RS50426B - Tenascin -c ligandi nukleinske kiseline - Google Patents

Tenascin -c ligandi nukleinske kiseline

Info

Publication number
RS50426B
RS50426B YUP-64/02A YUP6402A RS50426B RS 50426 B RS50426 B RS 50426B YU P6402 A YUP6402 A YU P6402A RS 50426 B RS50426 B RS 50426B
Authority
RS
Serbia
Prior art keywords
tenascin
complex
ligand
nucleic acid
ligands
Prior art date
Application number
YUP-64/02A
Other languages
English (en)
Inventor
Brian HICKE
Stephen WARREN
David PARMA
Larry GOLD
Original Assignee
Gilead Sciences Inc.,
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Gilead Sciences Inc., filed Critical Gilead Sciences Inc.,
Publication of YU6402A publication Critical patent/YU6402A/sh
Publication of RS50426B publication Critical patent/RS50426B/sr

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/115—Aptamers, i.e. nucleic acids binding a target molecule specifically and with high affinity without hybridising therewith ; Nucleic acids binding to non-nucleic acids, e.g. aptamers
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/54—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic compound
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/54—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic compound
    • A61K47/547—Chelates, e.g. Gd-DOTA or Zinc-amino acid chelates; Chelate-forming compounds, e.g. DOTA or ethylenediamine being covalently linked or complexed to the pharmacologically- or therapeutically-active agent
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/54—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic compound
    • A61K47/549—Sugars, nucleosides, nucleotides or nucleic acids
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A61P17/06—Antipsoriatics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A61P9/10—Drugs for disorders of the cardiovascular system for treating ischaemic or atherosclerotic diseases, e.g. antianginal drugs, coronary vasodilators, drugs for myocardial infarction, retinopathy, cerebrovascula insufficiency, renal arteriosclerosis
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B82—NANOTECHNOLOGY
    • B82Y—SPECIFIC USES OR APPLICATIONS OF NANOSTRUCTURES; MEASUREMENT OR ANALYSIS OF NANOSTRUCTURES; MANUFACTURE OR TREATMENT OF NANOSTRUCTURES
    • B82Y5/00—Nanobiotechnology or nanomedicine, e.g. protein engineering or drug delivery
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
    • C07H19/00—Compounds containing a hetero ring sharing one ring hetero atom with a saccharide radical; Nucleosides; Mononucleotides; Anhydro-derivatives thereof
    • C07H19/02—Compounds containing a hetero ring sharing one ring hetero atom with a saccharide radical; Nucleosides; Mononucleotides; Anhydro-derivatives thereof sharing nitrogen
    • C07H19/04—Heterocyclic radicals containing only nitrogen atoms as ring hetero atom
    • C07H19/06—Pyrimidine radicals
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
    • C07H19/00—Compounds containing a hetero ring sharing one ring hetero atom with a saccharide radical; Nucleosides; Mononucleotides; Anhydro-derivatives thereof
    • C07H19/02—Compounds containing a hetero ring sharing one ring hetero atom with a saccharide radical; Nucleosides; Mononucleotides; Anhydro-derivatives thereof sharing nitrogen
    • C07H19/04—Heterocyclic radicals containing only nitrogen atoms as ring hetero atom
    • C07H19/06—Pyrimidine radicals
    • C07H19/10—Pyrimidine radicals with the saccharide radical esterified by phosphoric or polyphosphoric acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
    • C07H21/00—Compounds containing two or more mononucleotide units having separate phosphate or polyphosphate groups linked by saccharide radicals of nucleoside groups, e.g. nucleic acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/001—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof by chemical synthesis
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
    • C12N15/1034—Isolating an individual clone by screening libraries
    • C12N15/1048—SELEX
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/10—Transferases (2.)
    • C12N9/12—Transferases (2.) transferring phosphorus containing groups, e.g. kinases (2.7)
    • C12N9/1241—Nucleotidyltransferases (2.7.7)
    • C12N9/1276—RNA-directed DNA polymerase (2.7.7.49), i.e. reverse transcriptase or telomerase
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/34—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving hydrolase
    • C12Q1/37—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving hydrolase involving peptidase or proteinase
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/531—Production of immunochemical test materials
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/531—Production of immunochemical test materials
    • G01N33/532—Production of labelled immunochemicals
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/531—Production of immunochemical test materials
    • G01N33/532—Production of labelled immunochemicals
    • G01N33/535—Production of labelled immunochemicals with enzyme label or co-enzymes, co-factors, enzyme inhibitors or enzyme substrates
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/569—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for microorganisms, e.g. protozoa, bacteria, viruses
    • G01N33/56983—Viruses
    • G01N33/56988—HIV or HTLV
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/74—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving hormones or other non-cytokine intercellular protein regulatory factors such as growth factors, including receptors to hormones and growth factors
    • G01N33/76—Human chorionic gonadotropin including luteinising hormone, follicle stimulating hormone, thyroid stimulating hormone or their receptors
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K2123/00—Preparations for testing in vivo
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/10—Type of nucleic acid
    • C12N2310/13—Decoys
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/31—Chemical structure of the backbone
    • C12N2310/317—Chemical structure of the backbone with an inverted bond, e.g. a cap structure
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/31—Chemical structure of the backbone
    • C12N2310/318—Chemical structure of the backbone where the PO2 is completely replaced, e.g. MMI or formacetal
    • C12N2310/3183—Diol linkers, e.g. glycols or propanediols
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/32—Chemical structure of the sugar
    • C12N2310/321—2'-O-R Modification
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/32—Chemical structure of the sugar
    • C12N2310/322—2'-R Modification
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/35—Nature of the modification
    • C12N2310/351—Conjugate
    • C12N2310/3517—Marker; Tag
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/50—Physical structure
    • C12N2310/53—Physical structure partially self-complementary or closed
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2541/00—Reactions characterised by directed evolution
    • C12Q2541/10—Reactions characterised by directed evolution the purpose being the selection or design of target specific nucleic acid binding sequences
    • C12Q2541/101—Selex
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/158—Expression markers
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C40—COMBINATORIAL TECHNOLOGY
    • C40B—COMBINATORIAL CHEMISTRY; LIBRARIES, e.g. CHEMICAL LIBRARIES
    • C40B40/00—Libraries per se, e.g. arrays, mixtures
    • F—MECHANICAL ENGINEERING; LIGHTING; HEATING; WEAPONS; BLASTING
    • F02—COMBUSTION ENGINES; HOT-GAS OR COMBUSTION-PRODUCT ENGINE PLANTS
    • F02B—INTERNAL-COMBUSTION PISTON ENGINES; COMBUSTION ENGINES IN GENERAL
    • F02B75/00—Other engines
    • F02B75/02—Engines characterised by their cycles, e.g. six-stroke
    • F02B2075/022—Engines characterised by their cycles, e.g. six-stroke having less than six strokes per cycle
    • F02B2075/027—Engines characterised by their cycles, e.g. six-stroke having less than six strokes per cycle four
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/005—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from viruses
    • G01N2333/08—RNA viruses
    • G01N2333/15—Retroviridae, e.g. bovine leukaemia virus, feline leukaemia virus, feline leukaemia virus, human T-cell leukaemia-lymphoma virus
    • G01N2333/155—Lentiviridae, e.g. visna-maedi virus, equine infectious virus, FIV, SIV
    • G01N2333/16—HIV-1, HIV-2
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/005—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from viruses
    • G01N2333/08—RNA viruses
    • G01N2333/15—Retroviridae, e.g. bovine leukaemia virus, feline leukaemia virus, feline leukaemia virus, human T-cell leukaemia-lymphoma virus
    • G01N2333/155—Lentiviridae, e.g. visna-maedi virus, equine infectious virus, FIV, SIV
    • G01N2333/16—HIV-1, HIV-2
    • G01N2333/163—Regulatory proteins, e.g. tat, nef, rev, vif, vpu, vpr, vpt, vpx
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/435—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans
    • G01N2333/475—Assays involving growth factors
    • G01N2333/50—Fibroblast growth factors [FGF]
    • G01N2333/503—Fibroblast growth factors [FGF] basic FGF [bFGF]
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/435—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans
    • G01N2333/575—Hormones
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/435—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans
    • G01N2333/575—Hormones
    • G01N2333/62—Insulins
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/81—Protease inhibitors
    • G01N2333/8107—Endopeptidase (E.C. 3.4.21-99) inhibitors
    • G01N2333/811—Serine protease (E.C. 3.4.21) inhibitors
    • G01N2333/8121—Serpins
    • G01N2333/8125—Alpha-1-antitrypsin
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/90—Enzymes; Proenzymes
    • G01N2333/914—Hydrolases (3)
    • G01N2333/948—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
    • G01N2333/95—Proteinases, i.e. endopeptidases (3.4.21-3.4.99)
    • G01N2333/964—Proteinases, i.e. endopeptidases (3.4.21-3.4.99) derived from animal tissue
    • G01N2333/96425—Proteinases, i.e. endopeptidases (3.4.21-3.4.99) derived from animal tissue from mammals
    • G01N2333/96427—Proteinases, i.e. endopeptidases (3.4.21-3.4.99) derived from animal tissue from mammals in general
    • G01N2333/9643—Proteinases, i.e. endopeptidases (3.4.21-3.4.99) derived from animal tissue from mammals in general with EC number
    • G01N2333/96433—Serine endopeptidases (3.4.21)
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/90—Enzymes; Proenzymes
    • G01N2333/914—Hydrolases (3)
    • G01N2333/948—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
    • G01N2333/95—Proteinases, i.e. endopeptidases (3.4.21-3.4.99)
    • G01N2333/964—Proteinases, i.e. endopeptidases (3.4.21-3.4.99) derived from animal tissue
    • G01N2333/96425—Proteinases, i.e. endopeptidases (3.4.21-3.4.99) derived from animal tissue from mammals
    • G01N2333/96427—Proteinases, i.e. endopeptidases (3.4.21-3.4.99) derived from animal tissue from mammals in general
    • G01N2333/9643—Proteinases, i.e. endopeptidases (3.4.21-3.4.99) derived from animal tissue from mammals in general with EC number
    • G01N2333/96433—Serine endopeptidases (3.4.21)
    • G01N2333/96441—Serine endopeptidases (3.4.21) with definite EC number
    • G01N2333/96455—Kallikrein (3.4.21.34; 3.4.21.35)
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/90—Enzymes; Proenzymes
    • G01N2333/914—Hydrolases (3)
    • G01N2333/948—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
    • G01N2333/966—Elastase
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/90—Enzymes; Proenzymes
    • G01N2333/914—Hydrolases (3)
    • G01N2333/948—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
    • G01N2333/972—Plasminogen activators
    • G01N2333/9726—Tissue plasminogen activator
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/90—Enzymes; Proenzymes
    • G01N2333/914—Hydrolases (3)
    • G01N2333/948—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
    • G01N2333/974—Thrombin
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/90—Enzymes; Proenzymes
    • G01N2333/914—Hydrolases (3)
    • G01N2333/948—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
    • G01N2333/976—Trypsin; Chymotrypsin

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Crystallography & Structural Chemistry (AREA)
  • Nanotechnology (AREA)
  • Virology (AREA)

Abstract

Kompleks koji sadrži ligand nukleinska kiselina za tenascin-C. naznačen time, što je (a) navedeni ligand odabran od grupe koja se sastoji od sekvenci sa SEQ ID NOs:4-64;(b) je navedeni ligand vise od 70% homologan sa i ima suštinski istu sposobnost da veze tenascin-C kao ligand iz (a); ili(c) navedeni ligand ima suštinski istu strukturu kao što je dato upotrebom NMR ili putem slaganja sekvence upotrebom Zukerfold programa i ima suštinski istu sposobnost da veze tenascin-C kao ligand iz (a);i marker. Prijava sadrži 3 nezavisna i 16 zavisnih patentnih zahteva,

Description

OBLASTPRONALASKA
Ovde se opisuju ligandi nukleinske kiseline visokog afiniteta za tenascin-C.
Takođe se opisuju postupci za identifikovanje i izradu liganada nukleinskih
kiselina visokog afiniteta za tenascin-C. Postupak koji se koristi ovde za identifikovanje takvih liganada nukleiniskih kiselina naziva se SELEX, akronim za Svstematic Evolution of Ligands by Exponential enrichment (Sistemska evolucija liganada eksponencijalnim obogaćivanjem). Osim toga otkrivaju se ligandi nukleinske kiseline visokog afiniteta za tenascin-C. Dalje se otkrivaju RNK ligandi za tenascin-C. Isto tako su obuhvaćeni oligonukleotidi koji sadrže nukleotidne derivate koji su modifikovani u 2'-položajima purina i pirimidina.
Pored toga otkriveni su RNK ligandi za tenascin-C koji sadrže 2'-F i 2'Ome modifikacije. Oligonukleotidi ovog pronalaska su korisni kao dijagnostički i/ili terapijski agensi.
STANJE TEHNIKE
Tenascin-C je 1,1-1,5 miliona Da, heksamerni glikoprotein koji je lociran naročito
u ekstraćelijskom matriksu. Tenascin-C se eksprimuje u toku embriogeneze, zaličivanja rane, i neoplazije, sugerišući ulogu za ovaj protein u ponovnom modelovanju tkiva (Erickson i Bourdon (1989) Ann Rev Cell Biol 5:71-92).
Neoplastični procesi takođe obuhvataju ponovno modelovanje tkiva, i tenascin-C se preterano eksprimuje kod mnogih tipova tumora koji obuhvataju karcinome pluća, grudi, prostate, i debelog creva, astrocitome, glioblastome, melanome, i sarkome (Soini i sar. (1993) Ara J Clin Pathol 100(2): 145-50; Koukoulis i sar.
(1991) Hum. Pathol 22(7):636-43; Borsi i sar. (1992) lnt J Cancer 52(5):688-92; Koukoulis i sar, (1993) J Submicrose Cytol Pathol 25(2):285-95; ibrahim i sar.
(1993) Hum Pathol: 24(9):982-9; Riedl i sar (1998) Dis Colon Rectum 41(1):86-92; Tuominen i Kallioinen (1994) J Cutan Pathol 21(5):424-9; Natali i sar. (1990) lnt J Cancer 46(4):586-90; Zagzag i sar. (1995) Cancer Res 55(4):907-14; Hasegavva i sar. (1997) Acta Neuropathol (Beri) 93(5):431-7: Saxon i sar. (1997) Pediatr Pathol Lab Med 17(2):259-66; Hasegavva i sar. (1995 Hum Pathol 26(8):838-45). Uz to, tenascin-C se preterano eksprimuje kod hiperprpliferativnih kožnih bolesti, na pr. psorijaze (Schalkvvijk i sar. (1991) Br J Dermatol 124(1): 13-20), i kod aterosklcrotičnih iezija (Fukumoto i sar. (1998) J Atheroscler Thromb 5(l):29-35: Wallner i sar. (1999) Circulation 99(10): 1284-9). Radio obeležena antitela koja vezuju tenascin-C su primenjena za snimanje i lečenje tumora u kliničkim utvrđivanjima (Paganelli i sar. (1999) Eur J NucI Med 26(4):348-57; Paganelli i sar. (1994) Eur J NucI Med 21(4):314-21; Bigner i sar. (1998) J Clin Oncol 6(6):2202-12; Nerlo i sar. (1997) lnt J Cancer 71 (5):810-6).
Aptameri protiv tenascina-C imaju potencijalnu korisnost za dijagnozu i lečenje kancera kao lečenje ateroskleroze i lečenje psorijaze. U odnosu na antitela, aptameri su mali (7-20 kDa), izlaze iz krvi vrlo brzo, i hemijski mogu da se sintetizuju. Brzo izlaženje iz krvi je važno zain vivodijagnostičko snimanje, gde su krvni nivoi primarna determinanta pozadine koja zamračuje sliku. Brzo uklanjanje iz krvi može da bude takođe važno u lečenju, gde krvni nivoi mogu da doprinesu toksičnosti. SELEX tehnologija dopušta brzo izolovanje aptamera, i hemijska sinteza omogućava lako i za nešto specifično konjugovanje aptamera za veliki broj različitih inertnih i bioaktivnih molekula. Aptamer za tenascin-C bi stoga bio koristan za lečenje tumora iliin vivoiliex vivodijagnostičko snimanje i/ili za oslobađanje različitih terapijskih agenasa kompleksiranih sa tenascin-C Ugandom nukleinskom kiselinom za lečenje bolesnih stanja u kojima se
eksprimuje tenascin-C. Mnogo godina je bila dogma da nukleinske kiseline imaju najpre informacionu ulogu. Putem postupka poznatog kao Svstematic Evolution of Ligands by Exponential enrichment, koja je nazvana SELEX postupak, postalo je jasno da nukleinske kiseline imaju trodimenzionalnu strukturalnu različitost koja je drukčija od proteina. SELEx postupak je postupak za in vitro razvijanje molekula nukleinske kiseline sa visoko specifičnim vezivanjem za ciljne molekule i opisan je u United States Application Serial No. 07/536.428, prijavljena juna 11, 1990, pod naslovom "Sistematsko razvijanje liganada eksponencijalnim obogaćivanjem," sada napuštenim, United States Patent No. 5,475,096 pod naslovom "Ligandi nukleinske kiseline", United States Patent No. 5,270,163 (vidi takođe i WO 91/19183) pod naslovom "Postupci za identifikovanje liganada nukleinske kiseline", od kojih je svaki u njegovoj celini specifično imet ovde referencom. Svaka od ovih prijava, kolektivno se ubrajaju ovde kao SELEX patentne prijave, opisuje fundamentalno novi postupak za izradu liganda nukleinske kiseline za bilo koji željeni ciljni molekul. SELEX postupak daje klasu proizvoda koji se navode kao ligandi nukleinske kiseline ili aptameri, pri čemu svaki ima jedinstvenu sekvencu, i koji imaju svojstvo vezivanja specifično za željeno ciljno jedinjenje ili molekul. Svaki SELEX-identifikovan ligand nukleinska kiselina je specifičan ligand datog ciljnog jedinjenja ili molekula. SELEX postupak je zasnovan na jedinstvenom uvidu da nukleinske kiseline imaju dovoljan kapacitet za obrazovanje različite dvo- ili tro-dimenzionalne^strukture i dovoljno hemijske različitosti raspoložive unutar njihovih monomera da deluju kao ligandi (obrazuju specifične vezujuće parove) sa praktično bilo kojim hemijskim jedinjenjem, bilo monomemim ili polimernim. Molekuli svake
veličine ili sastava mogu da služe kao ciljevi u SELEX postupku. SELEX postupak primenjen na primenu vezivanja visokog afiniteta uključuje selekciju iz smeše kandidata oligonukleotida i postupna ponavaljanja vezivanja, raspodele i amplifikacije, upotrebljavajući istu opštu šemu selekcije, da se postigne praktično svaki željeni kriterijum afiniteta vezivanja i selektivnosti. Polazeći od smeše nukleinskih kiselina, koja prvenstveno sadrži segment nasumične sekvence, SELEX postupak obuhvata stupnjeve dovođenja u dodir smeše sa ciljem pod uslovima povoljnim za vezivanje, odvajanje nevezanih nukleinskih kiselina iz tih nukleinskih kiselina koje su bile vezane specifično za ciljne molekule, disociranje nukleinske kiseline-ciljni kompleksi, amplifikaciju nukleinskih kiselina koje su
đisocirale iz nukleinska kiselina-ciljnih kompleksa da se dobije smeša nukleinskih kiselina obogaćena Ugandom, potom ponovnog ponavljanja stupnjeva vezivanja, odvajanja, đisociranja i amplifikacije pomoću onoliko ciklusa koliko se želi da se dobiju visoko specifični ligandi nukleinske kiseline visokog afiniteta prema ciljnom molekulu.
Bilo je zapaženo od strane ovih pronalazača da SELEX postupak pokazuje da nukleinske kiseline kao hemijska jedinjenja mogu da obrazuju široki skup oblika, veličina i konfiguracija, i u stanju su da pruže daleko širi repertoar vezivanja i drugih funkcija od onih koje ispoljavaju nukleinske kiseline u biološkim sistemima.
Osnovni SELEX postupak je bio modifikovan da se postignu brojni specifični ciljevi. Na primer, United States Patent Application No. 07/960,093, prijavljena oktobra 14, 1992, sada napuštena, i United Stats Patent No. 5,707,796? oba pod naslovom "Postuak za izbor nukleinskih kiselina na bazi strukture", opisuju upotrebu SELEX postupka u spoju sa gel elektroforezom da se izdvoje molekuli nukleinskih kiselina sa specifičnim strukturalnim karakteristikama, takvim kao izvijena DNK. United States Patent Application Serial No. 08/123,935 prijavljena septembra 17, 1993, pod naslovom "Fotoselekcija liganada nukleinskih kiselina", sada napuštena, United States Patent Application No. 5,763,177, pod naslovom
"Sistematsko razvijanje liganada eksponencijalnim obogaćivanjem: Fotoselekcija liganada nukleinskih kiselina i rešenje SELEX" i United States Patent Application Serial No. 09/093,293, prijavljena juna 8, 1998, pod naslovom "Sistematski razvoj liganada eksponencijalnim obogaćivanjem: Fotoselekcija liganada nukleinskih
kiselina i rešenje SELEX", opisuju SELEX koji se zasniva na postupku za selekciju liganada nukleinskih kiselina koji sadrže fotoreaktivne grupe sposobne da se vezuju i/ili fotoumreženo vezuju za i/ili fotoinaktivišu ciljni molekul. United States Patent Application No. 5,580,737, pod naslovom "Ligandi nukleinske kiseline visokog afiniteta koji vrše razliku između teofilina i kafeina", opisuje postupak, koji je označen Counter-SELEX, za identifikovanje visoko specifičnih liganada nukleiniskih kiselina koji su sposobni da vrše razliku između blisko srodnih molekula, koji mogu biti nepeptiđni. United States Patent No. 5,567,588, pod naslovom "Sistematski razvoj liganada pomoću eksponencijalnog obogaćivanja: Rešenje SELEX", opisuje SELEX koji bazira na postupku koji postiže visoko delotvorno odvajanje između oligonukleotida koji imaju visok i nizak afinitet za ciljni molekul.
SELEX postupak obuhvata identifikaciju nukleinskih kiselina kao liganda visokog afiniteta koji sadrže modifikovane nukleotide koji daju poboljšane karakteristike Ugandu, takve kao poboljšanuin vivostabilnost ili poboljšane karakteristike oslobađanja. Primere takvih modifikacija obuhvataju hemijske supstitucije na ribozi i/ili fosfatu i/ili baznim delovima. SELEX postupkom identifikovane nukleinske kiseline kao ligandi koji sadrže modifikovane nukleotide opisani su u United States Patent-u No. 5,660,985, pod naslovom "Nukleinske kiseline kao ligandi visokog afiniteta koji sadrže modifikovane nukleotide", koji opisuje oligonukleotide koji sadrže derivate hemijski modifikovane u 5- i 2-položajima pirimidina. United States Patent No. 5,580,737, supra, opisuje visoko specifične nukleinske kiseline kao ligande koji sadrže jedan ili više nukleotida modifikovanih sa 2'-amino (2'-NH2), 2'-fluoro (2'-F), i/ili 2'-0-metil (2'-Me). United States Patent Serial No. 08/264,029, prijavljen juna 22,1994, pod naslovom "Novi postupak izrade poznatih i novih 2' modifikovanih nukleotida intramolekularnim nukleofilnim premeštanjem", sada napušten, opisuje nukleotide koji sadrže različite 2'-modifikovane pirimidine.
SELEX postupak obuhvata kombinovanje odabranih nukleotida sa drugim odabranim oligonukleotidima i ne-oligonukleotidnim funkcionalnim jedinicama kako se opisuje u United States Patent-u No. 5,637,459, pod naslovom "Sistematski razvoj liganada eksponencijalnim obogaćivanjem: Himerni SELEX", i United States Patent-u No. 5,683,876, pod naslovom "Sistematski razvoj liganada eksponencijalnim obogaćivanjem: Mešani SELEX", respektivno. Ove primene omogućavaju kombinaciju širokog niza oblika i drugih svojstava, i delotvorna amplifikaciona i replikaciona svojstva, oligonukleotida sa poželjnim svojstvima drugih molekula. SELEX postupak osim toga obuhvata kombinovanje odabranih nukleinskih kiselina kao Uganda sa lipofilnim jedinjenjima ili ne-imunogenim, visoke molekulske mase jadinjenjima u dijagnostičkom ili terapijskom kompleksu kako se opisuje u United States Patent Application Serial No. 08/434,465, prijavljenoj maja 4, 1995, pod naslovom "Kompleksi nukleinskih kiselina kao Uganda". Svaki od gore opisanih patenata i prijava koji opisuju modifikacije osnovnog SELEX postupka su naročito uključene ovde referencom u celini.
KRATAK SADRŽAJ PRONALASKA
Ovaj pronalazak opisuje postupak za izolovanje nukleinskih kiselina kao liganda koji se vezuju za tenascin-C sa visokom specifičnošću. Dalje se ovde opisuju nukleinske kiseline kao ligandi za tenascin-C. Isto tako se ovde opisuju RNK ligandi visokog afiniteta za tenascin-C. Dalje se opisuju 2'fluoro modifikovan pirimidin i 2'Ome modifikovan purin RNK ligandi za tenascin-C. Postupak koji se ovde koristi za identifikovanje takvih nukleinskih kiselina kao liganda naziva se SELEX, akronim za Svstematic Evolution of Ligands by Exponential enrichment. Ovde su uključeni ligandi koji su pokazani u Tabelama 3 i 4 i na Slici 10.
Osim toga u ovom pronalasku je uključen postupak za otkrivanje prisustva bolesti koja eksprimuje tenascin-C u biološkom tkivu koje može da sadrži bolest. Još je osim toga u ovom pronalasku uključen postupak za otkrivanje prisustva tumora koji eksprimuje tenascin-C u biološkom tkivu koje može da sadrži tumor. Dalje je u ovom pronalasku kompleks za primenuin vivoiliex vivodijagnostikama. U ovom pronalasku je još osim toga obuhvaćen postupak za oslobađanje terapijskih agenasa za lečenje ili profilaksu obolelih tkiva koja eksprimuju tenascin-C. U ovom pronalasku je još obuhvaćen kompleks za primenu u otpuštanju terapijskih agenasa za lečenje ili profilaksu obolelih tkiva koja eksprimuju tenascin-C.
KRATAK OPIS CRTEŽA
Slika 1 pokazuje vezivanje Cell SELEX RNK akumulacija za U251 ćelije.
Slika 2 pokazuje predloženu sekundarnu strukturu aptamera TTA l i TTA1 .NB. U sliku je uključena konjugacija aptamera sa Tc-99m helatorom. Svako A je 2'OMe modifikovano. Svako G, izuzev kako je pokazano, je 2'OMe modifikovano. Svako Ć i U je 2'F modifikovano,
Slika 3 pokazuje slike U251 spojnih kalemljenja tumora kod miševa, koji su dobijeni upotrebljavajući Tc-99m obeleženi TTA1 i TTA1.NB, tri sata posle injekcije.
Slika 4 pokazuje fluorescentnu mikroskopiju preseka U251 glioblastoma tumora, uzetog tri sata posle i.v. injekcije Rhodamine-Red-X-obeleženim TTA1.
Slika 5 pokazuje način na koji je Tc-99m i linker vezan preko 5'G od TTAl. Slika 6 opisuje TTA1/GS7641 uzimanje na 3 sata u različitim spoljnim kalemljenjima humanog tumora u mišu, upoređeno sa uzimanjem nevezujućeg kontrolnog aptamera. ID/g = injicirana doza/gram.
Slika 7 prikazuje bioraspodelu In-111 obeleženog TTA1/GS7641 upotreljavajući ili DOTA ili DTPA kao radiometalni helator, 3 sata posle injekcije. ID/g = injicirana doza/gram.
Slika 8 pokazuje konjugaciju aptamera na DTPA. 11 'inje pokazan kao helatovan sa DTPA.
Slika 9 pokazuje konjugaciju aptamera na DOTA. 11 'in je pokazan kao helatovan sa DOTA.
Slika 10 pokazuje predloženu sekundarnu strukturu aptamera TTAl. U sliku je uključena konjugacija aptamera sa Tc-99m helatorom. Aptamer je pokazan u njegovom Tc-99m obeleženom obliku. Svako A je 2'OMe modifikovano. Svako G, izuzev kako je pokazano, je 2'OMe modifikovano. Svako C i U je 2'F modifikovano.
DETALJAN OPIS PRONALASKA
Glavni postupak koji se ovde koristi za identifikaciju nukleinskih kiselina kao liganda za tenascin-C je nazvan SELEX postupak, akronim za Svstematic Evolution of Ligands by Exponential enrichment i obuhvata (a) dovođenje u dodir smeše kandidata nukleinske kiseline sa tenascinom-C (b) odvajanje između članova smeše kandidata na bazi afiniteta prema tanascinu-C, i (c) amplifikovanje odabranih molekula da se dobije smeša nukleinskih kiselina obogaćena za sekvence nukleinske kiseline sa relativno višim afinitetom za vezivanje za tenascin-C. Ovaj pronalazak dalje obuhvata specifične RNK ligande za tenascin-C koji su prikazani u Tabelama 3 i 4 i na Slici 10. Specifičnije, ovaj pronalazak obuhvata sekvence nukleinske kiseline koje su suštinski homologe i koje imaju suštinski istu sposobnost da vezuju tenascin-C kao i specifične nukleinske kiseline kao ligande koji su prikazani u Tabelama 3 i 4 i na Slici 10. Pod suštinski homologo misli se na stepen homologije primarne sekvence više od 70%, najpodesnije više od 80%, i čak još najpodesnije više od 90%, 95% ili 99%. Procenat homologije kako se opisuje ovde izračunava se kao procenat nukleotida nađen u manjoj od dve sekvence koji se slaže sa identičnim nukleotidnim ostatcima u sekvenci koja se upoređuje kada 1 razmak u dužini od 10 nukleotida može da bude uveden da potpomogne u tom usaglašavanju. Suštinski ista sposobnost da se vezuje tenascin-C znači daje afinitet unutar jednog ili dva reda veličine afiniteta liganada koji se ovde opisuju. U okviru sposobnosti stručnjaka je da odredi da li data sekvenca - u suštini homologa onima koje se posebno opisuju ovde - ima sposobnost da vezuje tenascin-C.
Pregled sekvencnih homologija nukleinskih kiselina kao liganda tenascina-C pokazan u Tabelama 3 i 4 i na Slici 10 pokazuje da sekvenca sa malo ili bez primarne homologije može da ima suštinski istu sposobnost da vezuje tenascin-C. Zbog toga, ovaj pronalazak takođe obuhvata nukleinske kiseline kao ligande koji imaju suštinski istu traženu strukturu ili strukturalne motive i sposobnost da vezuju tenascin-C kao nukleinske kiseline kao ligandi pokazani u Tabelama 3 i 4 i na Slici 10. Suštinski ista struktura ili strukturalni motivi mogu da se traže slaganjem sekvence koristeći Zukerfold program (vidi Zuker (1989) Science 244:48-52). Kao što je poznato u struci, mogu da se upotrebe drugi računarski programi za pretskazivanje sekundarne strukture ili strukturalnih motiva. Suštinski ista struktura ili strukturalni motiv nukleinskih kiselina kao liganda u rastvoru ili kao vezana struktura takođe može da se traži koristeći NMR ili druge tehnike kao stoje poznato u struci.
Dalje u ovom pronalasku je obuhvaćen postupak za otkrivanje prisustva bolesti koja eksprimuje tenascin-C u biološkom tkivu koje može da sadrži bolest postupkom (a) identifikovanja nukleinskih kiselina kao liganda iz smeše kandidata nukleinskih kiselina, pri čemu je ligand nukleinska kiselina ligand tenascina-C, postupkom koji se sastoji od (i) dovođenja u dodir smeše kandidata nukleinskih kiselina sa tenascinom-C, gde nukleinske kiseline imaju povećani afinitet prema tenascinu-C u odnosu na s.nešu kandidata mogu da se odvoje iz ostatka smeša kandidata; (ii) odvajanja nukleinskih kiselina povećanog afiniteta iz ostatka smeše kandidata; (iii) amplifikovanja nukleinskih kiselina povećanog afiniteta da se dobije smeđa nukleinskih kiselina sa relativno višim afinitetom i specifično za vezivanje za tenascin-C; (b) prikačinjanja markera koji može da se koristiin vivoiliex vivodijagnostikama za nukleinske kiseline kao ligand identifikovan u koraku (iii) da se obrazuje kompleks marker-nukleinska kiselina kao ligand; (c) izlaganja tkiva koje može da sadrži bolest kompleksu marker-nukleinska kiselina kao ligand; i (d) otkrivanje prisustva marker-nukleinska kiselina kao ligand u tkivu, pri čemu se identifikuje bolest koja eksprimuje tenascin-C.
Dalje je cilj ovog pronalaska da da kompleks za upotrebu in vivo iii ex vivo dijagnostikama koji se sastoji od jednog ili više liganda nukleinske kiseline za tenascin-C i jednog ili više markera. Dalje je još u ovom pronalasku obuhvaćen i postupak za oslobađanje terapijskih agenasa za lečenje ili profilaksu bolesnih stanja u kojim se eksprimuje tenascin-C. Još je dalje u ovom pronalasku obuhvaćen kompleks za oslobađanje terapijskih agenasa za lečenje ili profilaksu bolesnih stanja u kojim se eksprimuje tenascin-C.
Definicije
Ovde su upotrebljeni različiti izrazi da se uputi na aspekte ovog pronalaska. Da se pomogne u razjašnjavanju opisa komponenata ovog pronalaska, daju se sledeće definicije: Kako se upotrebljava ovde, "ligand nukleinska kiselina" je nukleinska kiselina koja se ne nalazi prirodno koja ima poželjno delovanje na cilj. Nukleinske kiseline kao ligandi se često navode kao "aptameri". Cilj ovog pronalaska je tenascin-C, otuda izraz ligand nukleinska kiselina za tenascin-C. Poželjno delovanje obuhvata, ali nije na to ograničeno, vezivanje cilja, katalitičko menjanje cilja, reagovanje sa ciljem na način koji modifikuje/menja cilj ili funkcionalnu aktivnost, kovalentno vezivanje za cilj kao u samoubilačkom inhibitoru, olakšavanje reakcije između cilja i drugog molekula. U ostvarenju koje se pretpostavlja, delovanje je specifično vezujući afinitet za ciljni molekul, pri čemu je takav ciljni molekul trodimenzionalna hemijska struktura preko mehanizma koji predominantno zavisi od Watson/Crick baznog sparivanja ili trostrukog spiralnog vezivanja, gde nukleinska kiselina kao ligand nije nukleinska kiselina koja ima poznatu fiziološku funkciju vezivanja sa ciljnim molekulom budući daje vezana ciljnim molekulom. Nukleinske kiseline kao ligandi su idetifikovani kao smeše kandidata nukleinskih kiselina, pri čemu je ligand nukleinska kiselina ligand tenascina-C, postupkom koji obuhvata: a) dovođenje u dodir smeše kandidata sa tenascinom-C, u kojoj nukleinske kiseline koje imaju povišeni afinitet prema tenascinu-C u odnosu na smešu kandidata mogu da budu odvojene iz ostatka smeše kandidata; b) ođvanje povišenog afiniteta nukleinskih kiselina iz ostatka smeše kandidata; i c) ampiifikovanje povećanog afiniteta nukleinskih kiselina da se dobije ligandom obogaćena smeša nukleinskih kiselina (vidi U.S. Patent Application no. 08/434,425, prijavljena maja 3, 1995, sada United States Patent No. 5,789,157, koja je ovde uključena referencom). Kako se upotrebljava ovde, "smeša kandidata" je smeša nukleinskih kiselina različite sekvence iz koje treba da se izabere željeni ligand. Izvor smeše kandidata može da bude iz nukleinskih kiselina koje se nalaze prirodno ili fragmenata istih, hemijski sintetizovanih nukleinskih kiselina, enzimski sintetisanih nukleinskih kiselina ili nukleinskih kiselina izrađenih kombinovanjem prethodnih načina rad. U ostvarenju koje se pretpostavlja, svaka nukleinska kiselina ima fiksne sekvence koje okružuju nasumični region da se olakša proces amplifikacije.
Kako se upotrebljava ovde, "nukleinska kiselina" znači ili DNK, RNK, jednolančanu ili đovlančanu, i bilo koje hemijske modifikacije istih. Modifikacije obuhvataju, ali nisu ograničene na to, one koje daju druge hemijske grupe koje ugrađuju dodabno svojstvo, sposobnost polarizovanja, vodonično vezivanje, elektrostatičku interakciju, sposobnost nagomilavanja na baze nukleinskih kiselina kao liganda ili ligand nukleinsku kiselinu kao celinu. Takve modifikacije obuhvataju, ali nisu ograničene na to, modifikacije u 2'-položaju šećera, modifikacije u 5-položaju pirimidina, modifikacije u 8-položaju purina, modifikacije na egzocikliČnim aminima, supstituciju 4-tiouridina, supstituciju 5-brom ili 5-jod-uracija; modifikacije okosnice, metilacije, kombinacije neuobičajenih sparivanja baza takvih kao izobaza izocitidina i izogvanadina i slično. Modifikve mogu da obuhvate takođe i 3' i 5' modifikacije takve kao dodavanje šeširića (capping).
"SELEX" metodologija obuhvata kombinaciju selekcije nukleinskih kiselina kao liganda koja uzajamno reaguje sa ciljem na poželjan način, na primer vezivanje za
protein, sa amplifikovanjem tih odabranih nukleinskih kiselina. Po izboru ponavljanje ciklusa koraka selekcija/amplifikacija dozvoljava selekciju jednog ili malog broja nukleinskih kiselina koje uzajamno deluju najjače sa ciljem iz sredine koja sadrži vrolo veliki broj nukleinskih kiselina. Obnavljanje postupka selekcija/amplifikacija se nastavlja dok se ne postigne odabrani cilj. U ovom pronalasku, SELEX metodologija se upotrebljava da se dobiju nukleinske kiseline kao ligandi za tenascin-C.
SELEX metodologija je opisana u SELEX patentnim prijavama.
"SELEX cilj" ili "cilj" znači svako jedinjenje ili molekul od interesa za koji je ligand željen. Cilj može da bude bez ograničenja protein, peptid, ugljeni hidrat, polisaharid. glikoprotein, hormon, receptor, antigen, antitelo, virus, supstrat, metabolit, prelazno stanje, kofaktor, inhibitor, lek, boja, nutrijent, faktor rasta, itd. U ovoj prijavi SELEX cilj je tenascin-C.
"Kompleks" kako se upotrebljava ovde znači entitet molekula koji je obrazovan kovalentnim vezivanjem jednog ili više liganda nukleinske kiseline za tenascin-C sa jednim ili više markera. U izvesnim ostvarenjima ovog pronalaska, kompleks se predstavlja kao A-B-Y, gde je A marker; B je po izboru, i sastoji se od linkera; i Y je nukleinska kiselina kao ligand za tenascin-C.
"Marker" kako se upotrebljava ovde je entitet molekula ili entiteti koji kada se kompleksiraju sa nukleinskom kiselinom kao Ugandom za tenascin-C, ili direktno ili preko linkera ili držača odstojanja, dozvoljava otkrivanje kompleksa uin vivoiliex vivoispitivanju vizuelnim ili hemijskim sredstvima. Primere markera obuhvataju, ali nisu ograničeni na to, radionuklidi. uključujući Tc-99m, Re-188, Cu-64, F-18,<l25>J,<I3l>J, '"in. 32P,<IK6>Re; svi fluorofori, uključujući fluorescin,
rodamin; Texas Red; derivate gornjih fluorofora, uključujući Rhodamin-Red-X; magnetna jedinjenj a; ibiotin.
Kako se upotrebljava ovde, "linker" je molekularni entitet koji spaja dva ili više molekularnih entiteta kovalentnom vezom ili nekovalentnom interakcijom, i može da da dopusti prostorno odvajanje molekularnih entiteta na način koji čuva funkcionalna svojstva jednog ili više molekularnih entiteta. Linker može da bude poznat takođe i kao držač odstojanja. Primere linkera obuhvataju, ali nisu ograničeni na to, (CHoCH^O^ i heksilaminske strukture prikazane naSlici 2,
"Terapijski" kako se upotrebljava ovde, obuhvata lečenje i/ili profilaksu. Kada se upotrebljava, terapijski se odnosi na ljude i druge životinje.
"Kovalentna veza" je hemijska veza obrazovana zajedničkim elektronima.
"Nekovalentne interakcije" su sredstva kojima se molekularni entiteti drže zajedno interakcijom koja se razlikuje od Kovalentne Veze pri čemu se uključuju jonske interakcije i vođonične veze.
U ostvarenju kome se daje prednost, nukleinske kiseline kao ligandi ovog pronalaska proizlaze iz SELEX metodologije. SELEX postupak je opisan u United States Application Serial No. 07/536,428, pod naslovom "Sistematski razvoj liganada eksponencijalnim obogaćivanjem", sada napuštenoj, Unites States
Patent No. 5,475,096, pod naslovom "Ligandi nukleinske kiseline" i United States
Patent No.5.270,163, (vidi takođe i VVO/91/19813), pod naslovom "Postupci za identifikovanje nukleinskih kiselina kao liganda". Ove prijave, svaka posebno uneta ovde referencom, su zajednički nazvane SELEX patentne prijave.
SELEX postupak daje klasu proizvoda koji su molekuli nukleinske kiseline, pri čemu svaka ima jedinstvenu sekvencu, i od kojih svaki ima svojstvo vezivanja specifično za željeno ciljno jedinjenje ili molekul. Ciljni molekuli su prvenstveno proteini, ali isto tako mogu da obuhvate između ostalih ugljene hidrate, peptidoglukane i različite male molekule. SELEX metodologija može takođe da se primeni za ciljne biološke strukture, takve kao što su površine ćelija ili virusa, specifičnom interakcijom sa molekulom koji je integralni deo te biološke strukture.
U svom najosnovnijem oblku, SELEX postupak može da se definiše sledećim nizovima koraka: 1) Izrađuje se smeša kandidata nukleinskih kiselina različite sekvence. Smeša kandidata opšte uzev obuhvata regione fiksiranih sekvenci (t.j. svaki od članova smeše kandidata sadrži iste sekvence na istom mestu) i regione nasumičnih sekvenci. Regioni fiksne sekvence su odabrani ili: (a) da učestvuju u amplifikacionim koracima opisanim niže, (b) da oponašaju sekvencu za koju je poznato da se vezuje za cilj, ili (c) da pojača koncentraciju datog strukturalnog rasporeda nukleinskih kiselina u smeši kandidata. Nasurnične sekvence mogu da budu potpuno nasurnične (t.j. pri čemu je verovatnoća nalaženja baze na bilo kom položanju jedan u četiri) ili samo delimično nasumična (na pr. verovatnoća nalaženja baze u bilo kom mestu može da bude odabrana na bilo kom nivou između 0 i 100 procenata). 2) Smeša kandidata se dovodi u dodir sa odabranim ciljem pod uslovima povoljnim za vezivanje između cilja i članova smeše kandidata. Pod ovim okolnostima, interakcija između cilja i nukleinskih kiselina kandidata smeša može da se smatra kao da se stvaraju parovi nukleinska kiselina-cilj između cilja i onih nukleinskih kiselina koje imaju najjači afinitet za cilj. 3) Nukleinske kiseline sa najvišim afinitetom prema cilju se odvajaju iz ovih nukleinskih kiselina sa manjim afinitetom prema cilju. Pošto postoje samo mali broj sekvenci (i verovatno samo jedan molekul nukleinske kiseline) koji odgovaraju najvišem afinitetu nukleinskih kiselina u smeŠi kandidata, opšte uzev je poželjno da se postave kriterijum odvajanja tako da se znatna količina nukleinskih kiselina u smeši kandidata (približno 5-50%) zadržava u toku odvajanja. 4) One nukleinske kiseline odabrane u toku odvajanja pošto imaju relativno viši afinitet za cilj se potom amplifikuju da stvore novu smešu kandidata koja je obogaćena u nukleinskim kiselinama koje imaju relativno viši afinitet za cilj. 5) Ponavaljanjem koraka odvajanja i amplifikacije gore, novo obrazovana smeša kandidata sadrži manje jedinstvenih sekvenci, i prosečan stepen afiniteta nukleinskih kiselina prema cilju će opšte uzev da se povisi. Uzet u njegovoj krajnosti, SELEX postupak će dati smešu kandidata koja sadrži jednu ili mali broj jedinstvenih nukleinskih kiselina koje predstavljaju one nukleinske kiseline iz originalne smeše kandidata koje imaju najviši afinitet prema ciljnom molekulu.
Osnovni SELEX postupak je modifikovan da se postigne veliki broj specifičnih ciljeva. Na primer, United States Patent Application Serial No. 07/960,093, podnet oktobra 4, 1992, sada napuštena, i United States Patent No. 5,707,796, oba pod naslovom "Postupak za selekciju nukleinskih kiselina na bazi strukture" opisuju upotrebu SELEX postupka zajedno sa gel elektroforezom da se odaberu molekuli nukleinske kiseline sa specifičnim strukturnim karakteristikama, takvim kao što je savijena DNK, United States Application Serial No. 08/123,935, podneta septembra 17, 1993, pod naslovom "Fotoselekcija nukleinskih kiselina kao liganda", sada napuštena, United States Patent No. 5,736,177, pod naslovom "Sistematska evolucija liganada eksponencijalnim obogaćivanjem: Fotoselekcija nukleinskih kiselina kao liganda i rešenje SELEX", i United States Patent Application Serial No. 09/093,293, pođneta juna 8, 1998, pod naslovom "Sistematska evolucija liganada eksponencijalnim obogaćivanjem: Fotoselekcija nukleinskih kiselina kao liganda i rešenje SELEX", svi opisuju postupak koji bazira na SELEX-u za odabiranje nukleinskih kiselina kao liganda koji sadrže fotosenzitivne grupe koje su sposobne da vezuju i/ili fotoumrežavaju i/ili fotoinaktivišu ciljni molekul. United States Patent No. 5,580,737, pod naslovom "Nukleinske kiseline kao ligandi visokog afiniteta koji prave razliku između teofilina i kafeina", opisuje postupak nazvan Counter-SELEX za identifikovanje visoko specifičnih nukleinskih kiselina kao liganda koji su sposobni da prave razliku između blisko srodnih molekula. Unites States Patent No. 5,567,588, pod naslovom "Sistematska evolucija liganada eksponencijalnim obogaćivanjem: rešenje SELEX", opisuje postupak koji bazira na SELEX-u koji postiže visoku delotvornu raspodelu između oligonukleotida koji imaju visoki i niski afinitet za ciljni molekul. United States Patent No. 5,496,938, pod naslovom "Ligandi nukleinske kiseline za H5V-RT i HIV-1 Rev", opisuje postupke za dobijanje poboljšanih nukleinskih kiselina kao liganda posle pošto se izvede SELEX. United States Patent No. 5.705,337, pod naslovom "Sistematska evolucija liganada eksponencijalnim obogaćivanjem: Hemi SELEX", opisuje postupke za kovalentno vezivanje liganda za njegov cilj.
SELEX postupak obuhvata identifikovanje nukleinskih kiselina kao liganda visokog afiniteta koji sadrže modifikovane nukleotide koji prenose poboljšane karakteristike na ligand, takve kao što su poboljšanain vivostabilnost ili pojačane karakteristike otpuštanja. Primere takvih modifikacija obuhvataju hemijske supstitucije na ribozi i/ili fosfatu i/ili baznim delovima. SELEX-om identifikovane nukleinske kiseline kao ligandi koji sadrže modifikovane nukleotide su opisani u United States Patent No. 5.660,985, pod naslovom "Nukleinske kiseline kao ligandi visokog afiniteta koji sadrže modifikovane nukleotide", koji opisuje oligonukleotide koji sadrže derivate nukleotida hemijski modifikovanih na 5- i 2'-položajima pirimidina. United States Patent No. 5,637,459, supra, opisuje visoko specifične nukleinske kiseline kao ligande koji sadrže jedan ili više nukleotida modifikovanih sa 2'-amino (2-NH2), 2'fluoro (2'-F), i/ili 2'-0-metil (2'-OMe). United States Patent Application Serial No. 08/264,029, prijavljena juna 22, 1994, pod naslovom "Novi postupak za izradu poznatih i novih 2' modifikovanih nukleotida intramolekularnim nukleofilnim premeštanjem", opisuje oligonukleotide koji sadrže različite 2'-modifikovane pirimidine.
SELEX postupak obuhvata kombinovanje odabranih oligonukleotida sa drugim odabranim oligonukleotidima i ne-oligonukleotidnim funkcionalnim jedinicama kako je opisano u United States Patent No. 5,637,459, pod naslovom "Sistematska evolucija liganada eksponencijalnim obogaćivanjem: Himemi SELEX", i United States Patent No. 5,683,867, pod naslovom "Sistematska evolucija liganada eksponencijalnim obogaćivanjem: Mešani SELEX". Ove prijave dozvoljavaju kombinovanje širokog niza oblika i drugih svojstava, i delotvorna amplifikaciona i replikaciona svojstva, oligonukleotida sa željenim svojstvima drugih molekula.
U United States Patent-u No. 5.496,937 opisani su postupci za dobijanje poboljšanih nukleinskih kiselina kao liganda posle postoje izveden SELEX postupak. Ovaj patent, pod naslovom "Ligandi nukleinske kiseline za HIV-RT i HIV-1 Rev", je ovde specifično uključen referencom. United States Patent Application No. 08/434,425, pod naslovom "Sistematska evolucija liganada eksponencijalnim obogaćivanjem: SELEX tkiva", podneta maja 3, 1995, sada United States Patent No. 5.789,157, opisuje postupke za identifikovanje nukleinskih kiselina kao liganda za makromolekularnu komponentu tkiva, uključujući ćelije raka, i ligande nukleinske kiseline tako identifikovane. Ovaj patent je referencom ovde specifično uključen.
Jedan potencijalni problem koji se sreće u dijagnostici ili terapijskoj primeni nukleinskih kiselina je da oligonukleotidi u njihovom fosfodiestarskom obliku mogu brzo da se raspadnu u telesnim tečnostim pre nego što se ispolji željeno dejstvo intraćelijskim ili ekstraćelijskim encimima takvim kao što su endonukleaze i egzonukleaze. Mogu da se izvrše izvesne hemijske modifikacije nukleinskih kiselina kao liganda da se povisi stabilnost liganda nukleinske kiselinein vivoili da se pojača ili da se posreduje ispuštanje liganda nukleinske kiseline. Vidi, na pr. U.S. Patent Application Serial No. 09/117,991, podneta septembra 8, 1993. sada napuštena i Umted States Patent No. 5,660.985, oba pod naslovom "Ligandi nukleinske kiseline visokog afiniteta koji sadrže modifikovane nukleotide", koji je ovde specifično uključen referencom. Modifikacije nukleinskih kiselina kao liganda razmatrane u ovom pronalasku uključuju, ali nisu ograničeni na to, one koje daju druge hemijske grupe koje sadrže dodatnu šaržu, sposobnost polarizacije, hidrofobnost, vodonično vezivanje, elekfrostatičku interakciju, sposobnost tečenja prema bazama nukleinskih kiselina kao liganda ili nukleinskoj kiselini kao ligandu u celini. Takve modifikacije obuhvataju, ali nisu ograničene na to, modifikacije 2'-po!ožaja šećera, modifikacije 5-položaja pirimidina, modifikacije 8-položaja purina, modifikacije na egzocikličnim aminima, supstituciji 4-tiouridina, supstituciju 5-brom ili 5-jod-uracila, modifikacije okosnice, modifikacije fosforotioata ili alkil fosfata, metilacije, neuobičajene kombinacije sparivanja baza takvih kao što su izobaze izocitidina i slično. Modifikacije takođe mogu da obuhvate 3' i 5' modifikacije kao što je pokrivanje. U ostvarenjima datog pronalaska koja se pretpostavljaju, ligandi nukleinske kiseline su RNK molekuli koji su 2'-fluoro (2'-F) modifikovani na šećernom delu pirimidinskih ostataka.
Modifikacije mogu da budu pre ili posle SELEX postupka modifikacija. Modifikacije pre SELEX postupka daju ligande nukleinske kiseline i sa specifičnošću za njihov SELEX cilj i za poboljšanuin vivostabilnost. Modifikacije posle SELEX postupka koje su učinjene na 2'-OH nukleinskih kiselina kao liganda mogu da rezultiraju u poboljšanojin vivo stabilnostia da se time ne utiče nepovoljno na kapacitet vezivanja liganda nukleinske kiseline.
Stručnjacima su poznate druge modifikacije. Takve modifikacije mogu da se izvrše posle SELEX postupka (modifikacija prethodno identiftkovanih nemodifikovanih liganda) ili inkorporisanjem u SELEX postupak. Ligandi nukleinske kiseline pronalaska su izrađeni SELEX metodologijom koja je skicirana gore i potpuno se omogućava u SELEX primenama koje su ovde u njihovoj celini inkorporisane referencom. Tenascin-C aptameri ovog pronalaska se vezuju za mesto vezivanja heparina tenascin-C COOH završetka.
U izvesnim ostvarenjima ovog pronalaska, ligandi nukleinske kiseline za tenascin-C ovde opisani su korisni za dijagnostičke svrhe i mogu da se priinene da se snime patološka stanja (takva kao snimanje humanog tumora). Pored dijagnoze, nukleinske kiseline kao ligandi za tenascin-C su korisni u prognozi i praćenju bolesnih stanja u kojima se eksprimuje tenascin-C.
Dijagnostički agensi treba samo da budu u stanju da omoguće korisniku da identifikuje prisustvo datog cilja na posebnom mestu ili koncentraciji. Jednostavno sposobnost da se formiraju vezivni parovi sa ciljem mogu da budu dovoljni da se aktivira pozitivni signal za dijagnostičke svrhe. Stručnjaci mogu da budu u stanju da prilagode svaki ligand nukleinsku kiselinu za tenascin-C postupcima poznatim u struci da umetnu marker da bi se otkrilo prisustvo nukleinske kiseline kao liganda. Takvi markeri bi mogli da se upotrebe u velikom broju dijagnostičkih postupaka, takvih kao što je otkrivanje primarnih i metastaziranih tumora i aterosklerotičnih lezija. Ovde se kao primeri daju markeri za obeležavanje tehnecijum-99m i '"in: međutim, drugi markeri takvi kao dodatni radionuklidi, magnetna jedinjenja, fluorofori, biotin, i slični mogu da se spregnu za nukleinskom kiselinom kao Ugandom za tenascin-C za snimanjein vivoiliex vivoispitivanjima bolesnih stanja u kojima se eksprimuje tenascin-C (na pr. rak, ateroskleroza, i psorijaza). Marker može kovalentno da se veže za različite položaje na nukleinskoj kiselini kao Ugandu za tenascin-C, takve kao za egzocikličnu amino grupu na bazi, 5-položaju pirimidinskog nukleotida, 8-položaju purinskog nukleotida, hidroksilnu grupu fosfata, ili hidroksilnu grupi ili drugu grupu5'ili 3'završetka nukleinske kiseline kao liganda za tenascin-C. U ostvarenjima gde je marker tehnecijum 99m ili<!>"ln prvenstveno je vezan za 5' ili 3' hidroksil fosfatnc grupe istog ili u 5 položaju modifikovanog pirimidina. U ostvarenju koje se najviše pretpostavlja, marker je vezan za 5' hidroksil fosfatne grupe nukleinske kiseline kao liganda sa ili bez linkera. U drugom ostvarenju, marker je spojen za ligand nukleinske kiseline umetanjem pirimidina koji sadrži primarni amin u 5 položaju, i upotreba amina za spajanje za marker. Prikačinjanje markera može da se izvrši direktno ili uz korišćenje linkera. U ostvarenju gde se tehnecijum-99m ili 11 'in upotrebljava kao marker, linker koji se pretpostavlja je heksilaminski linker kako je pokazano na Slici 10.
U drugim ostvarenjima, nukleinske kiseline kao ligandi za tenascin-C su korisni za oslobađanje terapijskih jedinjenja (uključujući, ali nije ograničeno na to, citotoksična jedinjenja, supstance koje pojačavaju imunitet i terapijske radionuklide) tkivima ili organima koji eksprimuju tenascin-C. Bolesna stanja u kojima tenascin-C može da bude eksprimovan obuhvataju, ali nisu ograničena na to, rak, aterosklerozu, i psorijazu. Stručnjaci bi bili u stanju da prilagode bilo koju nukleinsku kiselinu kao ligand za tenascin-C postupcima poznatim u nauci da umetnu terapijsko jedinjenje u kompleks. Terapijsko jedinjenje može pogodno da bude vezano za različite položaje na nukleinskoj kiselini kao Iigandu za tenascin-C, takvim kao što je egzociklična amino grupa na bazi, 5-položaj pirimidin nukleotida, 8-položaj purinskog nukleotida, hidroksilna grupa fosfata, ili hidroksilna grupa ili druga grupa na 5' ili 3' zavšetku nukleinske kiseline kao liganda za tenascin-C. U ostvarenju koje se pretpostavlja, terapijski agens je vezan za 5' amin nukleinske kiseline kao liganda. Prikačinjanje terapijskog agensa može da se izvrši direktno ili uz korišćenje linkera. U ostvarenju u kome je rak bolest koja se cilja, 5'fluorodeoksiuracil ili drugi nukleotidni analozi za koje je poznato da su aktivni protiv tumora mogu da budu interno umetnuti u postojeće U ozanke unutar nukleinske kiseline kao liganda za tenascin-C ili mogu da budu dodati ili spojeni za kraj ili direktno ili preko linkera. Uz to, i pirimidinski analozi 2'2'-đifluorocitidin i purinski analozi (deoksikoformicin) mogu da budu umetnuti. Uz to United States Application Serial No. 08/993,765, podneta decembra 18, 1997, ovde u svojoj celini uneta referencom, opisuje,inter alia,prolek koji bazira na nukleotidu koji se sastoji od nukleinskih kiselina kao liganda koji su usmereni na tumor, na primer tenascin-C. za tačno lokalizovanje hemoradiosenzora, i radiosenzora i radionuklida i drugih radioterapijskih agenasa za tumor.
Isto tako se razmatra da i marker ii terapijski agens mogu da budu povezani sa nukleinskom kiselinom kao ligandom za tenascin-C, tako da se otkrivanje bolesnog stanja i oslobađanje terapijskog agensa izvršava zajedno u jednom aptameru ili kao smeša dve ili više različitih modifikovanih verzija istog aptamera. Isto tako se razmatra da jedan ili drugi ili oba markera i/ili terapijski agens mogu da budu povezani sa neimunogenim, visoke molekulske mase jedi nj enj em ili lipofilnim jeđinjenjem, takvim kao što je lipozom. Postupci za spajanje nukleinskih kiselina kao liganda sa lipofilnim jedinjenjima ili neimunogenim jedinjenjima u dijagnostički ili terapijski kompleks su opisani u United States Patent Application Serial No. 08/434,465, podnetoj maja 4, 1995, pod naslovom "Kompleksi nukleinskih kiselina kao liganda", koja je ovde u njenoj celini uneta.
Terapijski ili dijagnostički sastavi koji se opisuju ovde mogu da se daju injekcijom (na pr. intravenozno, potkožno, intradermalno, intralezionalno), iako su predviđeni i drugi delotvomi oblici davanja takvi kao intrartikulrana injekcija, raspršavanja za inhalaciju, oralno aktivne formulacije, transedmalna jontoforeza ili supozitorije.
Oni mogu takođe da se primene lokalno direktnom injekcijom, mogu da se otpuštaju iz naprava, takvih kao implantirani stentovi ili kateteri, ili da se direktno pomoću infuzione pumpe ispuštanju na mestu. Nosač koj se pretpostavlja je fiziološki slani rastvor, ali se smatra da i drugi farmaceutski prihvatljivi nosači mogu takođe da se primene. U jednom ostvarenju, predviđa se da nosač i kompleksirana nukleinska kiselina kao ligand za tenascin-C sa terapijskim jedinjeniem sačinjavaju fiziološku kompatibilnu formulaciju, koja se lagano otpušta. Po prirodi primarni rastvarač u takvom nosaču može da bude ili voden ili nevođen. Pored toga, nosač može da sadrži druge farmakološki prihvatljive sastojke za modifikovanje ili održavanje pH, osmoze, viskoziteta, bistrine, boje, sterilnost, stabilnosti, brzine rastvaranja, ili mirisa formulacije. Slično nosač može da sadrži još druge farmaceutski prihvatljive dodatke za modifikovanje ili održavanje stabilnosti, brzine rastvaranja, otpuštanja, ili absorbcije nukleinske kiseline kao liganda za tenascin-C. Takvi dodaci su one supstance koje se obično ili uobičajeno upotrebljavaju da se formulišu dozaže za parenteralno davanje ili u obliku jedinične doze ili multi-doze. Pošto su terapijski i dijagnostički sastavi jednom formulisani, mogu da se skladište u sterilnim bočicama kao rastvor, suspenzija, gel, emulzija, čvrsta materija, dehidratisani ili liofilizovan prah. Takve formulacije mogu da se skladište ili u obliku spremnom za upotrebu ili u oblicima koji zahtevaju rekonstituciju neposredno pre davanja. Način davanja formulacija koje sadrže nukleinske kiseline kao ligande za tenascin-C za sistemsko otpuštanje može da bude putem subkutanog, intramuskulranog, intravenoznog, intraarterijakalnog, intranazalnog ili vaginalne ili rektalne supozitorije.
Sledeći primeri se daju da objasne i prikažu ovaj pronalazak i ne treba ih smatrati kao ograničenje pronalaska. Primer 1 opisuje materijale i eksperimentalne postupke upotrebljene u Primeru 2 za stvaranje liganada RNK za tenascin-C. Primer 2 opisuje ligande RNK za tenascin-C i predskazanu sekundarnu strukturu odabarnog liganda nukleinske kiseline. Primer 3 opisuje određivanje minimalne veličine potrebne za vezivanje visokog afiniteta odabranog liganda nukleinske kiseline, i supstituciju 2'-OH purina sa 2'-OMe purinima. Primer 4 opisuje bioraspodelu Tc-99m obeleženih nukleinskih kiselina kao liganda za tenascin-C u miševima kod kojih se širi tumor. Primer 5 opisuje upotrebu fluorescentno obeleženih nukleinskih kiselina kao liganda za tenascin-C da se lokalizuje tenascin-C unutar tkiva tumora. Primer 6 opisuje otkrivanje tumorain vivopomoću Aptamer TTAl (takođe poznat i kao GS764). Primer 7 opisuje alternativno obeležavanje upotrebljavajući11 ^n.
PRIMERI
Primer 1. Upotreba SELEX-a da se dobiju nukleinske kiseline kao ligandi za tenascin-C i za ćelije glioblastoma U251.
Materijali i postupci
Tenascin-C je kupljen od Chemison (Temecula, CA). Jednolančani DNK-prajmeri i sekvence su bili sintetizovani pomoću Operon Technologies Inc.
(Alameda, CA).
SELEX postupak je bio opisan detaljno u SELEX patentnim prijavama. Ukratko, dvolanČane transkripcione matrice su bile pripreljene ekstenzijom Klenow fragmenta 4()N7a ssDNK: upotrebljavajući 5N7 prajmer:
koji sadrži promoter T7 polimeraze (podvučeno). RNK je bio izrađen sa T7RNK polimerazom kako su ranije opisali Fitzwater i Poliskv (1996) Methods Enzvmol. 267:275-301., ovde uneto u njegovoj celini referencom. Sve reakcije transkripcije su bile izvedene u prisustvu pirimidinskih nukleotida koji su bili 2'-fluoro (2'-F) modifikovani na šećernom delu. Ova supstitucija daje pojačani otpor na ribonukleazu koja koristi 2-hidroksilni deo za cepanje fosfordiestarske veze. Specifično, svaka transkripciona smeša je sadržavala 3,3 mM 2'F UTP i 3,3 mM 2'F CTP zajedno sa 1 mM GTP i ATP. Početna nasumična RNK biblioteka na taj način proizvedena sadržavala je 3x10" molekula. Afiniteti individualnih liganada za tenascin-C bili su određeni standardnim metodama koristeći particioni nitrocelulozni filter (Turk i Gold (1990) Science 249( 4968):505-10).
Za svaku rundu SELEX-a, Lumino ploče (Labsystems, Needham Heights, MA) su bile obložene u toku 2 sata na sobnoj temperaturi sa 200 p.L Dulbecco-ovog PBS koji sadrži tenascin-C koncentracije kako je prikazano na Tabeli 1. Posle oblaganja, udubljenja su bila blokirana koristeći HBSMC+pufer [20 mM Hepes, pH 7,4,137mM NaCL, 1 mM CaCl2,1 mM MgCl2i 1 g/litar albumina humanog seruma (Sigma, frakcija V) za runde 1 do 6 dok su za runde 7 i 8 udubljenja bila blokirana koristeći HBSMC+pufer koji sadrži 1 g/L kaseina (I-block; Topix)]. Vezivanje i ispiranje sa puferom sastojalo se od HBSMC+pufera koji sadrži 0,05% Tween-a 20. Za svaku SELEX rundu, RNK je bio razblaživan u 100 u.L vezujućeg pufera i ostavljeno je da se inkubira 2 sata na 37°C u proteinom obloženim udubljenjima koja su prethodno prana sa vezujućim puferom. Posle vezivanja, izvedena su šest ispiranja od 200pJL svako. Posle koraka ispiranja, suvo udubljenje je stavljeno na površinu grejnog bloka od 95°C u toku 5 minuta. Standardne AMV reakcije reversne transkriptaze (50pL) su izvedene na 48°C direktno u udubljenju i reakcioni proizvodi su korišćeni za standardne PCR i transkripcione reakcije. Dve sintetska prajmera 5N7 (vidi gore) i 3N7a: 5'-TCGCGCGAGTCGTCTG-3' (SEQID NO:3) su bili upotrebljeni za ove korake sekvencne amplifikacije i reversne transkripcije. Za SELEX ćeliju, U251 ćelije humanog glioblastoma (Hum. Hered, (1971)21:238) su gajene do konfluentnosti u Dulbecco-ovom modifikovanom Eagle-ovom medijumu dopunjenim sa 10% fetalnog telećeg seruma (GIBCO BRL, Gainthersburg, MD) na šest udubljenja ploča za kulturu tkiva (Becton Dickinson Labware, Lincoln Park, NJ) i ispirane tri puta upotrebljavajući Dulbecco-v PBS dopunjen sa CaCl2(DPBS, GIBCO BRL) puferom. Transkripcijom interno obeležena RNK (Fitzwater (1996)supra)inkubirana je sa ćelijama na 37°C u toku jednog sata. Obeležena RNK je potom odstranjena, i ćelije su se ispirale šest puta u toku deset minuta svaka na 37°C sa DPBS. DPBS koji sadrži 5 mM EDTA se potom dodaje i inkubira sa ćelijama u toku 30 minuta da se eluiraju vezane RNK koje zaostaju posle koraka ispiranja. Ova RNK se kvantifikuje standardnim tečnim scintilacionim protokolom brojanja
i amplifikuje upotrebljavajući RT-PCR.
Ispitivanja vezivanja U251 ćelije. Interno obeležena RNK se inkubira pri koncentracijama koje se povećavaju sa sastavom ćelija U251 u šest udubljenja ploča za kulturu tkiva (Becton Dickinson Labv/are, Lincoln Park, NJ) na 37°C u toku 60 minuta. Nevezana RNK se odstrani ispiranjem koristeći tri 10 minutna ispiranja DPBS+CaCl2na 37°C, i vezane RNK se odvoje razaranjem ćelija koristeći Trizol (Gibco BRL, Gaihtersburg, MD). Vezana RNK se kvantifikuje tečnim scintilacionim brojanjem.
Kloniranje i sekvenciranje. Koncentracija oligonukleotida obogaćene amplifikovanim afinitetom su prečišćavanje na 8% poliakrilamidnom gelu, reversno transkribovane u ssDNK i DNK ampliflkovane pomoću lančane reakcije polimeraze (PCR) koristeći prajmer koji sadrži BamHl i Hindlll restrikciona mesta endonukleaze. PCR fragmenti su klonirani, izrađeni plazmidi i izvedene analize sekvence prema standardnim načinim rada (Sambrooki sar.(1989) Molecular Cloning: A Laboratorv Manual, 2<nd>Ed, 3 vols., Cold Spring Harbor Laboratorv Press. Cold Spring Harbor).
Primer 2. RNK ligandi za tenascin-C.
Ligandi nukleinske kiseline za U251 ćelije su dobijeni pomoću SELEX postupka i opisani su u United States Patent Application Serial No. 08/434,425, pod naslovom "Sistemska evolucija liganada eksponencijalnim obogaćivanjem: SELEX tkiva", prijavljena maja 3. 1995. sada United States Patent No. 5,789,157. Naknadno je određeno da su ligandi-koji su bili dobijeni bili nukleinske kiseline kao ligandi za tenascin-C.
Da se dobiju oligonukleotidni ligandi za humani tenascin-C, izvedeno je osam rundi SELEX-a upotrebljavajući nasumičnu nukleotidnu biblioteku kako je opisano gore u Materijali i Postupci. RNK i ulaz proteina u svaku rundu je prikazan u Tabeli 1. Posle 8 rundi SELEX-a, afinitet oligonukleotidne akumulacije za tenascin-C je bio 10 nM, i ovaj afinitet se ni je povisio sa dodatnim SELEX rundama.
Da se dobiju ligandi za U251 ćelije glioblastoma, izvedeno je devet rundi koristeći nasumičnu nukleotidnu biblioteku. Posle devet rundi vezivanja za U251 ćelije i EDTA eluiranja, runde 3, 5 i 9 su bile ispitivane na njihovu sposobnost da se vezuju za U251 ćelije.Slika1 pokazuje da kako se broj SELEX rundi povećava, količina vezane RNK se takođe povećava pri posebnoj koncentraciji. Zbog složenosti ciljnog tkiva, nije bilo moguće da se odredi afinitet oligonukleotidnih akumulacija za nepoznat(e) ciljni(e) molekui(e) na ove ćelije.
E9 akumulacija (devet rundi vezivanja i EDTA eluiranje iz U251 ćelija) je potom upotrebljeno kao polazna tačka za SELEX za prečišćeni tenascin-C. Dve runde SELEX-a koristeći prečišćeni tenascin-C su bile izvedene kako je opisano gore. Ulaz proteina i RNK koncentracije za dve runde SELEX-a (E9P1 i E9P2) su opisane uTabeli 2.
Ukratko, tri različita SELEX eksperimenta su bila izvedena: eksperiment koji koristi prečišćeni tenascin-C kao cilj, eksperiment koji koristi U251 ćelije glioblastoma kao cilj, i eksperiment u kome je upotrebljena SELEX akumulacija iz U251 ćelija glioblastoma kao cilj, i eksperiment u kome je bila upotrebljena SELEX akumulacija iz U251 ćelija glioblastoma da se započne SELEX eksperiment koji koristi prečišćeni tenascin-C kao cilj.
Sva tri SELEX eksperimenta su bila analizirana kloniranjem i sekvenciranjem liganada iz runde 8 prečišćenog tenascin-C SELEX-a ("TN" sekvence), iz runde 9 U251 ćelije SELEX-a ("E9" sekvence) i iz runde 2 U251/tenascin-C hibrid SELEX-a ("E9P2" sekvence). Sekvence 34 jedinstvenih kolona su pokazane uTabeli3, i podeljene su u dve glavne grupe: ligandi za tenascin-C ("TN" i "E9P2" sekvence) i ligandi ćelije U251 ("E9" ligandi). Među ligandima za tenascin-C, najveći deo klonova (ukupno 65) predstavlja jednu od dve različite klase sekvenci označenih kao Familija I i Familija II (Slika 1). Ispitivanjem promenjljivog regiona 12 klona u Familiji I otkriveno je 7 jedinstvenih sekvenci koje su srodne preko saglasne sekvence GACNYUUCCNGCYAC (SEQ ID NO: 12). Ispitivanjem promenjljivog regiona od 18 klona u Familiji II otkrivene su sekvence koje dele saglasnu sekvencu CGUCGCC (Tabela 3). E9 sekvence bi mogle da se grupišu u srodan niz pomoću sačuvanih GAY i CAU sekvenci unutar promenljivih regiona. Preostale sekvence izgleda da nisu srodne sa drugim sekvencama i bile su kiasifikovane kao orphani (siročići). Preovlađuju tri sekvence, sa E9P2-1, E9P2-2, i TN9 koje su predstavljene 14, 16 i 10 puta. U "orphan" kategoriji jedna sekvenca, TN18, bila je predstavljena dva puta. Sve u sveku, ovi podaci predstavljaju visoko obogaćenu sekvencnu akumulaciju.
Većina individua je ispoljavala niske nanomolarne konstante disocijacije, sa tri najpreovlađujuće sekvence. TN9 i E9P2-1 i -2, koje imaju najviše afinitete na 5 nM, 2 nM, i 8 nM (Tabela 3). Ovi rezultati pokazuju daje SELEX U251 ćelija majdan za aptamere za tenascin-C, i daje bilo potrebno samo dve runde SELEX-a da se izoluju ligandi specifični za tenascin iz SELEX akumulacije ćelije. Oligonukleotidni ligandi za druge proteine mogu slično da budu izolovani iz E9 akumulacije koristeći prečišćene proteinske ciljeve.
Primer 3. Određivanje minimalne veličine TN9, i supstitucija 2'-OH purina sa 2'-OMe purinima; sinteza aptamera TTAl.
Postupci sinteze oligonukleotida su bili standardni za stručnjake (Green/ sar.
(1995) Chem Biol 2( 10) :683-95). 2'-fluoro pirimidin fosforamidit monomeri su dobijeni od JBL Scientific (San Luis Obispo, CA; 2'-OMe purin, heksilamin, i (CH2CH20)6monomeri, zajedno sa dT polistirolnim čvrstim nosačem, bili su dobijeni od Glen Research (Sterling, VA)). Aptamer afiniteti su bili određeni koristeći nitrocelulozni filter za odvajanja (Greeni sar.,supra).
TN9 je bio odabran za dalju analizu koja bazira na njegovom visokom afinitetu za tenascin-C. Najpre smo tragali za minimalnom sekvencom koja je potrebna za vezivanje visokog afiniteta. Koristeći standardne tehnike (Green i sar., supra), oktriveno je da su nuklotidi 3' od nukleotida 55 bili potrebni za vezivanje za tenascin-C, dok nijedan nukleotid na bi mogao da bude uklonjen sa 5' kraja bez gubitka afiniteta. Da se dalje smanji TN9 dužina od 55 nukleotida i zadrži vezivanje visokog afiniteta, nameravli smo tada da definišemo interna brisanja kod TN9. Prvih 55 nukleotida TN9, zajedno sa prvih 55 nukleotida srodne Familije II liganda TN7, TN21, i TN4I, su bili ulaz u kompjuterski algoritam da se odrede mogući oblici sekundarne strukture RNK (mfold 3.0, pristupačno na http:// www. ibc. wust. edu/~ zugek/, M. Zuker, D.H.Mathews & D.H.Turner. Algoritmi i termodinamika za RNK predskazivanje sekundarne strukture. Praktičan priručnik. U: RNA Biochemistrv and Biotechnologv, J. Barciszewski & B.F.C. Clark, izdavači, NATO ASI series, Kluvver Academic Publishers, (1999)). Među mnogim potencijalnim RNK preklapanjima predskazanim algoritmom, bila je otkrivena struktura zajednička svakom oligonukleotidu. Ova struktura, predstavljena oligonukieotidom TTAl na Slici 2, sadrži tri linije koje se susreću najednom sastavu, takozvanom 3-linijskom sastavu. Ovo preklapanje stavlja najviše očuvane nukleotide Familije II oligonukleotida u oblast spoja. U poređenju sa TN9, TN7, TN21, TN41, druga linija je bila promenjljive dužine i sekvence, sugerišući da proširenje druge linije nije potrebno za vezivanje za tenascin-C. Testirajući ovu hipotezu na TN9, otkrili smo da bi nukleotidi 10-26 mogli da budu zamenjeni sa etilen glikolnim linkerom, (CH2CH20)6. Linker služi kao zamena luka i smanjuje veličinu aptamera. Uz to, četiri nukleotidna luka
(CACU ili GAGA) koji zamenjuju nukleotide 10-26 proizvode sekvence sa visokim afinitetom za tenascin-C.
Da se povisi zaštita protiv aktivnosti nukleaze, bili su locirani položaji purina koji bi mogli da budu supstituisani sa odgovarajućim 2'-OMe purinima. Oligonukleotidi su bili arbitrarno podeljeni u pet sektora i svi purini unutar svakog sektora su bili supstituisani odgovarajućim 2'-OMe purinskim nukleotiđom, ukupan broj od pet nukleotida (Tabela4,Faza I sinteze). Afinitet svakog nukleotida za tenascin-C je bio određen, i nađeno je da bi svi purini sektora 1, 3 i 5 mogli da budu supstituisani bez znatnog gubitka u afinitetu. Unutar sektora 2 i 4, individualni purini su tada supstituisani sa 2'-OMe purinima i meren je efekat afiniteta (Tabela4,Faza III sinteze). Iz voih eksperimenata, zaključeno je da supstitucija nukleotidaG9.G28, G31, i G34, sa 2'-OMe G izaziva gubitak afiniteta za tenascin-C. Prema tome ovi nukleotidi ostaju kao 2'-OH purini u aptameru TTAl.
Aptamer TTAl (Tabela 4) je potom sintetizovan sa (CH2CH20)6(đistancer 18) linkerom, 3'-3' dT kapom za zaštitu egzonukleaze, 5' heksilaminom (Tabela 4), i svi purini kao 2'-0Me izuzev 5G koji su pakazani u Tabeli 4. Kontrolni aptamer koji ne vezuje, TTAl NB, je stvoren brisanjem 5 nukleotida na 3' kraju da se proizvede TTAl.NB. TTAl vezuje za tenascin-C sa konstantom ravnoteže disocijacije (Kd) od 5 nM, dok TTAl .NB ima Kd> 5 uM za tenascin-C.
Nukleotidi 10-26 mogu da se zamene nenukleotidnim etilen glikolinim linkerom. Verovatno je prema tome da TTAl može da se sintetizuje u dva odvojena komada, gde se prekid uvodi na položaju etilen glikoinog linkera i uvode se novi 5' i 3' krajevi. Posle sinteze, dva molekula će se inkubirati zajedno da se omogući obrazovanje hibrida. Ovaj postupak dozvoljava uvođenje dodatnih amino grupa kao i nukleotida na novim 5' i 3' krajevima. Nove funkcionalnosti bi mogle da se uptrebe za biokonjugovanje. Pored toga, sinteza iz dva komada ima za rezultat povećan hemijski sintetski prinos usled skraćivanja dužine molekula.
Primer 4. Bioraspodela Tc-99m obeleženih aptamera kod miševa kod kojih se širi tumor.
Bioraspodela aptamera je ispitivana konjugovanjem Tc-99m helatora (Hi^; Hilgeri sar.(1998) Tet. Lett 39:9403-9406) na 5' kraju oligonukleotida kako je pokazano na Slici 2, i radioobeležavanjem aptamera sa Tc-99m. Aptamer u njegovom Tc-99m obeleženom oblikuje pokazan na Slici 10. TTAl i TTAl.NB su bili konjugovani u Hi|5na 50 mg/mL aptamera u 30% dimetil formamidu sa 5 molarnih ekvivalenata Hil 5-N-hidroksisukcinimida, puferovano u 100 nM Na borata pH 9,3, u toku 30 minuta na sobnoj temperaturi. HPLC prečišćavanje reversnom fazom dalo je Hi|5-TTA1 i Hi|5-TTA1 .NB. Oligonukleotidi su potom bili obeleženi sa Tc-99m na slecieći način: u 1 mmol Hi]5-aptamera dodaje se 200uJL 100 mM natrijum fosfatnog pufera, pH 8,5,23 mg/mL Na tartarata, i 50 uL Tc-99m pertehnetata (5,0 mCi) koji je eluiran iz Mo-99 kolone (Syncor, Denver) u toku 12 sati upotrebe. Reakcija obeležavanje je započeta dodavanjem 10 juL 5 mg/mL SnCl2. Reakciona smeša je inkubirana 15 minuta na 90°C. Reakcija je odvojena od nereagovanog Tc-99m obrtnom dijalizom kroz 30.000 MVV propusnu membranu (Centrex & Scheukk) sa dva 300 u.L ispiranja. Ovaj protokol obeležavanja rezultuje u 30-50% dodatnog 99m Tc pri čemu je sa specifičnom aktivnošću uneto od 2-3 rnCi/nmola RNK. Tc-99m je vezan preko 5'G kako je pokazano na Slici 5.
Za eksperimente biodistribucije, U251 spol ja kalemljeni tumori su bili izrađeni kao što sledi: U251 ćelije su gajene u Dulbecco-vom modifikovanom Eagle-ovom međijumu dopunjenim sa 10% v/v telećim fetalnim serumom (Gibco BRL, Gaithersburg, MD). Atimični (bez timusa) miševi (Harlan Sprague Dawley, Indianapolis, IN) su subkutano injicirani sa lxl0<6>U251 ćelija. Kada su tumori dostigli veličinu od 200-300 mg (1-2 nedelje), injiciran je Tc-99m obeleženi aptamer intravenozno pri 3,25 mg/kg. U određenim vremenima, životinje su bile anestezirane koristeći izofluran (Fort Dodge Animal Health, Fort Dodge, IA), krv je sakupljena punkturom srca, i životinja je žrtvovana i sakupljena su tkiva. Tc-99m nivoi su bili brojani koristeći gama brojač (Wallac Oy, Turku, Finska). Upijanje aptamera u tkivo je bilo mereno kao % injicirane doze po gramu tkiva (%ID/g).
Slike miševa su dobijene korišćenjem gama kamere. Miševi su stavljeni na kameru (Siemens, LEM+) pod anestezijom (izofluran). Podaci su sakupljeni (30 sec do 10 minuta) i analizirani koristeći Nuclear MAC programsku verziju 3.22.2 (Scientific Imaging, CA) na Povver MAC G3 (Apple Computer, CA).
Eksperimenti bioraspodele,Tabela 5,pokazuju brzo i specifično upijanje aptamera u tkivo tumora: aptamer koji se ne vezuje nije ostao u tumoru. Nivoi Tc-99m krvi se takođe brzo gube. Posle tri sata, Tc-99m nivoi uneti u tumor koristeći Hi15-TTA1 imali su vrlo dug poluživot (> 18 sati). Ovo ukazuje da kad jednom aptamer prodre u tumor, radioobeležavanje nošeno sa njim ostaje u tumoru za dugi period vremena. Takvi podaci pokazuju da će citotoksicni agensi, uključujući radionuklide i neradioaktivne agense, konjugovani za aptamer ostati u tumoru sa dugim poluživotima.
Tc-99m radioaktivnost se pojavljuje takođe u drugim tkivima, naime malim i velikim intestinali jama. Putanju hepatobilijarnog izbacivanja koja se ovde vidi stručnjak može lako da izmeni menjanjem hidrofilnosti Tc-99m helatora, menjanjem helatora, ili menjanjem radiometal/helatorskog para zajedno.
Potpune životinjske slike bile su dobijene koristeći Tc-99m obleženi Hijs-TTAl i na 3 sata posle injekcije. Slike dobijene od miševa injiciranih sa Hi)5-TTA1.NB, jasno pokazuju tumor(Slika3). Dodatna radioaktivnost je evidentna u gastrointestinalnom traktu, kako je predskazano eksperimentima bioraspodele.
Primer 5. Primena fluorescentnoobeleženog TTAldaselokalizuje tenascin-Cunutar tkiva tumora
Materijali i postupci
TTAl i TTA1.NB su sintetizovani kako je opisano gore. Sukcinimdil Rhodamine-Red-X (Molecular Probes, Eugene, OR) je konjugovan u 5' amin aptamera kako je opisano gore za Hi15-NHS konjugaciju. Rhodamine-Red-X-konjugovani aptameri, TTAl-Red i TTAl .NB-red, su bili prečišćeni reversnom fazom HPLC. Kulture
ćelije U251 i rast tumora u golim miševima su bili kako je opisano gore. Pet nmola TTAl-Red-a ili TTAl.NB-Red-a su bili intravenozno injicirani u gole miševe i u željenom vremenu životinja je stavljena pod anesteziju, ispirana sa 0,9% NaCl, i žrtvovana. Tumor je isečen i stavljen u formalin. Posle 24 sata u formalinu, sečene su 10 uM sekcije i Rhodamin-Red-X je otkrivan upotrebljavajući fluorescentni mikroskop (Eclipse E800. Nikon, Japan).
Rezultati: TTAl-Red ima identičan afinitet za tenascin-C kao nekonjugovani izvorni aptamer, TTAl, pri 5 nM. Upoređivali smo nivoe fluorescencije tumora TTAl-Red-a i TTAl.NB-Red-a 10 minuta posle injekcije. Aptamer koji vezuje, TTAl-Red, jako boji tumor ali ne i susedno tkivo (Slika 4). Naprotiv, samo je otkrivena auto-fluorescencija tkiva sa TTAl .NB-Red-om. Ovi rezultati pokazuju korisnost aptamera u fluorescentnom otkrivanju tenascina-Cin vivo,i aptamer može slično da bude upotrebljen za bojenje sekcija tkivaex vivo.
Primer 6. Otkrivanje tumora In Vivo aptamerom TTAl (sada takođe poznat i kao GS7641): dodatni tipovi tumora.
Obeležavanje aptamera, bioraspodela, i goli spoljni kalemi tumora miša izvedeni su kako je opisano u Primeru 4.
Mnogi tipovi humanog tumora su poznati da eksprimuju tenascin-C. Da se proceni sposobnost TTA1/GS7641 da cilja tipove tumora pored glioblastoma, kulture ćelije humanog tumora su gajene kao tumori u golim miševima. Tkivo tumora je ispitivano za eksprimovanje humanog tenascina-C, i oni tumori koji eksprimuju humani tenascin-C su bili ispitivani za upijanje aptamera. Slika 6 pokazuje uzimanje aptamera u više tumora, uključujući glioblastom, grudi, kolorektalni i rhabdomiosarkom. Specifično upijanje u tumor je pokazano poređenjem između vezivanja (TTA1/GS7641) i aptamera koji se ne vezuje (TTAl.NB). Treba primetiti da KB, strani kalem koji eksprimuje miš ali ne humani TN-C, ne pokazuje uzimanje tumora. Ovaj eksperiment proširuje zapažanje uzimanja glioblastoma u dodatne karcinome i sarkome i dalje ukazuje da svi tumori koji eksprimuju humani tenascin-C pokazuju uzimanje TTA1/GS7641.
Primer 7. Alternativno obeležavanje koristeći In-l 11
Proučavanja spoljnog kalema tumora i bioraspodela su izvedena kako je opisano u Primeru 4. Da se spoje DTPA i DOTA u TTA1/GS7641, ciklični anhidrid svakog bio je inkubiran sa TTA1/GS7641 koji sadrži amin pod neutralnim pH uslovima koristeći standardne metode. Strukture DTPA i konjugati su pokazani naSlici8 iSlici 9,gde je svaki bio obeležen sa In-111. DOTA konjugat je imao identične linkere kao za DTPA. DOTA- i DTPA-konjugati su bili obeleženi sa In-111 inkubiranjem na 97°C u 0,5 M NaOAc, pH 5,5 u toku 10 minuta. Posle odstranjivanja neumetnutog radioobeležavanja vrtložnom dijalizom preko 30K skraćene membrane, radioobeleženi aptamer je prebačen u fosfatno puferovani fiziološki rastvor za injiciranje u miševe koji imaju tumor.
Bioraspodela In-111 obeleženog aptamera je znatno različita od Tc-obeležene formulacije koja je opisana u Primeru 4. Slika 7 pokazuje da, u odnosu na Tc-99m obeleženi TTA1/GS7641, radioaktivnost In-111 obeleženog/GS7641 se znatno smanjuje u intestinalijama, sa istovremenim povećanjem uzimanja u jetri i bubrezima. Ovaj eksperiment ukazuje da hemijska svojstva helatora imaju veliko delovanje na raspodclu radioobeležavanja TTA1/GS7641 unutar žive životinje. Obrasci bioraspodele koji su različiti od raspodele Hii5-TTAl/GS7641 mogu da budu korisni za ciljanje tumora pod izvesnim kliničkim uslovima gde je nepoželjno hepatobiiijarno otklanjanje. Takve uslove obuhvataju, ali nisu ograničeni na to, radioterapijske primene kao i snimanje unutrašnjih organa i drugih abdominalnih regija.

Claims (20)

1. Kompleks koji sadrži ligand nukleinska kiselina za tenascin-C, naznačen time, što (a) je navedeni ligand odabran od grupe koja se sastoji od sekvenci sa SEQ ID NOs:4-64; (b) je navedeni ligand više od 70% homologan sa i ima suštinski istu sposobnost da veže tenascin-C kao ligand iz (a); ili (c) navedeni ligand ima suštinski istu strukturu kao što je dato upotrebom NMR ili putem slaganja sekvence upotrebom Zukerfold programa i ima suštinski istu sposobnost da veže tenascin-C kao ligand iz (a); i marker.
2. Kompleks iz Zahteva 1, naznačen time, što je navedeni ligand gde: su svi pirimidini 2'F; 6=2' OMe G; 7=2' OMe A; 5=3'-3' dT; i B=linker
3. Kompleks iz Zahteva 2, naznačen time, što je B odabran iz grupe koja se sastoji od heksilamina i (CH2CH20)6.
4. Kompleks iz Zahteva 1, naznačen time, što je navedeni marker odabran od grupe koja se sastoji od radionuklida, fluorofora, magnetskih jedinjenja, i biotina.
5. Kompleks iz Zahteva 4, naznačen time, što je radionuklid odabran iz grupe koja se sastoji od tehnecijuma-99m (Tc-99m), Re-188, Cu-64, Cu-67, F-18,<125>J,131J, 1<u>In,32P,186Re.
6. Kompleks iz Zahteva 5, naznačen time, što je navedeni marker tehnecijum-99m.
7. Kompleks iz Zahteva 6, naznačen time, što navedeni ligand nukleinska kiselina za tenascin-C sadrži linker.
8. Kompleks iz Zahteva 7, naznačen time, što je navedeni linker (CH2CH20)6-
9. Kompleks iz Zahteva 7, naznačen time, što navedeni linker ima strukturu
10. Kompleks iz Zahteva 7, naznačen time, što je navedeni ligand nukleinske kiseline gde: su svi pirimidini 2'F; 6=2' OMe G; 7=2' OMe A; 5=3*-3' dT; i B=linker
11. Kompleks iz Zahteva 10, naznačen time, što dalje sadrži tehnecijum-99m helator.
12. Kompleks iz Zahteva 11, naznačen time, što je navedeni kompleks
13. Kompleks iz Zahteva 12, naznačen time. što je navedeni kompleks
14. Kompleks iz Zahteva 13, naznačen time, što je navedeni kompleks Heksilaminski linker Svako A = 2'-OMe Svako G, osim naznačenih, je 2'-OMe modifikovano Svako C je 2'-F modifikovano Svako U je 2'-F modifikovano
15. Kompleks iz bilo kog od zahteva 1-14, naznačen time, što se upotrebljava u terapiji ili uin vivoiliex vivodijagnostici.
16. Postupak za pripremanje kompleksa prema bilo kom od Zahteva 1-14, naznačen time, što se navedeni postupak sastoji od kovalentnog vezivanja navedenog liganda nukleinska kiselina za tenascin-C sa navedenim markerom.
17. Upotreba marker-nukleinska kiselina kompleksa iz bilo kog od zahteva 1-14 u proizvodnji farmaceutske kompozicije za detektovanje prisustva bolesti koja eksprimuje tenascin-C u biološko tkivo, koje može sadržati navedenu bolest.
18. Upotreba iz Zahteva 17 koja se dalje sastoji od kačenja terapeutskog ili dijagnostičkog agensa za navedeni kompleks.
19. Upotreba marker-nukleinska kiselina kompleksa iz bilo kog od zahteva 1-14 u proizvodnji farmaceutske kompozicije za isporuku terapeutskog agensa bolesti koja eksprimuje tenascin-C, pri čemu je terapeutski agens kovalentno vezan za navedeni ligand da se formira navedeni kompleks.
20. Upotreba iz Zahteva 17-19 pri čemu je navedena bolest odabrana od grupe koja se sastoji od kancera, psorijaze i ateroskleroze.
YUP-64/02A 1999-07-29 2000-01-28 Tenascin -c ligandi nukleinske kiseline RS50426B (sr)

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US09/364,902 US6232071B1 (en) 1990-06-11 1999-07-29 Tenascin-C nucleic acid ligands

Publications (2)

Publication Number Publication Date
YU6402A YU6402A (sh) 2005-03-15
RS50426B true RS50426B (sr) 2009-12-31

Family

ID=23436596

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
YUP-64/02A RS50426B (sr) 1999-07-29 2000-01-28 Tenascin -c ligandi nukleinske kiseline

Country Status (29)

Country Link
US (4) US6232071B1 (sr)
EP (1) EP1198589B9 (sr)
JP (1) JP2003505111A (sr)
KR (1) KR100605072B1 (sr)
CN (2) CN1164760C (sr)
AT (1) ATE405675T1 (sr)
AU (1) AU767501C (sr)
BG (1) BG106361A (sr)
BR (1) BR0013170A (sr)
CA (1) CA2380473A1 (sr)
CZ (1) CZ2002365A3 (sr)
DE (1) DE60039986D1 (sr)
DK (1) DK1198589T3 (sr)
EA (1) EA004795B1 (sr)
EE (1) EE200200051A (sr)
ES (1) ES2310989T3 (sr)
HK (1) HK1048499B (sr)
HR (1) HRP20020186A2 (sr)
HU (1) HUP0202221A3 (sr)
IL (2) IL147872A0 (sr)
MX (1) MXPA02000819A (sr)
NO (1) NO20020424L (sr)
NZ (2) NZ516907A (sr)
PL (1) PL201637B1 (sr)
RS (1) RS50426B (sr)
SK (1) SK1222002A3 (sr)
UA (1) UA75578C2 (sr)
WO (1) WO2001009390A1 (sr)
ZA (1) ZA200200747B (sr)

Families Citing this family (27)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6232071B1 (en) * 1990-06-11 2001-05-15 Gilead Sciences, Inc. Tenascin-C nucleic acid ligands
US7005260B1 (en) * 2000-01-28 2006-02-28 Gilead Sciences, Inc. Tenascin-C nucleic acid ligands
CA2328356A1 (en) * 1999-12-22 2001-06-22 Itty Atcravi Recreational vehicles
US7645743B2 (en) * 1999-12-22 2010-01-12 Altermune, Llc Chemically programmable immunity
DK2070939T3 (da) 2001-05-25 2014-06-23 Univ Duke Modulatorer af farmakologiske midler
US20040249130A1 (en) * 2002-06-18 2004-12-09 Martin Stanton Aptamer-toxin molecules and methods for using same
US20040022727A1 (en) * 2002-06-18 2004-02-05 Martin Stanton Aptamer-toxin molecules and methods for using same
US8039443B2 (en) * 2002-11-21 2011-10-18 Archemix Corporation Stabilized aptamers to platelet derived growth factor and their use as oncology therapeutics
US8853376B2 (en) 2002-11-21 2014-10-07 Archemix Llc Stabilized aptamers to platelet derived growth factor and their use as oncology therapeutics
US10100316B2 (en) 2002-11-21 2018-10-16 Archemix Llc Aptamers comprising CPG motifs
US7727969B2 (en) * 2003-06-06 2010-06-01 Massachusetts Institute Of Technology Controlled release nanoparticle having bound oligonucleotide for targeted delivery
WO2006093932A2 (en) * 2005-03-01 2006-09-08 Cedars-Sinai Medical Center Use of eotaxin as a diagnostic indicator for atherosclerosis and vascular inflammation
UY29460A1 (es) * 2005-04-08 2006-11-30 Noxxon Pharma Ag Acidos nucleicos de union a ghrelin
EP1897562A1 (en) * 2006-09-08 2008-03-12 Bayer Schering Pharma Aktiengesellschaft Aptamers labelled with Gallium-68
MX2009002492A (es) 2006-09-08 2009-08-28 Bayer Schering Pharma Ag Agentes que comprenden compuestos marcados con 18f y metodos relacionados.
US20110136099A1 (en) 2007-01-16 2011-06-09 Somalogic, Inc. Multiplexed Analyses of Test Samples
US8975026B2 (en) 2007-01-16 2015-03-10 Somalogic, Inc. Method for generating aptamers with improved off-rates
CN101802225B (zh) * 2007-07-17 2013-10-30 私募蛋白质体公司 检测样品的多元分析
EP2036981A1 (en) * 2007-09-12 2009-03-18 Bayer Schering Pharma Aktiengesellschaft Aptamers labeled with 18F
CN102459298A (zh) 2009-05-05 2012-05-16 阿尔特姆恩科技责任有限公司 化学可编程免疫
US8841429B2 (en) 2009-11-03 2014-09-23 Vivonics, Inc. Nucleic acid ligands against infectious prions
US8236570B2 (en) 2009-11-03 2012-08-07 Infoscitex Methods for identifying nucleic acid ligands
GB201114662D0 (en) 2011-08-24 2011-10-12 Altermune Technologies Llc Chemically programmable immunity
BR112014014295A2 (pt) * 2011-12-12 2017-06-13 Isis Innovation método para determinar um estado de artrite reumatoide, kit para a determinação o estado de artrite reumatoide erosiva de um indivíduo, usos de tenancina-c, e de uma determinação do nível de tenascina-c, e, métodos para tratar uma condição inflamatória, e uma artrite reumatoide
CN102533772B (zh) * 2011-12-12 2013-10-09 中国科学院武汉病毒研究所 一种抗hbv诱饵适体及其筛选方法
KR102213609B1 (ko) 2012-07-13 2021-02-08 웨이브 라이프 사이언시스 리미티드 키랄 제어
CN107058596A (zh) * 2017-06-19 2017-08-18 上海市第十人民医院 一种与恶性胶质瘤诊断相关的标志物及其应用

Family Cites Families (16)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE229046T1 (de) 1985-03-30 1987-12-17 Marc Genf/Geneve Ballivet Verfahren zum erhalten von dns, rns, peptiden, polypeptiden oder proteinen durch dns-rekombinant-verfahren.
WO1989006694A1 (en) 1988-01-15 1989-07-27 Trustees Of The University Of Pennsylvania Process for selection of proteinaceous substances which mimic growth-inducing molecules
US6610841B1 (en) * 1997-12-18 2003-08-26 Gilead Sciences, Inc. Nucleotide-based prodrugs
US5496938A (en) * 1990-06-11 1996-03-05 Nexstar Pharmaceuticals, Inc. Nucleic acid ligands to HIV-RT and HIV-1 rev
US6127119A (en) * 1990-06-11 2000-10-03 Nexstar Pharmaceuticals, Inc. Nucleic acid ligands of tissue target
ES2259800T3 (es) * 1990-06-11 2006-10-16 Gilead Sciences, Inc. Procedimientos de uso de ligandos de acido nucleico.
US5789157A (en) * 1990-06-11 1998-08-04 Nexstar Pharmaceuticals, Inc. Systematic evolution of ligands by exponential enrichment: tissue selex
US6232071B1 (en) * 1990-06-11 2001-05-15 Gilead Sciences, Inc. Tenascin-C nucleic acid ligands
JPH06508022A (ja) 1991-02-21 1994-09-14 ギリアド　サイエンシズ，インコーポレイテッド 生体分子に特異的なアプタマーおよび生産方法
US5683874A (en) * 1991-03-27 1997-11-04 Research Corporation Technologies, Inc. Single-stranded circular oligonucleotides capable of forming a triplex with a target sequence
US5582981A (en) * 1991-08-14 1996-12-10 Gilead Sciences, Inc. Method for identifying an oligonucleotide aptamer specific for a target
US5436132A (en) * 1993-02-13 1995-07-25 Amano Pharmaceutical Co., Ltd. Quantitative determination of tenascin as glioma marker
US5859228A (en) * 1995-05-04 1999-01-12 Nexstar Pharmaceuticals, Inc. Vascular endothelial growth factor (VEGF) nucleic acid ligand complexes
US6229002B1 (en) * 1995-06-07 2001-05-08 Nexstar Pharmaceuticlas, Inc. Platelet derived growth factor (PDGF) nucleic acid ligand complexes
RU2177950C2 (ru) * 1996-10-25 2002-01-10 Нексстар Фармасьютикалз, Инк. Комплексы нуклеиновых кислот - лигандов сосудистого эндотелиального фактора роста (vegf)
US6242246B1 (en) * 1997-12-15 2001-06-05 Somalogic, Inc. Nucleic acid ligand diagnostic Biochip

Also Published As

Publication number Publication date
EP1198589B1 (en) 2008-08-20
JP2003505111A (ja) 2003-02-12
YU6402A (sh) 2005-03-15
CA2380473A1 (en) 2001-02-08
SK1222002A3 (en) 2002-09-10
KR100605072B1 (ko) 2006-07-26
NZ528077A (en) 2005-04-29
AU767501C (en) 2004-06-17
CN1365395A (zh) 2002-08-21
DK1198589T3 (da) 2008-11-17
US20060105378A1 (en) 2006-05-18
US20030104377A1 (en) 2003-06-05
HRP20020186A2 (en) 2004-02-29
HK1048499A1 (zh) 2003-04-04
NO20020424L (no) 2002-03-27
PL353357A1 (pl) 2003-11-17
UA75578C2 (en) 2006-05-15
DE60039986D1 (de) 2008-10-02
AU3351900A (en) 2001-02-19
HUP0202221A1 (en) 2002-10-28
US6232071B1 (en) 2001-05-15
BG106361A (bg) 2002-10-31
ATE405675T1 (de) 2008-09-15
PL201637B1 (pl) 2009-04-30
ES2310989T3 (es) 2009-02-01
EE200200051A (et) 2003-04-15
EA200200094A1 (ru) 2002-08-29
EP1198589B9 (en) 2009-08-12
KR20020092897A (ko) 2002-12-12
US6596491B2 (en) 2003-07-22
EA004795B1 (ru) 2004-08-26
NO20020424D0 (no) 2002-01-28
IL147872A (en) 2008-06-05
CN1164760C (zh) 2004-09-01
WO2001009390A1 (en) 2001-02-08
ZA200200747B (en) 2004-01-28
HK1048499B (zh) 2005-05-13
AU767501B2 (en) 2003-11-13
IL147872A0 (en) 2002-08-14
CN100558411C (zh) 2009-11-11
CN1589908A (zh) 2005-03-09
NZ516907A (en) 2003-10-31
BR0013170A (pt) 2002-04-02
CZ2002365A3 (cs) 2002-06-12
EP1198589A1 (en) 2002-04-24
US20040058884A1 (en) 2004-03-25
HUP0202221A3 (en) 2010-01-28
EP1198589A4 (en) 2003-02-19
MXPA02000819A (es) 2003-07-14

Similar Documents

Publication Publication Date Title
RS50426B (sr) Tenascin -c ligandi nukleinske kiseline
JP4176466B2 (ja) 前立腺特異的膜抗原に対する核酸リガンド
US6013443A (en) Systematic evolution of ligands by exponential enrichment: tissue SELEX
US6699843B2 (en) Method for treatment of tumors using nucleic acid ligands to PDGF
AU777043B2 (en) Nucleic acid ligands to CD40ligand
US5723594A (en) High affinity PDGF nucleic acid ligands
AU2002224401A1 (en) Nucleic acid ligands to the prostate specific membrane antigen
EP1204672A1 (en) High affinity vascular endothelial growth factor (vegf) receptor nucleic acid ligands and inhibitors
WO2001087351A1 (en) Method for treatment of tumors using nucleic acid ligands to pdgf
US7005260B1 (en) Tenascin-C nucleic acid ligands
AU782620B2 (en) High affinity vascular endothelial growth factor (VEGF) receptor nucleic acid ligands and inhibitors