CZ2002801A3

CZ2002801A3 - Nové sloučeniny F-15078

Info

Publication number: CZ2002801A3
Application number: CZ2002801A
Authority: CZ
Inventors: Masatoshi Inukai; Tatsuya Takatsu; Toshio Yano; Isshin Tanaka
Original assignee: Sankyo Company Limited
Priority date: 1999-09-03
Filing date: 2000-08-31
Publication date: 2002-07-17
Also published as: EP1209240A1; AU767250B2; AU6867400A; HUP0202742A2; NO20021026D0; WO2001018227A1; ZA200201714B; NZ517561A; CN1387578A; TR200200558T2; NO20021026L; BR0013741A; PL353370A1; HK1044800A1; CA2383758A1; MXPA02002223A; RU2223968C2; US20040265280A1; EP1209240A4; KR20020029769A

Description

Oblast techniky

Předkládaný vynález se týká nových sloučenin, které vykazují fungicidní aktivitu; způsobu jejich přípravy, zahrnující izolaci z fermentačních produktů mikroorganismů, které tyto sloučeniny produkují; farmaceutických prostředků obsahujících tyto sloučeniny jako aktivní složku; farmaceutických směsi obsahujících tyto sloučeniny jako aktivní složku; terapeutických nebo profylaktických činidel pro plísňové infekční onemocnění, které obsahují tyto sloučeniny jako aktivní složku; mikroorganismů, které tyto sloučeniny produkují; využití těchto sloučenin; způsoby léčení a prevence plísňových infekčních onemocnění, obsahujících podávání farmaceuticky efektivního množství těchto sloučenin zvířatům.

Dosavadní stav techniky

V současnosti jsou amphotericin B, flucytosin a azolové deriváty klinicky používané jako fungicidní činidla. U některých sloučenin se však začaly objevovat některé problémy, jako je nebezpečí cytotoxicity a odolnost plísní vůči těmto činidlům.

Bylo uveřejněno, že některé mikroorganismy produkují fungicidní látky. Na příklad, Zalerion genus produkuje pneumokardiály (Schmatz, D. M., a kol., J. Antibiotics 45, 1886(1992)), Aspergillus genus produkuje echinokandiny (Nyfeler, R. a Keller-Schierlein, W., Helv. Chim. Acta 57, 2459(1974)) a • ·

Aureobasidium genus produkuje aureobasidiny (Ikai, K.,akol., J. Antibiotics, 44, 925(1991)) . Nicméně, tyto sloučeniny ještě nebyly klinicky použity.

Podstata vynálezu

Byly nalezeny nové sloučeniny vykazující fungicidní aktivitu ve fermentačních produktech mikroorganismů kmene Phoma sp. SANK 13899, který byl získán z půdního vzorku na Chichi-island, Ogasawara-mura, Tokyo.

Předkládaný vynález poskytuje nové sloučeniny, které mají fungicidní aktivitu; způsob přípravy těchto sloučenin; farmaceutické prostředky obsahující tyto sloučeniny jako aktivní složku; pharmaceutické směsi obsahující tyto sloučeniny jako aktivní složku; terapeutická nebo profylaktická činidla pro plísňová infekční onemocnění s těmito sloučeninami jako aktivními složkami; mikroorganismy produkující tyto sloučeniny; použití těchto sloučenin; způsoby léčení a prevence plísňových infekčních chorob obsahujících podávání farmaceuticky efektivního množství těchto sloučenin zvířatům.

(1) Předkládaný vynález zahrnuje novou fungicidní sloučeninu chemického vzorce I • · · · • ·

nebo její sůl.

(2) Předkládaný vynález zahrnuje sloučeninu, která má následující fyzikálně chemické vlastnosti:

1) Charakteristika: Bazický prášek rozpustný v tucích

2) Molekulární vzorec: C₅₅H_9aN₈0i4

3) Molekulová váha: 1094 (způsob FAB-MS)

4) Vysoké rozlišení: FAB-MS [M+H] ⁺ vypočteno pro C55H99N8O14 1095,7281 nalezeno 1095,7365

5) Ultrafialové absorpční spektrum: Zbytková absorpce

6) Infračervené absorpční spektrum (KBr tableta, cm'¹) :

3434, 3335, 2962, 2937, 2875, 2806, 1750, 1684, 1641, 150 9,1469, 1412, 1371, 1314, 1294, 1271, 1204, 1156, 1128, 1

074,1020

7) Optická rotace: [a] _D ²⁵

-120° (c 1,0, methanol) • · · · • «

8) '‘'Η NMR spektrum (v CDC1₃, 500 MHz, ó(ppm), interní standard:tetramethylsilan):

0,78(3H), 0,79(3H), 0,80(3H), 0,82(3H), 0,87(3H), O,88(1H), 0,9 2(3H), 0,93(3H), 0,94(3H), 0,96(3H), 0,97(3H), 0,98(3H), 1,01(3 H) , l,02(3H), l,03(3H), l,06(3H), 1,21(1H), 1,41(3H), 1,41(1H), 1,48(1H), 1,48(1H), 1,49(1H), 1,52(3H), 1,55(1H), 1,65(1H), 1, 66(1H), l,70(2H), 1,73(1H), 1,81(1H), 1,87(1H), 2,28(1H), 2,31(1 H) , 2,37(1H), 2,48(3H), 2,89(3H), 2,94(3H), 2,96(1H), 3,29(3H), 3,56(1H), 4,O6(1H), 4,14(1H), 4,77(1H), 4,78(1H), 4,84(1H), 4, 91(1H), 4,96(1H), 5,21(1H), 5,25(1H), 5,53(1H), 6,39(1H), 7,83(1 H) , 7,94(1H), 8,28(1H)

9) ¹³C NMR spektrum (v CDC1₃, 500 MHz, δ(ppm), interní stan dard: tetramethylsilan):

10,9(q), ll,9(q), 15,0(q), 15,l(q), 16,0(q), 16,6(q), 17,4(q), 18,3(q), 18,6(q), 18,7(q), 19,l(q), 21,0(q), 21,4(q), 22,l(q), 23,l(q), 23,51(q), 23,54(q), 24,2(t), 24,6(d), 24,8(d), 25,4(d),

25,5(t), 27,7(d), 29,5(q), 29,8(d), 30,2(q), 36,l(q), 36,5(t),

37,7(t), 38,3(d), 38,4(d), 39,7(t), 40,9(q), 46,2(d), 51,8(d),

53,l(d), 54,7(d), 55,l(d), 63,9(d), 64,7(d), 68,l(d), 7O,l(d),

73,4(d), 74,3(d), 77,l(d), 169,03(s), 169,04(s), 169,6(s), 169, 8 (s) , 169,9(s), 170,3 (s) , 172,0(s), 173,4(s), 173,8 (s) , 174,0 (s)

10) Vysokoúčinná kapalinová chromatografie:

Kolona: Shodex Asahipak C8P 50 4E (4,6 mm (průměr) x 250 mm (dé lka); produkt Showa Denko K.K.)

Mobilní fáze:acetonitril:10 mM vodný roztok hydrogenuhličitanu amonného = 13 : 7 (objemově)

Průtoková rychlost: 0,7 ml/minutu Vlnová délka detektoru: λ 210 nm

Retenční čas: 10,20 minut

11) Rozpustnost: Rozpustná v dimethylsulfoxidu, methanolu a chloroformu « · · · · · « · · · · · · • · * · · · • · · · * • « · ·· ····

12) Analýza aminokyselin:Z hydrolyzátu byl detekován threonin, alanin a isoleucin nebo její sůl.

(3) Předkládaný vynález zahrnuje novou fungicidní sloučeninu chemického vzorce II

(4) Předkládaný vynález zahrnuje sloučeninu, která má fyzikálně chemické vlastnosti:

1) Charakteristika: Neutrální prášek rozpustný v tucích

2) Molekulární vzorec: C57H100N8O15

3) Molekulová váha: 1136 (způsob FAB-MS)

4) Vysoké rozlišení FAB-MS [M+H] ⁺ vypočteno pro C57H101N8O15 1137,7387 nalezeno 1137,7410

5) Ultrafialové absorpční spektrum: Zbytková absorpce • · • ·

« · · · « «· ··· ·· ♦·· ·

6) Infračervené absorpční spektrum (KBr tableta, cm'¹) :

3433, 3333, 2963, 2937, 2875, 1751, 1686, 1642, 1516, 1469, 1409, 1388, 1372, 1311, 1292, 1272, 1201, 1156, 1128, 1074, 1017

7) Optická rotace: [a]_D ²⁵ -131° (c 1,0, methanol)

8) ¹H NMR spektrum (v CDC1₃, 500 MHz, δ (ppm) , interní standard: tetramethylsilan):

0,78(3H) ,	0,79(3H) ,	0,80(3H),	0,83 (3H) ,	0,87(1H),	0,87(3H) ,
0,90(3H),	0,92 (3H) ,	0,93(3H),	0,95 (3H) ,	0,95(3H),	0,98(3H) ,
0,98 (3H) ,	l,01(3H) ,	l,01(3H) ,	1,03(1H),	1,05(3H),	1,28(3H) ,
1,37(1H),	1,4O(1H) ,	1,46(1H) ,	1,47(1H) ,	1,49(1H),	1,51(3H) ,
1,64(1H),	1,65(1H),	1,66(1H),	1,86(1H) ,	1,72(1H),	1,78(1H) ,
2,12(3H) ,	2,13(1H),	2,26(1H),	2,31(1H),	2,37(1H),	2,88(3H) ,
2,93(3H) ,	2,97(3H) ,	3,28(3H),	3,56(1H),	4,03(1H),	4,15(1H) ,
4,73(1H),	4,78(1H),	4,82(1H),	4,83(1H),	4,91(1H),	4,97(1H),
5,15(1H) ,	5,28(1H),	5,5O(1H),	6,37(1H) ,	6,87(1H),	7,86(1H),
8,29(1H)
9) ¹³C NMR	spektrum (v	CDC1₃, 500	MHz, δ(ppm), interní	standard:

tetramethylsilan):

10,5(q) ,	10,9(q) ,	14,9(q) ,	15,l(q),	15,6(q) ,	16,6(q) ,	16,7(q) ,
18,3(q) ,	18,6(q),	18,7(q) ,	19,0(q),	20,8(q) ,	21,4(q) ,	22,0(q) ,
22,l(q),	23,l(q) ,	23,6(q) ,	23,6(q) ,	24,l(t) ,	24,6(t) ,	24,7(d) ,
24,8(d),	25,4(d),	27,7(d) ,	29,5(q) ,	29,8(d),	30,2(q) ,	31,6(d) ,
31,8(q) ,	36,1 (t) ,	37,6(t) ,	38,4(d) ,	39,6(t),	40,9(q) ,	46,l(d),
51,8(d),	53,1(d),	54,7(d) ,	54,7(d) ,	61,2(d),	63,9(d) ,	64,6(d),

68,l(d), 73,l(d), 74,3(d), 77,0(d), 168,9(s), 168,9(s), 169,l(s), 169,9(s), 169,9(s), 170,3 (s) , 170,6(s), 171,7(s), 172,0(s),

173,3(s), 173,8(s)

10) Vysoceúčinná kapalinová chromatografie:

Kolona: Shodex Asahipak C8P 50 4E (4,6 mm (průměr) x 250 mm (délka); produkt Showa Denko K.K.) • ·

Průtoková rychlost: 0,7 ml/minutu Vlnová délka detektoru: λ 210 nm Retenční čas: 9,05 minut

11) Rozpustnost: Rozpustná v dimethylsulfoxidu, methanoiu a c hloroformu

12) Analýza aminokyselin: Z hydrolyzátů byl detekován threoni n, alanin a isoleucin (5) Předkládaný vynález zahrnuje způsob přípravy jakékoliv ze sloučenin podle (1) až (4) ; fermentaci mikroorganismů, které náleží ke kmeni Phoma genus a produkující jakoukoliv ze sloučenin podle (1) až (4) ; izolaci jakékoliv ze sloučenin podle (1) až (4) z fermentačních produktů těchto mikroorganismů.

(6) Předkládaný vynález zahrnuje způsob podle (5), kde mikroorganismy, které náleží ke kmeni Phoma genus a produkující jakoukoliv ze sloučenin podle (1) až (4) jsou Phoma sp. SANK 13899 (FERM BP-6851).

(7) Předkládaný vynález zahrnuje farmaceutické prostředky obsahující jakoukoliv ze sloučenin podle (1) až (4) nebo její sůl jako aktivní ingredient.

(8) Předkládaný vynález zahrnuje terapeutická nebo profylaktická činidla pro plísňové infekční onemocnění obsahující jakoukoliv ze sloučenin podle (1) až (4) nebo její sůl jako aktivní ingredient.

(9) Předkládaný vynález zahrnuje kmen Phoma sp. SANK 13899 (FERM BP-6851).

• · • * (10) Předkládaný vynález zahrnuje použití jakékoliv ze sloučenin podle (1) až (4) nebo její soli.

(11) Předkládaný vynález zahrnuje způsob léčení a prevence infekčních onemocnění, zahrnujících podávání farmaceuticky efektivního množství jakékoliv ze sloučenin podle (1) až (4) nebo jejich soli zvířatům.

(12) Kromě toho poskytuje předkládaný vynález farmaceutické směsi obsahující jakoukoliv ze sloučenin (1) až (4) nebo její sůl jako aktivní ingredient.

Sloučeniny, podle předkládaného vynálezu jsou sloučeniny podle (1) až (4). Z těchto sloučenin jsou sloučeniny podle 1 a 3 sloučeniny obecného vzorce III

(III) • · kde R je vodík nebo COCH₃. V předkládaném vynálezu jsou sloučeniny obecného vzorce III označeny jako F-15078. Sloučenina označená jako 1 je sloučenina obecného chemického vzorce III kde R je vodík. V tomto vynálezu je sloučenina popsaná v bodě (1) nebo sloučenina, která má fyzikálně chemické vlastnosti popsané v bodě (2) označena F-15078A. Sloučenina popsaná v bodě (3) je sloučenina obecného vzorce III kde R je COCH₃. Sloučenina popsaná v bodě (3) nebo sloučenina, která má fyzikálně chemické vlastnosti popsané v bodě (4) je označena F-15078B.

Sloučeniny F-15078A mohou být převedeny běžnými postupy na soli. Soli F-15078A mohou být použity například v medicíně nebo veterinářství. Jsou-li použity v medicíně nebo veterinářství, není zde žádné omezení, za předpokladu, že jsou tyto soli farmaceuticky přijatelné. Příklady takových solí zahrnují anorganické soli, jako jsou hydrochloridy nebo organické soli jako je sůl kyseliny pamové. Pokud jsou soli požity jinak, například jako intermediáty v organických syntézách, není zde žádné omezení. Soli sloučenin F-15078A zahrnují například soli anorganických kyselin jako jsou acetáty, bromidy, chloridy, hydrochloridy, hydrobromidy, iodidy, sulfáty, fosfáty a difosfáty; soli organických kyselin jako jsou citráty, maleáty, soli pamové kyseliny a vinany a tak dále.

Každá sloučenina F-15078 může zaujímat různé izomery; nicméně tyto izomery jsou zde reprezentovány stejnou chemickou strukturou. Předkládaný vynález zahrnuje každý z těchto jednotlivých izomerů a také jejich směsi.

• * • ti·

9 • 999 9 9 9 · 9 99 9

Některé sloučeniny F-15078 tvoří solváty (například hydráty). Předkládaný vynález zahrnuje také tyto solváty. Pokud ponecháme tyto sloučeniny stát za přístupu vzduchu nebo provedeme rekrystalizací, pak některé sloučeniny F-15078 absorbují nebo zadrží vodu a vytvoří hydrát. Předkládaný vynález zahrnujee také tyto hydráty.

Předkládaný vynález zahrnuje také proléčiva, která jsou v těle převedena na sloučeninu F-15078.

Mikroorganismus produkující sloučeninu F-15078

Sloučeniny F-15078 mohou být získány z fermentačních produktů hub, které tyto sloučeniny produkují. Mikroorganismy produkující sloučeniny F-15078 jsou houby, které náleží ke kmeni Phoma genus, s výhodou je to mikroorganismus kmene Phoma sp. SANK 13899 (dále označovaný jako SANK 13899). Mikroorganismus kmene SANK 13899 byl izolován z půdy na Chichi-island, Ogasawara-mura, v Tokyu.

Kmen SANK 13899 byl kultivován v kultivačním prostředí k pozorování jeho morfologických vlastností. Složení každého prostředí je popsáno níže.

PDA prostředí (Potato Dextrose Agar medium)

Dextrosový agar z brambor (Nissui) 39 g (produkt Nissui Pharmaceutical Co., Ltd.)

Destilovaná voda 1000 ml

CMA prostředí (Corn Meal Agar medium)

Agar z kukuřičné mouky 17 g • · • · (produkt Nissui Pharmaceutical Co., Ltd.)

Destilovaná voda 1000 ml

WSH prostředí

Ovesná mouka 10 g

Síran hořečnatý heptahydrát 1 g

Fosforečnan draselný 1 g

Dusičnan sodný 1 g

Agar 20 g

Destilovaná voda 1000 ml

Prostředí podle Miury

Glukóza 1 g Dihydrogenfosforečnan draselný 1 g Síran hořečnatý heptahydrát 0,2 g Chlorid draselný 0,2 g Kvasničný extrakt 0,2 g Dusičnan sodný 2 g Agar 20 g Destilovaná voda 1000 ml

CYA prostředí (Czapek Yeast Extract Agar medium)

Hydrogen fosforečnan draselný 2 g

Koncentrovaný Czapkův roztok* 10 ml

Kvasničný extrakt 5 g

Sacharóza 30 g

Agar 15 g

Destilovaná voda 1000 ml

MEA prostředí (Malt Extract Nutrient Agar medium) Sladový výtažek g

• ·

Pepton

Glukóza

Agar

Destilovaná voda g 20 g 20 g

1000 ml

G25N prostředí (25% Glycerol Nitráte Agar medium)

Hydrogen fosforečnan draselný	0,75 g
Koncentrovaný Czapkův roztok*	7,5 ml
Kvasníčný extrakt	3,7 g
Glycerol	250 g
Agar	12 g
Destilovaná voda	750 ml

*Složení koncentrovaného Czapkova roztoku je následující:

Dusičnan sodný	30 g
Chlorid draselný	5 g
Síran hořečnatý heptahydrát	5 g
Síran železnatý heptahydrát	0,1 g
Síran zinečnatý heptahydrát	0,1 g
Síran měďnatý pentahydrát	0,05 g
Destilovaná voda	100 ml

Barevný odstín byl stanoven podle Methuen Handbook of Colour (Kornerup, A. and Wanscher, J. H. (1978) (třetí vydání) . Erye Methuen, London).

Morfologické vlastnosti kmene SANK 13899 po kultivaci jsou následující:

Růst kmene SANK 13899 v PAD prostředí při 23°C po dvou týdnech je od 13 do 17 mm v průměru. Kolony mají chmýřovitě bavlněný ar· · *· · vzhled, vystouplý střed kolonie, který má chmýřovitě vlnitý vzhled a hrana má jemně zoubkovitý vzhled. Barva povrchu kolonie je od šedé (3B1) až do bílé a odvrácená barva je hnědá (od 6E5 do 4).

Růst kmene SANK 13899 v CMA prostředí při 23 °C po dvou týdnech je od 15 do 17 mm v průměru. Kolonie má práškovítý vzhled a hrana kolonie má zoubkovitý vzhled. Barva povrchu kolonie je od šedo-zelené (27E5) k matně zelené (27E4) a odvrácená barva je tmavě zelená (27F4).

Růst kmene SANK 13899 v prostředí podle Miury při 23°C po dvou týdnech je od 22 do 33 mm v průměru. Kolonie je hladká a hrana kolonie je čistá. Barva povrchu kolonie je bílá a odvrácená barva je od nažloutle bílé (3A2) do bílé.

Růst kmene SANK 13899 v WSH prostředí při 23°C po dvou týdnech je od 33 do 34 mm v průměru. Kolonie je hladká a hrana kolonie je hladká. Barva povrchu kolonie je od bledě žluté (3A3) do žluto bílé (3A2) a odvrácená barva je stejná jako barva povrchu.

Růst kmene SANK 13899 v CYA prostředí při 23°C po dvou týdnech je od 34 do 35 mm v průměru. Kolonie má prachovitě bavlnný vzhled, střed kolonie stoupá a má prachovitě vlněný vzhled a vylučuje rozpustný bílý pigment. Hrana kolonie je plochá a uhlazená. Barva povrchu kolonie je šedo-oranžová (6B3) a odvrácená barva je od hnědo-oranžové (6C3) do hnědé (6D8).

Růst kmene SANK 13899 v MEA prostředí při 23 °C po dvou týdnech je od 15 do 23 mm v průměru. Kolonie má vlnitě bavlněný • » · · • » · · • « · • · · • · · • « · · · · vzhled, střed kolonie vystupuje a má vlnitě vlněný vzhled. Hrana kolonie je plochá a uhlazená až k mírně zoubkoví té struktuře . Barva povrchu kolonie je od bílé do šedé (3B1) a odvrácená barva je tmavě zelená (od 28F4 do 3).

Kmen SANK 13899 nevykazuje růst v prostředí G25N.

Hyfa je od 0,5 do 3 pm v průměru a pravidelně tvoří hyfoidní provaz a má tloušťku nebo hustotu buněčné stěny. Povrch micelia je uhlazený nebo hrubý a je bezbarvý až hnědý.

Při kultivaci v ODA prostředí, prostředí podle Miury a podobných po více než jednom měsíci tvoří kmen SANK 13899 určité oblasti, kde vznikají pyknidia, ve kterých jsou zapuštěny sektory agaru.

Morfologické vlastnosti pyknidia jsou následující:

Průměr pyknidia je od 100 do 200 pm. Pyknidium je uloženo nebo částečně zapuštěno do agaru, je kulovité nebo blízké kulovitému tvaru a je hnědé nebo černé. Žádná otevřená část nebyla pozorována. Buňky tvořící konidia jsou od 7,5 do 9 pm x od 1,3 do 1,8 pm a vytváří články tvořící kulovitá pyknidia. Články jsou jednostranné, válcovitého tvaru nebo uzavřené a bezbarvé. The phialo konidie je od 3,5 do 4,7 pm x od i, 3 do l, 8 pm a je válcovitá, jednostranná a bezbarvá. Hyfa je od 0,5 do 3 pm v průměru a pravidelně tvoří hyfoidní provaz, který má tloušťku nebo hustotu buněčné stěny. Povrch mycelia je uhlazený nebo drsný a je bezbarvý až hnědý. Totožnost kmene SANK 13899 k Phoma sp byla určena podle literatury (Kobayashi, M. J. Antibact. Antifung. Agents 22, 757(1994)) .

• · ··< · · » · » ·«·· ·· 9* · * · • « MM

Kmen SANK 13899 je uložen v mezinárodní Agency of Industrial Science and Technology, Ministry of International Trade and Industry, v 1-3, Higashi 1-chome, Ibaraki-ken , Japan (International Patent Organism Depositary, National Institute of Advanced Industrial Science and Technology v AIST Tsukuba Central 6,1-1, Higashi 1-Chome, Tsukuba-shi, Ibaraki-ken, Japan), pod číslem FERM BP-6851 datován k 20.8.1999.

Odborníkům je známo, že houby jsou schopné přírodně nebo synteticky (například ozářením UV zářením, radioaktivně nebo působením chemických činidel) mutovat. Kmen SANK 13899 je také schopen mutovat. Předkládaný vynález zahrnuje všechny tyto mutace Tyto mutace zahrnují také mutaci způsobenou genetickými metodami jako rekombinaci, transdukcí nebo transformací. Kmen SANK 13899 zahrnuje kmeny SANK 13899, které produkují sloučeniny F-15078, jejich mutace a všechny houby které nelze odlišit od kmene SANK 13899.

Způsoby kultivace a čištění

Jak je popsáno výše, fermentace kmenu produkujícího sloučeninu F-15078 je prováděna v kultivačním prostředí, které je použito za účelem získání obecných fermentačních produktů. Kultivační prostředí obsahuje zdroje uhlíku a dusíku, anorganické soli a stopové množství růstových faktorů a kovů, všech, které mohou být využity mikroorganismy.

Příklady zdrojů uhlíku jsou glukóza, fruktoza, maltoza, sacharoza, manitol, glycerin, dextrin, ovesná mouka, žito, kukuřičný škrob, brambory, kukuřičný prášek, sójový olej, bavlníkový olej, sirup, kyselina citrónová a kyselina vinná.

·· ··· ·

Tyto zdroje uhlíku mohou být použity jednotlivě nebo v kombinaci dvou nebo tří zdrojů.

Množství zdrojů uhlíku je ovlivněno přítomností zdrojů v kultivačním prostředí a je obvykle mezi 1 až 10 % hmotn.

Příklady zdrojů dusíku zahrnují mouku ze sojových bobů, pšeničné otruby, arašídový prášek, prášek z bavlníkových semen, hydrolyzovaný produkt kaseinu, Pharmamin, kukuřičný výluh, pepton, masný extrakt, droždí, kvasničný výtažek, sladový výtažek, dusičnan sodný, dusičnan amonný a síran amonný. Tyto zdroje dusíku mohou být použity jednotlivě nebo v kombinaci dvou nebo tří zdrojů.

Množství zdrojů dusíku závisí na ostatních složkách v kultivačním prostředí a je obvykle mezi 0,2 až 6 % hmotn.

Vysoká čistota uhlíkatých a dusíkatých zdrojů není požadována, zdroje smí obsahovat stopová množství růstových faktorů, vitamínů a anorganických živin. Určité soli, které tvoří ionty jako sodík, draslík, hořčík, ammonium, vápník, fosforečnany, sírany, chloridy a uhličitany, mohou být přidány do kultivačního prostředí.

Vitamíny jako B1 a biotin; thiamin, který zvyšuje bujení hub a soli kovů jako jsou manganany a molybdenany; všechny, které jsou houbami využívány, mohou být přidány do kultivačního prostředí.

Je-li kultivační prostředí roztok, mohou být do kultivačního prostředí také přidána odpěňovadla ve formě silikonových olejů, polyalkylovaných etherů glykolu, rostlinných olejů, živočišných olejů a surfaktantů, aby se předešlo pěnění.

• · pH roztoku prostředí pro kultivaci mikroorganismu produkujícího sloučeninu F-15078 závisí na pH stabilitě sloučenin F-15078 a produkujícího kmene; při použití kmene SANK 13899 je pH udržováno mezi 5,0 až 7,0.

Teplota kultivace mikroorganismu produkujícího sloučeninu F-15078 závisí na tepelné stabilitě sloučenin F-15078; jedná-li se o mikroorganismus kmene SANK 13899, je teplota mezi 15 až 37 °C. Výhodně je mezi 22 až 35 °C, výhodněji mezi 22 až 26 °C a nejlépe 23 °C.

Způsob fermentace mikroorganismu produkujícího sloučeninu F-15078 není nijak zvlášť omezen. Příklady fermentačních způsobů zahrnují kultivaci za použití pevného kultivační prostředí, protřepávaného prostředí, natřásaného prostředí, provzdušněného prostředí a provzdušněného-protřepávaného prostředí . Preferované způsoby jsou protřepávané prostředí, natřásané prostředí, provzdušněné prostředí a provzdušněné-protřepávané prostředí. Natřásané prostředí je preferované. Průmyslově výhodnou metodou je provzdušněné-protřepávané prostředí.

Prvním krokem fermentace mikroorganismu produkujícího sloučeninu F-15078 je inokulace prostředí zahrnující naočkování těmito organismy ze šikmého řezu do malého objemu kultivačního prostředí a jeho inkubaci, následovanou rozsáhlou inokulací prostředí, je-li to zapotřebí. Hlavní fermentace se provádí v rozsáhlém objemu kultivačního prostředí ve smyslu získat požadovaný produkt.

• · ·· ·*

Pokud je fermentace mikroorganismu produkujícího sloučeninu F-15078 provedena v malém objemu, inokulace se provádí v Erlenmeyerově baňce, nebo jak je uvedeno, pokud je nezbytné, rozsáhlá inokulace prostředí a pak je hlavní fermentace provedena Erlenmayerově baňce nebo podobně.

Pokud je fermentace mikroorganismu produkuj ícího sloučeninu F-15078 provedena ve velkém objemu, je výhodněji použita kvasná káď nebo rezervoár vybavený míchacím a provzdušňovacím zařízením. Příprava kultivačního prostředí a sterilizace může být provedena ve kvasné kádi nebo rezervoáru. Výroba sloučenin F-15078 ve velkém objemu je výhodněji prováděna ve stejné kvasné kádi nebo rezervoáru.

Maximální produkční titr sloučenin F-15078 produkovaný kmenem SANK 13899 je mezi 144 až 192 hodinami po naočkování.

Sloučeniny F-15078, vyskytující se ve fermentačních produktech jsou extrahovány a čištěny obvyklými technikami využívajícími fyzikálně chemické vlastnosti sloučenin F-15078, každá ze svého vlastního fermentačního produktu, z filtrátu, který je získán filtrací fermentačních produktů z rozsivkové zeminy nebo podobně, z kalu, který byl získán odstředěním fermentačního produktu a nebo z mycelia, které je získáno odstředěním nebo filtrací.

Sloučeniny F-15078, které jsou obsaženy ve filtrátu nebo kalu jsou extrahovány za podmínek neutrálního pH rozpouštědla nemísitelného s vodou jako je ethyl-acetát, chloroform, dichlorethan, dichlormethan, butanol nebo směs dvou nebo více rozpouštědel. Filtrát nebo kal může být nanesen na kolonu naplněnou aktivovaným uhlím, Amberlite XAD-2, Amberlite XAD-4 • ·

···· ·· ·· ··· · · ···· (produkty Rohm a Haas Co.,Ltd,), DiaionHP-10, DiaionHP-20, Diaion CHP-20, Diaion HP-50, Sepabeads SP-207 (produkty Mitsubishi Chemical Co.,Ltd.); a adsorbované sloučeniny F-15078 mohou být eluovány směsí methanol-voda, aceton-voda, butanol-voda nebo podobnými a nebo dalšími složkami, kterými je možno oddělit požadované sloučeniny.

Sloučeniny F-15078, které se vyskytují v myceliu jsou extrahovány vodným acetonem nebo methanolem, který obsahuje od 50 do 90 % objemových organického rozpouštědla. Extrakt je filtrován s rozsivkovitou zeminou a daným organickým rozpouštědlem a filtrát je oddělen. Požadovaná sloučenina je poté oddělena z koncentrátu stejnými technikami, které jsou popsány pro filtrát nebo kal z fermentačního produktu.

Sloučeniny F-15078 přítomné ve fermentačních produktech po kultivaci jsou extrahovány přidáním přiměřeného možství acetonu nebo methanolu, výhodně k výsledné koncentraci konečné směsi 50 % obj. Extrakt je filtrován s rozsivkovitou zeminou a sloučeniny F-15078 jsou odděleny z filtrátu jak je popsáno pro filtrát nebo kal z fermentačního produktu.

Požadovaný produkt získaný výše je dále čištěn kolonovou chromatografií za použití TSK gel Toyopearl HW-40F (produkt Toso K.K.) nebo Sephadex LH-20 (Amersham Pharmacia Co.ltd); nebo konolovou chromatografií s reverzní fází za použití kolony Cosmosil 140C18 (produkt Nacalai Tesque K.K.). Pokud je nutné, je žádaný produkt dále čištěn pomocí Vysoceúčinné kapalinové chromatografie (dále označena jako HPLC) za použití kolony s reverzní fází jako je Shodex Asahipak C8P50-4E (produkt Showa Denko K.K.), YMCPak ODS-AM (produkt YMC K.K.) a Capcellpak UG120 (produkt of Shiseido K.K.).

• · • ·

Izolace sloučenin F-15078 je dosažena jednoduchou extrakční nebo čistící metodou výše popsanou nebo patřičnou kombinací jednotlivých extrakcí a čistících technik výše popsaných a pokud je nutné, zopakováním těchto extrakcí nebo čistících technik.

Postup fermentace kmenu produkujícího sloučeninu F-15078 a čištění sloučeniny F-15078A nebo F-15078B lze sledovat následujícími způsoby 1 a 2.

Analytický způsob s použitím HPLC

Pokud je použita HPLC, pak na způsob jejího provedení nejsou kladeny žádné zvláštní požadavky. Například mohou být použity následující podmínky.

Kolona: Shodex Asahipak C8P 50 4E (průměr 4,6 mm x 250 mm; produkt Showa Denko K.K)

Mobilní fáze:acetonitril: 10 mM vodný hydrogen uhličitan amonný = 13 : 7 (oběmově)

Průtoková rychlost: 0,7 ml/minutu Vlnová délka detektoru: λ 210 mm Retenční čas F-15078A: 10,20 minut Retenční čas F-15078B: 9,05 minut

Způsob měření fungicidní aktivity

Na způsob hodnocení fungicidní aktivity nejsou kladeny žádné zvláštní požadavky. Například může být použita živná půda podle způsobu, popsaného v Yamaguchi a kol. (Yamaguchi, H. a kol., J. Med. Mycol. 36, 61(12995)).

• · · ·

Využití vynálezu

Sloučeniny 1 až 4 tohoto vynálezu vykazují fungicidní aktivitu a jsou použitelné jako terapeutická nebo profylaktická činidla pro plísňové infekční onemocnění lidských bytostí nebo zvířat.

Příklady provedení vynálezu

Následující příklady, zkušební příklady a příklady přípravků jsou určeny pro další ilustraci předkládaného vynálezu a v žádném případě nijak neomezují rámec předkládaného vynálezu.

Příklad 1: Příprava sloučeniny F-15078A(l)

Kultivace kmene SANK 13899 (1)

Jedna vlásenka kmene SANK 13899 byla sterilizována (121 °C, 3 0 minut) a naočkována do preinokulačního prostředí (100 ml) , které obsahovalo složky podle tabulky 1 v každé ze tří 500 ml Erlenmeyerových baněk. Baňky byly inkubovány při 23 °C pět dní v rotační třepačce (210 ot./min.; 7 cm zdvih). 5 % objemových koncové koncentrace roztoku výsledného preinokulačního prostředí bylo naočkováno do inokulačního prostředí (400 ml) do každé z devíti 2 1 Erlenmeyerových baněk připravených podle stejného způsobu jako u preinokulačního prostředí. Baňky byly kultivovány při 23 °C dva dny v rotační třepačce (210 ot./min.; 7 cm zdvih). 5 % objemových koncové koncentrace roztoku inokulačního prostředí bylo sterilizováno (121 °C, 30 minut) a naočkováno do připravovaného kultivačního prostředí (1) (15 1) obsahující ingredienty podle tabulky 2 v každé ze čtyř 30 1 kvasných kádí.

Kádě byly inkubovány při 23 °C sedm dní s promícháváním (od 100 do 420 ot./min.) a s provzdušňováním (provzdušňovací rychlost : 1 wm, koncentrace rozpuštěného kyslíku v roztoku prostředí : 5,0 ppm) .

Glycerin

Glukóza

Rozpustný škrob

Mouka ze sojových bobů

Želatina

Tabulka 1: Složky pro přípravu preinokulačního a inokulačního prostředí g 30 g 20 g 10 g 2,5 g

Kvasničný výtažek (Difco) 2,5 g

NH4NO3 2,5 g

Činidlo proti pěnění* 0,1 ml

Voda 1000 ml (pH nebylo upraveno) *Nissan Disfoam CB-442 (produkt Nihon Yushi K.K.)

Tabulka 2: Složky pro přípravu kultivačního prostředí (1)

Dextrin (Difco) 10 g

Glycerin 20 g

Glukóza 30 g

Sladový výtažek (Difco) 10 g

Kvasničný výtažek (Difco) 2 g

Tripton (Difco) 1 g

NH₄NO₃ 1 g

NaN0₃ 1 g

KH₂PO₄ 1 g

MgSO₄ 7H₂O 1 g

Činidlo proti pěnění* 0,1 ml

Voda

1000 ml (pH nebylo upraveno) *Nissan Disfoam CB-442 (produkt Nihon Yushi K.K.)

Izolace sloučenin F-15078A (1)

K získanému roztoku prostředí (60 1) byl přidán aceton (60 1) a Celíte 545 (3 kg, produkt Celíte Corporation). Výsledná suspenze byla filtrována skrz filtrační lis. Filtrát byl smísen s ethyl-acetátem (50 1) . Extrakt (49 1) byl promyt nasyceným roztokem chloridu sodného (50 1) , vodou (50 1) a sušen 1 hodinu bezvodým síranem sodným (5 kg) a poté byl skrz filtrační lis odfiltrován síran sodný. Filtrát byl odpařen za sníženého tlaku do sucha. Byl získán olej (95,9 g) . Olej byl rozpuštěn ve 100 ml směsi methanol: 0,04% vodná trifluoroctová kyselina = 8:2 (objemově). Tento roztok byl nanesen na HW-40F kolonu (produkt Toso K.K. , objem: 22 1) , která byla předem promyta směsí methanol: 0,04% vodná trifluoroctová kyselina = 8:2 (objemově) a vyvinuta touto směsí. Eluát byl sbírán do 500 ml frakcí a sloučenina F-15078A byla získána ve frakcích 13 až 25 (celkový objem: 6,5 1). Eluát byl odpařen za sníženého tlaku na objem 2 1, hodnota pH byla upravena na pH 7 pomocí roztoku 6,25 M hydroxidu sodného a pak byla aktivní složka extrahována ethyl-acetátem (3,1 1). Extrakt byl promyt nasyceným vodným roztokem chloridu sodného (3 1), sušen bezvodým síranem sodným a pak zakoncentrován za vakua do sucha. Byl získán olej (66,5 g) . Olej byl rozpuštěn ve 160 ml směsi methanol: 0,05% vodná trifluoroctová kyselina = 8:2 (objemově). Tento roztok byl nanesen na kolonu Cosmocil 14 0C18 (produkt Nacalai Tesques K.K., objem: 3 1) která byla vyvážena směsí acetonitril: 0,05 % vodná trifluoroctová kyselina = 4:6 (objemově), promyta tímto rozpouštědlem (10 1) a poté vyvinuta směsí acetonitril: 0,05 % vodná trifluoroctová kyselina =6:4 (objemově). Eluát byl sbírán do 2 1 frakcí a sloučenina F-15078A byla získána z frakce • · · • · • · · ·

číslo 2. Tato frakce (2 1) byla odpařena za sníženého tlaku na 800 ml a pH bylo upraveno na hodnotu pH 7 roztokem 6,25 M hydroxidu sodného. Aktivní složka byla extrahována ethyl-acetátem (1 1). Extrakt byl promyt, sušen a odpařen za sníženého tlaku do sucha. Byl získán žádaný surový rodukt (234,3 mg). Surový produkt byl podroben HPLC za podmínek popsaných dále v bodě (1) a poskytl frakci obsahující sloučeninu F-15078A.

Podmínky pro HPLC (1)

Kolona: YMC Pak ODS-AM průměr 30 mm x délka 300 mm (produkt YMC K.K.)

Mobilní fáze: Acetonitril: vodný triethylamin-fosfát (1%, vyjádřeno v procentech hmotnostních, pH 6,0) =3:1 (objemově) Průtoková rychlost: 10,4 ml/minutu

Teplota: Teplota místnosti

Retenční čas: 77 až 98 minut

Frakce obsahující sloučeninu F-15078A byla zbavena solí extrakcí ethyl-acetátem jak je popsáno výše a odpařena za sníženého tlaku do sucha. Byla získána sloučenina F-15078A (34,1 mg).

Příklad 2: Příprava sloučeniny F-15078A (2)

Kultivace kmene SANK 13899 (2)

Jedna vlásenka kmene SANK 13899 byla sterilizována (121 °C, 30 minut) a naočkována do preinokulačního prostředí (500 ml), které obsahovalo slo6ky podle tabulky 1 do všech šesti 2 1

Erlenmeyerových baňek. Baňky byly inkubovány při 23 °C šest dní v rotační třepačce (210 ot./min.; 7 cm zdvih). 5 % objemových koncové koncentrace výsledného preinokulačního prostředí bylo sterilizováno (121 °C, 30 minut) a naočkováno • · do inokulačního prostředí (30 1), které obsahovalo ingredience podle tabulky 1 v každé ze dvou 60 1 kvasných kádí. Kádě byly kultivovány při teplotě 23 °C dva dny s promícháváním (100 ot./min.) a s provzdušňováním (provzdušňovací rychlost: 1 wm, koncentrace rozpuštěného kyslíku v roztoku prostředí: 5,0 ppm) . 5 % objemových koncové koncentrace výsledného inokulačního prostředí bylo sterilizováno (121 °C, 30 minut) a naočkováno do připravovaného kultivačního prostředí (2) (3 00 1) , obsahující složky podle tabulky 3 v 600 1 kvasné kádi. Káď byla inkubována při teplotě 23 °C sedm dní s promícháváním (od 83 do 240 ot./min.) s provzdušňováním (provzdušňovací rychlost : 1 wm, koncentrace rozpuštěného kyslíku v kultivačním prostředí : 5,0 ppm).

Tabulka 3: Složky pro přípravu kultivačního prostředí (2)

Glukóza 80 g

Sladový výtažek (Difco) 20 g

Kvasničný výtažek (Difco) 2 g

Tripton (Difco) 10 g

NH₄NO₃ 1 g

NaN0₃ 1 g

KH₂PO₄ 1 g

MgSO₄ 7H₂0 1 g

Činidlo proti pěnění * 0,1 ml

Izolace sloučeniny F-15078A (2)

K získanému roztoku prostředí (370 1) byl přidán Celíte 545 (15 kg, produkt Celíte Corporation) . Výsledná směs byla filtrována filtračním lisem. Ke spečenině mycelia byl přidán vodný methanol • · (1:1, objemově, 400 1), suspenze byla míchána a poté bylo pH suspenze upraveno přidáním 6 M chlorovodíkové kyseliny na hodnotu 2. Výsledná suspenze byla filtrována skrz filtrační lis. Celkový objem sdruženého filtrátu byl 465 1. Podíl filtrátu o objemu 270 byl nanesen na kolonu Cosmocil 140 C18-OPN (produkt Nacalai

Tesque K.K., objem: 30 1), která byla předem promyta směsí methanol: 0,05% vodná trifluoroctová kyselina, vyjádřeno v procentech objemových =1:1, objemově. Kolona byla promyta tímto rozpouštědlem (270 1) a (100 1) směsi acetonitril: 0,05% vodná trif luoroctová kyselina (vyjádřeno v procentech objemových) =4:6, objemově, a vyvinuta směsí acetonitril: 0,05% vodná trifluorooctová kyselina (vyjádřeno v procentech objemových) =6:4, objemově. Eluát byl nasbírán jako první frakce (frakce 1; 15 litrů) a poté bylo nasbíráno dalších pět frakcí (frakce 2 až 6; každá frakce 10 litrů). Sloučenina F-15078A byla eluována ve frakcích až 4 (30 litrů).

Zbytek filtrátu (195 1) získaného výše byl nanesen na kolonu Cosmocil 140 C18-OPN (produkt Nacalai Tesque K.K., objem 30 1), která byla předem promyta směsí methanol: 0,05% vodná trifluoroctová kyselina (vyjádřeno v procentech objemových) =1:1, objemově. Kolona byla promyta tímto rozpouštědlem (200 1) a (100 1) směsi acetonitril: 0,05% vodná trifluoroctová kyselina (vyjádřeno v procentech objemových) = 4:6, objemově, a vyvinuta směsí acetonitril: 0,05% vodná trifluorooctová kyselina (vyjádřeno v procentech objemových) = 6:4, objemově. Eluát byl nasbírán jako první frakce (10 1), druhá frakce (5 1), dvě další frakce (frakce 3 a 4; obě frakce 15 1) a pátá frakce (10 1) . Sloučenina F-15078Abyla eluována ve frakcích 3 až 5 (celkový objem 40 1) .

pH spojených frakcí (celkový objem 70 1) obsahujících sloučeninu F-15078A získaných ze dvou experimentů výše, bylo 6 M hydroxidem sodným upraveno na pH 7 a poté byla aktivní substance extrahována ethyl-acetátem (50 L). Extrakt byl promyt nasyceným vodným roztokem chloridu sodného, sušen bezvodým síranem sodným a odpařen za sníženého tlaku do sucha, čímž byl získán olej(32,3 g) .

Olej byl rozpuštěn v methanolu (200 ml) . 50 ml roztoku bylo podrobeno HPLC za podmínek (2) a zbylých 150 ml methanolického roztoku bylo rozděleno do pěti částí. Každá část (3 0 ml) byla podrobena HPLC za podmínek (2), čímž byla získána sdružená frakce (26 1), obsahující sloučeninu F-15078A. Ke sdružené frakci byla přidána voda (10 1) . Sloučenina F-15078A byla extrahováva ethyl-acetátem (10 1) . Extrakt byl promyt, sušen a odpařen za sníženého tlaku do sucha. Byl získán surový produkt (7,78 g) . Roztok 326 mg surového produktu v methanolu (2 ml) byl rozdělen do deseti částí (každá část byla 200 μΐ) . Každá část byla podrobena HPLC za podmínek (3). Frakce obsahující požadovaný produkt byly sloučeny, odpařeny a lyofilizovány. Byla získána sloučenina F-15078A (275 mg).

Podmínky pro HPLC (2)

Kolona: YMC Pak ODS-AM průměr 100 mm x délka 500 mm (produkt YMC K.K.)

Mobilní fáze: Acetonitril: vodný triethylamine-fosfát (1%, vyjádřeno v procentech objemových, pH 6,0) = 3:1, objemově Vlnová délka detektoru: UV 210 nm

Průtoková rychlost: 240 ml/minutu

Teplota: Teplota místnosti

Retenční čas: 64 minut

Podmínky pro HPLC (3) · · · • · · »44· 44

Kolona: Shodex Asahipak C8P 90 2F průměr 20 mm x délka 250 mm(produkt Showa Denko K.K.)

Mobilní fáze: Acetonitril: 10 mM vodný hydrogenuhličitan amonný = 6:4, obj emově

Vlnová délka detektoru: UV 210 nm

Průtoková rychlost: 14 ml/minutu

Teptota: Teplota místnosti

Retenční čas: 19,2 minut

Příklad 3: Příprava F-15078B

Kultivace kmene SANK 13899 (3)

Jedna vlásemka kmene SANK 13899 byla sterilizována (121 °C, 3 0 minut) a naočkována do preinokulačního prostředí (500 ml) , obsahujícího složky podle tabulky 1 v každé ze šesti 2 1

Erlenmeyerových baňek. Baňky byly inkubovány při teplotě 23 °C šest dní v rotační třepačce (210 ot./min., 7 cm zdvih). 5 % objemových koncové koncentrace roztoku výsledného preinokulačního prostředí bylo sterilizováno (121 °C, 30 minut) a naočkováno do kultivačního prostředí (3 0 1) , které obsahovalo složky podle tabulky 1 v každé ze dvou 60 1 kvasných kádích. Kádě byly kultivovány při 23 °C dva dny s promícháváním (100 ot./min.) a za provzdušňování (provzdušňovací rychlost: 1 wm, koncentrace rozpuštěného kyslíku v roztoku prostředí : 5,0 ppm) . 5 % objemových koncové koncentrace roztoku inokulačního prostředí bylo naočkováno do připravovaného sterilizovaného (121 °C, 30 minut) kultivačního prostředí (2) (300 1) , které obsahovalo složky podle tabulky 3 v Příkladu 2 v kvasné kádi o objemu 600 1. Káď byla • » * · · · inkubována při teplotě 23 °C sedm dní s promícháváním (83 až 240 ot./min.) a za provzdušňování (provzdušňovací rychlost: 1 wm, koncentrace rozpuštěného kyslíku v roztoku prostředí: 5,0 ppm).

Izolace sloučenin F-15078B

K roztoku prostředí (370 1) byl přidán Celíte 545 (15 kg, produkt Celíte Corporation). Výsledná suspenze byla filtrována filtračním lisem. Ke spečenině mycelia byl přidán vodný methanol (1:1, objemově, 400 1) , suspenze byla míchána a poté bylo upraveno pH 6 M chlorovodíkovou kyselinou na hodnotu 2. Výsledná suspenze byla filtrována skrz filtrační lis. Celkový objem sdruženého filtrátu byl 465 1. Podíl filtrátu o objemu 270 1 byl nanesen na kolonu Cosmocil 140 C18-OPN (produkt Nacalai Tesque K.K., objem: 30 1), která byla promyta směsí methanol: 0,05% vodná trifluoroctová kyselina (vyjádřeno v procentech objemových) =1:1, objemově. Kolona byla promyta tímto rozpouštědlem (270 1) a (100 1) směsi acetonitril: 0,05% vodná trifluoroctová kyselina (vyjádřeno v procentech objemových) = 4:6, objemově a vyvinuta směsí acetonitril: 0,05% vodná trifluoroctová kyselina (vyjádřeno v procentech objemových) =6:4, objemově. Eluát byl nasbírán jako první frakce (frakce 1; 15 litrů) a poté pět dalších frakcí (frakce 2 až 6; každá frakce 10 litrů). Sloučenina F-15078B byla eluována ve frakcích 2 až 4 (30 litrů).

Zbytek filtrátu (195 1) získaného výše byl nanesen na kolonu Cosmocil 140 C18-OPN (produkt Nacalai Tesque K.K., objem 30 1) , která byla předem promyta směsí methanol: 0,05% vodná trifluoroctová kyselina (vyjádřeno v procentech objemových) =1:1, objemově. Kolona byla promyta tímto rozpouštědlem (200 1) a (100 1) směsi acetonitril: 0,05% vodná trifluoroctová kyselina (vyjádřeno v procentech objemových) = 4:6, objemově a vyvinuta * » • » · • · směsí acetonitril: 0,05% vodná trif luoroctová kyselina (vyjádřeno v procentech objemových) = 6:4, objemově. Eluát byl shromážděn jako první frakce (10 1), druhá frakce (5 1), dvě další frakce (frakce 3 a 4; 15 1 každá) a pátá frakce (10) . Sloučenina F-15078B byla eluována ve frakcích 3 až 5 (celkový objem 40 1).

Ph spojených frakcí (celkový objem 70 1) , obsahující sloučeninu F-15078B získané ze dvou experimentů výše bylo upraveno 6 M hydroxidem sodným na pH 7 a poté byla aktivní substance extrahována ethyl-acetátem (50 1). Extrakt byl promyt nasyceným roztokem chloridu sodného (50 1) , sušen bezvodým síranem sodným, odpařen za sníženého tlaku do sucha, čímž byl získán olej (32,3 g) . Olej byl rozpuštěn v methanolu (200 ml) . 50 ml roztoku podrobeno HPLC za podmínek (2) v příkladu 2 a zbytek methanolického roztoku (150 ml) bylo rozděleno do pěti částí, kdy každá obsahovala 30 ml a byla také podrobena HPLC za podmínek (2) v příkladu 2. Byla získána sdružená frakce (26 1) obsahující sloučeninu F-15078B. K výsledné frakci byla přidána voda (10 1) , aktivní složka byla extrahována ethyl-acetátem (10 1) , extrakt byl promyt vodou, sušen a odpařen za sníženého tlaku do sucha, čímž byl získán surový produkt (7,78 g).

K roztoku surového produktu (2,10 g) v methanolu (5 ml) byl přidán Cosmocil 140C18-OPN (5 g, produkt Nacalai Tesque K.K.). Rozpouštědlo bylo odpařeno. Odparek byl napuštěn na kolonu Cosmocil 140C18-OPN (objem: 170 ml), která byla promyta směsí acetonitril: 0,05% vodná trifluoroctová kyselina (vyjádřeno v procentech objemových) = 4:6, objemově. Po promytí tímto rozpouštědlem (300 ml) , byla kolona vyvinuta (300 ml) směsi acetonitril: 0,05% vodná trifluoroctová kyselina (vyjádřeno v procentech objemových) = 6:4, objemově a poté dále směsí acetonitril: 0,05% vodná trifluoroctová kyselina (vyjádřeno v procentech objemových) = 9:1, objemově. Eluát byl sbírán do 10 ml frakcí a sloučenina F-15078B byla eluována ve frakcích 64 až 72 (celkový objem 90 ml). Tyto frakce byly spojeny, odpařeny za sníženého tlaku a lyofylizovány. Byl získán žluto-bílý prášek (109 mg) . Roztok tohoto prášku (100 mg) v methanolu (1 ml) byl rozdělen do pěti částí (každá část byla 200 μΐ) . Každá část byla podrobena HPLC za podmínek (4) a frakce obsahující žádaný produkt byly spojeny, odpařeny a lyophilizovány. Byla získána sloučenina F-15078B (69,5 mg) jako bílý prášek.

Podmínky pro HPLC (4)

Kolona: Shodex Asahipak C8P 90 2F průměr 20 mm x délka 250 mm (produkt of Showa Denko K.K.)

Vlnová délka detektoru: UV 210 nm

Průtoková rychlost: 14 ml/minutu

Temperature: Teplota místnosti

Retenční čas: 17,8 minut

Testovací příklad 1: Fungicidní aktivita sloučenin F-15078A a F-15078B

Fungicidní aktivita sloučenin F-15078A a B, jenž je minimální inhibiční koncentrací (MIC) sloučeniny proti každému testovanému kmenu, byla stanovena metodou rozpouštění živné půdy (Yamaguchi,H. , a kol., J. Med. Mycol. 36, 61(1995)) na mikrotitrační destičces jamkami za použití RPMI 1640 kultivačního prostředí obsahujícího ·· ··· · · · · · · ···· ·· ·· ··· ·· ····

0,165 M tlumivý roztok 3-(N-morfolin)propansulfonové kyseliny (produkt Sigma Company). Výsledky jsou shrnuty v tabulce 4.

Tabulka 4: Fungicidní aktivita sloučenin F-15078A a B

Testovací kmen	MIC (gg/ml)
F-15078A	F-15078B
Candida albicans ATCC 90028	2,5	>50
Aspergillus fumigatus IAM 2034	1,3	>50
Cryptococcus neoformans IAM 4772	0,31	1,56
Jak je ukázáno v tabulce 4,	sloučeniny F	-15078A a B vykazují

fungicidní aktivitu.

Příklad přípravku 1: Kapsle pro orální použití

F-15078A		30	mg
Lactoza		170	mg
Kukuřičný	škrob	150	mg
Magnesium	stearát	2	mg
Celkem		352	mg

Složky uvedené výše v práškové formě byly smíseny a byly prosety skrz síto o velikosti ok 600 μΐϊΐ. Výsledná prášková směs byla umístěna do želatinové kapsle, čímž byla získána požadovaná kapsle.

···· · · · · ··· · · · · · ·

Možnosti využití

Sloučeniny podle předkládaného vynálezu vykazují fungicidní aktivitu a jsou použitelné k ošetřování nebo prevenci houbovitých infekčních onemocnění.

Pokud jsou sloučeniny podle předkládaného vynálezu použity jako therapeutická nebo profylaktická činidla pro houbovitá infekční onemocnění, nejsou žádná omezení s ohledem na způsob podávání a lze jej vybrat v závislosti na preparátu, věku, pohlaví, nemoci a symptomech pacienta a tak dále.

Tablety, pilulky, prášky, granule, sirupy, roztoky, suspenze, emulze a kapsule mohou být podávány orálně. Aktivní složku samu, roztok obsahující aktivní složku, glukózu a aminokyseliny apod. nebo emulzi obsahující aktivní složku, polyoxyethylenestery kyseliny sorbové mastných kyselin apod. lze vstřikovat intravenózně, intramuskulárně, podkožně, intrakutánně a nebo intraperitoneálně. Čípky mohou být podávány rektálně.

Tyto přípravky mohou být připraveny použitím aktivního ingredientu a pomocných látek, které jsou odborníkům známy. Pomocné látky jsou například: interní substance k přenosu léčebné látky, pojivá, rozvolňovadla, lubrikanty, solventy, pomocné látky upravující nepříjemné vlastnosti léku a potahovací látky.

Nosiče známé odborníkům pro přípravu tablet zahrnují interní substance k přenosu léčebné látky jako jsou laktoza, sacharoza, chlorid sodný, glukóza, močovina, škrob, uhličitan draselný, kaolin, krystalická celulóza a kyselina křemičitá; pojivá jako jsou voda, ethanol, propanol, prostá melasa, roztoky glukózy, roztoky škrobu, roztoky želatiny, karboxymethylcelulosa, přírodní pryskyřice, methylovaná celulóza, fosforečnan draselný a polyvinylpyrrolidony; rozvolňovadla jako jsou suchý škrob, sodný alginát, prášek z agaru, prášek z polysacharidu obsažený v zelených řasách, hydrogenuhličitan sodný, uhličitan vápenatý, polyoxyethylenestery kyseliny sorbové mastných kyselin, laurylsulfát sodný, mono-glycerid strearové kyseliny, škrob a laktoza; supresivní rozvolňovadla jako jsou sacharoza, stearin, kakaový prášek a hydrogenovaný olej; prostředky usnadňuj ící absorpci jako jsou kvarterní amonniové baze a laurylsulfát sodný; zvlhčovadla jako jsou glycerin a škrob; adsorbenty jako jsou škrob, laktoza, kaolin, bentonit a koloidní křemičitá kyselina; lubrikanty jako jsou rafinovaný mastek, stearáty, prášková kyselina boritá a polyethylen glycol. Pokud je to nutné mohou být tablety převedeny na potahované tablety jako jsoou tablety potahované cukrem, želatinou, látkou, která se rozpustí ve střevě, fólií, dvojitě potahované tablety a mnohonásobně potahované tablety.

Nosiče pro přípravu pilulek jsou odborníkům známy. Příklady takových nosičů zahrnují pomocné látky jako jsou glukóza, laktoza, škrob, kakaový prášek, hydrogenovaný rostlinný olej, kaolin a mastek; pojivá jako jsou prášek z klovatiny, tragantový prášek, želatina a ethanol; rozvolňovadla jako jsou polysacharid obsažený v zelených řasách a agar; a podobně.

Nosiče pro přípravu čípků jsou odborníkům známy. Příklady takových nosičů zahrnuj í polyethylen glycol, kakaový prášek, vyšší • · ···· ·· ·· alkoholy, estery vyšších alkoholů, želatinu a polosyntetické glyceridy.

Pokud je přípravek roztok pro vstřikováni, emulze nebo suspenze, přípravky jsou výhodně sterilizovány a izotonizovány do krve. Ředidla pro přípravu roztoků, emulzí a suspenzí pro vstřikování jsou odborníkům známé. Příklady takových ředidel zahrnují vodu, ethylalkohol, propylen glykol, epoxidovaný isostearyl alkohol, polyoxidovaný isostearyl alkohol, polyoxyethylenestery kyseliny sorbové mastných kyselin a pod. Vstřikovací prostředky smí obsahovat přiměřené množství soli, glukózy, glycerinu a podobně za účelem přípravy izotonických roztoků, emulzí nebo suspenzí do krve a smí také obsahovat pomocné látky jako jsou solubilizační činidla, pufry, uklidňující činidla a pod.

Tyto přípravky případně obsahují, pokud je to nutné také barvící činidla, konzervační prostředky, aromatické látky, sladidla a pod.

Množství aktivní složky podle předkládaného vynálezu v dávkovači formě závisí na přípravku, způsobu podávání a tak dále; je od 1 do 70 % hmotnostních dávkovači formy a výhodněji od 1 do 30 % hmotnostních. Dávka sloučeniny podle předkládaného vynálezu závisí na různých faktorech jako je nemoc, symptomy, věk a tělesná váha pacienta, způsobu podávání, typu přípravku a tak dále. Vhodná dávka je od 20 do 2000 mg jako horní limit denně pro dospělého člověka a od 0,001 do 0,1 mg jako dolní limit pro dospělého člověka. Preferovaná dávka je od 0,01 mg do 200 mg a výhodněji je od 0,1 do 20 mg.

• · • · · · • · · · · * · · · · * * · · · · ·

Farmaceutické prostředky obsahující sloučeniny podle předkládaného vynálezu lze podávat také v jedné dávce na několik dnů nebo lze tyto dávky rozdělit na odpovídající podjednotky podané jednou nebo několikrát během dne v závislosti na přípravku, nemoci, symptomech a tělesné váze pacienta a tak dále.

Claims

PATENTOVÉ NÁROKY

1) Charakteristika: Neutrální prášek rozpustný v tucích

1,73(1H) 2,48(3H) 4,06(1H) 4,96(1H)

0,87(3H) 0,97(3H) 1,21(1H), 1,52(3H) 1,81(1H) 2,89(3H) 4,14(1H) 5,21(1H)

O,88(1H), 0,98(3H) , 1,41(3H) , 1,55(1H) , 1,87(1H) , 2,94(3H), 4,77(1H), 5,25(1H),

1,70(2H) 2,37(1H) 3,56(1H) 4,91(1H)

1,48(1H), 1,49(1H)

0,78(3H) 0,92(3H) l,01(3H) 1,41(1H) 1,65(1H) 2,28(1H) 2,96(1H) 4,78(1H) 5,53(1H)

0,79(3H) , 0,93(3H) , 1, 02(3H) 1,48(1H) , 1,66(1H) , 2,31(1H), 3,29(3H) , 4,84(1H),

1,03 (3H) ,1,06 (3H) ,

1) Charakteristika: Bazický prášek rozpustný v tucích

1. Sloučenina chemického vzorce I nebo její sůl.

2) Molekulární vzorec: C₅7HiooN₈Oi₅

2) Molekulární vzorec: C₅5H9₈N₈Oi4

2. Sloučenina charakterizovaná fyzikálně chemickými vlastnostmi:

3) Molekulová váha: 1136; způsob FAB-MS • · · · · · · · · · ·

3. Sloučenina chemického vzorce II

3) Molekulová váha: 1094; způsob FAB-MS

4) Vysoké rozlišení FAB-MS [M+H]⁺ vypočteno pro C₅7HioiN₈Oi₅ 1137,7387 nalezeno 1137,7410

4. Sloučenina charakterizovaná fyzikálně chemickými vlastnostmi:

4) Vysoké rozlišení FAB-MS [M+H]⁺ vypočteno pro C₅₅H99N₈Oi₄ 1095,7281 nalezeno 1095,7365

5. Způsob přípravy sloučeniny podle kteréhokoliv z nároků 1 až 4, vyznačující se tím, že se fermentuje mikroorganismus náležící ke kmeni Phoma genus, produkující sloučeninu podle kteréhokoliv z nároků 1 až 4, a izolují sloučeniny podle kteréhokoliv z nároků 1 až 4 z fermentačních produktů tohoto mikroorganismu.

5) Ultrafialové absorpční spektrum: Zbytková absorpce

6. Způsob podle nároku 5vyznačující se tím, že se použije mikroorganismus, náležící ke kmeni Phoma genus a produkující sloučeninu podle kteréhokoliv z nároků 1 až 4 je Phoma sp. SANK 13899 (FERM BP-6851).

6) Infračervené absorpční spektrum (KBr tableta, cm'¹) :

3433, 3333, 2963, 2937, 2875, 1751, 1686, 1642, 1516, 1469,1409, 1388, 1372, 1311, 1292, 1272, 1201, 1156, 1128, 1074,1017

6,39(1H), 7,83(1H), 7,94(1H), 8,28(1H)

6) Infračervené absorpční spektrum (KBr tableta, cm'¹) :

3434, 3335, 2962, 2937, 2875, 2806, 1750, 1684, 1641, 150

7. Farmaceutický prostředek vyznačující se tím, že jako aktivní složku obsahuje sloučeninu podle kteréhokoliv z nároků 1 až 4 nebo její sůl.

7,86(1H), 8,29(1H).

7) Optická rotace: [a]_D ²⁵ -131° (c 1,0, methanol)

7) Optická rotace: [a]_D ²⁵ -120° (c 1,0, methanol)

8. Therapeutická nebo profylaktická činidla houbovitých infekčních onemocnění vyznačující se tím, že jako aktivní složku obsahují sloučeninu podle kteréhokoliv z nároků 1 až 4 nebo její sůl.

0,78(3H), 0,79(3H), 0,80(3H), 0,83(3H), O,87(1H),

0,87(3H) , 0,90(3H) , 0,92(3H) , 0,93(3H), 0,95(3H) , 0,95(3H) , 0,98(3H) , 0,98(3H) , l,01(3H) , l,01(3H) , 1,03(1H), l,05(3H) , 1,28(3H) , 1,37(1H), 1,4O(1H), 1,46(1H) , 1,47(1H), 1,49(1H), 1,51(3H) , 1,64(1H), 1,65(1H) , 1,66(1H) , 1,86(1H), 1,72(1H) , 1,78(1H) , 2,12 (3H) , 2,13(1H), 2,26(1H) , 2,31(1H), 2,37(1H), 2,88(3H), 2,93(3H), 2,97(3H) , 3,28(3H) , 3,56(1H), 4,03(1H), 4,15(1H) , 4,73(1H), 4,78(1H), 4,82(1H) , 4,83(1H), 4,91(1H), 4,97(1H), 5,15(1H), 5,28(1H), 5,5O(1H) , 6,37(1H), 6,87(1H),

8) ^ΧΗ NMR spektrum (v CDC1₃, 500 MHz, δ (ppm), interní standard: tetramethylsilan):

0,80(3H), 0,82(3H)

0,94(3H), 0,96(3H)

9. Kmen Phoma sp. SANK 13899 (FERM BP-6851).

• · · · ·· · 9 9 9 9 ·· 9 9 9 9

9) ¹³C NMR spektrum (v CDC1₃, 500 MHz, δ (ppm) , interní standard: tetramethylsilan):

9) ¹³C NMR spektrum (v CDC1₃, 500 MHz, δ (ppm) , interní standard:

tetramethylsilan):

9,1469, 1412, 1371, 1314, 1294, 1271, 1204, 1156, 1128, 1

074,1020

10. Použití sloučeniny podle kteréhokoliv z nároků 1 až 4 nebo její soli.

10) Vysoceúčinná kapalinová chromatografie:

16,7(q) 22,0(q) 24,7(d) 31,6(d) 46,l(d) 64,6(d)

169,1 (s) 172,0 (s) • · • · ·

Kolona: Shodex Asahipak C8P 50 4E (průměr 4,6 mm x délka 250 mm (produkt of Showa Denko K.K.)

Mobilní fáze: Acetonitril: 10 mM roztok vodného hydrogenu hličitanu amonného =13 : 7, objemově

10,5(q) , 10,9(q) , 14,9(q) , 15,l(q) , 15,6(q), 16,6(q) 18,3(q), 18,6(q) , 18,7(q) , 19,0(q) , 20,8(q), 21,4(q) 22,l(q) , 23,l(q) , 23,6(q) , 23,6(q), 24,l(t), 24,6(t) 24,8(d) , 25,4(d) , 27,7(d) , 29,5(q), 29,8(d), 30,2(q) 31,8(q) , 36,l(t) , 37,6(t) , 38,4(d) , 39,6(t), 40,9(q) 51,8(d) , 53,l(d) , 54,7(d), 54,7(d) , 61,2(d), 63,9(d)

68,l(d), 73,l(d), 74,3(d), 77,0(d), 168,9(s), 168,9(s), 169,9(s), 169,9(s), 170,3 (s), 170,6(s), 171,7(s),

173,3(s), 173,8(s)

10) Vysokoúčinná kapalinová chromatografie:

Kolona: Shodex Asahipak C8P 50 4E (průměr 4,6 mm x délka 250 mm (produkt Showa Denko K.K.)

Mobilní fáze: Acetonitril: 10 mM roztok vodného hydrogen uhličitanu amonného =13 : 7, objemově

Průtoková rychlost: 0,7 ml/minutu Vlnová délka detektoru: λ 210 nm

169,9(s), 170,3(s), 172,0(s), 173,4 (s), 173,8 (s), • 9 • ·

Retenční čas: 10,20 minut

10,9(q), ll,9(q), 15,0(q), 15,l(q), 16,0(q), 16,6(q), 17,4(q),

18,3(q), 18,6(q), 18,7(q), 19,l(q), 21,0(q), 21,4(q), 22,l(q),

23,l(q), 23,51{q), 23,54(q), 24,2(t), 24,6(d), 24,8{d), 25,4(d), 25,5(t), 27,7(d), 29,5(q), 29,8(d), 30,2(q), 36,l(q), 36,5(t),

37,7(t), 38,3(d), 38,4(d), 39,7(t), 40,9(q), 46,2(d), 51,8(d),

53,l(d), 54,7(d), 55,l(d), 63,9(d), 64,7(d), 68,l(d), 70,l(d),

74,3(d), 77,l(d), 169,03(s), 169,04(s), 169,6(s),

73,4(d),

169,8(s)

174,0(s)

11. Způsob léčení a prevence houbovitých infekčních onemocnění, vyznačující se tím, že zahrnuje podávání farmaceuticky účinného množství sloučeniny podle kteréhokoliv z nároků 1 až 4 nebo její soli zvířatům.

11) Rozpustnost: Rozpustná v dimethylsulfoxidu, methanolu a chloroformu

12) Analýza aminokyselin: Z hydrolyzátu byly detekovány threo nin, alanin a isoleucin.

11) Rozpustnost: rozpustná v dimethylsulfoxidu, methanolu a c hloroformu

12) Analýza aminokyselin: Z hydrolyzátu byly detekovány threo nin, alanin a izoleucin nebo její sůl.

12. Farmaceutický prostředek vyznačující se tím, že jako aktivní složku obsahuje sloučeninu podle jakéhokoliv z nároků 1 až 4 nebo její sůl.