CZ20031455A3 - Zařízení a způsob pro zkoumání vzorků v nevakuovém prostředí s použitím skenovacího elektronového mikroskopu - Google Patents

Description

Zařízení a způsob pro zkoumám' vzorků vnevakuovém prostředí s použitím skenovacího elektronového mikroskopu

Oblast techniky

Tento vynález se vztahuje k zařízení a způsobu pro zkoumání vzorků vnevakuovém prostředí s použitím skenovacího elektronového mikroskopu a konkrétněji, avšak nikoli výhradně, se zaměřuje na používání takového zařízení a způsobu při zkoumání předmětů ve vlhkém prostředí.

Vlnová délka švéda omezuje postupy optické mikroskopie na rozlišování v rozsahu stovky nebo obvykle několika stovek nanometrů. Skenovací elektronové mikroskopy (zkratka „SEM“ podle anglického výrazu „Scanning electron microecopes“) toto omezení nemají a jsou vybaveny schopností dosahovat podstatně vyšší rozlišování v rozsahu několika nanometrů.

Jedna z nevýhod skenovacích elektronových mikroskopů „SEM“ spočívá vtom, že vzorky se musí udržovat ve valátu, čímž se vylučuje zkoumání živých organismů nebo zkoumání vlhkých materiálů. Navíc elektricky izolující vzorky, které obsahují organické materiály, vyžadují povlékám, aby se předcházelo hromaděni elektrického náboje.

Už v roce 1960 byla zveřejněna disertační práce autora jménem Thomley (University of Cambridge, 1960\ která popisovala neúspěšné pokusy o udržení vzorku určeného pro elektronovou mikroskopii vprostřed! vodní páry. Pro utěsněné oddělení komory od vakua elektronového paprsku se používá membrána a vlastní komora má přívodní vstup od zdroje vodní páry.

Pokusy o využití elektronově mikroskopie při zkoumání živých vzorků sahají až do roku 1970. Dokument autorů Swifta a Browna (3> Phys- E: Sci. Instrum. 3, 924, 1970) popisuje použití prostupové elektronové mikroskopie (zkratka „TEM“ podle anglického výrazu „TransmtssiKni electron microscopy“) pro zkoumání vzorků při atmosférickém tlaku například ve vodě. Pro umístění vzorku se používá komůrka, jejíž otvor se utěsňuje kolodium-uhhkovým

-2« 4 • 4 «444 4

44 4 «*4 4

44 44 44 filmem. Elektronový paprsek prochází otvorem tak, aby dopadal na vzorek, a elektrony, které vzorek nezastavuje, pokračuji ke sctncflátoru, kde se vytvářejí protony. Zjttttoč výsledky při atmosférickém tlaku byly „spíše poruchové“, ačkoli bylo potvrzeno rozlišení 0,1 pm.

Patent USA číslo 4,071,766 popisuje pokus o použití elektronové mikroskopie při prohhžcní materiálu v «©vakuovém prostředí a označtge zkoumání živých předmětů jako „stále se opakující problém“. Patent USA číslo 4,720,633 popisuje další pokus o použití elektronové mikroskopie při prohlížení materiálu v nevakuovem prostředí. V případě obou uvedených patentů postupuje elektronový paprsek skrze otvor k vlhkému vzorku. Avšak ani jeden z těchto pokusů nebyl úspěšný při prohlížení vlhkých předmětů. Obsah obou zmíněných dokumentů je zde zahrnut ve formě odkazu.

Výrobkem pokoušejícím se o vyřešení zmíněného proUónu je komerčně dostupný „Envffonmentáhií skcnovací elektronový mikroskop“ (zkratka „ESEM“ podle anglického výrazu „Environmental Scarming Electron Microscope“) od firmy „Philips Electron Optics“ sídlící v holandském Eidhovenu, který udržuje vakuový gradient na dráze elektronového paprsku. Avšak mikroskop ESEM vyžaduje práci se vzorkem při kritickém bodu rovnováhy vody a páry a vyžaduje ochlazování vzorku na teplotu prfibtížnč 4° C. Uvádí se, že existuje možnost zkoumání vzorků při tlacích až to 5 Tonů. Doposud však neexistuje důkaz, že hy bylo možné prohlížet vlhké a/nebo živé předměty při rozlišení 10 nanometrů a méně. Další informace o tomto výrobku a o způsobu, kterým pracuje, lze nalézt v patentech USA čisto 5,250,808, číslo 5,362,964 a číslo 5,412,211, jejichž obsahy jsou zde zahrnuty ve formě odkazu.

Rozšířeným způsobem dosahování vysokého rozlišování při prohlížení organické hmoty je prostupová elektronové mikroskopie (zkratka „TEM“ podle anglického výrazu „Transmission electron microscopy“). TEM vyžaduje zvláštně připravované vzorky mající typickou tloušťku v rozedni 50 nm. Účinek velmi vysokého napětí vytváří rovnoběžný paprsek, který prostupuje skrze vzorek. Patent USA čisto 5,406,087, jehož obsah je zde zahrnut ve formě odkazu, popisuje zařízení pro držení vzorku, které je použitelné v přístroji pracujícím podle způsobu TEM. Vzorek se utěsňuje mezi dvěma filmy tak, aby skrze takto vytvořené vrstvené mohl prostupovat svazek elektronových paprsků. Vnitřek zařízení se plní vlhkostí a může se umístit do vakuového prostředí přístroje TEM. Paprsek s velkou energií prostupuje skrze vzorek a obklopuje tekutinu, což má za následek špatný poměr signálu vůči Šumu, jakož i závažné poškození vzorku.

-3« 4

44 4

4 4 · 4

4444 44

Informace, které poskytuje elektronová mikroskopie, obvykle nebývají dosažitelné s použitím jiných technických postupů (jejich přehled uvádí Griffiths (2001) pod názvem „Trendy v biologii buněk, 11:4:153 - 154]. Hlavní příčinou převažujícího malého zájmu o využívání elektronové mikroskopie je složitost přípravy vzorků, která je nejen náročná na práci a čas, ale také zvyšuje obavy o spolehlivost výsledků z biologického hlediska. Schopnost provádění elektronové mikroskopie ve vodném prostředí by odstranilo tyto problematické kroky přípravy vzorků.

Navzdory dlouhodobé pociťované potřebě v současnosti neexistuje žádný mikroskop, který by umožňoval zkoumání vlhkých vzorků při rozlišeních ukazujících makromolekulární a molekulární úrovně detailu. Taková schopnost je potřebná v takových oblastech, k nimž patří biologie buněk a nauka o potymcrech, jakož i ropný, potravinářský a mikroelektronický průmysl. Obzvláště v oblasti biologie buněk by lakový mikroskop umožňoval analýzu buněk, která by otevřela cestu k měření procesů molekulárních úrovní a která by taktéž uvedla do života novou oblast zkoumání farmaceutických látek a diagnostických měření.

Podstata vynálezu

Cílem přihlašovaného vynálezu je poskytnout komoru, která bude upravena pro použiti ve skenovacím elektronovém mikroskopu a umožní provádění elektronové mikroskopie vlhkých vzorků.

V souladu s prvním znakem přihlašovaného vynálezu je vyvinuta komora, která je určena pro použiti ve skenovacím elektronovém mikroskopu, řečená komora má přinejmenším jeden otvor, tento otvor je utěsněn membránou, řečená membrána je přizpůsobena tak, aby vydržela účinek vakua a aby umožňovala prostupnost elektronů, přičemž řečená komora je oddělena od řečeného vakua.

Je výhodné, že komora je přizpůsobena pro udržování vody nebo jiného vodného média, včetně, avšak nikoli výhradně média buněčné kultury v podmínkách působení v podstatě atmosférického tlaku.

Je výhodné, že otvor, který je utěsněn s použitím membrány, má průměr v rozsahu od 0,1 mm do 4 mm.

-4• 444

4 4 4

44 • 4 44

Membrána má výhodně doušťku s rozměrem v podstatě v rozsahu od 200 Á do 5000Á, výhodněji v rozsahu od 500 Á do 2000 Á a nejvýhodněji v rozsahu od 500 Á do 1500 Á.

K vlastnostem, které se od membrány vyžadují a které vytvářejí podstatný základ tohoto vynálezu, patří schopnost vydržet rozdíl tlaku přihhžnč 1 atmosféry mezi vakuem elektronového mikroskopu a prostředím existujícím v komoře, jež je utěsněna pomocí řečené membrány, přičemž tato membrána je natolik tenká, aby umožňovala prostupnost elektronů a jejich interakci se vzorkem umístěným v komoře. Lze použít každý materiál, který vykazuje uvedené vlastnosti v souladu s principy tohoto vynálezu. V souvislosti s právě upřednostňovanými provedeními se materiál membrány vybírá ze skupiny, do níž patří polyimid, polyamid, pdyamid-imid, polyethylen, polypyrrol a další vodivé polymery, pafodřtim, kolodium, Kapton, FormVar, Vinylec, ButVar, Pidoform, oxid křemičitý, oxid křemíku a uhlík.

Vzorek se výhodně umisťuje do blízkosti membrány. Alternativně se vzorek připevňuje ve styku sřečenou membránou a takové umístění poskytuje výhodu vtom, že elektronový paprsek musí překonávat minimální vzdálenost skrze hmotu (na rozdíl od vakua) ke vzorku. Membrána se výhodně opírá do opěrné mřížky, která se umisťuje mezi membránou a vakuem.

Obecně lze uvést, že komora je umístěna ve vakuu, přičemž vzorek je obklopen tekutinou nebo je vystaven účinku v podstatě atmosférického tlaku, popřípadě oběma složkám vnitřního prostředí komory. Přinejmenším část stěny řečené komory je odolná proti účinkům jedné atmosféry tlakového gradientu a umožňuje prostupnost elektronů majících energii vyšší než přibližně 2 keV.

V souladu s druhým znakem přihlašovaného vynálezu je vyvinut prfístroj s vysokou rozlišovací schopností pro prohlížení předmětu umístěného v komoře s použitím skenovacího elektronového mikroskopu, kdy toto zařízení obsahuje vakuovou dráhu pro elektronový paprsek a přepážku odolávající účinkům vakua, která se umisťuje ve spojitosti s předmětem, přičemž řečená přepážka odolávající účinkům vakua je umístěna tak, aby oddělovala předmět od vakua. Předmět může mít na sobě fluorescenční nebo elektroluminiscenční označení, neboť paprsek elektronů má schopnost buzení fotoelektrické emise. Označení může být přidruženo k molekule konkrétního zájmu a tento způsob umožňuje pozorování světelných obrazů, které obsahují informace o jednotlivých molekulách. Takové provedení výhodně využívá optickou snímací jednotku a komora se může budovat jako část svétlovodu. Optická snímací jednotka může také obsahovat trubici s fotoelektrickým násobičem.

• ··· « · ···· · • ·· · « »· * «· ·· ·· Μ

-5Optická snímací jednotka se může přizpůsobit pro detekování jednotlivých fotonů a na základč toho se zařízení přizpůsobuje pro snímání světefaiých záření, která jsou výsledkem stimulování jednotlivých molekul.

Ve výhodnějších provedeních se přepážková membrána může zhotovovat z některého z materiálů, k nimž patří pdyinrid, polyamid, pdyanúd-imid, Kapton, FonnVar a ButVar.

Přepážka nebo membrána se může vyztužit pomocí vyztužovací mřížky, která se umisťuje mezi řečenou membránu a řečené vakuum, a tato membrána může mít tloušťku, jejíž rozměr leží v podstatě v rozsahu od 200 Á do 5000Á, výhodněji v rozsahu od 500 A do 2000 A a nejvýhodněji v rozsahu od 500 A do 1500 A.

Je výhodné, že přepážka nebo membrána se umisťuje na otvor, který má průměr přibližně v rozsahu od 0,1 mm do 4 mm. Ve zvláště upřednostňovaném provedení je rozměr průměru přibližně 1 mm.

Přepážka nebo membrána výhodně umožňuje prostupnost energetických elektronů, jak se označují elektrony mající hodnoty energie, které překračují 2 ke V nebo 3 keV.

Podle jednoho provedení se přepážka povléká vrstvou materiálu, který má vysokou výtěžnost sekundárních elektronů a kterým je typicky fluorid lithný.

V jednom provedení se k řečenému předmětu přidružují molekuly pro zachycování radikálů.

V jednom provedení se předmět nebo vzorek umisťuje do blízkosti nebo do styku s řečenou přepážkou odolávající řečenému vakuu.

V souladu s třetím znakem přihlašovaného vynálezu je vyvinuta membrána, jejíž vystavená plocha s průměrem 1 mm odolává tlakovému gradientu jedné atmosféry a umožňuje prostupnost elektronů s velkou energií, a tato membrána je použitelná při sestavování komory, která umožňuje prohlížení vlhkých vzorků pod prohlížecím elektronovým paprskem při celkově lepším rozlišení, než je 100 nm.

V souladu se čtvrtým znakem přihlašovaného vynálezu je vyvinut způsob prohlížení vlhkých předmětů při rozháení v řádu nanometrů, kdy tento způsob zahrnuje kroky izolování vlhkého předmětu v vzorkové komoře na základě oddělení řečené vzorkové komory od vakuové komory s použitím přepážky, vyvíjení elektronového paprsku dopadajícího na řečený vzorek zřečené vakuové komory skrze řečenou přepážku a prohlížení přinejmenším jednoho z druhotných a odražených elektronů, které vystupují z řečené komory.

-6• 0 000

0 000 0 0

I 0· 1

0* ♦·

Jc výhodné, že přepážka obsahuje membránu, která se voh tak, aby vydržela tlak přibližné jedné atmosféry a aby umožňovala prostupnost elektronů majících hodnotu energie překračující přibližně 2 keV.

Je výhodné, když vlhkým předmětem je farmaceutická látka a když vlhký předmět obsahuje Živou buňku, s níž je farmaceutická látka ve vzájemné interakci

V řečené komoře je vytvořen přívodní otvor pro přívod tekutiny a farmaceutická látka se v průběhu zkoumání dynamicky obměňuje přes přívodní otvor s ohledem na jedno z hledisek, k nimž patří koncentrace a typ farmaceutické látky.

Přehled obrázků na výkrese

Pro účely lepšího pochopení přihlašovaného vynálezu a předvedení toho, jak je tento vynález prakticky proveditelný, bude nyní následovat podrobný popis, který je vypracován s odkazem na připojená vyobrazeni, na nichž:

Obr. 1 je zobecněné schéma znázorňující podélně orientovaný, příčný řez vzorkové oblasti skenovacfho elektronového mikroskopu podle dosavadního stavu techniky.

Obr. 2 je zobecněné schéma znázorňující podélně orientovaný, příčný řez skenovadho elektronového mikroskopu, do něhož je včleněna komora sestavená podle jednoho provedení přihlašovaného vynálezu.

Obr. 3 je zobecněné schéma příčného řezu komory sestavené podle jednoho provedení přihlašovaného vynálezu.

Obr. 4 je zobecněné schéma příčného řezu komory, která je sestavena podle dalšího provedení přihlašovaného vynálezu a která je zabudována ve světíovodu.

Obr. 5 je elektronový nrikrofotografický snímek, který byl pořízen s použitím provedení znázorněného na obr. 3.

Obr. 6 je schéma sestavené vzorkové komory pro fluorescenci.

Obr. 7 A až 7E jsou schémata součástí komory, jež jsou na obr. 6 označeny jako A - E.

Obr. 8 je schéma mikroskopového fázového adaptéru pro použití s komorou.

Obr. 9 je schéma alternativního provedení pro luminiscenci.

Obr. 10 předvádí snímky ustálených vlhkých buněk pod přepážkovou membránou.

♦ · a a aa· · · ·

-7• · φ·*· Β · · t a··· a aa aa a· ··

Obr. 11 předvádí snímky Živých, neoznačených, přilnavých buněk pod membránou. Obr. 12 předvádí snímek neporušených, neoznačených CHO buněk pod membránou. Obr. 13 předvádí snímek živých, nepřflnavých buněk pod membránou.

Obr. 14 předvádí katodoluminiscenční snímky ustálených NIH3T3 buněk.

Obr. 15 předvádí snímek neporušených NIH3T3 buněk

Příklady] ií vynálezu

Přihlašovaný vynález poskytuje nový technický postup ve skenovací elektronové mikroskopii, který K přizpůsoben pro zkoumání vlhkých vzorků. Vlhké prostředí se vytváří v malé komoře, která je obklopena membránou, jež je natolik tenká, aby umožňovala prostup elektronů a jejich interakci se zkoumaným vzorkem.

Nyní jsme podrobně vyzkoumali jak technický postup, tak i mechanismus tvoření signálu při skenování obrazů vzorků ve akenovacím elektronovém mikroskopu skrze membránu. Dále jsme objevili mechanické a prostorové nastavení a vlastnosti, které se od membrány, jako hlavního znaku tohoto způsobu, vyžadují.

Popisujeme jednoduchá měření, která potvrzují vlastnosti membrány a poskytují vodítko pro výběr materiálu a tloušťky. Dále popisujeme možnosti tohoto technického popisu při skenování obrazů řady rozdílných vzorků. Vyhodnocujeme dosažitelný kontrast a rozlišení, jakož i proud, který je potřebný k dosahování těchto hodnot Předvádíme, že je možné prohlížet částečky žlata ve vodě s rozlišením v řádu 10 nm, zatímco méně kontrastní materiály mohou poskytovat podstatně nižší rozlišení v řádu 100 nm. Tento nový technický postup se může přizpůsobovat celé řadě praktických využití v různých oblastech, jako jsou výzkumy materiálů nebo biologie buněk.

Přihlašovaný vynález je založen na oddělení vzorku v tekutině od vakua pomocí včleněné přepažující membrány. Nedávné výsledky vývoje technologie polymerů umožňují výrobu tenkých membrán, které umožňují praktickou prostupnost energetických elektronů a při tom jsou natolik pevné, aby vydržely atmosférické tlaky na jedné straně a velký podtlak na druhé straně. Zobrazovaný objem se nachází v těsné blízkosti membrány, a to typicky několik μη& v tekutině. Toto je ideální pro zkoumání předmětů, které jsou na membráně nebo se nacházejí v blízkosti membrány jako přilnavé biologické buňky. Vynalezené technické postupy

-8• ··· • · * ·· ·· • · · * ·· ·« se také mohou snadno přizpůsobovat všem existujícím skenovacím elektronovým mikroskopům a umožňují měření pří pokojové teplotě a atmosférickém tlaku.

A. PŘÍPRAVA EXPERIMENTU. Během výzkumu jsme úspěšně použiti zařízení a způsoby podle přihlašovaného vynálezu v kombinaci jak s přístrojem „JEOP 6400 SEM“, tak i přístrojem „Phffips ESEM“ ve vysokém vakuovém módu, avšak zařízení, která v této patentové specifikaci popisujeme, se mohou používat s každým skenovacím elektronovým mikroekopem „SEM“. Konkrétní, v současnosti upřednostňovaná provedení přihlašovaného vynálezu budou podrobně popsána v dalším textu v návaznosti na připojená vyobrazení a obrázky.

Vzorek se udržuje uvnitř komory tak, že je uspořádán podle řádků standardní vložky pro upevnění vzorku skenovacího elektronového mikroskopu „SEM“. Hlavní důraz se klade na utěsnění vzorku proti účinkům rozdílu vnějšího tlaku a toto se provádí s použitím typizované řady o-kroužků. Vzhledem k tomu, že vzorek s membránou se obvykle uzavírá přímo na místě, je nutné upozornit na to, že uzavírání vzorku představuje nebezpečí pro membránu, neboť snaha o stlačování tekutiny uvnitř komory by způsobila závažné deformování. Aby se takovému nebezpečí předešlo, zůstává ve stonku vzorkové vložky otevřen malý, uvolňovací kanálek, který slouží pro vyrovnávání vnitřního tlaku, což se projevuje nepatrným uvolněním tekutiny. Průchod tohoto kanálku se následně utěsňuje s použitím dalšího o-kroužku, který se šroubuje přímo na místě.

Membrána musí mít několik důležitých vlastností. Za prvé je potřebné, aby umožňovala maximálně dosažitelnou míru prostupností elektronů. Toto je podmíněno nízkým průměrným atomovým číslem (nízké Z) a malou měrnou hmotností. Z toho vyplývá skutečnost, že nejpřijatelnější volbou jsou polymerní filmy.

Rovněž je potřebné, aby membrána vykazovala dobré mechanické Mastností. I přes skutečnost udržování co možná nejmenší tloušťky kvůli minimalizování rozptylu elektronů před dosažením zóny zájmu, musí membrána odolávat rozdílu tlaku jedné atmosféry v rozsahu tak velké plochy, která se vyžaduje pro prohlížení. Musí být také natolik pružná, aby umožňovala přiměřený rozsah manipulace při přípravě vzorku, což vylučuje používání uhlíkových filmů, které jsou velmi křehké. Pórovitost materiálů, z mchž je vytvořen držák vzorků, a vnitřek vzorku se musí omezit tak, jak je to jen možné, aby se zajistilo správné utěsnění komory.

Elektrická vodivost membrány by ideálně měla mít takovou hodnotu, která by znemožňovala hromadění elektrického náboje na vnějším povrchu membrány, což by mohlo

-9*« »· • · · «« ♦· niáit dopadající elektronový paprsek a rozmazávat obraz. V praxi napařujeme na vnější stranu membrány tenký uhlíkový film, čímž se znemožňuje výskyt jevu hromadění náboje.

Konečně lze uvést, že důležitým faktorem může být afinita membrány ve vztahu k prohlíženému předmětu. V případě elektronových nrikroekopů je typické, že elektrony procházejí z hodní oblasti směrem dolů, takže předměty, které bychom rádi pozorovali, se nacházejí pod membránou. Ve vyvinutém způsobu se nejlepší výsledky dosahují tehdy, když se prohlížené předměty nacházejí v těsné blízkosti membrány, a vůbec nejlepší je situace, v níž prohlížené objekty na membráně ulpívají.

Pro účely zhotovování membrány byly testovány různé materiály a všechny testované materiály byty připravovány na bázi uhlíkových sloučenin. Byty testovány materiály „Formvar“ a „Butvar“, které se vprostupové elektronové mikroskopii obvykle používají při vytváření nosných filmů („Davidson a Colquhoun, J, Elec. Tech. 2, 35, 1985“; Jlandky a CHsen, Ultranricroscopy, 4, 479, 1979“] a dále byl testován materiál polyinrid. Z uvedených materiálů, které byty podrobeny testu, splňoval všechny mechanické a těsnicí požadavky jen poslední. V jednom provedení, jež je v současnosti upřednostňováno, používáme potyimidové membrány s tloušťkou 1450Á, které jsou k dostání od firmy J^doxtex, Inc.^u. Potyimidové membrány nevykazují žádnou měřitelnou pórovitoet vůči vodě: vzorky se umisťují do vakuového prostředí přibližně 10'⁷ barů po dobu několika hodin před vložením do skcnovacího elektronového mikroskopu „SEM“, aniž by došlo k detekovatelné ztrátě. Pak mohou odolávat silám vyvíjeným účinkem atmosférického tlaku, který působí na okénko s plochou přibližně 1 mm². Aby se minimalizoval účinek působení těchto sil na membránu a s tím související nebezpečí prasknutí, tato plocha povrchu okénka se obvykle zmenšuje pomocí niklové mřížky, která se používá v prostupové elektronové mikroskopii a která se připojuje k vnější straně membrány (používá se mřížka, jejíž oko má rozměr v rozsahu od 125 pm do 330 μιη. Z hlediska elektrické vodivosti postačuje nanesení vrstvičky uhlíku s tloušťkou 50 Á na vnější stranu membrány. Existuje-H takový požadavek, pak se vlastnosti afinity dosahují na základě uprav vnitřního povrchu.

B. MECHANISMUS VYTVÁŘENÍ KONTRASTU. K tvoření signálu na detektoru přispívají dva rozdílné činitele. Prvním činitelem je zdroj rovnoměrného šumu, zatímco druhý činitel zahrnuje signál:

1. Jakmile paprsek zasáhne membránu, pak tato membrána sama o sobě produkuje odražené elektrony (zkratka „BSE“ podle anglického výrazu „backscattered clectrons“) a

-10• · φ · · · «·· ··« · φφ φ· «φ ·· druhotné elektrony (zkratka „SE“ podle anglického výrazu „secondary dectrons“). Pouze druhotné elektrony, které ee tvoří v prvních několika nanometrech (střední volná cesta druhotných elektronů), mohou z membrány uniknout (Gokfatein a spoí, „Scarming Electron Microecopy and X-Ray Mtcroanalysis, pp. 113, Plenům Press, New York, London, 1992“]. Jejích střední volná cesta je přibližné 1 nm ve vodičích (tenká uhlíková vrstva) a až do 10 nm v izolátorech (jako jsou pdyimid a tekutina za ním). Druhotné elektrony se vytvářejí jak v membráně, tak i uhlíkovém povlakovém pokrytí.

Proto na základě uplatnění membrány získáváme první příspěvek k signálu, který obsahuje jak odražené elektrony „BSE“, tak i druhotné elektrony „SE“. Tento příspěvek je stejnorodý, protože jak složení, tak i tloušťka membrán, které používáme, je všude stejná.

V následujícím bude symbol „m“ (v případě membrány) označovat tento příspěvek.

2. Část elektronů z paprsku, které se neodrážejí při prostupu membránou, dopadají na vzorek. Opět se vytvářejí druhotné elektrony a odražené elektrony.

Druhotné elektrony „SE“, které se takto vytvářejí, nemají žádnou možnost uniknout, protože by byly zachyceny buď membránou (izolátorem) nebo tenkou uhlíkovým povlakovým pokrytím (vodičem). Na rozdfl od toho odražené elektrony JBSE“, které se vytvářejí na vzorku, mají možnost odcházet zpět skrze membránu. Vzhledem k tomu, že mohou prostupovat skrze membránu, mohou generovat druhotné elektrony, které, vytvářejí-K se v určité vzdáleností od povrchu, jenž je pod jejich střední volnou cestou, mohou umírat do detektoru.

Takto na základě jevů odrážení v zóně zájmu získáváme druhý signál, který se dostává jak do detektorů druhotných elektronů „SE“, tak i do detektoru odražených elektronů „BSE“.

V následujícím bude symbol „s“ (v případě vzorku) označovat tento příspěvek

Druhý příspěvek „s“je nepochybně příspěvkem, na který se soustřeďuje hlavní pozornost. Tento příspěvek „e“je nositelem informace, o kterou usilujeme, zatímco první příspěvek X se vztahuje pouze k membráně. Kontrast mezi dvěma sousedními body bude pozorovatelný tehdy, jestliže rozdíl signálu vzorku mezi těmito body bude větší než kolísání membránového signálu.

Naše schopnost vytvářet obraz je tudíž určována na základě možnosti získávání poměru silnějšího signálu vůči slabšímu Šumu. Toto je dále určováno na základě rozdílu koeficientů odrážení těch materiálů, které jsou obsaženy ve vzorku („materiálový kontrast“), což také závisí na membráně.

• ·

444« * ·

-11Jflon-K dány dva rozdílné materiály, jejichž koeficieaty odrážení jsou známy, a jsou-li známé vlastnosti membrány, pak lze určit podmínky, které je potřebné splnit v zájmu vytvoření obrazu.

Celkové shromážděný signál „S“ se skládá jak z druhotných elektronů, tak i odražených elektronů:

S ~ β^η + εα$ (vzorec 1) η a 6 představují podle příslušnosti poměry proudů odražených elektronů „BSE“ a druhotných elektronů „SE“ vůči proudu paprsku. Koeficient ε přestavuje shromažďovací účinnost obou druhů elektronů, které se detekují.

Vlastní koeficient odrážení η se určuje ze dvou příspěvků, a to odražených elektronů „BSE“ ze vnitřku membrány (m) a odražených elektronů „BSE“ zvnitřku vzorku (s), takže pdatí η = η m+ η s.

Podobně koeficient odrazu druhotných elektronů „SE“, který se označuje symbolem δ má dva příspěvky, takže δ = δ m + ηβ Am.

Rozdíl je vtom, že, zatímco 6m představuje druhotné elektrony, které se generují při vstupu elektronů paprsku do membrány, Am představuje druhotné elektrony, jež se generují v membráně z elektronů na jejich cestě ven po příslušném odrazovém jevu uvnitř vzorku.

Takto koeficient odrážení ηβ násobí Am, protože proud elektronů energetického paprsku, který se vrací zpět skrze membránu, se ze stejné hodnoty snižuje o ηβ.

Vezměte v úvahu, že jak 5m, tak i Am vyjadřují vyzařování druhotných elektronů z blízkostí povrchu membrány. V případě 8m tvoří vysokoenergetické elektrony, jež generují druhotné elektrony, hlavní část elektronů vstupujícího paprsku s malým přispěním elektronů, které se odrážejí uvnitř membrány. V případě Am platí, že elektrony, které generují druhotné elektrony, se podrobují odrazovému jevu uvnitř vzorku. Z tohoto důvodu může Am zahrnovat zpomalovací materiálovou závislost V závislosti na materiálu, jenž se nachází pod membránou, mohou být energetická spektra odražených materiálů „BSE“ v této oblasti odlišná a rozdílné energie odražených elektronů „BSE“ mohou generovat rozdílná vyzařování druhotných elektronů „SE“.

Povšimněte si, že definice odrážení a druhotných koeficientů, které používáme my, a definice, jež se používají v odborné literatuře, se mírné odlišují. Druhotné koeficienty se

-12•··· i · 0 · 0 0 I 0 · 0 · · · 0 0* 00 0« 00 vymykají v případě jedním směrem nekonečného média a jsou charakteristické z hlediska materiálů (zlato, uhlík, nylon apod.). V léto patentové specifikaci řečené koeficienty vyznačují vyzařování náboje v případě membrány s konkrétní tloušťkou s jejím uhlíkovým pobytím. Nevyznačují vyzařování náboje jedním směrem nekonečného vzorku z polyamidového materiálu. Koeficienty vzorků stejným způsobem vyznačují signál pocházející z materiálu uvmtř vzorku, který je však pokryt membránou. Jeden z našich cílů v následující části bude vysvětlení vztahu experimentálně naměřených koeficientů β klasickými, teoretickými koeficienty, které vyznačují vlastní materiály (například vodu, zlato atd.).

Dovolte nám posoudit dva sousední body, které poskytují Mgnály S_A a S_B. Materiálový kontrast mezi námi se definuje jako:

Cab = (S_A- Sb)ZSa (vzorec 2) (v úvahu se bere předpoklad, že S_A > Sb).

Existují dva základní způsoby modifikování signálu „S^u. Prvním způsobem je násobení tohoto signálu danou konstantou (zesílení). Druhý způsob je založen na přidávání kladné nebo záporné konstanty k rignáhi (to je takzvaná „úroveň černé“). Přispění membrány k signálu je všude stejné. Definování její tloušťky a jejího složení je dobře propracováno. Proto platí, že kvůli membráně se mezi body „A“ a J3“ neobjevuje žádný kompoziční kontrast ani topografický kontrast

Příspěvek „m“ je tudíž konstanta, které se může odstranit na základě přiměřené volby úrovně černé. Vezměte v úvahu, že šum v řádu pn, kde n je počet elektronů odražených od membrány, může rušit měření, avšak my tuto skutečnost na okamžik ignorujeme opěrným snížením dané hodnoty. Takto se na základě této volby kontrast mezi body „A“ a „B“ značně zjednodušuje:

Cab = (ηδ_Α - ηδβ)/ nS_A (vzorec 3)

Materiálový kontrast se vztahuje pouze k rozdílu v počtu odrazových jevů, k nimž dochází v materiálech, které se nacházejí pod membránou v bodech „A“ a J9“.

V souvislosti β opětnou zmínkou o příspěvku „m“ lze uvést, že tento příspěvek „m“ generuje Šum, který může úplně zničit obraz tehdy, když je v řádu amplitudy signálu, jenž se generuje na základě jevů ve vzorku. Z tohoto důvodu jsme museli zkoumat vlastnosti membrány a určovat tu část signálu, která se vztahuje pouze k membráně a byla potlačována ve vyjádření kontrastu (vzorec 3) s použitím přiměřené volby úrovně černé.

-13• tf·· • · ··«· ··«· ···» · ·· ·· «· «·

C. PRŮCHOD ELEKTRONŮ SKRZE MEMBRÁNU. V této fázi výzkumu jsme prováděli experimentální určování přispívání membrány k vytváření signálu. Toto jsme dělali v pojmech odražených elektronů „BSE“ a druhotných elektronu „SE“ vyzařovaných z povrchu membrány jako funkce energie. Způsob, který jsme uplatňovali, spočívá v měření celkového proudu prostupqjícího vzorkem v rozdílných situacích, po čemž následuje odečítání s výsledným Tiskáním ztrát „BSE“ a „SE“. Měříme proud bez jakýchkoli překážek, aby bylo možné odhadovat plný proud, který skenovací elektronový mikroskop „SEM“ vyvflí na vzorek a poté měříme účinek membrány na tento proud. Nakonec měříme proud, který prochází skrze membránu do daného materiálu, v našem případě do data a vody.

Pro tento účel jsme použili čtyři rozdílné vzorky a sestavu, která umožňovala součásné vsunování rozdílných vzorků do vnitřku mikroskopu (ze čtyř vzorků, které jsme mČh, se mohly tři vsouvat společně, takže jsme opakovali pokus s překrývajícími se trojicemi při existenci stejných podmínek). V případě rozdílů hodnot energie se paprsek postupně přemisťoval na každý vzorek a prováděla se měření proudu mezí nulovým elektrickým potenciálem a vzorkem.

Vzorkem jedna“ je jen Faradayova nádoba (GoWstein a spoL, Skenovací elektronová núkroekopie a mikroanalýza rentgenových paprsků, od strany 65, Plenům Press, New York, Londýn, 1992), která se požívá pří měření proudu papreku na základě shromažďování veškerého náboje paprsku (zanedbatelné množství náboje může unikat dozadu). Tato nádoba se zhotovuje z uhlíkového substrátu, aby se mohla připojit k nulovému elektrickému potenciálu, a na svém vrchu má dutinu (s průměrem 2 mm a hloubkou 3 mm), kterou zakrývá niklová destička mající uprostřed otvor 10_m. Paprsek vstupuje skrze otvor a dopadá na dno dutiny v uhlíkové nádobě, takže celý paprsek a prakticky všechny odražené elektrony se zachycují.

Vzorek „dva“ má stejnou konstruktů a jediný rozdíl je vtom, že otvor je pokryt membránou. Pro tato měření používáme název L—

Vzorek „tři“ je vzorkem z čistého ziata, které je připojeno k nulovému elektrickému potenciálu, a tento vzorek je rovněž pokryt membránou. Zlato se nejdříve taví, v důsledku čehož se jeho povrch vyhlazuje natolik, aby se vytvářely velké oblasti, na nichž se dosahuje „přímý“ styk s membránou. Konečně vzorkem „čtyři“ je naše experimentální komora, která obsahuje vodu a je utěsněna s použitím membrány. Vzorky „tři“ a „čtyři“ definují dvě hodnoty PrO InutoUl + ίαΜ»

-14» ♦ ···« · • t v » · · « ♦ ·· ·· ·· ·*

RozdO proudů naměřených na vzorku Jedna“ a vzorku „dva“ (porovnávacím vzorkem je vzorek Jedna“) dává procentuální vyjádření elektronů, které se vyzařují v důsledku interakce s membránou. Takto se měří příspěvky sekundárních a odrážecích koeficientů membrány:

[OptptfA - LmbMm) / IptpMk] ~ Ππι+δβ ·

Rozdíl proudu paprsku (vzorek Jedna“) od prowffl měřených na vzorcích „tři“ a „čtyři“ dává procentuální vyjádření elektronů, které se vyzařují ze vzorků, jež se dostávají ven. Mezi ně patří takové elektrony, které vzájemně spotuúčmkují jak s membránou, tak i a materiálem (příslušně jak s vodou, tak i se datem):

[OfMfXMk - Tmwtrt·+Ml«tt) ! ^Npmfc] ~ (Πιβ+^ι) + úsO + ΛΟ

Dolní index se vztahuje k materiálu, v našem případě to je zlato nebo voda.

V případě hodnot energie, které jsou nižší než 5 keV, lze pozoroval, že křivky data a vody překrývají křivku membrány. To znamená, že paprsek není natolik energeticky silný, aby jednak dospěl ke vzorku a jednak poslal odražené elektrony „BSE“ zpět do detektoru.

V případě hodnot energie, které jsou vyšší než 5 keV, se tři křivky odlišují v jejích strmosti. Rostoucí část detekovaného signálu je ovlivněna interakcí s posuzovaným materiálem. Se zvyšováním energie se tento rozdíl zvětšuje: materiálová složka signálu re stává dominujícím činitelem.

V případě vodního vzorku a energie odrážených elektronů lOkeV přispívá interakce mezi paprskem a membránou padesáti procenty k vyzařování náboje. Při 15 keV jejich příspěvek klesá na 35 %.

V případě zlata, jež má vyšší atomové číslo, je takový poměr výrazně nižší. Při 10 keV jsou pouze 4 % vyzařovaného náboje přispívající vlastností membrány. Při 15 keV klesá příspěvek membrány na 2 %.

V této fázi můžeme odečítat membránovou složku a celkového vyzařování elektronů a tím získáme příspěvek materiálu pro vytváření signálu. Toto zahrnuje pouze takové elektrony, které re odrážejí na základě jejich interakce s daným materiálem.

Při nízkých energiích re projevuje to, že elektrony paprsku nedosáhnou ke vzorkům a křivky by měly vykazovat nulové hodnoty. Pii vehm vysoké energii by křivky měly následovat chování odrážecích koeficientů materiálů, protože membrána re stává prakticky průhledná. Toto ve skutečnosti pozorujeme na dvou křivkách. Strmost klesání vodní křivky následuje

-15• · ·*· · ·· ·« ·« teoretické chování odrážecího koeficientu tak, jak to lze vypočítat β použitím derivace podle Hungera a Kuchlera („Phys. Status. SoBdi A 56, K45, 1979**; viz také „Goldstem v citované práci, strana 95). Také narůstající strmost křivky data přímo následuje vývoj odrážecího koeficientu ve vztahu k hodnotám energie (tak, jak to lze odvodit z téhož výrazu).

Na základě porovnávání tčehto křivek s odrážecím koeficientem příslušných materiálů (s jejich přiměřenou závisloetí na energii) dostaneme křivky, z nichž lze vyvodit, že zůstává pouze malá míra materiálové závislosti.

Výsledky týkající se vody ukazují, že odrážecí koeficient je o přibližně 25 % nižší než teoretická křivka, kterou předpovídají vědd Hunger a Kuchler. Nejsme si jisti, v čem je původ tohoto rozdílu, avšak s ohledem na skutečnost úplného uzavření našeho vzorku s přqmštěitim minimální možností znečištění jsme přesvědčeni, že naše experimentálně určená hodnota je z kvantitativního hlediska nqčistíím výsledkem, který je v současnosti k dispozici.

Ačkoli jsme neprováděli přímá měření, vlastnosti materiálů pod membránou ovBvůují energetická spektra odražených elektronů „BSE“, která se vyzařují. Energie jsou v rozsahu od 0 do Eo, kde Eo je energie odražených elektronů. Lehký materiál (například uhlík) má takové rozložení, které má přibližnou střední hodnotu Eo/2 a je souměrné [Bishop v dokumentech projednávaných na 4. mezinárodní konferenci na téma „X-Ray Optics and Mkroanalysb“ a vydaných nakladatelstvím „Hermann“ (Paříž, 1996); viz také Goldstem v citované práci, strana 100]. Těžký materiál (například zlato) má takové rozložení odražených elektronů „BSE“, které je silně nesouměmé a má vrchol, jenž se blíží Eo. Tento rozdfl vyvolává dva jevy. První souvisí s tím, že poměr odražených elektronů „BSE“, které jsou schopny projít zpět membránou, vůči celkovému počtu vyprodukovaných „BSE“ je vyšší v případě těžkých materiálů než v případě lehkých materiálů. Membrána skutečně účinkuje tak, že vyděluje odtažené elektrony s malou energií jako filtr a tím uměle vylepšuje kontrast mezi lehkými a těžkými prvky. Druhý spočívá v tom, že rozdíl energetických spekter odražených elektronů „BSE“ může také ovlivňovat Am vyzařovaných druhotných elektronů „SE“, protože odražené elektrony „BSE“ budou na své cestě zpět s větší pravděpodobností generovat druhotné elektrony „SE“.

V případě dalších materiálů, jejichž atomové číslo se nachází v množině atomových čísel mezi vodou a zlatém, budou příslušné křivky ležet mezi oběma popsanými extrémy. Naše výsledky, které jsme do této fáze získali, shrnujeme následovně:

-16• 0 000 • 0 • 000 0 • · · « 0 0 · 0 »0 0» 0· 00

a) V případě energií, které jsou nižší než 4 kcV až 5 keV, nemůže být detekován žádný signál. Tato prahová hodnoto se může snížit na základě použití tenčích membrán.

b) Středová oblast energií je zajímavá z několika důvodů. Prvním důvodem je to, že filtrační účinek membrány na odražené elektrony „BSE“ s malou energií zvýrazňuje kontrast meá těžkými a lehkými materiály. Druhý důvod spočívá v tom, že vyzařování druhotných elektronů „SE“ je v tomto režimu důležité a existuje možnost snadného zobrazování s použitím detektoru druhotných elektronů »SE“. Vrchol na křivce zlato dosahuje vyšší hodnoty než 1, což potvrzuje silné vyzařování druhotných elektronů „SE“.

c) V případě vdmi vysokých energií se náboje přibližují k teoreticky předpokládaným koeficientům odražených elektronů „BSE“. Důvod spočívá v tom, že při vyšších energiích elektronů (jak elektronů v paprsku, tok i odražených elektronů) existuje vyšší pravděpodobnost prostupnosti odtažených elektronů „BSE“ skrze membránu, zatímco pravděpodobnost vytváření druhotných elektronů na jejich cestě zpět je nižší. Vyzařování druhotných elektronů, které se vztahuje k Am se snižuje, a proto při experimentálním pozorování se snadněji zobrazuje přes detektor odražených elektronů „BSE“.

Filtrační účinek membrány na odražené elektrony „BSE“ se stává zanedbatelným při vysokých energiích. Ve vyjádření kontrastu (vzorec 3) se odrážecí koeficienty mohou nahrazovat odrážecími koeficienty materiálů, které přicházejí v úvahu (voda, zlato, uhUk atd.). Energie, při níž se dosahuje vyrovnaná úroveň, se rovná mmimálttí energii, nad níž začínají přibližné hodnoty platit. V případě zde popisovaného příkladu membrány se toto hodnoto pohybuje kolem 15 keV.

D. ODVOZOVÁNÍ MINIMÁLNÍHO PRŮNIKOVÉHO PROUDU PRO POZOROVÁNÍ KONTRASTU DANÉHO MATERIÁLU. Jakmile existuje malý rozdíl ve složení (rozdíl ve středních atomových číslech) mezi dvěma body, pak je teoreticky možné tento rozdíl pozorovat Otázkou je, kolík elektronů musí dopadnout na tyto body, aby se toto pozorování uskutečnilo.

Takové odvozování je užitečné z několika důvodů. Za prvé lze uvést zvolený proud ovlivňuje rozlišení: velký proud způsobuje méně přesné zaměřování. Toto se stává větším problémem tehdy, když je elektronovým zdrojem mikroskopu tungstenové vlákno, které je méně citlivé pro vyzařovací pole mikroekopu. Za druhé, zdroj elektronů může produkovat pouze omezený počet nábojů a zatřetí, velké dávky záření mohou poškodit vzorek.

• * ··· • 9

-179 · ···· · • »·» « ·· · ·· ·· *« ··

Všeobecnč se zabýváme vzorky, které obsahují kapahny jako emulze, biologické vzorky, polymerní roztoky atd., jež ve většině případů dokazují, ie se jedná o vzorky s nízkým kontrastem.

Do jisté míry hhovoiným, avšak užitečným kritériem postačující viditelnosti je „červené kritérium“ (Goldstein v citované práci, od strany 215). Toto konstatuje, ie v zájmu pozorování rozdílu mezi dvěma body „A“ a musí být rozdíl amplitudy signálu mezí těmito body větší než pětinásobek úrovně šumu:

(S_a-Sb)>5N

Na základě měření počtu elektronů, které vstupují do detektoru při různých pozorováních, když je paprsek v bodě „A“, dostáváme rozložení, jehož standardní odchylka je dána jako ~ η ^>A a přepočítává se na střední hodnotu _ a Takto je signál úměrný η a šum je úměrný η Vztah signálu vůči šumu je S/N ~ η ^1/2 a minimální úroveň pozorovatelného kontrastu materiálu je C^, = 5/η ^w.

Na základě toho střední hodnota počtu elektronů, které se musí shromažďovat v zájmu pozorování kontrastu „C“ specifického materiálu, je obecně dána jako η> (5/C)². Odpovídající proud (v detektoru) je I» > (q/tXS/Cj¹, kde „q“ je elektronový náboj a „t“ je časový úsek, v jehož průběhu paprsek dopadá na každý bod. Údaj „t“ se může také vyjádřit jako t = T/np, kde „T“ je čas skenovací čas a „tip“ je počet pixdů na rámeček. Měřením k vpřkoampérech a „T“ v sekundách zjistíme, že proud, který se vyžaduje pro získání kontrastu „C“ daného materiálu v detektoru, je:

Ia > 4/T C² (vzorec 4).

Konečně proud I» agnátu a proud t paprsku jsou ve vztahu Is = η s (sbs + Velmi účinným detektorem druhotných elektronů „SE“ je Everiuat-Thomley detektor, který vykatuje velmi dobré odmítání odtažených elektronů „BSE“ (Goldstein v citované práci). Detektor odražených elektronů „BSE“ neshromažďuje druhotné elektrony „SE“ a vzhledem k tomu, že má obvykle malou signaturu, má pouze střední sběrnou účinnost Experimentální cestou jsme sjistíli, že při energiích kolem 10 keV se obrazy jak odtažených elektronů „BSE“, tak i druhotných elektronů „SE“ objevují se stejným kontrastem, zatímco při vyšších eneigiích je „BSE mód“ lepší. Vezmeme-h v úvahu rozramý odhad sběrné účinnosti 25 X pak dospějeme

-18• ··· • · · * 4 4 4 4

44 « ·4 ktomu, že proud paprsku, který je potřebný pro dskání kontrastu „C“ je [19] (také v Goldstemovi od strany 217):

Ib > lé/ηβ TC¹ (pA) (vzorec 5).

Pfí vyšších energiích se kontrast „C“ jednoduše vztahuje na základě vzorce 3 k odrážecím koeficientům materiálů pod membránou. Tabulka I poskytuje výsledky výpočtů minmiálnfho proudu, který je potřebný pro prohlížení biologických vzorků jako jsou buňky, emulze vody s dějem a částečky data ve vodé.

Téměř 99 % hmotnosti biologických vzorků, jako jsou buňky, tvoří čtyři prvky, a to C, Η, Ν i O. Buňka obsahuje 70 % vody a 29 % organických sloučenin. Přibližně 50 % atomů v těchto sloučeninách jsou atomy vodíku, 24 % atomy uhlíku, 24 % atomy kyslíku a 1 % atomy dudku [20], Na základě stanovení těchto údajů má typická organická molekula střední hodnotu atomového Čísla 6,72, Střední hodnota atomového čísla vody je 7,72 a v případě živé buňky je 7,07. Výpočet odpovídajícího odrážecího koeficient při 20keV dává 0,075 pro vodu a 0,073 pro buňku. Z toho vyplývá, že buňka, kterou obklopuje vodné médium, vykazuje mzký kontrast C = 2,5 % a navíc platí, Že odrážecí koeficienty jsou nízké. Výpočty ukazují, že pro typické skenování po dobu 100 sekund se vyžadpje mmiaiábrf proud v řácfaa nanoampérů.

materiál	Z	η	kontrast vůči vodě	I(pA)
voda	7,22	0,075	—	—
buňky	7,07	0,073	0,27	2900
olej		0,055	0,267	30
zlato	79	0,78	0,90	0,25

TABULKA L Vyhodnocování minimálního proudu, který je potřebný pro prohlížení rozdílných vzorků obsahujících vodu. se vypočítává podle vzorce 5. Hodnoty η se vypořftávají z výrazu Hungera a Kuchlera při energii E = 20 keV s použitím středních hodnot atomových čísel „Z“, které jsou v tabulce uvedena. Skenovad čas T = 100 s umožňuje pečlivé, typicky pomalé skenování.

-19* ·« v « · I ·· »*

Emulze vodý s olejem jsou snáze pozorovatelné a vykáži# desetkrát vyšší kontrast: C 26,7 %. V tomto případě kfesí minimální proud na několik desetin přkoampérfi. V případě částeček zlata ve vodě je kontrast velmi vysoký (C = 90 %). Zobrazování vyžaduje pouze zlomek pikoampéra (Tabulka I).

Biologický vzorek, jako je buňka, vyžaduje při zobrazování vyšší proud působící θ' v rozumném integračním čase. Laborant může výhodně používat označování pomocí těžkých označovacích prvků, jako jsou Částečky kotoidnfho zlata, pro dekorování buňky. Emulze vody s olejem se může prohlížet přímo při existenci standardních podmínek proudu a integračního času.

Při nízkých energiích (10 keV a nižších) začíná být vtiv membrány důležitým faktorem. V důsledku toho vzorky s nižším kontrastem vyžadují při zobrazování stále více proudu.

E. VYHODNOCOVÁNÍ ROZLIŠOVACÍ SCHOPNOSTI POSTUPU. Tak, jak je tomu při každém měření s použitím skmovadho elektronového mikroskopu, se otázka rozlišení gednodušuje na existenci odrážených atomů, které mají velký obsah elektronů. V podmínkách nepřítomnosti prudce odrážených atomů bude paprsek zasahovat daleko do vzorku s následným rozšiřováním a ztrácením rozlišování, přičemž ktomu dochází před tím, než paprsek podstupuje takovou míra interakcí, aby se mohl vrátit V materiálu s velkou hustotou elektronů utazí paprsek pouze malou vzdálenost před vrácením nebo vstřebáním, takže rozptytovací objem je malý a rozlišení vysoké.

Pro znázornění účinku membrány na rozlišení potřebujeme vyhodnotit vytvořený objem účinného sonáto, který charakterizuje průměr d^(Gldstein vc své práci, od tínaný 162):

<U = (d¹»+ d\+4^I bsb)^w (vzorec 6), kde dfi označuje průměr paniku, který vstupuje do membrány. Jakmile paprsek prostoiqtf membránou, dochází k určité míře odrážení, které je obzvláště důležité při malé energii a má tendenci stát se zanedbatelným při velké energii. Symbol 4, představuje rozšířeni paprsku, k němuž dochází v důsledku interakce s membránou - paprsek s nulovou počáteční šířkou 4b vystupuje z membrány a má průměr d„.

Vzdálenost dese je střední hodnotou objemu, který elektrony ve vzorku pokrývají před tím než se vracejí jako odražené elektrony „BSE“. Symbol dsas lze nalézt v odborné literatuře (Goktetein ve své práci, od strany 105) a tento symbol se vztahuje k rozsahu, který je v odborných kruzích znám jako Kanaya-Okayama („KO“) rozsah. Přehodnocení stupnice » »04 • *

-20• · «««· 4 • 0 4 · 0· 4

00 00 00 všech charakteristických délek podle JCO“ rozsahu odstraňuje vdkou část závislosti na materiálu a ponechává pouze malou závislost na atomovém čísle „Z“. V přfpadč vzorku zlata má 90 % odražených etektnmů „BSE“ původ v objemu průměru = 0,3 R*o- V případě uhlíku dává tento vztah dm = Ο,όκο.

Rozsah „KO“ poskytuje typickou vehkost objemu interakce elektronů uvnitř materiálu. Je ekvivalentní k poloměru kruhu, který se vystfeďuje na povrchu bodu dopadu paprsku, jehož obvod zahrnuje vymezující balíček interakčního objemu:

Rxo = 0:0276(A/Z)Z°⁴¹ Ee¹**⁷ / p (vzorec 7).

R<o se uvádí v jednotkách v pm, energie dopadajícího paprsku v ke V, „A“ je atomová hmotnost v G/rnol, p je měrná hmotnost v g/cm³ a „Z“ je atomové čisto.

Vypočítávání teoretického rozhžení v obecném případě tří rozdílných vrstev (uhlíkový materiál membrány) není triviální. Avšak ve dvou vymezujících případech materiálů svebni malým atomovým číslem a veto» vdkým atomovým číslem je takový odhad možný.

A. Rozlišení vzorků s malým kontrastem při nhdcé úrovni energie.

Lehlý materiál, jako je voda, okj nebo materiál, z něhož se zhotovuje membrána, mají blízká atomová Čísla, takže odhadované hodnoty takového materiálu se mohou jednoduše považovat za stejné. Na základě toho jo jednoduchý odhad rozlišení následující:

dur=(dře + (^bsb) ^w (vzorec 8\ kde dua se vypočítává jako střední hodnota lehkého materiálu. Tento výpočet má smysl tehdy, když d^ je větší než tloušťka membrány.

Průměr paprsku dg závisí na zdroji elektronů, který se v mikroskopu používá. Zdroj vyzařovacího pole produkuje paprsek, který má v nejlepších podmínkách (slabý proud, velká energie) vehkost 1 nm, zatímco v nejsložitějších podmínkách je velikost paprsku 10 nm. V případě mikroskopu s tungstenovým vláknem se může průměr paprsku pohybovat v rosahu od 10 nm do 100 nm.

Na základě toho jsou rozlišení, která se získávají v případě lehkých vzorků, v řádu 200 nm. Při 10 keV, slabém proudu a při použili zdroje vyzařovacího prde dává odhad dur- 170 nm, přičemž při 20 keV se zvyšuje na d< = 500 nm.

Experimentálními cestami jsme zjistili, že je obtížné získat lepší rozlišení než tloušťku membrány. Pokud se sníží energie, pak se rozhšettí zlepšuje, neboť skenovaný objem vzorku se zmenšuje. Avšak v praxi platí, že při poklesu energie se kontrast snižuje v důsledku této změny.

-21* 9 • · «···«··< · • β · · · · ···· « ·* ·· «· *·

Od vzorku κ odráží méně elektronů a poměr signálu vzorku k signálu membrány ee snižuje. Proto se reálné vymezení rozlišení dosahuje na základě minimálního kontrastu, který se může detekovat Pokud se podaří zmenšit tloušťku membrány, pak se bude úroveň minimální energie pro zobrazování snižoval a rozlišení se výrazně zlepší.

Tento odhad rozhšenf naznačuje, proč náš postup v této fázi příliš nezlepšuje optickou rmkroskopti pří prohlížení lehkých vzorků, jako je emulze okje ve vodě. Toto se může vylepšovat na záldadč takových technických postupů, jako je uplatňování tenčích membrán. Situace se však úplně mění tehdy, když se hledají Částečky zlata ve vodě nebo obecněji při pozorování malých předmětů z těžkého materiálu, jež jsou ponořeny v lehkém materiálu.

B. Rozlišení vzorků s velkým kontrastem při vysoké úrovni energie.

Případ částeček zlata ve vodě je vehni zajímavý. Rozlišení získané experimentálně pří vysoké úrovni energie je v rozsahu několika desítek nanometrů. Čím je energie větší, tím se dosahují lepší výsledky rozhšenf. Tělíska se skutečným průměrem 40 nm vypadají při 30 keV, jako by měly prihněr SO nm, což přesahuje řád vehčmy , která je menší než objem interakce odražených elektronů „BSE“ (dáno hodnotou dssa)· Toto dokazuje, že rozlišení se nevztahuje na rozsah interakce. V tomto případě rozlišení souvisí s průměrem paprsku při dosahování hloubky částeček.

Při vysokých úrovních energie se může paprsek rozptylovat ve vodě, jestliže v ní není žádné tělísko, na něž by tento paprsek mohl dopadnout a objem, který odražené elektrony J3SE“ vzorkují, je hluboký a široký (od jednoho do několika mikronů). Signál, že se generují odražené elektrony JBSE“, je výsledkem jejich mtegrování nad vehni velkým objemem a z tohoto důvodu se příliš nemění v době, kdy se paprsek skenuje. Navíc při velkém zvětšení, kdy je velikost vlastního obrazu v řádu velikosti objemu vzorkovaného s použitím odražených elektronů „BSE“, je tento hluboký signál „BSE“ konstantou, jež se může odstraňovat na základě příslušné volby úrovně černé. Na drahé straně platí, že tehdy, když elektronový paprsek prochází tělískem z těžkého materiálu, může se značná část paprsku zachytit a okamžitě se vyzařuje daleko více odražených elektronů „BSE“ (vysoký odrážecí koeficient). Takto dosažené rozlišení závisí na prostorovém rozšiřování elektronového paprsku ve hloubce tělíska.

Tělísko, které je umístěno bezprostředně pod membránou, se zobrazuje s nejlepíím rozlišením. Čím se částečka nachází hlouběji ve vzorku, tím je úroveň rozlišení, při němž se taková částečka může zobrazit, nižší.

• · ·99 • · ♦ * · · · «··« ·* ·· ·· 4«

-22Rozšiřování paprsku je problém, který se dobře přizpůsobuje na řešení simulací podle způsobu „modelování Monte Carlo“ Používáme kód, který vynalezl D. C. Joy [Modelováni Monte Carlo pro elektronovou mikroskopii a mftroanatyzu (Oxford University Press, New York, Londýn, 1995)] a umožňuje provádění příslušných výpočtů. Jako vstupní hodnoty pro simulace se používá stochtametrický vzorec potyimidu C^OjHioN* střední hodnota atomového čísla 6:4 a střední hodnota atomové hmotnosti 9,8 g/moL Měrná hmotnost materiálu vykazuje hodnotu 1,4 g/cm³.

Při 20 keV se mez rozlišení odhaduje na 60 nm pod membránou. Při 30 keV je výpočet průměru papnku 35 nm, což je hodnota, která je srovnatelná s rozlišením, jež se dosahuje experimentální cestou tehdy, když jsou tělíska ve styku s membránou.

Výpočty ukazují, že při používání membrány, která je dvakrát tenčí, je při vysokých úrovních energii možné zobrazování s rozlišením lOnm.

V případě tělísek, která se nacházejí hlouběji uvnitř vzorku se musí vzít v úvahu to, že k rozšiřování paprsku dochází kvůli mezivntvě vody. Přibližné určení rozlišení je dáno vztahem dtf- ((fuň + <£-—»-*- + · dmte který se odvozuje ze simulací Monte Carlo.

S použitím membrány a při 30 keV se mohou částečky data, které se nacházejí 100 nm pod membránou, zobrazovat s rozlišením 45 nm. Tělísko, které je 200 nm hluboko, se může při stejné úrovni energie zobrazovat s rozttšením 80 nm.

F. HLOUBKA SKENOVÁNÍ VZORKU. Pro úplnost je třeba uvést, že existuje zájem na vyhodnocováni toho, jak hluboko lze detekovat těžké tělísko uvnitř vzorku.

V souvislosti s lehkým materiálem lze uvést, že téměř 50 % uniklých odražených elektronů „BSE“ dosahuje takovou hloubku, která se rovná 0,2 Rxo, před tím, než se vracení k povrchu (jak cituje Gddstem ve své práci, strana 105). Číselný koeficient 0,2 se vztahuje k uhlíku, avšak měl by bát velmi podobný v pří pádě vody a materiálu membrány, protože tento koeficient se vyv(jí vdmi pomalu s domovým číslem.

Za předpokladu stanovení naší hodnoty hloubky skenování vzorku, je při 6 keV tato hloubka vzorku přibližně 150 mn. Tato hodnota je srovnatelná s našimi zjištěními, na jejichž základě bylo zobrazování stěží možné pod uvedenou úrovní energie a s použitím naší membrány s tloušťkou 145 nm.

Ve vodě je hloubka skenovaní vzorku přibližně 0,4pm při 10 keV, 1,2 pm při 20 keV a 3, pm při 10 keV, což je maximální energie, která je dosažitelná na mnoha skenovadch

-234« 44 «

44 « · 44 dddnmových nrikroekopech. Tyto hodnoty poskytují odhad rozsahu hloubek, v nichž se mohou částečky zlata detekovat ve vodě.

G. ODHAD TLAKU UVNITŘ. KOMORY. Následující text se zaměřuje na jednoduchý výpočet daku uvnitř vodní komory. Tento výpočet se hlavně vztahuje na nastavení parametrů komory, která se podle předpokladu phu vodou a navíc obsahuje jen vehm malé množství vzduchu (řekněme malých bubínek).

Za účelem zjednodušení výpočtu následujících předpokladů se posuzuje následuj:

1. Začínáme s uzavřenou komorou, která je naplněna hlavně vodou při atmosférickém tlaku. Uvnitř se vyskytuje malé množství vzduchu V, (měřeného v atmosférickém tlaku), jehož objem je malý ve srovnání s roztaženým objemem V po umístění komory do vakua.

2. Membrána se modeluje jako píst, který udržuje pražma s pružící konstantou Je“. Toto modelování je pravděpodobně odpovídající, protože bere v úvahu pouze lineární vztah mezí sílou působící na membránu a rozsah přemisťování JC* membrány. Tato konstanta se snadno odhaduje experimentální cestou. Povrchová plocha membrány (pístu) se označuje symbolem „S“.

3. Vychází se z předpokladu, že voda je nestlačitelná. Po umístění komory do vakua se piet pohybuje do té doby než se dosáhne rovnovážný stav. Roztažený objem V, se určuje na základě podmínek rovnovážného stavu a obsahuje vzduch a vodní pára. Tlak vodní páry Ph2o se určuje pouze na základě teploty a závisí na objemu (víz literatura: Termální fyzika od Kitdeyho). Jak vzduch, tak i vodní pára se považují za ideální plyny.

Počet molekul vodní páry je dán vztahem:

PhxM (1) Nh2O ⁼ --RT kde „T“ je teplota.

Celkový tlak v komoře po umístění do vakua je:

N_MRT Μ, + NhxJRT P^Va (2) P_u =-= -, kde N_a =-je počet molekul vzduchu.

V_t V, RT

V (1) a (2) požíváme předpoklad „1“, že V_e> V,.

-24♦ · ·· ·« ·♦

DalŠí rovnice pro výpočet flaku je dána podmínkami rovnovážného stavu:

(3) P„5 = tór g použitím V, = XS dostaneme rovnici pro objem V_t:

(4) V_t =k

Vložením (4) do (1) a (2) lze po určité manipulaci dostat vzorec pro Plot, který závisí na výchozích parametrech:

(5) Ptat² =- + PjacPtat

Č

Tato rovnice se může transformovat na (pomocí dělení posledním výrazem):

P« P^V_a (6) -=/+ Ph2O Pfí2O K, nebo na

Ptat Ph2O Va

Rovnice (7) je použitelná pro odhad P_M. První výraz vpravo je přibližně 0,025. Jestliže poměr druhého výrazu je daleko menši než tato hodnota, pak se mohou vzduchově bublinky ignorovat a tlakem, který se projevuje v komoře, je flak vodní páry. Pokud je větší, pak tento poměr dává zlomek celkového flaku z atmosférického flaku. Vezměte v úvahu, Že tato rovníce byla odvozena s podmínkou, že V_e > V,. Jestliže V. > V„ potom flak zůstává v Nízkosti atmosférického flaku a flak vodní páry je bezvýznamný.

Ponte výhodných provedení. Nyní bude proveden odkaz na obr. 1, na němž je vidět zevšeobecněné schéma, které z podélného pohledu znázorňuje příčný řez oblasti vzorku skenovacího elektronového mikroskopu „SEM“ IQ pode dosavadního stavu techniky. Prvotní elektronový paprsek 12 prochází po vakuově dráze a dopadá na vzorek 14. Po zasažení vzorku 14 se vytváří proud odražených elektronů !£, které dopadají na detektor 1£ odražených * 4

-2544·· 4 efektronů. K odraženým elektronům lze dodat, že vzorek vyzařuje druhotné elektrony 2Q, jež akcelerují k detektoru 22 druhotných elektronů.

Střední volná dráha elektronu při průchodu atmosférou je velmi krátká a tudíž celá dráha elektronu od zářiče přes vzorek do detektoru se nachází ve vakuu, takže zkoumání vlhkých vzorků nebo živých procesů není z tohoto důvodu možné.

Nyní bude proveden odkaz na obr. 2, na němž je vyobrazeno zevšeobecněné schéma znázorňující podélně orientovaný, příčný řez akenovacího elektronového mikroskopu podle první význaěnoeti přihlašovaného vynálezu. Součástí, které jsou stejné jako součástí předvedené na obr. 1, mají tytéž odkazové značky a jepeh popis je již znovu neuvádí s výjimkou těch případů, kdy je to nezbytné pro pochopení stavby a účeftu vynalezeného provedení.

Z obr. 2 lze vypozorovat, že prvotní elektronový paprsek 12 prochází přes vakuovou komoru 20 směrem ke vzorku, který je umístěn v komoře 24. .Komora 24 je utěsněna, aby vm mohla existovat atmosféra, která vyhovuje pro udržování vlhké a živé tkáně a ve které se mdlou konat procesy příznačné pro živé organismy. Nejvýhodnějším prostředí bude obsahovat vodné médnun.

V zájmu utěsněného oddělení komory od vakuové komory se na otvor, který je vymezen s použitím kroužku 38, napíná přepážka 34, a to typicky membrána. Kroužek 28 je konstruován tak, aby okraje membrány 36 byly vzduchotěsné, což bude podrobněji vysvětleno v dalším textu v souvislosti s obr. 3. Vzorek 32 se výhodně umisťuje těsně k membráně 36, takže při dopadáni na vzorek nemusí elektronový paprsek procházet atmosférou v komoře. V upřednostňovaném provedení je vzorek 22 ve skutečném fyzickém styku s membránou a v případě živé tkáně může na membráně růst nebo se k ním může připojit s použitím známých způsobů, jež budou také zmíněny v dalším textu v souvislosti s popisem konkrétních příkladů.

Je výhodné, že komora 24 obsahuje uvolňovací vývod 40, který bude podrobněji popsán v dalším textu v souvisloeti s obr. 3. Dále obsahuje přívod 41 a vývod 42 pro měnění chemického prostředí vzorku, který je určen pro zkoumání. Tento znak je obzvláště využitelný při zkoumání účinků léčiv, protože je možné sledovat dynamickou reakci buňky při změně koncentrace daného léku.

Membránou 2é může být fólie nebo film a taková membrána by měla mít schopnost vydržet tlakové gradienty do jedné atmosféry, přičemž současně by měla být prostupná z hlediska vlastností elektronového paprsku. V jednom příkladu provedení se požívá vrstva ·

-26 444 4

4« 44 polyimidu mající celkově tloušťku 1500 A, aby mohla vydržet tlakový gradtont a umožňovat prostup elektronových paprsků majících energie v oblasti 3 ke V a vyšší. Tenčí membrány jsou prostupné do 2 keV. Obecněji lze uvést, že tloušťka může ležet v rozsahu od 200 A do 5000 A v zájmu odolnosti proti účinků datového gradientu a současně v zájmu vykazování schopnosti propouštět elektrony při energňch papnku, které jsou k dispozici. K upřednostňovaným matoiálům patří pofyňnid mající například molekulový vzorec CuHnHO, pdyannd, pdyamidťmúd, polyethylen, pdypymrf a další vodivé polymery, pariodium, kdodium, oxid křemičitý, oxid křemíku, uhMk a komerčně dostupné materiály prodávané pod příslušnými obchodními známkami, jako je Kapton™, FonnVar™, Vinylec™, Piolofonn™ a ButVar ™. Membrána, která se zhotovuje pofyimidu, který byl zmiňován v předcházejícím textu, umožňuje průchod prvotního papnku a výsledné vytváření odražených elektronů 1£.

Druhotné elektrony „SE“ mají celkově nižší úrovně energie než zpětně odražené elektrony a za normálních okolností by měly tendenci ke vstřebávání ve vodě. Proto se druhotné elektrony „SE“, jež se vyzařují ze vzorku, normálně nedetekují. V upřednostňovaném provedení se však signál „SE“ zesiluje na základě povlečení membrány jednou nebo více než jednou vrstvou 37 z takového materiálu, který vykazuje vysoký výtěžek druhotných elektronů. K typickým materiálům tohoto druhu patří fluorid hthný.

Bude oceněno, Že druhotné elektrony „SE“ se detekují pomocí detektoru 22 a tudíž slouží k posilování celkového signálu.

V upřednostňovaném provedení je vystavená plocha membrány 3é ^ω otvoru v rozsahu od přibližně 1 mm do 3 mm. Membrány je typicky podepřena mřížkou, přičemž každý otvor mřížky má maximální průměr přibhžně 0,1 mm. Mřížka porihije schopnost membrány vydržet Hákový gradient. Mřížka je schematicky předvedena na obr. 3.

Membrána výhodně umožňuje udržování normálních atmosférických podmínek uvnitř komor 34 a tím umožňuje zkoumání celé škály vzorků, které obsahují živé buňky, organely nebo jejich části, a proteiny. Dále umožňuje zkoumání povrchových činidel, koloidů, alejových složek, emulzí a polymeraích nebo mtcdárních roztoků. Ve farmaceutickém průmyslu se může vynalezená komora používat například při testování dynamických Mastností léků, k nimž patří otékání, rozpouštění a rozklad, jakož i celtová odolnost buněk vůči některým lékům. V textilním průmyslu se tato komora může používat pro zkoumání zMhčování a vysoušení vlny, bavlny a syntetických vláken. K dalším oblastem, v nich je tento vynález využitelný, patří

-27« ··· 4 zpracovád ropy, výroba potravin, geologie, mikroelektronika, povlékád papírů a nauka o materiálech.

Samotná komora 24 se může podle potřeby plnit plynem nebo kapalinou a vzorky se mohou pozorovat na molekulové úrovni na základě rozlišovací schopnosti elektronového paprsku v řádu nanometrů. Úbytek rozhled vlivem membrány je zanedMtdoý, protože tato membrána způsobuje jen větou malé množství rozptytovadch jevů. Ptoí-h se komora plynem, pak lze komoru vybavit zařízením pro uvolňování tlaku, které výhodně obsahuje pružinu 42 a přídavnou membránu 44 a které chrání membránu 26 před protržením.

Komora 24 podle popisovaných provedení přihlašovaného vynálezu se může včleňovat do standardních skenovacfch elektronových mikroskopů „SEM“ tak, jak to bude vysvětleno s ohledán na obr. 3. Komora 24 X kompatibilní se standardními držáky vzorků nebo s upevňovači vzorků. Konstrukce držáku vzorků se přizpůsobuje rozměrům standardních, komerčně dostupných držáků vzorků, takže se může snadno zabudovávat do vzorkové komory, což je kryt mikroskopu pro umístěd držáku vzorků.

Ačkoli v předcházejícím textu byla komora popsána Jako uzavřený prostor pro udržování atmosférického flaku, toto není nutné u všech vzotků a v některých případech postačují nižší flaky, letmé snižují flakový gradient na celé ploše membrány 2ftPotíž, která souvisí s používáním elektronového paprsku při prohlížení živé buňky nebo procesů v živých organismech, je vtom, že elektronový paprsek sám o sobě vzorek poškozuje. Jako příklad lze uvést to, že špičková hodnota, při níž dochází k poškození DNA, se projevuje při 4 keV. Poíyimidová membrána s parametry 3 keV a 1300 A je bezpečnou volbou pod úrovní takové špičkové hodnoty.

Úroveň, při dž dochází k poškozed vzorku, se může dále optimalizovat nalezením takové úrovně energie, která bude minimalizovat poškození danďio vzorku.

Nyní bude proveden odkaz na obr. 3, který předvádí gednodušené, mírně zvětšené schéma dalšího provedení komory, jež je nakreslena na obr. 2. Vyobrazení na obr. 3 je však podrobnější. Komora 50, která má výhodně veKkost, jež odpovídá rozměrům konvenčního držáku vzorků, obsahuje sestavu 51 pro držení vzorku. Tato sestava 51 pro držení vzorku má tělesovou součást 52, která obklopuje oblast 54 pro umístění vzorku mající otevřený povrch 55. V příkladu nakresleném na obr. 3 má tělesová součást 52 podobu upevňovače vzorků, který se používá ve standardním skenovacím elektronovém mikroskopu „SEM“. Oblast pro umístění

-28φφ ·· φ φφ ·· ·· ·· vzorku je obklopena membránou 56 takového typu, letmý byl popsán v předcházejícím textu a který je tvarové přizpůsoben pro přilehnutí na vystavené straně oblasti 54 pro umístění vzorku. Nad membránou se nachází mřížka, která je od membrány oddělena vymezovad rozpěrkou 57. Uzavírací součást 58 spolupracuje i tělesovou součástí 52 takovým způsobem, že svírá membránu 56 kolem je^ch okrajů. Uzavírací součást se připevňuje k řečenému tělesu pomocí závitových šroubů 62, které se umisťují do odpovídajících otvorů v obklopujících součástech 58, přičemž na tyto otvory navazují díry 6Q s odpovídacím závitem vytvořené v tělesové soočásti 52. V zájmu vytvoření hermetického utěsnění oblasti 54 pro umístění vzorku se do tělesové součásti 52 vkládá těsnicí O-kroužek 66, který utěsňuje obvod oblasti 54 pro umístění vzorku.

Je vidět, že vzorek 64 se nachází v těsné blízkosti membrány 56· Měl by být výhodně ve styku s membránou nebo by se měl nacházet ve vzdálenosti několika nanometrů od řečené membrány, aby elektronový paprsek nemusel procházet významným úsekem v podmínkách atmosféry.

Plwádf-K se utěsňování oblasti pro umístění vzorku utahováním Šroubů 62. pak se může projevová nárůst tlaku v této oblasti pro umístění vzorku. Aby nadbytečná kapalina mohla unikat, existuje v komoře sestava 6S pro uvolňování tlaku. Tato sestava 6§ má dřík ZQ, který obklopuje kanálek 22· Kanálek 72 propojuje oblast 54 pro umístění vzorku s dalším otvorem 74 na vzdáleném konci dříku 70. Dřík 70 je Iduzně zapuštěn v kluzné, váleěkovité, uzavírací součásti 76. která má hontí část 77, a tato horní část 77 spolupracuje s dolní částí 22 tak, aby se řečená hontí část 77 tlačila směrem dovnitř na druhý těsnicí O-kroužek 7§. Uzavírací součást 76 se výhodně používá pro utěsňování otvoru 24 pouze po předchozím vlastní oblasti pro utěsnění vzorku, což umožňuje vytvoření cesty pro odvedení nadbytečné tekutiny ze sestavy 51 pro udržování vzorku.

Vodicí drážky 73 umožňují zasunování komory do držáku vzorku (není předveden).

Nyní následuje odkaz na obr. 4, který předvádí provedení komory, jež se podobá komoře na obr. 2 a 3, avšak nyní je toto provedení upraveno pro další zkoumání vzorků s použitím optických prostředků. Na obr. 4 je vidět, že komora 80 se zhotovuje jako část světíovodu 82. Membrána 84. kterou udržuje uzavírací součást, způsoben utěsnění odděluje komoru $Q od vakua. Reflexní povlak 90 výhodně pokrývá jeden konec světíovodu 82, přičemž druhý konec vede ve směru šipky 22 k fotonásobiči (není předveden). Vzorek 24 se označuje

-29Mt*

I · · I ** «· s použitím dektrohiminiecenčního (fluorescenčního) značkovače, která se budí účinkem elektronového paprsku. Světlo se odráží ve směru šipky aby se zesilovalo účinkem fotonásobiče (není předveden). Proto je možné detekovat jednotlivé fotony a uplatnění prostředků optického detekování umožňuje, aby skenovací elektronový mikroskop „SEM“ detekoval rozlišení v rozsahu nanostupnice.

Nyní bude pozornost zaměřena na obr. 5, na němž je vidět elektronový nrikrosnfmck předvádějící zkoumání vfokdw vzorku s použitím provedení, jež je ukázáno na obr. 3. Vzorkem je tatáž emulze oleje ve vodě, který byla použita v přcdcháze^chn pokusu, v jehož průběhu byi demonstrován kontrast environmentálního skenovadho elektronového mikroekopu „ESEM“, jenž popisuje Mathews („Postupy ve Fyzikálním Institutu, EMAG99, strana 95, Sheffield, 1999) a jehož popis je zde zahrnut ve formě odkazu. Elektronový nrikrosnímek byl pořízen s použitím skenovadho elektronového mikroekopu „JEOL 8400 SEM“ majícím nízkou rozlišovací schopnost a na tomto nrikrosnímku je vidět značeni stupnice. Rozlišení, které se dosahuje s použitím membrány podle přihlašovaného vynálezu je prakticky stejné jako rozlišení dosažené s použitím konvenčního způsobu práce se skenovacím elektronovým mikroskopem „SEM“ bez membrány. Dosahuje se dobrá kvalita kontrastu a celkové výsledky vyhovují požadavkům na zkoumání vlhkých vzorků.

V kontextu tohoto popěni je třeba vzít v úvahu to, že různé znaky tohoto vynálezu, které jsou z důvodu srozumitelnosti popisovány v návaznosti na jednotlivá provedení, mohou být vrámci jednoho provedení uplatněny v kombinaci. Naopak různé znaky tohoto vynálezu, které jsou z důvodu hutnosti popisovány v kontextu jediného provedení, se mohou uplatňovat samostatně nebo v některé dílčí kombinaci, která vyhovuje danému technickému záměru.

Podrobný popis výhodných způsobu podle přihlašovaného vynálezu.

V ideálních podmínkách by technologie zobrazování vlhkých vzorků, knimž bez jakéhokoli výhradního omezení patří živé, neznehybněné buňky, měla přinášet následující schopnosti:

1. Zobrazovací Mastnosti:

Rozlišení přinejmenším 100 nm, výhodně pak v rozsahu od 1 do 20 nanometrů;

Vysoké hodnoty poměru signálu vůči Šumu a signálu vůči pozadí.

2. Fyziologické prostředí buňky:

Schopnost pracovat ve vlhkém prostředí vlhkých, neznehyhněných buněk;

-30• · · · ·«·· ·· ·♦ ·· ··

Mmánální poškozování v důsledku radiace (minimální rušení při zobrazování, minimální účinek na hodnosta výsledků s přihlédnutím na biologické aspekty)

3. Výkonnost:

Minimálnf počet kroků při přípravě vzorku;

Strategie automatizace.

Minimální počet kroků při přípravě vzorku. Klasické postupy práce se skenovadm elektronovým mikroskopem vyžadují povlékání vzorku, aby se znemožnilo jeho nabQení. V případě tohoto vynálezu platí, že vodný elektrolytický roztok (médium), který obklopuje buňky, poskytuje dostatečnou ochranu před nabíjením. Proto příprava vzoiku nevyžatfcge povlékání a umožňuje práci se živými buňkami Skutečnost, že příprava vzorku nevyžaduje upevňování, odvodňování nebo povlékání výrazně zkracuje a zjednodušuje postupy přípravy vzoiku ve srovnání s přípravou práce s konvenčním skenovadm elektronovým mikroskopem „SEM“ a významně vylepíige kvalitu výsledků. Zde je uveden příklad postupu přípravy jako výhradně neomezující příklad. Tento příklad je použitelný pro označování mimobuněčných součástí buněk, jako je mknobuněčná část membránových proteinů. K dalším označovacím postupům patří označování vmtrobuněčnýdi součástí buněk, které bude popsáno v dalším textu v části popisu příkladů. Označování buněk se provádí s použitím všeobecně známých postupů imunooznačování.

Strategie automatizace. Přihlašovaný vynález také řeší otázku nízké výkonnosti laboratorních skenovadch elektronových mStroskopů „SEM“. V případě hidogických vzorků uplatňuje automatizaci těchto mikroekopu, která byla vyvinuta pro průmysl polovodičů při zkoumání čipových plátků. Myšlenka využívání automatizace skenovadch elektronových mikroskopů, které byly vyvinuty pro zkoumání čipových plátků, také v oblasti biologie je obsáhle vysvětlena v souběžně vyřizované přihlášce PCT nazvané „Způsob identifikace a kvantifikace biologických molekul a zařízení pro provádění tohoto způsobu“ (číslo jednací PCT/IL01/00764). V tomto případě jsou vzorky v suchém stavu, což umožňuje přímé použití skenovadho elektronového mikroskopu pro zkoumání čipových plátků (zkratka „WISEM“ podle anglického výrazu „Wafer žnspection Scanntng Electron Microscope“) nebo jiného mikroekopu podobícího se mikroskopu „WISEM“). Tato myšlenky by se nemohla uplatnit v případě biologických vzorků, které se nacházejí v jejich přhozeném, vodném prostředí, protože příprava takových vzorků, která musí odpovídat požadavkům vakua v konvenčním

elektronovém mikroekopu včetně „WISEM“, zahrnuje drastické a komptikované kroky, jež znemožňiQÍ automatizování. Přihlašovaný vynález umož&ge zobrazování vzorků ve vodném prostředí bez potřeby provádění těchto problematických kroků přípravy vzorku. Na základě toho existuje možnost využívání automatizace skenovadch elektronových mikroskopů, které byly vyvinuty v průmyslu polovodičů pro zkoumání čipavých plátků, také v oblasti biologie. Takové využívání značně sníží náklady na přístrojové vybavení, které se vyžaduje při uplatňování zmíněného způsobu.

Strategie automatizace je formulována v sadě návodů, které popisují postupy, jimiž se se obsluha mikroekopu řídí při automatizované zobrazování vzorků živých buněk s použitím „mokré technologie SEM“. V upřednostňovaném provedení přihlašovaného vynálezu bude automatizovaný postup zahrnovat práci s „buněčným čipem“ majícím velký počet oddělených komůrek, přičemž každá z těchto komůrek bude obsahovat vzorek připravený pro zobrazování 8 použitím „mokré technologie SEM“. Jednotlivá dílčí oddělení (oddělené komůrky) mají Mastní přepažujíd memhránu, na níž se pěstují vzorky buněk (které mohou být stejné nebo rozdflné).

Při provádění přípravy vzorků ac může používat standardní, automatické řízení hodnot tekutiny.

Po dokončení přípravy se „buněčný čip“ může vzít do automatizovaného optického zobrazovacího zařízení (nebo vjmém případě skenovadho elektronového míkroekopického přístroje s omezeným rozsahem zvětšení), které používá standardní optickou míkroekopii nebo zvláštní prostředky, jako jsou optická vlákna apod. včleněná do ekenovacího elektronového mikroskopu „SEM“. Toto skenovací zařízení hode pořizovat celkový obraz buněk v každé komůrce, jejich polohu a každou informaci, která se vztahuje k experimentu. Informace o buňkách, které budou získány v tomto postupu skenování budou detekovány automaticky s použitím specificky vyvinutých algoritmů.

Přepažující membrána se umisťuje na kovovou mřížku, aby se posflib její mechanická stálost Mřížka poskytuje spolehlivou, krajně stabilní strukturu pro souřadnice každého obrazu.

V případě provádční optického skenování mimo skenovad elektronový mikroskop „SEM“ se „buněčný čip“ přenáší do komory ekenovacího elektronového mikroekopu pro účely zobrazování. V zájmu vzájemného sladění souřadnicových systémů optického mikroskopu a skenovadho elektronového mikroekopu „SEM“ se budou používat vyrovnávací algoritmy.

-32 · 444 ♦ ·»* * • · · · 4 4 4 4 ·· 44 4· ·«

Ρο provedení vzájemného ibcUM obou souřadnicových systémů bude skenovad ctektronový mflcroekop „SEM“ zobrazovat specifické oblasti zájmu, které se automaticky vybírají v optickém skenovadm zařízení (nebo skenovadho elektronového mikroskopického přístroje s omezeným rozsahem zvětšení) K takovým oblastem z$mu může patřit zvláštní oblast, ve které se konq# důležité biologické činnosti buňky, nebo oblast vztahujíd se ke specifickému dflčímu místu v buňce či oblastí buňky, jež poskytuje statistický údaj o přítomnosti dalších oblasti v buňce. V každé lakové oblasti se mohou zobrazovat kotoidní zlato.

Takové oblasti z^jnm mají rozdílnou velikost, která vyžaduje rozdílnou úroveň zvětšení skenovadho elektronového mrkroekopu JSEM“. Vezměte v úvahu, že existuje pozorovatelný vztah mezi zorným potem a vetikoetí označení. Proto při rozdílných zorných polích bude vyžadována rozdílná vdflcoet označování. Konkrétně lze uvést, že v případe obrazu celku jedné buňky bude potřebné velké zorné pote. Takovým velkým zorným potem se rozumí malé zvětšení a schopnost prohlížení pouze velkých koloidů zlata (v závislosti na roztišovad schopnosti skenovadho přístroje). V alternativním případě se cdá řada obrazů s malým zorným polán, které byly pořízeny s využitím nízké úrovně zvětšení), může kombinovat tak, aby se vytvořil obraz cdé buňky s vysokou úrovní roztišmí.

Obrazy pořizované s použitím skenovadho elektronového mikroskopu „SEM“ se snínugí automaticky. V této fázi se provádí automatické nastavování polohy skenovadho elektronového mikroskopu „SEM“, automatické zaostřováni a astigmatické korekce, jakož i automatické nastavování jasu a kontrastu.

Obrazy pořizované a použitím skenovadho elektronového mikroskopu „SEM“ se mohou automaticky analyzovat s použitím algoritmů pro analyzování obrazů. K této analýze patří identifikace, výpočty a porovnávání polohy a vctikoeti pozorovaných koloidů zlata.

Při zobrazování s použitím skenovadho elektronového mikroskopu „SEM“ se mohou také měřit další signály. K těmto Mgnátóm patří signály z katoddumtnbcenčních značení (jejich přOdady budou uvedeny v dalším textu) nebo emise roenlgenového záření ze vzorku, které se mohou využívat při analytickém chemickém rozboru vzorků.

V době, kdy se provádí skenování jednoho „buněčného čipu“ s použitím skenovadho elektronového mikroskopu „SEM“, se druhý „buněčný čip“ může skenovat opticky.

Optické zobrazování s vysokou úrovní rozlišení prováděné a použitím skenovadho elektronového mikroskopu „SEM“. Včten zajímavou možností se jeví používání úzkého

-334··* 4 « · 4

44 efektronového paprsku při buzení embe svěda ve vzorku. Takové vyzařování švéda se nazývá katodofammiscence (zkratka „CL“ vytvořená podte arghck&o výrazu ^adtodchrmmeceece“) a v mřnuioeti bylo zkoumáno na odvodněných vzorcích (opětné posouzení provedl vědec Hough PVC, „Skenovací elektronová mikroskopie I, 257, 1977“). Toto bude umožňovat detekování vyzařovaná» světla s takovým rozčlením, které je daleko lepňí než předpokládá teoretické omezení vtnttroskopn švéda. Toto řešení kombinuje vysokou úroveň rozklad zobrazování s použitím skenovacího elektronového mikroskopu se známým fluorescenčním značením. Tato možnost je velmi výhodná při zobrazování vlhkých a živých vzorků ve skenovacfm elektronovém mderoskopu. V tomto zobrazovacím systému dochází k tornu, že elektronový paprsek produkuje vyzařování druhotných elektronů „SE“, které budí fluorescenční označovací molekuly, jež dále emitují viditelné švédo. Toto emitované švédo se následně sdružuje na sběrné dráze, která je oddělená od obvyklé elektronové detekce. Lze pozorovat, že buzení účinkem druhotných elektronů je ekvivalentní k širokopásmovému ultrafialovému záření (viz Hough PVC, „Skenovací dekfranová mikroskopie 1,257,1977“). Výhody tohoto způsobu jsou početné:

1. Kombinace fluorescenčního značení * značení zlatém má mnoho biologických výhod;

2. Dosažení obrazu s vysokou úrovní rozlišení označených molekul může poskytnout nové a důkžité biologické informace;

3. Snadno se dosahuje řízení jediné fotonové detekce, která zajistí obnovování přiměřené frakce vyzařovaných fotonů;

4. Získání kódovaných fluorescenčních proteinů DNA otevírá cestu k novým označovacím možnostem elektronové mikroskopie;

5. V tomto postupu se unikátní sondy, jako jsou kvantové body a fluorescenční kuličky, mohou používat jako označovací prostředky, které poskytují univerzálnost a výhody, jež nebývají dosažitelné s použitím jiných postupů.

Provedení fluorescenčního zařízení pro zkoumání za mokra, může být založeno na existujících fluorescenčních detektorech nebo může vycházet z vývoje nových geometrických soustav a konfigurací. Existujícími detektory jsou například takové detektory, které detekují švédo z horní poloviny roviny (nad vzorkem). V tomto zrcadlovém uspořádání se nad vzorkem umisťuje eliptické zrcadlo, v němž je vytvořen malý otvor umožňující průchod elektronového paprsku. Světlo se zachycuje v zrcadle a následně se směruje do okénka v mikroekopu, pod

-34Β · · 4 ·· *« • · t 9 «· ·· ιώηζ re nachází fotonový detektor. Taková sběrná sestava je komerčně dostupná například od filmy „Gatan“ (dříve „Oxford Instrumente“). V dalším textu budou podrobně popsány dva příklady sestavy pro zachycovátí světla na dotaí polovině roviny, na které re fotony zachycují pod vzorkem a směn$ re pomocí světtovodu do detektoru, jenž re nachází vně rmkroskopu.

Zařízení re zhotovuje následovně. Vzorkoví komora (vyrobená z nerozsvěcí oedi) re uzavírá na horní ěásti pomocí přepažnjící membrány a na dolní části s použitím malých čoček, takže membrána re nachází v ohniskové rovině čoček Na základě toho re světlo, které je vyzařováno v těsné btízkosti membrány a které je zachycováno v čočkách, při výstupu z čoček přeměňuje na kohmatovmé světlo. Vzorková komora re umisťuje do vnitřku takováto stupně, kde hranol mění směr švéda přfeházejfcfho z čoček o 90 stupňů (tzn. vodorovně).

Tento stupeň také obsahuje čočky, které re používají pro další zaostření švéda u vstupu optického vlákna. Optické vlákno vede od řečeného stupně k detektoru, který je umístěn uvnitř mikroskopu. Použitým detektorem je jednomodulový, fotonový, detekční systém. Výstupním signálem každého detekovaného fotonu je TIL signál (0 V až 5 V čtvercový signál).

Výstup z detektoru re přqxýtýe k počítačové kartě, která počítá množství přijatých TIL signálů (fotonů). Počítačová karta také přjjímá několik signálů z mikroskopu, a to počátek získávání obrazu, počátek nového rámečku, počátek nové linie. K tomu lze dodat, že na základě používání odpovídajícího software vyvinutého pro tento účel re obraz sestavuje v reálném čase ze shromážděných údajů.

Obr. 6 předvádí vzorkovou komoro s různými součástmi A až £> které jsou sestaveny fo jednoho celku. Podrobnosti jednotlivých součástí jsou předvedeny na obr. 7A až 7E.

Příprava nastavení pro fluorescenční experiment Obr. 7 (obr. 7A až obr. 7E) předvádí první provedení sestavy, která re používá pro účely fluorescenčního experimentu.

Součást Δ, které má na straně vytvořen otvor s průměrem několik milimetrů (není předveden) re pokládá na stůl tak, aby jeho horní strana ležda na desce stohi. Součást B re opatrně umísťuje do vnitřku součásti A a pozornost re věnuje tomu, aby osy otvorů v obou součástech A a B, do nichž re umisťují šrouby, na sebe navazovaly. Do součásti B « vkládají dva O-kroužky. Membrána re umisťuje na své místo. Membrána se připevňuje na plastovou podpěrnou podložku mající tloušťku 0,1 mm. Průměr plastové podpěrné podložky re volí podle obou průměrů použitých O-krooŽků. Otvor s průměrem 3 mm re předem zhotovuje uprostřed plastové podpěrné podložky, což je oblast, v níž membrána {dní funkci výplně průchozího

-35• · • « tf i tftf tf tf · • · · · ···· ·· ·· tftf ·· otvoro. Mřížka, která je určena pro použili v přestupové elektronové trnkroakopii „TEM“, se umisťuje na jedné straní (vnější straně) uprostřed membrány. Potě se vkládá součást £. Je důležité, aby vodorovný kanálek vyrovnaně navazoval na boční otvor v součásti Poté se zavádějí Šrouby 6. Membrána, součásti A, B a £ se pomocí šroubů přitafauýá k sobě. Nyní se vzorek připravuje pro naplnění vodou nebo jarým vodným médiem. Kapalné médium se nalévá do volného prostoru uprostřed součásti £ (jgfž vrch stále směřuj* k desce stolu). Tenký hrot (mající průměr 0,1 mm) se zavádí do strany součásti Δ a součásti £. Hrot se zavádí tak hluboko, až jeho vůdčí konec vstoupí do komory 8 vodou. Druhý konec hrotu zůstává venku. Poslední O-kroužek se vkládá na své místo v součásti C. (V této fázi O-kroužek nemůže úplně zaujmout své místo, neboť právě pod ním se nachází řečený hrot Toto je normální a Ayužhehié v dalším kroku). Součást D (obsahující ve své střední oblasti čočky pro kohmatovárú světla nejsou předvedeny) se vkládá do sestavy. Vnitřní strana čoček je mokrá v důsledku styku s médiem, které komoru vyplňuje. Nakonec se připojuje součást £. Při otáčení součásti E uvnitř sestány se část D (a čočkami) postupně přitlačuje k O*kroužkn (součásti C). Vzhledem k tomu, že O-kroužek noú kvůli hrotu úplně na svém místě, ještě neutěaňuje komoru od vnějšího prostředí. PR šroubování součásti £ se objem komory s kapalinou zmenšuje, přičemž nadbytečné médium může odtékat pod O-kroužkcm v blízkosti hrotu, Nějaké kapky obvykle vytékají z kanálku v součásti £. Po dosažení potřebného stlačení O-kroužku a správného umístění čoček se hrot pomalu vytahuje ven. V této fázi sestavování je O-kroužek v součásti B natolik volný, aby mdli zaujímat celý prostor. Tím se dostává do své přirozené polohy, v níž zajišťuje utěsnění komory. Takto se na tomto stupni nakonec dosahuje ůphič utěsnění komory. Celá sestava (součásti Δ až E) se pak obrátí do své normální polohy (vrchní stranou nahoru) a vloží se do příslušného stupně núkroekopu, jehož konstrukce je qrecaálně přizpůsobena pro tento účel

Obr. 8 předvádí stupeň mikroekopu, v němž se výše popsaná sestava může používat Vrchní dutina stupně 2 má podobu vyhloubení, do kterého se umisťuje vzorková komora. Pod tímto vyhloubením je hranol Tento hranol J se používá pro přesměrování světla ve směru otvoru. V tomto otvoru se nacházejí čočky (nejsou předvedeny), které zaostřují světlo u vstupu optického vlákna.

V zájmu dosažení lepší účinnosti zachycování švéda bylo seřízeno takové nastavení, které umožňuje vytvoření přímého spojení mezi biologickým vzorkem a svědovodem. Toto

-36ί · ·' • · · · · · · · ·* ·· *« ·· ahesmativní sestavení je předvedeno na obr. 9. Obsahuje vakuově utěsněnou komoru se světlem procházejícím od oblasti vzorku do jedbomodubvého, fotonov&o, detekčního systému, který byl popsán v předcházejícím textu. Na tomto vyobrazení je vidět, že kryt i je připojen k podpěře 2 a víko 3 se trouby 6, 7, pod nímž se nachází drtina 4 ve tvaru kotouče s membránou g, se dále připojuje ke světlovodu 5, který je utěsněn pomocí O-kroužků g.

Označovací postupy. Přihlašovaný vynález je použitelný pro zobrazování buněčných složek buď ve vnitrobuněčných nebo numobuněčných částech buňky.

V případě označování vnitrobuněčných částí buňky mohou přicházet v úvahu různé přístupy:

Jestiiže se mohou buňky používat po jejich znehybnění, pak známé metody zahrnují zproetupnění nebo extrakce membrány buňky.

Alternativním přístupem, který je použitelný v případě živých buněk, je zavádění značek prostřednictvím pinocytotické reakce. Pinocytotická reakce chrání Životaschopnost buňky tehdy, když se provádí vpftjatetaých podmínkách. Tato reakce umožňuje zavádění molekul (ve většině použhdných postupů, které jsou v této oblasti techniky známé, to jsou fluorescenční značky) nebo částečky velikosti nanostupnice (což je obzvláště využitelné v právě popisovaném způsobu použití). Některé výzkumy také ohlásily úspěch v zavádění mikrokuliček s velikostí mfloonové stupnice do vnitřku buněk.

Postupy zproetupnění a extrakce jsou použitobé pro znehybněné buňky. V závislosti na tom, zda vědec chce odejmout celou membránu či pouze vytvořit nějako póry, lze akceptovat několik postupů.

Extrakce a znehybnění znamená to, Že vnější membrána buňky se nejdříve zcela odstraňuje. Okamžitě poté se buňka znehybňuje. Tento druh postupu je dobrý pro zviditelnění struktur v cytoplazmě, jádro buňky nebo kostru buňky.

Extrakce a znehybnění znamená to, že buňky se nejdříve znehybňu^ a dále to, Že membrána buňky se upravuje tak, aby byla prostupná.

Pinocytotická reakce je použitelná v případě živých buněk. Odborník v této oblasti techniky může například použít činidlo, jako je komerčně dostupný přípravek „Influx“ („Molekulární sondy 1-14402“) pro zavádění částeček do vnitřku buněk. Postup zavádění přípravku Jhiflux“ do buněk je založen na osmotickém rozpouštění struktur prnocytotických váčků. Stručně lze uvést, že látky, které se mají zavádět do vnitřku buněk, se míchají ve velkých

-37φφφφ · φ φ φ φ φφ φφ koncentradch s hypertorackým médiem, na základě čehož se vytvářejí podmínky pro přenášení materiálu do buněk prostřednictvím pmocytotických váčků. Buňky se poté přemisťují do hypotonickd» média, výsledkem čehož je uvolňování zachyceného materiálu z pmodtotických váčků v buňkách a plnění cytosota řečenými mt™™

Po sepsání zprávy o provedení postupu mofcknlánfcb sond jsme zaváděft koloidní zlato v podobě částeček majících uetifcost stovek nanometrů, fluorescenční mflarAuhěky v rozsahu mfcrostupnice a kvantové tečky do vnitřku buněk. Před prohttženfm se buňky mohou znehybnit a množství zlato nebo stříbra se může zvýšit V průběhu použití tohoto způsobu určité procento buněk hyne. Ve většině pokusů nebylo ztraceno větší množství než 10 % až 20 % celkového počtu buněk.

Buněčný povrch Živé buňky se může označovat částečkami zlato, které jen velmi málo poškozují buňky. V případě zprávy, která byla vypracována pro použití v souvislosti s tímto vynálezem, se uplatňují straptavidin-biotinové označovací způsoby, jež jsou v dosavadním stavu v této oblasti techniky známé. Tyto způsoby jsou založeny na tom, že buňky se mkubují sbiotmem, který připojuje určité procento proteinů k povrchu buněk. Následně se buňky inkubují se streptavidinem, který se váže na částečky zlata, což umožňuje jejich připojení k biotinu. Dávkování biotinu pro účely inkubace se musí pečftvě seřizovat, protože přífiš mnoho biotinu na proteinu membrány by mohlo utlumit činnost buňky a způsobit její odumření. Existuje řada vědeckých studií, které dokazují, že biotin je využitelný pro účely označování buněk. Několik studií se zaměřilo na buňky červených krvinek (například Jlofinan - Fezer a spoL, Anály hematologie, 74, 231 - 238, 1997“; „Ault, KA a C. Knowles, Experimentální hematologie, 23, 996 - 1001, 1995“ a odkazy uvedené v těchto studiích). Biotin označuje mnoho buněk s malou nebo žádriou změnou jejich biologie a v případě potřeby umožňuje jak jepeh detekování, tak i jejich obnovování.

Mikrosloupcové mikroskopy. Pokračující vývoj, který zvýší výkonnost, je souběžné zkoumání s použitím mikroeloupcových mikroskopů. Mikroeloupcové mikroekopy jsou miniaturní skenovací mikroskopy, které byly vyvinuty na základě postupů integrování křemíku. S ohledem na jejich rozměry mohou mikroeloupcové mikroekopy pracovat souběžně ; což podstatně zkracuje čas skenováré a zmenšuje objemnost systémů skenovacích elektronových mikroskopů „SEM“. Další podrobnosti týkající se mikroeloupcových mikroskopů uvádí autoři Fcinemum a Crewe ve vědeckém pojednání ^flmatumí elektronová optika“, zveřejněném * v ·«* · · ·

-38* · · · · · ·«·· ···· 4 »« ·« ·Φ v periodiku „Advances in hnaging and Electron Physíce“, vydání 102, 187 (1998)“, jakož i patent USA číslo 5,122,663. Obsahy obou dokumentů jsou zde zahnuty ve formě odkazu. Myšlenka využívání nukroeloopcových núkroekopů na bází účinnosti elektronů v biologii je rozsáhle popsána v souběžně vyřizované přihlášce PCT s názvem „Způsob a kvantifikace biologických molekul a zařízení pro provádění tohoto způsobu“ (číslo jednací PCT/IL01/00764).

Následující přfldadý principů přihlašovaného vynálezu slouží výhradně pro ukázkové účely, a proto jsou vypracovány způsobem, který není pojímán jako výhradní omezení. PWY

Pěstování buněk na pěepažtflfcf membráně. V následujícím textu budou popsány příklady postupů pěstování buněk na membráně a tyto postupy jsou pojímány jako výhradně neomezující přikladly. Potyimidové přepažující membrány se nejdříve poM&ají fibronectinem (0,1 mg/ml) po dobu 15 minut Po opláchnutí ochranným bidogkkým roztokem a médiem pro uchovávání kultury se buňky nanášejí v koncentracích od 800 do 1500 buněk v 12 pm až 15 pm na komoru. Po 24 hodinách jsou buňky připraveny pro mampukwání/označování. Většina typů buněk se může pěstovat na Mastní přepažia^cí membráně bez pomoci přídavné matrice, jako je fibronectin, avšak za takových podmínek by se buňky pravděpodobněji oplachovaly v průběhu přídavných oplachovadch postupů. Takové postupy neovlivňují Životaschopnost buněk Přihlašovaný vynález je kompatibilní jak s přilnavými, tak i ncpřflnavými buňkami (jejichž příklady budou uvedeny v dalším textu). Pro účely zobrazování nepřilnavých buněk (například lymfocytů) se buňky nejdříve označují v suspenzi a následně mohou ulpívat po dobu 30 minut na přepažující membráně, která se předem upravuje 0,4 % roztokem poty-lysinu v průběhu časového úseku 1 až 3 hodin.

Minimalizování škody účinkem záření. V současností dokládáme příklad zobrazování dynamiky nerušených procesů pouze na krátkodobé stupnici (v sekundách). Jedním druhem poškození účinkem záření, který vyžaduje pozornost, je poškození způsobované volnými radikály, které se vytvářejí v důsledku dopadu elektronového paprsku na molekuly vody.

Jedna možná strategie obrany proti takovému poškození je založena na tom, že do média se pfidávávají příměsi, aby se zajistilo vstřebávání volných radikálů vznikajících v důsledku záření, výsledkem čehož by bylo minimalizování poškození buněk Mohou se používat jakékoli známé sloučeniny, které jsou použitelné pro odstraňování radikálů, avšak do

A » AA#

A ·

-39• <

• A «ΑΑ A A

A · ♦ ·«

A · AA té nriry, pokud nejsou toxické ve vztahu k buňkám. Jedním příkladem použitelné etoučcnmy pro účely řečené příměsi je sacharóza, která byla identifikována jako pohkovač volných radikálů. Tento roztok je použitelný pouze v přihlašovaném vynálezu, protože doposud známá technologie ovládání elektronového paprsku nepracuje ve vlhkém prostředí.

Označováni bsměk «využitím hnunoocnačovánL Označování buněk se provádí s využitím obvyklých mmnooznačovadeh postupů. Buňky byly opláchnuty a znehybnčny účinkem 2 % roztoku paraformaldchydu působícím po dobu 7 minut Následně po zablokování s použitím použitelného séra se prováděla inkubace buněk za účasti specifické monoklonové nebo polyklonové protilátky po dobu jedné hodiny. Po opláchnutí vzorky podstupují inkubaci s druhou protilátkou, která rozeznává první specifickou protilátku. Tato druhá protilátka se váže na shluk data β velikostí 5, 10, 20 nebo 40 nm. Označování s použitím zlata se může dále posilovat s použitím stříbra, přičemž je třeba dbát na pečlivé kafibrování každého koloidu.

Znehybněné vlhké buňky pod přepažíte! membránou.

Receptory fofrgpi růstu označené na znchybněných buňkách A431 a buňkách C2C12 mvší svalové tkáně

Buňky byly znehybnčny s použitím 2 % roztoku parafonnalóehydu a označeny „anti-EGF“ receptorowu monoklonovou protilátkou (na buňkách C2C12), po čemž následovalo označování s použfflm myiího „antí-IgG* vážícího se na částečky koloidního data s průměrem 20 nm. Buňky byly znehybněny a navíc bylo použito stříbro pro zvětšení veHtosti označování částeček. Zobrazování buněk se provádělo s použitím přístroje ^XL 30 ESEM“ a buňky byly zkoumány s využitím módu odražených elektronů JBSE“. Jak je na obr. 10A vidět, EGT reccptorové označování zlatém lze pozorovat jako zářivé skvrnky na obou buňkách. Neostrost značek kolem oblasti jádra buňky je výsledkem topografických rozdílů med částečkami data. Označování zlatém v Nízkosti přepažující membrány je jasné a zaostřené, zatímco vzdálenější značky za a kolem jádra buňky je rozmazané. Neostrost označení v oblastí jádra buňky dokazuje skutečnost, že označení v této oblasti se nacházejí dále od přepažující membrány. Tato neostrost skutečně poskytuje nástroj pro určování vzdálenosti značek od roviny přepažující membrány, a tudíž poskytuje trojrozměrnou mfortnacÍ Na základě použití algoritmů pro analýzu obrazu, které mají schopnost dekonvdutovat, může účinek přídavného média mezi přepažující membránou a značkami poskytovat dosti přesný odhad této vzdálenosti.

-40• 4

4444 * • · 4 · 4 4 4 · • 4 *· «« 44

V zájmu dosahování vyšší úrovně roztišení zobrazených značek na vzdálenější taně buňky (na straně, letmá je opačná ve vztahu ke strmě, jež pfilěhá k substrátu membrány) se může použit jině konstrukční provedení komory. V případě takového provedení se buňky pěstují na ploché základně a pokrývají se jen tenkou vrstvou kapaliny. Následně se přepažující membrána umisťuje na vrch řečené ploché záldadtry a buňky se utěsňují uvnitř komory. Tímto způsobem se zobrazuje hond strana buňky a buňky zůstávají nadále ve vlhkém prostředí.

Živé, neoznačené, přilnavé buňky pod membránou.

Živé buňkvC2C12mvší svatové tkáně.

Buňky byly nejdříve povlečeny fibroncctinem v jejich normálním médiu pro pěstování kultury. Po 24 hodmách byty buňky podrobeny zkoumání v módu odražených elektronů „BSE“. V případě živých buněk C2C12 (obr. 11A až ok. 11D) a buněk CHO (obr. 12) je jasně vidět obrys buňky a její jádro, jakož i některé dílčí organdy jádra.

Buňky byly označeny s použitím „anti-human IL-2“ receptorové monoklonové protilátky, po čemž následovalo označování s použitím myšího „anti-IgG“ vážícího se na Částečky koloidního zlata s průměrem 20 nm. Buňkám bylo umožněno, aby přflnuty na přepažující membránu, která byla předem povlečena potyhsinern. Po uplynutí 3é minutového časného úseku, v jehož průběhu buňky ulpívaly na povlečené přepažující membráně, se provádělo zkoumání v módu odražených elektronů JBSE“. Obr. 13 předvádí zaostření a rozostřená zlatých značek, což je výsledek topografických rozdílů mezi částečkami zlata, které byly pozorovatelné v souvislosti se zmfaěným označováním FGF receptoru nehybných buněk C2C12 (obr. 10A) a označování EGF receptoru buněk A431 (obr. 10B až obr. 10D).

Obrazy získávané s použitím tohoto katodotumlniscenčníbo (CL) nastavení. Ačkoli je signál dosti slabý (pravděpodobně v důsledku špatné účňmosti zachycováití světla), buňky jsou jasně viditelné. Buňky jsou pozorovatelné dokonce i bez CL označení (tzn., že některé části buňky vyzařiyí světlo samy o sobě). S použitím CL označení a s vylepšenou účinností zachycování světla se očekává daleko vyšší úroveň rozlišení.

Katodohimttiwcenční obraz znehvbněnÝch buněk N1H3T3·

Do buněk nebyly včleněny Žádné honmiscenční značky. Lze konstatovat, že vyzařované světlo je výsledkem „přirozené“ katodduntimscence bunde, jak je to předvedeno na obr. 14A až 14C. Šířka buňky je přibližně 20 mikronů.

-41• * *······* · • · · * · * · · · * ··· » *· ·» ·· ··

Ozaačování buněk NIH3T3 na bázi Mottaiu:

Materiály:

Sutfo-NHS-LC-biotin (Sigma B1022) (rozpuštěno lOmg/ml v DMSO a udržováno při 4°C). Strcptavidin vážící se na částečky zlata s průměrem od 10 nm do 40 nm.

Fosfátem dumený fyziologický roztok (zkratka „PBS“ podle anglického výrazu „phosphate buffered pbysiological šalině“) předehřfvaný při 37° C.

Médium pro pěstování kultury buňkové hnie (přcdchřívané při teplotě kultury buňkové linie). Předehřáté médium neobsahující sérum.

Roztoky, které je třeba připravit:

Roztok A: Sutfo-NHS-LC-biotin v předehřátém „PBS“ v poměru 0,5 mg/mL Roztok se musí připravovat bezprostředně před použitím, protože ve vodě degraduje.

Roztok B: Strcptavidin vážící se na částečky data rozpuštěný v „PBS“ (v poměru od 1/10 do 1/100) + médium neobsahující sérum (v objemovém poměru 1:5).

Roztok C: plné médium - roztok „PBS“ (v objemovém poměru 1:5).

Postup:

1. Trypsimzace buněk.

2. Odstfeďování při 1250 otáčkách za minutu po dobu 4 minut

3. Odstranění kapaliny nad odstředěnou buněčnou hmotou a opětné uvedení buněk do vznosu v 10 ml Čerstvého média.

4. Odběr 3 ml rozdělených do dvou eppendorfekých zkumavek po 1,5 mL

5. Odstfeďování při 1600 otáčkách za minutu po dobu 3 minut

6. Odstranění kapaliny nad odstředěnou buněčnou hmotou v množství, jaké je prakticky odstranitelné

7. Opatrné přidávání „PBS“ při 37° C za účelem získáni 1,5 ml ve zkumavkách (oplachování). Opětné uvádění buněk do vznosu.

8. Opětně odstfeďování po dobu 3 minut

9. Odstranění „PBS“ a přidání biotinu („Roztok A“). Opětné uvedení buněk do vznosu a dobré, avšak jemné míchání.

10. Inkubace při 37* C po dobu 20 minut (s protfepáním po uplynutí každých 3 minut).

11. Odstfeďování.

-42• ··· > · v « ·· «»

Odstranění kapahny nad odstředěnou buněčnou hmotou a opětné uvedení buněk do vznosu v čerstvém médiu.

13. Přenesení bua& na Petriho misky nebo membrány a inkubace od několika hodin až do doby přes noc do drahého dne.

14. Jedno až dvojí oplachování s použitím J*BS“.

15. Inkubace s použitím „Roztoku B“ v průběhu jedné hodiny s mílným mícháním, jestliže je to možné.

16. Jedno až dvojí oplachování s použitím „PBS“.

17. Odstranění „PBS“ a nahrazeni „Roztokem C“.

18. Provádění postupu zkoumání v elektronovém mikroskopu.

Živé buňkv;

3Hí(K

Povrchové proteiny buněk byty podrobeny účinku biotími a připojeny k streptavidinu, na který se váži částečky zlata s vehkostí 40 nm, jak je to předvedeno na obr. 15.

Pro zkušené odborníky v této oblasti techniky bude zřejmé, že přihlašovaný vynález není výhradně omezen na skutečnosti, jež byly konkrétně předvedeny a popsány v předchozím textu. Spíše platí, že rozsah přihlašovaného vynálezu zahrnuje jak výše popsané kombinace a dílčí kombinace různých znaků, tak i jejich varianty a modifikace, které zkušení odborníci v této oblasti techniky vyvodí po prostudování vypracovaného popisu a které se v dosavadním stavu techniky nenacházejí.

Claims (60)

1. NOVÉ PATENTOVÉ NÁROKY

   1. Vzorková uzavírací sestava, vyznačující se tím , že obsahuje:

   tuhou uzavírací misku rn^d otvor a vymezující uzavřený prostor pro umístění vzorku; a ve vztahu k dcktronovému paprsku prostupné, tekutinu nepropouštějící, účmkům vakua odoláugíd víko, které utěsněné odděluje řečený objem pro umístění vzorku od prostora vně řečeného víka.
2. 2. Vzorková uzavírací sestava podle nároku 1, vyznačující se tím , že řečené víko se zhotovuje z materiálu, který se vybírá ze skupmy, do níž patří pofyimid, polyamid, polyamid-imid, polyethylen, potypynd a další vodivé polymery, pariodkm, COLLODION, KAPTON, FORMVAR, VINYLEC, BUTVAR, PIOLOFORM, oxid křemičitý, oxid křemíku a uhlík.
3. 3. Vzorková uzavírací sestava podle každého z předcházejících nároků 1 a 2, vyznačující se tím,že také obsahuje perforovanou mechanickou opěru pro řečené víko, která vymezuje otvory mající přinejmenším jeden z rozměrů, jež nejsou menší než 100 mikronů.
4. 4. Vzorková uzavírací sestava pode kteréhokoli z předcházejídch nároků 1 až 3, vyznačující se tím , že řečená uzavírací miska je konstruována a konfigurována tak, aby jednak znemožňovala prostupování elektronových paprsků skrze řečenou vzorkovou uzavírad sestavu a jednak umožňovala dopadáni elektronů do řečeného prostora pro umístění vzorku a odrážení řečených elektronů z míst uvnitř řečeného prostora pro umístění vzorku.
5. 5. Vzorková uzavírad sestava podle kteréhokoli z předcházejídch nároků 1 až 4, vyznačující se tím , že řečená uzavírad miska a řečené víko jsou konstruovány a konfigurovány tak, aby zajišťovaly styk vzorku s řečeným víkem.

   -444 4 • 4

   444» 4 • i 94* «44 •·9 4 4 *4 9 · 44 *4 44
6. 6. Vzorková uzavírad sestava podle kteréhokoli z předcházejídch nároků 1 až 5, vyznačující se tím , že řečené víko celkové nepropouští plyn až do úrovně tlakového gradientu přinejmenším jedné atmosféry.
7. 7. Vzorková uzavírad sestava podle kteréhokoft z předcházejídch nároků 1 až 6, vyznačující se tím , že řečený uzavřený prostor pro umístění vzorku má rozměry, z nichž všechny přesahují 10 mikronů, a vymezuje otvor, který je propojen s řečeným uzavřeným prostorem pro umístění vzorku.
8. 8. Vzorková uzavírad sestava podle kteréhokofi z předcházejídch nároků 1 až 7, vyznačující se tím , že řečené vflco je celkově prostupné ve vztahu k elektronům majícím energie v rozsahu od 2 ke V do 30keV.
9. 9. Vzorková uzavírad sestava podle kteréhokoli z předcházejídch nároků 1 až 8, vyznačující se tím , Že také obsahuje ztíízaaí pro odlehčování tlaku, které je v průtokovém propojení s řečeným uzavřeným prostorem pro umístění vzorku.
10. 10. Vzorková uzavírací sestava podle kteréhokoli z předcházejídch nároků 1 až 9, vyznačující se tím , že také obsahuje zachycovač světla, který je účinný při zachycování světla vyvíjeného v důsledku interakce mezi elektrony a vzorkem v místě uvnitř řečeného uzavřeného prostoru pro umístění vzorku.
11. 11. Vzorková uzavírad sestava, vyznačující se tím , že obsahuje: uzavírad strukturu, která vymezuje uzavřený prostor pro untistění vzorku mající otvor, vrstvu, která je prostupná ve vztahu k elektronovému paprsku, avšak nepropouští tekutinu, kdy tato vrstva pokrývá řečený otvor a utěsněné odděluje řečený prostor pro umístění vzorku od prostoru vně řečené uzavírací struktury, přičemž řečená uzavírad struktura je konstruována a konfigurována tak, aby jednak znemožňovala prostupování elektronových paprsků skrze řečenou vzorkovou uzavírad sestavu a jednak umožňovala dopadáni dektronů do řečeného prostoro pro umístění vzorku a odráženi řečených dektronů z míst uvnitř řečeného prostoro pro umístění vzorku.

    -454444 4 • 4 44 44 ··
12. 12. Vzorková uzavírad sestava podfc nároku 11, vyznačující se tím , že řečená vrstva se zhotovuje z materiálu, který se vybírá ze skupiny, do níž patří pofyimid, polyamid, pofyatmd-inňd, polyethylen, potypyirol a další vodivé polymery, parkxhon, COLLODION, KAPTON, FORMVAR, VINYLEC, BUTVAR, PIOLOFORM, oxid křemičitý, oxid křemíku a uhlík
13. 13. Vzorková uzavírací sestava podle každého z předcházejících nároků 11a 12, vyznačující se tím , že také obsahuje perforovanou mechanickou opční pro řečenou vrstvu, přičemž tato mechanická opčra vymezuje otvory mající přinepnenším jeden z rozměrů, jež nejsou menší než 100 mikronů.
14. 14. Vzorková uzavírací sestava podle kteréhokoli z předcházejících nároků 11 až 13, vy značující se tím , že řečená uzavírací struktura a řečená vrstva jsou konstruovány a konfigurovány tak, aby zajišťovaly styk vzorku s řečenou vrstvou.
15. 15. Vzorková uzavírací sestava podle kteréhokoli z předcházejících nároků 11 až 14, vyznačující se tím , že řečená vrstva celkové nepropouští plyn až do úrovně tlakového gradientu přinejmenším jedné atmosféry.
16. 16. Vzorková uzavírací sestava podle kteréhokoli z předcházejících nároků 11 až 15, vyznačující se tím , že řečený uzavřený prostor pro umístění vzorku má rozměry, z nichž všedný přesahují 10 mikronů, a vymezuje otvor, který je propqjen s řečeným uzavřeným prostorem pro umístění vzorku.
17. 17. Vzorková uzavírací sestava podle kteréhokoli z předcházejících nároků 11 až 16, vy zn a-čující se tím , že řečená vrstva je celkově prostupná ve vztahu k elektronům mají cím energie v rozsahu od 2 ke V do 30keV.
18. 18. Vzorková uzavírací sestava podle kteréhokofc z předcházejících nároků 11 až 17, vyznačující se tím , že také obsahuje září zení pro odlehČování tlaku, které je v průtokovém propojení s řečeným uzavřeným prostorem pro umístění vzorku.

    -46* * • » «··« · • · 4 ·· ··
19. 19. Vzorková uzavírací sestava podle kteréhokok z předcházejících nároků 11 až 18, vyznačující se tím , že také obsahuje zachycovač světla, který je ú#mý pří zachycování světla vyvíjen#» v důsledku interakce mezi elektrony a vzorkem v místě uvnitř řečeného uzavřeného prostoru pro umístění vzorku.
20. 20. Vzorková uzavírací sestava podle kteréhokoli z předcházejících nároků 11 až 13 a 15 až 19, vy značující se tím ,že řečená uzavírací struktura a řečená vrstva jsou konstruovány a konfigurovány tak, aby zajišťovaly styk vzorku s řečenou vrstvou.
21. 21. Vzorková uzavírací sestava, vyznačující se tím , že obsahuje:

    uzavírací strukturo, která vymezuje uzavřený prostor pro umístění vzorku mající rozměry, z nichž všechny přesahují 10 mikronů, a která vymezuje otvor, jenž je propojen s řečeným uzavřeným prostorem pro umístění vzorku;

    vrstvu, která je prostupná ve vztahu k elektronovému paprsku, avšak nepropouští tekutinu, kdy tato vrstva pokrývá řečený otvor a utěsněné odděluje řečený prostor pro umístění vzorku od prostoru vně řečené uzavírací struktury, přičemž řečená uzavírací struktura a řečená vrstva jsou konstruovány a konfigurovány tak, aby umožňovaly dopadání elektronů do řečen#» prostoro pro umístění vzorku a odrážení řečených elektronů z nést uvnitř řečen#» prostoro pro umístění vzorku.
22. 22. Vzorková uzavírací sestava podle nároku 21, vyznačující se tím , žeřečená vrstva se zhotovuje z materiálu, který se vybírá ze skupiny, do níž patří polyimid, polyamid, polyamid-imid, polyethylen, pdypyrrol a další vodivé polymery, pariodion, COLLODION, KAPTON, FORMVAR, VINYLEC, BUTVAR, PIOLOFORM, oxid křemičitý, oxid křemíku a uhlík.
23. 23. Vzorková uzavírací sestava podle každého z předcházejících nároků 21 a 22, vyznačující se tím , že také obsahuje perforovanou mechanickou opěru pro řečenou vrstvu, přičemž tato perforovaná mechanická opěta vymezuje otvory mající přinejmenším jeden z rozměrů, jež nejsou menší než 100 mikronů.

    • 444 4

    -47• 4 4 • 4 44

    4 ·Β 4 • 4 44
24. 24. Vzorkoví uzavírací sestava podk kteréhokoli z předcházejících nároků 21 až 23, vyznačující se tím , že řečená uzavírací struktura je konstruována a konfigurována tak, aby jednak znemožňovala prostupování elektronových paprsků skrze řečenou vzorkovou uzavírací sestavu a jednak umožňovala dopadání dektranů do řečeného prostoru pro umístění vzorku a odrážení řečených elektronů z míst uvnitř řečeného prostoru pro umístění vzorku.
25. 25. Vzorková uzavírací sestava podle kteréhokoli z předcházejících nároků 21 až 24, vyznačující se tím ,že řečená uzavírací struktura a řečená vrstva jsou konstruovány a konfigurovány tak, aby zajišťovaly atyic vzorku s řečenou vrstvou.
26. 26. Vzorková uzavírací sestava podle kteréhokoli z předcházejících nároků 21 až 25, vyznačující se tím , že řečená vrstva celkově nepropouští plyn až do úrovně tlakového gradientu přinejmenším jedné atmosféry.
27. 27. Vzorková uzavírací sestava podle kteréhokoli z předcháze^cích nároků 21 až 26, vyznačující se tím , že řečená vrstva je celkově prostupná ve vztahu k elektronům majícím energie v rozsahu od 2 keV do 30 keV.
28. 28. Vzorková uzavírací sestava pode kteréhokoli z předcházejících nároků 21 až 27, vyznačující se tím , že také obsahuje zařízení pro odkhčování flaku, které je v průtokovém propojení s řečeným uzavřeným prostorem pro umístění vzorku.
29. 29. Vzorková uzavírací sestava podk kteréhokoli z předcházejících nároků 21 až 28, vyznačující se tím , že také obsahuje zachycovač švéda, který je účinný při zachycování světla vyvíjeného v důsledku interakce mezi elektrony a vzorkem v místě uvnitř řečeného uzavřeného prostoru pro umístění vzorku.
30. 30. Vzorková uzavírací sestava, vyznačující se tím , že obsahuje:

    uzavírací strukturu vymezující uzavřený prosto pro umístění vzorku a vymezující otvor, jenž je propojen s řečeným uzavřeným prostorem pro umístění vzorku;

    -48» * * « ··· · · « • * ···· ···· »··· · ·· ·· ·· ·· vratvu, která je prostupná vc vztahu k elektronovému paprsku, avšak nepropouští tekutinu, kdy tato vratva pokrývá řečený otvor a utěsněné odděluje řečený prostor pro umístění vzorku od prostoru vně řečené uzavírací struktury; a zařízení pro odkfačováni flaku, které je v průtokovém propojení a řečeným uzavřeným prostorem pro umístění vzorku.
31. 31. Vzorková uzavírací sestava podle nároku 30, vyznačující se tím , že řečená vrstva se zhotovuje z materiálu, který se vybírá ze skupiny, do níž patří polyimid, polyamid, polyamid-mud, polyethylen, potypyrrol a další vodivé polymery, parlodíon, COLLODION, KAPTON, FORMVAR, VINYLEC, BUTVAR, PIOLOFORM, oxid křemičitý, oxid křemíku a uhlík.
32. 32. Vzorková uzavírací sestava podle každého z předcházejících nároků 30a 31, vyznačující se tím , ie také obsahuje perforovanou mechanickou opční pro řečené víko, která vymezuje otvory mající přinejmenším jeden z rozměrů, jež nejsou menší než lOOnrikranů.
33. 33. Vzorková uzavírací sestava podle kteréhokoli z předcházejících nároků 30 až 32, vyznačující se tím , že řečená uzavírací struktura a řečená vratva jsou konstruovány a konfigurovány tak, aby zajišťovaly styk vzorku a řečenou vrstvou.
34. 34. Vzorková uzavírací sestava podle kteréhokoli z předcházejících nároků 30 až 33, vyznačující se tím , že řečená vratva celkově nepropouští plyn až do úrovně tlakového gradientu přinejmenším jedné atmosféry.
35. 35. Vzorková uzavírací sestava podle kteréhokoli z předcházejících nároků 30 až 34, vyznačující se tím , že řečený uzavřený prostor pro umístěni vzorku má rozměry, z nichž všechny přesahují 10 mikronů, a vymezuje otvor, který je propojen s řečeným uzavřeným prostorem pro umístění vzorku.

    -49• φ ··· • 0 0 · 0 *0 00 • · · 0« 00
36. 36. Vzorková uzavírací sestava podle kteréhokoli z předcházejících nároků 30 až 35, vyznačující se tím , Že řečená vrstva je celkově prostupná ve vztahu k elektronům majícím energie v rozsahu od 2 ke V do 30 keV.
37. 37. Vzorkoví uzavírací sestava podle ktcrébokofi z předcházejících nároků 30 až 36, vyznačující se tím , že také obsahuje zacbycovač švéda, který je účinný při zachycování švéda vyvíjeného v důsledku interakce mezi elektrony a vzorkem v místě uvnitř řečeného uzavřeného prostoru pro umístění vzorku.
38. 38. Vzorková uzavírací sestava podle kteréhokoli z předcházeních nároků 30 až 32 a 34 až 37, vyznačující se tím , že řečená uzavírací struktura a řečená vrstva jsou konstruovány a konfigurovány tak, aby zajišťovaly styk vzorku a řečenou vrstvou.
39. 39. Sestava skenovadho elektronového mikroskopu, vyznačující se tím , Že obsahuje:

    skenovací dektronový mikroskop vyzařujíd paprsek dektronů do oblasti vzorku, ve které se udržuje dak, jenž je pod úrovní tlaku vodní páry, vzorkovou uzavírací sestavu, která se umisťuje ve vzorkové oblasti při tlaku nižším, než je tlak vodní páry, a která má:

    tuhou uzavírad misku mající otvor a vymezující uzavřený prostor pro umístění vzorku; a ve vztahu k elektronovému prasku prostupné, tekutinu nepropouštějící, účinkům vakua odolávající víko, které utěsněné odděluje řečený objem pro umístění vzorku od prostoru vně řečeného víka.
40. 40. Sestava skenovadho elektronového mikroskopu potfle nároku 39, vyznačující se tím , že řečené víko se zhotovuje z materiálu, který se vybírá ze skupiny, do níž patří pdyimid, polyamid, potyamid-imid, polyethylen, pofypyrrol a další vodivé polymery, parkxhon, COLLODION, KAPTON, FORMVAR, VINYLEC, BUTVAR, PIOLOFORM, oxid křemičitý, oxid křemíku a uhlík.

    -50• 4 44«

    4 · * 4 4 4 4444 • 444 4 44 44 44 44
41. 41. Sestava skenovacího elektronového mikroekopu podk každého z předcházejí cídí nároků 39 a 40, vyznačující se tím , žc také obsahuje perforovanou mechanickou opční pro řečené víko, kdy tato perforovaná mechanická opéra vymezuje otvory mající přinejmenším jeden z rozměrů, jež nejsou menší než 100 mikronů.
42. 42. Sestava gkenovacího elektronového mikroekopu podb každého z předcházejících nároků 39až41, vyznačující se tím , že řečená uzavírad miska je konstruována a konfigurována tak, tfay jednak znemožňovala proetupovtoí ebktronových paprsků skrze tečenou vzorkovou uzavírad sestavu a jednak umožňovala dopadání ebktronů do řečeného prostoru pro umístění vzorku a odrážení řečených ebktronů z míst uvnitř řečendw prostoru pro umístění vzorku.
43. 43. Sestava skenovacího elektronového mikroskopu podk každého z předcházejících nároků 39aŽ42, vyznačující se tím , že řečená uzavírací miska a řečené víko jsou konstruovány a konfigurovány tak, aby zajišťovaly styk vzorku s řečenou vrstvou.
44. 44. Sestava skenovacího elektronového mikroekopu podle každého z předcházejících nároků 39 aŽ 43, vyznačující se tím , Že řečené víko celkové nepropouští plyn až do úrovně tlakového gradientu přinejmenším jedné atmosféry.
45. 45. Sestava skenovacího elektronového mikroekopu pode každého z předcházejících nároků 39 až 44, vyznačující se tím , že řečený uzavřený prostor pro umístění vzorku má rozměry, z nichž všechny přesahují 10 mikronů, a vymezuje otvor, který je propojen s řečeným uzavřeným prostorem pro umístění vzorku.
46. 46. Sestava skenovacího elektronového mikroekopu podb každého z předcházejících nároků 39 až 45, vyznačující se tím , že řečené víko je celkové prostupné ve vztahu k elektronům majícím energb v rozsahu od 2 ke V do 30 keV.
47. 47. Sestava skenovacího elektronového mikroskopu podle každého z předcházejí cích nároků 39 až 46, vyznačující se tím , že také obsahuje zařízení pro odlehčování

    00·« ·

    -5100 00 >0 0 00 ·0 tlaku, které je v průtokovém propojení s řečeným uzavřeným prostorem pro umístění vzorku.
48. 48. Sestava skenovadho elektronového mikroekopu podle každého z předcházeních nároků 39 až 47, vyznačující se tím , že také obsahuje zachycovač švéda, který je účinný při zachycování švéda vyvíjeného v důsledku interakce mezi elektrony a vzorkem v místě uvnitř řečeného uzavřeného prostoro pro umístění vzorku.
49. 49. Vzorková uzavírací sestava, vyznačující se tím , že obsahuje: vzorkovou strukturu vymezující uzavřený prostor pro umístění vzorku;

    přinejmenším jednu vrstvu, která je prostupná ve vztahu k elektronovému paprsku, avšak nepropouští tekutinu, kdy tato vrstva pokrývá řečený otvor a utěsněné odděluje řečený prostor pro umístění vzorku od prostoro vně řeěené uzavírad struktury; a zachycovač světla, který je účinný při zachycování světla vyvíjeného v důsledku interakce mezi elektrony a vzorkem v místě uvnitř řečeného uzavřeného prostoro pro umístění vzteku.
50. 50. Vzorková uzavírací sestava podte nároku 49, vyznačující se tím , že řečená vrstva se zhotovuje zmateňáhi, který se vybírá ze skupiny, do níž patří potyimid, polyamid, potyamid-imid, polyethylen, pdypyrrol a další vodivé polymery, pariodion, COLLODION, KAPTON, FORMVAR, VINYLEC, BUTVAR, PIOLOFORM, oxid křemičitý, oxid křemíku a uhKL
51. 51. Vzorková uzavírad sestava podle každého z předcházejících nároků 49 a 50, vyznačující se tím,že také obsahuje perforovanou mechanickou opěru pro přinejmenším jednu řečenou vrstvu, kdy tato perforovaná mechanická opěra vymezuje otvory mající přinejmenším jeden z rozměrů, jež nejsou menší než 100 mikronů.
52. 52. Vzorková uzavírací sestava podle každého z předcházejících nároků 49 až 51, vyznačující se tím , že řečená vrstva celkově nepropouští plyn až do úrovně tlakového gradientu přinejmenším jedné atmosféry.

    -52«· · · • · · · »»
53. 53. Vzorková uzavírací sestava podle každého z předcházejících nároků 49 až 52, vyznačující se tím,že řečený uzavřený prostor pro umístění vzorku má rozměry, z nichž všechny přesahují 10 mflcronů, a vymezuje otvor, který je propojen s řečeným uzavřeným prostorem pro umístěni vzorku.
54. 54. Vzorková uzavírací sestava podle každého z předcházejí cí ch nároků 49 až 53, vyznačující se tím,že řečená vrstva je celkově prostupná ve vztahu k elektronům majtefrn energie v rozsahu od 2 keV do 30 keV.
55. 55. Vzorková uzavírací sestava podle každého z předcházejících nároků 49 až 54, vyznaČující se tím,že také obsahuje zařízení pro odlehčovíní flaku, které je v průtokovém propojení s řečeným uzavřeným prostorem pro umístění vzorku.
56. 56. Způsob provádění skenovací elektronové mikroskopie, vyznačující se tím, že zahrnuje:

    vyzařování paprsku elektronů do vzorkové oblasti, v níž se udržuje takový flak, který je nižší než flak vodní páry, umisťování vzorku do vzorkové uzavírací sestavy mající otvor a vymezující uzavřený prostor pro umístění vzorku, který se utěsňuje na řečeném otvoru s použitím řečeného, ve vztahu k elektronovému paprsku prostupného, tekutinu nepropouštějícího, Účinkům vakua odolávajícího víka;

    umisťování řečené vzorkové uzavírací sestavy do dráhy řečeného paprsku elektronů; a detekování odražených elektronů z interakce řečeného paprsku elektronů s řečeným vzorkem.
57. 57. Způsob provádění skenovací elektronové mikroskopie, vyznačující se tím, že zahrnuje:

    vyzařování paprsku elektronů do vzorkové oblasti, v níž se udržuje takový flak, který je nižší než flak vodní páry;

    umisťování vzorku do vzorkové uzavírací sestavy, která se udržuje ve vzorkové oblasti pří takovém flaku, jenž je nižší než flak vodní páry, a která obsahuje:

    * 9 999

    9 · 9

    -53• 9 9 9 «· ·· • · · · ·♦ «» uzavírací strukturu vymezující uzavřený prostor pro umíetění vzorku a vymezující otvor, který je propojen s řečeným uzavřeným prostorem pro untístční vzorku; ve vztahu k elektronovému paprsku prostupnou, tekutinu nepropouštějící vrstvu, jež pokrývá řečený otvor a utěsněné odděhge řečený prostor pro umístění vzorku od prostoru vně řečené uzavírací struktury, přičemž řečmi uzavírací struktura a řečeni vrstva jsou konstruovány a konfigurovány tak, aby umožňovaly dopadání elektronových paprsků do řečeného prostoro pro umístění vzorku;

    umisťování řečené vzorkové uzavírací sestavy do dráhy řečeného paprsku elektronů; a analyzování výsledků interakcí řečeného paprsku elektronů a řečeným vzorkem.
58. 58. Způsob provádění skenovací elektronové núkroekopie podle nároku 57, vyznačující se t í m , že analýza řečených výsledků interakcí řečeného paprsku elektronů s řečeným vzorkem se provádí na základě detekování rentgenových paprsků.
59. 59. Způsob provádění skenovací elektronové núkroekopie pode nároku 57, vyznačující s c t í m , že analýza řečených výsledků interakcí řečeného paprsku elektronů s řečeným vzorkem se provádí na základě detekování světla ve spektru od ultrafialového do infračerveného rozsahu.
60. 60. Způsob provádění skenovací elektronové núkroekopie podle nároku 57, vyznačující se t í m , že analýza řečených výsledků interakcí řečeného paprsku elektronů s řečeným vzorkem se provádí na základě detekování elektronů.