CZ20031404A3 - Způsob izolace imunostimulačního glukanu z hlívy ústřičné - Google Patents

Description

Vynález se týká způsobu izolace imunostimulačního glukanu z hlívy ústřičné (Pleurotus ostreatus), s výhodou z tření plodnice houby defibrací, následným bělením peroxidem vodíku a dehydratací.

Dosavadní stav techniky

Je dostatečně známé, že některé přírodní polysacharidy se vyznačují imunostimulačními a jinými farmakologickými vlastnostmi. Jsou to zpravidla ty polysacharidy, které mají v hlavním polysacharidovém řetězci přísně β-(1,3)-Dglykosidickou vazbu, která je hlavním nositelem jejich imunostimulační aktivity.

Imunostimulační polysacharidy se vyskytují v buněčných stěnách baktérií, kvasinek a mnohých hub, hlavně rodu Basidiomycetes /Di LUZIO, N.R., CHIHARA, G.: Adv. Imunopharmacol. 1, 477 (1981); JACQUES, P.J.: Imunomodulator polysacharides, str. 429 - 438 v Current concepts in human immunology and cancer immunomodulation: Eds SCRRON, B. et al.; Elsevier Biomed. Press B.V. (1982); CHIHARA, G.: EOS riv. Immunol. Immunofarm. 4, 85 (1984).

Imunofarmakologicky aktivní látky, tj. také β-(1,3)-D-glukany působící na základní obranné systémy hostitele, mohou pozitivně ovlivnit počet, funkční aktivitu a interakce makrofágů T a B lymfocytů, NK buněk, jakož i jejich humorální a sekreční komponenty. Mohou tedy nespecificky modifikovat rozsáhlý soubor bakteriálních, houbových, parazitních a virových infekcí. Mechanismus působení glukanů se tedy výrazně liší od mechanismu působení chemoterapeutik a antibiotik (TRNOVEC a spol.: Farm. obzor 56, 271 (1987); OSTAD, E., SELJELICH, R.: Acta path. Microbiol. Scand. 88, 97 (1980); LEHNBORG, G., HEDSTRÓM, K.G., C.E.: J. Reticuloendothel. Soc. 32, 347 (1982)).

Rovněž tak i další práce potvrzují, že imunostimulační glukány jsou látky, které si zasluhují mimořádnou pozornost při léčbě a prevenci mnohých onemocnění. Tak • 4 • ·· 4

2........

například je ověřeno, že imunoglukany zvyšují imunitu proti různým bakteriálním a virovým onemocněním, mají protirakovinný účinek, potencují účinek při radioterapii onkologických pacientů (KOMASU, N. a spol.: US pat. 3, 943 247 (1976), MIYACHI, M. a spol.: Ger. Offen 3, 032636 (1981), PATCHEM, M.: Surv. Imunol. Re. 2, 237 (1983), POSPÍŠIL a spol.: Experiencia 38, 1232 (1982).

V současnosti se v průmyslovém měřítku vyrábějí β-(1,3)-ϋ- glukany hlavně z kvasinek a některých hub rodu Basidiomycetes.

Hlavními nedostatky glukanu z kvasnic je poměrně náročná technologie, nízký výtěžek glukanu (kolem 5% na sušinu kvasnic) a vysoké nároky na eliminaci odpadních alkalických roztoků. Výhodou fungálních glukanů je především technologická jednoduchost a kolem 30 až 50 %-ní výtěžek glukanu na sušinu vstupní suroviny.

V současné době jsou známy dva způsoby izolace glukanu z hlívy ústřičné, a to buď studenou nebo horkou extrakcí plodnic (KUNIAK, L. a spol.: CS patent č. 274 918 a CS patent č. 276 192), při kterých lze dosáhnout až 50 %-ní výtěžek imunostimulačního glukanu na sušinu hlívy ústřičné.

Při způsobu podle CS patentu č. 274 918, při kterém se použije v prvním stupni k extrakci neglukanových složek hydroxid sodný s koncentrací 0,1 až 0,2 M/l, se po dobu extrakce rozpouští rovněž i část vodorozpustného glukanu v množství 10 až 15 % na sušinu vstupní suroviny.

Podrobnějším studiem chemických změn proteinové části hlívy ústřičné, které probíhají při teplotě 95 až 100 °C s 0,1 až 0,2 M roztokem NaOH, se zjistilo, že část proteinů se denaturuje a stává se nerozpustnou, t. j., zvyšuje se obsah dusíku ve finálním glukanu a část se alkalickou hydrolýzou transformuje na oligopeptidy, respektive na aminokyseliny, za tvorby tmavých kondenzačních produktů, které se sorbují na glukanu a snižují bělost hotového nerozpustného glukanu.

Cílem předkládaného vynálezu je zvýšit výtěžek nerozpustného glukanu a jeho bělost při minimální tvorbě odpadních alkalických roztoků.

• · · · • · · ·

Podstata vynálezu

Tento cíl do značné míry řeší způsob izolace imunostimulačního glukanu z hlívy ústřičné, s výhodou z tření plodnice, defibrací, následným bělením peroxidem vodíku při teplotě 15 až 25 °C po dobu 15 až 24 hodin, v prostředí hydroxidu sodného a dehydratací, jehož podstata spočívá vtom, že defibrace, která předchází bělení peroxidem vodíku v prostředí roztoku hydroxidu sodného, se uskutečňuje do 26 hodin po sběru hlívy ústřičné.

Důkladnějším studiem glukanového podílu hlívy ústřičné bylo zjištěno, že tento se skládá ze dvou částí, jedna část je vodorozpustná a představuje oligopeptidy respektive aminokyseliny, a druhá část je ve vodě nerozpustná a je tvořena denaturovanými proteiny, to znamená, že obsahuje zvýšený obsah dusíku. Poměr vodorozpustného glukanu k nerozpustnému glukanu je asi 1:2. Tento poměr však platí v době, kdy plodnici oddělíme od substrátu, to je v době bezprostředně po sběru. Je-li však hlíva ústřičné po sběru skladována, tak dochází k autolýze glukanu přítomným enzymem β-(1,3)-D-glukanázou. Aby se zpomalila autolýza glukanu, je zapotřebí defibrací hlívy ústřičné uskutečnit nejdéle do 26 hodin po její sběru.

Rovněž tak bylo zjištěno, že hydrolýza glukanu se značně zvyšuje při vyšší teplotě. Je-li teplota skladování kolem 20 °C a vyšší, potom je rozsah hydrolýzy úměrný teplotě a délce skladování. Při autolýze stoupá vodorozpustný podíl glukanu na úkor vodonerozpustného podílu. Bylo zjištěno, že je nevyhnutelné hlívu ústřičnou skladovat při teplotě 4 až 8 °C.

Defibrace se uskutečňuje v prostředí nejméně dvojnásobného množství vodního roztoku uhličitanu sodného anebo draselného s koncentrací 0,05 až 0,15 % hmotn. Defibrace probíhá při pH roztoku 8 až 9 po dobu 1 až 8 min. za vzniku reakční suspenze. Defibrace vykonávaná v takovémto krátkém časovém úseku 1 až 8 min. způsobí maximální eliminaci enzymové aktivity přítomné β-(1,3)-D-glukanázy. Potom se suspenze filtruje a dokonale promyje vodou, čímž dochází k odstranění vodorozpustných složek. Dále se reakční suspenze bělí peroxidem vodíku v přítomnosti hydroxidu sodného nebo draselného při koncentraci nerozpustného φφ ···· ·· φφ ·· ΦΦ·· • · · · · · · · · • · · · · ··· · · · • · φφφ ·· · · · · · φ · · · φφφφ ΦΦΦΦ φφ φφ φφ φφ φφ ·· glukanu 4 až 5 % hmotn. Dehydratace se uskutečňuje etanolem, acetonem nebo lyofilizací.

Bylo zjištěno, že je výhodné defibraci realizovat po dobu 5 min.

Dále bylo zjištěno, že se při filtraci odstraňují vodorozpustné složky, jako jsou například proteiny, popeloviny, enzymy, sacharidy a jiné.

Kromě doposud používaných de hydratačních činidel, jako je etanol a aceton, bylo zjištěno, že je výhodné uskutečňovat dehydrataci lyofilizací. Při takto zvolené dehydrataci se získává glukan o čistotě 94 %. Glukan s touto čistotou je vhodný pro přípravu vakcín.

Hlavní výhodou způsobu podle vynálezu je, že umožňuje získat o 15 až 20 % vyšší výtěžek na sušinu výchozí suroviny. Další výhodou je o 20 až 30 % vyšší bělost získaného glukanu oproti dosud známým způsobům. Nezanedbatelnou výhodou je ekologická výhoda tohoto způsobu, při kterém se dosáhne maximálního snížení nákladů na čištění odpadních vod. Podle vynálezu se obsah organických látek v pracích odpadních vodách sníží o 30 % a obsah vodorozpustného glukanu o 15 až 20 %.

Příklady provedení vynálezu

Příklad 1

V průmyslovém mixéru se defibruje 5 hod. po sběru 20 kg třeni plodnic hlívy ústřičné v prostředí vodného roztoku uhličitanu sodného, který sestává z pitné vody v množství 40 I a uhličitanu sodného v množství 60 g. Defibrace probíhá v mixéru po dobu 3 min. za vzniku zhomogenizované suspenze.

Přítomný uhličitan sodný zabezpečuje pH prostředí 8, při kterém se eliminuje enzymová aktivita přítomné β-(1,3)-D-glukanázy a současně se zabraňuje dalšímu rozpouštění vodonerozpustného glukanu. Po defibraci se reakční suspenze přefiltruje •9 9999

9

9 999 99 999 9 · ···· · · · · · · · ·

99 99 99 99 99 přes textilní filtr a dokonale se promyje pitnou vodou při odstranění všech vodorozpustných látek, jako jsou proteiny, popeloviny, enzymy, sacharidy, jakož i vodorozpustný glukan. Takto získaný nerozpustný podíl glukanu se nechá dobře odtéci od kapalné fáze, vloží se do reaktoru o obsahu 50 I a zalije se 200 ml vody, do které se přidá 80 g NaOH. Po dokonalém promíchání se k reakční směsi za nepřetržitého míchání přidají po částech 2 I 30 %-ního peroxidu vodíku a reakční směs se nechá staticky bělit 18 hod. Po vybělení se získaný glukan promývá pitnou vodou až do zmizení červeného zabarvení fenolftaleinového indikátoru na červeno. K filtračnímu koláči se přidá 5 I pitné vody okyselené 20 ml kyseliny octové a po promíchání se filtrační koláč opět promyje 10 I pitné vody. Mokrý glukan se lisuje v hydraulickém lise a odlisovaný koláč se v reaktoru zalije 20 I koncentrovaného etanolu, nechá se 1 hod. odstát, potom se suspenze přemístí do lisu s textilní vložkou a po odtečení se vylisuje. Dehydratace s etanolem se opakuje ještě dvakrát, poté se získaný glukan vysuší při teplotě 60 °O. Vysušený glukan se dále mele v suchém mlýně a proseje se přes síto s velikostí ok 0,5 mm.

Výsledný glukan s výtěžkem 70 % na hmotnost sušiny tření plodnice hlívy ústřičné je nerozpustný ve vodě, ve zředěných kyselinách, jakož i v organických rozpouštědlech, obsahuje 0,6 % chitinového dusíku, 1,5 % popele a má velikost částic 0,5 mm.

Příklad 2

Postupuje se jako v příkladě 1 s tím rozdílem, že se na bělení použije 1,5 I peroxidu vodíku o koncentraci 30 % hmotn. a bělení probíhá po dobu 24 hod. při teplotě 23 °C.

Výtěžek a kvalitativní parametry glukanu jsou srovnatelné s kvalitativními parametry glukanu v příkladě 1.

• 4 ·4« 4 • · 4 4 4 4

4 4 4

4 4 ·

4444 4 4

Příklad 3

Postupuje se jako v příkladě 2 s tím rozdílem, že dehydratace mokrého glukanu se uskutečňuje lyofilizací, přičemž se získá velmi jemný práškový glukan vhodný na přípravu vakcín ve veterinární medicíně.

Příklad 4

Postupuje se jako v příkladě 3 s tím rozdílem, že při mixování čerstvé hlívy se použije místo uhličitanu sodného 80 g uhličitanu draselného.

Výtěžek a kvalitativní parametry glukanu jsou srovnatelné s kvalitativními parametry glukanu v příkladě 1.

Průmyslová využitelnost

Glukan izolovaný způsobem podle vynálezu lze využít jako imunostimulační potravinový doplněk proti různým bakteriálním a virovým onemocněním, respektive s vysokým radioprotektivním účinkem při radioterapii onkologických pacientů.

·♦ t *· · ·· ·*·« • * * « « t · · « 9 9 999

9 9 9 9

PATENTOVÉ NÁROKY

Claims (7)

1. PATENTOVÉ NÁROKY

   1. Způsob izolace imunostimulačního glukanu z hlívy ústřičné (Pleurotus ostreatus), s výhodou z tření plodnice defibrací, následným bělením peroxidem vodíku při teplotě 15 až 25 °C po dobu 15 až 24 hod. v prostředí roztoku hydroxidu sodného a dehydratací, vyznačující se tím, že defibrace, která předchází bělení peroxidem vodíku v prostředí roztoku hydroxidu sodného při koncentraci nerozpustného glukanu 4 až 5 % hmotn. a dehydrataci, se uskutečňuje do 26 hodin po sběru hlívy ústřičné, skladované při teplotě 4 až 8 °C v prostředí nejméně dvojnásobného množství vodného roztoku uhličitanu sodného nebo draselného s koncentrací 0,05 až 0,15 % hmotn., při pH roztoku 8 až 9, po dobu 1 až 8 min. za vzniku reakční suspenze s eliminovanou enzymovou aktivitou přítomné β-(1,3)-D-glukanázy při odstranění vodorozpustných složek z reakční suspenze filtrací a dokonalým promytím vodou.
2. 2. Způsob podle nároku 1, vyznačující se tím, že bělení peroxidem vodíku probíhá v prostředí roztoku hydroxidu sodného o koncentraci 0,05 až 0,09 % hmotn.
3. 3. Způsob podle nároku 1 a 2 vyznačující se tím, že d efibrace s e s výhodou uskutečňuje po dobu 5 min.
4. 4. Způsob podle nároků 1 až 3 vyznačující se tím, že je výhodné defibrací uskutečnit do 24 hod. po sběru hlívy ústřičné.
5. 5. Způsob podle nároků 1 až 4 vyznačující se tím, že je výhodné defibrací uskutečnit u hlívy ústřičné skladované při teplotě 5°C.
6. 6. Způsob podle nároků 1 až 5 vyznačující se tím, že dehydratace se uskutečňuje etanolem, acetonem nebo lyofilizací.
7. 7. Způsob podle nároků 1 až 6 vyznačující se tím, že se ze suspenze filtrací odstraní vodorozpustné složky, jako jsou proteiny, popeloviny, enzymy, sacharidy, vodorozpustný glukan.