PL206037B1 - Sekwencja kwasu nukleinowego zawierająca regiony kodujące i niekodujące, białko fosfolipazy A₁ z Tetrahymena thermophila, zastosowanie kwasu nukleinowego i sposób ekspresji fosfolipazy A₁ oraz nośnik sekwencji kwasu nukleinowego - Google Patents
Sekwencja kwasu nukleinowego zawierająca regiony kodujące i niekodujące, białko fosfolipazy A₁ z Tetrahymena thermophila, zastosowanie kwasu nukleinowego i sposób ekspresji fosfolipazy A₁ oraz nośnik sekwencji kwasu nukleinowegoInfo
- Publication number
- PL206037B1 PL206037B1 PL362475A PL36247502A PL206037B1 PL 206037 B1 PL206037 B1 PL 206037B1 PL 362475 A PL362475 A PL 362475A PL 36247502 A PL36247502 A PL 36247502A PL 206037 B1 PL206037 B1 PL 206037B1
- Authority
- PL
- Poland
- Prior art keywords
- seq
- sequence
- nucleic acid
- ala
- heterogeneous
- Prior art date
Links
- 108010013563 Lipoprotein Lipase Proteins 0.000 title claims abstract description 41
- 102100022119 Lipoprotein lipase Human genes 0.000 title claims abstract description 40
- 241000223892 Tetrahymena Species 0.000 title claims description 18
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 title claims description 16
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 claims abstract description 30
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 claims abstract description 16
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 claims abstract description 16
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims abstract 2
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 91
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 65
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 claims description 31
- 108020004414 DNA Chemical group 0.000 claims description 18
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 18
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 claims description 15
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 claims description 11
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 claims description 11
- 241000248384 Tetrahymena thermophila Species 0.000 claims description 11
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 claims description 11
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 claims description 10
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims description 9
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims description 8
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 claims description 7
- 239000013598 vector Substances 0.000 claims description 7
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 claims description 6
- 241000700605 Viruses Species 0.000 claims description 6
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 claims description 5
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 claims description 5
- 230000006798 recombination Effects 0.000 claims description 5
- 238000005215 recombination Methods 0.000 claims description 5
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 claims description 4
- 241000233866 Fungi Species 0.000 claims description 3
- 241000282412 Homo Species 0.000 claims description 3
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 claims description 3
- 241000726445 Viroids Species 0.000 claims description 3
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 claims description 3
- 239000003623 enhancer Substances 0.000 claims description 3
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 claims description 3
- 241000223782 Ciliophora Species 0.000 abstract description 4
- 235000013351 cheese Nutrition 0.000 description 38
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 34
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 description 18
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 description 18
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 11
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 10
- 150000001413 amino acids Chemical group 0.000 description 8
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 7
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 7
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 6
- 235000014680 Saccharomyces cerevisiae Nutrition 0.000 description 6
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 6
- FADYJNXDPBKVCA-UHFFFAOYSA-N L-Phenylalanyl-L-lysin Natural products NCCCCC(C(O)=O)NC(=O)C(N)CC1=CC=CC=C1 FADYJNXDPBKVCA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 230000022131 cell cycle Effects 0.000 description 5
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 5
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 5
- 108010037850 glycylvaline Proteins 0.000 description 5
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 5
- ALBODLTZUXKBGZ-JUUVMNCLSA-N (2s)-2-amino-3-phenylpropanoic acid;(2s)-2,6-diaminohexanoic acid Chemical compound NCCCC[C@H](N)C(O)=O.OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 ALBODLTZUXKBGZ-JUUVMNCLSA-N 0.000 description 4
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 4
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 4
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- 102000007478 beta-N-Acetylhexosaminidases Human genes 0.000 description 4
- 108010085377 beta-N-Acetylhexosaminidases Proteins 0.000 description 4
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 4
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 4
- 230000013595 glycosylation Effects 0.000 description 4
- 238000006206 glycosylation reaction Methods 0.000 description 4
- 239000000047 product Substances 0.000 description 4
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 4
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 3
- 101100289385 Arabidopsis thaliana PLA1 gene Proteins 0.000 description 3
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 3
- 241000701022 Cytomegalovirus Species 0.000 description 3
- 101150059175 PLA1 gene Proteins 0.000 description 3
- BNGDYRRHRGOPHX-IFFSRLJSSA-N Thr-Glu-Val Chemical compound CC(C)[C@H](NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)[C@@H](C)O)C(O)=O BNGDYRRHRGOPHX-IFFSRLJSSA-N 0.000 description 3
- 239000013543 active substance Substances 0.000 description 3
- 108010005233 alanylglutamic acid Proteins 0.000 description 3
- 230000010261 cell growth Effects 0.000 description 3
- 108010016616 cysteinylglycine Proteins 0.000 description 3
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 3
- 230000008569 process Effects 0.000 description 3
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 3
- PKOHVHWNGUHYRE-ZFWWWQNUSA-N (2s)-1-[2-[[(2s)-2-amino-3-(1h-indol-3-yl)propanoyl]amino]acetyl]pyrrolidine-2-carboxylic acid Chemical compound O=C([C@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)N)NCC(=O)N1CCC[C@H]1C(O)=O PKOHVHWNGUHYRE-ZFWWWQNUSA-N 0.000 description 2
- AUXMWYRZQPIXCC-KNIFDHDWSA-N (2s)-2-amino-4-methylpentanoic acid;(2s)-2-aminopropanoic acid Chemical compound C[C@H](N)C(O)=O.CC(C)C[C@H](N)C(O)=O AUXMWYRZQPIXCC-KNIFDHDWSA-N 0.000 description 2
- YSMPVONNIWLJML-FXQIFTODSA-N Ala-Asp-Pro Chemical compound C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N1CCC[C@H]1C(O)=O YSMPVONNIWLJML-FXQIFTODSA-N 0.000 description 2
- CXISPYVYMQWFLE-VKHMYHEASA-N Ala-Gly Chemical compound C[C@H]([NH3+])C(=O)NCC([O-])=O CXISPYVYMQWFLE-VKHMYHEASA-N 0.000 description 2
- CCDFBRZVTDDJNM-GUBZILKMSA-N Ala-Leu-Glu Chemical compound [H]N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O CCDFBRZVTDDJNM-GUBZILKMSA-N 0.000 description 2
- MEFILNJXAVSUTO-JXUBOQSCSA-N Ala-Leu-Thr Chemical compound C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O MEFILNJXAVSUTO-JXUBOQSCSA-N 0.000 description 2
- HYIDEIQUCBKIPL-CQDKDKBSSA-N Ala-Phe-His Chemical compound C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(=O)N[C@@H](CC2=CN=CN2)C(=O)O)N HYIDEIQUCBKIPL-CQDKDKBSSA-N 0.000 description 2
- KUFVXLQLDHJVOG-SHGPDSBTSA-N Ala-Thr-Thr Chemical compound C[C@H]([C@@H](C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)O)NC(=O)[C@H](C)N)O KUFVXLQLDHJVOG-SHGPDSBTSA-N 0.000 description 2
- BVLPIIBTWIYOML-ZKWXMUAHSA-N Ala-Val-Asp Chemical compound [H]N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(O)=O BVLPIIBTWIYOML-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 2
- 102000013142 Amylases Human genes 0.000 description 2
- 108010065511 Amylases Proteins 0.000 description 2
- HDHZCEDPLTVHFZ-GUBZILKMSA-N Asn-Leu-Glu Chemical compound [H]N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O HDHZCEDPLTVHFZ-GUBZILKMSA-N 0.000 description 2
- AYOAHKWVQLNPDM-HJGDQZAQSA-N Asn-Lys-Thr Chemical compound [H]N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O AYOAHKWVQLNPDM-HJGDQZAQSA-N 0.000 description 2
- JDHOJQJMWBKHDB-CIUDSAMLSA-N Asp-Asn-Lys Chemical compound C(CCN)C[C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC(=O)N)NC(=O)[C@H](CC(=O)O)N JDHOJQJMWBKHDB-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 2
- AMRANMVXQWXNAH-ZLUOBGJFSA-N Asp-Cys-Ala Chemical compound OC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CS)NC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O AMRANMVXQWXNAH-ZLUOBGJFSA-N 0.000 description 2
- ORRJQLIATJDMQM-HJGDQZAQSA-N Asp-Leu-Thr Chemical compound C[C@@H](O)[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O ORRJQLIATJDMQM-HJGDQZAQSA-N 0.000 description 2
- KPSHWSWFPUDEGF-FXQIFTODSA-N Asp-Pro-Ala Chemical compound OC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H]1CCCN1C(=O)[C@@H](N)CC(O)=O KPSHWSWFPUDEGF-FXQIFTODSA-N 0.000 description 2
- 108091035707 Consensus sequence Proteins 0.000 description 2
- YFKWIIRWHGKSQQ-WFBYXXMGSA-N Cys-Trp-Ala Chemical compound C[C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC1=CNC2=CC=CC=C21)NC(=O)[C@H](CS)N YFKWIIRWHGKSQQ-WFBYXXMGSA-N 0.000 description 2
- 241000192125 Firmicutes Species 0.000 description 2
- LYCDZGLXQBPNQU-WDSKDSINSA-N Glu-Gly-Cys Chemical compound OC(=O)CC[C@H](N)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CS)C(O)=O LYCDZGLXQBPNQU-WDSKDSINSA-N 0.000 description 2
- GJBUAAAIZSRCDC-GVXVVHGQSA-N Glu-Leu-Val Chemical compound [H]N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(O)=O GJBUAAAIZSRCDC-GVXVVHGQSA-N 0.000 description 2
- SUDUYJOBLHQAMI-WHFBIAKZSA-N Gly-Asp-Cys Chemical compound NCC(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CS)C(O)=O SUDUYJOBLHQAMI-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 2
- UPADCCSMVOQAGF-LBPRGKRZSA-N Gly-Gly-Trp Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](NC(=O)CNC(=O)CN)C(O)=O)=CNC2=C1 UPADCCSMVOQAGF-LBPRGKRZSA-N 0.000 description 2
- JBCLFWXMTIKCCB-UHFFFAOYSA-N H-Gly-Phe-OH Natural products NCC(=O)NC(C(O)=O)CC1=CC=CC=C1 JBCLFWXMTIKCCB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 description 2
- WSDOHRLQDGAOGU-BQBZGAKWSA-N His-Asn Chemical compound NC(=O)C[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CC1=CN=CN1 WSDOHRLQDGAOGU-BQBZGAKWSA-N 0.000 description 2
- 108010033040 Histones Proteins 0.000 description 2
- ZUKPVRWZDMRIEO-VKHMYHEASA-N L-cysteinylglycine Chemical compound SC[C@H]([NH3+])C(=O)NCC([O-])=O ZUKPVRWZDMRIEO-VKHMYHEASA-N 0.000 description 2
- KXODZBLFVFSLAI-AVGNSLFASA-N Leu-His-Glu Chemical compound OC(=O)CC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@@H](N)CC(C)C)CC1=CN=CN1 KXODZBLFVFSLAI-AVGNSLFASA-N 0.000 description 2
- OTXBNHIUIHNGAO-UWVGGRQHSA-N Leu-Lys Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCCCN OTXBNHIUIHNGAO-UWVGGRQHSA-N 0.000 description 2
- AAKRWBIIGKPOKQ-ONGXEEELSA-N Leu-Val-Gly Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)NCC(O)=O AAKRWBIIGKPOKQ-ONGXEEELSA-N 0.000 description 2
- 102000004882 Lipase Human genes 0.000 description 2
- 108090001060 Lipase Proteins 0.000 description 2
- 239000004367 Lipase Substances 0.000 description 2
- MDDUIRLQCYVRDO-NHCYSSNCSA-N Lys-Val-Asn Chemical compound NC(=O)C[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@@H](N)CCCCN MDDUIRLQCYVRDO-NHCYSSNCSA-N 0.000 description 2
- XMBSYZWANAQXEV-UHFFFAOYSA-N N-alpha-L-glutamyl-L-phenylalanine Natural products OC(=O)CCC(N)C(=O)NC(C(O)=O)CC1=CC=CC=C1 XMBSYZWANAQXEV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- KZNQNBZMBZJQJO-UHFFFAOYSA-N N-glycyl-L-proline Natural products NCC(=O)N1CCCC1C(O)=O KZNQNBZMBZJQJO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- HNFUGJUZJRYUHN-JSGCOSHPSA-N Phe-Gly-Val Chemical compound CC(C)[C@@H](C(O)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 HNFUGJUZJRYUHN-JSGCOSHPSA-N 0.000 description 2
- CMHTUJQZQXFNTQ-OEAJRASXSA-N Phe-Leu-Thr Chemical compound C[C@H]([C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CC1=CC=CC=C1)N)O CMHTUJQZQXFNTQ-OEAJRASXSA-N 0.000 description 2
- PEFJUUYFEGBXFA-BZSNNMDCSA-N Phe-Lys-Lys Chemical compound NCCCC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 PEFJUUYFEGBXFA-BZSNNMDCSA-N 0.000 description 2
- IWNOFCGBMSFTBC-CIUDSAMLSA-N Pro-Ala-Glu Chemical compound [H]N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O IWNOFCGBMSFTBC-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 2
- 108700026226 TATA Box Proteins 0.000 description 2
- DFTCYYILCSQGIZ-GCJQMDKQSA-N Thr-Ala-Asn Chemical compound [H]N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(O)=O DFTCYYILCSQGIZ-GCJQMDKQSA-N 0.000 description 2
- ZUXQFMVPAYGPFJ-JXUBOQSCSA-N Thr-Ala-Lys Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCCCN ZUXQFMVPAYGPFJ-JXUBOQSCSA-N 0.000 description 2
- NZRUWPIYECBYRK-HTUGSXCWSA-N Thr-Phe-Glu Chemical compound [H]N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O NZRUWPIYECBYRK-HTUGSXCWSA-N 0.000 description 2
- BIBYEFRASCNLAA-CDMKHQONSA-N Thr-Phe-Gly Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(=O)NCC(O)=O)CC1=CC=CC=C1 BIBYEFRASCNLAA-CDMKHQONSA-N 0.000 description 2
- BEZTUFWTPVOROW-KJEVXHAQSA-N Thr-Tyr-Arg Chemical compound C[C@H]([C@@H](C(=O)N[C@@H](CC1=CC=C(C=C1)O)C(=O)N[C@@H](CCCN=C(N)N)C(=O)O)N)O BEZTUFWTPVOROW-KJEVXHAQSA-N 0.000 description 2
- NJGMALCNYAMYCB-JRQIVUDYSA-N Thr-Tyr-Asn Chemical compound [H]N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=C(O)C=C1)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(O)=O NJGMALCNYAMYCB-JRQIVUDYSA-N 0.000 description 2
- DZIKVMCFXIIETR-JSGCOSHPSA-N Trp-Gly-Glu Chemical compound [H]N[C@@H](CC1=CNC2=C1C=CC=C2)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O DZIKVMCFXIIETR-JSGCOSHPSA-N 0.000 description 2
- VNYDHJARLHNEGA-RYUDHWBXSA-N Tyr-Pro Chemical compound C([C@H](N)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(O)=O)C1=CC=C(O)C=C1 VNYDHJARLHNEGA-RYUDHWBXSA-N 0.000 description 2
- VPEFOFYNHBWFNQ-UFYCRDLUSA-N Tyr-Pro-Tyr Chemical compound C([C@H](N)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(O)=O)C1=CC=C(O)C=C1 VPEFOFYNHBWFNQ-UFYCRDLUSA-N 0.000 description 2
- UEOOXDLMQZBPFR-ZKWXMUAHSA-N Val-Ala-Asn Chemical compound C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(=O)N)C(=O)O)NC(=O)[C@H](C(C)C)N UEOOXDLMQZBPFR-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 2
- VVZDBPBZHLQPPB-XVKPBYJWSA-N Val-Glu-Gly Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)NCC(O)=O VVZDBPBZHLQPPB-XVKPBYJWSA-N 0.000 description 2
- XPKCFQZDQGVJCX-RHYQMDGZSA-N Val-Lys-Thr Chemical compound C[C@H]([C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H](C(C)C)N)O XPKCFQZDQGVJCX-RHYQMDGZSA-N 0.000 description 2
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 2
- 108010047495 alanylglycine Proteins 0.000 description 2
- 108010011559 alanylphenylalanine Proteins 0.000 description 2
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 2
- 235000019418 amylase Nutrition 0.000 description 2
- 238000005571 anion exchange chromatography Methods 0.000 description 2
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 2
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 2
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 2
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 2
- YPHMISFOHDHNIV-FSZOTQKASA-N cycloheximide Chemical compound C1[C@@H](C)C[C@H](C)C(=O)[C@@H]1[C@H](O)CC1CC(=O)NC(=O)C1 YPHMISFOHDHNIV-FSZOTQKASA-N 0.000 description 2
- 238000011161 development Methods 0.000 description 2
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 2
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 2
- 239000003480 eluent Substances 0.000 description 2
- KZNQNBZMBZJQJO-YFKPBYRVSA-N glyclproline Chemical compound NCC(=O)N1CCC[C@H]1C(O)=O KZNQNBZMBZJQJO-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 2
- 108010081551 glycylphenylalanine Proteins 0.000 description 2
- 108010077515 glycylproline Proteins 0.000 description 2
- 210000003000 inclusion body Anatomy 0.000 description 2
- NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N insulin Chemical compound N1C(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(NC(=O)CN)C(C)CC)CSSCC(C(NC(CO)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CCC(N)=O)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CSSCC(NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2C=CC(O)=CC=2)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(C)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2NC=NC=2)NC(=O)C(CO)NC(=O)CNC2=O)C(=O)NCC(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)NC(C(C)O)C(=O)N3C(CCC3)C(=O)NC(CCCCN)C(=O)NC(C)C(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(O)=O)=O)NC(=O)C(C(C)CC)NC(=O)C(CO)NC(=O)C(C(C)O)NC(=O)C1CSSCC2NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CC(N)=O)NC(=O)C(NC(=O)C(N)CC=1C=CC=CC=1)C(C)C)CC1=CN=CN1 NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108010034529 leucyl-lysine Proteins 0.000 description 2
- 235000019421 lipase Nutrition 0.000 description 2
- 108010003700 lysyl aspartic acid Proteins 0.000 description 2
- 230000014759 maintenance of location Effects 0.000 description 2
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 2
- 150000003904 phospholipids Chemical class 0.000 description 2
- 230000018883 protein targeting Effects 0.000 description 2
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 2
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 2
- 239000013605 shuttle vector Substances 0.000 description 2
- 238000001542 size-exclusion chromatography Methods 0.000 description 2
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 2
- 230000003068 static effect Effects 0.000 description 2
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 2
- 230000005026 transcription initiation Effects 0.000 description 2
- 108010020532 tyrosyl-proline Proteins 0.000 description 2
- GZCWLCBFPRFLKL-UHFFFAOYSA-N 1-prop-2-ynoxypropan-2-ol Chemical compound CC(O)COCC#C GZCWLCBFPRFLKL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010011619 6-Phytase Proteins 0.000 description 1
- FVFVNNKYKYZTJU-UHFFFAOYSA-N 6-chloro-1,3,5-triazine-2,4-diamine Chemical group NC1=NC(N)=NC(Cl)=N1 FVFVNNKYKYZTJU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000013563 Acid Phosphatase Human genes 0.000 description 1
- 108010051457 Acid Phosphatase Proteins 0.000 description 1
- 102000007469 Actins Human genes 0.000 description 1
- 108010085238 Actins Proteins 0.000 description 1
- RLMISHABBKUNFO-WHFBIAKZSA-N Ala-Ala-Gly Chemical compound C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)NCC(O)=O RLMISHABBKUNFO-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 1
- NHLAEBFGWPXFGI-WHFBIAKZSA-N Ala-Gly-Asn Chemical compound C[C@@H](C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC(=O)N)C(=O)O)N NHLAEBFGWPXFGI-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 1
- SUHLZMHFRALVSY-YUMQZZPRSA-N Ala-Lys-Gly Chemical compound NCCCC[C@H](NC(=O)[C@@H](N)C)C(=O)NCC(O)=O SUHLZMHFRALVSY-YUMQZZPRSA-N 0.000 description 1
- XQNRANMFRPCFFW-GCJQMDKQSA-N Ala-Thr-Asn Chemical compound C[C@H]([C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(=O)N)C(=O)O)NC(=O)[C@H](C)N)O XQNRANMFRPCFFW-GCJQMDKQSA-N 0.000 description 1
- LSMDIAAALJJLRO-XQXXSGGOSA-N Ala-Thr-Glu Chemical compound [H]N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O LSMDIAAALJJLRO-XQXXSGGOSA-N 0.000 description 1
- 102000007698 Alcohol dehydrogenase Human genes 0.000 description 1
- 108010021809 Alcohol dehydrogenase Proteins 0.000 description 1
- 108010025188 Alcohol oxidase Proteins 0.000 description 1
- 102100036826 Aldehyde oxidase Human genes 0.000 description 1
- 229930183010 Amphotericin Natural products 0.000 description 1
- QGGFZZLFKABGNL-UHFFFAOYSA-N Amphotericin A Natural products OC1C(N)C(O)C(C)OC1OC1C=CC=CC=CC=CCCC=CC=CC(C)C(O)C(C)C(C)OC(=O)CC(O)CC(O)CCC(O)C(O)CC(O)CC(O)(CC(O)C2C(O)=O)OC2C1 QGGFZZLFKABGNL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004382 Amylase Substances 0.000 description 1
- 101100437118 Arabidopsis thaliana AUG1 gene Proteins 0.000 description 1
- YNDLOUMBVDVALC-ZLUOBGJFSA-N Asn-Ala-Ala Chemical compound C[C@@H](C(=O)N[C@@H](C)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC(=O)N)N YNDLOUMBVDVALC-ZLUOBGJFSA-N 0.000 description 1
- PNHQRQTVBRDIEF-CIUDSAMLSA-N Asn-Leu-Ala Chemical compound C[C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CC(=O)N)N PNHQRQTVBRDIEF-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 1
- ZMUQQMGITUJQTI-CIUDSAMLSA-N Asn-Leu-Asn Chemical compound [H]N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(O)=O ZMUQQMGITUJQTI-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 1
- OMSMPWHEGLNQOD-UWVGGRQHSA-N Asn-Phe Chemical compound NC(=O)C[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC1=CC=CC=C1 OMSMPWHEGLNQOD-UWVGGRQHSA-N 0.000 description 1
- GOPFMQJUQDLUFW-LKXGYXEUSA-N Asn-Thr-Cys Chemical compound C[C@H]([C@@H](C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC(=O)N)N)O GOPFMQJUQDLUFW-LKXGYXEUSA-N 0.000 description 1
- JBDLMLZNDRLDIX-HJGDQZAQSA-N Asn-Thr-Leu Chemical compound [H]N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O JBDLMLZNDRLDIX-HJGDQZAQSA-N 0.000 description 1
- PZXPWHFYZXTFBI-YUMQZZPRSA-N Asp-Gly-Lys Chemical compound NCCCC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O PZXPWHFYZXTFBI-YUMQZZPRSA-N 0.000 description 1
- LEYKQPDPZJIRTA-AQZXSJQPSA-N Asp-Trp-Thr Chemical compound [H]N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC1=CNC2=C1C=CC=C2)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O LEYKQPDPZJIRTA-AQZXSJQPSA-N 0.000 description 1
- 235000014469 Bacillus subtilis Nutrition 0.000 description 1
- 108010077805 Bacterial Proteins Proteins 0.000 description 1
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 1
- 241000701489 Cauliflower mosaic virus Species 0.000 description 1
- 241000282693 Cercopithecidae Species 0.000 description 1
- OZHXXYOHPLLLMI-CIUDSAMLSA-N Cys-Lys-Ala Chemical compound [H]N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O OZHXXYOHPLLLMI-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 1
- VXLXATVURDNDCG-CIUDSAMLSA-N Cys-Lys-Asp Chemical compound C(CCN)C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(=O)O)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CS)N VXLXATVURDNDCG-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-QTVWNMPRSA-N D-mannopyranose Chemical compound OC[C@H]1OC(O)[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-QTVWNMPRSA-N 0.000 description 1
- 102000004163 DNA-directed RNA polymerases Human genes 0.000 description 1
- 108090000626 DNA-directed RNA polymerases Proteins 0.000 description 1
- 101100125027 Dictyostelium discoideum mhsp70 gene Proteins 0.000 description 1
- 108010044229 Dihydroflavanol 4-reductase Proteins 0.000 description 1
- 108090000204 Dipeptidase 1 Proteins 0.000 description 1
- YQYJSBFKSSDGFO-UHFFFAOYSA-N Epihygromycin Natural products OC1C(O)C(C(=O)C)OC1OC(C(=C1)O)=CC=C1C=C(C)C(=O)NC1C(O)C(O)C2OCOC2C1O YQYJSBFKSSDGFO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000003951 Erythropoietin Human genes 0.000 description 1
- 108090000394 Erythropoietin Proteins 0.000 description 1
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 1
- 241000206602 Eukaryota Species 0.000 description 1
- 206010017533 Fungal infection Diseases 0.000 description 1
- 108700028146 Genetic Enhancer Elements Proteins 0.000 description 1
- JRDYDYXZKFNNRQ-XPUUQOCRSA-N Gly-Ala-Val Chemical compound CC(C)[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)CN JRDYDYXZKFNNRQ-XPUUQOCRSA-N 0.000 description 1
- IEFJWDNGDZAYNZ-BYPYZUCNSA-N Gly-Glu Chemical compound NCC(=O)N[C@H](C(O)=O)CCC(O)=O IEFJWDNGDZAYNZ-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- MOJKRXIRAZPZLW-WDSKDSINSA-N Gly-Glu-Ala Chemical compound [H]NCC(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O MOJKRXIRAZPZLW-WDSKDSINSA-N 0.000 description 1
- OQQKUTVULYLCDG-ONGXEEELSA-N Gly-Lys-Val Chemical compound CC(C)[C@H](NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)CN)C(O)=O OQQKUTVULYLCDG-ONGXEEELSA-N 0.000 description 1
- JBCLFWXMTIKCCB-VIFPVBQESA-N Gly-Phe Chemical compound NCC(=O)N[C@H](C(O)=O)CC1=CC=CC=C1 JBCLFWXMTIKCCB-VIFPVBQESA-N 0.000 description 1
- DKJWUIYLMLUBDX-XPUUQOCRSA-N Gly-Val-Cys Chemical compound NCC(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)O DKJWUIYLMLUBDX-XPUUQOCRSA-N 0.000 description 1
- BNMRSWQOHIQTFL-JSGCOSHPSA-N Gly-Val-Phe Chemical compound NCC(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC1=CC=CC=C1 BNMRSWQOHIQTFL-JSGCOSHPSA-N 0.000 description 1
- VPZXBVLAVMBEQI-VKHMYHEASA-N Glycyl-alanine Chemical compound OC(=O)[C@H](C)NC(=O)CN VPZXBVLAVMBEQI-VKHMYHEASA-N 0.000 description 1
- 101150031823 HSP70 gene Proteins 0.000 description 1
- NTXIJPDAHXSHNL-ONGXEEELSA-N His-Gly-Val Chemical compound [H]N[C@@H](CC1=CNC=N1)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](C(C)C)C(O)=O NTXIJPDAHXSHNL-ONGXEEELSA-N 0.000 description 1
- 101000928314 Homo sapiens Aldehyde oxidase Proteins 0.000 description 1
- 102000004157 Hydrolases Human genes 0.000 description 1
- 108090000604 Hydrolases Proteins 0.000 description 1
- 108090001061 Insulin Proteins 0.000 description 1
- 102000004877 Insulin Human genes 0.000 description 1
- 108010002350 Interleukin-2 Proteins 0.000 description 1
- 102000000588 Interleukin-2 Human genes 0.000 description 1
- PWWVAXIEGOYWEE-UHFFFAOYSA-N Isophenergan Chemical compound C1=CC=C2N(CC(C)N(C)C)C3=CC=CC=C3SC2=C1 PWWVAXIEGOYWEE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241001138401 Kluyveromyces lactis Species 0.000 description 1
- 241000235058 Komagataella pastoris Species 0.000 description 1
- QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N L-tryptophane Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N 0.000 description 1
- CQQGCWPXDHTTNF-GUBZILKMSA-N Leu-Ala-Glu Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCC(O)=O CQQGCWPXDHTTNF-GUBZILKMSA-N 0.000 description 1
- MLTRLIITQPXHBJ-BQBZGAKWSA-N Leu-Asn Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC(N)=O MLTRLIITQPXHBJ-BQBZGAKWSA-N 0.000 description 1
- VIWUBXKCYJGNCL-SRVKXCTJSA-N Leu-Asn-His Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC1=CN=CN1 VIWUBXKCYJGNCL-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 1
- MPOHDJKRBLVGCT-CIUDSAMLSA-N Lys-Ala-Asn Chemical compound C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(=O)N)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CCCCN)N MPOHDJKRBLVGCT-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 1
- JPNRPAJITHRXRH-BQBZGAKWSA-N Lys-Asn Chemical compound NCCCC[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC(N)=O JPNRPAJITHRXRH-BQBZGAKWSA-N 0.000 description 1
- WLCYCADOWRMSAJ-CIUDSAMLSA-N Lys-Asn-Cys Chemical compound NCCCC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CS)C(O)=O WLCYCADOWRMSAJ-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 1
- AAORVPFVUIHEAB-YUMQZZPRSA-N Lys-Asp-Gly Chemical compound [H]N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)NCC(O)=O AAORVPFVUIHEAB-YUMQZZPRSA-N 0.000 description 1
- MWVUEPNEPWMFBD-SRVKXCTJSA-N Lys-Cys-Lys Chemical compound NCCCC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCCCN MWVUEPNEPWMFBD-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 1
- PBLLTSKBTAHDNA-KBPBESRZSA-N Lys-Gly-Phe Chemical compound [H]N[C@@H](CCCCN)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(O)=O PBLLTSKBTAHDNA-KBPBESRZSA-N 0.000 description 1
- NVGBPTNZLWRQSY-UWVGGRQHSA-N Lys-Lys Chemical compound NCCCC[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCCCN NVGBPTNZLWRQSY-UWVGGRQHSA-N 0.000 description 1
- BXPHMHQHYHILBB-BZSNNMDCSA-N Lys-Lys-Tyr Chemical compound [H]N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=C(O)C=C1)C(O)=O BXPHMHQHYHILBB-BZSNNMDCSA-N 0.000 description 1
- MYTOTTSMVMWVJN-STQMWFEESA-N Lys-Tyr Chemical compound NCCCC[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC1=CC=C(O)C=C1 MYTOTTSMVMWVJN-STQMWFEESA-N 0.000 description 1
- SUZVLFWOCKHWET-CQDKDKBSSA-N Lys-Tyr-Ala Chemical compound [H]N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=C(O)C=C1)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O SUZVLFWOCKHWET-CQDKDKBSSA-N 0.000 description 1
- RMKJOQSYLQQRFN-KKUMJFAQSA-N Lys-Tyr-Asp Chemical compound [H]N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=C(O)C=C1)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(O)=O RMKJOQSYLQQRFN-KKUMJFAQSA-N 0.000 description 1
- RIPJMCFGQHGHNP-RHYQMDGZSA-N Lys-Val-Thr Chemical compound C[C@H]([C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@H](CCCCN)N)O RIPJMCFGQHGHNP-RHYQMDGZSA-N 0.000 description 1
- 102100024295 Maltase-glucoamylase Human genes 0.000 description 1
- 208000031888 Mycoses Diseases 0.000 description 1
- SITLTJHOQZFJGG-UHFFFAOYSA-N N-L-alpha-glutamyl-L-valine Natural products CC(C)C(C(O)=O)NC(=O)C(N)CCC(O)=O SITLTJHOQZFJGG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010079364 N-glycylalanine Proteins 0.000 description 1
- 108010002311 N-glycylglutamic acid Proteins 0.000 description 1
- 241000320412 Ogataea angusta Species 0.000 description 1
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 1
- 108010038807 Oligopeptides Proteins 0.000 description 1
- 102000015636 Oligopeptides Human genes 0.000 description 1
- 239000002033 PVDF binder Substances 0.000 description 1
- UOZODPSAJZTQNH-UHFFFAOYSA-N Paromomycin II Natural products NC1C(O)C(O)C(CN)OC1OC1C(O)C(OC2C(C(N)CC(N)C2O)OC2C(C(O)C(O)C(CO)O2)N)OC1CO UOZODPSAJZTQNH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101710091688 Patatin Proteins 0.000 description 1
- 229930182555 Penicillin Natural products 0.000 description 1
- JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N Penicillin G Chemical compound N([C@H]1[C@H]2SC([C@@H](N2C1=O)C(O)=O)(C)C)C(=O)CC1=CC=CC=C1 JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N 0.000 description 1
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 1
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 description 1
- RMKGXGPQIPLTFC-KKUMJFAQSA-N Phe-Lys-Asn Chemical compound [H]N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(O)=O RMKGXGPQIPLTFC-KKUMJFAQSA-N 0.000 description 1
- BSHMIVKDJQGLNT-ACRUOGEOSA-N Phe-Lys-Tyr Chemical compound C([C@H](N)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(O)=O)C1=CC=CC=C1 BSHMIVKDJQGLNT-ACRUOGEOSA-N 0.000 description 1
- MHNBYYFXWDUGBW-RPTUDFQQSA-N Phe-Tyr-Thr Chemical compound C[C@H]([C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC1=CC=C(C=C1)O)NC(=O)[C@H](CC2=CC=CC=C2)N)O MHNBYYFXWDUGBW-RPTUDFQQSA-N 0.000 description 1
- 102000015439 Phospholipases Human genes 0.000 description 1
- 108010064785 Phospholipases Proteins 0.000 description 1
- 102000006448 Phospholipases A1 Human genes 0.000 description 1
- 241000235648 Pichia Species 0.000 description 1
- WCNVGGZRTNHOOS-ULQDDVLXSA-N Pro-Lys-Tyr Chemical compound C1C[C@H](NC1)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CC2=CC=C(C=C2)O)C(=O)O WCNVGGZRTNHOOS-ULQDDVLXSA-N 0.000 description 1
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 1
- 102000001708 Protein Isoforms Human genes 0.000 description 1
- 108010029485 Protein Isoforms Proteins 0.000 description 1
- 101100273253 Rhizopus niveus RNAP gene Proteins 0.000 description 1
- 241000283984 Rodentia Species 0.000 description 1
- 241000235070 Saccharomyces Species 0.000 description 1
- 241000710960 Sindbis virus Species 0.000 description 1
- VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M Sodium acetate Chemical compound [Na+].CC([O-])=O VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 108091081024 Start codon Proteins 0.000 description 1
- 239000012505 Superdex™ Substances 0.000 description 1
- 241000248418 Tetrahymena pyriformis Species 0.000 description 1
- LYGKYFKSZTUXGZ-ZDLURKLDSA-N Thr-Cys-Gly Chemical compound [H]N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)NCC(O)=O LYGKYFKSZTUXGZ-ZDLURKLDSA-N 0.000 description 1
- IMDMLDSVUSMAEJ-HJGDQZAQSA-N Thr-Leu-Asn Chemical compound [H]N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(O)=O IMDMLDSVUSMAEJ-HJGDQZAQSA-N 0.000 description 1
- YGCDFAJJCRVQKU-RCWTZXSCSA-N Thr-Pro-Val Chemical compound CC(C)[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H]1CCCN1C(=O)[C@@H](N)[C@@H](C)O YGCDFAJJCRVQKU-RCWTZXSCSA-N 0.000 description 1
- 102000003978 Tissue Plasminogen Activator Human genes 0.000 description 1
- 108090000373 Tissue Plasminogen Activator Proteins 0.000 description 1
- 102000004142 Trypsin Human genes 0.000 description 1
- 108090000631 Trypsin Proteins 0.000 description 1
- QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N Tryptophan Natural products C1=CC=C2C(CC(N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000004243 Tubulin Human genes 0.000 description 1
- 108090000704 Tubulin Proteins 0.000 description 1
- HSVPZJLMPLMPOX-BPNCWPANSA-N Tyr-Arg-Ala Chemical compound [H]N[C@@H](CC1=CC=C(O)C=C1)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O HSVPZJLMPLMPOX-BPNCWPANSA-N 0.000 description 1
- MFEVVAXTBZELLL-GGVZMXCHSA-N Tyr-Thr Chemical compound C[C@@H](O)[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 MFEVVAXTBZELLL-GGVZMXCHSA-N 0.000 description 1
- XKVXSCHXGJOQND-ZOBUZTSGSA-N Val-Asp-Trp Chemical compound CC(C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(=O)O)C(=O)N[C@@H](CC1=CNC2=CC=CC=C21)C(=O)O)N XKVXSCHXGJOQND-ZOBUZTSGSA-N 0.000 description 1
- PFMAFMPJJSHNDW-ZKWXMUAHSA-N Val-Cys-Asn Chemical compound CC(C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CC(=O)N)C(=O)O)N PFMAFMPJJSHNDW-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 1
- UPJONISHZRADBH-XPUUQOCRSA-N Val-Glu Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCC(O)=O UPJONISHZRADBH-XPUUQOCRSA-N 0.000 description 1
- XXWBHOWRARMUOC-NHCYSSNCSA-N Val-Lys-Asn Chemical compound CC(C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CC(=O)N)C(=O)O)N XXWBHOWRARMUOC-NHCYSSNCSA-N 0.000 description 1
- 208000036142 Viral infection Diseases 0.000 description 1
- IXKSXJFAGXLQOQ-XISFHERQSA-N WHWLQLKPGQPMY Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C1=CNC=N1 IXKSXJFAGXLQOQ-XISFHERQSA-N 0.000 description 1
- 230000009471 action Effects 0.000 description 1
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 1
- 238000005273 aeration Methods 0.000 description 1
- 108010028144 alpha-Glucosidases Proteins 0.000 description 1
- BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N ammonium sulfate Chemical compound N.N.OS(O)(=O)=O BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052921 ammonium sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011130 ammonium sulphate Nutrition 0.000 description 1
- 229940009444 amphotericin Drugs 0.000 description 1
- APKFDSVGJQXUKY-INPOYWNPSA-N amphotericin B Chemical compound O[C@H]1[C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](C)O[C@H]1O[C@H]1/C=C/C=C/C=C/C=C/C=C/C=C/C=C/[C@H](C)[C@@H](O)[C@@H](C)[C@H](C)OC(=O)C[C@H](O)C[C@H](O)CC[C@@H](O)[C@H](O)C[C@H](O)C[C@](O)(C[C@H](O)[C@H]2C(O)=O)O[C@H]2C1 APKFDSVGJQXUKY-INPOYWNPSA-N 0.000 description 1
- 229940025131 amylases Drugs 0.000 description 1
- 230000003698 anagen phase Effects 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 1
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 1
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 1
- 101150009206 aprE gene Proteins 0.000 description 1
- 230000002763 arrhythmic effect Effects 0.000 description 1
- 102000006635 beta-lactamase Human genes 0.000 description 1
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 1
- 230000031018 biological processes and functions Effects 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 238000013452 biotechnological production Methods 0.000 description 1
- OWMVSZAMULFTJU-UHFFFAOYSA-N bis-tris Chemical compound OCCN(CCO)C(CO)(CO)CO OWMVSZAMULFTJU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000006037 cell lysis Effects 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 210000004978 chinese hamster ovary cell Anatomy 0.000 description 1
- 229960005091 chloramphenicol Drugs 0.000 description 1
- WIIZWVCIJKGZOK-RKDXNWHRSA-N chloramphenicol Chemical compound ClC(Cl)C(=O)N[C@H](CO)[C@H](O)C1=CC=C([N+]([O-])=O)C=C1 WIIZWVCIJKGZOK-RKDXNWHRSA-N 0.000 description 1
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 1
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 1
- 239000012228 culture supernatant Substances 0.000 description 1
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 1
- 210000000805 cytoplasm Anatomy 0.000 description 1
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 1
- 230000020176 deacylation Effects 0.000 description 1
- 238000005947 deacylation reaction Methods 0.000 description 1
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 1
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 1
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 1
- 101150052825 dnaK gene Proteins 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 230000007613 environmental effect Effects 0.000 description 1
- 229940105423 erythropoietin Drugs 0.000 description 1
- 230000007717 exclusion Effects 0.000 description 1
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 1
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 1
- 230000002538 fungal effect Effects 0.000 description 1
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 1
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- VPZXBVLAVMBEQI-UHFFFAOYSA-N glycyl-DL-alpha-alanine Natural products OC(=O)C(C)NC(=O)CN VPZXBVLAVMBEQI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010027668 glycyl-alanyl-valine Proteins 0.000 description 1
- 108010015792 glycyllysine Proteins 0.000 description 1
- STKYPAFSDFAEPH-LURJTMIESA-N glycylvaline Chemical compound CC(C)[C@@H](C(O)=O)NC(=O)CN STKYPAFSDFAEPH-LURJTMIESA-N 0.000 description 1
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 1
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 1
- 108010036413 histidylglycine Proteins 0.000 description 1
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 1
- 238000004191 hydrophobic interaction chromatography Methods 0.000 description 1
- 229940125396 insulin Drugs 0.000 description 1
- 229930027917 kanamycin Natural products 0.000 description 1
- 229960000318 kanamycin Drugs 0.000 description 1
- SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N kanamycin Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CN)O[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N 0.000 description 1
- 229930182823 kanamycin A Natural products 0.000 description 1
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 1
- 108010064235 lysylglycine Proteins 0.000 description 1
- 108010054155 lysyllysine Proteins 0.000 description 1
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 1
- 210000004898 n-terminal fragment Anatomy 0.000 description 1
- 238000005457 optimization Methods 0.000 description 1
- 230000002018 overexpression Effects 0.000 description 1
- 229960001914 paromomycin Drugs 0.000 description 1
- UOZODPSAJZTQNH-LSWIJEOBSA-N paromomycin Chemical compound N[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](CN)O[C@@H]1O[C@H]1[C@@H](O)[C@H](O[C@H]2[C@@H]([C@@H](N)C[C@@H](N)[C@@H]2O)O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)N)O[C@@H]1CO UOZODPSAJZTQNH-LSWIJEOBSA-N 0.000 description 1
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 1
- 229940049954 penicillin Drugs 0.000 description 1
- 210000001322 periplasm Anatomy 0.000 description 1
- 125000001997 phenyl group Chemical group [H]C1=C([H])C([H])=C(*)C([H])=C1[H] 0.000 description 1
- 229940085127 phytase Drugs 0.000 description 1
- 230000008488 polyadenylation Effects 0.000 description 1
- 229920002981 polyvinylidene fluoride Polymers 0.000 description 1
- 239000011148 porous material Substances 0.000 description 1
- OXCMYAYHXIHQOA-UHFFFAOYSA-N potassium;[2-butyl-5-chloro-3-[[4-[2-(1,2,4-triaza-3-azanidacyclopenta-1,4-dien-5-yl)phenyl]phenyl]methyl]imidazol-4-yl]methanol Chemical compound [K+].CCCCC1=NC(Cl)=C(CO)N1CC1=CC=C(C=2C(=CC=CC=2)C2=N[N-]N=N2)C=C1 OXCMYAYHXIHQOA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 108010064037 prorennin Proteins 0.000 description 1
- 238000000734 protein sequencing Methods 0.000 description 1
- 230000002797 proteolythic effect Effects 0.000 description 1
- 230000037425 regulation of transcription Effects 0.000 description 1
- 230000000717 retained effect Effects 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 1
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 1
- 235000017281 sodium acetate Nutrition 0.000 description 1
- 239000001632 sodium acetate Substances 0.000 description 1
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 1
- -1 strepromycin Chemical compound 0.000 description 1
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 1
- 229960000187 tissue plasminogen activator Drugs 0.000 description 1
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 1
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 1
- 230000001131 transforming effect Effects 0.000 description 1
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 1
- 230000014621 translational initiation Effects 0.000 description 1
- 230000032258 transport Effects 0.000 description 1
- 238000000539 two dimensional gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 238000000108 ultra-filtration Methods 0.000 description 1
- 241000701161 unidentified adenovirus Species 0.000 description 1
- 210000003501 vero cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000009385 viral infection Effects 0.000 description 1
- 239000013603 viral vector Substances 0.000 description 1
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 1
- 210000005253 yeast cell Anatomy 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
- C12N15/52—Genes encoding for enzymes or proenzymes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/14—Hydrolases (3)
- C12N9/16—Hydrolases (3) acting on ester bonds (3.1)
- C12N9/18—Carboxylic ester hydrolases (3.1.1)
- C12N9/20—Triglyceride splitting, e.g. by means of lipase
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Y—ENZYMES
- C12Y301/00—Hydrolases acting on ester bonds (3.1)
- C12Y301/01—Carboxylic ester hydrolases (3.1.1)
- C12Y301/01032—Phospholipase A1 (3.1.1.32)
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Description
Opis wynalazku
Przedmiotem wynalazku jest sekwencja kwasu nukleinowego zawierająca regiony niekodujące i kodujące fosfolipazę A1 z Tetrahymena thermophila, N-końcowa sekwencja sygnałowa fosfolipazy A1 (PLA1), białko fosfolipazy A1 (PLA1), zastosowanie tej sekwencji kwasu nukleinowego lub jej fragmentów, sposób homologicznej lub heterogenicznej ekspresji białek i peptydów, oraz homologicznej lub heterogenicznej rekombinacji, zwłaszcza rozbicia lub zastąpienia genu. Przedmiotem wynalazku jest również wektor, plazmid, kosmid, chromosom, albo minichromosom, transpozon, element IS, rDNA, albo inne rodzaje pierścieniowego bądź liniowego DNA, albo RNA, zawierający przynajmniej jedną z przedmiotowych sekwencji kwasów nukleinowych.
W biotechnologicznych technikach ekspresji heterogenicznej obcych biał ek, szczególnie, stosowanych do uzyskiwania zrekombinowanych substancji czynnych, duże znaczenie odgrywają komórki drożdży, bakterii i ssacze linie komórkowe. Do wytwarzania zrekombinowanych peptydów lub białek, takich jak np. insulina, interleukina-2, aktywator plazminogenu tkankowego, proteazy i lipazy stosowane są układy ekspresyjne oparte na E.coli lub B.subtilis. W przypadku bakterii Gramujemnych, układy ekspresyjne oparte są najczęściej elementach genetycznych takich, jak operon lac lub operon tryptofanu. Białka obce dla organizmu gospodarza są wytwarzane w ciałkach inkluzyjnych, wewnątrz komórki, albo, jeśli zastosowano układ ekspresyjny oparty na genach kodujących β-laktamazę, w przestrzeni peryplazmatycznej. Nie opracowano jeszcze otrzymywania zrekombinowanych białek w otaczającej komórki pożywce fermentacyjnej. Jak dotychczas, wprowadza się w układach ekspresyjnych i uzyskuje nadekspresję w bakteriach Gram-dodatnich niemal wyłącznie białek komórkowych.
Do otrzymywania, drogą nadekspresji heterogenicznej, białek zrekombinowanych, np. ludzkiego czynnika XIIla, bydlęcej pro-chymosyny, fitazy czy antygenów powierzchniowych stosowane są także drożdże np. Saccharomyces cerevisiae, Hansenula polymorpha, Kluyveromyces lactis lub Pichia pastoris. W tych komórkach układy ekspresyjne oparte są na wektorach wahadłowych, które (w zależności od zastosowanego gospodarza) wykorzystują elementy genetyczne galakto-kinazo-epimerazy, oksydazy metanolowej, kwaśnej fosfatazy lub dehydrogenazy alkoholowej. Typowo białka zrekombinowane wytwarzane są do cytoplazmy komórki. Jeśli zastosowano sekwencje sygnałowe drożdży, np. czynnik alfa, wytworzone białka mogą być także wydzielane do środowiska fermentacyjnego. Glikozylacja wydzielanych białek zachodzi zgodnie z typem „wysokiego poziomu mannozy i często następuje wytworzenie nadmierne glikozylowanych białek, co może prowadzić do wytwarzania w organizmie pacjenta przeciwciał przeciwko tym białkom.
Zastosowanie w heterogenicznej ekspresji rekombinowanych białek znajdują także linie komórek ssaczych, na przykład komórek różnych gatunków gryzoni (komórki CHO, komórki C127) lub małp (komórki vero, CV-1, lub COS). Układy ekspresyjne oparte są na zrekombinowanych wirusach (wektor BPV) lub na wektorach wahadłowych. Do regulacji ekspresji stosowane są także wirusowe układy Enhancer/Promotor SV40 lub komórkowe elementy enhancerowe. Zrekombinowane białka, takie jak erytropoetyna, są wydzielane do pożywki fermentacyjnej, gdyż wprowadzone geny niosą zazwyczaj gotowe sekwencje sygnałowe, które są odczytywane przez układ ekspresyjny i wykorzystywane do kierowania białek.
Ponadto w biotechnologii, do wytwarzania glikozylowanych enzymów zewnątrzkomórkowych stosowane są pierwotniaki rodzaju Tetrahymena. Hodowla tych orzęsek może być prowadzona na podłożach fermentacyjnych korzystnych z ekonomicznego punktu widzenia, przy stosowaniu standardowego procesu fermentacyjnego. Do transformacji komórek odpowiednie są wektory oparte na rDNA pochodzącym z Tetrahymena. Do heterogenicznej ekspresji białek bakteryjnych w komórkach Tetrahymena stosuje się konstrukty DNA obejmujące geny pochodzące z Tetrahymena. Opracowanie odpowiednich środków do regulacji transkrypcji, ukierunkowania białka i glikozylacji obcych białek, umożliwi wykorzystanie Tetrahymena jako idealnego układu ekspresyjnego w ekonomicznie korzystnej produkcji medycznie wykorzystywanych zrekombinowanych białek.
W stosowanych dotychczas układach ekspresyjnych w bakteriach Gram-ujemnych, uzyskuje się typowo utworzenie ciałek inkluzyjnych w komórce, z jednoczesną denaturacją białka. W celu uzyskania zrekombinowanego białka komórki muszą zostać zniszczone i konieczne jest ponowne pofałdowanie unieczynnionego białka, prowadzącego do odzyskania jego aktywności biologicznej. Powoduje to konieczność zastosowania dalszych kosztownych etapów procesu technologicznego, a także obniża ilość uzyskanego pożądanego białka. Tak ważna dla białek eukariotycznych glikozylacja nie wyPL 206 037 B1 stępuje w ogóle. Natomiast zastosowanie układów ekspresyjnych w bakteriach Gram-dodatnich, powoduje, że pozyskanie docelowego białka jest wielce problematyczne ze względu na wysoką aktywność proteolityczną w pożywce fermentacyjnej.
Zastosowanie drożdży do ekspresji heterogenicznej docelowego białka zawsze prowadzi do wytwarzania białka wewnątrzkomórkowo, i konieczności pozyskania go w wyniku zniszczenia komórki. Powoduje to, podobnie jak to ma miejsce w przypadku bakteryjnych układów ekspresyjnych, dodatkowe wydłużenie czasu obróbki oraz konieczność stosowania dodatkowych, kosztownych etapów. Jeżeli zostaną zastosowane własne peptydy sygnałowe drożdży, to obce białka nie zostaną odpowiednio złożone i glikozylowane podczas wydzielania.
Przeciwnie, wytwarzanie zrekombinowanych białek w liniach komórkowych ssaków, prowadzi do uzyskania żądanego białka w podłożu fermentacyjnym, poza komórkami, prawidłowo złożone i glikozylowane. Wadą tego rozwią zania jest jednak niska efektywno ść ekspresyjna, wskutek wystę powania zakłóceń w przebiegu procesów biologicznych i nieefektywna translacja genów, które zostały wprowadzane do materiału genetycznego komórek z użyciem wektorów wirusowych. Z drugiej strony, zawierające surowicę podłoża fermentacyjne komórek ssaków są bardzo kosztowne. Technologia hodowli linii komórkowych wrażliwych na ścinanie, ze względu na konstrukcje zapewniające napowietrzanie podłoża wolne od pęcherzyków, jest skomplikowana oraz kosztowna. Kolejne problemy wynikają z dużego stopnia ryzyka grzybowego lub wirusowego zakażenia linii komórkowej. Reasumując, zastosowanie komórek ssaków do biotechnologicznego wytwarzania zrekombinowanych białek jest bardzo kosztowne, wymaga przestrzegania szeregu zasad bezpieczeństwa i charakteryzuje się niską wydajnością.
Opisane powyżej wady nie występują w przypadku zastosowania do produkcji rekombinowanych białek orzęsków z rodzaju Tetrahymena. Zatem na przykład pewne kwaśne hydrolazy, które uczestniczą w trawieniu cząstek pokarmu, są usuwane z komórki w dużych ilościach i ulegają skomplikowanej glikozylacji.
Alam i wsp. opisali w J. Euk. Microbiol. 43(4), 1996, strony 295 do 303, klonowanie genu kodującego kwaśną α-glukozydazę pochodzącą z Tetrahymena pyriformis. Jednakże tylko niewielka część tego białka została wydzielona z komórki. W międzynarodowym zgłoszeniu patentowym PCT/EP00/01853, opisano gen kodujący β-heksosaminidazę z Tetrahymena thermophila, jednak jak wiadomo białko to jest wydzielane z komórki tylko w 80%.
Dotychczas jednak nie było możliwe uzyskanie ekspresji, glikozylowanego, białka eukariotycznego w komórkach Tetrahymena, tak aby jednocześnie białko to było wydzielane do podłoża fermentacyjnego. Nie było to możliwe, ponieważ dotychczas nie były znane sekwencje DNA kodujące białka wydzielane do otoczenia, pochodzące z Tetrahymena, które są niezbędne do opracowania wektorów ekspresyjnych zapewniających wydzielanie wytworzonego obcego białka wyłącznie do podłoża fermentacyjnego. Znane były natomiast sekwencje DNA kodujące białka β-heksosaminidazę z Tetrahymena thermophila. Sekwencja ta została przedstawiona do ochrony patentowej w zgłoszeniach o nr DE 199 58 979.8, DE 199 09 189.7, a także pod numerem PCT/EP00/01853. Wadą opisanych w tych wnioskach sekwencji jest jednak to, że obecne w białku pre/propeptydy zapewniają wydzielanie żądanego białka do otaczającego podłoża fermentacyjnego tylko w ilości około 80%. Jest to spowodowane zatrzymaniem w naturalnych warunkach przez błonę komórkową β-heksosaminidazy w około 20%, w wyniku tego tylko 80% naturalnie wyprodukowanego enzymu ulega wydzieleniu z komórki. Zatem jeśli w wyniku inżynierii genetycznej obce białko zostanie poprzedzone β-heksosaminidazą to obecne pre/pro-peptydy będą kierować to obce dla gospodarza białko w ilości około 20% do błony cytoplazmatycznej Tetrahymena thermophila. Jest to poważna wada techniczna procesu wytwarzania rekombinowanych substancji czynnych. Po pierwsze, zmniejsza ilość uzyskanego produktu, ponieważ część powstałego białka zostaje zatrzymana przez błonę komórkową a zatem nie całe uzyskane białko może zostać odfiltrowane z zawiesiny. Z kolei wprowadzone białko po wbudowany do błony komórkowej może działać toksycznie na własne komórki i w ten sposób spowolnić wzrost komórek.
Do dnia dzisiejszego nie znane są żadne konstytutywne promotory z Tetrahymena, zapewniające jednorodność produktu lub stałość transkrypcji białek heterogenicznych. Jak dotąd znane są jedynie promotory genów kodujących histon i tubulinę (Bannon i wsp. 1984, Gaertig i wsp. 1993). Zasadniczą wadą tych promotorów jest jednak fakt, że ich aktywacja jest zależna od etapu cyklu komórkowego. Geny kodujące heterogeniczne białka zlokalizowane pod promotorem zależnym od etapu cyklu komórkowego, ulegają ekspresji tylko w komórkach rosnących lub ulegających podziałowi. Jest to zasadnicza wada procesu technologicznego, ponieważ żądane białka produkowane są tylko w lo4
PL 206 037 B1 garytmicznej fazie wzrostu kolonii. W statycznej fazie wzrostu, w której w procesie produkcyjnym osiągnięta zostaje najwyższa gęstość komórek i, w związku z tym, najwyższa wydajność organizmu produkującego (Tetrahymena), wzrost komórek prawie nie występuje, a w konsekwencji, występuje także niewielka ekspresja białek heterogenicznych.
Wynalazek ma zatem za zadanie dostarczenie układu, który umożliwi po transformacji Tetrahymena, wydzielanie z komórek do środowiska białek heterogenicznych.
Przedmiotem wynalazku jest sekwencja kwasu nukleinowego zawierająca regiony kodujące i niekodujące określone sekwencją nr 4 (Seq. ID. Nr 4), w której regiony kodujące kodują fosfolipazę A1 (PLA1) z Tetrahymena thermophila (Seq. ID. Nr 5), a regiony niekodujące obejmują regiony zlokalizowane w górę i w dół od tego genu.
Korzystnie niekodujące regiony w górę i w dół od genu są określone sekwencją Nr 2 oraz 3 (Seq. ID nr 2 oraz Seq. ID nr 3), a regiony kodujące są określone sekwencjami Nr 1, 8 i/lub 9 (Seq. ID nr 1, Seq. ID nr 8 i/lub Seq. ID nr 9).
Przedmiotem wynalazku jest również N-końcowa sekwencja sygnałowa PLA1 (Seq. ID nr 5), określona sekwencją Nr 6 (Seq. ID nr 6).
Ponadto przedmiotem wynalazku jest białko fosfolipazy A1 (PLA1) o sekwencji aminokwasowej odpowiadającej sekwencji Nr 7 (Seq. ID nr 7).
Kolejnym przedmiotem wynalazku jest zastosowanie kwasu nukleinowego według wynalazku lub jego fragmentów do homologicznych lub heterogenicznych ekspresji zrekombinowanych białek i peptydów, a także do homologicznej lub heterogenicznej rekombinacji, zwłaszcza rozbicia lub zastąpienia genu.
Przedmiotem wynalazku jest ponadto sposób homologicznej lub heterogenicznej ekspresji białek i peptydów, oraz homologicznej lub heterogenicznej rekombinacji, zwłaszcza rozbicia lub zastąpienia genu, w którym orzęski Tetrahymena, transformuje się kwasem nukleinowym według wynalazku.
Korzystnie kwasy nukleinowe lub ich fragmenty łączy się z homologicznymi i heterogenicznymi układami do ekspresji białek, takimi jak enhancery, promotory, operatory, miejsca inicjacji, terminatory, oporność na antybiotyki albo z innymi kwasami nukleinowymi, albo fragmentami DNA, albo sekwencjami różnych rodzajów wiroidów, wirusów, bakterii, archezoa, pierwotniaków, grzybów, roślin, zwierząt, albo ludzi.
W innym korzystnym rozwiązaniu kwas nukleinowy wprowadza się do wektora, plazmidu, kosmidu, chromosomu, minichromosomu, transpozonu, IS, rDNA, lub do każdego rodzaju pierścieniowego bądź liniowego DNA albo RNA.
Przedmiotem wynalazku jest ponadto wektor, plazmid, kosmid, chromosom, albo minichromosom, transpozon, element IS, rDNA, albo inne rodzaje pierścieniowego bądź liniowego DNA, albo RNA, zawierający przynajmniej jedną z sekwencji kwasów nukleinowych według wynalazku.
Zaletą zastosowania kwasu nukleinowego kodującego fosfolipazę A1 (Seq. ID Nr 7) jest to, że produkt tego DNA w określonych warunkach środowiskowych, jest wydzielany przez komórkę w dużych ilościach. Wytworzone białko ulega wydzieleniu w dużych ilościach do otaczającego komórki podłoża fermentacyjnego i nie jest wprowadzane do błony komórkowej. Zastosowana w ramach wynalazku sekwencja kwasu nukleinowego zawiera promotor, który powoduje konstytutywną tzn. niezależną od cykli komórkowych, transkrypcję przyłączonych do niego genów kodujących heterogeniczne białka. Ten sposób transkrypcji ma przy tym tę zaletę, że heterogeniczne białka są stale wytwarzane w organizmie gospodarza, w sposób niezależ ny od cyklu komórkowego. W ten sposób transkrypcja obcego genu a w konsekwencji, wytwarzanie heterogenicznych białek może mieć miejsce także w statycznej fazie wzrostu komórek.
Zastosowana w ramach wynalazku sekwencja DNA kodująca fosfolipazę A1 zawiera szczególnie pożądany odcinek PLA1 w górę od tego genu (Seq. ID Nr 2), który jest nośnikiem elementów inicjacji transkrypcji, a także zawiera peptydy sygnałowe, propeptydy, oraz dalsze elementy genetyczne sterujące białkami, w szczególności odcinek PLA1 zlokalizowany 'w dół' od genu (Seq. ID Nr 3), zawierający elementy genetyczne powodujące zatrzymanie transkrypcji. Zastosowanie kwasu nukleinowego według wynalazku umożliwia uzyskanie heterogenicznych białek niezależnie od cyklu komórkowego oraz ich transportowanie do otaczającego komórki podłoża fermentacyjnego, bez strat wskutek zatrzymywania białek w błonie cytoplazmatycznej i w konsekwencji możliwe jest odfiltrowywanie otrzymanych białek z zawiesiny fermentacyjnej bez konieczności lizy komórek.
Wynalazek został przedstawiony na rysunku, na którym
PL 206 037 B1 fig. 1 przedstawia sekwencję kwasu nukleinowego orzęsków, kodującą odcinek w górę (Seq. ID Nr 2), odcinek (Seq. ID Nr 1) oraz odcinek w dół (Seq. ID Nr 3) od genu kodującego fosfolipazę A1 fig. 2 przedstawia wydzielony do podłoża produkt kwasu nukleinowego o Seq. ID Nr 1.
Przedmiotem wynalazku jest także sekwencja sygnałowa (Seq. ID Nr 6) objętego wynalazkiem białka. Odnosi się to przede wszystkim do objętych wynalazkiem, aminokwasów od 1 do 110 (Seq. ID Nr 5). Także sekwencja kwasu nukleinowego, która koduje fragment N-końcowy, jest objęta wynalazkiem (Seq. ID Nr 3).
Sekwencja kwasu nukleinowego odcinka nie ulegającego transkrypcji (odcinek w górę) (Seq. ID Nr 2) powyżej obszaru sekwencji kodującego PLA1, pochodzącą z Tetrahymena jest usytuowana pomiędzy pozycją -275 a -1 (wyrażona przy pomocy małych liter). Stwierdzony odcinek nie podlegający transkrypcji obejmuje 275 zasad. Elementy promotora, TATA-Box, zlokalizowane są w pozycjach -49 do -55 (wytłuszczenie), a także domniemany CAAT-Box pomiędzy zasadami -133 a -136 (wytłuszczenie). Sekwencja kodująca cDNA została przedstawiona wielkimi literami. Numerowanie sekwencji zaczyna się od kodonu start ATG. Obszary znane z sekwencjonowania białek umieszczono w ramkach, a kodon stop został podkreślony. Dojrzałe białko jest kodowane od zasady 331. Opis sekwencji od zasady 1 do 963 przedstawia pre/prosekwencję (Seq. ID Nr 8) PLA1 Opis sekwencji od zasady 331 do 963 przedstawia sekwencję (Seq. ID Nr 9) dojrzałej PLA1 W pozycji 961 znajduje się kodon stop TGA, a w pozycji 1039 sygnał poliadenilizacji AAT AAA. Sekwencja kwasu nukleinowego od pozycji 964 do 1134, znajdująca się poniżej sekwencji kodującej PLA1z Tetrahymena, przedstawia odcinek w dół od regionu kodującego PLA1(Seq. ID Nr 3), który nie będzie podlegał transkrypcji (także przedstawiony małymi literami). W pozycjach od 964 do 1101 mieś ci się obszar znany z sekwencjonowania cDNA, który potwierdzono za pomocą odwrotnej PCR. Po transkrypcji, do ostatniego kodonu mRNA (ttt, pozycje 1098 - 1101) przyłącza się łańcuch końcowy poli-A.
Przedmiotem wynalazku jest sposób, w którym sekwencja kwasu nukleinowego, lub jej fragmenty, kodująca fosfolipazę A1 może być łączona z typowymi czynnikami optymalizującymi ekspresję np.: regionem NF-1 (czynnik optymalizujący ekspresję w cytomegalowirusie), promotorami takimi jak np.: lac, trc, tic lub promotorami tac, promotorami klasy II i III układu T7 RNAP, promotorami bateriofagowymi T7 i SP6, aprE, amylazami lub promotorami spac bakteryjnych układów ekspresyjnych, promotorami AOX1, AUG1 oraz 2 lub promotorami GAPp (Pichia) układów ekspresyjnych drożdży, promotorami RSV (Virus SV 40), promotorami CMV (cytomegalowirus), promotorami AFP (adenowirusy) lub promotorami metalotionininy w układach ekspresyjnych ssaków, promotorami wirusów sindbis, lub promotorami wirusa Semlike-Forest dla komórek owadów, promotorami dla układów ekspresyjnych komórek owadów takich, jak hsp70, DS47, aktyna 5C lub kopia, promotorami specyficznymi dla roślin, takimi jak promotor 35S (wirus mozaiki kalafiora), promotor amylazy lub promotor patatyny klasy I, operatorami takimi, jak np. operator tet; peptydami sygnałowymi takimi, jak pre/prosekwencje sygnałowe a-MF (Saccharomyces), miejscami inicjacji, terminatorami, genami oporności na antybiotyk oraz substancje biologicznie czynne, takie jak amplicylina, kanamycyna, strepromycyna, chloramfenikol, penicylina, amfoterycyna, cykloheksymid, 6-metylopuryna, paromomycyna, higromycyna, α-amanatyna, markerami auksotroficznymi, takimi jak gen kodujący reduktazę dhf lub różnorodnymi sekwencjami wiroidów, wirusów, bakterii, archezoa, pierwotniaków, grzybów, roślin, zwierząt czy ludzi.
Osoba biegła w dziedzinie wie, że w procesie technologicznym będącym przedmiotem wynalazku można zastosować kwasy nukleinowe, które posiadają minimum 40 procentową homologię z kwasem nukleinowym o Seq. ID. Nr 1. Także białko o Seq. ID. Nr 2 może być modyfikowane nie tracąc jego funkcji. W ten sposób mogą być przykładowo przeprowadzane tak zwane konserwatywne wymiany aminokwasów. Poza tym można, np. wymieniać pomiędzy sobą aminokwasy hydrofobowe.
Następujące metody mogą być zastosowane w celu wyodrębnienia i oczyszczenia fosfolipazy A1 pozyskanej z Tetrahymena oraz w celu ustalenia sekwencji:
Pozyskiwanie PLA1
PLA1 otrzymano z supernatantów hodowli Tetrahymena termophila pozbawionych komórek. Fermentację komórek prowadzono w 2 litrowym fermentatorze (Biostat MD, Braun Diessel Biotech, Melsungen, Niemcy), który sterowany jest przez cyfrową jednostkę DCU. Fermentator przez pierwsze 24 godziny pracuje w cyklu okresowym a następnie stale. Zebranie supernatantów pozbawionych komórek prowadzi się przez filtr prefuzyjny o wielkości porów ok. 0,3 μm (S6/2, Enka, Wuppertal).
Fermentacja przeprowadza się według następujących parametrów:
• objętość robocza 2 litry • wydajność prefuzyjna 2 litry/dobę
PL 206 037 B1 • liczba obrotów mieszadła została ograniczona do 800 obr./min.
• wartość temperatury wynosiła niezmiennie około 30°C • wartość pH była utrzymywana niezmiennie w pobliżu pH 7 • gęstość początkowa wynosiła 50.000 komórek/ml
Do fermentacji zastosowano szczep SB 1868 VII, będący typem dzikim szczepu Tetrahymena thermophilia.
Fermentację prowadzi się przez 264 godzin, a następnie zbiera supernatanty i bada pod kątem aktywności PLA1.
Oczyszczanie PLA1
W celu oczyszczenia PLA1 wykorzystano 1 I supernatantu pożywki hodowlanej pozbawionego komórek 1. Do tej hodowli dodano następnie 140 g siarczanu amonu i stosując jednostkę ultrafiltrującą (Pellikon XL, wielkość wykluczenia 3kDa, Millipore) zatężono do objętości 50 ml. Następnie próbkę oczyszczono stosując chromatografię oddziaływań hydrofobowych (20x1,6 Fractogel EMD fenyl I 650, Merck, Darmstadt). Szybkość przepływu wynosiła 5 ml/min, a eluent zebrano jako 5ml frakcje. Aktywność enzymatyczna określono jako poziom deacylacji radioaktywnie znakowanego fosfolipidu (L-3-fosfatydocholina, 1-palmitoyl-2-[1-14C]linoelyl). Fig. 3 przedstawia uzyskany profil elucyjny, gradient octanu sodu oraz aktywność enzymatyczną poszczególnych frakcji.
Trzy frakcje o najwyższej aktywności enzymatycznej zostały połączone i zmieniono bufor na bufor wyjściowy (Bis-Tris 20 mM, pH 6,5) w celu przeprowadzenia chromatografii anionowymiennej (AEC). Następnie próbkę umieszczono w kolumnie (Q-Sepharose-Hiload-16/10, Pharmacia, Szwecja) i PLA1 wymywano z kolumny liniowym gradientem NaCI (szybkość przepł ywu 3 ml/min) i zebrano jako frakcje po 5 ml. Fig. 4 przedstawia uzyskany profil elucyjny, gradient NaCI oraz aktywność enzymatyczną poszczególnych frakcji.
Z frakcji o najwyższej aktywności PLA1 pobrano 200 μΐ i rozdzielono stosując chromatografię wykluczenia (SEC). Zastosowano przy tym kolumnę Superdex HR 75 30/10 (Pharmacia, Szwecja). Podczas chromatografii szybkość przepływu wynosiła 0,6 ml/min, a eluent zbierano we frakcjach po 200 pl. Fig. 5 przedstawia otrzymany profil elucyjny oraz aktywność enzymatyczną poszczególnych frakcji.
Uzyskane frakcje zostały zbadane pod względem czystości z zastosowaniem jednowymiarowej elektroforezy w żelu. Stwierdzono przy tym występowanie dwóch wyraźnych prążków przy ~26 oraz -28 kDa. Rozdzielenie tych dwóch prążków stosując dwuwymiarową elektroforezę prowadziło do uzyskania z prążków 2 i 3 plamek o różnych punktach izoelektrycznych.
W przypadku białek o masie cząsteczkowej 26 kDa, wartości te wystąpiły przy pH 6,3 oraz 5,7, dla białek o masie 28 kDa - przy pH 6,3, 5,7 oraz 5,3. Ostateczne badanie tych punktów przy pomocy analizy Mass-Fingerprint pozwoliło stwierdzić, że plamki te odpowiadają izoformom tego samego białka.
Badanie PLA1 metodami biologii molekularnej
Po stwierdzeniu czystości białka, próbki białka zostały przeniesione na membranę PVDF i poddano wstępnemu sekwencjonowaniu od końca N. Dodatkowo kolejną próbkę trawiono enzymem, trypsyną i również poddano wstępnemu sekwencjonowaniu. Stosując uzyskane w ten sposób sekwencje białek opracowano starter oligonukleotydowy, który następnie zastosowano w transkryptazie odwrotne PCR (3'RACE, Szybka amplifikacja końców cDNA). W wyniku zastosowania techniki PCR, A1 amplifikowano, a następnie zsekwencjonowno cDNA kodujący fosfolipazę A1. Uzyskane sekwencje mają długość odpowiednio, 633 i 729 zasad, a obliczona na tej podstawie masa cząsteczkowa dojrzałego białka wynosi ok. 22,4 kDa. W uzyskanej sekwencji znalazły się w 100%, oligopeptydy z 22 aminokwasów (koniec N) i 18 aminokwasów (w obrębie białka). Dodatkowo, poza sekwencją dojrzałego białka można z pomocą 5'RACE (szybka amplifikacja końców cDNA) ustalić także sekwencję pre/propeptydu (fig. 2). Jest to peptyd o długości 110 aminokwasów, który jako taki zawiera zarówno sekwencję sygnałową jak i propeptyd, który dezaktywuje enzym i ulega odcięciu dopiero po ostatecznym osiągnięciu miejsca działania enzymu.
Porównanie sekwencji ze znanymi już fosfolipazami A1, nie umożliwiło stwierdzenia żadnych homologii, z wyjątkiem jednej sekwencji konsensusowej 5 aminokwasów (GxSxG), które występują we wszystkich lipazach i fosfolipazach, i które są brane pod uwagę jako miejsce przyłączania lipidów lub fosfolipidów. Poza tym, w wyniku odwrotnego PCR ustalono sekwencje w górę i w dół względem genu kodującego PLA1 (fig. 1). Zaten, genomowy DNA trawiono endonukleazami restrykcyjnymi, fragmenty połączono ligazą T4 i ostatecznie zamplifikowano z zastosowaniem starterów odwrotnych. Do amplifikowania regionu w górę względem genu PLA1 poprzez odwrotnym PCR zastosowano genomowy DNA, trawiony endonukleazą restrykcyjną Sspl. W ten sposób, zidentyfikowano region w górę wzglęPL 206 037 B1 dem genu PLA1 o długości 275 zasad oraz elementy promotora. W pozycji -136 znajduje się sekwencja CAAT (CAAT-box), oddalona podobnie od miejsca inicjacji translacji, jak sekwencje CCAAT (CCAAT-boxes) genów histonowych (-141 lub -151) Tetrahymena, których odkrycia dokonali Brunk i Sadler (1990). Sekwencja TATA (TATA-box), która okreś la w przypadku genów eukariotycznych dokładny punkt inicjacji transkrypcji, została zidentyfikowana w pozycji -55. Sekwencja odpowiada obecnym u eukariontów sekwencjom konsensusowym. W celu amplifikacji odcinka zlokalizowanego w dół od genu PLA1 odwrotna PCR, który zawiera terminator transkrypcji PLA1 z Tetrahymena, trawiono genomowy DNA BamHI. W ten sposób, oprócz regionu w dół znanego jako 3'RACE, kolejne 222 zasady mogły być określone (fig. 3).
<110> Cilian AG <120> Sekwencja DNA enzymu fosfolipazy A1 pozyskanego z orzęsków Tetrahymena i jego zastosowanie <130> cilian <140>
<141 >
<160>9 <170>Patent wer. 2. 1 <210> 1 <211> 963 <212> DNA <213> Tetrahymena thermophila <400> 1
| atgaacaaga | ctctcatctt | agctttagtt | gttgttttgg | ctttaactgc | caccaccttg | 60 |
| gttgctttcc | acaaccactc | tcacaacatc | agagttgact | aagaccccgc | cactctcttc | 120 |
| aagcaattca | agcaaactta | caataagaag | tatgctgatg | ctactttcga | aacctacaga | 180 |
| ttcggtgtct | tcacccaaaa | cttagaaatc | gtacaagactg | actctacttt | cggtgtcacc | 240 |
| taattcatgg | acttaactcc | tgctgaattc | gctcaacaat | tcctcacttt | cacgaaaagg | 300 |
| ttaacagcac | cgaagtttac | agagcttaag | gtgaagctac | cgaagttgac | tggactgcca | 360 |
| agggtaaggt | cacccctgtt | aagaactaag | gttcttgtgg | ttcctgctgg | gctttctcca | 420 |
| ccattggtgc | cgttgaatct | gctctttgga | ttgctggtca | aggtgaataa | aacactctta | 480 |
| accttgctga | ataagaataa | gttgactgtg | ctaagtcccc | caagtacgac | tctgaaggtt | 540 |
| gcaacggtgg | ttggatggtt | gaaggtttca | agtacatcat | cgacaacaag | atctcctaaa | 600 |
| ctgctaacta | tccctacact | gctaaggatg | gtaagtgcaa | ggacacctct | tccttcaaga | 660 |
| agttctctat | ttctaagtac | gctgaaatcc | cctaaggtga | ctgcaactcc | ctcaactctg | 720 |
| ccttagaaca | aggtcctatc | tccgttgctg | ttgatgccac | caacttctaa | ttctacactt | 780 |
| ctggtgtctt | taaaaactgc | aaggccaacc | tcaaccacgg | tgtcctctta | gttgccaacg | 840 |
| ttgactcttc | tctcaagatc | aagaactcct | ggggtccttc | ttggggtgaa | aagggtttca | 900 |
| tcagattagc | tgccggtaac | acttgcggtg | tctgcaatgc | tgcctcttac | cctattgtt | 960 |
| tga | 963 |
<210> 2 <211> 275 <212> DNA <213> Tetrahymena thermophila <4Q0> 2 _____ aatatttatc | aatgctactt | ataattcttt | tagtatgaga | tatgatatgc | tctttctctg | 60
PL 206 037 B1
| ctagacttaa | cttatgacat | ttgaactttt | aataaaagaa | ttttttttat | taaaaagcag | 120 |
| agatttttaa | tagaagaatc | aatgactcat | gaatttaata | aagattttca | agtgttttct | 180 |
| aataccgact | agctttataa | attcacttat | taatcaacga | tataaaaatt | atattaacaa | 240 |
| atcaataaat | aaaaaaataa | ataaaaacaa | aacaa | 275 |
<210> 3 <211> 171 <212> DNA <213> Tetrahymena thermophiia <400> 3
| aaaaacataa | tccaaattaa | aaaaaattac | tcaaaactga | taatataaaa | aattaatttt | 60 |
| cataatttta | atgtaaataa | atacctttat | atttgacgtt | ttgtactcaa | aataaattaa | 120 |
| agttaacaaa | ccatatttat | ttaattctac | ttttcattt | ttaaaaatat | a | 171 |
<210>4 <211> 1408 <212> DNA <2'\3>1etrahymena thermophiia <400> 4
| aatatttatc | aatgctacttt | ataattcttt | tagtatgaga | tatgatatgc | tctttctctg | 60 |
| ctagacttaa | cttatgacat | ttgaactttt | aataaaagaa | ttttttttat | taaaaagcag | 120 |
| agatttttaa | tagaagaatc | aatgactcat | gaatttaata | aagattttca | agtgttttct | 180 |
| aataccgact | agctttataa | attcacttat | taatcaacga | tataaaaatt | atattaacaa | 240 |
| atcaataaat | aaaaaaataa | ataaaaacaa | aacaaatgaa | caagactctc | atcttagctt | 300 |
| tagttgttgt | tttggcttta | actgccacca | ccttggttgc | tttccacaac | cactctcaca | 360 |
| acatcagagt | tgactaagac | cccgccactc | tcttcaagca | attcaagcaa | acttacaata | 420 |
| agaagtatgc | tgatgctact | ttcgaaacct | acagattcgg | tgtcttcacc | caaaacttag | 480 |
| aaatcgtcaa | gactgactct | actttcggtg | tcacctaatt | catggactta | actcctgctg | 540 |
| aattcgctca | acaattcctc | actttcacga | aaaggttaac | agcaccgaag | tttacagagc | 600 |
| ttaaggtgaa | gctaccgaag | ttgactggac | tgccaagggt | aaggtcaccc | ctgttaagaa | 660 |
| ctaaggttct | tgtggttcct | gctgggcttt | ctccaccatt | ggtgccgttg | aatctgctct | 720 |
| ttggattgct | ggtcaaggtg | aataaaacac | tcttaacctt | gctgaataag | aataagttga | 780 |
| ctgtgctaag | tcccccaagt | acgactctga | aggttgcaac | ggtggttgga | tggttgaagg | 840 |
| tttcaagtac | atcatcgaca | acaagatctc | ctaaactgct | aactatccct | acactgctaa | 900 |
| ggatggtaag | tgcaaggaca | cctcttcctt | caagaagttc | tctatttcta | agtacgctga | 960 |
| aatcccctaa | ggtgactgca | actccctcaa | ctctgcctta | gaacaaggtc | ctatctccgt | 1020 |
| tgctgttgat | gccaccaact | tctaattcta | cacttctggt | gtctttaaaa | actgcaaggc | 1080 |
| caacctcaac | cacggtgtcc | tcttagttgc | caacgttgac | tcttctctca | agatcaagaa | 1140 |
| ctcctggggt | ccttcttggg | gtgaaaaggg | tttcatcaga | ttagctgccg | gtaacacttg | 1200 |
| cggtgtctgc | aatgctgcct | cttaccctat | tgtttgaaaa | aacataatcc | aaattaaaaa | 1260 |
| aaattactca | aaactgataa | tataaaaaat | taattttcat | aattttaatg | taaataaata | 1320 |
| cctttatatt | tgacgttttg | tactcaaaat | aaattaaagt | taacaaacca | tatttattta | 1380 |
| attctacttt | tcaattttta | aaaatata | 1408 |
PL 206 037 B1 <210> 5 <211> 320 <212> PRT <213> Tetrahymena thermophila <400> 5
| Met | Asn | Lys | Thr | Leu | Ile | Leu | Ala | Leu | Val | Gly | Val | Leu | Ala | Leu | Thr |
| 1 | 5 | 10 | 15 | ||||||||||||
| Ala | Thr | Thr | Leu | Val | Ala | Phe | His | Asn | His | Ser | His | Asn | Ile | Arq | Val |
| 20 | 25 | 30 | |||||||||||||
| Asp | Gin | Asp | Pro | Ala | Thr | Leu | Phe | Lys | Gin | Phe | Lys | Gin | Thr | Tyr | Asn |
| 35 | 40 | 45 | |||||||||||||
| Lys | Lys | TyL | Ala | Asp | Pro | Thr | Phe | Glu | Thr | Tyr | Arg | Phe | Gly | Val | Phe |
| 50 | 55 | 60 | |||||||||||||
| Thr | Gin | Asn | Leu | Glu | Ile | Val | Lys | Thr | Asp | Ser | Thr | Phe | Gly | Val | Thr |
| 65 | 70 | 75 | 80 | ||||||||||||
| Gin | Phe | Met | Asp | Leu | Thr | Pro | Ala | Glu | Phe | Ala | Gin | Gin | Phe | Leu | Thr |
| 85 | 90 | 95 | |||||||||||||
| Leu | His | Glu | Lys | Val | Asn | Ser | Thr | Glu | Val | Tyr | Arg | Ala | Gin | Gly | Glu |
| 100 | 105 | 110 | |||||||||||||
| Ala | Thr | Glu | Val | Asp | Trp | Thr | Ala | Lys | Gly | Lys | Val | Thr | Pro | Val | Lys |
| 115 | 120 | 125 | |||||||||||||
| Asn | Gin | Gly | Ser | Cys | Gly | Ser | Cys | Trp | Ala | Phe | Ser | Thr | Ile | Gly | Ala |
| 130 | 135 | 140 | |||||||||||||
| Val | Glu | Ser | Ala | Leu | Leu | Ile | Ala | Gly | Gin | Gly | Glu | Gin | Asn | Thr | Leu |
| 145 | 150 | 155 | 160 | ||||||||||||
| Asn | Leu | Ala | Glu | Gin | Glu | Leu | Val | Asp | Cys | Ala | Lys | Ser | Pro | Lys | Tyr |
| 165 | 170 | 175 | |||||||||||||
| Asp | Ser | Glu | Gly | Cys | Asn | Gly | Gly | Trp | Met | Val | Glu | Gly | Phe | Lys | Tyr |
| 180 | 185 | 190 | |||||||||||||
| Ile | Ile | Asp | Asn | Lys | Ile | Ser | Gin | Thr | Ala | Asn | Tyr | Pro | Tyr | Thr | Ala |
| 195 | 200 | 205 | |||||||||||||
| Lys | Asp | Gly | Lys | Cys | Lys | Asp | Thr | Ser | Ser | Phe | Lys | Lys | Phe | Ser | Ile |
| 210 | 215 | 220 |
PL 206 037 B1
| Ser | Lys | JYL· | Ala | Glu | Ile | Pro | Gln | Gly | Asp | Cys | Asn | Ser | Leu | Asn | Ser |
| 225 | 230 | 235 | 240 | ||||||||||||
| Ala | Leu | Glu | Gln | Gly | Pro | Ile | Ser | Val | Ala | Val | Asp | Ala | Thr | Asn | Phe |
| 245 | 250 | 255 | |||||||||||||
| Gln | Phe | Tyr | Thr | Ser | Gly | Val | Phe | Lys | Asn | Cys | Lys | Ala | Asn | Leu | Asn |
| 260 | 265 | 270 | |||||||||||||
| His | Gly | Val | Leu | Leu | Val | Ala | Asn | Val | Asp | Ser | Ser | Leu | Lys | Ile | Lys |
| 275 | 280 | 285 | |||||||||||||
| Asn | Ser | Trp | Gly | Pro | Ser | Trp | Gly | Glu | Lys | Gly | Phe | Ile | Arg | Leu | Ala |
| 290 | 295 | 300 | |||||||||||||
| Ala | Gly | Asn | Thr | Cys | Gly | Val | Cys | Asn | Ala | Ala | Ser | Tyr | Pro | Ile | Val |
| 305 | 310 | 315 | 320 |
<210>6 <211> 110 <212> PRT <213> Tetrahymena thermophifa <400> 6
| Met | Asn | Lys | Thr | Leu | Ile | Leu | Ala | Leu | Val | Gly | Val | Leu | Ala | Leu | Thr |
| 1 | 5 | 10 | 15 | ||||||||||||
| Ala | Thr | Thr | Leu | Val | Ala | Phe | His | Asn | His | Ser | His | Asn | Ile | Arg | Val |
| 20 | 25 | 30 | |||||||||||||
| Asp | Gln | Asp | Pro | Ala | Thr | Leu | Phe | Lys | Gln | Phe | Lys | Gln | Thr | Tyr | Asn |
| 35 | 40 | 45 | |||||||||||||
| Lys | Lys | Tyr | Ala | Asp | Pro | Thr | Phe | Glu | Thr | Tyr | Arg | Phe | Gly | Val | Phe |
| 50 | 55 | 60 | |||||||||||||
| Thr | Gln | Asn | Leu | Glu | Ile | Val | Lys | Thr | Asp | Ser | Thr | Phe | Gly | Val | Thr |
| 65 | 70 | 75 | 80 | ||||||||||||
| Gln | Phe | Met | Asp | Leu | Thr | Pro | Ala | Glu | Phe | Ala | Gln | Gln | Phe | Leu | Thr |
| 85 | 90 | 95 | |||||||||||||
| Leu | His | Glu | Lys | Val | Asn | Ser | Thr | Glu | Val | τγϋ | Arg | Ala | Gln |
PL 206 037 B1
| ιοο | | 105 | | I | | no | | I t |
<210> 7 <211> 210 <212> PRT <213> Tetrahymena thermophila <400> 7
| Gly | Glu | Ala | Thr | Glu | Val | Asp | Trp | Thr | Ala | Lys | Gly | Lys | Val | Thr | Pro |
| 1 | 5 | 10 | 15 | ||||||||||||
| Val | Lys | Asn | Gin | Gly | Ser | Cys | Gly | Ser | Cys | Trp | Ala | Phe | Ser | Thr | Ile |
| 20 | 25 | 30 | |||||||||||||
| Gly | Ala | Val | Glu | Ser | Ala | Leu | Leu | Ile | Ala | Gly | Gin | Gly | Glu | Gin | Asn |
| 35 | 40 | 45 | |||||||||||||
| Thr | Leu | Asn | Leu | Ala | Glu | Gin | Glu | Leu | Val | Asp | Cys | Ala | Lys | Ser | Pro |
| 50 | 55 | 60 | |||||||||||||
| Lys | Tyr | Asp | Ser | Glu | Gly | Cys | Asn | Gly | Gly | Trp | Met | Val | Glu | Gly | Phe |
| 65 | 70 | 75 | 80 | ||||||||||||
| Lys | Tyr | Ile | Ile | Asp | Asn | Lys | Ile | Ser | Gin | Thr | Ala | Asn | Tyr | Pro | Tyr |
| 85 | 90 | 95 | |||||||||||||
| Thr | Ala | Lys | Asp | Gly | Lys | Cys | Lys | Asp | Thr | Ser | Ser | Phe | Lys | Lys | Phe |
| 100 | 105 | 110 | |||||||||||||
| Ser | Ile | Ser | Lys | Tyr | Ala | Glu | Ile | Pro | Gin | Gly | Asp | Cys | Asn | Ser | Leu |
| 115 | 120 | 125 | |||||||||||||
| Asn | Ser | Ala | Leu | Glu | Gin | Gly | Pro | Ile | Ser | Val | Ala | Val | Asp | Ala | Thr |
| 130 | 135 | 140 | |||||||||||||
| Asn | Phe | Gin | Phe | Tyr | Thr | Ser | Gly | Val | Phe | Lys | Asn | Cys | Lys | Ala | Asn |
| 145 | 150 | 155 | 160 | ||||||||||||
| Leu | Asn | His | Gly | Vai | Leu | Leu | Val | Ala | Asn | Val | Asp | Ser | Ser | Leu | Lys |
| 165 | 170 | 175 | |||||||||||||
| Ile | Lys | Asn | Ser | Trp | Gly | Pro | Ser | Trp | Gly | Glu | Lys | Gly | Phe | Ile | Arq |
| 180 | 185 | • | 190 | ||||||||||||
| Leu | Ala | Ala | Gly | Asn | Thr | Cys | Gly | Val | Cys | Asn | Ala | Ala | Ser | Tyr | Pro |
| 195 | 200 | 205 |
PL 206 037 B1
| Ile | Val | ||||||||||||||
| 210 |
<210> 8 <211> 330 <212> DNA <213> Tetrahymena thermophila <400> 8
| atgaacaaga | ctctcatctt | agctttagtt | gttgttttgg | ctttaactgc | caccaccttg | 60 |
| gttgctttcc | acaaccactc | tcacaacatc | agagttgact | aagaccccgc | cactctcttc | 120 |
| aagcaattca | agcaaactta | caataagaag | tatgctgatg | ctactttcga | aacctacaga | 180 |
| ttcggtgtct | tcacccaaaa | cttagaaatc | gtcaagactg | actctacttt | cggtgtcacc | 240 |
| taattcatgg | acttaactcc | tgctgaattc | gctcaacaat | tcctcacttt | acacgaaaag | 300 |
| gttaacagca | ccgaagttta | cagagcttaa | 330 |
<210> 9 <211> 633 <212> DNA <213> Tetrahynena thermophila <400> 9
| ggtgaagcta | ccgaagttga | ctggactgcc | aagggtaagg | tcacccctgt | taagaactaa | 60 |
| ggttcttgtg | gttcctgctg | ggctttctcc | accattggtg | ccgttgaatc | tgctctttgg | 120 |
| attgctggtc | aaggtgaata | aaacactctt | aaccttgctg | aataagaata | agttgactgt | 180 |
| gctaagtccc | ccaagtacga | ctctgaaggt | tgcaacggtg | gttggatggt | tgaaggtttc | 240 |
| aagtacatca | tcgacaacaa | ttccttcaag | actgctaact | atcccłacac | tgctaaggat | 300 |
| ggtaagtgca | aggacacctc | ttccttcaag | aagttctcta | tttctaagta | cgctgaaatc | 360 |
| ccctaaggtg | actgcaactc | cctcaactct | gccttagaac | aaggtcctat | ctccgttgct | 420 |
| gttgatgcca | ccaacttcta | attctacact | tctggtgtct | ttaaaaactg | caaggccaac | 480 |
| ctcaaccacg | gtgtcctctt | agttgccaac | gttgactctt | ctctcaagat | caagaactcc | 540 |
| tggggtcctt | cttggggtga | aaagggtttc | atcagattag | ctgccggtaa | cacttgcggt | 600 |
| gtctgcaatg | ctgcctctta | ccctattgtt | tga | 633 |
PL 206 037 B1
Claims (9)
- Zastrzeżenia patentowe1. Sekwencja kwasu nukleinowego zawierająca regiony kodujące i niekodujące określone sekwencją nr 4 (Seq. ID. Nr 4), znamienna tym, że regiony kodujące kodują fosfolipazę A1 (PLA1) z Tetrahymena thermophila (Seq. ID. Nr 5), a regiony niekodujące obejmują regiony zlokalizowane w górę i w dół od tego genu.
- 2. Sekwencja kwasu nukleinowego według zastrz. 1, znamienna tym, że niekodujące regiony w górę i w dół od genu są określone sekwencją Nr 2 oraz 3; (Seq. ID nr 2 oraz Seq. ID nr 3), a regiony kodujące są określone sekwencjami Nr 1, 8 i/lub 9 (Seq. ID nr 1, Seq. ID nr 8 i/lub Seq. ID nr 9).
- 3. N-końcowa sekwencja sygnałowa PLAi (Seq. ID nr 5) jak zdefiniowano w zastrz. 1, znamienna tym, że jest określona sekwencją Nr 6 (Seq. ID nr 6).
- 4. Białko fosfolipazy A1 (PLA1) o sekwencji aminokwasowej odpowiadającej sekwencji Nr 7 (Seq. ID nr 7).
- 5. Zastosowanie kwasu nukleinowego lub jego fragmentów o sekwencji jak zdefiniowano w zastrz. 1 do 3 do homologicznych lub heterogenicznych ekspresji zrekombinowanych białek i peptydów, a także do homologicznej lub heterogenicznej rekombinacji, zwłaszcza rozbicia lub zastąpienia genu.
- 6. Sposób homologicznej lub heterogenicznej ekspresji białek i peptydów, oraz homologicznej lub heterogenicznej rekombinacji, zwłaszcza rozbicia lub zastąpienia genu, znamienny tym, że orzęski Tetrahymena, transformuje się kwasem nukleinowym o sekwencji jak zdefiniowano w zastrz. 1 do 3.
- 7. Sposób według zastrz. 6, znamienny tym, że kwasy nukleinowe lub ich fragmenty łączy się z homologicznymi i heterogenicznymi układami do ekspresji białek, takimi jak enhancery, promotory, operatory, miejsca inicjacji, terminatory, oporność na antybiotyki albo z innymi kwasami nukleinowymi, albo fragmentami DNA, albo sekwencjami różnych rodzajów wiroidów, wirusów, bakterii, archezoa, pierwotniaków, grzybów, roślin, zwierząt, albo ludzi.
- 8. Sposób według zastrz. 6 albo 7, znamienny tym, że kwas nukleinowy wprowadza się do wektora, plazmidu, kosmidu, chromosomu, minichromosomu, transpozonu, IS, rDNA, lub do każdego rodzaju pierścieniowego bądź liniowego DNA aIbo RNA.
- 9. Wektor, plazmid kosmid, chromosom, albo minichromosom transpozon, element IS, rDNA, albo inne rodzaje pierścieniowego bądź liniowego DNA, albo RNA, zawierający przynajmniej jedną z sekwencji kwasów nukleinowych, jak zdefiniowano w zastrz. 1 do 3.
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DE10105152A DE10105152A1 (de) | 2001-01-22 | 2001-01-22 | Eine DNA-Sequenz des Enzyms Phospholipase A1 aus Ciliaten und die Verwendung dieser |
| PCT/EP2002/000578 WO2002057459A2 (de) | 2001-01-22 | 2002-01-22 | Eine dna-sequenz des enzyms phospholipase a1 aus dem ciliaten tetrahymena und die verwendung dieser |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| PL362475A1 PL362475A1 (pl) | 2004-11-02 |
| PL206037B1 true PL206037B1 (pl) | 2010-06-30 |
Family
ID=7672908
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| PL362475A PL206037B1 (pl) | 2001-01-22 | 2002-01-22 | Sekwencja kwasu nukleinowego zawierająca regiony kodujące i niekodujące, białko fosfolipazy A₁ z Tetrahymena thermophila, zastosowanie kwasu nukleinowego i sposób ekspresji fosfolipazy A₁ oraz nośnik sekwencji kwasu nukleinowego |
Country Status (17)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US7045330B2 (pl) |
| EP (1) | EP1360306B1 (pl) |
| JP (1) | JP4295508B2 (pl) |
| KR (1) | KR100855645B1 (pl) |
| AT (1) | ATE346155T1 (pl) |
| AU (1) | AU2002250842B2 (pl) |
| CA (1) | CA2435323C (pl) |
| CY (1) | CY1106337T1 (pl) |
| CZ (1) | CZ20031991A3 (pl) |
| DE (2) | DE10105152A1 (pl) |
| DK (1) | DK1360306T3 (pl) |
| ES (1) | ES2277615T3 (pl) |
| HU (1) | HUP0302801A3 (pl) |
| PL (1) | PL206037B1 (pl) |
| PT (1) | PT1360306E (pl) |
| RO (1) | RO122298B1 (pl) |
| WO (1) | WO2002057459A2 (pl) |
Families Citing this family (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR100774367B1 (ko) * | 2005-08-31 | 2007-11-08 | 인하대학교 산학협력단 | 섬모충류 특이적 프라이머 및 이를 이용한 섬모충류 검출방법 |
| KR101038914B1 (ko) * | 2008-10-22 | 2011-06-10 | 김세준 | 앨범대지 접착용 테이프 |
| TR201813880A2 (tr) | 2018-09-25 | 2020-04-21 | Anadolu Üniversitesi̇ | TETRAHYMENA THERMOPHILA YAPAY KROMOZOMU (TtAC1) VE REKOMBINANT PROTEIN ÜRETIMI IÇIN KULLANIMI |
Family Cites Families (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH10155493A (ja) | 1996-10-04 | 1998-06-16 | Sankyo Co Ltd | アスペルギルス属由来のホスホリパーゼａ１をコードする遺伝子 |
-
2001
- 2001-01-22 DE DE10105152A patent/DE10105152A1/de not_active Ceased
-
2002
- 2002-01-22 WO PCT/EP2002/000578 patent/WO2002057459A2/de not_active Ceased
- 2002-01-22 DK DK02719712T patent/DK1360306T3/da active
- 2002-01-22 RO ROA200300631A patent/RO122298B1/ro unknown
- 2002-01-22 AT AT02719712T patent/ATE346155T1/de active
- 2002-01-22 PT PT02719712T patent/PT1360306E/pt unknown
- 2002-01-22 JP JP2002558511A patent/JP4295508B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 2002-01-22 ES ES02719712T patent/ES2277615T3/es not_active Expired - Lifetime
- 2002-01-22 DE DE50208775T patent/DE50208775D1/de not_active Expired - Lifetime
- 2002-01-22 AU AU2002250842A patent/AU2002250842B2/en not_active Ceased
- 2002-01-22 HU HU0302801A patent/HUP0302801A3/hu unknown
- 2002-01-22 EP EP02719712A patent/EP1360306B1/de not_active Expired - Lifetime
- 2002-01-22 CZ CZ20031991A patent/CZ20031991A3/cs unknown
- 2002-01-22 PL PL362475A patent/PL206037B1/pl not_active IP Right Cessation
- 2002-01-22 CA CA002435323A patent/CA2435323C/en not_active Expired - Fee Related
- 2002-01-22 US US10/466,110 patent/US7045330B2/en not_active Expired - Fee Related
- 2002-01-22 KR KR1020037009667A patent/KR100855645B1/ko not_active Expired - Fee Related
-
2007
- 2007-02-22 CY CY20071100254T patent/CY1106337T1/el unknown
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| RO122298B1 (ro) | 2009-03-30 |
| AU2002250842B2 (en) | 2007-11-22 |
| PT1360306E (pt) | 2007-02-28 |
| WO2002057459A3 (de) | 2002-12-12 |
| US20040115673A1 (en) | 2004-06-17 |
| EP1360306A2 (de) | 2003-11-12 |
| DE50208775D1 (de) | 2007-01-04 |
| CZ20031991A3 (cs) | 2004-03-17 |
| HUP0302801A2 (hu) | 2003-11-28 |
| US7045330B2 (en) | 2006-05-16 |
| CA2435323C (en) | 2008-09-02 |
| JP4295508B2 (ja) | 2009-07-15 |
| HUP0302801A3 (en) | 2011-01-28 |
| CA2435323A1 (en) | 2002-07-25 |
| JP2004525622A (ja) | 2004-08-26 |
| EP1360306B1 (de) | 2006-11-22 |
| DK1360306T3 (da) | 2007-03-19 |
| ES2277615T3 (es) | 2007-07-16 |
| CY1106337T1 (el) | 2011-10-12 |
| KR100855645B1 (ko) | 2008-09-03 |
| ATE346155T1 (de) | 2006-12-15 |
| DE10105152A1 (de) | 2002-07-25 |
| PL362475A1 (pl) | 2004-11-02 |
| KR20030087627A (ko) | 2003-11-14 |
| WO2002057459A2 (de) | 2002-07-25 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| EP1926749B1 (en) | Cleavage of precursors of insulins by a variant of trypsin | |
| US7666629B2 (en) | Method for producing recombinant trypsin | |
| Tang et al. | Recombinant expression and characterization of the Candida rugosa lip4 lipase in Pichia pastoris: comparison of glycosylation, activity, and stability | |
| Moussa et al. | Expression of recombinant staphylokinase in the methylotrophic yeast Hansenula polymorpha | |
| Song et al. | Expression and purification of two lipases from Yarrowia lipolytica AS 2.1216 | |
| PL206037B1 (pl) | Sekwencja kwasu nukleinowego zawierająca regiony kodujące i niekodujące, białko fosfolipazy A₁ z Tetrahymena thermophila, zastosowanie kwasu nukleinowego i sposób ekspresji fosfolipazy A₁ oraz nośnik sekwencji kwasu nukleinowego | |
| RU2560577C2 (ru) | Композиции и способы получения энтерокиназы в дрожжах | |
| US20060127973A1 (en) | Dna sequences of major secreted proteins from the ciliate tetrahymena and use thereof | |
| AU3285600A (en) | Beta-hexosaminidase, dna sequence from ciliates for coding the same and use thereof | |
| CN118434285A (zh) | 半乳糖脂在食品中的改善的酶促修饰 | |
| Yoshigi et al. | Structure of barley β-amylase and expression in Escherichia coli of cDNA | |
| Simons et al. | The (phospho) lipase from Staphylococcus hyicus: Expression in Escherichia coli, large-scale purification and application in esterification reactions | |
| HK1124341B (en) | Cleavage of precursors of insulins by a variant of trypsin | |
| JP2004180681A (ja) | ウサギ肝臓由来のエステラーゼを発現する微生物およびそれを用いたウサギ肝臓由来のエステラーゼの製造方法 | |
| KR20140144356A (ko) | 밍크고래의 유전체로부터 분리된 신규의 당화 효소 및 이의 제조방법 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| LAPS | Decisions on the lapse of the protection rights |
Effective date: 20120122 |