CZ2002660A3

CZ2002660A3 - Způsob identifikace vazebných partnerů pozičně specifickým testem

Info

Publication number: CZ2002660A3
Application number: CZ2002660A
Authority: CZ
Inventors: Eberhard Krause; Thomas Bittorf; Jens Schneider-Mergener
Original assignee: Jerini Ag
Priority date: 1999-09-03
Filing date: 2000-09-01
Publication date: 2002-10-16
Also published as: WO2001018545A2; AU7644200A; DE19943743A1; EP1212622A2; DE19943743C2; WO2001018545A3; DE10082703D2; JP2003511652A; CA2386607A1; PL353995A1; HUP0203074A2

Description

Oblast techniky

Předložený vynález se týká způsobu identifikace vazebných partnerů pomocí hmotnostní spektrometrie, pozičně specifickým testem

Dosavadní stav techniky

S pokračujícím dekódováním lidského genomu je stále více zřejmé, že funkce genů a genových produktů je obtížné nebo ve většině případů nemožné předpovědět. Z tohoto důvodu je stále důležitější vyvinout způsob ke zjištění funkce genů. Funkce se přitom skládá v zásadě z dynamické syntézy a degradace proteinů a jejich interakce s ligandy, které ve většině případů jsou rovněž proteiny. Regulace funkce proteinů je extrémně komplikovaný proces, který je ovlivňován na různých úrovních, tak například posttranslačními modifikacemi, jejich poločasy degradace, kompartmentací, ale také dynamickými změnami terciární struktury. Oblast výzkumu funkcí a interakcí všech proteinů uvnitř buňky se nazývá „Proteomika“ (Dove, 1999; Hochstrasser, 1998), množina všech proteinů buňky se označuje jako „Proteom“. Tato oblast výzkumu bude mít mimořádný vliv na identifikaci účelu účinných látek, jejich formát a jejich objevy.

Ke znázornění proteomu buňky se dnes téměř výhradně používá metoda dvourozměrné polyakrylamidové gelové elektroforézy (2D-PAGE). Proteiny se v prvním rozměru od sebe oddělí pomocí izoelektrické fokusace, k ní v pravém úhlu SDS elektroforetické dělení vytvoří druhý rozměr. Tato metoda dnes umožňuje analýzu tisíců proteinů z dvourozměrného gelu během několika dní. Přitom jsme si však vědomi faktu, že je obtížné na jednom 2D-gelu oddělit více jak 50 až 60% proteomu, což je způsobeno velmi rozdílnými chemickými a fyzikálními vlastnostmi buněčných proteinů. Přitom se většina buněčných proteinů vyskytuje v buňce jen ve velmi malém množství.

K další analýze se izolovaný protein oddělený v 2-D gelu ve formě bandu nebo spotu většinou před svou elucí z matrice proteolyticky rozštěpí. Ktomu je třeba gelovou matrici zredukovat a podmínky v gelu musí být pro štěpení vhodné. Štěpení trvá více hodin.

Bluggel a Immler (Biospektrum 5/98, str. 39-44) popisují v návaznosti na výše uvedené technologické kroky další identifikaci dílčích spekter peptidových fragmentů pomocí hmotnostní spektrometrie. Tato metoda hodící se pouze k analýze jednoho proteinového spotu je ale velmi zdlouhavá a ještě stále vzdálená stupni automatizace, která se požaduje pro efektivní analýzu.

Klíčovým aspektem u proteomiky a hledání látek je identifikace signálních drah (pathways) v souvislosti se stimulací buněk zprostředkovanou interakcí receptor ligand. Tyto signální dráhy zahrnují kaskády protein-protein interakcí, kterými mohou být pouze nekovalentní fyzikální interakce proteinů signální dráhy, ale také kontakty enzymatického typu, jako fosforylace, defosforylace nebo proteolytické interakce.

Metodou identifikace buněčných interagujících partnerů, která je nyní k dispozici, je „yeast two-hybrid“ screeningový systém (např. Colas a Brent, TIBTECH 1998, 16 str. 355-363). Tato metoda in vitro však vede často k falešně pozitivním nebo falešně negativním výsledkům.

US 5821047 popisuje další aktuální přístup k identifikaci buněčných interaktivních partnerů, takzvaný „phage display“. Metoda obsahuje fúzi zkoumaného proteinu s C -terminální doménou genu III obalového proteinu filamentárního fága M13. S tímto fúzním proteinem prezentovaným na povrchu fága M13 se potom provede screening nového ligandu zkoumaného proteinu.

Další zajímavou a rozšiřující se technikou je povrchová plasmově-rezonanční biomolekulárně interakční analýza pomocí hmotnostní spektrometrie (BIA/MS) (Nelson a Krone, 1999). Je třeba vyčkat, jak se tento příspěvek vzhledem k signifíkact dat a potřebné automatizaci osvědčí v praxi.

Ke zkoumání molekulárních poznatků se používají na celulosových membránách peptidy syntetizované pomocí „techniky bodové syntézy“

Všechny výše uvedené způsoby analýzy proteomů a zkoumání v oblasti proteomiky mají značné nedostatky. Jsou experimentálně i časově náročné a nepostihují při analýze všechny proteiny v buňce najednou. Metoda 2D-PAGE je pro mnoho proteinů málo citlivá a nehodí se kproteomové analýze, protože neumí popsat interakce proteinů jedné buňky.

Všechny uvedené způsoby a metody jsou ještě navíc pro stále více požadovanou automatizaci při vývoji látek nevhodné.

Je proto úkolem předloženého vynálezu dát k dispozici pro analýzu proteomů způsob identifikace celulárních interakčních partnerů, který představuje rychlou, hodnotnou a spolehlivou analyzační metodu k identifikaci buněčných interakčních partnerů a která se dá bez velkých problémů automatizovat.

Podstata vynálezu

U způsobu podle vynálezu k identifikaci vazebných partnerů pomocí hmotnostní spektrometrie pozičně specifickým testem se na nosném materiálu pomocí specificky polohově naneseného malého objemu reakčních partnerů vytvoří polohově specifická testovací ligační oblast, přičemž se postupně provádí nejméně dvě po sobě následující reakce. Na nosném materiálu fixovaná polohově specifická ligační oblast se inkubuje se směsí ligandů, následně se odstraní ligandy nenavázané na ligační oblast a ligand/dy vázaný/é na ligační oblast se zkoumá/ají dále pomocí hmotnostní spektrometrie.

Překvapivě bylo shledáno, že kombinace inkubace směsi ligandů s testovací látkou specificky pozičně vázanou na nosič a následná analýza vázaných proteinů pomocí hmotnostní spektrometrie nevykazuje výše vyjmenované problémy dosavadního stavu techniky a představuje hodnotnou, rychlou, robustní a spolehlivou metodu analýzy proteomů. Dále může být tento způsob bez velkých problémů plně automatizován, takže je zaručena analýza velkého počtu vzorků při nízkých nákladech.

U způsobu podle vynálezu je výhodné, když ligační oblast je tvořena peptidy, nukleovými kyselinami nebo jinými organochemickými sloučeninami nebo kondenzovanými fragmenty testovaného proteinu. Je zvláště výhodné, je-li směs ligandů tvořena buněčným tyzátem, směsí nukleových kyselin nebo směsí jiných organochemických sloučenin.

U způsobu podle vynálezu se zamezí nákladným přípravným krokům s lyžovanými buňkami, protože jedna výhodná formy provedení způsobu vynálezu umožňuje najednou analyzovat všechny proteiny buňky bez jejich purifikace. Použití pozičně specifického testu umožňuje navíc standardizaci metody. Nosič pro testované peptidy použitý ve způsobu vynálezu může být pevný nebo pružný a zejména mohou být použity pryskyřičné kuličky, polymer částice nebo čipový materiál. Je zvláště výhodné, pokud je použitý materiál polymerní membrána, jako je například nylonová, celulosová membrána, membrána z modifikované celulózy nebo modifikované polypropylenové membrány.

* to to·· · · ··· «to to to ·· ··· to «toto · · totototo ·· to «·· ·· ·< ·· to»· ·· ····

K provedení způsobu podle vynálezu se běžně používá buněčný lyzát, je ale také možné použít odstředěním, filtrací nebo jinou vhodnou metodou získaný rozfrakcionovaný buněčný lyzát. Buněčným lyzátem může být lyzát z prokaryotních nebo eukaryotních buněk, je možné použít i transformované nebo transgenní buňky. Zvláště výhodné je, jestliže se jako buněčný lyzát použije lyzát značený ^Smethioninem nebo ^S-cysteinem.

Další forma provedení způsobu podle vynálezu se vyznačuje tím, že se použije buněčný lyzát spolu s nejméně jedním definovaným kofaktorem. Jako kofaktor se dají použít například proteiny nebo kovové ionty.

Další výhodný způsob podle vynálezu je charakterizován tím, že peptidy použité pro testovánímají délku mezi 3 a 30 aminokyselinami. Výhodné jsou peptidy o délce mezi 6 a 15 aminokyselinami, zvláště výhodné jsou peptidy o délce 13 aminokyselin. Zvláště se dává přednost provedení způsobu podle vynálezu, u kterého se peptidy použité pro testovací peptidovou oblast ukotví na nosič pomocí raménka. Toto raménko může být citlivé vůči proteázám nebo chemicky rozložitelné.

Další výhodný způsob podle vynálezu se vyznačuje tím, že použitá testovací peptidová oblast má tvar bodu (spotu).

Na testovací peptidovou oblast nenavázaný protein se podle vynálezu může odstranit vymýváním pufrem nebo vysrážením.

Jedna forma způsobu podle vynálezu je význačná tím, že protein/y vázaný/né na testovací peptidovou oblast se před štěpením proteázou oddělí od nosiče a následně se přečistí gelovou elektroforézou.

Hodnocení proteinů štěpených proteázou nebo ligandu, nebo odštěpených ligandu se podle vynálezu provádí pomocí hmotnostní spektrometrie, výhodně pomocí MALDI (Matrix assisted laser desorption ionisation) nebo ESI (Electrospray ionisation) hmotnostní spektrometrie, zvláště výhodně pomocí MALDI-TOF hmotnostní spektrometrie.

Zvláštní předností způsobu podle vynálezu je skutečnost, že všechny kroky analýzy proteomu je možné plně automatizovat. Dalším předmětem předloženého vynálezu je proto robot k provádění způsobu podle vynálezu.

Spotová syntéza (SPOT-synthesis) {R. Frank, Tetrahedron 1992, 48, 92179232, DE-OS 4027675) je osvědčená metoda k místně řízené syntéze peptidů a jejich screeningu na vazbu k proteinům {A.Kramer, J. J. Schneider-Mergener, Meth. Mol. Biol. 1998, 87, 25-39, A. Kramer, A. Schuster, U. Reineke, J.Schneider5

Mergener, METHODS (Comp. Meth. Enzymol.) 1994, 6, 388-395). Kromě peptidů jsou přístupné tímto způsobem i jiné třídy sloučenin jako např. peptoidy (T.Ast, N.Heine, L. Germeroth, J. Schneider-Mergener, H. Wenschuh, Tetraheron Lett. 1999, 40, 4317-4318).

Způsob podle vynálezu je použitelný s nejrůznéjšímí ligandy. Vhodné ligandy, které mohou tvořit pozičně specifické ligační oblasti podle vynálezu jsou například aniž by se to na ně omezilo - peptidy, β a γ peptidy, peptoidy, (oligo)-močoviny, {oligo-)thiomočoviny, (oligo-)karbamáty, (oligo-)karbonáty, triaziny, (oligo-)sulfonamidy, azatidy a glyko-konjugáty výše uvedených sloučenin, (oligo-)sacharidy, PNA (Peptide-Nucleic-Acid), hydantoin, 2-piperazon, izochinoliny, benzodiazepiny, farmakologický aktivní sloučeniny a látky (například antidepresiva, β-blokátory, kardiovaskulárně aktivní sloučeniny, antiarhytmika, antihistaminika, trankvilizéry, H2-blokátory, léčiva acidosy, aminoglykosidová antibiotika, amébicidy, anestetika, analgetika, androgeny, antacidy, antihelmetika, antialergika, antiandrogeny, antibiotika, anticholinergika, antikoangulancia, antikonvulsiva, antidota, antiemetika, antifibrinolytika, antihypertensiva, antihypertonika, antihypotonika, antimalarika, antimykotika, léky proti Parkinsonově nemoci, antiflogistika, antipsoriatika, antipyretika, antirevmatika, antiskabiotika, antiseboroika, antiseptika, protinádorové prostředky, antitusiva, atemanaleptika, bronchiolytika, antagonisté kalcia, kardiotonika, cerebrotonika, chemoterapeutika, látky snižující hladiny cholesterolu, cytostatika, inhibitory dehydropeptidázy, dezinfekční prostředky, diagnostické látky, diuretika, expektorancia, fibrinolytika, fungicidy, gestageny, glukokortikoidy, (LH-RH)-agonisté gonadorelinu, hypnotika, imunostimulancia, imunosupresiva, keratolytika, inhibitory β- laktamázy, laxativa, jaterní léky, ochranné prostředky proti světlu, látky snižující hladinu lipidů, lipotropika, lokální anestetika, antimalarika, myotika, svalová relaxancia, mydriatika, neuroleptika, neurotropika, ophtalmologika, parasympatikomimetika, léky na prostatu, proteolytika, psychotropika, rinologika, kontrastní látky pro rtg vyšetření, sedativa, spasmolytika, spermatocídy, sympatikomimetika, látky inhibující agregaci trombocytů, inhibitory trypsinu, tuberkulostatika, léky proti vředům, vasokonstriktory, vasodilatátory, léky proti žilním onemocněním, virustatika, vitamíny nebo přírodní látky (například steroidy, terpeny, alkaloidy, flavonoidy, mastné kyseliny, lipidy, feromony, vonné látky, protilátky, hormony, jedy, obranné, signální a růstové látky, enzymy) a další výše neuvedené organochamické sloučeniny.

• · ··· • · «· ♦

• · ··· * · · · « • · » · ft· *·» • · • · * · ·*« ·

Popis obrázků

Vynález bude blíže popsán na následujících příkladech.

Jak je vidět z obr. 1, proteiny značené se váží na imobilizované peptidy, které představují intracelulární EPOR-domény. Na celulózu vázané peptidy s částečné překrývajícími se sekvencemi (13 aminokyselin, přesah 10 aminokyselin), které pokrývají celou intracelulární EPOR-doménu (peptid čís. 1 představuje aminokyseliny 248-260, čís. 2 aminokyseliny 251-263 atd; sekvenční informace viz obr. 3), byly inkubovány s lyzáty erytroleukemických buněk J2E po označení ^S-methioninem/cysteinem EPO-stimulovaných (A) nebo nestimulovaných (B); vázané proteiny byly zjištěny autoradiograficky;

Obr. 2 znázorňuje in vitro translaci cDNA, které kódují různé signální molekuly. cDNA byly subklonovány a podrobeny translaci in vitro s použitím T7 a T3 polymerázy jak bylo popsáno (jedna z obou reakcí sloužila jako vnitřní kontrola).; Alikvotní část reakční směsi byla rozseparována pomocí PAGE.; Radioaktivní proteiny byly detekovány autoradiograficky po fluorografickém zesílení; molekulární hmotnost je uvedena na pravé straně (v kDa);

Obr. 3 ukazuje jak se proteiny JAK2, SHP1 a PLCy vázaly na imobilizované peptidy pokrývající sekvenci EPOR-domény. (A) částečně se překrývající sekvence jednotlivých peptidů vázaných na celulózu, (B) radioaktivně značené proteiny byly inkubovány s imobilizovanými peptidy jak popsáno a autoradiograficky zviditelněny; (C) ukazuje sekvenci celé intercelulární domény a oblasti s nejsilnějšími radioaktivními signály jsou pro příslušné uvedené proteiny označeny rámečky;

Na obr. 4 je „fingerprinť hmotnostní spektrum MALDI hmotnostní spektrometrie spotu E2 (tyrosín-protein-kináza JAK3).

Obr. 5 ukazuje výsledek analýzy spektra spotu E2 na obrázku 4 a

Obr. 6 znázorňuje aktivitu po inkubaci knihovny skládající se z 1600 dipeptoidů s buněčným lyzátem značeným “S- methioninem.

Příklady provedení vynálezu

Identifikace vazebních partnerů erytropoetinového receptoru s pozičně specifickými peptidovými oblastmi a pomocí hmotnostní spektrometrie

Aby bylo možno identifikovat potenciální intracelulámě interaktivní partnery erythropoetinového receptoru (EPOR), byly buněčné lyzáty erytropoetinem (EPO) stimulovaných a nestimulovaných buněk inkubovány s EPOR-specifickými skreeningovými peptidy vázanými na celulózové membrány - Peptidscan (čip s vázanými peptidy), proteiny různých vybraných skvrn byly rozsaparovány pomocí gelové elektroforézy a oddělené bandy byly analyzovány hmotnostní spektrometrií.

V dřívějších experimentech se ukázalo, že inkubace jedné sady peptidů s částečně překrývajícími se sekvencemi vázaných na celulózovou membránu, které pocházely z cytoplasmatické části TNF-receptoru (Tumor Necrosis Factor Receptor, 55 kDa, TNF-R55) s lyzátem buněk Jurkat značeným ^S-methioninem vedlo k vazbě buněčných proteinů na rozdílné spoty TNF-R Scanu. Oblasti TNF-R zvýrazněné tímto postupem odpovídaly přesně intracelulárním oblastem TNF-R, které už dříve byly popsány jako zodpovědné za různé biologické funkce tohoto receptorů. Dále mohlo být ukázáno, že nově objevený protein FAN pomocí “yeast two hybrid“ sytému reagoval specificky s různými spoty TNF-R Scanu, který odpovídal oblasti, která je známa aktivací neutrální sfingomyelinázy Použití dvou technik vedlo proto k relativně rychlé identifikaci nového proteinu, který se podílí na TNF signální kaskádě. Přesto byl tento proces relativně pracný, protože bylo nutno charakterizovat velký počet klonů cDNA (>50) získaných “yeasttwo-hybrid“ systémem vázaných na určitou receptorovou oblast.

Aby byla získána přímější cesta k identifikaci interaktivních partnerů v buněčné signálové kaskádě a bylo možno obejít použití „yeast two-hybrid“ systému, byl proveden pokus se získáním proteinů přímo ze spotu a tyto proteiny podrobit štěpení trypsinem a analyzovat hmotnostní spektrometrií a analýzou databanky. K otestování tohoto nového experimentálního postupu, byl v tomto případě syntetizován peptidscan vázaný na celulózovou membránu pocházející z EPO-R, který pak byl inkubován s buněčným lyzátem J2E erythroleukemických buněk odpovídajících na EPO a značených pomocí ^S-methioninu/cysteinu (viz obr. 1). Byla pozorována vazba na různé receptor- specifické spoty. Překvapivě byl jasný rozdíl ve vazbě při použití lyzátu buněk J2E stimulovaných EPO.

Intracelulámí domény cytokinových receptorů se - jak známo ~ skládají ze strukturálních modulů pro vazbu specifických buněčných signálních proteinů. Soudí se, že při regulaci genové exprese se uplatňuje schopnost interakce s určitými cílovými strukturami, kompetice a specifita. Aby bylo možno ověřit novou strategii k analýze interakcí mezi buněčnými proteiny a peptidy, které představují intracelulámí doménu receptorů EPO, byly použity na spotu syntetizované peptidy

8*’”· ·” ·»·’ · · · * • · «·» * * »·· · · · • ·» ··· * ··« · · ·«»* · · · · · ·· «» ♦♦ ··· ·· ···· vázané na celulózu. Buněčné proteiny erythroleukemické buněčné linie J2E odpovídající na EPO byly označeny in vivo pomocí inkorporace ^S-aminokyselin a jak bylo popsáno výše byl buněčný lyzát inkubován s imobilizovanými peptidy. Na obr. 1 je zobrazeno jak interagovaly buněčné lyzáty buněk stimulovaných pomocí EPO a nestimulovaných buněk. Byly pozorovány silné protein - peptidové interakce zvláště s peptidy, které odpovídají proximální membránové oblasti EPOR. Stimulace pomocí EPO zřejmě zvyšuje afinitu některých proteinů k určitým peptidům, ale většina interakcí zůstává nezměněna.

Ke studiu vazebných vlastností jednotlivých proteinů, u kterých bylo známo, že reagují s EPOR, byl použit výběr těchto proteinů in vitro translatovaných v témže systému. Přítomnost a čistota jednotlivých radioaktivních proteinů o známé velikosti byla ověřován a pomocí PAGE (obr. 2). Následně byly provedeny preparace s radioaktivně značenými proteiny, aby byla jistota, že všechny nalezené interakce jsou specifické.

Jak se vázaly tři signální molekuly, které se jak známo podílí na vzniku EPOR komplexu , je ukázáno na obr. 3. Značené proteiny reagují specificky s peptidy odvozenými z EPOR. JAK2 je považována za rozhodující kinázu, která zprostředkovává signální aktivity indukované pomocí EPOR a substituuje nepřítomnost jakékoli intramolekulární enzymové aktivity v intracelulámí doméně.

JAK2 se váže proximálně na aminokyseliny nejbližší k membráně a dodatečně na peptidy, které odpovídají distální oblasti receptoru.

Vazba proximálně vzhledem k membráně souhlasí s údaji o mutantech EPOR, které opakovaně ukázaly, že JAK2 imunoprecipituje s na C-konci silně zkrácenými receptorovými formami. Navíc mutace v oblasti sousedící s membránou zabraňují vazbě proteinu JAK2 a tak jeho funkci. Druhé místo interakce bylo identifikováno vdistálnější části receptoru. Je zajímavé, že tyrosinfosfatáza SHP1, která se funkčně podílí na signálové kaskádě indukované pomocí EPO, se váže s vysokou aktivitou na stejný peptid, aminokyseliny 386-398 a rovněž na proximální sekvenci membránových aminokyselin, jako JAK2. Už dříve bylo ukázáno, že fosfatáza, která obsahuje doménu SH2, se váže na fosfotyrosin 429 v C-terminální části aktivovaného receptoru. Zde předložené výsledky byly dosaženy s nefosforylovanými peptidy, i když mohla nastat fosforylace kinázou případně se vyskytující v lyzátu retikulocytů, který byl použit k in vitro k translaci, což se nedá úplně vyloučit. Místa vazby proteinů ukazují, že možná existují dodatečné interakce nezávislé na • · fosforylaci. JAK2 a SHP1 byly popsány jako funkčně závislé a interagují rovněž v in vitro experimentech. Jak bylo výše uvedeno, obsahuje lyzát použitý pro in vitro translaci také další neradioaktivní proteiny, které mohou vazebnou interakci. To muže vysvětlovat, že JAK2 se váže na preferenční místo pro SHP1 a obrácené. Za předpokladu vazby „neznačeného“ JAK2 a SHP1 na peptidy, mohou radioaktivní JAK2 a SHP1 interagovat a tím se vázat nepřímo na peptidy. Přesné místo interakce pro PLCy a EPOR nebylo dosud popsáno. Jestli vazba PLCy je vazbou na specifické tyrosiny uvnitř EPOR, je třeba zjistit. Naše údaje ukazují na vazebnou doménu v blízkosti C-konce, která možná přispívá k navržené interakci SH2-fosfotyrosin.

K podrobnějšímu prostudování popsané formulace bylo zkoumáno, jestli je možné identifikovat proteiny, které jsou vázány na peptidy, jenž pocházejí ze sekvence receptorů. K tomu byly použity peptidy, které vykazují silnou interakci s buněčnými proteiny. Ty byly inkubovány s buněčnými lyzáty a proteiny byly eluovány silnými elučními činidly, jak bylo popsáno. Po rozseparování na akrylamidovóm gelu byly tyto proteiny obarveny, v gelu enzymaticky naštěpeny a jednotlivé fragmenty byly izolovány a analyzovány pomocí hmotnostní spektrometrie. Čistota a množství proteinů vyskytujících se v bandech proteinů v gelu byly zcela dostatečné, aby se z peptidových spotů daly získané proteinové frakce identifikovat pomocí “finger prints“ hmotnostních spekter peptidových štěpů. U některých z těchto proteinů nejsou funkce v souvislosti s EPOR popsány. Například kináza Janus JAK3, o níž je známo, že se podílí na signálových kaskádách IL-2,4,7,9,15, jako vazebný partner peptidů, byla identifikována jako vazebný partner peptidů odvozených ze sekvence EPOR (obr. 4 a obr. 5). Je nezbytné další analýzy funkční relevance identifikovaných proteinů.

Štěpení v gelu

Byla využita Ševčenkem a kol. (1) použitá a snadno modifikovatelná metoda štěpení v gelu. Proteinové spoty byly vyříznuty, pomocí dehydratace 50% acetonitrilem v 25 mM uhličitanu amonném byly vysráženy a vysušeny v vakuové odstředivce.

Kousky gelu byly nabotnány v 10 μΙ 5 mM uhličitanu amonného s 300 ng trypsinu. Po 60 minutách bylo přidáno 5 μ! 5 mM uhličitanu amonného, aby se částečky gelui během tryptického štěpení udržely vlhké (37 °C, přes noc). K extrakci peptidů bylo přidáno 15 μΙ 0,5% kyseliny trifluoroctové (TFA) v acetonitrilu a vzorky byly 5 minut vystaveny ultrazvuku. Peptidy byly analyzovány přímo z izolované kapaliny pomocí hmotnostní MALDI spektrometrie.

Hmotnostní MALDI spektrometrie a hledání v databance

Měření hmotnostních spekter byla prováděna na hmotnostním spektrometru

Voyager-DE STR BioSpectrometrie Workstation MALDI-TOF (Perseptive Biosystems, Inc.). 2 μΙ analyzačního roztoku byly rozpuštěny a smíchány s 2 μΙ matricového roztoku alfa-kyano-4-hydroxykyseliny skořicové (4-HCCA), skládajícího se z 10 mg matrice v 1 ml 0,3% TFA ve směsi acetonitril-voda (1:1, obj./obj ). Ze získané směsi byl nanesen 1 μΙ na zkušební destičku. Vzorky byly vysušeny na vzduchu při pokojové teplotě (24 °C). Všechna měření byla provedena v reflexním módu při urychlovacím napětí 20kV, napětí mřížky 70% a při zpoždění 200 ns. Každé získané spektrum tvořilo střední hodnotu z 256 ozáření laserem. Hmotnostní spektra byla kalibrována s použitím známých trypsinových fragmentů jako interního standardu. Zjištěné peptidové hmotnosti byly porovnávány s teoretickými hmotnostmi proteinů z databanky NCBI čís. 11.09.98 s použitím vyhledávacího programu MSFIT.

(http://falcon.ludwig.ucl.ac.uk/msfit.htm).

Stanovení vazebných partnerů knihovny peptidů

Knihovna ze 1600 dipeptidů (velikost membrány: 9 cm x 9 cm) obecného vzorce I kde Ri a R₂ jsou libovolné zbytky, byla inkubována buněčným lyzátem značeným ^S-methyoninem. Pozice A, B a C přitom představují následující sloučeniny:

• · *·· • · « · ·....._ΛΛ

ΒΒ Β« Β· ··· ·· ····

v.

Ϊ i dipeptoid Α \ o >«γ N^yAk Ν*’''Ύ^®¹ <2 o > o *H dipeptoid Β >Λ,

Ύ^ ϊΎ**¹ ⁰ A>° dipeptoid C

Claims

PATENTOVÉ NÁROKY

1.6/24 porovnání (25%); 122561.6 DA; pl=6.25; přístup.č Q63272.RAT; kináza tyrosin-protein JAK3 (kináza Janus 3)(JAK-3)

Návrh m/z Porovnáno MH+ Delta (DA) Start Konec Sekvence peptidu K získání fragmentů iontů kliknout Modifikace 1111,5710 1111,5649 0,0061 882 891 (K)YRGVSYGPR(Q) 1111,5710 1111,5795 -0,0085 941 949 (R)CYHRDLAAR(N) 1267,7090 1267,7486 -0,0396 176 186 (R)KQAQRPGELLK(S) 1451,7680 1451,7391 0,0289 896 907 (R)LVMEYLPSGCLR(D) 1467,7790 1467,7340 0,0450 896 907 (R)LVMEYLPSGCLR(D) 1-Meth-ox 1555,7980 1555,7790 0,0190 1 14 (-)MAPPSEETPLISQR(S) 1571,7950 1571,7739 0,0211 1 14 (-)MAPPSEETPLISQR(S) 1 -Meth-ox

1 9HRKT1Q0KMPO 2 KOQOMMťOre 3 oorawraiPSKa 4 iwraptpswre 8 998PC8EPC0LP 8 SFOBFBOtFTTH 7 smOLFnMKQN 8 (απΤΗΚΟΝΚΙ 0 FTTHtorrotwu 10 HKONFQUNUORD 11 NFQtMUOROQCt 12 LVMUQROOCWWW 13 tOROQCUNWBRM 14 MCUMMffZMFP 18 UMMPQSSPPCDP 1« 8ΡΟ88Π»Κ)ΟΡΑΗ 17 ooppeqppmuv 18 OCDOMHLEVLSe 10 wuvuww 20 HuvLUomwvr 21 AWRWOAO a bprwowtoaoopo 23 WM7TQAQOPQMM) 24 ΤΟΑΟΟΡΟΑΟΟΜΡ 28 ΟΟΡΟΛΟΟβΟΜΙβ 28 4M0OMPU8PUQ 27 oegpueFveaeH 28 PUlF/asiHAQD 2» CPVOtKHAQOTYt 30 OMHAQffTYtVtO 31 KAaoTnvLOKWL 32 DTYU/UKWUPR 33 LVLDKmXMTPC 34 DttNUPKTPCKN 38 UPKTPC9BNUO X RlPeSENLMPOQ 37 CaCNLSOftXKVD- 38 NLMPQOSVOPVT 30 OPOOSVDOVTMD6 40 O8VDPVTMMA1E 41 DoviMoeAflrres 42 TMoeAstmcpo 43 EASETSSCPSOlA 44 KTUCRSOLAIKP 48 SCPUKASKPRPE 40 SDLA9KPRPEGTS 47 AaKPftoeenoes 48 PRP60T8P98«Y 40 lorspteremL 90 SPS9FCYTL0P8 31 3FBYTTLDP89QL 92 rnujpssQUco 83 LOPSSQUjCPRAL 84 99QLLCPRALPPE 98 ucpralppklpp 88 PRALPPCLPPTPP 87 LPWIPPTPPHIK 98 ELPPTPPHUCYIY 30 PTPPHLKIXYWV 80 PHtKYLYtW808 81 κηγιννιΟΜ» 82 YLWS0WWTDY 83 V30S0aTOY8S0 84 sanTOYsaoosa 88 8TDYSMO8OOVH 96 YSSOOSQOVHOOa <7 OO8Q0VHOD9S0O 88 Q0VHQ0880GPYS 80 HQ09800PY8HPY 70 WOQPYSHPYKNS 71 0PY9HPY8N8LVP 72 SHPYENSLVPOSK 73 YÍNStVPDSIPLH 74 8tVPD89PtHP0Y 78 PDStPtHPGY\AC 78 DSÍPUIPOYVŘCS

B

941 288 ΡΒβΙΚΠΗΚΟ 271 WQUNLLQRD 2M GCUWAFeOS 208 PP9OPMHLC 30· VL3EFRW.VT 311 QAOOPGADOE 320 OPLLSRVQSK 391 HAOOTYLVtO 341 KWLLPRTPCS 388 ENL8QPQO8V 399 371 OPVTMDEASE T8SCP80HMteKĚ HIIIOTFWITI· » 408 418 EF<tilof£2 5QLLCPRMF ΡβίΡΡΓΟΡΗΐΙ ^LYtWW» Ol 0WTDY88OO 448 SQovHooaao 499 3ΎΒΗΡΥΕΝ8 481 UVPOSEPUiP 478 QYVACS

Obr. 3

ΦΦΦ Φ

Φ Φ Φ

ΦΦΦ Φ

ΦΦΦ

44 ···· počet · »· • φ · • φ ·Φ· • φ φ · • « 4 φ

1-20

21-40

41-60

61-76

Obr. 1

Obr. 2 • e

999· sekvence EPOR- odvozených peptídů • · · • · ··· • · · * • · · · ·· ·· ·♦ • * • t

1. Způsobu identifikace vazebných partnerů pomocí hmotnostní spektrometrie pozičně specifickým testem, vyznačený t í m, že se na nosném materiálu pomocí specificky polohově naneseného malého objemu reakčních partnerů vytvoří polohově specifická testovací ligační oblast, přičemž se postupně provádí alespoň dvě po sobě následující reakce, tedy na nosném materiálu fixovaná polohově specifická ligační oblast se inkubuje se směsí ligandů, následně se odstraní ligandy nenavázané na ligační oblast a ligand/dy vázaný/é na ligační oblast se zkoumá/ají dále pomocí hmotnostní spektrometrie.

2. Způsob podle nároku Ivyznačený tím, že ligační oblast je tvořena testovacími peptidy, testovacími nukleovými kyselinami nebo jiných organochemických sloučeninami nebo je tvořena kondenzací peptidových fragmentů testovaného proteinu.

3. Způsob podle nároku Ivýznačný tím, že směs ligandů je tvořena buněčným lyzátem, směsí nukleových kyselin nebo směsí jiných organochemických sloučenin.

4 Φ · • Φ ···

Obr. 4 • · ♦ ·· • fcfc · · • · · · • fc ·· • fcfc • · ··· • fc fc • fc fc • fc ·*» • fcfc · • fc · • fcfc fc fc · · • · fcfcfcfc

Výsledky výzkumu MS-Fit

K předčasnému ukončení výpočtu MS-Fit stiskněte na Vašem browseru stop. Identifikační číslo vzorků (komentář): spot E2 Hledaná databáze: SwissProtr 07.09.99

Hledání molekulové hmotnosti (100000 -140000 Da) zvolte 25555 položek

Celá oblast Pl: 77419 položek

Hledání druhu (MAMMALS) zvolte 13799 položek

Kombinované hledání molekulové hmotnosti, pl a druhu - zvolte 661 položek Výpočet MS-Fit - zvolte 1 položku

Modifikace, které připadají v úvahu: /oxidace M/

Minimální Hmotnostní Použitá Maximální Cysteiny Peptid-N- Peptid-C- počet tolerance bílkovina ke počet modifikované konec konec porovnávaný peptidu (+/-) štěpení chybných ch peptidu štěpení 6 0,050 Da trypsin 1 akrylamidem vodík (H) volná

kyselina (OH)

Shrnutí výsledků

Pořadí počet(%) porovnávaných hmotností Protein molámí hmotnost (Da)/pl Druh SwissProt.r 07.09.99 Přístupové č. Název proteinu 1 6/24 (25%) 122561,6/6,25 krysa Q63272 trypsin-protein

kináza JAK3 (kináza Janus 3) (JAK-3)

Podrobné výsledky

4 Φ ΦΦ·

4ΦΦ ·

4« ··

Φ Φ ·

4 «4«

18. Způsob podle nároku 17vyznačený tím, že peptidy použité pro peptidovou testovací oblast mají délku 13 aminokyselin.

19. Způsob podle nároku 1 vyznačený tím, že ligandy použité pro ligační oblast jsou fixovány na nosný materiál pomocí raménka.

20. Způsob podle nároku 19 vyznačený tím, že raménko je citlivé na proteázu.

21. Způsob podle nároku 19 vyznačený tím, že raménko je chemicky štěpitelné.

22. Způsob podle nároku 2 vyznačený tím, že použitou peptidovou testovací oblast tvoří spoty.

23. Způsob podle nároku 1 vyznačený tím, že další vyhodnocování ligandů se provádí pomocí MALDI hmotnostní spektrometrie nebo ESI hmotnostní spektrometrie.

24. Způsob podle nároku 4 vyznačený tím, že se protein nenavázaný na peptidovou testovací oblast odstraní vymytím pomocí pufru.

25. Způsob podle nároku 4 vyznačený tím, že se protein nenavázaný na peptidovou testovací oblast odstraní vysrážením.

26. Způsob podle nároku 4 vyznačený tím, že se protein/ny vázaný/né na peptidovou testovací oblast před štěpením proteázou uvolní z nosného materiálu a přečistí se pomocí gelové elektroforézy.

27. Způsob podle nároku 4 vyznačený tím, že se vyhodnocování proteinů rozštěpených proteázou provádí pomocí MALDI nebo ESI hmotnostní spektrometrie.

• · * * · · • · ♦·· * * ·· ··»··»» · • · · * · · · ·· ·· »·*

Automatizované zařízení k provádění způsobu podle některého uvedených nároků.

• · · «« ·* ··♦· zvýše «· ·#»· • 0 ·0 • 0· • 0 000

0 »0 0 «

0 0 0 0 »0 04

0 0 0

0 0·00 ·

0 0 0 0 0 • 0 ·» ·* »00 peptid č. 1-20

21-40 41- 00 61-70 neupravený

• 4 « ·

4. Způsob podle nároku Ivýznačný t í m, že se na nosném materiálu vytvoří nanesením malého objemu pozičně specifických reakčních partnerů pozičně specifická peptidová testovací obiast, že na nosném materiálu fixovaná pozičně specifická peptidová oblast se inkubuje buněčným lyzátem, potom se protein nenavázaný na peptidovou oblast odstraní a protein/ny vázaný/né na peptidovou oblast se po proteázovém štěpení charakterizují hmotnostní spektrometrií.

5. Způsob podle nároku Ivyznačený tím, že použitý nosný materiál je pevný nebo ohebný.

6. Způsob podle nároku 5 vyznačený tím, že použitý nosný materiál je tvořen pryskyřičným kuličkami, polymerními částicemi nebo čipovým materiálem.

• » ·

7. Způsob podle nároku 5 vyznačený tím, že použitý nosný materiáf sestává z polymerní membrány.

8. Způsob podle nároku 7 vyznačený tím, že použitý nosný materiál se vybere ze skupiny sestávající z nylonové, celulosové membrány, membrány z modifikované celulózy nebo polypropylenové membrány.

9·

9 ·

9. Způsob podle nároku 3 vyznačený tím, že se jako buněčný lyzát používá plný nepurifikovaný buněčný lyzát.

10. Způsob podle nároku 3 vyznačený tím, že se jako buněčný lyzát použije plný buněčný lyzát rozfrakcionovaný centrifugací, filtrací nebo jinou vhodnou metodou.

11. Způsob podle nároku 9 nebo 10 vyznačený tím, že se jako buněčný lyzát použije lyzát z prokaryontních nebo eukaryontních buněk.

12. Způsob podle nároku 9až11vyznačený tím, že se jako buněčný lyzát používá lyzát z transformovaných buněk.

13. Způsob podle nároku 9 až 12 vyznačený tím, že se jako buněčný lyzát používá lyzát značený ^S-methioninem- nebo cysteinem.

14. Způsob podle nároku 9 až 13 vyznačený t í m, že se buněčný lyzát používá spolu s alespoň jedním definovaným kofaktorem.

15. Způsob podle nároku 14 vyznačený tím, že se jako kofaktory používají proteiny nebo kovové ionty.

16. Způsob podle nároku 2 vyznačený tím, že peptidy použité pro peptidovou testovací oblast mají délku 3 až 30 aminokyselin.

17. Způsob podle nároku 16 vyznačený tím, že peptidy použité pro peptidovou testovací oblast mají délku 6 a 15 aminokyselin.

18 neporovnaných hmotností: 634,2840; 550,0511; 684,2254; 804,2833; 1020,5080; 1207,3170; 1234,6750; 1347,7480; 1363,7360; 1379,7290; 1385,7220; 1433,7280; 1743,8410; 1762,7880; 2481,1810; 2550,1900;3153,3870;3211,3790

Obr. 5

Obr. 6