CZ20031657A3 - Způsob výroby tPA odvozeného z rekombinantní DNA nebo molekul K2S ve velkém měřítku - Google Patents

Description

Způsoby výroby tPA odvozeného z rekombinantní DNA nebo molekul K2S ve velkém měřítku

Oblast techniky

Vynález spadá do oblasti trombolýz^ a aktivátoru (tPA) tkáňového plazminogenu buňkách.

odvozené produkce v prokaryontních

Vynález popisuje způsoby produkce tPA odvozeného z rekombinantní DNA a jeho varianty nebo molekuly K2S (Kringle 2 serin) nebo její varianty v prokaryontních buňkách, kde nebo K2S nebo varianta se vylučovala jako aktivní a správně sbalený protein.

uvedený tPA extracelulárně

Prokaryontní buňka obsahuje a exprimuje vektor obsahující DNA kódující uvedený tPA nebo K2S nebo variantu operativně spojenou s DNA kódující signální peptid OmpA. Vynález dále zahrnuje uvedené molekuly DNA a použití uvedených molekul DNA v uvedených metodách.

Dosavadní stav techniky

Tkáňový plazminogenový aktivátor (tPA) je polypeptid obsahující 527 aminokyselinových zbytků (popisuje se v publikaci Pennica, D., W. E. Holmes, W. J. Kohr, R. N. Harkins, G. A. Vahar, C. A. Ward, W. F. Bennett, E. Yelverton, P. H. Seeburg, Η. I. Heyneker, D. V. Goeddel, and D. Collen. 1983. Clonníng and expression of human tissue-type plazminogen activator cDNA in E. coli. Nátuře 301:214-221) s molekulovou hmotností 72 000. Molekula se dělí na pět strukturálních oblastí. Nejbližší N-terminální oblast je prstu ve formě smyčky, pak následuje oblast růstového faktoru. Po ní následují dvě podobné oblasti „kringle 1 a „kringle 2.

Prstová oblast a oblast „kringle 2 se specificky váží na • · · ·

šbalek fibrinu, čímž urychlují aktivaci vázaného plazminogenu proteinem tPA. Ve směru 3'konce oblasti „kringle 2 je serinová proteináza se svým katalytickým místem lokalizovaným na C-konci. Serinová proteináza odpovídá za přeměnu plazminogenu na plazmin reakcí, která je důležitá při homeostáze tvorby fibrinu a rozpouštění sraženin. Správné sbalení tPA vyžaduje v molekule správné párování sedmnácti disulfidových můstků (popisuje se v publikaci Allen, S., Η. Y. Naim, and N. J. Bulleid. 1995. Intracellular folding of tissue-type plazminogen activator. Effects of disulfide bond formation on A-linked glykosylation and secretion. J. Biol. Chem. 270: 4797-4804).

Z klinického hlediska je tPA trombolytické činidlo, které je možné zvolit pro léčbu akutního infarktu myokardu, pulmonární embolie, mozkové příhody, okluze periferních arterií a jiných tromboembolických onemocnění. Výhodné je, že nedochází k vedlejším účinkům, jako je systemická krvácivost a deplece fibrinogenu (popisuje se v publikaci Camiolo, S. M., S. Thorsen, and T. Astrup. 1971. Fibrinogenolysis and fibrinolysis with tissue plasminogen activator, urokinase, streptokinase-activated human globulin and plasmin. Proč. Soc. Exp. Biol. Med. 38: 277-280). Buňky melanomu Bowes se poprvé použily jako zdroj produkce tpA pro terapeutické účely (popisuje se v publikaci Griffiths, J. B., A. Electricwala. 1987. Production of tissue plasminogen activators rom animal cells. Adv. Biochem. Eng. Biotechnol. 34: 147-166). Vzhledem ke konzistentnímu postupu s účinnou produkcí se pro klinické použití vyžaduje vysoce čištěný protein s vysokým výtěžkem. Tento postup je založen na konstrukci rekombinantního tPA plné délky (r-tPA) zpracovaného v savčích buňkách. Buňky vaječníků čínských křečků se transfekovaly genem tPA, aby došlo k syntéze r-tPA (popisuje se v publikaci Cartwright, T. 1992. Production of t-PA from animal cell culture, p. 217-245. In R.

• · · ·

E. Spier, and J. B. Griffiths (ed.), Animal Cell Biotechnology, Vol 5. Academie Press, N.Y., Lubiniecki, A., R. Arathoon, G. Polastri, J. Thomas, M. Wiebe, R. Garnick, A. Jones, R. van Reis, and S. Builder. Selected strategies for manufacture and control of recombinant tissue plasminogen activator prepared from cell culture, p. 442-451. In R. E. Spier, J. B. Griffiths, J. Stephenne, and p. J. Crooy (ed. ) , Advances in animal cell biology and technology for bioprocesses. Butterworths, London). Shromáždil se produkt získaný z rekombinantní DNA produkovaný fermentačním systémem kultury savčích buněk a odstranilo se kultivační médium. Na základě jednoduchosti a ekonomičnosti produkce se zkoumání možnosti produkce r-tPA z mikroorganizmů, zvláště z bakterií a zvláště z mikroorganizmu Escherichia coli, věnovalo velké úsilí (popisuje se v publikaci Datar, R. V., T. Cartwright, an C.-G. Rosen. 1993. Process economics of animal cell and bacterial fermetations: A čase study analysis of tissue plasminogen activator. Biotechnology 11: 349-357, Harris, T.

J. , T. Patel, F. A. Marston, S. Little, J.S. Emtage, G. Opdenakker, G. Volckaert, W. Rombauts, A. Biliau, and P. De Somer. 1986. Clonning of cDNA coding for human tissue-type plasminogen activator and its expression in Escherichia coli. Mol. Biol. Med. 3: 279-292, Sarmientos, Ρ., M. Duchesne, P.

Denefle, J. Boizian, N. Fromage, N. Delporte, F. Parker, Y. Lelievre, J.-F. Mayaux, and T. Carwright. 1989. synthesis and purification of active human tissue plasminogen activator from Escherichia coli. Biotechnology 7: 495-501) tvorbě okluzních tělísek, k deaktivaci enzymu, se

Vzhledem k což vede ke navrhla řada nízkému výtěžku a špatnému balení a strategií, které by předešly těmto problémům.

Zvažovala se řada delečních mutantních variant, které zahrnují oblast „kringle 2 a serinovou proteinázu (K2S). Enzymatická aktivita rekombinantního K2S (r-K2S) se získala • · pouze, když se dosáhlo opětného sbalení čištěných inkluzních tělísek z cytoplazmatického kompartmentu (popisuje se v publikaci Hu, C. K., U. Kohnert, 0. Wilhelm, S. Fischer, and M. Llinas. 1994. Tissue-type plasminogen activator domaindeletion mutant BM 06.022: modular stability, inhibitor binding, and activation cleavage. Biochemistry 33: 11760117 66, Saito, Y. , Fujimura, Y. Imai,

Production plasminogen

Y. Ishii, H. Sasaki, M. Hayashi, T. S. Nakamura, S. Suzuki, J. Notani, T. Asada, H. Horiai, K. Masakazu, and N. Mineo. 1994 and characterization of a novel tissue-type activator derívativein Escheríchia coli. Biotechnol. Prog. 10.: 472-479). Za účelem zabránit nežádoucím opětným procesům, vzniku nečistot špatně sbalených proteinů a zavedení periplasmického proteinu, se využily speciální bakteriální expresívní systémy (popisují s v publikaci Betton, J. Μ., N. Sassoon, M. Hofnung, and M. Laurent. 1998. Degradation versus aggregation of misfolded maltose-binding protein in the periplasm of Escheríchia coli. J. Biol. Chem. 273:8897-8902, Scherrer, S., N. Robas, H. Zouheiry, G. Branlant, and C. Branlant. 1994. Periplasmic aggregation limits the proteolytic maturation of the Escheríchia coli penicillin G amidase precursor polypeptide. Appl. Microbiol. Biotechnol. 42: 8589) . Navzdory periplasmické expresi tPA nadměrná exprese vede k deaktivaci agregátů dokonce v případě, kdy v periplazmě jsou relativně silné oxidační podmínky.

V předchozím stavu techniky se vyskytuje několik popisů způsobů přípravy rekombinantního K2S z mikroorganizmu E. coli. Neexistuje však žádná zmínka o metodě, která vede ke způsobu produkce biologicky aktivního K2S ve velkém měřítku, jenž je ekonomicky efektivní.

V publikaci Obukowicz, M. G., Μ. E. Gustafson, K. D. Junger, R. M. Leimgruber, A. J. Wittwer, T.C. Wun, T. G.

·· φφ φ · φ · • ••Φ φφ φφφφ

Warren, Β. F. Bishop, Κ. J. Mathis, D. Τ. McPherson, N.R. Siegel, Μ. G. Jenning, Β.Β. Brightweel, J. A. Diaz-Cllier, L. D. Bell, C. S. Craik, and W. C. Tacon. 1990. Secretion of active kringle-2-serine protease in Escherichia coli. Biochemistry 29: 9737-9745 se popisuje exprimovaný a čištěný r-K2S z periplazmatického prostoru. Zřejmou nevýhodou uvedené metody je krok periplazmatické extrakce, který není vhodný pro produkci ve velkém měřítku.

Production plasminogen

V publikaci Saito, Y., Y. Ishii, H. Sasaki, M. Hayashi, T. Fujimura, Y. Imai, S. Nakamura, S. Suzuki, J. Notani, T. Asada, H. Horiai, K. Masakazu, and N. Mineo. 1994 and characterization of a novel tissue-type activator derivativein Escherichia coli. Biotechnol. Prog. 10.: 472-479) se popisuje cytoplazmatická exprese r-K2S.

Autoři používaly v případě exprimovaného r-K2S renaturační postupy in vivo. r-K2S se izoloval z cytoplazmatického prostoru mikroorganizmu E. coli ve formě inkluzních tělísek. Firma Boehringer Mannheim používá podobný nepříliš výhodný postup denaturace/opětné sbalení, který zahrnuje kroky štěpení buněk, rozpouštění za denaturačních a redukčních podmínek a reaktivaci za oxidačních podmínek v přítomnosti GSH/GSSC, který není ekonomicky výhodný (jak se popisuje v publikaci

Martin, U. , S. Fischer, U. Kohnert, H. Lili, R. Rudoplh, G.

Sponer, A. Stern, and K. Strein. 1990. Properties of a novel (BM 06.022) produced in Escherichia 79: 167-170) a vyžaduje mutaci plasminogen activator coli. Z. Kardiol.

aminokyselinové sekvence s možným antigenním potencionálem.

V roce 1991 (popisuje se v publikaci Waldenstrom, Μ., E. Holmgren, A. Attersand, C. Kalderen, B. Lowenadler, B. Raden,

L. Hansson, and G Pohl. 1991. Synthesis and secretion of a fibrinolytically active tissue-type plasminogen activator variant in Escherichia coli. Gene 99: 243-248) se

4 ·« ·····♦ ··» * ····♦···./ £ ··········· · ^U ······· ···« ·· ·· ·· ♦ ·· ·« zkonstruoval vektor (pEZZZK2P) pro vylučování oblasti „kringle 2 a serinové proteinázy do supernatantu kultury E. coli. Za účelem odstranění fúzního peptidu ZZ z frakcí čištěných na IgG-sefaróze se použil hydroxylamin. Štěpící činidlo hydroxylamin vyžadovalo úpravu místa štěpení oblasti kringle 2 a serinová PROTEINÁZa (Asn¹⁷⁷-»Ser a Asn¹⁸⁴->Gln) , tak je chráněno před štěpením hydroxylaminem. Výsledná nepřirozená, nesprávně sbalená molekula K2S není vhodná pro terapeutické účely. Vedle vazebné aktivity fibrinu/PROTEINÁZové aktivity se opisují neenzymatické aktivity. Neobvyklá sekvence může dokonce aktivovat lidský imunitní systém.

Vynález popisuje běžně aplikovatelný způsob produkce molekul tPA ve velkém měřítku a jejich derivátů, například K2S, kde molekula K2S se vylučovala ve své biologicky aktivní formě do supernatantu kultury.

Podstata vynálezu

Vynález popisuje způsob produkce aktivátoru tkáňového plazminogenu (tPA) odvozeného z rekombinantní DNA, variantu tPA, molekulu kringle 2 serinové PROTEINÁZy (K2S) nebo varianty K2S v prokaryontních buňkách, kde uvedený tPA jeho varianta a molekula K2S se vylučuje extrabuněčně jako aktivní a správně balený protein charakterizovaný tím, že prokaryontní buňka obsahuje a exprimuje vektor obsahující DNA kódující uvedený tPA jeho variantu, molekulu K2S nebo variantu K2S operativně spojenou s DNA kódující signální peptid Omp nebo jeho funkční derivát.

Použití samotného signálního peptidu OmpA a/nebo v kombinaci s N-terminální aminokyselinami SEGN (sekvence SEQ

ID NO: 9)/SEGNSD (sekvence SEQ ID NO: 10) translokuje tPA odvozený z rekombinantní DNA, variantu tPA, molekulu K2S nebo

4494 ·· «·♦· »4 ···4 její variantu na vnější povrch a umožňuje uvolnění funkční a aktivní molekuly do kultivačního média ve větším rozsahu ve srovnání s libovolnou jinou metodou popsanou v dosavadním stavu techniky. Dříve než projde vnější membránou protein získaný z rekombiantní DNA, je správně sbalen podle vynálezu. Signální peptid se odštěpí za vzniku zralé molekuly. Účinnost odstranění signálního peptidů je velmi vysoká a vede ke správnému sbalení proteinu odvozeného z rekombinantní DNA.

Uvedený signální peptid OmpA interaguje s SecE a zavádí se přes vnitřní membránu energií vytvořenou SecA, který se váže na komponenty Sec (SecE-SecYj . SecY tvoří vylučovací pór pro z rekombinantní DNA podle a vnitřní membránou gramvykazuje silnější oxidační prostorem. Tato uvolnění proteinu odvozeného vynálezu. Prostor mezi vnější negativní bakterie, periplazma, podmínky ve srovnání s cytoplazmatickým skutečnost podporuje tvorbu disulfidových můstků a správné balení proteinu odvozeného z rekombinantí DNA (například K2S) v periplazmě za vzniku aktivní molekuly. Podle vynález se signální peptid odštěpí a dojde k produkcí zralé molekuly. Komplex sekretinu GspD a lipoproteinu GspS na vnější membráně slouží jako vstupní kanál pro vylučování proteinu odvozeného z rekombinantní DNA podle vynálezu do extrabuněčného média. Tento postup vylučování vyžaduje energii, která se tvoří v cytoplazmě proteinem GspE vázajícím se na nukleotid, než se přenese na protein vnitřní membrány (Gsp G-J, F a K-A) . GspC přenáší energii na GspD tvorbou řetězení mezi sadou vnitřního membránového proteinu (Gsp G-J, F a K-N) a GspD. Dříve než protein odvozený z rekombinantní DNA projde úspěšně vnější membránou je správně sbalen.

Termín „operativně spojen znamená, že DNA kódující tPA, variantu tPA, molekulu K2S nebo variantu K2S (z výhodou obsahující nukleovou kyselinu kódující SEGN nebo SEGNSD ve své •v ···· • 0 00 » · · t » 0 00 • 0 ····

N-terminální části) se klonuje do vektoru blízko DNA OmpA za účelem dosažen exprese OmpA-tPA, varianty tPA, molekuly K2S nebo fúzního proteinu obsahujícího fúzní protein a přímého vylučování vně prokaryontních hostitelských buněk. V typickém případě se vylučuje většina tPA, variant tPA, molekul K2S a jejich variant a může se pak čistit vhodnými metodami, jako je srážení síranem amonným a/nebo afinitní chromatografií a dalšími čistícími kroky. Vynález dále indukčního činidla, jako je IPTG nebo s glycerolem, zlepšení inkubačních podmínek a optimalizaci dgby shromáždění buněk za účelem maximalizovat množství aktivního proteinu.

zahrnuje použití IPTG v kombinaci

Ve výhodném provedení vynálezu uvedená DNA kódující signální peptid OmpA se může fúzovat s krátkým peptidem charakterizovaným aminokyselinovou sekvencí SEGN nebo SEGNSD nebo s kódující sekvencí nukleových kyselin TCTGAGGGAAAC (sekvence SEQ ID NO: 20) nebo TCTGAGGGAAACAGTGAC (sekvence SEQ ID NO: 1) . Uvedená sekvence se nachází v N-terminální části nebo v N-terminální části tPA, varianty tPA, molekuly K2S nebo variant K2S. Tak s výhodou uvedený fúzní protein obsahuje OmpA-SEGNSD-tPA, -tPA-varianta, -K2S-molekula nebo -K2Svarianta. Dokonce výhodněji uvedené aminokyseliny charakterizované sekvencí SEGN nebo SEGNSD mohou nést bodovou mutaci nebo mohou být substituovány nepřirozenou aminokyselinou. Výhodněji, mezi OmpA a SEGN nebo SEGNSD a tPA, variantou tPA molekulou K2S nebo variantou K2S může existovat aminokyselinový mezerník nebo mezerník, který není tvořený aminokyselinami.

Je výhodné, aby podle vynálezu uvedená prokaryontní buňka zahrnovala a exprimovala vektor obsahující DNA kódující uvedený tPA, variantu tPA, molekulu K2S nebo variantu K2S operativně spojenou s DNA kódující signální peptid OmpA, který • · • · · · je operativně spojen s molekulou nukleové kyseliny definované sekvenci TCTGAGGGAAACAGTGAC nebo jejím funkčním derivátem.

Způsob podle vynálezu zahrnuje prokaryontni hostitelské buňky, jako je Escherichia coli (E. coli), Bacillus subtilis, Streptomyces, Pseudomonas, například Pseudomonas putida, Próteus mirabilis, Saccharomyces, Pichia nebo Staphylococcus, například Staphylococcus carnosus. Uvedené hostitelské buňky podle vynálezu jsou gram-negativni bakterie.

Způsob podle vynálezu je také charakterizován tím, že prokaryontni buňkou je E. coli. Vhodné kmeny zahrnují, ale nejsou omezeny na E. coli XL-1 blue, BL21(DE3), JM109, série

DH, TOPIO a HB101.

Způsob podle vynálezu je také charakterizován tím, že následující kroky se provádějí:

a) DNA kódující tPA, variantu tPA, molekulu K2S nebo variantu K2S se amplifikuje pomocí PCR,

b) produkt PCR se čistí,

c) uvedený produkt PCR se začlenil do vektoru, který obsahuje DNA kódující signální peptid OmpA a DNA kódující gpIII takovým způsobem, že uvedený produkt PCR je operativně spojen s 5'-koncem DNA kódující signální sekvenci OmpA a s 3' koncem DNA kódující gpIII v uvedeném vektoru,

d) stop kodon se začlenil mezi uvedený tPA, variantu tPA, molekulu K2S nebo variantu K2S a gpIII,

e) uvedený vektor se exprimuje prokaryontni buňkou,

f) tPA, varianta tPA, molekula K2S nebo varianta K2S se čistí,

V případě kroku a) podle vynálezu je důležitá volba/návrh primerů pro klonování DNA do správného místa a směru expresívního vektoru (popisuje se v příkladu 1) . Primery jak se popisují v příkladu 1 a na obrázku 4 obsahují důležitý ·· ·· ·· ···· «· ···· • · · · ·· · ·· · ···· · · · ··« · · · · ··· ···· • · ·· · · · ·· ·· aspekt vynálezu. Termín „gpIII popsaný v odstavci c) je gen proteinu III, který je přítomen hlavně ve fágemidových vektorech. Aby se zabránilo transkripci genu gp III, začlenil se stop kodon, takže to eventuelně vede k vylučování tPA, varianty tPA, molekuly K2S nebo variant K2S. Pro začlenění stop kodonu se může použít libovolná vhodná metoda, jako je místně řízená mutageneze (popisuje se například v publikaci Weiner Mp, Costa GL (1994) PCR Methods Appl. 4 (3) : S131-136,

Weiner MP, Costa GL, Schoettlin W., Cline J., Mathur E, Bauer J.C. (1994) Gene 151(1-2):119-123, také se popisuje v příkladu 1) ·

V metodě podle vynálezu se může použít libovolný vektor. Výhodným vektorem je fágemidový vektor (popisuje se dále v textu).

Způsob podle vynálezu se také charakterizuje tím, že tPA, varianta tPA, molekula K2S nebo varianta K2S se vybrala z lidského tkáňového plazminogenovéhé aktivátoru (tPA, zobrazeno na obrázku č. 16) nebo jeho fragmentu, funkční varianty, alelické varianty, podjednotky, chemického derivátu, fúzního proteinu nebo glykosylační varianty. Takové fragmenty, alelické varianty, funkční varianty, varianty založené na degenerovaném kódu nukleových kyselin, fúzní proteiny s proteinem tPA podle vynálezu, chemické deriváty nebo glykosylační varianty proteinů tPA podle vynálezu mohou zahrnovat jeden, několik nebo všechny následující oblasti nebo podjednotky nebo jejich varianty:

1. oblast prstu (4 až 50)

2. oblast růstového faktoru (50 až 87)

3. oblast „kringle 1 (87 až 176)

4. oblast „kringle 2 (176 až 262)

5. proteinázovou oblast (276 až 527).

• · · · ···· ·· ···· • · · · · · · * · • ·· ··· · · ·

Číslování nebo pojmenování oblastí odpovídá datům databanky Genbank, přístupové číslo GI 1371 19, nebo publikaci Nátuře 301 (5897), 214-221 (1983).

Výhodněji způsob podle vynálezu se také charakterizuje tím, že tPA, varianta tPA, molekula K2S nebo varianta K2S se vybrala ze skupiny zahrnující variantu aktivátoru lidského tkáňového plazminogenu kringle 2(4.) plus serinová proteináza (5.) K2S nebo její fragment, funkční varianty, alelické varianty, podjednotky, chemický derivát, fúzni protein nebo glykosylační variantu.

Způsob podle vynálezu je také charakterizován tím, že vektor je fágemidový vektor obsahující DNA kódující signální peptid OmpA a DNA kódující gpIII.

Způsob podle vynálezu je také charakterizován tím, že vektor je pComb3HSS fágemid (popisuje se také v příkladu 1).

Způsob podle vynálezu se také výhodněji charakterizuje tím, že sekvence DNA obsahuje nebo se skládá z následující sekvence DNA kódující OmpA a K2S nebo její funkční variantu nebo variantu obsahující degenerovaný nukleotidový kód:

ATGAAAAAGACAGCTATCGCGATTGCAGTGGCACTGGCTGGTTTCGCTACCGTGGCC

CAGGCGGCCTCTGAGGGAAACAGTGACTGCTACTTTGGGAATGGGTCAGCCTACCG

TGGCACGCACAGCCTCACCGAGTCGGGTGCGTCCTGCCTCCCGTGGAATTCCATGAT

CCTGATAGGCAAGGTTTACACAGCACAGAACCCCAGTGCCCAGGCACTGGGCCTGG

GCAAACATAATTACTGCCGGAATCCTGATGGGGATGCCAAGCCCTGGTGCCACGTG

CTGAAGAACCGCAGGCTGACGTGGGAGTACTGTGATGTGCCCTCCTGCTCCACCTGC

GGCCTGAGACAGTACAGCCAGCCTCAGTTTCGCATCAAAGGAGGGCTCTTCGCCGA

CATCGCCTCCCACCCCTGGCAGGCTGCCATCTTTGCCAAGCACAGGAGGTCGCCCGG

AGAGCGGTTCCTGTGCGGGGGCATACTCATCAGCTCCTGCTGGATTCTCTCTGCCGC

CCACTGCTTCCAGGAGAGGTTTCCGCCCCACCACCTGACGGTGATCTTGGGCAGAAC

ATACCGGGTGGTCCCTGGCGAGGAGGAGCAGAAATTTGAAGTCGAAAAATACATTG

TCCATAAGGAATTCGATGATGACACTTACGACAATGACATTGCGCTGCTGCAGCTGA

AATCGGATTCGTCCCGCTGTGCCCAGGAGAGCAGCGTGGTCCGCACTGTGTGCCTTC

CCCCGGCGGACCTGCAGCTGCCGGACTGGACGGAGTGTGAGCTCTCCGGCTACGGC

AAGCATGAGGCCTTGTCTCCTTTCTATTCGGAGCGGCTGAAGGAGGCTCATGTCAGA

CTGTACCCATCCAGCCGCTGCACATCACAACATTTACTTAACAGAACAGTCACCGAC

AACATGCTGTGTGCTGGAGACACTCGGAGCGGCGGGCCCCAGGCAAACTTGCACGA

CGCCTGCCAGGGCGATTCGGGAGGCCCCCTGGTGTGTCTGAACGATGGCCGCATGA

CTTTGGTGGGCATCATCAGCTGGGGCCTGGGCTGTGGACAGAAGGATGTCCCGGGT

- GTGTACACAAAGGTTACGAACTACCTAGACTGGATTCGTGACAACATGCGACCG (SEQIDN0:2)

Způsob podle vynálezu je výhodněji charakterizován tím, že DNA sekvence OmpA obsahuje nebo zahrnuje následující sekvence nebo její funkční variantu nebo variantu obsahující degenerovaný nukleotidový kód:

ATGAAAAAGACAGCTATCGCGATTGCAGTGGCACTGGCTGGTTTCGCTACCGTGGCC CAGGCGGCC (SEQ ID N0:3).

Uvedená DNA kóduje následující aminokyselinovou sekvenci OmpA. OmpA tak obsahuje nebo se skládá z proteinu charakterizovaného následující aminokyselinovou sekvencí nebo jejím fragmentem, funkční variantou, alelickou variantou, podjednotkou, chemickým derivátem nebo glykosylační variantou:

MKKTAIAIAVALAGFATVAQAA (SEQ ID N0:21).

Nepřekládaná oblast může obsahovat regulační element, jako je například jednotka inicijující transkripci (promotor) nebo zesilovač. Uvedený promotor může například být konstitutivní, indukovatelný nebo vývojem řízený promotor. Jako konstitutivní promotor se může použít promotor lidského cytomegaloviru (CMV) a viru Rousova sarkomu (RSV) stejně jako Simian viru 40 (SV40) a Herpes viru. Indukovatelné promotory podle vynálezu zahrnují ·· ·· • · · · promotory genů nesoucích rezistenci na antibiotika, promotory genu teplotního šoku, hormonálně indukovatelný promotor viru nádoru prsní žlázy a promotor metalothioneinu. Výhodné promotory zahrnují promotor T3, T7, Lac/aral a LtetO-1.

Způsob podle vynálezu je také výhodněji charakterizován tím, že DNA tPA, varianty tPA, molekuly K2S nebo varianty K2S předchází lac promotor a/nebo ribozomální vazebné místo, jako je Shine-Dalgarnova sekvence (popisuje se také v příkladech).

Způsob podle vynálezu se také výhodněji charakterizuje tím, že DNA kódující tPA, variantu tPA, molekulu K2S nebo variantu K2S se vybrala ze skupiny zahrnující molekuly DNA kódující alespoň 90 % aminokyselin 87 až 527, 174 až 527, 180 až 527 nebo 220 až 527 proteinu lidského tkáňového plazminogenového aktivátoru.

Výhodněji způsob podle vynálezu se také charakterizuje tím, že sekvence DNA molekuly K2S obsahuje nebo se skládá z následující sekvence:

TCTGAGGGAAACAGTGACTGCTACTTTGGGAATGGGTCAGCCTACCGTGGCACGCA

CAGCCTCACCGAGTCGGGTGCCTCCTGCCTCCCGTGGAATTCCATGATCCTGATAGG

CAAGGTTTACACAGCACAGAACCCCAGTGCCCAGGCACTGGGCCTGGGCAAACATA

ATTACTGCCGGAATCCTGATGGGGATGCCAAGCCCTGGTGCCACGTGCTGAAGAAC CGCAGGCTGACGTGGGAGTACTGTGATGTGCCCTCCTGCTCCACCTGCGGCCTGAGA ' CAGTACAGCCAGCCTCAGTTTCGCATCAAAGGAGGGCTCTTCGCCGACATCGCCTCC CACCCCTGGCAGGCTGCCATCTTTGCCAAGCACAGGAGGTCGCCCGGAGAGCGGTT CCTGTGCGGGGGCATACTCATCAGCTCCTGCTGGATTCTCTCTGCCGCCCACTGCTTC CAGGAGAGGTTTCCGCCCCACCACCTGACGGTGATCTTGGGCAGAACATACCGGGT GGTCCCTGGCGAGGAGGAGCAGAAATTTGAAGTCGAAAAATACATTGTCCATAAGG AATTCGATGATGACACTTACGACAATGACATTGCGCTGCTGCAGCTGAAATCGGATT CGTCCCGCTGTGCCCAGGAGAGCAGCGTGGTCCGCACTGTGTGCCTTCCCCCGGCGG ACCTGCAGCTGCCGGACTGGACGGAGTGTGAGCTCTCCGGCTACGGCAAGCATGAG GCCTTGTCTCCTTTCTATTCGGAGCGGCTGAAGGAGGCTCATGTCAGACTGTACCCA TCCAGCCGCTGCACATCACAACATTTACTTAACAGAACAGTCACCGACAACATGCTG • · • · · · • · • · · ·

TGTGCTGGAGACACTCGGAGCGGCGGGCCCCAGGCAAACTTGCACGACGCCTGCCA GGGCGATTCGGGAGGCCCCCTGGTGTGTCTGAACGATGGCCGCATGACTTTGGTGGG CATCATCAGCTGGGGCCTGGGCTGTGGACAGAAGGATGTCCCGGGTGTGTACACAA AGGTTACCAACTACCTAGACTGGATTCGTGACAACATGCGACCGTGA (SEQ ID N0:4).

Vynález dále popisuje varianty dříve v textu uvedených molekul nukleových kyselin obsahující degenerovaný kód nebo jeho fragmenty, nukleové kyseliny, které hybridizují s uvedenými nukleovými kyselinami za přísných podmínek, alelické nebo funkční varianty. Vynález také popisuje nukleové kyseliny obsahující uvedenou nukleovou kyselinu K2S fúzovanou s nukleovou kyselinou kódující jinou molekulu proteinu.

Termín „přísné podmínky znamená podmínky, které zaručují více než 85 % homologii, s výhodou více než 90 % homologii (popisuje se v publikaci Sambrook et al, 1989, Molecular Clonning: A Laboratory Manual, 2^nd ed. , Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York). Hybridizace probíhá například v 6x koncentrovaném SSC/5x koncentrovaném Denhardtově roztoku/0,1 % SDS (dodecylsulfát sodný) při teplotě 65 °C. Stupeň přísnosti se dosáhl v kroku promývání.

Tak například v případě selekce sekvencí DNA s 85 % nebo vyšší homologii jsou vhodné podmínky 0,2x koncentrovaný SSC/0,01 % SDS/teplota 65 °C a v případě selekce sekvencí DNA s 90 % homologii jsou vhodné podmínky 0,lx koncentrovaný SSC/0,01 % SDS/teplota 65 °C. Složení uvedených činidel se popisuje v publikaci Sambrook et al, 1989, Molecular Clonning: A Laboratory Manual, 2^nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York.

Jinou aktivátoru nebo se důležitou předmětnou věcí vynálezu je lidského tkáňového plazminogenu, který skládá z proteinu kringle 2(4.) plus varianta obsahuj e serinové ·· 9999

99 » 9 9 1

I 9 99

PROTEINÁZy (5.) (zkráceno K2S) nebo jeho varianty, fragmentu, funkční varianty, alelické varianty, podjednotky, chemického derivátu, fúzního proteinu nebo glykosylační varianty.

Číslování/pojmenování oblastí je podle databanky GenbankGI 137119 nebo podle publikace Nátuře 301 (5897), 214-221 (1983), kde oblast „kringle 2 je od aminokyseliny 176 do 262 a proteinázová oblast od 276-527. Tak výhodná molekula K2S podle vynálezu může zahrnovat aminokyseliny 176 až 527 obsahující mezi aminokyselinami kringle 2 a proteináza (aminokyseliny 263 až 275, příklady jsou na obrázku (struktura A)). Molekula K2S podle vynálezu zahrnuje minimální část oblasti kringle 2 a proteinázovou oblast, která si uchovává proteinázovou aktivitu a vazebnou aktivitu na fibrin (měřeno způsobem, jak se popisuje v popisu vynálezu a v příkladu) . Uvedená molekula K2S podle vynálezu obsahuje aminokyseliny SEGN nebo SEGNSD ve své N-terminální části (popisuje se dále v textu). Výhodná molekula K2S nezahrnuje aminokyseliny 1 až 3 nebo 1 až 5 molekuly tPA. Molekula K2S podle vynálezu má aminokyselinu Asn v polohách 177 a 184, to znamená nevyžaduje úpravy, jak se popisuje v publikaci Waldenstrom, Μ., E. Holmgren, A. Attersand, C. Kalderen, B. Lowenadler, B. Raden, L. Hansson, and G Pohl. 1991. Synthesis and secretion of a fibrinolytically active tissue-type plasminogen activator variant in Escherichia coli. Gene 99: 243-248, za účelem zlepšení produktivity metodou podle vynálezu. Tak molekula K2S podle vynálezu má přirozenou aminokyselinovou sekvenci (neobsahuje mutaci) na rozdíl od molekul popsaných v předchozím stavu techniky. Nejvýhodnější je, když uvedená molekula K2S podle vynálezu je molekulou charakterizovanou přirozenou aminokyselinovou sekvencí nebo její částí, neobsahuje aminokyseliny 1 až 3 ani 1 až 5 z tPA a obsahuje Nterminální aminokyseliny SEGN nebo SEGNSD za účelem zlepšit produkovatelnost a/nebo správné balení molekuly.

9 9999

9 9« • •99 · 9 · ·· ·

9999 · 9 · 99 9

99999999 «99 9

9999 999 «999

99 99 9 99 99 • 999

Je podstatné, že protein K2S podle vynálezu obsahuje Nterminální část peptidu charakterizovaného aminokyselinovou sekvencí SEGN, která s výhodou umožňuje běžnou produkci metodou, jak se popisuje shora v textu, což vede ke vzniku správně baleného, vylučovaného proteinu K2S. Uvedené 4 aminokyseliny charakterizované sekvencí SEGN mohou mít jednu nebo několik aminokyselin delší N-konec, avšak uvedené aminokyseliny se musí nacházet v N-terminální části. Uvedené aminokyseliny charakterizované SEGN mohou nést bodovou mutaci nebo mohou být substituovány nepřirozenou aminokyselinou.

V jiném důležitém provedení vynálezu se popisuje protein K2S charakterizovaný tím, že obsahuje aminokyseliny definované sekvencí SEGN nebo jeho variantu nebo fragment, funkční variantu, alelickou variantu, podjednotku, chemický derivát, fúzní protein nebo glykosylační variantu.

Takové fragmenty jsou uvedeny na obrázku č. 10 (struktura B-l) a obrázku č. 11 (struktura B-2) obsahují aminokyseliny 193 až 527. Struktura B-l má přirozenou aminokyselinu Cys v poloze 261, kde v případě struktury B-2 je aminokyselina substituována aminokyselinou Ser. Další fragmenty podle vynálezu obsahující aminokyseliny 220 až 527 (zobrazeno na obrázku č. 14, struktura C) nebo aminokyseliny 260 až 527 (zobrazeno na obrázku č. 15, struktura D) se mohou upravit podle vynálezu přidáním aminokyselin SEGN a/nebo substitucí aminokyseliny v poloze 261 aminokyselinou Ser. Odborník může určit minimální délku molekuly K2S podle vynálezu za účelem zachovat její biologickou funkci a vytvořit molekulu K2S se zjednodušenou možností produkce a/nebo správným sbalením tím, že se do N-terminální části přidají aminokyseliny SEGN. Tak v jiném výhodném provedení vynálezu se uvádí minimální

9999 ·· 9999

molekula K2S, která ve své N-terminální části obsahuje sekvenci SEGN.

V jiném provedení vynálezu se popisuje protein K2S charakterizovaný tím, že obsahuje aminokyseliny definované sekvencí SEGNSD nebo jeho varianta nebo fragment, funkční varianta, alelická varianta, podjednotka, chemický derivát, fúzní protein nebo glykosylační varianta. Takové fragmenty se popisují na obrázku č. 12 (struktura B-3) a č. 13 (struktura B-4) a zahrnují aminokyseliny 191 až 527. Struktura B-3 obsahuje v poloze 261 přirozenou aminokyselinu Cys, kde struktura B-4 je uvedená aminokyselina substituována aminokyselinou Ser. Další fragmenty podle vynálezu obsahující aminokyseliny 220 až 527 (zobrazeno na obrázku č. 14, struktura C) nebo obsahující aminokyseliny 260 až 527 (zobrazeno na obrázku č. 15, struktura D) se mohou upravit podle vynálezu přidáním aminokyselin SEGNSD a/nebo substitucí aminokyseliny Cys v poloze 261 aminokyselinou Ser. Odborník může stanovit minimální délku molekuly K2S podle vynálezu za účelem uchovat jeho biologickou funkci a vytvořit molekulu K2S se zlepšenou možností produkce a/nebo správného balení přidáním aminokyselin SEGNSD do N-terminální oblasti. Tak jiné výhodné provedení vynálezu popisuje minimální molekulu K2S se sekvencí SEGNSD v N-terminální oblasti.

V jiném výhodném provedení vynálezu se popisuje protein K2S obsahující protein charakterizovaný následující aminokyselinovou sekvencí nebo jeho variantou, fragmentem, funkční variantou, alelickou variantou, podjednotkou, chemickým derivátem nebo glykosylační variantou:

SEGNSDCYFGNGSAYRGTHSLTESGASCLPWNSMILIGKVYTAQNPSAQALGLGKHNY

CRNPDGDAKPWCHVLKNRRLTWEYCDVPSCSTCGLRQYSQPQFRIKGGLFADIASHPW qaaifakhrrspgerflcggilisscwilsaahcfqerfpphhltvilgrtyrvvpgeeeq kfevekyivhkefdddtydndiallqlksdssrcaqesswrtvclppadlqlpdwtec φφ φφφφ φφ ··*· φφ φ» • φ φ φ φφ φ φφ φ φφφφ φφφ φφφ φφφφφφφ φφφφ φφ ©« φφ · ©« φφ

ELSGYGKHEALSPFYSERLKEAHVRLYPSSRCTSQHLLNRTVTDNMLCAGDTRSGGPQA NLHDACQGDSGGPLVCLNDGRMTLVGnSWGLGCGQHDVPGVYTKVTNYLDWlRDNM RP* (SEQ ID NO: 11).

Podle vynálezu značka * znamená STOP (kódováno stop kodonem). Tato moleula K2S je zobrazena na obrázku č. 8.

Jedna varianta molekuly K2S podle vynálezu zahrnuje fúzní protein K2S fúzovaný s jinou molekulou proteinu.

Jiné více výhodné provedení vynálezu popisuje protein K2S obsahující protein charakterizovaný následující aminokyselinovou sekvencí:

SEGNSDCYFGNGSAYRGTHSLTESGASCLPWNSMILIGKVYTAQNPSAQALGLGKHNY

CRNPDGDAKPWCHVLKNRRLTWEYCDVPSCSTCGLRQYSQPQFRIKGGLFADIASHPW

QAAIFAKHRRSPGERFLCGG1LISSCWILSAAHCFQERFPPHHLTVILGRTYRWPGEEEQ

KFEVEKYTVHKEFDDDTYDNDIALLQLKSDSSRCAQESSWRTVCLPPADLQLPDWTEC

Vř:.

ELSGYGKHEALSPFYSERLKEAHVRLYPSSRCTSQHLLNR.TVTDNMLCAGDTRSGGPQA NLHDACQGDSGGPLVCLNDGRMILVGnSWGLGCGQKDVPGVYTKVTNYLDWIRDNM RP* (SEQ FD NO: 11).

Uvedené molekuly K2S mohou být kódovány molekulou DNA, jak se popisuje shora v textu.

Jiný důležitý aspekt vynálezu je molekula DNA charakterizovaná tím, že kóduje:

a) proteinem OmpA nebo jeho funkční derivát,

b) polypeptid obsahující oblast „kringle 2 a oblast serinové proteinázy proteinu aktivátoru tkáňového plazminogenu.

Molekula DNA podle vynálezu je také charakterizována tím, že sekvence DNA obsahuje nebo se skládá z následující sekvence

DNA kódující OmpA a K2S nebo její funkční variantu způsobenou degenerovaným nukleotidovým kódem:

4 4 4 • 4 4 44 4 • »· · ♦ ♦ • 4 44 4 4 • * 4 4 4 4 4 •• 4 4 4 4

4« 44

ATGAAAAAGACAGCTATCGCGATTGCAGTGGCACTGGCTGGTTTCGCTACCGTGGCC

CAGGCGGCCTCTGAGGGAAACAGTGACTGCTACTTTGGGAATGGGTCAGCCTACCG

TGGCACGCACAGCCTCACCGAGTCGGGTGCCTCCTGCCTCCCGTGGAATTCCATGAT

CCTGATAGGCAAGGTTTACACAGCACAGAACCCCAGTGCCCAGGCACTGGGCCTGG

GCAAACATAATTACTGCCGGAATCCTGATGGGGATGCCAAGCCCTGGTGCCACGTG

CTGAAGAACCGCAGGCTGACGTGGGAGTACTGTGATGTGCCCTCCTGCTCCACCTGC

GGCCTGAGACAGTACAGCCAGCCTCAGTTTCGCATCAAAGGAGGGCTCTTCGCCGA

CATCGCCTCCCACCCCTGGCAGGCTGCCATCTTTGCCAAGCACAGGAGGTCGCCCGG

AGAGCGGTTCCTGTGCGGGGGCATACTCATCAGCTCCTGCTGGATTCTCTCTGCCGC

CCACTGCTTCCAGGAGAGGTTTCCGCCCCACCACCTGACGGTGATCTTGGGCAGAAC

ATACCGGGTGGTCCCTGGCGAGGAGGAGCAGAAATTTGAAGTCGAAAAATACATTG

TCCATAAGGAATTCGATGATGACACTTACGACAATGACATTGCGCTGCTGCAGCTGA

AATCGGATTCGTCCCGCTGTGCCCAGGAGAGCAGCGTGGTCCGCACTGTGTGCCTTC

CCCCGGCGGACCTGCAGCTGCCGGACTGGACGGAGTGTGAGCTCTCCGGCTACGGC

AAGCATGAGGCCTTGTCTCCTTTCTATTCGGAGCGGCTGAAGGAGGCTCÁŤGTCAGA

CTGTACCCATCCAGCCGGTGCACATCACAACATTTACTTAACAGAACAGTCACCGAC

AACATGCTGTGTGCTGGAGACACTCGGAGCGGCGGGCCCCAGGCAAACTTGCACGA

CGCCTGCCAGGGCGATTCGGGAGGCCCCCTGGTGTGTCTGAACGATGGCCGCATGA

CTTTGGTGGGCATCATCAGCTGGGGCCTGGGCTGTGGACAGAAGGATGTCCGGGGT

GTGTACACAAAGGTTACCAACTACCTAGACTGGATTCGTGACAACATGCGACCG .

(SEQ ID No :2)

Uvedená molekula DNA kóduje následující fúzní protein OmpA a K2S. Uvedený fúzní protein OmpA a K2S charakterizovaný tím, že obsahuje protein charakterizovaný následující aminokyselinovou sekvencí nebo jejím fragmentem, funkční variantou, alelickou variantou, podjednotkou, chemickým derivátem nebo glykosylační variantou tvoří důležitou část vynálezu:

MKKTAIAIAVALAGFATVAQAASEGNSDCYFGNGSAYRGTHSLTESGASCLPWNSMILI

GKVYTAQNPSAQALGLGKHNYCRNPDGDAKPWCHVLKNRRLTWEYCDVPSCSTCGLR

QYSQPQFRIKGGLFADIASHPWQAAIFAKHRRSPGERFLCGGILISSGWILSAAHCFQERF

PPHHLTVILGRTYKWPGEEEQKFEVEKYIVIÍKEFDDDIYDNDIALLQLKSDSSRCAQES

SWRTVCLPPADLQLPDWTECELSGYGKHEALSPFYSERLKEAHVRLYPSSRCTSQHLL

NRTVTDNMlLCAGDTRSGGPQANLHDACQGDSGGPLVCLNDGRMTLVGUSWGLGCGQ

KDVPGVYTKVTNYLDWIRDNMRPG (SEQ ID N0:8) •Φ φφφφ φ φ φφφφ φφ φφ φφφφφφ φφφ φ φφφφ φφφ φφφ φφφφφφφφ φφφ φ φφφφφφφ φφφφ φ· φ· φφ φ φφ φφ

Jiné výhodné provedení vynálezu popisuje molekulu DNA podle vynálezu charakterizovanou tím, že uvedená sekvence DNA popsaná v odstavci b) kóduje alespoň 90 % aminokyselin 87 až 527 proteinu aktivátoru lidského tkáňového plazminogenu (označení GI 137119 nebo podle publikace Nátuře 301 (5897),

214-221 (1983).

Jiné provedení podle vynálezu popisuje molekulu DNA podle vynálezu charakterizovanou tím, že uvedená sekvence DNA popsaná v odstavci b) kóduje alespoň 90 % aminokyselin 174 až 527 proteinu aktivátoru lidského tkáňového plazminogenu.

Jiné provedení podle vynálezu popisuje molekulu DNA podle vynálezu charakterizovanou tím, že uvedená sekvence DNA popsaná v odstavci b) kóduje alespoň 90 % aminokyselin 180 až 527 proteinu aktivátoru lidského tkáňového plazminogenu.

Jiné provedení podle vynálezu popisuje molekulu DNA podle vynálezu charakterizovanou tím, že uvedená sekvence DNA popsaná v odstavci b) kóduje alespoň 90 % aminokyselin 220 až 527 proteinu aktivátoru lidského tkáňového plazminogenu.

Jiné provedení podle vynálezu popisuje molekulu DNA podle vynálezu charakterizovanou tím, že uvedená sekvence DNA popsaná v odstavci a) hybridizuje s následující sekvencí za přísných podmínek:

ATGAAAAAGACAGCTATCGCGATTGCAGTGGCACTGGCTGGTTTCGCTACCGTGGCC

CAGGCGGCC (SEQ ID NO:3).

Jiné provedení podle vynálezu popisuje molekulu DNA podle vynálezu charakterizovanou tím, že uvedená sekvence DNA popsaná v odstavci a) se skládá z následující sekvence:

ATGAAAAAGACAGCTATCGCGATTGCAGTGGCACTGGCTGGTTTCGCTACCGTGGCC CAGGCGGCC (SEQ ID NO:3).

0· ·0 •000 00 0 00 « ί ί ·**· t ί I . ϊ ϊ ’· · 0 0 0 000 0000

0· 0· 00 0 00 00

Jiné provedeni podle vynálezu popisuje molekulu DNA podle vynálezu charakterizovanou tím, že uvedená sekvence DNA popsaná v odstavci b) hybridizuje s jednou z následujících za přísných podmínek:

·· 00··

TCTGAGGGAAACAGTGACTGCTACTTTGGGAATGGGTCAGCCTACCGTGGCACGCA

CAGCCTCACCGAGTCGGGTGCCTCCTGCCTCCCGTGGAATTCCATGATCCTGATAGG

CAAGGTTTACACAGCACAGAACCCCAGTGCCCAGGCACTGGGCCTGGGCAAACATA

ATTACTGCCGGAATCCTGATGGGGATGCCAAGCCCTGGTGCCACGTGCTGAAGAAC

CGCAGGCTGACGTGGGAGTACTGTGATGTGCCCTCCTGCTCCACCTGCGGCCTGAGA

CAGTACAGCCAGCCTCAGTTTCGCATCAAAGGAGGGCTCTTCGCCGACATCGCCTCC

CACCCCTGGCAGGCTGCCATCTTTGCCAAGCACAGGAGGTCGCCCGGAGAGCGGTT

CCTGTGCGGGGGCATACTCATCAGCTCCTGCTGGATTCTCTCTGCCGCCCACTGCTTC

CAGGAGAGGTTTCCGCCCCACCACCTGACGGTGATCTTGGGCAGAACATACCGGGT ggtccctggcgaggaggagcagaaatttgáagtcgaaaaatacattgtccataágg

AATTCGATGATGACACTTACGACAATGACATTGCGCTGCTGCAGCTGAAATCGGATT

CGTCCCGCTGTGCCCAGGAGAGCAGCGTGGTCCGCACTGTGTGCCTTCCCCCGGCGG

ACCTGCAGCTGCCGGACTGGACGGAGTGTGAGCTCTCCGGCTACGGCAAGCATGAG

GCCTTGTCTCCTTTCTATTCGGAGCGGCTGAAGGAGGCTCATGTCAGACTGTACCCA

TCCAGCCGCTGCACATCACAACATTTACTTAACAGAACAGTCACCGACAACATGCTG

TGTGCTGGAGACACTCGGAGCGGCGGGCCCCAGGCAAACTTGCACGACGCCTGCCA

GGGCGATTCGGGAGGCCCCCTGGTGTGTCTGAACGATGGCCGCATGACTTTGGTGGG catcatcagctggggcctgggctgtggacagaaggatgtcccgggtgtgtacacaa

AGGTTACCAACTACCTAGACTGGATTCGTGACAACATGCGACCGTGA (SEQ ID N0:4).

Jiné provedení podle vynálezu popisuje molekulu DNA podle vynálezu charakterizovanou tím, že uvedená sekvence DNA popsaná v odstavci b) se skládá z následující sekvence:

TCTGAGGGAAACAGTGACTGCTACTTTGGGAATGGGTCAGCCTACCGTGGCACGČA

CAGCCTCACCGAGTCGGGTGCCTCCTGCCTCCCGTGGAATTCCATGATCCTGATAGG * · · · · · ·· · · · « • · * • φ φ > φ· φφ

CAAGGTTTACACAGCACAGAACCCCAGTGCCCAGGCACTGGGCCTGGGCAAACATA ATTACTGCCGGAATCCTGATGGGGATGCCAAGCCCTGGTGCCACGTGCTGAAGAAC CGCAGGCTGACGTGGGAGTACTGTGATGTGCCCTCCTGCTCCACCTGCGGCCTGAGA CAGTACAGCCAGCCTCAGTTTCGCATCAAAGGAGGGCTCTTCGCCGACATCGCCTCC CACCCCTGGCAGGCTGCCATCTTTGCCAAGCACAGGAGGTCGCCCGGAGAGCGGTT , CCTGTGCGGGGGCATACTCATCAGCTCCTGCTGGATTCTCTCTGCCGCCCACTGCTTC CAGGAGAGGTTTCCGCCCCACCACCTGACGGTGATCTTGGGCAGAACATÁCCGGGT GGTCCCTGGCGAGGAGGAGCAGAAATTTGAAGTCGAAAAATACATTGTCCATAAGG AATTCGATGATGACACTTACGACAATGACATTGCGCTGCTGCAGCTGAAATCGGATT CGTCCCGCTGTGCCCAGGAGAGCAGCGTGGTCCGCACTGTGTGCCTTCCCCCGGCGG ACCTGCAGCTGCCGGACTGGACGGAGTGTGAGCTCTCCGGCTACGGCAAGCATGAG GCCTTGTCTCCTTTCTATTCGGAGCGGCTGAAGGAGGCTCATGTCAGACTGTACCCA TCCAGCCGCTGCACATCACAACATTTACTTAACAGAACAGTCACCGACAACATGCTG TGTGCTGGAGACACTCGGAGCGGCGGGCCCCAGGCAAACTTGCACGACGCCTGCCA GGGCGATTCGGGAGGCCCCCTGGTGTGTCTGAACGATGGCCGCATGACTTTGGTGGG CATCATCAGCTGGGGCCTGGGCTGTGGACAGAAGGATGTCCCGGGTGTGTACACAA AGGTTACCAACTACCTAGACTGGATTCGTGACAACATGCGACCGTGA (SEQ ID N0:4).

Jiné výhodné provedení vynálezu zahrnuje vektor obsahující sekvenci DNA podle vynálezu.

Jiné výhodné provedení vynálezu zahrnuje vektor podle vynálezu, kde uvedené sekvenci předchází promotor lac a ribozomální vazebné místo. Vhodné vektory podle vynálezu zahrnují, ale nejsou omezeny na virové vektory, jako je například vakcínie, virus „Semliki Forest virus a adenovirus, fágemidové vektory a podobně. Výhodnými vektory, které je možné použít v mikroorganismu E. coli, ale také v libovolném jiném prokaryontním hostiteli je pPROTet.E, pPROLar.A, členi rodiny pBAD, rodiny pSE, pQE a pCAL.

Jiné výhodné provedení vynálezu popisuje vektor pComb3HSS obsahující DNA podle vynálezu, kde exprese proteinu gp III je

0 0 0 010 *0 00

0 · 0 00 · 00 0 • • 00 000 000 Ο Ο 00000000 »·0 0

-J 0000 000 00·· • 0 00 00 0 00 00 potlačena nebo inhibována delecí molekuly DNA kódující uvedený protein gp III nebo pomocí stop kodonu mezi genem kódujícím polypeptid, který obsahuje oblast „kringle 2 a oblast serinové proteinázy proteinu aktivátoru tkáňového plazminogenu a genu proteinu III.

Jiné provedení vynálezu popisuje prokaryontní hostitelskou buňku obsahující molekulu DNA podle vynálezu.

Jiné provedení vynálezu podle popisuje prokaryontní hostitelskou buňku obsahující vektor podle vynálezu.

Jiné provedení vynálezu popisuje hostitelskou buňku mikroorganizmu E. coli obsahující molekulu DNA podle vynálezu.

Jiné provedení vynálezu popisuje hostitelskou buňku mikroorganizmu E. coli obsahující vektor podle vynálezu.

Jiné provedení vynálezu popisuje použití molekuly DNA nebo vektoru nebo hostitelské buňky podle vynálezu při způsobu produkce polypeptidů, které vykazují aktivitu aktivátoru tkáňového plazminogenu.

Jiné provedení vynálezu popisuje použití podle vynálezu, kde uvedenou metodou je způsob podle vynálezu.

Jinou předmětnou věcí vynálezu je farmaceutický prostředek obsahující látku získatelnou způsobem podle vynálezu a farmaceuticky přijatelné ekcipienty a nosiče. Příkladem uvedené látky je molekula K2S popsaná shora v textu. Termín „farmaceuticky přijatelný nosič je běžná farmaceutická pomocná látka nebo doplněk užívaný při výrobě farmaceutických prostředků. Takové farmaceuticky přijatelné sloučeniny zahrnují například sacharidy, jako je glukóza, sacharóza nebo

99·· «9 ♦··* «9 9«

999« «9 9 99 9

99 999 99· * ·« · « » · » ♦ · · ·· »« »» » »· *· dextrany, antioxidanty, jako je kyseliny askorbová nebo glutathion, chelatační činidla, molekulovou hmotnost nebo jiné proteiny vykazující nízkou stabilizátory nebo pomocné látky (popisuj e se například

Remington' sPharmaceuticai Sciences, 1990, 18^th ed v publikaci Mack Publ.,

Easton)). Uvedený farmaceutický prostředek podle vynálezu se může s výhodou aplikovat intravenózně jako jedna dávka, například jako jediná dávka intravenózně po dobu 5 až 10 sekund.

Vynález dále popisuje použití látky, kterou je možné získat způsobem podle vynálezu při výrobě léčebného prostředku vhodného pro léčbu mozkové příhody, srdečního infarktu, akutního infarktu myokardu, pulmonární embolie, libovolné okluze arterií, jako je okluze koronárních arterií, okluze intrakranálních arterií (například mozkové artérie), periferně okludované arterie, trombóza hlubokých cév nebo příbuzná onemocnění spojená s nežádoucí tvorbou krevních sraženin.

Přehled obrázků na výkrese

Na obrázku č. 1 je zobrazeno ověření správnosti produkce amplifikacé PCR genu K2S z vektoru p51-3 za použití primerů SK2/174 a asSP. V dráze 1 je markér o velikosti 1 kb (Roche Molecular Biochemicals, Indianapolis, IN) . Do dráhy 2 se aplikoval 1 μΐ amplifikovaného produktu. Je možné pozorovat pouze jediný pruh o velikosti 1110 pb. Elektroforéza se

uskutečnila na 1% agarózovém gelu.
Na obrázku č. 2	je v dráze	3 zobrazena	identifikace
začleněného genu K2S	obsahuj ícího	1110	bp (*)	po	štěpení
pComb3H-K2S restrikčním	enzymem Sfi	I. V	dráze 2	je	zobrazen
neštěpený pComb3H-K2S.	Elektroforéza	se	uskutečnila	na 1 %

agarózovém gelu.

·« ···· ·· 4··· ·» ·* • · · · « ·

9 99 9 9

9 9 9 9 9 9

9 9 9 9 9

99 99

9 9 9

9 9 9

9 9 9 9

9 9 9 9

99 99

Na obrázku č. 3 je zobrazeno schéma pComb3H-K2S zobrazující dvě klonovací místa Sfi I, do kterých se začlenil gen K2S. Dále je znázorněna signální sekvence (OmpA), místo vázající se na ribozom (RIBS), promotor lac a gen gpIII.

Na obrázku č. 4 je znázorněn schématický diagram mutačního místa na rozhraní mezi geny K2S a gpIII v pComb3H-K2S. Hybridizační místo pComb3H-K2S je vázáno na sadu mutačních primerů (msTPA a masTPA) obsahující upravené oligonukleotidy (podtrženo). Po uskutečnění cyklu amplifikace se místo 1 Sfi I (tužné písmo) upravilo a ztratilo se v nově syntetizovaném řetězci.

Obrázek č. 5 zobrazuje chyrykterizaci nově syntetizovaného MpComb3H-K2S restrikčním enzymem Sfi I. Jediný pruh obsahující 4 319 bp, který odpovídá jedinému místu štěpení MpComb3H-K2S se pozorovalo v dráze 3. Zviditelnil se nezačleněný K2S, jako pruh obsahující 1 110 bp. V dráze 1 je markér o velikosti 1 kb. V dráze 2 je neštěpený MpComb3H-K2S. Elektroforéza se uskutečnila na 1 % agarózovém gelu.

Na obrázku č. 6 je zobrazena identifikace imunologického reaktivního pruhu s proteinem odvozeným z rekombinantní DNA izolovaného ze supernatantu kultury XM[K2S] s ovčí anti-tPA konjugovaným s HRP. V dráze 1 je 40 ng tPA standardního melanomu (86/670), který vykazuje reaktivní pruh s molekulovou hmotností 70 000. Částečně čištěný a koncentrovaný supernatant kultury z netransformovaných buněk E. coli XLl-Blue a XM[K2S] se aplikovaly do dráhy 2 respektive 3. Odlišný reaktivní pruh se demonstroval v dráze 3 a jeho molekulová hmotnost je 39 000.

• · ···· ··· · ·· · · ♦ · · · ·· · · · ···· • · ·· · ·· ··

Na obrázku č. 7 je znázorněno stanovení molekulové hmotnosti extrabuněčného r-K2S, který nese aktivní oblast serinové proteinázy, elektroforézou kopolymerizovaného plazminogenu na polyakrylovém gelu. Dráha 1 obsahovala označené standardy molekulové hmotnosti (xlO^-3) , SDS-6H (Sigma, Saint Louis, Mo) . Do dráhy 2 se naneslo 50 pg 55 % saturovaného supernatantu kultury Xl-1 Blue, Xl-1 Blue transformovaného pComb3HSS sráženého síranem amonným a do dráhy 2, 3 a 4 se nanesl XM[K2S]. Dráha 5 obsahovala 50 mlU tPA standardního melanomu (86/670). Transparentní zóny štěpeného plazminogenu v polyakrylamidovém gelu jsou viditelné pouze v dráze 4. Mají molekulovou hmotnost 34 000 a 37 000 (B) a v dráze 5 o molekulové hmotnosti 66 000 a 72 000 (A) .

Na obrázku č. 8 je znázorněna struktura A (sekvence SEQ ID NO: 11) . Přirozená molekula K2S obsahující aminokyseliny 174 až 527 bez úpravy.

Na obrázku č. 9 je znázorněna struktura B-0 (sekvence SEQ ID NO: 12). Přirozená molekula K2S obsahující aminokyseliny 197 až 527 bez úpravy.

Na obrázku č. 10 je znázorněna struktura B-l (sekvence SEQ ID NO: 13) . Molekula K2S obsahující aminokyseliny 193 až 527 na jejíž část N-konce se přidala struktura B-0 zobrazená na obrázku č. 9.

Na obrázku č. 11 je zobrazena struktura B-2 (sekvence SEQ ID NO: 14). Molekula K2S obsahující aminokyseliny 193 až 527, jako na obrázku č. 10, kde Cys v poloze 261 se zaměnil za Ser.

Na obrázku č. 12 je zobrazena struktura B-3 (sekvence SEQ ID NO: 15) . Molekula K2S obsahuje aminokyseliny 191 až 527, ·· · · · · · · ·· ···· • · ♦ ♦ · · · ·· · · · · * · kde se do části N-konce struktury B-0 popsané na obrázku č. 9 přidaly aminokyseliny SEGNSD.

Na obrázku č. 13 je znázorněna struktura B-4 (sekvence SEQ ID NO: 16). Molekula K2S obsahující aminokyseliny 191 až 527, jak je zobrazena na obrázku č. 12, kde aminokyseliny Cys v poloze 261 je nahrazena Ser.

Na obrázku č. 14 je zobrazena struktura C (sekvence SEQ ID NO: 17) . Přirozená molekula K2S obsahující aminokyseliny 220 až 527 bez úpravy. Tato molekula se může dále upravovat stejným způsobem, jak se popisuje v případě struktury B na obrázcích 10 až 13.

Na obrázku č. 15 je uvedena struktura D (sekvence SEQ ID NO: 18). Přirozená molekula K2S obsahující aminokyseliny 260 až 527 bez úpravy. Tato molekula může být dále upravena stejným způsobem, jak se popisuje v případě struktury B na obrázcích 10 až 13.

Na obrázku č. 16 je uvedena molekula tPA (sekvence SEQ ID NO: 19).

Tabulka č. 1: Detekce molekuly r-K2S fágem pomocí testu sendvičová ELISA

záchytové protilátky	indikátorové protilátky
anti-tPA	anti-Ml3
K2S-(p	VCSM133	K2S-cp	VCSM13
anti- kringle2b	l,12±0,04c	0,12±0,03	l,89±0,02	0,16±0,02
anti-M13	0,17±0,01	0,14+0,05	1,91±0,02	l,88±0,03

^aVCSMl3 se získaly z buněk XL-1 Blue transformovaných pComb3HSS.

• · · · • · 9 99 9 • · · · ·· · «· « _λ 9 9 99 9 9 9 9 9 9 ο ο ········ ··· «

Ο · · · 9 9 9 9 9 9 9 9 ·· ·· 99 9 99 99 ^bPoužily se myší monoklonální protilátky proti kringle2 (16/B). Další protilátky se připravily z ovčího imunoglobulinu. ^cHodnota je průměr absorbance každého vzorku, která se stanovila třikrát.

Příklady provedení vynálezu

Příklad 1:

Materiál a metody

Primery:

Za účelem amplifikovat specifickou část genu tPA syntetizoval se pár primerů SK2/174 [5'GAGGAGGAGGTGGCCCAGGCGGCC TCTGAGGGAAACAGTGAC3^z ] (sekvence SEQ ID NO: 22) a ASSP [5'GAGGAGGAGCTGGCCGGCCTGGCCCGGTCGCATGTTGTCACG3'] (sekvence SEQ ID NO: 23) (Life Technologies, Grand Island, NY) . Primery se navrhly na základě lidského genu tPA vyhledaného v databázi NCBI (gl37119). Primery se syntetizovaly s klonovacím místem Sfi I (podtrženo) takovým způsobem, že čtecí rámec začínající ATG genu gpIII ve fágemidovém vektoru pComb3HSS se udržoval celou začleněnou sekvencí.

Jiný pár primerů určený pro místně řízenou mutagenezi se navrhl tak, že se hybridizoval na sekvenci umístěnou mezi genem K2S a genem III v pComb3H-K2S. Sekvence primerů s mutacemi baží (podtrženo) vhodné pro vytvoření nového stop kodonu jsou MSTPA [5' ACATGCGACCGTCACAGGCCGGCCAG 3 ’] (SEQ ID N0:24) a MASTPA [5 ’ CTGGCCGGCCTGTCACGGTCGCATGT 3 ’] (SEQ ID NO:25).

Amplifikace genu K2S pomocí PCR.

• · · ·

Fujisawa Pharmaceutical, pl reakční směsi PCR. jednotek Taq Biochemicals, se nakonec přidalo 2,5 firmy Roche Molecular

Jeden mikrogram SK2/174 a primerů asSP spolu s 50 ng templátu p51-3 (templát se získal od Dr. Hiroshi Sasaki, Japonsko) se suspendovalo ve 100 K roztoku polymerázy (od

Indíanapolis, IN) . Titrované podmínky amplifikace se iniciovaly skokovým startem při teplotě 85 °C po dobu 4 minut, pak proběhla denaturace při teplotě 95 °C po dobu 50 sekund, extenze při teplotě 72 °C po dobu 1,5 minut. Opakovaně proběhlo 35 kol. Směs se dále inkubovala při teplotě 72 °C po dobu 10 minut. Amplifikovaný produkt o velikosti 1 110 bp se následně čistil použitím čistící sady „QiAquick PCR Purification Kit (QIAGEN, Hilden, Německo). Správnost izolovaného produktu se potvrdila restrikčními enzymy.

Konstrukce fágemidu, který exprimuje K2S.

Čištěný produkt PCR K2S a fágemidu pComb3HSS (získal se od Dr. Carlos F.Barbas, Scripps Institute, USA) se štěpil restrikčním enzymem Sfi I (Roche Molecular Biochemicals, Indíanapolis, IN) za vzniku specifických kohezivních klonovacích míst. Čtyři mikrogramy čištěného produktu PCR se štěpilo 60 jednotkami restrikčního enzymu Sfi I při teplotě 50°C po dobu 18 hodin. V případě pComb3HSS se 20 pg fágemidových vektorů ošetřilo 100 jednotkami restrikčního enzymu Sfi I. Štěpené produkty čištěného produktu PCR K2S a pComb3HSS (přibližně 3 300 bp) se následně čistily na gelu extrakční sadou „QiAquick Gel Extraction Kit (od firmy QIAGEN, Hilden, Německo). Do směsi 0,7 pg pComb3HSS štěpeného restrikčním enzymem Sfi I a 0,9 pg čištěného produktu štěpeného restrikčním enzymem Sfi I se přidalo 5 jednotek T4 ligázy (Roche Molecular Biochemicals, Indíanapolis, IN) . Ligační reakce se inkubovala při teplotě 30 °C po dobu 18 hodin. Nově konstruovaný fágemid se nazval pComb3H-K2S.

• · • · • ··

Transformace E. coli Xl-1 Blue.

Dvě sta mikrolitrů CaCl₂ kompetentních buněk E. coli Xl-1 Blue (Statagene, La Jolla, CA) se transformovalo 70 ng ligovaného nebo mutovaného produktu. Transformované buňky se množily nanesením na agar LB obsahující ampicilin v koncentraci 100 pg/ml a tetracyklin v koncentraci 10 pg/ml (Sigma, Saint Louis, MO) . Po kultivaci při teplotě 37 °C po dobu 18 hodin se vybralo několik kolonií, které jsou rezistentní na antibiotika, a připravila se z nich plazmidová DNA za použití metody alkalické lyže. Každý čištěný plazmid se podrobil analýze, která zjišťovala přítomnost restrikčního místa Sfi

Transformant nesoucí plazmid se správným restrikčním místem Sfi I

O se následně propagoval po dobu 18 hodin při teplotě 37 °C ve 100 ml půdy LM s ampicilinem v koncentraci 100 pg/ml a tetracyklinem 10 pg/ml. Plazmid ve velkém množství se připravil za použiti sady QIAGEN Plasmid Maxi Kit (QIAGEN, Hilden, Německo) . Čištěný plazmid se znovu testoval za účelem zjištění, zda nese specifické restrikční místo Sfi I a sekvenoval se pomocí sekvenační sady „AmpliTaq DNA Polymerase Terminátor Cycle Sequencing Kit (The PerkinElmer Corporation, Forster City, CA).

Místně řízená mutageneze pComb3H-K2S.

Deset nanogramů templátu pComb3H-K2S se smíchalo s 125 ng primerů MSTPA a MASTPA. Do směsi za účelem amplifikace se přidala DNA polymeráza PfuTurbo (Stratagene, La Jolla, CA) v množství 2,5 jednotek. Reakce začala s jedním cyklem při teplotě 95 °C po dobu 30 sekund. Pak následuje 16 cyklů při teplotě 95 °C po dobu 30 sekund, při teplotě 55 °C po dobu 1 minuty a při teplotě 68 sekund po dobu 9 minut. Reakční zkumavka se následně umístila do ledu po dobu 2 minuty. Za • · ·· · · • · · · účelem poškodit templátové řetězce se do amplifikační reakce přidalo 10 jednotek restrikčního enzymu Dpn I (Stratagene, La Jolla, CA) a vše se inkubovalo při teplotě 37 °C po dobu 60 minut. Tento syntetizovaný produkt (MpComb3H-K2S) se dále použil k transformaci buněk mikroorganizmu E. coli XL-1 Blue.

Příprava r-K2S, který se vyjadřuje ve fágu.

použil pomocný

Ί 9 v množství 10

Po transformaci pComb3H-K2S do buněk XL-1 Blue se použila metoda vyjádření ve fágu. Klon buněk mikroorganizmu E. coli XL-1 Blue transformovaný pComb3H-K2S se pomnožil v 10 ml super půdy, která obsahuje ampicilin v koncentraci 100 pg/ml a tetracyklin v koncentraci 10 pg/ml, při teplotě 37 °C až se dosáhlo hodnoty OD při vlnové délce 600 nm 1,5. Bakteriální kultura se následně pomnožila ve 100 ml stejného média a nechala se kultivovat po dobu 2 hodiny. Za účelem infekce transformovaných buněk mikroorganizmu E. coli XL-1 Blue se fág VCSM13 (Stratagene, La Jolla, CA) Po 3 hodinách inkubace se do kultury přidal kanamycin v konečné koncentraci 70 pg/ml. Kultura se nechala míchat při 200 ot./min. po dobu 18 hodin při teplotě 37 °C.

Bakteriofágové, který nesou K2S v gp3(K2S-<p) se pak získaly přidáním 4 % (hmotnost/objem) PEG MW 8 000 (Sigma, Saint

Louis, MO) a 3 % (hmotnost/objem) NaCl. Fág se nakonec resuspendoval ve 2 ml PBS při hodnotě pH 7,4. Počet fágů se stanovilo infekcí buněk mikroorganizmu E. coli XL-1 Blue. Počet jednotek tvořící kolonie v jednom mililitru (cfu/ml) se vypočítal dříve popsaným způsobem (popisuje se v publikaci Lobel, L. I., P. Rausch, I. Trakht, S. Pollak and J. W. Lustbader. 1997. Filamentous phage displaying the extracellular domain of the hLH/CG receptor bind hCG specifically. Endocrinology. 138:1232-1239).

Exprese r-K2S v míchaných nádobách ·· ···· « « · ·

Buňky mikroorganizmu E. coli XL-1 Blue transformované MpComb3H-K2S se kultivovaly ve 100 ml super půdy (3 % (hmotnost/objem) trypton, 2 (hmotnost/objem) kvasinkového

s 55	Q. O	saturovaným
Soeda,	S.,	M. Kakiki,
Rapid	and	High-yield

extraktu a 1 % (hmotnost/objem) MOPS s hodnotou pH 7,0 v přítomnosti ampicilinu (100 pg/ml) při teplotě 37 °C až do okamžiku, kdy se dosáhlo hodnoty. OD při vlnové délce 600 nm 0,8. Pak se vyvolala syntéza proteinu přidáním 1 mM IPTG (Promega, Madison, WI) . Bakterie se dále kultivovaly za stálého míchání při 200 ot./min. po dobu 6 minut při teplotě 30 °C. Supernatant kultury se srážel síranem amonným (popisuje se v publikaci H. Shimeno, and A. Nagamatsu. 1986.

purification of porcine heart tissue-type plasminogen activator by heparin-sepharose chromatography. Life Sci. 39:1317-1324). Sraženina se rozpustila v PBS s hodnotou pH 7,2 a roztok se dialyzoval ve stejném pufru při teplotě 4 °C po dobu 18 hodin. Periplazmické proteiny pocházející z bakteriálních buněk se extrahovaly za použití chloroformového šoku, jak se popisuje v publikaci Ames, G. F., C. Prody, and S. Kustu. .1984. Simple, rapid, and Quantitative release of periplasmic proteins by chloroform. J. Bacteriol. 160: 1181-1183).

Stanovení množství r-K2S imunologickým testem.

Za účelem detekovat r-K2S se pevná fáze potáhla oblastí monoklonální protilátky proti kringle 2 (16/B) (získala se od

Dr. Ute Zacharias, Central Institute og Molecular Biology, Berlin-Buch, Německo). Provedl se blokování a promývání testu ELISA. Do každé prohlubně potažené proti oblasti kringle 2 se přidalo padesát ¹¹ jednotek tvořící kolonie v jednom mililitru standardního protilátkami mikrolitrů 10

K2S-<p. Detekce protilátka-antigen se provedla následujícím φφ φφφφ φφφφ • φφφ φφ · · φ · · ί ·**· . Σ Σ , Σ Σ • φφφ φ φ φ φφφφ φφ φφ φφ φ φφ φφ způsobem. Po promytí se do každé prohlubně přidala buď ovčí anti-M13 konjugovaná s HRP (Pharmacia Biotech, Uppsala, Švédsko) nebo ovčí anti-tPA konjugovaný s HRP (Cedarlane, Ontario, Kanada). Do každé prohlubně se přidal substrát TMB a reakce se nakonec ukončila roztokem H₂SO₄ po 30 minutách inkubace. Jako pozitivní kontrola se použil tPA standardního melanomu 86/670.

Test amidolytické aktivity.

Testovací sada pro detekci amidolytické aktivity tPA se získala od firmy Chromogenix (Molndal, Švédsko). Směs substrátu obsahující plasminogen a S-2251 se použila ke stanovení enzymatické aktivity serinové proteinázy. Ředění 10“² každého vzorku sraženého amoniakem se testovalo se stimulátorem, kterým jsou fragmenty lidského fibrinogenu nebo bez něho. Testovací postup se provedl podle postupu COASET tPA.

Test SDS-PAGE a imunologický přenos.

Dialyzovaný produkt získaný ze supernatantu se dále koncentroval desetkrát pomocí přípravku centrikon 10 (AMICON, Beverly, MA) . Koncentrovaný vzorek se podrobil separaci proteinu pomocí testu SDS-PAGE na 15 % dělícím gelu v redukčním pufru a pak následuje elektroblotování na nitrocelulóze. Nitrocelulóza se pak blokovala 4 % odtučněným mlékem po dobu 2 hodin. Za účelem detekovat r-K2S, se vhodné ředění ovčích anti-tPA konjugovaných s HRP aplikovalo na nitrocelulózu. Imunoreaktivní pruh se vizualizoval citlivým detekčním systémem „Amplified Opti-4CN kit (BIORAD, Hercules, CA) .

9999

9999

Elektroforéza kopolymerizovaného plazminogenu na polyakrylovém gelu.

gel se kopolymerizoval se popisuje v publikaci

Electrophoretic analysis % dělící polyakrylamidový s plazminogenem a želatinou, jak Heussen C., and E. B. Dowdle. 1984.

of plasminogen activators in polyacrylamide gels containing sodium dodecyl sulfáte nd copolymerized substrates. Anal. Biochem. 102:196-202.

Elektroforéza se provedla při teplotě 4°C při konstantním proudu 8 mA. Zbytkový SDS se z gelu odstranil po jemném míchaní při teplotě místnosti po dobu 1 hodiny v prostředí 2,5 % Triton X-100. Pak se gel inkuboval v 0,1 M glycinu v NaOH při hodnotě pH 8,3 po dobu 5 hodin při teplotě 37 °C. Nakonec se gel obarvil a odbarvil použitím standardního barvícího systému Coomassie briliantová modř (R-250). Místo výskytu peptidu, který vykazuje enzymatickou aktivitu, se nezbarvilo na rozdíl od modře zbarveného pozadí.

Výsledky

Konstrukce vektoru, který nese gen K2S. Z vektoru p51-3 se amplifikovala část tPA obsahující kringle 2 plus serinová PROTEINÁZa (Ser v poloze 174 v oblasti kringle 2 až Pro v poloze 527 v serinové PROTEINÁZe) za použití primerů SK2/174 a ASSP. Aplifikovaný produkt o velikosti 1110 bp se demonstroval elektroforézou na agarózovém gelu (zobrazeno na obrázku č. 1, dráha 2) a začlenil se do fágemidu pComb3HSS pomocí štěpících míst rozeznávaných restrikčním enzymem Sfi I na 5'a 3konci ve správném čtecím rámci. Tak se vytvořil nový vektor pComb3H-K2S nesoucí K2S. V tomto vektoru je K2S lemován signální sekvencí OmpA a sekvencí genu gp3. Správné začlenění K2S se ověřilo restrikční analýzou pomocí restrikčního enzymu • · 999 9

9 9 99 9

99 •999 9 9 9 9 9 · ~_r 9 9 99 9 9 9 9 9 9 ········ 999 9 s '-s 9 9 9 9 9 9 q 9 9 9 9 ·· 99 9 99 99

Sfi I (zobrazeno na obrázku č. 2, dráha 3), analýzou PCR (demonstrace jediného pruhu obsahující 1110 bp) a sekvenací DNA. Schématický digram mapy pComb3H-K2S je uveden na obrázku

č. 3.

rK2S vyjádřený ve fágu.

K infekci buněk mikroorganizmu E. coli XL-1 Blue, X[K2S] transformovaných pComb3H-K2S se použil vláknitý fág VCSM13. VCSM13 se pomnožil a začleněný fúzní protein K2S-gp3 se zpracoval při balení viru. Získaný rekombinantní fág (K2S-cp) poskytl koncentraci 5,4 x 10¹¹ jednotek tvořících kolonie v jednom mililitru, což se stanovilo opětnou infekcí buněk mikroorganizmů E. coli XL-1 Blue s fágy, který se srážely pomocí PEG. U těchto rekombinantních fágových částic se ověřila exprese r-K2S pomocí testu sendvičová ELISA. Heterogenní protein K2S vázaný na fágu je rozeznáván monoklonální protilátkou určenou proti oblasti kringle 2 (16/B) použitím detekčního systému ovčí anti-tPA konjugované s HRP. Absorbance tohoto testu byla 1,1210,03 (tabulka č. 1). Množství K2S detekovaného v 10¹² částic fága odpovídá 336 ng proteinu ve vztahu k tPA standardního melanomu. Za účelem potvrdit, že fúzní protein K2S-gp3 je spojen s fágovými částicemi, ovčí protilátka anti-tPA konjugovaný s HRP se nahradily ovčí protilátkou proti M13 konjugovanou s HRP. Tato imunologický reakce vykazovala absorbanci 1,8910,07 (tabulka č. 1) . Naopak, jestliže se jako záchytová protilátka použila ovčí protilátka proti M13, pak se pozorovala extrémně nízká koncentrace K2S s ovčí protilátkou anti-tPA konjugovanou s HRP. Absorbance byla pouze 0,1710,01 (tabulka č. 1). To naznačuje, že pouze menšina čištěných fágových částic nesla fúzní protein K2S-gp3. Jako negativní kontrola se použil VCSM13 připravený z netransformovaných buněk mikroorganizmu E. coli XL-1 Blue.

9999

99 •999 99 9 99 ·« ·9 999 999

99 999 99 «9 9 9

9999 999 999 9 •9 99 99 9 99 99

9999

Konstrukce MpComb3H-K2S.

Pomocí mutagenních primerů (msTPA a masTPA) se vytvořil mezi K2S a gp3 v pComb3H-K2S stop kodon (zobrazeno na obrázku č.4). Za účelem obohatit nově syntetizovaný a mutovaný MpComb3H-K2S se amlifikační směs štěpila restrikčním enzymem Dpn I, aby se degradoval metylovaný templát pComb3H-K2S (restrikční enzym Dpn I preferuje metylovanou DNA) . Po transformaci buněk XL-1 Blue mikroorganizmu E. coli pomocí MpComb3H-K2S se vybral transformant XM[K2S] za účelem dalšího studia. Následkem substituce párů baží se jedno místo štěpení Sfi I blízko 3'konci genu K2S ztratilo následkem místně řízené mutageneze. Lineární verze MpComb3H-K2S štěpená restrikčním enzymem Sfi I se pozorovala ve vzdálenosti odpovídající velikosti 4 319 bp, aniž se objevil začleněný fragment v genu K2S (zobrazeno na obrázku č. 5, dráha 3) . Tak gen K2S v MpComb3H-K2S se exprimoval ve formě fúze, která neobsahuje gp3, v XM[K2S].

Exprese a čištění K2S.

Exprese K2S v XM[K2S] se vyvolala pomocí IPTG. r-K2S se detekoval použitím testu ELISA v periplazmatickém prostoru a v supernatantu kultury. Množství heterogenního proteinu v každém přípravku se stanovilo testem sendvičová ELISA a je vztaženo ke standardnímu tPA. Ze 100 ml bakteriální kultury v míchaných lahvích s hodnotou O.D. 50 při vlnové délce 600 nm sraženého amoniakem se získalo 1,38 pg r-K2S (přibližně 32 %), zatímco ze supernatantu kultury sráženého amoniakem se získalo 2,96 pg r-K2S (přibližně 68 %) . Test sendvičová ELISA se použila pro ověření fága sráženého pomocí PEG z XM[K2S] infikovaného VCSN13. Monoklonální protilátkou určenou proti oblasti kringle 2 se nezachytil žádný r-K2S, který se ·» ···· ·* ··· · detekoval anti-M13 konjugovanou s HRP, což naznačuje, že K2S není přítomen na částicích fága v případě, že není přítomen gp3.

Měření amydolytické aktivity.

Jestliže je ve vzorku přítomna oblast serinové PROTEINÁZy, pak se plazminogen přemění na plazmin. Vytvořený plazmin bude dále štěpit substrát S-2251 na zbarvený produkt p-nitroanilin, který vykazuje maximální absorbanci při vlnové délce 405 nm. Specifická aktivita rekombinantního produktu je v souladu s absorbanci. Hodnotila se a porovnávala se enzymatická aktivita závislá na fibrinogenu každého vzorku, to je K2S-(p, periplazmický r-K2S nebo r-K2S supernatantu kultury. K2S-<p a periplazmický r-K2S vykazuje znatelně nízkou enzymatickou aktivitu, která je pod hranicí citlivosti testu (0,25 IU/ml). r-K2S supernatantu kultury vykazuje enzymatickou aktivitu závislou na fibrinogenu 7 IU/ml. Ze 100 ml kultury se získalo celkem 700 IU enzymatické aktivity. Bez fibrinogenu se nepozorovala žádná enzymatická aktivita r-K2S izolovaného ze supernatantu kutlury, zatímco tPA standardního melanomu vykazoval stejnou aktivitu.

Demonstrace rekombinantního proteinu imunologickým přenosem,.

Částečně čištěný K2S ze supernatantu kultury XM[K2S] vykazuje molekulovou hmotnost 39 000, což se stanovilo za použití ovčích protilátek určených proti tPA (zobrazeno na obrázku č. 6). Negativní kontrola, což je částečně čištěný supernatant kultury netransformovaných XLl-Blue, obsahovala nereaktivní pruh odpovídající stejné velikosti.

Lokalizace aktivního enzymu pomocí testu PAGE.

·· *« » 9 · 4 > · ·« ·· *«·· ♦♦ »·♦·

Plazminogen se před elektroforézou kopolymerizoval a imobilizoval želatinou do polyakrylového gelu. Analyzovaly se supernatanty kultury E. colu XL-1 Blue, E. coli XL-1 Blue transformované pComb3HSS a XM[K2S] srážené síranem amonným (zobrazeno na obrázku č. 7). Všechny vzorky se zpracovaly v neredukčních podmínkách, aby se zabezpečilo správné aktivita oblasti oblasti plazminogenu uspořádání a Transparentní proteinázou se pozorovaly pouze serinové PROTEINAZy.

štěpeného serinovou supernatantech kultur

XM[K2S] srážených síranem amonným v polohách odpovídajícím molekulové nevykazuj í kterou je a 37 000. Ostatní vzorky

Dráha pozitivní kontroly, melanomu, také demonstruje hmotnosti 34 000 transparentní zóny tPA standardního enzymatickou aktivitu v polohách odpovídajícím molekulové hmotnosti 66 000 a 72 000.

44 • · 4 4 · • · «4 4 ·· ·»♦·

4 4 4

44

4 4

4

4 4 4 • 4 44

Seznam sekvencí (2) Informace o SEQ ID NO: 1:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

	(A)	DÉLKA: 18 párů baží
	(B)	TYP: nukleová kyselina
	(C)	DRUH ŘETĚZCE:
	(D)	TOPOLOGIE:
(ii)	DRUH	MOLEKULY: DNA
(ix)	ZNAKY:
	(A)	Název/klíč: umělá sekvence
	(D)	Jiné informace:

/poznámka=kódující sekvence N-terminální části proteinu K2S/ (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 1:

tctgagggaa acagtgac -. .

(2) Informace o SEQ ID NO: 2:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

	(A)	DÉLKA: 1128 párů baží
	(B)	TYP: nukleová kyselina
	(C)	DRUH ŘETĚZCE:
	(D)	TOPOLOGIE: lineární
(ii)	DRUH	MOLEKULY: DNA
(ix)	ZNAKY:
	(A)	Název/klíč: umělá sekvence
	(D)	Jiné informace:

/poznámka=kódující sekvence fúzního proteinu OmpAK2S/ (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 2:

·

9 9 * 9 9 9 •9 99

99

9 9

9 9 9

99

atgaaaaaga cagctatcgc gattgcagtg gcactggctg gtttcgctac cgtggcccag 60 gcggcctctg agggaaacag tgactgctac tttgggaatg ggtcagccta ccgtggcacg 120 cacagcctca ccgagtcggg tgcctcctgc ctcccgtgga attccatgat cctgataggc 180 aaggtttaca cagcacagaa ccccagtgcc caggcactgg gcctgggcaa acataattac 240 tgccggaatc ctgatgggga tgccaagccc tggtgccacg tgctgaagaa ccgcaggctg .300 acgtgggagt actgtgatgt gccctcctgc tccacctgcg gcctgagaca gtacagccag 360 cctcagtttc gcatcaaagg agggctcttc gccgacafccg cctcccaccc ctggcaggct 420 gccatctttg ccaagcacag gaggtcgccc ggagagcggt tcctgtgcgg gggcatactc 480 atcagctcct gctggattct ctctgccgcc cactgcttcc aggagaggtt tccgccccac 540 cacctgacgg tgatcttggg cagaacatac cgggtggtcc ctggcgagga ggagcagaaa 600 tttgaagtcg aaaaatacat tgtccataag gaattcgatg atgacactta cgacaatgac 660 attgcgctgc tgcagctgaa atcggattcg tcccgctgtg cccaggagag cagcgtggtc 720 cgcactgtgt gccttccccc ggcggacctg cagctgccgg actggacgga gtgtgagctc 780 tccggctacg gcaagcatga ggccttgtct cctttctatt cggagcggct gaaggaggct 840 catgtcagac tgtacccatc cagccgctgc acatcacaac atttacttaa cagaacagtc 900 accgacaaca tgctgtgtgc tggagacact cggagcggcg ggccccaggc aaacttgcac 960 gacgcctgcc agggcgattc gggaggcccc ctggtgtgtc tgaacgatgg ccgcatgact 1020 ttggtgggca tcatcagctg gggcctgggc tgtggacaga aggatgtccc gggtgtgtac 1080 acaaaggtta ccaactacct agactggatt cgtgacaaca tgcgaccg 1128 (2) Informace o SEQ ID NO: 3:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 66 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) DRUH ŘETĚZCE:

(D) TOPOLOGIE:

(ii) DRUH MOLEKULY: DNA (vi) PŮVODNÍ ZDROJ:

(A) ORGANIZMUS: Escherichia coli (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 3:

atgaaaaaga cagctatcgc gattgcagtg gcactggctg gtttcgctac cgtggcccag 60 gcggcc (2) Informace ο SEQ ID ΝΟ: 4:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

ΦΦ 4« * Φ ♦ · · · φ • · ΦΦ · Φ φ

Φ ΦΦ ΦΦΦ ΦΦ

ΦΦΦΦ Φ Φ φ

ΦΦ ΦΦ ΦΦ φ

ΦΦ φφφφ ·· · * ·

Φ Φ

Φφφ

Φ Φ Φ

Φ Φ Φ> »

	(A)	DÉLKA: 1 065 párů baží
	(B)	TYP: nukleová kyselina
	(C)	DRUH ŘETĚZCE:
	(D)	TOPOLOGIE:
(ii)	DRUH	MOLEKULY: DNA
(ix)	ZNAKY:
	(A)	Název/klíč: umělá sekvence
	(D)	Jiné informace:

/poznámka=kódující sekvence proteinu K2S/

C tctgagggaa ctcaccgagt tacacagcac aatcctgatg gagtactgtg tttcgcatca tttgccaagc tcctgctgga acggtgatct gtcgaaaaat ctgctgcagc gtgtgccttc tacggcaagc agactgtacc aacatgctgt tgccagggcg ggcatcatca gttaccaact :i) Popi acagtgactg cgggtgcctc agaaccccag gggatgccaa atgtgccctc aaggagggct acaggaggtc ttctctctgc tgggcagaac acattgtcca tgaaatcgga ccccggcgga atgaggcctt catccagccg gtgctggaga attcgggagg gctggggcct acctagactg s sekvenc ctactttggg ctgcctcccg tgcccaggca gccctggtgc ctgctccacc cttcgccgac gcccggagag cgcccactgc ataccgggtg taaggaattc ttcgtcccgc cctgcagctg gtctcctttc ctgcacatca cactcggagc ccccctggtg gggctgtgga gattcgtgac í: SEQ ID aatgggtcag tggaattcca ctgggcctgg cacgtgctga tgcggcctga atcgcctccc cggttcctgt ttccaggaga gtccctggcg gatgatgaca tgtgcccagg ccggactgga tattcggagc caacatttac ggcgggcccc tgtctgaacg cagaaggatg aacatgcgac

NO: 4:
cctaccgtgg	cacgcacagc	60
tgatcctgat	aggcaaggtt	120
gcaaacataa	ttactgccgg	180
agaaccgcag	gctgacgtgg	240
gacagtacag	ccagcctcag	300
acccctggca	ggctgccatc	360
gcgggggcat	actcatcagc	420
ggtttccgcc	ccaccacctg	480
aggaggagca	gaaatttgaa	540
cttacgacaa	tgacattgcg	600
agagcagcgt	ggtccgcact	660
cggagtgtga	gctctccggc	720
ggctgaagga	ggctcatgtc	780
ttaacagaac	agtcaccgac	840
aggcaaactt	gcacgacgcc	900
atggccgcat	gactttggtg	960
tcccgggtgt	gtacacaaag	1020
cgtga		1065

(2) Informace o SEQ ID NO: 5:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A)	DÉLKA: 1128 párů baží
(B)	TYP: nukleová kyselina
(C)	DRUH ŘETĚZCE:
(D)	TOPOLOGIE:
DRUH	MOLEKULY: DNA

«· «·«<* • · · *· * • ·

·· ♦· ·· · ·* 91 (ix) ZNAKY:

(A) Název/klíč: umělá sekvence (D) Jiné informace:

/poznámka=kódující sekvence fúzního proteinu OmpA K2S/ (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 5:

atgaaaaaga cagctatcgc gattgcagtg gcactggctg gtttcgctac cgtggcccag 60 gcggcctctg agggaaacag tgactgctac tttgggaatg ggtcagccta ccgtggcacg 120 cacagcctca ccgagtcggg tgcctcctgc ctcccgtgga attccatgat cctgataggc 180 aaggtttaca cagcacagaa ccccagtgcc caggcactgg gcctgggcaa acataattac 240 tgccggaatc ctgatgggga tgccaagccc tggtgccacg tgctgaagaa ccgcaggctg 300 acgtgggagt actgtgatgt gccctcctgc tccacctgcg gcctgagaca gtacagccag 360 cctcagtttc gcatcaaagg agggctcttc gccgacatcg cctcccaccc ctggcaggct 420 gccatctttg ccaagcacag gaggtcgccc ggagagcggt tcctgtgcgg gggcatactc 480 atcagctcct gctggattct ctctgccgcc cactgcttcc aggagaggtt tccgccccac 540 cacctgacgg tgatcttggg cagaacatac cgggtggtcc ctggcgagga ggagcagaaa 600 tttgaagtcg aaaaatacat tgtccataag gaattcgatg atgacactta cgacaatgac 660 attgcgctgc tgcagctgaa atcggattcg tcccgctgtg cccaggagag cagcgtggtc 720 cgcactgtgt gccttccccc ggcggacctg cagctgccgg actggacgga gtgtgagctc 780 tccggctacg gcaagcatga ggccttgtct cctttctatt cggagcggct gaaggaggct 840 catgtcagac tgtacccatc cagccgctgc acatcacaac atttacttaa cagaacagtc 900 accgacaaca tgctgtgtgc tggagacact cggagcggcg ggccccaggc aaacttgcac 960 gacgcctgcc agggcgattc gggaggcccc ctggtgtgfcc tgaacgatgg ccgcatgact 1020 ttggtgggca tcatcagctg gggcctgggc tgtggacaga aggatgtccc gggtgtgtac 1080 acaaaggtta ccaactacct agactggatt cgtgacaaca tgcgaccg 1128 (2) Informace o SEQ ID NO: 6:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A)	DÉLKA: 66 párů baží TYP: nukleová kyselina DRUH ŘETĚZCE: TOPOLOGIE: lineární
	(B) (C) (D)
(ii)	DRUH	MOLEKULY: DNA
(vi)	PŮVODNÍ ZDROJ:
	(A)	ORGANIZMUS: Escherichia

(xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 6:

ΦΦ φφ φ

φ * *· φφφφ • Φ ♦

ΦΦΦ *« φφφφ

9 ΦΦ

ΦΦΦ

ΦΦ Φ • · · Φ

ΦΦ ΦΦ atgaaaaaga cagctatcgc gattgcagtg gcactggctg gtttcgctac cgtggcccag 60 gcggcc . . , _6g (2) Informace o SEQ ID NO: 7:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 1 065 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) DRUH ŘETĚZCE:

(D) TOPOLOGIE:

(ii) DRUH MOLEKULY: DNA (ix) ZNAKY:

(A) Název/klíč: umělá sekvence (D) Jiné informace:

/poznámka=kódující sekvence proteinu K2S/ (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 7:

tcfcgagggaa acagtgactg ctactttggg ctcaccgagt cgggtgcctc ctgcctcccg tacacagcac agaaccccag tgcccaggca aatcctgatg gggatgccaa gccctggtgc gagtactgtg atgtgccctc ctgctccacc tttcgcatca aaggagggct cttcgccgac tttgccaagc acaggaggtc gcccggagag tcctgctgga ttctctctgc cgcccactgc. acggtgatct tgggcagaac ataccgggtg gtcgaaaaat acattgtcca taaggaattc ctgctgcagc tgaaatcgga ttcgtcccgc gtgtgccttc ccccggcgga cctgcagctg tacggcaagc atgaggcctt gtctcctttc agactgtacc catccagccg ctgcacatca aacatgctgt gtgctggaga cactcggagc tgccagggcg attcgggagg ccccctggtg ggcatcatca gctggggcct gggctgtgga gttaccaact acctagactg gattcgtgac aatgggtcag cctaccgtgg cacgcacagc 60 tggaattcca tgatcctgat aggcaaggtt 120 ctgggcctgg gcaaacataa ttactgccgg 180 cacgtgcfcga agaaccgcag gctgacgtgg 240 tgcggcctga gacagtacag ccagcctcag 300 atcgcctccc acccctggca ggctgccatc 360 cggttcctgt gcgggggcat actcatcagc 420 ttccaggaga ggtttccgcc ccaccacctg. 480 gtccctggcg ággaggagca gaaatttgaa 540 gatgatgaca cttacgacaa tgacattgcg 600 tgtgcccagg agagcagcgt ggtccgcact 660 ccggactgga cggagtgtga gctctccggc 720 tattcggagc ggctgaagga ggctcatgtc 780 caacatttac ttaacagaac agtcaccgac 840 ggcgggcccc aggcaaactt gcacgacgcc 900 tgtctgaacg atggccgcat gactttggtg 960 cagaaggatg'tcccgggtgt gtacacaaag 1020 aacatgcgac cgtga - 1065

0000 ·· 00 ··

0 0 0 0 0 • · 00 0 0 • 0 0 · · · · • 0 0 0 · · ·· ·* ··

000« 0 0 0

0 0

0 0 0 • 0 0 0

00 (2) Informace o SEQ ID NO: 8:

(i) (ii) (ÍX)

CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 377 aminokyselinových (B) TYP: aminokyselinová (C) DRUH ŘETĚZCE:

(D) TOPOLOGIE:

DRUH MOLEKULY: protein ZNAKY:

zbytků (A) Název/klíč: umělá sekvence (D) Jiné informace:

/poznámka=fúzní protein 0mpA-K2S (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 8:

Met 1	Lys Lys	Thr	Ala 5	Ile	Ala	Ile	Ala	Val Ala 10	Leu Ala Gly Phe Ala 15
Thr	Val Ala	Gin 20	Ala	Ala	Ser	Glu	Gly 25	Asn Ser	Asp Cys Tyr’Phe Gly 30
Asn	Gly Ser 35	Ala	Tyr	Arg	Gly	Thr 40	His	Ser Leu	Thr Glu Ser Gly Ala 45
Ser	Cys Leu 50	Pro	Trp	Asn	Ser 55	Met	Ile	Leu Ile	Gly Lys Val Tyr Thr 60
Ala 65	Gin Asn	Pro	Ser	Ala 70	Gin	Ala	Leu	Gly Leu 75	Gly Lys His Asn Tyr 80
Cys	Arg Asn	Pro	Asp 85	Gly	Asp	Ala	Lys	Pro Trp 90	Cys His Val Leu Lys 95
Asn	Arg Arg	Leu 100	Thr	Trp	Glu	Tyr	Cys 105	Asp Val	Pro Ser Cys Ser Thr 110
Cys	Gly Leu 115	Arg	Gin	Tyr	Ser	Gin 120	Pro	Gin Phe	Arg Ile Lys Gly Gly 125

• ·

45

• · fr · • · • · • · • ·

• · • · • · • · • · • ·

• · • • • · • • ·

• · · · • · » · • · • · •

• · • • • · • • ·

• frfr • • · • • · • ·

Leu

Phe

Ala

Asp

Ile

Ala

Ser

His

Pro Trp

Gin

Ala

Ala

Ile

Phe

Ala

130

135

140

Lys

His

Arg

Arg

Ser

Pro

Gly

Glu

Arg Phe

Leu

Cys

Gly

Gly

Ile

Leu

145

-

150

155

160

-

Ile

Ser

Ser

Cys

Trp

Ile

Leu

Ser

Ala Ala

His

Cys

Phe

Gin

Glu

Arg

*

165

170

--

175

Phe

Pro

Pro

His

His

Leu

Thr

Val

Ile. Leu

Gly

Arg

Thr

Tyr

Arg

Val

v.-·

180

185

190

Val

Pro

Gly

Glu

Glu

Glu

Gin

Lys

Phe Glu

Val

Glu

Lys

Tyr

Ile

Val

195

200

205

His'

Lys

Glu

Phe

Asp

Asp

Asp

Thr

Tyr Asp

Asn

Asp

Ile

Ala

Leu

Leu

210

215

220

Gin

Leu

Lys

Ser

Asp

Ser

Ser

Arg

Cys Ala

Gin

Glu.

Ser

Ser

Val

Val

'225

230

235

240

Arg

Thr

Val

Cys

Leu

Pro

Pro

Ala

Asp Leu

Gin

Leu

Pro

Asp

Trp

Thr

245

250

255

Glu

Cys

Glu

Leu

Se.r

Gly

Tyr

Gly Lys His

Glu

Ala

Leu

Ser

Pro

Phe

260

265

270

Tyr

Ser

Glu

Arg

Leu

Lys

Glu

Ala

His Val

Arg

Leu

Tyr

Pro

Ser

Ser

.

275

280

285

»

Arg

Cys

Thr

Ser

Gin

His

Leu

Leu

. Asn Arg

Thr

Val

Thr

Asp

Asn

Met

290

295

300

Leu

Cys

Ála

Gly

Asp

Thr

Arg

Ser

• C-ly Gly

Pro

Gin

Ala

Asn

Leu

His

305

.310

315

320

Asp

Ala

Cys

Gin

Gly

Asp

Ser

Gly

• Gly Pro

Leu

Val

Cys

Leu

Asn

Asp

325 330 335

Gly

Arg

'Met

Thr

Leu

Val

Gly

Ile

Ile

Ser

Trp

Gly

Leu

Gly

Cys

Gly

340

345

350

Gin

Lys

Asp

Val

Pro

Gly

Val

Tyr

Thr

Lvs

Val

Thr

Asn

Tyr

Leu

Asp

355

360

365

Trp

Ile

Arg

Asp

Asn

Met

Arg

Pro

Gly

370 375 (2)

Informace o SEQ ID NO: 9:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 4 aminokyselinových zbytků (B) TYP: aminokyselinová (C) DRUH ŘETĚZCE:

(D) TOPOLOGIE:

(ii) DRUH MOLEKULY: protein (ix) ZNAKY:

(A) Název/klíč: umělá sekvence (D) Jiné informace:

/poznámka=peptidová sekvence (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 9:

Ser Glu Gly Asn 1 (2) Informace o SEQ ID NO: 10:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 6 aminokyselinových zbytků (B) TYP: aminokyselinová (C) DRUH ŘETĚZCE:

(D) TOPOLOGIE:

(ii) DRUH MOLEKULY: protein (ix) ZNAKY:

(A) Název/klíč: umělá sekvence (D) Jiné informace:

/poznámka=peptidová sekvence

9 • · · · ····

	47	• · · · • 9 99 • · 9 9 9 9 99 99	9 9 9 9 9 9 «9 9 9 9 99 9
(Xi)	Popis sekvence:	SEQ ID NO:	10:
	Ser Glu Gly Asn	Ser Asp
	1	5
Informace o SEQ ID NO:	11:
(i)	CHARAKTERISTIKA	SEKVENCE:
	(A) DÉLKA: 354	aminokyselinových	zbytků

(B) TYP: aminokyselinová (C) DRUH ŘETĚZCE:

(D) TOPOLOGIE:

(ii) DRUH MOLEKULY: protein (ix) ZNAKY:

(A) Název/klíč: umělá sekvence (D) Jiné informace:

/poznámka=K2S 174 až 527

	(xi)	Popis	sekvence:	SEQ	ID	NO:	11:
Ser 1	Glu Gly	Asn Ser 5	Asp Cys Tyr	Phe.	Gly 10	Asn	Gly Ser Ala Tyr Arg 15 ·
v-: Gly	Thr His	Ser Leu 20	Thr Glu Ser	Gly 25	Ala	Ser	Cys Leu Pro Trp Asn 30
Ser	Met Ile 35	Leu Ile	Gly Lys Val 40	Tyr	Thr	Ala	Gin Asn Pro Ser Ala 45
Gin	Ala Leu 50	Gly Leu	Gly Lys His 55	Asn	Tyr	Cys	Arg Asn Pro Asp Gly 60
Asp 65	Ala Lys	Pro Trp	Cys His Val. 70	Leu	Lys	Asn 75	Arg Arg Leu Thr Trp 80
Glu	Tyr Cys	Asp Val	Pro Ser Cys	Ser	Thr	Cys	Gly Leu Arg Gin Tyr

• · • · · ·

• · · · • · · ·

90 95

Ser

Gin

Pro Gin . 100

Phe Arg lle

Lys

Gly Gly Leu Phe Ala Asp

Ile

Ala

105

110

Ser

His

Pro

Trp

Gin

Ala

Ala

lle

Phe

Ala

Lys

His

Arg

Arg

Ser

Pro

115·

120

125

Gly

Glu.

-Arg

Phe

Leu

Cys

Gly

Gly

lle

Leu

lle

Ser

Ser

Cys

Trp

lle

130

135

140

Leu

Ser

Ala

Ala

His

Cys

Phe

Gin

Glu

Arg

Phe

Pro

Pro

His

His

Leu

145

150

155

160

Thr

Val

lle

Leu

Gly

Arg

Thr

Tyr

Arg

Val

Val

Pro

Gly

Glu

Glu

Glu

165

170

175

Gin

Lys

Phe

Glu

Val

Glu

Lys

Tyr

lle

Val

His

Lys

Glu

Phe

Asp

Asp

180

185

190

Asp

Thr

Tyr

Asp

Asn

Asp

lle

Ala

Leu

Leu

Gin

Leu

Lys

Ser

Asp

Ser

195

200

205

Ser

Arg

Cys

Ala

Gin

Glu

Ser

Ser

Val

Val

Arg

Thr

Val

Cys

Leu

Pro

V-·,

210

215

220

Pro

Ala

Asp

Leu

Gin

Leu

Pro

Asp

Trp

Thr

Glu

Cys

Glu

Leu

Ser

Gly

225

230

235

240

Tyr

Gly

Lys

His

Glu

Ala

Leu

Ser

Pro

Phe

Tyr'

Ser

Glu

Arg

Leu

Lys

245

250

255

Glu

Ala

His

Val

Arg

Leu

Tyr

Pro

Ser

Ser

Arg

Cys

Thr

Ser

Gin

His

260

265

270

Leu

Leu

Asn

Arg

Thr

Val

Thr

Asp

Asn

Met

Leu

Cys

Ala

Gly

Asp

Thr

275

280

285

Arg

Ser

Gly

Gly

Pro

Gin

Ala

Asn

Leu

His

Asp

Ala

Cys

Gin.

Gly

Asp

• · • · · ·

	49	• 4 4 4 1	4 44 4 4 • 4 » · 4	4 4 4 4 4 4	4 4 4 4 4 • 4 4	• 4 4 4 4	• 4 4 4 4 4 4 4 · 4 ·
290	295		300
Ser Gly	Gly Pro Leu Val Cys Leu Asn	Asp Gly	Arg	Met	Thr	Leu	Val
305	310	315					320
Gly Ile	Ile Ser Trp Gly Leu Gly Cys	Gly Gin	Lys	Asp	Val	Pro	Gly
	325	330				335
Val Tyr	Thr Lys Val Thr Asn Tyr Leu	Asp Trp	Ile	Arg	Asp	Asn	Met
	340 345				350
Arg.Pro
2) Informace o SEQ ID NO: 12:
(i)	CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
	(A) DÉLKA: 331 aminokyselinových	zbytků

(B) TYP: aminokyselinová (C) DRUH ŘETĚZCE:

(D) TOPOLOGIE:

(ii) DRUH MOLEKULY: protein (ix) ZNAKY:

(A) Název/klíč: umělá sekvence (D) Jiné informace:

/poznámka=K2S 197 až 527

(x

i)

Popis

sek

:vence:

SEQ

ID

NO:

12:

Ser’

Gly

Ala

Ser

Cys

Leu

Pro

Trp

Asn

Ser

Met

Ile

Leu

Ile

Gly

Lys

Ϊ

5

10

15

Val

Tyr

Thr

Ala

Gin

Asn

Pro

Ser

Ala

Gin

Ala

Leu

Gly

Leu

Gly

Lys

' 20

25

30

His

Asn

Tyr

Cys

Arg

Asn

Pro

Asp

Gly

Asp

Ala

Lys

Pro

Trp

Cys

His

35

40

45

Val

Leu

Lys

Asn

Arg

Arg

Leu

Thr

Trp

Glu

Tyr

Cys

Asp

Val

Pro

Ser

50

55

60

Cys

Ser

Thr

Cys

Gly

Leu

Arg

Gin

Tyr

Ser

Gin

Pro

Gin

Phe

Arg

Ile

65

70

75

80

• · • * ····

	50	• • 4	• 9 • · i · · 1	• · · • · •	9 9 • · • · ·	• · · • · · « ·
Lys Gly	Gly Leu Phe Ala Asp Ile Ala Ser 85 90	His	Pro	Trp	Gin	Ala Ala 95
Ile Píie	Ala Lys His Arg Arg Ser Pro Gly 100 105	Glu	Arg	Phe	Leu 110	Cys Gly
Gly Ile	Leu Ile Ser Ser Cys Trp Ile Leu 115 120	Ser	Ala	Ala 125	His	Cys Phe
Gin Glu 130	Arg Phe Pro Pro His His Leu Thr 135	Val	Ile 140	Leu	Gly	Arg Thr
Tyr Arg 145	Val Val Pro Gly Glu Glu Glu Gin 150	Lys 155	Phe	Glu	Val	Glu Lys 160.
Tyr Ile	Val His Lys Glu Phe Asp Asp Asp 165 170	Thr	Tyr	Asp	Asn	Asp Ile 175
Ala Leu	Leu Gin Leu Lys Ser Asp Ser Ser 180 185.	Arg	Cys	Ala	Gin 190	Glu Ser
Ser Val	Val Arg Thr Val Cys Leu Pro Pro 195 200	Ala	Asp	Leu 205	Gin	Leu Pro
Asp Trp 210	Thr Glu Cys Glu Leu Ser Gly Tyr 215	Gly	Lys 220	His	Glu	Ala Leu
Ser Pro 225	Phe Tyr Ser Glu Arg Leu Lys Glu 230	Ala 235	His	Val	Arg	Leu Tyr 240
Pro Ser	Ser Arg Cys Thr Ser Gin His Leu 245 250	Leu	Asn	Arg	Thr	Val Thr 255
Asp Asn	Met Leu Cys Ala Gly Asp Thr Arg 260 265	Ser	Gly	Gly	Pro 270	Gin Ala
Asn Leu	His Asp Ala Cys Gin Gly Asp Ser 275 280	Gly	Gly	Pro 285	Leu	Val Cys

i ····

	51	• •	• 9 • · » 99	9 9 9 • ·	• · • 9 99 ·	9 · 9	9 * 9 9 9 9· 99
Leu	Asn Asp Gly Arg Met Thr Leu Val Gly	Ile	Ile	Ser	Trp	Gly	Leu
	290 295		300
Gly	Cys Gly Gin Lys Asp Val Pro Gly Val	Tyr	Thr	Lys	Val	Thr	Asn
305	310	315					320
Tyr	Leu Asp Trp Tle Arg Asp Asn Met Arg	Pro
	325 330
2) Informace o SEQ ID NO: 13:
	(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

	(A)	DÉLKA: 339 aminokyselinových zbytků
	(B)	TYP: aminokyselinová
	(C)	DRUH ŘETĚZCE:
	(D)	TOPOLOGIE:
(ii)	DRUH	MOLEKULY: protein
(ix)	ZNAKY:
	(A)	Název/klíč: umělá sekvence
	(D)	Jiné informace:
	/poznámka=K2S 193 až 527
(xi)	Popis sekvence: SEQ ID NO: 13:

Ser Glu Gly Asn Ser Leu Thr Glu Ser Gly Ala Ser

Cys

Leu Pro Trp 15

1

5

10

Asn

Ser

Met

Ile

Leu

Ile

Gly

Lys

Val·

Tyr

Thr

Ala

Gin

Asn

Pro

Ser

20

25

30

Ala

Gin

Ala

Leu

Gly

Leu

Gly

Lys

His

Asn

Tyr

Cys

Arg

Asn

Pro

Asp

35

40

45

Gly

Asp

Ala

Lys

Pro

Trp

Cys

His

Val

Leu

Lys

Asn

Arg

Arg

Leu

Thr

50

55

60

Trp

Glu

Tyr

Cys

Asp

Val

Pro

Ser

Cys

Ser

Thr

Cys

Gly

Leu

Arg

Gin

65

70

75

80

0 · 0

0 0 0 0 «

0 0·

0 0 0 ·

0 0 0 0 0 0

00 ·* ·

Tyr Ser Gin Pro Gin Phe Arg Ile Lys Gly Gly Leu Phe Ala Asp Ile 85 ' 90 95

Ala Ser His Pro ..Trp Gin Ala Ala Ile Phe Ala Lys His Arg Arg Ser 100 105 ' 110

Pro Gly Glu

Arg Phe

Leu Cys Gly 120

Gly Ile

Leu Ile

Ser 125

Ser

Cys.

Trp

115

Ile

Leu

Ser

Ala

Ala

His

Cys

Phe

Gin

Glu

Arg

Phe

Pro

Pro

His

His

130

135

140

•

-

Leu

Thr

Val

Ile

Leu

Gly

Arg

Thr

Tyr

Arg.

Val

Val

Pro

Gly

Glu

Glu

145

150

155

160

Glu

Gin

Lys

Phe

Glu

Val

Glu

Lys

Tyr

Ile

Val

His

Lys

Glu

Phe

Asp

165

170

175

Asp

Asp

Thr

Tyr

Asp

Asn

Asp

Ile

Ala

Leu

Leu

Gin

Leu

Lys

Ser

Asp

180

185

190

Ser

Ser

Arg

Cys

Ala

Gin

Glu

Ser

Ser

Val

Val

Arg

Thr

Val

Cys

Leu

195

200

205

Pro

Pro

Ala

Asp

Leu

Gin

Leu

Pro

Asp

Trp

Thr

Glu

Cys

Glu

Leu

Ser

210

215

220

Gly

Tyr

Gly

Lys

His

Glu

Ala

Leu

Ser

Pro

Phe

Tyr

Ser

Glu

Arg

Leu

225

230

235

240

Lys

Glu

Ala

His

Val

Arg

Leu

Tyr

Pro

Ser

Ser

Arg

Cys

Thr

Ser

Gin

245

250

255

His

Leu

Leu

Asn

Arg

Thr

Val

Thr

Asp

Asn

Met

Leu

Cys

Ala

Gly

Asp

260

265

270

Thr

Arg

Ser

Gly

Gly

Pro

Gin

Ala

Asn

Leu

His

Asp

Ala

Cys

Gin

Gly

275 ^{280 285} 'tí

φ· • · ·· ····

Asp

Ser

Gly

Gly

Pro

Leu

Val

Cys

Leu Asn

Asp

Gly

Arg

Met

Thr

Leu

Λ

290

295

300

Val

Gly

Ile

Ile

Ser

Trp

Gly

Leu

Gly čýs

Gly

Gin

Lys

Asp

Val

Pro

305

'310

315

320

Gly

Val

Tyr

Thr

Lys

Val

Thr

Asn

Tyr Leu

Asp

Trp

Ile

Arg

Asp

Asn

³³θ .. '335

Met Arg Pro (2) Informace o SEQ ID NO: 14:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 335 aminokyselinových zbytků (B) TYP: aminokyselinová (C) DRUH ŘETĚZCE:

(D) TOPOLOGIE:.

(ii) DRUH MOLEKULY: protein (ix) ZNAKY:

(A) Název/klíč: umělá sekvence (D) Jiné informace:

/poznámka=K2S 193 až 527 (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 14:

Šer 1

Leu Thr

Glu

Ser Gly Ala Ser Cys Leu

Pro Trp

Asn

Ser

Met 15

Ile

5

10

Leu

Ile

Gly

Lys

Val

Tyr

Thr

Ala

Gin

Asn

Pro

Ser

Ala

Gin

Ala

Leu

20

25

30

Gly

Leu

Gly

Lys

His

Asn

Tyr

cys

Arg

Asn

Pro

Asp

Gly

Asp

Ala

Lys

35

40

45

Pro

Trp

Cys

His

Val

Leu

Lys

Asn

Arg

Arg

Leu

Thr

Trp

Glu

Tyr

Cys

50

55

60

Asp

Val

Pro

Ser

Ser

Ser

Thr

Cys

Gly

'Leu

Arg

Gin

Tyr

Ser

Gin

Pro

65

70

75

80

Gin

Phe

Arg

Ile

Lys

Gly

Gly

Leu

Phe

Ala

Asp

Ile

Ala

Ser

His

Pro

90 ⁹⁵

Μ ·♦ » · · · ···· ·· ····

Trp Gin Ala Ala Ile Phe Ala Lys His Arg Arg Ser Pro Gly Glu Arg 100 105 v 110

Phe Leu Cys 115

Gly Gly Ile

Leu Ile Ser Ser Cys Trp Ile Leu

Ser

Ala

120

125

Ala

His

Cys

Phe

Gin

Glu

Arg

Phe

Pro

Pro

His

His

Leu

Thr

Val

Ile

130

135

140

Leu

Gly

Arg

Thr

Tyr

Arg

Val

Val

Pro

Gly

Glu

Glu

Glu

Gin

Lys

Phe

145

-

150

155

160

Glu

Val

Glu

Lys

Tyr

Ile

Val

His

Lys

Glu

Phe

Asp

Asp

Asp

Thr

Tyr

165

170

175

Asp

Asn'

Asp

Ile

Ala

Leu

Leu

Gin

Leu

Lys

Ser

Asp

Ser

Ser

Arg

Cys

180

185

190

Ala

Gin

Glu

Ser

Ser

Val

Val

Arg

Thr

Val

Cys

Leu

Pro

. Pro

Ala

Asp

195

200

205

Leu

Gin

Leu

Pro

Asp

Trp

Thr

Glu

Cys

Glu

Leu

Ser

Gly

Tyr

Gly

Lys

210

215

220

His

Glu

Ala

Leu

Ser

Pro

Phe

Tyr

Ser

Glu

Arg

Leu

Lys

Glu

Ala

His

225

230

235

240

val

Arg

Leu

Tyr

Pro

Ser

Ser

Arg

Cys

Thr

Ser

Gin

His

Leu

Leu

Asn

245

250

255

Arg

Thr

Val

Thr

Asp

Asn

Met

Leu

Cys

Ala

Gly

Asp

Thr

Arg

Ser

Gly

260

265

270

Gly

Pro

Gin

Ala

Asn

Leu

His

Asp

Ala

Cys

Gin

Gly

Asp

Ser

Gly

Gly

275

280

285

Pro

Leu

Val

Cys

Leu

Asn

Asp

Gly

Arg

Met

Thr

Leu

Val

Gly

Ile

Ile

290 295 300

Μ ···· ··*♦ ·“··· : : , : ’··**; ·: : :

Ser Trp Gly Leu Gly Cys Gly Gin Lys Asp Val Pro Gly Val Tyr Thr

305 ³¹⁰ · · ^{315 320}

Lys Val Thr Asn Tyr Leu Asp Trp Ile Arg Asp Asn Met Arg Pro .

325 · 330 . 335 (2) Informace o SEQ ID NO: 15:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 343 aminokyselinových zbytků (B) TYP: aminokyselinová (C) DRUH ŘETĚZCE:

(D) TOPOLOGIE:

(ii) DRUH MOLEKULY: protein (ix) ZNAKY:

(A) Název/klič: umělá sekvence (D) Jiné informace:

/poznámka=

K2S

191

až

527

\\

(

xi)

P

opis

i se

kvence:

SEQ

! ID

NO:

15

Ser

Glu

Gly

Asn

Ser

Asp

Thr

His

Ser

Leu

Thr

Glu

Ser

Gly

Ala

Ser

1

5

10

•

15

Cys

Leu

Pro

Trp

Asn

Ser

Met

Ile

Leu

Ile

Gly

Lys

Val

Tyr

Thr

Ala

20

25

30

Gin

Asn

Pro

Ser

Ala

Gin

Ala

Leu

Gly

Leu

Gly

Lys

His

Asn

Tyr

Cys

35

40

45

Arg

Asn

Pro

Asp

Gly

Asp

Ala

Lys

Pro

Trp

Cys

His

Val

Leu

Lys

Asn

. 50

55

60

Arg

Arg

Leu

Thr

Trp

Glu

Tyr

Cys

Asp

Val

Pro

Ser

Cys

Ser

Thr

Cys

65

70

75

80

Gly

Leu

Arg

Gin

Tyr

Ser

Gin

Pro

Gin

Phe

Arg

Ile

Lys

Gly

Gly

Leu

85

-

90

95

»999

Phe Ala	• 9	99 Ala	«9 Ala	9 Ile	9« ··
Asp	Ile 100	Ala	Ser His Pro	Trp Gin 105	Phe 110	Ala Lys
His Arg	Arg 115	Ser	Pro	Gly Glu Arg 120	Phe Leu	Cys	Gly	Gly 125	Ile	Leu Ile
Ser Ser 130	Cys	Trp	Ile	Leu Ser Ala 135	Ala His	Cys	Phe 140	Gin	Glu	Arg Phe
Pro Pro 145	His	His	Leu	Thr Val Ile 150	Leu Gly	Arg 155	Thr	Tyr	Arg	Val Val 160
Pro Gly	Glu	Glu	Glu 165	Gin Lys Phe	Glu Val 170	Glu	Lys	Tyr	Ile	Val His 175
Lys Glu	Phe	Asp 180	Asp	Asp Thr Tyr	Asp Asn 185	Asp	Ile	Ala	Leu 190	Leu Gin
Leu Lys	Ser 195	Asp	Ser	Ser Arg Cys 200	Ala Gin	Glu	Ser	Ser 205	Val	Val Arg
Thr Val 210	Cys	Leu	Pro	Pro Ala Asp 215	Leu Gin	Leu	Pro 220	Asp	Trp	Thr Glu
Cys Glu 225	Leu	Ser	Gly	Tyr Gly Lys 230	His Glu	Ala 235	Leu	Ser	Pro	Phe Tyr 240
Ser Glu	Arg	Leu	Lys 245	Glu Ala His	Val Arg 250	Leu	Tyr	Pro	Ser	Ser Arg 255
Cys Thr	Ser	Gin 260	His	Leu Leu Asn	Arg Thr 265	Val	Thr	Asp	Asn 270	Met Leu
Cys Ala	Gly Asp 275	Thr	Arg Ser Gly 280	Gly Pro	Gin	Ala	Asn 285	Leu	His Asp
Ala Cys	Gin	Gly	Asp	Ser Gly Gl.y	Pro Leu	Val	Cys	Leu	Asn	Asp Gly

290 295 300

«fr • · ·« fr · fr « • fr ·· frfrfrfr

Arg Met Thr Leu Val Gly Ile	Ile Ser Trp Gly Leu Gly Cys Gly Gin
305	310	315	320
Lys Asp	Val Pro Gly Val Tyr	Thr Lys Val Thr	Asn Tyr Leu Asp Trp
	325	330	335
Ile Arg	Asp Asn. Met Arg Pro

340 (2) Informace o SEQ ID NO: 16:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 343 aminokyselinových zbytků (B) TYP: aminokyselinová (C) DRUH ŘETĚZCE:

(D) TOPOLOGIE:

(ii) DRUH MOLEKULY: protein (ix) ZNAKY:

			(A)	Název/klíč	: umělá	sekvence
	(xi)	(D) Jiné informace: /poznámka=K2S 191 až 527 Popis sekvence: SEQ ID NO: 16:
Ser 1	Glu	Gly	Asn	Ser Asp Thr 5	His Ser	Leu Thr Glu 10	Ser	Gly	Ala . 15	Ser
Cys	Leu	Pro	Trp 20	Asn Ser Met	Ile Leu 25	Ile Gly Lys	Val	Tyr 30	Thr	Ala
Gin	Asn	Pro 35	Ser	Ala Gin Ala	Leu Gly 40	Leu Gly Lys	His 45	Asn	Tyr	Cys
Arg	Asn 50	Pro	Asp	Gly Asp Ala 55	Lys Pro	Trp Cys His 60	Val	Leu	Lys	Asn
Arg 65	Arg	Leu	Thr	Trp Glu Tyr 70	Cys Asp	Val Pro Ser 75	Ser	Ser	Thr	Cys 80
Gly	Leu	Arg	Gin	Tyr Ser Gin 85	Pro Gin	Phe Arg Ile 90	Lys	Gly	Gly 95	Leu

···♦ * · - * ♦ 1

4« 9999

	58	• · • * ♦ • 9 4 • ·	• ♦ • 99	« · ♦ » • · ··	▼ • • 4	4 · • 4«	4 4 4 4 · 4 4
Phe Ala Asp Ile Ala Ser	•His Pro Trp	Gin Ala	Ala	Ile	Phe	Ala	Lys
100	105				110
His Arg Arg Ser Pro Gly	Glu Arg Phe	Leu Cys	Gly	Gly	Ile	Leu	Ile
115	120			125
Ser Ser Cys Trp Ile Leu.	Ser Ala Ala	His Cys	Phe	Gin	Glu	Arg	Phe
130	135 .		140
Pro Pro His His Leu Thr	Val Ile Leu	Gly Arg	Thr	Tyr	Arg	Val	Val
145 150		155					160
Pro Gly Glu Glu Glu Gin	Lys Phe Glu	Val Glu	Lys	Tyr	Ile	Val	His
165		170				175
Lys Glu Phe Asp Asp Asp	Thr Tyr Asp	Asn Asp	Ile	Ala	Leu	Leu	Gin
180	185				190
Leu Lys Ser Asp Ser Ser	Arg Cys Ala	Gin Glu	Ser	Ser	Val	Val	Arg
195	200			205
Thr Val Cys Leu Pro Pro	Ala Asp Leu	Gin Leu	Pro	Asp	Trp	Thr	Glu
210	215		220
Cys Glu Leu Ser Gly Tyr	Gly Lys His	Glu Ala	Leu	Ser	Pro	Phe	Tyr
225 230		235				•	240
Ser Glu Arg Leu Lys Glu	Ala His Val	Arg Leu	Tyr	Pro	Ser	Ser	Arg
245		250				255
Cys Thr Ser Gin His Leu	Leu Asn Arg	Thr Val	Thr	Asp	Asn	Met	Leu
260	265				270
v- \ ' Cys Ala Gly Asp Thr Arg	Ser Gly Gly	Pro Gin	Ala	Asn	Leu	His	Asp
275	280			285
Ala Cys Gin Gly Asp Ser	Gly Gly Pro	Leu Val	Cys	Leu	Asn	Asp	Gly
. 290	295		300

·» ·<·* «««♦ * · · · il * ♦· * • •••-ϊ!···· * ·····; j ; ♦ · · <

*./♦..· .. ϊ ·· ··

Arg Met Thr Leu Val Gly lle lle Ser Trp Gly Leu Gly Cys Gly Gin

305 310 315 320

Lys Asp Val Pro Gly Val Tyr Thr Lys Val Thr Asn Tyr Leu Asp Trp

325 330 335 lle Arg Asp Asn Met Arg Pro 340

Informace o	SEQ ID NO: 17:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A)	DÉLKA: 308 aminokyselinových zbytků
(B)	TYP: aminokyselinová
(C)	DRUH ŘETĚZCE:
(D)	TOPOLOGIE:
(ii) DRUH	MOLEKULY: protein
(ix) ZNAKY:
(A)	Název/klíč: umělá sekvence
(D)	Jiné informace:

Ser . 1

/poznámka=K2S 220

až SEQ Lys

527 ID NO: His Asn 10

17: Tyr

Cys

Arg

Asn 15

Pro

(xi) Ala Gin

Popis Ala Leu 5

sekvence: Gly Leu Gly

Asp

Gly

Asp

Ala

Lys

Pro

Trp

Cys

His

Val

Leu

Lys

Asn

Arg

Arg

Leu

20

25

30

Thr

Trp

Glu

Tyr

Cys

Asp

Val

Pro

Ser

Cys

Ser

Thr

Cys

Gly

Leu

Arg

35

40

' 45

Gin

Tyr

Ser

Gin

Pro

Gin

Phe

Arg

lle

Lys

Gly

Gly

Leu

Phe

Ala

Asp

50

55

60

lle

Ala

Ser

His

Pro

Trp

Gin

Ala

Ala

lle

Phe

Ala

Lys

His

Arg

Arg

65

70

75

80

Ser

Pro

Gly

Glu

Arg

Phe

Leu

Cys

Gly

Gly

lle

Leu

lle

Ser

Ser

Cys

85

90

95

• 4 • 4 • · • · • fl «

44*4 «

* · 4 ·· # • ·

Trp Ile Leu Ser Ala Ala His Cys Phe Gin Glu Arg Phe Pro Pro His 100 105 no

His Leu Thr Val Ile Leu Gly Arg Thr Tyr Arg Val Val Pro Gly Glu 115 120 125

Glu Glu Gin Lys Phe Glu Val Glu Lys Tyr Ile Val His Lys Glu Phe 130 135 140

Asp Asp 145

Asp

Thr

Tyr Asp Asn Asp Ile Ala Leu Leu Gin Leu Lys

Ser 160

150

155

Asp

Ser

Ser

Árg

Cys

Ala

Gin

Glu

Ser

Ser

Val

Val

Arg

Thr

Val

Cys

165

170

175

Leu

Pro

Pro

Ala

Asp

Leu

Gin

Leu

Pro

Asp

Trp

Thr

Glu

Cys

Glu

Leu

180

185

190

Ser

Gly 'Tyr

Gly

Lys

His

Glu

Ala

Leu

Ser

Pro

Phe

Tyr

Ser

Glu

Arg

195

200

205

Leu

Lys

Glu

Ala

His

Val

Arg

Leu

Tyr

Pro

Ser

Ser

Arg

Cys

Thr

Ser

210

215

220

Gin

His

Leu

Leu

Asn

Arg

Thr

Val

Thr

Asp

Asn

Met

Leu

Cys

Ala

Gly

225

230

235

240

Asp

Thr

Arg

Ser

Gly

Gly

Pro

Gin

Ala

Asn

Leu

His

Asp

Ala

Cys

Gin

245

250

255

Gly

Asp

Ser

Gly

Gly

Pro

Leu

Val

Cys

Leu

Asn

Asp

Gly

Arg

Met

Thr

260

265

270

Leu

Val

Gly

Ile

Ile

Ser

Trp

Gly

Leu

Gly

Cys

Gly

Gin

Lys

Asp

Val

V..

275

280

285

Pro

Gly

Val

Tyr

Thr

Lys

Val

Thr

Asn

Tyr

Leu

Asp

Trp

Ile

Arg

Asp

290

295

300

Asn Met Arg Pro 305

			·*	1911
	• ·	9	9 1·	9
	• ·		·« · ·	1
61	• · • ·	'1 •	• « · · 19 1	9 1
			99 99	9

« · • • · · ·* ··« »« ·· (2) Informace o SEQ ID NO: 18:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 268 aminokyselinových zbytků (B) TYP: aminokyselinová (C) DRUH ŘETĚZCE:

(D) TOPOLOGIE:

(ii) DRUH MOLEKULY: protein (ix) ZNAKY:

(A) Název/klíč: umělá sekvence (D) Jiné informace:

/poznámka=K2S 260 až 527

(xí;

)

Pop

is sekv

ence: S

EQ ID N

O:

18:

Ser

Cys

Ser

Thr

Cys

Gly

Leu

Arg

Gin

Tyr

Ser

Gin

Pro

Gin

Phe

Arg

1

5

10

15'

Ile

Lys

C-ly

Gly

Leu

Phe

Ala

Asp

Ile

Ala

Ser

His

Pro

Trp

Gin

Ala

20

25

.30

Ala

Ile

Phe

Ala

Lys

His

Arg

Arg

Ser

Pro

Gly

Glu

Arg

Phe

Leu

Cys

35

40

45

Gly

Gly

Ile

Leu

Ile

Ser

Ser

Cys

Trp

Ile

Leu

Ser

Ala

Ala

His

Cys

50

55

60

Phe

Gin

Glu

Arg

Phe

Pro

Pro

His

His

Leu

Thr

Val

Ile

Leu

Gly

Arg

65

70

75

80

Thr

Tyr

Arg

Val

Val

Pro

Gly

Glu

Glu

Glu

Gin

Lys

Phe

Glu

Val

Glu

85

90

95

Lys

Tyr

Ile

Val

His

Lys

Glu

Phe

Asp

Asp

Asp

Thr

Tyr

Asp

Asn

Asp

100

105

110

Ile.

Ala

Leu

Leu

Gin

Leu

Lys

Ser

Asp

Ser

Ser

Arg

Cys

Ala

Gin

Glu

115

120

125

• · · ·

Ser	Ser 130	Val	Val	Arg	Thr	Val 135	Cys
Pro 145	Asp	Trp	Thr	Glu	Cys 150	Glu	Leu
Leu	Ser	Pro	Phe	Tyr 165	Ser	Glu	Arg
Tyr	Pro	Ser	Ser 180	Arg	Cys	Thr	Sér
Thr	Asp	Asn 195	Met	Leu	Cys	Ala	Gly 200
Ala	Asn 210	Leu	His	Asp	Ala	Cys 215	Gin
Cys 225	Leu	Asn	Asp	Gly Arg 230	Met	Thr
Leu	Gly	Cys	Gly	Gin 245	Lys	Asp	Val
Asn	Tyr	Leu	Asp	Trp	Ile	Arg	Asp

260

Leu Pro Pro Ala Asp Leu Gin Leu . 140

Ser Gly Tyr Gly Lys His Glu Ala 155 160

Leu Lys Glu Ala His Val Arg Leu 170 175

Gin. His Leu Leu Asn Arg Thr Val 185 ... 190

Asp Thr Arg Ser Gly Gly Pro Gin 205

Gly Asp Ser Gly Gly Pro Leu Val 220

Leu Val Gly Ile Ile Ser Trp Gly 235 240

Pro Gly Val Tyr Thr Lys Val Thr 250 255

Asn Met Arg Pro

265 • ·· · • · • »

	63	♦ · · · : : .. · · j ·· ·· ··
2) Informace o SEQ ID NO: 19: (i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE: (A) DÉLKA: 527 aminokyselinových zbytků

(B) TYP: aminokyselinová (C) DRUH ŘETĚZCE:

(D) TOPOLOGIE:

(ii) DRUH MOLEKULY: protein (vi) PŮVODNÍ ZDROJ:

(A) ORGANIZMUS: Homo sapiens (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 19:

Ser 1

Tyr

Gin

Val

Ile 5

Cys Arg

Asp Glu Lys Thr Gin Met Ile Tyr

Gin

10

15

v:. ’’ Gin

His

Gin

Ser

Trp

Leu

Arg

Pro

Val

Leu

Arg

Ser

Asn

Arg

Val

Glu

20

25

30.

Tyr

Cys

Trp

Cys

Asn

Ser

Gly

Arg

Ala

Gin

Cys

His

Ser

•Val

Pro

Val

35

40

45

Lys

Ser

Cys

Ser.

Glu

Pro

Arg

Cys

Phe

Asn

Gly

Gly

Thr

Cys

Gin

Gin

50

55

60

Ala

Leu

Tyr

Phe

Ser

Asp

Phe

Val

Cys

Gin

Cys

Pro

Glu

Gly

Phe

Ala

65

70

75

80

Gly

Lyš

Cys

Cys

Glu

Ile

Asp

Thr

Arg

Ala

Thr

Cys

Tyr

Glu

Asp

Gin

90

Tyr 100	Arg	Gly	Thr	Trp	Ser 105	Thr	Ala
Trp	Asn	Ser	Ser	Ala 120	Leu	Ala	Gin
Asp	Ala	Ile	Arg 135	Leu	Gly	Leu	Gly
Asp	Arg	Asp 150	Ser	Lys	Pro	Trp	Cys 155
Ser	Ser 165	Glu	Phe	Cys	Ser	Thr 170	Pro
Cys 180	Tyr	Phe	Gly	Asn	Gly 185	Ser	Ala
Glu	Ser	Gly	Ala	Ser 200	Cys	Leu	Pro
Lys	Val	Tyr ‘Thr 215	Ala	Gin	Asn	Pro
Lys	His	Asn 230	Tyr	Cys	Arg	Asn	Pro 235
His	Val 245	Leu	Lys	Asn	Arg	Arg 250	Leu
Ser 260	Cys	Ser	Thr	Cys	Gly 265	Leu	Arg
Ile	Lys	Gly	Gly	Leu 280	Phe	Ala	Asp
Ala	Ile	Phe	Ala	Lys	His	Arg Arg

Glu Ser Gly Ala Glu 110

Lys Pro Tyr Ser Gly • 125

Asn His Asn Tyr Cys 140

Tyr Val Phe Lys Ala 160

Ala Cys Ser Glu Gly 175

Tyr Arg Gly Thr His 190

Trp Asn' Ser Met Ile 205

Ser Ala Gin Ala Leu 220

Asp Gly Asp Ala Lys 240

Thr Trp Glu Tyr Cys 255

Gin Tyr Ser Gin Pro 270

Ile Ala Ser His Pro 285

Ser Pro Gly Glu Arg • ·· ·

65

• · • · • · • · • · • ·

• · • · ·· • · • · • ·

• · • · • « • · · • « • ·

·· · « • • • • •

• · • • • · • • ·

290

295

300

Phe

Leu

Cys

Gly

Gly

Ile

Leu

Ile

Ser

Ser

Cys

Trp

Ile

Leu

Ser

Ala

305

310

315

320

Ala

His

Cys

Phe

Gin'

Glu

Arg

Phe

Pro

Pro

Eis

His

Leu

Thr

Val

Ile

325

330

335

Leu.

Gly

Arg

Thr

Tyr

Arg

Val

Val

Pro

Gly

Glu

Glu

Glu

Gin

Lys

Phe

340

345

350

Glu

Val

Glu

Lys

Tyr

Ile

Val

His

Lys

Glu

Phe

Asp

Asp

Asp

Thr

Tyr

355

360

365

Asp

Asn

Asp

Ile

Ala

Leu

Leu

Gin

Leu

Lys

Asp

Ser

'Ser

Arg

Cys

370

375

380

Ala

Gin

Glu

Ser

Ser

Val

Val

Arg

Thr

Val

Cys

Leu

Pro

Pro

Ala

Asp

385

390

395

400

Leu

Gin

Leu

Pro

Asp

Trp

Thr

Glu

Cys

Glu

Leu

Ser

Gly

Tyr

Gly

Lys

405

410

415

His

Glu

Ala

Leu

Ser

Pro

Phe

Tyr

Ser

Glu

Arg

Leu

Lys

Glu

Ala

His

420

425

430

Val

Arg

Leu

Tyr

Pro

Ser

Ser

Arg

Cys

Thr

Ser

Gin

His

Leu

Leu

Asn

435

440

445

Arg

Thr

Val

Thr

Asp

Asn

Met

Leu

Cys

Ala

Gly Asp

Thr

Arg

Ser

Gly

450

455

460

Gly

Pro

Gin

Ala

Asn

Leu

His

Asp

Ala

Cys

Gin

Gly Asp

Ser

Gly

Gly

465

470

475

480

Pro

Leu

Val

Cys

Leu

Asn

Asp

Gly

Arg

Met

Thr

Leu

Val

Gly

Ile

Ile

485

490

495

Ser

Trp

Gly

Leu

Gly

Cys

Gly

Gin

Lys

Asp

Val

Pro Gly

Val

Tyr

Thř

• · • 9 9

·· · · • · ··· ·

500 505 ' 510

Lys Val Thr Asn Tyr Leu Asp Trp Ile Arg Asp Asn Met Arg Pro 515 520 525 (2) Informace o SEQ ID NO: 20:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

	(A)	DÉLKA: 12 párů baží
	(B)	TYP: nukleová kyselina
	(C)	DRUH ŘETĚZCE:
	(D)	TOPOLOGIE:
(ii)	DRUH	MOLEKULY: DNA
(ix)	ZNAKY:
	(A)	Název/klíč: umělá sekvence
	(D)	Jiné informace:

/poznámka=kódující sekvence SEGN/ (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 20:

tctgagggaa ac (2) Informace o SEQ ID NO: 21:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 22 aminokyselinových zbytků (B) TYP: aminokyselinová (C) DRUH ŘETĚZCE:

(D) TOPOLOGIE:

(ii) DRUH MOLEKULY: protein (vi) PŮVODNÍ ZDROJ:

(A) ORGANIZMUS: Escherichia coli (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 21:

• · · ·

Met Lys Lys Thr Ala Ile Ala Ile Ala Val Ala Leu Ala Gly Phe Ala ^{1 5} 10 15

Thr Val Ala Gin Ala Ala 20 (2) Informace o SEQ ID NO: 22:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

	(A)	DÉLKA: 42 párů bázi
	(B)	TYP: nukleová kyselina
	(C)	DRUH ŘETĚZCE:
	(D)	TOPOLOGIE:
(ii)	DRUH	MOLEKULY: DNA
(ix)	ZNAKY:
	(A)	Název/klíč: umělá sekvence
	(D)	Jiné informace:

/poznámka=primer/ (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 22:

gaggaggagg tggcccaggc ggcctctgag ggaaacagtg ac 42 (2) Informace o SEQ ID NO: 23:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

	(A)	DÉLKA: 42 párů baží
	(B)	TYP: nukleová kyselina
	(C)	DRUH ŘETĚZCE:
	(D)	TOPOLOGIE:
(ii)	DRUH	MOLEKULY: DNA
(ix)	ZNAKY:
	(A)	Název/klíč: umělá sekvence
	(D)	Jiné informace:

/poznámka=primer/ (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 23:

gaggaggagc tggccggcct ggcccggtcg catgttgtca cg » · ·· · · • · · · · · (2) Informace o SEQ ID NO: 24:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

	(A)	DÉLKA: 26 párů baží
	(B)	TYP: nukleová kyselina
	(C)	DRUH ŘETĚZCE:
	(D)	TOPOLOGIE:
(ii)	DRUH	MOLEKULY: DNA
(ix)	ZNAKY:
	(A)	Název/klíč: umělá sekvence
	(D)	Jiné informace:

/poznámka=primer/ (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 24:

acatgcgacc gtgacaggcc ggccag (2) Informace o SEQ ID N0-: 25:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

	(A)	DÉLKA: 26 párů baží
	(B)	TYP: nukleová kyselina
	(C)	DRUH ŘETĚZCE:
	(D)	TOPOLOGIE:
(ii)	DRUH	MOLEKULY: DNA
(ix)	ZNAKY:
	(A)	Název/klíč: umělá sekvence
	(D)	Jiné informace:

/poznámka=primer/ (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 25:

ctggccggcc tgtcacggtc gcatgt • 999

f]/

PATENTOVÉ • · ·· • 9 9 ·

9 99 » * ·

9 9 ·

99

Claims (7)

1. NÁROKY « · 999 · • 9

   1. Způsob výroby aktivátoru tkáňového plazminogenu (tPA) odvozeného z rekombinatní DNA, varianty tPA, molekuly kringle 2 serinové proteinázy (K2S) nebo její varianty v prokaryontních buňkách vyznačující se tím, ž e uvedený tPA, jeho varianta, molekula K2S a její varianta se vylučovaly extrabuněčně jako aktivní, správně sbalený protein, přičemž prokaryontní buňka zahrnuje a exprimuje vektor obsahující DNA, která kóduje uvedený tPA, jeho variantu, molekulu K2S a její variantu a je operativně spojena s DNA kódující signální peptid OmpA.
2. 2. Způsob podle nároku 1, vyznačující se tím, ž e uvedená prokaryontní buňky zahrnuje a exprimuje vektor obsahující DNA, která kóduje uvedený tPA, jeho variantu, molekulu K2S nebo její variantu a je operativně spojena s DNA kódující signální peptid OmpA, který je operativně spojen s molekulou nukleové kyseliny definované sekvencí TCTGAGGGAAACAGTGAC (sekvence SEQ ID NO: 1) nebo jejího funkčního derivátu.
3. 3. Způsob podle nároku 1 nebo 2, vyznačující se tím, že prokaryontní buňkou je E. coli.
4. 4. Způsob podle libovolného z nároků 1 až 3, vyznačující se tím, že zahrnuje:

   a) DNA kódující tPA, jeho variantu, molekulu K2S nebo její variantu se amplifikuje pomocí PCR,

   b) produkt PCR se čistí,

   c) uvedený produkt PCR se začlenil do vektoru, který obsahuje DNA kódující signální peptid OmpA a DNA kódující gpIII, takovým způsobem, že uvedený produkt PCR je operativně

   0000 • 0

   0 0 0 • 00 0 0 0 0 • 0 0

   0 0 ·« 0000 • 0 ·

   0 0· spojen s 5' koncem DNA kódující signální sekvenci OmpA a s 3'koncem DNA kódující gpIII uvedeného vektoru,

   d) stop kodon se začlenil mezi uvedený tPA, jeho variantu, molekulu K2S nebo její variantu a gpIII,

   e) uvedený vektor se exprimuje v prokaryontní buňce,

   f) tPA, jeho varianta, molekula K2S nebo její varianta se čistí.
5. 5. Způsob podle libovolného z nároků 1 až 4, vyznačující se tím, že vektorem je fágemidový vektor obsahující DNA kódující signální peptid OmpA a DNA kódující gpIII.
6. 6. Způsob podle libovolného z nároků 1 až 5, vyznačující se tím, že vektorem je fágemid pComb3HSS.
7. 7. Způsob podle libovolného z nároků 1 až 6, vyznačující se tím, že sekvence DNA OmpA spojená s 5'koncem K2S obsahuje následující sekvenci nebo variantu způsobenou degenerovaným nukleotidovým kódem:

   ATGAAAAAGACAGCTATCGCGATTGCAGTGGCACTGGCTGGTTTCGCTACCGTGG

   CCCAGGCGGCCTCTGAGGGÁAACAGTGACTGCTACTTTGGGAATGGGTCAGCCT

   ACCGTGGCACGCACAGCCTCACCGAGTCGGGTGCCTCCTGCCTCCCGTGGAATTC

   CATGATCCTGATAGGCAAGGTTTACACAGCACAGAACCCCAGTGCCCAGGCACT

   GGGCCTGGGCAAACATAATTACTGCCGGAATCCTGATGGGGATGCCAAGCCCTG.

   GTGCCACGTGCTGAAGAACCGCAGGCTGACGTGGGAGTACTGTGATGTGCCCTCC

   TGCTCCACCTGCGGCCTGAGACAGTACAGCCAGCCTCAGTTTCGCATCAAAGGAG

   GGCTCTTCGCCGACATCGGCTCCCACCCCTGGCAGGCTGCCATCTTTGCCAAGCA

   CAGGAGGTCGCCCGGAGAGCGGTTCCTGTGCGGGGGCATACTCATCAGCTCCTGC

   TGGATTCTCTCTGCCGCCCACTGCTTCCAGGAGAGGTTTCCGCCCCACCACCTGA • · · ·· ·