CZ2002365A3 - Nukleové kyseliny jako ligandy tenascinu-C - Google Patents

Nukleové kyseliny jako ligandy tenascinu-C Download PDF

Info

Publication number
CZ2002365A3
CZ2002365A3 CZ2002365A CZ2002365A CZ2002365A3 CZ 2002365 A3 CZ2002365 A3 CZ 2002365A3 CZ 2002365 A CZ2002365 A CZ 2002365A CZ 2002365 A CZ2002365 A CZ 2002365A CZ 2002365 A3 CZ2002365 A3 CZ 2002365A3
Authority
CZ
Czechia
Prior art keywords
tenascin
nucleic acid
ligand
nucleic acids
mixture
Prior art date
Application number
CZ2002365A
Other languages
English (en)
Inventor
Brian Hicke
Stephen Warren
David Parma
Larry Gold
Original Assignee
Gilead Sciences, Inc.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Gilead Sciences, Inc. filed Critical Gilead Sciences, Inc.
Publication of CZ2002365A3 publication Critical patent/CZ2002365A3/cs

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/115—Aptamers, i.e. nucleic acids binding a target molecule specifically and with high affinity without hybridising therewith ; Nucleic acids binding to non-nucleic acids, e.g. aptamers
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/54—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic compound
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/54—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic compound
    • A61K47/547—Chelates, e.g. Gd-DOTA or Zinc-amino acid chelates; Chelate-forming compounds, e.g. DOTA or ethylenediamine being covalently linked or complexed to the pharmacologically- or therapeutically-active agent
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/54—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic compound
    • A61K47/549—Sugars, nucleosides, nucleotides or nucleic acids
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A61P17/06—Antipsoriatics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A61P9/10—Drugs for disorders of the cardiovascular system for treating ischaemic or atherosclerotic diseases, e.g. antianginal drugs, coronary vasodilators, drugs for myocardial infarction, retinopathy, cerebrovascula insufficiency, renal arteriosclerosis
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B82—NANOTECHNOLOGY
    • B82Y—SPECIFIC USES OR APPLICATIONS OF NANOSTRUCTURES; MEASUREMENT OR ANALYSIS OF NANOSTRUCTURES; MANUFACTURE OR TREATMENT OF NANOSTRUCTURES
    • B82Y5/00—Nanobiotechnology or nanomedicine, e.g. protein engineering or drug delivery
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
    • C07H19/00—Compounds containing a hetero ring sharing one ring hetero atom with a saccharide radical; Nucleosides; Mononucleotides; Anhydro-derivatives thereof
    • C07H19/02—Compounds containing a hetero ring sharing one ring hetero atom with a saccharide radical; Nucleosides; Mononucleotides; Anhydro-derivatives thereof sharing nitrogen
    • C07H19/04—Heterocyclic radicals containing only nitrogen atoms as ring hetero atom
    • C07H19/06—Pyrimidine radicals
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
    • C07H19/00—Compounds containing a hetero ring sharing one ring hetero atom with a saccharide radical; Nucleosides; Mononucleotides; Anhydro-derivatives thereof
    • C07H19/02—Compounds containing a hetero ring sharing one ring hetero atom with a saccharide radical; Nucleosides; Mononucleotides; Anhydro-derivatives thereof sharing nitrogen
    • C07H19/04—Heterocyclic radicals containing only nitrogen atoms as ring hetero atom
    • C07H19/06—Pyrimidine radicals
    • C07H19/10—Pyrimidine radicals with the saccharide radical esterified by phosphoric or polyphosphoric acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
    • C07H21/00—Compounds containing two or more mononucleotide units having separate phosphate or polyphosphate groups linked by saccharide radicals of nucleoside groups, e.g. nucleic acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/001—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof by chemical synthesis
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
    • C12N15/1034—Isolating an individual clone by screening libraries
    • C12N15/1048—SELEX
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/10—Transferases (2.)
    • C12N9/12—Transferases (2.) transferring phosphorus containing groups, e.g. kinases (2.7)
    • C12N9/1241—Nucleotidyltransferases (2.7.7)
    • C12N9/1276—RNA-directed DNA polymerase (2.7.7.49), i.e. reverse transcriptase or telomerase
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/34—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving hydrolase
    • C12Q1/37—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving hydrolase involving peptidase or proteinase
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/531—Production of immunochemical test materials
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/531—Production of immunochemical test materials
    • G01N33/532—Production of labelled immunochemicals
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/531—Production of immunochemical test materials
    • G01N33/532—Production of labelled immunochemicals
    • G01N33/535—Production of labelled immunochemicals with enzyme label or co-enzymes, co-factors, enzyme inhibitors or enzyme substrates
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/569—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for microorganisms, e.g. protozoa, bacteria, viruses
    • G01N33/56983—Viruses
    • G01N33/56988—HIV or HTLV
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/74—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving hormones or other non-cytokine intercellular protein regulatory factors such as growth factors, including receptors to hormones and growth factors
    • G01N33/76—Human chorionic gonadotropin including luteinising hormone, follicle stimulating hormone, thyroid stimulating hormone or their receptors
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K2123/00—Preparations for testing in vivo
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/10—Type of nucleic acid
    • C12N2310/13—Decoys
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/31—Chemical structure of the backbone
    • C12N2310/317—Chemical structure of the backbone with an inverted bond, e.g. a cap structure
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/31—Chemical structure of the backbone
    • C12N2310/318—Chemical structure of the backbone where the PO2 is completely replaced, e.g. MMI or formacetal
    • C12N2310/3183—Diol linkers, e.g. glycols or propanediols
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/32—Chemical structure of the sugar
    • C12N2310/321—2'-O-R Modification
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/32—Chemical structure of the sugar
    • C12N2310/322—2'-R Modification
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/35—Nature of the modification
    • C12N2310/351—Conjugate
    • C12N2310/3517—Marker; Tag
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/50—Physical structure
    • C12N2310/53—Physical structure partially self-complementary or closed
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2541/00—Reactions characterised by directed evolution
    • C12Q2541/10—Reactions characterised by directed evolution the purpose being the selection or design of target specific nucleic acid binding sequences
    • C12Q2541/101—Selex
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/158—Expression markers
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C40—COMBINATORIAL TECHNOLOGY
    • C40B—COMBINATORIAL CHEMISTRY; LIBRARIES, e.g. CHEMICAL LIBRARIES
    • C40B40/00—Libraries per se, e.g. arrays, mixtures
    • F—MECHANICAL ENGINEERING; LIGHTING; HEATING; WEAPONS; BLASTING
    • F02—COMBUSTION ENGINES; HOT-GAS OR COMBUSTION-PRODUCT ENGINE PLANTS
    • F02B—INTERNAL-COMBUSTION PISTON ENGINES; COMBUSTION ENGINES IN GENERAL
    • F02B75/00—Other engines
    • F02B75/02—Engines characterised by their cycles, e.g. six-stroke
    • F02B2075/022—Engines characterised by their cycles, e.g. six-stroke having less than six strokes per cycle
    • F02B2075/027—Engines characterised by their cycles, e.g. six-stroke having less than six strokes per cycle four
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/005—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from viruses
    • G01N2333/08—RNA viruses
    • G01N2333/15—Retroviridae, e.g. bovine leukaemia virus, feline leukaemia virus, feline leukaemia virus, human T-cell leukaemia-lymphoma virus
    • G01N2333/155—Lentiviridae, e.g. visna-maedi virus, equine infectious virus, FIV, SIV
    • G01N2333/16—HIV-1, HIV-2
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/005—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from viruses
    • G01N2333/08—RNA viruses
    • G01N2333/15—Retroviridae, e.g. bovine leukaemia virus, feline leukaemia virus, feline leukaemia virus, human T-cell leukaemia-lymphoma virus
    • G01N2333/155—Lentiviridae, e.g. visna-maedi virus, equine infectious virus, FIV, SIV
    • G01N2333/16—HIV-1, HIV-2
    • G01N2333/163—Regulatory proteins, e.g. tat, nef, rev, vif, vpu, vpr, vpt, vpx
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/435—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans
    • G01N2333/475—Assays involving growth factors
    • G01N2333/50—Fibroblast growth factors [FGF]
    • G01N2333/503—Fibroblast growth factors [FGF] basic FGF [bFGF]
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/435—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans
    • G01N2333/575—Hormones
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/435—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans
    • G01N2333/575—Hormones
    • G01N2333/62—Insulins
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/81—Protease inhibitors
    • G01N2333/8107—Endopeptidase (E.C. 3.4.21-99) inhibitors
    • G01N2333/811—Serine protease (E.C. 3.4.21) inhibitors
    • G01N2333/8121—Serpins
    • G01N2333/8125—Alpha-1-antitrypsin
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/90—Enzymes; Proenzymes
    • G01N2333/914—Hydrolases (3)
    • G01N2333/948—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
    • G01N2333/95—Proteinases, i.e. endopeptidases (3.4.21-3.4.99)
    • G01N2333/964—Proteinases, i.e. endopeptidases (3.4.21-3.4.99) derived from animal tissue
    • G01N2333/96425—Proteinases, i.e. endopeptidases (3.4.21-3.4.99) derived from animal tissue from mammals
    • G01N2333/96427—Proteinases, i.e. endopeptidases (3.4.21-3.4.99) derived from animal tissue from mammals in general
    • G01N2333/9643—Proteinases, i.e. endopeptidases (3.4.21-3.4.99) derived from animal tissue from mammals in general with EC number
    • G01N2333/96433—Serine endopeptidases (3.4.21)
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/90—Enzymes; Proenzymes
    • G01N2333/914—Hydrolases (3)
    • G01N2333/948—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
    • G01N2333/95—Proteinases, i.e. endopeptidases (3.4.21-3.4.99)
    • G01N2333/964—Proteinases, i.e. endopeptidases (3.4.21-3.4.99) derived from animal tissue
    • G01N2333/96425—Proteinases, i.e. endopeptidases (3.4.21-3.4.99) derived from animal tissue from mammals
    • G01N2333/96427—Proteinases, i.e. endopeptidases (3.4.21-3.4.99) derived from animal tissue from mammals in general
    • G01N2333/9643—Proteinases, i.e. endopeptidases (3.4.21-3.4.99) derived from animal tissue from mammals in general with EC number
    • G01N2333/96433—Serine endopeptidases (3.4.21)
    • G01N2333/96441—Serine endopeptidases (3.4.21) with definite EC number
    • G01N2333/96455—Kallikrein (3.4.21.34; 3.4.21.35)
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/90—Enzymes; Proenzymes
    • G01N2333/914—Hydrolases (3)
    • G01N2333/948—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
    • G01N2333/966—Elastase
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/90—Enzymes; Proenzymes
    • G01N2333/914—Hydrolases (3)
    • G01N2333/948—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
    • G01N2333/972—Plasminogen activators
    • G01N2333/9726—Tissue plasminogen activator
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/90—Enzymes; Proenzymes
    • G01N2333/914—Hydrolases (3)
    • G01N2333/948—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
    • G01N2333/974—Thrombin
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/90—Enzymes; Proenzymes
    • G01N2333/914—Hydrolases (3)
    • G01N2333/948—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
    • G01N2333/976—Trypsin; Chymotrypsin

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Crystallography & Structural Chemistry (AREA)
  • Nanotechnology (AREA)
  • Virology (AREA)

Description

(57) Anotace:
Předkládané řešení se týká nukleových kyselin, které působí s vysokou afinitou jako ligandy tenascinu-C. Dále se řešeni týká způsobu identifikace a přípravy vysokoafinitních ligandových nukleových kyselin k tenascinu-C. Dále se řešení týká ligandových nukleových kyselin k tenascinu-C s vysokou afinitou, RNA ligandů k tenascinu-C a oligonukleotidů obsahujících deriváty chemicky modifikované v poloze 2'purinů a pyrimidinů. Dále se řešení týká RNA ligandů k tenascinu-C, které obsahují modifikace skupinami 2'-F a 2'-OMe. Dále se řešení týká způsobů detekce nemoci v biologické tkáni, kde je exprimován tenascin-C.
• · · ·
180 266/HK « · · · • · · · • · · · • · • · · · · · pp zoo z Nukleové kyseliny jako ligandy tenascinu-C
Oblast techniky
Předkládaný vynález se týká nukleových kyselin, které působí s vysokou afinitou jako ligandy tenascinu-C. Dále se vynález týká způsobů identifikace a způsobů přípravy vysokoafinitních ligandových nukleových kyselin k tenascinu-C. Pro identifikaci takových nukleových kyselin byl použit způsob SELEX, což je akronym z termínu Systematic Evolution of Ligands by Exponential enrichment. Dále se vynález týká ligandových nukleových kyselin k tenascinu-C s vysokou afinitou, RNA ligandů k tenascinu-C a oligonukleotidů obsahujících deriváty chemicky modifikované v poloze 2' purinů a pyrimidinů. Dále se vynález týká RNA ligandů k tenascinu-C, které obsahuji modifikace skupinami 2'-F a 2'-OMe. Oligonukleotidy podle vynálezu jsou užitečné jako diagnostická a/nebo terapeutická činidla.
Dosavadní stav techniky
Tenascin-C je hexamerní glykoprotein velikosti 1,1 až l,5xl06 (Da), lokalizovaný primárně v extracelulární matrix. Tenascin-C je exprimován během embryogenese, hojení poraněni, a neoplázie, což vede k představě o tom, že tento protein hraje roli při přestavbě (remodelingu) tkání (Erickson and Bourdon (1989) Annu Rev Cell Biol 5:71-92). Proces neoplázie zahrnuje také přestavbu tkání, a tenascin-C je nadměrně exprimován v mnoha typech nádorů vč. např. karcinomu plic, prsu, prostaty, tlustého střeva, astrocytomů, glioblastomů, «· · · · · • · · · ·
- 2 melanomů a sarkomů (Soini et al. (1993) Am J Clin Pathol 100 (2):145-50,- Koukoulis et al. (1991) Hum Pathol 22(7):636-43:
Borsi et al. (1992) Int J Cancer 52 (5):688-92,- Koukoulis et al. (1993) J Submicrosc Cytol Pathol 25 (2):285-95,- Ibrahim et al. (1993) Hum Pathol 24 (9):982-9,- Riedl et al. (1998) Dis
Colon Rectum 41 (1):86-92,- Tuominen and Kallioinen (1994) J Cutan Pathol 21 (5):424-9,- Natali et al. (1990) Int J Cancer 46 (4):586-90,- Zagzag et al. (1995) Cancer Res 55 (4):907-14,Iiasegawa et al. (1997) Acta Neuropathol (Berl) 93 (5):431-7,Saxon et al. (1997) Pediatr Pathol Lab Med 17 (2):259-66,Hasegawa et al. (1995) Hum Pathol 26 (8):38-45). Kromě toho je tenascin-C nadměrně exprimován při hyperproliferativních onemocněních kůže jak je např. psoriáza (lupénka) (Schalkwijk et al. (1991) Br J Dermatol 124 (1):13-20) a v aterosklerotických lezích (Fukumoto et al. (1998) J Atheroscler
Thromb 5 (1):29-35,- Wallner et al. (1999) Circulation
99(10):1284-9). Radioaktivně značené protilátky, které se váží na tenascin-C, jsou užívány pro zobrazování a terapii nádorů v klinické praxi (Paganelli et al. (1999) Eur J Nucl Med (4):348-57,- Paganelli et al. (1994) Eur J Nucl Med 21(4):314-21: Bigner et al. (1998) J Clin Oncol 16 (6):2202-12,Merlo et al. (1997) Int J Cancer 71(5).-810-6).
Aptamery proti tenascinu-C jsou potenciálně užitečné pro diagnostiku a terapii nádorů, aterosklerózy a psoriázy. Ve srovnání s protilátkami jsou aptamery malé molekuly, 7000 až 20000 (Da), clearance z krve je velmi rychlá, a lze je připravit chemickou syntézou. Velmi rychlá clearance z krve je důležitá pro in vivo diagnostické zobrazovací metody, kde hladiny v krvi jsou primárním faktorem určujícím pozadí rušící kvalitu zobrazení. Rychlá clearance z krve je důležitá i pro terapii, a sice tam, kde hladina v krvi přispívá k toxicitě.
·· ·· · · · · * · · • ·· · · · · · · ·· • ····· · · · · · · • · · · · ··· ••fcfc fcfc fcfc ··· ·· ····
Technologie SELEX dovoluje rychlou izolaci aptameru a chemická syntéza dovoluje snadnou a místně-specifickou konjugaci aptamerů s celou řadou inertních a bioaktivních molekul. Aptamer k tenascinu-C by proto byl užitečný pro terapii nádorů nebo pro in vivo a ex vivo diagnostické zobrazování a/nebo pro přenos různých terapeuticky účinných činidel v komplexu s ligandovou nukleovou kyselinou tenascinuC pro léčení nemocí, při kterých je tenascin-C exprimován.
Po mnoho let se udržovalo dogma, že nukleová kyselina má primárně informační roli. Metodou známou pod označením SELEX (systematický vývoj ligandů exponenciálním obohacováním, Systematic Evolution of Ligands by EXponential enrichment) se objasnilo, že nukleové kyseliny mají diverzitu trojrozměrné struktury ne nepodobnou proteinům. Metoda SELEX je metoda pro in vitro vývoj molekul nukleové kyseliny, které se vysoce specificky váží na cílové molekuly, a byla popsána v patentové přihlášce USA č. 07/536.428. podané 11. června 1990, nazvané Systematic Evolution of Ligands by EXponential Enrichment, nyní opuštěna, v patentu USA č. 5,475,096 nazvaném Nucleic Acid Ligands, a patentu USA č. 5,270,163 (viz také WO 91/19813) nazvaném Methods for Identifying Nucleic Acid Ligands, kteréžto dokumenty jsou vloženy formou odkazu. Každý z těchto patentových dokumentů, souhrnně zde nazývaných patentové dokumenty SELEX popisuje zásadně novu metodu přípravy nukleových kyselin jakožto ligandů pro požadované cílové molekuly. Metoda SELEX poskytuje třídu produktů, které jsou nazývány ligandové nukleové kyseliny neboli aptamery, z nichž každý má jedinečnou sekvenci a má vlastnost specificky se vázat na požadovanou cílovou sloučeninu nebo molekulu. Každá z ligandových nukleových kyselin identifikovaných metodou SELEX je specifickým ligandem požadované cílové sloučeniny nebo molekuly.
- 4 ···· ·· ·· ··· ··
Metoda SELEX je založena na jedinečné myšlence, a sice, že nukleové kyseliny mají dostatečnou schopnost vytvářet různé dvoj- a trojrozměrné struktury a dostatečnou proměnlivost v rámci jejich monomerů k tomu, aby mohly působit jako ligandy (tj. vytvářet specifické vazebné páry) prakticky s jakoukoliv chemickou sloučeninou, monomemí nebo polymerní. Při metodě SELEX jsou cílové molekuly jakékoliv velikosti a jakéhokoliv složení. Metoda SELEX pro vysokoafinitní vazbu zahrnuje selekci ze směsi kandidátních oligonukleotidů a postupné opakování navázání, oddělení a amplifikace podle stejného obecného schématu, aby bylo dosaženo téměř jakéhokoliv požadovaného kritéria na afinitu a selektivitu vazby. Metoda SELEX vychází ze směsi nukleových kyselin, která výhodně obsahuje segment randomizované sekvence, a zahrnuje kroky, kdy se směs přivede do kontaktu s cílovou molekulou v podmínkách výhodných pro vazbu, nenavázané nukleové kyseliny se oddělí od nukleových kyselin, které se specificky navázaly na cílovou molekulu, komplexy cílová molekula-nukleová kyselina se disociují a nukleové kyseliny disociované z komplexů se amplifikují, čímž se vytvoří ligandy obohacená směs nukleových kyselin, a pak se opakují kroky navázání, oddělení, disociace a amplifikace v tolika cyklech, kolik jich je potřeba k získání vysoce specifické ligandové nukleové kyseliny vázající se na cílovou molekulu s vysokou afinitou.
Původci předkládaného vynálezu uznávají, že metoda SELEX ukázala, že nukleové kyseliny jakožto chemické sloučeniny mohou vytvářet velké spektrum tvarů, velikostí a konfigurací, a jsou schopné mnohem většího repertoáru vazeb a dalších funkcí, než jsou ty vazby a funkce, které projevují nukleové kyseliny v biologických systémech.
Základní metoda SELEX byla modifikována pro řadu specifických cílů. Tak např. patentová přihláška USA
č. 07/960,093, podaná 14. října 1992, nyní opuštěna, a patent USA č. 5,707,796, oba dokumenty s názvem Method for Selecting Nucleic Acids on the Basis of Structure popisují použití metody SELEX ve spojení s gelovou elektroforézou pro selekci molekul nukleové kyseliny se specifickými strukturními vlastnostmi, jako je např. zahnutá DNA.
Patentová přihláška USA č. 08/123,935, podaná 17. Září 1993, nazvaná Photoselection of Nucleic Acid Ligands nyní opuštěna, Patent USA č. 5,763,177, nazvaný Systematic Evolution of Ligands by Exponential Enrichment: Photoselection of Nucleic Acid Ligands and Solution SELEX a patentová přihláška USA č. 09/093.293, podaná 8. června 1998, nazvaná Systematic Evolution of Ligands by Exponential Enrichment: Photoselection of Nucleic Acid Ligands and Solution SELEX popisují metodu založenou na postupu SELEX pro selekci ligandových nukleových kyselin obsahujících fotoreaktivní skupiny schopné vazby a/nebo fotozesítění na a/nebo fotoinaktivaci cílové molekuly. Patent USA č. 5,580,737, nazvaný High-Affinity Nucleic Acid Ligands That Discriminate Between Theophylline and Caffeine popisuje způsob identifikace vysoce specifických ligandových nukleových kyselin schopných rozlišit mezi blízce příbuznými molekulami, které mohou být jiné než peptidové povahy, a tato metoda byla nazvána Counter-SELEX. Patent USA č. 5,567,588, nazvaný Systematic Evolution of Ligands by Exponential Enrichment: Solution SELEX popisuje metodu založenou na SELEX, která dosahuje vysoce účinného rozdělení oligonukleotidů majících vysokou a nízkou afinitu k cílové molekule.
Metoda SELEX zahrnuje identifikaci vysokoafinitních ligandových nukleových kyselin obsahujících modifikované nukleotidy, které poskytují např. zlepšenou stabilitu in vivo nebo zlepšené vlastnosti pro podávání. K příkladům takových
9 9 modifikací patří chemická substituce v poloze ribózy a/nebo fosfátu a/nebo báze. Ligandové nukleové kyseliny obsahující modifikované báze, které byly identifikovány metodou SELEX byly popsány v Patentu USA č. 5,660,985, nazvaném High Affinity Nucleic Acid Ligands Containing Modified Nucleotides, kde jsou popsány oligonukleotidy obsahující nukleotidové deriváty chemicky modifikované v poloze 5- a 21-pyrimidinů. Patent USA č. 5,580,737 zmíněný výše popisuje vysoce specifické ligandové nukleové kyseliny obsahující jeden nebo více nukleotidů modifikovaných 2'-aminoskupinou (2'-NH2), 2'-fluoroskupinou (2'-F) a/nebo 2'-O-methylovou skupinou (2'-0Me). Patentová přihláška USA č. 08/264,029, podaná 22. června 1994, nazvaná Novel Method of Preparation of Known and Novel 2' Modified Nucleosides by Intramolecuiar Nucleophilic Displacement, nyní opuštěna, popisuje oligonukleotidy obsahující různé 2'-modifikované pyrimidiny.
Metoda SELEX zahrnuje také kombinování vybraných oligonukleotidů s jinými vybranými oligonukleotidy a jinými než oligonukleotidovými funkčními skupinami, což bylo popsáno v Patentu USA č. 5,637,459, nazvaném Systematic Evolution of Ligands by EXponential Enrichment: Chimeric SELEX, a Patentu USA č. 5,683,867, nazvaném Systematic Evolution of Ligands by EXponential Enrichment: Blended SELEX,. Tyto metody umožňují kombinace Širokého spektra tvarů a dalších vlastností, a účinných amplifikačních a replikačních vlastností oligonukleotidů s požadovanými vlastnostmi jiných molekul.
Metoda SELEX dále zahrnuje kombinaci vybraných ligandových nukleových kyselin s lipofilními sloučeninami nebo s neimunogenními vysokomolekulárními sloučeninami do diagnostických nebo terapeutických komplexů, jak bylo popsáno v patentové přihlášce USA č. 08/434,465, podané 4. května 1995, nazvané Nucleic Acid Ligand Complexes.
Ί • · · · ·· · ·· ·· ···· · · · · ···· • ····· · · · · · · • · · « ♦ · · » ···· ·· ·· ··· ·· ····
Každý z výše zmíněných patentových dokumentů je v předkládané přihlášce celý zahrnut formou odkazu.
Podstata vynálezu
Předkládaný vynález popisuje způsob izolace ligandových nukleových kyselin, které se vysoce specificky váží na tenascin-C. Vynález dále popisuje ligandové nukleové kyseliny, tj. nukleové kyseliny působící jako ligandy, k tenascinu-C. Vynález dále popisuje vysokoafinitní RNA ligandy k tenascinu-C. Dále vynález popisuje RNA ligandy k tenascinu-C obsahující pyrimidiny modifikované 2'-fluoroskupinou (21-F) a puriny modifikované 21-O-methylovou skupinou (2'-0Me). Způsob užitý ve vynálezu pro identifikaci nukleových kyselin působících jako ligandy (ligandových nukleových kyselin) je zván SELEX, což je akronym ze Systematic Evolution of Ligands by Exponential enrichment (Systematický vývoj ligandů exponenciálním obohacováním). Vynález zahrnuje také ligandy uvedené v tabulkách 3 a 4 a na obrázku 10.
Předkládaný vynález se dále týká způsobu detekce nemoci, při které je v biologické tkáni exprimován tenascin-C. Dále se týká způsobu detekce nádoru, který exprimuje tenascin-C, v biologické tkáni. Dále se vynález týká komplexů pro použití pro in vivo a in vitro diagnostiku. Dále se vynález týká komplexu pro použití k podávání léčivého přípravku k profylaxi nebo léčení nemocné tkáně exprimující tenascin-C.
Popis obrázků
Obr. 1 ukazuje vazbu SELEX RNA poolů na buňky U251.
« · · · · · ·
9 9 9 «··· · · ·· · • · 11 · ·
Obr. 2 ukazuje předpokládanou sekundární strukturu aptamerů TTA1 a TTA1.NB. Na obrázku je znázorněna konjugace aptamerů s chelatačním činidlem Tc-99m. Všechny A byly 2OMe-modifikované, všechny G, až na uvedené výjimky, byly 2'OMe-modifikované a všechny C a U byly 2'F-modifikované.
Obr. 3 ukazuje zobrazení xenotransplantátů nádorů U251 u myší získaných Tc-99m-značeným TTA1 a TTA1.NB, 3 hodiny po injekci.
Obr. 4 ukazuje fluorescenční mikroskopii řezu glioblastomu U251 3 hodiny po i.v. injekci Rhodamin-Red-X-značeného TTA1.
Obr. 5 ukazuje způsob, jakým je Tc-99m a linker navázán prostřednitvím 5'G TTA 1.
Obr. 6 popisuje příjem TTAI/GS7641 xenotransplantáty humánních nádorů u myší po 3 hodinách ve srovnání a příjmem kontrolního aptamerů, který se neváže. ID/g = injikovaná dávka na gram.
Obr. 7 ukazuje biodistribuci In-111-značeného TTA1/GS7641 užitím buďto DOTA nebo DTPA jako chalatačního činidla radioaktivního kovu, 3 hodiny po injekci. ID/g = injikovaná dávka na gram.
Obr. 8 ukazuje konjugaci aptamerů s DTPA. 11:LIn je ukázáno jako chelatované DTPA.
Obr. 9 ukazuje konjugaci aptamerů s DOTA. chelatované DTPA.
111
In je ukázáno jako • · * · · · · ·· · · • ·· · · · ♦ · · « · • ····· · · ·· · · • · · · ·· ·· ··· ·· · · · ·
Obr. 10 ukazuje předpokládanou sekundární strukturu aptameru TTA1. Na obrázku je také konjugace aptameru s chelatačním činidlem Tc-99m. Aptamer je ukázán ve formě Tc-99m-značeného aptameru. Všechny A byly 2'OMe-modifikované, všechny G, až na uvedené výjimky, byly 2'OMe-modifikované a všechny C a U byly 21F-modifikované.
Popis výhodných provedení vynálezu
Základní metodou použitou pro identifikaci nukleových kyselin působících jako ligandy k tenascinu-C (ligandových nukleových kyselin) byla metoda SELEX (Systematic Evolution of Ligands by Exponential enrichment) , která zahrnuje kroky, kdy: (a) kandidátní směs nukleových kyselin se přivede do kontaktu s tenascinem-C (b) členy kandidátní směsi se rozdělí na základě afinity k tenascinu-C, a c) selektované molekuly se amplifikují, čímž vznikne směs obohacená sekvencemi nukleových kyselin s relativně vysokou afinitou vazby k tenascinu-C.
Vynález zahrnuje také ligandové RNA (tj. RNA působící jako ligandy) k tenascinu-C. Vynález zahrnuje také specifické ligandy uvedené v tabulkách 3 a 4 a na obrázku 10.
Předkládaný vynález zahrnuje také sekvence nukleových kyselin, které jsou v podstatě homologní s a taktéž mají v podstatě stejnou schopnost vázat tenascin-C jako specifické ligandové nukleové kyseliny uvedené v tabulkách 3 a 4 a na obr. 10. Termínem v podstatě homologní se míní míra homologie primární sekvence vyšší než 70 %, výhodněji vyšší než 80 %, a nejvýhodněji vyšší než 90 %, 95 % nebo 99 %. Procenta homologie zde uváděná jsou vypočtena jako procenta nukleotidů nalezených v kratší ze dvou sekvencí shodující se s odpovídajícím nukleotidem srovnávané sekvence, přičemž 1
9 9 9 9 9 9 9 9 9 9
9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9
9 9 9 9 9 9 9 9 • ····· · · 9 9 · · • ···· 9 9 9
9999 99 99 99 9 9 9 999 9 mezera může být vnesena na délku 10 nukleotidů, aby se napomohlo přiřazení sekvencí. V podstatě stejná schopnost vázat tenascin-C znamená, že afinita je v rámci 1 až dvou řádů shodná s afinitou ligandů zde uvedených. Je zcela v kompetenci odborníka určit, zda dané sekvence, která je v podstatě homologní se sekvencemi zde popsanými, má také stejnou schopnost vázat tenascin-C.
Přehled sekvenčních homologií ligandových nukleových kyselin uvedených v tab. 3 a 4 a na obr. 10 ukazuje, že sekvence s malou nebo žádnou primární homologií mohou mít v podstatě stejnou schopnost vázat tenascin-C. Z tohoto důvodu předkládaný vynález zahrnuje také ligandové nukleové kyseliny, které mají v podstatě stejné předpokládané struktury nebo strukturní motivy a schopnost vázat tenascin-C jako ligandové nukleové kyseliny uvedené v tab. 3 a 4 a na obr. 10. V podstatě stejné předpokládané struktury nebo strukturní motivy lze postulovat na základě přiřazení sekvencí (sequence alignment) pomocí programu Zukerfold (viz Zuker (1989) Science 244:48-52). Jak je odborníkům dostatečně známo, také jiné počítačové programy mohou být použity k predikci sekundární struktury a strukturních motivů. V podstatě stejná struktura nebo strukturní motivy ligandových nukleových kyselin v roztoku nebo jako vázaných struktur může být postulována pomocí NMR nebo i jiné metody, což je odborníkům známo.
Dále se předkládaný vynález týká způsobu detekce nemoci, při které je exprimován tenascin-C v biologické tkáni, která může tenascin-C obsahovat, kdy se a) identifikuje ligandové nukleové kyselina z kandidátní směsi nukleových kyselin, přičemž nukleové kyselina je ligandem tenascinu-C, a sice způsobem, kdy I) kandidátní směs nukleových kyselin se přivede do kontaktu s tenascinem-C, přičemž nukleové kyselina mající •« ·« · · · »9 ··»· · · · 9 · · · *
- 11 zvýšenou afinitu k tenascinu-C ve srovnáni se zbytkem kandidátní směsi může být oddělena od zbytku kandidátní směsi,
II) nukleové kyseliny se zvýšenou afinitou se oddělí od zbytku kandidátní směsi, III) nukleové kyseliny se zvýšenou afinitou se amplifikují, čímž se připraví směs nukleových kyselin s relativně vysokou afinitou a specifitou k tenascinu-C, čímž je identifikována ligandová nukleová kyselina k tenascinu-C, b) na ligandovou nukleovou kyselinu identifikovanou v kroku III se naváže markér, který se může použít pro in vivo nebo ex vivo diagnostiku, c) tkáň, která by mohla obsahovat nemoc, se vystaví působení komplexu ligandové nukleové kyseliny s markérem a d) detekuje se přítomnost komplexu ligandové nukleové kyseliny s markérem ve tkáni, čímž se identifikuje nemoc exprimující tenascin-C.
Předkládaný vynález dále poskytuje komplex pro použití pro in vivo nebo ex vivo diagnostiku, který obsahuje jednu nebo více nukleových kyselin působících jako ligand k tenascinu-C (ligandových nukleových kyselin) a jeden nebo více markérů.
Dále se vynález týká způsobu podávání terapeutických činidel k profylaxi nebo léčení nemocí, při kterých je exprimován tenascin-C.
Definice
Předkládaný vynález je popisován pomocí různých specifických termínů. Aby bylo usnadněno porozumění popisu, termíny jsou definovány následovně:
Termín ligandová nukleová kyselina je nukleová kyselina, která se nevyskytuje v přírodě a která působí požadovaným účinkem na cílovou molekulu. Ligandové nukleové kyseliny se označují jako aptamery. Cílovou molekulou je • » « r «« · «· «« • · » · · *,4 9 9 9 9 9 ··««« · · ·· » · ···* »k 44 ··· ·· podle předkládaného vynálezu tenascin-C, což vyjadřuje termín ligandová nukleová kyselina tenascinu-C. Požadovaný účinkem se, kromě jiného, rozumí vazba s cílovou molekulou, katalytické působení na cílovou molekulu, reakce s cílovou molekulou způsobem, který modifikuje/mění cílovou molekulu nebo její funkční aktivity, kovalentní navázání na cílovou molekulu jako je tomu např. u sebevražedných inhibitorů, a nebo usnadnění reakce cílové molekuly s jinou molekulou. Ve výhodném provedení vynálezu je požadovaným účinkem specifická vazebná afinita k cílové molekule, kdy cílová molekula je trojrozměrná chemická struktura jiná než polynukleotid, která se váže na ligandovou nukleovou kyselinu mechanismem, který je zejména závislý na Watson/Crickově principu párování bází nebo na trojšroubovicové vazbě, přičemž ligandová nukleová kyselina není nukleová kyselina, jejíž známá fyziologická funkce by byla vázat se na cílovou molekulu. Ligandová nukleová kyselina je identifikována z kandidátní směsi nukleových kyselin, přičemž působí jako ligand tenascinu-C, následujícím způsobem: a) kandidátní směs nukleových kyselin se přivede do kontaktu s tenascinem-C, přičemž nukleové kyseliny mající zvýšenou afinitu k tenascinu-C mohou být odděleny od zbytku kandidátní směsi, b) nukleové kyseliny mající zvýšenou afinitu k tenascinu-C se oddělí od zbytku kandidátní směsi a c) selektované molekuly nukleové kyseliny se amplifikují, čímž vznikne směs obohacená ligandovými nukleovými kyselinami (viz patentová přihláška USA č. 081434,425, podaná 3. května 1995, nyní Patent USA č. 5.789,157, zahrnut formou odkazu).
Termín kandidátní směs označuje směs nukleových kyselin s různými sekvencemi, ze kterých se vybírá ligand (tj. ligandová nukleová kyselina). Zdrojem kandidátní směsi mohou být přirozeně se vyskytující nukleové kyseliny nebo jejich fragmenty, chemicky syntetizované nukleové kyseliny • · nebo nukleové kyseliny připravené kombinací uvedených způsobů. Ve výhodném provedení má každá nukleová kyselina fixní sekvenci obklopenou randomizovaným úsekem pro usnadnění amplifikace.
Termín nukleová kyselina znamená DNA, RNA, a to jednořetězcové nebo dvoj řetězcové formy, a jakékoliv jejich modifikace. K modifikacím patří kromě jiného modifikace, které poskytují další chemické skupiny nesoucí dodatečný náboj, polarizovatelnost, vodíkové vazby, elektrostatické interakce a fluxionalitu bází ligandové nukleové kyseliny nebo celé ligandové nukleové kyseliny. K modifikacím patří, aniž by výčet byl omezující, modifikace sacharidu v poloze 2' , modifikace pyrymidinu v poloze 5, modifikace purinu v poloze 8, modifikace exocylických aminových skupin, substituce 4-thiouridinu, substituce 5-brom- nebo joduracilu, modifikace kostry, methylace, neobvyklé kombinace párování bází jako např. isobáze isocytidin a isoguanidin apod. K modifikacím patří také modifikace 3'- a 5'- konců jako je např. opatření čepičkou (capping).
Metoda SELEX je postup zahrnující kombinaci selekce ligandových nukleových kyselin, které interagují požadovaným způsobem s cílovou molekulu, např. vazbou na protein, s amplifikací takto vybraných molekul. Případné opakované cykly těchto kroků selekce/amplifikace umožňují vybrat z původního poolu (souboru) obsahujícího velký počet nukleových kyselin nakonec jednu nebo jen malý počet molekul, které interagují s cílovou molekulou velmi silně. Opakování cyklů selekce/amplifikace pokračuje do té doby, dokud není dosaženo požadovaného cíle. V předkládaném vynálezu se metoda SELEX užila k získání ligandové nukleové kyseliny k tenascinuC.
• · • · · ·
- 14 • · · · · • · · ·· ·«··
Metoda SELEX je podrobně popsána ve výše uvedených patentových dokumetech SELEX.
Termín SELEX cíl nebo cíl znamená jakoukoliv sloučeninu nebo molekulu, pro kterou je požadován ligand. Cílem může být protein, peptid, sacharid, polysacharid, glykoprotein, hormon, receptor, antigen, protilátka, virus, substrát, metabolit, analog v přechodném stavu, kofaktor, inhibitor, léčivo, barvivo, živina, růstový faktor apod., bez jakéhokoliv omezení. V předkládané přihlášce vynález je cílem, resp. cílovou molekulou tenascin-C.
Termín komplex označuje molekulární entitu vytvořenou kovalentními vazbami jedené nebo několika ligandových nukleových kyselin tenascinu-C s jedním nebo několika markéry. V některých provedeních předkládaného vynálezu je komplex znázorněn jako A-B-Y, kde A je markér, B je volitelná část, např. linker a Y je ligandová nukleová kyselina tenascinu-C.
Termín markér označuje molekulární entitu, které je§-li komplexována s ligandovou nukleovou kyselinou tenascinu-C, buďto přímo nebo nepřímo prostřednictvím linkeru (linkerů) nebo spaceru (spacerů) umožňuje detekci komplexu v podmínkách in vivo nebo ex vivo vizuálně nebo chemickými prostředky. K příkladům markérů patří, avšak výčet není omezující, radionuklidy jako je Tc-99m, Re-188, Cu-64, Cu-67, F-18, 125I, 131I, 32P, 18SRe, všechny fluorofory jako je fluorescein, rhodamin, Texas červeň, deriváty fluoroforů jako je např. Rhodamin-červeň-X, magnetické sloučeniny, a také biotin.
Linker je molekulární entita, která spojuje dvě (nebo více) jiné molekulární entity prostřednictvím kovalentních vazeb nebo nekovalentních interakcí, a může umožnit prostorové oddělení molekulárních entit takovým způsobem, který zachovává funkční vlastnosti jedné nebo obou molekulárních entit. Linker je někdy označován termínem spacer. K neomezujícím • ·
- 15 příkladům linkerů patří (CH2CH20)6 a hexylaminové struktury ukázané na obr. 2.
Therapeutický se v popisu vynálezu užívá ve smyslu léčivý a/nebo profylaktický. Tento termín se užívá ve vztahu k člověku nebo zvířatům.
Termín kovalentní vazba označuje chemickou vazbu vytvořenou sdílenými elektrony.
Nekovalentní interakce označují to, že molekulární entity jsou drženy pohromadě interakcemi jinými než jsou kovalentní vazby, např. iontovými interakcemi nebo vodíkovými vazbami.
Ve výhodném provedení vynálezu je ligandová nukleová kyselina podle předkládaného vynálezu získána metodou SELEX, která byla popsána v patentové přihlášce USA č. 07/536,428 podané 11. června 1990, nazvané Systematic Evolution of Ligands by EXponential Enrichment, nyní opuštěna, v patentu USA č. 5,475,096 nazvaném Nucieic Acid Ligands, a patentu USA č. 5,270,163 (viz také WO 91/19813) nazvaném Methods for Identifying Nucieic Acid Ligands. Tyto dokumenty jsou vloženy formou odkazu souhrnně jsou zde označovány jako patentové dokumenty SELEX.
Metoda SELEX poskytuje třídu produktů, které jsou ligandové nukleové kyseliny, z nichž každá má jedinečnou sekvenci a má vlastnost specificky se vázat na požadovanou cílovou sloučeninu nebo molekulu. Cílové molekuly jsou výhodně proteiny, ale mohou to být sacharidy, peptidoglykany a různé malé molekuly, přičemž tento výčet není omezující. Metodu SELEX lze užít také k zacílení na biologické struktury jako je buněčný povrch nebo virus, a to prostřednictvím specifické interakce s molekulou, která je integrální součástí takové biologické struktury.
V nej základnějš£ podobě je metoda SELEX definována následujícími kroky:
1) připraví se kandidátní směs nukleových kyselin různých sekvencí. Kandidátní směs obecně obsahuje úseky fixních sekvencí (tj . každý člen kandidátní směsi obsahuje stejné sekvence na stejném místě) a úseky randomizovaných (náhodných) sekvencí. Úseky fixních sekvencí jsou vybrány proto, aby se a) buďto napomohlo amplifikačním krokům popsaným výše nebo b) napodobila sekvence, o které je známo, že se váže na cíl, nebo c) aby se zvýšila koncentrace daného strukturního uspořádání nukleových kyselin v kandidátní směsi. Randomizovaná sekvence mohou být buďto plně randomizované báze v jakékoliv poloze (tj. pravděpodobnost nalezení je 1/4) nebo částečně
3) randomizovaná (tj . pravděpodobnost nalezení báze v jakékoliv poloze může být vybrána z jakékoliv hladiny mezi 0 a 100 %.
Kandidátní směs se přivede do kontaktu s vybraným cílem v podmínkách, které jsou výhodné pro vazbu cíle a členů kandidátní směsi. Za těchto podmínek spočívá interakce mezi cílem a nukleovými kyselinami kandidátní směsi ve vytváření párů nukleová kyselina - cíl mezi cílovou molekulou a těmi nukleovými kyselinami, které mají nejvyšší afinitu k cílové molekule.
Nukleová kyselina s nejvyšší afinitou pro cíl je oddělena od nukleových kyselin s menší afinitou. Jelikož v kandidátní směsi existuje jen mimořádně malý počet sekvencí (případně jen jediná molekula nukleové kyseliny) odpovídajících molekule s nejvyšší afinitou, je obecně potřebné stanovit selekční kritéria, tak aby významné množství (přibližně 5 - 50 %) nukleových kyselin zůstalo zachyceno v průběhu oddělování.
- 17 4) Nukleové kyseliny vybrané v průběhu oddělování pro relativně vysokou afinitu k cíli jsou pak amplifikována, čímž se vytvoří nová kandidátní směs, která je obohacena o nukleové kyseliny mající relativně vysokou afinitu k cíli.
5) Opakováním kroků oddělení a amplifikace výše popsaných nově vytvořená kandidátní směs obsahuje stále méně a méně jedinečných sekvencí a průměrná afinita nukleové kyseliny k cíli obecně roste. V extrémním případě by nakonec metoda SELEX poskytla kandidátní směs, obsahovala jednu nebo jen velmi malý počet jedinečných sekvencí, které představují sekvence nukleových kyselin z původní kandidátní směsi, které mají nejvyšší afinitu k cílové molekule.
Základní metoda SELEX byla modifikována pro dosažení řady specifických cílů. Tak např. patentová přihláška USA č. 07/960,093, podaná 14. října 1992, nyní opuštěna, a patent USA č. 5,707.796, oba dokumenty s názvem Method for Selecting Nucieic Acids on the Basis of Structure popisují použití metody SELEX ve spojení s gelovou elektroforézou pro selekci molekul nukleové kyseliny se specifickými strukturními vlastnostmi, jako je např. zahnutá DNA. Patentová přihláška USA č. 08/123,935, podaná 17. Září 1993, nazvaná Photoselection of Nucieic Acid Ligands nyní opuštěna, Patent USA č. 5,763,177, nazvaný Systematic Evolution of Ligands by Exponential Enrichment: Photoselection of Nucieic Acid Ligands and Solution SELEX a patentová přihláška USA č. 09/093,293, podaná 8. června 1998, nazvaná Systematic Evolution of Ligands by Exponential Enrichment: Photoselection of Nucieic Acid Ligands and Solution SELEX popisují metodu založenou na postupu SELEX pro selekci ligandových nukleových kyselin obsahujících fotoreaktivní skupiny schopné vazby a/nebo zesítění účinkem světla (photocrosslinking) na a/nebo fotoinaktivaci cílové molekuly. Patent USA č. 5,580,737,
- 18 • · · · • ····· · · · · · · » · · · · ·«· ···· ·· ·· ··· ·· ···* nazvaný High-Affinity Nucleic Acid Ligands That Discriminate Between Theophylline and Caffeine popisuje způsob identifikace vysoce specifických ligandových nukleových kyselin schopných rozlišit mezi blízce příbuznými molekulami, které mohou být jiné než peptidové povahy, a tato metoda byla nazvána Counter-SELEX. Patent USA č. 5,567,588, nazvaný Systematic Evolution of Ligands by EXponential Enrichment: Solution SELEX, popisuje metodu založenou na SELEX, která dosahuje vysoce účinného rozdělení oligonukleotidů majících vysokou a nízkou afinitu k cílové molekule. Patent USA č. 5,496,938, nazvaný Nucleic Acid Ligands to HIV-RT and HIV-1 Rev, popisuje metodu získání zlepšených ligandových nukleových kyselin po provedení metody SELEX. Patent USA č. 5,705,337 nazvaný Systematic Evolution of Ligands by Exponential Enrichment: Chemi-SELEX popisuje metodu kovalentního navázání ligandu na cíl.
Metoda SELEX zahrnuje identifikaci vysokoafinitních ligandových nukleových kyselin obsahujících modifikované nukleotidy, které poskytují zlepšené vlastnosti ligandu, např. zlepšenou stabilitu in vivo nebo zlepšené vlastnosti pro podávání. K příkladům takových modifikací patří chemická substituce v poloze ribózy a/nebo fosfátu a/nebo báze. Ligandové nukleové kyseliny obsahující modifikované nukleotidy, které byly identifikovány metodou SELEX, byly popsány v Patentu USA č. 5,660,985, nazvaném High Affinity Nucleic Acid Ligands Containing Modified Nucleotides, kde jsou popsány oligonukleotidy obsahující nukleotidové deriváty chemicky modifikované v poloze 5- a 2'- pyrimidinů. Patent USA č. 5,580,737 zmíněný výše popisuje vysoce specifické ligandové nukleové kyseliny obsahující jeden nebo více nukleotidů modifikovaných 2'-aminoskupinou (2'-NH2), 2'-fluoroskupinou (2'-F) a/nebo 2'-O-methylovou skupinou (2'-OMe). Patentová • · ·
- 19 přihláška USA č. 08/264,029, podaná 22. června 1994, nazvaná Novel Method of Preparation of Known and Novel 2' Modified Nucleosides by Intramolecuiar Nucleophilic Displacement, nyní opuštěna, popisuje oligonukleotidy obsahující různé 21-modifikované pyrimidiny.
Metoda SELEX zahrnuje také kombinování vybraných oligonukleotidů s jinými vybranými oligonukleotidy a jinými funkčními skupinami, které nejsou oligonukleotidy, což bylo popsáno v Patentu USA č. 5,637,459, nazvaném Systematic Evolution of Ligands by EXponential Enrichment: Chimeric
Patentu USA č. of Ligands by nazvaném Systematic Enrichment: Blended
5,683,867,
EXponential
SELEX. Tyto metody umožňují kombinace širokého spektra tvarů a dalších vlastností, a účinných amplifikačních a replikačních vlastností oligonukleotidů s požadovanými vlastnostmi jiných molekul.
V Patentu USA č. 5,496,938 je popsána metoda získání zlepšených ligandových nukleových kyselin po té, co byl proveden postup SELEX. Tento patent nazvaný Nucleic Acid Ligands to HIV-RT and HIV-1 Rev, je specificky zahrnut formou odkazu.
SELEX a
Evolution
Patentová přihláška
USA
č. 08/434,425, nazvaná
Systematic Evolution of Ligands by Exponential Enrichment
Tissue SELEX, podaná 3 č. 5,789,157, popisuje
1995, nyní již Patent USA identifikace ligandových
Května metodu nukleových kyselin pro makromolekulární komponenty tkání, včetně nádorových buněk, a také tímto způsobem identifikované ligandy. Tento patent je specificky zahrnut formou odkazu.
Jedním potenciálním problémem při terapeutickém nebo diagnostickém využití nukleových kyselin je to, že oligonukleotidy v jejich fosfodiesterové forma mohou být snadno degradovány v tělních tekutinách působením intracelulárních a extracelulárníchů jako jsou např. endonukleázy a exonukleázy, ještě před tím, než se projeví požadovaný účinek. Určité chemické modifikace ligandových nukleových kyselin lze realizovat s cílem, aby se zvýšila in vivo stabilita nukleových kyselin nebo aby se zlepšil či zprostředkoval přenos ligandové nukleové kyseliny do organizmu (viz např. patentová přihláška USA č. 08/117,991, podaná 8. září 1993, nyní opuštěna, a Patent USA č. 5,660,985, oba dokumenty s názvem High Affinity Nucleic Acid Ligands Containing Modified Nucleotides, zahrnuty formou odkazu).
K modifikacím ligandových nukleových kyselin podle vynálezu patří, aniž by výčet byl omezující, takové modifikace, které poskytují další chemické skupiny nesoucí dodatečný náboj, polarizovatelnost, vodíkové vazby, elektrostatické interakce a fluxionalitu bází ligandové nukleové kyseliny nebo celé ligandové nukleové kyseliny. K modifikacím patří, aniž by výčet byl omezující, modifikace sacharidu v poloze 2', modifikace pyrymidinu v poloze 5, modifikace purinu v poloze 8, modifikace exocylických aminových skupin, substituce 4-thiouridinu, substituce 5-bromnebo joduracilu, modifikace kostry, methylace, neobvyklé kombinace párování bází jako např. isobáze isocytidin a isoguanidin apod. K modifkacím patří také modifikace 3'- a 5'-konců jako je např. opatření čepičkou (capping). Ve výhodném provedení vynálezu jsou ligandové nukleové kyseliny molekuly RNA, které jsou modifikované 2'-fluoroskupinou (2'F) na sacahridové části pyrimidinového zbytku.
Modifkace mohou být provedeny buďto před (pre-SELEX) nebo po provedení postupu SELEX (post-SELEX). Pre-SELEX modifikace poskytují ligandové nukleové kyseliny jak se specifitou pro cíl tak zlepšenou in vivo stabilitou. Post-SELEX modifikace provedené na 2'-OH ligandové nukleové kyseliny vedou ke • · a zlepšené in vivo stabilitě ani by uškodily vazebné schopnosti ligandové nukleové kyseliny.
Další typy modifikací jsou odborníkům známy. Takové modifikace mohou být provedeny jako post-SELEX modifikace (modifikace dříve identifikovaného ligandů) nebo v průběhu procesu SELEX.
Ligandy podle předkládaného vynálezu byly připraveny metodou SELEX, která je podrobně popsána ve výše citovaných patentových dokumentech SELEX.
Tenascin-C aptamery podle předkládaného vynálezu se váží na heparinové vazebné místo COOH konce tenascinu-C.
V některých provedeních vynálezu jsou ligandové nukleové kyseliny k tenascinu-C užitečné pro diagnostické účely ke zobrazování patologických stavů (např. zobrazovací metody při diagnostice nádorů). Kromě toho ligandové nukleové kyseliny k tenascinu-C mohou být užitečné pro prognózy a monitorování nemocí, při kterých je exprimován tenascin-C.
Diagnostická činidla musí dovolit identifikovat přítomnost daného cíle v konkrétním místě nebo určité koncentraci. Jednoduše schopnost vytvářet vazebné páry s cílem může být dostatečná pro vznik pozitivního signálu vhodného pro diagnostické účely. Odborník je snadno schopen adaptovat jakoukoliv ligandovou nukleovou kyselinu pro tenascin-C pomocí markéru tak, aby byl schopen sledovat přítomnost ligandové nukleové kyseliny. Takové markér aby se mohly využít v celé řadě diagnostických aplikací, např. pro detekci primárních nádorů a metastáz nebo pro detekci aterosklerotických lézi. K příkladům značících markérů patří Tc-99m a mIn, ale lze užít i řadu jiných markérů jako např. další radionuklidy, magnetické sloučeniny, fluorofory nebo biotin, které mohou být konjugovány s ligandovou nukleovou kyselinou tenascinu-C pro využití při zobrazování v podmínkách in vivo nebo ex vivo při exprimován tenascin-C (např.
psoriáza). Markér může být polohách ligandové nukleové diagnostice nemocí, kdy je rakovina, ateroskleróza nebo kovalentně vázán v různých kyseliny tenascinu-C, např. na exocyklickou aminoskupinu báze, v 5-pozici pyrimidinového nukleotidu, v 8-pozici purinového nukleotidu, na hydroxylovou skupinu fosfátu nebo hydroxylovou skupinu nebo jiné skupiny na 5'- nebo 3'-konci ligandové nukleové kyseliny tenascinu-C.
V provedeních vynálezu, kde markér je technecium-99m nebo lxlIn, je markér vázán na 5'- nebo 3'-hydroxylovou skupinu fosfátu nebo v 5-poloze modifikovaného pyrimidinu. V nejvýhodnějším provedení je markér vázán na 51-hydroxylovou skupinu fosfátové skupiny ligandové nukleové kyseliny s linkerem nebo bez linkeru. V jiném provedení vynálezu je markér konjugován s ligandovou nukleovou kyselinou tím, že je do nukleové kyseliny inkorporován pyrimidin obsahující primární amin v poloze 5 a tento amin je pak využit pro konjugaci markéru. Navázání markéru může být provedeno přímo nebo pomocí linkeru. V provedeních vynálezu, kde je užito jako markér technecium-99m nebo luIn, je výhodný hexylaminový linkerem, jak je ukázáno ne obr. 10.
V dalších provedeních vynálezu jsou ligandové nukleové kyseliny tenascinu-C užitečné k podávání terapeutických sloučenin (např. cytotoxických sloučenin, látek zvyšujících imunitu, terapeutických radionuklidů, avšak tento výčet není omezující) do tkání nebo orgánů exprimujících tenascin-C. K nemocem, při kterých je exprimován tenascin-C, patří (avšak výčet není omezující) rakovina, ateroskleróza a psoriáza (lupénka). Odborník snadno adaptuje jakoukoliv ligandovou nukleovou kyselinu známým postupem tak, aby vytvořila komplex s terapeutickým činidlem. Terapeutická sloučenina může být kovalentně vázána v různých polohách ligandové nukleové • ·
- 23 kyseliny tenascinu-C, např. na exocyklickou aminoskupinu báze, v 5-pozici pyrimidinového nukleotidu, v 8-pozici purinového nukleotidu, na hydroxylovou skupinu fosfátu nebo hydroxylovou skupinu nebo jiné skupiny na 5'- nebo 3'-konci ligandové nukleové kyseliny tenascinu-C. Ve výhodném provedení vynálezu je terapeutické činidlo vázáno na 5'-aminoskupinu ligandové nukleové kyseliny. Navázání terapeutického činidla může být přímé nebo prostřednictvím linkeru. V provedeních vynálezu, kde cílovou nemocí je rakovina, lze inkorporovat 5-fluordeoxyuracil nebo jiný nukleotidový analog známý jako účinné protinádorové činidlo, interně do existujících U v ligandové nukleové kyselině tenascinu-C nebo může být přidán interně nebo konjugován s kterýmkoliv z konců nukleové kyseliny buďto přímo nebo prostřednictvím linkeru. Kromě toho mohou být inkorporovány jak pyrimidinový analog 2'2'-difluorcytidin tak i purinový analog deoxycoformycin. Patentová přihláška USA č. 08/993,765 podaná 18.prosince 1997, zahrnutá formou odkazu, popisuje kromě jiného předléčiva založená na nukleotidech obsahující ligandové nukleové kyseliny namířené proti nádorům, např. proti tenascinu-C, pro přesnou lokalizaci látek užívaných pro zvýšení vnímavosti k chemoradioterapii, radioaterapii nebo lokalizaci radionuklidových léčivých přípravků v nádoru.
Podle vynálezu může být asociován s ligandovou nukleovou kyselinou jak markér tak i terapeutické činidlo, takže podávání terapeutického činidla i detekce jsou uskutečněny společně pomocí jednoho aptameru nebo pomocí směsi dvou nebo více modifikovaných verzí téhož aptameru. Ve smyslu vynálezu také může být markér a/nebo terapeutické činidlo asociovány s neimunogenní vysokomolekulární sloučeninou nebo lipofilní sloučeninou jako je např. Liposom. Metody pro konjugaci ligandových nukleových kyselin s liposomy a vytváření
diagnostických nebo terapeutický komplexů bylo popsáno v patentové přihlášce USA č. 08/434,465, podané 4. května 1995, nazvané Nucleic Acid Ligand Complexes, která je zahrnuta formou odkazu.
Terapeutické nebo diagnostické přípravky podle předkládaného vynálezu mohou být podávány parenterálně injekcí (např. intravenózní, subkutánní, intradermální nebo do léze), i když jsou možné i jiné formy podávání jako je např. intraartikulární injekce, inhalace mlhy, orálně účinné přípravky, transdermální iontoforéza nebo čípky. Přípravky podle vynálezu mohou být také podávány lokálně přímou injekcí nebo uvolňováním z terapeutického systému, jako jsou implantované stenty nebo katetry, nebo podáván přímo na místo infúzní pumpou. Výhodným farmaceutickým nosičem je solný roztok, resp. fyziologický roztok, avšak ve smyslu vynálezu lze užít i jiné známé farmaceuticky přijatelné nosiče. V jednom provedení vynálezu tvoří komplex nosiče a ligandové nukleové kyseliny tenascinu-C fyziologicky kompatibilní formu s pomalým uvolňováním léčiva. Primární rozpouštědlo v takovém nosiči je vodné nebo nevodné povahy. Navíc nosič muže obsahovat ještě další farmakologicky přijatelné excipienty, které udržují nebo modifikují pH, osmolaritu, viskozitu, průzračnost, barvu, sterilitu, stabilitu, rychlost rozpouštění nebo vůní přípravku. Nosič může obsahovat ještě další farmaceuticky přijatelné excipienty modifikující nebo udržující stabilitu, rychlost rozpouštění, rychlost uvolňování nebo absorpci ligandové nukleové kyseliny tenascinu-C. k těmto excipientúm patří látky běžně využívané pro formulaci léků pro parenterální podávání v jednotkové nebo násobné lékové formě.
Jakmile byl přípravek formulován, může být skladován ve sterilních nádobkách jako roztok, suspenze, gel, emulze, pevná látka nebo dehydrovaný nebo lyofilizovaný prášek. Takové ft · · · · » · · · přípravky lze skladovat ve formě připravené k použití nebo ve formě, která vyžaduje rekonstituci bezprostředně před použitím. Způsob podávání přípravku obsahující ligandovou nukleovou kyselinu tenascinu-C určeného pro systémové podávání je např. subkutánní, intramuskulární, intravenózní, intraarteriální nebo intranazální nebo formou vaginálních nebo rektálních čípků.
Následující příklady slouží k vysvětlení a ilustraci předkládaného vynálezu a rozsah vynálezu nijak neomezují. Příklad 1 popisuje materiály a experimentální postupy použité v příkladu 2 pro přípravu RNA ligandů k tenascinu-C. příklad 2 popisuje RNA ligandy tenascinu-C a predikovanou sekundární strukturu selektovaných ligandových nukleových kyselin. Příklad 3 popisuje stanovení minimální velikosti nezbytné pro vysokoafinitní vazbu selektovaných ligandových nukleových kyselin a substituci 2'-OH purinů 2'-OMe puriny. Příklad 4 popisuje biodistribuci Tc-99m-značených ligandových nukleových kyselin tenascinu-C u myší s nádory. Příklad 5 popisuje použití fluorescenčně značených ligandových nukleových kyselin tenascinu-C pro lokalizaci tenascinu-C ve tkáni nádorů. Příklad 6 popisuje detekci nádorů in vivo pomocí aptameru TTA1 (znám také pod označením GS7641). Příklad 7 popisuje alternativní značení pomocí 111In.
Příklady provedení vynálezu
Příklad 1
Užití metody SELEX k získání ligandových nukleových kyselin tenascinu-C a glioblastomových buněk U251 • · · ·
- 26 Materiály a metody
Tenascin-C byl zakoupen od firmy Chemicon (Temecula, CA). Jednořetězcové DNA primery a templáty byly syntetizovány firmou Operon Technologies Inc. (Alameda. CA).
Metoda SELEX byla podrobně popsána v patentové dokumentaci SELEX uvedené v předchozí části přihlášky.
Ve stručnosti: dvoj řetězcové transkripční templáty byly připraveny extenzí užitím Klenowova fragmentu ssDNA 40N7a:
5'-TCGCGCGAGTCGTCTG{4ON)CCGCATCGTCCTCCC-3' (SEKVENCE ID. Č. 1) užitím primeru SN7:
51-TAATACGACTCACTATAGGGAGGACGATGCGG-31 (SEKVENCE ID. Č. 2), který obsahuje promotor T7 polymerázy (podtržen). RNA byla připravena pomocí T7 RNA polymerázy postupem, který popsali Fitzwater a Polisky (1996) Methods Enzymol. 267: 275-301 (publikace je zahrnuta formou odkazu). Všechny transkripční reakce byly provedeny nukleotidu, který měl 21-fluoroskupinou (21-F).
za přítomnosti pyrimidinového sacharidovou část modifikovanou Tato substituce vedla ke zvýšení rezistence k ribonukleázám, které užívají 21-hydroxylovou skupinu ke štěpení fosfodiesterové vazby. Specificky transkripční reakční směs obsahovala 3,3mM 2'-FUTP a
3,3mM 21-FCTP společně s lmM GTP a ATP.
Počáteční randomizovaná RNA knihovna poskytla 3 χ 1014 molekul. Afinity jednotlivých ligandových nukleových kyselin tenascinu-C byly určeny standardním postupem nitrocelulózovém filtru (Tuerk and Gold (1990) dělení na Science 249
496:505-10).
Pro každý cyklus SELEX byly destičky Lumino (Labsystems, Needham Heights, MA) potaženy 2 hodiny při teplotě místnosti užitím 200 μΐ Dulbeccova PBS obsahujícího tenascin-C v koncentraci uvedené v tab. 1. Po potažení byly jamky destičky blokovány užitím pufru HBSMC+ [20 mM Hepes, pH 7,4, • · * · • ·
- 27 13 7 mM NaCl, 1 mM CaCl2, 1 mM MgCl2 a 1 g/1 humánní sérový albumin (Sigma, frakce V) pro opakování cyklů 1 až 6, zatímco pro cykly 7 a 8 byly jamky blokovány pufrem HBSMC+ obsahujícím 1 g/1 kaseinu (I-block; Tropix). Vazebný a promývací pufr byl pufr HBSMC+ obsahující 0,05% Tween 20. Pro každý cyklus SELEX byla RNA naředěna do 100 μΐ vazebného pufru a ponechána inkubovat 2 hodiny při 37°C v jamkách potažených proteinem, které byl předem promyty vazebným pufrem. Po navázání bylo provedeno 6 promyt i vždy po 200 μΐ. Po promyt i byly suché destičky umístěny na 5 minut na ohřívací blok s teplotou 95 °C. Standardní reakce s AMV reverzní transkriptázou (50 μΐ) byla provedena při 48 °C přímo v jamkách a reakční produkty pak byly užity pro standardní PCR a transkripční reakci. V těchto krocích reverzní transkripce a amplifikace templátu byly užity dva syntetické primery SN7 (viz výše) a 3N7a: 5'-TCGCGCGAGTCGTCTG-3' (SEKVENCE ID. Č.3)
Pro postup SELEX s buňkami byly humánní glioblastomové buňky U251 (Hum. Hered. (1971) 21:238) kultivovány do konfluence v médiu DMEM (Dulbecco's Modified Eagle's Medium) s 10% fetálním telecím sérem (GIBCO BRL. Gaithersburg, MD) na šestijamkových miskách pro kultivaci tkání (Becton Dickinson Labware, Lincoln Park, NJ) a třikrát opláchnuty Dulbeccovým PBS s CaCl2 (DPBS, GIBCO BRL) . RNA značená vnitřně při transkripci (Fitzwater (1996) supra) byla inkubována s buňkami 1 hodinu při 37°C. Značená RNA pak byla odstraněna a buňky byly promyty šestkrát DPBS po 10 minutách ve 37°C. Pak se přidalo DPBS obsahující 5mM EDTA a buňky se dále 3 0 minut inkubovaly, aby se eluovala navázaná RNA, která zůstala po promytí. Tato RNA byla kvantifikována standardním scintilačním postupem a pak amplifikována metodou RT-PCR.
Vazebný test buněk U251
Vnitřně značená RNA byla inkubována se zvětšující se koncentrací konfluentních buněk U251 v šestijamkových kultivačních miskách (Becton Dickinson Labware. Lincoln Park, NJ) 60 minut ve 37°C. nenavázaná RNA byla odmyta ve třech promytích po 10 minutách s DPBS+ CaCl2 při 37°C, a vázaná byla odebrána tak, že buňky byly rozrušeny Trizolem (Gibco BRLGaithersburg; MD) . Navázaná RNA byla kvantifikována standardním měřením scintilace.
Klonování a sekvencování
Amplifikované afinitně obohacené oligonukleotidové pooly byly purifikovány na 8% polyakrylamidovém gelu, reverzní tato DNA pak byla reakci (PCR) užitím a HindlII restrikční transkripcí převedeny na ssDNA a amplifikována v polymerázové řetězové primerů obsahujících místa pro BamHI endonukleázy. PCR fragmenty byly klonovány, plazmidy byl izolovány a DNA byla sekvencována standardními postupy, které jsoi odborníkům známy (viz Sambrook et al. (1989) Molecular
Cloning: A Laboratorv Manual, 2nd Ed. 3 vols., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor).
Příklad 2
RNA ligandy tenascinu-C
Ligandové nukleové kyseliny k buňkám U251 byly získány metodou SELEX, která byla popsána v patentové přihlášce USA č. 08/434,425, nazvané Systematic Evolution of Ligands by Exponential Enrichment: Tissue SELEX, podané 3. Května 1995, • · · · · ·
nyní Patent USA č. 5,789,157. Následně bylo určeno, že získané ligandy jsou ligandové nukleové kyseliny tenascinu-C.
Pro získání ligandových nukleových kyselin k humánnímu tenascinu-C bylo provedeno 8 cyklů SELEX s randomizovanou nukleotidovou knihovnou jak bylo popsáno v části Materiály a metody. RNA a protein, které sloužily jako vstupní materiál v každém cyklu jsou uvedeny v tab. 1. Po 8 cyklech SELEX byla afinita oligonukleotidového poolu k tenascinu-C 10 nM, a již se dále nezvyšovala v dalších cyklech SELEX.
Pro získání ligandu ke glioblastomovým buňkám U251 bylo provedeno 9 cyklů SELEX s randomizovanou nukleotidovou knihovnou. Po 9 cyklech vazby na buňky U251 a eluci EDTA byly produkty ze 3., 5. a 9. Cyklu testována na jejich schopnost vázat buňky U251. Obr. 1 ukazuje, že s rostoucím počtem cyklů SELEX roste také množství navázané RNA při konkrétní koncentraci. Vzhledem ke složitosti cíle nebylo možné stanovit afinitu oligonukleotidového poolu k neznámé cílové molekule na těchto buňkách.
Pool oligonukleotidů E9 (9 cyklů navázání a EDTA eluce z buněk U251) byl pak užit jako výchozí materiál pro další SELEX proti purifikovanému tenascinu-C. Dva cykly SELEX s purifikovaným tenascinem-C byly provedeny stejně, jak bylo popsáno výše. Proteiny a RNA koncentrace ve dvou cyklech SELEX (E9P1 a E9P2) jsou uvedeny v tab. 2.
Celkem byly provedeny tři různě experimenty SELEX: SELEX experiment, kde cílem byl purifikovaný tenascin-C, druhý experiment, kde cílem byly glioblastomové buňky U251 a třetí experiment, kde pool z experimentu s glioblastomovými buňkami U251 byl použit jako výchozí materiál v experimentu s purifikovaným tenascinem-C jakožto cílem.
Všechny tři uvedené experimenty byly analyzovány klonováním a sekvencováním získaných ligandů z 8 cyklů SELEX • · · · · · · • · * · · » • · · · · · · ·*· proti purifikovanému tenascinu-C (sekvence TN), z 9 cyklů SELEX proti buňkám U251 (sekvence E9), a ze dvou cyklů hybridní U251/tenascin-C SELEX (sekvence E9P2) . Sekvence jedinečných klonů jsou ukázány v tab. 3 a jsou rozděleny do dvou hlavních skupin: ligandy tenascinu-C (sekvence TN a E9P2) a ligandy buněk U251 (ligandy E9). Mezi ligandy tenascinu-C většina klonů (celkem 65) představuje jednu ze dvou odlišných tříd sekvencí označených jako rodina I a rodina II (viz obr. 1).
Vyšetření variabilních úseků 12 klonů z rodiny I ukázalo 7 jedinečných sekvencí, které jsou příbuzné prostřednictvím kanonické sekvence GACNYLJUCCNGCYAC (SEKVENCE ID. Č. 12). Vyšetření variabilních úseků 18 klonů z rodiny II odhalilo sdílenou kanonickou sekvenci CGUCGCC (Tab. 3) . Sekvence E9 mohou být seskupeny podle konzervativních úseků GAY a CAU ve variabilních úsecích. Zbývající sekvence nejsou s ostatními sekvencemi nijak příbuzné a byly označeny jako sirotci. Tři sekvence převládají, s E9P2-1, E9P2-2, a TN9 byly reprezentovány 14x, 16x a ΙΟχ. V kategorii sirotků je jedna sekvence, a sice TN18, zastoupena 2x. celkově lze shrnout, že tyto údaje ukazují na vysoce obohacený pool sekvencí.
Většina jedinců vykazovala nízkou nanomolární disociační konstantu, přičemž nejčastější sekvence TN9, E9P2-1 a E9P2-2 měly nejvyšší afinity, a sice 5 nM, 2nM a 8 nM (viz tabulka
3) . Tyto výsledky ukazují, že metoda SELEX s buňkami U251 je dobrým zdrojem aptamerů k tenascinu-C, přičemž pouhé dva cykly SELEX byly potřebné k izolaci ligandů specifických pro tenascin-C z celého poolu SELEX oligonukleotidů. Podobně mohou být izolovány oligonukleotidové ligandy k jiným proteinům z poolu E9 pomocí purifikovaného proteinového cíle.
• « *# ·« • · « » • · · • · · · · • · · · · a
Příklad 3
Stanovení minimální velikosti TN9 a substituce 21-OH purinů 21-OMe puriny: Syntéza aptamerů TTA1 zkoumána minimální vazbu. Standardním
Byl užit standardní postup syntézy oligonukleotidů, který je odborníkům znám (Green et al. (1995) Chem Biol 2 10 :68395). 2'-fluorpyrimidinfosforamiditové monomery byly získány od firmy JBL Scientific (San Luis Obispo, CA); 2'-OMe-purinové, 21-OH-purinové, hexylaminové a (CH2CH20)6 monomery, a také dT-polystyrenový pevný nosič, byly získány od firmy Glen Research (Sterling, VA). Afinity aptamerů byly stanoveny pomocí dělení na nitrocelulózovém filtru (Green et al. , supra).
TN9 byl vybrán pro další analýzu na základě jeho vysoké afinity k tenascinu-C. nejdříve byla sekvence nezbytná pro vysokoafinitní postupem (Green et al, supra) bylo zjištěno, že 55 nukleotidů 3'-konce bylo nutných k vazbě na tenascin-C, zatímco žádné nukleotidy nemohly být odstraněny z 5'-konce bez ztráty afinity. Kvůli zjištění, zda lze TN9 ještě z délky 55 nukleotidů zkrátit a přitom zachovat vysokou afinitu vazby, byly provedeny pokusy s vnitřními delecemi v TN9. Prvních 55 nukleotidů TN9 společně s prvními 55 nukleotidy ligandů TN7, TN21 a TN41 rodiny II bylo analyzováno počítačovým programem z hlediska možného uspořádání sekundární struktury RNA (mfold 3.0, dostupný na adrese http://www.ibc.wustl.eduhzuker/ (viz také M. Zuker, D.H. Mathews & D.H. Turner. Algorithms and Thermodynamics for RNA Secondary Structure Prediction: A Practical Guide. In: RNA Biochemistry and Biotechnology, J. Barciszewski & B.F.C. Clark, eds., NATO ASI Series, Kluwer Academie Publishers, (1999)). Kromě mnoha potenciálních sestav
• · • · * • fl· • · e • »
RNA predikovaných pomocí užitého algoritmu byla nalezena struktura společná každému oligonukleotidů. Tato struktura je představována oligonukleotidem TTA1 uvedeným na obr. 2, a obsahuje 3 stonky setkávající se v jednom bodě, tzv.
třístonkový uzel
Při tomto uspořádání j sou nejkonzervativnější nukleotidy z oligonukleotidů rodiny II lokalizovány v oblasti uzlu. Při srovnání TN9, TN7, TN21 a TN41 se ukázalo, že druhý stonek má proměnlivou délku a sekvenci, což vedlo k předpokladu, že extenze 2. Stonku není nutná k vazně na tenascin-C. Při testování této hypotézy se zjistilo, že nukleotidy 10 až 26 mohou být nahrazeny ethyleneglykolovým linkerem (CH2CH2O) 6· Tento linker slouží jako náhradní smyčka a snižuje velikost aptameru. Navíc čtyřnukleotidové smyčky (CACU nebo GAGA), které nahradí nukleotidy 10 až 26, vytvoří sekvenci s vysokou afinitou k tenascinu-C. Odborník snadno stanoví další nukleotidové smyčky nebo jiné spacery, které by mohly nahradit nukleotidy 10 až 26, aby vznikly sekvence s vysokou afinitou k tenascinuC.
Kvůli zvýšení ochrany proti nukleázám byla vyhledány polohy purinů, kde by mohly být provedeny substituce odpovídajícími 2'-OMe-purinovými nukleotidy. Oligonukleotidy byly libovolně rozděleny do pěti sektorů a všechny puriny v jednom sektoru hyly nahrazeny odpovídajícími
2'-OMe-purinovými nukleotidy, celkem 5 oligonukleotidů (tabulka 4, fáze I syntézy). Afinita každého oligonukleotidů k tenascinu-C byla určena a bylo zjištěno, že všechny puriny v sektorech 1, 3 a 5 mohou být nahrazeny, aniž by došlo k viditelné ztrátě afinity. V sektorech 2 a 4 byly pak substituovány jednotlivé puriny 2'-OMe puriny a výsledný účinek byl měřen (tabulka 4, fáze III syntézy). Z těchto experimentů se dalo soudit, že substituce nukleotidů G9, G28, ·· · * · ♦ · · · · · ···· · « · ♦ · · « 4 • ····· · · · · · · • * · · · ··· • · · · · · ·· · · · ·· ····
G31 a G34 2'OMeG vedla ke ztrátě afinity k tenascinu-C. Takže tyto nukleotidy byly v aptameru TTA 1 ponechány jako 2'-OH puriny.
Aptamer TTA1 (Tab. 4) byl pak syntetizován s linkerem (CH2CH2O)s (Spacer 18), a 3'-3' dT čepičkou pro ochranu proti exonukleázám, 5' hexylaminem (Tab. 4) a všemi puriny ve formě 2'-OMe, s výjimkou 5 G uvedených v tab. 4. Nevázající se kontrolní aptamer TTA1.NB byl připraven deleci 5 nukleotidů tenascin-C zatímco TTA1.NB má pro na 3' -konci. TTA1 se váže na disociační konstantou (Kd) 5 nM, tenascin-C Kd > 5 pM.
Nukleotidy 10 až 26 mohou být nahrazeny nenukleotidovým ethylenglykolovým linkerem. Je tedy pravděpodobné, že TTA1 může být syntetizován ve dvou oddělených částech, přičemž přerušení je v pozici ethylenglykolového linkeru a jsou vneseny nové 5'- a 3'-konce. Po syntéze se tyto dvě molekuly společně inkubuji tak, aby byl umožněn vznik hybridu. Tato metoda umožňuje vnesení dalších aminových skupin a také dalších nukleotidů na nové 5'- a 3'-konce. Pro biokonjugaci mohou být užity nové funkční skupiny. Navíc takováto syntéz ave dvou částech vede k vyššímu výtěžku, neboú se syntetizují kratší molekuly.
Příklad 4
Biodistribuce Tc-99m-značených aptamerů u myší s nádory
Biodistribuce aptamerů byla testována pomocí konjugace chelatačního činidla pro Tc-99m (HiiS: Hilger et al. (1998) Tet Lett 39:9403-9406) na 5'-konec oligonukleotidu, jak je ukázáno na obr. 2, a značením aptameru Tc-99m. Aptamer ve formě značené Tc-99m je ukázán na obr. 10. TTA1 a TTA1.NB byly konjugovány s Hii5 při koncentraci 50 mg/ml aptameru ve 30% dimethylformamidu s 5 molárními ekvivalenty Hi15-Nhydoxysukcinimidu, pufrováno 100 mM boritaném sodným, pH 9,3, 30 minut přu teplotě místnosti. Po přečištění pomocí HPLC s reverzní fází byly získány Hii5-TTA1 a Hii5-TTA1 .NB. Oligonucleotidy pak byly značeny Tc-99m následujícím způsobem: k 1 nmol Hils-aptameru bylo přidáno 200 μΐ 100 mM fosfátového pufru pH 8,5, s 23 mg/ml tartrátu sodného a 50 μΐ Tc-99m pertechnetátu (5,0 mCi) eluovaného z kolony Mo-99 (Syncor, Denver) během 12 hodin. Značící reakce byla zahájena přidáním 10 μΐ SnCl2. Reakční směs byla inkubována 15 minut při 90 °C. Reakce pak byla oddělena od nezreagovaného Tc-99m rotační dialýzou přes membránu s prahem molekulové hmotnosti (cut-off) 30 000 (Centrex, Schleicher & Scheull) se dvěma promytími po 300 μΐ. Tento značící postup vedl k inkorporaci 30 až 50 % přidaného Tc-99m a specifikcé aktivitě 2-3 mCi/nmol RNA. Tc-99m je vázáno prostřednictvím 5'G jak je ukázáno na obr. 5.
Pro pokusy s biodistribucí byly xenotransplantáty nádoru U251 připraveny následovně: buňky U251 byly kultivovány v médiu DMEM (Dulbeccos1 Modified Eagle's Medium) s 10% (objem/objem) telecím fetálním sérem (Gibco BRL, Gaithersburg, MD) . Athymické myši, tj . myši bez brzlíku (Harlan Sprague Dawley, Indianapolis, IN) dostaly subkutánní injekcí 1 χ 106 buněk U251. Když nádory dosáhly velikosti 200-300 mg (za 1 až 2 týdny), Tc-99m-značené aptamery byly injikovány intravenózně v dávce 3,25 mg/kg. V určených časech byla zvířata podrobena anestezi isofluranem (Fort Dodge Animal Health, Fort Dodge, ΙΑ) , byla jim odebrána krev srdeční punkcí a zvířata pak byla utracena a byly z nich odebrány tkáně. Hladina Tc-99m byla měřena gama-počítačem (Wallac Oy, Turku, Finland). Příjem • · • ···· ··« • *»· ·· ·· ··· ·· »···
- 35 aptameru do tkání byl měřen jako % of injikované dávky na gram tkáně (%ID/g).
Snímky myší byly získány gama-kamerou. Myši byly pod anestezí (isofluran) umístěny do kamery (Siemens, LEM+). Data byla sbírána (30 vteřin až 10 minut) a analyzována pomocí programového vybavení Nuclear MAC verze 3.22.2 (Scientific Imaging. CA) na počítači Power MAC G3 (Apple Computer, CA).
Biodistribuční experimenty (tab. 5) ukázaly rychlý a specifický příjem aptameru do tkání nádoru, nevázající se apatmer nebyl zadržen v nádoru. Hladina Tc-99m v krvi klesala velmi rychle. Po třech hodinách hladina Tc-99m vnesená do nádoru užitím Hii5-TTA1 měla velmi dlouhý poločas (>18 hodin).
To ukazuje, že jakmile jednou aptamer pronikne do nádoru, radioaktivní značka jím nesená zůstává v nádoru o dlouhou dobu. To by ukazovalo, že také cytotoxická činidla, včetně radionuklidů nebo neradioaktivních činidel, konjugovaná s aptamery, by zůstávala v nádoru s dlouhým poločasem.
Tc-99m radioaktivita se objevila i v jiných tkáních, zejména v tenkém a tlustém střevu. Profil hepatobiliární clearance, který byl zde pozorován, může být odborníkem snadno změněn, např. tím, že se změní hydrofilnost chelatačního činidla pro Tc-99m, změní se chelatační činidlo nebo se změní současně radioaktivní značka i chelatační činidlo.
Celotělové snímky zvířat byly získány užitím Tc-99mznačeného Hii5-TTA1 3 hodiny po injekci: Snímky z myší injikovaných Hii5-TTA1 jasně zobrazují nádory, zatímco snímky z myší injikovaných Hils-TTAl.NB nikoliv (obr. 3). Další radioaktivita je patrná v gastrointestinálním traktu, jak bylo predikováno v biodistribučnímn experimentu.
• · · · • · · · • #
Příklad 5
Užití fluorescenčně značeného TTA1 k lokalizaci tenascinu-C v nádorové tkáni
Materiály a metody
TTA1 a TTA1.NB byly syntetizovány jak již bylo popsáno výše. Fluorescenční barvivo sukcinimdylrhodamin-Red-X (Molecular Probes, Eugene, OR) bylo konjugováno na 5'-aminovou skupinu aptameru, jak bylo popsáno výše pro Hii5-NHS konjugáty. Rhodamin-Red-X-konjugované aptamery, TTAl-Red a TTAl.NB-Red, byly purifikovány HPLC s reverzní fází. Buněčné kultury U251 a růst nádorů u nahých (athymických) myší byly taktéž popsány výše. 5 nmol TTAl-Red nebo TTAl.NB-Red bylo injikováno intravenozně do myši a v požadovaném čase bylo zvíře podrobeno anestezi a perfundováno 0,9% NaCl a utraceno. Nádor byl vyoperován a vložen do formalínu. Po 24 hodinách ve formalínu byly připraveny 10 μιη řezy a Rhodamin-Red-X byla detekována fluorescenční mikroskopií (Eclipse E800, Nikon, Japan).
tenascinu-C jako sice 5 nM. Byla pro TTAl-Red a
Výsledky
TTAl-Red měl stejnou afinitu k nekonjugovaný původní aptamer, TTA 1, a srovnána hladina fluorescence v nádoru
TTAl.NB-Red 10 minut po injekci. Vázající se aptamer TTAl-Red silně obarvil nádor, ale nikoliv okolní tkáně (obr. 4). Naproti tomu při použití TTAl.NB-Red byla detekována pouze vlastní fluorescence tkání. Tyto výsledky ukazují užitečnost aptamerů podle vynálezu pro fluorescenční detekci tenascin-C in vivo.
♦ · · * ·
Příklad 6
Detekce nádorů in vivo pomocí aptameru TTA1 (GS7641): další typy nádorů
Značení apatameru, biodistribuce a xenotransplantace nádorů na nahé myši byly shodné s příkladem 4.
Je známo, že mnohé typy humánních nádorů exprimují tenascin-C. Pro vyhodnocení schopnosti TTA1/GS7641 zaměřit i jiné typy nádorů než glioblastomy, byly kultivovány buněčné linie humánních nádorů jakožto nádory na nahých myších. Nádorové tkáně pak byly testovány na expresi humánního tenascinu-C, a pak nádory exprimující humánní tenascin-C byly testovány na příjem aptameru.
Obr. 6 ukazuje příjem aptameru u několika nádorů, jako např. glioblastomu, nádoru prsu, kolorektálního nádoru a rhabdomyosarkomu. Specifický příjem do nádoru byl demonstrován na základě srovnání vázajícího se (TTA1/GS7641) a nevázajícího se aptameru (TTA1.NB). Zajímavé bylo, že KB, xenotransplantát, který exprimuje myší a nikoliv humánní TN-C, nejevil žádný příjem do nádoru. Tento experiment rozšiřuje pozorování příjmu aptameru do glioblastomu o další typy karcinomů a sarkomů, a prokazuje, že všechny nádory exprimující humánní tenascin-C vykazují příjem TTA1/GS7641.
Příklad 7
Alternativní značení pomocí In-111
Xenotransplantáty nádorů a biodistribuční studie byly provedeny shodně s příkladem 4. Pro navázání DTPA a DOTA na
- 38 TTA1/GS7641, byl cyklický anhydrid každého z nich inkubován s TTA1/GS7641 obsahujícím amin v podmínkách neutrálního pH standardním způsobem. Struktura DTPA a příslušného konjugátu je uvedena na obr. 8 a 9, kde jsou značeny In-111. DOTA-konjugát má identické linkery jako DTPA. DOTA- a DTPA-konjugát byly značeny In-111 inkubací 30 minut v 95°C v 0,5M NaOAc, pH 5,5. P odstranění neinkorporované radioaktivní značky odstřeďovací dialýzou přes membránu s limitem propustnosti 3OK byl radioaktivně značený aptamer přenesen do fosfátem pufrovaného solného roztoku, aby mohlo být injikován myším nesoucím nádory.
Biodistribuce aptameru značeného In-111 byla výrazně odlišná od přípravků značených Tc popsaných v příkladu 4. Obr. 7 ukazuje, še ve srovnání se TTA1/GS7641 značeným Tc-99m je radioaktivita z TTA1/GS7641 značeného In-111 v intestinálním traktu značně snížena a současně je zvýšen příjem do jater a ledvin. Tento experiment ukazuje, že chemické vlastnosti chelatačního činidla mají významný vliv na distribuci radioaktivní značky TTA1/GS7641 v živém zvířeti. Biodstribuční profily odlišné od profilů HÍ15-TTA1/GS7641 mohu být užitečné pro zacílení nádorů za určitých klinických stavů, kdy hepatobiliární clearance není žádoucí. K takovým klinickým stavům patří, aniž by výčet byl omezující, radioaterapeutické aplikace a zobrazování intestinálního traktu, prostaty a dalších abdominálních oblastí.
- 39 Tabulka 1
Tenascin-C SELEX RNA a vstupní protein
Cyklus Tenascin-C (pmol/jamka) RNA (pmol/jamka)
1 12 200
2 12 200
3 12 200
4 12 200
5 2 33
6 2 33
7 2 33
8 0,2 3,3
Tabulka 2
Tenascin-C SELEX RNA a vstupní protein v buněčném SELEX
Cyklus Tenascin-C (pmol/jamka) RNA (pmol/j amka)
E9P1 2 33
E9P2 2 33
• · • * • * σ>
υ υ
υ ssssssss cccccccc m
CN
S S S S Z S c c c c c c
CN 00 O O Ά O (S H CN ·· ·· • ♦ · « • · * • · · .Jg ....
o*
(0 <0 <0 <0 <0 <0 <0 θ' θ' θ' θ' cn ο» θ' ο ο ο υ υ ο υ υ υ ο υ υ υ ο υ u υ υ
Ο Ο Ο θ' θ' θ' θ'
cn θ' υ θ' cn θ' θ' υ υ υ U (0 10 (0 10 θ' (0 10 ιο
υ υ υ υ υ U ο 3 3 3 3 ο» ο» θ' θ' υ θ' cn θ'
3 3 ο» υ 3 3 3 υ υ υ υ υ υ U υ 3 υ υ CJ
o υ υ υ υ Ο υ (0 10 10 10 υ υ ο υ Ο υ U ο
<0 10 3 θ' <0 10 <0 θ' θ' cn cn (J υ ο υ 10 υ υ υ
cn θ' cn cn θ' θ' θ' θ' cn θ' ο> υ υ ο υ
10 3 U υ υ CD m <0 0 υ υ υ υ υ υ υ υ
θ' υ 10 (0 <0 θ' cn cn ο» 3 3 3 3 (0 3 3 3
υ 10 en ο ο» co >0 C0 Ό υ Ο υ υ ο» υ υ υ
<0 θ' Φ ιο <0 υ υ υ υ 10 10 (0 <0 (0 10 <0 10
cn υ υ υ υ cn θ' θ> ο> υ ο> θ' θ'
Φ ιο ο U υ υ U υ υ υ
υ θ' 3 (0 <0 ιο (0 >0 <0 <0
10 CJ (J CJ cn ο» ο» θ' CJ ο» ο» cn
υ CJ CJ U ο υ υ (0 C0 <0 10 CJ <0 (0 <0
υ υ υ υ u ο 3
U CJ CJ tenascinu-C: purifikované metodou SELEX (TN vane metodou buněčné SELEX z buněk U251
a)
C •rl
Ό
O
M
3 υ rt rt 3 3 rt 3
Ο U ο ο υ υ 3 υ a
3 3 3 3 υ 3 υ υ
rt rt rt <1 rt rt rt rt rt
α ο υ ο υ υ υ υ u
3 ο ο ο CD CD υ CD CD
3 ο H
CJ 3 ο ο υ 3 3 u Z H
CJ Ο ο ο υ Ο CJ CD u
U υ ο υ υ υ CD cj u <d
3 3 3 3 3 3 υ 3 3 ti
3 3 3 3 3 3 3 3 3 •H
Ο 3 3 3 3 CJ U > Ό
rt 3 3 3 rt υ υ rt Z 0
3 Ο ω υ CJ υ υ u CJ
3 rt rt rt « rt «ί rt rt
CD Ο ο ο CD 3 CD CD CD
CJ rt rt rt 3 3 3
rt «τ «£ 3 3 3 3 3
υ rt (3. rt υ υ rt 3
3 rt Ο CD 3 rt U 3
u rt o u rt 3 O cj υ υ 3 o $
υ o
υ CJ υ υ υ υ o rt
3 3 o ο u o rt
rt £ rt (0 |£ rt cj
rt rt rt rt rt o
CJ u υ υ o υ
σ> cn Θ» cn o o o
«0
O υ
rt θ' cn θ' cn ο» tn Cn υ
O
Φ 44
υ •rl
β ί-ι
φ •rl
> Μ z—‘
Αί 3 CN
Φ ft (b
η ra •
ιΟ H >u
η — Φ •
Φ o Q
Λ O β Η
Αί β φ
ι—1 φ >
8* fc £
Φ Φ n n cn Cn cn cn rt >o cd cn Cn θ' cn cn
U ο ο cj cj rt ο u ο ο υ υ υ 3 3 3 rt u u υ υ
3 υ υ CD CD CD 3 CJ O CD CJ υ CJ rt CJ
CD 3 3 3 3 3 υ o u 3 CJ u o CJ CJ
CJ CJ O 3 3 3 a CJ CJ CJ CJ < CJ CD CJ
CJ υ a rt 3 3 CJ a CJ CJ CJ CJ 3 υ
CJ o u 3 CJ 3 CJ 3 υ CJ 3 rt CD CJ
3 CD υ rt rt CD CJ 3 υ 3 3 CJ 3 CJ
a CJ CJ 3 3 3 3 CD 3 CD CD σι rt CD CJ
CJ rt 3 rt rt rt rt 3 a 3 3 3 rt 3
CD rt 3 CD CD CD CD CJ a CD a «£ CJ a rt
3 3 3 CD CD CD rt CJ CD CJ CJ CJ 3 υ
rt a rt υ 3 υ CD 3 1¾ rt CJ rt
O o u U a CJ CJ CD rt u u < 3 rt
rt 3 CJ υ 3 CJ 3 CD 3 u u CD 3
rt rt rt «5 CJ =? 3 rt 3 u CJ CJ CJ
ο υ
rt ο
ο
CJ rt rt ο
ο ο
CJ rt
Ο rt
CJ CD CD CJ CD
CD s υ CJ CJ υ CJ
CJ a a CJ O CJ CJ
CJ o CD CD CD CD CD
CD CD CJ CJ a CJ
3 3 3 3 3
3 3 CD CD CD rt CD
CD CD CJ CJ a rt CJ
CJ CJ CD CJ 3 CD CD
CD CD 3 CJ 3
rt 3 rt rt 3
rt rt υ ,χ a CD
CJ CJ CD CD
CD CJ CJ 3 CJ
rt 3 3 rt rt 3
3 CJ 3 CD rt CJ
rt 3 rt rt < _ υ υ υ u u υ υ rt υ υ υ < ΰ u rt 3 3
CJ
CD u
S2 rt
CD □
•U ο
H •rl ra
U33OCD333
CDrtrtCD333rt
CJCDrtCJ3CD33 rtourtuortu
CJ3rttJrt33U
CJ3rtCJrt3CJrt
O3CJCJU3rtCJ
CJ CD < δ ° 3 CD CJ CJ
CJ CD í 2 U 3 < rt 3
3 rt 3 CJ U
CD o o
Ž o o o 3 rt rt 3 υ u CJ CJ 3 3
(J CD CJ CJ 3 rt CJ
υ CJ CJ 3 υ CD rt
CD CJ rt CD CJ 3 CD
3 rt rt rt 3 rt 3
CJ CD CD CD 3 CJ rt
3 CJ CJ υ rt 3 2
u 3 3 θ' υ CJ CD
3 tn CD υ rt 3 CJ
3 CD rt CJ rt CD 3
3 CJ rt rt υ CJ CJ
u υ ΰ
CD U rt rt rt O CD O rt υ u O rt 3 rt
CD 3 ιο
θ' θ' θ’ θ' θ' θ' θ' θ' θ' θ' cn θ’ ο» θ' cn θ' θ' θ' θ' θ'
u ο υ υ CJ θ' θ' θ' θ' θ' θ' θ' ο» θ' θ' ο» θ' tn tn θ'
θ' CD θ' θ' θ' υ υ CJ U CJ υ U υ υ CJ υ υ υ υ υ
□ 3 3 3 3 σ> ο> θ' θ' θ' σ' θ' σ» ο» θ' ο> cn ο» ο» cn
(0 (0 10 (0 <0 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3
O> CD θ' θ' θ' <0 (0 (0 (0 «ο ιο (0 <0 <0 <0 Φ Φ <0 (0 <0
CJ υ U Ο CJ θ' Ο» θ' θ' θ' θ' θ' θ' θ' θ' θ' ο» θ' θ' σ>
10 rt <0 «0 (0 CJ CJ U CJ υ υ υ υ υ υ υ υ υ υ υ
θ' ο» θ' θ' θ' <0 (0 <0 <0 <0 (0 (0 Q «0 Φ <0 10 (0 Φ (0
θ' θ' θ' θ' θ' ο» θ' θ' θ' θ' σ» σ> θ' θ' θ' θ' θ' cn θ' cn
ΙΟ rt (0 «0 10 θ' θ' θ' θ' ο» ο» θ' θ' ο» θ' θ' σ> θ' θ' θ'
θ' tn θ' θ' θ' 10 rt 10 <0 <0 (0 <0 <0 <0 <0 (0 <0 >0 φ <0
θ' ο» θ' θ' θ' θ' θ' θ' θ' σ> θ' ο» θ' cn ο> θ' ο» θ' θ> θ'
θ' θ' ο» θ' θ' θ' θ' θ' θ' cn θ' ο> θ' ο» θ' cn θ' σ> ο» θ>
θ' θ' θ' θ' σ> θ' θ' θ' σ» θ' θ' σ> θ' θ' θ'
O r-t CN
VinVOr-aOOr-lr-tr-l ro xr m vo r- oo cn ot-tCNcnvinvorCNCNCNCNCNCNCNCN
CN
Π CN
rH Ό CN CJ «η
«Μ V· CN ΓΩ ι·4 «σ* CN
ζ Z Ζ Ζ Ζ 2 2 ζ
Η Η Η Η Β- Η Η Η
'Λ M υ rl β O β (0 _ « ra φ
o fi φ
>
aí φ
—. xr vo Ό rN rH
V
I
CN
Cu cn bď r* cn σ> v· z z z z Η Η Η H '10
Aí
O rl β
β (0 φ
υ φ
&
φ
• ·
2 3 C
O O <M r-M A rH
O rH
Λ
M α
*Φ >
o >o
M
Ai
O
A ro (li
M r-1
Λ (0
E-* <0 (0 (0 σ* σ* σ* o o o o o o o o o Ο» cn cn o u υ 3 3 3 o o υ ra ra ra ο» σ* σ» u u υ ra ra ra o* o* o* ra ra ra o o o ra ra o* 0* o o u o o u o* o* o υ 3 3 o u
ra ra ra ra ra ra ra «
ο* ο» ο* σ* ο* cn ο* σ»
ο υ ο ο ο υ υ υ
υ υ υ ο υ υ υ υ
ο ο ο ο U υ υ ο
σ» σ* σ* σ* σ* σ» σ* ο*
υ υ υ ο υ υ υ υ
3 3 3 3 3 3 3 3
U υ υ υ U U υ υ
ra (0 ra ra ra ra ra ra
σ* σ* σ» σ* σ* ο* σ* σ*
υ ο υ ο υ υ υ υ
ra ra ra ra ra ra ra ra
ο* σ* σ* σ* σ» σ* σ» cn
ra ra ra ra ra ra ra ra
ο α U υ ο U υ υ
o at < 003 σ* o* o* o* υ υ σ* σ* 3 3 ra ra σ* ο» υ ra ο» ο* ο* ο» ra ra σ* ο* ο* σ* ο» σ*
O* O* O* O* υ u o* o* 3 3 ra ra o* o* (0
ra ο*
σ» υ
« υ ο
O* ra υ υ
U o* υ σ»
υ υ σ»
o υ υ 3
o* υ 3 υ
o σ* υ ra
3 υ ra ο»
O 3 ο* ο
« Ο υ ra
O* ra ra cn
υ σ* σ» ra
ra υ ra υ
L> u u o u 0 3 3 3 U
ra < o 2 0 3
ο 2 2 2 2 o 0 3 0 U U O
ο 0 0 0 0 u 3 3 3 3
O*
W
σ* Ο* ο* σ* σ* σ* 0* 0 σ* 0* cn cn ο* σ* σ*
ο* σ> σ* cn σ* σ* Ο* σ* σ* ra σ* cn σ* σ* σ* σ*
υ υ υ υ υ υ υ υ υ Η U υ υ υ υ υ
σ» σ* ο* ο* σ* ο* ο* σ* σ» Q σ* cn σ» σ» σ» ο*
3 3 3 3 3 3 3 3 □ Μ 3 3 3 3 3 3
«0 π ra ra ra <0 ra ra ra (0 ra ra ra ra ra
0*0*0*0*0»0*cncnD*
0* Ο* 0* 0* Ο* Ο*
CJ υ υ ο υ υ υ Ο υ υ ο υ υ υ υ υ U υ u
<0 ra <0 <0 ra ο <0 (0 C0 ra 3 (0 ra ra ra ra
O* O* 0* O* 0* 0* 0* O* O* 0i 0*0*0*0*0*0*0*0*010* ra ra ra ra o* σ* o* o* o* o* o* o* o* o* σ» 0*
0* 0* 0* 0*
0* 0* 0* 0* σ* σ* σ* σ*
ra ra ra ra ra ra ra ra ra ra ra ra «
0* o* 0* o* cn o* 0* o* cn cn cn o* 0»
0* Cn 0* σ* o* o* cn >1 o* o* cn o* 0» o*
o* O* o* o* o* o* 0* M Φ o* 0* O* cn 0* o*
i Jj r-1 n m *D
*Γ *Γ V *τ cNCsifnnfonnmnmnrn’?
σ* ο ο»-* γ— σ* τ «χ* ο ο <-* Ν*η®Ν(ΏΝΐηίη*θΗΗΗ>-ι ΖΖΖΖΖΖΖΖΖΖΖΖΖ
8·
Μ
Μ tn
Η ιη (Ν &
ί*>
to
— CM *—
*n *·—*
00 τΗ *o m m σ*
1 1 1 1 1 1
σ* o* σ* σ\ <τ» σ*
ω ω ω ω (ι3 ω
ε ε ε ε ε ε ε ε
2 ε ε 35 ε 2 2 3 c c g g c G G
p G 3 c c c £3
in IN r- r~ n tn t~- in
o CN to o r- Λ Ν' o tn
rH CN C t-i to ÍN rl r* rM CS
. Λ
ε c
tn ε
tn
Λ
Tabulka 4: 2'-ΟΜθ substituce, vnitřní delece, TTA1 a TTA1 id
4J
-rl
G •rl
IM
CN
H
Φ
N 'id fa
XJ *
Q
H
W
Z
Z
B
M
OT tn tn O to
O to O to
tn tn tn tn tn tn tn tn tn
tn to to to to to to to to to
to Z Z Z Z Z Z Z Z Z
Z Z z Z z z z Z Z Z
Z u u Z z z z Z U z
Z z z z z z z Z Z z
Z z z z z z z Z Z z
Z z z z z u z z Z z
Z to to to to to to to to to
r^oootOi-iNm'^
Ν'Ν’Ν'ΐηιηιηιηιη
r-1 CS η ιη αι
ε ε ε ε ε ε
n N< N* Ν' Ν* Ν' Ν' Ν'
Ot Ot Ot σι Ot σ\ σ\ σ>
Z Z Z z Ζ ζ ζ Ζ
H H Η £- Η Η Η
G •rl r—I
5?
φ b
id
J4 >υ •rl
P<
Φ >Z
Č-l
I n
II tn <
=
II t
ϋ
Ξ
II
Ό
tO tO tO to tO o o o tore» z z z z z u □ mot o E> O O Z O <<>|<<
to e> o oi o e> o υ z z z z υ z r- < μ < < < < to toi e> o o o o
10 10 10 10 10 10
r- Γ* t~ r-
• to to 10 10 to 10
id 10 to 10 10 10 to
4J 10 to to 10 to 10
•H H rH rH rH rH rH
•rl
«Η
in 10 r- CD Ot O
in tn m in m 10
Φ
ε S·
o rH
1 o
·· o CS
CS 10 Γ* r-t
tn o o o
• m tn tn tn m tn
H CS n m m n co
H rd r-t rH ri rH
H ε ε ε ε ε ε
Ν' N* <3* 59·
Φ
N Ot Ot ot Ot σι σι
'id Z Z Z Z z z
fa H H H
w cn m ffl rl V
Z Z Η H rH ,-i in r> n ε
Ν' to
Z r* to to
Z rt—
Z
O z
o z
z z
z z
I s
z rf
X u
i
O u
r10
Γ* o
in ri
Č
TTA1.NB: 65 5’-1G667667CG- (CH,CH,O) «-CGUCGCCGU77U667U6UUUU6CU5
- 43 o o o- t— to o o o o o o o o o o *- o o o o o t- n
V- CO v- bl t— bl O T— O O
N Ó Ó O
O O CM IO b o tn n o 10 ▼7 cm in tr o o o o o o
O O co lO 05 CO b b ON i- o co y oori no ffi z
v£
H Ή +1 +1 H H H -H H H H -H -H -H •H H -H +1 •H
O o b O O O O CO O) $ O O 10 O CO O O O ν-
b CM co CM O CM tr O- IO co b 10 CM v— CJ) tr IO τ-
tr CO co CM Τ- v— tr C0 CM Τ- z CM b- <0 O b tr oq o Ο
tř tř o d Ο CO cd xř T- Ο CM Ó v* CO O* T“ V— o O*
to t- V- CM V
g
o o O 00 CO IO o o co o b CO O O ν- CJ) co b O O co CM CM co
co tr CM O o IO b cd O tr Ό- tř έο co o CO <o O) o O O o
CM o O O o o CM o o b CM CM O CD 00 b ν- o o o O o
tř o d O o o* o o CM o O d d d 10 b d d Ο d © d d o d
H •H -H H +1 +1 H H •H H -H +1 Ή H -H H H +1 -H •H H •H H •H
O O CO o ν- o o C0 oi O) o O o O) CM CO 00 O O Ό· CO v- co
CO V“ V- 00 •Ο- έο O) τ- b co tr Ol 0) CO co Ol b b CO τ- v— o
tř CD 10 CM ν- o CD Ο K- tr CM CM CO co CM CM CM CO o Ο O o
tr có v— O* ο o cd b 10 τ4 O O CM d o cd V“ O* d d O d o*
tr Tv- CM
CM O O O O O t— co co b cm t- to o
CM O O O O O t- CO CO b bl v- IO O
Tabulka 5: Biodistribuce Tc-99m-TTAl a -TTAl.NB
CM O O O O O f co CO b CM v- IO O
CM O O O O O t— CO CO b CM v- to O
o
'M ν’* Ή O
M iPÍ SĚ
M ď iPí >
E-I co d H co
E-ι co
ffi
Z
V g
o o 00 t»· τ- co to Ol co v— o o tn co CM o o IO o CO o o IO tn Τ-
o v— O Ο O cn o o C0 co o o o tn co O) m O co CM O Ο
CD CM o o O m τ- o o o CD CM o o o CO 00 o o O τ- v— O o o
d d d d d d Ο o d d d d d o* o* o d d o d Ο d d d d
H «Η H •H H H H H H •H Ή H H H H +1 -H -H -H •H H. +1 •H H •H
O O b CO CO < co b CM tr T- O O O b < o o co CO < O O o co O
v- CM Ό- tř v— Ό- O co CD tr CM vr τ- o o CM v— tn (O CM ν- co CM
10 O ν- o o o O τ- O O Z. CJ) τ- o Ο Cl) tr CM o Z CO CM ν- o O
CD ο d O tn bi Ο d d CÓ v— Ο d d b CJ) d O d tr v— Ο d d
g
o o O O CO O CO to CO v- Τ- O o co co Τ- o o O- b CO o o co co tr co
v— O) ν- o co to CD tr O o O Ο co v· o o Ο co IO σ> co τ- o v— ^- b bl o o
Ό- to έο o O CM O o O o (N o O o o o to bl o O Ο o tr bl o o o o
d d d d o d d d d d o t-' o d d d d d d d O d o d d d d d
H H H •H H +1 -H H •w H H +1 H •H •H H -H H -H H «Η H •H -H H H H +1 +1 -H
O O Oi CD O) o ř*. to CM CM co CD O O r*. 00 00 b o o ν- tr IO o o co 00 bl O
b Ό- OD CD O) IO co <o O b co 10 Ό- bl o bl co CD Ο o b o co tr O) d to
tr O) CO CD v- CM CM o o o Ol v— O o o tr CM tr τ- o tr CD o o
tř to CM v· v— v— CÓ CM o O d O aj CM d d o o O) bi v’ d Ο d to bi d d d d
CM O O O O O t- (O CO b CM t— lO O
CM O O O O O t- CO CO b Ol v- IO O
CM O O O O O t— (O CO b Ol t- lO O
CM O O O O O
T- co CO b Ol v- to O
CM O O O O O t“ CD CO b- Ol v- to O
Pí
O
Ě«
PS
X
M
U
Ή d
Λ
E-t '3
Š
H
M
W w
SEZNAM SEKEVNCÍ <160> 65 <170> Patentln Ver. 2.0 <210> 1 <211> 71 <212> DNA <213> Umělá sekvence <220>
<221> modifikovaná báze <222> (1)..(56) <223> N v polohách 17-56 je A, C, T, nebo G <400> 1 tcgcgcgagt cgtctgnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnccgc 60 atcgtcctcc c 71 <210> 2 <211> 32 <212> DNA <213> Umělá sekvence <220>
<223> Popis umělé sekvence: Nukleová kyselina <400> 2 taatacgact cactataggg aggacgatgc gg 32 <210> 3 <211> 16 <212> DNA <213> Umělá sekvence <220>
<223> Popis umělé sekvence: Nukleová kyselina <400> 3 tcgcgcgagt cgtctg
- 45 <210> 4 <211> 71 <212> RNA <213> Umělá sekvence <220>
<223> Popis umělé sekvence: Nukleová kyselina <220>
<221> modifikovaná báze <222> (1)..(71) <223> Všechny pyrimidiny jsou modifikované 2'F.
<400> 4 gggaggacga ugcggcaauc aaaacucacg uuauucccuc aucuauuagc uuccccagac 60 gacucgcccg a 71 <210> 5 <211> 71 <212> RNA <213> Umělá sekvence <220>
<223> Popis umělé sekvence: Nukleová kyselina <220>
<221> modifikovaná báze <222> (1)..(71) <223> Všechny pyrimidiny jsou modifikované 2'F.
<400> 5 gggaggacga ugcggcaauc uccgaaaaag acucuuccug cauccucuca ccccccagac 60 gacucgcccg a 71 <210> 6 <211> 71 <212> RNA <213> Umělá sekvence <220>
<223> Popis umělé sekvence: Nukleová kyselina <220>
<221> modifikovaná báze
<222> (1)..(71) <223> Všechny pyrimidiny jsou modifikované 2'F.
<400> 6 gggaggacga ugcggcaacc ucgaaagacu uuucccgcau cacuguguac ucccccagac 60 gacucgcccg a 71 <210> 7 <211> 71 <212> RNA <213> Umělá sekvence <220>
<223> Popis umělé sekvence: Nukleová kyselina <220>
<221> modifikovaná báze <222> (1)..(71) <223> Všechny pyrimidiny jsou modifikované 2'F.
<400> 7 gggaggacga ugcggcaacc ucgauagacu uuucccgcau cacuguguac ucccccagac 60 gacucgcccg a 71 <210> 8 <211> 71 <212> RNA <213> Umělá sekvence <220>
<223> Popis umělé sekvence: Nukleová kyselina <220>
<221> modifikovaná báze <222> (1)..(71) <223> Všechny pyrimidiny jsou modifikované 2'F.
<400> 8 gggaggacga ugcggcaacc ucaaucuuga cauuucccgc accuaaauuu gcccccagac 60 gacucgcccg a
- 47 <210> 9 <211> 71 <212> RNA <213> Umělá sekvence <220>
<223> Popis umělé sekvence: Nukleové kyselina <220>
<221> modifikovaná báze <222> (1)..(71) <223> Všechny pyrimidiny jsou modifikované 2'F.
<400> 9 gggaggacga ugcggcaaac gaucacuuac cuuuccugca ucugcuagcc ucccccagac 60 gacucgcccg a 71 <210> 10 <211> 71 <212> RNA <213> Umělá sekvence <220>
<220>
<221> modifikovaná báze <222> (1)..(71) <223> Všechny pyrimidiny jsou modifikované 2'F.
<400> 10 gggaggacga ugcggacgcc agccauugac ccucgcuucc acuauuccau ccccccagac 60 gacucgcccg a 71 <210> 11 <211> 70 <212> RNA <213> Umělá sekvence <220>
<223> Popis umělé sekvence: Nukleové kyselina <220>
<221> modifikovaná báze <222> (1)..(70) <223> Všechny pyrimidiny jsou modifikované 2'F.
♦ ····· · Η · « « « * ···« ··· • · * · ♦· ·· ·*· · · ···
- 48 <400> 11 gggaggacga ugcggccaac cucauuuuga cacuucgccg caccuaauug cccccagacg 60 acucgcccga 70 <210> 12 <211> 15 <212> RNA <213> Umělá sekvence <220>
<223 > Popis umělé sekvence: Nukleová kyselina <220>
<221> modifikovaná báze <222> (1)..(15) <223> Všechny pyrimidiny jsou modifikované 2'F.
<220>
<221> modifikovaná báze <222> (1)..(15) <223> N v polohách 4 a 10 je A, G, 2'-F-U nebo 2'-F-C <400> 12 gacnyuuccn gcayc 15 <210> 13 <211> 71 <212> RNA <213> Umělá sekvence <220>
<223> Popis umělé sekvence: Nukleová kyselina <220>
<221> modifikovaná báze <222> (1)..(71) <223> Všechny pyrimidiny jsou modifikované 2'F. <400> 13 gggaggacga ugcggaaccc auaacgcgaa ccgaccaaca ugccucccgu gcccccagac 60 gacucgcccg a 71
- 49 <210> 14 <211> 70 <212> RNA <213> Umělá sekvence <220>
<223> Popis umělé sekvence: Nukleová kyselina <220>
<221> modifikovaná báze <222> (1)..(70) <223> Všechny pyrimidiny jsou modifikované 2'F.
<400> 14 gggaggacga ugcggugccc auagaagcgu gccgcuaaug cuaacgcccu cccccagacg 60 acucgcccga 70 <210> 15 <211> 71 <212> RNA <213> Umělá sekvence <220>
<223> Popis umělé sekvence: Nukleová kyselina <220>
<221> modifikovaná báze <222> (1)..(71) <223> Všechny pyrimidiny jsou modifikované 2'F.
<400> 15 gggaggacga ugcggugccc acuaugcgug ccgaaaaaca uuucccccuc uaccccagac 60 gacucgcccg a 71 <210> 16 <211> 71 <212> RNA <213> Umělá sekvence <220>
<223> Popis umělé sekvence: Nukleová kyselina <220>
<221> modifikovaná báze <222> (1)..(71)
9 9 9 · 9 · · · » ·· · · • · · · · ·
<223> Všechny pyrimidiny jsou modifikované 2'F.
<400> 16 gggaggacga ugcggaacac uuucccaugc gucgccauac cggauauauu gcucccagac 60 gacucgcccg a 71 <21O> 17 <211> 71 <212> RNA <213> Umělá sekvence <220>
<223> Popis umělé sekvence: Nukleová kyselina <220>
<221> modifikovaná báze <222> (1)..(71) <223> Všechny pyrimidiny jsou modifikované 2'F.
<400> 17 gggaggacga ugcggacugg accaaaccgu cgccgauacc cggauacuuu gcucccagac 60 gacucgcccg a 71 <210> 18 <211> 71 <212> RNA <213> Umělá sekvence <220>
<223> Popis umělé sekvence: Nukleová kyselina <220>
<221> modifikovaná báze <222> (1)..(71) <223> Všechny pyrimidiny jsou modifikované 2'F.
<400> 18 gggaggacga ugcggaacaa ugcacucguc gccguaaugg auguuuugcu cccugcagac 60 gacucgcccg a 71
- 51 ··
<210> 19 <211> 71 <212> RNA <213> Umělá sekvence <220>
<223> Popis umělé sekvence: Nukleová kyselina <220>
<221> modifikovaná báze <222> (1)..(71) <223> Všechny pyrimidiny jsou modifikované 2'F.
<400> 19 gggaggacga ugcgguuaag ucucgguuga augcccaucc cagauccccc ugacccagac 60 gacucgcccg a 71 <210> 20 <212> RNA <213> Umělá sekvence <220>
<223> Popis umělé sekvence: Nukleová kyselina <220>
<221> modifikovaná báze <222> (1)..(71) <223> Všechny pyrimidiny jsou modifikované 2'F.
<400> 20 gggaggacga ugcggauggc aagucgaacc aucccccacg cuucuccugu ucccccagac 60 gacucgcccg a 71 <210> 21 <211> 71 <212> RNA <213> Umělá sekvence <220>
<223> Popis umělé sekvence: Nukleová kyselina <220>
<221> modifikovaná báze <222> (1)..(71) <400> 21
• · ** «· • · · · · · gggaggacga ugcgggaagu uuucucugcc uugguuucga uuggcgccuc ccccccagac 60 gacucgcccg a 71 <210> 22 <211> 71 <212> RNA <213> Umělá sekvence <220>
<223> Popis umělé sekvence: Nukleová kyselina <220>
<221> modifikovaná báze <222> (1)..(71) <223> Všechny pyrimidiny jsou modifikované 2'F.
<400> 22 gggaggacga ugcggucgag cggucgaccg ucaacaagaa uaaagcgugu cccugcagac 60 gacucgcccg a 71 <210> 23 <211> 71 <212> RNA <213> Umělá sekvence <220>
<223> Popis umělé sekvence: Nukleová kyselina <220>
<221> modifikovaná báze <222> (1)..(71) <223> Všechny pyrimidiny jsou modifikované 2'F.
<400> 23 gggaggacga ugcggauggc aagucgaacc aucccccacg cuucuccugu ucccccagac 60 gacucgcccg a 71 <220>
<210> 24 <211> 76 <212> RNA <213> Umělá sekvence • · · · • « · · • · 9 • · · ·
- 53 • *
<223> Popis umělé sekvence: Nukleová kyselina <220>
<221> modifikovaná báze <222> (1) . . (76) <223> Všechny pyrimidiny jsou modifikované 2'F.
<400> 24 gggaggacga ugcggacuag accgcgaguc cauucaacuu gcccaaaaaa aaaccucccc 60 cagacgacuc gcccga 76 <210> 25 <211> 71 <212> RNA <213> Umělá sekvence <220>
<223> Popis umělé sekvence: Nukleová kyselina <220>
<221> modifikovaná báze <222> (1)..(71) <223> Všechny pyrimidiny jsou modifikované 2'F.
<400> 25 gggaggacga ugcgggagau caacauuccu cuaguuuggu uccaaccuac acccccagac 60 gacucgcccg a 71 <210> 26 <211> 71 <212> RNA <213> Umělá sekvence <220>
<223> Popis umělé sekvence: Nukleová kyselina <220>
<221> modifikovaná báze <222> (1)..(71) <223> Všechny pyrimidiny jsou modifikované 2'F.
- 54 <400> 26 gggaggacga ugcggacgag cgucucauga ucacacuauu ucgucucagu gugcacagac 60 gacucgcccg a 71 <210> 27 <211> 71 <212> RNA <213> Umělá sekvence <220>
<223> Popis umělé sekvence: Nukleová kyselina <220>
<221> modifikovaná báze <222> (1)..(71) <223> Všechny pyrimidiny jsou modifikované 2'F.
<400> 27 gggaggacga ugcggucgac cucgaaugac ucuccaccua ucuaacaucc ccccccagac 60 gacucgcccg a 71 <210> 28 <211> 71 <212> RNA <213> Umělá sekvence <220>
<223> Popis umělé sekvence: Nukleová kyselina <220>
<221> modifikovaná báze <222> (1) .. (71) <400> 28 gggaggacga ugcggucgac cucgaaugac ucuccaccua ucuaacagcc uuccccagac gacucgcccg a <210> 29 <211> 71 <212> RNA <213> Umělá sekvence ·* *· • · · c · ·
<220>
<223> Popis umělé sekvence: Nukleové kyselina <220>
<221> modifikovaná báze <222> (1)..(71) <223> Všechny pyrimidiny jsou modifikované 2'F.
<400> 29 gggaggacga ugcggagaac ucauccuaac cgcucuaaca aaucuugucc gaccgcagac 60 gacucgcccg a 71 <210> 30 <211> 71 <212> RNA <213> Umělá sekvence <220>
<223> Popis umělé sekvence: Nukleové kyselina <220>
<221> modifikovaná báze <222> (1)..(71) <223> Všechny pyrimidiny jsou modifikované 2'F.
<400> 30 gggaggacga ugcggauaau ucgacaccaa ccaggucccg gaaaucaucc cucugcagac 60 gacucgcccg a 71 <210> 31 <21l> 71 <212> RNA <213> Umělá sekvence <220>
<223> Popis umělé sekvence: Nukleové kyselina <220>
<221> modifikovaná báze <222> (1)..(71) <223> Všechny pyrimidiny jsou modifikované 2'F.
<400> 31 • · · · · · *6 , • ··· · · · · · # , .
* ···» , , „ »··· ·· *' ·· *« ····
- 56 gggaggacga ugcggaaacc aaccguugac caccuuuucg uuuccggaaa guccccagac 60 gacucgcccg a 71 <210> 32 <211> 71 <212> RNA <213> Umělá sekvence <220>
<223> Popis umělé sekvence: Nukleová kyselina <220>
<22l> modifikovaná báze <222> (1). . (71) <223> Všechny pyrimidiny jsou modifikované 2'F.
<400> 32 gggaggacga ugcggaagcc aacccucuag ucagccuuuc guuucccacg ccacccagac 60 gacucgcccg a 71 <210> 33 <211> 72 <212> RNA <213> Umělá sekvence <220>
<223> Popis umělé sekvence: Nukleová kyselina <220>
<221> modifikovaná báze <222> (1) . . (72) <223> Všechny pyrimidiny jsou modifikované 2'F.
<400> 33 gggaggacga ugcgggacca acuaaacugu ucgaaagcug gaacaugucc ugacgccaga 60 cgacucgccc ga 72 <210> 34 <211> 71 <212> RNA <213> Umělá sekvence • · · ·
- 57 • · * • · • 4 • · · · 4 <220>
<223> Popis umělé sekvence: Nukleová kyselina <220>
<221> modifikovaná báze <222> (l)..(71) <223> Všechny pyrimidiny jsou modifikované 2'F.
<400> 34 gggaggacga ugcggaccaa cuaaacuguu cgaaagcugg aacacguccu gacgccagac 60 gacucgcccg a 71 <211> 71 <212> RNA <213> Umělá sekvence <220>
<223> Popis umělé sekvence: Nukleová kyselina <220>
<221> modifikovaná báze <222> (1). . (71) <223> Všechny pyrimidiny jsou modifikované 2'F.
<400> 35 gggaggacga ugcggaccaa cuaaacuguu cgaaagcuag aacacgucca gacgccagac 60 gacucgcccg a 71 <210> 36 <211> 71 <212> RNA <213> Umělá sekvence <220>
<223> Popis umělé sekvence: Nukleová kyselina <220>
<221> modifikovaná báze <222> (1)..(71) <223> Všechny pyrimidiny jsou modifikované 2'F.
- 58 <400> 36 gggaggacga ugcggaccaa cuaaacuguu cgaaagcugg aacacguucu gacgccagac 60 gacucgcccg a 71 <210> 37 <211> 71 <212> RNA <213> Umělá sekvence <220>
<223> Popis umělé sekvence: Nukleová kyselina <220>
<221> modifikovaná báze <222> (1) . . (71) <223> Všechny pyrimidiny jsou modifikované 2'F.
<400> 37 gggaggacga ugcggaccaa cuaaacuguu cgaaagcugg aauacguccu gacgccagac 60 gacucgcccg a 71 <210> 38 <211> 71 <212> RNA <213> Umělá sekvence <220>
<223> Popis umělé sekvence: Nukleová kyselina <220>
<221> modifikovaná báze <222> (1)..(71) <400> 38 gggaggacga ugcggaaguu uagugcucca guuccgacac uccucuacuc agccccagac 60 gacucgcccg a 71 <210> 39 <211> 71 <212> RNA <213> Umělá sekvence
- 59 • · · · • · * · • · · · · • · • · · · · · • ·
<220>
<223> Popis umělé sekvence: Nukleové kyselina <220>
<221> modifikovaná báze <222> (1)..(71) <223> Všechny pyrimidiny jsou modifikované 2'F.
<400> 39 gggaggacga ugcggagcca gagccucucu caguucuaca gaacuuaccc acuggcagac 60 gacucgcccg a 71 <210> 40 <211> 71 <212> RNA <213> Umělá sekvence <220>
<223> Popis umělé sekvence: Nukleové kyselina <220>
<221> modifikovaná báze <222> (1)..(71) <223> Všechny pyrimidiny jsou modifikované 2'F.
<400> 40 gggaggacga ugcggaccua acucaaucag gaaccaaacc uagcacucuc auggccagac 60 gacucgcccg a 71 <210> 41 <211> 71 <212> RNA <213> Umělá sekvence <220>
<223> Popis umělé sekvence: Nukleové kyselina <220>
<221> modifikovaná báze <222> (1)..(71) <223> Všechny pyrimidiny jsou modifikované 2'F.
<400> 41 gggaggacga ugcgggagau caacauuccu cuaguuuggu uccaaccuac acccccagac 60 gacucgcccg a ····· · » ·♦ · · • · · · · · · • · · · · · · ·· ···· <210> 42 <211> 71 <212> RNA <213> Umělá sekvence <220>
<223> Popis umělé sekvence: Nukleová kyselina <220>
<221> modifikovaná báze <222> (1)..(71) <223> Všechny pyrimidiny jsou modifikované 2'F.
<400> 42 gggaggacga ugcggaucuc gauccuucag cacuucauuu cauuccuuuc ugccccagac 60 gacucgcccg a 71 <210> 43 <211> 71 <212> RNA <213> Umělá sekvence <220>
<223> Popis umělé sekvence: Nukleová kyselina <220>
<221> modifikovaná báze <222> (1)..(71) <223> Všechny pyrimidiny jsou modifikované 2'F.
<400> 43 gggaggacga ugcggacgau ccuuuccuua acauuucauc auuucucuug ugccccagac 60 gacucgcccg a 71 <210> 44 <211> 71 <212> RNA <213> Umělá sekvence <220>
<223> Popis umělé sekvence: Nukleová kyselina <220>
<221> modifikovaná báze <222> (1)..(71)
<223> Všechny pyrimidiny jsou modifikované 2'F.
<400> 44 gggaggacga ugcggugacg acaacucgac ugcauaucuc acaacuccug ugccccagac 60 gacucgcccg a 71 <211> 72 <212> RNA <213> Umělá sekvence <220>
<223> Popis umělé sekvence: Nukleová kyselina <220>
<221> modifikovaná báze <222> (1)..(72) <223> Všechny pyrimidiny jsou modifikované 2'F.
<400> 45 gggaggacga ugcggacuag accgcgaguc cauucaacuu gcccaaaaac cucccccaga 60 cgacucgccc ga 72 <210> 46 <211> 70 <212> RNA <213> Umělá sekvence <220>
<223> Popis umělé sekvence: Nukleová kyselina <220>
<221> modifikovaná báze <222> (1)..(70) <223> Všechny pyrimidiny jsou modifikované 2'F.
<400> 46 gggaggacga ugcgggcgca ucgagcaaca uccgauucgg auuccuccac ucccccagac 60 gacugcccga 70 <210> 47 <211> 50 <212> RNA <213 > Umělá sekvence « ·
- 62 <220>
<223 > Popis umělé sekvence: Nukleová kyselina <220>
<221> modifikovaná báze <222> (1)..(50) <223> Všechny pyrimidiny jsou modifikované 2'F; vazba v polohách 50 a 51 je 3 ' -3 ' .
<400> 47 gggaggacga ugcggaacaa ugcacucguc gccguaaugg auguuuugcu 50 <210> 48 <211> 55 <212> RNA <213> Umělá sekvence <220>
<223> Popis umělé sekvence: Nukleová kyselina <220>
<221> modifikovaná báze <222> (1)..(55) <223> Všechny pyrimidiny jsou modifikované 2'F; vazba v polohách 55 a 56 je 3 ' -3 ' .
<400> 48 gggaggacga ugcggaacaa ugcacucguc gccguaaugg auguuuugcu cccug 55 <210> 49 <211> 55 <212> RNA <213> Umělá sekvence <220>
<223> Popis umělé sekvence: Nukleová kyselina <220>
<221> modifikovaná báze <222> (1)..(55) <223> Všechny pyrimidiny jsou modifikované 2'F; G v polohách 1-3, 5 a 55 jsou modifikované 2'OMe; a v poloze 4 je 2'OMe; vazba v polohách 55 a 56 je 3'-3'.
<400> 49 • »
- 63 gggaggacga ugcggaacaa ugcacucguc gccguaaugg auguuuugcu cccug 55 <210> 50 <211> 55 <212> RNA <213> Umělá sekvence <220>
<223> Popis umělé sekvence: Nukleová kyselina <220>
<222> (1)..(55) <223> Všechny pyrimidiny jsou modifikované 2'F; G v polohách 6, 3, 12 a 14 jsou modifikované 2'OMe; A v polohách 7 a 10 jsou modifikované 2'OMe; vazba v polohách je 3'-3'.
<400> 50 gggaggacga ugcggaacaa ugcacucguc gccguaaugg auguuuugcu cccug 55 <210> 51 <211> 55 <212> RNA <213> Umělá sekvence <220>
<223> Popis umělé sekvence: Nukleová kyselina <220>
<221> modifikovaná báze <222> (1) .. (55) <223> Všechny pyrimidiny jsou modifikované 2'F; g v polohách 15 a 22 jsou modifikované 2'OMe; a v polohách 16-17, 19-20 a 24 jsou modifikované 2'0Me; vazba v polohách 55 a 56 je 3'-3 ' .
<400> 51 gggaggacga ugcggaacaa ugcacucguc gccguaaugg auguuuugcu cccug 55 <210> 52 <211> 55 <212> RNA <213> Umělá sekvence <220>
<223> Popis umělé sekvence: Nukleová kyselina <220>
<221> modifikovaná báze <222> (1)..(55) <223> Všechny pyrimidiny jsou modifikované 2'F; g v polohách 38, 41 a 44 jsou 2'OMe; vazba v polohách 55 a 56 je 3'-3'.
<400> 52 gggaggacga ugcggaacaa ugcacucguc gccguaaugg auguuuugcu cccug 55 <210> 53 <211> 55 <212> RNA <213> Umělá sekvence <220>
<223> Popis umělé sekvence: Nukleová kyselina <220>
<221> modifikovaná báze <222> (1).. (55) <223> Všechny pyrimidiny jsou modifikované 2'F; g v polohách 39-40, 43 a 48 jsou 2OMe; a’s v polohách 36-37 a 41 jsou 2'OMe; vazba v polohách 55 a 56 je 3'-3 ' .
<400> 53 gggaggacga ugcggaacaa ugcacucguc gccguaaugg auguuuugcu cccug 55 <210> 54 <2ll> 55 <212> RNA <213> Umělá sekvence <220>
<223> Popis umělé sekvence: Nukleová kyselina <220>
<221> modifikovaná báze <222> (1)..(55) <223> Všechny pyrimidiny jsou modifikované 2'F; g v polohách 1-3, 5-6, 9, 12, 14-15, 22, 28, 31, 34, 39-40, 43, 48 a 55 jsou 2'OMe.
<220>
- 65 <221> modifikovaná báze <222> (1)..(55) <223> a v polohách 7, 10, 16-17, 19-20, 24, 36-37, a 41 jsou 2'OMe; vazba v polohách 55 a 56 je 3'-3'.
<400> 54 gggaggacga ugcggaacaa ugcacucguc gccguaaugg auguuuugcu cccug 55 <210> 55 <211> 55 <212> RNA <213> Umělá sekvence <220>
<223> Popis umělé sekvence: Nukleová kyselina <220>
<221> modifikovaná báze <222> (1)..(55) <223> Všechny pyrimidiny jsou modifikované 2'F; g v polohách 1-3,
5-6, 9, 12, 14-15, 22, 39-40, 43, 48 a 55 jsou 2'OMe; a v polohách 4,7, 10, 16-17,19-20, 24-36-37, 40 jsou 2'0Me.
<220>
<221> modifikovaná báze <222> (1)..(55) <223> Vazba v polohách 55 a 56 je 3'-3'.
<400> 55 gggaggacga ugcggaacaa ugcacucguc gccguaaugg auguuuugcu cccug 55 <210> 56 <211> 55 <212> RNA <213> Umělá sekvence <220>
<223> Popis umělé sekvence: Nukleová kyselina <220>
<221> modifikovaná báze <222> (1)..(55) <223> Všechny pyrimidiny jsou modifikované 2'F; g v polohách 1-3,
5-6, 15, 22, 39-40, 43, 48 a 55 jsou 2'OMe; a v polohách 4, 16-17, • · J ·
- 66 19-20, 24 36-37 a 40 jsou 2'OMe; vazba v polohách 55 a 56 je 3'-3' .
<400> 56 gggaggacga ugcggaacaa ugcacucguc gccguaaugg auguuuugcu cccug 55 <210> 57 <211> 55 <212> RNA <213> Umělá sekvence <220>
<223> Popis umělé sekvence: Nukleová kyselina <220>
<221> modifikovaná báze <222> (1) .. (55) <223> Všechny pyrimidiny jsou modifikované 2'F; g v polohách 1-3, 5, 15, 22, 39-40, 43, 48, 55 jsou 2'OMe; a v polohách 4, 7, 16-17, 19-20, 24, 36-37, 40 jsou 2'0Me; vazba v polohách 55, 56 je 3'-3'.
<400> 57 gggaggacga ugcggaacaa ugcacucguc gccguaaugg auguuuugcu cccug 55 <210> 58 <211> 55 <212> RNA <213> Umělá sekvence <220>
<223> Popis umělé sekvence: Nukleová kyselina <220>
<221> modifikovaná báze <222> (1) .. (55) <223> Všechny pyrimidiny jsou modifikované 2'F; g v 1-3, 5, 9, 15, 22,
39-40, 43, 48, 55 jsou 2'0Me; a V 4, 16-17, 19-20, 24, 36-37, 41 jsou 2'0Me; vazba v 55, 56 je 3 '-3 ' .
<400> 58 gggaggacga ugcggaacaa ugcacucguc gccguaaugg auguuuugcu cccug 55
- 67 <210> 59 <211> 55 <212> RNA <213> Umělá sekvence <220>
<223> Popis umělé sekvence: Nukleová kyselina <220>
<221> modifikovaná báze <222> (1)..(55) <223> Všechny pyrimidiny jsou modifikované 2'F; g v 1-3, 5, 15, 22,
39-40, 43, 48 a 55 jsou 2'0Me; a v 4, 10, 16-17, 19-20, 24, 36-37, a 41 jsou 2'OMe; vazba v 55 a 56 je 3'-3'.
<400> 59 gggaggacga ugcggaacaa ugcacucguc gccguaaugg auguuuugcu cccug 55 <210> 60 <211> 55 <212> RNA <213> Umělá sekvence <220>
<223> Popis umělé sekvence: Nukleová kyselina <220>
<221> modifikovaná báze <222> (1)..(55) <223> Všechny pyrimidiny jsou modifikované 2'F; g v 1-3, 5, 12, 14-15,
22, 39-40, 43, 48 a 55 jsou 2'OMe; a v 4, 16-17, 19-20, 24, 36-37 a 41 jsou 2'OMe; vazba v 55 a 56 je 3'-3‘.
<400> 60 gggaggacga ugcggaacaa ugcacucguc gccguaaugg auguuuugcu cccug 55 <210> 61 <211> 55 <212> RNA <213> Umělá sekvence <220>
<223> Popis umělé sekvence: Nukleová kyselina <220>
<221> modifikovaná báze <222> (1)..(55) <223> Všechny pyrimidiny jsou modifikované 2'F; g v 1-3, 6, 15, 22,
28, 39-40, 43, 48, a 55 jsou 2'OMe; a v 4, 16-17, 19-20, 24, 36-37 a 40 jsou 2'OMe; vazba v 55 a 56 je 3'-3'.
<400> 61 gggaggacga ugcggaacaa ugcacucguc gccguaaugg auguuuugcu cccug 55 <210> 62 <211> 55 <212> RNA <213> Umělá sekvence <220>
<223> Popis umělé sekvence: Nukleová kyselina <220>
<221> modifikovaná báze <222> (1) .. (55) <223> Všechny pyrimidiny jsou modifikované 2'F; g v 1-3, 5, 15, 22,
39-40, 43, 48 a 55 jsou 2'0Me; a v 4, 16-17, 19-20, 27, 36-37 a 40 jsou 2'OMe; vazba v 55 a 56 je 3 '-3 ' .
<400> 62 gggaggacga ugcggaacaa ugcacucguc gccguaaugg auguuuugcu cccug 55 <210> 63 <211> 55 <212> RNA <213> Umělá sekvence <220>
<223> Popis umělé sekvence: Nukleová kyselina <220>
<221> modifikovaná báze <222> (1)..(55) <223> Všechny pyrimidiny jsou modifikované 2'F; g v 1-3, 5, 15, 22,
39-40, 43, 48 a 55 jsou 2'OMe; a v 4, 16-17,19-20, 24, 36-37, a 40 jsou 2'0Me; vazba v 55 a 56 je 3'-3' .
<400> 63 gggaggacga ugcggaacaa ugcacucguc gccguaaugg auguuuugcu cccug 55
<210> 64 <211> 39 <212> RNA <213> Umělá sekvence <220>
<223> Popis umělé sekvence: Nukleová kyselina <220>
<221> modifikovaná báze <222> (1) .. (39) <223> Všechny pyrimidiny jsou modifikované 2'F; g v polohách 2-3,
5-6, 23-24, 27, 32, a 39 jsou 2'0Me; a v polohách 4, 7, 20-21, a 25 j sou 2'OMe.
<220>
<221> modifikovaná báze <223> Vazba v polohách 39 a 40 je 3'-3'.
<220>
<221> modifikovaná báze <222> (1)..(39) <223> N v poloze 10 je (CH2CH20)6 <400> 64 gggaggacgn cgucgccgua auggauguuu ugcucccug 39 <210> 65 <211> 34 <212> RNA <213> Umělá sekvence <220>
<223> Popis umělé sekvence: Nukleová kyselina <220>
<221> modifikovaná báze <222> (1)..(34) <223> Všechny pyrimidiny jsou modifikované 2'F; g v polohách 2-3,
5-6, 23-24, 27 a 32 jsou 2'0Me; a v polohách 4, 7, 20-21, a 25 j sou 21OMe <220>
<221> modifikovaná báze <222> (1)..(34) <223> N v poloze 10 je (CH2CH2O)6
- 70 <220>
<221> modifikovaná báze <222> (1)..(34) <223> vazba v polohách 34 a 35 je 3' - 3' <400> 65 gggaggacgn cgucgccgua auggauguuu ugcu

Claims (43)

  1. PATENTOVÉ
    NÁROKY
    1. Ligandová nukleová kyselina k tenascinu-C identifikovaná způsobem, který obsahuje následující kroky:
    a) kandidátní směs nukleových kyselin se přivede do kontaktu s tenascinem-C, přičemž nukleová kyselina mající zvýšenou afinitu k tenascinu-C ve srovnání se zbytkem kandidátní směsi může být oddělena od zbytku kandidátní směsi,
    b) nukleové kyseliny se zvýšenou afinitou se oddělí od zbytku kandidátní směsi, c) nukleové kyseliny se zvýšenou afinitou se amplifikují,
    c) čímž se připraví směs nukleových kyselin obohacená nukleovými kyselinami s relativně vysokou afinitou a specifitou pro vazbu k tenascinu-C, čímž je identifikována ligandová nukleová kyselina k tenascinu-C.
  2. 2. Ligandová nukleová kandidátní směs nukleových nukleové kyseliny.
    kyselina podle nároku 1, kde kyselin obsahuje jednořetězcové
  3. 3. Ligandová nukleová kyselina podle nároku 2, kde jednořetězcové nukleové kyseliny jsou ribonukleové kyseliny.
  4. 4. Ligandová nukleová kyselina podle nároku 3, kde kandidátní směs nukleových kyselin obsahuje ribonukleové kyseliny modifikované 2'-fluoroskupinou.
  5. 5. Purifikovaná a izolovaná ligandová nukleová kyselina k tenascinu-C, která se nevyskytuje v přírodě.
    - 72
  6. 6. Purifikovaná a izolovaná ligandová nukleová kyselina k tenascinu-C, která se nevyskytuje v přírodě, podle nároku 5, kde ligandová nukleová kyselina je jednořetězcová.
  7. 7. Purifikovaná a izolovaná ligandová nukleová kyselina k tenascinu-C, která se nevyskytuje v přírodě, podle nároku 6, kde ligandová nukleová kyselina je RNA.
  8. 8. Purifikovaná a izolovaná ligandová RNA, která se nevyskytuje v přírodě, podle nároku 7, kde ligandová RNA obsahuje nukleotidy modifikované 2'-fluoroskupinou.
  9. 9. Purifikovaná a izolovaná ligandová RNA, která se nevyskytuje v přírodě, podle nároku 8, kde ligandová RNA je vybrána ze skupiny obsahující sekvence uvedené v tabulkách 3 a 4 a na obrázku 2.
  10. 10. Způsob identifikace ligandové nukleové kyseliny k tenascinu-C vyznačující se tím, že obsahuje kroky:
    a) kandidátní směs nukleových kyselin se přivede do kontaktu s tenascinem-C, přičemž nukleová . kyselina mající zvýšenou afinitu k tenascinu-C ve srovnání se zbytkem kandidátní směsi může být oddělena od zbytku kandidátní směsi,
    b) nukleové kyseliny se zvýšenou afinitou se oddělí od zbytku kandidátní směsi,
    c) nukleové kyseliny se zvýšenou afinitou se amplifikují, čímž se připraví směs nukleových kyselin obohacená nukleovými kyselinami s relativně vysokou afinitou a specifitou pro vazbu k tenascinu-C, čímž je identifikována ligandová nukleová kyselina k tenascinu-C.
    • · · · · · · *· · ·
  11. 11. Způsob podle nároku 10 vyznačující se tím, že dále obsahuje krok:
    d) opakují se kroky a), b), a c).
  12. 12. Způsob podle nároku 10 vyznačující se tím, že kandidátní směs nukleových kyselin je složena z jednořetězcových nukleových kyselin.
  13. 13. Způsob podle nároku 12 vyznačující se tím, že jednořetězcové nukleové kyseliny jsou ribonukleové kyseliny.
  14. 14. Způsob podle nároku 13 vyznačující se tím, že nukleové kyseliny jsou ribonukleové kyseliny modifikované 21-fluoroskupinou.
  15. 15. Komplex pro použití při in vivo diagnostice, který obsahuje ligandovou nukleovou kyselinu k tenascinu-C a markér.
  16. 16. Komplex podle nároku 15, kde ligandová nukleová kyselina k tenascinu-C byla identifikována způsobem, který obsahuje následující kroky:
    a) kandidátní směs nukleových kyselin se přivede do kontaktu s tenascinem-C, přičemž nukleová kyselina mající zvýšenou afinitu k tenascinu-C ve srovnání se zbytkem kandidátní směsi může být oddělena od zbytku kandidátní směsi,
    b) nukleové kyseliny se zvýšenou afinitou se oddělí od zbytku kandidátní směsi,
    c) nukleové kyseliny se zvýšenou afinitou se amplifikují, čímž se připraví směs nukleových kyselin obohacená nukleovými kyselinami s relativně vysokou afinitou a specifitou pro vazbu k tenascinu-C, čímž je kyselina k tenascinu-C.
    identifikována ligandová nukleová
  17. 17. Komplex podle nároku 16, kde kandidátní směs nukleových kyselin je složena z jednořetězcových nukleových kyselin.
  18. 18. Komplex podle nároku 17, kde jednořetězcové nukleové kyseliny jsou ribonukleové kyseliny.
  19. 19. Komplex podle nároku 18, kde nukleové kyseliny jsou ribonukleové kyseliny modifikované 21-fluoroskupinou.
  20. 20. Komplex podle nároku 15, kde markér je vybrán ze skupiny obsahující radionuklidy, fluorofory, magnetické sloučeniny a biotin.
  21. 21. Komplex podle nároku 20, kde radionuklid je vybrán ze skupiny obsahující technecium-99m, Re-188, Cu-64, Cu-67, F-18, 125I, 131I, inln, 32P, a 186Re.
  22. 22. Komplex podle nároku 21, kde markér je technecium-99m.
  23. 23. Komplex podle nároku 22, který dále obsahuje linker.
    - 75 • ·· · · · · · · * · ·
  24. 24. Komplex podle nároku 23, kde linker má následující strukturu:
    -O
    P _ O
    II o
  25. 25. Komplex podle nároku 24, který je následující:
    (CH2CH2O), linker •GC/ZC 97. uuGu gg-cgUu hexylaminový linker =2’ OH G
    U-G-3’-3'-T kde všechny A jsou modifikované skupinou 2'-OMe, všechny G, s výjimkou označených, jsou modifikované skupinou 2'-OMe, všechny C jsou modifikované skupinou 2'-F a všechny U jsou modifikované skupinou 2'-F.
    tím, že obsahuje následující
  26. 26. Způsob přípravy komplexu obsahujícího ligandovou nukleovou kyselinu k tenascinu-C a markér vyznačující se kroky:
    • · · · · 4
    a) kandidátní směs nukleových kyselin se přivede do kontaktu s tenascinem-C, přičemž nukleová kyselina mající zvýšenou afinitu k tenascinu-C ve srovnání se zbytkem kandidátní směsi může být oddělena od zbytku kandidátní směsi,
    b) nukleové kyseliny se zvýšenou afinitou se oddělí od zbytku kandidátní směsi,
    c) nukleové kyseliny se zvýšenou afinitou se amplifikují, čímž se připraví směs nukleových kyselin obohacená nukleovými kyselinami s relativně vysokou afinitou a specifitou pro vazbu k tenascinu-C, čímž je identifikována ligandová nukleová kyselina k tenascinu-C, a
    d) na ligandovou nukleovou kyselinu k tenascinu-C se kovalentně naváže markér.
  27. 27. Způsob podle nároku 26 vyznačující se tím, že markér je vybrán ze skupiny obsahující radionuklidy, fluorofory, magnetické sloučeniny a biotin.
  28. 28. Způsob podle nároku 27 vyznačující se tím, že radionuklid je vybrán ze skupiny obsahující Tc-99m, Re-188, Cu-64, Cu-67, F-18, 125I, 131I, 111In, 31 32P, a 186Re.
  29. 29. Způsob podle nároku 28 vyznačující se tím, že markér je Tc-99m.
  30. 30. Způsob podle nároku 29 vyznačující se tím, že dále obsahuje linker.
  31. 31. Způsob podle nároku 30 vyznačující se tím, že linker má následující strukturu:
    - 77 • · · · · · · · * · · • · · · · · · · · ·· ·
    -O
    O_ P __0 o
  32. 32. Způsob podle nároku 31 vyznačující se tím, že komplex je následující:
    (CH2CH2O), linker hexylaminový linker kde všechny A jsou modifikované skupinou 2'-OMe, všechny G, s výjimkou označených, jsou modifikované skupinou 2'-OMe, všechny C jsou modifikované skupinou 2'-F a všechny U jsou modifikované skupinou 2'-F.
  33. 33. Způsob detekce přítomnosti nemoci, při které je exprimován tenascin-C v biologické tkáni, která je nemocí zasažena, vyznačující se tím, že obsahuje následující kroky:
    * · • · »» · ·· ·» • ·· · · ··· * ·· ·
    - 78 a) identifikuje se ligandová nukleová kyselina z kandidátní směsi nukleových kyselin, přičemž tato ligandová nukleová kyselina je ligandem k tenascinu-C, způsobem kdy
    I) kandidátní směs nukleových kyselin se přivede do kontaktu s tenascinem-C, přičemž nukleová kyselina mající zvýšenou afinitu k tenascinu-C ve srovnání se zbytkem kandidátní směsi může být oddělena od zbytku kandidátní směsi,
    II) nukleové kyseliny se zvýšenou afinitou se oddělí od zbytku kandidátní směsi,
    III) nukleové kyseliny se zvýšenou afinitou se amplifikují, čímž se připraví směs nukleových kyselin obohacená o nukleové kyseliny s relativně vysokou afinitou a specifitou pro vazbu k tenascinu-C, čímž je identifikována ligandová nukleová kyselina k tenascinu-C, a
    b) na ligandovou nukleovou kyselinu k tenascinu-C identifikovanou v kroku III se kovalentně naváže markér použitelný pro in vivo diagnostiku, čímž se připraví komplex markér-ligandová nukleová kyselina,
    c) tkáň, která může obsahovat nádor, se vystaví komplexu markér-ligandová nukleová kyselina, a
    d) detekuje se přítomnost komplexu markér-ligandová nukleová kyselina ve tkáni, čímž je identifikována nemoc, při které je exprimován tenascin-C.
  34. 34. Způsob podle nároku 33 vyznačující se tím, že komplex markér-ligandová nukleová kyselina dále obsahuje linker.
  35. 35. Způsob podle nároku 34 vyznačující se tím, že markér je vybrán ze skupiny obsahující radionuklidy, fluorofory, magnetické sloučeniny a biotin.
    ·· ·· ·« » *4 4» • 4 · 4 · «·« 4 44 4
    4 * · 4 4 · 4 · 4« 4 · ·««· 44 44 44 4 44 44*4
  36. 36. Způsob podle nároku 35 vyznačující se tím, že radionuklid je vybrán ze skupiny obsahující Tc-99m, Re-188, Cu-64, Cu-67, F-18, 125I, 131I, U1ln, 32P, a 186Re.
  37. 37. Způsob podle nároku 36 vyznačující se tím, že markér je technecium-99m.
  38. 38. Způsob podle nároku 37 vyznačující se tím, že linker má následující strukturu:
    -O
  39. 39. Způsob podle nároku 38 vyznačující se tím, že komplex markér-ligandová nukleová kyselina je následuj ící:
    (CH2CH2O,6 linker •Gc/p 9¾ uUGu gg-cgUu
    A-U G“C o (5-C O-P-O-^GTC » U-G-3’-3’-T =2’0HG hexylaminový linker I kde všechny A jsou modifikované skupinou 2'-OMe, všechny G, s výjimkou označených, jsou modifikované skupinou 21-OMe, • · 94 9 9 • · · « · · • · · 9 9
    9 99999 9
    9 9 9 9
    994 9 99 99
    - 80 všechny C jsou modifikované skupinou 2'-F a všechny U jsou modifikované skupinou 2'-F.
  40. 40. Způsob podle nároku 33 vyznačující se tím, že dále obsahuje krok, kdy se ke komplexu naváže terapeutické nebo diagnostické činidlo.
  41. 41. Způsob podle nároku 33 vyznačující se tím, že nemoc je vybrána ze skupiny obsahující rakovinu, psoriázu a aterosklerózu.
  42. 42. Způsob podle nároku 41 vyznačující se tím, že nemoc je rakovina.
  43. 43. Způsob podávání terapeutického činidla při nemoci, kdy je exprimován tenascin-C, vyznačující se tím, že obsahuje kroky, kdy se ligandová nukleové kyseliny k tenascinu-C kovalentně naváže na terapeutické činidlo a vytvoří s ním komplex, a tento komplex se podává pacientovi.
CZ2002365A 1999-07-29 2000-01-28 Nukleové kyseliny jako ligandy tenascinu-C CZ2002365A3 (cs)

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US09/364,902 US6232071B1 (en) 1990-06-11 1999-07-29 Tenascin-C nucleic acid ligands

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CZ2002365A3 true CZ2002365A3 (cs) 2002-06-12

Family

ID=23436596

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CZ2002365A CZ2002365A3 (cs) 1999-07-29 2000-01-28 Nukleové kyseliny jako ligandy tenascinu-C

Country Status (29)

Country Link
US (4) US6232071B1 (cs)
EP (1) EP1198589B9 (cs)
JP (1) JP2003505111A (cs)
KR (1) KR100605072B1 (cs)
CN (2) CN1164760C (cs)
AT (1) ATE405675T1 (cs)
AU (1) AU767501C (cs)
BG (1) BG106361A (cs)
BR (1) BR0013170A (cs)
CA (1) CA2380473A1 (cs)
CZ (1) CZ2002365A3 (cs)
DE (1) DE60039986D1 (cs)
DK (1) DK1198589T3 (cs)
EA (1) EA004795B1 (cs)
EE (1) EE200200051A (cs)
ES (1) ES2310989T3 (cs)
HK (1) HK1048499B (cs)
HR (1) HRP20020186A2 (cs)
HU (1) HUP0202221A3 (cs)
IL (2) IL147872A0 (cs)
MX (1) MXPA02000819A (cs)
NO (1) NO20020424L (cs)
NZ (2) NZ516907A (cs)
PL (1) PL201637B1 (cs)
RS (1) RS50426B (cs)
SK (1) SK1222002A3 (cs)
UA (1) UA75578C2 (cs)
WO (1) WO2001009390A1 (cs)
ZA (1) ZA200200747B (cs)

Families Citing this family (27)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6232071B1 (en) * 1990-06-11 2001-05-15 Gilead Sciences, Inc. Tenascin-C nucleic acid ligands
US7005260B1 (en) * 2000-01-28 2006-02-28 Gilead Sciences, Inc. Tenascin-C nucleic acid ligands
CA2328356A1 (en) * 1999-12-22 2001-06-22 Itty Atcravi Recreational vehicles
US7645743B2 (en) * 1999-12-22 2010-01-12 Altermune, Llc Chemically programmable immunity
DK2070939T3 (da) 2001-05-25 2014-06-23 Univ Duke Modulatorer af farmakologiske midler
US20040249130A1 (en) * 2002-06-18 2004-12-09 Martin Stanton Aptamer-toxin molecules and methods for using same
US20040022727A1 (en) * 2002-06-18 2004-02-05 Martin Stanton Aptamer-toxin molecules and methods for using same
US8039443B2 (en) * 2002-11-21 2011-10-18 Archemix Corporation Stabilized aptamers to platelet derived growth factor and their use as oncology therapeutics
US8853376B2 (en) 2002-11-21 2014-10-07 Archemix Llc Stabilized aptamers to platelet derived growth factor and their use as oncology therapeutics
US10100316B2 (en) 2002-11-21 2018-10-16 Archemix Llc Aptamers comprising CPG motifs
US7727969B2 (en) * 2003-06-06 2010-06-01 Massachusetts Institute Of Technology Controlled release nanoparticle having bound oligonucleotide for targeted delivery
WO2006093932A2 (en) * 2005-03-01 2006-09-08 Cedars-Sinai Medical Center Use of eotaxin as a diagnostic indicator for atherosclerosis and vascular inflammation
UY29460A1 (es) * 2005-04-08 2006-11-30 Noxxon Pharma Ag Acidos nucleicos de union a ghrelin
EP1897562A1 (en) * 2006-09-08 2008-03-12 Bayer Schering Pharma Aktiengesellschaft Aptamers labelled with Gallium-68
MX2009002492A (es) 2006-09-08 2009-08-28 Bayer Schering Pharma Ag Agentes que comprenden compuestos marcados con 18f y metodos relacionados.
US20110136099A1 (en) 2007-01-16 2011-06-09 Somalogic, Inc. Multiplexed Analyses of Test Samples
US8975026B2 (en) 2007-01-16 2015-03-10 Somalogic, Inc. Method for generating aptamers with improved off-rates
CN101802225B (zh) * 2007-07-17 2013-10-30 私募蛋白质体公司 检测样品的多元分析
EP2036981A1 (en) * 2007-09-12 2009-03-18 Bayer Schering Pharma Aktiengesellschaft Aptamers labeled with 18F
CN102459298A (zh) 2009-05-05 2012-05-16 阿尔特姆恩科技责任有限公司 化学可编程免疫
US8841429B2 (en) 2009-11-03 2014-09-23 Vivonics, Inc. Nucleic acid ligands against infectious prions
US8236570B2 (en) 2009-11-03 2012-08-07 Infoscitex Methods for identifying nucleic acid ligands
GB201114662D0 (en) 2011-08-24 2011-10-12 Altermune Technologies Llc Chemically programmable immunity
BR112014014295A2 (pt) * 2011-12-12 2017-06-13 Isis Innovation método para determinar um estado de artrite reumatoide, kit para a determinação o estado de artrite reumatoide erosiva de um indivíduo, usos de tenancina-c, e de uma determinação do nível de tenascina-c, e, métodos para tratar uma condição inflamatória, e uma artrite reumatoide
CN102533772B (zh) * 2011-12-12 2013-10-09 中国科学院武汉病毒研究所 一种抗hbv诱饵适体及其筛选方法
KR102213609B1 (ko) 2012-07-13 2021-02-08 웨이브 라이프 사이언시스 리미티드 키랄 제어
CN107058596A (zh) * 2017-06-19 2017-08-18 上海市第十人民医院 一种与恶性胶质瘤诊断相关的标志物及其应用

Family Cites Families (16)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE229046T1 (de) 1985-03-30 1987-12-17 Marc Genf/Geneve Ballivet Verfahren zum erhalten von dns, rns, peptiden, polypeptiden oder proteinen durch dns-rekombinant-verfahren.
WO1989006694A1 (en) 1988-01-15 1989-07-27 Trustees Of The University Of Pennsylvania Process for selection of proteinaceous substances which mimic growth-inducing molecules
US6610841B1 (en) * 1997-12-18 2003-08-26 Gilead Sciences, Inc. Nucleotide-based prodrugs
US5496938A (en) * 1990-06-11 1996-03-05 Nexstar Pharmaceuticals, Inc. Nucleic acid ligands to HIV-RT and HIV-1 rev
US6127119A (en) * 1990-06-11 2000-10-03 Nexstar Pharmaceuticals, Inc. Nucleic acid ligands of tissue target
ES2259800T3 (es) * 1990-06-11 2006-10-16 Gilead Sciences, Inc. Procedimientos de uso de ligandos de acido nucleico.
US5789157A (en) * 1990-06-11 1998-08-04 Nexstar Pharmaceuticals, Inc. Systematic evolution of ligands by exponential enrichment: tissue selex
US6232071B1 (en) * 1990-06-11 2001-05-15 Gilead Sciences, Inc. Tenascin-C nucleic acid ligands
JPH06508022A (ja) 1991-02-21 1994-09-14 ギリアド　サイエンシズ，インコーポレイテッド 生体分子に特異的なアプタマーおよび生産方法
US5683874A (en) * 1991-03-27 1997-11-04 Research Corporation Technologies, Inc. Single-stranded circular oligonucleotides capable of forming a triplex with a target sequence
US5582981A (en) * 1991-08-14 1996-12-10 Gilead Sciences, Inc. Method for identifying an oligonucleotide aptamer specific for a target
US5436132A (en) * 1993-02-13 1995-07-25 Amano Pharmaceutical Co., Ltd. Quantitative determination of tenascin as glioma marker
US5859228A (en) * 1995-05-04 1999-01-12 Nexstar Pharmaceuticals, Inc. Vascular endothelial growth factor (VEGF) nucleic acid ligand complexes
US6229002B1 (en) * 1995-06-07 2001-05-08 Nexstar Pharmaceuticlas, Inc. Platelet derived growth factor (PDGF) nucleic acid ligand complexes
RU2177950C2 (ru) * 1996-10-25 2002-01-10 Нексстар Фармасьютикалз, Инк. Комплексы нуклеиновых кислот - лигандов сосудистого эндотелиального фактора роста (vegf)
US6242246B1 (en) * 1997-12-15 2001-06-05 Somalogic, Inc. Nucleic acid ligand diagnostic Biochip

Also Published As

Publication number Publication date
EP1198589B1 (en) 2008-08-20
JP2003505111A (ja) 2003-02-12
YU6402A (sh) 2005-03-15
CA2380473A1 (en) 2001-02-08
SK1222002A3 (en) 2002-09-10
KR100605072B1 (ko) 2006-07-26
NZ528077A (en) 2005-04-29
AU767501C (en) 2004-06-17
CN1365395A (zh) 2002-08-21
DK1198589T3 (da) 2008-11-17
US20060105378A1 (en) 2006-05-18
US20030104377A1 (en) 2003-06-05
HRP20020186A2 (en) 2004-02-29
HK1048499A1 (zh) 2003-04-04
NO20020424L (no) 2002-03-27
PL353357A1 (pl) 2003-11-17
UA75578C2 (en) 2006-05-15
DE60039986D1 (de) 2008-10-02
AU3351900A (en) 2001-02-19
HUP0202221A1 (en) 2002-10-28
US6232071B1 (en) 2001-05-15
BG106361A (bg) 2002-10-31
ATE405675T1 (de) 2008-09-15
PL201637B1 (pl) 2009-04-30
ES2310989T3 (es) 2009-02-01
EE200200051A (et) 2003-04-15
EA200200094A1 (ru) 2002-08-29
EP1198589B9 (en) 2009-08-12
KR20020092897A (ko) 2002-12-12
US6596491B2 (en) 2003-07-22
EA004795B1 (ru) 2004-08-26
NO20020424D0 (no) 2002-01-28
IL147872A (en) 2008-06-05
CN1164760C (zh) 2004-09-01
WO2001009390A1 (en) 2001-02-08
ZA200200747B (en) 2004-01-28
HK1048499B (zh) 2005-05-13
AU767501B2 (en) 2003-11-13
IL147872A0 (en) 2002-08-14
CN100558411C (zh) 2009-11-11
CN1589908A (zh) 2005-03-09
RS50426B (sr) 2009-12-31
NZ516907A (en) 2003-10-31
BR0013170A (pt) 2002-04-02
EP1198589A1 (en) 2002-04-24
US20040058884A1 (en) 2004-03-25
HUP0202221A3 (en) 2010-01-28
EP1198589A4 (en) 2003-02-19
MXPA02000819A (es) 2003-07-14

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CZ2002365A3 (cs) Nukleové kyseliny jako ligandy tenascinu-C
JP4176466B2 (ja) 前立腺特異的膜抗原に対する核酸リガンド
US6699843B2 (en) Method for treatment of tumors using nucleic acid ligands to PDGF
ES2426160T3 (es) Complejos de ligandos de ácidos nucleicos de factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF)
JP2021521796A (ja) 高コレステロール血症及び関連状態を治療するための、ｐｃｓｋ９を標的とするオリゴヌクレオチド
JP2003506024A (ja) 肝細胞増殖因子／細胞分散因子（ＨＧＦ）又はその受容体ｃ−ｍｅｔ、及びインテグリン類に対する核酸リガンド
JP2008536485A (ja) Ｐｓｍａに対する安定化したアプタマーおよび前立腺癌治療薬としてのそれらの使用
US11479772B2 (en) Thiomorpholino oligonucleotides for the treatment of muscular dystrophy
TW201103983A (en) Aptamer against chymase and use thereof
KR20140083039A (ko) 글루카곤 결합형 핵산
WO2009033876A1 (en) Aptamers labeled with 18f
WO2001087351A1 (en) Method for treatment of tumors using nucleic acid ligands to pdgf
US7005260B1 (en) Tenascin-C nucleic acid ligands