PL207026B1

PL207026B1 - Wyizolowany kwas nukleinowy, konstrukt genowy zawierający ten kwas, sekwencja aminokwasowa kodowana przez wyizolowaną sekwencję tego kwasu nukleinowego, wektor zawierający kwas nukleinowy lub konstrukt genowy, roślina transgeniczna lub mikroorganizm transgeniczny zawierający kwas nukleinowy, konstrukt genowy lub wektor, przeciwciało specyficznie wiążące się z polipeptydem kodowanym przez kwas nukleinowy, cząsteczka antysensownego kwasu nukleinowego oraz sposób wytwarzania wielonienasyconych kwasów tłuszczowych (PUFA)

Info

Publication number: PL207026B1
Application number: PL362905A
Authority: PL
Inventors: Ernst Heinz; Thorsten Zank; Ulrich Zähringer; Jens Lerchl; Andreas Renz
Original assignee: Basf Ag
Priority date: 2000-02-09
Filing date: 2001-02-08
Publication date: 2010-10-29
Also published as: AU3924401A; KR20020073580A; HUP0300081A2; WO2001059128A3; US8933300B2; HUP0300081A3; MXPA02007078A; EP1254238B1; JP2003523746A; PL362905A1; US20040111763A1; BR0108198A; DE50115107D1; DK1254238T3; ATE443146T1; AU2001239244B2; US7544859B2; NO20023757L; US20080160054A1; NO20023757D0

Description

Opis wynalazku

Wynalazek dotyczy wyizolowanego kwasu nukleinowego, konstruktu genowego zawierającego ten kwas, sekwencji aminokwasowej kodowanej przez wyizolowaną sekwencję tego kwasu nukleinowego, wektora zawierającego kwas nukleinowy lub konstrukt genowy, rośliny transgenicznej lub mikroorganizmu transgenicznego zawierającego kwas nukleinowy, konstrukt genowy lub wektor, przeciwciała specyficznie wiążącego się z polipeptydem kodowanym przez kwas nukleinowy, cząsteczki antysensownego kwasu nukleinowego oraz sposobu wytwarzania wielonienasyconych kwasów tłuszczowych (PUFA).

Pewne produkty i produkty uboczne procesów metabolicznych naturalnie występujących w komórkach można stosować w szerokim spektrum przemysłu, włączając przemysł żywności dla zwierząt, przemysł spożywczy, przemysł kosmetyczny i przemysł farmaceutyczny. Cząsteczki takie, wspólnie określane jako wysokowartościowe związki chemiczne, obejmują także lipidy i kwasy tłuszczowe, wśród których przykład jednej z klas stanowią wielonienasycone kwasy tłuszczowe. Wielonienasycone kwasy tłuszczowe (kwasy PUFA) są dodawane, przykładowo, do produktów dla dzieci w celu podniesienia ich wartości odżywczej. Przykładowo, kwasy PUFA wykazują pozytywny wpływ na poziom cholesterolu we krwi ludzi i są zatem przydatne w ochronie przed chorobą serca. Wysokowartościowe związki chemiczne i wielonienasycone kwasy tłuszczowe (kwasy PUFA) można izolować ze źródeł zwierzęcych, przykładowo z ryb lub z mikroorganizmów. Hodowanie takich mikroorganizmów pozwala na wytwarzanie i izolowanie dużych ilości jednej lub większej liczby pożądanych cząsteczek.

Mikroorganizmy, które są szczególnie przydatne do wytwarzania kwasów PUFA to mikroorganizmy takie jak szczepy Thraustochytria lub Schizochytria, glony takie jak gatunki Phaeodactylum tricornutum lub Crypthecodinium, orzęski takie jak Stylonychia lub Colpidium, grzyby takie jak Mortierella, Entomophthora lub Mucor. Szereg zmutowanych szczepów, o których mowa, wytwarzających serie pożądanych związków, w tym kwasy PUFA, wyodrębniono na podstawie selekcji szczepów. Selekcja szczepów, z ulepszoną produkcją pewnych cząsteczek, jest jednak procedurą czasochłonną i trudną Także niekorzystny jest fakt, że w określonym mikroorganizmie można wytwarzać tylko określone wielonienasycone kwasy tłuszczowe lub tylko spektrum specyficznych kwasów tłuszczowych.

Alternatywnie, wysokowartościowe związki chemiczne można odpowiednio wytwarzać na dużą skalę produkując takie rośliny, które produkują wspomniane powyżej kwasy PUFA. Roślinami szczególnie odpowiednimi do tego celu są rośliny oleiste, które zawierają duże ilości składników lipidowych takie jak rzepak oleisty, rzepak, len, soja, słonecznik, ogórecznik i wiesiołek dwuletni. Chociaż, jak wspomniano w szczegółowym opisie niniejszego wynalazku odpowiednie są też inne rośliny zawierające oleje lub lipidy i kwasy tłuszczowe. Tradycyjna hodowla roślin doprowadziła do uzyskania serii zmutowanych roślin, które wytwarzają spektrum pożądanych lipidów i kwasów tłuszczowych, kofaktorów i enzymów. Jednakże, selekcja nowych odmian roślinnych o ulepszonej produkcji określonej cząsteczki, jest procedurą czasochłonną i trudną, czy wręcz niemożliwą, jeśli związek nie występuje naturalnie w roślinie o której mowa, tak jak w przypadku wielonienasyconych kwasów tłuszczowych C20 i kwasów tłuszczowych C22 i kwasów o dłuższych łańcuchach węglowych.

Celem wynalazku było dostarczenie nowych cząsteczek kwasu nukleinowego, które są stosowane do identyfikowania i izolowania genów elongazy do biosyntezy PUFA, które można użyć do modyfikowania olejów, kwasów tłuszczowych, lipidów i pochodnych związków lipidów, a w szczególności, do wytwarzania wielonienasyconych kwasów tłuszczowych, ponieważ istnieje duże zapotrzebowanie na nowe geny, które kodują enzymy wymagane do biosyntezy nienasyconych kwasów tłuszczowych i które umożliwiają wytwarzanie ich na skalę przemysłową. W szczególności, celem było zaspokojenie zapotrzebowania na enzymy biosyntezy kwasów tłuszczowych pozwalające na wydłużanie wielonienasyconych kwasów tłuszczowych, korzystnie z dwoma lub większą liczbą wiązań podwójnych w cząsteczce.

W przemyś le, do wytwarzania na dużą skalę duż ej liczby wysokowartoś ciowych zwią zków chemicznych zazwyczaj stosowane są mikroorganizmy takie jak Phaeodactylum, Colpidium, Mortierella, Entomophthora, Mucor, Crypthecodiniumi i inne glony oraz grzyby i rośliny, w szczególności rośliny oleiste.

Tak długo jak dostępne są wektory do klonowania i techniki do manipulacji genetycznej w wymienionych wyżej organizmach i w orzęskach, jak ujawniono w WO 98/01572 i WO 00/23504, lub w glonach i organizmach pokrewnych, takich jak Phaeodactylum tricornutum, opisanych w Falciatore i wsp.[1999. Marine Biotechnology 1(3):239-251]; i Dunahay i wsp. [1995, Genetic transformation of

PL 207 026 B1 diatoms, J. Phycol. 31:10004-1012] i w cytowanych tam publikacjach, cząsteczki kwasów nukleinowych według wynalazku można stosować do rekombinacyjnych modyfikacji tych organizmów, tak że staną się one lepszymi lub wydajniejszymi producentami jednego lub większej liczby wysokowartościowych związków chemicznych, w szczególności nienasyconych kwasów tłuszczowych. Ta ulepszona produkcja, lub wydajność produkcyjna wysokowartościowego związku chemicznego, może być bezpośrednim wynikiem manipulacji genem według wynalazku lub pośrednim wynikiem tej manipulacji.

Mchy i glony są jedynymi znanymi systemami roślinnymi, które wytwarzają znaczne ilości wielonienasyconych kwasów tłuszczowych, takich jak kwas arachidonowy (=ARA) i/lub kwas eikozapentaenowy (=EPA) i/lub dekozaheksaenowy (DHA). Mchy zawierają kwasy PUFA w lipidach błonowych, podczas gdy glony, organizmy pokrewne algom i niektóre grzyby, gromadzą znaczne ilości kwasów PUFA we frakcji triacylogliceroli. Zatem, cząsteczki kwasu nukleinowego, wyizolowane ze szczepów, które także gromadzą kwasy PUFA we frakcjach triacylogliceroli są szczególnie stosowane do modyfikowania systemów produkcji lipidu i PUFA w gospodarzu, w szczególności w mikroorganizmach, takich jak wspomniane powyżej mikroorganizmy i w roślinach takich jak rośliny oleiste, przykładowo rzepak oleisty, rzepak, len, soja, słonecznik, ogórecznik, rącznik, palma oleista, szafran łąkowy (Carthamus tinctorius), kokos, orzech ziemny lub ziarno kokosowe. Ponadto, kwasy nukleinowe z mikroorganizmów gromadzących triacyloglicerol można stosować do identyfikowania takich sekwencji DNA i enzymów z innych gatunków, które umożliwią modyfikowanie biosyntezy cząsteczek prekursorowych PUFA w organizmach, o których mowa. Mikroorganizmami, które gromadzą kwasy PUFA takie jak ARA, EPA lub DHA w triacyloglicerolach są, w szczególności, mikroorganizmy takie jak, Crypthecodinium cohnii i Thraustochytrium sp. Thraustochytria są także blisko spokrewnione w znaczeniu filogenetycznym ze szczepami Schizochytria. Mimo tego, że organizmy te nie są blisko spokrewnione z mchami takimi jak Physcomitrella, obserwuje się do takiego stopnia podobień stwa sekwencji, na poziomie sekwencji DNA, a w szczególności na poziomie polipeptydu, że cząsteczki DNA można identyfikować, izolować i funkcjonalnie charakteryzować dzięki doświadczeniom z hybrydyzacją heterologiczną, przyrównaniom sekwencji i doświadczeniom wykorzystującym reakcję łańcuchową polimerazy, nawet dla organizmów, które są daleko spokrewnione w znaczeniu ewolucyjnym. W szczególności można znaleźć sekwencje najwyższej zgodności, które są stosowne do heterologicznego przeszukiwania lub do funkcjonalnej komplementacji i przewidywania funkcji genu w trzecim gatunku. Zdolność do identyfikowania tych funkcji, przykładowo, do przewidywania specyficzności substratowej enzymów może zatem posiadać istotne znaczenie. Ponadto, takie cząsteczki kwasów nukleinowych mogą działać jako sekwencje odniesienia przy mapowaniu pokrewnych genomów lub do uzyskiwania starterów dla PCR. Nowe cząsteczki kwasów nukleinowych kodują białka nazwane, w niniejszym kontekście, elongazami specyficznymi dla PUFA (= białka PSE lub w liczbie pojedynczej białko PSE). Takie białka PSE mogą, przykładowo, nadawać funkcję, która jest związana z metabolizmem (przykładowo, z biosyntezą lub rozkładem) związków wymaganych do syntezy lipidu lub kwasu tłuszczowego, takich jak kwasy PUFA, lub które uczestniczą w transporcie przez błonę jednego lub kilku składników lipidu/kwasu tłuszczowego, zarówno do jak i na zewnątrz komórki.

To nowe zgłoszenie przedstawia izolację takich nowych genów elongazy bardziej szczegółowo. Po raz pierwszy wyizolowaliśmy geny elongazy, które są stosowne do produkcji wielonienasyconych kwasów tłuszczowych o długich łańcuchach, korzystnie posiadających ponad osiemnaście lub dwadzieścia atomów węgla w szkielecie węglowym kwasu tłuszczowego i/lub przynajmniej dwa podwójne wiązania w łańcuchu węglowym, pochodzących z typowych organizmów, które posiadają wysoką ilość kwasów PUFA we frakcji triacylogliceroli. Oznacza to, w liczbie pojedynczej, gen PSE lub białko PSE, lub, w liczbie mnogiej, geny PSE lub białka PSE. Inne znane zgłoszenia patentowe i publikacje nie ujawniają lub nie prezentują funkcjonalnie aktywnego genu PSE, pomimo tego, że istnieją różne znane zgłoszenia patentowe prezentujące wydłużanie nasyconych kwasów tłuszczowych o krótkiej lub średniej długości łańcucha (WO 98/46776 i patent USA 5475099) lub wydłużanie albo produkcję kwasów tłuszczowych o długich łańcuchach, które jednak nie posiadają więcej niż jedno podwójne wiązanie lub prowadzą do powstania estrów woskowych kwasów tłuszczowych o długich łańcuchach (patrz WO 98/54954, WO 96/13582, WO 95/15387). Prezentowany tu wynalazek opisuje izolację nowych elongaz o nowych właściwościach. Wychodząc od sekwencji przedstawionej w SEKW. NR ID.:1, możliwe było znalezienie dalszych kwasów nukleinowych, kodujących elongazy, które wydłużają nienasycone kwasy tłuszczowe.

W WO 99/64615, WO 98/46763, WO 98/46764 i WO 98/46765 opisano produkcję kwasów PUFA w roślinach transgenicznych i przedstawiono klonowanie oraz funkcjonalną ekspresję odpowiadających aktywności desaturazy, w szczególności z grzybów, lecz nie pokazują genu kodującego PSE

PL 207 026 B1 ani funkcjonalnej aktywności PSE. Ekspresja aktywności desaturazy prowadzi do przesunięcia w spektrum kwasów tłuszczowych w transgenicznych roślinach, lecz nie obserwuje się podniesienia zawartości nienasyconych kwasów tłuszczowych. Przedstawiona została produkcja kwasu trienowego o ł a ń cuchu wę glowym C18 i zastrzeż ona w odniesieniu do kwasu gamma-linolenowego, lecz do tej pory nie przedstawiano produkcji wielonienasyconych kwasów tłuszczowych o bardzo długim łańcuchu (z łańcuchem węglowym C20 lub dłuższym oraz kwasów trienowych i typów o wyższym stopniu nienasycenia).

Przedmiotem niniejszego wynalazku jest wyizolowany kwas nukleinowy zawierający sekwencję nukleotydową kodującą polipeptyd, który wydłuża kwasy tłuszczowe C16, C18 lub C20, z co najmniej dwoma wiązaniami podwójnymi w kwasie tłuszczowym, o co najmniej dwa atomy węgla, przy czym sekwencja nukleotydową jest wybrana z grupy złożonej z:

(a) sekwencji kwasu nukleinowego nr 1, 3 lub 9, (b) sekwencji kwasu nukleinowego, która zgodnie ze zdegenerowanym kodem genetycznym pochodzi z sekwencji nr 1, 3 lub 9 (c) pochodnej sekwencji kwasu nukleinowego nr 1, 3 lub 9, która koduje polipeptydy o sekwencji aminokwasowej nr 2, 4 lub 10 oraz która wykazuje co najmniej 70% identyczności na poziomie sekwencji aminokwasowej, i która wykazuje działanie polegające na wydłużaniu kwasów tłuszczowych C16, C18 lub C20, z co najmniej dwoma wiązaniami podwójnymi w kwasie tłuszczowym, o co najmniej dwa atomy węgla.

W jednym z korzystnych wariantów realizacji wyizolowanego kwasu nukleinowego według wynalazku sekwencja nukleotydowa pochodzi z rośliny, glonu lub grzyba. W innym korzystnym przypadku sekwencja nukleotydowa pochodzi z Physcomitrella lub Thraustochytrium.

Przedmiotem wynalazku jest również konstrukt genowy zawierający wyizolowany kwas nukleinowy według wynalazku, przy czym kwas nukleinowy jest funkcjonalnie połączony z jednym lub większą liczbą sygnałów regulacyjnych. Ekspresja genu jest korzystnie wzmocniona sygnałami regulacyjnymi.

Kolejnym przedmiotem wynalazku jest konstrukt genowy zawierający wyizolowany kwas nukleinowy według wynalazku albo konstrukt genowy określony powyżej i co najmniej jeden dodatkowy kwas nukleinowy kodujący gen biosyntezy kwasu tłuszczowego, wybrany z grupy obejmującej Δ19-,

Δ17-, Δ15-, Δ12-, Δ9-, Δ8-, Δ6-, Δ5-, Δ4-desaturazy, różne hydrolazy, Δ^-acetylenazę, tioesterazy acylo-ACP, syntazy β-ketoacylo-ACP lub reduktazy β-ketoacylo-ACP.

Przedmiotem wynalazku jest taże sekwencja aminokwasowa kodowana przez wyizolowaną sekwencję kwasu nukleinowego według wynalazku lub przez konstrukt genowy według wynalazku.

Dalszym przedmiotem wynalazku jest wektor zawierający kwas nukleinowy według wynalazku lub konstrukt genowy według wynalazku.

Następnym przedmiotem wynalazku jest roślina transgeniczna lub mikroorganizm transgeniczny zawierający co najmniej jeden kwas nukleinowy według wynalazku, konstrukt genowy według wynalazku lub wektor według wynalazku.

Przedmiotem wynalazku jest również przeciwciało specyficznie wiążące się z polipeptydem kodowanym przez jeden z kwasów nukleinowych według wynalazku.

Ponadto, przedmiotem wynalazku jest cząsteczka antysensownego kwasu nukleinowego zawierająca sekwencję komplementarną z kwasem nukleinowym według wynalazku.

Przedmiotem wynalazku jest wreszcie sposób wytwarzania wielonienasyconych kwasów tłuszczowych (PUFA), charakteryzujący się tym, że obejmuje hodowanie rośliny transgenicznej lub mikroorganizmu transgenicznego, zawierającego kwas nukleinowy według wynalazku, konstrukt genowy według wynalazku lub wektor według wynalazku, kodujący polipeptyd, który w warunkach wytwarzania kwasów PUFA w organizmie wydłuża kwasy tłuszczowe C16, C18 lub C20, z co najmniej dwoma wiązaniami podwójnymi w kwasie tłuszczowym, o co najmniej dwa atomy węgla. W jednym z korzystnych wariantów realizacji sposobu według wynalazku otrzymane kwasy PUFA są cząsteczkami kwasów tłuszczowych C18, C20 lub C22, z co najmniej dwoma wiązaniami podwójnymi w cząsteczce. W innym korzystnym wariancie realizacji sposobu według wynalazku cząsteczki kwasów tłuszczowych C18, C20 lub C22 wyizolowuje się z rośliny transgenicznej lub mikroorganizmu transgenicznego w postaci oleju, lipidu lub wolnego kwasu tłuszczowego. W dalszym korzystnym przypadku kwas tłuszczowy C16, C18 lub C20 jest kwasem tłuszczowym z trzema wiązaniami podwójnymi w cząsteczce.

W celu wytworzenia kwasów PUFA o długich łańcuchach, wielonienasycone kwasy tłuszczowe C16 lub C18 muszą być wydłużone o co najmniej dwa atomy węgla, dzięki enzymatycznej aktywności

PL 207 026 B1 elongazy. Sekwencja kwasu nukleinowego SEKW. NR ID.:1 według wynalazku, obejmuje pierwszą elongazę roślinną, która jest zdolna do wydłużania kwasów tłuszczowych C16 lub C18 z co najmniej dwoma wiązaniami podwójnymi o przynajmniej dwa atomy węgla. Po jednym cyklu wydłużania, aktywność enzymatyczna prowadzi do kwasów tłuszczowych C20, a po dwóch, trzech i czterech cyklach wydłużania do kwasów tłuszczowych C22, C24 lub C26. Kwasy PUFA o dłuższych łańcuchach można także syntetyzować za pomocą innych ujawnionych innych elongaz (SEKW. NR ID.:3, SEKW. NR ID.:9). W celu podniesienia zawartości kwasów PUFA w nowych procesach wytwarzania PUFA, można je wykorzystać pojedynczo lub razem czy, przykładowo, dodatkowo do elongazy PUFA z mchu Physcomitrella patens (SEKW. NR ID.:1). Aktywność elongaz według wynalazku, korzystnie prowadzi do powstania kwasów tłuszczowych C20 z przynajmniej dwoma wiązaniami podwójnymi w cząsteczce, korzystnie trzema lub czterema wiązaniami podwójnymi, szczególnie korzystnie trzema wiązaniami podwójnymi w cząsteczce i/lub kwasów tłuszczowych C22 z przynajmniej dwoma wiązaniami podwójnymi w cząsteczce, korzystnie czterema, pięcioma lub sześcioma wiązaniami podwójnymi, szczególnie korzystnie pięcioma lub sześcioma wiązaniami podwójnymi w cząsteczce. Po przeprowadzeniu wydłużania za pomocą enzymu według wynalazku, można przeprowadzić dodatkowy etap wprowadzania wiązań nienasyconych (desaturacji) w celu uzyskania wysoko nienasyconych kwasów tłuszczowych. Produkty aktywności elongazy i procesu dodatkowej desaturacji może zatem prowadzić do powstania korzystnych kwasów PUFA o wyższym stopniu nienasycenia, jak kwas dokozadienowy, kwas arachidonowy, kwas ffi6-eikozatrienodihomo-Y-linolenowy, kwas eikozapentaenowy, kwas (O3-eikozatrienowy, kwas (n3-eikozatetraenowy, kwas dokozapentaenowy lub kwas dokozaheksaenowy. Substratami dla aktywności enzynnatycznej według wynalazku są, przykładowo, kwas taksolowy; kwas 7,10,13-heksadekatrienowy, kwas 6,9-oktadekadienowy, kwas linolowy, kwas linolenowy, kwas α- lub γ-linolenowy lub kwas stearydonowy a także kwas arachidonowy, kwas eikozatetraenowy, kwas dokozapentaenowy, kwas eikozapentaenowy. Korzystnymi substratami są kwas linolowy, kwas γ-linolenowy i/lub kwas α-linolenowy, a także kwas arachidonowy, kwas eikozatetraenowy, kwas dokozapentaenowy i kwas eikozapentaenowy. W szczególności korzystne są kwas arachidonowy, kwas dokozapentaenowy i kwas eikozapentaenowy. Kwasy tłuszczowe C16 lub C18 z co najmniej dwoma wiązaniami podwójnymi można wydłużać za pomocą aktywności enzymatycznej według wynalazku w formie wolnego kwasu tłuszczowego lub w formie estrów, takich jak fosfolipidy, glikolipidy, sfingolipidy, fosfoglicerydy, monoacyloglicerol, diacyloglicerol lub triacyloglicerol. Szczególnie istotny dla pożywienia ludzkiego jest sprzężony kwas linolowy CLA. CLA powinien być rozumiany w znaczeniu, w szczególności, kwasu tłuszczowego takiego jak C18:2^9cis,11trans lub izomeru C18:2^{10trans,12cis}, który może być desaturowany lub wydłużany po pobraniu, w organizmie, dzięki ludzkim systemom enzymatycznym i może wpływać na polepszenie stanu zdrowia. Elongazy według wynalazku pozwalają także na wydłużanie takich sprzężonych kwasów tłuszczowych, z co najmniej dwoma wiązaniami podwójnymi w cząsteczce i tym samym powodują, że takie kwasy tłuszczowe polepszające stan zdrowia, nadają się do ludzkiego pożywienia. Innymi przykładami skoniugowanych kwasów tłuszczowych są kwas alfa-parynarowy (ang. alfa-parinaric acid), kwas eleostearynowy i kwas kalendulowy.

Dysponując wektorami do stosowania w roślinach i w transformacji roślin, takimi jak opublikowane i cytowane w: Plant Molecular Biology i Biotechnology (CRC Press, Boca Raton, Florida), rozdz. 6/7, str. 71-119 (1993); F.F. White, Vectors for Gene Transfer in Higher Plants; w: Transgenic Plants, Vol. 1, Engineering and Utilization, Wyd.: Kung i R. Wu, Academic Press, 1993, 15-38; B. Jenes i wsp., Techniques for Gene Transfer, w: Transgenic Plants, Vol. 1, Engineering and Utilization, Wyd.: Kung i R. Wu, Academic Press (1993), 128-143; Potrykus, Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Molec. Biol. 42 (1991), 205-225)), kwasy nukleinowe według wynalazku można stosować do modyfikacji rekombinacyjnej szerokiego spektrum roślin, w wyniku czego staną się one lepszymi, bardziej wydajnymi lub zmodyfikowanymi producentami jednego lub większej liczby produktów pochodnych lipidów, takich jak kwasy PUFA. Ta ulepszona produkcja czy wydajność produkcyjna produktu pochodzącego od lipidów, takiego jak kwasy PUFA, może być wywołana bezpośrednim wpływem manipulacji lub pośrednim wpływem tej manipulacji.

Istnieje wiele mechanizmów, poprzez które modyfikacja białka PSE według wynalazku, może bezpośrednio zaburzać ilość, produkcję i/lub wydajność produkcyjną wysokowartościowego związku chemicznego z rośliny oleistej lub z mikroorganizmu, dzięki zmodyfikowanemu białku. Liczba czy aktywność białka PSE lub genu PSE może wzrastać tak, że wytwarzane są większe ilości tych składników de novo, ponieważ organizmy te nie posiadały aktywności i zdolności biosyntezy, przed wprowa6

PL 207 026 B1 dzeniem genu o którym mowa. Także w tym kontekście korzystne może być zastosowanie różnych, zróżnicowanych sekwencji, tzn. sekwencji, które różnią się na poziomie sekwencji DNA.

Wprowadzenie genu PSE lub wielu genów PSE do organizmu lub do komórki może nie tylko zwiększyć przepływ biosyntezy do produktu końcowego, ale także podnieść, lub stworzyć de novo, odpowiedni związek triacyloglicerolu. Podobnie, można podnieść liczbę lub aktywność innych genów, które są wymagane w imporcie składników pokarmowych, potrzebnych do biosyntezy jednego lub kilku wysokowartościowych związków chemicznych (przykładowo kwasów tłuszczowych, polarnych i obojętnych lipidów) tak, że stężenie tych prekursorów, kofaktorów lub produktów pośrednich wzrasta w komórkach lub w przedział ach magazynują cych, co tym samym dodatkowo zwię ksza zdolność komórek do wytwarzania kwasów PUFA, jak zostało opisane poniżej. Kwasy tłuszczowe i lipidy są jako takie pożądanymi, wysokowartościowymi związkami chemicznymi; optymalizacja aktywności czy wzrost liczby jednego lub kilku białek PSE, które są wymagane w biosyntezie tych związków lub zniszczenie aktywności jednego lub kilku białek PSE, które są wymagane w rozkładzie tych związków, może przyczynić się do wzrostu ilości, produkcji i/lub wydajności produkcyjnej cząsteczek kwasu tłuszczowego i cząsteczek lipidów z roślin lub mikroorganizmów.

Mutageneza genu PSE według wynalazku może także dawać białko PSE ze zmodyfikowanymi aktywnościami, które bezpośrednio lub pośrednio wpływają na produkcję jednego lub więcej pożądanych wysokowartościowych związków chemicznych. Przykładowo, liczbę lub aktywność genu PSE według wynalazku można zwiększyć tak, że normalne odpady metaboliczne lub produkty uboczne komórki (których ilość może być podwyższona na skutek nadprodukcji pożądanego wysokowartościowego związku chemicznego) są eksportowane w wydajny sposób zanim zniszczą inne cząsteczki lub procesy w komórce (co mogłoby zredukować żywotność komórki) lub mogłyby oddziaływać ze szlakami biosyntetycznymi wysokowartościowego związku chemicznego (tym samym obniżając ilości, produkcję i/lub wydajność produkcyjną pożądanego wysokowartościowego związku chemicznego). Ponadto, stosunkowo duże ilości wewnątrzkomórkowego pożądanego wysokowartościowego związku chemicznego, same w sobie, mogą być toksyczne dla komórki lub mogą oddziaływać z mechanizmami enzymatycznego sprzężenia zwrotnego, takimi jak regulacja allosteryczna, przykładowo, mogą zwiększać przemieszczanie PUFA do frakcji triacyloglicerolu na skutek podniesionej aktywności lub liczby innych enzymów, lub enzymów detoksyfikujących szlak PUFA następujący poniżej. Można podwyższyć żywotność komórek nasiona, co z kolei prowadzi do lepszego rozwoju komórek w hodowli lub nasion, które produkują pożądany wysokowartościowy związek chemiczny. Alternatywnie, genem PSE według wynalazku można manipulować w taki sposób, że produkowane są odpowiednie ilości różnych cząsteczek lipidów i cząsteczek kwasów tłuszczowych. Może to mieć decydujący wpływ na skład lipidowy błony komórkowej i wytwarzanie nowych olejów, dodatkowo do występujących kwasów PUFA, które są syntetyzowane de novo. Ponieważ każdy typ lipidu posiada różne właściwości fizyczne, zmiana w składzie lipidowym błony może zasadniczo modyfikować płynność błony. Zmiany w pł ynnoś ci bł ony mogą mieć wpł yw na transport czą steczek przez bł onę i na integralność komórki, co może mieć decydujący wpływ na produkcję wysokowartościowych związków chemicznych. Ponadto w roś linach, zmiany te mogą także mieć wpływ na inne cechy, takie jak tolerancja na abiotyczne i biotyczne warunki stresu.

Tolerancja na stres biotyczny i abiotyczny jest ogólną cechą pożądaną do wprowadzenia do szerokiego spektrum roślin takich jak kukurydza, pszenica, ryż, żyto, owies, pszenżyto, jęczmień, soja, orzech ziemny, bawełna, rzepak oleisty i rzepak, kasawa, pieprz, słonecznik i aksamitka, rośliny rodzaju Solanaceae jak ziemniak, tytoń, oberżyna i pomidor, Vicia sp., groch, lucerna, rośliny krzewiaste (kawa, kakao, herbata), Salix sp., drzewa (palma oleista, kokos) oraz trawy bylinowe i rośliny spożywcze. Jako dodatkowe wykonanie według wynalazku takie zboża są także korzystnymi roślinami docelowymi dla inżynierii genetycznej. Szczególnie korzystnymi roślinami, według wynalazku, są rośliny oleiste takie jak soja, orzech ziemny, rzepak oleisty, rzepak, słonecznik, szafran łąkowy, drzewa (palma oleista, kokos) lub zboża takie jak kukurydza, pszenica, żyto, owies, pszenżyto, ryż, jęczmień, lucerna lub rośliny krzewiaste (kawa, kakao, herbata).

Zgodnie z tym, jak wspomniano powyżej jeden aspekt wynalazku dotyczy cząsteczek wyizolowanego kwasu nukleinowego (przykładowo cząsteczek cDNA), obejmujących sekwencje nukleotydowe, które kodują białko PSE lub kilka białek PSE lub ich biologicznie aktywne części, lub fragmenty kwasu nukleinowego, które są odpowiednie jako startery lub też sondy hybrydyzacyjne dla wykrywania lub amplifikacji kwasów nukleinowych kodujących PSE (przykładowo DNA lub mRNA). W szczególnie korzystnym wykonaniu, cząsteczka kwasu nukleinowego obejmuje jedną z sekwencji nukleotyPL 207 026 B1 dowych przedstawionych na SEKW. NR ID.:1, SEKW. NR ID.:3, SEKW. NR ID.:5, SEKW. NR ID.:7, SEKW. NR ID.:9 i SEKW. NR ID.:11 lub region kodujący albo komplementarny do jednej z tych sekwencji nukleotydowych. W innych szczególnie korzystnych wykonaniach, cząsteczka wyizolowanego kwasu nukleinowego według wynalazku obejmuje sekwencję nukleotydową, która hybrydyzuje z sekwencją nukleotydową przedstawioną na sekwencji SEKW. NR ID.:1, SEKW. NR ID.:3, SEKW. NR ID.:5, SEKW. NR ID.:7, SEKW. NR ID.:9 i SEKW. NR ID.11, lub jej część lub sekwencję nukleotydową, która ma z nią przynajmniej około 50%, korzystnie przynajmniej około 60%, korzystniej przynajmniej około 70%, 80% lub 90% i jeszcze korzystniej przynajmniej około 95%, 96%, 97%, 98%, 99% lub więcej homologii. W innych korzystnych wykonaniach, cząsteczka wyizolowanego kwasu nukleinowego koduje jedną z sekwencji aminokwasowych przedstawionych na sekwencji SEKW. NR ID.:2, SEKW. NR ID.:4, SEKW. NR ID.:6, SEKW. NR ID.:8, SEKW. NR ID.:10 i SEKW. NR ID.:12. Korzystnie, preferowany gen według wynalazku ma także co najmniej jedną z opisanych tu aktywności PSE.

W dalszym wykonaniu, czą steczka wyizolowanego kwasu nukleinowego koduje biał ko lub jego część, białko lub jego część obejmujące sekwencję aminokwasową, która posiada wystarczającą homologię z sekwencją aminokwasową z sekwencji SEKW. NR ID.:2, SEKW. NR ID.:4, SEKW. NR ID.:6, SEKW. NR ID.:8, SEKW. NR ID.:10 i SEKW. NR ID.:12, tak, że białko lub jego część zachowuje aktywność PSE. Korzystnie, białko lub jego część, które jest kodowane przez cząsteczkę kwasu nukleinowego zachowuje zdolność uczestniczenia w metabolizmie związków wymaganych do syntezy błon komórkowych roślin, lub w transporcie cząsteczek przez te błony. W jednym z wykonań, białko kodowane przez cząsteczkę kwasu nukleinowego ma co najmniej około 50%, korzystnie co najmniej około 60% i korzystniej co najmniej około 70%, 80% lub 90% i najkorzystniej co najmniej około 95%, 96%, 97%, 98%, 99% lub więcej homologii z sekwencją aminokwasową z sekwencji SEKW. NR ID.:2, SEKW. NR ID.:4, SEKW. NR ID.:6, SEKW. NR ID.:8, SEKW. NR ID.:10 i SEKW. NR ID.:12. W dalszym korzystnym wykonaniu, białko to jest białkiem o pełnej długości, fragmentami, które są zasadniczo homologiczne z pełną sekwencją aminokwasową z SEKW. NR ID.:2, SEKW. NR ID.:4, SEKW. NR ID.:6, SEKW. NR ID.:8, SEKW. NR ID.:10 i SEKW. NR ID.:12, (która odpowiada otwartej ramce odczytu z SEKW. NR ID.:1, SEKW. NR ID.:3, SEKW. NR ID.:5, SEKW. NR ID.:7, SEKW. NR ID.:9 i SEKW. NR ID.:11) i która może być wyizolowana w swojej pełnej długości sposobami i za pomocą doświadczeń, które są znane specjalistom.

W innym korzystnym wykonaniu, cząsteczka wyizolowanego kwasu nukleinowego pochodzi z Phytophthora infestans, Physcomitrella patens, Crypthecodinium cohnii lub Thraustochytrium i koduje białko (przykładowo białko fuzyjne PSE) obejmujące biologicznie aktywną domenę, która posiada co najmniej około 50% lub więcej homologii z sekwencją aminokwasową z sekwencji SEKW. NR ID.:2, SEKW. NR ID.:4, SEKW. NR ID.:6, SEKW. NR ID.:8, SEKW. NR ID.:10 i SEKW. NR ID.:12 i zachowuje zdolność uczestniczenia w metabolizmie związków wymaganych do syntezy błon komórkowych roślin lub w transporcie cząsteczek przez te błony lub która posiada co najmniej jedną aktywność elongacyjną prowadzącą do powstania kwasów PUFA takich jak ARA, EPA lub DHA lub ich cząsteczek prekursorowych lub posiada jedną z aktywności wymienionych w Tabeli 1, a także obejmuje heterologiczne sekwencje kwasu nukleinowego, które kodują heterologiczny polipeptyd lub białka regulacyjne.

T a b e l a 1: Profil kwasów tłuszczowych dla pięciu szczepów drożdż y transgenicznych w% moli.

Proporcje kwasu γ-linolenowego dodanego i pobranego uwydatniono poprzez numery wydrukowane pogrubioną czcionką, podkreślono wydłużone produkty, a produkty wydłużonego kwasu γ-linolenowego zaznaczono poprzez numery wydrukowane pogrubioną czcionką (ostatnia linia).

Kwasy tłuszczowe [% molowe]	pYES2	pY2PSE1a	pY2PSE1b	pY2PSE1c	pY2PSE1d
1	2	3	4	5	6
16:0	17,0	17,6	16,4	16,3	17,6
16: 1Δ⁹	28,0	26,8	28,0	27,9	25,1
18:0	6,5	6,0	6,4	5,6	6,1
18: 1Δ⁹	25,9	23,5	27,0	25,2	21,4
18:3Δ^6,9,12	22,6	15,7	13,2	16,4	22,8

PL 207 026 B1 cd. tabeli 1

1	2	3	4	5	6
20:3Δ⁸,¹¹,¹⁴	-	10,3	9,0	8,6	7,1
wydłużanie 18:3Δ^6,9,12	-	39,6	40,5	34,4	23,7

W innym wykonaniu, cząsteczka wyizolowanego kwasu nukleinowego ma długość co najmniej 15 nukleotydów i hybrydyzuje w ostrych warunkach z cząsteczką kwasu nukleinowego obejmującą sekwencję nukleotydową z SEKW. NR ID.:1, SEKW. NR ID.:3, SEKW. NR ID.:5, SEKW. NR ID.:7, SEKW. NR ID.:9 i SEKW. NR ID.:11. Cząsteczka wyizolowanego kwasu nukleinowego korzystnie odpowiada naturalnie występującej cząsteczce kwasu nukleinowego. Bardziej korzystnie, cząsteczka wyizolowanego kwasu nukleinowego koduje białko PSE naturalnie występujące w Crypthecodinium, Phytophthora czy PSE z Thraustochytrium lub jego część aktywną biologicznie.

Dalszy aspekt wynalazku dotyczy wektorów, przykładowo zrekombinowanych wektorów ekspresyjnych, obejmujących co najmniej jedną cząsteczkę nukleotydową według wynalazku oraz komórek gospodarza, do których wprowadzane są te wektory, w szczególności mikroorganizmów, komórek roślinnych, tkanek roślinnych, organów roślinnych lub całych roślin. W jednym wykonaniu, taka komórka gospodarza może gromadzić wysokowartościowe związki chemiczne, w szczególności kwasy PUFA; komórki są zbierane w celu wyizolowania pożądanego związku. Związki (oleje, lipidy, triacyloglicerydy, kwasy tłuszczowe) lub białko PSE można następnie izolować z podłoża lub z komórki gospodarza, które w przypadku roślin są komórkami zawierającymi lub magazynującymi wysokowartościowe związki chemiczne, najkorzystniej są komórkami tkanek magazynujących, takich jak okrywy nasion, bulwy, komórki epidermy oraz komórki nasion.

Jeszcze inny aspekt wynalazku dotyczy - jak wspomniano powyżej - genetycznie zmodyfikowanych roślin, korzystnie roślin oleistych, w szczególności rzepaku, lnu, czy rośliny Physcomitrella patens, do których wprowadzono gen PSE. W jednym wykonaniu, genom rzepaku oleistego, lnu, lub rośliny Physcomitrella patens, został zmodyfikowany poprzez wprowadzenie, jako transgen, cząsteczki kwasu nukleinowego według wynalazku, kodującej sekwencję PSE dzikiego typu, bądź zmodyfikowaną. W innym wykonaniu, zmodyfikowano endogenny gen PSE w genomie organizmów donorowych Physcomitrella patens, Phytophthora infestans, Crypthecodinium czy Thraustochytrium, to znaczy został on funkcjonalnie zniszczony, przykładowo, poprzez rekombinację homologiczną ze zmodyfikowanym genem PSE lub poprzez mutagenezę i wykrycie metodą sekwencjonowania DNA. W korzystnym wykonaniu, korzystny jest organizm roślinny należący do rodzaju Physcomitrella, Ceratodon, Funaria, rzepaku oleistego lub lnu. W korzystnym wykonaniu, jest także stosowany Physcomitrella, rzepak oleisty lub len do produkcji pożądanego związku, takiego jak lipidy lub kwasy tłuszczowe, ze szczególnie korzystnymi kwasami PUFA.

W jeszcze innym korzystnym wykonaniu, dla zademonstrowania funkcji genu elongazy przy użyciu rekombinacji homologicznej na bazie kwasów nukleinowych opisanych w niniejszym wynalazku można stosować mech Physcomitrella patens.

Jeszcze inny, opisany powyżej aspekt wynalazku dotyczy wyizolowanego genu PSE lub jego części, przykładowo jego części aktywnej biologicznie. W korzystnym wykonaniu, wyizolowana PSE lub jej część, może brać udział w metabolizmie związków wymaganych do syntezy błon komórkowych w mikroorganizmie lub komórce roś linnej lub w transporcie czą steczek przez te bł ony. W dalszym korzystnym wykonaniu, wyizolowane białko PSE lub jego część posiada wystarczającą homologię z sekwencją aminokwasową z SEKW. NR ID.:2, SEKW. NR ID.:4, SEKW. NR ID.:6, SEKW. NR ID.:8, SEKW. NR ID.:10 i SEKW. NR ID.:12 tak aby białko to lub jego część zachowywało zdolność uczestniczenia w metabolizmie związków wymaganych do syntezy błon komórkowych w mikroorganizmach lub komórkach roślinnych lub w transporcie cząsteczek przez te błony.

Wynalazek może zostać wykorzystany do dostarczenia preparatu wyizolowanego białka PSE. W korzystnych wykonaniach, gen PSE obejmuje sekwencję aminokwasową z SEKW. NR ID.:2, SEKW. NR ID.:4, SEKW. NR ID.:6, SEKW. NR ID.:8, SEKW. NR ID.:10 i SEKW. NR ID.:12. W dalszym korzystnym wykonaniu możliwe jest zastosowanie wyizolowanego białka o pełnej długości, które jest zasadniczo homologiczne z pełną sekwencją aminokwasową z SEKW. NR ID.:2, SEKW. NR ID.:4, SEKW. NR ID.:6, SEKW. NR ID.:8, SEKW. NR ID.:10 i SEKW. NR ID.:12 (które są kodowane przez otwarte ramki odczytu pokazane w SEKW. NR ID.:1, SEKW. NR ID.:3, SEKW. NR ID.:5, SEKW. NR ID.:7, SEKW. NR ID.:9 i SEKW. NR ID.:11). W dalszym wykonaniu, białko posiada co najmniej około 50%, koPL 207 026 B1 rzystnie co najmniej około 60%, korzystniej co najmniej około 70%, 80% lub 90% i najkorzystniej co najmniej około 95%, 96%, 97%, 98%, 99% lub większą homologię z sekwencją aminokwasową z sekwencji SEKW. NR ID.:2, SEKW. NR ID.:4, SEKW. NR ID.:6, SEKW. NR ID.:8, SEKW. NR ID.:10 i SEKW. NR ID.:12. W innych wykonaniach, wyizolowane białko PSE obejmuje sekwencję aminokwasową, która posiada co najmniej około 50% homologii z jedną z sekwencji aminokwasowych z SEKW. NR ID.:2, SEKW. NR ID.:4, SEKW. NR ID.:6, SEKW. NR ID.:8, SEKW. NR ID.:10 i SEKW. NR ID.:12 i która może brać udział w metabolizmie związków wymaganych do syntezy kwasów tłuszczowych w mikroorganizmie lub w komórce roś linnej, lub w transporcie czą steczek przez ich bł ony, posiada jedną lub więcej aktywności wydłużania PUFA. Wydłużanie to korzystnie dotyczy nienasyconych łańcuchów C16, C18 lub C20 z podwójnymi wiązaniami przynajmniej w dwóch miejscach.

Alternatywnie, wyizolowana PSE może obejmować sekwencję aminokwasową, która jest kodowana przez sekwencję nukleotydową hybrydyzującą z sekwencją nukleotydową z SEKW. NR ID.:1, SEKW. NR ID.:3, SEKW. NR ID.:5, SEKW. NR ID.:7, SEKW. NR ID.:9 i SEKW. NR ID.:11, przykładowo w ostrych warunkach lub posiada z nią, co najmniej około 50%, korzystnie co najmniej około 60%, korzystniej co najmniej około 70%, 80% lub 90% a jeszcze korzystniej co najmniej około 95%, 96%, 97%, 98%, 99% lub więcej homologii. Preferowane formy PSE korzystnie mają również jedną z opisanych tu aktywności PSE.

Polipeptyd PSE lub jego część aktywna biologicznie, może być funkcjonalnie połączony z polipeptydem nie będącym PSE dla utworzenia białka fuzyjnego. W korzystnym wykonaniu, takie białko fuzyjne posiada aktywność, która różni się od tej dla samego białka PSE. W innych korzystnych wykonaniach, takie białko fuzyjne bierze udział w metabolizmie związków wymaganych do syntezy lipidów i kwasów tłuszczowych, kofaktorów i enzymów w mikroorganizmach lub w roślinach, lub w transporcie cząsteczek przez ich błony. W szczególnie korzystnych wykonaniach, wprowadzenie takiego białka fuzyjnego do komórki gospodarza moduluje produkcję pożądanego związku przez komórkę. W korzystnym wykonaniu, takie białka fuzyjne zawierają także aktywności Δ4-, Δ5- lub Δ6-, Δ8-, Δ15-, Δ17lub Δ19-desaturazy, pojedyncze lub w kombinacji.

Inny aspekt wynalazku wspomniany również powyżej dotyczy sposobu produkcji wysokowartościowych związków chemicznych. Sposób ten albo obejmuje hodowanie odpowiedniego mikroorganizmu albo hodowanie komórek roślinnych, tkanek roślinnych, organów roślinnych lub całych roślin, obejmujących sekwencje nukleotydowe według wynalazku z SEKW. NR ID.:1, SEKW. NR ID.:3, SEKW. NR ID.:5, SEKW. NR ID.:7, SEKW. NR ID.:9 i SEKW. NR ID.:11 albo ich homologi, pochodne lub analogi lub konstrukt genowy obejmujący SEKW. NR ID.:1, SEKW. NR ID.:3, SEKW. NR ID.:5, SEKW. NR ID.:7, SEKW. NR ID.:9 i SEKW. NR ID.:11 lub ich homologi, pochodne lub analogi lub wektor, obejmujący te sekwencje, lub konstrukt genowy, który powoduje ekspresję cząsteczki kwasu nukleinowego dla PSE według wynalazku, tak że produkowany jest wysokowartościowy związek chemiczny. W korzystnym wykonaniu, sposób ponadto obejmuje etap uzyskiwania komórki zawierającej taką sekwencję kwasu nukleinowego elongazy według wynalazku, w którym komórka jest transformowana sekwencją kwasu nukleinowego dla elongazy, konstruktem genowym lub wektorem, który powoduje ekspresję cząsteczki kwasu nukleinowego dla PSE według wynalazku. W dalszym korzystnym wykonaniu, sposób obejmuje ponadto etap uzyskiwania wysokowartościowego związku chemicznego z hodowli. W szczególnie korzystnym wykonaniu, komórka należy do rzędu Ciliata (orzęski), do mikroorganizmów takich jak grzyby lub do królestwa roślin, w szczególności do roślin oleistych, w którym mikroorganizmy lub rośliny oleiste są szczególnie korzystne.

Wynalazek znajduje zastosowanie w sposobach modulowania produkcji cząsteczki przez mikroorganizm. Sposoby te obejmują mieszanie komórki z substancją modulującą aktywność PSE lub ekspresję kwasu nukleinowego PSE tak, że aktywność związana z komórką jest zmodyfikowana, w odniesieniu do tej samej aktywności przy braku danej substancji. W korzystnym wykonaniu, szlak metaboliczny lub dwa szlaki metaboliczne komórki dla lipidów i kwasów tłuszczowych, kofaktorów i enzymów jest, lub są modulowane lub modulowany jest transport związków przez ich błony, tak że ulepszona jest produkcja przez mikroorganizm lub wydajność produkcyjna pożądanego wysokowartościowego związku chemicznego. Substancja, która moduluje aktywność PSE, może być substancją stymulującą aktywność PSE bądź ekspresję kwasu nukleinowego dla PSE lub, która może być stosowana jako produkt pośredni w biosyntezie kwasu tłuszczowego. Przykładami takich substancji, które stymulują aktywność PSE czy ekspresję kwasów nukleinowych dla PSE są, między innymi, małe cząsteczki, aktywne PSE i kwasy nukleinowe kodujące PSE, które wprowadzono do komórki. Przykładami

PL 207 026 B1 substancji hamujących aktywność PSE czy ekspresje PSE są, między innymi, małe cząsteczki i/lub cząsteczki antysensownego kwasu nukleinowego dla PSE.

Dalszy aspekt wynalazku wykorzystania wynalazku dotyczy sposobów modulowania ilości pożądanego związku z komórki, które obejmują wprowadzenie, do komórki, genu PSE dzikiego typu lub zmutowanego, który albo jest utrzymywany w oddzielnym plazmidzie albo jest zintegrowany z genomem komórki gospodarza. W przypadku integracji z genomem, integracja może być losowa lub zachodzi dzięki rekombinacji, w której natywny gen jest wymieniany przez wprowadzaną kopię, zatem moduluje produkcję pożądanego związku przez komórkę, lub poprzez zastosowanie genu w pozycji trans tak, że gen jest funkcjonalnie połączony z funkcjonalną jednostką ekspresyjną, obejmującą co najmniej jedną sekwencję, która zapewnia ekspresję genu i co najmniej jedną sekwencję, która zapewnia poliadenylację funkcjonalnie transkrybowanego genu.

W korzystnym wykonaniu, plony są zmodyfikowane. W dalszym wykonaniu, aby podnieść ilość pożądanego związku, możliwe jest zredukowanie niepożądanch związków, które mają negatywny wpływ. W szczególnie korzystnym wykonaniu, pożądany wysokowartościowy związek chemiczny jest lipidem lub kwasem tłuszczowym, kofaktorem czy enzymem. W szczególnie korzystnym wykonaniu, związek taki jest wielonienasyconym kwasem tłuszczowym. Bardziej korzystnie gdy jest on wyselekcjonowany spośród kwasu arachidonowego (= ARA), kwasu eikozapentanowego (= EPA) czy kwasu dokozaheksanowego (= DHA).

Jak wspomniano powyżej niniejszy wynalazek dostarcza kwasy nukleinowe dla PSE i cząsteczki białkowe PSE, które biorą udział w metabolizmie lipidów i kwasów tłuszczowych, kofaktory PUFA i enzymy z mchu Physcomitrella patens, Phytophthora infestans, Crypthecodinium czy Traustochytrium lub, które biorą udział w transporcie związków lipofilowych przez błony. Związki według wynalazku można stosować do modulowania produkcji wysokowartościowych związków chemicznych z organizmów, przykładowo, mikroorganizmów takich jak orzęski, grzyby, drożdże, bakterie, glony i/lub rośliny jak kukurydza, pszenica, żyto, owies, pszenżyto, ryż, jęczmień, soja, orzech ziemny, bawełna, Brassica sp. jak rzepak oleisty, rzepak i rzepik, pieprz, słonecznik, ogórecznik, wiesiołek dwuletni i aksamitka, rośliny rodzaju Solanaceae jak ziemniak, tytoń, oberżyna i pomidor, Vicia sp., groch, lucerna, kasawa, rośliny krzewiaste (kawa, kakao, herbata), Salix sp., drzewa (palma oleista, kokos) oraz trawy bylinowe i rośliny spożywcze majac bezpośredni wpływ (przykładowo kiedy nadprodukcja czy optymalizacja biosyntezy białka ma bezpośredni wpływ na ilość, produkcję i/lub wydajność produkcyjną kwasu tłuszczowego ze zmodyfikowanych organizmów) lub wpływają pośrednio gdy mimo wszystko prowadzi to do podniesienia ilości, produkcji i/lub wydajności produkcyjnej pożądanego związku lub obniżenia niepożądanych związków (przykładowo, kiedy modulacja metabolizmu lipidu i kwasu tłuszczowego, kofaktora i enzymu prowadzi do zmian ilości, produkcji i/lub wydajności produkcyjnej lub prowadzi do zmian w kompozycji pożądanych związków w komórkach, co z kolei może wpływać na produkcję jednego lub kilku wysokowartościowych związków chemicznych). Bardziej szczegółowo aspekty wynalazku zilustrowano poniżej.

I. Wysokowartościowe związki chemiczne i kwasy PUFA

Termin wysokowartościowe związki chemiczne jest znany specjalistom i obejmuje cząsteczki, które zostały wytworzone przez organizm i są używane w różnych gałęziach przemysłu takich jak, przykładowo lecz nie wyłącznie, przemysł farmaceutyczny, przemysł rolny, przemysł spożywczy czy przemysł kosmetyczny. Związki te obejmują lipidy, kwasy tłuszczowe, kofaktory oraz enzymy i im podobne (jak opisano, przykładowo, w Kuninaka, A. (1996) Nucleotides and related compounds, str. 561-612, w Biotechnology Vol. 6, Rehm i wsp., Wyd.: VCH Weinheim i cytowane tam referencje), lipidy, nasycone i nienasycone kwasy tłuszczowe (przykładowo kwas arachidonowy), witaminy i kofaktory (jak opisano w Ullmann's Encyclopedia of Industrial Chemistry, Tom A27, Vitamins, str. 443-613 (1996): VCH Weinheim, i cytowane tam referencje oraz Ong, A.S., Niki, E., & Packer, L. (1995) Nutrition, Lipids, Health and Disease Proceedings of the UNESCO/Confederation of Scientific and Technological Associations in Malaysia and the Society for Free Radical Research - Asia, która odbyła się we wrześniu 1-3, 1994 w Penang, Malaysia, AOCS Press (1995)), enzymy i wszystkie inne związki opisane przez Gutcho (1983) w Chemicals by Fermentation, Noyes Data Corporation, ISBN: 0818805086 i cytowanych tam referencjach. Metabolizm i użycie określonych wysokowartościowych związków chemicznych zilustrowano poniżej bardziej szczegółowo.

Kombinacja różnych cząsteczek prekursorowych i enzymów biosyntetycznych prowadzi do produkcji różnych cząsteczek kwasów tłuszczowych, posiadających decydujący wpływ na kompozycję

PL 207 026 B1 błony. Można przypuszczać, że kwasy PUFA są nie tylko wprowadzane do triacyloglicerolu lecz także do lipidów błonowych.

Synteza błony jest dobrze scharakteryzowanym procesem, w którym wymagany jest szereg związków, łącznie z lipidami jako częścią błony dwuwarstwowej. Produkcja nowych kwasów tłuszczowych takich jak kwasy PUFA, może zatem nadawać nowe właściwości błonom komórkowym czy organizmowi.

Błony komórkowe pełnią wielorakie funkcje. Po pierwsze i przede wszystkim, błona wytycza granice pomiędzy zawartością komórki a środowiskiem, zapewniając tym samym integralność komórki. Błony mogą także działać jako bariery uniemożliwiające wpływanie groźnych lub niepożądanych związków lub wypływanie pożądanych związków.

Bardziej szczegółowe opisy dotyczące funkcji błon i mechanizmów ich działania, patrz w Bamberg, E., i wsp. (1993) Charge transport of ion pumps on lipid bilayer membranes, Q. Rev. Biophys. 26:1-25; Gennis, R.B. (1989) Pores, Channels and Transporters, w: Biomembranes, Molecular Structure and Function, Springer: Heidelberg, str. 270-322 oraz Nikaido, H. i Saier, H. (1992) Transport proteins in bacteria: common themes in their design. Science 258:936-942 oraz cytowania zawarte w tych odniesieniach.

Syntezę lipidów można podzielić na dwie części: syntezę kwasów tłuszczowych i ich wiązanie z sn-glicerolo-3-fosforanem oraz dodawanie lub modyfikacja polarnej grupy głowy. Zwyk łe lipidy występujące w błonach obejmują fosfolipidy, glikolipidy, sfingolipidy i fosfoglicerydy. Synteza kwasów tłuszczowych rozpoczyna się przekształceniem acetylo-CoA albo do malonylo-CoA przeprowadzanym przez karboksylazę acetylo-CoA lub do acetylo-ACP przeprowadzanym przez transacylazę acetylową. Po reakcji kondensacji te dwie cząsteczki produktu tworzą razem acetoacetylo-ACP, który jest przekształcany poprzez serie reakcji kondensacji, redukcji i dehydratacji dając cząsteczkę nasyconego kwasu tłuszczowego, o pożądanej długości łańcucha. Produkcja nienasyconych kwasów tłuszczowych z tych czą steczek jest katalizowana przez specyficzne desaturazy, albo tlenowo za pomocą tlenu czą steczkowego lub beztlenowo (jak obserwowana synteza kwasu tłuszczowego w mikroorganizmach, patrz F.C. Neidhardt i wsp. (1996) E. coli and Salmonella. ASM Press: Washington, D.C., str. 612-636 and references contained therein; Lengeler i wsp. (Wyd.) (1999) Biology of Procaryotes. Thieme: Stuttgart, New York i zawarte tam referencje oraz Magnuson, K., i wsp. (1993) Microbiological Reviews 57:522-542 i zawarte tam referencje).

Przykładami prekursorów biosyntezy PUFA są kwasy linolowy i linolenowy. Te C18-węglowe kwasy tłuszczowe muszą zostać wydłużone do C20 lub C22 dając kwasy tłuszczowe o typie łańcucha eikozanowym i dokozanowym. Różne desaturazy, takie jak enzymy posiadające aktywność A6-desaturazy, Δ5- i Δ4-desaturazy mogą prowadzić do powstania kwasu arachidonowego, kwasu eikozapentanowego i kwasu dokozaheksanowego oraz różnych innych kwasów PUFA o długich łańcuchach, które można ekstrahować i stosować do różnych celów w zastosowaniach do pokarmu i żywienia, kosmetycznych czy farmaceutycznych.

Dla produkcji kwasów PUFA o długich łańcuchach, wielonienasycone kwasy tłuszczowe C16- lub C18- lub C20- muszą, jak wspomniano powyżej, zostać wydłużone o co najmniej dwa atomy węgla za pomocą enzymatycznej aktywności elongazy. Sekwencje kwasu nukleinowego według wynalazku kodują pierwsze elongazy mikrobowe z typowych producentów zawierających PUFA we frakcji troacyloglicerolu, które to elongazy mogą wydłużać C16-, C18- lub C20 kwasy tłuszczowe z co najmniej dwoma wiązaniami podwójnymi o co najmniej dwa atomy węgla lub które przekształcają je, przykładowo w sposób sekwencyjny po kolei, przez przekształcanie kwasu tłuszczowego C16- lub C18- w kwas tłuszczowy C20- a następnie C20- w C22- lub nawet w kwas tłuszczowy o większej liczbie atomów węgla zawierający jednostki o 2 atomach C. Po cyklu elongacji, taka aktywność enzymatyczna prowadzi do kwasów tłuszczowych C20-, a po dwóch, trzech i czterech cyklach elongacji do kwasów tłuszczowych C22-, C24- lub C26-. Za pomocą elongazy według wynalazku można także syntetyzować dłuższe kwasy PUFA. Aktywność elongaz według wynalazku prowadzi korzystnie do powstania kwasów tłuszczowych C20- i/lub C22-, z co najmniej dwoma wiązaniami podwójnymi w cząsteczce kwasu tłuszczowego, kwasów tłuszczowych C20-, korzystnie z trzema, czterema lub pięcioma wiązaniami podwójnymi, szczególnie korzystnie z trzema wiązaniami podwójnymi, kwasów tłuszczowych C22-, korzystnie z trzema, czterema, pięcioma lub sześcioma wiązaniami podwójnymi, szczególnie korzystnie z pięcioma lub sześcioma wiązaniami podwójnymi w cząsteczce kwasu tłuszczowego. Po elongacji enzymem według wynalazku, można przeprowadzić dalsze etapy desaturacji. Zatem, produkty aktywności elongaz i dalsza możliwa desaturacja prowadzą do powstania korzystnych kwasów PUFA

PL 207 026 B1 o wyższym stopniu desaturacji, takich jak kwas dokozadienowy, kwas arachidonowy, kwas ai6-eikozatrienodihomo-Y-linolenowy, kwas eikozapentaenowy, kwas ffi3-eikozatrienowy, kwas (n3-eikozatetraenowy, kwas dokozapentaenowy czy kwas dokozaheksaenowy. Przykładami substratów dla takiej aktywności enzymatycznej według wynalazku są kwas taksolowy, kwas 7,10,13-heksadekatrienowy, kwas 6,9-oktadekadienowy, kwas linolowy, kwas γ-linolenowy, kwas linolenowy, kwas α-linolenowy, kwas arachidonowy, kwas eikozapentaenowy lub kwas stearydonowy. Korzystnymi substratami są kwas linolowy, kwas γ-linolenowy i/lub kwas α-linolenowy lub kwas arachidonowy, kwas eikozatetraenowy lub kwas eikozapentaenowy. Kwasy tłuszczowe C16- lub C18- lub C20- z co najmniej dwoma wiązaniami podwójnymi w kwasie tłuszczowym można wydłużać za pomocą aktywności enzymatycznej według wynalazku w formie wolnego kwasu tłuszczowego lub w formie estrów, takich jak fosfolipidy, glikolipidy, sfingolipidy, fosfoglicerydy, monoacyloglicerol, diacyloglicerol lub triacyloglicerol.

Ponadto, kwasy tłuszczowe muszą następnie zostać przetransportowane do różnych miejsc i wbudowane do triacyloglicerolowego lipidu magazynującego. Innym ważnym etapem syntezy lipidu jest przeniesienie kwasów tłuszczowych na polarne grupy głowy, przykładowo przez acylotransferazę glicerolowego kwasu tłuszczowego (patrz Frentzen, 1998, Lipid, 100(4-5): 161-166).

Jako publikacje dotyczące biosyntezy roślinnych kwasów tłuszczowych, desaturacji, metabolizmu lipidowego oraz transportu przez błony składników tłuszczowych, beta-oksydacji, modyfikacji kwasów tłuszczowych i kofaktorów magazynowania i składania triacyloglicerolu patrz, łącznie z cytowanymi tam odniesieniami, następujące artykuły: Kinney, 1997, Genetic Engineering, Wyd.: JK Setlow, 19:149-166; Ohirogge i Browse, 1995, Plant Cell 7:957-970; Shanklin i Cahoon, 1998, Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol. 49:611-641; Voelker, 1996, Genetic Engineering, Wyd.: JK Setlow, 18:111-13; Gerhardt, 1992, Prog. Lipid R. 31:397-417; Gϋhnemann-Schafer & KindI, 1995, Biochim. Biophys Acta 1256:181-186; Kunau i wsp., 1995, Prog. Lipid Res. 34:267-342; Stymne i wsp., 1993, w: Biochemistry and Molecular Biology of Membrane and Storage Lipids of Plants, Wyd.: Murata & Somerville, Rockville, American Society of Plant Physiologists, 150-158, Murphy & Ross 1998, Plant Journal. 13(1):1-16.

Witaminy, kofaktory i odżywki, takie jak kwasy PUFA, obejmują grupę cząsteczek których zwierzęta wyższe nie syntetyzują, a zatem muszą je pobierać, lub których zwierzęta wyższe nie syntetyzują same w wystarczającym stopniu i muszą je pobierać dodatkowo, chociaż są one z łatwością syntetyzowane przez inne organizmy takie jak bakterie. Biosynteza takich cząsteczek w organizmach, zdolnych do ich produkcji, jak w bakteriach, została mniej więcej scharakteryzowana (Ullmann's Encyclopedia of Industrial Chemistry, i Vitamins, Tom A27, str. 443-613, VCH Weinheim, 1996; Michal, G. (1999) Biochemical Pathways: An Atlas of Biochemistry and Molecular Biology, John Wiley & Sons; Ong, A.S., Niki, E., & Packer, L. (1995) Nutrition, Lipids, Health and Disease Proceedings of the UNESCO/Confederation of Scientific and Technological Associations in Malaysia and the Society for Free Radical Research Asia, która odbyła się we wrześniu 1-3, 1994 w Penang, Malaysia, AOCS Press, Champaign, IL X, str. 374).

Wspomniane powyżej cząsteczki są albo same cząsteczkami aktywnymi biologicznie albo są prekursorami substancji aktywnych biologicznie, które działają jako nośniki elektronów lub jak produkty pośrednie w wielu szlakach metabolicznych. Poza ich wartością odżywczą, związki te posiadają także znaczącą wartość przemysłową jako barwniki, antyoksydanty i katalizatory czy inne środki pomocnicze dla procesu. (Dla przeglądu struktury, aktywności i zastosowań przemysłowych tych związków, patrz, przykładowo, Ullmann's Encyclopedia of Industrial Chemistry, Vitamins, Tom A27, str. 443-613, VCH Weinheim, 1996). Wielonienasycone kwasy tłuszczowe posiadają różnorodne funkcje i poprawiają zdrowie, przykładowo w chorobie wieńcowej serca, mechanizmów zapalnych, żywienia dziecięcego i im podobnych. Jako publikacje i cytowane tam odniesienia, patrz: Simopoulos, 1999, Am. J. Clin. Nutr. 70 (3-ci Suppl.):550-569, Takahata i wsp., Biosc. Biotechnol. Biochem. 1998, 62(ll):2079-2085, Willich and Winther, 1995, Deutsche Medizinische Wochenschrift 120(7):229.

II. Elementy i procesy dotyczące rozwiązań według wynalazku

Niniejszy wynalazek opiera się, przynajmniej w części, na otrzymaniu nowych cząsteczek określonych tu jako cząsteczki białka PSE, które wywierają wpływ na produkcję błon komórkowych w Physcomitrella patens, Crypthecodinium cohnii, Phytophthora infestans, Thraustochytrium i/lub Ceratodon purpureus oraz, przykładowo, mają wpływ na przemieszczanie się cząsteczek przez te błony. W jednym z wykonań, cząsteczki PSE biorą udział w metabolizmie związków wymaganych do syntezy błon komórkowych w takich organizmach jak mikroorganizmy i rośliny lub pośrednio wpływają na transport cząsteczek przez te błony. W korzystnym wykonaniu, aktywność cząsteczek PSE według wynalazku

PL 207 026 B1 do regulowania produkcji składników transportu przez błonę ma wpływ na produkcję pożądanego wysokowartościowego związku chemicznego przez ten organizm. W szczególnie korzystnym wykonaniu, aktywność cząsteczek PSE według wynalazku jest modulowana tak, że modulowane są ilość, produkcja i/lub wydajność produkcyjna szlaków mikroorganizmów czy roślin, które regulują PSE według wynalazku i zmodyfikowana jest wydajność transportu związków przez błony, co bezpośrednio lub pośrednio moduluje ilość, produkcję i/lub wydajność produkcyjną pożądanego wysokowartościowego związku chemicznego w mikroorganizmach i roślinach.

Termin polipeptyd PSE lub polipeptydy PSE obejmuje białka, które uczestniczą w metabolizmie związków wymaganych do syntezy błon komórkowych w takich organizmach jak mikroorganizmy i rośliny lub w transporcie cząsteczek przez te błony. Przykłady białek PSE ujawnione są w SEKW. NR ID.:1, SEKW. NR ID.:3, SEKW. NR ID.:5, SEKW. NR ID.:7, SEKW. NR ID.:9 i SEKW. NR ID.:11 lub ich homologów, pochodnych czy analogów. Termin sekwencja kwasu nukleinowego dla PSE lub sekwencje kwasu nukleinowego dla PSE obejmuje sekwencje kwasu nukleinowego, które kodują PSE lub jej część, które są regionem kodującym a także, odpowiadające regiony 5' i 3' sekwencji niepodlegających translacji. Przykładami genów PSE są sekwencje pokazane w SEKW. NR ID.:1, SEKW. NR ID.:3, SEKW. NR ID.:5, SEKW. NR ID.:7, SEKW. NR ID.:9 i SEKW. NR ID.:11. Terminy produkcja i produkcyjność są znane specjalistom i obejmują stężenie produktu fermentacji (przykładowo, pożądanego wysokowartościowego związku chemicznego), który jest wytwarzany w określonym okresie czasu i w określonej objętości fermentacyjnej (przykładowo kg produktu na godzinę na litr). Termin wydajność produkcyjna, obejmuje czas potrzebny do uzyskania określonej ilości produktu (przykładowo, czas potrzebny komórce do ustanowienia określonego poziomu wydajności dla wysokowartościowego związku chemicznego. Termin, ilość lub produkt/ilość węgla jest znany specjalistom i obejmuje wydajność z jaką źródło węgla jest przekształcane w produkt (tzn. wysokowartościowy związek chemiczny). Jest on zazwyczaj wyrażany jako, przykładowo, kg produktu na kg źródła węgla. Podniesienie ilości lub produkcji związku, podnosi ilość uzyskiwanych cząsteczek lub stosownych cząsteczek tego związku, uzyskiwanych w specyficznej ilości dla hodowli przez zdefiniowany okres czasu. Terminy biosynteza lub szlak biosyntetyczny są znane specjalistom i obejmują syntezę związku, korzystnie związku organicznego, przez komórkę z produktów pośrednich, przykładowo w wieloetapowym procesie, który podlega silnej regulacji. Terminy katabolizm czy szlak kataboliczny są znane specjalistom i obejmują rozkład związku, korzystnie związku organicznego, przez komórkę do katabolitów (zasadniczo mniejszych lub mniej złożonych cząsteczek), przykładowo w wieloetapowym procesie, który podlega silnej regulacji. Termin metabolizm jest znany specjalistom i obejmuje całość reakcji biochemicznych mających miejsce w organizmie. Metabolizm pewnego związku (przykładowo, metabolizm kwasu tłuszczowego) obejmuje zatem całość szlaków biosyntetycznych, modyfikujących i katabolicznych tego związku w komórce, które są związane z tym związkiem.

W innym wykonaniu, czą steczki PSE wedł ug wynalazku mogą modulować produkcję pożądanej cząsteczki, takiej jak wysokowartościowy związek chemiczny, w mikroorganizmie czy w roślinach. Istnieje seria mechanizmów, dzięki którym modyfikacja PSE według wynalazku może wpływać na ilość, produkcję i/lub wydajność produkcyjną wysokowartościowego związku chemicznego ze szczepu mikroorganizmu czy szczepu rośliny obejmującego zmodyfikowane białko. Ilość lub aktywność PSE uczestniczących w transporcie cząsteczek wysokowartościowego związku chemicznego, do wewnątrz lub z komórki, można podnieść, tak że przez błony transportowane są większe ilości takich związków, z których mogą być one uzyskiwane i przekształ cane nawzajem z wię kszą ł atwoś cią . Ponadto, kwasy tłuszczowe, triacyloglicerole i/lub lipidy są jako takie pożądanymi wysokowartościowymi związkami chemicznymi; optymalizacja aktywności czy wzrost liczby jednej lub kilku PSE według wynalazku, które uczestniczą w biosyntezie tych związków lub oddziaływanie z aktywnością jednego lub kilku białek PSE, które uczestniczą w katabolizmie tych związków może przyczynić się do wzrostu ilości, produkcji i/lub wydajności produkcyjnej cząsteczek kwasu lipidowego i cząsteczek lipidu z organizmów takich jak mikroorganizmy czy rośliny.

Mutageneza genu PSE według wynalazku może także dawać białka PSE ze zmodyfikowanymi aktywnościami, które bezpośrednio lub pośrednio wpływają na produkcję, jednego lub więcej, pożądanych wysokowartościowych związków chemicznych z mikroorganizmów lub roślin. Przykładowo, białka PSE według wynalazku, które uczestniczą w eksporcie odpadów produkcyjnych, mogą wykazywać zwiększoną ilość lub podniesioną wydajność tak, że normalne metaboliczne odpady produkcyjne komórki (których ilość może być podwyższona na skutek nadprodukcji pożądanego wysokowartościowego związku chemicznego) są eksportowane w wydajny sposób, zanim zniszczą one cząsteczki

PL 207 026 B1 w komórce (co mogłoby zredukować żywotność komórki) lub oddziałują ze szlakami biosyntetycznymi wysokowartościowych związków chemicznych (tym samym obniżając ilości, produkcję lub wydajność produkcyjną pożądanego wysokowartościowego związku chemicznego). Stosunkowo duże ilości wewnątrzkomórkowego pożądanego wysokowartościowego związku chemicznego same w sobie mogą ponadto być toksyczne dla komórki, zatem podniesienie aktywności lub liczby transporterów zdolnych do eksportowania tych związków z komórki prowadzi do podniesionej żywotności komórki w hodowli, co z kolei prowadzi do wyższej liczby komórek w hodowli produkujących pożądany, wysokowartościowy związek chemiczny. Białkami PSE według wynalazku można manipulować w taki sposób, że produkowane są odpowiednie ilości różnych cząsteczek lipidów i cząsteczek kwasów tłuszczowych. Może to mieć zasadniczy wpływ na kompozycję lipidową błony komórkowej. Ponieważ każdy typ lipidu ma inne właściwości fizyczne, modyfikacja kompozycji lipidowej błony może znacząco zmodyfikować płynność błony. Modyfikacje płynności błony mogą mieć wpływ na transport cząsteczek przez błonę i na integralność komórki, co mo ż e mie ć zasadniczy wpł yw na produkcję wysokowartoś ciowych zwią zków chemicznych z mikroorganizmów i roślin w hodowli fermentacyjnej na dużą skalę. Błony roślinne nadają specyficzne właściwości takie jak, tolerancja na wysokie i niskie temperatury, sól, suszę i tolerancja w stosunku do patogenów takich jak bakterie i grzyby. Modulowanie składnikami błony może zatem mieć krytyczny wpływ na zdolność roślin do przeżycia we wspomnianych powyżej warunkach stresu. Może to zachodzić poprzez zmiany w kaskadzie przekazywania sygnału lub bezpośrednio poprzez zmodyfikowaną kompozycję błonową (patrz, przykładowo, Chapman, 1998, Trends in Plant Science, 3(11):419-426), kaskady przekazywania sygnału (patrz Wang 1999, Plant Physiology, 120:645-651) lub wpływ na tolerancję niskich temperatur, jak ujawniono w WO 95/18222.

Sekwencje wyizolowanych kwasów nukleinowych, według wynalazku są obecne, przykładowo, w genomie szczepu dostępnego w American Type Culture Collection (ATCC) jako szczep o numerze ATCC26185 (Thraustochytrium), lub, w przypadku Crypthecodinium, przykładowo, dostępnego w Provasoli-Guillard National Center for Culture of Marine Phytoplankton ((CCMP) West Boothbay Harbour, ME, USA) jako hodowla szczepu nr CCMP316. W przypadku Phytophthora infestans, przedstawione cząsteczki kwasu nukleinowego są wyizolowane ze szczepu ATCC 48886.

Sekwencja nukleotydowa cDNA wyizolowanych z Physcomitrella, Crypthecodinium, Phytophthora infestans lub Thraustochytrium oraz przewidywane sekwencje aminokwasowe PSE z Physcomitrella patens przedstawiono w SEKW. NR ID.:1 do SEKW. NR ID.:12. Przeprowadzone analizy komputerowe, które klasyfikują i/lub identyfikują te sekwencje nukleotydowe jako sekwencje, które kodują białka uczestniczące w metabolizmie składników błony komórkowej lub uczestniczące w transporcie składników przez błony komórkowe lub z biosyntezy PUFA. ESTy z bazy danych o nr dostępu PP001019019F, CC001042041R, PI001002014R, TC002034029R, TC002034029R-11 i TC002014093R w bazie danych wynalazcy stanowią sekwencje według wynalazku w SEKW. NR ID.:1, SEKW. NR ID.:3, SEKW. NR ID.:5, SEKW. NR ID.:7, SEKW. NR ID.:9 i SEKW. NR ID.:11. W podobny sposób, częściowe polipeptydy nazwano PP001019019F, CC001042041R, PI001002014R, TC002034029R, TC002034029R-11 i TC002014093R i stanowią sekwencje według wynalazku w SEKW. NR ID.:2, SEKW. NR ID.:4, SEKW. NR ID.:6, SEKW. NR ID.:8, SEKW. NR ID.:10 i SEKW. NR ID.:12 zgodnie z Tabelą 2. Cały fragment wstawki z ESTów TC002034029R zsekwencjonowano i uzyskano SEKW. NR ID.:3, która jest pełną sekwencją TC002034029R. TC002034029R-11 opisuje pełnej długości sekwencję elongazy z Thrausto-chytrium. Nazewnictwo pozostałych klonów jest podobne. Także, do różnych klonów zostały przydzielone nazwy odpowiadających genów. Skróty: Tc = Thraustochytrium, Cc = Crypthecodinium, Pp = Physcomitrella patens, P: Phytophthora infestans.

T a b e l a 2

Nazwa/ Nazwa ESTu	Nazwa genu	Polipeptyd SEKW. NR ID.	Kwas nukleinowy SEKW. NR ID
1	2	3	4
PP001019019F	Pp_PSE1	2	1
TC002034029R	Tc_PSE1	4	3
TC002014093R	Tc_PSE2	6	5

PL 207 026 B1 cd. tabeli 2

1	2	3	4
CC001042041R	Cc_PSE1	8	7
TC002034029R-11	Tc_PSE1_1	10	9
PI001002014R	Pi_PSE1	12	11

Niniejszy wynalazek dotyczy także białek o sekwencji aminokwasowej, która jest zasadniczo homologiczna z sekwencją aminokwasową z SEKW. NR ID.:2, SEKW. NR ID.:4, SEKW. NR ID.:6, SEKW. NR ID.:8, SEKW. NR ID.:10 i SEKW. NR ID.:12. Użyte w niniejszym kontekście, białko o sekwencji aminokwasowej, która jest zasadniczo homologiczna z wybraną sekwencją aminokwasową posiada przynajmniej około 50% homologii z wybraną sekwencją aminokwasową, przykładowo, pełną wybraną sekwencją aminokwasową. Białko o sekwencji aminokwasowej, która jest zasadniczo homologiczna, z wybraną sekwencją aminokwasową, może także posiadać przynajmniej około 50 do 60%, korzystnie przynajmniej około 60 do 70%, bardziej korzystnie przynajmniej około 70 do 80%, 80 do 90% lub 90 do 95% i najkorzystniej przynajmniej około 96%, 97%, 98%, 99% i więcej homologii z wybraną sekwencją aminokwasową.

Białko PSE według wynalazku, lub jego aktywna biologicznie część lub jego fragment może brać udział w metabolizmie związków wymaganych do syntezy błon komórkowych, w mikroorganizmach czy w roślinach lub w transporcie cząsteczek przez te błony, mieć jedną lub więcej aktywności wymaganych do elongacji kwasów PUFA C16- lub C18- lub C20-, dzięki czemu uzyskiwane są kwasy PUFA C20-, C22- lub C24- oraz kwasy PUFA pokrewne.

Różne aspekty wynalazku opisane są bardziej szczegółowo w następującym podrozdziale.

A. Cząsteczki wyizolowanego kwasu nukleinowego

Jedno z wykonań według wynalazku obejmuje wyizolowane kwasy nukleinowe pochodzące z mikroorganizmów produkujących kwasy PUFA i kodujące polipeptydy wydłużające kwasy tłuszczowe C16- lub C18- o co najmniej dwa podwójne wiązania w kwasie tłuszczowym, przez co najmniej dwa atomy węgla lub wydłużające kwasy tłuszczowe C20- o co najmniej dwa podwójne wiązania w kwasie tłuszczowym, przez co najmniej dwa atomy węgla.

Dalsze wykonanie według wynalazku obejmuje wyizolowane kwasy nukleinowe zawierające sekwencje nukleotydowe kodujące polipeptydy wydłużające kwasy tłuszczowe C16- lub C18- lub C20- o co najmniej dwa podwójne wiązania w kwasie tłuszczowym i które wyselekcjonowano z grupy złożonej z:

a) sekwencji kwasów nukleinowych pokazanych na SEKW. NR ID.:1, SEKW. NR ID.:3, SEKW. NR ID.:5, SEKW. NR ID.:7, SEKW. NR ID.:9 i SEKW. NR ID.:11,

b) sekwencji kwasu nukleinowego, która zgodnie z degeneracją kodu genetycznego, pochodzi z jednej z sekwencji pokazanych na SEKW. NR ID.:1, SEKW. NR ID.:3, SEKW. NR ID.:5, SEKW. NR ID.:7, SEKW. NR ID.:9 i SEKW. NR ID.:11 lub

c) pochodnych sekwencji pokazanych na SEKW. NR ID.:1, SEKW. NR ID.:3, SEKW. NR ID.:5, SEKW. NR ID.:7, SEKW. NR ID.:9 i SEKW. NR ID.:11, które kodują polipeptydy o sekwencji aminokwasowej pokazanej na SEKW. NR ID.:2, SEKW. NR ID.:4, SEKW. NR ID.:6, SEKW. NR ID.:8, SEKW. NR ID.:10 i SEKW. NR ID.:12 oraz, które posiadają przynajmniej 50% homologii na poziomie aminokwasowym bez zasadniczej redukcji działania enzymatycznego.

Wspomniane powyżej kwasy nukleinowe według wynalazku, działające jako elongazy C16- lub C18- lub C20-, pochodzą z organizmów takich jak orzęski, grzyby, glony, rośliny czy Dinoflagellatae, które są zdolne do syntezy kwasów PUFA, korzystnie z roślin czy glonów, szczególnie korzystnie z rodzaju Phytophthora, Physcomitrella, Crypthecodinium, Thraustochytrium czy Schizochytrium, najkorzystniej z Phytophthora infestans, Physcomitrella patens, Crypthecodinium cohnii czy Thraustochytrium sp., Schizochytrium sp. lub organizmów blisko spokrewnionych.

Jeden z aspektów wynalazku dotyczy cząsteczek wyizolowanego kwasu nukleinowego, które kodują polipeptydy PSE lub ich aktywne biologicznie części oraz fragmentów kwasu nukleinowego, które wystarczają do użycia jako sondy hybrydyzacyjne, czy startery do identyfikowania lub amplifikowania kwasu nukleinowego kodującego PSE (przykładowo DNA dla PSE). Termin cząsteczka kwasu nukleinowego użyty w niniejszym kontekście obejmuje cząsteczki DNA (przykładowo cDNA lub genomowego DNA) i cząsteczki RNA (przykładowo mRNA) oraz analogi DNA czy RNA wytworzone jako analogi nukleotydowe. Termin ten dodatkowo obejmuje sekwencję, nie podlegającą translacji na koń16

PL 207 026 B1 cu 3' i końcu 5' regionu kodującego: co najmniej około 100 nukleotydów z sekwencji leżącej powyżej końca 5' regionu kodującego i co najmniej około 20 nukleotydów z sekwencji leżącej poniżej końca 3' regionu kodującego. Cząsteczka kwasu nukleinowego może być jedno- lub dwuniciowa, choć korzystny jest dwuniciowy DNA. Cząsteczka wyizolowanego kwasu nukleinowego jest oddzielona od innych cząsteczek kwasu nukleinowego obecnych w naturalnym źródle kwasu nukleinowego. Wyizolowany kwas nukleinowy korzystnie nie posiada sekwencji naturalnie flankujących kwas nukleinowy, w genomowym DNA organizmu, z którego pochodzi ten kwas nukleinowy (przykładowo, sekwencji położonych na końcach 5' i 3' kwasu nukleinowego). W różnych wykonaniach, cząsteczki wyizolowanego kwasu nukleinowego dla PSE mogą zawierać, przykładowo, mniej niż około 5 kb; 4 kb; 3 kb; 2 kb; 1 kb; 0,5 kb lub 0,1 kb sekwencji nukleotydowych, naturalnie flankuj ących czą steczkę kwasu nukleinowego w genomowym DNA organizmu z którego pochodzi kwas nukleinowy (przykładowo, komórki Physcomitrella patens). Cząsteczka wyizolowanego kwasu nukleinowego, taka jak cząsteczka cDNA, jest ponadto zasadniczo wolna od innego materiału komórkowego lub podłoża hodowlanego, jeśli została wytworzona technikami rekombinancyjnymi lub wolna od prekursorów chemicznych, czy innych związków chemicznych jeśli została zsyntetyzowana chemicznie. Cząsteczkę kwasu nukleinowego według wynalazku, przykładowo cząsteczkę kwasu nukleinowego o sekwencji nukleotydowej z SEKW. NR ID.:1, SEKW. NR ID.:3, SEKW. NR ID.:5, SEKW. NR ID.:7, SEKW. NR ID.:9 i SEKW. NR ID.:11 lub ich fragmentów, można wyizolować przy użyciu standardowych technik biologii molekularnej i dostarczonych tu informacji o sekwencji. Także, przykładowo, za pomocą algorytmów przyrównania można identyfikować sekwencję homologiczną czy homologiczne, konserwowane regiony sekwencji na poziomie DNA lub aminokwasowym. Przykładowo, cDNA dla Phytophthora, Physcomitrella, Crypthecodinium czy Thraustochytrium można wyizolować z biblioteki Phytophthora, Physcomitrella, Crypthecodinium czy Thraustochytrium przy użyciu całej SEKW. NR ID.:1, SEKW. NR ID.:3, SEKW. NR ID.:5, SEKW. NR ID.:7, SEKW. NR ID.:9 i/lub SEKW. NR ID.:11 lub ich części, jako sondy hybrydyzacyjnej i standardowych technik hybrydyzacji (takich jak, przykładowo, opisane w Sambrook i wsp., Molecular Cloning: A Laboratory Manual. Wyd. 2-gie, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989). Ponadto, cząsteczki kwasu nukleinowego obejmujące całe sekwencje z SEKW. NR ID.:1, SEKW. NR ID.:3, SEKW. NR ID.:5, SEKW. NR ID.:7, SEKW. NR ID.:9 i SEKW. NR ID.:11 lub ich części, można wyizolować przy użyciu reakcji łańcuchowej polimerazy, gdzie stosowane są startery oligonukleotydowe wytworzone na podstawie tych sekwencji lub ich części, w szczególności na podstawie regionów wokół motywów His-box z SEKW. NR ID.:2, SEKW. NR ID.:4, SEKW. NR ID.:6, SEKW. NR ID.:8, SEKW. NR ID.:10 i SEKW. NR ID.:12 lub ich indywidualnych modyfikacji, dotyczących określonych aminokwasów (przykładowo, cząsteczki kwasu nukleinowego obejmujące całą sekwencję z SEKW. NR ID.:1, SEKW. NR ID.:3, SEKW. NR ID.:5, SEKW. NR ID.:7, SEKW. NR ID.:9 i SEKW. NR ID.:11 lub ich część można wyizolować przy użyciu reakcji łańcuchowej polimerazy, stosując startery oligonukleotydowe wytworzone na podstawie tych samych sekwencji z SEKW. NR ID.:1, SEKW. NR ID.:3, SEKW. NR ID.:5, SEKW. NR ID.:7, SEKW. NR ID.:9 i SEKW. NR ID.:11). Ponadto, szczególnie stosowne do tego celu są te sekwencje cząsteczek, które pokazano na Fig. 10. Przykładowo, z komórek można wyizolować mRNA (np. metodą ekstrakcji rodankiem guanidyny według Chirgwin i wsp. (1979) Biochemistry 18: 5294-5299) i można wytworzyć cDNA za pomocą odwrotnej transkryptazy (przykładowo, odwrotnej transkryptazy z wirusa Moloneya, MLV, dostępnej w Gibco/BRL, Bethesda, MD lub odwrotnej transkryptazy z AMV, dostępnej w Seikagaku America, Inc., St. Petersburg, FL). Syntetyczne startery oligonukleotydowe, do amplifikacji za pomocą reakcji łańcuchowej polimerazy, można wytworzyć na podstawie jednej z sekwencji nukleotydowych pokazanych na SEKW. NR ID.:1, 3, 5, 7, 9 lub 11 czy za pomocą sekwencji aminokwasowych pokazanych na Fig. 10. Kwas nukleinowy, według wynalazku, można amplifikować używając jako matrycy cDNA lub, alternatywnie, genomowego DNA oraz stosownych starterów oligonukleotydowych, zgodnie ze standardowymi technikami amplifikacji PCR. Tak zamplifikowany kwas nukleinowy można sklonować w odpowiednim wektorze i scharakteryzować sposobami analizy sekwencji DNA. Oligonukleotydy odpowiadające sekwencji nukleotydowej PSE można wytwarzać standardowymi metodami syntezy, przykładowo z automatycznym syntezatorem DNA.

cDNA pokazany w SEKW. NR ID.:1, SEKW. NR ID.:3, SEKW. NR ID.:5, SEKW. NR ID.:7, SEKW. NR ID.:9 i SEKW. NR ID.:11 obejmuje sekwencje kodujące PSE (tzn. region kodujący) a także sekwencje nie podlegające translacji z końca 5' i 3'. Alternatywnie, cząsteczka kwasu nukleinowego może obejmować tylko region kodujący jednej z sekwencji z SEKW. NR ID.:1, SEKW. NR ID.:3,

PL 207 026 B1

SEKW. NR ID.:5, SEKW. NR ID.:7, SEKW. NR ID.:9 i SEKW. NR ID.:11 lub może zawierać całe fragmenty genomowe wyizolowane z genomowego DNA.

SEKW. NR ID.:2, SEKW. NR ID.:4, SEKW. NR ID.:6, SEKW. NR ID.:8, SEKW. NR ID.:10 i SEKW. NR ID.:12 są zidentyfikowane przez ten sam numer kodu dostępu EST co SEKW. NR ID.:1, SEKW. NR ID.:3, SEKW. NR ID.:5, SEKW. NR ID.:7, SEKW. NR ID.:9 i SEKW. NR ID.:11 dla ułatwienia korelacji.

W dalszym korzystnym wykonaniu, cząsteczka wyizolowanego kwasu nukleinowego według wynalazku obejmuje cząsteczkę kwasu nukleinowego, która jest komplementarna z jedną z sekwencji nukleotydowych pokazanych na SEKW. NR ID.:1, SEKW. NR ID.:3, SEKW. NR ID.:5, SEKW. NR ID.:7, SEKW. NR ID.:9 i SEKW. NR ID.:11 lub z ich częściami. Cząsteczka kwasu nukleinowego komplementarna do jednej z sekwencji nukleotydowych pokazanych na SEKW. NR ID.:1, SEKW. NR ID.:3, SEKW. NR ID.:5, SEKW. NR ID.:7, SEKW. NR ID.:9 i SEKW. NR ID.:11 jest wystarczająco komplementarna, jeśli jest zdolna do hybrydyzacji z jedną z sekwencji przedstawionych na SEKW. NR ID.:1, SEKW. NR ID.:3, SEKW. NR ID.:5, SEKW. NR ID.:7, SEKW. NR ID.:9 i SEKW. NR ID.:11, dając stabilny dupleks.

Homologi sekwencji kwasu nukleinowego nowych elongaz o sekwencji SEKW. NR ID.:1, SEKW. NR ID.:3, SEKW. NR ID.:5, SEKW. NR ID.:7, SEKW. NR ID.:9 i SEKW. NR ID.:11 oznaczają przykładowo, odmiany alleliczne z co najmniej około 50 do 60%, korzystnie co najmniej około 60 do 70%, bardziej korzystnie co najmniej około 70 do 80%, 80 do 90% lub 90 do 95%, a jeszcze bardziej korzystnie co najmniej około 95%, 96%, 97%, 98%, 99% lub większą homologią z jedną z sekwencji nukleotydowych pokazanych na SEKW. NR ID.:1, SEKW. NR ID.:3, SEKW. NR ID.:5, SEKW. NR ID.:7, SEKW. NR ID.:9 i SEKW. NR ID.:11 lub ich homologami, pochodnymi czy analogami lub ich częściami. W dalszym korzystnym wykonaniu, cząsteczka wyizolowanego kwasu nukleinowego, według wynalazku, obejmuje sekwencję nukleotydową, która hybrydyzuje z jedną z sekwencji nukleotydowych pokazanych na SEKW. NR ID.:1, SEKW. NR ID.:3, SEKW. NR ID.:5, SEKW. NR ID.:7, SEKW. NR ID.:9 i SEKW. NR ID.:11 lub jej częścią, w ostrych warunkach hybrydyzacji. Odmiany alleliczne powinny obejmować, w szczególności, odmiany funkcjonalne, które posiadają delecję, insercję czy podstawienie nukleotydów z/w sekwencji pokazanej na SEKW. NR ID.:1, SEKW. NR ID.:3, SEKW. NR ID.:5, SEKW. NR ID.:7, SEKW. NR ID.:9 i SEKW. NR ID.:11 jednakże, dla aktywności enzymatycznej uzyskanych białek, które są syntetyzowane, powinna zostać zachowana insercja jednego lub więcej genów. Białka z zachowaną aktywnością enzymatyczną elongazy oznaczają białka z co najmniej 10%, korzystnie 20%, korzystniej 30%, szczególnie korzystnie 40% pierwotną aktywnością enzymatyczną w porównaniu z białkiem kodowanym przez SEKW. NR ID.:2, SEKW. NR ID.:4, SEKW. NR ID.:6, SEKW. NR ID.:8, SEKW. NR ID.:10 i SEKW. NR ID.:12. Elongazy, które zachowały wspomniane powyżej aktywności są elongazami, których aktywność enzymatyczna nie jest zasadniczo zmniejszona.

Homologi SEKW. NR ID.:1, SEKW. NR ID.:3, SEKW. NR ID.:5, SEKW. NR ID.:7, SEKW. NR

ID.:9 i SEKW. NR ID.:11 oznaczają także, przykładowo, homologi bakteryjne, grzybowe i roślinne, sekwencje obcięte, jednoniciowy DNA czy RNA, sekwencji DNA kodującej lub niekodującej,

ID.:9 i SEKW. NR ID.:11 oznaczają także pochodne takie jak, przykładowo, odmiany promotora. Promotory położone powyżej sekwencji nukleotydowych, można modyfikować przez podstawienia jednym lub większą liczbą nukleotydów, przez insercję(cje) i/lub delecję(cje), bez wpływu na funkcjonalność i aktywność promotorów. Ponadto jest dalej możliwe podniesienie aktywności promotorów poprzez modyfikację ich sekwencji lub poprzez całkowitą ich zamianę promotorami bardziej aktywnymi, nawet z organizmów heterologicznych.

Ponadto, cząsteczka kwasu nukleinowego według wynalazku może obejmować tylko część regionu kodującego jednej z sekwencji w SEKW. NR ID.:1, SEKW. NR ID.:3, SEKW. NR ID.:5, SEKW. NR ID.:7, SEKW. NR ID.:9 i SEKW. NR ID.:11, przykładowo fragment, który można użyć jako sondę lub starter lub fragment, który koduje biologicznie aktywny segment PSE. Sekwencje nukleotydowe określone na podstawie sklonowanego genu PSE z Physcomitrella patens, Phytophthora infestans, i Thraustochytrium i Crypthecodinium pozwalają na wytworzenie sond i starterów, które są zaprojektowane do identyfikowania i/lub klonowania homologów PSE w innych typach komórek i organizmach oraz homologów PSE z innych mchów czy gatunków pokrewnych. Sonda/starter normalnie obejmuje oczyszczony oligonukleotyd, Oligonukleotyd normalnie obejmuje region sekwencji nukleotydowej, który hybrydyzuje w warunkach ostrych z co najmniej około 12, korzystnie około 16, bardziej korzyst18

PL 207 026 B1 nie około 25, 40, 50 czy 75 kolejnymi nukleotydami z sensownej nici jednej z sekwencji przedstawionych na SEKW. NR ID.:1, SEKW. NR ID.:3, SEKW. NR ID.:5, SEKW. NR ID.:7, SEKW. NR ID.:9 i SEKW. NR ID.:11, z antysensownej nici jednej z sekwencji przedstawionych na SEKW. NR ID.:1, SEKW. NR ID.:3, SEKW. NR ID.:5, SEKW. NR ID.:7, SEKW. NR ID.:9 i SEKW. NR ID.:11 lub ich homologów, pochodnych i analogów czy ich naturalnie występujących mutantów. Startery na bazie sekwencji nukleotydowej z SEKW. NR ID.:1, SEKW. NR ID.:3, SEKW. NR ID.:5, SEKW. NR ID.:7, SEKW. NR ID.:9 i SEKW. NR ID.:11 można użyć w reakcjach PCR do klonowania homologów PSE. Sondy na bazie sekwencji nukleotydowych dla PSE można użyć do wykrywania transkryptów czy sekwencji genomowych, które kodują te same lub homologiczne białka. W korzystnych wykonaniach, sonda dodatkowo obejmuje związaną z nią wyznakowaną grupę, przykładowo radioizotop, związek fluorescencyjny, enzym lub kofaktor enzymu. Sondy takie można zastosować jako część zestawu do badania markerów genomowych dla identyfikowania komórek, które nie wytwarzają PSE, przykładowo, poprzez mierzenie ilości kwasu nukleinowego kodującego PSE w próbce komórki, przykładowo mierząc poziom mRNA dla PSE, lub do określania czy genomowy gen PSE jest zmutowany lub wydeletowany.

W jednym z wykonań wynalazku, cząsteczka kwasu nukleinowego, według wynalazku, koduje białko lub jego część, które obejmuje sekwencję aminokwasową posiadającą wystarczającą homologię z sekwencją aminokwasową z SEKW. NR ID.:2, SEKW. NR ID.:4, SEKW. NR ID.:6, SEKW. NR

ID.:8, SEKW. NR ID.:10 i SEKW. NR ID.:12, białka lub jego części dla zachowania zdolności uczestniczenia w metabolizmie składników, wymaganych do syntezy błon komórkowych w mikroorganizmach lub roślinach czy w transporcie cząsteczek przez te błony. Użyty w niniejszym kontekście termin wystarczająca homologia dotyczy białek lub ich części, których sekwencje aminokwasowe posiadają minimalną ilość reszt aminokwasowych (przykładowo, reszta aminokwasowa z podobnym łańcuchem bocznym, taka jak reszta aminokwasowa w jednej z sekwencji z SEKW. NR ID.:2 do 12), która jest identyczna z, lub równoważna z, sekwencją aminokwasową z SEKW. NR ID.:2, SEKW. NR ID.:4, SEKW. NR ID.:6, SEKW. NR ID.:8, SEKW. NR ID.:10 i SEKW. NR ID.:12 tak, że białko lub jego część może uczestniczyć w metabolizmie składników wymaganych do syntezy błon komórkowych, w mikroorganizmach lub roślinach, czy w transporcie cząsteczek przez te błony. Jak opisano, składniki białkowe tych szlaków metabolicznych lub systemów transportu przez błony, mogą odgrywać rolę w produkcji i sekrecji jednego lub większej liczby wysokowartościowych związków chemicznych. Przykłady tych aktywności także są tu opisane. Zatem, funkcja PSE przyczynia się bezpośrednio lub pośrednio do ilości, produkcji i/lub wydajności produkcyjnej jednego, lub więcej wysokowartościowych związków chemicznych. Przykłady specyficzności substratowych PSE dla aktywności katalitycznej przedstawiono w Tabeli 1.

W kolejnym wykonaniu, pochodne cząsteczki kwasu nukleinowego według wynalazku, kodują białka z co najmniej około 50 do 60%, korzystnie co najmniej około 60 do 70% i bardziej korzystnie co najmniej około 70 do 80%, 80 do 90%, 90 do 95% i najkorzystniej co najmniej około 96%, 97%, 98%, 99% lub większą homologią do całej sekwencji aminokwasowej z SEKW. NR ID.:2, SEKW. NR ID.:4,

SEKW. NR ID.:6, SEKW. NR ID.:8, SEKW. NR ID.:10 i SEKW. NR ID.:12. Homologię sekwencji aminokwasowej, do regionu pełnej sekwencji, określono stosując program PileUp (J. Mol. Evolution., 25, 351-360, 1987, Higgins i wsp., CABIOS, 5, 1989:151-153) lub BESTFIT czy GAP (Henikoff, S. i Henikoff, J. G. (1992). Amino acid substitution matrices from protein blocks. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 10915-10919.)

Fragmenty białek kodowanych przez cząsteczki kwasu nukleinowego dla PSE, są korzystnie fragmentami aktywnymi biologicznie jednego z białek PSE. Jak tu użyto, termin biologicznie aktywny fragment białka PSE ma obejmować segment, przykładowo, domenę/motyw z PSE, który uczestniczy w metabolizmie składników wymaganych do syntezy błon komórkowych w mikroorganizmach lub roślinach czy w transporcie cząsteczek przez te błony lub, który posiada aktywność przedstawioną w Tabeli 1. Można przeprowadzić badanie aktywności enzymatycznej, w celu określenia czy PSE lub jego fragment aktywny biologicznie, uczestniczy w metabolizmie składników wymaganych do syntezy błon komórkowych w mikroorganizmach lub roślinach, czy w transporcie cząsteczek przez te błony. Sposoby przeprowadzania tych badań, jak opisano szczegółowo w Przykładzie 8 w rozdziale z przykładami, są znane specjalistom.

Dodatkowe fragmenty kwasów nukleinowych, które kodują biologicznie aktywne segmenty z PSE można wytwarzać poprzez izolowanie części jednej z tych sekwencji w SEKW. NR ID.:2, SEKW. NR ID.:4, SEKW. NR ID.:6, SEKW. NR ID.:8, SEKW. NR ID.:10 i SEKW. NR ID.:12, wyrażając

PL 207 026 B1 segment kodujący z PSE lub z peptydu (przykładowo, poprzez ekspresję rekombinacyjną in vitro) i okreś lanie aktywnoś ci części kodują cej z PSE lub z peptydu.

Ponadto, wynalazek obejmuje cząsteczki kwasu nukleinowego, które różnią się od jednej z sekwencji nukleotydowych pokazanych w SEKW. NR ID.:1, SEKW. NR ID.:3, SEKW. NR ID.:5, SEKW. NR ID.:7, SEKW. NR ID.:9 i SEKW. NR ID.:11 (i jej części) z powodu degeneracji kodu genetycznego i które zatem kodują to samo białko PSE, jak to kodowane przez sekwencje nukleotydowe pokazane w SEKW, NR ID.:1, SEKW. NR ID.:3, SEKW. NR ID.:5, SEKW. NR ID.:7, SEKW. NR ID.:9 i SEKW. NR ID.:11. W innym wykonaniu, cząsteczka wyizolowanego kwasu nukleinowego posiada sekwencję nukleotydową kodującą białka o sekwencji aminokwasowej pokazanej w SEKW. NR ID.:2, SEKW. NR ID.:4, SEKW. NR ID.:6, SEKW. NR ID.:8, SEKW. NR ID.:10 i SEKW. NR ID.:12. W dalszym wykonaniu, cząsteczka kwasu nukleinowego koduje białko PSE o pełnej długości, które jest zasadniczo homologiczne z sekwencją aminokwasową z SEKW. NR ID.:2, SEKW. NR ID.:4, SEKW. NR ID.:6, SEKW. NR ID.:8, SEKW. NR ID.:10 i SEKW. NR ID.:12 (które jest kodowane przez otwartą ramkę odczytu pokazaną w SEKW. NR ID.:1, SEKW. NR ID.:3, SEKW. NR ID.:5, SEKW. NR ID.:7, SEKW. NR ID.:9 i SEKW. NR ID.:11) i które można identyfikować i izolować zwyczajnymi metodami.

Dodatkowo do sekwencji nukleotydowych dla PSE pokazanych w SEKW. NR ID.:1, SEKW. NR ID.:3, SEKW. NR ID.:5, SEKW. NR ID.:7, SEKW. NR ID.:9 i SEKW. NR ID.:11, specjaliści zauważą, że mogą istnieć polimorfizmy sekwencji DNA prowadzące do zmian sekwencji aminokwasowych dla białka PSE w populacji (przykładowo, w populacji Physcomitrella, Phytophthora, Crypthecodinium czy Thraustochytrium). Polimorfizmy genetyczne w genie dla PSE mogą istnieć wśród indywidualnych osobników w populacji, na skutek naturalnej zmienności. Użyte w niniejszym kontekście, terminy gen i gen zrekombinowany odnosz ą się do czą steczek kwasu nukleinowego z otwartą ramką odczytu, która koduje białko PSE, korzystnie z Phytophthora, Physcomitrella, Crypthecodinium czy Thraustochytrium PSE. Te naturalne odmiany zazwyczaj dają rozbieżność od 1 do 5% w sekwencji nukleotydowej genu dla PSE. Wszystkie te odmiany nukleotydowe i będące tego wynikiem polimorfizmy aminokwasowe w PSE, które wywodzą się z naturalnej zmienności i nie zmieniają funkcjonalnej aktywności PSE, wchodzą w zakres wynalazku.

Cząsteczki kwasu nukleinowego, które odpowiadają naturalnym odmianom i nie pochodzą z Physcomitrella, Phytophthora, Crypthecodinium czy Thraustochytrium homologom, pochodnym czy analogom cDNA z Phytophthora, Physcomitrella, Crypthecodinium czy Thraustochytrium można izolować według standardowych technik hybrydyzacyjnych w ostrych warunkach hybrydyzacji, dzięki ich homologii z ujawnionym tu kwasem nukleinowym dla PSE z Phytophthora, Physcomitrella, Crypthecodinium czy Thraustochytrium PSE, stosując jako sondę hybrydyzacyjną cDNA z Physcomitrella, Phytophthora, Crypthecodinium czy Thraustochytrium cDNA lub jego części. W innym wykonaniu, cząsteczka wyizolowanego kwasu nukleinowego ma minimalną długość 15 nukleotydów i hybrydyzuje w ostrych warunkach z czą steczką kwasu nukleinowego, który obejmuje sekwencję nukleotydową z SEKW. NR ID.:1, SEKW. NR ID.:3, SEKW. NR ID.:5, SEKW. NR ID.:7, SEKW. NR ID.:9 i SEKW. NR ID.:11. W innych wykonaniach, kwas nukleinowy ma minimalną długość 25, 50, 100, 250 lub więcej nukleotydów. Termin hybrydyzuje w ostrych warunkach użyty w niniejszym kontekście, ma opisywać warunki hybrydyzacji i płukania, w których sekwencje nukleotydowe posiadające ze sobą co najmniej 60% homologii, zazwyczaj pozostają ze sobą w stanie hybrydyzacji. Warunki są korzystne kiedy sekwencje posiadające co najmniej około 65%, bardziej korzystne kiedy sekwencje posiadające co najmniej około 70% i jeszcze bardziej korzystne kiedy sekwencje posiadające co najmniej około 75% lub więcej homologii ze sobą, zazwyczaj pozostają ze sobą w stanie hybrydyzacji. Takie ostre warunki hybrydyzacji są znane specjalistom i można je znaleźć w Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, N. Y. J (1989), 6.3.1-6.3.6. Korzystnym, nie ograniczającym przykładem ostrych warunków hybrydyzacji, są hybrydyzacje w 6 x chlorek sodu/cytrynian sodu (ang. sodium chloride/sodium ctrate = SSC) w około 45°C po których następuje jeden lub więcej etapów płukania w 0,2 x SSC, 0,1% SDS w 50 do 65°C. Specjaliści wiedzą, że takie warunki hybrydyzacji różnią się, w zależności od typu kwasu nukleinowego i, obecności rozpuszczalników organicznych, temperatury i stężenia buforu. Przykładowo, temperatura różni się w standardowych warunkach hybrydyzacji w zależności od typu kwasu nukleinowego od 42°C do 58°C, w buforze wodnym, przy stężeniu od 0,1 do 5 x SSC (phi 7,2). Jeśli we wspomnianym powyżej buforze obecny jest rozpuszczalnik organiczny, przykładowo 50% formamid, temperatura w standardowych warunkach wynosi około 42°C. Warunki hybrydyzacji dla hybryd DNA:DNA korzystnie wynoszą, przykładowo, 0,1 x SSC i 20°C do 45°C, korzystnie pomiędzy 30°C i 45°C. Warunki hybrydyzacji dla hybryd DNA:RNA korzystnie wynoszą, przy20

PL 207 026 B1 kładowo, 0,1 x SSC i 30°C do 55°C, korzystnie pomiędzy 45°C i 55°C. Wspomniane powyżej temperatury hybrydyzacji są określone, przykładowo dla kwasu nukleinowego o długości około 100 bp (= par zasad) i 50% zawartości G + C przy braku formamidu. Specjaliści wiedzą jak można określić wymagane warunki hybrydyzacji przy pomocy podręczników, takich jak podręcznik wspomniany powyżej lub przy pomocy następujących podręczników: Sambrook i wsp., Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory, 1989; Hames and Higgins (Wyd.) 1985, Nucleic Acids Hybridization: A Practical Approach, IRL Press at Oxford University Press, Oxford; Brown (Wyd.) 1991, Essential Molecular Biology: A Practical Approach, IRL Press at Oxford University Press, Oxford.

Korzystnie, cząsteczka wyizolowanego kwasu nukleinowego, która hybrydyzuje w ostrych warunkach z sekwencją z SEKW. NR ID.:1, SEKW. NR ID.:3, SEKW. NR ID.:5, SEKW. NR ID.:7, SEKW. NR ID.:9 i SEKW. NR ID.:11 odpowiada cząsteczce naturalnie występującego kwasu nukleinowego. Użyta w niniejszym kontekście cząsteczka naturalnie występującego kwasu nukleinowego, odnosi się do cząsteczki RNA lub DNA o sekwencji nukleotydowej, która występuje w przyrodzie (przykładowo, która koduje naturalne białko). W jednym z wykonań, kwas nukleinowy koduje naturalnie występującą PSE z Physcomitrella patens, PSE z Phytophthora infestans, PSE z Crypthecodinium cohnii lub PSE z Thraustochytrium.

Dodatkowo do naturalnie występujących odmian sekwencji PSE, które mogą istnieć w populacji, specjaliści ponadto zauważą, że można także wprowadzać zmiany na drodze mutacji do sekwencji nukleotydowej z SEKW. NR ID.:1, SEKW. NR ID.:3, SEKW. NR ID.:5, SEKW. NR ID.:7, SEKW. NR ID.:9 i SEKW. NR ID.:11, które prowadzą do zmian w sekwencji aminokwasowej kodującej PSE, bez niewłaściwego wpływu na funkgonowanie białka PSE. Przykładowo, podstawienia nukleotydowe, które prowadzą do podstawień o aminokwasowych w nieistotnych resztach aminokwasowych można wytwarzać w sekwencji SEKW. NR ID.:1, SEKW. NR ID.:3, SEKW. NR ID.:5, SEKW. NR ID.:7, SEKW. NR ID.:9 i SEKW. NR ID.:11. Nieistotna reszta aminokwasowa jest resztą, którą można zmienić w sekwencji dzikiego typu jednej z PSE (SEKW. NR ID.:2, SEKW. NR ID.:4, SEKW. NR ID.:6, SEKW. NR ID.:8, SEKW. NR ID.:10 i SEKW. NR ID.:12) bez zmienienia aktywności PSE, podczas gdy istotna reszta aminokwasowa jest wymagana dla aktywności PSE. Inne reszty aminokwasowe (przykładowo, te które nie są konserwowane, lub są częściowo konserwowane w domenie z aktywnością PSE) mogą jednakże, nie być istotne dla aktywności i mogą zatem prawdopodobnie być zmienione, bez zmienienia akt/wności PSE.

Dalszy aspekt wynalazku dotyczy cząsteczek kwasu nukleinowego, które kodują PSE, obejmujące zmienione reszty aminokwasowe, które nie są istotne dla aktywności PSE. Te PSE różnią się od sekwencji w SEKW. NR ID.:2, SEKW. NR ID.:4, SEKW. NR ID.:6, SEKW. NR ID.:8, SEKW. NR ID.:10 i SEKW. NR ID.:12, w odniesieniu do sekwencji aminokwasowej, podczas gdy nadal zachowują co najmniej jedną z opisanych tu aktywności PSE. W jednym z wykonań, cząsteczka wyizolowanego kwasu nukleinowego obejmuje sekwencję nukleotydową kodującą białko, gdzie białko obejmuje sekwencję aminokwasową o co najmniej około 50% homologii z sekwencją aminokwasową z SEKW. NR ID.:2, SEKW. NR ID.:4, SEKW. NR ID.:6, SEKW. NR ID.:8, SEKW. NR ID.:10 i SEKW. NR ID.:12 i jest zdolne do uczestniczenia w metabolizmie składników wymaganych do syntezy błon komórkowych w Phytophthora, Physcomitrella, Crypthecodinium lub Thraustochytrium, czy w transporcie cząsteczek przez te błony. Białko kodowane przez cząsteczkę kwasu nukleinowego korzystnie posiada co najmniej około 50 do 60% homologii z jedną z sekwencji w SEKW. NR ID.:2, SEKW. NR ID.:4, SEKW. NR ID.:6, SEKW. NRID.:8, SEKW, NR ID.:10 i SEKW. NR ID,:12, bardziej korzystnie co najmniej około 60 do 70% homologii z jedną z sekwencji w SEKW, NR ID.:2, SEKW. NR ID.:4, SEKW. NR ID.:6, SEKW, NR ID,;8, SEKW. NR ID,: 10 i SEKW. NR ID.:12, jeszcze bardziej korzystnie co najmniej około 70 do 80%, 80 do 90%, 90 do 95% homologii z jedną z sekwencji w SEKW. NR ID.:2, SEKW. NR ID.:4, SEKW. NR ID.:6, SEKW. NR ID.:8, SEKW. NR ID.:10; SEKW. NR ID.:12, i najkorzystniej co najmniej około 96%, 97%, 98% lub 99% homologii z jedną z sekwencji w SEKW. NR ID.:2, SEKW. NR ID.:4, SEKW. NR ID.:6, SEKW. NR ID.:8, SEKW. NR ID.:10 i SEKW. NR ID.:12.

W celu określenia procentu homologii dla dwóch sekwencji aminokwasowych (przykładowo jednej z sekwencji SEKW. NR ID.:2, SEKW. NR ID.:4, SEKW. NR ID.:6, SEKW. NR ID.:8, SEKW. NR ID.:10 i SEKW. NR ID.:12 i jej zmutowanej formy) lub dwóch kwasów nukleinowych, sekwencje są zapisywane jedna pod drugą co pozwala na optymalne porównanie (przykładowo, można wprowadzać przerwy do sekwencji białka lub kwasu nukleinowego w celu wytworzenia optymalnego przyrównania z innym białkiem czy innym kwasem nukleinowym). Następnie porównywane są reszty aminokwasowe czy nukleotydowe, w odpowiednich pozycjach aminokwasowych czy pozycjach nukleotydowych. Jeśli

PL 207 026 B1 pozycja w sekwencji (przykładowo, jednej z sekwencji z SEKW. NR ID.:2, SEKW. NR ID.:4, SEKW. NR ID.:6, SEKW. NR ID.:8, SEKW. NR ID.:10 i SEKW. NR ID.:12) jest zajmowana przez tę samą resztę aminokwasową, czy tę samą resztę nukleotydową jak odpowiednia pozycja w innej sekwencji (przykładowo, zmutowanej formy sekwencji wybranej z SEKW. NR ID.:2, SEKW. NR ID.:4, SEKW. NR ID.:6, SEKW. NR ID.:8, SEKW. NR ID.:10 i SEKW. NR ID.:12), to cząsteczki są w tej pozycji homologiczne (tzn. użyta w niniejszym kontekście homologia aminokwasowa lub kwasu nukleinowego odpowiada identyczności aminokwasowej lub kwasu nukleinowego). Procent homologii pomiędzy dwiema sekwencjami jest funkcją liczby identycznych pozycji dla obu sekwencji (tzn.% homologii = liczba identycznych pozycji /całkowita liczba pozycji x 100).

Cząsteczkę wyizolowanego kwasu nukleinowego, która koduje białko PSE, homologiczne z sekwencją białka z SEKW. NR ID.:2, SEKW. NR ID.:4, SEKW. NR ID.:6, SEKW. NR ID.:8, SEKW. NR ID.:10 i SEKW. NR ID.:12 można wytworzyć poprzez wprowadzenie podstawień, dodania czy delecji jednego lub większej liczby nukleotydów, do sekwencji z SEKW. NR ID.:1, SEKW. NR ID.:3, SEKW. NR ID.:5, SEKW. NR ID.:7, SEKW. NR ID.:9 i SEKW. NR ID.:11, tak że do kodowanego białka wprowadzane jest jedno lub większa liczba podstawień, dodania czy delecji aminokwasowych. Do jednej z sekwencji z SEKW. NR 30 ID.:1, SEKW. NR ID.:3, SEKW. NR ID.:5, SEKW. NR ID.:7, SEKW. NR ID.:9 i SEKW. NR ID.:11 można wprowadzać mutacje standardowymi technikami, takimi jak mutageneza ukierunkowana za pośrednictwem PCR. Korzystnie, konserwatywne podstawienia aminokwasowe są wytwarzane w jednej lub większej liczbie przewidywanych nieistotnych reszt aminokwasowych. W konserwatywnym podstawieniu aminokwasowym, reszta aminokwasowa jest wymieniana, na inną resztę aminokwasową o podobnym łańcuchu bocznym. Rodziny reszt aminokwasowych o podobnym łańcuchu bocznym zostały zdefiniowane przez specjalistów. Rodziny te obejmują aminokwasy z zasadowymi łańcuchami bocznymi (przykładowo lizyna, arginina, histydyna), kwaśnymi łańcuchami bocznymi (przykładowo kwas asparaginowy, kwas glutaminowy), nienaładowanymi polarnymi łańcuchami bocznymi (przykładowo glicyna, asparagina, glutamina, seryna, treonina, tyrozyna, cysteina), niepolarnymi łańcuchami bocznymi, (przykładowo alanina, walina, leucyna, izoleucyna, prolina, fenyloalanina, metionina, tryptofan), beta-rozgałęzionymi łańcuchami bocznymi (przykładowo treonina, walina, izoleucyna) oraz aromatycznymi łańcuchami bocznymi (przykładowo tyrozyna, fenyloalanina, tryptofan, histydyna). Przewidywana, nieistotna reszta aminokwasowa w PSE jest zatem korzystnie wymieniana, na inną resztę aminokwasowa z tej samej rodziny łańcucha bocznego. Alternatywnie, w innym wykonaniu, można losowo wprowadzać mutacje w całej lub w części sekwencji kodującej PSE, przykładowo poprzez mutagenezę wysycającą a uzyskane mutanty można wyszukiwać pod kątem opisanej tu aktywności PSE w celu zidentyfikowania mutantów z zachowaną aktywnością PSE. Po mutagenezie jednej z sekwencji z SEKW. NR ID.:1, SEKW. NR ID.:3, SEKW. NR ID.:5, SEKW. NR ID.:7, SEKW. NR ID.:9 i SEKW. NR ID.:11, kodowane białko można wytworzyć za pomocą techniki rekombinacji a aktywność białka można określić, przykładowo, stosując opisany tu test (patrz rozdział z przykł adami).

Dodatkowo do cząsteczek kwasu nukleinowego, które kodują opisane powyżej białka PSE, dalszy aspekt według wynalazku dotyczy cząsteczek wyizolowanego kwasu nukleinowego, które są do nich antysensowne. Antysensowny kwas nukleinowy obejmuje sekwencję nukleotydową, która jest komplementarna do sensownego kwasu nukleinowego, kodującego białko, przykładowo, komplementarna do nici kodującej cząsteczki dwuniciowego cDNA lub komplementarna do sekwencji mRNA. Zatem, antysensowny kwas nukleinowy można związać z sensownym kwasem nukleinowym poprzez wiązania wodorowe. Antysensowny kwas nukleinowy może być komplementarny do całej nici kodującej PSE lub tylko do jej części. W jednym wykonaniu, cząsteczka antysensownego kwasu nukleinowego jest antysensowna do regionu kodującego nici kodującej z sekwencji nukleotydowej kodującej PSE. Termin region kodujący odnosi się do regionu sekwencji nukleotydowej, który obejmuje kodony ulegające translacji w reszty aminokwasowe (przykładowo, całego regionu kodującego, który rozpoczyna się i kończy kodonem stop, tzn. ostatnim kodonem przed kodonem stop). W dalszym wykonaniu, cząsteczka antysensownego kwasu nukleinowego jest antysensowna do regionu niekodującego nici kodującej z sekwencji nukleotydowej kodującej PSE. Termin nić niekodująca dotyczy sekwencji 5' i 3' otaczających region kodujący i nie ulegających translacji do aminokwasów (tzn. regionów, które są także nazywane regionami 5' i 3' nie ulegającymi translacji).

Biorąc pod uwagę ujawnione tu sekwencje kodujące PSE nici kodującej (przykładowo, sekwencje pokazane w SEKW. NR ID.:1, SEKW. NR ID.:3, SEKW. NR ID.:5, SEKW. NR ID.:7, SEKW. NR ID.:9 i SEKW. NR ID.:11), antysensowne kwasy nukleinowe według wynalazku, można projektować

PL 207 026 B1 zgodnie z prawami parowania zasad Watsona-Cricka. Cząsteczka antysensownego kwasu nukleinowego, może być komplementarna do całego regionu kodującego mRNA dla PSE, lecz bardziej korzystny jest oligonukleotyd antysensowny komplementarny tylko do części regionu kodującego bądź niekodującego, wokół miejsca startu translacji. Przykładowo, antysensowny oligonukleotyd może być komplementarny do regionu wokół startu translacji z mRNA dla PSE. Antysensowny oligonukleotyd może posiadać długość, przykładowo, około 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45 lub 50 i więcej nukleotydów. Antysensowny oligonukleotyd ma korzystnie długość 15 do 25 nukleotydów. Antysensowny kwas nukleinowy, według wynalazku, można skonstruować za pomocą procesów znanych specjalistom, stosując syntezę chemiczną czy reakcję ligacji enzymatycznej. Przykładowo, antysensowny kwas nukleinowy (np. antysensowny oligonukleotyd) można syntetyzować chemicznie, używając naturalnie występujących nukleotydów lub różnych zmodyfikowanych nukleotydów, takich które podnoszą stabilność biologiczną cząsteczek lub podnoszą stabilność fizyczną dupleksów, utworzonych pomiędzy antysensownym i sensownym kwasem nukleinowym; przykładowo, można użyć pochodnych fosforotionianowych i nukleotydów podstawionych akrydyną. Przykładami zmodyfikowanych nukleotydów, które można użyć do wytworzenia antysensownych kwasów nukleinowych są, między innymi, 5-fluorouracyl, 5-bromouracyl, 5-chlorouracyl, 5-jodouracyl, hypoksantyna, ksantyna, 4-acetylocytozyna, 5-(karboksyhydroksylometylo)uracyl, 5-karboksymetyloaminometylo-2-tiourydyna, 5-karboksymetyloaminometylouracyl, dihydrouracyl, beta-D-galaktozylokweozyna, inozyna, N6-izopentenyloadenina, 1-metyloguanina, 1-metyloinozyna, 2,2-dimetyloguanina, 2-metyloadenina, 2-metyloguanina, 3-metylocytozyna, 5-metylcytozyna, N6-adenina, 7-metyloguanina, 5-metyloaminometylouracyl, 5-metoksyaminometylo-2-tiouracyl, beta-D-mannozylokweozyna, 5'-metoksykarboksymetylouracyl, 5-metoksyuracyl, 2-metylotio-N6-izopentyloadenina, kwas uracylo-5-oksyoctowy (v), wybutoksozyna, pseudouracyl, kweozyna, 2-tiocytozyna, 5-metylo-2-tiouracyl, 2-tiouracyl, 4-tiouracyl, 5-metylouracyl, uracylo-5-oksyactan metylowy, kwas uracylo-5-oksyoctowy (v), 5-metylo-2-tiouracyl, 3-(3-amino-3-N-2-karboksypropylo)uracyl, (acp3)w oraz 2,6-diaminopuryna. Alternatywnie, antysensowny kwas nukleinowy można wytworzyć biologicznie, stosując wektor ekspresyjny, do którego przeklonowano kwas nukleinowy w antysensownej orientacji (tzn. RNA, który powstaje w wyniku transkrypcji wprowadzonego kwasu nukleinowego i jest w orientacji antysensownej w stosunku do interesującego docelowego kwasu nukleinowego, który opisano szczegółowo w podrozdziale poniżej).

Cząsteczki antysensownego kwasu nukleinowego, według wynalazku, są zazwyczaj podawane do komórki czy wytwarzane in situ, tak że hybrydyzują z, lub wiążą się z mRNA komórkowym i/lub genomowym DNA kodującym PSE, hamując tym samym wytwarzanie białka, przykładowo, poprzez hamowanie transkrypcji i/lub translacji. Hybrydyzację można przeprowadzić dzięki konwencjonalnej komplementarności nukleotydowej z utworzeniem stabilnego dupleksu lub, przykładowo, w przypadku cząsteczki antysensownego kwasu nukleinowego, która wiąże się z dwuniciowym DNA, dzięki specyficznym oddziaływaniom w dużym rowku podwójnej helisy. Antysensowna cząsteczka może być zmodyfikowana w taki sposób, że specyficznie wiąże receptor lub antygen wyrażany w wyselekcjonowanej komórce, przykładowo poprzez związanie cząsteczki antysensownego kwasu nukleinowego z peptydem lub przeciwciałem, z których każdy wiąże się z receptorem powierzchniowym komórki lub z antygenem. Komórkom można także dostarczyć cząsteczkę antysensownego kwasu nukleinowego, przy użyciu opisanych tu wektorów. Dla uzyskania wystarczających wewnątrzkomórkowych stężeń cząsteczek antysensownych, korzystne są konstrukty wektorów, w których cząsteczka antysensownego kwasu nukleinowego znajduje się pod kontrolą silnego promotora prokariotycznego, wirusowego czy eukariotycznego obejmującego promotor roślinny.

W dalszym wykonaniu, cząsteczka antysensownego kwasu nukleinowego według wynalazku jest cząsteczką α-anomerycznego kwasu nukleinowego. Cząsteczka α-anomerycznego kwasu nukleinowego tworzy specyficzne, dwuniciowe hybrydy, z komplementarnym RNA, nici biegną równolegle do siebie, dla kontrastu ze zwykłymi podjednostkami β [Gaultier i wsp. (1987) Nucleic Acids Res. 15:6625-6641]. Ponadto, cząsteczka antysensownego kwasu nukleinowego może obejmować 2'-o-metylorybonukleotyd [Inoue i wsp. (1987) Nucleic Acids Res. 15:6131-6148] lub himerowy analogon RNA-DNA [Inoue i wsp. (1987) FEBS Lett. 215:327-330].

W dalszym wykonaniu, antysensowny kwas nukleinowy według wynalazku jest rybozymem. Rybozymy są cząsteczkami katalitycznego RNA z aktywnością rybonukleazy, która tnie jednoniciowy kwas nukleinowy, taki jak mRNA, do którego posiadają region komplementarny. Zatem, rybozymy, przykładowo rybozymy ryby-młota [opisane w Haselhoff i Gerlach (1988) Nature 334:585-591], można użyć do katalitycznego cięcia transkryptów mRNA dla PSE w celu zahamowania translacji mRNA dla

PL 207 026 B1

PSE. Rybozym ze specyficznością do kwasu nukleinowego kodującego PSE, można zaprojektować na podstawie ujawnionej tu sekwencji nukleotydowej cDNA dla PSE (tzn. 38°Ck21_g07fwd w SEKW. NR ID.:1, SEKW. NR ID.:3, SEKW. NR ID.:5, SEKW. NR ID.:7, SEKW. NR ID.:9 i SEKW. NR ID.:11) lub na podstawie sekwencji heterologicznej, wyizolowanej według procesów zaprezentowanych w niniejszym wynalazku. Przykładowo, moż na skonstruować pochodny RNA z Tetrahymena-L-19-IVS, w którym sekwencja nukleotydowa miejsca aktywnego, jest komplementarna do sekwencji nukleotydowej, która ma zostać przecięta w mRNA kodującym PSE. Patrz, przykładowo. Cech i wsp., patent USA 4987071 oraz Cech i wsp., patent USA 5116742. Alternatywnie, mRNA dla PSE można użyć do selekcjonowania katalitycznego RNA, ze specyficzną aktywnością rybonukleazową, spośród puli cząsteczek RNA [patrz przykładowo, Bartel, D. i Szostak, J.W. (1993) Science 261:1411-1418].

Alternatywnie, ekspresję genu PSE można zahamować, poprzez skierowanie sekwencji nukleotydowych, które są komplementarne do regionu regulacyjnego sekwencji nukleotydowej PSE (przykładowo, promotora PSE i/lub enhancera) w taki sposób, że tworzy się potrójna helisa, która hamuje transkrypcję genu PSE w komórkach docelowych [patrz ogólnie Helene, C. (1991) Anticancer Drug Res. 6(6) 569-84; Helene, C, i wsp. (1992) Ann. N. Y. Acad. Sci. 660:27-36 oraz Maher. LJ. (1992) Bioassays 14(12):807-815].

Konstrukt genowy

Dalsze wykonanie według wynalazku jest konstruktem nowego genu, obejmującego wyizolowany kwas nukleinowy pochodzący z Physcomitrella, Phytophthora, Crypthecodinium czy Thraustochytrium i kodujący polipeptyd wydłużający kwasy tłuszczowe C16-, C18- lub C20- z co najmniej dwoma wiązaniami podwójnymi w kwasie tłuszczowym o co najmniej dwa atomy węgla lub który obejmuje sekwencję genu z SEKW. NR ID.:1, SEKW. NR ID.:3, SEKW. NR ID.:5, SEKW. NR ID.:7, SEKW. NR ID.:9 i SEKW. NR ID.:11, jego homologi, pochodne czy analogi, które są funkcjonalnie połączone z jednym lub większą liczbą sygnał ów regulacyjnych, korzystnie dla podniesienia ekspresji genu. Przykładami takich sekwencji regulacyjnych są sekwencje wiążące induktory lub represory i w ten sposób regulujące ekspresję kwasu nukleinowego. Dodatkowo do tych nowych sekwencji regulacyjnych, stale może występować regulacja naturalna sekwencji leżących przed faktycznymi genami strukturalnymi i, jeśli jest to stosowne, są modyfikowane genetycznie, tak że wyłączona jest regulacja naturalna a wzmocniona ekspresja genów. Jednakże, konstrukt genowy może posiadać także prostszą strukturę, tzn. bez wprowadzenia dodatkowych sygnałów regulacyjnych przed sekwencje SEKW. NR ID.:1, SEKW. NR ID.:3, SEKW. NR ID.:5, SEKW. NR ID.:7, SEKW. NR ID.:9 i SEKW. NR ID.:11 lub ich homologi a promotor naturalny ze swoją regulacją nie jest usunięty. Zamiast tego, naturalna sekwencja regulacyjna jest zmutowana w taki sposób, że nie zachodzi regulacja i wzmocniona jest ekspresja genu. Konstrukt genowy, może ponadto, korzystnie obejmować jedną lub więcej tak zwanych sekwencji enhancerowych, które są funkcjonalnie połączone z promotorem i które pozwalają na podniesienie ekspresji sekwencji kwasu nukleinowego. Jest także możliwe dodatkowe wprowadzenie korzystnych sekwencji na końcu 3' sekwencji DNA, przykładowo dalszych elementów regulacyjnych czy terminatorów. Geny elongazy mogą być obecne w jednej lub większej liczbie kopii w konstrukcie genowym. Korzystne dla wprowadzania dalszych genów do organizmów jest to, aby dalsze geny były obecne w konstrukcie genowym.

Korzystne sekwencje regulacyjne dla nowego procesu istnieją, przykładowo, w promotorach takich jak promotor cos, tac, trp, tet, trp-tet, Ipp, lac, Ipp-lac, lad^q, T7, T5, T3, gal, trc, ara, SP6, λ-Ρ_ρ lub λ-Ρ|_ i korzystnie są stosowane w bakteriach Gram-ujemnych. Dalsze korzystne sekwencje regulacyjne istnieją przykładowo, w promotorach Gram-dodatnich amy i SPO2, w promotorach drożdży czy grzybów ADC1, MFλ,, AC, P-60, CYC1, GAPDH, TEF, rp28, ADH lub w promotorach roślin CaMV/35S [Franek i wsp,. Cell 21 (1980) 285-294], PRP1 [Ward i wsp,. Plant, Mol. Biol, 22 (1993)], SSU, OCS, Iib4, usp, STLS1, B33, nos lub w promotorze ubikwityny czy fazeoliny. Korzystne, w tym kontekście, są także promotory indukowalne, takie jak promotory opisane w EP-A-0 388 186 (indukowany benzylosulfonamidem). Plant J. 2, 1992:397-404 (Gatz i wsp., indukowany tetracykliną), EP-A-0 335 528 (indukowany kwasem abscysynowym (ang. abscisic acid) lub WO 93/21334 (indukowany etanolem lub indukowany cykloheksenolem). Innymi odpowiednimi promotorami roślinnymi są: promotor cytozolowej FBPazy czy promotor ziemniaka ST-LSI (Stockhaus i wsp., EMBO J. 8, 1989, 2445), promotor Glycine max amidotransferazy fosforybozylopirofosfatu (Genbank Accession No. U87999) czy promotor specyficzny dla węzła EP-A-0 249 676. Szczególnie korzystnymi promotorami są promotory, które pozwalają na ekspresję w tkankach wymaganych do biosyntezy kwasu tłuszczowego. Szczególnie korzystne są promotory specyficzne dla nasion, takie jak promotor usp, LEB4,

PL 207 026 B1 fazeoliny czy napiny. Dalsze szczególnie korzystne promotory są specyficzne dla nasion, które można użyć w roślinach jednoliściennych czy dwuliściennych, opisane w US 5,608,152 (promotor napiny rzepaku oleistego), WO 98/45461 (promotor fazeoliny z Arabidopsis), US 5,504,200 (promotor fazeoliny z Phaseolus vulgaris), WO 91/13980 (promotor Bce4 z Brassica), Baeumlein i wsp.. Plant J., 2, 2, 1992:233-239 (promotor LEB4 strączkowych), promotory te są stosowne dla dwuliściennych. Przydatne są następujące promotory, przykładowo, dla jednoliściennych: promotor lpt-2 lub lpt-1 z jęczmienia (WO 95/15389 i WO 95/23230), promotor hordeiny z jęczmienia oraz inne stosowne promotory opisane w WO 99/16890.

Zasadniczo, jest możliwe użycie wszystkich promotorów naturalnych z ich sekwencjami regulacyjnymi, jak te wspomniane powyżej, dla nowego procesu. Jest także możliwe i korzystne, dodatkowe użycie promotorów syntetycznych.

Jak opisano powyżej, konstrukt genowy może obejmować także dalsze geny, które mają być wprowadzone do organizmów. Jest możliwe i korzystne wprowadzenie do organizmów gospodarza, i uzyskanie w nich ekspresji, genów regulatorowych takich jak geny dla induktorów, represorów czy enzymów, które dzięki ich aktywności enzymatycznej zaangażowane są w regulację jednego lub więcej genów ze szlaku biosyntezy. Geny te mogą mieć pochodzenie heterologiczne bądź homologiczne. Wprowadzone geny mogą mieć swoje własne promotory lub inaczej mogą znajdować się pod kontrolą promotora z sekwencji SEKW. NR ID,;1, SEKW. NR ID.:3, SEKW. NR ID.:5, SEKW. NR ID.:7, SEKW. NR ID.:9 i SEKW. NR ID.:11 lub ich homologów, pochodnych czy analogów.

Dla ekspresji innych obecnych genów, konstrukt genowy korzystnie obejmuje dalsze sekwencje regulacyjne na końcu 3'- i/lub 5' dla wzmocnienia ekspresji i są one wyselekcjonowane dla optymalnej ekspresji, jako funkcja wybranego organizmu gospodarza i genu(ów).

Jak wspomniano powyżej, takie sekwencje regulacyjne mają umożliwić specyficzną ekspresję genów i wytworzenie białka. W zależności od organizmu gospodarza, może to znaczyć, przykładowo, że gen ulega ekspresji lub nadekspresji tylko po indukcji czy że ulega ekspresji i/lub nadekspresji natychmiast.

Ponadto, sekwencje regulacyjne czy czynniki regulacyjne wprowadzone aby wzmacniać ekspresję genów mogą mieć korzystny wpływ na ich ekspresję. W ten sposób, jest możliwe, że elementy regulacyjne są korzystnie wzmacniane przy użyciu silnych sygnałów transkrypcyjnych na poziomie transkrypcji, takich jak promotory i/lub enhancery. Jednakże, jest dalej także możliwe wzmocnienie translacji, przykładowo poprzez wprowadzenie stabilności mRNA. Sekwencje kwasu nukleinowego według wynalazku są korzystnie sklonowane w konstrukcie genowym (= kasecie ekspresyjnej, konstrukcie kwasu nukleinowego) wraz z co najmniej jednym genem reporterowym i ten konstrukt genowy jest wprowadzony do organizmu za pośrednictwem wektora lub bezpośrednio do genomu. Gen reporterowy powinien pozwolić na łatwe wykrycie, na podstawie testu wzrostu, fluorescencji, chemiluminescencji, bioluminescencji czy oporności lub za pośrednictwem pomiaru fotometrycznego. Przykładami genów reporterowych, które można wymienić są geny oporności na antybiotyki czy herbicydy, geny hydrolazy, geny białek fluorescencyjnych, geny bioluminescencyjne, geny metabolizmu cukru lub nukleotydu lub geny biosyntezy takie jak gen Ura3, gen Ilv2, gen lucyferazy, gen β-galaktozydazy, gen gfp, gen 2-fosfatazy dezoksyglukozo-6-fosforanu, gen β-glukuronidazy, gen β-laktamazy, gen fosfotransferazy neomycyny, gen fosfotransferazy higromycyny lub gen BASTA (= oporność na glufosynat). Geny te dają możliwość badania aktywności transkrypcyjnej i tym samym ekspresji genu co prowadzi do łatwego pomiaru i określania ilości. Pozwala to na identyfikację pozycji w genomie, która wykazuje różną produktywność.

Sekwencje kwasu nukleinowego, według wynalazku, z SEKW. NR ID.:1, SEKW. NR ID.:3, SEKW. NR ID.:5, SEKW. NR ID.:7, SEKW. NR ID.:9 i SEKW. NR ID.:11, które kodują elongazy, mogą być obecne w kasecie ekspresyjnej konstrukcie genowym) w jednej lub większej liczbie kopii.

Kaseta ekspresyjna (= konstrukt genowy, konstrukt kwasu nukleinowego) może dodatkowo obejmować co najmniej jeden dalszy kwas nukleinowy, który koduje gen, korzystnie z biosyntezy kwasu tłuszczowego, który ma zostać wprowadzony do organizmów gospodarza. Geny te mogą znajdować się pod kontrolą oddzielnej regulacji lub pod tym samym regionem regulacyjnym co geny elongazy według wynalazku. Geny te są, przykładowo, dodatkowymi genami biosyntezy, korzystnie biosyntezy kwasu tłuszczowego, które umożliwiają podniesienie syntezy. Genami, które można wymienić, na drodze przykładu, są geny Δ19-, Δ17-, Δ15-, Δ12-, Δ9-, Δ8-, Δ6-, Δ5-, Δ4- desaturazy, różnych hydrokylaz, A12-acetylenazy, tioesterazy acylo-ACP, syntetazy β-ketoacylo-ACP czy reduktazy

PL 207 026 B1 β-ketoacylo-ACP. Korzystnie, w konstrukcie kwasu nukleinowego, stosowane są geny desaturazy. Znowu, geny te, mogą być obecne w konstrukcie genowym w jednej lub większej liczbie kopii.

C. Zrekombinowane wektory ekspresyjne i komórki gospodarza

Dalszy aspekt według wynalazku dotyczy wektorów, korzystnie wektorów ekspresyjnych, obejmujących kwas nukleinowy według wynalazku lub konstrukt genowy według wynalazku, który koduje PSE (lub jego część). Użyty w niniejszym kontekście termin wektor dotyczy cząsteczki kwasu nukleinowego, która transportuje inny kwas nukleinowy, z którym jest związana. Jeden typ wektora jest plazmidem, który jest kolistym dwuniciowym pierścieniem DNA, do którego można ligować dodatkowe segmenty DNA. Dalszym typem wektora jest wektor wirusowy. Możliwe jest ligowanie dodatkowych segmentów DNA do genomu wirusowego. Pewne wektory są zdolne do autonomicznej replikacji w komórce gospodarza, do której zostały wprowadzone (przykładowo wektory bakteryjne z bakteryjnym miejscem startu replikacji i ssacze wektory episomalne). Inne wektory (przykładowo nieepisomalne wektory ssacze) ulegają integracji z genomem komórki gospodarza, po wprowadzeniu do komórki gospodarza i zatem replikacji wraz z genomem gospodarza. Dodatkowo, pewne wektory mogą wpływać na ekspresję genów, z którymi są funkcjonalnie połączone. Wektory takie są tu określone jako wektory ekspresyjne. Zazwyczaj, wektory ekspresyjne, które są odpowiednie dla technik rekombinacji DNA mają formę plazmidów. W niniejszym opisie, plazmid i wektor mogą być stosowane wymiennie, ponieważ plazmid jest najczęściej stosowaną formą wektora. Chociaż, w zamiarze wynalazku leży objęcie innych form wektorów ekspresyjnych, jak wektory wirusowe (przykładowo retrowirusy niezdolne do replikacji, adenowirusy i wirusy pokrewne z adeno), które wykazują podobne funkcje. Ponadto, termin wektor obejmuje także inne wektory znane specjalistom, takie jak fagi, wirusy jak SV40, CMV, bakulowirus, adenowirus, transpozony, elementy IS, fazmidy, fagemidy, kosmidy, liniowe lub koliste DNA i RNA.

Zrekombinowane wektory ekspresyjne, według wynalazku, obejmują kwas nukleinowy, według wynalazku, lub konstrukt genu, według wynalazku, w formie stosownej do ekspresji kwasu nukleinowego w komórce gospodarza, co oznacza, że zrekombinowane wektory ekspresyjne obejmują, jedną lub więcej sekwencji regulacyjnych, wyselekcjonowanych na podstawie komórek gospodarza użytych do ekspresji, która jest lub są funkcjonalnie połączone z sekwencją kwasu nukleinowego, która ma ulec ekspresji. W zrekombinowanym wektorze ekspresyjnym, funkcjonalnie połączona oznacza, że interesująca sekwencja nukleotydowa jest związana z sekwencją(ami) regulatorową w taki sposób, że możliwa jest ekspresja sekwencji nukleotydowej i, że są one połączone ze sobą tak, że obie sekwencje spełniają przewidywaną funkcję przypisaną sekwencji (przykładowo w systemie transkrypcji/translatacji in vitro czy w komórce gospodarza, gdy wektor jest wprowadzony do komórki gospodarza). Termin sekwencja regulacyjna obejmuje promotory, enhancery i inne elementy kontrolujące ekspresję (przykładowo sygnały poliadenylacji). Takie sekwencje regulacyjne są opisane, przykładowo, w Goeddel: Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, CA (1990), lub patrz: Gruber i Crosby, w: Methods in Plant Molecular Biology and Biotechnology, CRC Press, Boca Raton, Florida, Wyd.: Glick i Thompson, Rozdz. 7, 89-108, włączając zawarte w nich referencje. Sekwencje regulacyjne obejmują te, które kontrolują konstytutywną ekspresję sekwencji nukleotydowej w wielu typach komórek gospodarza oraz te, które kontrolują bezpośrednią ekspresję sekwencji nukleotydowej tylko w określonych komórkach gospodarza w określonych warunkach. Specjaliści wiedzą że model wektora ekspresyjnego może zależeć od wielu czynników takich jak wybór komórki gospodarza do transformacji, stopnia w jakim pożądane białko ma być wytwarzane i im podobnych. Wektory ekspresyjne, według wynalazku, można wprowadzać do komórek gospodarza w celu wytworzenia białek czy peptydów, włączając białka fuzyjne czy peptydy fuzyjne, które są kodowane przez opisane tu kwasy nukleinowe (przykładowo białka PSE, zmutowane formy białek PSE, białka fuzyjne i temu podobne).

Zrekombinowane wektory ekspresyjne według wynalazku mogą być zaprojektowane do wytwarzania białek PSE w komórkach prokariotycznych i eukariotycznych. Przykładowo, geny PSE można wyrażać w komórkach bakteryjnych, takich jak C. glutamicum, komórkach owadzich (przy użyciu wektorów ekspresyjnych opartych na bakulowirusach), komórkach drożdżowych i komórkach pochodzących z innych grzybów [patrz Romanos, M.A., i wsp. (1992) Foreign gene expression in yeast: a review, Yeast 8:423-488; van den Hondel, C.A.M.J.J., i wsp. (1991) Heterologous gene expression in filamentous fungi, w: More Gene Manipulations in Fungi, J.W. Bennet & L.L Lasure, Ed., str. 396-428: Academic Press: San Diego; oraz van den Hondel, C.A.M.J.J., & Punt, P.J. (1991) Gene transfer systems and wektor development for filamentous fungi, w: Applied Molecular Genetics of Fungi, Pe26

PL 207 026 B1 berdy, J.F., i wsp., Wyd., str. 1-28, Cambridge University Press: Cambridge], glonach [Falciatore i wsp., 1999, Marine Biotechnology. 1, 3:239-251], orzęskach z następujących typów: Holotrichia, Peritrichia,

Spirotrichia, Suctoria, Tetrahymena, Paramecium, Colpidium, Glaucoma, Platyophrya, Potomacus, Pseudocohnilembus, Euplotes, Engelmaniella and Stylonychia, w szczególności w gatunku Stylonychia lemnae, przy użyciu wektorów oraz metod transformacji opisanych w WO 98/01572, oraz komórkach roślin wielokomórkowych [patrz Schmidt, R. and Willmitzer, L. (1988) High efficiency Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation of Arabidopsis thaliana leaf and cotyledon explants Plant Cell Rep.-.583-586; Plant Molecular Biology and Biotechnology, C Press, Boca Raton, Florida, Rozdz. 6/7, str. 71-119 (1993); F.F. White, B. Jenes i wsp., Techniques for Gene Transfer, w: Transgenic Plants, Bd. 1, Engineering and Utilization, Ed.: Kung and R. Wu, Academic Press (1993), 128-43; Potrykus, Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Molec. Biol. 42 (1991), 205-225 (oraz cytowane tam referencje)] czy komórkach ssaczych. Stosowne komórki gospodarza są ponadto omówione w Goeddel, Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, CA (1990). Alternatywnie, zrekombinowany wektor ekspresyjny może być poddany transkrypcji i translacji in vitro, przykładowo dzięki sekwencjom regulacyjnym promotora T7 przy użyciu polimerazy T7.

U prokariota, białka są zazwyczaj wyrażane przy użyciu wektorów zawierających promotory konstytutywne lub indukcyjne, kontrolujące wytwarzanie białek fuzyjnych czy białek nie będących w fuzji. Wektory do fuzji dodają serie aminokwasów do kodowanego przez nie białka, zazwyczaj na końcu aminowym zrekombinowanego białka, lecz także na końcu C czy w fuzji ze stosownymi regionami w białkach. Takie wektory do fuzji zazwyczaj posiadają trzy zadania: 1) wzmocnienie wytwarzania zrekombinowanego białka; 2) zwiększenie rozpuszczalności zrekombinowanego białka i 3) ułatwienie oczyszczania zrekombinowanego białka poprzez działanie jako ligand w oczyszczaniu przez powinowactwo, przykładowo poprzez tak zwane znaczniki (ang. tags). W przypadku wektorów ekspresyjnych służących do fuzji, często wprowadzane jest miejsce dla proteolitycznego cięcia, w miejscu połączenia odcinka fuzyjnego ze zrekombinowanym białkiem, tak że zrekombinowane białko można oddzielić od odcinka fuzyjnego po oczyszczeniu białka fuzyjnego. Enzymy takie oraz odpowiednie sekwencje przez nie rozpoznawane obejmują czynnik Xa, trombinę i enterokinazę.

Typowymi wektorami ekspresyjnymi do fuzji są, między innymi, pGEX [Pharmacia Biotech Inc; Smith, D.B., and Johnson, K.S. (1988) Gene 67:31-40], pMAL [New England Biolabs, Beverly, MA] i pRIT5 [Pharmacia, Piscataway, NJ], gdzie w fuzji z docelowym zrekombinowanym białkiem występuje transferaza S glutationu (GST), białko E wiążące maltozę czy białko A. W jednym z wykonań, sekwencja kodująca PSE jest sklonowana w wektorze ekspresyjnym pGEX w celu uzyskania wektora kodującego białko fuzyjne, która obejmuje od końca N do końca C, GST miejsce trawienia dla trombiny-X-białko. Białko fuzyjne można oczyszczać poprzez chromatografię powinowactwa przy użyciu złoża agarozy z glutationem. Zrekombinowane białko PSE, które nie będące w fuzji z GST można uzyskać poprzez cięcie białka fuzyjnego z użyciem trombiny.

Przykładami stosownych wektorów ekspresyjnych nie służących do fuzji dla E. coli są między innymi, pTrc (Amann i wsp. (1988) Gene 69:301-315) i pET (Studier i wsp., Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, California (1990) 60-89). Ekspresja docelowego genu z wektora pTrc oparta jest na transkrypcji przez polimerazę RNA pochodzącą z gospodarza z hybrydowej fuzji promotorowej trp-lac. Ekspresja docelowego genu z wektora pET 11d oparta jest na transkrypcji z fuzji promotorowej T7-gn10-lac, w której bierze udział wytwarzana jednocześnie wirusowa polimeraza RNA (T7 gn1). Ta wirusowa polimeraza jest dostarczana przez szczep gospodarza BL21 (DE3) lub HMS174 (DE3) dzięki obecności profaga, który niesie gen T7 gn1 pod kontrolą transkrypcyjną promotora lacUV 5.

Specjalistom znane są inne wektory stosowne do użycia w organizmach prokariotycznych; wektorami tymi są, przykładowo, w E. coli pLG338, pACYC184, z serii pBR taki jak pBR322, z serii pUC takie jak pUC18 czy pUC19, serie M113mp, pKC30, pRep4, pHS1, pHS2, pPLc236, pMBL24, pLG200, pUR290, pIN-¹¹³-B1, pgt11 lub pBdCI, w Streptomyces pIJ101, pIJ364, pIJ702 lub pIJ361, w Bacillus pUB110, pC194 lub pBD214, w Corynebacterium pSA77 lub pAJ667.

Strategią maksymalizacji wytwarzania zrekombinowanego białka jest wytwarzanie białka w gospodarzu bakteryjnym, który ma uszkodzoną zdolność proteolitycznego cięcia zrekombinowanego białka [Gottesman, S., Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, California (1990) 119-128]. Dalszą strategią jest zmodyfikowanie sekwencji kwasu nukleinowego wprowadzanego do wektora ekspresyjnego, tak, że poszczególne kodony dla każdego aminokwasu są takimi, które są preferencyjnie wykorzystywane w bakterii wybranej do ekspresji, jak

PL 207 026 B1

C. glutamicum [Wada i wsp. (1992) Nucleic Acids Res. 20:2111-2118]. Modyfikacje sekwencji kwasów nukleinowych według wynalazku przeprowadza się standardowymi technikami syntezy DNA.

W dalszym wykonaniu, wektorem ekspresyjnym dla PSE jest drożdżowy wektor ekspresyjny. Przykłady wektorów do ekspresji w drożdżach S. cerevisiae obejmują pYepSec1 [Baldari i wsp. (1987) Embo J. 6:229-234], pMFa [Kurjan and Herskowitz (1982) Cell 30:933-943], pJRY88 [Schultz i wsp. (1987) Gene 54:113-123] oraz pYES2 [Invitrogen Corporation, San Diego, CA]. Wektory i sposoby konstruowania wektorów stosownych do użycia u innych grzybów, takich jak grzyby nitkowate, obejmują te, które zostały szczegółowo opisane w: van den Hondel, C.A.M.J.J., & Punt, P.J. (1991) Gene transfer systems and wektor development for filamentous fungi w: Applied Molecular Genetics of fungi, J.F. Peberdy i wsp., Wyd., str. 1-28, Cambridge University Press: Cambridge, lub w: More Gene Manipulations in Fungi [J.W. Bennet & L.L. Lasure, Wyd., str. 396-428: Academic Press: San Diego]. Dalszymi stosownymi wektorami dla drożdży są przykładowo, pAG-1, YEp6, YEp13 lub pEMBLYe23.

Alternatywnie, białka PSE według wynalazku można wytwarzać w komórkach owadzich przy użyciu wektorów ekspresyjnych opartych na bakulowirusach. Wektory oparte na bakulowirusach, do dyspozycji przy wytwarzaniu białka w hodowlach komórek owadzich (przykładowo komórkach Sf9) obejmują serie pAc [Smith i wsp. (1983) Mol. Cell Biol. 3:2156-2165] oraz serie pVL [Lucklow and Summers (1989) Virology 170:31-39].

Wspomniane wektory stanowią jedynie krótki przegląd wektorów możliwych do użycia. Specjalistom znane są dalsze plazmidy i zostały one opisane, przykładowo, w: Cloning Vectors (Ed. Pouwels, P.H., i wsp., Elsevier, Amsterdam-New York-Oxford, 1985, ISBN 0 444 904018).

W jeszcze kolejnym wykonaniu, kwas nukleinowy według wynalazku ulega ekspresji w komórkach ssaczych, dzięki użyciu ssaczego wektora ekspresyjnego. Przykłady ssaczych wektorów ekspresyjnych obejmują pCDM8 [Seed, B. (1987) Nature 329:840] i pMT2PC [Kaufman i wsp. (1987) EMBO J. 6:187-195]. Kiedy stosowane są w komórkach ssaczych, funkcje kontrolne wektora ekspresyjnego są często dostarczane przez wirusowe elementy regulacyjne. Zazwyczaj stosowane promotory pochodzą, przykładowo, z polyoma, adenowirusa2, cytomegalowirusa i małpiego wirusa SV 40. Inne stosowne systemy ekspresyjne dla komórek prokariotycznych i eukariotycznych można znaleźć w Rozdz. 16 i 17 w Sambrook, J., Fritsch, E.F., i Maniatis, T., Molecular Cloning; A Laboratory Manual, Wyd. 2-gie, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989.

W innym wykonaniu ssaczy wektor ekspresyjny może kontrolować ekspresję kwasu nukleinowego korzystnie w specyficznym typie komórek (przykładowo, do ekspresji kwasu nukleinowego stosowane są tkankowo specyficzne elementy regulacyjne). Specjalistom znane są tkankowo specyficzne elementy regulacyjne. Nie ograniczającymi przykładami stosownych promotorów tkankowo specyficznych są, między innymi, promotor albuminy [specyficzny dla wątroby; Pinkert i wsp. (1987) Genes Dev. 1:268-277], promotory specyficzne dla komórek limfatycznych [Calame i Eaton (1988) Adv. Immunol. 43:235-275], w szczególności promotory specyficzne dla receptorów komórek T [Winoto i Baltimore (1989) EMBO J. 8:729-733] i dla immunoglobulin [Banerji i wsp. (1983) Cell 33:729-740; Queen i Baltimore (1983) Cell 33:741-748], promotory specyficzne dla neuronów [przykładowo promotor neurofilamentów; Byrne and Ruddie (1989) PNAS 86:5473-5477], promotory specyficzne dla trzustki [Ediund i wsp., (1985) Science 230:912-916] oraz promotory specyficzne dla gruczołu sutkowego [przykładowo promotor surowicy mleka; US 4873316 i EP-A-0 264 166). Także objęte są promotory regulowane podczas rozwoju, przykładowo promotory mysich hox [Kessel i Gruss (1990) Science 249:374-379] oraz promotor fotobiałka [Campes and Tilghman (1989) Genes Dev. 3:537-546].

W dalszym wykonaniu, białka PSE według wynalazku można wytwarzać w jednokomórkowych organizmach roślinnych (takich jak glony), patrz Falciatore i wsp., 1999, Marine Biotechnology 1 (3):239-251 oraz cytowane tam referencje, i w komórkach roślinnych z roślin wyższych (przykładowo rośliny nasienne jak rośliny uprawne). Przykłady roślinnych wektorów ekspresyjnych obejmują te szczegółowo opisane w: Becker, D., Kemper, E., Schell, J., i Masterson, R. (1992) New plant binary vectors with selectable markers located proximal to the left border. Plant Mol. Biol. 20:1195-1197; oraz Bevan, M.W. (1984) Binary Agrobacterium vectors for plant transformation, Nucl. Acids Res. 12:8711-8721; \/ectors for Gene Transfer in Higher Plants; w: Transgenic Plants, Tom 1, Engineering and Utilization, Wyd.: Kung i R. Wu, Academic Press, 1993, str. 15-38. Kolejne stosowne wektory roślinne są opisane, między innymi, w Methods in Plant Molecular Biology and Biotechnology (CRC Press), Rozdz. 6/7, str. 71-119. Korzystnymi wektorami są tak zwane wektory wahadłowe czy binarne, które ulegają replikacji w E. coli i Agrobacterium.

PL 207 026 B1

Roślinna kaseta ekspresyjna korzystnie obejmuje sekwencje regulacyjne, które mogą kontrolować ekspresję genu w komórkach roślinnych i które są funkcjonalnie połączone tak, że każda z sekwencji może spełniać swoją funkcję, tak jak terminację transkrypcji pełnią, przykładowo, sygnały poliadenylacji. Korzystnymi sygnałami poliadenylacji są pochodzące z T-DNA Agrobacterium tumefaciens, jak gen 3 z plazmidu Ti, pTiACH5, znany jako syntaza oktopiny [Gielen i wsp., EMBO J. (1984) 835 w sekw.] lub jego funkcjonalne odpowiedniki, chociaż wszystkie inne terminatory funkcjonalnie aktywne w roślinach są także odpowiednie.

Ponieważ roślinna ekspresja genów bardzo często nie jest ograniczona do poziomu transkrypcji, roślinna kaseta ekspresyjna korzystnie obejmuje inne sekwencje połączone funkcjonalnie, jak enhancery translacji, przykładowo sekwencja typu overdrive, która zawiera nie ulegającą translacji sekwencję liderową z końca 5' wirusa mozaiki tytoniu podnoszącą stosunek białko/RNA [Gallie i wsp., 1987, Nuci. Acids Research 15:8693-8711].

Roślinna ekspresja genów musi być funkcjonalnie powiązana z odpowiednim promotorem, który wpływa na ekspresję genu w sposób komórkowo lub tkankowo specyficzny z właściwą koordynacją. Korzystnymi promotorami są takie, które prowadzą do konstytutywnej ekspresji [Benfey i wsp., EMBO J. 8 (1989) 2195-2202] jak te, które pochodzą z wirusów roślinnych jak 35S CAMV [Franek i wsp.. Cell 21 (1980) 285-294], 19S CaMV (patrz także US 5352605 i WO 84/02913) czy promotory roślinne takie jak promotor małej podjednostki Rubisco opisany w US 4962028.

Innymi sekwencjami, korzystnymi do użycia do funkcjonalnego połączenia w roślinnej kasecie ekspresyjnej genu, są sekwencje celujące, które są wymagane do docelowego umiejscawiania produktu genu w odpowiednim przedziale komórkowym [jako artykuł przeglądowy, patrz Kermode, Crit. Rev. Plant Sci. 15, 4 (1996) 285-423 oraz cytowane w nim referencje], przykładowo w wakuoli, jądrze, we wszystkich rodzajach plazmidów jak amyloplasty, chloroplasty, chromoplasty, w przestrzeni zewnątrzkomórkowej, mitochondriach, retikulum endoplazmatycznym, elajoplastach, peroksysomach i innych i przedział ach komórek roś linnych.

Roślinna ekspresja genów może być także ułatwiona poprzez promotor indukowany chemicznie [jako artykuł przeglądowy, patrz Gatz 1997, Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol., 48:89-108]. Promotory indukowane chemicznie są szczególnie stosowane, kiedy pożądane jest aby ekspresja genu zachodziła w specyficzny sposób z uwzględnieniem synchronizacji. Przykładami takich promotorów są promotor indukowany kwasem salicylowym (WO 95/19443), promotor indukowany tetracykliną [Gatz i wsp. (1992) Plant J. 2, 397-404] oraz promotor indukowany etanolem.

Innymi stosownymi promotorami są promotory odpowiadające na warunki biotycznego i abiotycznego stresu, przykładowo promotor genu PRP1 indukowany patogenem [Ward i wsp.. Plant. Mol. Biol. 22 (1993) 361-366], promotor hsp80 z pomidora indukowany ciepłem (US 5,187,267), promotor alfa-amylazy z ziemniaka indukowany niską temperaturą (WO 96/12814) lub promotor pinII indukowany zranieniem (EP-A-0 375 091).

Promotorami szczególnie korzystnymi są takie, które prowadzą do ekspresji genu w tkankach czy organach, w których zachodzi biosynteza lipidu czy oleju, komórkach nasion, takich jak komórki bielma i komórki z rozwijającego się zarodka. Stosownymi promotorami są promotor genu napiny z rzepaku oleistego (US 5608152), promotor USP z Vicia faba [Baeumlein i wsp.. Mol Gen Genet, 1991, 225 (3):459-67], promotor oleozyny z Arabidopsis (WO 98/45461), promotor fazeoliny z Phaseolus vulgaris (US 5,504,200), promotor Bce4 z Brassica (WO 91/13980) lub promotor B4 z roślin strączkowych [LeB4; Baeumlein i wsp., 1992, Plant Journal, 2 (2):233-9] oraz promotory, które prowadzą do ekspresji specyficznej dla nasion u jednoliściennych kukurydza, jęczmień, pszenica, żyto, ryż i im podobnych. Godnymi uwagi odpowiednimi promotorami są promotor genu Ipt2 czy Ipt1 z ję czmienia (WO 95/15389 i WO 95/23230) lub promotory opisane w WO 99/16890 (promotor/ z genu hordeiny z jęczmienia, genu gluteliny z ryżu, genu oryzyny z ryżu, genu protaminy z ryżu, genu gliadyny z pszenicy, genu gluteliny z pszenicy, genu zeiny z kukurydzy, genu gluteliny z owsa, genu kazyryny z sorgo oraz genu sekaliny z żyta).

Promotorami, które także są szczególnie stosowne, są te, które prowadzą do ekspresji specyficznej dla plastydów, ponieważ plastydy są przedziałami, w których syntetyzowane są prekursory i niektóre produkty końcowe biosyntezy lipidów. Stosowne promotory, takie jak promotor wirusowej polimerazy RNA są opisane w WO 95/16783 i WO 97/06250 oraz promotor cIpP z Arabidopsis, opisany w WO 99/46394.

Wynalazek dalej dostarcza zrekombinowany wektor ekspresyjny, obejmujący cząsteczkę DNA według wynalazku, która jest sklonowana w wektorze ekspresyjnym w antysensownej orientacji, tzn.

PL 207 026 B1 cząsteczka DNA jest funkcjonalnie połączona z sekwencją regulacyjną w sposób, który umożliwia wytworzenie (poprzez transkrypcję cząsteczki DNA) cząsteczki RNA, która jest antysensowna do mRNA dla PSE. Można wybrać sekwencje regulacyjne, które są funkcjonalnie połączone z kwasem nukleinowym sklonowanym w antysensownej orientacji i które kontrolują stałe wytwarzanie cząsteczek antysensownego RNA w wielu rodzajach komórek, przykładowo, można wyselekcjonować wirusowe promotory i/lub enhancery, czy sekwencje regulacyjne, które kontrolują konstytutywną, tkankowo specyficzną czy specyficzną dla rodzaju komórek ekspresję antysensownego RNA. Wektor ekspresyjny, do wytwarzania antysensów, może występować w formie zrekombinowanego plazmidu, fagemidu czy atenuowanego wirusa, w którym antysensowne kwasy nukleinowe są wytwarzane pod kontrolą wysoko wydajnego regionu regulacyjnego, który może być określony przez rodzaj komórki, do której został wprowadzony wektor. W celu wyjaśnienia regulacji ekspresji genu za pomocą antysensownych genów patrz Weintraub H. i wsp., Antisense-RNA as a molecular tool for genetic analysis, Reviews - Trends in Genetics, Tom 1(1) 1986.

Kolejny aspekt wynalazku dotyczy komórek gospodarza, do których jest wprowadzony zrekombinowany wektor ekspresyjny, według wynalazku. Terminy komórka gospodarza i zrekombinowana komórka gospodarza są w niniejszym kontekście stosowane wymiennie. Oczywiście, terminy te nie odnoszą się wyłącznie do określonej komórki docelowej, lecz także do potomstwa czy potencjalnego potomstwa tej komórki. Ponieważ w wyniku mutacji czy czynników środowiskowych, w późniejszych generacjach mogą pojawić się specyficzne modyfikacje, potomstwo nie musi być identyczne z komórką rodzicielską, lecz pozostaje w zakresie znaczenia użytego w niniejszym kontekście.

Komórka gospodarza może być komórką prokariotyczną lub eukariotyczną. Przykładowo, białko PSE można wytwarzać w komórkach bakteryjnych, takich jak C. glutamicum, komórkach owadzich, komórkach z grzybów czy komórkach ssaczych (takich jak komórki jajnika chomika syryjskiego (CHO) lub komórki COS), w glonach, orzęskach, komórkach roślinnych, grzybach czy innych mikroorganizmach, takich jak C. glutamicum. Specjalistom znane są inne stosowne komórki gospodarza.

DNA wektorowy można wprowadzać do komórek prokariotycznych i eukariotycznych, za pośrednictwem technik tradycyjnej transformacji czy transfekcji. Terminy transformacja i transfekcja, koniugacja i transdukcja, użyte w niniejszym kontekście, mają objąć różnorodne, znane specjalistom, metody wprowadzania obcego kwasu nukleinowego (przykładowo DNA) do komórki gospodarza, włączając współwytrącanie fosforanem wapnia czy chlorkiem wapnia, transfekcję za pośrednictwem DEAE-dektranu, lipofekcję, naturalną kompetencję, transfer wywołany chemicznie, elektroporację czy bombardowanie cząsteczkami. Stosowne metody transformacji czy transfekcji komórek gospodarza, w tym komórek roślinnych, można znaleźć w Sambrook i wsp. (Molecular Cloning: A Laboratory Manual., wyd. 2-gie, Cold Spring Harbor Laborator, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989) i w innych podręcznikach laboratoryjnych, takich jak Methods in Molecular Biology, 1995, Tom 44, Agrobacterium protocols, Wyd.: Gartland and Davey, Humana Press, Totowa, New Jersey.

Wiadomo, że stabilna transfekcja ssaczych komórek, w której tylko mniejszość komórek wprowadza obcy DNA do ich genomu, zależy od stosowanego wektora ekspresyjnego i stosowanych technik transfekcji. W celu zidentyfikowania i wyselekcjonowania tych integratnów, wraz z interesującym genem do komórek gospodarza wprowadzany jest zazwyczaj gen kodujący marker selekcyjny (przykładowo oporność na antybiotyk). Korzystne markery selekcyjne obejmują te, które nadają oporność na środki farmakologiczne takie jak G418, higromycyna i metotreksat, czy w roślinach, te nadające oporność na herbicyd taki jak glifosfat czy glufosynat. Dalszymi stosownymi markerami są, przykładowo, markery kodujące geny, które są wymagane w szlakach biosyntezy, przykładowo, cukrów czy aminokwasów, takich jak β-galaktozydaza, ura3 czy ilv2. Stosowne są także markery kodujące geny takie jak lucyferaza, gfp czy inne geny fluorescencyjne. Markery te można stosować w mutantach, w których geny te nie funkcjonują dlatego, że zostały wydeletowane za pomocą tradycyjnych metod. Ponadto, markery kodujące kwas nukleinowy, który koduje marker selekcyjny można wprowadzać do komórki gospodarza, na tym samym wektorze, który koduje PSE lub można wprowadzać na oddzielnym wektorze. Komórki, które zostały stabilnie stransfekowane wprowadzonym kwasem nukleinowym można identyfikować przykładowo za pomocą selekcji na środek farmakologiczny (przykładowo, komórki, które posiadają zintegrowany marker selekcyjny przeżywają, podczas gdy inne umierają).

W celu wytworzenia homologicznie zrekombinowanych mikroorganizmów, wytwarzany jest wektor, który zawiera co najmniej jeden segment genu PSE do którego wprowadzono delecję, addycję czy substytucję w celu zmodyfikowania tym samym genu PSE, przykładowo w celu jego funkcjonalnego

PL 207 026 B1 uszkodzenia. Taki gen PSE jest korzystnie genem PSE z Physcomitrella, Phytophthora, Crypthecodinium czy Thraustochytrium, chociaż można także użyć formę homologiczną czy analogiczną z innego organizmu, nawet ze ssaka, grzyba czy owada. W korzystnym wykonaniu, wektor jest tak zaprojektowany, że endogenny gen PSE jest niszczony (tzn. nie koduje funkcjonalnego białka, wektor zwany także wektorem do nokautów) na drodze homologicznej rekombinacji. Alternatywnie, wektor można tak zaprojektować, że endogenny gen PSE jest zmutowany lub jest inaczej zmodyfikowany na drodze rekombinacji homologicznej stale jednak kodując funkcjonalne białko (przykładowo, można zmodyfikować leżący powyżej region regulacyjny w sposób, który prowadzi do modyfikacji ekspresji endogennego genu PSE). W celu wytworzenia mutacji punktowej, poprzez rekombinację homologiczną można także użyć, hybrydy DNA-RNA, znane także jako chimeraplasty i opisane w Cole-Strauss i wsp., 1999, Nucleic Acids Research 27(5):1323-1330 and Kmiec, Gene therapy, 1999, American Scientist, 87(3):240-247.

W wektorze do rekombinacji homologicznej, zmodyfikowany segment genu PSE jest oflankowany na końcu 5' i 3' przez dodatkowy kwas nukleinowy z genu PSE, tak że możliwa jest rekombinacja homologiczna pomiędzy egzogennym genem PSE obecnym w wektorze i endogennym genem PSE w mikroorganizmie czy w roślinie. Dodatkowy kwas nukleinowy flankujący PSE jest wystarczająco długi, dla pomyślnej rekombinacji homologicznej z genem endogennym. Zazwyczaj, obecny w wektorze flankujący DNA ma kilkaset par zasad, do tysięcy zasad (zarówno na końcu 5' jak i na 3') [opis wektorów do rekombinacji homologicznej, patrz, przykładowo, Thomas, K.R., i Capecchi, M.R. (1987) Cell 51:503 lub do rekombinacji w Physcomitrella patens na bazie cDNA, patrz Strepp i wsp., 1998, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95 (8):4368-4373]. Wektor jest wprowadzany do mikroorganizmu czy komórki roślinnej (przykładowo, metodą wprowadzania DNA z glikolem polietylenowym) a komórki, w których wprowadzony gen PSE uległ rekombinacji homologicznej z endogennym genem PSE są selekcjonowane technikami znanymi specjalistom.

W innym wykonaniu, można wytwarzać takie zrekombinowane organizmy, jak mikroorganizmy z roślin, które zawierają wyselekcjonowane systemy pozwalające na regulowanie ekspresją wprowadzonego genu. Wprowadzenie genu PSE do wektora, gdzie jest umieszczony pod kontrolą operonu lac pozwala, przykładowo, na ekspresję genu PSE jedynie w obecności IPTG. Takie systemy regulacyjne znane są specjalistom.

Komórkę gospodarza według wynalazku, taką jak komórki gospodarza prokariotycznego czy eukariotycznego, hodowane w hodowli lub na polu można wykorzystać do produkcji (tzn. wytworzenia) białka PSE. W roślinach można zastosować alternatywną metodę poprzez bezpośrednie wprowadzenie DNA do rozwijających się kwiatów poprzez elektroporację czy przez przeniesienie genu za pośrednictwem Agrobacterium. Zatem, wynalazek dostarcza ponadto sposobów wytwarzania białek PSE przy użyciu komórek gospodarza według wynalazku. W jednym z wykonań, sposób obejmuje hodowanie komórki gospodarza, według wynalazku do której wprowadzono zrekombinowany wektor ekspresyjny kodujący PSE lub do której genomu wprowadzono gen kodujący PSE dzikiego typu lub zmodyfikowany), w stosownej pożywce, aż do wyprodukowania PSE. W kolejnym wykonaniu sposób obejmuje izolowanie białek PSE z pożywki lub z komórki gospodarza.

Komórki gospodarza, które są zasadniczo przydatne w pobieraniu kwasu nukleinowego według wynalazku, produktu w postaci nowego genu według wynalazku, lub wektora według wynalazku, wszystkie są organizmami prokariotycznymi lub eukariotycznymi. Organizmy gospodarza, używane korzystnie są organizmami takimi jak bakterie, grzyby, drożdże, komórki zwierzęce czy komórki roślinne. Dalszymi korzystnymi organizmami są zwierzęta lub, korzystnie, rośliny czy ich części. Termin zwierzę jest tu rozumiany jako nie obejmujący ludzi. Korzystnie stosowane są grzyby, drożdże czy rośliny, szczególnie korzystnie grzyby czy rośliny, najkorzystniej rośliny takie jak rośliny oleiste, które zawierają duże ilości składników lipidowych takie jak rzepak oleisty, wiesiołek dwuletni, rącznik, rzepak, orzech ziemny, len, soja, szafran łąkowy, słonecznik, ogórecznik, palma oleista, kokos czy rośliny takie jak kukurydza, pszenica, żyto, owies, pszenżyto, ryż, jęczmień, bawełna, kasawa, pieprz, aksamitka, rośliny rodzaju Solanaceae jak ziemniak, tytoń, oberżyna i pomidor, Vicia sp., groch, lucerna, rośliny krzewiaste (kawa, kakao, herbata), Salix sp., drzewa (palma oleista, kokos) oraz trawy bylinowe i rośliny spożywcze. Szczególnie korzystnymi roślinami według wynalazku są rośliny oleiste takie jak soja, orzech ziemny, rzepak oleisty, rzepak, rącznik, len, wiesiołek dwuletni, słonecznik, ogórecznik, drzewa (palma oleista, kokos).

Szczególnie korzystny aspekt według wynalazku dotyczy komórki roślinnej, która zawiera polinukleotyd według wynalazku lub wektor według wynalazku. Preferowane są ponadto transgeniczne

PL 207 026 B1 rośliny lub tkanka roślinna obejmujące komórkę roślinną według wynalazku. Kolejny aspekt niniejszego wynalazku dotyczy tych części roślin według wynalazku, które można zbierać i materiału stosownego do rozmnażania roślin transgenicznych według wynalazku, zawierających albo komórki roślinne według wynalazku, które wyrażają kwas nukleinowy według wynalazku lub zawierają komórki posiadające podniesiony poziom białka według wynalazku. W zasadzie można zbierać wszystkie części rośliny, w szczególności kwiaty, pyłek, owoce, kiełki, korzenie, liście, nasiona, bulwy, łodygi. Materiał do rozmnażania obejmuje, przykładowo, nasiona, owoce, kiełki, bulwy, sadzonki i kłącza.

D. Wyizolowane białko PSE

Kolejny aspekt wynalazku dotyczy wyizolowanych białek PSE lub ich fragmentów aktywnych biologicznie. Wyizolowane lub oczyszczone białko lub jego fragment aktywny biologicznie jest zasadniczo wolne od materiału komórkowego, kiedy jest wyprodukowane technikami rekombinacji DNA lub wolne od prekursorowych związków chemicznych czy innych związków chemicznych, kiedy jest zsyntetyzowane chemicznie. Termin zasadniczo wolne od materiału komórkowego obejmuje preparaty PSE w których białko jest oddzielone od składników komórkowych komórek, w których jest ono produkowane naturalnie lub na drodze rekombinacji. W jednym z wykonań, termin zasadniczo wolne od materiału komórkowego obejmuje preparaty PSE w których białko nie będące PSE (także określane jako białko zanieczyszczające) stanowi mniej niż w przybliżeniu 30% (suchej masy), bardziej korzystnie białko nie będące PSE stanowi mniej niż w przybliżeniu 20%, jeszcze bardziej korzystnie białko nie będące PSE stanowi mniej niż w przybliżeniu 10% i najkorzystniej białko nie będące PSE stanowi mniej niż w przybliżeniu 5%. Wówczas gdy białko PSE czy jego aktywny biologicznie fragment jest wyprodukowany za pomocą technologii rekombinacji, jest ono także zasadniczo wolne od pożywki hodowlanej, tzn. zawartość pożywki hodowlanej jest mniejsza niż w przybliżeniu 20%, bardziej korzystnie mniej niż w przybliżeniu 10% i najkorzystniej mniej niż w przybliżeniu 5% objętości preparatu białka. Termin zasadniczo wolny od prekursorowych związków chemicznych czy innych związków chemicznych obejmuje preparaty PSE, w których białko jest oddzielone od prekursorowych związków chemicznych czy innych związków chemicznych wymaganych do syntezy białka. W jednym wykonaniu, termin zasadniczo wolny od prekursorowych związków chemicznych czy innych związków chemicznych obejmuje preparaty PSE zawierające mniej niż w przybliżeniu 30% (suchej masy) prekursorowych związków chemicznych czy innych związków chemicznych nie będących PSE, bardziej korzystnie mniej niż w przybliżeniu 20% prekursorowych związków chemicznych czy innych związków chemicznych nie będących PSE, jeszcze bardziej korzystnie mniej niż w przybliżeniu 10% prekursorowych związków chemicznych czy innych związków chemicznych nie będących PSE i najkorzystniej mniej niż w przybliżeniu 5% prekursorowych związków chemicznych czy innych związków chemicznych nie będących PSE. W korzystnych wykonaniach, wyizolowane białka czy ich biologicznie aktywne fragmenty nie wykazują zanieczyszczenia białkami tego samego organizmu, z którego pochodzi białko PSE. W przypadku białka według wynalazku, które zawiera sekwencję przedstawioną w SEKW. NR ID.:10 lub które jest kodowane przez gen obejmujący SEKW. NR ID.:9 powinno zostać uwzględnione, że sekwencja zaczyna się dwoma aminokwasami Met. Przy translacji odpowiednich sekwencji kwasu nukleinowego może to prowadzić do wytworzenia dwóch pochodnych białka według wynalazku, które rozpoczynają się w pierwszej czy drugiej Met. Stosunek ekspresji tych dwóch pochodnych może się różnić w zakresie pomiędzy 0 do 1, w zależności od typu ekspresji czy organizmu gospodarza. Wynalazek zatem obejmuje białka PSE zawierające obie wspomniane pochodne. Obie te pochodne mogą posiadać różne aktywności, lokalizacje, okresy półtrwania, mechanizmy regulacyjne itp. Białka te są zazwyczaj wytwarzane poprzez ekspresję rekombinacyjną przykładowo PSE z Physcomitrella, Phytophthora, Crypthecodinium czy Thraustochytrium w roślinach takich jak Physcomitrella patens czy wspomnianych powyżej, lub w mikroorganizmach przykładowo w bakteriach takich jak

E. coli, Bacillus subtilis, C. glutamicum, w grzybach takich jak Mortierella, drożdżach takich jak Saccharomyces czy w orzęskach takich jak Colpidium czy w glonach takich jak Phaeodactylum.

Wyizolowane białko PSE według wynalazku, czy jego część może brać także udział w metabolizmie składników potrzebnych do syntezy błon komórkowych u Physcomitrella, Phytophthora, Crypthecodinium czy Thraustochytrium lub w transporcie cząsteczek przez te błony. W korzystnych wykonaniach, białko czy jego część obejmuje sekwencję aminokwasową która posiada wystarczającą homologię z sekwencją aminokwasową z SEKW. NR ID.:2, SEKW. NR ID.:4, SEKW. NR ID.:6, SEKW. NR ID.:8, SEKW. NR ID.:10 lub SEKW. NR ID.:12 dla białka lub jego części tak, że zostaje zachowana zdolność udziału w metabolizmie składników wymaganych do syntezy błon komórkowych u Physcomitrella, Phytophthora, Crypthecodinium czy Thraustochytrium lub w transporcie cząsteczek

PL 207 026 B1 przez te błony. Część białka jest korzystnie, jak tu opisano, aktywną biologicznie częścią białka. W kolejnym korzystnym wykonaniu, białko PSE według wynalazku posiada jedną z sekwencji aminokwasowych przedstawionych w SEKW. NR ID.:2, SEKW. NR ID.:4, SEKW. NR ID.:6, SEKW. NR ID.:8, SEKW. NR ID.:10 lub SEKW. NR ID.:12. W kolejnym korzystnym wykonaniu, białko PSE posiada sekwencję aminokwasową kodowaną przez sekwencję nukleotydową, która hybrydyzuje z sekwencją nukleotydową przedstawioną w SEKW. NR ID.:1. SEKW. NR ID.:3, SEKW. NR ID.:5, SEKW. NR ID.:7, SEKW. NR ID.:9 lub SEKW. NR ID.:11, przykładowo, w ostrych warunkach. W jeszcze innym korzystnym wykonaniu, białko PSE posiada sekwencję aminokwasową, kodowaną przez sekwencję nukleotydową, która posiada co najmniej w przybliżeniu 50 do 60%, korzystnie co najmniej w przybliżeniu 60 do 70%, bardziej korzystnie 70 do 80%, 80 do 90%, 90 do 95% i bardziej korzystnie co najmniej w przybliżeniu 96%, 97%, 98%, 99% lub więcej homologii z jedną z sekwencji aminokwasowych z SEKW. NR ID.:2, SEKW. NR ID.:4, SEKW. NR ID.:6, SEKW. NR ID.:8, SEKW. NR ID.:10 lub SEKW. NR ID.:12. Korzystne białko PSE według wynalazku posiada korzystnie co najmniej jedną z opisanych tu aktywności PSE. Przykładowo, korzystne białko PSE według wynalazku obejmuje sekwencję aminokwasową, która hybrydyzuje z sekwencją nukleotydową z SEKW. NR ID.:1. SEKW. NR ID.:3, SEKW. NR ID.:5, SEKW. NR ID.:7, SEKW. NR ID.:9 lub SEKW. NR ID.:11, przykładowo w ostrych warunkach i która może brać udział w metabolizmie składników potrzebnych do syntezy błon komórkowych u Physcomitrella, Phytophthora, Crypthecodinium czy Thraustochytrium lub w transporcie cząsteczek przez te błony oraz która jest zdolna do wydłużania jednego lub większej liczby wielonienasyconych kwasów tłuszczowych z co najmniej dwoma wiązaniami podwójnymi i łańcuchem długości C16 lub C18.

W innych wykonaniach, białko PSE jest zasadniczo homologiczne do sekwencji aminokwasowej z SEKW. NR ID.:2, SEKW. NR ID.:4, SEKW. NR ID.:6, SEKW. NR ID.:8, SEKW. NR ID.:10 lub

SEKW. NR ID.:12 i zachowuje aktywność funkcjonalną białka z jednej z sekwencji przedstawionych w SEKW. NR ID.:2, SEKW. NR ID.:4, SEKW. NR ID.:6, SEKW. NR ID.:8, SEKW. NR ID.:10 lub SEKW. NR ID.:12, sekwencje ich różnią się na skutek naturalnych odmian czy mutagenezy jak opisano szczegółowo powyżej w podrozdziale I. W kolejnym wykonaniu, białko PSE jest zatem białkiem obejmującym sekwencję aminokwasową, która posiada co najmniej w przybliżeniu 50 do 60% korzystnie co najmniej w przybliżeniu 60 do 70%, bardziej korzystnie 70 do 80%, 80 do 90%, 90 do 95% i najkorzystniej co najmniej w przybliżeniu 96%, 97%, 98%, 99% lub więcej homologii z pełną sekwencją aminokwasową z SEKW. NR ID.:2, SEKW. NR ID.:4, SEKW. NR ID.:6, SEKW. NR ID.:8, SEKW. NR ID.:10 lub SEKW. NR ID.:12. W innym wykonaniu, wynalazek dotyczy pełnego białka z Physcomitrella, Phytophthora, Crypthecodinium czy Thraustochytrium, które jest zasadniczo homologiczne z pełną sekwencją aminokwasową z SEKW. NR ID.:2, SEKW. NR ID.:4, SEKW. NR ID.:6, SEKW. NR ID.:8, SEKW. NR ID.:10 lub SEKW. NR ID.:12.

Biologicznie aktywne fragmenty białka PSE obejmują peptydy, obejmujące sekwencje aminokwasowe pochodzące z sekwencji aminokwasowej dla PSE, przykładowo sekwencji aminokwasowej przedstawionej w SEKW. NR ID.:2, SEKW. NR ID.:4, SEKW. NR ID.:6, SEKW. NR ID.:8, SEKW. NR ID.:10 lub SEKW. NR ID.:12 lub sekwencji aminokwasowej białka homologicznego do PSE. Peptydy te posiadają mniej aminokwasów niż PSE pełnej długości lub pełnej długości białko homologiczne do PSE oraz posiadają, co najmniej jedną aktywność PSE. Biologicznie aktywne fragmenty (peptydy, przykładowo peptydy o długości, przykładowo 5, 10, 15, 20, 30, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 50, 100 lub więcej aminokwasów), zazwyczaj obejmują domenę lub motyw z co najmniej jedną aktywnością PSE. Ponadto, technikami rekombinacji można wytwarzać inne aktywne biologicznie fragmenty, w których zostały usunięte inne regiony białka. Biologicznie aktywne fragmenty białka PSE korzystnie obejmują jedną lub więcej wyselekcjonowanych domen/motywów czy ich fragmentów z aktywnością biologiczną.

Niektóre z takich domen czy motywów można identyfikować poprzez analizę sekwencji, przykładowo stosują metody wspomagane komputerowo.

Ustalono, że sekwencje według wynalazku zawierają przykładowo motywy KK.

Kermode 1996, Critical Reviews in Plant Science 15 (4): 285-423, opisuje motywy KK, podwójna lizyna, który jest znajdowany głównie jako motyw KKXX lub K X K XXX i wpływa na recykling z ER do aparatu Golgiego i tym samym na czas pozostawania białka i aktywności enzymatycznej w określonym miejscu, w szczególności w ER.

Motywy z podwójną lizyną znaleziono także, przykładowo w Δ12-desaturazach (Arondel, i wsp. 1992, Science 258:1353) i są one także obecne w elongazach według wynalazku. Opisano je w pewPL 207 026 B1 nych motywach, które można zlokalizować na końcu C. W sekwencjach według wynalazku, istnieje zauważalne gromadzenie lizyn na końcu C.

Elongaza PSE1 z mchu; koniec C KQKGAKTE

SEKW. NR. ID:2	KTKKA
SEKW. NR. ID:4	KSTPAAKKTN
SEKW. NR. ID:6	KHLK

Mogą to być możliwe odmiany genu.

Istnieją rodniki Lys, które wpływają na celowanie, adresowanie i lokalizowanie na lub w ER. W celu wpływania na kompartmentację można stosować maskowanie tej sekwencji, modyfikowanie czy przestrzenne modyfikowanie, w sąsiedztwie końca C, przykładowo poprzez fuzję z GFP białkiem zielonej fluorescencji.

Białka PSE korzystnie są wytwarzane technikami rekombinacji DNA. Przykładowo, cząsteczka kwasu nukleinowego kodująca białko jest klonowana w wektorze ekspresyjnym (jak opisano powyżej), wektor ekspresyjny jest wprowadzany do komórki gospodarza (jak opisano powyżej) i białko PSE jest wyrażane w komórce gospodarza. Białko PSE można izolować z komórek za pomocą stosownego schematu oczyszczania. Alternatywnie do ekspresji drogą rekombinacji, białko PSE, polipeptyd PSE czy peptyd PSE można syntetyzować chemicznie standardowymi technikami syntezy peptydów. Ponadto, natywne białko PSE można wyizolować z komórek (przykładowo komórek śródbłonka) przykładowo, przy użyciu przeciwciał przeciwko PSE, które można wytworzyć standardowymi technikami, przy użyciu białka PSE według wynalazku lub jego fragmentu.

Wynalazek dostarcza także chimerowych białek PSE lub białek fuzyjnych PSE. Użyte w niniejszym kontekście określenia chimerowe białko PSE lub białko fuzyjne PSE obejmuje polipeptyd PSE, który jest funkcjonalnie połączony z polipeptydem nie będącym PSE. Polipeptyd PSE odnosi się do polipeptydu o sekwencji aminokwasowej odpowiadającej PSE, podczas gdy polipeptyd nie będący PSE odnosi się do polipeptydu o sekwencji aminokwasowej odpowiadającej białku, które zasadniczo nie jest homologiczne do PSE, przykładowo białku, które różni się od PSE i które pochodzi z tego samego lub innego organizmu. Termin dla białka fuzyjnego funkcjonalnie połączony, powinien być rozumiany jako oznaczający, że polipeptyd PSE i polipeptyd nie będący PSE znajdują się ze sobą w fuzji, w taki sposób, że obie sekwencje spełniają przewidywaną funkcję przypisaną stosowanej sekwencji. Polipeptyd nie będący PSE może znajdować się w fuzji po stronie końca N lub końca C polipeptydu PSE. W jednym wykonaniu białko fuzyjne jest, przykładowo, białko fuzyjne GST-PSE, w którym sekwencje PSE znajdują się w fuzji z końcem C sekwencji GST. Fuzje białkowe mogą ułatwiać czyszczenie zrekombinowanych białek PSE. W kolejnym wykonaniu, białko fuzyjne jest białkiem PSE, które posiada heterologiczną sekwencję sygnałową na swoim końcu N. W określonych komórkach gospodarza (przykładowo ssaczych komórkach gospodarza), można podnieść ekspresję i/lub sekrecję PSE, poprzez użycie heterologicznej sekwencji sygnałowej.

Chimerowe białko PSE lub białko fuzyjne PSE według wynalazku, jest wytwarzana standardowymi technikami rekombinacji DNA. Przykładowo, fragmenty DNA kodujące różne sekwencje polipeptydowe są ze sobą łączone za pomocą ligazy w poprawnej ramce odczytu przy użyciu tradycyjnych technik, przykładowo poprzez wykorzystanie do reakcji ligacji tępych lub lepkich końców, trawienie enzymami restrykcyjnymi w celu wprowadzenia odpowiednich końców, wypełnianie lepkich końców, jeśli zachodzi konieczność, traktowanie alkaliczną fosfatazą celem uniknięcia niepożądanych połączeń oraz enzymatyczną ligację. W kolejnym wykonaniu, gen fuzyjny można zsyntetyzować tradycyjnymi technikami, włączając automatyczne syntetyzowanie DNA. Alternatywnie można przeprowadzić amplifikację PCR fragmentów genów przy użyciu starterów kotwiczących, które dają zwisające sekwencje komplementarne do kolejnych fragmentów genu, które następnie można hybrydyzować i ponownie amplifikować w celu uzyskania sekwencji chimerowej (patrz przykładowo, Current Protocols in Molecular Biology, Ed. Ausubel i wsp., John Wiley & Sons: 1992). Ponadto, handlowo dostępna jest duża liczba wektorów ekspresyjnych, które kodują już jednostkę do fuzji (przykładowo polipeptyd GST). Kwas nukleinowy kodujący PSE, można klonować to takiego wektora ekspresyjnego w taki sposób, że jednostka do fuzji jest połączona z białkiem PSE w poprawnej ramce odczytu.

Homologi PSE można wytwarzać poprzez mutagenezę, przykładowo poprzez specyficzną mutagenezę punktową lub przez obcięcie białka PSE. Termin homologi, użyty w niniejszym kontekście, odnosi się do odmiennej formy PSE, która działa jako agonista lub antagonista aktywności PSE. Agonista PSE zasadniczo ma zachowaną tę samą aktywność PSE lub niektóre aktywności biologiczne. Antagonista PSE może hamować jedną lub więcej aktywności naturalnie występującej formy PSE,

PL 207 026 B1 przykładowo poprzez kompetycyjne wiązanie się z elementem leżącym powyżej lub poniżej kaskady metabolicznej dla składników błony komórkowej, która obejmuje PSE lub poprzez wiązanie się z białkiem PSE, które bierze udział w transporcie składników przez błony komórkowe, tym samym hamując ich przemieszczanie.

W alternatywnym wykonaniu, homologi PSE można identyfikować poprzez przeszukiwanie kombinowanych bibliotek z mutantów, przykładowo obciętych mutantów z PSE, zwracając uwagę na aktywność agonisty PSE lub antagonisty PSE. W jednym z wykonań, wytwarzana jest urozmaicona biblioteka odmian PSE za pomocą kombinatorycznej mutagenezy na poziomie kwasu nukleinowego i kodującej urozmaiconej biblioteki genetycznej. Urozmaiconą bibliotekę odmian PSE, można wytwarzać przykładowo poprzez enzymatyczną reakcję ligacji mieszaniny syntetycznych oligonukleotydów do sekwencji genomowych, tak że wytworzony zestaw potencjalnych sekwencji PSE można wyrazić jako poszczególne polipeptydy lub alternatywnie, jako zestaw większych białek fuzyjnych (przykładowo do ekspresji na fagu). Istnieje wiele metod, które można użyć do wytwarzania bibliotek potencjalnych homologów PSE, ze zdegenerowanej sekwencji i oligonukleotydowej. Chemiczną syntezę zdegenerowanej sekwencji genu można przeprowadzić w syntetyzerze DNA a syntetyczny gen można następnie łączyć w reakcji ligacji, ze stosownym wektorem ekspresyjnym. Użycie zdegenerowanego zestawu genów pozwala na wprowadzenie w mieszaninie wszystkich sekwencji, które kodują pożądany zestaw potencjalnych sekwencji PSE. Metody syntezy zdegenerowanych oligonukleotydów są dobrze znane specjalistom [patrz przykładowo, Narang, S.A. (1983) Tetrahedron 39:3; Itakura i wsp. (1984) Annu. Rev. Biochem. 53:323; Itakura i wsp., (1984) Science 198:1056; Ike i wsp. (1983) Nucleic Acids Res. 11:477].

Dodatkowo, biblioteki z fragmentów PSE można użyć do wytwarzania urozmaiconych populacji fragmentów PSE, w celu przeszukiwania a następnie selekcjonowania homologów białka PSE. W jednym wykonaniu, biblioteka fragmentów sekwencji kodującej może być wytworzona poprzez traktowanie dwuniciowego fragmentu PCR sekwencji kodującej PSE nukleazą w warunkach, w których przerwanie podwójnej nici pojawia się średnio raz na cząsteczkę, denaturację dwuniciowego DNA, powtórną hybrydyzację DNA z wytworzeniem dwuniciowego DNA obejmującego pary sensowne/antysensowne różnych produktów z przerwami w podwójnej nici, usuniecie jednoniciowych części z nowo powstałych dupleksów poprzez traktowanie nukleazą S1 oraz ligację uzyskanej biblioteki fragmentów z wektorem ekspresyjnym. Metoda ta, pozwala na dostarczenie biblioteki ekspresyjnej, która koduje fragmenty z końca N, końca C i wewnętrzne PSE o różnych rozmiarach.

Specjaliści znają szereg metod przeszukiwania produktów genów w bibliotekach kombinatorycznych, które zostały wytworzone poprzez mutacje punktowe lub poprzez obcięcie i przeszukiwania bibliotek cDNA, pod kątem produktów genów o wybranych właściwościach. Techniki te można zaadoptować do szybkiego przeszukiwania bibliotek genetycznych, które zostały wytworzone poprzez kombinatoryczną mutagenezę homologów PSE. Najczęściej stosowane techniki przeszukiwania dużych bibliotek genetycznych, poddawanych wysokowydajnej analizie obejmują klonowanie biblioteki genetycznej w samoreplikującym wektorze ekspresyjnym, transformowanie stosownych komórek uzyskaną na wektorze biblioteką, wyrażanie kombinatorycznych genów w warunkach, w których wykrywanie pożądanej aktywności ułatwia izolację wektora kodującego gen, którego produkt został wykryty. Do identyfikowania homologów PSE można zastosować nową technikę REM (ang. recursive ensemble mutagenese) podnoszącą częstość funkcjonalnych mutantów w bibliotekach, w kombinacji z testami przesiewowymi [Arkin and Yourvan (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:7811-7815; Delgrave i wsp. (1993) Protein Engineering 5(3):327-331]. Korzystnie można także użyć kombinacji wspomnianych powyżej metod.

Dalszą znaną techniką modyfikowania katalitycznych właściwości enzymów lub genów je kodujących jest podmiana genów (patrz przykładowo, WO 97/20078 lub WO 98/13487), która polega na kombinacji fragmentów genów, gdzie nowa kombinacja może dodatkowo być zmieniona dzięki reakcjom łańcuchowym polimerazy wprowadzającym błędy tak, że tworzona jest wysoka różnorodność sekwencyjna do testowania. Jednakże wstępnym warunkiem użycia takiego podejścia, jest dysponowanie stosownym systemem przeszukiwania, w celu testowania funkcjonalności uzyskanego zróżnicowania genów. Dysponowanie metodą przesiewową, która identyfikuje aktywność enzymatyczną zależną od PUFA, lub aktywności, jest wstępnym warunkiem, w szczególności przy przeszukiwaniu pod kątem aktywności na elongazę. Co do aktywności elongazy ze specyficznością do kwasów PUFA, dla przeprowadzenia wstępnego przeszukiwania opartego na wzroście w Mucor sp., który można transformować pożądanymi konstruktami genu, przy pomocy znanych metod transformacji (Eroshin

PL 207 026 B1 i wsp., Mikrobiologiya, Tom 65, Nr 1, 1996, str. 31-36) można wykorzystywać toksyczność kwasu arachidonowego w obecności toksycznego metabolitu (tutaj: kwas salicylowy lub pochodne kwasu salicylowego). Uzyskane klony można analizować pod kątem ich składu lipidowego, sposobami chromatografii gazowej lub spektroskopii mas, w celu zidentyfikowania natury i ilości materiałów wyjściowych i produktów.

W kolejnym wykonaniu, można wykonać testy oparte na komórkach do analizy urozmaiconej biblioteki PSE stosując dodatkowe procesy znane specjalistom.

W kolejnym wykonaniu, niniejszy wynalazek dotyczy przeciwciała, które wiąże się swoiście z polipeptydem według niniejszego wynalazku lub z fragmentami, przykładowo epitopami, takiego białka. Przeciwciało według wynalazku można użyć do identyfikowania i izolowania elongaz, w szczególności białek PSE. Przeciwciała takie mogą być przeciwciałami monoklonalnymi, przeciwciałami poliklonalnymi lub syntetycznymi przeciwciałami, a także fragmentami tych przeciwciał takimi jak, przykładowo, fragmenty Fab, Fv czy scFV itd. Przeciwciała monoklonalne można wytwarzać, przykładowo, sposobami takimi jak opisane po raz pierwszy przez Kohler i Milstein i Nature 256 (1975), 485 oraz Galfro w Meth. Enzymol. 73 (1981). Przeciwciała i ich fragmenty można także wytwarzać, przykładowo, według Harlow & Lane, Antibodies, a Laboratory Manual, CSH Press, Cold Spring Harbor, 1988. Przeciwciała te można użyć do wytrącania i lokalizowania, przykładowo, białek według wynalazku lub do monitorowania syntezy tych białek, przykładowo w zrekombinowanych organizmach oraz do identyfikowania składników oddziałujących z białkami według wynalazku. W wielu przypadkach, wiązanie przeciwciał z antygenami jest równoważne wiązaniu innych ligandów i antyligandów.

Niniejszy wynalazek ponadto dotyczy procesu identyfikowania agonisty i antagonisty elongaz, w szczególności białek PSE, obejmującego:

a) kontaktowania się komórek, które wytwarzają polipeptyd według niniejszego wynalazku z wytypowaną substancją;

b) testowania aktywności PSE;

c) porównania aktywności PSE ze standardową aktywnością przy nieobecności wytypowanej substancji, gdzie aktywność PSE, która jest wyższa od standardowej wskazuje, że wytypowana substancja jest agonistą i gdzie aktywność PSE, która jest niższa od standardowej wskazuje, że wytypowana substancja jest antagonistą.

Wspomniana wytypowana substancja może być substancją zsyntetyzowaną chemicznie lub wyprodukowaną mikrobiologicznie obecną, przykładowo w ekstraktach komórkowych, przykładowo, z roślin, zwierząt czy mikroorganizmów. Wspomniana substancja może ponadto być znana specjalistom, lecz dotąd nieznana jako podnosząca lub hamująca aktywność białek PSE. Mieszaniną reakcyjną może być układ bezkomórkowy lub obejmujący komórki czy hodowle komórkową. Stosowne metody znane są specjalistom i zostały opisane ogólnie, przykładowo, w Alberts, Molecular Biology of the cell, wyd. 3 (1994), przykładowo rozdz. 17. Wspomniane substancje można dodać, przykładowo, do mieszaniny reakcyjnej lub pożywki hodowlanej lub wstrzyknąć do komórek czy rozpylić na roślinę.

Jeśli zidentyfikowana zostanie próbka, która zawiera substancję aktywną zgodnie z metodą według wynalazku możliwe jest wyizolowanie substancji bezpośrednio z wyjściowej próbki, lub podzielenie próbki na różne grupy, przykładowo, kiedy składa się ona z dużej liczby różnych składników w celu zredukowania ilości różnych substancji w próbce, a następnie powtórzenie procesu, według wynalazku, z taką podpróbką wyjściowej próbki. W zależności od złożoności próbki opisanej powyżej, etapy można powtarzać kilka razy, korzystnie, dopóki próbka zidentyfikowana metodą, według wynalazku, obejmuje jedynie małą liczbę substancji lub tylko jedną substancję. Substancja zidentyfikowana, metodą według wynalazku, lub jej pochodne, korzystnie są wytwarzane dodatkowo tak, że są one właściwe do stosowania w hodowli roślin lub w kulturach komórkowych czy tkankowych.

Substancjami, które można identyfikować i testować za pomocą procesu, według wynalazku, mogą być: biblioteki ekspresyjne, przykładowo ekspresyjne biblioteki cDNA, peptydy, białka, kwasy nukleinowe, przeciwciała, małe substancje organiczne, hormony, cząsteczki PNA lub podobne (Milner, Nature Medicin 1 (1995), 879-880; Hupp, Cell. 83 (1995), 237-245; Gibbs, Cell. 79 (1994), 193-198 oraz literatura tam cytowana). Substancje te mogą być także funkcjonalnymi pochodnymi lub analogami znanych inhibitorów lub aktywatorów. Procesy wytwarzania chemicznych pochodnych lub analogów są znane specjalistom. Znane pochodne lub analogi można testować, stosując procesy ze stanu techniki. Ponadto możliwe jest użycie projektowania wspomaganego komputerem lub peptydomimetyki do wytwarzania stosownych pochodnych i analogów. Komórka lub tkanka stosowana do proce36

PL 207 026 B1 su(ów) według wynalazku, korzystnie jest komórką gospodarza, komórką roślinną lub tkanką roślinną jak opisano w wykonaniach powyżej.

Odpowiednio, niniejszy wynalazek dotyczy także substancji, która została zidentyfikowana za pomocą procesu według wynalazku, opisanego powyżej. Substancja jest, przykładowo, homologiem białka PSE według wynalazku. Homologi białek PSE można wytwarzać poprzez mutagenezę, przykładowo przez mutację punktową czy delecję w PSE. Użyty tu termin homolog oznacza odmienną formę białek PSE, która działa jako agonista lub antagonista aktywności PSE. Agonista może posiadać zasadniczo tę samą lub część biologicznej aktywności białek PSE. Antagonista białek PSE może hamować jedną lub więcej aktywności naturalnie występujących form białek PSE, przykładowo wiązać się kompetytywnie z przedstawicielem wczesnego, bądź późnego etapu szlaków metabolicznych syntezy kwasów tłuszczowych, włączając białka PSE lub wiązać się z białkami PSE i redukować lub hamować aktywność w tym procesie.

Zatem, niniejszy wynalazek dotyczy także przeciwciała czy jego fragmentu jak tu opisano, hamującego aktywność białek PSE według wynalazku.

Jeden aspekt według wynalazku dotyczy przeciwciała, które swoiście rozpoznaje lub wiąże się z opisanym powyżej agonistą lub antagonistą według wynalazku.

Kolejny aspekt dotyczy kompozycji, która obejmuje przeciwciało, cząsteczkę stop lub antysensowna zidentyfikowaną za pomocą procesu według wynalazku.

E. Zastosowania i procesy/metody według wynalazku

Opisane tu cząsteczki kwasu nukleinowego, białka, homologi białek, białka fuzyjne, przeciwciała, startery, wektory i komórki gospodarza, można stosować w jednej lub większej liczbie następujących metod: identyfikowanie Physcomitrella patens, Crypthecodinium, Phytophthora infestans lub Thraustochytrium i organizmów pokrewnych, mapowanie genomowe organizmów pokrewnych z Physcomitrella, Phytophthora, Crypthecodinium lub Thraustochytrium, identyfikowanie i lokalizowanie interesujących sekwencji z Physcomitrella, Phytophthora, Crypthecodinium lub Thraustochytrium, badania ewolucyjne, określanie regionów białka PSE wymaganych dla jego funkcji, modulowanie aktywności PSE; modulowanie metabolizmu jednego lub większej liczby składników błony komórkowej; modulowanie transportu transbłonowego jednego lub większej liczby związków oraz modulowanie produkcji komórkowej pożądanych związków, takich jak wysokowartościowe związki chemiczne. Cząsteczki kwasu nukleinowego dla PSE według wynalazku mają wielorakie zastosowanie. Po pierwsze, można je stosować do identyfikowania organizmów takich jak Physcomitrella, Phytophthora, Crypthecodinium lub Thraustochytrium lub blisko im spokrewnionych. Można je także stosować do identyfikowania obecności Physcomitrella, Crypthecodinium, Phytophthora lub Thraustochytrium lub organizmów im pokrewnych w mieszanej populacji mikroorganizmów. Wynalazek dostarcza także sekwencji kwasów nukleinowych serii genów z Physcomitrella, Phytophthora, Crypthecodinium lub Thraustochytrium; obecność lub nieobecność takiego organizmu można określić poprzez przeszukanie wyekstrahowanego genomowego DNA, z hodowli jednorodnej lub zmieszanej populacji mikroorganizmów w ostrych warunkach z sondą pokrywającą region genu z Physcomitrella, Crypthecodinium, Phytophthora lub Thraustochytrium, który jest unikatowy dla tego organizmu lub pokrywającą fragment tego genu. Physcomitrella, Crypthecodinium, Phytophthora lub Thraustochytrium same są stosowane do handlowej produkcji wielonienasyconych kwasów. Ponadto, kwasy nukleinowe według wynalazku, są odpowiednie do produkcji kwasów PUFA, także w innych organizmach, w szczególności wówczas, gdy zamiarem jest wprowadzenie uzyskanych kwasów PUFA do frakcji triacyloglicerolu.

Ponadto, cząsteczki kwasu nukleinowego i białka według wynalazku mogą działać jako markery dla specyficznych regionów genomu. Są one nie tylko stosowne do mapowania genomu, lecz także do badań funkcjonalnych białek z Physcomitrella, Phytophthora, Crypthecodinium lub Thraustochytrium. Dla zidentyfikowania regionu genomowego, z którym wiąże się określone białko wiążące DNA z Physcomitrella, Crypthecodinium, Phytophthora lub Thraustochytrium można, przykładowo, pofragmentować genom Physcomitrella, Crypthecodinium, Phytophthora lub Thraustochytrium i fragmenty inkubować z białkiem wiążącym DNA. Regiony, które wiążą białko, można dodatkowo przeszukiwać cząsteczkami kwasu nukleinowego według wynalazku, korzystnie łatwo wykrywalnymi markerami. Związanie takiej cząsteczki kwasu nukleinowego z fragmentem genomowym, umożliwia lokalizację fragmentu na mapie genomowej Physcomitrella, Phytophthora, Crypthecodinium lub Thraustochytrium i, jeśli jest to przeprowadzone powtarzalnie dla różnych enzymów, ułatwia szybką determinację sekwencji kwasu nukleinowego, z którą wiąże się białko. Ponadto, cząsteczki kwasu nukleinowego według wynalazku, mogą mieć wystarczającą homologię z sekwencjami dla tych cząsteczek kwasu nuPL 207 026 B1 kleinowego u gatunków pokrewnych i mogą działać jako markery do konstruowania mapy genomowej, dla pokrewnych grzybów i glonów.

Cząsteczki kwasu nukleinowego dla PSE według wynalazku, są również przydatne w badaniach ewolucyjnych oraz w badaniach struktury białka. Procesy metaboliczne i transport, w których wymagane są cząsteczki według wynalazku, wykorzystywane są przez dużą liczbę komórek prokariotycznych i eukariotycznych; ewolucyjny stopień pokrewieństwa tych organizmów można określać poprzez porównanie sekwencji cząsteczek kwasu nukleinowego według wynalazku, z tymi, które kodują podobne enzymy z innych organizmów. Zatem, porównanie takie pozwala na określenie, które z regionów sekwencji są konserwowane, a które nie są, co może być przydatne przy określaniu regionów białka istotnych dla funkcji enzymatycznej. Taki rodzaj determinacji jest użyteczny przy badaniach inżynierii białka i wskazuje, jak dalece może być tolerowana mutageneza białka bez utraty jego funkcji.

Manipulowanie cząsteczkami kwasu nukleinowego dla PSE według wynalazku, może prowadzić do produkcji białek PSE posiadających różnice funkcjonalne wobec białek PSE dzikiego typu. Skuteczność czy aktywność tych białek można ulepszać, mogą być obecne w komórce w większej ilości niż zazwyczaj; lub ich skuteczność czy aktywność można zredukować. Ulepszona skuteczność czy aktywność oznacza, przykładowo, że enzym posiada wyższą selektywność i/lub aktywność, korzystnie aktywność, która jest co najmniej 10% wyższa, szczególnie aktywność, która jest co najmniej 20% wyższa, bardzo szczególnie korzystnie aktywność, która jest co najmniej 30% wyższa niż dla oryginalnego enzymu.

Istnieje szereg mechanizmów, dzięki którym można modyfikować PSE według wynalazku co może bezpośrednio wpływać na ilość, produkcję i/lub wydajność produkcyjną wysokowartościowego związku chemicznego, obejmującego takie zmodyfikowane białko. Uzyskiwanie wysokowartościowych związków chemicznych z hodowli, orzęsków, glonów czy grzybów, na dużą skalę, jest znacząco udoskonalone, kiedy komórka wydziela pożądane związki, ponieważ związki te można z łatwością izolować z pożywki hodowlanej (w odróżnieniu od ekstrakcji z biomasy hodowanych komórek). Z drugiej strony, oczyszczanie można ulepszyć gdy komórka gromadzi związki in vivo, w wyspecjalizowanych przedziałach komórkowych, dzięki mechanizmowi zatężania. W roślinach wyrażających białka PSE zwiększony transport może prowadzić do ich lepszego rozmieszczenia w tkance roślinnej, czy organach roślinnych. Zwiększona liczba czy aktywność cząsteczek transportera, które eksportują wysokowartościowe związki chemiczne z komórki, może pozwalać na zwiększenie ilości produkowanego związku wysokowartościowego obecnego w pożywce na zewnątrz komórki, a tym samym ulepszyć zbieranie i oczyszczanie lub, w przypadku roślin, wydajniejsze rozmieszczenie. Dla kontrastu, podwyższenie ilości kofaktorów, cząsteczek prekursorowych czy produktów pośrednich, stosownych szlaków biosyntez, jest wymagane dla wydajnej nadprodukcji jednego lub więcej wysokowartościowych związków chemicznych. Podniesienie ilości i/lub aktywności białek transporterowych, wymaganych w imporcie składników odżywczych takich jak źródła węgla (tj. cukrów), źródeł azotu (tj. aminokwasów, soli amonowych), fosforanu i siarki może ulepszyć produkcję wysokowartościowego związku chemicznego na skutek wyeliminowania wszystkich ograniczeń w pożywieniu dostępnych dla procesu biosyntezy. Kwasy tłuszczowe takie jak PUFA czy lipidy obejmujące PUFA, są jako takie pożądanymi wysokowartościowymi związkami chemicznymi. Optymalizowanie aktywności czy podniesienie ilości jednej, czy większej liczby białek PSE według wynalazku, wymaganej w biosyntezie tych związków czy zniszczenie aktywności jednej, czy większej liczby białek PSE wymaganej do obniżenia ilości tych związków, może zatem podnieść ilość, produkcję i/lub wydajność produkcyjną cząsteczek kwasu tłuszczowego i lipidu w orzęskach, glonach, roślinach, grzybach, drożdżach czy innych mikroorganizmach.

Manipulacja jednym lub większa liczbą genów dla PSE według wynalazku może także prowadzić do powstania białek PSE o zmodyfikowanych aktywnościach, które pośrednio wywierają wpływ na produkcję jednego lub więcej wysokowartościowych związków chemicznych z glonów, roślin, orzęsków czy grzybów. Normalne biochemiczne procesy metaboliczne prowadzą, przykładowo, do produkcji wielu produktów odpadowych (przykładowo nadtlenku wodoru i innych rodzajów reaktywnego tlenu), które mogą aktywnie uszkadzać te procesy metaboliczne [przykładowo, wiadomo, że nadtlenoazotyn nitruje łańcuch boczny tyrozyny, zatem inaktywuje niektóre enzymy z tyrozyną w centrum aktywnym; Groves, J.T. (1999) Curr. Opin. Chem. Biol. 3(2);226-235]. Ponieważ te produkty odpadowe są normalnie wydzielane z organizmu, komórki stosowane do produkcji fermentacyjnej na dużą skalę są optymalizowane do nadprodukowania jednego lub większej liczby, wysokowartościowych związków chemicznych i mogą zatem produkować więcej produktów odpadowych niż zwyczajna komórka dzikiego typu. Optymalizowanie aktywności jednego, lub większej ilości białek PSE według wynalazku,

PL 207 026 B1 które są wymagane w eksporcie cząsteczek odpadowych, pozwala na polepszenie żywotności komórki i utrzymywanie wydajnej aktywności metabolicznej. Także obecność wysokich i wewnątrzkomórkowych ilości pożądanego wysokowartościowego związku chemicznego może być w rzeczywistości toksyczna dla komórki, zatem żywotność komórki można polepszyć, przez podniesienie zdolności komórki do wydzielania tych związków.

Ponadto, białkami PSE według wynalazku, można manipulować w taki sposób, że modyfikowane są względne ilości różnych cząsteczek lipidów czy kwasów nukleinowych. Może to mieć decydujący wpływ na kompozycje lipidów błony komórkowej. Ponieważ każdy rodzaj lipidu posiada różne właściwości fizyczne, modyfikacja kompozycji lipidów błony, może znacząco modyfikować płynność błony. Zmiany w płynności błony mogą wpływać na transport cząsteczek poprzez błonę, jak wyjaśniono powyżej, mogą modyfikować eksport produktów odpadowych lub wytworzonego wysokowartościowego związku chemicznego, czy import potrzebnych składników odżywczych. Zmiany w płynności błony mogą także posiadać decydujący wpływ na integralność komórkową. Komórki z porównywalnie słabszymi błonami są bardziej wrażliwe na warunki abiotyczne i biotyczne warunki stresu, które mogą niszczyć czy zabijać komórkę. Manipulacja białkami PSE wymaganymi do produkcji kwasów tłuszczowych i lipidów do syntezy błony, w wyniku której błona posiada kompozycję bardziej wrażliwą na warunki środowiskowe panujące w hodowlach stosowanych do produkcji wysokowartościowych związków chemicznych, powinna pozwolić na przetrwanie i namnożenie większej ilości komórek. Większa liczba produkujących komórek powinna się manifestować większą ilością, wyższą produkcją lub wyższą wydajnością produkcyjną wysokowartościowego związku chemicznego w hodowli.

Wspomniane powyżej strategie mutagenezy białek PSE mające na celu podniesienie wydajności wysokowartościowego związku chemicznego nie mają być interpretowane jako ograniczające. Odmiany tych strategii są oczywiste dla specjalistów. Stosując te mechanizmy, łącznie z mechanizmami tutaj ujawnionymi, cząsteczki kwasu nukleinowego i białka według wynalazku można stosować do wytwarzania glonów, orzęsków, roślin, zwierząt grzybów i innych mikroorganizmów takich jak C. glutamicum, które wyrażają zmutowane cząsteczki kwasu nukleinowego PSE lub białka tak, że ulepszona jest ilość, produkcja i/lub wydajność produkcyjna pożądanego związku. Ten pożądany związek może być dowolnym, naturalnym produktem pochodzącym z glonów, orzęsków, roślin, zwierząt, grzybów czy bakterii, które obejmują końcowe produkty szlaków biosyntetycznych oraz produkty pośrednie, naturalnie występującego szlaku metabolicznego a także cząsteczki, które nie występują naturalnie w metabolizmie tych komórek, lecz są produkowane przez komórki według wynalazku.

Kolejnym wykonaniem według wynalazku, jest proces produkowania kwasów PUFA, który obejmuje hodowanie organizmu, zawierającego kwas nukleinowy według wynalazku, konstrukt genowy według wynalazku, czy wektor według wynalazku, który koduje polipeptyd wydłużający kwasy tłuszczowe C16-, C18- lub C20 z co najmniej dwoma i wiązaniami podwójnymi w cząsteczce kwasu tłuszczowego, o co najmniej dwa atomy węgla w warunkach, w których organizmach produkowane są kwasy PUFA. Kwasy PUFA wytworzone za pomocą tego procesu, można izolować poprzez zbieranie organizmów z hodowli, w której rosły lub z pola i niszczenie i/lub ekstrahowanie materiału rozpuszczalnikiem organicznym. Z rozpuszczalnika tego można izolować olej, który zawiera lipidy, fosfolipidy, sfingolipidy, glikolipidy, triacyloglicerole i/lub wolne kwasy tłuszczowe, z podwyższoną zawartością kwasów PUFA. Wolne kwasy tłuszczowe z podwyższoną zawartością kwsów PUFA można izolować poprzez zasadową lub kwaśną hydrolizę lipidów, fosfolipidów, sfingolipidów, glikolipidów i triacylogliceroli. Podwyższona zawartość cząsteczek PUFA oznacza co najmniej 5%, korzystnie 10%, szczególnie korzystnie 20% i bardzo szczególnie korzystnie 40% więcej kwasów PUFA niż w organizmie wyjściowym, który nie posiada dodatkowego kwasu nukleinowego, kodującego elongazę według wynalazku.

Produkowane za pomocą tego procesu kwasy PUFA korzystnie są cząsteczkami kwasu tłuszczowego C18-, C20- lub C22 z co najmniej dwoma wiązaniami podwójnymi, korzystnie trzema, czterema, pięcioma i sześcioma wiązaniami podwójnymi, szczególnie korzystnie trzema lub pięcioma wiązaniami podwójnymi. Cząsteczki kwasu tłuszczowego C18-, C20- lub C22 można izolować z organizmu w formie oleju, lipidu czy wolnego kwasu tłuszczowego. Przykłady odpowiednich organizmów omówiono powyżej. Korzystnymi organizmami są mikroorganizmy, zwierzęta czy rośliny, szczególnie korzystne są rośliny czy glony, bardzo szczególnie korzystne są rośliny transgeniczne.

Wykonanie według wynalazku obejmuje oleje, lipidy, kwasy tłuszczowe lub ich frakcje, które zostały wytworzone za pomocą procesu opisanego powyżej. Szczególnie korzystna kompozycja olei, lipidów czy kwasów tłuszczowych obejmuje kwasy PUFA i pochodzi z roślin transgenicznych.

PL 207 026 B1

Jednym z wykonań według wynalazku są oleje, lipidy lub kwasy tłuszczowe, które zostały wytworzone za pomocą procesu według wynalazku. Innymi wykonaniami według wynalazku są kompozycje olei, lipidów lub kwasów tłuszczowych, które obejmują kwasy PUFA wytworzone za pomocą procesu według wynalazku i które pochodzą z roślin transgenicznych obejmujących kwas nukleinowy, konstrukt genu lub wektor według wynalazku.

Kolejnym wykonaniem według wynalazku jest użycie kompozycji olei, lipidów czy kwasów tłuszczowych w przemyśle żywności zwierząt, przemyśle żywnościowym, przemyśle kosmetycznym i przemyśle farmaceutycznym.

Kolejne wykonanie według wynalazku dotyczy zestawu, obejmującego kwas nukleinowy według wynalazku, konstrukt genowy według wynalazku, sekwencję aminokwasową według wynalazku, cząsteczkę antysensownego kwasu nukleinowego według wynalazku, przeciwciało i/lub kompozycję według wynalazku, antagonistę lub agonistę wytworzonego za pomocą procesu według wynalazku i/lub oleje, lipidy i/lub kwasy tłuszczowe według wynalazku lub ich frakcje. Zestaw może także obejmować komórki gospodarza, organizmy lub rośliny według wynalazku, lub ich części, części roślin według wynalazku, które można zbierać lub materiał do rozmnażania czy innego antagonistę lub agonistę według wynalazku. Składniki zestawu według niniejszego wynalazku mogą być zapakowane w stosowne pojemniki, przykładowo wraz z buforami czy innymi roztworami. Jeden lub więcej wymienionych składników można zapakować do jednego i tego samego pojemnika. Dodatkowo lub alternatywnie jeden lub więcej wymienionych składników może, przykładowo, występować w formie zaabsorbowanej na stałym podłożu, przykładowo na filtrze nitrocelulozowym, płytce szklanej, chipie, błonie nylonowej czy na płytkach mikrotitracyjnych. Zestaw można stosować w dowolnych opisanych tu metodach i wykonaniach, przykładowo do produkcyjnych komórek gospodarza, roślin transgenicznych, do wykrywania sekwencji homologicznych, do identyfikowania antagonistów i agonistów i im podobnych. Ponadto, zestaw może zawierać instrukcje użycia zestawu, w jednym ze wspomnianych zastosowań.

Wynalazek jest zilustrowany bardziej szczegółowo poprzez przedstawione poniżej przykłady, które nie mają na celu ograniczenia wynalazku. Zawarte odniesienia, zgłoszenia patentowe, patenty i opublikowane zgłoszenia patentowe, cytowane w tym zgłoszeniu patentowym, są włączone na drodze referencji.

P r z y k ł a d y

P r z y k ł a d 1: Ogólne metody

a) Ogólne metody klonowania:

Metody klonowania takie jak, przykładowo, trawienia restrykcyjne, elektroforeza w żelu agarozowym, oczyszczanie fragmentów DNA, przenoszenie kwasów nukleinowycii na filtry nylonowe, łączenie fragmentów DNA, transformacja komórek Escherichia coli i drożdży, hodowle bakterii oraz analiza sekwencji DNA przeprowadzano według opisu w Sambrook i wsp. [(1989), Cold Spring Harbor Laboratory Press: ISBN 0-87969-309-6] or Kaiser, Michaelis and Mitchell [(1994), Methods in Yeast Genetics, Cold Spring Harbor Laboratory Press: ISBN 0-87969-451-3]. Transformację i hodowlę glonów takich jak Chlorella czy Phaeodactylum przeprowadzano według opisu E1-Sheekh [(1999), Biologia Plantarum 42:209-216] lub Apt i wsp. [(1996) Molecular and General Genetics 252 (5):872-9].

b) Odczynniki chemiczne

Stosowane odczynniki chemiczne, o ile w tekście nie podano inaczej, posiadały analityczny stopień jakości i pochodziły z Fluka (Neu-Ulm), Merck (Darmstadt), Roth (Karlsruhe), Serva (Heidelberg) and Sigma (Deisenhofen). Roztwór przygotowano stosując wodę wolną od pirogenów, określaną w przedstawionym tekście jako H2O, z systemu Milli-Q do oczyszczania wody (Millipore, Eschborn). Endonukleazy restrykcyjne, enzymy modyfikujące DNA i zestawy do biologii molekularnej, pochodziły z AGS (Heidelberg), Amersham (Brunswick), Biometra (Gottingen), Boehringer (Mannheim), Genomed (Bad Oeynhausen), New England Biolabs (Schwalbach/Taunus), Novagen (Madison, Wisconsin, USA), Perkin-Elmer (Weiterstadt), Pharmacia (Freiburg), Qiagen (Hilden) i Stratagene (Amsterdam, Netherlands). Stosowano je według zaleceń producenta, o ile w tekście nie podano inaczej.

c) Materiał komórkowy

Niniejsze badania przeprowadzano stosując szczep Thraustochytrium dostępny w American Type Culture Collection (ATCC) pod numerem szczepu ATCC26185 (Thraustochytrium) lub, w przypadku Crypthecodinium, w Provasoli-Guillard National Center for Culture of Marine Phytoplankton ((CCMP) West Boothbay Harbour, ME, USA), pod numerem szczepu CCMP316. Glony hodowano w ciemności w 25 stopniach Celsjusza w szklanych probówkach, do których z dołu doprowadzano

PL 207 026 B1 powietrze. Alternatywnie, Thraustochytrium hodowano tak jak szczegółowo opisano w Singh & Ward (1997, Advances in Microbiology, 45, 271-311).

Pożywkę hodowlaną dla Crypthecodinium stanowiła pożywka hodowlana f/2 uzupełniona 10% pożywką organiczną według Guillard, R.R.L [1975; Culture of phytoplankton for feeding marine invertebrates. In: Smith, W.L. and Chanley, M.H. (Wyd.) Culture of marine Invertebrate animals, NY Plenum Press, str. 29-60.]. Zawiera ona: 995,5 ml (syntetycznej) słonej wody; 1 ml NaNO3 (75 g/l); 1 ml NaH2PO4 (5 g/l); 1 ml roztworu metali śladowych; 1 ml Tris/CI pH 8,0; 0,5 ml roztworu witamin dla f/2.

Roztwór metali śladowych: Na2EDTA (4,36 g/l); FeCl3 (3,15 g/l);

Podstawowe metale śladowe: CUSO4 (10 g/l); ZnSO4 (22 g/l); CoCl2 (10 g/l); MnCl2 (18 g/l); NaMoO4 (6,3 g/l)

Roztwór witamin dla f/2: biotyna: 10 mg/l; tiamina 200 mg/l; witaminy B12 0,1 mg/l

Pożywka org.: octan sodowy (1 g/l), glukoza (6 g/l), bursztynian sodowy (3 g/l), Bactotryptone (4 g/l), ekstrakt drożdżowy (2 g/l)

d) Materiał mchu (= materiał roślinny)

W tych badaniach stosowano rośliny z gatunku Physcomitrella patens (Hedw.) B.S.G. z kolekcji Zakładu badań genetycznych Uniwersytetu w Hamburgu, Są one pochodną szczepu 16/14, z kolekcji H.L.K, Whitehouse w Gransden Wood, Huntingdonshire (England) i uzyskane zostały ze spor przez Engel (1968, Am J Bot 55, 438-446). Rozmnażanie wegetatywne roślin przeprowadzano ze spor i poprzez regeneracją gametofitów. Protonema rozwija się z haploidalnej spory, w bogatą w chloroplasty chloronemę i pozbawioną chloroplastów kaulonemę, które pączkują po średnio 12 dniach. Pączki te rozwijają się w gametofory i anterydiami i archeogoniami. Zapłodnienie prowadzi do powstania diploidalnego sporofitu z krótkim trzonkiem (setą), komorą zarodnikową, w której dojrzewają mejospory.

e) Hodowla roślin

Rośliny hodowano w komorach z kontrolowanymi warunkami w temp. powierza 25°C i przy natężeniu światła 55 gmol.s'¹.m'² (światło białe; Philips TL 65W/25 fluorescent tube) w warunkach światło/ciemność w przedziałach 16/8 godz. Mech hodowano w hodowlach płynnych stosując pożywkę Reski and Abel's modified knop medium (1985, Planta 165, 354-358) lub na podłożu stałym, knop medium, zawierającym 1% Oxoid agar (Unipath, Basingstoke, England).

Splątki używane do izolacji RNA i DNA hodowano w płynnych, napowietrzanych hodowlach. Splątki rozdrabniano co 9 dni i przenoszono do nowej pożywki hodowlanej.

f) Kultywacja Phytophthora infestans

Najpierw skonstruowano bibliotekę cDNA z Phytophthora infestans. W tym celu, możliwe było uzyskanie szczepu ATCC 48886 z American Type Culture Collection Rockville, USA. Odmiennie do przepisu hodowli podanego dla szczepu ATCC 48886, spory Phytophthora płukano dwukrotnie zimną wodą destylowaną i trzymano przez 6 godz. w lodówce, dla zaindukowania sporulacji. Materiał przenoszono następnie do pożywki z grochu. W tym celu, 150 g mocno zamrożonego grochu (Iglu, kupowanego w miejscowym supermarkecie) autoklawowano w sterylnych warunkach w 1 l wody przez 20 min. Materiał hodowano w 100 ml kolbach w temp. pokojowej, na wytrząsarce orbitalnej (200 rpm). Po dwóch dniach, materiał po przefiltrowaniu kolb rozdrabniano w ciekłym azocie, stosując moździerz i tłuczek a po kolejnych 4 dniach procedurę powtarzano w każdym przypadku dla 2 kolb.

P r z y k ł a d 2: Izolacja całkowitego DNA z roślin i mikroorganizmów takich jak Thraustochytrium i Crypthecodinium do doświadczeń hybrydyzacyjnych

Szczegóły dotyczące izolacji całkowitego DNA są opracowane dla jednego grama świeżej masy materiału roślinnego.

Bufor CTAB: 2% (w/v) bromek N-acetylo-N,N,N-trimetylamonowy (CTAB); 100 mM Tris-HCI, pH 8,0; 1,4 M NaCI; 20 mM EDTA

Bufor N-Laup/losarkozynowy: 10% (w/v) N-laurylosarkozyna; 100 mM Tris-HCI, pH 8,0; 20 mM

EDTA

Materiał roślinny lub materiał komórkowy z Crypthecodinium czy Thraustochytrium ucierano w ciekłym azocie przy użyciu moździerza i drobny proszek przenoszono do 2 ml probówek Eppendorfa. Zamrożony materiał roślinny przykrywano warstwą z 1 ml buforu do lizy (1 ml buforu CTAB, 100 ml buforu N-laurylosarkozynowego, 20 ml β-merkaptoetanolu i 10 ml roztworu proteinazy K, 10 mg/ml) i inkubowano w 60°C przez jedną godz. ze stałym mieszaniem. Uzyskany homogenat rozdzielano na dwie probówki Eppendorfa (2 ml) i dwukrotnie ekstrahowano z wytrząsaniem, równą objętością mieszaniny chloroform/alkohol izoamylowy (24:1). W celu rozdziału faz przeprowadzano wirowanie przy 8000 x g w RT (= temp. pokojowa = ~23°C) przez 15 min. w każdym przypadku. Następnie DNA wyPL 207 026 B1 trącano w -70°C przez 30 min. stosując schłodzony w lodzie izopropanol. Wytrącony DNA osadzano w 4°C przy 10000 g przez 30 min. i zawieszano w 180 ml buforu TE (Sambrook i wsp., 1989, Cold Spring Harbor Laboratory Press: ISBN 0-87969-309-6). Celem dalszego oczyszczenia, do DNA dodawano NaCI (stężenie końcowe 1,2 M) i ponownie wytracano w -70°C przez 30 min. stosując dwie objętości absolutnego etanolu. Po etapie płukania 70% etanolem, DNA suszono a następnie zawieszano w 50 ml H2O + RNza (stężenie końcowe 50 mg/ml). DNA zawieszano przez noc w 4°C a trawienie RNazą przeprowadzano następnie przez 1 godz. w 37°C. DNA przechowywano w 4°C.

P r z y k ł a d 3: Izolacja całkowitego RNA i poli(A)⁺-RNA z roślin i mikroorganizmów (Crypthecodinium i Thraustochytrium)

Całkowity RNA izolowano z roślin takich jak len i rzepak oleisty, metodą opisaną przez Logemann i wsp. (1987, Anal. Biochem. 163, 21). Całkowity RNA z mchu uzyskiwano z tkanki splątków stosując metodę GTC (Reski i wsp., 1994, Mol. Gen. Genet., 244:352-359).

Izolacja RNA z Crypthecodinium i Thraustochytrium:

Zamrożone próbki glonów (- 70°C) są ucierane w ciekłym azocie w schłodzonym moździerzu na drobny proszek. Do zamrożonego proszku z komórek dodawane są 2 objętości środka do homogenizacji (12,024 g sorbitol, 40,0 ml 1M Tris-HCI, pH 9 (0,2 M); 12,0 ml 5 M NaCI (0,3 M), 8,0 ml 250 mM EDTA, 761,0 mg EGTA, 40,0 ml 10% SDS uzupełnione do 200 ml za pomocą H2O i pH ustawione do 8,5) i 4 objętości fenolu z 0,2% merkaptoetanolem w 40-50°C z dokładnym mieszaniem. Następnie dodawane są 2 objętości chloroformu i mieszanina jest mieszana energicznie przez 15 min. Mieszanina jest wirowana przez 10 min, przy 10000 g a faza wodna jest poddawana ekstrakcji przy użyciu mieszaniny fenol/chloroform (2 obj./2 obj.) a następnie chloroformu.

Do uzyskanej objętości fazy wodnej dodawana jest 1/20 objętości 4 M octanu sodowego (pH 6) i 1 objętość (schłodzonego w lodzie) izopropanolu, kwas nukleinowy jest wytrącany w -20°C. Mieszanina jest wirowana przez 30 min. przy 10000 g a supernatant jest usuwany przez odessanie. Po tym następuje etap płukania 70% EtOH i kolejny etap wirowania. Osad jest zawieszany w buforze Tris-boran (80 mM bufor Tris-boran, 10 mM EDTA, pH 7,0). Do supernatantu dodawana jest 1/3 obj. 8 M LiCI, supernatant jest mieszany i inkubowany przez 30 min. w 4°C. Po ponownym wirowaniu, osad jest płukany 70% etanolem, wirowany i zawieszany w wodzie wolnej od RNaz.

Poli(A)⁺-RNA jest izolowany przy użyciu Dyna Beads® (Dynal, Oslo, Finlandia) zgodnie z zaleceniami producenta.

Po ustaleniu stężenia RNA czy poli(A)⁺-RNA, RNA jest wytrącany przez dodanie 1/10 objętości 3 M octanu sodowego, pH 4,6 i 2 objętości etanolu i przechowywany w 70°C.

Do analizy, porcje po 20 μg RNA rozdzielane są w 1,5% żelu agarozowym zawierającym formaldehyd i RNA jest przenoszony na filtr nylonowy (Hybond, Amersham). Specyficzne transkrypty wykrywane są jak opisano w Amasino ((1986) Anal. Biochem. 152, 304)).

Izolacja całkowitego RNA i poli-(A)+ RNA z Phytophthora infestans:

Całkowity RNA uzyskiwano przy użyciu zestawu RNeasy Plant Total RNA kit (Quiagen, Milden) i zawartego w nim buforu, postępując zgodnie z zaleceniami producenta. Z uzyskanego w ten sposób całkowitego RNA izolowano poli-(A)+ RNA przy użyciu zestawu Poly Attract in RNA Isolation System III z Promega (Heidelberg), postępując zgodnie z zaleceniami producenta.

P r z y k ł a d 4: Konstrukcja biblioteki cDNA

W celu skonstruowania biblioteki cDNA odpowiednio z Physcomitrella, Crypthecodinium i Thraustochytrium przeprowadzono syntezę pierwszej nici, przy użyciu odwrotnej transkryptazy z wirusa białaczki mysiej (Roche, Mannheim, Germany) i starterów oligo-d(T), podczas gdy syntezę drugiej nici prowadzono poprzez inkubację z polimerazą I DNA, fragment Klenowa i trawienie RNazą H w 12°C (2 godz.), 16°C (1 godz.) i 22°C (1 godz.). Reakcję tłumiono przez inkubację w 65°C (10 min.) a następnie przenoszono do lodu. Cząsteczki dwuniciowego DNA były wytępiane na końcach za pomocą polimerazy DNA faga T4 (Roche, Mannheim) w 37°C (30 min.). Nukleotydy usuwano przez ekstrakcję mieszaniną fenol/chloroform i sączenie przez kolumienki typu Sephadex G50 spin columns. Za pomocą ligazy DNA faga T4 (Roche, 12°C, przez noc) dołączano adaptory EcoRI/XhoI (Pharmacia, Freiburg, Niemcy) do końców cDNA, rozcinano XhoI i fosforylowano przez inkubację z kinazą polinukleotydową (Roche, 37°C, 30 min.). Mieszaninę rozdzielano w żelu agarozowym, o niskim punkcie topnienia. Cząsteczki DNA powyżej 300 bp eluowano z żelu, poddawano ekstrakcji fenolem, zatężano na kolumienkach typu Elutip D columns (Schleicher and Sch^I, Dassel, Niemcy), łączono w reakcji ligacji z ramionami wektora i pakowano do fagów lambda-ZAPII lub fagów ekspre42

PL 207 026 B1 syjnych lambda-ZAP przy użyciu zestawu Gigapack Gold kit (Stratagene, Amsterdam, Holandia), stosując materiał producenta oraz jego zalecenia.

Konstrukcję biblioteki cDNA z Phytophthora infestans przeprowadzono jak opisano powyżej.

P r z y k ł a d 5: Sekwencjonowanie DNA i analiza komputerowa

Biblioteki cDNA opisane w Przykładzie 4 były używane do sekwencjonowania DNA standardowymi metodami, w szczególności metodą terminacji łańcucha przy użyciu zestawu ABI PRISM Big Dye Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction Kit (Perkin-Elmer, Weiterstadt, Niemcy). Przed wytworzeniem preparatu plazmidowego z bibliotek cDNA, pojedyncze, losowe klony sekwencjonowano poprzez wycinanie z masy in vivo i ponowną transformację DH10B na płytkach z agarem (szczegóły na temat materiału i protokołu: Stratagene, Amsterdam, Holandia). Plazmidowy DNA wytwarzano z hodowli E. coli hodowanych przez noc w pożywce Luria, uzupełnionej ampicyliną (patrz, Sambrook i wsp. (1989) (Cold Spring Harbor Laboratory Press: ISBN 0-87969-309-6)) przy użyciu robota Qiagen DNA preparation (Qiagen, Hilden) zgodnie z zaleceniami producenta. Stosowano startery do sekwencjonowania o następujących sekwencjach nukleotydowych:

5'-CAGGAAACAGCTATGACC-3'

5'-CTAAAGGGAACAAAAGCTG-3'

5'-TGTAAAACGACGGCCAGT-3'

Sekwencje przetwarzano i nagrywano przy użyciu pakietu ze standardowym oprogramowaniem EST-MAX dostępnego handlowo w Bio-Max (Munich, Germany). Wykorzystując algorytmy porównawcze i używając sekwencji do przeszukiwania, znaleziono geny homologiczne przy użyciu programu BLAST (AItschul i wsp. (1997) Gapped BLAST and PSI-BLAST: a new generation of protein database search programs, Nucleic Acids Res. 25:3389-3402). Bardziej szczegółowo scharakteryzowano jedną sekwencję z Crypthecodinium i Thraustochytrium posiadającą homologię z sekwencją elongazy z mchu Physcomitrella patens, użytą do przeszukiwania.

P r z y k ł a d 6a: Identyfikacja genu Tc_PSE1 i Tc_PSE2 (Tc = Thraustochytrium) oraz genu Cc_PSE1 i Cc_PSE2 (Cc = Crypthecodinium cohnii) przez porównanie z genem Pp_PSE1 z Physcomitrella patens.

Do porównań sekwencji algorytmem do porównań TBLASTN wykorzystano pełnej długości sekwencję Pp_PSE1 elongazy z mchu według wynalazku (nazwa: patrz Tabela 2):

MEVVERFYGE LDGKVSQGVN ALLGSFGVEL TDTPTTKGLP LVDSPTPIVL

GVSVYLTIVI GGLLWIKARD LKPRASEPFL LQALVLVHNL FCFALSLYMC

VGIAYQAITW RYSLWGNAYN PKHKEMAILV YLFYMSKYVE FMDTVIMILK

RSTRQISFLH VYHHSSISLI WWAIAHHAPG GEAYWSAALN SGVHVLMYAY

YFLAACLRSS PKLKNKYLFW GRYLTQFQMF QFMLNLVQAY YDMKTNAPYP

QWLIKILFYY MISLLFLFGN FYVQKYIKPS DGKQKGAKTE.

Cała sekwencja nukleotydowa cDNA Pp_PSE1 elongazy z mchu składa się w przybliżeniu z 1200 bp. Zawiera ona otwartą ramkę odczytu o długości 873 bp, która koduje 290 aminokwasów i posiada obliczoną masę cząsteczkową 33,4 Da. Sekwencja białkowa posiada tylko 38,5% identyczności i 48,3% podobieństwa z produktem genu z Saccharomyces cerevisiae, przykładowo, z produktem genu PSE1 u Saccharomyces) cerevisiae PSE1, który jest wymagany u drożdży do wydłużania kwasów tłuszczowych o średniej długości łańcucha (Toke & Martin, 1996, Isolation and characterization of a gene affecting fatty acid elongation in Saccharomyces cerevisiae. Journal of Biological Chemistry 271, 18413-18422).

Wśród innych wytypowanych genów, pierwszymi, rozpatrywanymi jako geny docelowe były sekwencje EST CC001042041R, TC002034029R i TC002014093R ze względu na wyjściowo słabe homologie z elongazą z Physcomitrella patens (patrz Tabela 2), gen PSE1. Fig. 5 przedstawia wyniki porównania sekwencji peptydu Pp_PSE1 ze znalezioną sekwencją. Jest to fragment kwasu nukleinowego z SEKW. NR ID.:3 według wynalazku (nazwa genu: TcPSE1, w bazie danych twórcy wynalazku nr TC002034029R). Litery wskazują identyczne aminokwasy, podczas gdy symbol plus oznacza aminokwasy podobne chemicznie. Identyczności i homologie we wszystkich sekwencjach znalezionych według wynalazku, można zobaczyć w podsumowaniu w Tabeli 3.

Sekwencjonowanie całego fragmentu cDNA z klonu TC002034029R dało sekwencję 693 bp wychodząc od pierwszej zasady w otwartej ramce odczytu. Sekwencja koduje polipeptyd o 195 aminokwasach przedstawiony w SEKW. NR ID.:4 z kodonem stop w miejscu pary zasad ulegających translacji z SEKW. NR ID.:3 w pozycji pary zasad 586-588. Klon TC002014093R obejmuje faktycznie cały polipeptyd elongazy, jak wynika z przyrównania sekwencji na Fig. 7. Linie oznaczają identyczne

PL 207 026 B1 aminokwasy, podczas gdy dwukropki i kropki chemicznie wymienne, tzn. równoważne chemicznie, aminokwasy. Przyrównanie przeprowadzono przy użyciu matrycy podstawień aminokwasowych BLOSUM62 według Henikoff & Henikoff ((1992) Amino acid substitution matrices from protein blocks. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 10915-10919). Stosowane parametry: waga związana z przerwą: 8; średnie dopasowanie: 2.912, waga związana z długością: 2, średnie niedopasowanie: -2.003.

Ponadto na podstawie przyrównania sekwencji zidentyfikowano drugi EST. Przyrównanie sekwencji peptydu Pp_PSE1 ze znalezioną sekwencją pokazano na Fig. 6. Pomimo tego, że homologią dla wybranych parametrów jest ograniczona do niewielu aminokwasów, dotyczy ona silnie konserwowanego regionu elongaz specyficznych do PUFA. Zatem ustalono sekwencję całego fragmentu klonu.

Sekwencjonowanie całego fragmentu cDNA z klonu TC002014093R dało sekwencję 693 bp wychodząc od pierwszej zasady w otwartej ramce odczytu. I jest określona przez sekwencję SEKW. NR ID.:5 według wynalazku. Sekwencja koduje polipeptyd o 297 aminokwasach, z kodonem stop w pozycji 892-894 pary zasad pokazanej według wynalazku w SEKW. NR ID.:6.

EST CC001042041R z Crypthecodinium cohnii, który koduje gen Cc_PSE1 zidentyfikowano za pomocą sekwencji PpPSE1. Wyizolowany EST CC001042041R, pokazany według wynalazku jako SEKW. NR ID.:7 ma długość 708 par zasad i posiada otwartą ramkę odczytu o długości 642 par zasad, od pierwszej zasady, która koduje 214 aminokwasów i posiada kodon stop w pozycji 643-645. Sekwencja aminokwasowa powyżej kodonu stop jest pokazana według niniejszego wynalazku w SEKW. NR ID.:8.

Oprócz podobieństwa do produktu genu PSE1, można także zastosować podobieństwo do elongazy z Saccharomyces cerevisiae elongase (sce elo 1P), która jest wymagana w drożdżach, do wydłużania kwasów tłuszczowych o średniej długości łańcucha (Toke & Martin, 1996, Isolation and characterization of a gene affecting fatty acid elongation in Saccharomyces cerevisiae. Journal of Biological Chemistry 271, 18413-18422). W Tabeli 3 pokazano identyczności i homologię elongaz według wynalazku, każdej z każdą oraz z Physcomitrella patens i elongazami drożdżowymi. Dane uzyskano przy pomocy programu GAP program z oprogramowania: Wisconsin Package Version 10.0 (Genetics Computer Group (GCG), Madison, Wisc, USA).

T a b e l a 3:

Identyczność/ homologia	Tc_PSE1	TC_PSE2	Pp_PSE1	Sce elo 1P
Cc_PSE1	47,1% / 40,2%	50,6% / 43,5%	38,5% / 29,4%	45,1% / 33,5%
Tc_PSE1	100/100	n.d.	43,2% / 32,7%	41,9% / 29,9%
Tc_PSE2	41,7% / 29,5%	100/100	39,2% /30,0	35,4% / 27,8%

W szczególności, Fig. 5 do 10 można stosować do uzyskiwania kolejnych motywów sekwencji jako regionów o wysokiej homologii i uzyskanych z nich odpowiednich sekwencji konsensusowych, przez odwróconą translację od aminokwasów do kodonów z trzech par zasad, prowadzącą do oligonukleotydów, które można wykorzystać do izolowania nowych elongaz przy pomocy reakcji łańcuchowej polimerazy. Są to, w szczególności, motywy sekwencji pokazane na Fig. 10. Motywy te można stosować do uzyskiwania oligonukleotydów, które w kombinacji dwóch oligonukleotydów można wykorzystać w doświadczeniach PCR do izolowania kolejnych fragmentów elongazy. W tym celu, wskazane jest zaprojektowanie i zsyntetyzowanie oligonukleotydu pasującego do nici konwencjonalnie zdefiniowanej jako 5'-3' i drugiego będącego oligonukleotydem pasującym do nici 3'-5' poniżej. W wyniku tego powstanie określona liczba kombinacji starterów, która jest ograniczona przez permutację możliwych wariantów.

W tym wypadku, można także wykonać startery oligo-dT lub ich odmiany, przykładowo, w których ostatnia zasada nadaje specyficzności wobec puli transkryptów, takie jak, przykładowo, oligo dT (12-20) X, gdzie X może być G, C lub T. Można także zastosować oligo dT (12-20) z dwiema określonymi zasadami XY, gdzie X może być G, C lub A, podczas gdy Y może być A, G, C lub T.

Zdefiniowane powyżej sekwencje pozwalają na uzyskanie 17- do 20-merowych oligonukleotydów, które można wykorzystać do izolacji fragmentów zmieniając kombinacje starterów i parametry doświadczalne takie jak profil temperatury, stężenie jonów Mg i im podobne. Uzyskane fragmenty

PL 207 026 B1 można klonować w stosownych wektorach a sekwencję uzyskanych klonów można określać przy użyciu aktualnych metod identyfikowania nowych elongaz.

P r z y k ł a d 6b: Izolacja klonu cDNA z Phytophthora infestans

Klon cDNA z Phytophthora infestans oznaczony jako PI001002014R zidentyfikowano na podstawie losowo zsekwencjonowanych cząsteczek cDNA, wykorzystując homologię do elongazy PUFA z mchu Physcomitrella patens (ATCCC 48886). Klon zawiera motyw konsensusowy MyxYYF pokazany na Fig. 8, gdzie, inaczej niż w dotychczas zidentyfikowanych elongazach PUFA, rodnik treoninowy został zidentyfikowany jako zmienny aminokwas x. Te dodatkowe różnice można wykorzystać w uzyskiwaniu starterów PCR.

P r z y k ł a d 7: Identyfikacja genów sposobami hybrydyzacji (TC002034029R-11 iGenTcPCE1)

Do identyfikowania genów homologicznych i heterologicznych w bibliotekach cDNA i bibliotekach genomowych można użyć sekwencji genów.

Geny homologiczne (tzn. klony pełnej długości cDNA które są homologiczne, lub homologi) można izolować za pomocą hybrydyzacji kwasu nukleinowego stosując, przykładowo, biblioteki cDNA: metoda ta może być używana w szczególności do izolowania aktywnych funkcjonalnie genów o pełnej długości z SEKW. NR ID.:1, SEKW. NR ID.:3, SEKW. NR ID.:5, SEKW. NR ID.:7, SEKW. NR ID.:9 i SEKW. NR ID.:11. W zależności od częstości występowania genu, 100000 do 1000000 zrekombinowanych bakteriofagów wysiewa się na szalkę i przenosi na filtr nylonowy, Po denaturacji alkalicznej, DNA jest unieruchamiany na filtrze, przykładowo, przez wiązanie krzyżowe za pomocą U\/. Hybrydyzacja jest przeprowadzana w bardzo ostrych warunkach. Hybrydyzacja i etapy płukania prowadzone są w roztworze wodnym przy sile jonowej dla 1 M NaCI i temp. 68°C. Sondy do hybrydyzacji wytwarzano, przykładowo, poprzez znakowanie radioaktywne (³²P-) w reakcji typu nick transcription (High Prime, Roche, Mannheim, Niemcy). Sygnały wykrywane są autoradiograficznie.

Geny częściowo homologiczne lub heterologiczne, które są pokrewne lecz nie identyczne, można identyfikować analogicznie do procesu opisanego powyżej przy użyciu warunków hybrydyzacji i płukania o niskiej sile jonowej. Dla hybrydyzacji w wodnym roztworze, zazwyczaj siła jonowa była utrzymywana w 1 M NaCI, a temperatura była obniżana stopniowo od 68 do 42°C.

Izolację sekwencji genów, które wykazują homologię jedynie w pojedynczych domenach o, przykładowo, 10 to 20 aminokwasach można przeprowadzić stosując syntetyczne, wyznakowane radioaktywnie sondy oligonukleotydowe. Wyznakowane radioaktywnie oligonukleotydy są wytwarzane poprzez fosforylację końca 5' dwóch komplementarnych oligonukleotydów za pomocą kinazy polinukleotydowej faga T4. Komplementarne oligonukleotydy są hybrydyzowane i łączone ze sobą w reakcji ligacji co daje konkatamery. Dwuniciowe konkatamery są znakowane radioaktywnie, przykładowo, w reakcji typu nick transcription. Hybrydyzacja jest zazwyczaj przeprowadzana w warunkach niskiej siły jonowej przy użyciu wysokich stężeń oligonukleotydów.

Roztwór do hybrydyzacji oligonukleotydów:

6xSSC

0,01 M fosforan sodowy mM EDTA (pH 8)

0,5% SDS

100 μg/ml zdenaturowanego DNA ze spermy łososia

0,1% odtłuszczone mleko w proszku

Podczas hybrydyzacji stopniowo obniżana jest temperatura o 5 do 10°C poniżej obliczonej temperatury oligonukleotydu lub do temp. pokojowej (o ile nie podano inaczej, RT = ~ 23°C we wszystkich doświadczeniach), następnie przeprowadzane są etapy płukania i autoradiografia. Płukanie przeprowadzane jest w wyjątkowo niskiej sile jonowej, przykładowo, 3 etapy płukania przy użyciu 4 x SSC. Dodatkowe szczegóły opisano w Sambrook, J., i wsp. (1989), Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, or Ausubel, F.M., i wsp. (1994) Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons.

Klon TC002034029R-11 z nazwą genu Tc_PCE1_1 jest pełnej długości sekwencją elongazy z Thraustochytrium i tym samym dłuższym niż klon TC002034029R z SEKW NR ID.:3 i SEKW NR ID.:4. Klon ten wyizolowano przy użyciu metody hybrydyzacji opisanej powyżej (Przykład 7). Jest to sekwencja DNA o długości 1050 bp kodująca 271 aminokwasów z kodonem start w pozycji 43-45 pary zasad i kodonem stop w pozycji 855-858 pary zasad.

PL 207 026 B1

P r z y k ł a d 8: Identyfikacja genów docelowych poprzez przeszukiwanie bibliotek ekspresyjnych przeciwciałami

W celu wytworzenia zrekombinowanego białka, przykładowo w E. coli, stosowane są sekwencje cDNA (przykładowo, Qiagen QIAexpress pQE system). Zrekombinowane białka są następnie oczyszczane poprzez chromatografie powinowactwa, zazwyczaj poprzez chromatografie powinowactwa do Ni-NTA (Qiagen). Zrekombinowane białka są następnie stosowane do wytworzenia swoistych przeciwciał, przykładowo, przy zastosowaniu standardowych technik immunizacji królików. Przeciwciała są następnie oczyszczane przez powinowactwo przy użyciu kolumn z Ni-NTA, które są wcześniej wysycane zrekombinowanym antygenem, jak opisano w Gu i wsp., (1994) BioTechniques 17:257-252. Przeciwciała mogą być następnie stosowane do przeszukiwania ekspresyjnych bibliotek cDNA poprzez przeszukiwanie immunologiczne. (Sambrook, J., i wsp. (1989), Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, or Ausubel, F.M., i wsp. (1994) Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons).

P r z y k ł a d 9: Plazmidy do transformacji roślin

Do transformacji roślin można stosować wektory binarne takie jak pBinAR (Hofgen and Willmitzer, Plant Science 65 (1990) 221-230). Wektory binarne można konstruować poprzez wprowadzanie cDNA sensownej i antysensownej w orientacji do T-DNA dzięki reakcji ligacji. Promotor roślinny położony na końcu 5' cDNA aktywuje transkrypcję cDNA. Sekwencja poliadenylacji leży po stronie 3' cDNA.

Ekspresję tkankowo specyficzną można osiągnąć stosując tkankowo specyficzny promotor. Przykładowo, specyficzną ekspresję w nasionach można osiągnąć poprzez klonowanie cDNA po stronie 5' promotora napiny lub promotora LeB4 czy promotora USP. Można także użyć inny element promotorowy specyficzny dla nasion. Promotor CaMV-35S można użyć dla konstytutywnej ekspresji we wszystkich roślinach.

Wytworzone białko może być wprowadzone do kompartmentu komórkowego przy użyciu peptydu sygnałowego, przykładowo dla plastydów, mitochondrów czy retikulum endoplazmatycznego (Kermode, Crit. Rev. Plant Sci. 15, 4 (1995) 285-423). Peptyd sygnałowy jest klonowany na końcu 5' w prawidłowej ramce odczytu z cDNA, w celu uzyskania lokalizacji komórkowej dla białka fuzyjnego.

P r z y k ł a d 10: Transformacja Agrobacterium

Transformację roślin za pośrednictwem Agrobacterium można, przykładowo, przeprowadzić stosując szczep Agrobacterium tumefaciens GV3101 (pMP90) (Koncz i Schell, Mol. Gen. Genet. 204 (1986) 383-396) lub LBA4404 (Clontech). Transformację można prowadzić standardowymi technikami transformacji (Deblaere i wsp.. Nuci. Acids. Tes. 13 (1984), 4777-4788).

P r z y k ł a d 11: Transformacja roślin

Transformację roślin za pośrednictwem Agrobacterium można przeprowadzić stosując standardowe techniki transformacji i regeneracji (Gelvin, Stilton B., Schilperoort, Robert A., Plant Molecular Biology Manual, 2 wyd., Dordrecht: Kluwer Academic Publ., 1995, in Sect., Ringbuc Zentrale Signatur: BT11-P ISBN 0-7923-2731-4; Glick, Bernard R., Thompson, John E., Methods in Plant Molecular Biology and Biotechnology, Boca Raton: CRC Press, 1993, 360 str. ISBN 0-8493-5164-2).

Przykładowo, rzepak oleisty można transformować za pomocą transformacji kotyledonu i hipokotyledonu (Moloney i wsp.. Plant Cell Report 8 (1989) 238-242; De Block i wsp.. Plant Physiol. 91 (1989) 694-701). Zastosowanie antybiotyków do selekcji agrobakterii i roślin zależy od wektora binarnego i szczepu agrobakterii użytego do transformacji. Selekcja dla rzepaku oleistego przeprowadzana jest zazwyczaj przy użyciu kanamycyny jako markera selekcyjnego. Przenoszenie genu za pośrednictwem Agrobacterium do lnu (Linum usitatissimum) można przeprowadzić, przykładowo, przy użyciu techniki opisanej przez Mlynarova i wsp. (1994) Plant Cell Report 13:282-285.

Transformację soi można przeprowadzić przy użyciu, przykładowo, techniki opisanej w EPA-0 424 047 (Pioneer Hi-Bred International) lub u EP-A-0 397 687, US 5376543, US 5169770 (Uniwersytet w Toledo).

Transformację roślin przy użyciu cząstek do bombardowania, pobierania DNA za pośrednictwem glikolu polietylenowego czy techniką z włóknami węglanu krzemu opisano w, przykładowo, Freeling i Walbot The maize handbook (1993) ISBN 3-540-97826-7, Springer Verlag New York).

P r z y k ł a d 12: Plazmidy do transformacji roślin

Do transformacji roślin można stosować wektory binarne takie jak pBinAR (Hofgen and Willmitzer, Plant Science 66 (1990) 221-230). Wektory binarne można konstruować poprzez wprowadzanie cDNA sensownego i antysensownego w orientacji do T-DNA, dzięki reakcji ligacji. Promotor roślinny

PL 207 026 B1 położony na końcu 5' cDNA aktywuje transkrypcję cDNA. Sekwencja poliadenylacji leży po stronie 3' cDNA.

Ekspresję tkankowo specyficzną można osiągnąć stosując tkankowo specyficzny promotor. Przykładowo, specyficzną ekspresję w nasionach można osiągnąć poprzez klonowanie cDNA po stronie 5' promotora napiny lub promotora LeB4, czy promotora USP. Można także użyć inny element promotorowy, specyficzny dla nasion. Promotor CaMV-35S można użyć dla konstytutywnej ekspresji we wszystkich roślinach.

W szczególności, w wektorze binarnym można klonować geny kodujące elongazy i desaturazy poprzez konstruowanie wielu kaset ekspresyjnych, następstwem czego jest uporządkowane naśladowanie szlaku metabolicznego w roślinie.

Białko wytwarzane w kasecie ekspresyjnej może być wprowadzone do kompartmentu komórkowego, przy użyciu peptydu sygnałowego, przykładowo dla plastydów, mitochondrów czy retikulum endoplazmatycznego (Kermode, Crit. Rev. Plant Sci. 15, 4 (1996) 285-423). Peptyd sygnałowy jest klonowany na końcu 5' w prawidłowej ramce odczytu z cDNA w celu uzyskania lokalizacji komórkowej dla białka fuzyjnego.

P r z y k ł a d 13: Mutageneza in vitro

Mutagenezę in vitro mikroorganizmów można prowadzić poprzez pasażowanie plazmidu DNA (lub dowolnego innego wektora DNA) przez E. coli lub inny mikroorganizm (przykładowo, Bacillus spp. lub drożdże takie jak Saccharomyces cerevisiae), który ma zniszczoną zdolność zachowania integralności własnej informacji genetycznej. Tradycyjne szczepy mutatorowe posiadają mutacje w genach systemu naprawy DNA (przykładowo, mutHLS, mutD, mutT i im podobne; jako referencje, patrz Rupp, W.D. (1996) DNA repair mechanisms, in: Escherichia coli and Salmonella, str. 2277-2294, ASM: Washington). Szczepy te znane są specjalistom. Użycie tych szczepów jest zilustrowane przykładowo w Greener, A., i Callahan, M. (1994) Strategies 7:32-34. Cząsteczki zmutowanego DNA są korzystnie przenoszone do roślin po wyselekcjonowaniu i przetestowaniu mikroorganizmów. Rośliny transgeniczne są wytwarzane według różnych przykładów, w sekcji z przykładami niniejszego dokumentu.

P r z y k ł a d 14: Badanie wytwarzania produktu zrekombinowanego genu w stransformowanym organizmie

Aktywność produktu zrekombinowanego genu w stransformowanym organizmie gospodarza, mierzono na poziomie transkrypcji i/lub translacji.

Stosowną metodą określania ilości transkryptu genu (która wskazuje na ilość RNA dostępnego do translacji produktu genu) jest przeprowadzenie analizy typu Northern blot, jak szczegółowo opisano poniżej (jako referencje, patrz Ausubel i wsp. (1988) Current Protocols in Molecular Biology, Wiley: New York lub we wspomnianej powyżej sekcji z przykładami), w której starter zaprojektowany jest tak, że wiąże się z interesującym genem i wyznakowany jest wykrywalnym znacznikiem (zazwyczaj radioaktywnie lub za pomocą chemilumine (scencji) tak, że kiedy całkowity RNA z hodowli mikroorganizmu jest wyizolowany, rozdzielony w żelu, przeniesiony na stosowne podłoże i inkubowany z sondą, wiązanie i rozmiar wiązania sondy, wskazuje na obecność, jak również ilość mRNA tego genu. Informacja ta wskazuje na stopień transkrypcji stransformowanego genu. Całkowity RNA komórkowy można wytworzyć z komórek, tkanek czy narządów wieloma metodami, wszystkie znane specjalistom, takimi jak, przykładowo, metoda według Bormann, E.R., i wsp. (1992) Mol. Microbiol. 6:317-326.

Hybrydyzacja typu Northern:

Do hybrydyzacji RNA, 20 μg całkowitego RNA lub 1 μg poli(A)+- RNA rozdzielano za pomocą elektroforezy w 1,25% żelu agarozowym, przy użyciu formaldehydu jak opisano w Amasino (1986, Anal. Biochem, 152, 304), przenoszono na filtr nylonowy z dodatnim ładunkiem (Hybond N+, Amersham, Brunswick) za pomocą kapilarnego podsiąkania przy użyciu 10 X SSC, unieruchamiano przez naświetlanie promieniowaniem UV i prehybrydyzowano przez 3 godz. w 68°C stosując bufor hybrydyzacyjny (10% siarczan dekstranu w/v, 1 M NaCI, 1% SDS, 100 mg DNA spermy śledzia). Sondę DNA znakowano przy użyciu zestawu Highprime DNA labeling kit (Roche, Mannheim, Germany) podczas etapu prehybrydyzacji, stosując α -³²P-dCTP (Amersham, Brunswick, Germany). Hybrydyzację przeprowadzano po dodaniu wyznakowanej sondy DNA w tym samym buforze w 68°C przez noc. Etapy płukania przeprowadzano dwukrotnie przez 15 min. stosując 2 X SSC i dwukrotnie przez 30 min. stosując 1 x SSC, 1% SDS w 68°C. Zamknięte filtry eksponowano w -70°C przez okres 1 do 14 dni.

Do badania obecności lub względnych ilości białek uzyskanych w wyniku translacji mRNA można wykorzystać standardowe techniki, takie jak technika typu Western blot (patrz przykładowo, Ausubel i wsp. (1988) Current Protocols in Molecular Biology, Wiley: New York). W metodzie tej, izolowane

PL 207 026 B1 są całkowite białka komórkowe, rozdzielane za pomocą elektroforezy w żelu, przenoszone na podłoże takie jak nitroceluloza i inkubowane z sondą taką jak przeciwciało specyficznie wiążące się z pożądanym białkiem. Sonda ta jest zazwyczaj dostarczana w postaci wyznakowanej chemiluminescencyjnie lub kolorymetrycznie, co można z łatwością wykrywać. Obecność i ilość obserwowanego znacznika wskazuje na obecność i ilość pożądanego, zmutowanego białka obecnego w komórce.

P r z y k ł a d 15: Analiza wpływu zrekombinowanych białek na produkcję pożądanego produktu

Wpływ modyfikacji genetycznej w roślinach, grzybach, glonach, orzęskach czy na produkcję pożądanego związku (takiego jak kwas tłuszczowy), można określić poprzez hodowanie zmodyfikowanego mikroorganizmu czy zmodyfikowanej rośliny w stosownych warunkach (takich jak te opisane powyżej) i analizowanie pożywki i/lub składników komórkowych pod kątem podniesionej produkcji pożądanego produktu (tzn. lipidów lub kwasu tłuszczowego). Takie techniki analityczne są znane specjalistom i obejmują spektroskopię, chromatografię cienkowarstwową różne metody barwienia, metody enzymatyczne i mikrobiologiczne oraz chromatografię analityczną, taką jak wysokosprawna chromatografia cieczowa (patrz przykładowo, Ullman, Encyclopedia of Industrial Chemistry, Vol. A2, str. 89-90 i str. 443-613, VCH Weinheim (1985); Fallon, A., i wsp., (1987) Applications of HPLC in Biochemistry in: Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology, Tom 17; Rehm i wsp. (1993) Biotechnology, Tom 3, Rozdz. III Product recovery and purification, str. 469-714, VCH Weinheim; Belter, P.A., i wsp. (1988) Bioseparations: downstream processing for Biotechnology, John Wiley and Sons; Kennedy, J.F., i Cabral, J.M.S. (1992) Recovery processes for biological Materials, John Wiley and Sons; Shaeiwitz, J.A., i Henry, J.D. (1988) Biochemical Separations, w: Ullmann's Encyclopedia of Industrial Chemistry, Bd. B3; Rozdz. 11, Tom. 1-27, VCH Weinheim; oraz Dechow, F.J. (1989) Separation and purification techniques in biotechnology, Noyes Publications).

Dodatkowo do wspomnianych powyżej metod, lipidy roślinne są ekstrahowane z materiału roślinnego jak opisano w Cahoon i wsp. (1999) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96 (22): 12935-12940 oraz Browse i wsp. (1986) Analytic Biochemistry 152:141-145. Jakościowa i ilościowa analiza lipidów i kwasów tłuszczowych jest opisana w Christie, William W., Advances in Lipid Methodology, Ayr/Scotland: Oily Press (Oily Press Lipid Library; 2); Christie, William W., Gas Chromatography and Lipids. A Practical Guide - Ayr, Scotland: Oily Press, 1989, dodruk 1992, IX, str. 307 (Oily Press Lipid Library; 1); Progress in Lipid Research, Oxford: Pergamon Press, 1 (1952) - 16 (1977) pod tytułem: Progress in the Chemistry of Fats and Other Lipids CODEN.

Dodatkowo do pomiaru produktu końcowego fermentacji, możliwe jest także analizowanie innych związków szlaków metabolicznych, które są stosowane do wytwarzania pożądanego związku, takich jak produkty pośrednie i produkty uboczne, w celu określenia ogólnej wydajności produkcyjnej związku.

Metody analityczne obejmują pomiary ilości składnika odżywczego w pożywce (przykładowo cukrów, węglowodanów, źródeł azotu, fosforanu i innych jonów), pomiary kompozycji biomasy i wzrostu, analizę produkcji zwykłych metabolitów szlaków biosyntezy i pomiary gazów wytwarzanych podczas fermentacji. Standardowe metody tych pomiarów opisano w Applied Microbial Physiology; A Practical Approach, P.M. Rhodes and P.F. Stanbury, wyd., IRL Press, str. 131-163 i 165-192 (ISBN: 0199635773) i zamieszczone tam referencje.

Jednym z przykładów jest analiza kwasów tłuszczowych (skróty: FAME, ester metylowy kwasu tłuszczowego; GC-MS, gazowo cieczowa chromatografia /spektrometria mas; TAG, triacyloglicerol; TLC, chromatografia cienkowarstwowa).

Jednoznaczną detekcję obecności produktów w postaci kwasów tłuszczowych można uzyskać dzięki analizie zrekombinowanych organizmów za pomocą standardowych metod analitycznych: GC, GC-MS lub TLC, jak są one opisane przy wielu okazjach przez Christie i w zawartych tam referencjach (1997, w: Advances on Lipid Methodology, Fourth edition: Christie, Oily Press, Dundee, 119-169; 1998, gas chromatography/mass spectrometry methods, Lipide 33:343-353).

Materiał do analizy można rozrywać przez sonikację, ucieranie w młynku szklanym, ciekłym azocie i ucieranie lub innymi stosowanymi metodami. Po rozerwaniu, materiał musi zostać odwirowany. Osad jest zawieszany w wodzie destylowanej, grzany przez 10 min. w 100°C, schładzany w lodzie i ponownie wirowany a następnie poddawany ekstrakcji w 0,5 M kwasie siarkowym w metanolu z 2% dimetoksypropanem przez 1 godz. w 90°C, co prowadzi do hydrolizy składników olejowych i lipidowych co daje transmetylowane lipidy. Takie estry metylowe kwasów tłuszczowych są ekstrahowane w eterze naftowym i ostatecznie poddawane analizie GC przy użyciu kolumny kapilarnej (Chrompack, WCOT Fused Silica, CP-Wax-52 CB, 25 μm, 0,32 mm) w gradiencie temperatury pomiędzy 170°C

PL 207 026 B1 a 240°C przez 20 min. i 5 min. w 240°C. Tożsamość uzyskanych estrów metylowych kwasów tłuszczowych musi być określona wobec standardów, które są dostępne handlowo (tzn. Sigma).

W przypadku kwasów tłuszczowych dla których nie ma dostępnych standardów, tożsamość musi być wykazana poprzez derywatyzację a następnie analizę GC/MS. Przykładowo, lokalizacja kwasów tłuszczowych z potrójnym wiązaniem musi być wykazana poprzez GC/MS a następnie derywatyzację z pochodnymi 4,4-dimetoksyoksazoliny (Christie, 1998, patrz powyżej).

P r z y k ł a d 16: Konstrukty ekspresyjne w heterologicznych systemach mikrobiologicznych

Szczepy, warunki wzrostu i plazmidy

Szczep Escherichia coli XL1 Blue MRF' kan (Stratagene) jest stosowany do subklonowania nowych elongaz z Physcomitrella patens, jak PpPSE1. Do funkcjonalnej ekspresji tego genu użyliśmy szczep Saccharomyces cerevisiae INVSc 1 (Invitrogen Co.). E. coli jest hodowana w 37°C pożywce Luria-Bertini (LB, Duchefa, Haarlem, Holandia). Jeśli jest to konieczne, dodawana jest ampicylina (100 mg/l) i dodawany jest 1,5% agar (w/v) do stałej pożywki LB. S. cerevisiae są hodowane w 30°C albo w pożywce YPG albo w kompletnej pożywce minimalnej bez uracylu (CMdum; patrz: Ausubel, F.M., Brent, R., Kingston, R.E., Moore, D.D., Seidman, J.G., Smith, J.A., Struhl, K., Albright, L.B., Coen, D.M., i Varki, A. (1995) Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York) wraz z 2% (w/v) rafinozą lub glukozą. Do pożywek stałych, 2% (w/v) dodawany jest Bacto™ agar (Difco). Plazmidami używanymi do klonowania i ekspresji są pUC18 (Pharmacia) i pYES2 (Invitrogen Co.).

P r z y k ł a d 17: Klonowanie i wytwarzanie elongaz z Physcomitrella, Crypthecodinium i Thraustochytrium specyficznych dla PUFA

Geny pełnej długości o sekwencjach opisanych według wynalazku można izolować jak opisano w Przykładzie 7 i przetwarzać jak zobrazowano tu poniżej. Przykłady konkretnej ekspresji są pokazane w odniesieniu do zastosowania.

A) Wydłużanie kwasów tłuszczowych przez elongazę Pp_PSE1 z mchu:

Dla ekspresji w drożdżach, klon cDNA PpPSE1 z P. patens (wcześniejsza nazwa sekwencji w bazie danych: 08_ck19_b07, nowa nazwa: pp001019019f), który koduje gen elongazy specyficznej do PUFA, został pierwszy raz zmodyfikowany w taki sposób, że miejsce restrykcyjne BamHI oraz drożdżową sekwencją konsensusową dla wysoko wydajnej translacji (Kozak, M. (1986) Point mutations define a sequence flanking the AUG initiator codon that modulates translation by eukaryotic ribosomes. Cell 44, 283-292) uzyskano obok kodonu start oraz uzyskano miejsce restrykcyjne BamHI, które flankuje kodon stop. W celu zamplifikowania otwartej ramki odczytu, zsyntetyzowano parę starterów, które były komplementarne do jej końców 5' i 3'.

Gen o sekwencji według wynalazku pokazanej w SEKW. NR ID.:1 sklonowano w pYES za pomocą reakcji łańcuchowej polimerazy, co dało plazmid pYPp_PSE1:

Do doświadczenia typu PCR zastosowano następujące oligonukleotydy:

Ppex6: ggatccacataatggaggtcgtggagagattc

Ppex6r: ggatcctcactcagttttagctccttttgc

Reakcje PCR przeprowadzano z plazmidowym DNA dla klonu PP001019019F jako matrycą w termocyklerze (Biometra) z Pfu polimeraza DNA (Stratagene) stosując następujący profil temperaturowy: 3 min. w 96°C a następnie 25 cykli: 30 sek. w 96°C, 30 sek. w 55°C i 1 min. w 72°C, 1 cykl przez 10 min. w 72°C.

Prawidłową wielkość zamplifikowanego fragmentu DNA potwierdzano przez elektroforezę w żelu agarozowym z buforem TBE. Zamplifikowany DNA izolowano z żelu przy użyciu zestawu QIAquick gel extraction kit (QIAGEN) i wstępnie klonowano w pUC18 przy użyciu zestawu Sure Clone Ligation Kit (Pharmacia). Tak sklonowany fragment trawiono BamHI i poddawano ligacji z pYES, co dało plazmid pYPp_PSE1. Orientację fragmentu sprawdzano przy użyciu Hindlll. Po transformacji E. coli XLI Blue MRF' kan, przeprowadzano izolację DNA z transformantów metodą miniprep' (Riggs, M.G., & McLachlan, A. (1986) A simplified screening procedurę for large numbers of plasmid mini-preparation. BioTechniques 4, 310-313) i klony pozytywne identyfikowano za pomocą analizy restrykcyjnej BamHI. Sekwencję sklonowanych produktów PCR potwierdzano przez ponowne sekwencjonowanie przy użyciu zestawu ABI PRISM Big Dye Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction Kit (Perkin-Elmer, Weiterstadt).

Jeden klon wyizolowano przy użyciu zestawu Nucleobond® AX 500 plasmid DNA extraction kit (Macherey-Nagel, Dϋringen) do izolowania DNA metodą maxiprep.

PL 207 026 B1

Saccharomyces INVSc1 stransformowano pYPp_PSE1 lub pYES2, jako kontrola za pomocą zmodyfikowanego protokołu dla metody PEG/octan litu (Ausubel i wsp., 1995). Po selekcji na płytkach z agarem Cmdum z 2% glukozą, do dalszej hodowli i funkcjonalnej ekspresji wyselekcjonowano transformanty i transformanta pYES2 jak już przedstawiono i podawano różne kwasy tłuszczowe do pożywki.

i) Wzór lipidów dla drożdży stransformowanych plazmidem pYES bez wprowadzonego fragmentu lub który wyrażał gen Pp-PSE1 (dane w% molowe) po podaniu 250 μm kwasu heksadekatrienowego (16:3^δ7°'^10ο'¹³°).

T a b e l a 4:

PYES2	PYES2	pYPp_PSE1	PYPp_PSE1
16:0	11,8%	16:0	11,1%
16:1	28,7%	16:1	23,9%
1g:3A7c,10c,13c	9,2%	1 6: 3A7c,10c,13c	12,0%
18:0	10,6%	18:0	8,6%
18:1?^a9c	34,9%	18:1?^a9c	20,6%
18:1?^a11c	1,1%	18:1?^a11c	1,4%
18_:3?A9c,12c,15c	3,7%	1 8_:3?A9c,12c,15c	21,4%

ii) Wzór lipidów dla drożdży stransformowanych plazmidem pYES bez wprowadzonego fragmentu lub który wyrażał gen Pp-PSE1 (dane w% molowe) po podaniu 500 μm kwasu pinolenowego (18:3Δ6ο,9ο,12θ)

T a b e l a 5:

PYES2	PYES2	pYPp_PSE1	PYPp_PSE1
16:0	18,3%	16:0	16,9%
16:1?^a9c	16,0%	16:1?^A9c	15,3%
18:0	8,6%	18:0	8,4%
18:1?^a9c	16,7%	18:1?^A9c	17,5%
18:1?^a11c	0,7%	18:1?^a11c	2,0%
18 3A5c,9c,12c	39,8%	1 8_:3A5c,9c,12c	32,6%
20:3?A7c,11c,1 4c	0%	20: 3?A7c,11c,1 4c	5,1%

iii) Wzór lipidów dla drożdży stransformowanych plazmidem pYES bez wprowadzonego fragmentu lub który wyrażał gen Pp-PSE1 (dane w% molowe) po podaniu 500 μm kwasu stearydonowego(18:3^^c,9c,12c,15c).

T a b e l a 6:

PYES2	pYES2	pYPp_PSE1	PYPp_PSE1
1	2	3	4
16:0	15,2%	16:0	15,6%
16:1?^a9c	13,1%	16:1?^a9c	14,9%
18:0	12,3%	18:0	10,7%

PL 207 026 B1 cd. tabeli 6

1	2	3	4
18:1?^A9c	12,9%	18:1?^A9c	14,0%
18:1?^A11c	0,7%	18:1?^A11c	1,2%
18 3A6c,9c,12c,15c	45,4%	1 8_:3A6c,9c,12c,15c	23,8%
20_:4?A8c,11c,14c,17c	0,4%	20_:4?A8c,11c,14c,17c	19,8%

iv) Wzór lipidów dla drożdży stransformowanych plazmidem pYES bez wprowadzonego fragmentu lub który wyrażał gen Pp-PSE1 (dane w% molowe) po podaniu 500 μm kwasu linolenowego(18:2''^Sc,12c).

T a b e l a 7:

pYES2	pYES2	pYPp_PSE1	PYPp_PSE1
16:0	7,9%	16:0	8,7%
16:1?^A9c	1,2%	16:1?^A9c	1,3%
18:0	5,3%	18:0	5,1%
18:1?^A9c	1,3%	18:1?^A11c	1,3%
18 2?A9c,12c	83,9%	1 8:2?A9c,12c	80,4%
20:2A11c,14c	0,5%	20: 2A11c,14c	3,2%

B) Wydłużanie kwasów tłuszczowych przez elongazę z Thraustochytrium

Dla ekspresji w drożdżach, klon cDNA z Thraustochytrium z SEKW. NR ID.:3 (Tc_PSE2), który koduje gen elongazy specyficznej do PUFA, został pierwszy raz zmodyfikowany w taki sposób, że tworzy funkcjonalnie aktywny polipeptyd, W tym celu N koniec białka jest wydłużony na poziomie DNA o 42 bp przez kilka brakujących zasad z elongazy z Physcomitrella patens. Chociaż możliwe jest dodanie tylko kodonu start do sekwencji, w prawidłowej ramce odczytu.

Do doświadczenia typu PCR zastosowano następujące oligonukleotydy: pTCPSE2-5': aaaggatccacataatggaggtcgtggagagattctacggtgagttggatggga agGTCATTTCGGGCCTCGACC pTCPSE2-3': aaggatccctgagttttagctcccttttgctttcc

Dodatkowo, oba nukleotydy zawierają miejsce restrykcyjne BamHI oraz drożdżową sekwencję konsensusową dla wysoko wydajnej translacji (Kozak, M. (1986) Point mutations define a sequence flanking the AUG initiator codon that modulates translation by eukaryotic ribosomes. Cell 44, 283-292).

Reakcje PCR przeprowadzano z plazmidowym DNA jako matrycą w termocyklerze (Biometra) z Pfu polimeraza DNA (Stratagene) stosując następujący profil temperaturowy: 3 min. w 96°C a następnie 25 cykli: 30 sek. w 96°C, 30 sek. w 55°C i 3 min. w 72°C, 1 cykl przez 10 min. w 72°C i stop w 4°C.

Prawidłową wielkość zamplifikowanego fragmentu DNA potwierdzano przez elektroforezę w żelu agarozowym z buforem TBE. Zamplifikowany DNA izolowano z żelu przy użyciu zestawu QIAquick gel extraction kit (QIAGEN) i poddawano ligacji z miejscem restrykcyjnym Smal zdefosforylowanego wektora pUC18 przy użyciu zestawu Sure Clone Ligation Kit (Pharmacia), co dało plazmid pUChybrid-Tc_PSE2. Po transformacji E. coli XL1 Blue MRF' kan, przeprowadzano izolację DNA z 24 transformantów opornych na ampicylinę metodą miniprep (Riggs, M.G., & McLachlan, A. (1986) A simplified screening procedure for large numbers of plasmid mini-preparation. BioTechniques 4, 310-313) i klony pozytywne identyfikowano za pomocą analizy restrykcyjnej BamHI. Sekwencję sklonowanych produktów PCR potwierdzano przez ponowne sekwencjonowanie przy użyciu zestawu ABI PRISM Big Dye Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction Kit (Perkin-Elmer, Weiterstadt).

Plazmidowy DNA z pUC-PSE1 i pUC-hybrid-Tc_PSE2 trawiono najpierw BamHI i uzyskane fragmenty poddawano reakcji ligacji z miejscem restrykcyjnym BamHI zdefosforylowanego wektora

PL 207 026 B1 wahadłowego drożdże/E.coli pYES2, co dało plazmid pY2 hybrid-Tc_PSE2. Po transformacji E. coli i uzyskaniu miniprep DNA z transformantów, badano orientację fragmentu DNA w wektorze poprzez trawienie Hindlll. Jeden klon wyizolowano przy użyciu zestawu Nucleobond® AX 500 plasmid DNA extraction kit (Macherey-Nagel, Duringen) do izolowania DNA metodą maxiprep. Saccharomyces INVSc1 transformowane są pY2PSE1, pYES2, pY2-hybrid-Tc_PSE2 i pYES2 za pomocą zmodyfikowanego protokołu dla metody PEG/octan litu (Ausubel i wsp., 1995). Po selekcji na płytkach z agarem Cmdum z 2% glukozą, do dalszej hodowli i funkcjonalnej ekspresji wyselekcjonowano cztery transformanty pY2PSE1 (pY2PSE1a-d), cztery transformanty pY2-hybrid-Tc_PSE2 (pY2-hybrid-Tc_PSE2 1a-d) i jednego transformanta pYES2.

Funkcjonalna ekspresja aktywności elongazy u drożdży

Hodowla wstępna:

ml płynnej pożywki CMdum z 2% (w/v) rafinozą zaszczepiano klonami transgenicznych drożdży (pY2-hybrid-Tc_PSE2 1a-d, pYES2) i hodowano przez 3 dni w 30°C, 200 rpm, do uzyskania gęstości optycznej 600 nm (OD600) 1,5-2.

Hodowla główna:

Do ekspresji, 20 ml płynnej pożywki CMdum z 2% rafinozą i 1% (v/v) Tergitolem NP-40 uzupełniano substratami dla kwasów tłuszczowych do końcowego stężenia 0,003% (w/v). Pożywki zaszczepiano hodowlą wstępną do OD600 0,05. Ekspresję indukowano przez 16 godz. przy OD600 0,2, stosując 2% (w/v) galaktozę i hodowle zbierano przy OD600 0,8-1,2.

Analiza kwasów tłuszczowych

Całkowite kwasy tłuszczowe izolowano z hodowli drożdży i analizowano za pomocą chromatografii gazowej. W tym celu z 5 ml hodowli zbierano komórki przez wirowanie (1000 x g, 10 min., 4°C) i płukano raz 100 mM NaHCO3, pH 8,0, w celu usunięcia resztek pożywki i kwasów tłuszczowych. Do wytwarzania estrów metylowych kwasów tłuszczowych (estry FAME), osady komórkowe poddawano działaniu 1 M H2SO4 w metanolu i 2% (v/v) dimetoksypropanu przez 1 godz. w 80°C. Estry FAME ekstrahowano dwukrotnie 2 ml eteru naftowego, płukano raz 100 mM NaHCO3, pH 8,0 i raz wodą destylowaną i suszono z Na2SO4. Organiczny rozpuszczalnik odparowywano pod strumieniem argonu i estry FAME rozpuszczano w 50 μl eteru naftowego. Próbki rozdzielano na kolumnie kapilarnej typu ZEBRON ZB Wax (30 m, 0,32 mm, 0,25 μm; Phenomenex) w chromatografie gazowym a Hewlett Packard 6850 wyposażonym w detektor jonizacji płomiennej. Temperatura pieca była zaprogramowana na od 70°C (utrzymywana przez 1 min.) do 200°C przy szybkości 20°C/min., następnie do 250°C (utrzymywana przez 5 min.) przy szybkości 5°C/min. i w końcu do 260°C przy szybkości 5°C/min. Jako gaz nośnikowy stosowano azot (4,5 ml/min. w 70°C). Kwasy tłuszczowe identyfikowano przez porównanie z czasem retencji dla standardów FAME (SIGMA).

Wzory kwasów tłuszczowych z pięciu szczepów transgeniczych drożdży pokazano w Tabeli 1 w % molowych.

Stosunki kwasu γ-linolenowego dodanego i pobranego uwydatniono, przez numery wydrukowane pogrubioną czcionką, te dla wydłużonych produktów przez numery zaznaczone na czerwono a te dla wydłużonego kwasu γ-linolenowego przez numery wydrukowane pogrubioną czcionką (ostatnia linia).

Analizę GC estrów FAME, które pochodzą z całkowitych lipidów drożdży transformowanych pYES2 (i/kontrola) i pY2PSE1 (ii-iv c+d/ w każdym przypadku transformowanych pY2PSE1A, pY2PSE1B, pY2PSE1C, pY2PSE1D) przedstawiono na Fig. 2a-e. Do analizy transgeniczne drożdże hodowano w obecności γ-18:3. Tabela 1 pokazuje wzór ich kwasów tłuszczowych w% molowe. Pobieranie γ-18:3 uwydatniono przez numery wydrukowane pogrubioną czcionką wydłużony produkt kwasu dihomo-Y-linolenowego (20:3Δ8,11,14) podkreślono, a stosunek Y-18:3-produkt elongacji (także w % molowe) uwydatniono przez numery wydrukowane pogrubioną czcionką (ostatnia linia). Strukturę i widma masowe pochodnych DMOX dla cis-A6,9,12 C18:3 można zobaczyć na Fig. 3a+b. Strukturę i widma masowe pochodnych DMOX dla Δ8,11,14 C20:3 można zobaczyć na Fig. 4a+b.

Wyniki te pokazują, że γ-18:3 został wbudowany do wszystkich drożdży transgenicznych w dużych ilościach. Wszystkie cztery klony drożdży transgenicznych, które stransformowano pY2PSE1 wykazują dodatkowy pik na chromatogramie gazowym, który zidentyfikowano jako 20:3Δ8,11,14 przez porównanie czasu retencji. Chromatografia gazowa/spektroskopia mas dostarcza dodatkowego dowodu potwierdzającego tę tożsamość. Zawartość procentowa wydłużonego γ-18:3 wynosił 23,7 do 40,5%, jak pokazano w Tabeli 1. Ponadto nie zaobserwowano znaczącego wydłużenia kwasu palmi52

PL 207 026 B1 tynowego, (16:0), kwasu oleopalmitynowego (16:1), kwasu stearynowego (18:0) czy kwasu oleinowego (18:1Δ9).

Zidentyfikowane produkty pokazują, że sekwencja nukleotydowa PpPSE1 koduje elongazę z mchu Physcomitrella patens selektywną dla kwasów tłuszczowych Δ6, prowadzącą do wytwarzania nowych kwasów tłuszczowych w transgenicznych drożdżach.

Stosunki substratów kwasów tłuszczowych, które były dodawane i pobierane można określać tak jak powyżej i można wykrywać ilość i jakość reakcji elongazy.

Struktura i widma masowe pochodnych DMOX ujawniają także poszczególne pozycje wiązania podwójnego.

Można przeprowadzić dalsze badania pokarmowe z szerokim zakresem innych kwasów tłuszczowych (przykładowo kwasem arachidonowym, kwasem eikozapentaenowym i podobnymi) w celu dokładniejszego potwierdzenia selektywności substratowej tej elongazy.

P r z y k ł a d 18: Ogólny opis izolacji pożądanego produktu ze stransformowanych organizmów

Pożądany produkt można uzyskać z materiału roślinnego lub z grzybów, glonów, orzęsków, komórek zwierzęcych lub z supernatantu, opisanych powyżej hodowli, różnymi metodami znanymi specjalistom. Jeśli pożądany produkt nie jest wydzielany z komórek, komórki można zbierać z hodowli przez wolne wirowanie i komórki można lizować standardowymi takimi jak siła mechaniczna czy sonikacja. Organy roślinne można oddzielać mechanicznie od innej tkanki czy innych organów. Po homogenizacji, resztki są usuwane przez wirowanie a frakcja supernatantu, która zawiera rozpuszczalne białka, jest zachowywana do dalszej izolacji pożądanego związku. Jeśli produkt jest wydzielany z pożądanych komórek, komórki są usuwane z hodowli przez wolne wirowanie a frakcja supernatantu jest zachowywana do dalszej izolacji.

Frakcja supernatantu z każdego etapu izolacji jest poddawana chromatografii ze stosowną żywicą, pożądana cząsteczka zatrzymuje się na żywicy chromatograficznej, podczas gdy zanieczyszczenia z próbki nie zatrzymują się lub zanieczyszczenia z próbki zatrzymują się, na żywicy a próbka nie. Te etapy chromatografii można powtarzać, jeśli jest to pożądane, przy użyciu tych samych czy innych żywic. Specjaliści potrafią wybrać odpowiednie żywice chromatograficzne, które są najbardziej skuteczne przy izolacji określonej cząsteczki. Wyizolowany produkt można zatężyć przez filtrowanie lub ultrafiltrowanie i przechowywać w temperaturze, w której najwyższa jest stabilność produktu.

Specjalistom znane jest szerokie spektrum metod izolacji i powyższe metody izolacji nie mają na celu ich ograniczenia. Takie metody izolacji są opisane, przykładowo, w Bailey, J.E., & Ollis, D.F., Biochemical Engineering Fundamentals, McGraw-Hill: New York (1986).

Tożsamość i czystość wyizolowanych związków można określać standardowymi technikami znanymi w dziedzinie. Obejmują one wysokosprawną chromatografię cieczową (HPLC), metody spektroskopii, metody barwienia, chromatografie cienkowarstwową, NIRS, testy enzymatyczne i metody mikrobiologiczne. Dla przeglądu tych analitycznych metod, patrz: Patek i wsp. (1994) Appl. Environ. Microbiol. 60:133-140; Malakhova i wsp. (1996) Biotekhnologiya 11:27-32; oraz Schmidt i wsp. (1998) Bioprocess Engineer. 19:67-70. Ulmann's Encyclopedia of Industrial Chemistry (1996) Vol. A27, VCH Weinheim, str. 89-90, str. 521-540, str. 540-547, str. 559-566, 575-581 i str. 581-587; Michal, G (1999) Biochemical Pathways: An Atlas of Biochemistry and Molecular Biology, John Wiley and Sons; Fallon, A., i wsp. (1987) Applications of HPLC in Biochemistry in: Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology, Tom 17.

PL 207 026 B1

Lista sekwencji <110> BASF Aktiengesellschaft <120> Nowy gen elongazy i proces wytwarzania wielonienasyconych kwasów tłuszczowych <130> 0050/51159 <140> 20000081 <141> 2000-02-09 <160> 12 <170> Patentln Vers. 2.0 <210> 1 <211> 1192 <212> DNA <213> Physcomitrella patens <220>

<221> CDS <222> (58)..(930) <400> 1 ctgcttcgtc tcatcttggg ggtgtgattc gggagtgggt tgagttggtg gagcgca 57 atg gag gtc gtg gag aga ttc tac ggt gag ttg gat ggg aag gtc tcg 105

Met Glu Val Val Glu Arg Phe Tyr Gly Glu Leu Asp Gly Lys Val Ser

10 15 cag ggc gtg aat gca ttg ctg ggt agt ttt ggg gtg gag ttg acg gat 153

Gin Gly Val Asn Ala Leu Leu Gly Ser Phe Gly Val Glu Leu Thr Asp

25 30 acg ccc act acc aaa ggc ttg ccc ctc gtt gac agt ccc aca ccc atc 201

Thr Pro Thr Thr Lys Gly Leu Pro Leu Val Asp Ser Pro Thr Pro Ile

40 45 gtc ctc ggt gtt tct gta tac ttg act att gtc att gga ggg ctt ttg 249

Val Leu Gly Val Ser Val Tyr Leu Thr Ile Val Ile Gly Gly Leu Leu

55 60 tgg ata aag gcc agg gat ctg aaa ccg cgc gcc tcg gag cca ttt ttg 297

Trp Ile Lys Ala Arg Asp Leu Lys Pro Arg Ala Ser Glu Pro Phe Leu

70 75 80 ctc caa gct ttg gtg ctt gtg cac aac ctg ttc tgt ttt gcg ctc agt 345

Leu Gin Ala Leu Val Leu Val His Asn Leu Phe Cys Phe Ala Leu Ser

90 95 ctg tat atg tgc gtg ggc atc gct tat cag gct att acc tgg cgg tac 393

Leu Tyr Met Cys Val Gly Ile Ala Tyr Gin Ala Ile Thr Trp Arg Tyr

100 105 110 tct ctc tgg ggc aat gca tac aat cct aaa cat aaa gag atg gcg att 441

PL 207 026 B1

Ser

Leu

Trp 115

Gly

Asn

Ala

Tyr

Asn 120

Pro

Lys

His

Lys

Glu 125

Met

Ala

Ile

ctg

gta

tac

ttg

ttc

tac

atg

tct

aag

tac

gtg

gaa

ttc

atg

gat

acc

489

Leu

Val 130

Tyr

Leu

Phe

Tyr

Met 135

Ser

Lys

Tyr

Val

Glu 140

Phe

Met

Asp

Thr

gtt

atc

atg

ata

ctg

aag

cgc

agc

acc

agg

caa

ata

agc

ttc

ctc

cac

537

Val 145

Ile

Met

Ile

Leu

Lys 150

Arg

Ser

Thr

Arg

Gin 155

Ile

Ser

Phe

Leu

His 160

gtt

tat

cat

tct

tca

att

tcc

ctc

att

tgg

gct

att

gct

cat

585

Val

Tyr

His

Ser 165

Ser

Ile

Ser

Leu

Ile 170

Trp

Ala

Ile

Ala 175

His

cac

gct

cct

ggc

ggt

gaa

gca

tat

tgg

tct

gcg

gct

ctg

aac

tca

gga

633

His

Ala

Pro

Gly 180

Gly

Glu

Ala

Tyr

Trp 185

Ser

Ala

Leu

Asn 190

Ser

Gly

gtg

cat

gtt

ctc

atg

tat

gcg

tat

tac

ttc

ttg

gct

gcc

tgc

ctt

ega

681

Val

His

Val 195

Leu

Met

Tyr

Ala

Tyr 200

Tyr

Phe

Leu

Ala

Ala 205

Cys

Leu

Arg

agt

agc

cca

aag

tta

aaa

aat

aag

tac

ctt

ttt

tgg

ggc

agg

tac

ttg

729

Ser

Ser 210

Pro

Lys

Leu

Lys

Asn 215

Lys

Tyr

Leu

Phe

Trp 220

Gly

Arg

Tyr

Leu

aca

caa

ttc

caa

atg

ttc

cag

ttt

atg

ctg

aac

tta

gtg

cag

gct

tac

777

Thr 225

Gin

Phe

Gin

Met

Phe 230

Gin

Phe

Met

Leu

Asn 235

Leu

Val

Gin

Ala

Tyr 240

tac

gac

atg

aaa

acg

aat

gcg

cca

tat

cca

caa

tgg

ctg

atc

aag

att

825

Tyr

Asp

Met

Lys

Thr 245

Asn

Ala

Pro

Tyr

Pro 250

Gin

Trp

Leu

Ile

Lys 255

Ile

ttg

ttc

tac

atg

atc

tcg

ttg

ctg

ttt

ctt

ttc

ggc

aat

ttt

tac

873

Leu

Phe

Tyr

Tyr 260

Met

Ile

Ser

Leu

Leu 265

Phe

Leu

Phe

Gly

Asn 270

Phe

Tyr

gta

caa

aaa

tac

atc

aaa

ccc

tct

gac

gga

aag

caa

aag

gga

gct

aaa

921

Val

Gin

Lys

Tyr

Ile

Lys

Pro

Ser

Asp

Gly

Lys

Gin

Lys

Gly

Ala

Lys

275 280 285 act gag tga gctgtatcaa gccatagaaa ctctattatg ttagaacctg 970

Thr Glu

290 aagttggtgc tttcttatct ccacttatct tttaagcagc atcagttttg aaatgatgtg 1030 tgggcgtggt ctgcaagtag tcatcaatat aatcggcctg agcacttcag atggattgtt 1090 agaacatgag taaaagcggt tattacggtg tttattttgt accaaatcac cgcacgggtg 1150 aattgaaata tttcagattt gatcaatttc atctgaaaaa aa 1192

PL 207 026 B1 <210> 2 <211> 290 <212> PRT

<213> Physcomitrella patens <400> 2

Met 1

Glu

Val

Glu 5

Arg

Phe

Tyr

Gly

Glu 10

Leu

Asp

Gly

Lys

Val 15

Ser

Gin

Gly

Val

Asn 20

Ala

Leu

Gly

Ser 25

Phe

Gly

Val

Glu

Leu 30

Thr

Asp

Thr

Pro

Thr 35

Thr

Lys

Gly

Leu

Pro 40

Leu

Val

Asp

Ser

Pro 45

Thr

Pro

Ile

Val

Leu 50

Gly

Val

Ser

Val

Tyr 55

Leu

Thr

Ile

Val

Ile 60

Gly

Leu

Trp 65

Ile

Lys

Ala

Arg

Asp 70

Leu

Lys

Pro

Arg

Ala 75

Ser

Glu

Pro

Phe

Leu 80

Leu

Gin

Ala

Leu

Val 85

Leu

Val

His

Asn

Leu 90

Phe

Cys

Phe

Ala

Leu 95

Ser

Leu

Tyr

Met

Cys 100

Val

Gly

Ile

Ala

Tyr 105

Gin

Ala

Ile

Thr

Trp 110

Arg

Tyr

Ser

Leu

Trp 115

Gly

Asn

Ala

Tyr

Asn 120

Pro

Lys

His

Lys

Glu 125

Met

Ala

Ile

Leu

Val 130

Tyr

Leu

Phe

Tyr

Met 135

Ser

Lys

Tyr

Val

Glu 140

Phe

Met

Asp

Thr

Val 145

Ile

Met

Ile

Leu

Lys 150

Arg

Ser

Thr

Arg

Gin 155

Ile

Ser

Phe

Leu

His 160

Val

Tyr

His

Ser 165

Ser

Ile

Ser

Leu

Ile 170

Trp

Ala

Ile

Ala 175

His

Ala

Pro

Gly 180

Gly

Glu

Ala

Tyr

Trp 185

Ser

Ala

Leu

Asn 190

Ser

Gly

Val

His

Val 195

Leu

Met

Tyr

Ala

Tyr 200

Tyr

Phe

Leu

Ala

Ala 205

Cys

Leu

Arg

Ser

Ser 210

Pro

Lys

Leu

Lys

Asn 215

Lys

Tyr

Leu

Phe

Trp 220

Gly

Arg

Tyr

Leu

Thr 225

Gin

Phe

Gin

Met

Phe 230

Gin

Phe

Met

Leu

Asn 235

Leu

Val

Gin

Ala

Tyr 240

Tyr

Asp

Met

Lys

Thr 245

Asn

Ala

Pro

Tyr

Pro 250

Gin

Trp

Leu

Ile

Lys 255

Ile

PL 207 026 B1

Leu

Phe

Tyr

Tyr 260

Met

Ile

Ser

Leu

Leu 265

Phe

Leu

Phe

Gly

Asn 270

Phe

Tyr

Val

Gin

Lys

Tyr

Ile

Lys

Pro

Ser

Asp

Gly

Lys

Gin

Lys

Gly

Ala

Lys

275 280 285

Thr Glu 2 90 <210> 3 <211> 687 <212> DNA <213> Thraustochytrium.

<220>

<221> CDS <222> (1)..(588) <400> 3

cgc Arg 1

agc Ser

gtg Val

cat His

aac Asn 5

ctc Leu

ggg Gly

ctc Leu

tgc Cys

ctc Leu 10

ttc Phe

tcg Ser

ggc Gly

gcc Ala

gtg Val 15

tgg Trp

48

atc

tac

acg

agc

tac

ctc

atg

atc

cag

gat

ggg

cac

ttt

cgc

agc

ctc

96

Ile

Tyr

Thr

Ser 20

Tyr

Leu

Met

Ile

Gin 25

Asp

Gly

His

Phe

Arg 30

Ser

Leu

gag

gcg

gca

acg

tgc

gag

ccg

ctc

aag

cat

ccg

cac

ttc

cag

ctc

atc

144

Glu

Ala

Ala 35

Thr

Cys

Glu

Pro

Leu 40

Lys

His

Pro

His

Phe 45

Gin

Leu

Ile

agc

ttg

ctc

ttt

gcg

ctg

tcc

aag

atc

tgg

gag

tgg

ttc

gac

acg

gtg

192

Ser

Leu 50

Leu

Phe

Ala

Leu

Ser 55

Lys

Ile

Trp

Glu

Trp 60

Phe

Asp

Thr

Val

ctc

atc

gtc

aag

ggc

aac

aag

ctc

cgc

ttc

ctg

cac

gtc

ttg

cac

240

Leu 65

Leu

Ile

Val

Lys

Gly 70

Asn

Lys

Leu

Arg

Phe 75

Leu

His

Val

Leu

His 80

cac

gcc

acg

acc

ttt

tgg

ctc

tac

gcc

atc

gac

cac

atc

ttt

ctc

tcg

288

His

Ala

Thr

Phe 85

Trp

Leu

Tyr

Ala

Ile 90

Asp

His

Ile

Phe

Leu 95

Ser

tcc

atc

aag

tac

ggc

gtc

gcg

gtc

aat

gct

ttc

atc

cac

acc

gtc

atg

336

Ser

Ile

Lys

Tyr 100

Gly

Val

Ala

Val

Asn 105

Ala

Phe

Ile

His

Thr 110

Val

Met

tac

gcg

cac

tac

ttc

cgc

cca

ttc

ccg

aag

ggc

ttg

cgc

ccg

ctt

att

384

Tyr

Ala

His 115

Tyr

Phe

Arg

Pro

Phe 120

Pro

Lys

Gly

Leu

Arg 125

Pro

Leu

Ile

acg

cag

ttg

cag

atc

gtc

cag

ttc

atc

ttc

agc

atc

ggc

atc

cat

acc

432

Thr

Gin 130

Leu

Gin

Ile

Val

Gin 135

Phe

Ile

Phe

Ser

Ile 140

Gly

Ile

His

Thr

PL 207 026 B1

gcc Ala 145

atc Ile

tac Tyr

tgg Trp

cac His

tac Tyr 150

gac Asp

tgc Cys

gag Glu

ccg Pro

ctc Leu 155

gtg cat Val His

acc Thr

cac His

ttt Phe 160

480

tgg

gaa

tac

gtc

acg

ccc

tac

ctc

ttc

gtc

gtg

ccc ttc

ctc

atc

ctc

528

Trp

Glu

Tyr

Val

Thr 165

Pro

Tyr

Leu

Phe

Val 170

Val

Pro Phe

Leu

Ile 175

Leu

ttt

ctc

aat

ttc

tac

ctg

cag

tac

gtc

ctc

gcg ccc

gca

aaa

acc

576

Phe

Leu

Asn

Phe 180

Tyr

Leu

Gin

Tyr 185

Val

Leu

Ala Pro

Ala 190

Lys

Thr

aag Lys

gca Ala 195

tag

ccacgtaaca gtagaccagc agcgccgagg acgcgtgccg

628

cgttatcgcg aagcacgaaa taaagaagat catttgattc aaaaaaaaaa aaaaaaaaa 687 <210> 4 <211> 195 <212> PRT <213> Thraustochytrium <400> 4

Arg Ser Val His Asn Leu Gly Leu Cys Leu Phe Ser Gly Ala Val Trp 15 10 15

Ile Tyr Thr Ser Tyr Leu Met Ile Gin Asp Gly His Phe Arg Ser Leu 20 25 30

Glu Ala Ala Thr Cys Glu Pro Leu Lys His Pro His Phe Gin Leu Ile 35 40 45

Ser Leu Leu Phe Ala Leu Ser Lys Ile Trp Glu Trp Phe Asp Thr Val 50 55 60

Leu Leu Ile Val Lys Gly Asn Lys Leu Arg Phe Leu His Val Leu His 65 70 75 80

His Ala Thr Thr Phe Trp Leu Tyr Ala Ile Asp His Ile Phe Leu Ser 85 90 95

Ser Ile Lys Tyr Gly Val Ala Val Asn Ala Phe Ile His Thr Val Met 100 105 110

Tyr Ala His Tyr Phe Arg Pro Phe Pro Lys Gly Leu Arg Pro Leu Ile 115 120 125

Thr Gin Leu Gin Ile Val Gin Phe Ile Phe Ser Ile Gly Ile His Thr 130 135 140

Ala Ile Tyr Trp His Tyr Asp Cys Glu Pro Leu Val His Thr His Phe 145 150 155 160

PL 207 026 B1

Trp Glu Tyr Val Thr Pro Tyr Leu Phe Val Val Pro Phe Leu Ile Leu 165 170 175

Phe Leu Asn Phe Tyr Leu Gin Gin Tyr Val Leu Ala Pro Ala Lys Thr 180 185 190

Lys Lys Ala 195 <210> 5 <211> 955 <212> DNA <213> Thaustochytrium <220>

<221> CDS <222> (1)..(894)

<400> 5

gtc

att

tcg

ggc

ctc

gac

ctt

ctc

ccc

gtg

ctc

tcg

tgg

gag

act

atg

48

Val

Ile

Ser

Gly

Leu

Asp

Leu

Pro

Val

Leu

Ser

Trp

Glu

Thr

Met

1

5

10

15

aag

ttc

gac

act

gcc

gaa

gtt

gtc

tcg

gtc

tgg

ctg

cgc

acg

cac

atg

96

Lys

Phe

Asp

Thr

Ala

Glu

Val

Ser

Val

Trp

Leu

Arg

Thr

His

Met

20

25

30

tgg

gtc

ccc

ttc

ctg

atg

tgc

ttc

atc

tac

ctg

gtc

atc

ttc

ggc

144

Trp

Val

Pro

Phe

Leu

Met

Cys

Phe

Ile

Tyr

Leu

Val

Ile

Phe

Gly

35

40

45

atc

cag

tac

atg

gag

gac

cgc

aag

gag

ttc

gat

ctg

cgc

aag

ccg

192

Ile

Gin

Tyr

Met

Glu

Asp

Arg

Lys

Glu

Phe

Asp

Leu

Arg

Lys

Pro

50

55

60

ctg

gcc

tgg

agc

gcc

ttc

ttg

gcc

att

ttc

agc

atc

ggc

gcc

tcc

240

Leu

Ala

Trp

Ser

Ala

Phe

Leu

Ala

Ile

Phe

Ser

Ile

Gly

Ala

Ser

65

70

75

80

atc

cgc

acc

gtg

ccc

gtc

ctg

ctc

aag

atg

ctc

tac

gaa

aag

ggc

^acg

288

Ile

Arg

Thr

Val

Pro

Val

Leu

Lys

Met

Leu

Tyr

Glu

Lys

Gly

Thr

85

90

95

cac

gtg

ctc

tgc

ggc

gac

acg

cgc

aac

gac

tgg

gtc

att

gac

aac

336

His

Val

Leu

Cys

Gly

Asp

Thr

Arg

Asn

Asp

Trp

Val

Ile

Asp

Asn

100

105

110

ccg

gcc

ggc

gtc

tgg

acc

atg

gcc

ttt

atc

ttt

tcc

aag

att

ccc

gag

384

Pro

Ala

Gly

Val

Trp

Thr

Met

Ala

Phe

Ile

Phe

Ser

Lys

Ile

Pro

Glu

115

120

125

ctc

atc

gac

acc

ctc

ttt

atc

gtg

ctc

cgc

aag

cgc

aag

ctc

atc

acc

432

Leu

Ile

Asp

Thr

Leu

Phe

Ile

Val

Leu

Arg

Lys

Arg

Lys

Leu

Ile

Thr

PL 207 026 B1

480

130

135

140

ctc

cac

tgg

tac

cac

gtg

acc

gtg

ctc

ctg

ttc

tgc

tgg

cac

gcc

Leu

His

Trp

Tyr

His

Val

Thr

Val

Leu

Phe

Cys

Trp

His

Ala

145

150

155

160

tgg

gcc

acc

ttt

gcg

ctc

acc

ggc

atc

gtc

ttt

gcc

atc

aac

gcc

Trp

Ala

Thr

Phe

Ala

Leu

Thr

Gly

Ile

Val

Phe

Ala

Ile

Asn

Ala

165

170

175

528 tcg gtg cac gcc atc atg tac gcc tat tac gcc ttc acg gcc ctc ggc Ser Val His Ala Ile Met Tyr Ala Tyr Tyr Ala Phe Thr Ala Leu Gly

180 185 190

576 tac ega cca acc tcg tac gcc atc tac att acg ctc att cag atc atg Tyr Arg Pro Thr Ser Tyr Ala Ile Tyr Ile Thr Leu Ile Gin Ile Met

195 200 205

624 cag atg gtc gtc ggc acc gcc gtc acc ttt tac att ggc tac gac atg Gin Met Val Val Gly Thr Ala Val Thr Phe Tyr Ile Gly Tyr Asp Met

210 215 220

672 gcc ttt gtc acg ccg cag ccc ttc ege ctt gac atg aaa ctc aac tgg Ala Phe Val Thr Pro Gin Pro Phe Arg Leu Asp Met Lys Leu Asn Trp 225 230 235 240

720 gac ccg ctc age aag ggc gag aac acc gag ccc acc tgc aag ggc gcc Asp Pro Leu Ser Lys Gly Glu Asn Thr Glu Pro Thr Cys Lys Gly Ala

245 250 255

768

260

tac	ctc	ttc	tgc	ctc	ttc	ttc	tac
Tyr	Leu	Phe	Cys	Leu	Phe	Phe	Tyr
		275					280
tcg	acg	ccc	gcg	gcc	aag	aag	aca
Ser	Thr	Pro	Ala	Ala	Lys	Lys	Thr
	290					295

gtc	atc	atg	tac	gcc	tcg	tac	ctc	816
Val	Ile	Met	Tyr	Ala	Ser	Tyr	Leu
265					270
atg	gcc	tac	ctg	ege	ccg	aag	aag	864
Met	Ala	Tyr	Leu	Arg	Pro	Lys	Lys
				285

914 ttccactcga cctagaaaaa aaaaaaaaaa aaaaactcga g

955 <210> 6 <211> 297 <212> PRT <213> Thaustochytrium <400> 6

Val Ile Ser Gly Leu Asp Leu Leu Pro Val Leu Ser Trp Glu Thr Met 15 10 15

Lys Phe Asp Thr Ala Glu Val Val Ser Val Trp Leu Arg Thr His Met

PL 207 026 B1

25 30

Trp

Val

Pro 35

Phe

Leu

Met

Cys

Phe 40

Ile

Tyr

Leu

Val

Val 45

Ile

Phe

Gly

Ile

Gin

Tyr

Met

Glu

Asp

Arg

Lys

Glu

Phe

Asp

Leu

Arg

Lys

Pro

50

55

60

Leu

Ala

Trp

Ser

Ala

Phe

Leu

Ala

Ile

Phe

Ser

Ile

Gly

Ala

Ser

65

70

75

80

Ile

Arg

Thr

Val

Pro

Val

Leu

Lys

Met

Leu

Tyr

Glu

Lys

Gly

Thr

85

90

95

His

Val

Leu

Cys

Gly

Asp

Thr

Arg

Asn

Asp

Trp

Val

Ile

Asp

Asn

100

105

110

Pro

Ala

Gly

Val

Trp

Thr

Met

Ala

Phe

Ile

Phe

Ser

Lys

Ile

Pro

Glu

115

120

125

Leu

Ile

Asp

Thr

Leu

Phe

Ile

Val

Leu

Arg

Lys

Arg

Lys

Leu

Ile

Thr

130

135

140

Leu

His

Trp

Tyr

His

Val

Thr

Val

Leu

Phe

Cys

Trp

His

Ala

145

150

155

160

Trp

Ala

Thr

Phe

Ala

Leu

Thr

Gly

Ile

Val

Phe

Ala

Ile

Asn

Ala

165

170

175

Ser

Val

His

Ala

Ile

Met

Tyr

Ala

Tyr

Ala

Phe

Thr

Ala

Leu

Gly

180

185

190

Tyr

Arg

Pro

Thr

Ser

Tyr

Ala

Ile

Tyr

Ile

Thr

Leu

Ile

Gin

Ile

Met

195

200

205

Gin

Met

Val

Gly

Thr

Ala

Val

Thr

Phe

Tyr

Ile

Gly

Tyr

Asp

Met

210

215

220

Ala

Phe

Val

Thr

Pro

Gin

Pro

Phe

Arg

Leu

Asp

Met

Lys

Leu

Asn

Trp

225

230

235

240

Asp

Pro

Leu

Ser

Lys

Gly

Glu

Asn

Thr

Glu

Pro

Thr

Cys

Lys

Gly

Ala

245

250

255

Asn

Ser

Asn

Ala

Ile

Phe

Gly

Val

Ile

Met

Tyr

Ala

Ser

Tyr

Leu

260

265

270

Tyr

Leu

Phe

Cys

Leu

Phe

Tyr

Met

Ala

Tyr

Leu

Arg

Pro

Lys

275

280

285

Ser

Thr

Pro

Ala

Lys

Thr

Asn

290 295 <210> 7

PL 207 026 B1

<211> 708 <212> DNA <213> Crypthecodiniuia

<220>

<221> CDS

<222> (1) . .

(645:

)

<400> 7

cgg

cac

gag

gta

cac

atg

acc

gag

aag

agg

gga

ctg

cag

ttc

acg

atc

48

Arg

His

Glu

Val

His

Met

Thr

Glu

Lys

Arg

Gly

Leu

Gin

Phe

Thr

Ile

1

5

10

15

tgc

ggc

tct

act

ggt

gag

ttg

gtg

cag

aat

ctc

cag

gat

ggt

ccc

act

96

Cys

Gly

Ser

Thr

Gly

Glu

Leu

Val

Gin

Asn

Leu

Gin

Asp

Gly

Pro

Thr

20

25

30

gcc

ttg

gcg

ttg

tgc

ctc

ttt

tgc

ttc

age

aaa

att

ccc

gag

ttg

atg

144

Ala

Leu

Ala

Leu

Cys

Leu

Phe

Cys

Phe

Ser

Lys

Ile

Pro

Glu

Leu

Met

35

40

45

gac

acg

gtc

ttt

ctc

atc

ttg

aag

ggc

aag

gtt

ege

ttt

ttg

cag

192

Asp

Thr

Val

Phe

Leu

Ile

Leu

Lys

Gly

Lys

Val

Arg

Phe

Leu

Gin

50

55

60

tgg

tac

cac

gct

acc

gtg

atg

ctc

ttc

tgc

tgg

ttg

gca

ctg

gct

240

Trp

Tyr

His

Ala

Thr

Val

Met

Leu

Phe

Cys

Trp

Leu

Ala

Leu

Ala

65

70

75

80

acg

gag

tac

acc

ccg

ggc

ctc

tgg

ttc

gcg

gcc

act

aac

tac

ttc

gtg

288

Thr

Glu

Tyr

Thr

Pro

Gly

Leu

Trp

Phe

Ala

Thr

Asn

Tyr

Phe

Val

85

90

95

cac

tcc

atc

atg

tac

atg

tac

ttc

ttg

atg

acc

ttc

aag

acg

gcc

336

His

Ser

Ile

Met

Tyr

Met

Tyr

Phe

Leu

Met

Thr

Phe

Lys

Thr

Ala

100

105

110

gca

aag

gtc

gtg

aag

ccc

att

gcc

cct

ctc

atc

acc

atc

cag

atc

384

Ala

Lys

Val

Lys

Pro

Ile

Ala

Pro

Leu

Ile

Thr

Ile

Gin

Ile

115

120

125

gcc

cag

atg

gtc

tgg

ggt

ctc

atc

gtc

aac

ggc

atc

gcg

atc

acc

act

432

Ala

Gin

Met

Val

Trp

Gly

Leu

Ile

Val

Asn

Gly

Ile

Ala

Ile

Thr

130

135

140

ttc

acc

acg

ggc

gcc

tgc

cag

atc

cag

tcc

gtg

acg

gtc

tac

tcg

480

Phe

Thr

Gly

Ala

Cys

Gin

Ile

Gin

Ser

Val

Thr

Val

Tyr

Ser

145

150

155

160

gcc

att

gtg

atg

tac

gct

tcg

tac

ttc

tac

ctc

ttc

tcc

cag

ctc

ttc

528

Ala

Ile

Val

Met

Tyr

Ala

Ser

Tyr

Phe

Tyr

Leu

Phe

Ser

Gin

Leu

Phe

165

170

175

ctg

gag

gca

tac

gga

tcc

gct

ggc

aag

aac

aag

ctc

gcc

ege

576

Leu

Glu

Ala

Tyr

Gly

Ser

Ala

Gly

Lys

Asn

Lys

Leu

Ala

Arg

PL 207 026 B1

180

185

190

gag

ctc

tcc

ega

aag

atc

tcc

gag

gct

ctc

ctg

aat

agt

ggc gac gag

624

Glu

Leu

Ser

Arg

Lys

Ile

Ser

Glu

Ala

Leu

Asn

Ser

Gly Asp Glu

195

200

205

gta

gcc

aag

cac

ctc

aag

tga

actgagcgac

eteatettgg tctggtccgc

675

Val

Ala

Lys

His

Leu

Lys

210

215

caaattgccg cgtgcatgtg catgagatgc tgt 708 <210> 8 <211> 214 <212> PRT <213> Crypthecodinium

<400> 8

Arg 1

His

Glu

Val

His 5

Met

Thr

Glu

Lys

Arg 10

Gly

Leu

Gin

Phe

Thr 15

Ile

Cys

Gly

Ser

Thr 20

Gly

Glu

Leu

Val

Gin 25

Asn

Leu

Gin

Asp

Gly 30

Pro

Thr

Ala

Leu

Ala 35

Leu

Cys

Leu

Phe

Cys 40

Phe

Ser

Lys

Ile

Pro 45

Glu

Leu

Met

Asp

Thr 50

Val

Phe

Leu

Ile

Leu 55

Lys

Gly

Lys

Val 60

Arg

Phe

Leu

Gin

Trp 65

Tyr

His

Ala

Thr 70

Val

Met

Leu

Phe

Cys 75

Trp

Leu

Ala

Leu

Ala 80

Thr

Glu

Tyr

Thr

Pro 85

Gly

Leu

Trp

Phe

Ala 90

Ala

Thr

Asn

Tyr

Phe 95

Val

His

Ser

Ile

Met 100

Tyr

Met

Tyr

Phe

Phe 105

Leu

Met

Thr

Phe

Lys 110

Thr

Ala

Lys

Val 115

Val

Lys

Pro

Ile

Ala 120

Pro

Leu

Ile

Thr

Ile 125

Ile

Gin

Ile

Ala

Gin 130

Met

Val

Trp

Gly

Leu 135

Ile

Val

Asn

Gly

Ile 140

Ala

Ile

Thr

Phe 145

Phe

Thr

Gly

Ala 150

Cys

Gin

Ile

Gin

Ser 155

Val

Thr

Val

Tyr

Ser 160

Ala

Ile

Val

Met

Tyr 165

Ala

Ser

Tyr

Phe

Tyr 170

Leu

Phe

Ser

Gin

Leu 175

Phe

Leu

Glu

Ala

Tyr

Gly

Ser

Ala

Gly

Lys

Asn

Lys

Leu

Ala

Arg

180 185 190

PL 207 026 B1

Glu Leu Ser Arg Lys Ile Ser Glu Ala Leu Leu Asn Ser Gly Asp Glu 195 200 205

Val Ala Lys His Leu Lys 210 <210> 9 <211> 1054 <212> DNA <213> Thraustochytrium <220>

<221> CDS <222> (43)..(858) <400> 9 gaattcggca cgagagcgcg cggagcggag acctcggccg cg atg atg gag ccg 54 Met Met Glu Pro ctc gac agg tac agg gcg Leu Asp Arg Tyr Arg Ala

10 tcg gcg gcc ttc aag tgg Ser Ala Ala Phe Lys Trp gtc ggg ccc ctg gga atc Val Gly Pro Leu Gly Ile gtg gtc ctc tac ctg agc Val Val Leu Tyr Leu Ser tac ctt ggc ggc ctc atg Tyr Leu Gly Gly Leu Met tgc ctc ttc tcg ggc gcc Cys Leu Phe Ser Gly Ala

90 cag gat ggg cac ttt cgc Gin Asp Gly His Phe Arg

105 aag cat ccg cac ttc cag Lys His Pro His Phe Gin

120 atc tgg gag tgg ttc gac

ctg	gcg	gag	ctc	gcc	gcg
Leu	Ala	Glu	Leu	Ala 15	Ala
caa	gtc	acg	tac	gac	gcc
Gin	Val	Thr	Tyr 30	Asp	Ala
cgg	gag	ccg	ctc	ggg	ctc
Arg	Glu	Pro 45	Leu	Gly	Leu
ctg	ctg	gcc	gtg	gtc	tac
Leu	Leu 60	Ala	Val	Val	Tyr
gcg	ctc	cgc	agc	gtg	cat
Ala 75	Leu	Arg	Ser	Val	His 80
gtg	tgg	atc	tac	acg	agc
Val	Trp	Ile	Tyr	Thr 95	Ser
agc	ctc	gag	gcg	gca	acg
Ser	Leu	Glu	Ala 110	Ala	Thr
ctc	atc	agc	ttg	ctc	ttt
Leu	Ile	Ser 125	Leu	Leu	Phe
acg	gtg	ctc	ctc	atc	gtc

agg tac gcc agc 102 Arg Tyr Ala Ser aag gac agc ttc 150 Lys Asp Ser Phe ctg gtg ggc tcc 198 Leu Val Gly Ser gcg ctg cgg aac 246 Ala Leu Arg Asn aac ctc ggg ctc 294 Asn Leu Gly Leu tac ctc atg atc 342 Tyr Leu Met Ile

100 tgc gag ccg ctc 390

Cys Glu Pro Leu

115 gcg ctg tcc aag 438

Ala Leu Ser Lys

130 aag ggc aac aag 486

PL 207 026 B1

Ile

Trp

Glu 135

Trp

Phe

Asp

Thr

Val 140

Leu

Ile

Val

Lys 145

Gly

Asn

Lys

ctc

cgc

ttc

ctg

cac

gtc

ttg

cac

gcc

acg

acc

ttt

tgg

ctc

tac

534

Leu

Arg

Phe

Leu

His

Val

Leu

His

Ala

Thr

Phe

Trp

Leu

Tyr

150

155

160

gcc

atc

gac

cac

atc

ttt

ctc

tcg

tcc

atc

aag

tac

ggc

gtc

gcg

gtc

582

Ala

Ile

Asp

His

Ile

Phe

Leu

Ser

Ile

Lys

Tyr

Gly

Val

Ala

Val

165

170

175

180

aat

gct

ttc

atc

cac

acc

gtc

atg

tac

gcg

cac

tac

ttc

cgc

cca

ttc

630

Asn

Ala

Phe

Ile

His

Thr

Val

Met

Tyr

Ala

His

Tyr

Phe

Arg

Pro

Phe

185

190

195

ccg

aag

ggc

ttg

cgc

ccg

ctt

att

acg

cag

ttg

cag

atc

gtc

cag

ttc

678

Pro

Lys

Gly

Leu

Arg

Pro

Leu

Ile

Thr

Gin

Leu

Gin

Ile

Val

Gin

Phe

200

205

210

att

ttc

agc

atc

ggc

atc

cat

acc

gcc

att

tac

tgg

cac

tac

gac

tgc

726

Ile

Phe

Ser

Ile

Gly

Ile

His

Thr

Ala

Ile

Tyr

Trp

His

Tyr

Asp

Cys

215

220

225

gag

ccg

ctc

gtg

cat

acc

cac

ttt

tgg

gaa

tac

gtc

acg

ccc

tac

ctt

774

Glu

Pro

Leu

Val

His

Thr

His

Phe

Trp

Glu

Tyr

Val

Thr

Pro

Tyr

Leu

230

235

240

ttc

gtc

gtg

ccc

ttc

ctc

atc

ctc

ttt

ttc

aat

ttt

tac

ctg

cag

822

Phe

Val

Pro

Phe

Leu

Ile

Leu

Phe

Asn

Phe

Tyr

Leu

Gin

245

250

255

260

tac

gtc

ctc

gcg

ccc

gca

aaa

acc

aag

gca

tag

ccacgtaaca

868

Tyr

Val

Leu

Ala

Pro

Ala

Lys

Thr

Lys

Ala

265

270

gtagaccagc	agcgccgagg	acgcgtgccg	cgttatcgcg	aagcacgaaa	taaagaagat	928
catttgattc	aacgaggcta	cttgcggcca	cgagaaaaaa	aaaaaaaaaa	aaaaaaaaaa	988
aaaaaaaaaa	aaaaaaaaaa	aaaaaaaaaa	aaaaaaaaaa	aaaaaaaaaa	aaaaaaaaaa	1048
ctcgag						1054

<210> 10 <211> 271 <212> PRT <213> Thraustochytrium.

<400> 10

Met Met Glu Pro Leu Asp Arg Tyr Arg Ala Leu Ala Glu Leu Ala Ala 15 10 15

Arg Tyr Ala Ser Ser Ala Ala Phe Lys Trp Gin Val Thr Tyr Asp Ala 20 25 30

PL 207 026 B1

Lys

Asp

Ser 35

Phe

Val

Gly

Pro

Leu 40

Gly

Ile

Arg Glu

Pro 45

Leu

Gly

Leu

Val

Gly

Ser

Val

Leu

Tyr

Leu

Ser

Leu Leu

Ala

Val

Tyr

50

55

60

Ala

Leu

Arg

Asn

Tyr

Leu

Gly

Leu

Met

Ala Leu

Arg

Ser

Val

His

65

70

75

80

Asn

Leu

Gly

Leu

Cys

Leu

Phe

Ser

Gly

Ala

Val Trp

Ile

Tyr

Thr

Ser

85

90

95

Tyr

Leu

Met

Ile

Gin

Asp

Gly

His

Phe

Arg

Ser Leu

Glu

Ala

Thr

100

105

110

Cys

Glu

Pro

Leu

Lys

His

Pro

His

Phe

Gin

Leu Ile

Ser

Leu

Phe

115

120

125

Ala

Leu

Ser

Lys

Ile

Trp

Glu

Trp

Phe

Asp

Thr Val

Leu

Ile

Val

130

135

140

Lys

Gly

Asn

Lys

Leu

Arg

Phe

Leu

His

Val

Leu His

His

Ala

Thr

145

150

155

160

Phe

Trp

Leu

Tyr

Ala

Ile

Asp

His

Ile

Phe

Leu Ser

Ser

Ile

Lys

Tyr

165

170

175

Gly

Val

Ala

Val

Asn

Ala

Phe

Ile

His

Thr

Val Met

Tyr

Ala

His

Tyr

180

185

190

Phe

Arg

Pro

Phe

Pro

Lys

Gly

Leu

Arg

Pro

Leu Ile

Thr

Gin

Leu

Gin

195

200

205

Ile

Val

Gin

Phe

Ile

Phe

Ser

Ile

Gly

Ile

His Thr

Ala

Ile

Tyr

Trp

210

215

220

His

Tyr

Asp

Cys

Glu

Pro

Leu

Val

His

Thr

His Phe

Trp

Glu

Tyr

Val

225

230

235

240

Thr

Pro

Tyr

Leu

Phe

Val

Pro

Phe

Leu

Ile Leu

Phe

Asn

Phe

245

250

255

Tyr

Leu

Gin

Tyr

Val

Leu

Ala

Pro

Ala

Lys Thr

Lys

Ala

260 265 270

<210>	11
<211>	421
<212>	DNA
<213>	Phytophthora infestans
<220>
<221>	CDS
<222>	(1)-.(279)
<400>	11

PL 207 026 B1

cac His 1

acc Thr

atc Ile

atg Met

tac Tyr 5

act Thr

tac Tyr

ttc Phe

gtc Val 10

agc Ser

gcc Ala

cac His

acg Thr

cgc Arg 15

aac Asn

48

att

tgg

aag

tac

ctc

acg

cgc

att

cag

ctt

atc

cag

ttc

gtg

96

Ile

Trp

Lys

Tyr

Leu

Thr

Arg

Ile

Gin

Leu

Ile

Gin

Phe

Val

20

25

30

acc

atg

aac

gtg

cag

ggc

tac

ctg

acc

tac

tct

ega

cag

tgc

cca

ggc

144

Thr

Met

Asn

Val

Gin

Gly

Tyr

Leu

Thr

Tyr

Ser

Arg

Gin

Cys

Pro

Gly

35

40

45

atg

cct

aag

gtg

ccg

ctc

atg

tac

ctt

gtg

tac

gtg

cag

tca

ctc

192

Met

Pro

Lys

Val

Pro

Leu

Met

Tyr

Leu

Val

Tyr

Val

Gin

Ser

Leu

50

55

60

ttc

tgg

ctc

ttc

atg

aat

ttc

tac

att

cgc

gcg

tac

gtg

ttc

ggc

ccc

240

Phe

Trp

Leu

Phe

Met

Asn

Phe

Tyr

Ile

Arg

Ala

Tyr

Val

Phe

Gly

Pro

65

70

75

80

aag

aaa

ccg

gcc

gtg

gag

gaa

tcg

aag

ttg

taa

cggcgcttgt

289

Lys

Pro

Ala

Val

Glu

Ser

Lys

Leu

85

90

taaaaagtct	aacctcgctg	taacagctta	aaacacacac	acacacaacg	ctttgtagag	349
gaggtaagta	gtggcaactc	gtgtagaaat	gcagcatgcc	catcaaatac	atcccgtatg	409
attcatacta	ct					421

<210> 12 <211> 92 <212> PRT <213> Phytophthora infestans <400> 12

His Thr Ile Met Tyr Thr Tyr Tyr Phe Val Ser Ala His Thr Arg Asn 15 10 15

Ile Trp Trp Lys Lys Tyr Leu Thr Arg Ile Gin Leu Ile Gin Phe Val 20 25 30

Thr Met Asn Val Gin Gly Tyr Leu Thr Tyr Ser Arg Gin Cys Pro Gly 35 40 45

Met Pro Pro Lys Val Pro Leu Met Tyr Leu Val Tyr Val Gin Ser Leu 50 55 60

Phe Trp Leu Phe Met Asn Phe Tyr Ile Arg Ala Tyr Val Phe Gly Pro 65 70 75 80

Lys Lys Pro Ala Val Glu Glu Ser Lys Lys Lys Leu 85 90

Claims

Zastrzeżenia patentowe

1. Wyizolowany kwas nukleinowy zawierający sekwencję nukleotydową kodującą polipeptyd, który wydłuża kwasy tłuszczowe C16, C18 lub C20, z co najmniej dwoma wiązaniami podwójnymi w kwasie tłuszczowym, o co najmniej dwa atomy węgla, przy czym sekwencja nukleotydowa jest wybrana z grupy złożonej z:

(d) sekwencji kwasu nukleinowego nr 1, 3 lub 9, (e) sekwencji kwasu nukleinowego, która zgodnie ze zdegenerowanym kodem genetycznym pochodzi z sekwencji nr 1, 3 lub 9 (f) pochodnej sekwencji kwasu nukleinowego nr 1, 3 lub 9, która koduje polipeptydy o sekwencji aminokwasowej nr 2, 4 lub 10 oraz która wykazuje co najmniej 70% identyczności na poziomie sekwencji aminokwasowej, i która wykazuje działanie polegające na wydłużaniu kwasów tłuszczowych C16, C18 lub C20, z co najmniej dwoma wiązaniami podwójnymi w kwasie tłuszczowym, o co najmniej dwa atomy węgla.
2. Wyizolowany kwas nukleinowy według zastrz. 1, znamienny tym, że sekwencja nukleotydowa pochodzi z rośliny, glonu lub grzyba.
3. Wyizolowany kwas nukleinowy według zastrz. 1 albo 2, znamienny tym, że sekwencja nukleotydowa pochodzi z Physcomitrella lub Thraustochytrium.
4. Konstrukt genowy zawierający wyizolowany kwas nukleinowy określony w jednym z zastrzeżeń od 1 do 3, przy czym kwas nukleinowy jest funkcjonalnie połączony z jednym lub większą liczbą sygnałów regulacyjnych.
5. Konstrukt genowy według zastrz. 4, znamienny tym, że ekspresja genu jest wzmocniona sygnałami regulacyjnymi.
6. Konstrukt genowy zawierający wyizolowany kwas nukleinowy określony w jednym z zastrzeżeń od 1 do 3 albo konstrukt genowy określony w zastrzeżeniu 4 albo 5 i co najmniej jeden dodatkowy kwas nukleinowy kodujący gen biosyntezy kwasu tłuszczowego, wybrany z grupy obejmującej Δ19-, Δ17-, Δ15-, Δ12-, Δ9-, Δ8-, Δ6-, Δ5-, Δ4-desaturazy, różne hydrolazy, Δ12-acetylenazę, tioesterazy acylo-ACP, syntazy β-ketoacylo-ACP lub reduktazy β-ketoacylo-ACP.
7. Sekwencja aminokwasowa kodowana przez wyizolowaną sekwencję kwasu nukleinowego określoną w zastrzeżeniach od 1 do 3 lub przez konstrukt genowy określony w zastrzeżeniach od 4 do 6.
8. Wektor zawierający kwas nukleinowy określony w jednym z zastrzeżeń od 1 do 3 lub konstrukt genowy określony w jednym z zastrzeżeń od 4 do 6.
9. Roślina transgeniczna zawierająca co najmniej jeden kwas nukleinowy określony w jednym z zastrzeżeń od 1 do 3, konstrukt genowy określony w jednym z zastrzeżeń od 4 do 6, lub wektor określony w zastrzeżeniu 8.
10. Mikroorganizm transgeniczny zawierający co najmniej jeden kwas nukleinowy określony w jednym z zastrzeżeń od 1 do 3, konstrukt genowy określony w jednym z zastrzeżeń od 4 do 6, lub wektor określony w zastrzeżeniu 8.
11. Przeciwciało specyficznie wiążące się z polipeptydem kodowanym przez jeden z kwasów nukleinowych określonych w jednym z zastrzeżeń od 1 do 3.
12. Cząsteczka antysensownego kwasu nukleinowego zawierająca sekwencję komplementarną z kwasem nukleinowym określonym w jednym z zastrzeżeń od 1 do 3.
13. Sposób wytwarzania wielonienasyconych kwasów tłuszczowych (PUFA), znamienny tym, że obejmuje hodowanie rośliny transgenicznej lub mikroorganizmu transgenicznego, zawierającego kwas nukleinowy określony w zastrzeżeniu 1, konstrukt genowy określony w zastrzeżeniu 5 lub wektor określony w zastrzeżeniu 8, kodujący polipeptyd, który w warunkach wytwarzania kwasów PUFA w organizmie wydłuża kwasy tłuszczowe C16, C18 lub C20, z co najmniej dwoma wiązaniami podwójnymi w kwasie tłuszczowym, o co najmniej dwa atomy węgla.
14. Sposób według zastrz. 13, znamienny tym, że otrzymane kwasy PUFA są cząsteczkami kwasów tłuszczowych C18, C20 lub C22, z co najmniej dwoma wiązaniami podwójnymi w cząsteczce.
15. Sposób według zastrz. 13 albo 14, znamienny tym, że cząsteczki kwasów tłuszczowych C18, C20 lub C22 wyizolowuje się z rośliny transgenicznej lub mikroorganizmu transgenicznego w postaci oleju, lipidu lub wolnego kwasu tłuszczowego.
16. Sposób według jednego z zastrz. od 13 do 15, znamienny tym, że kwas tłuszczowy C16, C18 lub C20 jest kwasem tłuszczowym z trzema wiązaniami podwójnymi w cząsteczce.