CZ20031991A3 - Sekvence DNA kódující enzym fosfolipáza A1 z nálevníka Tetrahymena a její použití - Google Patents
Sekvence DNA kódující enzym fosfolipáza A1 z nálevníka Tetrahymena a její použití Download PDFInfo
- Publication number
- CZ20031991A3 CZ20031991A3 CZ20031991A CZ20031991A CZ20031991A3 CZ 20031991 A3 CZ20031991 A3 CZ 20031991A3 CZ 20031991 A CZ20031991 A CZ 20031991A CZ 20031991 A CZ20031991 A CZ 20031991A CZ 20031991 A3 CZ20031991 A3 CZ 20031991A3
- Authority
- CZ
- Czechia
- Prior art keywords
- seq
- nucleic acid
- sequence
- homologous
- proteins
- Prior art date
Links
- 102000015439 Phospholipases Human genes 0.000 title claims description 11
- 108010064785 Phospholipases Proteins 0.000 title claims description 11
- 241000223892 Tetrahymena Species 0.000 title description 20
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 title description 9
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 claims abstract description 29
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 claims abstract description 24
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 claims abstract description 24
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims abstract 2
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 65
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 49
- 108020004414 DNA Chemical group 0.000 claims description 12
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 claims description 12
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 claims description 12
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 12
- ZIIUUSVHCHPIQD-UHFFFAOYSA-N 2,4,6-trimethyl-N-[3-(trifluoromethyl)phenyl]benzenesulfonamide Chemical compound CC1=CC(C)=CC(C)=C1S(=O)(=O)NC1=CC=CC(C(F)(F)F)=C1 ZIIUUSVHCHPIQD-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 9
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 claims description 9
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 claims description 9
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 claims description 8
- 239000013598 vector Substances 0.000 claims description 8
- 241000700605 Viruses Species 0.000 claims description 6
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims description 6
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 claims description 5
- 241000248384 Tetrahymena thermophila Species 0.000 claims description 5
- 239000003623 enhancer Substances 0.000 claims description 5
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 claims description 5
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 claims description 4
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 claims description 4
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 claims description 3
- 241000233866 Fungi Species 0.000 claims description 3
- 241000282412 Homo Species 0.000 claims description 3
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 claims description 3
- 241000726445 Viroids Species 0.000 claims description 3
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 claims description 3
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims description 3
- LPLLVINFLBSFRP-UHFFFAOYSA-N 2-methylamino-1-phenylpropan-1-one Chemical compound CNC(C)C(=O)C1=CC=CC=C1 LPLLVINFLBSFRP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 1
- 240000003023 Cosmos bipinnatus Species 0.000 claims 1
- 235000005956 Cosmos caudatus Nutrition 0.000 claims 1
- 238000005215 recombination Methods 0.000 claims 1
- 230000006798 recombination Effects 0.000 claims 1
- 241000223782 Ciliophora Species 0.000 abstract description 4
- 108010013563 Lipoprotein Lipase Proteins 0.000 abstract description 4
- 102100022119 Lipoprotein lipase Human genes 0.000 abstract description 3
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 28
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 description 19
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 description 19
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 10
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 10
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 10
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 8
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 8
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 8
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 7
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 7
- 230000022131 cell cycle Effects 0.000 description 5
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 5
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 5
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 5
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 description 4
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 4
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 4
- 108010085377 beta-N-Acetylhexosaminidases Proteins 0.000 description 4
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 4
- 230000013595 glycosylation Effects 0.000 description 4
- 238000006206 glycosylation reaction Methods 0.000 description 4
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 4
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 3
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 3
- 102000007478 beta-N-Acetylhexosaminidases Human genes 0.000 description 3
- 230000010261 cell growth Effects 0.000 description 3
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 3
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 3
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 3
- 238000007852 inverse PCR Methods 0.000 description 3
- 230000008569 process Effects 0.000 description 3
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 3
- 239000013605 shuttle vector Substances 0.000 description 3
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 3
- 230000014616 translation Effects 0.000 description 3
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 3
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 2
- FVFVNNKYKYZTJU-UHFFFAOYSA-N 6-chloro-1,3,5-triazine-2,4-diamine Chemical compound NC1=NC(N)=NC(Cl)=N1 FVFVNNKYKYZTJU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000004382 Amylase Substances 0.000 description 2
- 102000013142 Amylases Human genes 0.000 description 2
- 108010065511 Amylases Proteins 0.000 description 2
- 108091035707 Consensus sequence Proteins 0.000 description 2
- 241000701022 Cytomegalovirus Species 0.000 description 2
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 description 2
- 108010033040 Histones Proteins 0.000 description 2
- 102000004157 Hydrolases Human genes 0.000 description 2
- 108090000604 Hydrolases Proteins 0.000 description 2
- 102000004882 Lipase Human genes 0.000 description 2
- 108090001060 Lipase Proteins 0.000 description 2
- 239000004367 Lipase Substances 0.000 description 2
- 108700026226 TATA Box Proteins 0.000 description 2
- 108091023045 Untranslated Region Proteins 0.000 description 2
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 2
- 235000019418 amylase Nutrition 0.000 description 2
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 2
- 238000005571 anion exchange chromatography Methods 0.000 description 2
- YPHMISFOHDHNIV-FSZOTQKASA-N cycloheximide Chemical compound C1[C@@H](C)C[C@H](C)C(=O)[C@@H]1[C@H](O)CC1CC(=O)NC(=O)C1 YPHMISFOHDHNIV-FSZOTQKASA-N 0.000 description 2
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 2
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 2
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 2
- 210000003000 inclusion body Anatomy 0.000 description 2
- NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N insulin Chemical compound N1C(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(NC(=O)CN)C(C)CC)CSSCC(C(NC(CO)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CCC(N)=O)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CSSCC(NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2C=CC(O)=CC=2)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(C)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2NC=NC=2)NC(=O)C(CO)NC(=O)CNC2=O)C(=O)NCC(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)NC(C(C)O)C(=O)N3C(CCC3)C(=O)NC(CCCCN)C(=O)NC(C)C(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(O)=O)=O)NC(=O)C(C(C)CC)NC(=O)C(CO)NC(=O)C(C(C)O)NC(=O)C1CSSCC2NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CC(N)=O)NC(=O)C(NC(=O)C(N)CC=1C=CC=CC=1)C(C)C)CC1=CN=CN1 NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 235000019421 lipase Nutrition 0.000 description 2
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 2
- 150000003904 phospholipids Chemical class 0.000 description 2
- 239000000047 product Substances 0.000 description 2
- 238000000734 protein sequencing Methods 0.000 description 2
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 2
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 2
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 2
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 2
- UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N streptomycin Chemical compound CN[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@](C=O)(O)[C@H](C)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@H]1O UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N 0.000 description 2
- 230000008685 targeting Effects 0.000 description 2
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 2
- 238000000108 ultra-filtration Methods 0.000 description 2
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 2
- 101710149506 28 kDa protein Proteins 0.000 description 1
- 108010011619 6-Phytase Proteins 0.000 description 1
- SYMHUEFSSMBHJA-UHFFFAOYSA-N 6-methylpurine Chemical compound CC1=NC=NC2=C1NC=N2 SYMHUEFSSMBHJA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000013563 Acid Phosphatase Human genes 0.000 description 1
- 108010051457 Acid Phosphatase Proteins 0.000 description 1
- 102000007469 Actins Human genes 0.000 description 1
- 108010085238 Actins Proteins 0.000 description 1
- 102000007698 Alcohol dehydrogenase Human genes 0.000 description 1
- 108010021809 Alcohol dehydrogenase Proteins 0.000 description 1
- 108010025188 Alcohol oxidase Proteins 0.000 description 1
- 229930183010 Amphotericin Natural products 0.000 description 1
- QGGFZZLFKABGNL-UHFFFAOYSA-N Amphotericin A Natural products OC1C(N)C(O)C(C)OC1OC1C=CC=CC=CC=CCCC=CC=CC(C)C(O)C(C)C(C)OC(=O)CC(O)CC(O)CCC(O)C(O)CC(O)CC(O)(CC(O)C2C(O)=O)OC2C1 QGGFZZLFKABGNL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101100437118 Arabidopsis thaliana AUG1 gene Proteins 0.000 description 1
- 241000193830 Bacillus <bacterium> Species 0.000 description 1
- 235000014469 Bacillus subtilis Nutrition 0.000 description 1
- 108010077805 Bacterial Proteins Proteins 0.000 description 1
- 101000609456 Beet necrotic yellow vein virus (isolate Japan/S) Protein P26 Proteins 0.000 description 1
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 1
- 241000701489 Cauliflower mosaic virus Species 0.000 description 1
- 241000282693 Cercopithecidae Species 0.000 description 1
- 101710137943 Complement control protein C3 Proteins 0.000 description 1
- 239000003155 DNA primer Substances 0.000 description 1
- -1 DS47 Proteins 0.000 description 1
- 101100125027 Dictyostelium discoideum mhsp70 gene Proteins 0.000 description 1
- 108090000204 Dipeptidase 1 Proteins 0.000 description 1
- 241000701832 Enterobacteria phage T3 Species 0.000 description 1
- YQYJSBFKSSDGFO-UHFFFAOYSA-N Epihygromycin Natural products OC1C(O)C(C(=O)C)OC1OC(C(=C1)O)=CC=C1C=C(C)C(=O)NC1C(O)C(O)C2OCOC2C1O YQYJSBFKSSDGFO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000003951 Erythropoietin Human genes 0.000 description 1
- 108090000394 Erythropoietin Proteins 0.000 description 1
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 1
- 241000206602 Eukaryota Species 0.000 description 1
- 108050001049 Extracellular proteins Proteins 0.000 description 1
- 108010071241 Factor XIIa Proteins 0.000 description 1
- 241000192125 Firmicutes Species 0.000 description 1
- 230000005526 G1 to G0 transition Effects 0.000 description 1
- 102000048120 Galactokinases Human genes 0.000 description 1
- 108700023157 Galactokinases Proteins 0.000 description 1
- 108700028146 Genetic Enhancer Elements Proteins 0.000 description 1
- 101150031823 HSP70 gene Proteins 0.000 description 1
- 108090001061 Insulin Proteins 0.000 description 1
- 102000004877 Insulin Human genes 0.000 description 1
- 108010002350 Interleukin-2 Proteins 0.000 description 1
- 102000000588 Interleukin-2 Human genes 0.000 description 1
- 241001138401 Kluyveromyces lactis Species 0.000 description 1
- 241000235058 Komagataella pastoris Species 0.000 description 1
- QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N L-tryptophane Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N 0.000 description 1
- 102000003960 Ligases Human genes 0.000 description 1
- 108090000364 Ligases Proteins 0.000 description 1
- 102100024295 Maltase-glucoamylase Human genes 0.000 description 1
- 241000320412 Ogataea angusta Species 0.000 description 1
- 108010038807 Oligopeptides Proteins 0.000 description 1
- 102000015636 Oligopeptides Human genes 0.000 description 1
- 239000002033 PVDF binder Substances 0.000 description 1
- 229930182555 Penicillin Natural products 0.000 description 1
- JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N Penicillin G Chemical compound N([C@H]1[C@H]2SC([C@@H](N2C1=O)C(O)=O)(C)C)C(=O)CC1=CC=CC=C1 JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N 0.000 description 1
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 1
- 102000006448 Phospholipases A1 Human genes 0.000 description 1
- 241000235648 Pichia Species 0.000 description 1
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 1
- 102000001708 Protein Isoforms Human genes 0.000 description 1
- 108010029485 Protein Isoforms Proteins 0.000 description 1
- 108090001066 Racemases and epimerases Proteins 0.000 description 1
- 102100037486 Reverse transcriptase/ribonuclease H Human genes 0.000 description 1
- 101100273253 Rhizopus niveus RNAP gene Proteins 0.000 description 1
- 241000283984 Rodentia Species 0.000 description 1
- 241000235070 Saccharomyces Species 0.000 description 1
- 241001468001 Salmonella virus SP6 Species 0.000 description 1
- VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M Sodium acetate Chemical compound [Na+].CC([O-])=O VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 101001116809 Solanum tuberosum Patatin group M-1 Proteins 0.000 description 1
- 108091081024 Start codon Proteins 0.000 description 1
- 239000012505 Superdex™ Substances 0.000 description 1
- 101710152003 Suppressor of silencing P0 Proteins 0.000 description 1
- 101710137500 T7 RNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- 241000248418 Tetrahymena pyriformis Species 0.000 description 1
- 108010022394 Threonine synthase Proteins 0.000 description 1
- 102000003978 Tissue Plasminogen Activator Human genes 0.000 description 1
- 108090000373 Tissue Plasminogen Activator Proteins 0.000 description 1
- 108090000631 Trypsin Proteins 0.000 description 1
- 102000004142 Trypsin Human genes 0.000 description 1
- QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N Tryptophan Natural products C1=CC=C2C(CC(N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108090000704 Tubulin Proteins 0.000 description 1
- IXKSXJFAGXLQOQ-XISFHERQSA-N WHWLQLKPGQPMY Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C1=CNC=N1 IXKSXJFAGXLQOQ-XISFHERQSA-N 0.000 description 1
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 1
- 239000004480 active ingredient Substances 0.000 description 1
- 239000013543 active substance Substances 0.000 description 1
- 238000005273 aeration Methods 0.000 description 1
- 108010028144 alpha-Glucosidases Proteins 0.000 description 1
- BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N ammonium sulfate Chemical compound N.N.OS(O)(=O)=O BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052921 ammonium sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011130 ammonium sulphate Nutrition 0.000 description 1
- 229940009444 amphotericin Drugs 0.000 description 1
- APKFDSVGJQXUKY-INPOYWNPSA-N amphotericin B Chemical compound O[C@H]1[C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](C)O[C@H]1O[C@H]1/C=C/C=C/C=C/C=C/C=C/C=C/C=C/[C@H](C)[C@@H](O)[C@@H](C)[C@H](C)OC(=O)C[C@H](O)C[C@H](O)CC[C@@H](O)[C@H](O)C[C@H](O)C[C@](O)(C[C@H](O)[C@H]2C(O)=O)O[C@H]2C1 APKFDSVGJQXUKY-INPOYWNPSA-N 0.000 description 1
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 1
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 1
- 230000003698 anagen phase Effects 0.000 description 1
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 1
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 1
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 1
- 101150009206 aprE gene Proteins 0.000 description 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 238000011138 biotechnological process Methods 0.000 description 1
- 238000013452 biotechnological production Methods 0.000 description 1
- OWMVSZAMULFTJU-UHFFFAOYSA-N bis-tris Chemical compound OCCN(CCO)C(CO)(CO)CO OWMVSZAMULFTJU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 1
- 230000006037 cell lysis Effects 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 210000004978 chinese hamster ovary cell Anatomy 0.000 description 1
- WIIZWVCIJKGZOK-RKDXNWHRSA-N chloramphenicol Chemical compound ClC(Cl)C(=O)N[C@H](CO)[C@H](O)C1=CC=C([N+]([O-])=O)C=C1 WIIZWVCIJKGZOK-RKDXNWHRSA-N 0.000 description 1
- 229960005091 chloramphenicol Drugs 0.000 description 1
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 1
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 1
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 1
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 description 1
- 210000000805 cytoplasm Anatomy 0.000 description 1
- 230000020176 deacylation Effects 0.000 description 1
- 238000005947 deacylation reaction Methods 0.000 description 1
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 1
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 1
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 1
- 238000013461 design Methods 0.000 description 1
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 1
- 101150052825 dnaK gene Proteins 0.000 description 1
- 229940105423 erythropoietin Drugs 0.000 description 1
- 230000007717 exclusion Effects 0.000 description 1
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 1
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 1
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 1
- 238000003306 harvesting Methods 0.000 description 1
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 1
- 238000004191 hydrophobic interaction chromatography Methods 0.000 description 1
- 230000016784 immunoglobulin production Effects 0.000 description 1
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 description 1
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 1
- 229940125396 insulin Drugs 0.000 description 1
- 229930027917 kanamycin Natural products 0.000 description 1
- 229960000318 kanamycin Drugs 0.000 description 1
- SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N kanamycin Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CN)O[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N 0.000 description 1
- 229930182823 kanamycin A Natural products 0.000 description 1
- 125000002669 linoleoyl group Chemical group O=C([*])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])/C([H])=C([H])\C([H])([H])/C([H])=C([H])\C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])[H] 0.000 description 1
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 1
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 1
- 210000004898 n-terminal fragment Anatomy 0.000 description 1
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 1
- 229940049954 penicillin Drugs 0.000 description 1
- 210000001322 periplasm Anatomy 0.000 description 1
- 125000001997 phenyl group Chemical group [H]C1=C([H])C([H])=C(*)C([H])=C1[H] 0.000 description 1
- 229940085127 phytase Drugs 0.000 description 1
- 230000008488 polyadenylation Effects 0.000 description 1
- 229920002981 polyvinylidene fluoride Polymers 0.000 description 1
- 239000011148 porous material Substances 0.000 description 1
- OXCMYAYHXIHQOA-UHFFFAOYSA-N potassium;[2-butyl-5-chloro-3-[[4-[2-(1,2,4-triaza-3-azanidacyclopenta-1,4-dien-5-yl)phenyl]phenyl]methyl]imidazol-4-yl]methanol Chemical compound [K+].CCCCC1=NC(Cl)=C(CO)N1CC1=CC=C(C=2C(=CC=CC=2)C2=N[N-]N=N2)C=C1 OXCMYAYHXIHQOA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- 239000013615 primer Substances 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 108010064037 prorennin Proteins 0.000 description 1
- 230000018883 protein targeting Effects 0.000 description 1
- 230000002797 proteolythic effect Effects 0.000 description 1
- 238000012340 reverse transcriptase PCR Methods 0.000 description 1
- 238000003757 reverse transcription PCR Methods 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 1
- 238000001542 size-exclusion chromatography Methods 0.000 description 1
- 235000017281 sodium acetate Nutrition 0.000 description 1
- 239000001632 sodium acetate Substances 0.000 description 1
- 229960005322 streptomycin Drugs 0.000 description 1
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 1
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 1
- 229960000187 tissue plasminogen activator Drugs 0.000 description 1
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 1
- 230000005030 transcription termination Effects 0.000 description 1
- 230000002103 transcriptional effect Effects 0.000 description 1
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 1
- 230000032258 transport Effects 0.000 description 1
- 239000012588 trypsin Substances 0.000 description 1
- 238000000539 two dimensional gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 241000701161 unidentified adenovirus Species 0.000 description 1
- 235000013311 vegetables Nutrition 0.000 description 1
- 238000012795 verification Methods 0.000 description 1
- 239000013603 viral vector Substances 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
- C12N15/52—Genes encoding for enzymes or proenzymes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/14—Hydrolases (3)
- C12N9/16—Hydrolases (3) acting on ester bonds (3.1)
- C12N9/18—Carboxylic ester hydrolases (3.1.1)
- C12N9/20—Triglyceride splitting, e.g. by means of lipase
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Y—ENZYMES
- C12Y301/00—Hydrolases acting on ester bonds (3.1)
- C12Y301/01—Carboxylic ester hydrolases (3.1.1)
- C12Y301/01032—Phospholipase A1 (3.1.1.32)
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Description
Sekvence DNA kódující enzym fosfolipáza Ax z nálevníka Tetrahymena a její použití
Oblast techniky
Vynález se týká nukleové kyseliny kódující fosfolipázu Αχ a jejího použití podle nároků 1 až 5.
Dosavadní stav techniky
Kvasinky, bakterie a savčí buňky mají velký význam pro biotechnologickou přípravu a produkci rekombinantních účinných látek pomocí heterologní exprese cizích genů. Bakteriální expresní systémy založené na E.coli nebo B.subtilis jsou používány pro produkci rekombinantních peptidů nebo proteinů, jako je insulin, interleukin-2, tkáňový aktivátor plasminogenu, proteázy a lipázy.U Gramnegativních bakterií jsou expresní systémy většinou založeny na použití genetických prvků, jako je lac operon nebo tryptofanový operon. Proteiny cizorodé pro hostitele jsou produkovány buďto do „inkluzních tělísek uvnitř buňky, nebo, jestliže je expresní systém založen na použití β-laktamázových genů, do periplasmatického prostoru. Zatím nebyla provedena produkce rekombinantních proteinů do obklopujícího fermentačního média. Až dosud byly u Grampozitivních bakterií téměř výlučně zaváděny do expresních systémů a exprimovány buňkám vlastní proteiny.
Kvasinky, jako je S.cerevisiae, Hansenula polymorpha, Kluyveromyces lactis nebo Pichia pastoris, jsou rovněž používány pro heterologní expresi rekombinantních proteinů, jako je lidský faktor XlIIa, bovinní pro-chymosin, fytáza nebo povrchové antigeny. V tomto případě jsou expresní systémy založeny na kyvadlových vektorech (vektory mající
• · · · • · « 9 9 9 9 9 9
9 9 9 9 9 9 99 9
9 99 9 9 9 9 9 · · • · · · · ······ · · jak kvasinkový, tak bakteriální podíl), které jsou založeny (v závislosti na druhu kvasinky) na genetických prvcích galaktokinázy, epimerázy, methanol oxidázy, kyselé fosfatázy nebo alkohol dehydrogenázy. Zpravidla je rekombinantní protein produkován do cytoplasmy buňky. Jestliže jsou použity vlastní kvasinkové signální sekvence, jako je alfa faktor, rovněž mohou být exprimované proteiny sekretovány do fermentačního média. Glykosylace sekretovaných proteinů je provedena jako typ „high manose a často probíhají hyperglykosylace na proteinu, které mohou vést k tvorbě protilátek u pacienta.
Savčí buňky, jako jsou různé buněčné typy z hlodavců (CHO buňky, C127 buňky) nebo z opic (vero, CV-1 nebo COS buňky), jsou rovněž používány pro heterologní expresi rekombinantních proteinů. V tomto případě jsou expresní systémy založeny na rekombinantních virech (BPV vektor) nebo na kyvadlových vektorech. Pro regulaci exprese jsou používány virové SV40 zesilovací/promotorové systémy nebo buněčné zesilující elementy. Rekombinantní proteiny, jako je erythropoietin, jsou sekretovány do fermentačního média, neboť cizí geny obvykle nesou své vlastní signální sekvence, které jsou rozpoznávány expresním systémem a jsou používány k nasměrování.
Kromě toho jsou pro biotechnologickou produkci glykosylovaných extracelulárních enzymů používány protozoa (prvoci) rodu Tetrahymena. Tetrahymena roste na nenákladném fermentačním médiu za použití standardních fermentačních metod. Pro transformaci takových buněk Tetrahymena jsou dostupné vektory, které jsou založeny na elementech rDNA. z Tetrahymena Pro heterologní expresi bakteriálních proteinů v Tetrahymena jsou používány konstrukty DNA připravené z genů z Tetrahymena. Jestliže jsou dostupné vhodné genetické prvky pro regulaci transkripce, nasměrování a • · · · · · • ·· 00 0 0 • · 0 · 0 · 0 ·· ·
0·0 0 0 0 · · · ·
0 0 0 0 «00000 0 0 • 0 · · · · ·' · 0 · · · · 0 0« 00 00 ·· glykosylaci cizích proteinů, je Tetrahymena ideálním expresním systémem pro nenákladný způsob výroby terapeutických rekombinantních proteinů.
Až dosud používané Gram-negativní bakteriální expresní systémy obvykle vedou k tvorbě „inkluzních tělísek v buňce, spojené s denaturací proteinů. Pro získání rekombinantního proteinu musí buňky být lyžovány a denaturovaný inaktivovaný protein musí být zpětně poskládán, aby byl funkční. Toto představuje dodatečné nákladné stupně způsobu a snižuje výtěžek požadovaného proteinu. Glykosylace, která je u eukaryontních proteinů významná, je kompletně vynechána. Jestliže je použit bakteriální expresní systém, je degradace dalším problémem cílového proteinu díky vysoké proteolytické aktivitě ve fermentační půdě.
Jestliže jsou použity kvasinky pro heterologní expresi, požadovaný cílový protein je rovněž produkován pouze do buňky, ze které musí být odstraněn pomocí lyže buněk. Podobně jako v bakteriálním expresním systému, způsobuje tato skutečnost dodatečné časově a finančně nákladné stupně způsobu. Jestliže jsou použity vlastní kvasinkové signální sekvence, nejsou cizí proteiny správně sestřihány a glykosylovány pro sekreci.
Naopak, jestliže je pro produkci rekombinantních proteinů použit savčí buněčný systém, jsou.požadované proteiny nalézány ve fermentačním médiu v extracelulárním stavu, správně sestřihány a glykosylovány. Nicméně, nevýhodou je, že na jedné straně dochází k nízké hladině exprese díky nedokonalé úpravě a neúčinné translaci genů, které byly zavedeny do genomu produkční buněčné linie prostřednictvím virálních vektorů. Na druhé straně jsou fermentační média pro savčí buňky obsahující sérum extrémně finančně nákladná. Kromě toho je fermentační technologie • · · · ··· · · · · · « · ·«·· · · · · · · · • · ··· ······ · · ··· ·· · ···· ··· · · · · · · · · · · pro buněčné linie citlivé na střih komplikovaná a podobně nákladná díky konstrukci bezbublinové aerace. Další problémy vznikají z vysokého rizika mykoplasmatické a virové infekce buněčných linií. Shrnuto, použití savčích buněk pro biotechnologický způsob přípravy rekombinantních proteinů má přináší velmi vysoké náklady, bezpečnostní požadavky a nízké výtěžky.
S použitím nálevníků, jako je Tetrahymena, odpadají výše uvedené nevýhody při produkci rekombinantních proteinů. Tak například, některé kyselé hydrolázy, které působí při trávení částic potravy, jsou vylučovány z buněk ve velkých množstvích a s komplexní glykosylací.
Alam et al., J.Euk.Microbiol., 43 (4), 1996, 295-303 popisuje klonování genu, který kóduje kyselou α-glukosidázu z Tetrahymena pyriformis. Nicméně, pouze malý podíl proteinu je vylučován z buněk . Kromě toho, Mezinárodní patentová přihláška PCT/EP 00/01853 popisuje gen pro β-hexosaminidázu z Tetrahymena thermophila, o které je nicméně známo, že je vylučována z buňky pouze z 80 %.
Až dosud nebylo možné exprimovat glykosylované eukaryontní proteiny v Tetrahymena s výlučnou sekrecí do fermentačního prostředí. Je to proto, že sekvence DNA pro extracelulární proteiny vlastní Tetrahymena, které jsou nezbytné pro konstrukci expresních vektorů a které jedinečně exportují cizí protein do obklopujícího fermentačního média, nebyly až dosud známy. Jsou známy sekvence DNA, které kódují protein β-hexosaminidázu z Tetrahymena thermophila. Takové sekvence byly popsány v přihlášce vynálezu číslo DE 199 58 979.8, DE 199 09 189.7 a PCT/EP 00/01853. Nicméně, nevýhodou těchto sekvencí je, že v nich obsažené pre/propeptidy způsobuji uvolňování požadovaného pro hostitele cizího proteinu do obklopujícího fermentačního média pouze z 80 %. Je to dáno skutečností, • · • · · · ·· · · · · · ·· · • · · · · ·· · · · · • · ··· ······ · · ··· · · · · · · · ·· · ·· ·· ·· · · ·· že za normálních podmínek je enzym β-hexosaminidáza přítomna uvnitř membrány přibližně až z 20 % a pouze 80 % přirozeně produkovaného enzymu je vylučováno z buněk.
Z tohoto důvodu pre/propeptidy β-hexosaminidázy, jestliže jsou metodami genetického inženýrství umístěny před protein cizí pro hostitele, nasměrují pouze přibližně 20 % cizorodého proteinu do cytoplasmatické membrány na povrchu Tetrahymena thermophila. Toto je spojeno s významnou nevýhodou technologie postupu pro způsob přípravy rekombinantních účinných látek. Na jedné straně, je výtěžek snižován, protože část exprimovaného proteinu zůstává v buňkách vázána k membráně, a proto není možné purifikovat veškerý exprimovaný protein z fermentační půdy. Na druhé straně pro hostitele cizí protein může v buněčné membráně projevovat toxické účinky pro hostitele, a tak snižovat buněčný růst.
Kromě toho, žádné konstitutivní promotory z Tetrahymena, které způsobují odpovídající nebo kontinuální transkripci heterologních proteinů, nejsou až dosud známy. Dosud jsou známy pouze promotory histonových a tubulinových genů (Bannon et al., 1984, Gaertig et al.,
1993). Nicméně, zásadní nevýhodou těchto promotorů je, že jejich aktivace je závislá na buněčném cyklu. Geny pro heterologní protein, které jsou spojeny s takovými na buněčném cyklu závisejícími promotory, jsou exprimovány pouze v rostoucích a dělících se buňkách. Toto má závažné nevýhody pro technologii postupu, neboť požadovaný protein je tak produkován pouze v logaritmické fázi růstu. Ve stacionární fázi růstu, ve kterém je dosaženo nejvyšší hustoty buněk a tím nejvyššího výkonu exprimovaného organismu (Tetrahymena) ve způsobu produkce, je stěží zachován buněčný růst, a tak se uskutečňuje pouze nízká exprese heterologního proteinu.
• ·· · · ·· ··«··· ··· ♦··· · · · • · · · · 4 · · · · · •4 ··· ······ · · • · · · · · ···· ····· ·· ·· ·· 44
Podstata vynálezu
Cílem vynálezu je poskytnout systém, který umožňuje produkci heterologních proteinů z buněk do fermentačního média v expresním systému, kterým je transformovaný nálevník Tetrahymena
Tohoto cíle je dosaženo systémem, v němž je použito nukleové kyseliny, která má sekvenci SEQ ID NO:1, kódující fosfolipázu Αχ (SEQ IDNO:7). Během kultivačních podmínek.produkt exprese této DNA výhodně exportován z buňky ve velkém množství. Exprimovaný protein je uvolňován do obklopujícího kultivačního média ve velkém množství a není obsažen v membráně. Sekvence nukleové kyseliny podle vynálezu obsahuje promotor, který způsobuje konstitutivní, tj. na buněčném cyklu nezávislou, transkripci po směru genů pro heterologní proteiny. Taková konstitutivní transkripce má tu výhodu, že proteiny jsou kontinuálně exprimovány pomocí heterologní exprese v hostitelském organismu, aniž by byla ovlivněna buněčným cyklem. Z tohoto důvodu je transkripce cizího genu účinná a heterologní protein je exprimován rovněž během stacionární růstové fáze bez buněčného růstu.
Sekvence DNA pro fosfolipázu Αχ podle vynálezu obsahuje výhodně oblast „proti směru PLAi (SEQ ID N0:2), která nese prvky promotoru pro iniciaci transkripce, signální peptid a propeptid, další genetické elementy pro nasměrováni proteinu, a zejména PLAx oblast „po směru (SEQ ID NO:3), která obsahuje genetické prvky pro ukončení transkripce. Použití těchto nukleových kyselin ve vektoru umožňuje expresi heterologně exprimovaných proteinů nezávisle na buněčném cyklu a jejich transport ven z buňky do obklopujícího kultivačního média, aniž by exprimované proteiny byly inkorporovány do cytoplasmatické membrány, a • toto ·· ·· • · to to to · to ···· · ·· · ·· ··· ····· • · · ·· ·· ·· ·« takové proteiny mohou být izolovány z fermentační půdy bez buněčné lyže.
Obrázek 1 uvádí nukleovou kyselinu kódující oblast „proti směru (SEQ ID NO:2), kódující oblast (SEQ ID NO:1) a oblast „po směru (SEQ ID NO:3) pro fosfolipázu Ai z nálevníků.
Obrázek 2 uvádí produkt exprese odpovídající nukleové kyselině podle SEQ ID NO:1. Vynález se také týká proteinu podle SEQ ID NO:7.
Konkrétně se vynález týká signální sekvence (SEQ ID NO:6) proteinu podle vynálezu. Výhodně se jedná o aminokyseliny 1 až 110 proteinu podle vynálezu (SEQ ID NO:5). Vynález se rovněž týká nukleové kyseliny kódující N-terminální fragment (SEQ ID NO:3). Jedná se přednostně o fragment nukleových kyselin podle vynálezu (SEQ ID NO:4), zejména mající nukleové kyseliny 1 až 155 podle Obrázku 1.
Sekvence nukleové kyseliny netranslatové oblasti („oblast proti směru) (SEQ ID NO:2) umístěná opačně do protisměru k oblasti kódující PLAX z Tetrahymena , je umístěna mezi pozici -275 a pozicí -1 (znázorněno malými písmeny). Stanovená netranslatovaná oblast obsahuje 275 baží. Jako prvky promotoru jsou přítomny TATA box v pozicích -49 až -55 (tištěno tučně), předpokládaný CAAT box mezi baží -133 a baží -136 (tištěno tučně). Rozsah kódující sekvence cDNA je znázorněn velkými písmeny. Číslování sekvence začíná start kodónem ATG. Oblasti známé ze sekvenování proteinu jsou v rámečku a stop kodón je podtržen. Zralý protein je kódován od baze 331. Sekvenční pořadí od baze 1 do baze 330 přestavuje pre/pro sekvenci (SEQ ID NO:8) PLAX. Sekvenční pořadí od baze 331 do baze 963 je sekvencí zralé PLAX. (SEQ ID NO:9) . V pozici 961 je translační stop kodón TGA a v pozici 1039 je polyadenylačni signál AAT AAA. Sekvence nukleové kyseliny od pozice 964 do • · · · • · · · · · · · · • ♦ · 4 4*4 · · * • · · · 4 44 · 4 4 4
444 444444 4 4
444 4 4 44 44 4 4 44 pozice 1134, která je uvedena pod kódující sekvencí pro PLAi z Tetrahymena, znázorňuje sekvenci „oblasti po směru PLAi. (SEQ ID NO:3), která není translatována (rovněž je uvedena malými písmeny). Od pozice 964 až do pozice 1101 je oblast známá ze sekvenování cDNA, která byla rovněž potvrzena inverzní PCR. Po transkripci je připojen póly(A)konec k poslednímu kodónu mRNA (ttt, pozice 1098-1101).
Dalším aspektem vynálezu je použití sekvence nukleové kyseliny pro kyselé hydrolázy podle vynálezu nebo jejich částí pro homologní nebo heterologní expresi rekombinantních proteinů a peptidů a pro homologní nebo heterologní rekombinaci („knock-out - vyřazení, „gene replacement- genová substituce), ve které jsou nálevníci tranfektováni nukleovou kyselinou podle vynálezu.
Nukleové kyseliny nebo jejich části mohou být kombinovány, konkrétně se zesilovači, promotory, operátory, počátky, terminátory, geny rezistence na antibiotika, které jsou běžné pro homologní nebo heterologní expresi proteinů, nebo s jinými nukleovými kyselinami nebo fragmenty DNA, nebo se všemi typy sekvencí z viroidů, virů, bakterií, archezoí, protozoí, hub, rostlin, zvířat nebo lidí.
Konkrétně je nukleová kyselina podle vynálezu obsažena ve vektoru, plasmidu, kosmidu, chromozomu nebo minichromozomu, transposonu, elementu IS, rDNA, nebo ve všech typech cirkulární nebo lineární DNA nebo RNA.
Vynález se také týká způsobu, ve kterém nukleová kyselina nebo její části podle vynálezu, které kódují fosfolipázu Αχ, jsou kombinovány v homologní nebo heterologní expresi s obvyklými zesilovači, jako je oblast NF-1 (cytomegalovirový zesilovač), promotory, jako je lac, trc, tic nebo tac promotor, promotory třídy II a III systému T7 RNAP (T7 RNA polymeráza), promotory bakteriofága T7 a SP6, aprE, amylázový nebo spac promotor pro systémy • * ·» ·· ··· · • · · · · « · • · » · · · · • ·····« · · exprese v druhu Bacillus, A0X1, AUG1 a 2 nebo GAPp promotory (Pichia) pro systémy exprese v kvasinkách, RSV promotor (virus SV40), CMV promotor (Cytomegalovirus), AFP promotor (adenoviry) nebo metallothioninové promotory pro expresi v savčích systémech, promotory víru Sindibis nebo promotory viru Semlike forest pro hmyzí buňky, promotory pro hmyzí systémy exprese, jako je hsp70, DS47, aktin 5C nebo copia, specifické rostlinné promotory, jako je promotor 35S, (virus květákové mozaiky), amylázový promotor,nebo patatinový promotor třídy I, operátory, jako je tet operátor, signální peptidy, jako je a-MF preprosignální sekvence (Saccharomyces), počátky, terminátory, geny pro rezistenci na antibiotika a jiné látky, jako je ampicillin, kanamycin, streptomycin, chloramfenikol, penicilín, amfotericin, cykloheximid, 6-methylpurin, paromycin, hygromycin, a-amanatin, auxotrofní markéry, jako je gen pro dihydrofolát reduktázu, nebo jiné nukleové kyseliny nebo fragmenty DNA, nebo všechny typy sekvencí z viroidů, virů, baktérií, archezoí, protozoí, hub, rostlin, zvířat nebo lidí.
Konkrétně, nukleová kyselina nebo její část podle vynálezu jsou včleněny do vektoru, plasmidu, kosmidu , chromozomu nebo minichromozomu, transposonu, IS elementu, rDNA, nebo všech typů cirkulární nebo lineární DNA nebo RNA.
Pro odborníka v oboru je zřejmé, že nukleové kyseliny mající alespoň 40% homologii s nukleovou kyselinou podle SEQ ID NO:1 mohou být použity podle vynálezu. Protein odpovídající SEQ ID NO:2 může být modifikován bez ztráty své funkce. Tak například mohou být provedeny tzv. konzervativní záměny aminokyselin. Například mohou být provedeny vzájemné výměny hydrofobních aminokyselin.
• · · ·
9 9 9 9 9 9 9 9 9
9 99 9 9 9 9 9 9 · • · 999 999999 9 9
9 9 9 9 · 9 · 9 · ··» 99 9 9 9 9 99 99
Pro čištění a izolaci fosfolipázy Ax z Tetrahymena a pro stanovení její sekvence mohou být použity následující postupy.
Příklady provedení vynálezu
Získání PLAi
PLAi byla získána z bezbuněčného supernatantu z Tetrahymena thermophíla. Buňky byly fermentovány ve 21 fermentorech (Biostat MD, Braun Diessel Biotech, Melsungen, Germany), které byly řízeny digitální řídící jednotkou (DCU, digital controlling unit). Fermentor nejprve pracoval po dobu 24 hodin vsádkovým systémem a pak kontinuálně. Sklizení bezbuněčného supernatantu bylo zajištěno promývacím modulem, který měl velikost pórů přibližně 0,3 μιη (S6/2, Wuppertal) .
Fermentace probíhala za následujících parametrů:
. pracovní objem byl 2 litry;
. rychlost promývání byla 2 litry/den;
. otáčky míchadla byly stanoveny na 800 rpm (ot./min.);
. teplota byla konstantní 30 °C;
. hodnota pH byla udržována konstantní na pH 7;
. inokulační titr byl 50 000 buněk/ml.
Pro fermentaci byl použit kmen SB1868 VII. Jedná se o kmen divokého typu (standardní) Tetrahymena thermophíla. Fermentace probíhala po dobu 264 hodin a sklizeny výtěžek byl testován na aktivitu PLAiČištění PLAi
Pro čištění PLAX byl použit 1 litr bezbuněčného supernatantu z fermentace, který byl smíchán se 140 g • 44 ·
síranu amonného a zakoncentrován pomocí ultrafiltrační jednotky (Pellikon XL, propustnost (size exclusion)3 kDa, Millipore) na objem 50 ml. Následně byl vzorek purifikován hydrofóbní interakční chromatografií (20 x 1,6 Fractogel EMD Phenyl I 650, Merck, Darmstadt). Rychlost průtoku byla 5 ml/min a eluát byl sbírán do 5ml frakcí. Aktivita enzymu byla měřena deacylací radioaktivně značeného fosfolipidu (L-3-fosfatidylcholin, l-palmitoyl-2-[l-14C]linoleoyl) . Obrázek 3 znázorňuje získaný eluční profil v natriumacetátovém gradientu a enzymové aktivity jednotlivých frakcí.
Tři frakce, které měly nejvyšší aktivitu enzymu, byly spojeny a opětovně pufrovány pomocí výchozího pufru (BisTris 20 mM, pH 6,5) pro aniontově-výměnnou chromatografií (anion-exchange chromatography, AEC) s použitím ultrafiltrační jednotky. Následně byly vzorky naneseny na sloupec (Q-Sepharose-Hiload-16/10, Pharmacia, Sweden) a PLAi byla ze sloupce eluována lineárním gradientem NaCl (průtoková rychlost = 3 ml/min) a sbírána do 5ml frakcí. Obrázek 4 znázorňuje získaný eluční profil v NaCl-gradientu a enzymové aktivity jednotlivých frakcí.
Z frakcí, které měly nejvyšší PLAi aktivitu, bylo 200 μΐ odstraněno a odděleno SEC chromatografií (size exclusion chromatography). K tomuto účelu byl použit sloupec Superdex HR 75 30/10 (Pharmacia, Sweden). Rychlost promývání.v téoto chromatografií byla 0,6 ml/min, eluát byl sbítán do 200 μΐ frakcí. Obrázek 5 uvádí zíksaný eluční profil a enyzmové aktivity jednotlivých frakcí.
Získané frakce byla testovány na čistotu s použitím trojrozměrné gelové elektroforézy. Byly stanoveny dva odlišné pruhy při velikosti ~ 26 a ~ 28 kDa. Separace těchto dvou pruhů dvojrozměrnou gelovou elektroforézou • ·· · φ φφ φφ ·φ φφ φφφ φφφφ φφ φ φ φφφ φφφφ φ φ φ φ φ φφφ φ φφφ Φφφ φ φφφ φφ φ · · · · φφφ φφ φφ φφ ·· φφ vedla k rozdělení dvou pruhů do 2 a 3 skvrn, v uvedeném pořadí, s odlišnými izoelektrickými body.
Proteiny o 26 kDa odpovídaly pH 6,3 a 5,7 a proteiny o 28 kDa odpovídaly pH 6,3, 5,7 a 5,3. Konečná analýza těchto skvrn pomocí mass fingerprint analýzy prokázala, že tyto skvrny jsou izoformami stejného proteinu.
Molekulárně-blologické ověřeni PLAi
Jakmile byla prokázána čistota proteinu, byly vzorky proteinu naneseny na PVDF membránu a podrobeny sekvenování od N konce. Kromě toho byly další vzorky štěpeny trypsinem a rovněž podrobeny sekvenování od počátku. S použitím takto získaných proteinových sekvencí byly připraveny oligonukleotidové primery, které byly podrobeny RT-PCR (reverse transcriptase PCR; 3'RACE, rapid amplification of cDNA ends). S použitím této techniky PCR byla fosfolipáza Ai úspěšně amplifikována a následně sekvenována. Získaná sekvence měla délku 633 baží a 729 baží v uvedeném pořadí, a molekulová hmotnost zralého proteinu z ní odvozená je přibližně 22,4 kDa. V odvozené sekvenci oligopeptidy o 22 aminokyselinách (N-terminální) a o 18 aminokyselinách (uvnitř peptidů) stanovené sekvenováním proteinu byly opětovně nalézány ve 100 %. Kromě toho sekvence zralého proteinu, sekvence pre/propeptidu mohly rovněž být určeny pomocí 5'RACE (rapid amplification of cDNA ends)(Obrázek 2). Jedná se o peptid mající délku 110 aminokyselin, který nese jak signální sekvenci, tak sekvenci propeptidu, jenž enzym inaktivuje a je odštěpován pouze v místě konečné aktivity enzymu. Sekvenční porovnání poskytlo zjištění, že neexistuje žádná homologie s dříve známými fosfolipázami Ai, s výjimkou konsensus sekvence 5 aminokyselin (GxSxG), která je nalézána ve všech lipázách a fosfolipázách a je
44 4
4 4 4 4 · 44 4 • 444 4 4 4 4 4 4 4 • 4 444 4 444 · 4 4 4
444 44 4 4··4
444 44 44 44 44 44 považována za vazebné místo pro lipidy nebo fosfolipidy. Kromě toho, PLAi „sekvence po směru a „sekvence proti směru byly stanoveny inverzní PCR (Obrázek 1). Genomová DNA byly rozštěpena restrikčními endonukleázami, ligována T4 ligázou a nakonec amplifikována s inverzními primery.
V inverzní PCR byla pro amplifikaci PLAi „oblasti proti směru ke štěpení genomové DNA použita restrikční endonukleáza Sspl. Proto mohla být stanovena „oblast proti směru o 275 bazích a byly identifikovány promotorové prvky. V pozici -136 se nalézá CAAT box, který má podobnou vzdálenost od translačního startu, jako CCAAT boxy histonových genů (-141 a -151) Tetrahymena, jak nalezli Brunk a Sadler (1990). TATA box, který fixuje exaktní počáteční bod transkripce v eukaryontních genech, byl identifikován v pozici -55. Jeho sekvence odpovídá konsensus sekvenci nalezené u eukaryont. Pro amplifikaci „oblasti po směru, která obsahuje terminátor transkripce PLAi z Tetrahymena, metodou PCR, bylo použito štěpení DNA pomocí BamHI. Proto, kromě oblasti „po směru známé z STRACE, mohlo být určeno dalších 222 baží (Obrázek 3).
Claims (9)
- Patentové nárokyUpravené 20.12.20021. Nukleová kyselina obsahující kódující a nekódující oblasti mající sekvenci SEQ ID NO:4, ve které řečené kódující oblasti kódují fosfolipázu Αχ (PLAi) z Tetrahymena thermophíla (SEQ ID NO:5) a řečené nekódující oblasti znamenají oblasti „proti směru a „po směru od tohoto genu.
- 2. Nukleová kyselina podle nároku 1, ve které řečené nekódující oblasti „po směru a „proti směru mají sekvence SEQ ID NO:2 a 3 a kódující oblasti mají sekvence SEQ IDNO:1, 8 a/nebo 9.
- 3. N-terminální signální sekvence PLAi (SEQ ID NO:5) podle nároku 1 mající sekvenci SEQ ID NO:6.
- 4. Protein fosfolipázy Ai (PLAi) mající aminokyselinovou sekvenci podle SEQ ID NO:7.
- 6. Použití nukleové kyseliny podle nároků 1 až 3 nebo jejích částí pro homologní nebo heterologní expresi rekombinantních proteinů a peptidů a pro homologní nebo heterologní rekombinaci (vyřazení „knock-out, substituce „gene replacement).
- 7. Způsob homologní nebo heterologní exprese proteinů a peptidů a homologní nebo heterologní rekombinace („knock out,gene replacement), ve kterém jsou nálevníci (cíliata) transfektováni nukleovou kyselinou podle jakéhokoliv z nároků 1 až 3.• 44 9 • 4 44 ·· ··4 4 4 4 4 9 4449 4444 444 494 944449 944 49 4 ' 4 · 4 4 «4 44 44 44 44
- 8. Způsob podle nároku 9, ve kterém řečené nukleové kyseliny nebo jejich části jsou kombinovány se zesilovači, promotory, operátory, počátky , terminátory, geny pro antibiotickou rezistencí běžnými pro homologní nebo heterologní expresi proteinů, nebo s jinými nukleovými kyselinami nebo fragmenty DNA, nebo se všemi typy sekvencí z viroidů, virů, bakterií, archezoí, protozoí, hub, rostlin, zvířat a lidí.
- 11. Způsob podle nároku 10 a/nebo 11, ve kterém je nukleová kyselina je obsažena ve vektoru, plasmidu, kosmidu, chromozomu nebo minichromozomu, transposonu, IS elementu, rDNA, nebo v jakémkoliv jiném typu cirkulární nebo lineární DNA nebo RNA.
- 12. Vektory, plasmidy, kosmídy, chromozomy nebo minichromozomy, transposony, IS elementy, rDNA a jiné typy cirkulární nebo lineární DNA nebo RNA obsahující alespoň jednu z nukleových kyselin podle alespoň jednoho z nároků 1
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DE10105152A DE10105152A1 (de) | 2001-01-22 | 2001-01-22 | Eine DNA-Sequenz des Enzyms Phospholipase A1 aus Ciliaten und die Verwendung dieser |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CZ20031991A3 true CZ20031991A3 (cs) | 2004-03-17 |
Family
ID=7672908
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CZ20031991A CZ20031991A3 (cs) | 2001-01-22 | 2002-01-22 | Sekvence DNA kódující enzym fosfolipáza A1 z nálevníka Tetrahymena a její použití |
Country Status (17)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US7045330B2 (cs) |
| EP (1) | EP1360306B1 (cs) |
| JP (1) | JP4295508B2 (cs) |
| KR (1) | KR100855645B1 (cs) |
| AT (1) | ATE346155T1 (cs) |
| AU (1) | AU2002250842B2 (cs) |
| CA (1) | CA2435323C (cs) |
| CY (1) | CY1106337T1 (cs) |
| CZ (1) | CZ20031991A3 (cs) |
| DE (2) | DE10105152A1 (cs) |
| DK (1) | DK1360306T3 (cs) |
| ES (1) | ES2277615T3 (cs) |
| HU (1) | HUP0302801A3 (cs) |
| PL (1) | PL206037B1 (cs) |
| PT (1) | PT1360306E (cs) |
| RO (1) | RO122298B1 (cs) |
| WO (1) | WO2002057459A2 (cs) |
Families Citing this family (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR100774367B1 (ko) * | 2005-08-31 | 2007-11-08 | 인하대학교 산학협력단 | 섬모충류 특이적 프라이머 및 이를 이용한 섬모충류 검출방법 |
| KR101038914B1 (ko) * | 2008-10-22 | 2011-06-10 | 김세준 | 앨범대지 접착용 테이프 |
| TR201813880A2 (tr) | 2018-09-25 | 2020-04-21 | Anadolu Üniversitesi̇ | TETRAHYMENA THERMOPHILA YAPAY KROMOZOMU (TtAC1) VE REKOMBINANT PROTEIN ÜRETIMI IÇIN KULLANIMI |
Family Cites Families (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH10155493A (ja) | 1996-10-04 | 1998-06-16 | Sankyo Co Ltd | アスペルギルス属由来のホスホリパーゼａ１をコードする遺伝子 |
-
2001
- 2001-01-22 DE DE10105152A patent/DE10105152A1/de not_active Ceased
-
2002
- 2002-01-22 WO PCT/EP2002/000578 patent/WO2002057459A2/de not_active Ceased
- 2002-01-22 DK DK02719712T patent/DK1360306T3/da active
- 2002-01-22 RO ROA200300631A patent/RO122298B1/ro unknown
- 2002-01-22 AT AT02719712T patent/ATE346155T1/de active
- 2002-01-22 PT PT02719712T patent/PT1360306E/pt unknown
- 2002-01-22 JP JP2002558511A patent/JP4295508B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 2002-01-22 ES ES02719712T patent/ES2277615T3/es not_active Expired - Lifetime
- 2002-01-22 DE DE50208775T patent/DE50208775D1/de not_active Expired - Lifetime
- 2002-01-22 AU AU2002250842A patent/AU2002250842B2/en not_active Ceased
- 2002-01-22 HU HU0302801A patent/HUP0302801A3/hu unknown
- 2002-01-22 EP EP02719712A patent/EP1360306B1/de not_active Expired - Lifetime
- 2002-01-22 CZ CZ20031991A patent/CZ20031991A3/cs unknown
- 2002-01-22 PL PL362475A patent/PL206037B1/pl not_active IP Right Cessation
- 2002-01-22 CA CA002435323A patent/CA2435323C/en not_active Expired - Fee Related
- 2002-01-22 US US10/466,110 patent/US7045330B2/en not_active Expired - Fee Related
- 2002-01-22 KR KR1020037009667A patent/KR100855645B1/ko not_active Expired - Fee Related
-
2007
- 2007-02-22 CY CY20071100254T patent/CY1106337T1/el unknown
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| RO122298B1 (ro) | 2009-03-30 |
| AU2002250842B2 (en) | 2007-11-22 |
| PT1360306E (pt) | 2007-02-28 |
| WO2002057459A3 (de) | 2002-12-12 |
| US20040115673A1 (en) | 2004-06-17 |
| EP1360306A2 (de) | 2003-11-12 |
| DE50208775D1 (de) | 2007-01-04 |
| HUP0302801A2 (hu) | 2003-11-28 |
| US7045330B2 (en) | 2006-05-16 |
| CA2435323C (en) | 2008-09-02 |
| PL206037B1 (pl) | 2010-06-30 |
| JP4295508B2 (ja) | 2009-07-15 |
| HUP0302801A3 (en) | 2011-01-28 |
| CA2435323A1 (en) | 2002-07-25 |
| JP2004525622A (ja) | 2004-08-26 |
| EP1360306B1 (de) | 2006-11-22 |
| DK1360306T3 (da) | 2007-03-19 |
| ES2277615T3 (es) | 2007-07-16 |
| CY1106337T1 (el) | 2011-10-12 |
| KR100855645B1 (ko) | 2008-09-03 |
| ATE346155T1 (de) | 2006-12-15 |
| DE10105152A1 (de) | 2002-07-25 |
| PL362475A1 (en) | 2004-11-02 |
| KR20030087627A (ko) | 2003-11-14 |
| WO2002057459A2 (de) | 2002-07-25 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CA2621344C (en) | Cleavage of precursors of insulins by a variant of trypsin | |
| US7666629B2 (en) | Method for producing recombinant trypsin | |
| Tang et al. | Recombinant expression and characterization of the Candida rugosa lip4 lipase in Pichia pastoris: comparison of glycosylation, activity, and stability | |
| CZ20031991A3 (cs) | Sekvence DNA kódující enzym fosfolipáza A1 z nálevníka Tetrahymena a její použití | |
| RU2560577C2 (ru) | Композиции и способы получения энтерокиназы в дрожжах | |
| US20040161836A1 (en) | Recombinant porcine liver esterases, their use and a method for the production thereof | |
| US20060127973A1 (en) | Dna sequences of major secreted proteins from the ciliate tetrahymena and use thereof | |
| KR20010109348A (ko) | 췌장의 프로카복시-펩티다제 ｂ, 이의 동질 효소 및뮤테인의 제조 방법, 및 이들의 용도 | |
| US7323325B2 (en) | Shrimp alkaline phosphatase | |
| AU3285600A (en) | Beta-hexosaminidase, dna sequence from ciliates for coding the same and use thereof | |
| JP2004180681A (ja) | ウサギ肝臓由来のエステラーゼを発現する微生物およびそれを用いたウサギ肝臓由来のエステラーゼの製造方法 | |
| HK1057760B (en) | Shrimp alkaline phosphatase | |
| HK1124341B (en) | Cleavage of precursors of insulins by a variant of trypsin | |
| WO2002040652A2 (en) | Novel soluble endoproteases for the in vitro processing of recombinant proteins |