ponechá pro další izolaci žádané sloučeniny. Pokud je produkt sekretován z žádaných buněk, odstraní se buňky z kultury pomalým odstřeďováním, supernatantová frakce se ponechá pro další izolaci .

Supernatantová frakce z každého izolačního stupně se podrobuje chromatografíi se vhodnou pryskyřicí, žádaná molekula se buď zadržuje na chromatografické pryskyřici, přičemž četné nečistoty ve vzorku nejsou nebo nečistoty zůstávají na prysky124

říci a ve vzorku nikoliv. Tyto chromatografické stupně se mohou opakovat popřípadě za použití těchže nebo jiných chromatograf ických pryskyřic. Pracovník v oboru umí volit vhodné chromatograf ické pryskyřice s nejich nejúčinnější použitím pro izolaci určité molekuly. Isolovaný produkt se může koncentrovat filtrací nebo ultrafi 1trací a ukládat při teplotě, při které je stabilita produktu nejvyšší.

Široké spektrum izolačních způsobů je v oboru známo a není záměrem shora uvedené izolační způsoby chápat jako omezeni. Tyto izoloační způsoby jsou popsány v literatuře (naříklad Bailey J.E. & 01 lis D.F., Biochemical Engineering Fundaraentals, McGraw-Hill: New York, 1986).

Identita a čistota izolovaných sloučenin se mohou stanovit v oboru o sobě známými způsoby. Zahrnují vysoko výkonnou kapalinou chromatografií (HPLC), spektroskopické způsoby, zabarvovací způsoby, chromatografií v tenké vrstvě, NIRS, enzymové testy nebo mikrobiologické způsoby. Přehledně jsou tyto způsoby popsány v literatuře (Patek a kol., Appl Environ. Microbiol . 60, str. 133 až 140, 1994; Malakhova a kol., Biotekhnologiya 11, str. 27 až 32, 1996; a Schmidt a kol., Bioprocess Engineer. 19 str. 67 až 70, 1998; Ulmann’s Encyclopedia of Industrial Chemistry, svazek A27, VCH Weinheim, str. 89 až 90, str. 521 až 540, str. 540 až 547, str. 559 až 566, str. 575 až 581 a str. 581 až 587, 1996; Michal G., Biochemical

Pathway'· An Atlas of Biochemistry and Molecular Biology, John Wiley & Sons, 1999; Fallon A. a kol., Application of HPLC in Biochemistry, Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology, svazek 17, 1987).

Ekvivalenty

Pracovníkům v oboru je známo, že jsou možné četné ekvivalenty specifických provedení podle vynálezu, které jsou zde

125

• 44 ·· • 4 44 • »4 * · ♦ • · · · 4 «· 4444 popsány v rámci jednoduchých rutinních lenty vynález zahrnuje.

zkoušek. Tyto ekvivaPrůmyslová využitelnost

Způsobu přípravy polynenasycených mastných kyselin a způsoby zavádění DNA do organizmů, které produkují velké množství olejů, zvláště olejů s vysokým obsahem nenasycených mastných kyselin. Zvláště příprava oleje a/nebo mastné kyseliny s vyšším obsahem polynenasycených mastných kyselin s alespoň dvěma dvojnými vazbami a/nebo přípravy triacylglycerolu s vysokým obsahem polynenasycených mastných kyselin s alespoň dvěma dvojnými vazbami.

JUDr. Petr Kalenský advokát

SPOLEČNÁ ADVOKÁTNÍ KANCELÁŘ VSETEČKA ZELENÝ ŠVORČÍK KALENSKÝ A PARTNEŘI 120 00 Praha 2, Hálkova 2 Česká republika

Claims

1. Isolovaná nukleová kyselina odvozená z rostlin nebo z řas a kódující polypeptid, která elonguje mastné kyseliny se 16, s 18 nebo se 20 atomy uhlíku s alespoň se dvěma dvojnými vazbami ve skeletu mastné kyseliny o alespoň dva atomy uhlíku.

2. Izolovaná nukleová kyselina zahrnující nukleotidovou sekvenci kódující polypeptid, který elonguje mastné kyseliny se 16, s 18 nebo se 20 atomy uhlíku s alespoň se dvěma dvojnými vazbami v molekule mastné kyseliny, vybraný ze souboru zahrnuj ícího

a) sekvenci nukleové kyseliny uvedené v SEQ ID NO: 1 , SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7,

b) sekvenci nukleové kyseliny, která podle degenerace genetického kódu je odvozena z jedné sekvence uvedené v SEQ ID NO ^: 1 , SEQ ID NO:3, SEQ ID NO=5, SEQ ID NO:7,

c) deriváty sekvencí uvedené v SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO=7, které kódují polypeptidy sekvence amxnokyseliny uvedené v SEQ ID N0=2, SEQ ID N0:4, SEQ ID NO:6 nebo SEQ ID NO=8, a které mají alespoň 50% homologii se zřetelem na aminokyselinu bez podstatného snížení enzymatické aktivity polypeptidů.

3. Izolovaná sekvence nukleové kyseliny podle nároku 2, odvozená z rostliny, řasy nebo houby.

4. Izolovaná sekvence nukleové kyseliny podle nároku 2 nebo 3 odvozená od organizmu Physcomitřella, Thraustochytri um nebo Crypthecodinium.

5. Genový konstrukt zahrnující izolovanou nukleovou kyselinu podle nároku 1 až 4, která je funkčně vázána na jeden nebo na několik regulačních signálů.

127 ·* ·»·· • · · • ·· • · • · ttt · ·

6. Genový konstrukt podle nároku 5, jehož genová exprese je podporována regulačními signály.

7. Genový konstrukt obsahující sekvenci nukleové kyseliny podle nároku 1 až 4 nebo genový konstrukt podle nároku 5 nebo 6 a alespoň jednu další nukleovou kyselinu, která kóduje gen biosyntézy mastné kyseliny.

8. Genový konstrukt podle nároku 7, přičemž nukleová kyselina, která kóduje gen biosyntézy mastné kyseliny, je volena ze souboru zahrnujícího Δ19-, Δ17-, Δ15-, /\12-, Δ 9-, £.8-,

£.6-, Z\5~, 4-desaturázu, různé hydroxylázy, /\ 12-acetylenázu, acyl-ACP thioesterázy, fj-ketoacyl - ACPsyntázy nebo p-ketoacyl-ACPreduktázy.

9. Aminokyselinová sekvence, která je kódována izolovanou aminokyselinovou sekvencí podle nároku 1 až 4 nebo genovým konstruktem podle nároku 5 až 8.

10. Vektor zahrnující nukleovou kyselinu podle nároku 1 až 4 nebo genový konstrukt podle nároku 5 až 8.

11. Organizmus zahrnující nukleovou kyselinu podle nároku 1 až 4 nebo genový konstrukt podle nároku 5 až 8 nebo vektor podle nároku 10.

12. Organizmus podle nároku 11, kterým je mikroorganizmus, živočich nebo rostlina.

13. Organizmus podle nároku 11 nebo 12, kterým je transgenická rostlina.

14. Protilátka, která specificky váže polypeptid, který se kóduje jednou z nukleových kyselin podle nároku 1 až 4.

128 ·· ·· »·♦· ·« ♦ ♦ • · · » · ·*·· ·« · « · · » · • « ·«· «·· ·· ·· · ·9 ····

15. Antismyslová molekula nukleové kyseliny, která zahrnuje komplementární sekvenci nukleové kyseliny podle nároku 1 až 4.

16. Způsob přípravy polynenasycené mastné kyseliny, vyznačující se tím, Se se kultivuje organizmus, který zahrnuje nukleovou kyselinu podle nároku 1, genový konstrukt podle nároku 6 nebo vektor podle nároku 10, kódující polypeptid, který elonguje mastné kyseliny se 16, s 18 nebo se 20 atomy uhlíku alespoň se dvěma dvojnými vazbami v molekule mastné kyseliny o alespoň dva atomy uhlíku za podmínek, při kterých se polynenasycené mastné kyseliny vytvářejí v organizmu.

17. Způsob podle nároku 16, vyznačuj ící se tím, Se polynenasycenými mastnými kyselinami jsou molekuly mastné kyseliny se 16, s 18 nebo se 20 atomy uhlíku alespoň se dvěma dvojnými vazbami v molekule mastné kyseliny.

18. Způsob podle nároku 16 nebo 17, vyznačuj ící se t i m , še se molekuly mastné kyseliny s 18, se 20 nebo se 22 atomy uhlíku izolují z organizmu ve formě oleje, lipidu nebo volné mastné kyseliny.

19. Způsob podle nároku 1.6 až 18, vyznač uj i c i se tím, še organizmem je mikroorganizmus, živočich nebo rostl ina.

20. Způsob podle nároku 16 až 19, vyznač uj ící se t i m, že organizmem je transgenická rostlina.

21. Způsob podle nároku 16 až 20, vyznačuj ící se t i m, že mastnou kyselinou se 16, s 18 nebo se 20 atomy uhlíku je mastná kyselina se třemi dvojnými vazbami v molekule

129 ·· • · · · · · · · · · · • *· » » · · · · ··· ·»« ··· ··« ·> Λ* · ·· ····

22. Olej, lipid nebo mastná kyselina nebo její frakce připravené způsobem podle nároku 16 až 21 .

23. Komposice oleje, lipidu nebo mastné kyseliny ofosahu j ící polynenasycené mastné kyseliny odvozené od transgenické rostliny.

24. Komposice oleje, lipidu nebo mastné kyseliny podle nároku 23, přičemž polynenasycené mastné kyseliny jsou odvozeny od transgenických rostlin, které obsahují nukleotidovou sekvenci podle nároku 1 až 4, genový konstrukt podle nároku 5 až 8, antismyslovou molekula nukleové kyseliny podle nároku 15 nebo vektor podle nároku 10.

25. Použití komposice oleje, lipidu nebo mastné kyseliny podle nároku 22 až 24 v krmivech, v potravinách, v kosmetických nebo ve farmaceutických prostředcích.

26. Komposice obsahující protilátku podle nároku 14, konstrukt antismyslové molekuly nukleové kyseliny podle nároku 15 nebo antagonist nebo agonist podle nároku 28.

27. Kit, vysnačující se tím, že obsahuje nukleovou kyselinu podle nároku 1 až 4, genový konstrukt podle nároku 5 až 8, antismyslovou molekula nukleové kyseliny podle nároku 15, protilátku podle nároku 14, antagonist nebo agonist podle nároku 28, komposuicí podle nároku 26, aminokyselinovou sekvenci podle nároku 9 a/nebo olej, lipidy a/nebo mastné kyseliny nebo jejich frakci podle nároku 22 až 25.

28. Způsob pro identifikaci agonístu nebo antagonistu elongás, vysnačující se tím, že se

a) uvádějí se do styku buňky, které expresují polypeptid podle vynálezu, s kandidátskou substancí,

130

b) testuje se PSE aktivita,

spote,

'í '^r° ^p®^tr Kafenský ·· ·· • · · · • · · • · · • · · • · · · · · • · ···· ··· *·

1/16

OBR. 1

49 dfeftvgkqplseprpvllfiamyywifggrslvk.......sckplkl 91 | | | . | |:.| :·»! :: || d · d I

32 DTPTTKGLPLVDSPTPIVLGVSVYLTIVIGGLLWIKARDLKPRASEPFLL 81 • · · · ·

92 rfisqvhnlmltsvsflwlilmveqmlpivyrhglyfavcnveswtqpme 141 : lili ..| ^: · I I ^:l^: l^: I - .|

82 QALVLVHNLFCFALSLYMCVGIAYQ. . AITWRYSLWGNAYNPKH.. KEMA 127 • · · · ·

142 tlyylnymtkfvefadtvlmvlkh..rkltflhtyhhgatallcy...nq 186

I II 11-1 = 111 lll^:l^:ll I·:.III III . -I^: : ·

128 ILVYLFYMSKYVEFMDTVIMILKRSTRQISFLHVYHHSSISLIWWAIAHH 177 • · · · ·

187 lvgytavtwvpvtlnlavhvlmywyyflsa........sgirvwwkawvt 228

III II IIHII Jí Hd -d =d

178 APGGEAY.W.SAALNSGVHVLMYAYYFLAACLRSSPKLKNKYLFWGRYLT 225

229 rlqivqfmldliwyyvlyqkivaayfknactpqcedclgsmtaiaagaa 278 • |. Illld^: II = I I I II I

226 QFQMFQFMLNLVQAYYDM. .KTNAPY......PQ........WLIKILFY 259

279 iltsylflfisfyievykrgsasgkkk 305 : I lili -ll^:: I : I lid

260 YMISLLFLFGNFYVQKYIKPS.DGKQK

I i dent i cká am i nokyse1 i na ./: chemický ekvivalent

JUDr. Petr Kateí-w&v advokát • · ♦ · · · • · ·· ····

2/16

Γ)

OBR-

3/16 • · ·44 · ·· 44 ♦ · · · • · · • · · • 4 4 •4 444· lil ω

c.

CM >

•LL-87S^:OS-=^ · cc i > i;

OBR- 21» ·· ·· » · · · ► · · » · · » · · *· ···· • ·

4/16 ·· ··· ·

OBR. 2c í

t i • co

c c c o o c o o o o to ’Τ n <N 4—

_ŤCJ e

JUDr* Pet^

5/16

99 9999

9 9 9 9

9· ·

9*·

9 9 9

99 9999

OBR- 2d advokát

6/16 ·· ► « ·· «· ···* ·· ···· iv) PY2PSE1D [CD i

!?

LL‘8v£'O2 C

-co •CM < C c. LO

OJ c

c

CM

JUDr, Petr Kaleneký advokát

7/16 ·· ····

OBR-3a: DMOX derivative of cis Δ⁶'⁹'¹² 18:3

JUDr. Petr Kalenský advokát ·· ·· » · · · » · ⁴

8/16 ·· ► « n *· ·*»·· ·* ·*··

OBR- 3b:

>«5 >

0)

Ό

X

O r

o w

JC

R) rH

Φ

Sm

BR···»

10/16

CQ

O relativní El-MS DMOX derivátu fQ ·· o

r\i co ω

•H ϋ

>£>

ΓΊ •w

N

C

1) c

• ··

4 « • · ·· · · ·

CM in m

II > ° o c

3 o * a

Φ £ a

JUDr. Petr Katenský advokát

11/16 « 9 9 · « to · · · toto *· «•«to toto · ·«·» ··· · · <> ·· * ··· ·»· ··· ··· ·« ·» to ·· ····

a 1 < o co 1 Eh fa fa 1 z fa 1 H 33 33 H 1 o 33 33 fa + H Q z + w H H fa fa z + H X fa fa fa *2 Z fa OI OI σ H Z fa 3» fa fa z + H CO Ol OI Ol H E-i fa fa co + Ol OI Ol co + E-t El 33 33 33 fa 1 33 33 33 X 1 X fa z 1 H + > > > > o 1 X X X 33 33 33 z 1 fa + Ol fa fa fa fa 1 p Ol OI fa fa fa fa + H > + fa co Z X fa X X X H + fa fa fa fa fa fa Ol + fa z z z z z Z 1 fa fa o fa Eh 1 fa o fa fa fa co + Z fa fa fa fa fa fa Z o fa fa fa fa H Z fa fa co fa fa fa fa /1 + > co fa fa fa H H H z Z z co fa Z + fa fa 1 H + H + fa o 1 Z + > > > > 1 X + fa Eh p 2 1 X fa G Q o fa 1 fa + X S fa fa fa fa fa fa fa + z X X X H E-t fa fa fa X + z fa > > z < < H X X H X X X fa W fa fa fa z z z Z z Z co CO co fa + > Ol fa Z + fa > E-t fa z X z z z X E-< fa fa fa > + H fa Z fa fa fa o fa > X fa co + z fa > co z z z E-t fa fa + H + > fa + w H + fa 2 Z u rfj σ 2 > Q Q G sj fa co o X X X fa 33 z + X X + Z fa fa X fa z 33 33 33 «c H Ol X fa fa fa fa co > + H ·· ·· ·· ·· ·· ·· «· tH t—1 »—1 r-H r-i r-Η tn fa fa fa fa fa w co co co co co co « fa fa fa fa fa fa Z 1 1 1 1 m £X υ G. u IX □ o fa fa En fa E-t

advokát

12/16 • 4 • 4 4

4· 4

4 4 · ·

4 · 4 • 4 4

44 44 • · · « • 4 * • · · • β · • > · · 4 4

*c E-i u b Eli 4 X X X X X 4 X X X Σ s Σ H > 4 » > o X > K > m ω + 4 z z z u + H

CM w

W &

o

Pp_PSEl lUDr. Petr Kalenský advokát

13/16 • ·« * · · · · · · * · 9 • · · · ·· · ····

9 9 9 9 9

9 9 9 --- 9 9' ·

Pp_PSEl: AILVYLFYMSKYVEFMDTVIMILKRSTRQISFLHVYHHSSISLIW-AIA-HHAPGGEAY

fa 1 1 o fa + + £ >4 + + + 33 33 X fa fa + + + fa fa 1 1 o fa X fa fa fa fa o fa fa i 33 33 X St o fa fa fa > fa fa 1 1 o fa fa ro σ> H H o n + fa fa > CM CO > fa fa fa Eh fa fa fa fa O Q X + fa £ £ X X X fa fa fa X X £ X fa £ £ £ H fa + H fa fa > ω w w 33 33 33 fa > > > fa o fa O W fa X fa fa Z Z Z + + o fa 3 w 2 tu £ s 5

·· rH ·· rH ·« iH fa fa fa w w ω % fa I fa o Ol o o fa o

advokát

14/16

OBR· ⁸ Alignment of the polypeptide sequence PpPSEl and

Tc PSE2

Pp_PSEl: 1 MEWERFYGELDGKVSQGVNAL.LGSFGVELTDTPTTKGLPLVDSPTPIV 49 I I · · I · I · II ·|

Tc_PSE2: 1 ..............VISGLDLLPVLSWETMKFDTAEWSVWLRTHMWVPF 36

50 LGVSVYLTI VIGGLLWIKAR... DL. KPRASEPFLLQALVLVHNLFCFAL 95

I dl ··: I :·· I lilii. I . :

37 LMCFIYLWIFGIQYYMEDRKEFDLRKPLAA. .. .WSAFLAIFSIGASIR 82

96 SLYMCVGIAYQAITWRYSLWGNAYNP. .KHKEMAILVYLFYMSKYVEFMD 143

..... Η I : I I- I : I II I -I

83 TVPVLLKMLYEKGT.HHVLCGDTRNDWVIDNPAGVWTMAFIFSKIPELID 131

144 TVIMILKRSTRQISFLHVYHHSSISLI.WWAIAHHAPGGEAYWSAALNSG 192 I- -ϊ|:ϊ |·: II III I | | | | | : | | = |.132 TLFIVLRK. . RKLITLHWYHHVTVLLFCWHAWATFALTGIVF. . AAINAS 177

193 VHVLMYAYYFLAACLRSSPKLKNKYLFWGRYLTQFQMFQFMLNLVQAY. . 240

II .-11111 III I Id |. I ..

178 VHAIMYAYYAFTA.LGYRP. . .TSYAI. . .YITLIQIMQMWGTAVTFYI 220

241 .YDMKTNAPYP.......QW. .LIK...............ILFYYMI..S 263

III II III d .. I

221 GYDMAFVTPQPFRLDMKLNWDPLSKGENTEPTCKGANSSNAIFGVIMYAS 270

264 LLFLFGNFYVQKYIKPSDGKQKGAKTE. 290

Idl l^: hd II

271 YLYLFCLFFYMAYLRPKKSTPAAKKTN. 297

I i dent i cká am i nokyse1 i na ./: chemický ekvivalent

JUDr. Petr Kalenský advokát

15/16 • · • · · ·

OBR- 9:

• · · · ·

6 MTEKRGLQFTICGSTGELVQNLQDGPTALALCLFCFSKIPELMDTVFLIL 55

I ·^:Ι ^:ll I · i I . I II Η!II.11· I:: I

9 0 MLYEKGTHHVLCGDTRN..DWVIDNPAGVWTMAFIFSKIPELIDTLFIVL 137

56 KGKKVRFLQWYHHATVMLFCWLALATEYTPGLWFAATNYFVHSIMYMYFF 105 : :|. I lili 11=1111 I II |: III I ll.lll |:

138 RKRKLITLHWYHHVTVLLFCWHAWATFALTGIVFAAINASVHAIMYAYY. 186 • · · · ·

106 LMTFKTAAKWKPIAPLITIIQIAQMVWGLIVN.....GIAITT...F.. 145

I I i 1 = 111 III I I dli

187 .. AFTALGYRPTSYAIYITLIQIMQMWGTAVTFYIGYDMAFVTPQPFRL 234

146 .............FTTGACQ.IQSVTVYSAIVMYASYFYLFSQLFLEAY 180

I l· I -lilii III I II

235 DMKLNWDPLSKGENTEPTCKGANSSNAIFGVIMYASYLYLFCLFFYMAY 283 ;identická aminokyselina /í chemický ekvivalent

16/16

OBR- 10

Pp_PSEl

Tc_PSEl

Tc_PSE2

Cc_PSEl

Motif 1 Motif 2 Motif 3 Motif 4 FLHVYHH LMYAYYF FGNFYVQ FLHVLHH LMYAHYF FLNFYLQ FSKIPEL TLHWYHH IMYAYFF FSKIPEL FLQWYHH IMYMYFF

konsensus:

var i ace:

FSKIPEL FLHWYHH LMYAYYF FGNFYVQ T QVL I MHF L L

JUDr. P@4r Kalensitý advokáí

99 9 « »9 • ·· • 9 « 9 9 · • 9 · 9 «

9 9 9 9 9 9

9 9 9 9 ' » • 9 9 9 9 9 9

9 9«

9 · 9 9 9 9

SEZNAM SEKVENCÍ <110> BASF Aktiengesellschaft <120> Elongázový gen a způsob přípravy polynenasycených mastných kyselin <130> 0050/51159 <140> 20000081 <141> 2000-02-09 <160> 12 <170> Patentln Verš. 2.0 <210> 1 <211> 1192 <212> DNA <213> Physcomitrella patens <220>

<221> CDS <222> (58)..(930) <400> 1 ctgcttcgtc tcatcttggg ggtgtgattc gggagtgggt tgagttggtg gagcgca 57

atg gag gtc gtg gag aga ttc tac ggt gag ttg gat ggg aag gtc tcg 105 Met Glu 1 Val Val Glu Arg 5 Phe Tyr Gly Glu Leu Asp Gly Lys Val Ser 10 15 cag ggc gtg aat gca ttg ctg ggt agt ttt ggg gtg gag ttg acg gat 153 Gin Gly Val Asn Ala Leu Leu Gly Ser Phe Gly Val Glu Leu Thr Asp 20 25 30 acg ccc act acc aaa ggc ttg ccc ctc gtt gac agt ccc aca ccc atc 201 Thr Pro Thr Thr Lys Gly Leu Pro Leu Val Asp Ser Pro Thr Pro ile 35 40 45 gtc ctc ggt gtt tet gta tac ttg act att gtc att gga ggg ctt ttg 249 Val Leu Gly val Ser Val Tyr Leu Thr Ile Val Ile Gly Gly Leu Leu 50 55 60 tgg a ta aag gcc agg gat ctg aaa ccg cgc gcc tcg gag cca ttt ttg 297 Trp Ile Lys Ala Arg Asp Leu Lys Pro Arg Ala Ser Glu Pro Phe Leu

65 70 75 80 • ·· ·· ♦··· *· ·· • · · · · » « ♦ · · ♦ • ·· · · · · · · ··· · · · · · « «···· ·· < ·♦····

ctc Leu caa gct ttg gtg Leu Val 85 ctt gtg Leu Val cac aac ctg ttc tgt Cys ttt gcg ctc Leu 95 agt Ser 345 Gin Ala His Asn Leu 90 Phe Phe Ala ctg tat atg tgc gtg ggc atc gct tat cag gct att acc tgg cgg tac 393 Leu Tyr Met Cys Val Gly Ile Ala Tyr Gin Ala Ile Thr Trp Arg Tyr 100 105 110 tet ctc tgg ggc aat gca tac aat cct aaa cat aaa gag atg gcg att 441 Ser Leu Trp Gly Asn Ala Tyr Asn Pro Lys His Lys Glu Met Ala Ile 115 120 125 ctg gta tac ttg ttc tac atg tet aag tac gtg gaa ttc atg gat acc 489 Leu Val Tyr Leu Phe Tyr Met Ser Lys Tyr Val Glu Phe Met Asp Thr 130 135 140 gtt atc atg ata ctg aag cgc age acc agg caa ata age ttc ctc cac 537 Val Ile Met Ile Leu Lys Arg Ser Thr Arg Gin Ile Ser Phe Leu His 145 150 155 160 gtt tat cat cat tet tea att tcc ctc att tgg tgg gct att gct cat 585 Val Tyr His His Ser Ser Ile Ser Leu Ile Trp Trp Ala Ile Ala His 165 170 175 cac gct cct ggc ggt gaa gca tat tgg tet gcg gct ctg aac tea gga 633 His Ala Pro Gly Gly Glu Ala Tyr Trp Ser Ala Ala Leu Asn Ser Gly 180 185 190 gtg cat gtt ctc atg tat gcg tat tac ttc ttg gct gcc tgc ctt ega 681 Val His Val Leu Met Tyr Ala Tyr Tyr Phe Leu Ala Ala Cys Leu Arg 195 200 205 agt age cca aag tta aaa aat aag tac ctt ttt tgg ggc agg tac ttg 729 Ser Ser Pro Lys Leu Lys Asn Lys Tyr Leu Phe Trp Gly Arg Tyr Leu 210 215 220 aca caa ttc caa atg ttc cag ttt atg ctg aac tta gtg cag gct tac 777 Thr Gin Phe Gin Met Phe Gin Phe Met Leu Asn Leu Val Gin Ala Tyr 225 230 235 240 tac gac atg aaa acg aat gcg cca tat cca caa tgg ctg atc aag att 825 Tyr Asp Met Lys Thr Asn Ala Pro Tyr Pro Gin Trp Leu Ile Lys Ile 245 250 255 ttg ttc tac tac atg atc tcg ttg ctg ttt ctt ttc ggc aat ttt tac 873 Leu Phe Tyr Tyr Met Ile Ser Leu Leu Phe Leu Phe Gly Asn Phe Tyr 260 265 270

♦ « * · • » · • * * · · * gta caa aaa tac atc aaa ccc tet gac gga aag caa aag gga get aaa Val Gin Lys Tyr Ile Lys Pro Ser Asp Gly Lys Gin Lys Gly Ala Lys

275 280 285 act gag tga gctgtatcaa gccatagaaa ctctattatg ttagaacctg Thr Glu

290

921

970

aagttggtgc tttettatet ccacttatct tttaagcagc atcagttttg aaatgatgtg 1030 tgggcgtggt ctgcaagtag tcatcaatat aatcggcctg agcacttcag atggattgtt 1090 agaacatgag taaaagcggt tattacggtg tttattttgt accaaatcac cgcacgggtg 1150 aattgaaata tttcagattt gatcaatttc atctgaaaaa aa 1192

<210> 2 <211> 290 <212> PRT <213> Physcomitřella patens <400> 2

Met 1 Glu val Val Glu 5 Arg Phe Tyr Gly Glu Leu Asp Gly Lys Val Ser 10 15 Gin Gly Val Asn Ala Leu Leu Gly Ser Phe Gly Val Glu Leu Thr Asp 20 25 30 Thr Pro Thr Thr Lys Gly Leu Pro Leu Val Asp Ser Pro Thr Pro Ile 35 40 45 Val Leu Gly Val Ser Val Tyr Leu Thr Ile Val Ile Gly Gly Leu Leu 50 55 60 Trp Ile Lys Ala Arg Asp Leu Lys Pro Arg Ala Ser Glu Pro Phe Leu 65 70 75 80 Leu Gin Ala Leu Val Leu Val His Asn Leu Phe Cys Phe Ala Leu Ser 85 90 95 Leu Tyr Met Cys Val Gly Ile Ala Tyr Gin Ala Ile Thr Trp Arg Tyr 100 105 110 Ser Leu Trp Gly Asn Ala Tyr Asn Pro Lys His Lys Glu Met Ala Ile 115 120 125 Leu Val Tyr Leu Phe Tyr Met Ser Lys Tyr Val Glu Phe Met Asp Thr

» 4 · · * · • · 1 ’ · * · *

9 · φ · ♦ * «9 · 4 · * · » · «· » * · • · · · · 9 9 * ··

130 135 140

Val 145 Ile Met Ile Leu Lys Arg 150 Ser Thr Arg Gin Ile Ser Phe Leu His 155 160 Val Tyr His His Ser Ser Ile Ser Leu Ile Trp Trp Ala Ile Ala His 165 170 175 His Ala Pro Gly Gly Glu Ala Tyr Trp Ser Ala Ala Leu Asn Ser Gly 180 185 • 190 Val His Val Leu Met Tyr Ala Tyr Tyr Phe Leu Ala Ala Cys Leu Arg 195 200 205 Ser Ser Pro Lys Leu Lys Asn Lys Tyr Leu Phe Trp Gly Arg Tyr Leu 210 215 220 Thr Gin Phe Gin Met Phe Gin Phe Met Leu Asn Leu Val Gin Ala Tyr 225 230 235 240 Tyr Asp Met Lys Thr Asn Ala Pro Tyr Pro Gin Trp Leu Ile Lys Ile 245 250 255 Leu Phe Tyr Tyr Met Ile Ser Leu Leu Phe Leu Phe Gly Asn Phe Tyr 260 265 270 Val Gin Lys Tyr Ile Lys Pro Ser Asp Gly Lys Gin Lys Gly Ala Lys 275 280 285

Thr Glu 290 <210> 3 <211> 687 <212> DNA <213> Thraustochytrium <22 0>

<221> CDS <222> (1).. (588) <400> 3 cgc age gtg cat aac ctc ggg ctc tgc ctc ttc tcg ggc gcc gtg tgg 48 Arg Ser Val His Asn Leu Gly Leu Cys Leu Phe Ser Gly Ala Val Trp 1 5 10 15 atc tac acg age tac ctc atg atc cag gat ggg cac ttt cgc age ctc 96

4 · 4 4 ·· ·· a « * ·

44 · · • · · a «

4 4 * * a ·« a · • · · · • a · · » • · « ·

4 4 4 4 4 • 4·4 « 4 * 4 4 4 4

Ile Tyr Thr Ser Tyr Leu Met 20 Ile Gin 25 Asp Gly His Phe Arg 30 Ser Leu gag gcg gca acg tgc gag ccg ctc aag cat ccg cac ttc cag ctc atc 144 Glu Ala Ala Thr Cys Glu Pro Leu Lys His Pro His Phe Gin Leu Ile 35 40 45 age ttg ctc ttt gcg ctg tcc aag atc tgg gag tgg ttc gac acg gtg 192 Ser Leu Leu Phe Ala Leu Ser Lys Ile Trp Glu Trp Phe Asp Thr Val 50 55. 60 ctc ctc atc gtc aag ggc aac aag ctc ege ttc ctg cac gtc ttg cac 240 Leu Leu Ile Val Lys Gly Asn Lys Leu Arg Phe Leu His Val Leu His 65 70 75 80 cac gcc acg acc ttt tgg ctc tac gcc atc gac cac atc ttt ctc tcg 288 His Ala Thr Thr Phe Trp Leu Tyr Ala Ile Asp His Ile Phe Leu Ser 85 90 95 tcc atc aag tac ggc gtc gcg gtc aat get ttc atc cac acc gtc atg 336 Ser Ile Lys Tyr Gly Val Ala Val Asn Ala Phe Ile His Thr Val Met 100 105 110 tac gcg cac tac ttc ege cca ttc ccg aag ggc ttg ege ccg ctt att 384 Tyr Ala His Tyr Phe Arg Pro Phe Pro Lys Gly Leu Arg Pro Leu Ile 115 120 125 acg cag ttg cag atc gtc cag ttc atc ttc age atc ggc atc cat acc 432 Thr Gin Leu Gin Ile Val Gin Phe Ile Phe Ser Ile Gly Ile His Thr 130 135 140 gcc atc tac tgg cac tac gac tgc gag ccg ctc gtg cat acc cac ttt 480 Ala Ile Tyr Trp His Tyr Asp Cys Glu Pro Leu Val His Thr His Phe 145 150 155 160 tgg gaa tac gtc acg ccc tac ctc ttc gtc gtg ccc ttc ctc atc ctc 528 Trp Glu Tyr Val Thr -Pro Tyr Leu Phe Val Val Pro Phe Leu Ile Leu 165 170 175 ttt ctc aat ttc tac ctg cag cag tac gtc ctc gcg ccc gca aaa acc 576 Phe Leu Asn Phe Tyr Leu Gin Gin Tyr Val Leu Ala Pro Ala Lys Thr 180 185 190

aag aag gca tag ccacgtaaca gtagaccagc agcgccgagg acgcgtgccg 628

Lys Lys Ala

195 cgttatcgcg aagcacgaaa taaagaagat catttgattc aaaaaaaaaa aaaaaaaaa 687 • fc <210> 4 <211> 195 <212> PRT <213> Thraustochytr!um <400> 4

Arg 1 Ser Val His Asn Leu 5 Gly Leu Cys Leu Phe Ser Gly Ala Val Trp 10 15 Ile Tyr Thr Ser Tyr Leu Met Ile Gin Asp Gly His Phe Arg Ser Leu 20 25 30 Glu Ala Ala Thr Cys Glu Pro Leu Lys His Pro His Phe Gin Leu Ile 35 40 45 Ser Leu Leu Phe Ala Leu Ser Lys Ile Trp Glu Trp Phe Asp Thr Val 50 55 60 Leu Leu Ile Val Lys Gly Asn Lys Leu Arg Phe Leu His Val Leu His 65 70 75 80 His Ala Thr Thr Phe Trp Leu Tyr Ala Ile Asp His Ile Phe Leu Ser 85 90 95 Ser Ile Lys Tyr Gly Val Ala Val Asn Ala Phe Ile His Thr Val Met 100 105 110 Tyr Ala His Tyr Phe Arg Pro Phe Pro Lys Gly Leu Arg Pro Leu Ile 115 120 125 Thr Gin Leu Gin Ile Val Gin Phe Ile Phe Ser Ile Gly Ile His Thr 130 135 140 Ala Ile Tyr Trp His Tyr Asp Cys Glu Pro Leu Val His Thr His Phe 145 150 155 160 Trp Glu Tyr Val Thr Pro Tyr Leu Phe Val Val Pro Phe Leu Ile Leu 165 170 175 Phe Leu Asn Phe Tyr Leu Gin Gin Tyr Val Leu Ala Pro Ala Lys Thr 180 185 190

Lys Lys Ala 195 • Φ · · · · φ ·

ΦΦΦ • φ φ

ΦΦΦ φ· φ φφ ♦

φ φ * φφ * · φ φ

φ • Μ» <210> 5 <211> 955 <212> DNA <213> Th.austochytriům <220>

<221> CDS <222> (1)..(894) <400> 5 gtc att tcg ggc ctc gac ctt ctc ccc gtg ctc tcg tgg gag act atg 48 Val Ile Ser Gly Leu Asp Leu Leu Pro val Leu Ser Trp Glu Thr Met 1 5 10 15 aag ttc gac act gcc gaa gtt gtc tcg gtc tgg ctg cgc acg cac atg 96 Lys Phe Asp Thr Ala Glu Val Val Ser Val Trp Leu Arg Thr His Met 20 25 30 tgg gtc ccc ttc ctg atg tgc ttc atc tac ctg gtc gtc atc ttc ggc 144 Trp Val Pro Phe Leu Met Cys Phe Ile Tyr Leu Val Val Ile Phe Gly 35 40 45 atc cag tac tac atg gag gac cgc aag gag ttc gat ctg cgc aag ccg 192 Ile Gin Tyr Tyr Met Glu Asp Arg Lys Glu Phe Asp Leu Arg Lys Pro 50 55 60 ctg gcc gcc tgg agc gcc ttc ttg gcc att ttc agc atc ggc gcc tcc 240 Leu Ala Ala Trp Ser Ala Phe Leu Ala Ile Phe Ser Ile Gly Ala Ser 65 70 75 80 atc cgc acc gtg ccc gtc ctg ctc aag atg ctc tac gaa aag ggc acg 288 Ile Arg Thr val Pro Val Leu Leu Lys Met Leu Tyr Glu Lys Gly Thr 85 90 95 cac cac gtg ctc tgc ggc gac acg cgc aac gac tgg gtc att gac aac 336 His His Val Leu Cys Gly Asp Thr Arg Asn Asp Trp Val Ile Asp Asn 100 105 110 ccg gcc ggc gtc tgg acc atg gcc ttt atc ttt tcc aag att ccc gag 384 Pro Ala Gly Val Trp Thr Met Ala Phe Ile Phe Ser Lys Ile Pro Glu 115 120 125 ctc atc gac acc ctc ttt atc gtg ctc cgc aag cgc aag ctc atc acc 432 Leu Ile Asp Thr Leu Phe Ile Val Leu Arg Lys Arg Lys Leu Ile Thr 130 135 140 ctc cac tgg tac cac cac gtg acc gtg ctc ctg ttc tgc tgg cac gcc 480 Leu His Trp Tyr His His val Thr Val Leu Leu Phe Cys Trp His Ala

* ·· « • φ ·· ♦ « * φ φ φ · * · φ φ ♦ · φ » * · φ · φ

145

150

155

160

tgg gcc acc Thr ttt gcg ctc acc ggc atc gtc ttt gcc gcc atc aac gcc 528 Trp Ala Phe Ala 165 Leu Thr Gly Ile Val 170 Phe Ala Ala Ile Asn Ala 175 tcg gtg cac gcc atc atg tac gcc tat tac gcc ttc acg gcc ctc ggc 576 Ser Val His Ala Ile Met Tyr Ala Tyr Tyr Ala Phe Thr Ala Leu Gly 180 185 190 tac ega cca acc tcg tac gcc atc tac att acg ctc att cag atc atg 624 Tyr Arg Pro Thr Ser Tyr Ala Ile Tyr Ile Thr Leu Ile Gin Ile Met 195 200 205 cag atg gtc gtc ggc acc gcc gtc acc ttt tac att ggc tac gac atg 672 Gin Met Val Val Gly Thr Ala Val Thr Phe Tyr Ile Gly Tyr Asp Met 210 215 220 gcc ttt gtc acg ccg cag ccc ttc cgc ctt gac atg aaa ctc aac tgg 720 Ala Phe Val Thr Pro Gin Pro Phe Arg Leu Asp Met Lys Leu Asn Trp 225 230 235 240 gac ccg ctc agc aag ggc gag aac acc gag ccc acc tgc aag ggc gcc 768 Asp Pro Leu Ser Lys Gly Glu Asn Thr Glu Pro Thr Cys Lys Gly Ala 245 250 255 aac tcc tcc aac gcc atc ttc ggc gtc atc atg tac gcc tcg tac ctc 816 Asn Ser Ser Asn Ala Ile Phe Gly Val Ile Met Tyr Ala Ser Tyr Leu 260 265 270 tac ctc ttc tgc ctc ttc ttc tac atg gcc tac ctg cgc ccg aag aag 864 Tyr Leu Phe Cys Leu Phe Phe Tyr Met Ala Tyr Leu Arg Pro Lys Lys 275 280 285 tcg acg ccc gcg gcc aag aag aca aac taa tcgcacacta ccaaacaatc 914 Ser Thr Pro Ala Ala Lys Lys Thr Asn 290 295

ttccactcga cctagaaaaa aaaaaaaaaa aaaaactcga g

955 <210> 6 <211> 297 <212> PRT <213> Thaustochytriuw <400> 6

Val Ile Ser Gly Leu Asp Leu Leu Pro Val Leu Ser Trp Glu Thr Met • 4 »«»· • 4 · · 4 · • «· *4 ·

4 4 4«« 44

4 4 4 4 4 4

444 44 44 ·

4 4 44

15 10 15

Lys Phe Asp Thr Ala Glu 20 Val Val Ser Val Trp Leu Arg Thr His Met 25 30 Trp Val Pro Phe Leu Met Cys Phe Ile Tyr Leu Val Val Ile Phe Gly 35 40 45 ile Gin Tyr Tyr Met Glu Asp Arg Lys Glu Phe Asp Leu Arg Lys Pro 50 55 60 Leu Ala Ala Trp Ser Ala Phe Leu Ala Ile Phe Ser Ile Gly Ala Ser 65 70 75 80 ile Arg Thr Val Pro Val Leu Leu Lys Met Leu Tyr Glu Lys Gly Thr 85 90 95 His His Val Leu Cys Gly Asp Thr Arg Asn Asp Trp Val Ile Asp Asn 100 105 110 Pro Ala Gly Val Trp Thr Met Ala Phe Ile Phe Ser Lys Ile Pro Glu 115 120 125 Leu Ile Asp Thr Leu Phe Ile Val Leu Arg Lys Arg Lys L$u Ile Thr 130 135 140 Leu His Trp Tyr His His Val Thr Val Leu Leu Phe Cys Trp His Ala 145 150 155 160 Trp Ala Thr Phe Ala Leu Thr Gly Ile Val Phe Ala Ala Ile Asn Ala 165 170 175 Ser Val His Ala Ile Met Tyr Ala Tyr Tyr Ala Phe Thr Ala Leu Gly 180 185 190 Tyr Arg Pro Thr Ser Tyr Ala Ile Tyr Ile Thr Leu Ile Gin Ile Met 195 200 205 Gin Met Val Val Gly Thr Ala Val Thr Phe Tyr Ile Gly Tyr Asp Met 210 215 220 Ala Phe Val Thr Pro Gin Pro Phe Arg Leu Asp Met Lys Leu Asn Trp 225 230 235 240 Asp Pro Leu Ser Lys Gly Glu Asn Thr Glu Pro Thr Cys Lys Gly Ala 245 250 255 Asn Ser Ser Asn Ala Ile Phe Gly Val Ile Met Tyr Ala Ser Tyr Leu

• 44 444444 ·· ·· »444 4 · 4 444 4

444 444 44 4

44 444 44 44* 4

444 444 44* «44 44 44 4 4» 4444

260 265 270 Tyr Leu Phe Cys Leu Phe Phe Tyr Met Ala Tyr Leu Arg Pro 275 280 285 Ser Thr Pro Ala Ala Lys Lys Thr Asn 290 295

<210> 7 <211> 708 <212> DNA <213> Crypthecodinium <220>

<221> CDS <222> (1).. (645) <400> 7

cgg cac gag gta cac His 5 atg Met acc Thr gag Glu aag Lys agg gga ctg cag Gin ttc Phe acg atc 48 Arg His 1 Glu Val Arg 10 Gly Leu Thr 15 Ile tgc ggc tet act ggt gag ttg gtg cag aat ctc cag gat ggt ccc act 96 Cys Gly Ser Thr Gly Glu Leu val Gin Asn Leu Gin Asp Gly Pro Thr 20 25 30 gcc ttg gcg ttg tgc ctc ttt tgc ttc age aaa att ccc gag ttg atg 144 Ala Leu Ala Leu Cys Leu Phe Cys Phe Ser Lys Ile Pro Glu Leu Met 35 40 45 gac acg gtc ttt ctc atc ttg aag ggc aag aag gtt ege ttt ttg cag 192 Asp Thr Val Phe Leu Ile Leu Lys Gly Lys Lys Val Arg Phe Leu Gin 50 55 60 tgg tac cac cac gct acc gtg atg ctc ttc tgc tgg ttg gca ctg gct 240 Trp Tyr His His Ala Thr Val Met Leu Phe Cys Trp Leu Ala Leu Ala 65 70 75 80 acg gag tac acc ccg ggc ctc tgg ttc gcg gcc act aac tac ttc gtg 288 Thr Glu Tyr Thr Pro Gly Leu Trp Phe Ala Ala Thr Asn Tyr Phe Val 85 90 95 cac tcc atc atg tac atg tac ttc ttc ttg atg acc ttc aag acg gcc 336 His Ser Ile Met Tyr Met Tyr Phe Phe Leu Met Thr Phe Lys Thr Ala 100 105 110 gca aag gtc gtg aag ccc att gcc cct ctc atc acc atc atc cag atc 384

• ·4 44 • 4 · 4 44 • 4 4 · 4

4 4 4 4 4 4

4*4 44

44 44 • 4 4 4 • 4 4

4 4 4

40 4444

Ala Lys Val 115 Val Lys Pro Ile Ala Pro Leu Ile Thr Ile Ile Gin Ile 120 125 gcc cag atg gtc tgg ggt ctc atc gtc aac ggc atc gcg atc acc act 432 Ala Gin Met Val Trp Gly Leu Ile Val Asn Gly Ile Ala Ile Thr Thr 130 135 140 ttc ttc acc acg ggc gcc tgc cag atc cag tcc gtg acg gtc tac tcg 480 Phe Phe Thr Thr Gly Ala Cys Gin Ile Gin Ser Val Thr Val Tyr Ser 145 150 ’ 155 160 gcc att gtg atg tac get tcg tac ttc tac ctc ttc tcc cag ctc ttc 528 Ala Ile Val Met Tyr Ala Ser Tyr Phe Tyr Leu Phe Ser Gin Leu Phe 165 170 175 ctg gag gca tac gga tcc get ggc aag aac aag aag aag ctc gcc ege 576 Leu Glu Ala Tyr Gly Ser Ala Gly Lys Asn Lys Lys Lys Leu Ala Arg 180 185 190 gag ctc tcc ega aag atc tcc gag get ctc ctg aat agt ggc gac gag 624 Glu Leu Ser Arg Lys Ile Ser Glu Ala Leu Leu Asn Ser Gly Asp Glu 195 200 205 gta gcc aag cac ctc aag tga actgagcgac ctcatcttgg tctggtccgc 675 Val Ala Lys His Leu Lys 210 215

caaattgccg cgtgcatgtg catgagatgc tgt 708 <210> 8 <211> 214 <212> PRT <213> Crypthecodinium <400> 8

Arg 1 His Glu Val His 5 Met Thr Glu Lys Arg 10 Gly Leu Gin Phe Thr 15 Ile Cys Gly Ser Thr 20 Gly Glu Leu Val Gin 25 Asn Leu Gin Asp Gly 30 Pro Thr Ala Leu Ala 35 Leu Cys Leu Phe Cys 40 Phe Ser Lys Ile Pro 45 Glu Leu Met Asp Thr Val Phe Leu Ile Leu Lys Gly Lys Lys Val Arg Phe Leu Gin

50 55 60 • 94 99 9494 99 99

44 4 4 4 9 9 4 4 4 9

9 9 9 9 9 9 9 9 9

999 4 4 99 9 4 4 9999

Trp Tyr His His 65 Ala Thr Val Met Leu Phe Cys Trp Leu Ala Leu Ala 80 70 75 Thr Glu Tyr Thr Pro Gly Leu Trp Phe Ala Ala Thr Asn Tyr Phe Val 85 90 95 His Ser Ile Met Tyr Met Tyr Phe Phe Leu Met Thr Phe Lys Thr Ala 100 105 110 Ala Lys Val Val Lys Pro Ile Ala Pro Leu Ile Thr Ile Ile Gin Ile 115 120 125 Ala Gin Met Val Trp Gly Leu Ile Val Asn Gly Ile Ala Ile Thr Thr 130 135 140 Phe Phe Thr Thr Gly Ala Cys Gin Ile Gin Ser Val Thr Val Tyr Ser 145 150 155 160 Ala Ile Val Met Tyr Ala Ser Tyr Phe Tyr Leu Phe Ser Gin Leu Phe 165 170 175 Leu Glu Ala Tyr Gly Ser Ala Gly Lys Asn Lys Lys Lys Leu Ala Arg 180 185 190 Glu Leu Ser Arg Lys Ile Ser Glu Ala Leu Leu Asn Ser Gly Asp Glu 195 200 205 Val Ala Lys His Leu Lys

210 <210> 9 <211> 1054 <212> DNA <213> Thraustochytrium <220>

<221> CDS <222> (43) . . (858) <400> 9 gaattcggca cgagagcgcg cggagcggag acctcggccg cg atg atg gag ccg 54 Met Met Glu Pro ctc gac agg tac agg gcg ctg gcg gag ctc gcc gcg agg tac gcc agc 102

Leu Asp Arg Tyr Arg Ala Leu Ala Glu Leu Ala Ala Arg Tyr Ala Ser

5 10 15 20 ·· · fcfc fc • fc fcfc fc · fc · · * · · fcfc · • •fcfc* fc · fc • ••fcfc* ··· fc • fc ··· ···

• · · * · • · • fcfc · · · · tcg gcg gcc ttc aag tgg caa gtc acg tac gac gcc aag gac age ttc 150 Ser Ala Ala Phe Lys 25 Trp Gin Val Thr Tyr 30 Asp Ala Lys Asp Ser 35 Phe gtc ggg ccc ctg gga atc cgg gag ccg ctc ggg ctc ctg gtg ggc tcc 19 8 Val Gly Pro Leu 40 Gly Ile Arg Glu Pro 45 Leu Gly Leu Leu val 50 Gly Ser gtg gtc ctc tac ctg age ctg ctg gcc gtg gtc tac gcg ctg cgg aac 246 Val Val Leu 55 Tyr Leu Ser Leu Leu 60 Ala val Val Tyr Ala 65 Leu Arg Asn tac ctt ggc ggc ctc atg gcg ctc cgc age gtg cat aac ctc ggg ctc 294 Tyr Leu 70 Gly Gly Leu Met Ala 75 Leu Arg Ser Val His 80 Asn Leu Gly Leu tgc ctc ttc tcg ggc gcc gtg tgg atc tac acg age tac ctc atg atc 342 Cys 85 Leu Phe Ser Gly Ala 90 Val Trp Ile Tyr Thr 95 Ser Tyr Leu Met Ile 100 cag gat ggg cac ttt cgc age ctc gag gcg gca acg tgc gag ccg ctc 390 Gin Asp Gly His Phe 105 Arg Ser Leu Glu Ala 110 Ala Thr Cys Glu Pro 115 Leu aag cat ccg cac ttc cag ctc atc age ttg ctc ttt gcg ctg tcc aag 438 Lys His Pro His 120 Phe Gin Leu Ile Ser 125 Leu Leu Phe Ala Leu 130 Ser Lys atc tgg gag tgg ttc gac acg gtg ctc ctc atc gtc aag ggc aac aag 486 Ile Trp Glu 135 Trp Phe Asp Thr Val 140 Leu Leu Ile Val Lys 145 Gly Asn Lys ctc cgc ttc ctg cac gtc ttg cac cac gcc acg acc ttt tgg ctc tac 534 Leu Arg 150 Phe Leu His Val Leu 155 His His Ala Thr Thr 160 Phe Trp Leu Tyr gcc atc gac cac atc ttt ctc tcg tcc atc aag tac ggc gtc gcg gtc 582 Ala 165 Ile Asp His Ile Phe 170 Leu Ser Ser Ile Lys 175 Tyr Gly Val Ala Val 180 aat get ttc atc cac acc gtc atg tac gcg cac tac ttc cgc cca ttc 630 Asn Ala Phe Ile His 185 Thr Val Met Tyr Ala 190 His Tyr Phe Arg Pro 195 Phe ccg aag ggc ttg cgc ccg ctt att acg cag ttg cag atc gtc cag ttc 678 Pro Lys Gly Leu 200 Arg Pro Leu Ile Thr 205 Gin Leu Gin Ile Val 210 Gin Phe

♦ ·· »· ··«» ·· ·· »«4· · · · ·«·· ··* * «· ·· * ··« · · · ·«· • ·· ·· · · « *· ···«

att Ile ttc agc atc Ile ggc atc cat acc gcc att tac Tyr tgg Trp cac His 225 tac Tyr gac Asp tgc Cys 726 Phe Ser 215 Gly Ile His Thr 220 Ala Ile gag ccg ctc gtg cat acc cac ttt tgg gaa tac gtc acg ccc tac ctt 774 Glu Pro Leu Val His Thr His Phe Trp Glu Tyr Val Thr Pro Tyr Leu 230 235 240 ttc gtc gtg ccc ttc ctc atc ctc ttt ttc aat ttt tac ctg cag cag 822 Phe Val Val Pro Phe Leu Ile Leu Phe Phe Asn Phe Tyr Leu Gin Gin 245 250 255 260 tac gtc ctc gcg ccc gca aaa acc aag aag gca tag ccacgtaaca 868 Tyr Val Leu Ala Pro Ala Lys Thr Lys Lys Ala 265 270

gtagaccagc agcgccgagg acgcgtgccg cgttatcgcg aagcacgaaa taaagaagat 928 catttgattc aacgaggcta cttgcggcca cgagaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 988 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 1048 ctcgag 1054

<210> 10 <211> 271 <212> PRT <213> Thraustochytrium <400> 10

Met Met Glu Pro Leu Asp Arg Tyr Arg Ala Leu Ala Glu Leu Ala Ala 15 10 15

Arg Tyr Ala Ser Ser Ala Ala Phe Lys Trp Gin Val Thr Tyr Asp Ala 20 25 30

Lys Asp Ser Phe Val Gly Pro Leu Gly Ile Arg Glu Pro Leu Gly Leu 35 40 45

Leu Val Gly Ser Val Val Leu Tyr Leu Ser Leu Leu Ala Val Val Tyr 50 55 60

Ala Leu Arg Asn Tyr Leu Gly Gly Leu Met Ala Leu Arg Ser Val His 65 70 75 80

Asn Leu Gly Leu Cys Leu Phe Ser Gly Ala Val Trp Ile Tyr Thr Ser •Φ φφφφ φ φφ φφφ φ φ φ φ φφ φφφ φ φ φφφ φ φ φφφ φφφ ♦ ·φ φφ φ φ φ φφ φφ φ φ φ φ φ φ ·

Tyr Leu Met Ile 100 Gin Asp Gly His Phe Arg Ser Leu Glu Ala Ala Thr 105 110 Cys Glu Pro Leu Lys His Pro His Phe Gin Leu Ile Ser Leu Leu Phe 115 120 125 Ala Leu Ser Lys Ile Trp Glu Trp Phe Asp Thr Val Leu Leu Ile Val 130 135 • 140 Lys Gly Asn Lys Leu Arg Phe Leu His Val Leu His His Ala Thr Thr 145 150 155 160 Phe Trp Leu Tyr Ala Ile Asp His Ile Phe Leu Ser Ser Ile Lys Tyr 165 170 175 Gly Val Ala Val Asn Ala Phe Ile His Thr Val Met Tyr Ala His Tyr 180 185 190 Phe Arg Pro Phe Pro Lys Gly Leu Arg Pro Leu Ile Thr Gin Leu Gin 195 200 205 Ile Val Gin Phe Ile Phe Ser Ile Gly Ile His Thr Ala Ile Tyr Trp 210 215 220 His Tyr Asp Cys Glu Pro Leu Val His Thr His Phe Trp Glu Tyr Val 225 230 235 240 Thr Pro Tyr Leu Phe Val Val Pro Phe Leu Ile Leu Phe Phe Asn Phe 245 250 255 Tyr Leu Gin Gin Tyr Val Leu Ala Pro Ala Lys Thr Lys Lys Ala

260 265 270 <210> 11 <211> 421 <212> DNA <213> Phytophthora infestans <220>

<221> CDS <222> (1)..(279) <400> 11 cac acc atc atg tac act tac tac ttc gtc age gcc cac acg ege aac 48

His Thr Ile Met Tyr Thr Tyr Tyr Phe Val Ser Ala His Thr Arg Asn

9 ·· 94 ···· • 4 • 9 99 9 9 • 9 9 • • 9 9 • • · 9 • • « • • 9 9 9 9 • • • • • 99 49 • « • 9 9 • 99 9

1 5 10 15 att tgg tgg aag aag tac ctc acg cgc att cag ctt atc cag ttc gtg 96 Ile Trp Trp Lys Lys Tyr Leu Thr Arg 20 25 Ile Gin Leu Ile Gin Phe Val 30 acc atg aac gtg cag ggc tac ctg acc tac tet ega cag tgc cca ggc 144 Thr Met Asn 35 Val Gin Gly Tyr Leu Thr 40 Tyr Ser Arg Gin Cys Pro Gly 45 atg cct cct aag gtg ccg ctc atg tac ctt gtg tac gtg cag tea ctc 192 Met Pro Pro 50 Lys Val Pro Leu Met Tyr 55 Leu val Tyr 60 Val Gin Ser Leu ttc tgg ctc ttc atg aat ttc tac att cgc gcg tac gtg ttc ggc ccc 240 Phe Trp Leu 65 Phe Met Asn Phe Tyr Ile 70 Arg Ala Tyr 75 Val Phe Gly Pro 80 aag aaa ccg Lys Lys Pro gcc gtg gag gaa tcg aag Ala Val Glu Glu Ser Lys 85 aag aag ttg Lys Lys Leu 90 taa cggcgcttgt 289 taaaaagtct aacctcgctg taacagctta aaacacacac acacacaacg ctttgtagag 349 gaggtaagta gtggcaactc gtgtagaaat gcagcatgcc catcaaatac atcccgtatg 409

attcatacta ct 421 <210> 12 <211> 92 <212> PRT <213> Phytophthora infestans <400> 12

His 1 Thr Ile Met Tyr 5 Thr Tyr Tyr Phe Val 10 Ser Ala His Thr Arg 15 Asn Ile Trp Trp Lys 20 Lys Tyr Leu Thr Arg 25 Ile Gin Leu Ile Gin 30 Phe Val Thr Met Asn 35 Val Gin Gly Tyr Leu 40 Thr Tyr Ser Arg Gin 45 Cys Pro Gly Met Pro 50 Pro Lys Val Pro Leu 55 Met Tyr Leu Val Tyr 60 Val Gin Ser Leu Phe Trp Leu Phe Met Asn Phe Tyr ile Arg Ala Tyr Val Phe Gly Pro