ES2288967T3 - Reforzamiento de las respuestas inmunes mediadas por la proteina de fusion anticuerpo-citoquina por medio del tratamiento combinado por agentes que mejoran la incorporacion de inmunocitoquina. - Google Patents

Reforzamiento de las respuestas inmunes mediadas por la proteina de fusion anticuerpo-citoquina por medio del tratamiento combinado por agentes que mejoran la incorporacion de inmunocitoquina. Download PDF

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Abstract

Un kit de partes adecuado para mediar la destrucción inmunológica de un tumor en un mamífero que comprende (i) un primer empaque que contiene una composición que comprende una proteína de fusión anticuerpo-citoquina, y (ii) un segundo empaque que contiene una composición que comprende un agente que incrementa la penetración de dicha proteína de fusión con el anticuerpo dentro del tumor; dicho agente se selecciona del grupo que consiste de un agente quimioterapéutico y un agente que daña el ADN, en donde la composición de dicho segundo empaque es para la administración a dicho mamífero antes que la composición de dicho primer empaque.

Description

Reforzamiento de las respuestas inmunes mediadas por la proteína de fusión anticuerpo-citoquina por medio del tratamiento combinado con agentes que mejoran la incorporación de inmunocitoquina.
Campo de la invención
La presente invención se relaciona con proteínas de fusión anticuerpo-citoquina útiles para inmunoterapia dirigida. En general, la invención se relaciona con el uso de agentes que mejoran la incorporación de inmunocitoquina en una terapia de combinación para reforzar una respuesta inmune mediada por una proteína de fusión anticuerpo-citoquina contra un objetivo preseleccionado, por ejemplo, células en un tumor. En particular, la invención se relaciona con la administración de proteínas de fusión anticuerpo-citoquina en combinación con agentes quimioterapéuticos tales como taxanos y/o agentes de alquilación para tratar células tumorales y otras células cancerosas o enfermas.
Antecedentes de la invención
El tratamiento efectivo de enfermedades tales como el cáncer requiere de respuestas inmunes robustas por parte de uno o más tipos de células efectoras tales como las células asesinas naturales (NK), macrófagos y linfocitos T. En animales y en pacientes que padecen de tumores, el sistema inmune no trata efectivamente con el crecimiento del tumor, debido en gran parte, a mecanismos específicos que el tumor ha elaborado para suprimir la respuesta inmune. En muchos casos, las células monocíticas potencialmente destructoras de tumores, por ejemplo, macrófagos, migran dentro de las capas del tumor en crecimiento, pero la secreción de factores tales como las prostaglandinas, TGF-\beta e IL-10 por parte de las células del tumor modula su actividad citotóxica (ver, por ejemplo, Sharma y colaboradores, 1999, J. IMMUNOL. 163:5020-5028). Igualmente, las células linfocíticas que migran dentro de los tumores, tales como las células NK y T, pueden ser suprimidas por factores secretados por los tumores así como por interacciones con receptores expresados sobre la superficie de las células del tumor que activan la apoptosis de las células inmunes (ver, por ejemplo, Villunger, y colaboradores, 1997, BLOOD 90:12-20). La exposición de estos linfocitos a células monocíticas inmunosupresoras dentro de las capas del tumor puede reducir además su habilidad para armar una respuesta antitumoral efectiva.
Los esfuerzos hechos para vencer los efectos inmunosupresores del microambiente local del tumor incluyen una inmunoestimulación dirigida, tal como el tratamiento con proteínas de fusión anticuerpo-citoquina específicas para el tumor. El tratamiento efectivo con esta aproximación ha sido demostrado en varios modelos de metástasis tumoral de ratón, sin embargo, el tratamiento es cada vez menos efectivo en la medida en que se incrementa el tamaño de los tumores. Esto es probablemente debido al mayor nivel de factores supresores secretados por la masa del tumor así como por otros factores, tales como el incremento en la presión intersticial de fluido en el tumor (Griffon-Etienne y colaboradores, 1999, CANCER RES. 59:3776-3782), una barrera para la penetración de tumores sólidos por parte de los agentes terapéuticos.
Mientras que la mayoría de los pacientes con cáncer son tratados aún con uno o más procedimientos de quimioterapia, se sabe que la terapia citotóxica del cáncer es dañina para el sistema inmunológico. Las células inmunes están entre las células que más rápidamente se dividen en el cuerpo humano, y cualquier tratamiento que mate a las células en división también matará a las células inmunes. Por lo tanto, los tratamientos que incluyen radiación, productos químicos que dañen el ADN, inhibidores de la síntesis del ADN, e inhibidores de la función de los microtúbulos, todos causan daño al sistema inmunológico. Los trasplantes de médula ósea son necesarios como coadyuvantes en la terapia del cáncer precisamente porque el sistema inmunológico se daña y necesita ser surtido de nuevo. El metotrexato y otras drogas contra el cáncer son utilizadas a menudo como inmunosupresores. También existe evidencia de que los tratamientos pueden inhibir específicamente la función de las células T. Por ejemplo, los pacientes que han sido tratados por la enfermedad de Hodgkin con irradiación del cuerpo entero sufren de una perdida aparentemente permanente de células T nativas (Watanabe y colaboradores, 1997, Blood 90:3662).
WO99/52562 describe que la respuesta inmune citocidal iniciada por las citoquinas de fusión con el anticuerpo puede ser mejorada, si se administra la proteína de fusión simultáneamente con un inhibidor de angiogénesis. Sin embargo, no se sabe que los inhibidores de angiogénesis tengan para mostrar una eficacia citotóxica como agentes quimioterapéuticos. Baselga y colaboradores (Cancer Research 1998, 58(13)) enseña que un tratamiento combinado de algunos agentes quimioterapéuticos específicos, tales como paclitaxel o doxorubicina, y un anticuerpo específico anti-Her2 (HER2; Herceptin®), que son conocidos por mostrar una citotoxicidad notable aún cuando se los utilice en una monoterapia, mejoran la actividad citotoxicidad antitumoral de estos agentes quimioterapéuticos. Sin embargo, tal incremento en la toxicidad con base en los agentes quimioterapéuticos como tales no es un objetivo específico y causa muchos efectos secundarios indeseados.
Con base en el conocimiento actual parecería improbable que tratamientos estándar (quimioterapia y radiación) y de estimulación inmunológica local fueran una aproximación de una combinación útil para el tratamiento efectivo del cáncer. Por lo tanto, se necesitan en el estado del arte métodos que refuercen las respuestas inmunes mediadas por la proteína de fusión anticuerpo-citoquina contra tipos de células preseleccionadas, por ejemplo, células tumorales, y las composiciones empleadas en tales métodos.
Resumen de la invención
Se ha descubierto que cuando se administra una proteína de fusión anticuerpo-citoquina (inmunocitoquina) a un mamífero que padezca de un tumor o metástasis de un tumor, es posible crear una respuesta antitumoral más potente si se administra preferiblemente después de un tratamiento del mamífero con un agente que mejora la incorporación de la inmunocitoquina que incrementa o refuerza el efecto terapéutico de la proteína de fusión anticuerpo-citoquina, reforzando o incrementando su incorporación por parte del tumor. Se ha encontrado que los agentes útiles que refuerzan la incorporación de la inmunocitoquina contienen agentes quimioterapéuticos de alquilación y taxanos tales como paclitaxel. En particular, se ha encontrado que tales combinaciones son útiles en mediar la destrucción inmunológica del tipo de célula preseleccionada, tal como las células tumorales o las células infectadas por virus.
En un aspecto, se describe un método de inducir una respuesta inmune citocidal contra un tipo preseleccionado de célula en un mamífero. El método comprende administrar a un mamífero (i) una inmunocitoquina que contiene un sitio de enlazamiento del anticuerpo capaz de enlazar al tipo preseleccionado de célula y una citoquina capaz de inducir tal respuesta inmune contra el tipo de célula preseleccionado, y (ii) un agente que refuerzan la incorporación de una inmunocitoquina en una cantidad suficiente para mejorar la respuesta inmune con relación a la respuesta inmune estimulada por la inmunocitoquina sola.
En una modalidad preferida, el tipo de célula preseleccionado puede ser una célula cancerosa, por ejemplo, en un tumor sólido, más preferiblemente en un tumor sólido grande (esto es, aproximadamente mayor a 100 mm^{3}). Alternativamente, el tipo de célula preseleccionado puede ser una célula cancerosa presente en la forma de una metástasis pequeña.
El agente que refuerza la incorporación de inmunocitoquina se administra preferiblemente antes de la administración de la inmunocitoquina. Además, se contempla que la inmunocitoquina pueda ser administrada junto con una pluralidad de agentes diferentes que refuerzan la incorporación de inmunocitoquina. Alternativamente, se contempla que un agente que refuerza la incorporación de inmunocitoquina se pueda administrar junto con una pluralidad de inmunocitoquinas diferentes.
En otro aspecto, la invención provee una composición en forma de un kit de partes para inducir una respuesta inmune citocidal contra un tipo de célula preseleccionado en un mamífero. El kit de partes comprende: (i) un primer paquete que contiene una composición que comprende una inmunocitoquina que contiene un sitio de enlazamiento del anticuerpo capaz de enlazar al tipo de célula preseleccionado, y una citoquina capaz de inducir tal respuesta inmune contra el tipo de célula preseleccionado en el mamífero, y (ii) un segundo paquete que contiene una composición que comprende a un agente que refuerza la incorporación de inmunocitoquina en una cantidad suficiente para mejorar la respuesta citocidal, inducida por la inmunocitoquina de la combinación con relación a la respuesta citocidal estimulada por la inmunocitoquina sola.
En una modalidad preferida, el sitio de enlazamiento del anticuerpo de la inmunocitoquina preferiblemente contiene una cadena pesada de inmunoglobulina o un fragmento de la misma de enlazamiento del antígeno. La cadena pesada de la inmunoglobulina preferiblemente contiene, en dirección amino-terminal a carboxi-terminal, un dominio de una región variable de la inmunoglobulina (V_{H}) capaz de enlazar un antígeno preseleccionado, un dominio pesado constante 1 (CH1) de la inmunoglobulina, un dominio pesado constante 2 (CH2) de la inmunoglobulina, y opcionalmente puede incluir además un dominio pesado constante 3 (CH3) de la inmunoglobulina. En una modalidad más preferida, la inmunocitoquina es una proteína de fusión que contiene una cadena pesada de inmunoglobulina o un fragmento de la misma de enlazamiento del antígeno fusionada a través de un enlace polipeptídico a la citoquina. Por lo tanto, una proteína de fusión preferida anticuerpo-citoquina comprende, en una dirección amino-terminal a carboxi-terminal, (i) el sitio de enlazamiento del anticuerpo que contiene una región variable de inmunoglobulina capaz de enlazar un antígeno de la superficie de célula sobre el tipo de célula preseleccionado, un dominio CH1 de la inmunoglobulina, un dominio CH2 de la inmunoglobulina (opcionalmente un dominio CH3), y (ii) la citoquina. Los métodos para elaborar y utilizar tales proteínas de fusión son descritos con detalle en Gillies y colaboradores (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 1428-1432; Gillies y colaboradores (1998) J. Immunol. 160: 6195-6203; y en la patente estadounidense No. 5.650.150.
Los dominios de la región constante de la inmunoglobulina (esto es, los dominios CH1, CH2 y/o CH3) pueden ser los dominios de la región constante normalmente asociados con el dominio de la región variable en un anticuerpo de ocurrencia natural. Alternativamente, uno o más de los dominios de la región constante de la inmunoglobulina se pueden derivar de anticuerpo diferentes al anticuerpo utilizado como fuente del dominio de la región variable. En otras palabras, los dominios de la región constante y de la región variable de la inmunoglobulina se pueden derivar de anticuerpo diferentes, por ejemplo, anticuerpos derivados de especies diferentes. Ver, por ejemplo, la patente estadounidense No. 4.816.567. Además, las regiones variables de la inmunoglobulina pueden contener secuencias de la región del marco (FR) derivadas de una especie, por ejemplo, un humano, y las secuencias de la región determinante de complementariedad (CDR) interpuestas entre las FR, derivadas de una segunda especie diferente, por ejemplo, un ratón. Los métodos para elaborar y utilizar tales regiones quiméricas variables de la inmunoglobulina son divulgados, por ejemplo, en las patentes estadounidenses Nos. 5.225.539 y 5.585.089.
Las inmunocitoquinas basadas en el anticuerpo preferiblemente comprenden además una cadena liviana de la inmunoglobulina que preferiblemente está enlazada en forma covalente a la cadena pesada de la inmunoglobulina por medio de, por ejemplo, un enlace disulfuro. Las regiones variables de las cadenas liviana y pesada enlazadas de la inmunoglobulina definen ambas un sitio de enlazamiento único y completo para enlazar al antígeno preseleccionado. En otras modalidades, las inmunocitoquinas contienen dos cadenas quiméricas, cada una conteniendo al menos una porción de una cadena pesada de inmunoglobulina fusionada a una citoquina. Las dos cadenas quiméricas preferiblemente están enlazadas juntas en forma covalente, por ejemplo, por uno o más enlaces disulfuro entre cadenas.
La invención provee además proteínas de fusión en las cuales la especificidad del enlazamiento del antígeno y la actividad de un anticuerpo se combina con la potente actividad biológica de una citoquina. Una proteína de fusión de la presente invención puede ser utilizada para suministrar selectivamente la citoquina a una célula objetivo in vivo para que la citoquina pueda ejercer un efecto biológico localizado en la vecindad de la célula objetivo. En una modalidad preferida, el componente del anticuerpo de la proteína de fusión específicamente enlaza un anticuerpo, sobre o dentro, de una célula cancerosa y, como resultado, la proteína de fusión ejerce una actividad anticancerosa localizada. En una modalidad alternativa preferida, el componente del anticuerpo de la proteína de fusión específicamente enlaza a una célula infectada con el virus, tal como una célula infectada con el VIH, y, como resultado, la proteína de fusión ejerce una actividad antiviral localizada.
Las citoquinas que se pueden incorporar en las inmunocitoquinas de la invención incluyen, por ejemplo, factores de necrosis tumoral, interleuquinas, factores de estimulación de colonias, y linfoquinas, así como otros conocidos en el arte. Los factores de necrosis tumoral preferidos incluyen, por ejemplo, al factor \alpha de necrosis del tejido (TNF\alpha). Las interleuquinas preferidas incluyen, por ejemplo, interleuquina-2 (IL-2), interleuquina-4 (IL-4), interleuquina-5 (IL-5), interleuquina-7 (IL-7), interleuquina-12 (IL-12), interleuquina-15 (IL-15) y interleuquina-18 (IL-18). Los factores preferidos de estimulación de colonias incluyen, por ejemplo, al factor de estimulación de colonias del macrófago de granulocitos (GM-CSF) y el factor de estimulación de colonias de macrófagos (M-CSF). Las linfoquinas preferidas incluyen, por ejemplo, linfotoxina (LT). Otras citoquinas útiles incluyen interferones, incluyen INF-\alpha, INF-\beta, INF-\gamma, todos los cuales tienen efectos inmunológicos, así como efectos antiangiogénicos, que son independientes de sus actividades antivirales.
Se ha encontrado que varios tipos de agentes quimioterapéuticos son agentes efectivos para mejorar la incorporación de inmunocitoquina. En particular, los agentes que mejoran la incorporación de inmunocitoquina incluyen taxanos y agentes quimioterapéuticos de alquilación. Se conocen varios taxanos en el arte (ver Bissery y Lavelle, 1997, en Cancer Therapeutics: Experimental and Clinical Agents, Chapter 8, B. Teicher, ed.). En una modalidad preferida, el taxano es Taxol, también conocido como paclitaxel. Otras modalidades incluyen al taxano semisintético, docetaxel, que en algunos modelos tumorales e indicaciones clínicas es más eficiente que el paclitaxel. Otras modalidades incluyen derivados adicionales de taxano, tales como aquellas derivadas del material de partida natural, 10-deacetil Baccatin III, extraído de las agujas del árbol de Tejo Europeo. Un ejemplo del mismo es el compuesto oralmente disponible, IDN5109, que es también un sustrato pobre para P-glicoproteína y generalmente más activo contra tumores resistentes a multidrogas. Además de ser oralmente biodisponible, también tiene una dosis tolerable más alta y exhibe menos efectos secundarios neurotóxicos (Polizzi y colaboradores, 1999, Cancer Res. 59:1036-1040).
También se proveen dosis preferidas y regímenes de administración para administrar las inmunocitoquinas en combinación con los agentes que refuerzan la incorporación de la inmunocitoquina.
Descripción de los dibujos
La Figura 1 es una representación esquemática de una citoquina.
La figura 2 muestra el efecto del paclitaxel y de una inmunocitoquina sobre el volumen del tumor LLC/KSA con el transcurso del tiempo.
La Figura 3 muestra el efecto de dosis múltiples de paclitaxel y de una inmunocitoquina sobre el volumen medio del tumor con el transcurso del tiempo.
La figura cuatro muestra el efecto del paclitaxel y de una inmunocitoquina sobre el peso del tumor en un ensayo metástasis en el pulmón.
La Figura 5 muestra el efecto del paclitaxel y de una inmunocitoquina sobre el volumen del tumor CR26/KSA con el transcurso del tiempo.
La Figura seis muestra el efecto del paclitaxel y de una inmunocitoquina sobre el peso del tumor en un ensayo de metástasis en el hígado.
Las Figuras 7A y 7B muestran el efecto del paclitaxel sobre la incorporación de inmunocitoquina por un tumor.
La Figura 8 muestra el efecto de la ciclofosfamida sobre la incorporación de inmunocitoquina por un tumor.
La Figura 9 muestra el efecto de la ciclofosfamida y de una inmunocitoquina sobre el peso del tumor en un ensayo de metástasis en el pulmón.
La Figura 9B muestra el efecto de la ciclofosfamida y de una inmunocitoquina sobre el volumen del tumor en un ensayo de crecimiento del mismo.
La Figura 9C muestra el efecto de la ciclofosfamida y de una inmunocitoquina sobre el volumen del tumor en un ensayo de crecimiento del mismo.
La Figura 10 muestra el efecto de la carboplatina y de una inmunocitoquina sobre el volumen del tumor en un ensayo de crecimiento del mismo.
Descripción detallada de la invención
Los estudios han mostrado que los tumores sólidos grandes son mucho más refractarios a la intervención terapéutica mediada por un anticuerpo, y a las inmunoterapias en general que los foci metastáticos diseminados (Sulitzeanu y colaboradores (1993) Adv. Cancer Res. 60: 247-267). Se cree que la baja sensibilidad a las terapias con base en un anticuerpo, se relacionan, en parte, con la producción de factores inmunosupresores por parte de los tumores.
Aunque el mecanismo para la erradicación del tumor no está completamente entendido, se contempla que las respuestas al linfocito citotóxico T (CTL) pueden conducir a la destrucción de las células cancerosas y proveen memoria inmune. Además, se contempla que bajo ciertas circunstancias las células asesinas naturales (NK) son responsables por la realización del tumor en ausencia de los CTL. Las diferentes respuestas inmunes pueden resultar del hecho de que ciertos tumores producen diferentes tipos o cantidades de sustancias capaces de reducir la expresión de las células T. Esto es especialmente cierto para tumores sólidos, en vez de para los foci micrometastáticos, que han alcanzado una masa crítica y son capaces de producir y de secretar factores inmunosupresores en niveles suficientes para modular una respuesta inmune contra los tumores.
Se ha descubierto ahora que las respuestas citocidales inmunes iniciadas por una inmunocitoquina contra un tipo de célula preseleccionado se puede mejorar significativamente por medio de la administración de la inmunocitoquina junto con un agente para reforzar la incorporación de la inmunocitoquina, en donde este agente es administrado preferiblemente antes de la inmunocitoquina. La terapia combinada es particularmente efectiva en la mediación de la destrucción inmune de un tejido enfermo, tal como, un tumor establecido. Sin desear quedar limitado por la teoría, se contempla que el agente que refuerza la incorporación de la inmunocitoquina incrementa la penetración de la inmunocitoquina dentro del microambiente del tumor haciendo posible así vencer el efecto inmunosupresor y la hace más efectiva para activar las respuestas celulares inmunes contra el tumor. En forma similar, se contempla que tal método puede ser útil para el tratamiento de ciertas enfermedades virales donde un mecanismo inmunosupresor similar evita la inmunidad celular efectiva, por ejemplo, en la infección por el VIH. Se contempla que el agente que refuerza la incorporación de la inmunocitoquina actúa sinergísticamente con la inmunocitoquina para mediar la destrucción inmune de un tejido enfermo tal como un tumor establecido o células infectadas por virus. La presente divulgación también describe métodos para elaborar y utilizar inmunocitoquina útiles, así como ensayos útiles para analizar su actividad farmacocinética en modelos animales preclínicos in vivo cuando se los combina con agentes adecuados para reforzar la incorporación de la inmunocitoquina.
Como se lo utiliza aquí, el término "agente que refuerza la incorporación de la inmunocitoquina" se entiende que significa cualquier agente que refuerce una respuesta citocidal inmune inducida por una inmunocitoquina contra tipo preseleccionado de célula. Más específicamente, un agente preferido que refuerce la incorporación de la inmunocitoquina es un agente que refuerza la incorporación en el tumor, que incrementa la penetración de una inmunocitoquina dentro de un tumor. Los ejemplos de agentes que refuerzan la incorporación de la inmunocitoquina incluyen, pero no se limitan a, agentes quimioterapéuticos tales como taxanos, agentes que dañan al ADN incluidos los agentes quimioterapéuticos de alquilación, agentes de terapia por radiación, y agentes que modulan la presión sanguínea. Los taxanos preferidos son taxol, docetaxel, 10-deacetil Baccatin III, y derivados de los mismos. Los agentes de alquilación preferidos son ciclofosfamida, carboplatina, cisplatina, y derivados de los mismos. Una forma preferida de radiación es la irradiación gama. Un agente preferido para la modulación de la presión sanguínea es un agonista de angiotensina II, tal como la angiotensina II en sí misma, preferiblemente administrada periódicamente de acuerdo a los principios generales descritos por Netti y colaboradores (Cancer Research [1995] 55:5451-8) y Netti y colaboradores (Proc. Nat. Acad. Sci. [1999] 96:3137-3142). La respuesta inmune se puede determinar por medio de métodos conocidos por aquellos ordinariamente capacitados en el arte y/o como se describió aquí.
Como se lo utiliza aquí, el término "respuesta citocidal inmune" se entiende que significa cualquier respuesta inmune en un mamífero, ya sea de naturaleza humoral o celular, que es estimulada por una inmunocitoquina y que o bien mata o reduce la viabilidad de un tipo preseleccionado de célula en un mamífero. La respuesta inmune puede incluir uno o más tipos de células, incluidas células T, células NK y macrófagos.
Como se lo utiliza aquí, el término "inmunocitoquina" se entiende que significa una fusión de (i) un sitio de enlazamiento de anticuerpo que tiene especificidad de enlazamiento por, y capaz de enlazarse a un antígeno preseleccionado, por ejemplo, un antígeno específico para un tipo de célula, y (ii) una citoquina que es capaz de inducir o estimular una respuesta citocidal inmune típicamente contra una célula cancerosa o infectada por un virus. Los ejemplos de antígenos preseleccionados incluyen antígenos de la superficie de la célula tal como sobre células cancerosas o células infectadas por un virus, y antígenos intracelulares insolubles, por ejemplo, de células necróticas, que pueden permanecer unidas a la membrana de la célula. Los antígenos preferidos son antígenos objetivo que son característicos de células tumorales, tal como los antígenos específicos tumorales. Por lo tanto, la inmunocitoquina es capaz de suministrar selectivamente la citoquina a un objetivo (que típicamente es una célula) in vivo para que la citoquina pueda mediar una respuesta inmune localizada contra una célula objetivo. Por ejemplo, si el componente del anticuerpo de la inmunocitoquina enlaza selectivamente un antígeno o célula cancerosa, tal célula cancerosa en un tumor sólido, y en particular un tumor sólido más grande aproximadamente a 100 mm^{3}, la inmunocitoquina ejerce una actividad anticancerosa localizada. Alternativamente, si el componente del anticuerpo de la inmunocitoquina enlaza selectivamente un antígeno o una célula infectada con un virus, tal como una célula infectada con el VIH, la inmunocitoquina ejerce una actividad antiviral localizada.
Como se lo utiliza aquí, el término "sitio de enlazamiento del anticuerpo" se entiende que significa al menos una porción de una cadena pesada de inmunoglobulina, por ejemplo, una región variable de inmunoglobulina capaz de enlazar un antígeno preseleccionado tal como un tipo de célula. El sitio de enlazamiento del anticuerpo también comprende preferiblemente al menos una porción de una región constante de inmunoglobulina que incluye, por ejemplo, un dominio CH1, un dominio CH2, y opcionalmente, un dominio CH3, o al menos un dominio CH2, o una o más porciones de los mismos. Además, la cadena pesada de la inmunoglobulina se puede asociar, ya sea en forma covalente o no covalente, a una cadena liviana de la inmunoglobulina que comprende, por ejemplo, una región variable de una cadena liviana de la inmunoglobulina y opcionalmente una región constante de cadena liviana. Por lo tanto, se contempla que el sitio de enlazamiento del anticuerpo puede comprender un anticuerpo intacto o un fragmento del mismo, o un anticuerpo de una cadena única, capaz de enlazar al antígeno preseleccionado.
Con relación a la inmunocitoquina, se contempla que el fragmento del anticuerpo se puede enlazar a la citoquina por medio de una variedad de formas bien conocidas por aquellos ordinariamente capacitados en el arte. Por ejemplo, el sitio de enlazamiento del anticuerpo se enlaza preferiblemente a través de un enlace polipeptídico o de un polipéptido enlazador a la citoquina en una construcción de una proteína de fusión. Alternativamente, el sitio de enlazamiento del anticuerpo se puede acoplar químicamente a la citoquina a través de grupos reactivos, por ejemplo, grupos sulfhidrilo, dentro de cadenas laterales de aminoácidos presentes dentro del sitio de enlazamiento del anticuerpo y de la citoquina.
Como se lo utiliza aquí, el término "citoquina" se entiende que significa cualquier proteína o péptido, análogo o fragmento funcional de los mismos, que es capaz de estimular o de inducir una respuesta citocidal inmune contra tipo de célula preseleccionado, por ejemplo, una célula cancerosa o una célula dictada con un virus, en un mamífero. Por lo tanto, se contempla que se pueden incorporar una variedad de citoquinas dentro de las inmunocitoquinas de la invención. Las citoquinas útiles incluyen, por ejemplo, factores de necrosis tumoral (TNF), interleuquinas (IL), linfoquinas (L), factores de estimulación de colonias (CSF), interferones (IFN) incluidas variantes de las especies, análogos truncados de las mismas que son capaces de estimular o de inducir tales respuestas citocidales inmunes. Los factores de necrosis tumoral útiles incluyen, por ejemplo, TNF\alpha. Las linfoquinas útiles incluyen, por ejemplo, LT. Los factores útiles de estimulación de colonias incluyen, por ejemplo, GM-CSF y M-CSF. Las interleuquinas útiles incluyen, por ejemplo,
IL-2, IL-4, IL-5, IL-7, IL-12, IL-15 e IL-18. Los interferones útiles incluyen, por ejemplo, IFN-\alpha, IFN-\beta, IFN-\gamma.
El gen que codifica una citoquina particular de interés se puede clonar de nuevo, obtenido a partir de una fuente disponible, o sintetizado por medio de síntesis estándar de ADN a partir de una secuencia conocida de nucleótidos. Por ejemplo, se conoce la secuencia de ADN de LT (ver, por ejemplo, Nedwin y colaboradores (1985) NUCLEIC ACIDS RES. 13: 6361), así como las secuencias para IL-2 (ver, por ejemplo, Taniguchi y colaboradores (1983) NATURE 302: 305-318), GM-CSF (ver, por ejemplo, Gasson y colaboradores (1984) SCIENCE 266: 1339-1342), y TNF \alpha (ver, por ejemplo, Nedwin y colaboradores (1985) NUCLEIC ACIDS RES. 13: 6361).
En una modalidad preferida, las inmunocitoquinas son proteínas de fusión recombinantes producidas por medio de metodologías convencionales de ADN recombinante, esto es, por medio de la formación de una construcción de ácido nucleico que codifica la inmunocitoquina quimérica. La construcción de proteínas de fusión recombinantes anticuerpo-citoquina ha sido descrita en el arte previo. Ver, por ejemplo, Gillies y colaboradores (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 1428-1432; Gillies y colaboradores (1998) J. Immunol. 160: 6195-6203; y la patente estadounidense No. 5.650.150. Preferiblemente, una construcción génica que codifica a la inmunocitoquina de la invención incluye, en orientación 5' a 3', un segmento de ADN que codifica a un dominio de una región variable de la cadena pesada de inmunoglobulina, un segmento de ADN que codifica a una región constante de la cadena pesada de inmunoglobulina, y un ADN que codifica a la citoquina. El gen fusionado se ensambla o se inserta dentro de un vector de expresión para transfección dentro de una célula receptora apropiada donde se expresa el gen fusionado. La cadena híbrida de polipéptido se combina preferiblemente con una cadena liviana de inmunoglobulina de tal manera que la región variable de la inmunoglobulina de la cadena pesada (V_{H}) y la región variable de la inmunoglobulina de la cadena liviana (V_{L}) se combinen para producir un sitio único y completo para enlazar un antígeno preseleccionado. En una modalidad preferida, las cadenas liviana y pesada de la inmunoglobulina se acoplan en forma covalente, por ejemplo, por medio de un enlace disulfuro dentro de la cadena. Además, dos cadenas pesadas de inmunoglobulina, ya sea que una o las dos se fusionen a una citoquina, se puede acoplar en forma covalente, por ejemplo, por medio de uno o más enlaces disulfuro dentro de la cadena.
Por lo tanto, los métodos descritos aquí son útiles para reforzar la actividad antitumoral de una inmunocitoquina utilizada un método terapéutico para tratar un tumor, incluidas las composiciones de inmunocitoquina y los métodos divulgados en WO99/29732, WO99/43713, WO99/52562, WO99/53958, y WO01/10912, y las proteínas de fusión con base en el anticuerpo con una secuencia alterada de aminoácidos en la región de unión. En una modalidad, se describen métodos útiles aquí en combinación con proteínas de fusión Fc tales como Fc-interferón-\alpha.
La Figura 1 muestra una representación esquemática de un ejemplo de una interleuquina 1. En esta modalidad, las moléculas de citoquina 2 y 4 son péptidos enlazados a los terminales carboxilo 6 y 8 de la regiones 10 y 12 de CH3 de las cadenas pesadas de anticuerpo 14 y 16. Las regiones 26 y 28 de V_{L} se muestran emparejadas con las regiones 18 y 20 de V_{H} en una configuración típica de IgG, proveyendo por lo tanto dos sitios de enlazamiento del antígeno 30 y 32 en los extremos del terminal amino de la inmunocitoquina 1 y dos sitios de enlazamiento del receptor de citoquina 40 y 42 en los extremos carboxilo de la inmunocitoquina 1. Por su puesto, en sus aspectos más amplios, las inmunocitoquinas no necesitan ser emparejadas como se ilustró o únicamente una de las dos cadenas pesadas de la inmunoglobulina necesita ser fusionada a una molécula de citoquina.
Las inmunocitoquinas descritas aquí se pueden considerar quiméricas en virtud de dos aspectos de su estructura. Primero, la inmunocitoquina es quimérica en que incluye una cadena pesada de inmunoglobulina que tiene especificidad de enlazamiento por el antígeno enlazado a una citoquina dada. Segundo, una inmunocitoquina puede ser quimérica en el sentido de que incluye una región variable de la inmunoglobulina (V) y una región constante de la inmunoglobulina (C), las cuales se derivan ambas de anticuerpo diferentes de tal manera que la proteína resultante es una quimera V/C. Por ejemplo, las regiones variable y constante se pueden derivar de moléculas de anticuerpo de ocurrencia natural que se pueden aislar de diferentes especies. Ver, por ejemplo, la patente estadounidense No. 4.816.567. También se incluyen las construcciones en las cuales cualquiera o ambas regiones variables de la inmunoglobulina contienen secuencias de la región del marco (FR) y secuencias de región determinante de complementariedad (CDR) derivadas de diferentes especies. Tales construcciones son divulgadas, por ejemplo, en Jones y colaboradores (1986) Nature 321: 522-525, Verhoyen y colaboradores (1988) SCIENCE 239: 1534-1535, y en las patentes estadounidenses Nos. 5.225.539 y 5.585.089. Además, se contempla que las secuencias de la región variable se pueden derivar por medio de bibliotecas de selección, por ejemplo, bibliotecas que muestran fagos, para secuencias de región variable que enlaza a un antígeno preseleccionado con una afinidad deseada. Los métodos para elaborar y seleccionar bibliotecas que muestran fagos son divulgados, por ejemplo, en Huse y colaboradores (1989) Science 246: 1275-1281 y Kang y colaboradores (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:11120-11123.
Los dominios de la región constante de la cadena pesada de la inmunoglobulina de las inmunocitoquinas se pueden seleccionar a partir de cualquiera de las cinco clases de inmunoglobulina conocidas como IgA (Ig\alpha), IgD (Ig\delta), IgE (Ig\varepsilon), IgG (Ig\gamma), e IgM (Ig\mu). Sin embargo, se prefieren las regiones constantes de la cadena pesada de la inmunoglobulina de la clase IgG. Además, se contempla que las cadenas pesadas de la inmunoglobulina se pueden derivar de cualquiera de las subclases de anticuerpo de IgG conocidas en el arte como IgG1, IgG2, IgG3 e IgG4. Como se sabe, cada región constante de la cadena pesada de la inmunoglobulina comprende cuatro o cinco dominios. Los dominios son llamados secuencialmente de la siguiente manera: CH1-bisagra-CH2-CH3-(CH4). CH4 está presente en IgM, que no tiene una región de bisagra. Las secuencias de ADN de los dominios de la cadena pesada tienen homología cruzada entre las clases de inmunoglobulina, por ejemplo, el dominio CH2 de IgG es homólogo al dominio CH2 de IgA e IgD, y con el dominio CH3 de IgM y de IgE. Las cadenas livianas de la inmunoglobulina pueden tener tanto una cadena constante kapa (\kappa) como una lambda (\lambda). Las secuencias y alineamientos de secuencia de estas regiones de la inmunoglobulina son bien conocidas en el arte (ver, por ejemplo, Kabat y colaboradores, "Sequences of Proteins of Immunological Interest", U.S. Department of Health and Human Services, tercera edición 1983, cuarta edición 1987, y Huck y colaboradores (1986) Nuc. ACIDS RES. 14: 1779-1789).
En modalidades preferidas, la región variable se deriva de un anticuerpo específico para un antígeno preseleccionado de la superficie de la célula (un antígeno asociado con una célula enferma tal como una célula cancerosa o una célula infectada por un virus), y la región constante incluye los dominios CH1, y CH2 (y opcionalmente CH3) de un anticuerpo que es el mismo o diferente del anticuerpo que es la fuente de la región variable. En la práctica de esta invención, la porción de anticuerpo de la inmunocitoquina es preferiblemente no inmunogénica o es débilmente inmunogénica en el receptor deseado. Por lo tanto, la porción de anticuerpo, se deriva preferiblemente, tanto como sea posible, de la misma especie que el receptor deseado. Por ejemplo, si se va a administrar la inmunocitoquina a humanos, los dominios de la región constante son preferiblemente de origen humano. Ver, por ejemplo, la patente estadounidense No. 4.816.567. Además, cuando la región variable de la inmunoglobulina se deriva de una especie diferente a la del receptor deseado, por ejemplo, cuando las secuencias de la región variable son de origen múrido y el receptor deseado es un humano, entonces la región variable preferiblemente contiene secuencias humanas de FR con secuencias de la CDR interpuestas entre las secuencias de la FR para producir una región quimérica variable que tiene especificidad de enlazamiento por un antígeno preseleccionado pero sin embargo al mismo tiempo minimiza la inmunoreactividad en el huésped deseado. El diseño y la síntesis de tales regiones quiméricas variables son divulgadas en Jones y colaboradores (1986) Nature 321: 522-525, Verhoyen y colaboradores (1988) SCIENCE 239:1534-1535, y en las patentes estadounidenses Nos. 5.225.539 y 5.585.089. La clonación y la expresión de una proteína en fusión anticuerpo-citoquina humanizada, proteína en fusión KS-1/4 anti-EpCAM anticuerpo-IL-12, así como su habilidad para erradicar una metástasis establecida de carcinoma de colon, han sido descritas en Gillies y colaboradores (1998) J. Immunol. 160: 6195-6203.
El gen que codifica la citoquina se une, ya sea directamente o por medio de un enlazador, por ejemplo, por medio de ADN que codifica a un enlazador (Gly_{4}-Ser)_{3} en el marco al extremo 3' del gen que codifica a la región constante de la inmunoglobulina (por ejemplo, un exón CH2 o CH3). En ciertas modalidades, el enlazador puede contener una secuencia de nucleótidos que codifica un sitio de escisión proteolítica. Este sitio, cuando está interpuesto entre la región constante de la inmunoglobulina y la citoquina, puede ser diseñado para proveer una liberación proteolítica de la citoquina en el sitio objetivo. Por ejemplo, se sabe que la plasmina y la tripsina se escinden después de los residuos de lisina y de arginina en sitios que son accesibles a las proteasas. Muchas otras endoproteasas específicas para un sitio y las secuencias de aminoácidos que ellas escinden son conocidas en el arte. Los sitios preferidos de escisión proteolítica y las enzimas proteolíticas que son reactivas con tales sitios de escisión son divulgados en las patentes estadounidenses Nos. 5.541.087 y 5.726.044.
La construcción de ácido nucleico puede incluir opcionalmente al promotor endógeno y al reforzador para que el gen que codifica la región variable regule la expresión de la cadena quimérica de inmunoglobulina. Por ejemplo, los genes que codifican la región variable se pueden obtener como fragmentos de ADN que contienen al péptido líder, al gen VJ (regiones variables (V) reordenadas funcionalmente con un segmento de unión (J)) para la cadena liviana, o al gen VDJ para la cadena pesada, y al promotor endógeno y al reforzador para estos genes. Alternativamente, el gen que codifica la región variable se puede obtener separadamente de los elementos reguladores endógenos y utilizarlo en un vector de expresión que provee estos elementos.
Los genes de la región variable se pueden obtener por medio de procedimientos estándar de clonación de ADN a partir de células que producen al anticuerpo deseado. La selección de la biblioteca genómica para una región variable específica reordena funcionalmente se puede lograr con el uso de sondas apropiadas en ADN tales como los segmentos de ADN que contienen la secuencia de ADN de la región J y secuencias secuencia abajo. La identificación y la confirmación de los clones correctos se logran por medio de la secuenciación de los genes clonados y la comparación de la secuencia con la correspondiente secuencia de longitud completa, de ARNm adecuadamente empalmada.
El antígeno objetivo puede ser un antígeno de la superficie de la célula de una célula tumoral o cancerosa, de una célula infectada con virus a otra célula enferma. El antígeno objetivo puede ser también un antígeno intracelular insoluble de una célula necrótica (ver, por ejemplo, la patente estadounidense No. 5.019.368). Los genes que codifican regiones variables apropiadas se pueden obtener generalmente a partir de líneas celulares linfoideas que producen inmunoglobulina. Por ejemplo, se pueden producir las líneas celulares de hibridoma que producen inmunoglobulina específica para antígenos asociados al tumor o antígenos virales, por medio de técnicas estándar de hibridación somática de la célula bien conocidas en el arte (ver, por ejemplo, la patente estadounidense No. 4.196.265). Estas líneas celulares que producen inmunoglobulina proveen la fuente de genes para la región variable en una forma reordenara funcionalmente. Los genes de la región variable serán típicamente de origen múrido debido a que este sistema múrido se presta por sí mismo a la producción de una amplia variedad de inmunoglobulinas de especificidad deseada. Además, las secuencias de la región variable se pueden derivar por medio de bibliotecas de selección, por ejemplo, bibliotecas que muestran fagos, para las secuencias de la región variable que enlazan un antígeno preseleccionado con una afinidad deseada. Los métodos para elaborar y seleccionar las bibliotecas que muestran fagos son divulgadas, por ejemplo, en Huse y colaboradores (1989) Science 246: 1275-1281 y Kang y colaboradores (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 11120-11123.
El fragmento de ADN que codifica al gen de la región variable funcionalmente activa se enlaza a un fragmento de ADN que contiene al gen que codifica la región constante deseada (o una porción de la misma). Las regiones constantes de inmunoglobulina (cadena pesada y liviana) se pueden obtener a partir de células que producen anticuerpo por medio de técnicas estándar de clonación génica. Los genes para las dos clases de cadenas livianas humanas (\kappa y \lambda) y las cinco clases de cadenas pesadas humanas (\alpha, \delta, \varepsilon, \gamma y \mu) han sido clonados, y por lo tanto, las regiones constantes de origen humano se encuentran fácilmente disponibles a partir de estos clones.
El gen fusionado que codifica a la cadena híbrida pesada de inmunoglobulina se une o se inserta dentro de un vector de expresión para la incorporación dentro de una célula receptora. La introducción de la construcción génica dentro de vectores plásmidos se puede lograr por medio de procedimientos estándar para empalme del gen. La cadena pesada de inmunoglobulina quimérica se puede coexpresar en la misma célula con la cadena liviana correspondiente de inmunoglobulina para que se pueda expresar una inmunoglobulina completa y empalmarla simultáneamente. Para este propósito, se pueden ubicar las construcciones de la cadena pesada y liviana en los mismos vectores o en vectores separados.
Las líneas celulares receptoras son generalmente células linfoideas. La célula receptora preferida es un mieloma (o hibridoma). Los mielomas pueden sintetizar, empalmar, y secretar inmunoglobulinas codificadas por genes transfectados y pueden glicosilar proteínas. El receptor o las células huésped particularmente preferidas incluyen mieloma Sp2/0 que normalmente no produce inmunoglobulina endógena, y células NS/0 de mieloma de ratón. Cuando se transfecta, la célula produce únicamente inmunoglobulina codificada por las construcciones génicas transfectadas. Los mielomas transfectados se pueden desarrollar en un cultivo o en el peritoneo de ratones donde la inmunocitoquina secretada se puede recuperar a partir de fluido de ascitis. Otras células linfoides tales como los linfocitos B se puede utilizar como células receptoras.
Existen diferentes métodos para transfectar células linfoides con vectores que contienen las construcciones de ácido nucleico que codifican la cadena quimérica de inmunoglobulina. Por ejemplo, los vectores se pueden introducir en células linfoides por medio de fusión de esferoblastos (ver, por ejemplo, Gillies y colaboradores (1989) BIOTECHNOL. 7: 798-804). Otros métodos útiles incluyen electroporación o precipitación en fosfato de calcio (ver, por ejemplo, Sambrook y colaboradores eds (1989) "Molecular Cloning: A Laboratory Manual", Cold Spring Harbor Press).
Otros métodos útiles para producir las inmunocitoquinas incluyen la preparación de una secuencia de ARN que codifica la construcción y su traducción en un sistema apropiado de expresión in vivo o in vitro. Está contemplado que las metodologías de ADN recombinante para sintetizar genes que codifican las proteínas de fusión anticuerpo-citoquina, para introducir los genes dentro de las células huésped, para expresar los genes en el huésped, y para recolectar las proteínas de fusión resultantes, son bien conocidas y están completamente documentadas en el arte. Los protocolos específicos son descritos, por ejemplo, en Sambrook y colaboradores eds (1989) "Molecular Cloning: A Laboratory Manual", Cold Spring Harbor Press.
Se entiende que las inmunocitoquinas químicamente acopladas se pueden producir utilizando una variedad de métodos bien conocidos por aquellos capacitados en el arte. Por ejemplo, el anticuerpo o un fragmento de anticuerpo se pueden acoplar químicamente a la citoquina utilizando cadenas laterales químicamente reactivas de aminoácido en el anticuerpo o fragmento de anticuerpo y la citoquina. Las cadenas laterales de aminoácido se pueden enlazar en forma covalente, por ejemplo, a través de enlaces disulfuro, o por medio de reactivos de entrelazamiento homo o heterobifuncionales, por ejemplo, N-succinimidil 3(-2-piridiilditio)propionato, éster m-maleimidobenzoil-N-hidroxisuccinato, éster m-maleimidobenzoil-N-hidroxisulfosuccinimida, y 1,4-di-[3'(2'-piridiltio)propionamida]butano, todos los cuales se encuentran comercialmente disponibles con Pierce, Rockford, IL.
La combinación de inmunocitoquinas con agentes se refuerzan la incorporación de inmunocitoquina es útil para mejorar la estimulación del sistema inmune, resultando por lo tanto en una respuesta citotóxica en el sitio del tipo de célula objetivo, por ejemplo, células tumorales u otras células enfermas. Una combinación de una inmunocitoquina y de un agente que refuerza la incorporación de inmunocitoquina se esperaría que no tuvieran un efecto antitumoral combinado o sinergístico in vitro ya que la inmunocitoquina sola es no citotóxica.
Sin desear estar atado a ninguna teoría en particular, se cree que los efectos de la terapia combinada in vivo puede incluir la incorporación mejorada de uno de los agentes por medio de la acción del otro resultando en una cualquiera o en ambas de (1) una citotoxicidad quimioterapéutica mayor (si la inmunocitoquina incrementa la incorporación del agente que incrementa la incorporación de la inmunocitoquina quimioterapéutica en las células tumorales); y/o (2) una mayor inmunoestimulación (si el agente que refuerza la incorporación de la inmunocitoquina incrementa en alguna forma la incorporación de la inmunocitoquina en el tumor). Con respecto al mecanismo (1), los primeros estudios han mostrado que es posible incrementar la incorporación de anticuerpos marcados en forma radiactiva (y presumiblemente, de drogas de moléculas pequeñas) en los tumores por medio de un tratamiento previo con altas dosis de un inmunoconjugado anticuerpo-IL-2 que induce una fuga vascular (ver, por ejemplo, Hornick y colaboradores, 1999, CLIN CANCER RES 5:51-60). Si este mecanismo particular es operativo en la terapia de combinación de inmunocitoquinas y de agentes que refuerzan la incorporación de inmunocitoquina, sería necesario tratar primero al animal que sufre el tumor con la inmunocitoquina. Sin embargo, si una dosis única de un agente para reforzar la incorporación de una inmunocitoquina suministrada previamente al tratamiento con una inmunocitoquina resulta en un efecto sinergístico sobre la actividad antitumoral, entonces tal mecanismo podría no ser operativo. Por el contrario, una explicación más probable sería que el tratamiento con un agente para reforzar la incorporación de la inmunocitoquina incrementó la incorporación de la inmunocitoquina por medio del mecanismo (2). Esta hipótesis podría ser soportada adicionalmente demostrando que la administración conjunta con un agente que refuerza la incorporación de la inmunocitoquina incrementa la incorporación de inmunocitoquina marcada en forma radiactiva en un tumor sólido.
Una ventaja de la terapia de combinación es que la administración de una inmunocitoquina refuerza el efecto citotóxico de un agente quimioterapéutico que actúa como agente para reforzar la incorporación de la inmunocitoquina. Por lo tanto, se puede administrar a un paciente una dosis menor del agente quimioterapéutico. De esta forma, se reduce la supresión de algunos aspectos de un sistema inmune de un paciente, a menudo asociada con el tratamiento utilizando un agente quimioterapéutico. En una modalidad de la invención, se administra a un paciente una dosis única de un agente quimioterapéutico que refuerza la incorporación de la inmunocitoquina, preferiblemente antes de administrar a una inmunocitoquina. El agente quimioterapéutico que refuerza la incorporación de la inmunocitoquina se administra preferiblemente aproximadamente entre 4 días y aproximadamente 4 horas, y lo más preferiblemente aproximadamente 24-48 horas, antes de la inmunocitoquina. En otra modalidad de la invención se administran a un paciente diferentes dosis del agente quimioterapéutico que refuerza la incorporación de la inmunocitoquina, antes de administrar la inmunocitoquina.
El paclitaxel es un ejemplo de un agente quimioterapéutico que refuerza la incorporación de la inmunocitoquina que puede suprimir o comprometer aspectos de un sistema inmunológico de un paciente. Mientras que la mayoría de los efectos del paclitaxel que potencian la inmunidad son mediados a través de células de macrófago/monocito, muchos estudios sobre la función del linfocito indican un efecto perjudicial del paclitaxel sobre este subconjunto. Por ejemplo, se encontró que el tratamiento con paclitaxel compromete severamente la capacidad de proliferación de linfocitos tanto en ratones normales como en los que padecen de un tumor (Mullins y colaboradores, 1998, IMMUNOPHARMACOL IMMUNOTOXICOL 20:473-492), y deteriora tanto la citotoxicidad de las células NK como la generación de citotoxicidad activada por linfoquina en cultivos celulares que contienen IL-2 (Chuang y colaboradores, 1993, GYNECOL ONCOL 49:291-298). En realidad, la evidencia disponible señala al subconjunto de células linfocito como la población efectora esencial en la actividad antitumoral de las inmunocitoquinas (Lode y colaboradores, 1998, PHARMACOL THER 80:277-292). La evidencia experimental contenida dentro de la presente divulgación ha revelado diferentes hallazgos nuevos que no habían sido predichos por el arte previo, especialmente con respecto al orden de la administración de la droga.
Los taxano se pueden administrar con la inmunocitoquina por medio de rutas diferentes de administración. Las composiciones de la presente invención se pueden administrar por medio de cualquier ruta que sea compatible con las moléculas particulares. Por lo tanto, según sea apropiado, la administración puede ser oral o parenteral, incluidas las rutas intravenosa e intraperitoneal de administración.
Las composiciones de la presente invención se le pueden administrar a un animal por cualquier medio adecuado, directamente (por ejemplo, localmente, por medio de una inyección, administración tópica o por medio de un implante a un locus de tejido) o sistémicamente (por ejemplo, en forma parenteral u oral). Cuando la composición va a ser administrada en forma parenteral, tal como por vía intravenosa, subcutánea, oftálmica, intraperitoneal, intramuscular, bucal, rectal, vaginal, intraorbital, intracerebral, intracraneal, intraespinal, intraventricular, intratecal, intracistemal, intracapsular, intranasal o por medio de administración en aerosol, la composición comprende preferiblemente parte de una suspensión o solución fluida acuosa fisiológicamente compatible. Por lo tanto, el portador o vehículo es fisiológicamente aceptable para que además de suministrar la composición deseada al paciente, no afecte de otra manera adversa el balance de electrolitos y/o de volumen del paciente. El medio fluido para el agente puede comprender por lo tanto solución salina fisiológica normal (por ejemplo, NaCl acuoso al 9,85%, 0,15 M, pH 7-7,4). Para muchos taxanos, las formulaciones son generalmente más complejas, debido a sus propiedades de solubilidad generalmente desfavorables. Por ejemplo, la formulación estándar para paclitaxel es 10% de Cremóforo, 10% de etanol, y 80% de solución salina (0,9% de NaCl), mientras que la formulación para docetaxel es una solución 1:1 de etanol:polisorbato 80 que se diluye 1:10 en una solución de glucosa al 5% antes de su administración (Bissery y Lavelle, 1999). Sin embargo, se reconocerán y/o se desarrollarán rutinariamente otras formulaciones que incluyen taxanos y análogos recientemente sintetizados por parte de aquellos capacitados en el arte.
Las dosis preferidas de la inmunocitoquina por administración están en el rango entre 0,1 mg/m^{2} - 100 mg/m^{2}, más preferiblemente, 1 mg/m^{2} - 20 mg/m^{2}, y lo más preferible 2 mg/m^{2} - 6 mg/m^{2}. Las dosis preferidas del agente que refuerza la incorporación de la inmunocitoquina dependerán generalmente del tipo de agente utilizado para reforzar la incorporación de la inmunocitoquina, sin embargo, se pueden determinar las dosis óptimas utilizando experimentación de rutina. La administración de la inmunocitoquina y/o del agente para reforzar la incorporación de la inmunocitoquina puede ser por medio de inyecciones periódicas en bolo, o por medio de administración intravenosa o intraperitoneal continua desde un reservorio externo (por ejemplo, desde una bolsa intravenosa) o interna (por ejemplo, desde un implante biodegradable). Además, se contempla que la inmunocitoquina se puede administra también al receptor deseado junto con una pluralidad de diferentes agentes que refuerzan la incorporación de la inmunocitoquina. Se contempla, sin embargo, que la combinación óptima de inmunocitoquinas y de agentes que refuerzan la incorporación de la inmunocitoquina, las formas de administración y las dosis se pueden determinar bien por medio de experimentación de rutina dentro del nivel de destreza el arte.
Se pueden emplear una variedad de métodos para evaluar la eficacia de la terapia combinada utilizando proteínas de fusión anticuerpo-citoquina y agentes que refuerzan la incorporación de la inmunocitoquina sobre respuestas inmunes. Por ejemplo, el modelo animal que se escribe en los ejemplos más adelante, u otros modelos animales adecuados, pueden ser utilizados por un operario calificado para analizar que agentes que refuerzan la incorporación de la inmunocitoquina, o combinaciones de agentes que refuerzan la incorporación de la inmunocitoquina, son más efectivos para actuar en forma sinergística con una inmunocitoquina (por ejemplo, una proteína de fusión anticuerpo-IL-2) para reforzar la destrucción inmune de tumores establecidos. El agente para reforzar la incorporación de la inmunocitoquina, o combinación de agentes para reforzar la incorporación de la inmunocitoquina, se pueden administrar antes de, o simultáneamente con, el curso de la terapia con inmunocitoquina y el efecto sobre el tumor puede ser convenientemente monitoreado por medio de una medición volumétrica. Además, mientras se identifican nuevos agentes que refuerzan la incorporación de la inmunocitoquina, un operario entrenado será capaz de utilizar los métodos descritos aquí para evaluar el potencial de estos nuevos compuestos para reforzar o bien para modificar la actividad contra el cáncer de proteínas de fusión anticuerpo-citoquina.
Alternativamente, después de una terapia, se pueden cortar los tumores, seccionarlos y colorearlos a través de métodos histológicos estándar, o a través de reactivos inmunohistológicos con el propósito de evaluar el efecto de la terapia combinada sobre la respuesta inmune. Por ejemplo, la simple colaboración con hematoxolina y eosina puede revelar diferencias en la infiltración linfocítica en los tumores sólidos lo cual es indicativo de una respuesta celular inmune. Además, la inmunocoloración de secciones con anticuerpos para clases específicas de células inmunes puede revelar la naturaleza de una respuesta inducida. Por ejemplo, los anticuerpos que se enlazan a CD45 (un marcador general de leucocitos), CD4 y CD8 (para la identificación de una subclase de célula T), y NK1.1 (un marcador sobre células NK) pueden ser utilizados para evaluar el tipo de respuesta inmune que ha sido mediada por las inmunocitoquinas de la invención.
Alternativamente, el tipo de respuesta inmune mediada por las inmunocitoquinas se puede evaluar medio de estudios convencionales de agotamiento del subconjunto de células por ejemplo en Lode y colaboradores (1998) Blood 91: 1706-1715. Los ejemplos de anticuerpos de agotamiento incluyen a aquéllos que reaccionan con marcadores de células T CD4 y CD8, así como aquellos que se enlazan a los marcadores de NK, NKI 1 y asialo GM. En resumen, se inyectan estos anticuerpos al mamífero antes de iniciar el tratamiento con anticuerpo-citoquina en dosis bastante altas (por ejemplo, con una dosis aproximadamente de 0,5 mg/ratón), y se administran después de eso en intervalos semanales hasta que se completa el experimento. Esta técnica puede identificar los tipos de células necesarios para producir la respuesta inmune observada en el mamífero.
En otra aproximación, la actividad citotóxica de los esplenocitos aislados de animales que han sido tratados con la terapia de combinación se puede comparar con aquella de los otros grupos de tratamiento. Los cultivos de esplenocitos se preparan por medio del desmenuzamiento mecánico de bazos estériles recuperados por medio de técnicas estándar encontradas en la mayoría de los manuales de laboratorio de inmunología. Ver, por ejemplo, Coligan y colaboradores (eds) (1988) "Current Protocols in Immunology", John Wiley & Sons, Inc. Las células resultantes se cultivan luego en un medio de cultivo celular adecuado (por ejemplo, DMEM de GIBCO) que contiene suero, antibióticos y una baja concentración de IL-2 (\sim 10 U/mL). Por ejemplo, con el propósito de comparar la actividad de NK, normalmente 3 días de cultivo es óptimo, mientras que, con el propósito de comparar la actividad citotóxica de las células T, normalmente 5 días de cultivo es óptimo. La actividad citotóxica se puede medir marcando en forma atractiva células tumorales objetivo (por ejemplo, células LLC) con ^{51}Cr durante 30 minutos. Después de remover el exceso de marcador radioactivo, las células marcadas se mezclan con diferentes concentraciones de células de bazo cultivadas durante 4 horas. Al final de la incubación, el ^{51}Cr liberado por las células se mide por medio de un contador gama que es utilizado luego para cuantificar el grado de lisis celular inducido por las células inmunes. De esta forma se mide la actividad tradicional de los linfocitos T citotóxicos (o CTL).
La invención se ilustra adicionalmente por medio de los siguientes ejemplos no limitantes.
Ejemplo 1 Modelos Animales
Se desarrollaron modelos de cáncer en múridos para estudiar el efecto de combinar inmunocitoquinas y taxanos en la mediación efectiva de respuestas citotóxicas contra un tumor. Las inmunocitoquinas utilizadas en los siguientes ejemplos enlazan EpCAM, el antígeno tumoral humano encontrado en la mayoría los tumores derivados del epitelio (ver, Perez y Walker (1989) J. Immunol. 142: 3662-3667). Con el propósito de analizar la eficacia en un modelo de múrido inmunocompetente, fue necesario expresar el antígeno humano sobre la superficie de una célula tumoral de ratón que es singenéica con el huésped ratón. Las células de carcinoma de pulmón de Lewis (LLC), una línea celular de cáncer de pulmón de ratón bien conocida, fue la primera línea celular seleccionada para éste propósito. Esta línea celular es conocida por producir altos niveles de inhibidores del sistema inmune y por inducir la producción de IL-10 a partir de células inmunes en el microambiente tumoral conduciendo a una inmunosupresión localizada (Sharma y colaboradores, 1999, J IMMUNOL 163:5020-5028). El antígeno tumoral humano, EpCAM (también denominado KSA), se expresó sobre la superficie de las células LLC para que pudiera ser dirigido in vivo con inmunocitoquinas derivadas del anticuerpo anti-EpCAM de ratón, KS-1/4. Esto fue logrado por medio de la transducción de la secuencia de ADNc para EpCAM con un vector retroviral recombinante como el descrito (Gillies, solicitud estadounidense de patente 09/293.042) resultando en una línea celular designada como LLC/KSA. Estas células fueron mantenidas en DMEM, suplementado con suero fetal bovino al 10% inactivado con calor, L-glutamina, penicilina/estreptomicina y Geneticina (GIBCO) a 37ºC y 7,0% de CO_{2}.
Se diseñaron por medio de ingeniería genética en una forma similar líneas celulares adicionales que representan carcinoma originado en tejidos diferentes. 4T1, una línea celular de carcinoma mamario de múrido no inmunogénico, fue suministrado por el Dr. Paul Sondel (Universidad de Wisconsin). Esta línea crece lenta y progresivamente después del implante subcutáneo y hace metástasis espontáneamente hacia muchos órganos aún antes de la remoción quirúrgica del tumor primario. Es también posible inducir metástasis experimental en el pulmón por medio de una inyección intravenosa. CT26, una línea celular de carcinoma de colon de múrido, derivada por medio de una inyección intrarectal de N-nitroso-N-metiluretano en ratones BALB/C, fue suministrada por el Dr. I.J. Fidler (MD Anderson Cancer Center, Houston, TX). Las células 4T1 y CT26 fueron transfectadas con Ep-CAM como se describió (Gillies y colaboradores, 1998, J IMMUNOL 160:6195-6203). Las células 4T1/KSA fueron mantenidas en RPMI, suplementadas con suero fetal bovino al 10% inactivado con calor, L-glutamina, penicilina/estreptomicina y Geneticina (GIBCO) a 37ºC y 7,0% de CO_{2}, las células CT26/KSA fueron mantenidas en DMEM, suplementadas con suero fetal bovino al 10% inactivado con calor, L-glutamina, vitaminas, piruvato de sodio, aminoácidos no esenciales, penicilina/estreptomicina y Geneticina (GIBCO, Gaithersberg, MD) a 37ºC y 7,0% de CO_{2}. Se añadió Geneticina a las células transfectadas para mantener la expresión de KSA. Todas las líneas celulares crecen progresivamente como tumores de la piel (después de una inyección subcutánea) o como metástasis (después de una inyección intravenosa) y matan a los ratones, a pesar de su expresión de la molécula EpCAM humana (un antígeno exterior potencial) sobre su superficie celular.
Para los estudios del desarrollo del tumor se implantaron o bien tumores LLC/KSA o CT26/KSA en forma subcutánea sobre el lomo de los ratones. Para los estudios con LLC/KSA, se trasplantaron los tumores a partir de diferentes cepas de tumores que habían sido inyectadas con una suspensión celular única de 1 x 10^{6} células en 100 ul de PBS. Aproximadamente después de dos semanas, se recolectaron en forma escéptica los tumores, se los pasó través de un tamiz equipado con una malla de 150 \mum. Las células fueron pasadas luego a través de una jeringa y una aguja de calibre 23 dos o tres veces, lavadas dos veces, y resuspendidas en PBS. Se inyectó una suspensión celular única de 1 x 10^{6} células de LLC/KSA en 100 \mul de PBS en forma subcutánea utilizando una aguja de calibre 30 ½ sobre el lomo de los ratones. Para los estudios de CT26/KSA, se inyectaron las células que crecieron exponencialmente en el cultivo como una suspensión celular única de 1 x 10^{6} células en 100 \mul de PBS. Después de que se habían establecido los tumores, aproximadamente 2 semanas después de la implantación, se inició la dosificación el Día 0. Se midieron los tumores con calibradores en tres dimensiones dos veces a la semana. Se calcularon los volúmenes de los rumores utilizando la ecuación:
Volumen = ½ x 4/3 \pi (L/2 x W/2 x H)
donde L = longitud, W = ancho y H = altura del tumor. Los animales fueron pesados y se monitoreó su estado general de salud durante el curso del estudio. Cuando los tumores se hicieron necróticos o si los animales estaban moribundos, se les aplicó la eutanasia asfixiándolos con CO_{2}.
Los datos se presentaron en forma gráfica. Las gráficas describieron los volúmenes individuales o promedio del tumor de los ratones tratados, en relación con los ratones tratados con el vehículo. La prueba t de Student se realizó sobre volúmenes de tumores individuales para determinar diferencias significativas.
Para estudios experimentales de metástasis hepática, los ratones fueron anestesiados utilizando 80 mg/kg de clorhidrato de ketamina (Fort Dodge Animal Health, Fort Dodge, IA) y 5 mg/kg de xilazina (Bayer, Shawnee Mission, KS). Se inyectó una suspensión celular única de 1 x 10^{5} células CT26/KSA en 100 \mul de DMEM que contenía HEPES 25 mM (GIBCO) utilizando una aguja de calibre 27 ½ por debajo de la cápsula esplénica durante un período de 60 segundos el Día 0. Después de otros 2 minutos se cauterizaron los vasos esplénicos con una unidad de cauterización (Roboz, Rockville, MD) y se removió el bazo. Los animales fueron suturados utilizando autoclips. Tres semanas después de la inoculación se sacrificaron los animales; se removieron y se pesaron sus hígados. Se fijaron luego los hígados y se los coloreó en solución de Bouin (Sigma, St. Louis MO).
Los datos se presentan en forma gráfica. Los gráficos describen los pesos promedio del tumor (+/- SEM) al momento del sacrificio. Los pesos del tumor se determinaron restando el peso de un hígado normal del peso de los hígados del experimento. Los datos se expresaron también como el porcentaje de control del peso promedio del tumor de los ratones tratados con relación a los ratones tratados con el vehículo. La prueba t de Student se realizó sobre los pesos individuales de los tumores para determinar diferencias significativas.
Para los estudios experimentales de metástasis en el pulmón, se inyectó lentamente una suspensión celular única de 2,5 x 10^{5} células 4T1/KSA en 100 \mul de PBS utilizando una aguja de calibre 27 ½ en la vena lateral de la cola el Día 0. Aproximadamente 3 semanas después de la inoculación los animales fueron sacrificados; sus pulmones fueron removidos y pesados. Se fijaron luego los pulmones y se los coloreó en solución de Bouin (Sigma). Los datos se presentan en forma gráfica. Los gráficos describen los pesos promedio del tumor (+/- SEM) al momento del sacrificio. Se determinó el peso del tumor restando el peso de un pulmón normal del peso de los pulmones del experimento. Los datos se expresaron también como el porcentaje de control del peso promedio del tumor de los ratones tratados con relación a los ratones tratados con el vehículo. La prueba t de Student se realizó sobre los pesos individuales de los tumores para determinar diferencias significativas.
Ejemplo 2 Preparación de Proteínas de Fusión-Anticuerpo (Inmunocitoquinas)
En los siguientes ejemplos se discuten diferentes proteínas de fusión anticuerpo- citoquina.
huKS-hu\gamma1-huIL2 (abreviado, KS-IL2)
Se preparó y expresó un gen que codifica a la proteína de fusión huKS-hu\gamma-huIL2 esencialmente como lo describen Gillies y colaboradores (1998) J. Immunol. 160: 6195-6203 y la patente estadounidense No. 5.650.150. En resumen, las regiones variables humanizadas del anticuerpo KS1/4 de ratón (Varki y colaboradores, (1984) Cancer Res. 44: 681-687) fueron modeladas utilizando los métodos divulgados por Jones y colaboradores (1986) Nature 321: 522-525, que involucrar la inserción de las CDR de cada región variable KS1/4 en las secuencias de consenso del marco de las regiones variables humanas con el grado más alto de homología. La modelación molecular con una estación de trabajo Silicon Graphics Indigo implementando el software BioSym confirmó que se mantuvieron las formas de las CDR. Las secuencias de la proteína fueron luego traducidas a la inversa, y se construyeron los genes por medio de la ligación de oligonucleótidos que se superponen.
Se insertaron las regiones variables resultantes en un vector de expresión que contenía las regiones constantes de la cadena liviana humana \kappa y la cadena pesada humana C\gamma1 esencialmente como se describe en Gillies y colaboradores (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 1428-1432, excepto porque los promotores de metalotioneina y los reforzadores de la cadena pesada de inmunoglobulina fueron reemplazados por el promotor/reforzador del CMV para la expresión de ambas cadenas. Las fusiones de las secuencias maduras de IL-2 al terminal carboxilo de las cadenas pesadas humanas se prepararon como se describe en Gillies y colaboradores (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 1428-1432, excepto porque las regiones 3' no traducidas del gen de la IL-2 se derivaron de la región poli(A) de SV40.
La proteína de fusión de la IL-2 se expresó por medio de la transfección del plásmido resultante en la línea celular de mieloma NS/0 con el medio de selección que contenía metotrexato 0,1 \muM (MTX). En resumen, con el propósito de obtener clones transfectados en forma estable, se introdujo un ADN de plásmido en las células de mieloma NS/0 de ratón por medio de electroporación. Las células NS/0 fueron cultivadas en medio modificado de Eagle de Dulbecco suplementado con suero bovino fetal al 10%. Se lavaron aproximadamente 5 x 10^{6} células una vez con PBS y se las resuspendió en 0,5 mL de PBS. Se incubaron luego 10 \mug de ADN de plásmido lineal con las células en una Gene Pulser Cuvette (0,4 cm de abertura de electrodo, BioRad) sobre hielo durante 10 minutos. Se llevó a cabo la electroporación utilizando una Gene Pulser (BioRad, Hercules, CA) ajustada en 0,25 V y 500 \muF. A las células se les permitió recuperarse durante 10 minutos, sobre hielo, después de lo cual se resuspendieron en medio de cultivo y luego se las sembró sobre dos placas de 96 pozos. Se seleccionaron los clones transfectados en forma estable por medio del crecimiento en presencia de metotrexato 100 nM, que fue introducido dos días después de la transfección. Las células fueron alimentadas cada 3 días por tres veces más, y aparecieron clones resistentes a MTX en el lapso de 2 a 3 semanas.
Los clones que se expresan fueron identificados por medio de ELISA para Fc o para una citoquina utilizando los anticuerpos apropiados (ver, por ejemplo, Gillies y colaboradores (1989) Biotechnol. 7: 798-804). La proteína de fusión resultante fue purificada por medio de enlazamiento y elución de proteína A acoplada a Sefarosa (Pharmacia), de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
huKS-hu\gamma4-huIL2
Se construyó un gen que codifica a la proteína de fusión huKS-hu\gamma4-huIL2 y se expresó esencialmente como se describe en la U.S.S.N. 09/256.156, presentada el 24 de febrero de 1999, que reivindica prioridad con la U.S.S.N 60/075.887, presentada el 25 de febrero de 1998.
En resumen, se preparó una versión Ig\gamma4 de la proteína de fusión huKS-hu\gamma1-huIL2, descrita anteriormente, removiendo el fragmento del gen C\gamma1 de la región constante de la inmunoglobulina del vector de expresión de huKS-hu\gamma4-huIL2 y reemplazándolo con la secuencia correspondiente del gen C\gamma4. Las secuencias y los alineamientos de las secuencias de las regiones constantes de cadena pesada humana C\gamma1, C\gamma2, C\gamma3 y C\gamma4 se divulgan en Huck y colaboradores (1986) Nuc. ACIDS RES. 14: 1779-1789.
El cambio de los fragmentos C\gamma1 y C\gamma4 se logró digiriendo el ADN original del plásmido que contiene C\gamma1 con Hind III y Xho I y purificando un fragmento grande de 7,8 kb por medio de electroforesis en gel de agarosa. Se digirió un segundo ADN del plásmido que contiene al gen C\gamma4 con Hind III y Nsi I y se purificó un fragmento de 1,75 kb. Un tercer plásmido que contiene el ADNc para IL-2 humana y un sitio poliA de SV40, fusionado al terminal carboxilo del gen C\gamma1 humano, fue digerido con Xho I y Nsi I y se purificó el fragmento pequeño de 470 pb. Todos los tres fragmentos se ligaron juntos en cantidades molares aproximadamente iguales. Se utilizó el producto de ligación para transformar al E. coli competente y se seleccionaron las colonias por medio del cultivo sobre placas que contenían ampicilina. Se identificaron los plásmidos recombinantes correctamente ensamblados por medio de análisis de restricción de preparaciones de ADN de plásmido de transformantes aislados y se utilizó digestión con Fsp I para discriminar entre los insertos del gen C\gamma1 (sin Fsp I) y C\gamma4 (un sitio).
El vector final, que contiene el reemplazo de cadena pesada C\gamma4-IL2, fue introducido en células de mieloma de ratón NS/0 por medio de electroporación (0,25 V y 500 \muF) y se seleccionaron los transfectantes por medio del cultivo en medio que contenía metotrexato (0,1 \muM). Se identificaron los clones celulares que expresaban altos niveles de la proteína de fusión huKS-hu\gamma4-huIL2, se los expandió, y se purificó la proteína de fusión a partir de los sobrenadantes del cultivo utilizando cromatografía sobre proteína A acoplada a Sefarosa. La pureza e integridad de la proteína de fusión de C\gamma4 se determinaron por medio de electroforesis en gel de poliacrilamida-SDS. Se midió la actividad de IL-2 en un ensayo de proliferación de células T (Gillis y colaboradores (1978) J. Immunol. 120: 2027-2032) y se encontró que era idéntica a aquella de la construcción de \gamma-1.
huKS-mu\gamma2a-muIL2
Se construyó un gen que codifica a la proteína de fusión huKS-mu\gamma2a-muIL2 por medio del reemplazo de las regiones constantes del anticuerpo humano y la IL-2 humana de la proteína de fusión huKS-hu\gamma1-muIL2, como se describió anteriormente, con las secuencias de múrido correspondientes. Específicamente, se reemplazó el ADN para la IL2 de C\gamma1 con un fragmento de ADNc de C\gamma2a de múrido fusionado a un ADN que codifica a la IL-2 de múrido. En resumen, la región V_{H} de la huKS se unió en el marco al ADNc para \gamma2a de múrido llevando a cabo la PCR de solapamiento utilizando iniciadores oligonucleótidos de solapamiento:
(sentido) 5' CC GTC TCC TCA GCC AAA ACA ACA GCC CCA TCG GTC (SEQ ID NO: 3);
(antisentido) 5' GG GGC TGT TGT TTT GGC TGA GGA GAC GGT GAC TGA CG (SEQ ID NO:4)
(sentido) 5'C TTA AGC CAG ATC CAG TTG GTG CAG (SEQ ID NO: 5); y
(antisentido) 5' CC CGG GGT CCG GGA GAA GCT CTT AGT C (SEQ ID NO: 6).
Los oligonucleótidos de las SEQ ID NOs: 3 y 4 fueron diseñados para hibridar la unión del dominio de la V_{H} de huKS y la región constante del ADNc para \gamma2a (en itálicas). En el primer ciclo de PCR, había dos reacciones separadas. En una reacción, se utilizó ADN para la V_{H} de huKS como el molde con los oligonucleótidos de SEQ ID Nos: 4 y 5. El iniciador de SEQ ID NO: 5 introdujo un sitio de restricción AflII (CTTAAG) secuencia arriba de la secuencia que codifica al terminal amino maduro de la V_{H} de huKS (en negrilla). En otra reacción, se utilizó ADNc para \gamma2a de múrido como molde con los oligonucleótidos de SEQ ID NOs: 3 y 6. El iniciador de SEQ ID NO: 6 hibrida al ADNc que codifica la región alrededor del C-terminal de \gamma2a e introdujo un sitio de restricción Xmal (CCCGGG) para ligación posterior al ADNc para muIL2. Se mezclaron los productos de la PCR de las dos reacciones y se los sometió a un segundo ciclo de PCR, utilizando los oligonucleótidos de las SEQ ID NOs: 5 y 6. Se clonaron los productos resultantes de la PCR, y tras la verificación de la secuencia, se utilizó el fragmento AflII-Xmal que codifica a la V_{H} de huKS y la región constante de \gamma2a de múrido para ligación al ADN que codifica al péptido señal en el sitio AflII y al ADNc para muIL2 en el sitio Xmal.
Se clonó el ADNc para IL2 de múrido a partir del ARNm de múrido de células mononucleares de sangre periférica utilizando los oligonucleótidos expuestos en las SEQ ID NOs: 7 y 8, especialmente:
(sentido) 5'GGC CCG GGT AAA GCA CCC ACT TCA AGC TCC (SEQ ID NO. 7); y
(antisentido) 5' CCCTCGAGTTATTGAGGGCTTGTTG (SEQ ID NO. 8).
El iniciador de la SEQ ID NO: 7 adaptó la muIL2 (secuencia en negrilla) para unirla a mu \gamma2a en el sitio de restricción Xmal (CCCGGG). El iniciador de la SEQ ID NO: 8 introdujo un sitio de restricción Xhol (CTCGAG) inmediatamente después del codón de terminación de la traducción (antisentido en negrilla).
En forma similar, se unió el dominio de la cadena liviana de la región variable (V_{L}) de ofhuKS a la secuencia de ADNc para mu \kappa por medio de PCR de solapamiento. Los oligonucleótidos de solapamiento utilizados incluyeron
(sentido) 5' G GAA ATA AAA CGG GCT GAT GCT GCA CCA ACT G (SEQ ID NO. 9);
(antisentido) 5' GC AGC ATC AGC CCGTT TTA TTT CCA GCT TGG TCC (SEQ ID NO. 10);
(sentido) 5'C TTA AGC GAG ATC GTG CTG ACC CAG (SEQ ID NO. 11); y
(antisentido) 5' CTC GAG CTA ACA CTC ATT CCT GTT GAA GC (SEQ ID NO. 12).
Los oligonucleótidos fueron diseñados para hibridar a la unión de la V_{L} de huKS y la región constante del ADNc de \kappa de múrido (en itálicas). En el primer ciclo de PCR, hubo dos reacciones separadas. En una reacción, se utilizó ADN para la V_{H} de huKS como el molde, con los oligonucleótidos expuestos en las SEQ ID Nos: 10 y 11, que introdujo un sitio de restricción AflII (CTTAAG) secuencia arriba de la secuencia que codifica al terminal amino maduro de la V_{L} de huKS (en negrilla). En la otra reacción, se utilizó ADNc de \kappa de múrido como molde, con los oligonucleótidos expuestos en las SEQ ID Nos: 9 y 12, que introdujo un sitio de restricción Xhol después del codón de terminación de la traducción (antisentido en negrilla).
Se mezclaron los productos de las dos reacciones y se los sometió a un segundo ciclo de PCR utilizando los iniciadores oligonucleótidos expuestos en las SEQ ID NOs: 11 y 12. Se clonó el producto PCR resultante, y tras la verificación de la secuencia, se ligó el fragmento AflII-Xmal que codifica a la V_{L} de huKS y la región constante de \kappa de múrido al ADN que codifica al péptido señal en el sitio AflII.
Utilizaron las secuencias tanto de la cadena pesada como en la cadena liviana de múrido para reemplazar las secuencias humanas en pdHL7. El vector de expresión resultante del anticuerpo, que contenía un gen marcador dhfr seleccionable, fue electroporado (6,25 V, 500 \muF) en células de mieloma NS/0 de múrido y se seleccionaron los clones por medio de cultivo en un medio que contenía metotrexato 0,1 \muM. Los clones transfectados, resistentes al metotrexato, fueron analizados por la secreción de determinantes de anticuerpo por medio de métodos estándar de ELISA. Las proteínas de fusión fueron purificadas a través de cromatografía sobre proteína A acoplada a Sefarosa de acuerdo a las instrucciones del fabricante.
huKS-mu\gamma2a-muIL12
Se construyó un gen que codifica a la proteína de fusión huKS-mu\gamma2a-muIL12 y se expresó esencialmente como se describe en la U.S.S.N. 08/986.997, presentada el 8 de diciembre de 1997, y en Gillis y colaboradores (1978) J. Immunol. 160: 6195-6203. En resumen, esto fue logrado por medio de la fusión del ADNc de la subunidad de IL-12 de p35 de múrido a la región de codificación de cadena pesada de huKS-mu\gamma2a previamente preparada. Se transfectó luego el vector resultante dentro de una línea celular de mieloma NS/0 con, y capaz de expresar a la subunidad de IL-12 de p40. En otras palabras, se transfectó una línea celular solo con p40, y se seleccionó una célula de expresión alta y estable, que fue utilizada luego como receptora para transfección por la p35 que contenía la proteína de fusión (esto es, transfección secuencial).
Se aislaron las subunidades de IL-12 de p35 y p40 de múrido por medio de PCR de un ARNm preparado a partir de células de bazo activadas con Concanavalina A (5 \mug/mL en medio de cultivo durante 3 días). Los iniciadores PCR utilizados para aislar a la secuencia de ácido nucleico que codifica a p35 que también adaptó el ADNc de p35 como un fragmento de restricción Xmal-Xhol incluían:
5' CCCCGGGTAGGGTCATTCCAGTCTCTGG (SEQ ID NO: 13); y
5' CTCGAGTCAGGCGGAGCTCAGATAGC (SEQ ID NO: 14). 
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El iniciador PCR utilizado par aislar a la secuencia de ácido nucleico que codifica a p40 incluía:
5'TCTAGACCATGTGTCCTCAGAAGCTAAC (SEQ ID NO: 15); y
5' CTCGAGCTAGGATCGGACCCTGCAG (SEQ ID NO: 16).
Se construyó un vector plásmido (pdHL7-huKS-mu\gamma2a-p35) como el descrito (Gillies y colaboradores. J. Immunol. Methods 125: 191) que contenía un gen marcador dhfr seleccionable, una unidad de transcripción que codifica a una cadena liviana de anticuerpo KS humanizado, y una unidad de transcripción que codifica a una cadena pesada de múrido fusionada a la subunidad p35 de IL-12 de ratón. La fusión se logró por medio de la ligación del fragmento Xmal a Xhol del ADNc de la subunidad adaptada de p35, a un sitio único Xmal en el extremo del exón CH3 del gen \gamma2a de múrido previamente preparado. Tanto las unidades de transcripción de la cadena H como de la L incluían un promotor citomegalovirus (CMV) (en lugar del promotor metalotioneina en la referencia original) en el extremo 5' y, un sitio de poliadenilación en el extremo 3'.
Se construyó un vector similar (pNC-p40) para expresión de la subunidad p40 libre que incluía un gen marcador seleccionable (gen resistente a la neomicina) pero utilizando aún al promotor CMV para transcripción. La región de codificación en este caso incluía la secuencia líder natural de la subunidad p40 para el tránsito adecuado hasta el retículo endoplasmático y ensamblaje con la proteína de fusión. El plásmido pNC-p40 fue electroporado dentro de las células que luego fueron sembradas en placa y seleccionadas en medio que contenía G418. En este caso, se analizaron los sobrenadantes del cultivo de los clones resistentes a la droga por medio de ELISA para la producción de una subunidad p40.
El vector de expresión pdHL7-huKS-mu\gamma2a-p35 fue electroporado en la línea celular NS/0 que ya expresa a p40 de múrido, como se describe en Gillies y colaboradores (1998)J. Immunol. 160: 6195-6203. Se analizaron los clones transfectados resistentes al metrotexato por la secreción de determinantes de anticuerpo y la IL-12 de ratón por medio de métodos estándar de ELISA. Se purificó la proteína resultante por medio del enlazamiento a, y elusión de una columna de proteína A acoplada a Sefarosa de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
Ejemplo 3 Actividad citotóxica in vitro de una terapia de combinación
Se analizaron líneas celulares modificadas por medio de ingeniería genética para ser utilizadas en modelos animales (ejemplo 1) por su sensibilidad a la citotoxicidad inducida con taxano en un cultivo de células en presencia o en ausencia de una inmunocitoquina con base en IL-2 que consiste de la forma humanizada del anticuerpo KS-1/4 fusionado en el terminal carboxilo de la cadena pesada a la IL-2 humana (huKS-hu\gamma1-huIL-2, de ahora en adelante abreviado KS-IL2). Se sembraron las células a razón de 1000 células/pozo en placas de 96 pozos fondo plano y se las incubó durante 24 horas a 37ºC, 7% de CO_{2}. Se añadieron por duplicado, paclitaxel, en una concentración de una dilución 2X de 200 ng/ml a 3,125 ng/ml, KS-IL-2, en una concentración de 200 ng/ml e IL-2, en una concentración de 33,3 ng/ml (la cantidad equivalente de IL-2 en KS-IL-2) a las placas de cultivo celular y se incubaron durante 6 días a 37ºC, 7% de CO_{2}. El ensayo colorimétrico MTS (Promega), una medida de la viabilidad de la célula con base en la conversión celular de una sal de tetrazolio, se realizó directamente en las placas de 96 pozos. Se leyeron y registraron después las placas, se colorearon las células adherentes viables con Cristal violeta (Sigma, St. Louis, MO). Las placas coloreadas con Cristal violeta fueron utilizadas para verificar los resultados de ensayo MTS. Los resultados se expresan en forma tabular. El valor de IC_{50} es la concentración de la droga que produjo citotoxicidad en un nivel del 50% del control.
Un ensayo de citotoxicidad fue llevado a cabo con paclitaxel (3 a 200 ng/ml) solo o en combinación con KS-IL2 (200 ng/ml) o IL-2 (33,3 ng/ml, la cantidad equivalente de IL-2 en KS-IL2) contra células CT26/KSA, LLC/KSA y 4T1/KSA. Existía poca o ninguna toxicidad de KS-IL2 o de IL-2 solos o sobre las tres líneas celulares analizadas (81% a 101% de control, Tabla 1). La adición ya sea de KS-IL2 o de IL-2 no afectó la citotoxicidad del Paclitaxel. Por lo tanto, ya que ni KS-IL2 ni IL-2 afectan la citotoxicidad del paclitaxel, cualquier mejora en la actividad antitumoral en ratones por medio de los tratamientos combinados debe ser debida a otros mecanismos, que ocurren únicamente en el animal que padece de un tumor.
TABLA 1 Citotoxicidad del Paclitaxel en combinación con IL-2 o KS-IL2
100 
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Ejemplo 4 Terapia de combinación de tumores de piel LLC con KS-IL2 y un taxano
Se llevó a cabo un ensayo de regresión del crecimiento del tumor utilizando el tumor que crece agresivamente, LLC/KSA, en el cual una dosis única de paclitaxel (80 mg/kg) fue seguida una semana después por KS-IL2 (20 \mug) administrado por medio de una inyección intravenosa en la vena de la cola durante 5 días (Figura 2). No se observó efecto ni por parte del paclitaxel ni de KS-IL2 administrados solos (los Días 0-4). Sin embargo, cuando se administró KS-IL2 una semana después del paclitaxel se observó una gran reducción en el volumen promedio del tumor (41% del control) y un retraso en el crecimiento del tumor (TGD) de aproximadamente 8 días lo cual fue significativamente diferente que con el paclitaxel solo (p = 0,023). No se observó una toxicidad flagrante relacionada con la droga excepto por una pérdida de peso <5% en los grupos tratados con paclitaxel.
A continuación, se comparó el efecto de dosis múltiples de paclitaxel, generalmente considerado una programación de quimioterapia más efectiva, con una dosis única de paclitaxel en combinación con KS-IL2 para determinar cómo afecta la programación el refuerzo. KS-IL2 (20 \mug. Días 0-4) solo nuevamente no tenía efecto sobre el crecimiento del tumor LLC/KSA pero el paclitaxel solo, cuando se lo administra en dosis múltiples (50 mg/kg, cada día), redujo el volumen promedio del tumor hasta un 63% del de control y causó un retraso de 4 días en el crecimiento del tumor (TGD) (Figura 3). Cuando se administró la inmunocitoquina KS-IL2 una semana después del tratamiento con paclitaxel, se observó una reducción en el volumen del tumor hasta un 27% del de control y un TGD de 10 días lo cual fue significativamente diferente que el paclitaxel solo (p = 0,016). No se observó toxicidad flagrante relacionada con la droga excepto por una pérdida de peso <5% en los grupos tratados con paclitaxel. El grupo con terapia combinada tuvo aún una menor pérdida de peso. Estos resultados positivos con la terapia de combinación son sorprendentes considerando el intervalo relativamente corto entre el tratamiento quimioterapéutico (y el daño inmunológico potencial) y la iniciación de un tratamiento que se basa en la habilidad para estimular la proliferación de linfocitos y la
citotoxicidad.
Una explicación para el efecto combinado es que la apoptosis inducida con taxano de una porción de la masa del tumor en crecimiento redujo la presión intersticial que, a su vez, incrementó la incorporación efectiva de KS-IL2 dentro del tumor. Estudios recientes (Griffon-Etienne y colaboradores 1999, CANCER RES. 59:3776-3782) indican que el efecto de una dosis única de paclitaxel efectivamente disminuye las presiones del fluido intersticial con un efecto máximo observado de 24 a 48 horas (Griffon-Etienne y colaboradores 1999, CANCER RES. 59:3776-3782). Aunque este puede ser el mejor momento para incorporar a la inmunocitoquina dentro del tumor, es también un intervalo de tiempo muy corto después de la quimioterapia. Sin embargo, tratamos ratones que padecían de tumores LLC/KSA con KS-IL2 durante 5 días consecutivos comenzando justo 24 horas después de recibir una dosis única de paclitaxel. Los resultados indican que existe una respuesta combinada aún mejor cuando se inicia el tratamiento con inmunocitoquina una semana antes después de una dosis única de paclitaxel con esta línea tumoral así como con carcinoma de colon CT26 (ver más adelante).
Ejemplo 5 Terapia de combinación de metástasis 4T1 con KS-IL2 y un taxano
Desde que encontramos que los intervalos de tratamiento entre la administración de un taxano y una inmunocitoquina podrían ser más cortos de lo esperado, analizamos regímenes de combinación en los cuales el taxano y la inmunocitoquina se administran el mismo día y se compara con una dosis única (75 mg/kg) de paclitaxel con una dosis fraccionada (25 mg/kg x 3 días) administrada actualmente con el tratamiento con KS-IL2 (15 \mug/dosis x 3 días administrados 4 horas después del paclitaxel). Para este ejemplo utilizamos un modelo experimental de metástasis de pulmón inducida con células de carcinoma de seno 4T1/KSA. Las dosis de las drogas se seleccionaron para que estuvieran en si mismas por debajo del óptimo para que cualquier aditivo adicional o actividad sinergística pudiera ser observada.
Cada agente administrado solo reduce significativamente (p < 0,02) los pesos promedio del pulmón hasta un grado similar: 43% de reducción para la dosis única de paclitaxel, una reducción del 49% para dosis múltiples de paclitaxel solo y una reducción del 39% con KS-IL2 solo (Figura 4). La combinación de paclitaxel y de KS-IL2 redujo además la metástasis de pulmón ligeramente pero fue menos que aditiva: 58% de reducción para una dosis única de paclitaxel en combinación con KS-IL2 y una reducción del 68% para una dosis múltiple de paclitaxel en combinación con KS-IL2. Aunque no se observó sinergismo, la dosis única de paclitaxel en combinación con KS-IL2 resultó en una diferencia significativa comparada con paclitaxel administrado solo (p = 0,047).
Se observó una pérdida en peso del 10% en todos los grupos, sin embargo, la pérdida más grande en peso se obtuvo con 25 mg/kg de paclitaxel administrado 3 veces cada día. Con base en estos datos, el mejor régimen en este ensayo de metástasis de pulmón 4T1 con respecto al efecto más grande de la terapia de combinación fue una dosis única de paclitaxel seguida por KS-IL2, como fue el caso para el modelo de regresión de crecimiento del tumor LLC/KSA. Ya que el intervalo de la dosis en este caso fue solamente de 4 horas, los resultados pueden no haber sido óptimos para la incorporación eficiente por el tumor.
Ejemplo 6 Terapia de combinación de tumores de piel CT26 con KS-IL2 y un taxano
Los resultados descritos en el ejemplo 5 sugirieron que el intervalo de tiempo de 4 horas entre la dosis de dos agentes puede ser muy corto. Quizás los niveles de paclitaxel que aún permanecen en el animal al momento de dosificar KS-IL2 pudieran interferir directamente con la activación de los linfocitos, reduciendo así su actividad antitumoral potencial en el establecimiento de la combinación. También, a las 4 horas el efecto máximo sobre la presión intersticial del tumor no habría sido alcanzado. Por lo tanto, diseñamos otro experimento, esta vez utilizando tumores establecidos de piel del carcinoma de colon CT26/KSA, en los cuales combinamos una dosis única de paclitaxel (75 mg/kg) con una cantidad de KS-IL2 durante 5 días comenzando 24 horas después de la administración del taxano. El paclitaxel solo no tuvo efecto sobre el crecimiento del tumor (Figura 5). El tratamiento con dosis por debajo del óptimo de KS-IL2 (10 \mug, Días 1-5) resultó en volúmenes de tumor que fueron del 71% del de control. Una reducción dramática y sinergística del volumen del tumor al 8% del de control fue observada con la combinación de paclitaxel y KS-IL2, lo cual fue significativamente diferente del tratamiento solo con paclitaxel (p < 0,001). Se observó una pérdida mínima de peso de \sim5% para ambos grupos tratados con paclitaxel.
Se llevó a cabo un segundo experimento utilizando el modelo CT26/KSA, esta vez analizando el efecto de la terapia combinada en metástasis establecida en el hígado y nuevamente utilizando el retraso de 24 horas entre la administración de paclitaxel y el tratamiento con KS-IL2. Comparamos también la respuesta a la dosis de paclitaxel en la terapia de combinación. Los ratones fueron inyectados con 25, 50 ó 75 mg/kg de paclitaxel el Día 5 después de la inducción de la metástasis, solo o pasado un día con KS-IL2 (7 ug) durante 5 días. Se observó un efecto de respuesta a la dosis para paclitaxel solo, en la cual 25, 50, 75 mg/kg resultaron en pesos de tumor de 49%, 23%, 10% del de control, respectivamente (Figura 6). Combinando paclitaxel con KS-IL2 reduce además la metástasis en el pulmón a 12%, 9% y 6% del de control para la misma dosis respectiva de paclitaxel. La dosis más baja de paclitaxel (25 mg/kg) en combinación con KS-IL2 resultó en la reducción más grande y más significativa (p < 0,001) en el peso del tumor comparado con las dosis más altas de paclitaxel con KS-IL2. Por lo tanto, la combinación de KS-IL2 precedida por paclitaxel resultó en un efecto antitumoral mayor que cualquier agente solo. Además, la dosis más baja de paclitaxel en combinación con KS-IL2 resultó en una eficacia antitumoral que la dosis más alta de paclitaxel solo. En consecuencia, utilizando una dosis menor de paclitaxel en combinación con KS-IL2 se reduciría la toxicidad mientras se mantiene una buena eficacia.
Ejemplo 7 Medición de la incorporación de KS-IL2 en tumores
Si el efecto de dosis únicas del tratamiento con droga citotóxica, antes de la terapia con inmunocitoquina, es el de disminuir la presión intersticial del tumor e incrementar la penetración de los tumores, esto se debe medir utilizando inmunocitoquina marcada en forma radioactiva, por ejemplo KS-IL2. La KS-IL2 purificada fue marcada con ^{125}I por medio de procedimientos estándar (referencia) a través de un convenio con un vendedor comercial (New England Nuclear, Billerica, MA). Los tumores de piel de CT26/KSA fueron implantados en forma subcutánea como se describe en el Ejemplo 1 y se les permitió crecer hasta que alcanzaran un volumen entre 100-200 mm^{3}. Se inyectaron dos grupos de 4 ratones ya sea con paclitaxel (50 mg/kg) en vehículo o el vehículo solo seguido en 1 hora (Experimento 1) ó en 24 horas (Experimento 2) por 10 \mug de ^{125}I-KS-IL2 (95 \muCi). Seis horas después de inyectar la inmunocitoquina marcada en forma radioactiva, se sacrificaron los ratones y se removieron quirúrgicamente sus tumores. Como control, se recogieron también los hígados de los animales y se pesaron todos los tejidos y luego se hizo un recuento e un contador gama. Los resultados se expresaron como los recuentos por minuto (CPM) por gramo de tejido, dividiendo el CPM total en el tejido por el peso.
Cuando se inyectó KS-IL2 marcado 1 hora después del tratamiento con paclitaxel (Figura 7A), únicamente se observó un pequeño incremento en la cantidad de reactividad en los tumores extraídos de los animales que recibieron la droga. Por el contrario, cuando se inyectó KS-IL2 marcado 24 horas después del tratamiento con paclitaxel, se observó un dramático incremento en la incorporación (> 200 porciento) con relación al vehículo de control (Figura 7B). Esta gran diferencia en la incorporación por parte del tumor entre los períodos de tiempo de 1 hora y 24 horas está de acuerdo con los datos sobre los cambios inducidos con el taxano en la presión intersticial (Griffon-Etienne y colaboradores, 1999, CANCER RES. 59:3776-3782), y es consistente con los datos en nuestros modelos tumorales que muestran que comenzando el tratamiento 24 horas después del paclitaxel es más eficiente que el tratamiento más temprano (4 horas).
También analizamos si otras clases de drogas podrían incrementar la incorporación de la inmunocitoquina marcada dentro de los tumores sólidos. En este caso, los ratones fueron inyectados con una dosis única de ciclofosfamida (40 mg/kg) ya sea 24 horas ó 3 días antes del experimento. Se inyectó en todos los ratones KS-IL2 marcado con ^{125}I, incluidos los ratones de control tratados previamente con PBS, y se determinó la cantidad de radioactividad en los tumores extirpados 16 horas después. Los resultados (Figura 8) muestran que el tratamiento previo con ciclofosfamida incrementó la incorporación de KS-IL2 en un 48% en ratones tratados previamente 24 horas antes, y en un 70% en ratones tratados previamente durante 3 días.
Ejemplo 8 Terapia de combinación con huKS-hu\gamma4-IL2 y un taxano
Se han descrito recientemente nuevas formas de inmunocitoquinas que tienen vidas medias en circulación mayores y una eficacia mejorada debido a una afinidad reducida por los receptores de Fc (ver Gillies y colaboradores, 1999, CANCER RES. 59:2159-2166). Una de las inmunocitoquinas representativas de estas IL-2 mejoradas, huKS-hu\gamma4-IL2, fue analizada en una terapia de combinación con una dosis única de paclitaxel. Nuevamente, existió una eficacia mejorada cuando las dos drogas fueron suministradas secuencialmente en ratones que padecían de tumores de piel CT26/KSA.
Ejemplo 9 Terapia de combinación con huKS-mu\gamma2a-muIL12 y un taxano
Con el propósito de analizar si el efecto de la terapia sinergística es específica únicamente para citoquinas con base en IL-2, tratamos tumores voluminosos CT26/KSA establecidos primero con paclitaxel (dosis única de 75 mg/kg) seguido 24 horas después con una cantidad de huKS-mu\gamma2a-muIL12 durante el transcurso de 5 días (5 \mug por día). Esta inmunocitoquina representa una fusión entre la forma múrida del anticuerpo HuKS (esto es, las regiones constantes fueron revertidas a kapa C y gama 2A C de múrido) e IL-12 de múrido. Fue necesario utilizar secuencias de IL-12 de múrido porque, a diferencia de IL-2, esta citoquina es altamente específica para la especie y la forma humana no es muy activa en el ratón. Los resultados muestran que el tratamiento con paclitaxel solo tenía muy poco efecto sobre el crecimiento del tumor. El tratamiento con dosis por debajo del óptimo de huKS-mu\gamma2a-muIL12 tuvo un efecto antitumoral y éste se incrementó en ratones que fueron tratados primero con una dosis única de paclitaxel.
Ejemplo 10 Terapia de combinación con huKS-IL2 y un agente de alquilación
i.
Se demostró también el efecto terapéutico mejorado de la combinación de huKS-IL2 con ciclofosfamida, una droga para quimioterapia en la clase de los agentes de alquilación. Las células de carcinoma de seno 4T1 fueron inyectadas en forma intravenosa en los ratones competentes inmunológicamente para establecer metástasis en el pulmón 3 días después del tratamiento. Los ratones fueron tratados con una dosis única de ciclofosfamida (15, 40 u 80 mg/kg) seguido tres días después con una dosis de huKS-IL2 durante el transcurso de 5 días (15 \mug/día). Aunque las dos dosis más bajas solas causaron únicamente una modesta reducción en el peso del tumor que hizo metástasis en el pulmón, la combinación con huKS-IL2 resultó en una disminución significativamente grande en el peso del tumor comparado con la ciclofosfamida sola (p < 0,05, Figura 9). Sin embargo, con la dosis más alta (80 mg/kg) no ocurre sinergia.
ii.
El efecto terapéutico mejorado de la combinación de huKS-IL2 con ciclofosfamida fue demostrado también en un ensayo de crecimiento de tumor, en ratones competentes inmunológicamente que padecían de tumores subcutáneos establecidos de carcinoma de seno. Los ratones fueron tratados con una dosis única de 80 mg/kg de ciclofosfamida, ya sea sola o en combinación con 5 dosis diarias de huKS-IL2 (30 \mug) 3 días después del tratamiento con ciclofosfamida. Los volúmenes promedio de los tumores para huKS-IL2 y 80 mg/kg de ciclofosfamida sola se redujeron en un 31% y en un 69%, respectivamente (Figura 9B). El tratamiento de combinación redujo los volúmenes promedio de los tumores en un 100% el Día 25 lo cual fue significativamente diferente o bien de huKS-IL2 solo o a la ciclofosfamida sola (p < 0,05) y se eliminaron completamente los tumores en seis de los ocho ratones dice semanas después de iniciado el tratamiento. Los animales toleraron estos tratamientos bien con una perdida observada en peso menor al 10% en todos los grupos.
iii.
El efecto terapéutico mejorado de la combinación de huKS-IL2 con ciclofosfamida fue demostrado también en un ensayo de crecimiento de tumor, en ratones competentes inmunológicamente que padecían de tumores subcutáneos establecidos de carcinoma de pulmón. Los ratones fueron tratados con una dosis única de 80 mg/kg de ciclofosfamida, ya sea sola o en combinación con 5 dosis diarias de huKS-IL2 (20 \mug) 3 días después del tratamiento con ciclofosfamida. Los volúmenes promedio de los tumores para huKS-IL2 y 80 mg/kg de ciclofosfamida sola se redujeron en un 2% y en un 27%, respectivamente (Figura 9C). El tratamiento de combinación redujo los volúmenes promedio de los tumores en un 48% el Día 20 lo cual fue significativamente diferente o bien de huKS-IL2 solo o a la ciclofosfamida sola (p < 0,05). Los animales toleraron estos tratamientos bien con una perdida observada en peso menor al 10% en todos los grupos.
Ejemplo 11 Terapia de combinación con huKS-IL2 y un agente de alquilación
Se demostró el efecto terapéutico mejorado de la combinación de huKS-IL2 con Carboplatina, otro agente quimioterapéutico en la clase de los agentes de alquilación. Los ratones que padecían de tumores subcutáneos establecidos de carcinoma de pulmón de células no pequeñas (LLC/KSA) fueron tratados con Carboplatina (75 mg/kg) el Día 0 seguido tres días después con una dosis de KS-IL2 en el transcurso de 5 días (20 \mug por día). El tratamiento con Carboplatina y con KS-IL2 solos resultó cada uno en una disminución modesta en el crecimiento del tumor, sin embargo, únicamente el tratamiento de combinación redujo significativamente el volumen promedio del tumor el Día 20 (p < 0,05, Figura 10). Además, el crecimiento de tumores en los cuales los ratones fueron tratados con la combinación comparado con el tratamiento con Carboplatina sola fue significativamente diferente (p < 0,05).
La invención puede ser formulada en otras formas específicas sin apartarse del espíritu o características esenciales de la misma. Las modalidades anteriores se consideran por lo tanto en todo sentido, ilustrativas, en vez de limitantes de la invención descrita aquí. El alcance de la invención está indicado por lo tanto por las reivindicaciones anexas en vez de por la descripción anterior, y todos los cambios que surjan dentro del sentido y rango de equivalencia de las reivindicaciones están encaminados a ser abarcados por la misma.
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Referencias citadas en la descripción
Este listado de referencias citado por el solicitante es únicamente para conveniencia del lector. No forma parte del documento europeo de la patente. Aunque se ha tenido gran cuidado en la recopilación, no se pueden excluir los errores o las omisiones y la OEP rechaza toda responsabilidad en este sentido.
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<212>
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<213>
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<220>
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<223> nil
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<400> 1
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"000"
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<210> 2
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<211> 0
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<212>
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<213>
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<220>
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<223> nil
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<400> 2
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"000"
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<210> 3
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<211> 35
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<212> ADN
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<213> secuencia artificial
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<220>
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<223> iniciador sentido para la unión del ADNc gama 2a de ratón de huKS
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 3
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
ccgtctcctc agccaaaaca acagccccat cggtc 
\hfill
35 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 4
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<211> 37
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<212> ADN
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<213> secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> iniciador antisentido para el ADNc gama 2a de huKS
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<400> 4
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\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
ggggctgttg ttttggctga ggagacggtg actgacg 
\hfill
37 
\vskip1.000000\baselineskip
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<210> 5
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<211> 25
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<212> ADN
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<213> secuencia artificial
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<220>
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<223> iniciador sentido que incluye un sitio AfIII
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<400> 5
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\hskip-.1em\dddseqskip
cttaagccag atccagttgg tgcag 
\hfill
25 
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<210> 6
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<211> 27
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<212> ADN
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<213> secuencia artificial
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<220>
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<223> iniciador antisentido que incluye un sitio XmaI
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<400> 6
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cccggggtcc gggagaagct cttagtc 
\hfill
27 
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<212> ADN
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<223> iniciador sentido
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<400> 7
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\vskip0.400000\baselineskip
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ggcccgggta aagcacccac ttcaagctcc 
\hfill
30 
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<212> ADN
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<213> secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
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<223> iniciador antisentido
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 8
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ccctcgagtt attgagggct tgttg 
\hfill
25 
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<211> 32
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<212> ADN
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<213> secuencia artificial
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ggaaataaaa cgggctgatg ctgcaccaac tg 
\hfill
32 
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<212> ADN
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<400> 10
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gcagcatcag cccgttttat ttccagcttg gtcc 
\hfill
34 
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<212> ADN
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<223> iniciador sentido
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cttaagcgag atcgtgctga cccag 
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25 
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<213> secuencia artificial
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<223> iniciador antisentido
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\hskip-.1em\dddseqskip
ctcgagctaa cactcattcc tgttgaagc 
\hfill
29 
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\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
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<213> secuencia artificial
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<220>
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<223> iniciador PCR p35
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ccccgggtag ggtcattcca gtctctgg 
\hfill
28 
\vskip1.000000\baselineskip
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<210> 14
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<213> secuencia artificial
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> iniciador PCR p35
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<400> 14
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\hskip-.1em\dddseqskip
ctcgagtcag gcggagctca gatagc 
\hfill
26 
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<210> 15
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<211> 28
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<212> ADN
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<213> secuencia artificial
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<220>
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<223> iniciador PCR p40
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<400> 15
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tctagaccat gtgtcctcag aagctaac 
\hfill
28 
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<210> 16
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<212> ADN
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<213> secuencia artificial
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> iniciador PCR p40
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<400> 16
\vskip1.000000\baselineskip
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\hskip-.1em\dddseqskip
ctcgagctag gatcggaccc tgcag 
\hfill
25

Claims (11)

1. Un kit de partes adecuado para mediar la destrucción inmunológica de un tumor en un mamífero que comprende
(i)
un primer empaque que contiene una composición que comprende una proteína de fusión anticuerpo-citoquina, y
(ii)
un segundo empaque que contiene una composición que comprende un agente que incrementa la penetración de dicha proteína de fusión con el anticuerpo dentro del tumor; dicho agente se selecciona del grupo que consiste de un agente quimioterapéutico y un agente que daña el ADN,
en donde la composición de dicho segundo empaque es para la administración a dicho mamífero antes que la composición de dicho primer empaque.
2. El kit de partes de acuerdo a la reivindicación 1, en donde la proteína de fusión anticuerpo-citoquina comprende en una dirección desde el terminal amino hacia el terminal carboxilo (a) al sitio de enlazamiento del anticuerpo que contiene una región variable de inmunoglobulina capaz de enlazar a un antígeno en la superficie de la célula, un dominio CH1 de la inmunoglobulina, un dominio CH2 de la inmunoglobulina, y (b) la citoquina.
3. El kit de partes de acuerdo a la reivindicación 2, en donde la proteína de fusión anticuerpo-citoquina comprende además un dominio CH3 interpuesto entre el dominio CH2 y la citoquina.
4. El kit de partes de acuerdo a cualquiera de las reivindicaciones 1-3, en donde la citoquina en dicha proteína de fusión anticuerpo-citoquina se selecciona del grupo que consiste de un factor de necrosis tumoral, una interleuquina, un factor de estimulación de colonias y una linfoquina.
5. El kit de partes de acuerdo a la reivindicación 4, en donde dicha proteína de fusión anticuerpo-citoquina es KS-IL2, en donde KS es anticuerpo KS-1/4 anti-EpCAM humanizado.
6. Un kit de partes de acuerdo a cualquiera de las reivindicaciones 1-5, en donde dicho agente quimioterapéutico es un taxano.
7. Un kit de partes de acuerdo a cualquiera de las reivindicaciones 1-6, en donde la composición de dicho segundo empaque es para administrarla a dicho mamífero entre 4 horas y 4 días antes del tratamiento con la composición de dicho primer empaque.
8. Un kit de partes de acuerdo a la reivindicación 7, en donde la composición de dicho segundo empaque es para administración en dicho mamífero entre 24 horas y 48 horas antes del tratamiento con la composición de dicho primer empaque.
9. Un kit de partes de acuerdo a la reivindicación 8, en donde la composición de dicho segundo empaque es para administración en dicho mamífero 24 horas antes del tratamiento con la composición de dicho primer empaque.
10. El uso de un kit de partes como se define en cualquiera de las reivindicaciones 1-9 para la elaboración de un medicamento para el tratamiento de tumores o metástasis de tumores.
11. El uso de la reivindicación 10, en donde el tumor es un tumor sólido.
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