CZ20032201A3 - A method for identification, isolation and production of antigens to a specific pathogen - Google Patents

Description

Oblast techniky izolace a produkce

Vynález se týká způsobu identifikace, izolace a produkce antigenů ke. specifickému patogenu, stejně tak jako nových antigenů vhodných pro použití ve vakcíně pro daný typ zvířete nebo pro člověka.

Dosavadní stav techniky

Vakcíny mohou zachránit více životů {a zdrojů} než jakékoli jiné lékařské opatření. V důsledku celosvětových vakcinačních programů se incidence mnoha fatálních onemocnění drasticky snížila. Ačkoli toto platí pro celou řadu onemocnění, např. záškrt, černý kašel, spalničky a tetanus, chybí účinné vakcíny pro četná infekční onemocnění zahrnující většinu virových infekcí, jako jsou například HIV, HCV, CMV a mnoho dalších. Chybí také účinné vakcíny pro jiná onemocnění, infekční nebo neinfekční, které si vyžadují životy miliónů pacientů za rok, a která zahrnují malárii nebo nádorová onemocnění. Navíc rychle se objevující baktérie a mikroorganismy rezistentní na antibiotika volají po alternativních léčebných možnostech, kde léčba pomocí vakcín je logickou volbou. Velká potřeba vakcín je nakonec také ilustrována faktem, že infekční onemocnění, spíše než kardiovaskulární choroby nebo nádorová onemocnění nebo zranění, zůstávají nejčastější příčinou úmrtí a neschopnosti na světě.

Několik zavedených vakcín obsahuje živé atenuované organismy, kde existuje riziko reverze na virulentní divoký kmen. obzvláště u imunokompromitovaných hostitelů toto může být život ohrožující komplikací. Vakcíny jsou alternativně podávány jako kombinace antigenů odvozených od patogenů spolu se sloučeninami, které indukují nebo zvyšují imunitní odpověd proti těmto antigenům (tyto sloučeniny jsou běžně nazývány

adjuvantní látky), protože tyto subjednotkové vakcíny sami o sobě nejsou obecně účinné.

Zatímco není pochyb, že výše uvedené vakcíny jsou cennými léčebnými prostředky, je jejich nevýhodou, že v důsledku jejich komplexnosti mohou být vyvolány závažné vedlejší účinky, např. v důsledku reakce k antigenům, které jsou obsaženy ve vakcíně, a které vykazují zkříženou reaktivitu s molekulami exprimovanými buňkami’ očkovaných jedinci. Navíc je obtížné dostát existujícím požadavkům regulačních institucí, např. Světové zdravotnické organizace (World Health Qrganization (WHQ)), Food and Drug Administration (FDA), a jejich evropských protějšků, na přesnou specifikaci preparátů s vakcínamí a mechanismů indukce imunity.

Některé široce používané vakcíny jsou celobuněčné vakcíny (atenuované baktérie nebo víry (např. Bacílus Calmette-Guerin (BCG) (tuberkulóza), spalničky, příušnice, zarděnky, peorální polio vakcína (Sabin), vakcíny na bázi usmrcených baktérií nebo virů (např. černý kašel, inaktívovaná polio vakcína (Salk)), subjednotkové vakcíny (např. Toxoid (Záškrt, Tetanus)), vakcíny na bázi kapsuláního polysacharidu (H. influenzae typ B), vakcíny na bázi kvasničné rekombinantní subjednotky (povrchový protein viru hepatitidy B).

Vakcína může obsahovat celou řadu odlišných antigenů. Příklady antigenů jsou usmrcené organismy, jako jsou například inaktivované viry nebo baktérie, plísně, protozoa nebo dokonce nádorové buňky. Antigeny mohou také obsahovat částí těchto organismů/tkání, proteinů, nebo v jejich nej jednodušší formě peptídy. Antigeny . mohou být také rozpoznávány imunitním systémem ve formě glykosylovaných proteinů nebo peptídů a mohou také být nebo obsahovat polysacharidy nebo lipidy. Použity mohou být krátké peptidy, protože například cytotoxické T-buňky (CTL) rozpoznávají antigeny ve formě krátké sekvence, obvykle peptidů o 8-11 aminokyselinách ve • · spojení s hlavním histokompatibilitním komplexem (MHC). B lymfocyty mohou rozpoznávat lineární epitopy o 4-5 aminokyselinách, stejně tak jako trojrozměrné struktury (konformační epitopy). Aby bylo možno získat trvalou, antigen specifickou imunitní odpověd, musí adjuvantní látky spouštět imunitní kaskády, které nezbytně zahrhují všechny buňky imunitního systému. Adjuvantní látky účinkují, ale jejich způsob účinku není omezen na takzvané antigen předkládající buňky (ABC). Tyto buňky se obvykle jako první setkávají s antigenem(y) a předkládají zpracovaný nebo nemodifikovaný antigen imunitním efektorovým buňkám. Hrát roli mohou i intermediální buňky. V produktivní imunitní odpovědi jsou akivovány pouze efektorové buňky s příslušnou specifioitou. Adjuvantní látky mohou také lokálně zadržovat antigeny a spolu-injikované další faktory. Adjuvantní látky mohou navíc účinkovat jako chemoatraktanty pro jiné imunitní buňky nebo mohou účinkovat lokálně a/nebo systémově jako stimulační látky pro imunitní systém.

Antigen předkládající buňky patří k přirozenému imunitnímu systému, který se vyvinul jako obrana hostitele první linie, který omezuje infekci časně po expozici mikroorganismům. Buňky přirozeného imunitního systému rozpoznávají vzory nebo relativně nespecifické struktury exprimované na svých cílech spíše než sofistikovanější specifické struktury, které jsou rozpoznávány adaptivním imunitním systémem. Příklady buněk přirozeného imunitního systému jsou makrofágy a dendritické buňky, ale také granulocyty (např. neutrofily), přirození zabiječi a další. Na druhou stranu buňky adaptivního imunitního systému rozpoznávají specifické antigenní struktury zahrnující peptidy v případě T lymfocytů a peptidy, stejně tak jako trojrozměrné struktury v případě B lymfocytů. Adaptivní imunitní systém je mnohem specifičtější a sofistikovanější než přirozený imunitní systém a zlepšuje se po opakované expozici danému patogenu/antigenu. Fylogeneticky je přirozený imunitní systém je mnohem starší a může být nalezen už u velmi

primitivních organismů. Přirozený imunitní systém je nicméně kritický během iniciální fáze antigenní expozice, protože navíc k tomu, že buňky přirozeného imunitního systému, t.j. buňky APC, pohlcují patogeny, stimulují také buňky adaptivního imunitního systému a tedy spouštějí specifické imunitní odpovědi vedoucí ke zbavení se vetřelců. Vcelku řečeno, buňky přirozeného imunitního systému a obzvláště APC hrají kritickou roli během indukční fáze imunitní odpovědi z důvodů a) pohlcení infekčních agens prostřednictvím rozpoznávacího systému primitivních vzorů a b) stimulací buněk adaptivního imunitního systému vedoucí ke specifické imunitní odpovědi a paměti vedoucí ke zbavení se invadujících patogenů nebo jiných cílů. Tyto mechanismy mohou být také důležité pro zbavení se nebo pro pohlcení nádorových buněk.

Antigeny používané pro takové vakcíny jsou často vybírány náhodně nebo pro snadnou dostupnost. Existuje požadavek identifikovat účinné antigeny pro daný patogen nebo, přednostně, téměř úplný soubor všech antigenů daného patogenů, které jsou prakticky (klinicky) relevantní. Takové antigeny mohou být přednostními kandidátní antigeny ve vakcíně.

Popis vynálezu

Je proto cílem předkládaného vynálezu vyrovnat se s těmito požadavky a poskytnout způsob, v kterém takové antigeny mohou být poskytnuty, a v kterém může být identifikován daným sérem jako zdrojem protilátky prakticky úplný soubor antigenů, např. daného patogenů. Takový způsob by měl být také vhodný pro rychle se měnící patogeny, u kterých se vyvíjí rychlá rezistence proti běžným lékům nebo vakcínám. Způsob by měl být také aplikovatelný pro identifikaci a izolaci nádorových antigenů, alergenů a autoimunních antigenů.

Proto předkládaný vynález poskytuje způsob identifikace, izolace a produkce antigenů reagujících s hyperimunním sérem, které pocházejí ze specifického patogenů, nádoru, alergenu ze sbírané plazmy protilátkami proti nebo tkáňě nebo hostitele náchylného k autoimunitě, obzvláště ze specifického patogenu, kde řečené antigeny jsou uzpůsobeny pro použití ve vakcíně pro daný typ zvířete nebo pro člověka, a kde řečený způsob je charakterizovaný následujícími kroky:

• poskytnutí přípravku s protilátkou ze sbírané plazmy řečeného daného typu zvířete nebo člověka nebo jednotlivých sér s řečenému specifickému patogenu, nádoru, alergenu nebo tkáni nebo hostiteli náchylnému k autoimunitš, • poskytnutí alespoň jedné expresní knihovny řečeného specifického patogenu, nádoru, alergenu nebo tkáně nebo hostitele náchylného k autoimunitě, • vyhledávání řečené alespoň jedné expresní knihovny řečeným přípravkem s protilátkou, • identifikace antigenů, které se váží v řečeném způsobu k protilátkám v řečeném přípravku s antigenů jednotlivými vyhledávání protilátkou, vyhledávání identifikovaných přípravky s protilátkami z jednotlivých sér od jedinců s protilátkami proti řečenému specifickému patogenu, nádoru, alergenu nebo tkáni nebo hostiteli náchylnému k autoimunitě, identifikace části antigenů reaktivního s hyperimunním sérem řečených identifikovaných antigenů, kteréžto antigeny reaktivní s hyperimunním sérem se váží k relevantní části řečených jednotlivých přípravků protilátky z řečených jednotlivých sér, a volitelně izolaci řečených antigenů reaktivních s hyperimunním sérem a produkci řečených antigenů reaktivních s hyperimunním sérem chemickými nebo rekombinantními způsoby.

Tento způsob je také vhodný obecně pro identifikaci prakticky celého souboru antigenů reaktivních s hyperimunním sérem specifického patogenu s daným sérem jako zdrojem protilátky, • · pokud jsou v programu identifikace patogenu/antigenu za použití způsobu podle předkládaného vynálezu vyhledány alespoň tři odlišné expresní knihovny. Předkládaný vynález se proto také týká způsobu identifikace, izolace a produkce prakticky celého souboru antigenů specifického patogenu reagujících s hyperimunním sérem, kde řečené antigeny jsou upraveny pro použití ve vakcíně pro daný typ zvířete nebo pro člověka, kterýžto způsob je charakterizovaný následujícími kroky:

• poskytnutí přípravku s protilátkou ze sbírané plazmy řečeného daného typu zvířete nebo ze sbírané plazmy člověka nebo jednotlivých sér s protilátkami proti řečenému specifickému patogenu, • poskytnutí řečených alespoň třech expresních knihoven řečeného specifického patogenu, • vyhledávání identifikovaných antigenů jednotlivými přípravky s protilátkami z jednotlivých sér od jedinců s protilátkami proti řečenému specifickému patogenu, • identifikace části antigenu reaktivního s hyperimunním sérem řečených identifikovaných antigenů, kteréžto antigeny reaktivní s hyperimunním sérem se váží k relevantní části řečených jednotlivých přípravků protilátky z řečených jednotlivých sér, • opakování řečených vyhledávacích a identifikačních kroků alespoň jedenkrát, • srovnání identifikovaných antigenů reaktivních s hyperimunním sérem identifikovaných v opakovaných vyhledávacích a identifikačních krocích s antigeny reaktivními s hyperimunním sérem identifikovanými v iniciálních vyhledávacích a identifikačních krocích, • další opakování řečených vyhledávacích a identifikačních kroků, pokud alespoň 5% antigenů reaktivních s hyperimunním sérem bylo identifikováno v opakovaných vyhledávacích a identifikačních krocích pouze až do té doby, než je identifikováno v dalším opakovaném kroku méně než 5 % antigenů reaktivních s hyperimunním sérem pouze k

	7	• ·· ·· · ··· ··· · · · · · · ·· ··· ·· · · · · · • ····· · · ·· ····· ··· · · · · ··· · · ·
získání úplného	souboru	antigenů reaktivních s
hyperimunním sérem	specifického	patogenu, a
• volitelně izolace	řečených	antigenů reaktivních s

hyperimunním sérem a produkci řečených antigenů reaktivních s hyperimunním sérem chemickými nebo rekombinantními způsoby.

Způsob podle předkládaného vynálezu se sestává hlavně ze tří základních částí, zejména 1. identifikace zdrojů hyperimunního séra obsahujících specifické protilátky proti danému patogenu,

2. vyhledávání vhodné expresní knihovny s vhodným přípravkem protilátky, kde jsou vybrány kandidátní antigeny (nebo antigenní fragmenty takových antigenů), a 3. v druhém vyhledávacím kole, kde antigeny reaktivní s hyperimunním sérem jsou identifikovány pomocí jejich schopnosti se vázat k relevantní části jednotlivých přípravků s protilátkou z jednotlivých sér, aby bylo prokázáno, že tyto antigeny jsou prakticky relevantní, a ne pouze reaktivní s hyperimunním sérem, ale také široce imunogenní (t.j. že mnoho jednotlivých sér reaguje s daným antigenem) . S předkládaným způsobem je možné poskytnout soubor antigenů daného patogenu, který je prakticky úplný s ohledem na zvolený patogen a zvolené sérum. Proto je v předkládaném způsobu vyloučeno ovlivnění s ohledem na špatné antigenní kandidáty nebo neúplný soubor antigenů daného patogenu.

Úplnost antigenního souboru daného patogenu ve významu předkládaného vynálezu je samozřejmě závislá na úplnosti expresní knihovny používané v předkládaném způsobu a na kvalitě a množství sesbíraného testovaného séra (počet jednotlivých plazem/sér), obojí s ohledem reprezentovatelnost knihovny a užitečnost expresního systému. Proto jsou přednostní formy předkládaného způsobu charakterizovány tím, že alespoň jedna řečená expresní knihovna je vybrána z ribosomální knihovny, bakteriální povrchové knihovny a proteomu.

Sbírané sérum používané v předkládaném vynálezu by mělo být testováno proti panelu známých antigenních sloučenin daného patogenu, jako jsou například polysacharid, lipidové a bílkovinné složky buněčné stěny, buněčných membrán a cytoplasmy, stejně tak jako vylučovaných produktů. Přednostně jsou používána tři odlišná sbíraná séra: 1. s velmi stabilním protilátkovým repertoárem: normální dospělí jedinci, klinicky zdraví lidé, kteří překonali předchozí setkání s antigenem nebo současní nosiči, např. daného patogenu bez akutního onemocnění a symptomů, 2. s protilátkami indukovanými skutečně přítomností patogenního organismu: pacienti s akutním onemocněním s odlišnou manifestací (např. sepse nebo infekce ran vyvolaná S. aureus, atd.), 3. bez specifických protilátek (jako negativní kontroly): 5-8 měsíční děti, kteří ztratily imunoglobuliny přenesené od matky 5-6 měsíců po narození. Séra musí reagovat se specifickými antigeny mnoha patogenů, aby je bylo možno považovat za hyperimunní pro daný patogen (baktérie, plíseň, parazit nebo jiné), a jako relevantní ve vyhledávacím způsobu podle předkládaného vynálezu.

V programu identifikace antigenu pro identifikaci úplného souboru antigenů podle předkládaného vynálezu je preferováno, aby řečené alespoň tři odlišné expresní knihovny byly alespoň ribosomální zobrazovací knihovna, bakteriální povrchová knihovna a proteom. Bylo pozorováno, že ačkoli všechny expresní knihovny mohou být úplné, nevede použití pouze jedné nebo dvou expresních knihoven v programu identifikace antigenu k získání úplného souboru antigenů v důsledku preferenčních expresních vlastností každé odlišné expresní knihovny. Zatímco je proto možné získat antigeny reaktivní s hyperimunním sérem za použití pouze jedné nebo dvou odlišných expresních knihoven, nevede tento postup v mnoha případech v konečném důsledku k identifikaci úplného souboru antigenů reaktivních s hyperimunním sérem. Samozřejmě termín úplný podle předkládaného vynálezu neindikuje teoretické maximum, ale skutečně prakticky úplnnost, t.j. že alespoň 95% prakticky • · ····· ·· ··· ·· · relevantních antigenů nebo antigenních determinant daného patogenu bylo identifikováno. Praktická relevance je tedy definována výskytem protilátek proti daným antigenům v populaci pacientů.

Podle předkládaného vynálezu také sbíraná séra nebo frakce plazmy nebo jiné sbírané protilátky obsahující tělní tekutiny jsou označovány jako sbíraná plazma.

Příkladu 2) a ^viz Příklad 3) potenciál jmenovaný obsáhnout úplný přístup výhodu

Termín expresní knihovna, jak je používaná v předkládaném vynálezu by měla alespoň umožnit expresi všech potenciálních antigenů, např. všech povrchových proteinů daného patogenu. S expresními knihovnami podle předkládaného vynálezu je poskytnut alespoň jeden soubor potenciálních antigenů daného patogenu, kde tento soubor je přednostně úplný teoretický doplněk (póly-)peptidů kódovaný geonomem patogenu (t.j. genomickými knihovnami, jak je popsáno v exprimovaný buďto v rekombinantním hostiteli nebo in vitro (viz Příklad 4) . Tento soubor potenciálních antigenů může také být přípravkem bílkoviny, v případě extracelulárních patogenů přednostně přípravek bílkoviny obsahující povrchové proteiny řečeného patogenu získané z řečeného patogenu kultivovaného za definovaných fyziologických podmínek (viz Příklad 5) . Zatímco genomický přístup má soubor antigenů, má posledně obsáhnout proteiny v jejich přirozeném stavu, t.j. zahrnujíce například posttranslační modifikace nebo zpracované formy těchto proteinů, které nejsou zřejmé z DNA sekvence. Tyto nebo jakékoli jiné soubory potenciálních antigenů z patogenu, nádoru, alergenu nebo tkáně nebo hostitele náchylného k autoimunitě jsou poté označovány jako expresní knihovna. Expresní knihovny velmi odlišných druhů mohou být použity v souladu s předkládaným vynálezem. Vhodné příklady jsou uvedeny např. v publikaci Ausubel et al., 1994. Obzvláště přednostní jsou expresní knihovny reprezentující genetický soubor patogenu v rekombinantní • · • · · · · formě, jako jsou například in vitro translační techniky, např. ribosomální zobrazení, nebo prokaryotické expresní systémy, např. bakteriální povrchové expresní knihovny nebo takové, které napodobují specifické fyziologické expresní stavy daného patogenu v daném fyziologickém stavu, jako je například proteom.

Ribosomové zobrazení je zavedený způsob v technologii rekombinantní DNA, který je použitelný pro každý specifický patogen v zájmu předkládaného vynálezu (Schaffitzel et al, 1999). Bakteriální povrchové zobrazovací knihovny budou reprezentovány rekombinantní knihovnou bakteriálního hostitele zobrazujícího (celkový) soubor exprimovaných peptidových sekvencí daného patogenu na např. vybraném vnějším membránovém proteinu bakteriální hostitelské membrány (Georgiou et al., 1997). Nehledě k zobrazení peptidových nebo proteinových sekvencí ve vnějším membránovém proteinu, jsou preferovány také jiné bakteriální zobrazovací techniky, jako jsou například bakteriofágové zobrazovací technologie a exprese prostřednictvím exportovaných proteinů jako bakteriální povrchová expresní knihovna (Forrer et al., 1999; Rodí a Makowski, 1993; Georgiou et al., 1997).

Přípravek antigenu pro první kolo vyhledávání ve způsobu podle předkládaného vynálezu může být odvozen z jakéhokoli zdroje obsahujícího protilátky proti danému patogenu. Přednostně, pokud je jako zdroj pro přípravek protilátky používaná sbíraná plazma, je vybrána lidská sbíraná plazma, která zahrnuje plazmu dárců krve, kteří prodělali nebo prodělávají infekci daným patogenem. Ačkoli takový výběr plazmy nebo sbírané plazmy je v principu standardní technologií například v produkci hyperimunoglobulinových přípravků, bylo překvapivé, že tyto technologie mají tyto účinky, jak bylo obzvláště ukázáno pro přednostní formy předkládaného vynálezu.

Expresní knihovny jsou přednostně genomické expresní knihovny • · · daného patogenu, nebo alternativně m-RNA knihovny. Je preferováno, aby tyto genomické nebo m-RNA knihovny byly úplné genomické nebo m-RNA expresní knihovny, což znamená, že obsahují alespoň jedenkrát všechny možné proteiny, peptidy nebo fragmenty peptidů daného patogenu, které jsou exprimovatelné, Genomické expresní knihovny přednostně vykazují alespoň dvojnásobnou redundanci, přednostněji alespoň pětinásobnou, obzvláště alespoň desetinásobnou.

Způsob podle předkládaného vynálezu přednostně zahrnuje vyhledávání alespoň ribosomální zobrazovací knihovny, bakteriální povrchové zobrazovací knihovny a proteomu s přípravkem protilátky, a identifikací antigenů, které se váží k alespoň dvěma, přednostně všem řečeným vyhledáváním protilátek v řečeném přípravku protilátky. Takové antigeny mohou být poté považovány za extrémně vhodné jako hyperimunogenní antigeny bez ohledu na jejich způsob exprese. Alespoň dvě vyhledávání by měla přednostně alespoň obsahovat proteom, protože proteom vždy reprezentuje antigeny jako přirozeně exprimované proteiny včetně posttranslačních modifikací, zpracování, atd., které nejsou zřejmé z DNA sekvence.

o

Způsob podle předkládaného vynálezu může být použit pro jakýkoli daný patogen, Proto jsou přednostní patogeny vybrány ze skupiny of bakteriálních, vírových, fungálních a protozoických patogenů. Způsob podle předkládaného vynálezu je také použitelný na nádorová onemocnění, t.j, pro identifikaci tumor asociovaných antigenů a pro identifikaci alergenů nebo antigenů hrajících roli v autoimunitních onemocněních. Obzvláště rekombinantní způsoby jsou samozřejmě spíše jednoduché pro patogeny mající malý genom nebo poměrně malý počet exprimovaných proteinů (jako jsou například bakteriální nebo virové patogeny) a jsou více komplikované pro komplexní (eukaryotické) organismy mající velké genomy. Takové velké genomické knihovny patogenů ze skupiny vyšších organismů však • · · ·» · ·» · 9 · <· · · ··· · · · ···«· · · * · · ···· ··· ·· · · » · * · · také mohou být dobře analyzovány způsobem podle předkládaného vynálezu, alespoň rychlejším a spolehlivějším způsobem než při použití známých způsobů identifikace vhodných antigenů.

Přednostní patogeny, které mají být analyzovány nebo jejichž antigeny mají být extrahovány, zahrnují virus lidské imunodeficience (HIV), virus hepatitidy A (HAV), virus hepatitidy B (HBV), virus hepatitidy C (HCV), virus Rousova sarkomu (RSV), virus Epstein-Barrové (EBV), virus chřipky (IV), rotavirus (RV), Staphylococcus aureus (S. aureus), Staphylococcus epidermidis (S. epidermidis), Chlamydia pneumoniae (C. pneumoniae), Chlamydia trachomatis (C. trachomatis), Mycobacterium tuberculosis (M. tuberculosis), Mycobacterium leprae (M. leprae), Streptococcus pneumoniae (S. pneumoniae), Streptococcus pyogenes (S. pyogenes), Streptococcus agalactiae (S. agalactiae) , faecalis (E. faecalis), Bacillus anthracis Vibrio cholerae (V. cholerae), Borrelia burgdorferi), Plasmodium sp., plísňová onemocnění, jako jsou například Pneumocystis carinii, Aspergillus sp., Cryptococcus sp., Candida albicans nebo parasitární infekce, jako jsou například ascarióza (Ascaris lumbricoides) a taenióza (Taenia saginata). Způsob podle předkládaného vynálezu je nejlépe použitelný pro baktérie, parazity nebo Candidu.

Enterococcus (B. anthracis), burgdorferi (B.

Jako modelový organismus pro předkládané použití byl zvolen Staphylococcus aureus, aby byla demonstrována použitelnost a účinnost způsobu podle předkládaného vynálezu. Obzvláště s ohledem na příklady provedené vynálezu je jasné, že vynález je snadno použitelný na všechny potenciální patogeny, obzvláště ty, které jsou uvedeny výše.

Překvapivé bylo zjištěno, že způsob podle předkládaného vynálezu umožňuje účinné a rychlé biologické vyhledávání daného patogenu, obzvláště s ohledem na fakt, že pouze malá frakce protilátkového repertoáru pacienta je namířena k danému « · · • · patogenu, dokonce i za stavu, kdy je vyvinuta účinná obrana proti tomuto patogenu. V průběhu předkládaného vynálezu bylo objeveno, obzvláště během provádění příkladu se S.aureus, že pouze 1-2% protilátkového repertoáru pacienta majícího vysoké titry proti S.aureus jsou skutečně protilátky namířené proti S. aureus. Navíc přes 70% této specifické 1% části je namířeno proti non-proteinovým antigenům, jako jsou například teichoová kyselina, takže pouze celkem 0.1% nebo méně protilátek je namířeno proti bílkovinným antigenům.

Jedna z výhod použití rekombinantních expresních knihoven, obzvláště ribosomových zobrazovacích knihoven a bakteriálních povrchových zobrazovacích knihoven spočívá v tom, že identifikované antigeny reaktivní s hyperimunním sérem mohou být okamžitě produkovány expresí kódujících sekvencí vyhledaných a vybraných klonů exprimujících antigeny reaktivní s hyperimunním sérem bez další nezbytné technologie rekombinantní DNA nebo dalších klonovacích kroků.

Antigeny reaktivní s hyperimunním sérem, které je možno získat způsobem podle předkládaného vynálezu, mohou být proto okamžitě připraveny do farmaceutického přípravku, přednostně přidáním farmaceuticky přijatelného nosiče a/nebo excipientní látky, okamžitě po jeho přípravě (v průběhu druhého selekčního kroku), např. expresí z platformy expresní knihovny.

Farmaceutický přípravek obsahující přednostně antigen reaktivní s hyperimunním sérem je vakcína pro prevenci nebo léčbu infekce způsobených specifickým patogenem, pro který byly vybrány antigeny.

Farmaceutický přípravek může obsahovat jakékoli vhodné pomocné látky, jako jsou například pufrující látky, stabilizační látky nebo další aktivní složky, obzvláště složky známé ve spojení s produkcí vakcíny.

Přednostní nosič/nebo excipientní látka pro antigeny reaktivní s hyperimunním sérem podle předkládaného vynálezu je imunostimulační sloučenina pro další stimulaci imunitní odpovědi vůči danému antigenů reaktivnímu s hyperimunním sérem. Imunostimulační sloučenina ve farmaceutickém přípravku podle předkládaného vynálezu je přednostně vybrána ze skupiny polykationických látek, obzvláště polykationickákých peptidů, imunostimulačních deoxynukleotidů, alumn, Freundových úplných adjuvantních látek, Freundových neúplných adjuvantních látek, neuroaktivních sloučenin, obzvláště lidského růstového hormonu, nebo jejich kombinací.

Polykationickáká sloučenina(s), která má bý používaná podle předkládaného vynálezu může být jakákoli polykationická sloučenina, která vykazuje characteristické účinky podle WO 97/30721. Přednostní polykationické sloučeniny jsou vybrány z bázických polypeptidů, organických polykationtů, bázických polyaminokyselin nebo jejich směsí. Tyto polyaminokyseliny by měly mít délku řetězce alespoň 4 aminokyselinová residua (viz: Tuftsin, jak je popsáno v publikaci Goldman et al. (1983)). Obzvláště přednostní jsou látky jako polylysin, polyarginin a polypeptidy obsahující více než 20%, obzvláště více než 50% bázických aminokyselin v rozmezí více než 8, obzvláště více než 20, aminokyselinových residuí nebo jejich směsi. Jiné přednostní polykationty a jejich farmaceutické preparáty jsou popsány ve WO 97/30721 (např. polyetyleneimin) a WO 99/38528. Tyto polypeptidy přednostně obsahují mezi 20 a 500 aminokyselinovými residui, obzvláště mezi 30 a 200 residui.

Tyto polykationické sloučeniny mohou být produkovány chemicky nebo rekombinantně nebo mohou být odvozeny z přirozených zdrojů.

Kationické (póly)peptidy mohou mít také antimikrobiální vlastnosti, jak je shrnuto v publikacích Ganz et al, 1999; Hancock, 1999. Tyto (póly)peptidy mohou být prokaryotického, zvířecího nebo rostlinného původu, nebo mohou být produkovány • · chemicky nebo rekombinantně (Andreu et al., 1998; Ganz et al., 1999; Simmaco et al., 1998). Peptidy mohou také patřit ke třídě defensinů (Ganz, 1999; Ganz-et al., 1999). Sekvence takových peptidů mohou být například nalezeny v Databázi antimikrobiálních sekvencí na následující internetové adrese:

http://www.bbcm.univ.trieste.it/~tossi/paminokyseliny 2.html

Takové hostitelské obranné peptidy nebo defensivní látky jsou také přednostní formou polykationického polymeru podle předkládaného vynálezu. Sloučenina umožňující jako konečný produkt aktivaci (nebo snížení) adaptivního imunitního systému, přednostně zprostředkovaného APC (zahrnujících dendritické buňky) je obecně používaná jako polyckationický polymer.

Obzvláště přednostní pro použití jako polykationická látka v předkládaném vynálezu jsou antimikrobiální peptidy odvozené od cathelicidinu nebo jejich deriváty přihláška PCT/EP01/09529, začleněná obzvláště antimikrobiální peptidy (Mezinárodní patentová zde jako reference), odvozené od savčího cathelicidinu, přednostně humánního, bovinního nebo myšího,

Polykationické sloučeniny odvozené z přirozených zdrojů zahrnují HIV-REV nebo HIV-TAT (odvozené kationické peptidy, antenapediové peptidy, chitosan nebo jiné deriváty chitinu) nebo jiné peptidy odvozené od těchto peptidů nebo proteinů biochemickou nebo rekombinantní produkcí. Jiné přednostní polykationické sloučeniny jsou cathelin nebo příbuzné či odvozené látky z cathelinu. Myší cathelin je například peptid, který má aminokyselinovou sekvenci NH₂RLAGLLRKGGEKIGEKLKKIGOKIKNFFQKLVPQPE-COOH. Příbuzné nebo odvozené látky od cathelinu obsahují celou nebo část sekvence cathelinu sekvence s alespoň 15-20 aminokyselinovými residui. Derivace mohou zahrnovat substituce nebo modifikace přirozených aminokyselin aminokyselinami, které nepatří mezi

standardních aminokyselin. Navíc mohou být do takových cathelinových molekul začleněna další kationická residua. Je preferováno, aby tyto cathelinové molekuly byly zkombinovány s antigenem. Bylo prokázáno, že tyto cathelinové molekuly jsou překvapivě účinné také jako adjuvantní látky pro antigen bez přidání dalších adjuvantních látek. Je proto možné použít takové cathelinové molekuly jako účinné adjuvantní látky v přípravcích vakcín s nebo bez dalších imunoaktivačních látek.

Další přednostní polykationická látka, která můýe být používaná podle předkládaného vynálezu je syntetický peptid obsahující alespoň 2 KLK motivy oddělené spojovací částí 3 až 7 hydrofobními aminokyselinami (Mezinárodní patentová přihláška PCT/EP01/12041, začleněná zde jako reference).

Imunostimulační deoxynukleotidy jsou např. neutrální nebo artificiální DNA obsahující CpG, krátké úseky DNA získané od bezobratlých živočichů nebo ve formě krátkých oligonukleotidů (ODN) obsahující nemetylované cytosine-guanin dinukleotidy (CpG) v určitém kontextu bází (např. Krieg et al., 1995), ale také ODN obsahující inosin (I-ODN), jak je popsáno ve WO 01/93905.

Neuroaktivní sloučeniny, např. kombinované s polykationickými látkami jsou popsány ve WO 01/24822.

Podle přednostní formy jsou jednotlivé přípravky protilátky pro druhé kolo vyhledávání získány od pacientů, kteří prodělali akutní infekci daným patogenem, obzvláště od pacientů, kteří mají titr protilátek k danému patogenu nad určitou minimální hladinu, například titr protilátek nad 80. percentil, přednostně nad 90. percentil, obzvláště nad 95. percentil testovaných humánních (pacienti nebo nosiči) sér. Použití takových vysokých titrů jednotlivých přípravků protilátek v druhém vyhledávacím kole umožňuje velmi selektivní identifikaci antigenů reaktivních s hyperimunním sérem k danému patogenu.

Je důležité, že druhé vyhledávání s jednotlivým přípravkem protilátky (což může být také vybrané sérum) umožňuje selektivní identifikaci antigenů reaktivních s hyperimunním sérem ze všech slibných kandidátů z prvního kola. Proto by mělo být používáno pro identifikaci těchto antigenů v druhém vyhledávacím kole přednostně alespoň 10 jednotlivých přípravků protilátek (t.j. přípravky protilátek (např. séra) od alespoň 10 odlišných jedinců, kteří prodělali infekci zvoleným patogenem). Samozřejmě je možné použít také méně než 10 jednotlivých přípravků, avšak selektivita kroku nemusí být s nízkým počtem jednotlivých přípravků protilátek optimální. Na druhé straně, pokud je daný antigen reaktivní s hyperimunním sérem (nebo jeho antigenní fragment) rozpoznáván v alespoň 10 jednotlivých přípravcích protilátek, přednostně alespoň 30, obzvláště alespoň 50 jednotlivých přípravků protilátek, je identifikace antigenů reaktivního s hyperimunním sérem také dostatečně selektivní pro správnou identifikaci. Reaktivita hyperimunního séra může být samozřejmě testována s tolika jednotlivými přípravky, jak je to možné (např. s více než 100 nebo dokonce s více než 1000).

Proto relevantní část přípravků protilátky reaktivního s hyperimunním sérem podle způsobu předkládaného vynálezu by měla přednostně být alespoň 10, přednostněji alespoň 30, obzvláště alespoň 50 jednotlivých přípravků protilátek. Alternativně (nebo v kombinaci) může být antigen reaktivní s hyperimunním sérem přednostně také identifikován s alespoň 20%, přednostně alespoň 30%, obzvláště alespoň 40% všech jednotlivých přípravků protilátek používaných v druhém vyhledávacím kole.

Podle přednostní formy předkládaného vynálezu, jsou zvolena séra, z kterých jsou připraveny jednotlivé přípravky protilátek pro druhé kolo vyhledávání (nebo, která jsou používaná jako přípravky protilátek), podle jejich titru proti specifickému patogenu (např. proti přípravku tohoto patogenu, jako jsou například lysát, složky buněčné stěny a rekombinantní proteiny). Přednostně jsou některá séra vybrána s celkovým IgA titrem nad 4000 U, obzvláště nad 6000 U, a/nebo IgG titrem nad 10000 U, obzvláště nad 12000 U (U = jednotky, vypočtené z odečetu OD₄₀5nm v daném ředění) , když je použit jako antigen v ELISA testu celý organismus (celkový lysát nebo celé buňky). Jednotlivé proteiny s Ig titry nad 800-1000 U jsou specificky preferovány pro výběr antigenů reaktivních s hyperimunním sérem podle předkládaného vynálezu pouze pro celkový titr. Podmínky pro jednotlivé proteiny mohou být odvozeny z Obr. 9.

Podle demonstračního příkladu, který je také přednostní formou předkládaného vynálezu, je daný patogen Staphylokokový patogen, obzvláště Staphylococcus aureus a Staphylococcus epidermidis. Staphylokoky jsou oportunističtí patogeni, kteří mohou způsobit onemocnění, od nezávazných infekcí až k život ohrožujícím onemocněním. Z velkého počtu Staphylokoků jsou alespoň 3 běžně sdružené s onemocněním člověka: S. aureus, S. epidermidis a vzácně S. saprophyticus (Crossley a Archer, 1997). S. aureus byl použit v průběhu předkládaného vynálezu jako ilustrační příklad způsobu, jak předkládaný vynález účinkuje. Kromě toho je také důležitým organismem s ohledem na své závažné patogenní dopady na .člověka. Staphylokokové infekce jsou zvyšující se hrozbou v nemocnicích po celém světě. Výskyt a onemocnění Staphylokoky mají vztah k širokému používání antibiotik, které indukují a pokračují v indukci rezistence proti mnoha lékům. Z tohoto důvodu se léčba Staphylokokových infekcí nemůže spoléhat pouze na antibiotika. Proto je zoufale potřeba taktické změny v léčbě těchto onemocnění, jejíž cílem je prevence infekce. Indukce vysoce afinitních protilátek opsonizačního a neutralizačního typu vakcinací pomáhá přirozenému imunitnímu systému eliminovat baktérie a toxiny. Toto činí způsob podle předkládaného • · · · · · · ····· · · ·· ····· vynálezu optimálním nástrojem pro identifikaci staphylokokových antigenních proteinů.

Každý člověk je kolonizovaný baktérií S. epidermidis. Normální lokalitou S. epidermidis jsou kůže a sliznice. Hlavními lokalitami většiny patogenních druhů S. aureus, jsou přední nares a perineum. Některé jedinci se stávají trvalými nosiči S. aureus často stejného kmene. Nosičové stádium je klinicky relevantní, protože nosiči, kteří se podrobí chirurgickému zákroku mají více infekcí než non-nosiči. Normální flóra nosu obecně zabraňuje získání nových kmenů. Ke kolonizaci jinými kmeny však může dojít, jsou-li podána antibiotika, která vedou k eliminaci vnímavého nosičového kmene. Protože tato situace se vyskytuje v nemocnicích, mohou být pacienti kolonizováni resistentními nozokomiálními Staphylokoky. Tyto baktérie mají přirozenou adaptovatelnost, která je doplňována širokým a někdy nevhodným použitím antimikrobiálních látek. Proto nemocnice poskytují úrodné prostředí pro vývoj lékové resistence (těsný kontakt mezi nemocnými pacienty, extenzivní používání antimikrobiálních léků, nosokomiální infekce). S. aureus i S. epidermidis se staly rezistentní k mnoha běžně používaným antibiotikům, nejdůležitěji k methicilinu (MRSA) a vankomycinu (VISA) . Léková rezistence se stává čím dál důležitějším problémem veřejného zdraví a brzy se může mnoho infekcí způsobených Staphylokoky stát neléčitelnými antibiotiky. Navíc k nežádoucím účinkům na veřejné zdraví se antimikrobiální rezistence podílí na vyšších nákladech na zdravotní péči, protože léčba rezistentní infekce často vyžaduje použití toxičtějších a dražších léků a může vést k delšímu pobytu infikovaných pacientů v nemocnici.

Navíc dokonce s pomocí účinných antibiotik má většina závažných stafylokokových infekcí 30-50% mortalitu.

Staphylokoky se stávají potenciálně patogenními, jakmile dojde k narušení přirozené rovnováhy mezi mikroorganismy a imunitním systémem, jsou-li porušeny přirozené barriéry (kůže, sliznice). Koaguláza-pozitivní S. aureus je nejpatogennějším stafylokokovým druhem, kterého se obávají chirurgové již dlouhou dobu. Nej častěji způsobuje infekce chirurgických ran a vyvolává tvorbu abscesů. Tato lokální infekce se může stát systémovou, způsobujíce bakteriémii a sepsi. Obzvláště po virových infekcích a u starších jedinců mohou způsobit závažné pneumonie. S. aureus je také častou příčinou infekcí sdružených s lékařskými instrumenty, jako jsou například intravaskulární a perkutánní katétry (endokarditis, sepse, peritonitis), protézy (septická arthritis, osteomyelitis). S. epidermidis způsobuje onemocnění většinou ve vztahu k přítomnosti cizího tělesa a používání instrumentů, jako jsou například katétrové infekce, infekce v důsledku shuntu cerebrospinální tekutiny, peritonitis u dialyzovaných pacientů (zejména CAPD), endokarditis u jedinců s umělými chlopněmi. Typickým příkladem jsou imunokompromitovaní jedinci, jako jsou například onkologičtí pacienti a předčasně narození novorozenci, u kterých se často vyskytuje koaguláza-negativní stafylokoková infekce ve spojení s použitím intravaskulárních zařízení. Zvýšení incidence má vztah ke zvýšenému používaní těchto zařízení a zvýšenému počtu imunokompromitovaných pacientů.

Mnohem méně je známo o S. saprophyticus, dalším koagulázanegativním Staphylokoku, který způsobuje akutní infekci močového traktu u dříve zdravých lidí. S několika výjimkami se jedná o ženy ve věku 16-25 roků.

Patogeneze Staphylokoků je multifaktoriální. Aby mohlo dojít k zahájení infekce, musí patogen získat přístup do buněk a tkání hostitele, ke kterému je adherován. S. aureus exprimuje povrchové proteiny, které podporují připevnění hostitelských proteinů, jako jsou například laminin, fibronektin, elastin, vitronektin, fibrinogen a mnoho jiných molekul, které tvoří část extracelulární matrix (proteiny vázající extracelulární • · matrix, ECMBP). S. epidermidis je vybaven buněčnými povrchovými molekulami, které podporují adherenci k cizímu materiálu a tímto mechanismem způsobují infekci hostitele. Další mocné zbraně, které stafylokokové používají, jsou sekretované produkty, jako jsou například enterotoxiny, exotoxiny a enzymy poškozující tkáň. Toxiny zabíjejí nebo špatně navádějí imunitní buňky, které jsou důležité při obraně hostitele. Za většinu symptomů během infekce je zodpovědno několik odlišných typů toxinů.

Obrana hstitele proti S. aureus závisí zejména na přirozených imunologických mechanismech. Kůže a sliznice jsou imponujícími bariérami proti invazi stafylokoků. Jakmile je však kůže nebo sliznice narušena (rány, perkutánní katétry, atd.), první linie neadaptivní buněčné obrany začíná koordinovat svoje působení prostřednictvím komplementu a fagocytů, obzvláště polymorfonukleárních leukocytů (PMN). Tyto buňky mohou být považovány základ pro eliminaci invadujících baktérií. Protože stafylokoky jsou primárně extracelulárními patogeny, přichází hlavní antistafylokoková adaptivní odpověd z humorální větve imunitního systému a je zprostředkována prostřednictvím třech hlavních mechanismů: podpora opsonizace, neutralizace toxinů a inhibice adherence. Je věřeno, že opsonizace je obzvláště důležitá zejména pro účinnou fágocytózu. Pro účinnou opsonizaci musí být mikrobiální povrch potažen protilátkami a faktory komplementu pro rozpoznání PMN prostřednictvím receptoru k Fc fragmentu IgG molekuly nebo aktivovanému C3b. Po opsonizaci jsou stafylokoky fagocytovány a usmrceny. Navíc se může S. aureus připevnit k endoteliálním buňkám a být internalizován procesem podobným fagocytóze. Protilátky navázané ke specifickým antigenům na buněčném povrchu baktérie slouží jako ligandy pro připevnění PMN a podporují fágocytózu. Je předpokládáno, že velmi podobné protilátky navázané k adhesinům a jiným buněčným povrchovým proteinům neutralizují adhezi a zabraňují kolonizaci.

• · · · • ·

Existuje málo klinických důkazů, že buněčná imunita má významný podíl v obraně proti stafylokokům, nicméně musí být přiznáno, že tato otázka nebyla ještě adekvátně zodpovězena. Je však známo, že Staphylococcus aureus využívá velkou řadu protiopatření, aby manipuloval obranným molekulárních mikroproštředím infikovaného hostitele pomoci sekrece polypeptidů označovaných jako superantigeny, které zasahují multireceptorovou komunikací mezi T lymfocytmi a buňkami předkládajícími antígen, což je zásadní pro iniciaci patogenspecifické imunitní odpovědi. Superantigeny hrají kritickou úlohu u syndromu toxického šoku a potravinových otrav, ačkoli jejich funkce v rutinních infekcích není ještě dobře pochopena. Navíc nelze pčekávat dlouhotrvající protilátkovou (paměťovou) odpověd bez T-buněk. Je také známo, že většina antistafylokokových protilátek je proti antigenům nezávislým na T lymfocytech (kapsulární polysacharídy, lipoteichoiová kyselina, peptidoglykan) bez paměťové funkce. Na T lymfocytech závislé bílkovinné antigeny mohou vyvolat dlouhodobou protektivní protilátkovou odpověd. Tyto stafylokokové proteiny a peptidy nebyly ještě určeny.

Pro všechny tyto výše zmíněné důvody je na válečném poli proti stafylokokovým infekcím velmi potřeba taktické změny. Jeden způsob potlačení infekce je prevence aktivní imunizací. Vývoj vakcíny S. aureus byl zahájen několika výzkumnými skupinami a národními institucemi po celém světě, ale dosud nebyla schválena žádná účinná vakcína. Bylo prokázáno, že protilátkový deficit se spolupodílí na přetrvávání stafylokokové infekce, což naznačuje, že antistafylokokové protilátky jsou důležité v obraně hostitele. Protilátky, přidané jako pasivní imunizace nebo indukované aktivní vakcinací, namířené na bakteriální adherenci fagocytózu. Vakcína fibronectin indukuje dobytka a naznačuje, povrchové komponenty by mohly zabránit i neutralizovat toxiny a podporovat založená na vazebném proteinu pro protektivní imunitu proti mastítís u že tento přístup bude pravděpodobně

• · · · · účinkovat i u člověka (refs), Dohromady vzato je sugestivní, že účinná vakcína by měla být tvořena proteiny nebo polypeptidy, které jsou exprimované všemi kmeny, a které jsou schopné indukovat v nadbytku vysoce afinltní protilátky proti buněčným povrchovým komponentám S, aureus. Protilátky by měly být igGl a/nebo i'gG3 pro opsonizaci, a jakéhokoli IgG subtypu a IgA pro neutralizaci adherence a účinku toxinu. Chemicky definovaná vakcína musí být určitě nadřazená ceiobuněčným vakcínám (atenuovaným nebo s usmrcenými baktériemi), protože složky S. aureus, které paralyzují TH buňky (superantigeny) nebo inhibují opsonizaci (protein A), mohou být eliminovány a mohou být vybrány jednotlivé proteiny indukující protektivní protilátky. Identifikace relevantních antigenů pomáhá generovat účinnou pasivní imunizaci (léčba humanizovanými monoklonálními protilátkami), která může nahradit podávání lidského imunoglobulinu se všemi nebezpečnými vedlejšími účinky. Neonatální stafylokoková infekce, závažné septikémie a jiná život ohrožující akutní onemocnění jsou primárním cílem pasivní imunizace. Účinná vakcína nabízí velký potenciál obecně pro pacienty čekající na elektivní chirurgický výkon, a obzvláště pro pacienty, kteří se podrobí implantaci endovaskulárních zařízení. Navíc pacienti trpící chronickým onemocněním, které snižuje imunitní odpověď, nebo kteří jsou léčeni kontinuální ambulantní peritoneální dialýzou budou mít pravděpodobně z takové vakcíny prospěch.

Pro ilustrativní příklad týkající se baktérie Staphylococcus aureus byly paralelně použity tři odlišné přístupy. Všechny tři tyto způsoby jsou založeny na interakci stafylokokových proteinů nebo peptidů s protilátkami přítomných v lidském séru ve shodě se způsobem podle předkládaného vynálezu. Tato interakce závisí na rozpoznání epitopů proteinů, které mohou být krátkými peptidy (lineární epitopy) nebo polypeptidovými doménami (strukturální epitopy). Antigenní proteiny jsou identifikovány odlišnými způsoby za použití sbíraných předem vybraných sér a - v druhém vyhledávacím kole - jednotlivými • · vybranými séry.

V důsledku vysoké propustnosti vyhledávání, jsou vybrané antigenní proteiny exprimované jako rekombinantní proteiny nebo in vitro přepsané produkty (v případě, že nemohou být exprimovány v prokaryotických expresních systémech), a testovány v sérii ELISA a Western blotingových testů pro posouzení imunogenicity s velkým množstvím lidského séra (> 100 neinfikovaných, > 50 sér pacientů). Přednostní antigeny jsou umístěny na buněčném povrchu nebo sekretovány, takže jsou přístupné extracelulárně. Je předpokládáno, že protilátky proti proteinům buněčné stěny (jako jsou například proteiny vázající extracelulární matrix) slouží dvojímu účelu: k inhibici adheze a podporování fagocytózy. Protilátky proti sekretovaným proteinům jsou prospěšné pro neutralizaci toxinů. Je také známo, že baktérie komunikují mezi sebou prostřednictvím sekretovaných proteinů. Neutralizující protilátky proti těmto proteinům přeruší komunikaci podporující růst mezi stafylokokovými druhy. Bylo prokázáno, že bioinformatika (signální sekvence, lokalizační signály na buněčné stěně, transmembránové domény) je velmi užitečná pro posouzení lokalizace nebo sekrece buněčného povrchu. Experimentální přístup zahrnuje izolaci protilátek s odpovídajícími epitopy a proteiny z lidského séra, a jejich použití jako činidel v následujících testech: barvení buněčného povrchu stafylokoků kultivovaných za odlišných podmínek (FACS, mikroskopie), určení neutralizační kapacity (toxin, adherence) a podpora opsonizace a fagocytózy (test in vitro fagocytózy).

Rozpoznání lineárních epitopů protilátkami může být. založeno na sekvencích krátkých jen 4-5 aminokyselin. Toto samozřejmě neznamená, že tyto krátké peptidy jsou schopné indukovat dané protilátky in vivo. Z tohoto důvodu definované epitopy, polypeptidy a proteiny mohou být dále testovány na zvířatech (hlavně na myších) pro jejich kapacitu indukovat protilátky proti vybraným proteinům in vivo. Antigeny s prokázanou schopností indukovat protilátky budou testovány na zvířecích modelech pro schopnost zabránit infekci.

Protilátky produkované proti Staphylokokům lidským imunitním systémem a přítomné v lidském séru ukazují na in vivo expresi antigenních proteinů a jejich imunogenicitu.

Proto bylo možné způsobem podle předkládaného vynálezu získat nové antigeny reaktivní s hyperimunním sérem ze Staphylococcus aureus nebo Staphylococcus epidermidis. Podle dalšího aspektu předkládaného vynálezu se vynález týká antigenu reaktivního s hyperimunním sérem vybraným ze skupiny obsahující sekvence uvedené v jakékoli z Tabulek 2a, 2b, 2c, 2d, 3, 4 a 5, obzvláště vybraným ze skupiny obsahující ze Sekv. ID č. 56,

57,	59,	60	' 67,	70,	72,	73, 74, 75,	76,	77, 78, 79, 80, 81,
82,	85,	87	, 88,	89,	90,	92, 95, 96.	, 91,	99, 100, 101, 102,
103,	104	r	106,	108,	110,	112, 114,	116,	118, 120, 122, 126,
128,	132	r	134,	138,	140	, 142, 151,	152,	154, 155 a jejich

hyperimunní fragmenty. Proto se předkládaný vynález také týká antigenu reaktivního s hyperimunním sérem, který je možno získat způsobem podle předkládaného vynálezu, a který je vybrán ze skupiny obsahující sekvence uvedené v jakékoli z Tabulek 2a, 2b, 2c, 2d, 3, 4 a 5, obzvláště vybrán ze skupiny obsahující Sekv. ID č. 56, 57, 59, 60, 67, 70, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 85, 87, 88, 89, 90, 92, 95, 96, 97, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 106, 108, 110, 112, 114, 116, 118, 120, 122, 126, 128, 132, 134, 138, 140, 142, 151, 152,

154, 155 a jejich hyperimunní fragmenty.

Antigeny ze Staphylococcus aureus a Staphylococcus epidermidis byly extrahovány způsobem podle předkládaného vynálezu, které mohou být použity ve výrobě farmaceutického přípravku, obzvláště pro výrobu vakcíny proti infekcím způsobeným baktériemi Staphylococcus aureus a Staphylococcus epidermidis. Příklady takových antigenu reaktivních s hyperimunním sérem

Staphylococcus aureus a Staphylococcus epidermidis, které mohou být použity ve farmaceutickém přípravku, jsou vybrány ze skupiny obsahující sekvence uvedené v jakékoli z Tabulek 2a, 2b, 2c, 2d, 3, 4 a 5, obzvláště vybrány ze skupiny obsahující

Sekv	. ID ě. 55, 56,	57,	58, 59, 60, 62,	66, 67, 70	, 71, 72,
73,	74, 75, 76, 77,	78,	79, 80, 81, 82,	83, 84, 85	, 87, 88,
89,	90, 92, 94, 95,	96,	97, 99, 100, 101,	102, 103,	104, 106,
108,	110, 112, 114,	116	, 118, 120, 122,	126, 128,	130, 132,
134,	138, 140, 142,	151, 152, 154,	155, 158	a jejich

hyperimunní fragmenty pro výrobu obzvláště pro výrobu vakcíny baktériemi Staphylococcus aureus a farmaceutického přípravku, proti inkekci způsobené

Staphylococcus epidermidis.

Hyperimunní fragment je definován jako fragment identifikovaného antigenů, který je sám o sobě antigenní nebo může být antigenní, je-li poskytnut jako hapten. Proto také antigen nebo antigenní fragmenty vykazující jednu nebo (pro delší fragmenty) pouze několik aminokyselinových záměn jsou ve shodě s předkládaným vynálezem za předpokladu, že antigenní kapacity takových fragmentů s aminokyselinovými záměnami nejsou záměnou(ami) závažněji porušeny, t.j. jsou vhodné pro vyvolání příslušné imunitní odpovědi u jedince vakcinovaného tímto antigenem a identifikované jednotlivým přípravkem protilátek z jednotlivých sér.

Přednostní příklady takpvýh hyperimunních fragmentů antigenů reaktivních s hyperimunním sérem jsou vybrány ze skupiny obsahující peptidy obsahujícími aminokyselinové sekvence ve sloupcích predikované imunogenní aminokyseliny, Umístění identifikované imunogenní oblasti a Sérová reaktivita s relevantní oblastí z Tabulek 2a, 2b, 2c a 2d a aminokyselinové sekvence ve sloupcích Domnělé antigenní povrchové oblasti z Tabulek 4 a 5, obzvláště peptidy obsahující aminokyseliny č. aminokyseliny 12-29, 34-40, 63-71, 101-110, 114-122, 130-138, 140-195, 197-209, 215-229, 239-253, 255-274 a 39-94 ze Sekv. ID ě. 55, • · aminokyseliny 5-39, 111-117, 125-132, 134-141, 167-191, 196202, 214-232, 236-241, 244-249, 292-297, 319-328, 336-341, 365-380, 385-391, 407-416, 420-429, 435-441, 452-461, 477-488, 491-498, 518-532, 545-556, 569-576, 581-587, 595-602, 604-609, 617-640, 643-651, 702-715, 723-731, 786-793, 805-811, 826-839, 874-889, 37-49-, 63-77 a 274-334, ze Sekv, ID č.56, aminokyseliny 28-55, 82-100, 105-111, 125-131, 137-143, 1-49, ze Sekv, ID č. 57, aminokyseliny 33-43, 45-51, 57-63, 65-72, 80-96, 99-110, 123129, 161-171, 173-179, 185-191, 193-200, 208-224, 227-246, 252-258, 294-308, C 321-329, 344-352, 691-707, 358-411 a 588606, ze Sekv, ID č. 58, aminokyseliny 16-38, 71-77, 87-94, 105-112, 124-144, 158-164, 169-177, 180-186, 194-204, 221-228, 236-245, 250-267, 336-343, 363-378, 385-394, 406-412, 423-440, 443-449, 401-494, ze Sekv. ID «5. 59, aminokyseliny 18-23, 42-55, 69-77, 85-98, 129-136, 182-188, 214-220, 229-235, 242-248, 251-258, 281-292, 309-316, 333-343, 348-354, 361367, 393-407, 441-447, 481-488, 493-505, 510-515, 517-527, 530-535, 540-549, 564-583, 593-599, 608-621, 636-645, 656-670, 674-687, 697-708, 726-734, 755-760, 765-772, 785-792, 798-815, 819-824, 826-838, 846-852, 889-904, 907-913, 932-939, 956-964, 982-1000, 1008-1015, 1017-1024, 1028-1034, 1059-1065, 1078-1084, 1122-1129, 1134-1143, 1180-1186, 1188-1194, 12051215, 1224-1230, 1276-1283, 1333-1339, 1377-1382, 1415-1421,

1448-1459, 1467-1472, 1537-1545, 1556-1566, 1647-1654, 16661675, 1683-1689, 1722-1737, 1740-1754, 1756-1762, 1764-1773, 1775-1783, 1800-1809, 1811-1819, 1839-1851, 1859-1866, 18761882, 1930-1939, 1947-1954, 1978-1985, 1999-2007, 2015-2029, 2080-2086, 2094-2100, 2112-2118, 2196-2205, 2232-2243, 198258, 646-727 a 2104-2206, ze Sekv, ID č. 60, aminokyseliny 10-29, 46-56, 63-74, 83-105, 107-114, 138-145, 170-184, 186-193, 216-221, 242-248, 277-289, 303-311, 346-360, 379-389, 422-428, 446-453, 459-469, 479-489, 496-501, 83-156, ze Sekv. ID č, 62, aminokyseliny 14-22, 32-40, 52-58, 61-77, 81-93, 111-117, 12428 * ·· ·· · · · · • · · · · ··· » · · • ····· · · ·» * · · · · ····· ·· ··· ·· ·

138, 151-190, 193-214, 224-244, 253-277, 287-295, 307-324,

326-332, 348-355, 357-362,	384-394,	397-434,	437-460,	489-496,
503-510, 516-522, 528-539,	541-547,	552-558,	563-573,	589-595,
602-624, 626-632, 651-667,	673-689,	694-706,	712-739,	756-790,
403-462, ze Sekv. ID č. 66,
aminokyseliny 49-56, 62-68	, 83-89,	92-98, 10.9-115,	124-131,
142-159, 161-167, 169-175,	177-188,	196-224,	230-243,	246-252,
34-46, ze Sekv. ID č. 67,
aminokyseliny 11-20, 26-41	\ 69-75,	84-92,	102-109,	119-136,
139-147, 160-170, 178-185,	190-196,	208-215,	225-233,	245-250,
265-272, 277-284, 300-306,	346-357,	373-379,	384-390,	429-435,
471-481, 502-507, 536-561,.	,663-688,	791-816,	905-910,	919-933,
977-985, 1001-1010, 1052-	1057, 1070-1077,	1082-1087	', 1094-
1112, 493-587, 633-715 a 704-760, ze	Sekv. ID	Č.70,
aminokyseliny 6-20, 53-63,	83-90,	135-146,	195-208,	244-259,
263-314, 319-327, 337-349,	353-362,	365-374,	380-390,	397-405,
407-415, 208-287 a 286-314,	ze Sekv.	ID č, 71	t
aminokyseliny 10-26, 31-43	, 46-58,	61-66, 69-79, 85-	92, 100-
115, 120-126, 128-135, 149-155, 167-173,	178-187,	189-196,
202-222, 225-231, 233-240,	245-251,	257-263,	271-292,	314-322,
325-334, 339-345, 59-74, ze	Sekv. ID	č. 72,
aminokyseliny 4-9, 15-26,	65-76, :	108-115,	119-128,	144-153,
38-52 a 66-114, ze Sekv. ID	Č. 73,
aminokyseliny 5-22, 42-50,	74-81,	139-145,	167-178,	220-230,
246-253, 255-264, 137-237 a	250-267,	ze Sekv.	ID č, 74,
aminokyseliny 10-26, 31-44	, 60-66,	99-104,	146-153,	163-169,
197-205, 216-223, 226-238,	241-258,	271-280,	295-315,	346-351,
371-385, 396-407, 440-446,	452-457,	460-466,	492-510,	537-543,
546-551, 565-582, 590-595,	635-650,	672-678,	686-701,	705-712,
714-721, 725-731, 762-768,	800-805,	672-727	, ze Seky	y ID č.
75,
aminokyseliny 5-32, 35-48,	55-76, ze	Sekv. ID	č. 76,
aminokyseliny 7-35, 54-59,	247-261,	263-272,	302-320,	330-339,
368-374, 382- 411, 126-143	a 168-186	, ze Sekv	. ID č. 77	t
aminokyseliny 5-24, 88-94,	102-113,	132-143,	163-173,	216-224,
254-269, 273-278, 305-313,	321-327,	334-341,	31-61 a 58-74, ze

• · » * » · • * · ·

Sekv. ID č. 78, aminokyseliny 16-24, 32-39, 43-49, 64-71, 93-99, 126-141, 144156, 210-218, 226-233, 265-273, 276-284, 158-220, ze Sekv. ID č, 79, aminokyseliny 49-72, 76-83, 95-105, 135-146, 148-164, 183-205, 57-128, ze Sekv. ID č. 80, aminokyseliny 6-15, 22-32, 58-73, 82-88, 97-109, 120-131, 134140, 151-163, 179-185, 219-230, 242-255, 271-277, 288-293,

305-319, 345-356, 368-381, 397-406, 408-420, 427-437, 448-454,

473-482, 498-505, 529-535, 550-563, 573-580, 582-590, 600-605,

618-627, 677-685, 718-725, 729-735, 744-759, 773-784, 789-794,

820-837, 902-908, 916-921, 929-935, 949-955, 1001-1008, 10261032, 1074-1083, 1088-1094, 1108-1117, 1137-1142, 1159-1177,

1183-1194, 1214-1220, 1236-1252, 1261-1269, 1289-1294, 13111329, 1336-1341, 1406-1413, 1419-1432, 1437-1457, 1464-1503,

1519-1525, 1531-1537, 1539-1557, 1560-1567, 1611-1618, 16201629, 1697-1704, 1712-1719, 1726-1736, 1781-1786, 1797-1817,

1848-1854, 1879-1890, 1919-1925, 1946-1953, 1974-1979, 5 až

134, ze Sekv. ID č, 81, aminokyseliny 6-33, 40-46, 51-59, 61-77, 84-104, 112-118, 124187, 194-248, 252-296, 308-325, 327-361, 367-393, 396-437,

452-479, 484-520,	535-545,	558-574, 582-614,	627-633,	656-663,
671-678, 698-704,	713-722,	725-742, 744-755,	770-784,	786-800,
816-822, 827-837,	483-511,	ze Sekv, ID č, 82,
aminokyseliny 4-19, 57-70,	79-88, 126-132,	144-159,	161-167,
180-198, 200-212,	233-240,	248-255, 276-286,	298-304,	309-323,
332-346, 357-366,	374-391,	394-406, 450-456,	466-473,	479-487,
498-505, 507-519,	521-530,	532-540, 555-565,	571-581,	600-611,
619-625, 634-642,	650-656,	658-665, 676-682,	690-699,	724-733,
740-771, 774-784,	791-797,	808-815; 821-828,	832-838,	876-881,
893-906, 922-929,	938-943,	948-953, 969-976,	1002-1008, 1015-
1035, 1056-1069,	1105-1116	, 1124-1135, 1144	-1151, 1173-1181,

1186-1191, 1206-1215, 1225-1230, 1235-1242, 6-66, 65-124 a

590-604, ze Sekv, ID č, 83, aminokyseliny 5-32, 66-72, 87-98, 104-112, 116-124, 128-137,

162-168, 174-183, 248-254, 261-266, 289-303, 3.12-331, 17430

249, ze Sekv. ID č. 84, aminokyseliny 4-21, 28-40, 45-52, 59-71, 92-107, 123-137, 159174, 190-202, 220-229, 232-241, 282-296, 302-308, 312-331, 21118, ze Sekv. ID č. 85, aminokyseliny 9-28, 43-48, 56-75, 109-126, 128-141, 143-162,

164-195, 197-216, 234-242, 244-251, 168-181, ze Sekv. ID č.

87, aminokyseliny 4-10, 20-42, 50-86, 88-98, 102-171, 176-182,

189-221, 223-244, 246-268, 276-284, 296-329, 112-188, ze Sekv. ID č, 88, aminokyseliny 4-9, 13-24, 26-34, 37-43, 45-51, 59-73, 90-96,

99-113, 160-173, 178-184, 218-228, 233-238, 255-262, 45-105,

103-166 a 66-153, ze Sekv. ID č, 89, aminokyseliny 13-27, 42-63, 107-191, 198-215, 218-225, 233250, 474-367, ze Sekv. ID č. 90;

aminokyseliny 26-53, 95-123, 164-176, 189-199, 8^Λ-48, ze Sekv, ID č. 92, aminokyseliny 7-13, 15-23, 26-33, 68-81, 84-90, 106-117, 129137, 140-159, 165-172, 177-230, 234-240, 258-278, 295-319, 2256, 23-99, 97-115, 233-250 a 245-265, ze Sekv. ID č. 94, aminokyseliny 13-36, 40-49, 111-118, 134-140, 159-164, 173183, 208-220, 232-241, 245-254, 262-271, 280-286, 295-301,

303-310, 319-324, 332-339, 1-85, 54-121 a 103-185, ze Sekv. ID č. 95, aminokyseliny 39-44, 46-80, 92-98, 105-113, 118-123, 133-165,

176-208, 226-238, 240-255, 279-285, 298-330, 338-345, 350-357,

365-372, 397-402, 409-415, 465-473, 488-515, 517-535, 542-550,

554-590, 593-601, 603-620, 627-653, 660-665, 674-687, 698-718,

726-739, 386-402, ze Sekv. ID č. 96, aminokyseliny 5-32, 34-49, 1-43, ze Sekv. ID č. 97, aminokyseliny 10-27, 37-56, 64-99, 106-119, 121-136, 139-145,

148-178, 190-216, 225-249, 251-276, 292-297, 312-321, 332-399, 403-458, 183-200, ze Sekv. ID č. 99, aminokyseliny 5-12, 15-20, 43-49, 94-106, 110-116, 119-128,

153-163, 175-180, 185-191, 198-209, 244-252, 254-264, 266-273, 280-288, 290-297, 63-126, ze Sekv. ID č. 100, aminokyseliny 5-44, 47-55, 62-68, 70-78, 93-100, 128-151, 166171, 176-308, 1-59, ze Sekv. ID č. 101, aminokyseliny 18-28, 36-49, 56-62, 67-84, 86-95, 102-153,

180r-195, 198-218, 254-280, 284-296, 301-325, 327-348, 353390, 397-402, 407-414, 431-455, 328-394, ze Sekv. ID č, 102, aminokyseliny 7-37, 56-71, 74-150, 155-162, 183-203, 211-222, 224-234, 242-272, 77-128, ze Sekv. ID č. 103, aminokyseliny 34-58, 63-69, 74-86, 92-101, 130-138, 142-150,

158-191, 199-207, 210-221, 234-249, 252-271, 5-48, ze Sekv. ID č. 104, aminokyseliny 12-36, 43-50, 58-65, 73-78, 80-87, 108-139, 147153, 159-172, 190-203, 211-216, 224-232, 234-246, 256-261, 273-279, 286-293, 299-306, 340-346, 354-366, 167-181, ze Sekv. ID č, 106, aminokyseliny 61-75, 82-87, 97-104, 113-123, 128-133, 203-216, 224-229, 236-246, 251-258, 271-286, 288-294, 301-310, 316-329, 337-346, 348-371, 394-406, 418-435, 440-452 ze Sekv. ID č. 112, aminokyseliny 30-37, 44-55, 83-91,.101-118, 121-128, 136-149, 175-183, 185-193, 206-212, 222-229, 235-242 ze Sekv. ID č, 114, aminokyseliny 28-38, 76-91, 102-109, 118-141, 146-153, 155161, 165-179, 186-202, 215-221, 234-249, 262-269, 276-282,

289-302, 306-314, 321-326, 338-345, 360-369, 385-391 ze Sekv. ID č. 116, aminokyseliny 9-33, 56-62,75-84, 99-105, 122-127, 163-180,

186-192, 206-228, 233-240, 254-262, 275-283, 289-296, 322-330, 348-355, 416-424, 426-438, 441-452, 484-491, 522-528, 541-549, 563-569, 578-584, 624-641, 527-544, ze Sekv. ID č- 142, aminokyseliny 37-42, 57-62, .121-135, 139-145, 183-190, 204212, 220-227, 242-248, 278-288, 295-30, 304-309, 335-341, 396404, 412-433, 443-449, 497-503, 505-513, 539-545, 552-558,

601-617, 629-649, 702-711, 736-745, 793-804, 814-829, 843-858, 864-885, 889-895, 905-913, 919-929, 937-943, 957-965, 970-986, 990-1030, 1038-1049, 1063-1072, 1080-1091, 1093-1116, 11261136, 1145-1157, 1163-1171, 1177-1183, 1189-1196, 1211-1218,

1225-1235, 1242-1256, 1261-1269, 624-684, ze Sekv. ID č. 151, aminokyseliny 8-23, 31-38, 42-49, 61-77, 83-90, 99-108, 110119, 140-147, 149-155, 159-171, 180-185, 189-209, 228-234,

245-262, 264-275, 280-302, 304-330, 343-360, 391-409, 432-437,

454-463, 467-474, 478-485, 515-528, 532-539, 553-567, 569-581,

586-592, 605-612, 627-635, 639-656, 671-682, 700-714, 731-747,

754-770, 775-791, 797-834, 838-848, 872-891, 927-933, 935-942,

948-968, 976-986, 1000-1007, 1029-1037, 630-700, ze Sekv. ID

Č. 152, aminokyseliny 17-25, 27-55, 84-90, 95-101, 115-121, 55-101, ze Sekv. ID č. 154, .

aminokyseliny 13-28, 40-46, 69-75, 86-92, 114-120, 126-137,

155- 172, 182-193, 199-206, 213-221, 232-238, 243-253, 270-276, 284-290, 22-100, ze Sekv. ID č. 155, a aminokyseliny 7-19, 46-57, 85-91, 110-117, 125-133, 140-149,

156- 163, 198-204, 236-251, 269-275, 283-290, 318-323, 347-363, 9-42 a 158-174, ze Sekv, ID Č. 158, aminokyseliny 7-14, 21-30, 34-50, 52-63, 65-72, 77-84, 109124, 129-152, 158-163, 175-190, 193-216, 219-234 ze Sekv, ID č. 168, aminokyseliny 5-24, 38-44, 100-106, 118-130, 144-154, 204-210, 218-223, 228-243, 257-264, 266-286, 292-299 ze Sekv. ID. č.

174, aminokyseliny 29-44, 74-83, 105-113, 119-125, 130-148, 155175, 182-190, 198-211, 238-245 ze Sekv. ID č. 176, a fragmenty obsahující alespoň 6, přednostně více než 8, obzvláště více než 10 aminokyselin řečených sekvencí. Všechny tyto fragmenty jednotlivě a každý nezávisle tvoří přednostní vybraný aspekt předkládaného vynálezu.

Od těchto antigenů mohou být také odvozeny obzvláště vhodné pomocné epitopy. Obzvláště přednostní pomocné epitopy jsou peptidy obsahující fragmenty vybrané z peptidů uvedených ve sloupci Domnělé antigenní povrchové oblasti v Tabulkách 4 a 5, a ze skupiny aminokyselin 6-40, 583-598, 620-646 a 871-896 ze Sekv. ID. č. 56, aminokyselin 24-53 ze Sekv. ID č. 70, aminokyselin 240-260 ze Sekv. ID č. 74, aminokyselin 1660-1682 a 1746-1790 ze Sekv. ID č. 81, aminokyselin 1-29, 680-709, a 878-902 ze Sekv. ID č. 83, aminokyselin 96-136 ze Sekv. ID č. 89, aminokyselin 1-29, 226-269 a 275-326 ze Sekv. ID č. 94, aminokyselin 23-47 a 107-156 ze Sekv. ID č. 114 a aminokyselin 24-53 ze Sekv. ID č. 142 a jejich fragmenty, které jsou epitopy T lymfocytů.

Podle dalšího aspektu se předkládaný vynález týká vakcíny obsahující takový antigen reaktivní s hyperimunním sérem nebo jeho fragment, jak je identifikován výše pro Staphylococcus aureus a Staphylococcus epidermidis. Taková vakcína může obsahovat jeden nebo více antigenů proti S. aureus nebo S. epidermidis. Volitelně mohou být takové antigeny S. aureus nebo S. epidermidis kombinované s antigeny proti jiným patogenům v kombinační vakcíně. Přednostně tato vakcína dále obsahuje imunostimulační látku přednostně vybranou ze skupiny obsahující polykationické polymery, obzvláště polykationické peptidy, imunostimulační deoxynukleotidy (ODN), neuroaktivní sloučeniny, obzvláště lidský růstový hormon, alumn, Freundovo úplné nebo neúplné adjuvans nebo jejich kombinace. Taková vakcína může také obsahovat antigen vystavený na povrchu zobrazovací proteinové platformy na povrchu geneticky upravených mikroorganismů, jako jsou například E. coli.

Podle dalšího aspektu se předkládaný vynález týká specifických přípravků obsahujících protilátky proti alespoň jednomu z antigenů Staphylococcus aureus a Staphylococcus epidermidis nebo fragmentů antigenů Staphylococcus aureus a Staphylococcus epidermidis, jak je definováno výše. Tyto protilátky jsou přednostně monoklonální protilátky.

Způsoby produkce takových přípravků protilátek, polyklonálních nebo monoklonálních, jsou dobře dostupné pro osoby znalé oboru a jsou dobře popsané. Přednostní způsob produkce takového monoklonálního přípravku protilátky je charakterizovaný

následujícími kroky • iniciací imunitní odpovědí u živočicha, kterým není člověk, podáním stafylokokového antigenu nebo jeho fragmentu, jak je definováno výše, řečenému živočichovi, • vyjmutím sleziny nebo buněk sleziny z řečeného živočicha,.

• produkcí hybridomových buněk z řečené sleziny nebo slezinnýoh buněk, • výběrem klonovaných hybridomových buněk specifických pro řečený antigen, a » produkcí přípravku protilátky kultivací řečených klonovaných hybridomových buněk a volitelně použitím dalších purifikačních kroků.

Vyjmutí sleziny nebo slezinnýoh buněk je přednostně spojeno s usmrcením živočicha.

Monoklonální protilátky a jejich fragmenty mohou být chimerizované nebo humanizované (Grazíano et al, 1995), aby bylo možno je opakovaně .podávat. Lidské monoklonální protilátky a jejich fragmenty mohou být alternativně získány z fagové-zobrazovací knihovny (McGuinnes et al., 1996) nebo od transgenních zvířat (Bruggemann et al., 1996),

Přednostní způsob produkce polyklonálních přípravků protilátek proti řečeným antigenům Staphylococcus aureus nebo Staphylococcus epidermidis identifikovaných podle předkládaného vynálezu je charakterizovaný následujícími kroky • iniciací imunitní odpovědi u živočicha, kterým není člověk, podáním stafylokokového antigenu nebo jeho fragmentu, jak je definováno výše, řečenému živočichovi, • vyjmutí tělní tekutiny obsahující protilátku z řečeného zvířete, a • produkci přípravku protilátky použitím dalších purifikačních kroků pro purífikací řečené tělní tekutiny obsahující protilátku.

Tyto monoklonální nebo polyklonální přípravky protilátek mohou být použity pro výrobu léku pro léčbu nebo prevenci onemocnění způsobených stafylokokovou infekcí. Navíc mohou být použity pro diagnostické a zobrazovací účely.

Způsob je dále popsán v následujících příkladech a v obrázcích, ale neměl by jimi být omezen.

Obrázek 1 ukazuje předvýběr séra na základě titrů antistafylokokových protilátek měřených testem ELISA.

Obrázek 2 ukazuje velikost distribuce DNA fragmentů v knihovně LSA50/6 v pMAL4.1.

Obrázek 3 ukazuje MACS výběr s biotinylovaným lidským sérem. LSA50/6 knihovna v pMALS.l byla vyhledána s 10 ug biotinylovaným lidským sérem v prvním (A) a s 1 ug v druhém výběrovém kole (B) . P. sérum, sérum pacienta; B. sérum, sérum dítěte. Počet buněk vybraných po 2. a 3. ředění je uveden pro každé výběrové kolo.

Obrázek 4 ukazuje reaktivitu séra se specifickými klony izolovanými zobrazením bakteriálního povrchu, jak bylo analyzováno analýzou Western blot se sérem pacienta při ředění 1 : 5000.

Obrázek 5 ukazuje peptidový ELISA test se sérem od pacientů a zdravých jedinců s epitopem identifikovaným ribosomovým zobrazením.

Obrázek 6 ukazuje reprezentativní 2D Imunoblot povrchových proteinů S. aureus detekovaných lidským sérem. 800 ug proteinu ze S. aureus/COL kultivovaného na BHI bylo rozděleno pomocí IEF (pí 4-7) a SDS-PAGE (9-16%), a následně přeneseno na PVDF membránu. Po blokování byla membrána inkubována se sérem IC35 (1:20000). Vazba sérového IgG byla vizualizována pomocí antilidského IgG/HRPO konjugátu a ECL vyvinutí.

Obrázek 7 demonstruje reprezentativní 2D gel ukazující povrchové proteiny S. aureus obarvené pomocí Coomassie Blue. 1 mg proteinu ze S. aureus/COL byl rozdělen pomocí IEF (pí 4-7) a SDS-PAGE (9-16%). Vyznačeny jsou spoty vybrané pro sekvenování po serologické analýze proteomu.

Obrázky 8A a 8B ukazuje strukturu LPXTG proteinů buněčné stěny.

Obrázek 9 ukazuje IgG odpověd neinfikovaných (N, C) a infikovaných (p) pacientů k LPXTGV, novému antigenů a pravděpodobnému povrchovému adhesinu S. aureus objevenému pomocí přístupů zobrazení bakteriálního povrchu a proteomiky.

Obrázek 10 ukazuje barvení povrchu S. aureus purifikovanými anti-LPXTGV IgG.

stejného	přípravku	bylo
následně	přeneseno	na
membrána	inkubována	se

Obrázek 11 ukazuje 2D gel, kde jsou povrchové proteiny S. aureus obarveny pomocí Coomassie Blue (vlevo). 1 mg proteinu z S. aureus/agr kultivovaného do časné log fáze byl rozdělen pomocí IEF (pí 6-11) a SDS-PAGE (9-16%). Vyznačeny jsou spoty vybrané pro sekvenaci po serologické analýze proteomu. Odpovídající 2D-imunoblot (vpravo). 800 ug proteinu ze paralelně rozděleno pomocí 2DE a PVDF membránu. Po blokování byla sbíranou plazmou (1:10000). Vazba sérového IgG byla vizualizována antilidským IgG/HRPO konjugátem a ECL vyvinutím.

Příklady provedení vynálezu

Objevení nových antigenů Staphyloccocus aureus

Příklad 1: Příprava protilátky z lidského séra

Protilátky produkované proti stafylokokům imunitním systémem člověka a přítomné v lidském séru ukazují na in vivo expresi antigenních proteinů a jejich imunogenicitu. Tyto molekuly

3Ί jsou nezbytné pro identifikaci jednotlivých antigenů v přístupu podle předkládaného vynálezu, který je založen na interakci specifických antistafylokokových protilátek a odpovídajících peptídů nebo proteinů S. aureus. Aby bylo možno získat přístup k relevantnímu protilátkovému repertoáru, byla odebírána lidská séra od I. pacientů s akutní infekcí S. aureus, jako jsou například bakteriémie, sepse, infekce intravaskulárních a perkutánních katétrů a zařízení, infekce ran, a povrchové a hluboké infekce měkkých tkání. Pomocí mikrobiologických testů bylo prokázáno, že S. aureus je příčinou těchto infekcí. II. Sbírání vzorků séra od neinfikovaných dospělých bylo také zahrnuto do předkládané analýzy, protože stafylokokové infekce jsou běžné, a protilátky jsou přítomny jako následek přirozené imunizace po předchozích infekcí stafylokoky z kůže a měkkých tkání (furunkulus, infekce ran, periodontitis atd.).

Séra byla charakterizována na protilátky proti S. aureus sérií ELISA testů. Několik styafylokokových antigenů bylo použito k průkazu, že změřený titr není výsledkem sumace zkříženě reagujících protilátek. Pro tento účel nebyly v ELISA testu použity jen extrakty z celých buněk S. aureus (protein deficientní) (kultivované za odlišných podmínek) nebo celé baktérie, ale také jednotlivé složky buněčné stěny, jako jsou například lipoteichoová kyselina a peptidoglykanem izolovaným ze S. aureus. Důležitější bylo, že sběr rekombinantních proteinů reprezentujících známé stafylokokové buněčné povrchové proteiny byl zajištěn pro lepší charakterizaci odebraných lidských sér.

V nedávné době bylo zaznamenáno, že nejen pouze IgG, ale také IgA sérové protilátky mohou být rozpoznávány pomocí FcRIII receptorů PMN, a podporují opsonizaci (Phillips-Quagliata et ai., 2000; Shibuya et al., 2000). Primární úlohou IgA protilátek je neutralizace, hlavně na slizničním povrchu. Hladina sérového IgA odráží kvalitu, množství a specificitu dimerických sekrečních IgA. Z tohoto důvodu nebylo sbírané sérum pouze analyzováno pro antistafylokokové IgG, ale také na hladiny IgA. V ELISA testech byla použita vysoce specifická sekundární činidla, aby byly detekovány protilátky s vysokou afinitou, jako jsou například IgG a IgA, a vyloučeny IgM. Produkce IgM protilátek se vyskytuje během primární adaptivní humorální odpovědi a vede k tvorbě nízko-afinitních protilátek, zatímco IgG a IgA protilátky se už podrobily afinitnímu dozrávání, a jsou cennější pro léčbu nebo prevenci onemocnění.

Experimentální postupy

Enzymově spřažená imunitní analýza (ELISA). ELISA desky byly potaženy 2-10 ug/ml odlišných antigenů v potahovacím pufru (uhličitan sodný pH 9.2). Bylo provedeno sériové ředění séra (100-100000) v TBS-BSA. Vysoce specifická (zkříženěadsorbovaná) HRP (křenová peroxidáza) označená antilidskou IgG nebo antilidskou IgA sekundární protilátkou (Southern Biotech) byly použity podle doporučení výrobce (-2000 x) . Komplexy antigen-protilátka byly kvantifikovány měřením konverze substrátu (ABTS) na barevný produkt na základě odečetů OD₄₀5nm na automatizovaném ELISA čtecím zařízení (Wallace Victor 1420). Titry byly porovnány pro dané ředění, kde ředící odpověd byla lineární (Tabulka 1) . Přibližně 100 sér bylo klasifikováno na základě reaktivity proti mnoha stafylokokovým složkám a nejvyšší (nad 90 percentil) byly vybrány pro další analýzu identifikace antigenů. Důležité je, že bylo prokázáno, že antistafylokokové protilátky ze sér klinicky zdravých jedinců jsou velmi stabilní dávajíce stejně vysoké ELISA titry proti všem stafylokokovým antigenům měřené po 3, 6 a 9 měsících (data nejsou uvedena). Oproti tomu protilátky proti S. aureus se u pacientů po několika týdnech po infekci snižují a poté mizí (Coloque-Havarro et al, 1998). Avšak protilátky od pacientů jsou velmi důležité, protože jsou přímým důkazem in vivo exprese bakteriálních antigenů testovaných v ELISA analýzách nebo identifikovaných jako imunogenní během vyhledávání podle předkládaného vynálezu.

Tento komplexní přístup použitý během charakterizace protilátky je jedinečný, a vedl k jednoznačné identifikaci antistafylokokových hyperimunních sér.

Purifikace protilátek pro genomické vyhledávání. Pět sér ze skupin pacientů a noninfikovaných jedinců bylo vybráno na základě celkového antistafylokokového titru. Protilátky proti proteinům E. coli byly odstraněny buďto inkubací teplem inaktivovaného séra s celými buňkami E. coli (DH5a, transformované s pHIEll, kultivované za stejných podmínek, jako je používáno pro bakteriální zobrazení) nebo afinitní chromatografií s lyzátem E. coli pro ribosomové zobrazení. Vysoce obohacené přípravky IgG ze sbíraného, ochuzeného séra byly vytvořeny pomocí afinitní chromatografie s proteinem G podle instrukcí výrobce (UltraLink Immobilizovaný protein G, Pierce). IgA protilátky byly purifikovány také afinitní chromatografií za použití biotinem-značeného antilidského IgA (Southern Biotech) imobilizovaného na Streptavidin-agaróze (GIBCO BRL). Účinnost deplece a purifikace byla kontrolována pomocí SDS-PAGE, Western blotingu, ELISA, a měření koncentrace proteinu. Pro proteomiku nebyla deplece IgG a IgA přípravků nezbytná, protože sekundární činidlo zajistilo specificitu.

Příklad 2: Tvorba vysoce náhodné, rámcově-vybrané, malofragmentové, genomické DNA knihovny Staphylococcus aureus

Experimentální postupy

Příprava stafylokokové genomické DNA. Tento způsob byl vyvinut jako modifikace dvou dříve publikovaných protokolů (Sohail, 1998, Betley et al., 1984) původně specificky přizpůsobených pro methicillin rezistentní kmen Staphylococcus aureus COL za účelem získání genomické DNA vysoké kvality a ve velkém měřítku. 500 ml BHI (Brain Heart Infusion) média suplementovaného 5 ug/ml tetracyclinu bylo inokulováno

baktériemi ze zamražené konzervy a kultivováno s provzdušňováním a protřepáváním po dobu 18 hodin při 37°. Kultura byla poté stažena ve dvou alikvótách, každá po 250 ml, centrifugována (1600 g, 15 min) a supernatant byl odstraněn. Bakteriální pelety byly opatrně resuspendovány v 26 ml 0.1 mM Tris-HCl, pH 7.6 a opět centrifugovány (1600 g, 15 min). Pelety byly resuspendovány ve 20 ml 1 mM Tris-HCl, pH 7.6, 0.1 mM EDTA, a přeneseny do sterilních 50 ml polypropylenových zkumavek. 1 ml 10 mg/ml teplem ošetřené RNázy a 200 U RNázy TI bylo přidáno do každé zkumavky a roztok byl pečlivě promíchán. Poté bylo přidáno do zkumavek 250 ul Lysostafinu (10 mg/ml zásobní roztok, čerstvě připravený v ddH₂O) , zkumavky byly důkladně promíchány inkubovány při 40°C po dobu 10 min v třepací vodní lázni kontinuálního promíchávání. Po přidání 1 ml 10 % SDS, 40 ul Proteinázy K (25 mg/ml zásobní roztok) a 100 ul Pronázy (10 mg/ml), byly zkumavky opět invertovány několikrát a inkubovány při 40°C po dobu 5 min v třepací vodní lázni. Poté bylo přidáno 3.75 ml 5 M NaCl a 2.5 ml roztoku cetyl tri-metyl-ammonium bromidu (CTAB) (10% w/v, 4% w/v NaCl) a zkumavky byly dále inkubovány při 65°C v třepací vodní lázni po dobu 10 min. Vzorky byly ochlazeny pokojovou teplotu a extrahovány PhOH/CHCl₃/IAA (25:24:1) a CHC1₃/IAA (24:1). Vodné fáze byly pečlivě sesbírány a přeneseny do nové sterilní 50-ml zkumavky. Do každé zkumavky bylo přidáno 1.5 ml Strataclean™ Resin, zkumavky byly jemně, ale důkladně promíchány, a inkubovány po dobu jedné minuty při pokojové teplotě. Vzorky byly centrifugovány a vrchní vrstvy obsahující DNA byly sbírány do čistých 50ml zkumavek. DNA byla precipitována při pokojové teplotě přidáním 0.6 objemu Isopropanolu odebraného z roztoku sterilní Pasteurovou pipetou a přenesena do zkumavky obsahující 80% ledový etanol. DNA byla získána centrifugací precipitátů (10-12000 g) , poté vysušena na vzduchu a rozpuštěna v ddH₂O.

Příprava malých genomických DNA fragmentů. Genomické DNA fragmenty byly za použití sonikátoru mechanicky rozrušeny na • · · fragmenty o velikosti mezi 150 a 300 bp (Bandelin Sonoplus UV 2200 sonikátor vybavený BBS zdrojem ve tvaru šálku, 10 sek. pulsy při 100 % výstupním výkonu) nebo na fragmenty o velikosti mezi 50 a 7 0 bp podrbením mírné reakci s DNázou I (Novagen). Bylo pozorováno, že sonikace vede k mnohem těsnější velikostní distribuci fragmentů, když byla DNA rozbita na fragmenty o velikosti 150-300 bp. Avšak navzdory extensivní expozici DNA hydromechanické střižné síle indukované ultrazvukovou vlnou, nebylo účinně a reprodukovatelně dosaženo dalšího snížení velikosti fragmentů. Proto byly zíkány fragmenty o velikosti 50 až 70 bp mírnou reakcí s DNázou I za použití soupravy Novagen’s shotgun cleavage kit. Bylo připraveno ředění 1:20 ředění DNázy I poskytnuté v kitu a natráveni bylo provedeno v přítomnosti MnCÍ2 v 60 ul objemu při 20°C po dobu 5 min, aby se zajistilo dvojvláknové štěpení enzymem. Reakce byly zastaveny 2 ul 0.5 M EDTA a účinnost fragmentace byla hodnocena na 2% TAE agarózovém gelu. Tato léčba vedla k celkové fragmentaci of genomické DNA do 50-70 bp fragmentů. Fragmenty byly poté dvojmo hrubě zakončeny za použití T4 DNA Polymerázy v přítomnosti 100 uM každého DTP, aby se zajistilo účinné promytí konců. Fragmenty byly použity okamžitě v ligačních reakcích nebo zamrazeny při -20°C pro další použití.

Popis vektorů. Vektor pMAL4.1 byl zkonstruován kostře pEHl (Hashemzadeh-Bonehí et al., 1998) s genem rezistence pro kanamycin. Tento vektor navíc nese gene pro b-laktamázu (bia) klonovaný do mnohočetného klonovacího místa. Před bia genem je umístěna vedoucí peptidová sekvence opa k zajištění účinné sekrece přes cytoplasmatickou membránu. Srna I restrikční místo slouží pro inzerční knihovnu. Místo Srna I hraničí nahoře s místem Fsel místo a dole s místem Notl, které bylo použito pro zísání vybraných fragmentů. Tři restrikční místa jsou vložena za ompA vedoucí sekvenci takovým způsobem, že gen bia je přepsán v -1 čtecím rámci, což vede ke stop kodónu 15 bp za místem Notl. +1 bp inzerce restauruje bia ORF, takže je produkován rezistence k b-laktamázový ampicil.i nu.

protein s následným získáním

Vektor pMAL4.31 byl zkonstruován na kostře pASK-lBA (Skerra, 1994) s genem pro b-laktamázu zaměněným za gen rezistence pro kanamycin. Navíc nese gen pro b-laktamázu (bia) klonovaný do mnohočetného klonovacího místa. Sekvenci kódující zralou blaktamázu předchází vedoucí peptidová sekvence opa umožňující účinnou sekreci přes cytoplazmatickou membránu. Dále následuje ompA vedoucí peptidovou sekvenci sekvence kódující prvních 12 aminokyselin (distanční sekvence) zralé b-laktamázy, aby se vyloučila fúze sekvencí okamžitě za vedoucím peptidázovým štěpícím místě, protože např. nahromadění positivně nabitých aminokyselin v této oblasti by snížilo nebo zrušilo translokaci přes cytoplazmatickou membránu (Kajava et al.,

2000). Smál restrikční místo slouží pro inzerční knihovnu. Smál místo hraničí nahoře s Fsel místem a dole s Notl místem, které byly použity pro získání vybraných fragmentů. Tři restrikční místa jsou vloženy za sekvenci kódující 12 aminokyselinovou distanční sekvenci takovým způsobem, že gen bia je přepisován v -1 čtecím rámci, což vede ke stop kodónu 15 bp za místem Notl. +1 bp inzerce restauruje bia ORF, takže je produkován b-laktamázový protein s následným získáním rezistence k ampicilinu.

Vektor pMALS.l byl zkonstruován klonováním genu lamB do mnohočetného klonovacího místa pEHl. Následně byla do lamB vložena sekvence za aminokyselinu 154, obsahující restrikční místa Fsel, Smál a Notl· Čtecí rámec pro tuto inzerci byl zvolen způsobem, že přenos rámcově vybraných DNA fragmentů excitovaných natrávením s Fsel a Notl z plazmidů pMAL4,1 nebo PMAL4.31 na plazmid pMAL9.1 vede k získání kontinuálního čtecího rámce lamB a odpovídajícího inzertu.

Vektor pHlEll byla zkonstruován klonováním genu fhuA do mnohočetného klonovacího místa pEHl. Poté byla do fhuA vložena sekvence za aminokyselinu 405 obsahující restrikční místo

Fsel, Xbal a Notll. Čtecí rámec pro tuto inzerci byl zvolen způsobem, že přenos rámcově vybraných DNA fragmentů excitovaných natrávením s Fsel a Notl z plazmidů pMAL4.1 nebo PMAL4.31 na plazmid pMAL9.1 vedl k získání kontinuálního čtecího rámce fhuA a odpovídajícího inzertu.

Klonování a vyhodnocení knihovny pro rámcový výběr. Genomické DNA fragmenty S. aureus byly ligovány na Smál místo buďto vektoru pMAL4.1 nebo pMAL4.31. Rekombinantní DNA byla elektroporována do DH1OB elektrokompetentních buněk E. coli (GIBCO BRL) a transformanty byly umístěny na LB-agar suplementovaný kanamycinem (50 ug/ml) a ampicilinem (50 ug/ml) . Misky byly inkubovány přes noc při 37°C a kolonie byly sbírány pro DNA extrakci ve velkém měřítku. Reprezentativní miska byla uskladněna a uchována pro sběr kolonií pro PCR analýzu kolonií a sekvenci ve velkém měřítku. Jednoduchá PCR analýza kolonií byla použita k iniciálnímu určení hrubé velikosti distribuce fragmentů, stejně tak jako inzerční účinnosti. Ze sekvenčních údajů byla vyhodnocena přesná velikost fragmentů, intaktnost spojení v místě inzerce, stejně tak jako přesnost rámcového výběru (pravidlo 3n+l).

Klonování a vyhodnocení knihovny pro zobrazení bakteriálního povrchu. Genomické DNA fragmenty byly excidovány z pMAL4.1 nebo pMAL4.31 vektoru obsahující knihovnu S. aureus s restrikčními enzymy Fsel a Notl. Celá populace fragmentů byla poté přenesena do plazmidů pMAL9.1 (LamB) nebo pHIEll (FhuA), které byly natráveny pomocí Fsel a Notl. Za použití těchto dvou restrikčních enzymů, které rezpoznávají 8 bp GC bohatou sekvenci, je v každém z platformových vektorů udržen čtecí rámec, který byl vybrán v pMAL4.1 nebo pMAL4.31 vektoru. Plazmidová knihovna byla poté elektroporací transformována do E. coli DH5a buněk. Buňky byly umístěny na velké LB-agarové misky suplementované 50 ug/ml kanamycinu a kultivovány· přes noc při 37°C při hustotě vedoucí k jasně viditelným jednotlivým koloniím. Buňky byly poté staženy z povrchu těchto misek, promyty čerstvým LB médiem a uskladněny v alikvótách pro vyhledávání knihoven při -80°C.

Výsledky

Knihovny pro rámcový výběr. Dvě knihovny (LSA50/6 a LSA250/1) byly vytvořeny v pMAL4.1 vektoru s velikostmi přibližně 50 a 250 bp. Pro obě knihovny byl získán celkový počet klonů po rámcovém výběru 1-2 x 10⁶ za použití přibližně 1 ug pMAL4.1 plazmidové DNA a 50 ng fragmentové genomické DNA S. aureus. K posouzení náhodnosti LSA50/6 knihovny, bylo sekvenováno 672 náhodně zvolených klonů. Bioinformační analýza prokázala, že z těchto klonů ani jeden nebyl přítomen více než jedenkrát. Dále bylo prokázáno, že 90% klonů mělo velikost 19 až 70 bp s průměrnou velikostí 25 bp (Obrázek 2) . Všech 672 sekvencí sledovalo pravidlo 3n+l, což prokázalo, že všechny klony byly správně rámcově vybrány.

Bakteriální povrchové zobrazovací knihovny. Zobrazení peptidů na povrchu E. coli vyžadovalo k zobrazení plazmidů pMAL9.1 (LamB) nebo pHIEll (FhuA) přenos inzertů z LSA50/6 knihovny z rámcového selekčního vektoru pMAL4.1. Genomické fragmenty DNA byly excitovány pomocí Fsel a Notl restrikce a ligace 5ng inzertů s 0.1 ug plazmidové DNA vedla ke vzniku 2-5x 10⁶ klonů. Klony byly staženy z LB misek a zamrazeny bez další amplifikace.

Příklad 3: Identifikace vysoce imunogennich peptidových sekvencí ze S. aureus za použití genomických knihoven zobrazených na bakteriálním povrchu a lidského séra

Experimentální postupy

MACS vyhledávání. Přibližně 2.5 x 10⁸ buněk z dané knihovny bylo kultivováno v 5 ml LB-média suplementovaného s 50 ug/ml kanamycinu po dobu 2 h při 37 °C. Exprese byla indukována přidáním 1 mM IPTG po dobu 30 min. Buňky byly dvakrát promyty čerstvým LB médiem a přibližně 2 x 10⁷ buněk bylo resuspendováno ve 100 ul LB média a přeneseno do zkumavky Eppendorf.

ug of biotinylovaného lidského séra bylo přidáno k buňkám a suspenze byla inkubována přes noc při 4°C s jemným promícháváním. Bylo přidáno 900 ul LB média, suspenze byla promíchána a následně centrifugována 10 min při 6000 ot./min při 4°C. Buňky byly jedenkrát promyty s 1 ml LB a poté resuspendovány v 10.0 ul LB média. Bylo přidáno 10 ul MA.CS mikrokuliček připojených k streptavidinu (Miltenyi Biotech, Německo) a inkubace pokračovala 20 min při 4°C. Poté bylo přidáno 900 ul LB média a MACS mikrokuličková buněčná suspenze byla nanesena na ekvilibrovanou MS kolonu (Miltenyi Biotech, Německo), která byla fixovaná k magnetu. (MS kolony byly ekvilibrovány promytím jedenkrát 1 ml 70% EtOH a dvakrát 2 ml LB média.)

Kolona byla poté promyta třikrát 3 ml LB média. Eluce byla provedena odstraněním magnetu a promytím 2 ml LB média. Po promytí kolony 3 ml LB média, byly 2 ml eluátu naneseny podruhé na stejnou kolonu a promývací a eluční postup byl zopakován. Nanesení, promytí a eluce byly provedeny potřetí, což vedlo k finálnímu eluátu 2 ml.

Druhé kolo vyhledávání bylo provedeno následovně. Buňky z finálního eluátu byly sbírány centrifugací a resuspendovány v 1 ml LB média suplementovaného s 50 ug/ml kanamycinu. Kultura byla inkubována při 37°C 90 min a poté indukována 1 mM IPTG po dobu 30 min. Buňky byly následně sbírány, promyty jedenkrát 1 ml LB média a suspendovány v 10 ul LB média. Protože objem byl snížen, byl přidán 1 ug lidského, biotinylovaného séra a suspenze byla inkubován přes noc při 4°C s jemným promícháváním. Všechny další kroky byly přesně stejné jako ·· ·· · ··· • · ···· ♦ · · • · »·· ·.·· • · · · · · · ·· »···· ··· ·· ·· ··* ·· * v prvním výběrovém kole. Buňky vybrané po dvou kolech selekce byly umístěny na LB-agarové misky suplementované 50 ug/ml kanamycinu a kultivované přes noc při 37 °C.

Vyhodnocení vybraných klonů sekvenaci a Western blotovou analýzou. Vybrané klony byly kultivovány přes noc při 37°C v 3 ml LB média suplementovaného 50 ug/ml kanamycinu, aby byla připravena plazmidová DNA za použití standardních postupů. Sekvenace byla provedena v MWG (Německo) nebo ve spolupráci s TIGR (USA).

Pro Western blotovou analýzu bylo separováno přibližně 10 až 20 ug celkového buněčného proteinu pomocí 10% SDS-PAGE a blotováno na Hybond C membránu (Amersham Pharmacia Biotech, Anglie) . LamB nebo FhuA fúzní proteiny byly detekovány za použití lidského séra jako primární protilátky při ředění 1:5000 a antilidské IgG protilátky připojené k HRP při ředění 1:5000 jako sekundární protilátce. Detekce byla provedena za použití ECL detekčního křtu (Amersham Pharmacia Biotech, England). Alternativně byly použity pro detekci fúzních proteinů jako primární protilátky králičí anti-FhuA nebo myší anti-LamB protilátky v kombinace s příslušnými sekundárními protilátkami připojenými k HRP.

Výsledky

Vyhledávání bakteriálních povrchových zobrazovacích knihoven magneticky aktivovaným buněčným sortováním (MACS) za použití biotinylovaného lidského séra. Knihovny LSA50/6 v pMAL9.1 a LSA250/1 v pHIEll byly vyhledávány sbíraným biotinylovaným lidským sérem pacientů (viz Příklad 1, Příprava protilátek z lidského séra). Selekční postup byl proveden, jak je popsáno v kapitole Experimentální postupy. Jako kontrolní materiál byla použita sbíraná lidská séra dětí, které nebyly velmi pravděpodobně infikovány baktérií S. aureus. Podle popsaných podmínek bylo rutinně vybráno 10 až 50 krát více buněk od pacientů ve srovnání s dětským sérem (Obrázek 3).

• ·

K vyhodnocení účinnosti vyhledávání bylo náhodně zvoleno přibližně 100 vybraných klonů a podrobeno analýze Western blotem se stejným sbíraným sérem pacienta. Tato analýza odhalila, že 30 až 50% vybraných klonů prokázalo reaktivitu s protilátkami přítomnými v séru pacienta, zatímco kontrolní kmen exprimující LamB nebo FhuA bez S. aureus specifického inzertu se stejným sérem nereagoval. PCR analýza kolonií prokázala, že všechny vybrané klony obsahovaly inzert v očekávaném velikostním rozmezí.

Následná sekvenace většího počtu náhodně odebraných klonů (500 až 800 na vyhledávání) vedla k identifikaci genu a odpovídající peptidové nebo proteinové sekvenci, která byla specificky rozpoznávána lidským sérem pacienta použitým pro vyhledávání. Frekvence, s kterou je specifický klon vybrán, odráží alespoň částečně nadbytek a/nebo afinitu specifické protilátky v séru použitém pro selekci a rozpoznávání epitopu prezentovaného tímto klonem. V tomto ohledu je nápadné, že některé klony (ORF2264, ORF1951, ORF0222, lipáza a IsaA) byly odebrány až 90 krát, což ukazuje na jejich vysoce imunogenní vlastnosti. Všechny klony, které jsou prezentovány v Tabulce 2 byly verifikovány Western blotovou analýzou za použití, extraktů z celých buněk z jednotlivých klonů, aby byla prokázána indikovaná reaktivita se sbíraným lidským sérem použitém při vyhledávání.

Stojí dále za povšimnutí, že většina genů identifikovaných bakteriálním povrchovém zobrazovacím vyhledáváním kódují proteiny, které jsou buďto připevněné k povrchu S. aureus a/nebo jsou sekretované. Toto je ve shodě s očekávanou rolí povrch proteinů připevněných k povrchu nebo sekretovaných proteinů pro virulenci S. aureus.

Posouzení reaktivity vysoce imunogenních peptidových sekvencí s různými lidskými séry. Následně bylo použito 10 až 30 různých lidských sér pacientů k vyhodnocení přítomnosti protilátek proti vybraným imunogenním peptidovým sekvencím, které byly objeveny při vyhledávání podle předkládaného vynálezu. K eliminaci možné zkřížené reaktivity s proteiny exprimovanými E. coli, byla všechna séra pre-adsorbována s celkovým buněčným lysátem buněk E. coli DHa exprimujících FhuA protein.

Tato analýza je sumarizována v Tabulce 2 a jako příklad uvedena na Obrázku 4 a indikuje validitu předkládaného vyhledávání. Dále ukazuje, že již vybrané krátké epitopy mohou vést k produkci protilátek u velkého počtu pacientů (ORF1618, ORF1632, IsaA, Empbp, Protein A) . Ty peptidové sekvence, které nejsou rozpoznávány větším souborem pacientských sér mohou být stále částí vysoce imunogenního proteinu, ale rekombinantní protein samotný může být testován z tohoto důvodu pro každý jednotlivý případ.

Příklad 4: Identifikace vysoce imunogenních peptidových sekvencí z genomických fragmentů S. aureus za použití ribosomového zobrazení a lidského séra

Experimentální postupy

Ribosomové zobrazovací vyhledávání: 2.4 ng genomické knihovny z S. aureus LSA250/1 v pMAL4.1 (popsáno výše) bylo amplifikováno pomocí PCR with pomocí oligo ICC277 a ICC202, aby tato knihovna mohla být použita pro pro ribosomové zobrazení. Oligo ICC277 (CGAATAATACGACTCACTATAGGGAGACCACAACGGTTTCCCACTAGTAATAATTTTGTTT AACTTTAAGAAGGAGATATATCCATGCAGaCCTTGGCCGGCCTCCC) a ICC202 (GGCCCACCCGTGAAGGTGAGCCGGCGTAAGATGCTTTTCTGTGACTGG) hybridizuj í 5’ a 3' Fse 1-Not I inzerční místo plazmidu pMAL4.1. ICC277 zavádí T7 fágový RNA polymerázový promotér, palindromickou sekvenci vedoucí ke struktuře stonkové kličky na úrovni RNA, ribosomovém vazebném místě (RBS) a translačním startu genu 10 T7 tága zahrnující ATG startovací kodón. Oligo ICC202 hybridizuje v nukleotidové pozici 668 E-laktamázového otevřeného čtecího rámce a také zavádí strukturu stonkové • · * « · · · » « · * »·* · » · · · · « · · • ·· ·· «· · ♦ · · · · smyčky na 3’ konci výsledné RNA. PCR bylo provedeno s vysoce přesným PCR kitem (Roche Diagnostic) 25' cyklů při 50°C hybridizačni teplotě a jinak standardních podmínkách.

Výsledná PCR knihovna byla použita v 5 po sobě jdoucích kolech výběru a amplifikace ribosomovým zobrazením podobně, jak bylo dříve popsáno (Hanes et al., 1997), ale s modifikacemi, jak je popsáno níže.

Jedno kolo ribosomového zobrazení obsahovalo následující kroky: in vitro transkripce 2 ug PCR produktu s RiboMax kitem (Promega) vedlo ke vzniku cca. 50 ug RNA. In vitro translace byla prováděna 9 minutes při 37°C v 22 ul objemu s 4.4 ul Premix Z (250 mM TRIS-acetát pH 7.5, 1.75 mM každé aminokyseliny, 10 mM ATP, 2.5 mM GTP, 5 mM cAMP, 150 mM acetylfosfátu, 2.5 mg/ml E. coli tRNA, 0.1 mg/ml folinové kyseliny, 7.5 % PEG 8000, 200 mM glutamátu draselného, 13.8 mM Mg(Ac)2, 8 ul S30 extract (x mg/ml) a zhruba 2 ug in vitro transkribované RNA z poolu. Byl připraven extrakt S30, jak je popsáno v publikaci Chen et al, 1983. Dále byl přenesen vzorek do ledově vychlazené zkumavky obsahující 35.2 ul 10 % milk-WBT (TRIS-acetát pH 7.5, 150 mM NaCl, 50 mM Mg(Ac)2, 0.1 % Tween20, 10 % mléčný prášek) a 52.8 ul WBTH (jako výše plus 2.5 mg/ml heparinu). Následně byla provedena imunoprecipitace přidáním 10 ug purifikovaných IgG, inkubace 90 minut na ledu, s následovným přidáním 30 ul kuliček MAGmol Protein G (Miltenyi Biotec, 90 minut na ledu). Vzorek byl aplikován na předem ekvilibrovanou kolonu (Miltenyi Biotec), která byla promyta 5 krát s ledovým WBT pufrem. Dále bylo na kolonu naneseno 20 ul EB20 elučního pufru (50 mM TRIS-acetát, 150 mM NaCl, 20 mM EDTA, 50 ug/ml S. cerevisiae RNA) a byla provedena inkubace 5 minut při 4°C. Eluce byla dokončena přidáním 2 x 50 ul EB20. mRNA z elučního vzorku sample byla purifikována vysoce čistým RNA izolačním kitem (Roche Diagnostics). Následná reverzní transcripce byla provedena kitem Superscript II reversní transkriptáza (Roche Diagnostics) podle instrukcí • · · • · výrobce s 60 pmol oligo ICC202 1 hour při 50°C v 50 ul volume. 5 ul této směsi bylo použito pro následující PCR reakci s primery ICC202 a ICC277, jak je popsáno výše.

Tři kola ribosomového zobrazení byla provedena a výsledný vybraný PCR pool byl následně klonován do plazmidu pHIEll (popsáno výše) štěpením s restrikčními endonucleázami Notl a Fsel.

Vyhodnocení vybraných klonů sekvenací a ELISA analýzou peptidů: Vybrané klony byly kultivovány přes noc při 37°C v 3 ml LB média suplementovaného 50 ug/ml kanamycinu, aby byla připravena plazmidová DNA za použití standardních postupů. Sekvenace byla provedena v MWG (Německo) nebo v Ústavu pro Genomický Výzkum (TIGR; Rockville, MD, USA). Peptidy odpovídající inzertům byly syntetizovány a potaženy v 10 mM NaHC03 pH 9.3 při koncentraci 10 ug/ml (50 ul) do 96-jamkových mikrotitračních destiček (Nunc). Po blokování 1% BSA v PBS při 37 °C, a ředěních uvedených sér 1:200 a 1:1000 byly naředěny v 1% BSA/PBS a aplikovány do jamek. Po promytí PBS/0.1 % Tween20, byly přidány biotinem-značené antilidské IgG sekundární protilátky (SBA) a tyto byly detekovány následným přidáním streptavidinu spřaženého s křenovou peroxidázou podle standardních postupů.

Výsledky

Pro vyhledávání byla použita 250-bp genomická knihovna (LSA250/1), jak je popsáno výše. Pro výběr antigenních peptidů byly použity purifikované IgG od neinfikovaných dospělých, ale s vysokým titrem proti S. aureus, jak je popsáno výše.

Tři kola ribosomového zobrazovacího výběru a amplifikace byla provedena podle Experimentálních postupů a zakončena klonováním a sekvenováním výsledného PCR poolu.

Sekvenční analýzy velkého počtu náhodně odebraných klonů (700) vedly k identifikaci genu a odpovídajícího peptidu nebo proteinové sekvence, které byly specificky rozpoznávány sérem s vysokým titrem používaným pro vyhledávání. Frekvence, s kterou byl vybrán specifický klon odráží alespoň částečně nadbytek a/nebo afinitu specifické protilátky v séru používaném pro výběr a rozpoznávání epitopu prezentovaného tímto klonem. Zajímavé je, že některé klony (ORF) byly odebírány až 50 krát, což ukazuje na jejich vysoce imunogénní vlastnosti. Tabulka 2 ukazuje název ORF, Sekv. ID č. a počet, kolikrát byl identikován ve vyhledávání podle vynálezu.

Celá řada imunoselektovaných ORF peptidů odpovídajících identifikované imunogénní oblasti byla syntetizována a testována v peptidových ELISA analýzách na jejich reaktivitu vůči sbíranému séru a byla také identifikována pomocí celé řády dalších sér od pacientů, kteří prodělali infekci baktérií S. aureus. Dva příklady v grafech na obrázku 5 ukazují hodnoty peptidů z aureolysinu a Pis. Nejsou pouze hyperimunnitně reaktivní proti sbíranému séru s vysokým titrem, ale také proti celé řadě jednotlivých sér pacientů. Všechny syntetizované peptidy odpovídající vybraným imunogenním oblastí vykazovaly reaktivitu proti sbíráhému séru s vysokým titrem a Tabulka 2 sumarizuje počet, kolikrát peptidy reagovaly s jednotlivými séry pacientů podobně, jako je popsáno výše.

Navíc je nápadné, že pro ty ORF, které byly také identifikovány bakteriálním povrchovým zobrazením popsaným výše, byla skutečná imunogénní oblast ORF velmi často identická nebo překrývající se s ORF identifikovanými ribosomovým zobrazením. Toto srovnání může být patrno v Tabulce 2,

Přiklad 5: Identifikace vysoce imunogennich antigenů ze S aureus za použití Serologické Analýzy Proteomu.

Experimentální postupy baktérií (O.D.₆oo resuspendováno v

Příprava povrchových bílkovin ze S. aureus obsahující vysoce imunogenní antigeny. Kmeny S. aureus COL (Shafer a Iandolo, 1979) a agr- (Rescei et al., 1986) byly uskladněny jako glycerolové konzervy při -80°C nebo na BHI (DIFCO) miskách při 4°C. Jednotlivé klony byly použity pro inokulaci kultivací přes noc v buďto BHI (standardní podmínky) nebo RPMI 1640 (GibcoBRL), kde poslední médium bylo zbaveno železa (zátěžové podmínky”), reakcí o/n s iminodioctovou kyselinou (Sigma). Čerstvé médium bylo inokulováno v ředění 1:100 další den a baktérie byly kultivovány do O.D.₆₀o, mezi 0.3 a 0.7. Baktérie byly staženy centrifugací a promyty ledovým PBS. Povrchové proteiny byly připraveny reakcí s lysostafinem za isotonických podmínek (Lim et al. 1998). Stručně řečeno, bylo ~3xl0⁹ = 1 odpovídá zhruba 5xlO⁷ baktérií) ml trávicího pufru obsahujícího 35% rafinózy (Aldrich Chemical Company), proteázových inhibitorů (Roche) a 5 jednotek lysostafinu (Sigma). Po inkubaci při 37°C 30 min, byly protoplasty pečlivě sedimentovány nízkorychlostní centrifugací. Tento postup uvolňuje povrchové proteiny kovalentně připojené k pentaglycinovému můstku peptidoglykanové buněčné stěny do supernatantu (Crossley, 1997). Buněčné povrchové proteiny byly buďto precipitovány metanolem/chloroformem (Wessel, 1984) nebo v centrifugačních filtračních zkumavkách koncentrovány (Millipore).

Proteinové vzorky byly zmraženy a uskladněny při -80°C nebo rozpuštěny ve vzorkovém pufru a okamžitě použity pro isoelektrickou fokusaci (IEF) (Pasgualí et al. 1997).

Serologická analýza proteomu povrchových bílkovin ze S. aureus. Vzorky byly získány za) S. aureus/agr kultivovaného za zátěžových podmínek, b) S. aureus/COL kultivovaného za • · · • ·

standardních podmínek a c) S. aureus/COL kultivovaného za zátěžových podmínek. Nanesení na 17 cm proužky obsahující imobilizované pH gradienty (pH 4-7, BioRad) bylo provedeno za použití postupu se znovunabobtnáním v gelu (Pasquali et al., 1997). Gely pro blotting byly naneseny 100-800 ug proteinu, preparativní gely 400-1,000 ug proteinu. Isoelektrická fokusace a SDS-PAGE (9-16% gradientově gely) byly provedeny, jak je popsáno (Pasquali et al., 1997). Pro Western blotting byly proteiny přeneseny na PVDF-membrány (BioRad) polosuchým blotem. Účinnost přenosu byla kontrolována barvením amidočerní. Po blokování (PBS/0.1% Tween 20/10% suché mléko, 4°C 16 h) , byly bloty inkubovány dvě hodiny se sérem (1:2,5001:100,000 v blokovacím roztoku, viz Tabulka 3). Po promytí byla specifická vazba sérového IgG vizualizována konjugátem kozího-antilidského-IgG/peroxidázy (1:25000, Southern Biotech) jako sekundární protilátky a vyvinutím s chemiluminescenčním substrátem (ECL™, Amersham). Reprezentativní výsledek je uveden na Obrázku 6. Membrány byly odvrstveny reakcí s 2% βME/Laemmliho pufrem 30 min při 50-65°C, okamžitě podrobeny reakci s odlišným sérem, a vyvinuty, jak je popsáno výše. Tento postup byl opakován až pětkrát. Signály přítomné u sér pacieritů a/nebo zdravých kontrolních dárců krve, ale ne u dětských sbíraných sér, byly naneseny na Coomassie (BioRad) obarvené preparativní gely (příklad uveden na Obrázku 7). Výsledky těchto serologických proteomových analýz povrchových bílkovin ze S. aureus jsou sumarizovány v Tabulce 3.

Sekvenace proteinových spotů pomocí peptid-fingerprint MALDITOF-MS a tandemového MS/MS. Kusy gelu byly promyty alternativně třikrát 10 ul trávicího pufru (10 mM NH4HCO3/CAN, 1:1). Poté byly kusy gelu svraštěny pomocí 10 ul ACN a znovunabobtnány 2 ul proteázového roztoku (0.05 ug/ul trypsinu, Promega, Madison, USA). Natrávení bylo prováděno 1012 h při 37°C. Pro MALDI-TOF-MS byly peptidy extrahovány z kusů gelu 10 ul trávicího pufru. Supernatant byl koncentrován pomocí ZipTip™ (Millipore, Bedford, USA), peptidy

byly eluovány na MALDI terčík 0.5 ul extrakčního pufru (0.1% TFA/CAN, 1:1) a bylo přidáno 0.5 ul matrixového roztoku (HCCA v ACN/0.1% TFA, 1:1). MALDI-TOF-MS byla provedena za použití zařízení REFLEX III (Bruker Daltonik, Brémy, Německo) vybaveném iontovým zdrojem SCOUT384. Akcelerační napětí bylo nastaveno na 25 kV, a odrazové napětí na 28.7 kV. Hmotové rozmezí bylo nastaveno na 700 Da to 4000 Da. Akvizice dat byla provedena na zařízení SUN Ultra za použití softwaru XACQ, verze 4.0. Poanalytické zpracování dat bylo provedeno za použití softwaru XMASS, verze 4.02 (Bruker Daltonik, Brémy, Německo). Výsledky jsou sumarizované v tabulkách 3 a 4.

Příklad 6: Charakterizace vysoce imunogenních proteinů ze S. aureus

Antigeny identifikované odlišnými vyhledávacími způsoby pomocí přípravkových forem IgG a IgA předem vybraných sér jsou dále charakterizovanýy následujícími způsoby:

1. Proteiny jsou purifikovány, nejpřednostněji jako rekombinantní proteiny exprimované v E. coli nebo v Gram+ expresním systému nebo v in vitro translačním systému a hodnoceny na antigenicitu sérií lidských sér. Proteiny jsou modifikovány na základě bioinformační analýzy: N-terminální sekvence reprezentující signální peptid jsou odstraněny, Cterminální oblasti směrem dolů od kotvy buněčné stěny jsou také odstraněny, a jsou vloženy extra aminokyseliny jako značky pro usnadnění purifikace (jako jsou například Streptagll, His-tag, atd.). Velký počet sér je poté použit v ELISA analýzách k posouzení frakce lidského séra obsahujícího specifické protilátky proti danému proteinu (viz Obr. 9 jako příklad). Jeden z vybraných antigenů je 895 aminokyselin dlouhý protein, který byl nazván LPXTGV (viz Tabulky 2 a 4), protože obsahuje Gram+ sekvenci LPXTG kotvící buněčnou stěnu. Bylo prokázáno, že tato sekvence slouží jako štěpící místo pro sortázu, trans-peptidázu, která kovalentně váže proteiny obsahující LPXTG motiv k peptidoglykanové buněčné stěně.

LPXTGV je také vybaven typickým signálním peptidem (Obr. 8). Data z ELISA za použití tohoto proteinu jako Strep-označeného rekombinantního proteinu demonstrují, že tento protein je vysoce imunogenní (vysoké titry relativně k jiným rekombinantním proteinům) ve vysokém procentu sér (Obr. 9) . Důležité je, že pacienti s akutní infekcí S. aureus produkují signifikantně více těchto anti-LPXTGV protilátek, než zdraví normální jedinci, což naznačuje, že protein je exprimovaný během in vivo infekce. Celkové ELISA titry jednotlivých antigenních proteinů jsou porovnány, a ty, které indukují nejvyšší protilátkové hladiny (vysoce imunogenní) u většiny jedinců (protein je exprimovaný většinou kmenů in vivo), jsou preferované. Protože antigenní specificita a kvalita (třída, subtyp, funkčnost, nefunkčnost) protilátek proti S. aureus produkovaných u jednotlivých pacientů se mohou lišit v závislosti na místě infekce, byla speciální pozornost věnována doprovázejícím chronickým onemocněním (např. diabetes) a chronickým stavům (např. intravaskulární zařízení) a imunitní odpovědi jedince s ohledem na rozdíly detekovanými mezi odlišnými skupinami pacientů, protože byly dostupné lékařské zprávy ke každému sér. Navíc každé sérum pacienta je doprovázeno patogenním kmenem izolovaným od pacienta v čase odběru séra.

2. Specifické protilátky jsou purifikovány pro funkční charakterizaci. Čistota a integrita rekombinantních proteinů je kontrolována (např. detekcí N-terminální Strep-značky ve Western blotové analýze ve srovnání stříbřením na SDS-PAGE). Antigeny jsou imobilizovanýy prostřednictvím značek, aby se vytvořila afinitní matrice a použity pro purifikaci specifických protilátek z vysoce reaktivních sér. Při použití jako příklad střep-značené sekvence LPXTGV jako zachycujícího antigenů, bylo purifikováno 20 ug protilátky ze 125 mg IgG. Na základě ELISA dat byl získán čisty přípravek, nemající např. anti-LTA a antí-peptidoglykanovou (které jsou dominantní u nefrakciovaného IgG) aktivitu. Protilátky jsou poté použity

• · k testování lokalizace na buněčném povrchu metodou FACS a fluorescenční mikroskopií (Obr. 10) .

3. Výskyt genu v klinických izolátech

Ideální vakcínový antigen by měl být antigen, který je přítomen u všech, nebo velké většiny kmenů cílového organismu, na který je vakcína namířena. Aby bylo možno určit, zdali se geny kódující identifikované antigeny Staphyiococcus aureus vyskytují v kmenech S. aureus ubikvitérnš, bylo provedeno PCR na celé řadě nezávislých izolátů S. aureus s primery specifickými pro gen zájmu. Izoláty S. aureus byly získány od pacientů s různými infekcemi způsobenými S. aureus. Navíc bylo odebráno a analyzováno také několik- nazálních izolátů od zdravých nosičů a několik laboratorních kmenů. Kmeny byly typizované analýzou polymorfismu délky restrikčních fragmentů (restriction fragment length polymorphism (RFLP)) genů spa a coa (Goh et al. 1992, Frenay et al., 1994, van den Bergh et al. 1999). Z těchto výsledků bylo identifikováno 30 odlišných kmenů - 24 izolátů od pacientů, 3 nosní izoláty a 3 laboratorní kmeny. K určení genové distribuce vybraných antigenů byla genomická DNA těchto 30 kmenů podrobena PCR s genově specifickými primery, které hraničily s vybraným epitopem (ORF1361: Sekv. ID č. 187 a 188; ORF2268: Sekv. ID č. 193 a 194; ORF1951: Sekv. ID č. 195 a 196; 0RF1632: Sekv. ID č. 181 a 182; ORF0766: Sekv. ID č. 183 a 184; ORF0576: Sekv. ID č. 185 a 186; ORF0222: Sekv. ID č. 189 a 190; ORF0360;

Sekv. ID č. 191 a 192) . PCR produkty byly analyzovány gelovou elektroforézou, aby byl identifikován produkt správné predíkované velikosti. ORF 1361, 2268, 1951, 1632, 0766 a 0222 jsou přítomny ve 100% testovaných kmenů a ORF0576 v 97%. Avšak ORF0360 se vyskytl pouze v 71% kmenů. ORF 1361, 2268, 1951,

1632, 0766, 0576 a 0222 se tedy ubikvitérně vyskytovaly mezi izobáty S. aureus.

Tyto antigeny (nebo jejich antigenní fragmenty, obzvláště identifikované fragmenty) jsou obzvláště přednostní pro ··· ·· ·· ··· použití ve vakcinačním projektut proti S. aureus.

4. Identifikace nejčastějí se vyskytujících pomocných epitopů HLA-třídy II v ORF vybraných antigenů

ORF odpovídající antigenům identifikovaných na základě rozpoznání protilátkami v lidském séru, také nejpravděpodobněji obsahují lineární epitopy T lymfocytů. Obzvláště překvapivým zjištěním v průběhu vynálezu bylo, že dokonce zdraví neinfikovaní, ne-kolonizovaní jedinci vykazují extrémně vysoké titry protilátek (> 100000 pro některé antigeny, viz Příklad 5), které jsou stabilní >1 rok (viz Příklad 1), což naznačuje existenci paměti závislé na T lymfocytech zprostředkované CD4+ pomocnými T lymfocyty. Molekulární definice odpovídajících epitopů HLA třídy II je použita pro návrh syntetických antistafylokokových vakcín, které mohou indukovat imunologickou paměť. V tomto scénáři poskytují pomocné epitopy odvozené od stafylokokových antigenů kognátní pomoc B lymfocytární odpovědi proti těmto antigenům nebo jejich fragmentům. Navíc je možné použít tyto pomocné epitopy k indukci paměti k T-nezávislým antigenům, jako jsou například karbohydráty (konjugátové vakcíny). Na druhé straně mohou být intracelulárně se vyskytující stafylokoky eliminovány CD8+ cytotoxickými T lymfocyty, které rozpoznávají epitopy omezené na HLA třídu I.

Epitopy T lymfocytů mohou být predikovány různými algoritmy veřejných domén: http;//bimas.dcrt.nih.aov/molbio/hla bind/ (Parker et al. 1994), http://134.2.96.221/scripts/MHCServer.dll/home.htm (Rammens ee et al. 1999), http://mvpage.ihost.com/uslnet.hamme7 6/ (Sturniolo et al. 1999). Posledně uvedený predikční algoritmus nabízí možnost identifikovat často se vyskytující pomocné epitopy, t.j. peptidy, které se váží k několika molekulám HLA třídy II. Aby bylo možné identifikovat často se vyskytující pomocné epitopy stafylokokových antigenů, byly analyzovány za použití TEPITOPE programu http://mypage.ihost.com/usinet.hamme76/ (Sturniolo et al. 1999) ORF odpovídající Sekv. ID 64 (isaA), Sekv. ID 114 (P0V2), Sekv. ID 89 (QRF0222), Sekv. ID 70 (LPXTGIV), Sekv. ID 56 (LPXTGV), Sekv. ID 142 (LPXTGVI), Sekv. ID 81 (ORF3200), Sekv. ID 74 (ORF1951), Sekv. ID 94 (Empbp), Sekv. ID 83 (autolysin) a Sekv. ID 58 (ORF2498). Analýza byla provedena pro 25 prevalentních DR-alel a peptidy byly vybrány, pokud byly predikovány jako a) silné vazebné látky (1% práh) pro alespoň 10/25 alel nebo b) střední vazebné látky (3% práh) pro alespoň 17/25 alel.

Byly vybrány (a jsou nárokovány) následující peptidy obsahující jeden nebo několik často se vyskytujících pomocných epitopů:

Sekv.	ID	56:	poz.	6-40, 583-598, 620-646, 871-896
Sekv.	ID	58:	žádný peptid nesplňuje výběrová kritéria
Sekv.	ID	64:	žádný peptid nesplňuje výběrová kritéria
Sekv.	ID	70:	poz.	24-53
Sekv.	ID	74:	poz.	240-260
Sekv.	ID	81:	poz.	1660-1682, 1746-1790
Sekv.	ID	83:	poz.	1-29, 680-709, 878-902
Sekv.	ID	89:	poz.	96-136
Sekv	ID	94:	poz.	1-29, 226-269, 275-326
Sekv.	ID	114	: poz	. 23-47, 107-156
Sekv.	ID	142	: poz.	24-53

Odpovídající peptidy nebo jejich fragmenty (například překrývající se 15-mery) mohou být syntetizovány a testovány pro jejich schopnost vázat se k různým HLA molekulám in vitro. Jejich imunogenicita může být testována posouzením proliferace zprostředkované peptidem (antigenem) (BrdU nebo 3H-thymidin inkorporace) nebo sekrece cytokinů (ELIspot, intraceiulární barvení cytokinů) T lymfocytů in vitro (Mayer et al. 1996, Schmittel et al. 2000, Sester et al. 2000). V tomto ohledu bude zajímavé určit kvantitativní a kvalitativní rozdíly

• · · · · · • · · · * · • · «· ····· • · · · · · v odpovědi T lymfocytů ke stafylokokovým antigenům nebo vybraným často se vyskytujícím peptidům nebo jejich fragmentům v populacích pacientů s odlišnou stafylokokovou infekcí, nebo u kolonizovaných versus zdravých jedinců ani neinfikovaných v poslední době ani nekolonizovaných. Navíc je očekávána korelace mezi titry protilátek titry a množstvím a kvalitou odpovědi T lymfocytů pozorované v těchto populacích. Alternativně může být imunogenicita predikovaných peptidů testována na HLA-transgenních myších (Sonderstrup et al. 1999).

Podobné přístupy mohou být použity pro identifikaci epitopů stafylokokových antigenů omezených na HLA třídu I.

Syntetické peptidy reprezentující jeden nebo více často se vyskytujících T pomocné epitopů z S.aureus

Byly syntetizovány částečně se překrývající peptidy rozprostírající se přes uvedené oblasti ze Sekv ID 56 (LPXTGV), Sekv. ID 70 (LPXTGIV), Sekv. ID 74 (ORFlhoml), Sekv. ID 81 (EM_BP), Sekv. ID 83 (Autolysin), Sekv. ID 89 (0RFlhom2), Sekv. ID 94 (EMPBP), Sekv. ID 114 (POV2) a Sekv. ID 142 (LPXTGVI). Sekvence jednotlivých peptidů jsou uvedeny v Tabulce 5. Všechny peptidy bylý syntetizovány za použití Fmoc reakce, purifikovány pomocí HPLC a analyzovány hmotnostní spektrometrií. Lyofilizované peptidy byly rozpuštěny v DMSO a uskladněny při -20°C při koncentraci 5-10 mM.

Vazba syntetických peptidů reprezentujících často se vyskytující T pomocné epitopy HLA molekul in vitro

Vazba peptidů na HLA molekuly povrch antigen prezentujících buněk je předpokladem pro aktivaci T lymfocytů. Vazba byla posuzována in vitro dvěmi nezávislými biochemickými analýzami za použití rekombinantních rozpustných verzí molekul HLA třídy II. Jedna analýza měří kompetitivní nahrazení označeného referenčního peptidů závislé na koncentraci testovanými peptidy. Druhá analýza je založena na tvorbě SDS-stabilních komplexů po vazbě vysoce- a středně-afinitních ligandů. Souhrn výsledků získaných dvěmi analýzami je uveden v Tabulce 5.

Rozpustné HLA molekuly (DRAl*0101/DRBl*0101 a DRAl*0101/DRBl*0401) byly exprimované v buňkách SC-2 a purifikovány, jak je popsáno v publikaci Aichinger et al., 1997. Pro kompetitivní analýzu (Hammer et al. 1995) byly použity HLA molekuly mezi 50 a 200 ng/jamku. Pro DRB1*0101 byl použit biotinyiovaný indikátorový peptid HA (PKYVKQNTLKLAT, Valli et al. 1993) v koncentraci 0.008 uM. Pro DRBl*0401 byl použit biotinyiovaný indikátorový peptid UD4 (YPKFVKQNTLKAA, Valli et al. 1993) v koncentraci mezi 0.03 a 0.06 uM. Testované peptidy byly použity v sérii ředění od 0.02 nM do 200 uM. Molekuly, indikátory a testované peptidy byly inkubovány přes noc při 37°C, pH 7. Komplexy HLA:peptid získané po inkubaci se sérií ředění testovaných a referenčních peptidů (známé vysoce-afinitní vazebné látky HA a UD4 byly použity jako pozitivní kontrola) byly zachyceny v ELISA destičkách potažených protilátkou L243, o které je známo, že rozpoznává konformační epitop vytvořený pouze správně asociovanými heterodimery. Inkorporovaný biotin byl měřen standardní kolorimetrickou detekcí za použití konjugátu streptavidin-alkalické fosfatázy (Dako) s NBT/BCIP tabletami (Sigma) jako substrát a automatizovaného odečetu OD na čtecím zařízení Victor (Wallac).

Odpověď T lymfocytů proti často se vyskytujícím T pomocným epitopům posuzovaných analýzou IFNg ELIspot

Po antigenní stimulaci T lymfocyty začínají proliferovat a sekretovat cytokiny, jako jsou například interferon gamma (IFNg). Lidské T lymfocyty specificky rozpoznávající epitopy antigenů S.aureus byly detekovány pomocí· IFNg-ELIspot (Schmittel et al. 2000). PBMC od zdravých jedinců se silnou anti-S. aureus IgG odpovědí byly izolovány z 50-100 ml žilní krve pomocí ficoll denzitní gradientově centrifugace a použity po zamražení a rozmražení. Buňky byly umístěny v množství • ·

200,000/jamku do 96-jamkových destiček. Peptidy byly přidány jako směsi odpovídající na jednotlivé antigeny, v obou případech při koncentraci 10 ug/ml. Concavalin (Amersham) a PPD (purifikovaný proteinový derivát tuberkulinu, Statens Sérum Institute) sloužily v analýze jako positivní kontroly, médium pro analýzu bez jakéhokoli peptidu jako negativní kontrola. Po inkubaci přes noc v Multi Screen 96-jamkových filtračních destičkách (Millipore) potažených s antilidskou IFNg monoklonální protilátkou B140 (Bender Med Systems) byl vyvinut ELIspot za použití biotinylované antilidské IFNg monoklonální protilátky B308-BT2 (Bender Med Systems), a substrátů Streptavidin-alkalické fosphatázy (DAKO) a BCIP/NBT alkalické fosfatázy (SIGMA). Spoty byly počítány za použití automatického čtecího zařízení destiček (Bioreader 2000, BIOSYS). Spots spočítané v jamkách s buňkami stimulovanými pouze médiem pro analýzu (negativní kontrola, obecně pod 10 spotů/ 100000 buňěk) byly považovány za pozadí a odečteny od počtu spotů v jamkách s peptidy.

Tabulka 5: Často se vyskytující T pomocné epítopy obsažené v antígenech S.aureus

Aminokyselinové sekvence antigenů S.aureus obsahujíci často se vyskytující T pomocné epitopy	Vazba 1)	IFNg ELIspot 2)
Sekv. ID 56 (LPXTGV): poz. 6-40 p6-28 >PKLRSFYSIRKSTLGVASVIVST// p24-40 >VIVSTLFLISQHQAQA//	+	44;80;8; 95; 112
Sekv. ID 56 (LPXTGV): poz. 620-646 P620-646 >FPYIPDKAVYNAIVKWVANIGYEGQ//	+
Sekv. ID 56 (LPXTGV): poz. 871-896 P871-896 >QSWWGLYALLGMLALFIPKFRKESK//	-
Sekv. ID 70 (LPXTGIV): poz. 24-53 p24-53 >YSIRKFTVGTASILIGSLMYLGTQQEAEA//	nd	34;14;0; 57; 16
Sekv. ID 74 (ORFlhoml): poz. 240-260 p240-260 >MNYGYGPGWTSRTISASQA//	+	47;50;0; 85; 92

• · • ···· ···

Sekv. ID 81 (EM BP) : poz. 1660-1682 P1660-1682 >NEIVLETIRDINNAHTLQQVEA//	nd	2;14;5; 77 ? 26
Sekv. ID 81 (EM_BP): poz. 1746-1790 P1746-1773 >LHMRHFSNNFGJSTVIKNAIGWGISGLLA// P1753-1779 >NNFGNVIKNAIGWGISGLLASFWFFI// P1777-1789 >FFIAKRRRKEDEE/	nd nd nd
Sekv. ID 83 (Autolysin) poz. 1-29 pl-2 9: >MAKKFNYKLPSMVALTLVGSAVTAHQVQA//	nd	6;35;7; 60; 49
Sekv. ID 83 (Autolysin) poz. 878-902 P878-902: >NGLSMVPWGTKNQVILTGNNIAQG/	nd
Sekv. ID 89 (ORFlhomž) : poz. 96-136 P96-121 >GESLNIIASRYGVSVDQLMAMINOKYSELINY nnlrg// P117-136 >NNLRGYLIMPNQTIjQIPNG//	-	Q;35;0; 29, -104
Sekv. ID 94 (EMPBP): poz. 1-29 p4-29 : >KLLVLTMSTIJATQIMN3NHAKASV//	+
Sekv. IQ 94 (EMPBP): poz. 226-269 P226-251 >IKINHFCWPQINS FKVIPPYGHNS// p254-270 >MHVPSFQNNTTATHQN//	+	26;28;1 6; 43; 97
Sekv. ID 94 (EMPBP): poz. 275-326 P275-299 >YDYKYFYSYKWKGVKKYFSFSQS// P284-305 >YKWKGVKKYFSFSQSNGYKIG// p306-326 >PSLNIKNVNYQYAVPSYSPT//	+ + +
Sekv. ID 114 (PQV2) j poz, 23-47 p23-47 >AGGIFYNQTNQQLLVLCDGMGGHK//	-	49;20; 4;77;25
Sekv. ID 114 (PQV2): poz, 107-156 P1Q7-124 >ALVFEKSWIANVGDSRA/ P126-146 >RAYVINSRQIEQITSDHSFVN// P142-158 >SFVNHLVLTGQITPEE//	nd nd
Sekv. ID 142 (LPXTGVI): poz. 1-42 p6-30 >KEFKSFYSIRKSSLGVASVAISTL// pl8-42 >SSLGVASVAISTLLLLMSNGEAQA//	++ nd	0;41;20; 88;109
Sekv. ID 142 (LPXTGVI): poz, 209-244 p209-233 MKLVSYDTVKDYAYIRFSVSNGTKA// p218-244 >KDYAYIRFSVSNGTKAVKIVSSTHFNN//	+ +
Sekv, ID 142 (LPXTGVI): poz. 395-428 P395-418 >FMVEGQRVRTISTYAINNTRCTIF// P416-428 >TIFRYVEGKS1YE//	-
Sekv. ID 142 (LPXTGVI): pos. 623-647 P623-647 >MTLPLMALLALSSIVAFVLPRKRKN //

• ·

¹¹ vazba k solubilním molekulám DRAl*0101/DRBl*0401 byla určena za použití kompetitivní analýzy ( + , ++: vazba, žádná kompetice do 200 uM testovaného peptidu; nd: neprovedeno) ²⁾ výsledky od 5 zdravých jedinců se silnou anti-S.aureus IgG odpovědí. Data jsou reprezentovány jako spoty/200000 buněk (hodnoty pozadí jsou odečteny)

5. Antigeny mohou být injikovány myším - a protilátky proti těmto proteinům mohou být měřeny.

6. Protektivní kapacita protilátek indukovaných antigeny prostřednictvím vakcinace mohou být posouzeny na zvířecích modelech.

5. i 6. jsou způsoby dobře dostupné osobě znalé oboru.

Příklad 7: Aplikace

A) Účinná vakcína nabízí velký potenciál pro pacienty obecně čekající na elektivní chirurgický výkon, a obzvláště pacienty, kterým má být aplikováno endovaskulární zařízení. Pacienti trpící chronickým onemocněním se sníženou imunitní odpovědí nebo podstupující kontinuální ambulantní peritoneální dialýzu budou mít pravděpodobně prospěch z vakcíny se S. aureus v důsledku imunogenních antigenů reaktivních se sérem podie předkládaného vynálezu. Identifikace relevantních antigenů pomůže generovat účinnou pasivní immunizaci (léčba humanizovanými monoklonálními protilátkami), které mohou nahradit u člověka podávání imunoglobulínů se všemi nebezpečnými vedlejšími účinky. Proto účinná vakcína nabízí velký potenciál pro pacienty obecně čekající na elektivní chirurgický výkon, a obzvláště pacienty, kterým má být aplikováno endovaskulární zařízení. S. aureus může způsobit mnoho různých onemocnění.

1. Sepse, baktériemie

2. Bakteriémie u hemodialyzovaných pacientů, sepse

3. Pacienti na peritoneální dialýze - peritonitis

4. Pacienti s endovaskulárními zařízeními (chirurgie srdce, atd.) - endokarditis, bacteriémie, sepse

5. Ortopedičtí pacienti s protézami - septická artritis

6. Preventivní vakcinace obecné populace

B) Pasivní a aktivní vakcinace, se zvláštní pozorností k T lymfocytům s následujícím: Cílem je indukovat silnou T pomocnou odpověd během vakcinace, aby bylo dosaženo účinné humorální odpovědi a také imunologické paměti. Dosud neexistuje důkaz, že T lymfocyty hrají důležitou roli pro zbavení se infekce způsobené S. aureus, tato otázka však nebyla dosud dostatečně řešena. Účinná humorální odpověď proti proteinovým antigenům musí zahrnovat pomoc T lymfocytů a je nezbytná pro rozvoj paměti. Naivní CD4+ lymfocyty se mohou diferencovat na Thl nebo Th2 lymfocyty. Protože přirozená imunologická odpověd (cytokiny) ovlivní toto rozhodnutí, měla by být role T lymfocytů během akutní, těžké infekce relativně odlišná v porovnání s imunizací zdravých jedinců subjednotkovými vakcínami neobsahujícími složky, které narušují imunitní odpověď během přirozeného průběhu infekce. Následky indukce Thl nebo Th2 odpovědí jsou výrazné. Thl lymfocyty vedou k buněčně zprostředkované imunitě, zatímco Th2 lymfocyty poskytují humorální imunitu.

C) Preventivní a terapeutické vakcíny

Preventivní: aktivní vakcinace/pasivní imunizace skupin lidí s vysokým rizikem před infekcí Terapeutické: pasivní vakcinace již nemocných,

Aktivní vakcinace k odstranění nazálního nosičství • · < ·* * · · · •fr « · · · ·· < * » ··· * · · » · - · • ··· · · · · · · t ···· • · · · · · · » ··· ·· »· ··* ·· ·

Specifické příklady použiti

Elimination of MRSA nosičství a prevence kolonizace zdravotnického personálu

Frekvence nosičství S. aureus v nosní dutině lidí mimo nemocnice je v rozmezí 10 až 40%. Nemocniční pacienti a personál mají vyšší výskyt nosičství. Výskyt je obzvláště vysoký pacientů podstupující hemodialýzu a u diabetiků, narkomanů a pacientů s celou řadou dermatologických nemocí. Pacienti s nejvyšším rizikem MRSA infekce jsou pacienti hospitalizovaní ve velkých nemocnicích terciární péče, obzvláště staří a imunokompromitovaní pacienti, pacienti na jednotkách intenzivní péče, pacienti s popáleninami, pacienti s chirurgickými ranami a pacienti s intravenózními katétry.

Výsledky z ELISA analýz silně naznačují, že existuje silná IgA odpověd na S. aureus, která není zřejmá nebo známá z literatury. Protože predominantní slizniční imunitní odpovědí je produkce IgA s neutralizační aktivitou, je jasné, že stafylokokové epitopy a antigeny identifikované s vysoce čistými IgA přípravky vedou k účinné slizniční vakcíně.

• Jasná indikace: Ohrožení každého provádějí operace (obzvi. ortopedie, chirurgie) • Dobře definovaná populace pro zdravotní sestry) v odděleních, kde se traumatologie, obecná vakcinace (lékaři a • Zdravotničtí pracovníci identifikovaní jako intranazální nosiči epidemického kmene S. aureus jsou v současnosti léčeni mupirocinem a rifampicinem, až do eliminace baktérie. Tento způsob není někdy účinný a stojí šas.

• Dostupný zvířecí model: Existují zvířecí modely pro intranazální nosičství.

Tabulka 1: ELISA titry sér od neinfikovaných jedinců proti mnoha stafylokokovým proteinům

•«±

ní

I*~

°í

ví

§

-ti

O\ a£

so

sd vT

(ί

- d, n.

xá

s£

d

ví

06

~Su,

!J

1 i_;

£

c£

d.

VÍ

□

[1

Ί o «i

L

s'J

1 id.

..xn

d

Ov O

s X£L

60

• • • Jft-.

§.·

•

i

m

s

2 4

: d

tt

i

: •

$

í .. ra

i -ia.

M“

m

r—

í ní

w JL

s ci

-«£

d

: oo

t VÍ

n

s 2

1

1 d

i l ví

§· Q

2 -4

VÍ

ví

JL·

• • • -fl&J

-ΓΟ-

id

.. Ó ·. ω

„.CL

ví

i n.

d

n

JL

r d

· « « « « • -t*

VÍ

TÍ-’

L.

S (

J

d

« * * ' « « «

'O v? V

□

íj

!1

1

—c±

3t

—2CL

SQ

r*

sa

flk

o

CS

<*»

V>

so —»<

r- -

06 «—<

O\

O ΓΜ

es

1*

Γ

O\

§ L2

£Í

m

°1

co

£Í

•

,JC

0

—fifi

JL

ΫΪ

1 o o

sí£

*1 n-

n

r-Ί

KfT

c

LP342

<n

<n

§ s

L~

«tí·

1

rj

« « « « « «

—st.

J

• * •

r±

0

řsí

v

rj

s£

X : iá

'1

$

s 1

.až

- X X X VÍ

73

w _

í _ci

j t -s£

•

F7

§ Ih ,. ,

i x ^3

r<

M·

X

' 8 + Q

: -JEL

.r-í

X •d

X oo Ctí

a<x

r;

i

a

t»4

a

2

s

« « a

» X a : cž

<d r>f

X

LTA.

od

co

BHI tysate

*© ..3l·

-až

vo v?

i co

a

-S.

-φ —CL

53

%> n

Sl

oo fM

Os _Cá.

O _m.

- m

<s _ m

<n m

Ό

Ό

r-

00

O\

o

L—IXU

ί vJ

• · · • · · * · · · • · · · · ·

Tabulka 1: ELISA titry sér od neinfikovaných jedinců proti mnoha stafylokokovým proteinům

Hladiny antistafylokokových protilátek byly měřeny jednotlivě standardní ELISA analýzou s celkovým lyzátem připraveným ze S. aureus kultivovaným v BHI médiu (BHI) proti lipoteichoové kyselině (LTA), peptidoglykanu (PG), 13 rekombinantním proteinům, reprezentujících proteiny buněčného povrchu a sekretovanými proteiny, jako jsou například aglutinující faktor A a B (ClfA, ClfB), Fibronektin vázající protein (FnBPA), SD-repeat proteiny (sdrC, sdrE), proteiny analogiclé proteinům MHC třídy II (map-w), Elastin vázající protein (EBP), enoláza (která byla popsána, že je imunogení a lokalizována na buněčném povrchu), lipoproteiny transportující železo (LP309, LP342), sortáza (srtA), koaguláza (coa), extracelulární fibrinogen vázající protein (fib). Jako antigeny byly také zahrnuty dva krátké syntetické peptidy reprezentující 2 z pěti imunodominantních D repetitivních domén z FnBPA (E1+D3) . Jednotlivá séra byla klasifikována na základě IgG titru a bylo získáno skóre z 1-9. Skóre 1 označuje nej vyšší titr séra a skóre 8 nebo 9 označuje séra, která byla 8. nebo 9. mezi všemi séry testovanými pro daný antigen. Toto vedlo k analýzám horniho 20. percentilu sér (8-9/40) . Pět nej lepších sér znamená nejhyperreaktivnější ve smyslu, že antistafylokokové protilátky byly vybrány na základě čísla skóre 1-8. **** znamená, že protilátková reaktivita proti konkrétnímu antigenu byla výjimečně vysoká (>2x ELISA jednotek relativně k 2. nej reaktivnějŠímu séru).

Tabulka 2a: Imunogenní proteiny identifikované bakteriálním, povrchovým a ribosomóvým zobrazením: S. aureus

Bakteriální povrchové zobrazení: A, LSA250/1 knihovna ve fhuA se sérem pacienta 1 (655); B, LSA50/6 knihovna v lamB se sérem pacienta 1 (484); C, LSA250/1 knihovna v fhuA s IC sérem 1 (571); E, LSA50/6 knihovna v lamB s IC sérem 2 (454); F, LSA50/6 knihovna v lamB se sérem pacienta PI (1105); G, «·> · * · · · · ·· ··· ·· · ···· • ····· « · ·· ····

LSA50/6 knihovna v lamb s 1C sérem 1 (471); H, LSA250/1 knihovna v fhuA se sérem pacienta 1 (IgA, 708).

Ribosomové zobrazení: D, LSA250/1 knihovna s 1C sérem (1686). ★, identifikována 18 krát ze 33 vyhledávání; byla proto eliminována z vyhledávání C. ★*, predikce antigenních sekvencí delších než 5 aminokyselin byla provedena programem ANTIGENIC (Kolaskar a Tongaonkar, 1990); #, identická sekvence přítomná dvakrát v ORF; ##, klon nepřítomný v databázi (nesekvenován TIGRem) • · ·

s. aureus antigenní protein	staré číslo ORF	Domnělá funkce (podle homologie)	predikované ímunogenní ak**	č. vybraných klonů na ORF a vyhledán i	Místo identifikované Ímunogenní oblasti	Reaktivita séra s relevantní oblastí (pozitivní/celkový)	Sekv. ID č. : (DNA +Prot)
SaA.0003	ORF2963P	repC	5-20,37-44,5259, 87-94, 1 16-132	C:3	aminokyseliny 112-189	C:GSBYM94012189):26/30	171, 172
SaA0003	ORF2967P	repc	7-19,46-57, 85-91, 110- 117,125-133, 140-149, 156- 163, 198- 204,236- 251, 269-275, 283- 290, 318323, 347-363	C:18	Aminokyseliny 9-42 aminokyseliny 158-174	C:GSBYI53(942): 1/1	150, 158
0093	ORF1879	SdrC	23-51,75-80, 90-99, 101- 107, 151-157, 173-180, 186- 205, 215-226, 239-263, 269- 274, 284-304, 317-323, 329- 336, 340-347, 360-366, 372-379, 391- 397, 399-406, 413-425, 430- 436, 444-455, 499-505, 520-529, 553- 568, 586-592, 600-617, 631- 639, 664-678, 695-701, 891-903, 906- 912, 926-940	A:1,D:5, C:1,F:6, G:2	aminokyseliny 98-182 aminokyseliny 684-764 aminokyseliny 836-870	A:GSBXL70(98182):9/30 D:n.d. C:GSBZA73(815870):3/16	34,86
0095	ORF1881	SdrE	25-45,72-77, 147-155, 198- 211, 217-223, 232— 238, 246-261, 266-278, 281- 294, 299-304, 332-340, 353-360, 367- 380, 384-396, 404-409, 418- 429, 434—440, 448-460, 465-476, 493- 509, 517-523, 531-540, 543- 555, 561-566, 576-582, 584-591, 603- 617, 633-643, 647-652, 668- 674, 677-683, 696-704, 716-728. 744- 752, 755-761, 789-796, 809- 815, 826-840, 854-862, 887-903, 918- 924, 1110-1116,	C:12,E:2	aminokyseliny 147-192	C:GSBYH31(147192):2/14 EGSBZA27(144162)53/41	145, 153

• · • ·

			1125-1131, 1145-1159
0123	ORF1909	ne známá	9-28,43-48,5675, 109-126, 128-141, 143162, 164-195, 197-216, 234242,244-251	B:3,E:7, G:1	aminokyseliny 168-181	B:GSBXF80(168181):5/27 E:GSBZC17(168181)05/41	35, 87
0160	ORF1941	neznámá	4-10, 20-42, 50-86, 88-98, 102-171, 176- 182, 189-221, 223-244, 246268,276-284, 296-329	A:1	amino ky s el iny 112-188	A:GSBX007(112188) -.5/30	36,88
0222	ORF1988	homologie s ORF1	4-9, 13-24, 26-34, 37-43, 45-51, 59-73, 90-96, 99-113, 160-173, 178- 184, 218-228, 233-238, 255262	A: 52, C:18*. H:I9	aminokyseliny 45-105 aminokyseliny 103-166 aminokyseliny 66-153	A:GSBXM63(6595): 1/1 A:GSBXM82(103-166): 14/29 A:GSBXK44-bmd3{651S3):47/51	37,89
0308	ORF2077	Komplement, neznámá	13-27,42-63, 107-191, 198- 215, 218-225,233- 250	A:6, B:2, C:47, E--35	complement bp 474-367	A:GSBXK03(bp473 -367):28/69 B-.GSBXD29 (bp465 -431):10/27	38, 90

• · • · · • · · · ·

• ·

s. aureus antigenní protein	staré číslo ORF	Domnělá funkce (podle homologie)	predikované imunogenní ak**	Č. vybraných klonů na ORF a vyhledán i	Místo identifikované imunogenní oblasti	Reaktivita séra s relevantní oblastí (pozitivní/celkový )	Sekv. ID č. : (DNA +Prot)
0317	ORF2088	preprotein translokáza seca subjednotka	16-29, 64- 77, 87-93, 95-101, 127- 143, 150- 161, 204- 221, 225- 230, 236- 249, 263- 269, 281- 309, 311- 325, 337- 343, 411- 418, 421- 432, 435- 448, 461- 467, 474- 480, 483- 489, 508- 516, 542- 550, 580- 589, 602- 611, 630- 636, 658- 672, 688705, 717- 723, 738- 746, 775- 786, 800- 805, 812- 821, 828- 834	A:1	Aminokyseliny 1-19	A:GSBXP37(1-19) : 6/29	39, 91
0337	ORF2IIO	Hypotetický pro tein	26-53,95123, 164- 176, 189- 199	D:12	aminokyseliny 8-48	D:n.d	40, 92
0358	ORF2132	Aglutinační faktor A	8-35, 41- 48, 59-66, 87-93, 139- 144, 156-163, 198-209, 215-229, 236- 244, 246- 273, 276- 283, 285326, 328- 342,349- 355,362- 370.372- 384, 396- 402,405- 415, 423- 42S, 432-452, 458-465, 471-477, 484- 494, 502- 515, 540- 547, 554- 559, 869-875, 893-898,	C:l, D:2, E:1	aminokyseliny 706-809	D:n.d	41, 93

			907-924
0360	ORF2135 Empbp	extracelulárni matrix a plazmatický vazebný protein	7-13, 15- 23, 26-33, 68-81, 84- 90, 106-117, 129-137, 140-159, 165- 172, 177- 230, 234- 240, 258278, 295-319	A:46, B:21, C:11,E:2, F:18,G:7, H: 12	aminokyseliny 22- 56 aminokyseliny 23- 99 aminokyseliny 97-115 aminokyseliny 233-250 aminokyseliny 245-265	A:GSBXK24(23-55): 1/1 B:GSBXB43(39-54): 58/71 AK3SBXK02bmdl(22-99):59/59 B:GSBXD82-bdbl9 (97-115):1/1 F:SALA103(233250):15/41
0453	ORF2227	Coma operon protein 2	17-25, 27- 55, 84-90, 95-101, 115-121	C:3	aminokyseliny 55-101	C:GSBYG07(55101): 1/1	146, 154
0569	ORF1640	V8 proteáza	5-32, 66- 72, 87-98, 104-112, 116- 124, 128- 137, 162- 168, 174- 183, 248-254, 261-266, 289-303, 312-331	A:1,F:1	aminokyseliny 174-249	A:GSBXS51(174249): 11/30	32,84

• · ·

s. aureus antigen ní protein	staré Číslo ORF	Domnělá funkce (podle homologie)	predikované imunogénní ak**	č. vybraný ch klonů na ORF a vyhledá ní	Místo identifik ováné imunogenn í oblasti	Reaktivita séra s relevantn i oblastí (pozitivní/ celkový)	Sekv. ID č. : (DNA +Prot)
0576	ORFI633 Autolysin	autolysin, adheze	4-19, 57-70, 79-88, 126-132, 144-159, 161-167, 180-198, 200-212, 233-240, 248-255, 276-286, 298-304, 309-323, 332-346, 357-366, 374-391, 394-406, 450-456, 466- 473, 479-487, 498-505, 507-519, 521-530, 532-540, 555-565, 571-581, 600-611, 619-625, 634-642, 650—656, 658—665, 676-682, 690- 699, 724-733, 740-771, 774-784, 791-797, 808-815, 821-828, 832-838, 876-881, 893-906, 922-929, 938-943, 948-953, 969-976, 1002-1008. 1015-1035, 1056- 1069, 1105-1116, 1124-1135, 1144- 1151, 1173-1181, 1186-1191, 1206- 1215, 1225-1230, 1235-1242	A:21, B:46, C:55, E:5, F:85, H:19	Aminokyse líny 6-66 aminokyse liny 65124 aminokyse liny 579592 aminokyse liny 590604	A:GSBXN93(6 -66):5/16 C:GSBYHOS(4 5-144):7/8 A:GSBXK66Bmdl8(65124): 16/30 B:GSBXB89 (108-123): 1/1 B:GSBXB02(S 90-603): 39/71 F:SAIAM15(5 79-S92): 25/41	31,83
0657	ORF neznámé	LPXTGVI protein	9-33, 56-62, 75-84, 99-105, 122-127, 163-180, 186192,206-228, 233-240, 254-262, 275-283, 289-296, 322-330, 348-355, 416-424, 426-438, 441-452, 484-491, 541-549, 563-569, 578-584, 624-641	A:2,B:2 7, F:15	aminokyse liny 527544	B:OSBXE07- Mbl(527- 542):11/71 F:SALftX7Q(5 26-544): 11/41	1, 142
0749	ORF1462	Karbamoyl fosfát syntáza	8-23, 31-38, 42-49, 61-77, 83-90, 99-108, 110-119, 140-147, 149-155, 159-171, 180-185, 189-209, 228-234, 245-262, 264-275, 280-302, 304-330, 343-360, 391-409, 432-437, 454-463, 467-474, 478-485, 515-528, 532-539, 553-567, 569-581, 586-592, 605-612, 627-635, 639-656, 671-682, 700-714, 731-747, 754-770, 775-791, 797-834, 838-848, 872-891, 927-933, 935-942, 948-968, 976-986, 1000-1007, 10291037	c:2	aminokyse liny 630700	C:GSBYK17(6 30-700):5/9	144, 152

944	ORF1414	Yfix	6-33,	40-46,	51-59,	D:4	aminokyse	D:n.d.	30,82
			61-77	, 84-104,	112-		líny 483-
			118,	124-187,	194-		511
			248,	252-296,	308-
			325,	327-361,	367-
			393,	396-437,	452-
			479,	484-520,	535-
			545,	558-574,	582-
			614,	627-633,	656-
			663,	671-678,	698-
			704,	713-722,	725-
			742,	744-755,	770-
			784,	786-800,	816-
			822,	827-837
1050	ORF1307	neznámá	49-72	,76-83, 95	-105,	A:1,H:	aminokyse	A:GSBXM26(5	28,80
			135-146, 148-164,	45	liny 57-	7-128):7/30
			183-205			128

• ·

s.

aureus antigenní protein

1209

1344

1356

1361

1371 staré číslo

ORF

ORF300

ORF02I

Domnělá predikované funkce imunogenní ak** (podle homologi

e) hemN homolog

NífS protein homolog

ORF019 Hypoteti 7 cká _ proteáza

ORF019 LPXTOV 0 protein

ORF017

YtpT, konzervo váný hypoteti cký protein

12-36,43-50,58-65

73-78,80-87,108139,147-153,159172,190-203,

211-216,224-232,

234-246,256-261,

273-279,286-293,

299-306,340-346,

354-366

8-16,22-35, 4958,70-77,101121,123-132,147161,163-192,203209,216-234,238249,268-274,

280-293,298318,328-333,339345,355-361,372381_

28-55,82-100,105111,125-131, 137-143_

5-39,111-117,125132,134-141,

167-191,196202,214-232,236241,244-249,292297,319-328,

336-341,365380,385-391,407416,420-4229,435441,452-461,

477-488,491498,518-532,545556,569-576,581587,595-602,

604-609,617640,643-651,702715,723-731,786793,805-811,

826-839,874-889

37-42,57-62,121135,139-145,

183-190.204212,220-227,242248,278-288,29530,304-309,

335-341,396404,412-433,443449,497-503,505513/539-545,

552-558,601617,629-649,702711,736-745,793804,814-829,

843-858,864885,889-895,905913,919-929,937943,957-965,

970-986,9901030,1038-1049,

1063-1072,10801091,1093-1116,

1126-1136,11451157,1163-1171,

1177-1183,11891196,1211-1218,

1225-1235,12421256,1261-1269

č.

vybraných klonů na ORF vyhledání

B:7, F:8

A:ll

D:12

A:1,B:23

E:3,F:31

C:3,E:2,

G:1

Místo ídentifik

Reaktivita séra

Sekv. ID č.:

ováné a imunogenn i oblasti aminokyše líny 167181 aminokyše liny 3494

Aminokyse liny 1-49 aminokyse liny 3749 aminokyse liny 6377 aminokyse liny 274334 aminokyse liny 624684 aminokyse liny 891905 s relevantní oblastí (pozitivní/ce (DNA +Prot) ikový)

B:GSBXB76(167 -179):25/71 F:SALBC54(169 -183):18/41

AK3SBXK59bmd21(34-94)

6/29 :nd.

B:GSBXF81(3749): 1/1 B;GSBXD45bdb4(62-77): 12/70

A-.GSBXL77 (274 -334):5/30 F:SA1AP81(6277):10/41

C:GSBYG95(624 -684):7/22 E:GSBZB45(891 -905):10/41

54,

106

5,141

4,57

3,56

143,151

1491	ORF005 3	homolog Cmp vazebnéh o faktoru 1	12-29,34-40,63- 71,101-110,114- 122,130-138,140- 195,197-209, 215-229,239- 253,255-274	A:7,C:2, E:7,F:4	aminokyse líny 3994	A:GSBXM13(3994/:10/29 F:SALAY30(3953) :4/41	2,55
1616	0RF118 0	homolog leukocid inu F	16-24,32-39,43- 49,64-71,93-99, 126-141,144- 156,210-218,226- 233,265-273,276- 284	A: 10	aminokyse liny 158220	A:GSBXK06(158 -220):8/29	27, 79
1618	0RF117 8	LukM homolog	5-24,88-94,102- 113,132-143, 163-173,216- 224,254-269,273- 278.305-313,321- 327,334-341	A:13, B:3 C:36, E:4, F:12,G:2, H:10	aminokyse liny 3161 aminokyse liny 5874	A:GSBXK6O(3161) :20/29 B:GSBXB48(5874):49/71 F:SALAY41(5874):30/41	26,78

• · · · ·

s. aureus antigen ní protein	staré číslo ORF	Domnělá funkce (podle homologie)	Predikované imunogenní ak**	č. vybraných klonů na ORF a vyhledání	Místo identifik ováné imunogenn i oblasti	Reaktivita séra s relevant ni oblastí (pozitivní /celkový)	Sekv. ID č. : (DNA +Prot)
1632	ORFII63	SdrH homolog	7-35,54-59,247-261, 263-272,302-320, 330-339,368-374,382- 411	B:6,E:11, F:34	aminokyše liny 105119 aminokyse liny 126143 aminokyse liny 168186	B:GSBXG53 (168-186): 39/71 F:SALAP07( 105- 119:11/41	25, 77
1763	ORFI024	neznámá	5-32,35-48,55-76	C:3	komplemen t bp 237-1 70	C:GSBYI30( 98 aminokysel iny ):1 n	24,76
1845	ORF0942	Hyaluronát lyáza	10-26,31-44,60- 66,99-104,146- 153,163-169,197- 205,216-223, 226-238,241-258,271- 280,295- 315,346-351,371- 385,396-407, 440-446,452-457,460- 466,492- 510,537-543,546- 551,565-582, 590-595,635-650,672- 678,686- 701,705-712,714- 721,725-731, 762-768, 800-805	D:5, F:2	Aminokyse liny 208224 aminokyse liny 672727	D:n.d.	23, 75
1951	ORF0831	homologie s ORF1	5-22,42-50,74- 81,139-145,167- 178,220-230,246- 253,255-264	A: 223, B-56, C:167, E:43, F:100, G:13, H:102	aminokyse liny 137237 aminokyse liny 250267	B:GSBXC07( 180- 190):1/1 A:GSBXK29( 177- 195): X5/29 B:GSBXD43( 250-267): 10/71 F:SALAM13( 178- 191): 20/41	22,74
1955	ORF0826	homologie s ORFl	4-9,15-26, 65-76,108115,119-128,144-153	A:l, B:3, E:1,F:8	aminokyse liny 3852 aminokyse liny 66114	Ασε BXR10(66 -114): 5/30 F:SAIAM67( 37-52) : 16/41	21,73
2031	ORF0749	neznámá	10-26,31-43,46- 58,61-66,69-79, 85-92,100-115,120- 126,128-135, 149-155,167-173,178- 187,189- 1961202-222,225- 231,233-240, 245-251,257-263,271- 292,314- 322,325-334,339-345	B:2, F:2	aminokyse liny 5974	B:GSBXC01 (59-71): 11/26	20,72
2086	ORF0691 Sbi	IgG vazebný protein	6-20,53-63,8390,135-146,195208,244-259,263314,319-327, 337-349,353-362,365374,380- 390,397-405,407-415	A:1,B:8, E;24, F3, G:137	aminokyse liny 208287 aminokyse liny 261276 aminokyse liny 286314	A.-GSBXS55 (208-287): 38/46 B:GSBXB34 (299-314): 11/71 F:SALAX32 (261-276) : 21/41	19, 71

• · staré číslo

ORF

Domnělá funkce (podle homologie)

s.

aureus antigen ní protein

č.

vybraných klonů na

ORF i vyhledání

Místo identifik ováné imunogenn oblasti

2180

2184

2186

ORF0594

ORF0590

ORF0588

LPXTGIV protein

FnbpB

Fnbp

Predikované imunogenní ak**

11-20,26-47,6975,84-92,102109,119-136,139147,160-170,

178-185,190196,208-215,225233,245-250,265272,277-284,

300-306,346357,373-379,384390,429-435,471481,502-507,

536-561,663688,791-816,905910,919-933,977985,1001-1010,

1052-1057,10701077,1082-1087,

1094-1112

5-12,18124,139154-166,

181,185199,203244,268278-292,

307,309t

364,375404,430450-461,

495,505

535,551573,587599-609,

631,651671,714766,799818-825,

833,841861,876903,927

8-29, 96121,123141-147, 165,171206,222265,267294-300, 312,332368,377402,410451-459, 489,497543,549600,§23643-649, 666,680700,707 727,770822,874 889,897917,925 939,946 973,997

37,104145,

175190,193209,235274,

299320,356384,390440,

488511,527556,567593,

624656, 665726,754804,

827847,855893,895940

105,

129,

151183,

232,

277,

302338,

383,

416,

473503,

559,

629,

655687,

712,

782,

881,

903,

931,

963,

1010

11419825336239653758169472181088391193396549-56, 62-68,8389,92-98,109115,124-131,142159,161-167,

169-175,177188,196-224,230243,246-252

A:3,C:3,

E:6,F:2,

H:6

A:2,C:4,

G:9

A:4,C:4,

D:5,E:2

B:2

Reaktivita séra s relevantní oblastí (pozitivní/c elkový)

Sekv. ID č. :

(DNA + Prot) aminokyse liny 493587 aminokyse liny 633715 aminokyse liny 704760 aminokyse liny 7 60832 (aminokys elíny 832887) aminokyse liny 701777 aminokyse liny 783822 aminokyse liny 7 10-787 aminokyse liny 855975 aminokyse liny 916983 aminokyse liny 3446

A:GSBXS61(49 3-555): I/I A-.GSBXL64 (49 6-585): 1/1 A-.GSBXS92 (760-841): 1/1.

A:bmd4(704760):16/30¹ (A:bmd4(830885) -.16/30) F:SALBC43(51 9-533):4/41

A:GSBXM62 (702-777): 28/28 A:GSBXR22 (783-855): 1/1

C:GSBYN05 (710-787): 19/25 D:n.d. A:GSBXP01 (916-983): 17/30

B:GSBXD89 (34-46): 1/1

18,70

17, 69

16, 68

2224

ORF0551 neznámá

15, 67 staré číslo

ORF

Domnělá funkce (podle homologie)

s.

aureus antigen ní protein

č.

vybraných klonů na

ORF £ vyhledání

Místo identifik ováné imunogenn í oblasti

2254

2264

2268

2344

ORF05I9

ORF0509

ORF0503

ORF0426

Predikované imunogenní ak**

Konzervovaný hypotetický protein

ORF 1;

homologie s domnělým sekretovaným prekurzorem antigenů ze

S.

epidermidís

IsaA, možná adheze/ agregace

Aglutinační factor B

14-22,32-40,52-58,6177,81-93,111-117,

124-138,151-190,193214,224-244,253-277,

287-295,307-324,326332,348-355,357362,384-394,397434,437-460,489496.503-510,516522,528-539,541547,552-558,563-573,

589-595,602-624,626632,651-667,673689,694-706,712-739,

756-790

5-31,47-55,99-104,

133-139,156172,214-224,240-247

7-19,26-45,60-68,94100,111-119, 126-137, 143-148,169-181, 217-228

4-10,17

127,135

180,187224,244264,290356-366,

414,421437,442464-479,

512,548868,87145,120141,168208,216254,256312,322-330,

374-384,391428,430449,455-461,

483-492,501—

555,862876,891-904

10-29,46-56.63-74,83105,107-114,138145,170-184,186-193, 216-221,242-248,277289,303-311,346360,379-389,422-428, 446-453,459-469,479489,496-501

D:3

A: 131,

8:51,

C:13,

E:43,

F:78,G:2,

H:17 aminokyše liny 403462

Aminokyse liny 7-87 aminokyse liny 133242

Reaktivita séra s relevant ní oblastí (pozitivní /celkový)

D.n.d.

A:GSBXP22 (H5-196): 1/1

A: GSBXKOSbmdlě (178-218) :6/29

B:GSBXE24— bdb20(167Í78):1/1 F;SAIiAQ91( 173-184): 15/41

A:7,B:65,	aminokyse	A:GSBXK88(
C3,E:2,	liny 67-1	67-116):
F:53	16	1/1
	aminokyse	A:GSBXN19(
	liny 98-	98-184):
	184	22/29
	aminokyse	A:GSBXN32(
	liny 182-	182-225):
	225	34/71
		B:GSBXB71(
		196-209):
		16/29
		F:SALAL22(
		196-210):
		16/41

D:9,E:1,

F:3,H:4 aminokyse liny 706762 aminokyse liny 810852

D:n,d.

A:l, C:6 aminokyse liny 83156

A-.GSBX046 (83-156): 14/29

Sekv. ID č. : (DNA +Prot)

14, 66

13,65

12,64

11,63

2351

ORF04I8 aureolysin

10,62 • · staré číslo

ORF

Domnělá Predikované funkce imunogenní ak** (podle homologie)

č.

vybraných klonů na

ORF a vyhledání

Místo identifiko váné imunogenní oblasti

s.

aureus antigenní protein

2359

ORF040

ISSP, prekursor domnělého imunogenní ho sekretovan ého proteinu

4-29,92-99,119-130, 228-236,264-269, 271280,311-317,321-331, 341-353,357-363,366372,377-384,390-396, 409-415,440-448, 458470,504-520,544-563, 568-581,584-592, 594603,610-616

B:4,F:11

2378

ORF039

ORF030

SrpA

YycH protein

18-23,42-55,69-77, 8598,129-136,182-188,

214-220,229-235,

242-248,251-258,281292,309-316,333343,348-354,361-367,

393-407,441-447,481488,493-505,510-515,

517-527,530-335,

540-549,564-583, 593599,608-621,636-645,

656-670,674-687,

697-708,726-734,755760,765-772,785792,798-815,819-S24,

826-838, 846-852,889904,907-913,932—939,

956-964,982-1000,

1008-1015,1017—

1024,1028-1034,

1059-1065,10781084,1122-1129,

1134-1143,11801186,1188-1194,

1205-1215,12241230,1276-1283,

1333-1339,13771382,1415-1421,

1448-1459,14671472,1537-1545,

1556-1566,16471654,1666-1675,

1683-1689,17221737,1740-1754,

1756-1762,17641773,1775-1783,

1800-1809,18111819,1839-1851,

1859-1866,18761882,1930-1939,

1947-1954,19781985,1999-2007,

2015-2029,20802086,2094-2100,

2112-2118,21962205,2232-2243_

16-38,71-77,87-94,

105-112,124-144,158164,169-177,180-186,

194-204,221-228,236245,250-267,336-343,

363-378,385-394,406—

412,423-440,443-449

C:1,D:7,

F:4,H:11

0:14

Reaktivita séra s relevantní oblastí (pozitivníZe elkový)

aminokysel	B:GSBXDO1
iny	168-	(168-184):
184		1/1
aminokysel	B:GSBXD62
iny	206-	(205-220):
220		1/1
aminokysel	B:GSBXC17
iny	297-	(297-309)
309		6/27
		F:SAXiAL04
		(205-220):
		9/41

amino kysel lny 198258 aminokysel iny 646727 aminokysel iny 846857 aminokysel iny 21042206

Sekv. ID č. : (DNA +Prot)

9,61

C:GSBYI73 (646727): 2/9

F:SALA033 (846-857) :

10/41

D:n.d.

8,60

2466 aminokysel iny 401D:n.d.

7,59

494 • ·

ORF029

2470 9

Konzervová ný hypotetick ý protein

4-9,17-41,50-56,6369,82-87,108-115,145151,207-214,244-249, 284-290,308-316,323338,348-358,361-378, 410-419,445-451, 512522,527-533,540-546, 553-558,561-575,601608,632-644,656-667, 701-713,727-733, 766-780

C:3 • · * •v. · · · · · · « a ··· · · · . . . · • ··· « · « · · . » »*«· • · » · * * « » ··.*· * · «·· .· v aminokysel iny 414455

C:GSBYH6O(41 169 4-455):28/31 170 • · • · staré číslo

ORF

Domnělá funkce (podle homologie)

Místo identifik ováné imunogenn í oblasti

s.

aureus antigenni protein

2498

2548

2577

2642

2664

2670

2680

2740

QRF0267

ORF2711

ORF2683

ORF2614

ORF2593

ORF2588

ORF2S77

ORF2515

Predikované imunogenní ak** vybraných klonů na ORF i vyhledání

Reaktivita séra s relevant ní oblastí (pozitivní /celkový)

Sekv. ID č. : (DNA +Prot)

Konzervovaný hypotetický protein

IgG vazbebný protein

Hypotetický protein neznámá

Konzervovaný hypotetický protein

Transportér hexósy

Koaguláza

Hypotetický protein homologie s ORF1

33-43,45-51,57-63,

65-72,80-96,99110, 123-129,161171,173-179,185191,193-200,208224,227-246,252258,294-308,321329,344-352,691707

4-16,24-57,6573,85-91,95-102,

125-132,146152.156-163,184190,204-210,214221,242-252,

262-268,272279,300-311,320337,433-440,472480,505-523

4-21,49-56,6574,95-112,202208,214-235

34-58,63-69,7486,92-101,130-138,

142-150,158-191,

199-207,210-221,

234-249,252-271

7-37,56-71,74150,155-162,183203,211-222,224234,242-272

18-28,36-49,5662,67-84,86-95,

102-153,180195,198-218,254280,284-296,301325,327-348,

353-390,397402,407-414,431455

4-18,25-31,3540,53-69,89-102,

147-154,159165,185-202,215223,284-289,315322,350-363,

384-392,447453,473-479,517523,544-550,572577,598-604,

617-623

5-44,47-55,6268,70-78,93-100, 128-151,166171,176-308

D:12

A: 55, B:54, C:35, F:59, 0:56, H:38

C:6

C:1,E:1

0:35

D:16

C:26,

G-.4,

K:

D:4

A:1,H:13 aminokyse líny 358411 aminokyse líny 588606 aminokyse líny 1-48 aminokyse líny 47143 aminokyse líny 219285 aminokyse líny 345424 aminokyse líny 99171

Aminokyse líny 5-48 aminokyse liny 77128 aminokyse liny 328394 aminokyse liny 438516 aminokyse liny 505570 aminokyse liny 5696 19 aminokyse liny 63126

D:17/21

A:GSBXK68( 1-73): 21/30

A:GSBXK41( 47-135): 1/1

A:GSBXN38 ( 219-285): 19/3Ó A:GSBXL1 1(322-375) :10/30 B:GSBXB22( 406-418): 37/71

F: ŠALAMI 7 ( 406-418): 29/41

C:GSBYL56( 99-171): 1/1

C:bhe3(548):25/30

D:n.d.

D:n.d.

C:GSBYH16( 438-516): 3/5

CK5SBYG24( 505-570): 1/7

C:GSBYL82( 569-619): 2/7

A:GSBXO40( 66-123): 8/29

6, 58

53, 105

149,

157

52,104

51, 103

50,102

148,

156 aminokyse liny 1-59

D:n.d.

49, 101

2746

ORF2507

48, 100

5-12,15-20,43-49,

94-106,110-116,

119-128,153-163,

175-180,185-191,

198-209,244-252,

254-264,266-273,

280-288,290-297

2797	ORF2470	neznámá	10-27,37-56,64-	B:3, E:2,	aminokyse	B:GSBXE85(	47,99
			99,106-119,121-	F:13, H:3	liny 183-	183-200):
			136,139-145,148-		200	11/27
			178,190-216,		aminokyse	F:SALAQ47 (
			225-249,251-276,		liny 349-	183-200):
			292-297,312-321, 332-399,403-458		363	8/41

staré číslo

ORF

Domnělá funkce (podle homologie)

Místo identifiko váné imunogenní oblasti

s.

aureus antigenni protein

2798

2815

2914

2960

2963

ORF2469

ORF24S1

ORF2351

ORF2298

ORF2295

Predikované imunogenní ak**

č.

vybraných klonů na ORF e vyhledáni

Reaktivita séra s relevant ni oblasti (pozitivní /celkový)

Sekv. ID č. : (DNA +Prot)

Lipáza (geh)

Konzervová ný hypotetick ý protein mete domnělé

Exotoxin domnělé

Exotoxin homologie s ORF1

12-35,93-99, 179,217-227, 248,269-276, 294,296-320, 327,334-339, 356,362-371, 384,404-411, 438,443-448, 464, 480-486, 503,516-525, 541,561-570, 585,603-622,

5-32,34-49

166239288322344375433455497535579633-641

A: 41, B:42,C:3, F:35.G:1, H:ll aminokysel iny 48-136 aminokysel iny 128172 aminokysel iny 201258

C:GSBYG01( 48-136): 2/6

AX3SBXM31Bmdl2(128188):11/30 B:GSBXE16( 165-177): 10/30

A:GSBXN20( 201-258): 8/30

F:SALAW05( 165-177) : 13/41

46, 98

D:21

Aminokysel iny 1-43

D:n.d.

45,97

39-44,46-80, 105-113,118133-165,176 226-238,240

279-285,298338-345,350365-372,397409-415,465488-515.517 542-550,554 593-601,603627-653,660 674-687,698726-739

92-98,

123,

208,

255,

330,

357,

402,

473,

535,

590,

620,

665,

718,

13-36,40-49,111118,134-140,159164,173-183,208220,232-241,245254,262-271,280286,295-301,303310,319-324,332339

13-28,40-46,69-75,

86-92,114-120,126137,155-172,182193,199-206,213221,232-238,243253,270-276,284-290

4-21,28-40,45-52, 59-71,92-107,123137,159-174,190202,220-229,232241,282-296,302308,312-331

A:1,C:14,

F:2

C:101,

E:2,H:58

C:3,E3,

G:1

A:2,C:1,

H:4 aminokysel iny 386402

Aminokysel iny 1-85 aminokysel iny 54-121 aminokysel iny 103195 aminokysel iny 22-100

Aminokysel iny 21-118

A:GSBXM18( 386-402): 17/29

C:GSBYG32( 1-85):6/7 CK3SBYG61bhe2(54121) -.26/30 CK3SBYN80( 103-195) : 13/17

C:GSBYJ58( 22-100): 9/15

A:GSBXL06( 21-118): 50/52

44,96

43,95

147,

155

3002

ORF1704

33,85

s. aureus antigenni protein	staré čislo ORF	Domnělá funkce (podle homologie)	Predikované imunogenni ak**	č. vybraných klonů na ORF a vyhledáni	Mi sto identifiko váné imunogenni oblasti	Reaktivita séra s relevant ni oblasti (pozitivní /celkový)	Sekv. ID ¢. : (DNA +Prot)
3200	ORF 1331	domnělý	6-15,22-32,58-73,	A:ll,	aminokysel	A:GSBXL07(	29,81
		extracelul	82-88,97-109,120-	B:ll,	iny 5-134	5-134):
		árni	131,134-140,151-	C:36		6/28
		matrix	163,179-185,219-
		vazebný	230,242-255,271-
		protein	277,288-293,305- 319,345-356,368- 381,397-406,408- 420,427-437,448- 454,473-482,498- 505,529-535,550- 563,573-580,582- 590,600-605,618- 627,677-685,718- 725,729-735,744- 759,773-784,789- 794,820-837,902- 908,916-921,929- 935,949-955,1001- 1008,1026-1032, 1074-1083,1088- 1094,1108-1117, 1137-1142,1159- 1177,1183-1194, 1214-1220,1236- 1252,1261-1269, 1289-1294,1311- 1329,1336-1341, 1406-1413,1419- 1432,1437-1457, 1464-1503,1519- 1525,1531-1537, 1539-1557,1560- 1567,1611-1618, 1620-1629,1697- 1704,1712-1719, 1726-1736,1781- 1786,1797-1817, 1848-1854,1879- 1890,1919-1925, 1946-;1953,1974- 1979

Tabulka 2b: Další imunogenni proteiny identifikované bakteriálním povrchovým a ribosomovým zobrazením: S. aureus

Bakteriální povrchové zobrazení: A, LSA250/1 knihovna v fhuA se sérem pacienta 1 (655); B, LSA50/6 knihovna v lamB se sérem pacienta 1 (484); C, LSA250/1 knihovna v fhuA s 1C sérem 1 (571); E, LSA50/6 knihovna v lamB s 1C sérem 2 (454); F, LSA50/6 knihovna v lamB se sérem pacienta Pi (1105); G, LSA50/6 knihovna v lamb s 1C sérem 1 (471) ; H, LSA250/1 knihovna v fhuA se sérem pacienta 1 (IgA, 708) . Ribosomové zobrazení: D, LSA250/1 knihovna s 1C sérem (1686). *★, predikce antigenních sekvencí delších než 5 aminokyselin byla provedena programem ANTIGENIC (Koiaskar a Tongaonkar, 1990) . ORF, otevřený čtecí rámec; CRF, čtecí rámec na komplementárním vlákně; ARF, alternativní čtecí rámec.

S. aureus antigenni c protein	Domnělá funkce (podle homologie)	predikované imunogenní ak**	Č. vybraných klonů na ORF a vyhledání	Místo identifikované imunogenní oblasti	Reaktivita séra s relevantní oblastí (pozitivní/celkový)	Sekv. ID č. : (DNA +Prot)
ARF0280	Domnělý protein	7-14	F:6	aminokyseliny 25-43	SALAMS9(25-43) : 1/1	401,402
CRF0145	Domnělý protein	18-28,31- 37,40-47,51-	F:5	aminokyseliny 81-90	SAiAZ40(8 1-90): 2/12	403,404
CRF0250	Domnělý protein	4-24,26- 46,49-86	G:8	aminokyseliny 60-76	SAIAJ87(60-76): n.d.	365, 378
CRF0308	Domnělý protein	40-46	A:6, B:2, C:47, E:35	aminokyseliny 5-38	A:GSBXK03C7~36):28/69 B:GSBXD29(10-20): 10/27	391,392
CRF0337	Neznámá	4-17	D:3	Aminokyseliny 1-20	D:n.d.	469; 486
CRF0497	Domnělý protein	4-28,31-37, 58-64	B:13,F:5	aminokyseliny 18-34	GSBXF31(19-34): 1/7	366,379
CRF0538	Neznámá	4-20	D:7	Aminokyseliny 1-11	D:n.d.	470; 487
CRF0750	Domnělý protein	4-11,18- 24,35-40	0:44	aminokyseliny 25-39	SALAG92(26-39):n.d.	367,380
CRF1145	Neznámá	4-57	D-.28	aminokyseliny 16-32	D:n.d.	464; 481
CRF1247	Domnělý protein	4-25,27-56	F:6	aminokyseliny 36-46	SAIAR23(36-46):ad.	368,381
CRF1256	Domnělý protein	19-25, 38-37, 55-74, 77-87	0:5	aminokyseliny 54-67	SALAG65(54-67):n.d.	369,382
CRF136	Neznámá	8-15; 18-24; 27-38	D:5	Aminokyseliny 5-33	D:n.d.	471; 488
CRF1763	Domnělý protein	4-9,23-41,43- 58,71-85	03	Aminokyseliny 1-22	C:GSBY130(1-22):1/1	407,408
CRF1783	Neznámá	8-161	D-.5	aminokyseliny 76-127	D:n.d.	465; 482
CRF1845	Neznámá	4-28; 30-36	Ό-.27Ζ	Aminokyseliny 1-17	D:n.d.	472; 489
CEF1861	Neznámá	6-11; 13-34; 36-50	D:8	Aminokyseliny 4-27	D:n.d.	4 66; 483
CRF1928	Domnělý protein	4-9, 17-30	F:9	aminokyseliny 13-22	SAIAR41(13-22): n.d.	370,383
CRF2004	Domnělý protein	18-38	F:13	aminokyseliny 16-32	SALAM75(16—32):n.d	371,384
CRF2155	Domnělý protein	4-15, 30-58	F:9	aminokyseliny 54-66	SALAQ54(54-66):1/12	372,385
CRF2180	Domnělý protein	4-61, 65-72, 79-95, 97-106	E:13	aminokys eliny 86-9!)	GSBZE08(86-99): n.d.	373, 386
CRF2207	Neznámá	4-13	D:3	aminokyseliny 17-39	D:n.d.	473; 490
CRF2305	Domnělý protein	4-9,22-33,44- 60	0.5	aminokyseliny 80-116	GSBYL75(80-116):n.d.	374, 387
CRF2341	Domnělý protein	4-23,30- 44,49-70	F:8	aminokyseliny 46-55	SALAW31 (46-55): n.d.	375,388
CRF2349	Domnělý protein	4-32, 39-46, 62-69, 77-83	B:10,F:4	aminokyseliny 46-67	GSBXC92(52-67):2/11	376, 389

S. aureus antigenní c protein	Domnělá funkce [podle homologie)	predíkované imunogenní ak**	č. vybraných klonů na ORF a, vyhledání	Místo identifikované imunogenní oblasti	Reaktivita séra s relevantní oblastí (pozitivní/ celkový)	Sekv. ID č. : (DNA +Prot)
CRF2356	Neznámá	4-18	D:3	Aminokyseliny 3-18	D:n.d.	475; 492
CRF2452	Neznámá	4-31	D:9	aminokyseliny 7-21	D:n.d.	476; 493
CRF2498	Domnělý protein	4-29,31-41	0:8	Aminokyseliny 2-15	SALAF30(315): n.d	377, 390
CRF2S53	Neznámá	4-35; 37-42	D:4	Aminokyseliny 1-20	D:n.d.	474; 491
CRF2578	Neznámá	5-25; 30-39	D:ll	Aminokyseliny 9-30	D:n.d.	4 67; 484
CRF2664	Neznámá	11-21	D:17	Aminokyseliny 1-14	D:n.d.	477; 494
CRF2729	Domnělý protein	10-41, 50-57	F:3	aminokyseliny 40-56	SALAQ25(4056): 1/1	405,406
CRF2863/1	Neznámá	4-43	D:78	aminokyseliny 17-40	D:n.d.	478; 495
CRF286 3/2	Neznámá	4-46	D:78	aminokyseliny 44-49	D:n.d.	479; 496
CRFA002	Neznámá	17-39;52-59	D:3	aminokyseliny 38-55	D:n.d.	463; 480
CRFN1	Neznámá	5-20; 37-44; 52-59; 87-94; 116-132	D:4	aminokyseliny 94-116	D:n.d.	468; 485
ORFO188	UDP-N-acetyl-D- manosamin transferáza, domnělá	1 1-18, 43-6, 58-97, 100-118, 120-148, 152-171, 195-203,207214, 220-227,233-244	B:4,F29	aminokyseliny 197-210	ŠALAMI4(198209): n.d.	397,398
ORF0254	Multilékový efluxní transportér	4-33,35-56,66-99, 109-124, 136-144, 151-180, 188-198, 201-236, 238-244, 250-260, 266-290, 294-306, 342-377	D:3	aminokyseliny 155-175	D:n.d.	297, 325
ORF0307	Konzervovaný hypotetický protein	4-23, 25-67, 76-107, 109-148	D:3	Aminokyseliny 9-44	D:n.d.	298,326
ORF04S2	Konzervovaný hypotetický protein	4-35, 41-47, 55-75, 77-89, 98-1 13, 1 16140, 144-179, 194215, 232-254, 260273, 280-288, 290302, 315-323, 330369, 372-385, 413-432	D:5	aminokyseliny 105-122	D:n.d.	299, 327
ORF0456	Na+/H+ Antiporter	4-81	D:66	Aminokyseliny 1-21	D: n. d.	300, 328
ORF0556	Fe(III)dicitrát vazebný protein	5-23, 50-74, 92-99, 107-122, 126-142, 152-159, 172-179, 188-196, 211-218, 271-282	D: 10	aminokyseliny 1-18	D: n.d.	301,329
ORF0629	Hypotetický Protein	9-44, 63-69, 75-82, 86-106, 108-146, 153161, 166-178, 185192, 233-239, 258266, 302-307	D:313	aminokyseliny 13 - 37	D:n.d.	302, 330

S. aureu: antigenní c protein

Domnělá funkce (podle homologie) predikované imunogenní ak**

č.

vybraných klonů na ORF a

Místo identifikované imunogenní oblasti

ORF0637

GTP-vazebný protein Typ A

10-19,	22-32, 95-105,
1 12-1	19, 121-
133,	140-154, 162-
174,	186-200,207-
224,	238-247, 254-
266,	274-280, 288-
294,	296-305, 343-
351,	358-364, 366-

373. 382-393, 403413, 415-422,440-447, 499-507, 565- 575,

578-588

ORF0713

Konzervovaný hypotetický transmembránový protein, domnělý

22-51,53-71,80-85,9399, 105112, 123-146, 151157, 165-222, 226-236,247-270,290296,301324, 330-348, 362382, 384-391,

396-461, 463-482,

490-515

ORF0788 protein buněčného dělení

ORF0797

Konzervovaný hypotetický protein

ORF0836 protein buněčného dělení

104-111, 158-171,

186- 197, 204209, 230-247, 253259, 269-277,

290-314, 330-340,

347-367, 378-388

1-40, 56-75, 83102, 1 12-1 17, 129147, 154-168, 174191, 196-270,

280-344, 354-377,

380-429, 431450, 458-483, 502520, 525-532,

595-602, 662-669,

675-686, 696702,704-711,720735,739-748,

750-756, 770-779,

793-800, 813822,834-862_

34-91, 100-119, 126143, 147-185,

187- 197, 319-335,

349-355, 363395, 397-412, 414422, 424-440,

458-465, 467-475,

480-505, 507529, 531-542, 548553, 577-589,

614-632, 640-649,

685-704, 730741,744-751,780-786 vyhledání

F:3

D:3

D:4

D:12

D:5

Aminokyselinová permeáza

D:8

Reaktivita séra s relevantní oblastí (pozitivní/ celkový) aminokyseliny F:SALAX70(107107-119 119):10/41 aminokyseliny

487-513 aminokyseliny 152 -178 aminokyseliny 196 -218 aminokyseliny

26-56

Aminokyseliny

127-152

D:n.d.

D:n.d.

D:n.d.

D:n.d.

D:n.d

Sekv. ID č. : (DNA +Prot)

393

395

303,331

304,332

305,333

306,

334

ORF1318

307,

335

1-21, 25-32, 34-54, 81-88. 93-99,

105-117. 122-145,

148-174, 187193, 203-218, 226260, 265-298,

306-318, 325-381,

393-399, 402421,426-448

Domnělá funkce (podle homologie) predikované imunogenni ak**

S. aureu: antigenní c protein

ORF1388

ORF1402

ORF1473

ORF1523

ORF1707 vybraných klonů na ORF vyhledáni

Místo identifikova né imunogenni oblasti

Reaktivita séra s relevantní oblastí (pozitivní/ celkový)

Sekv. ID č. : (DNA +Prot)

LPXTO motiv kotvy buněčné kotvy

3,4dihydroxy— 2—butanon4—fosfát syntáza hemolysin II (LukDLeukotoxin

Regulátor vychytáván 1 železa

Vnitřní membránový protein, kDa

11-31,86175-182,

218-226,

260-269,

304-313,

355-360,

390-399,

468-486,

535-547,

604-615,

653-659,

730-737,

879-891,

922-931,

997-1009,

1089-1096

1123-1130

1176-1184

1209-1215

1265-1275

1304-1310

1382-1388

1412-1430

1489-1507

1535-1540

1619-1626

1647-1655

1726-1748

1767-1783

1809-1822

1883-1889

1931-1936

1978-1989

2023-2042

2101-2136

91,103-111,

205-212,

242-247,

279-288,

329-334,

378-387,

407-435,

510-516,

574-581,

635-646,

689-696,

802-812,

893-906,

954-964,

1031-1042, ,1107-1120, ,1149-1162, ,1192-1207, ,1253-1259, ,1282-1295, ,1345-1361, ,1394-1400, ,1457-1462, ,1509-1515, ,1571-1591, ,1635-1641, ,1695-1701, ,1750-1757, ,1802-1807, ,1844-1875, ,1922-1929, ,1951-1967, ,1999-2008, ,2056-2083, ,2161-2177

18-23, 32-37, 54-63, 65-74, 83-92, 107114, 123-139, 144155, 157-164, 191198,232-240,247-272, 284-290, 295-301,

303-309, 311-321,

328-341,367-376

4-36, 39-47, 57-65,

75-82, 108-114, 119-126, 135-143,

189-195,234244, 250-257, 266272, 311-316

13-27, 29-44, 46-66, 68-81, 97-116, 138-145

4-23, 57-77, 89-103, 1 19-125, 132-172, 179-197, 210-254, 256-265, 281-287

5-10, 16-24, 62-69,

77-96, 100-115,117126, 137-156, 165183, 202-211, 215225, 229-241, 250260, 267-273, 290300, 302-308, 320333, 336-342, 348356, 375-382,384-389

D:3

E-3

F:1

D:3

F:1 aminokyselin y 508-523 aminokyselin y 121-137 aminokyselin y 245-256 aminokyselin y 120-135 aminokyselin y 293-312

D:n.d.

308,336

E:GSBZB68(121 -137):7/41

F:SALAP76(245 -256) :6/41

D: n.d

F:SALBC82(104 -118):7/41

198,217

199,218

309,337

200,219 aminokyselin y 104-118

ORFI754 amiB

D:3

D:n.d.

310,338

S. aureusDomnělá antigenni funkce c protein

ORFI783

ORF1848

ORF1891

ORF2011

ORF2027 predikované imunogenní ak** (podle homologie)

Mip protein (fmtB)

Map-ND2C protein ribosomální protein L2(iplB)

Domnělý lékový transportér domnělá laktáza permeáza,

Hemolysin

II (domnělý)

č.

vybraných klonů na ORF vyhledání

Místo identifiko váné imunogenní oblasti

Reaktivita séra s relevantní oblastí (pozitivní/ celkový)

Sekv. č. : (DNA +Prot)

ID

5-29,46-52,70-76, 8187, 155-170,192-197,

206-213,215-220, 225231, 249-258,273-279,

281-287,300-306, 313319, 323-332,335-341,

344-351,360-382,407431,443-448,459-468, 475-496,513-520, 522537,543-550, 556-565, 567-573,580-585, 593615, 619-631,633-642,

670-686, 688-698,759766,768-782,799-808, 842-848,868-877, 879917, 945-950,979-988,

996-1002, 1025-1036, 1065-1084, 1101-1107,

1113-1119,

1163-1169,

1213-1219,

1307-1315,

1369-1378,

1410-1415,

1433-1447,

1487-1494,

1564-1570,

1675-1681,

1714-1725,

1767-1774,

1125-1142,

1183-1189,

1289-1301,

1331-1342,

1385-1391,

1421-1427,

1468-1475,

1518-1529,

1592-1609,

1686-1693,

1740-1747,

1793-1807,

1824-1841,1920-1937, 1953-1958, 1972-1978, 1980-1986,1997-1011, 2048-2066, 2161-2166,

2219-2224,

2292-2298,

2394-2399,

2449-2468

2252-2257,

2375-2380,

2435-2440,

4-27,42-66, 70-76,102107, 113-118,133-138

31-39, 48-54,61-67,7583,90-98,103-119,123145,160-167,169-176, 182-193,195-206,267273

5-27,79138-165, 225,233298-320, 345,363400-422, 495,506549-554, 598,60385,105-110,

183-202,204259, 272-292,

327-336,338376,383-398,

425-470,489518,536-544,

562-568,584623

10-33,38-71, 113-125,132— 163,170-216, 250-269,271335,337-355, 384-408,425465, 468-476, 508-529

73-103,

147,154222-248,

278,287360-374,

442,453478-501,

F:2

E:5

F:4

D:5

E:2

D:3 aminokysel iny 850860 aminokysel iny 75-90 aminokysel iny 239257 aminokysel iny 205224 aminokysel iny 422436 aminokysel iny 126 147

F:SALAQ36(850860):8/4 1

E:GSBZB15(7590):6/41

F:SAiAV36(239257) -.19/41

D:n.d.

E:GSBZFS8(422436):6/41

201,220

202, 221

203,222

311,339

204,223

ORF208

8-27,52-59,73-80, 9099,104-110,117-124,

131-140,189-209,217232,265-279,287-293,

299-306

D: n.d.

312,340 ♦ ·

Domnělá funkce (podle homologie )

Predikované Ímunogenní ak**

S. aureu; antigenní c protein vybraných klonů na ORF vyhledání

Místo identifiko váné ímunogenní oblasti

Reaktivita séra s relevantní oblastí (pozitivní/ celkový)

Sekv. í. : (DNA +Prot)

ID

ORF2090

ORF2092

ORF21O7

ORF2192

ORF2305

ORF2324

ORF2422

ORF2553

ORF2S55

ORF2558

ORF2610 preLukS

Hemolysin

II (preLUKF)

Protein rezistenc e proti mnoha lékům (domnělý)

Transkrip ční regulátor z GntR rodiny, domnělý

Aminoysel inová permeáza

Citrátový transport ér

Protein z rodiny aniontový ch transport érů

SirA ornitin cyklodeam ináza

Efluxní protei pro mnoho léků, domnělý

CapSM

CapSP (UDP-Nacetylglu kos amin 2— epimeráza )

8-26,75-82,118-126,

136-142,163-177,182189,205-215,221-236,

239-248,268-274

5-22,30-47,58-65,7581,87-92,99-105,107113,119-126,189-195, Ž17-223,234-244,250257,266-272

10-28,30-43,50-75,80113,116-125,136-167, 170-191,197-245,253329,345-367,375-396

20-31,46-52,55-69,7479,89-97,108-113,120128,141-171,188-214

25-79,91-103,105-127,

132-149,158-175,185221,231-249,267-293,

307-329,336-343,346359,362-405,415-442,

446-468

10-77,85-96, 99-109,

111-138,144-155,167176,178-205,225-238,

241-247,258-280,282294,304-309,313-327,

333-383,386-402,

405-422,429-453

7-26,28-34,36-53,5573,75-81,87-100,108117,121-138,150-160, 175-181,184-195,202215,221-247,265-271, 274-314,324-337,341412,414-423,425-40,447462,464-469

5-22,54-78,97-103,113123,130-148,166-171, 173-180,192-201^254261,2 66-2 72,310-322

20-35,37-50,96-102, 109-120,123-137,141150,165-182.206-224, 237-256,267-273, 277291,300-305,313-324.

11-63, 79-129,136-191, 209-231,237-250,254276,282-306,311-345, 352-373,376-397

4-30,34-40,79-85,8998,104-118,124-139,148160,167-178

4-9,17-24,32-38,44-54, 68-82,89-95,101-120, 124-131,136-142,145157,174-181,184-191, 196-204,215-224,228236,243-250,259-266, 274-281,293-301,314319,325-331,355-367, 373-378

F:2

F:3

D:9

D:3

D:53

D:7

D: 16

D:3

E:2

D:8

D: 13

B:3,F:11 aminokysel iny 270284 aminokysel iny 238253 aminokysel iny 54104 aminokysel iny 15-35 aminokysel iny 363393 aminokysel iny 37-83 aminokysel iny 275295 aminokysel inyl-22 aminokysel iny 32-48 aminokysel iny 84-100 aminokysel iny 114141 aminokysel iny 321341

F:SALAQ77(270284):23/41

F:SALAQ67(237252): 10/41.

D:n.d.

D.n-d.

D:n.d.

D:n.d.

D:n.d.

D:n.d.

E:GSB2B37(3248):11/41

D:n.d.

D:n.d.

F:SALAU27(325337):9/41

205, 224

206,225

313,341

314, 342

315,343

316,344

317,345

318, 346

207,226

319,347

320, 348

ORF2613

208, 227 • · · · ·

Predikované imunogénní ak**

Domnělá funkce (podle homologie)

S. aureus antigenní c protein

ORF2628

Hypotetický protein

9-15,28-36,44-62, 69-88,

98-104,111-136,139-149,

177-186,195-217,224236,241-257,260-278,

283-290,292-373, 395408,411-443,465-472,

475-496,503-520,552559,569-589,593-599,

607-613,615-636,648654,659-687,689-696,

721-733,738-759,783789,795-801,811-823,

827-836,839-851,867875,877-883,890-898,

900-908,912-931,937551,961-992,994-1002,

1005-1011,1016-1060,

1062-1074,1088-1096,

1101-1123,1137-1153,

1169-1192,1210-1220,

1228-1239,1242-1251,

1268-1275,1299-1311,

1322-1330,1338-1361,

1378-1384,1393-1412,

1419-1425,1439-1459,

1469-1482,1489-1495,

1502-1519,1527-1544,

1548-1555,1600-1607,

1609-1617,1624-1657,

1667-1691,1705-1723,

1727-1742,1749-1770,

1773-1787,1804-1813,

1829-1837,1846-1852,

1854-1864,1869-1879,

1881-1896,1900-1909,

1922-1927,1929-1935,

1942-1962,1972-2005,

2009-2029,2031-2038,

2055-2076,2101-2114,

2117-2124,2147-2178,

2188-2202,2209-2217,

2224-2230,2255-2266,

2271-2280,2282-2302,

2307-2316,2319-2324,

2379-2387

0RF2644

PTS systém, sacharózaspecifická IIBC komponenta

8-15,24-30,49-68,80-93, 102-107,126-147,149168,170-180,185-193, 241-305,307-339,346355,358-372,382390,392-415, 418425,427-433,435444,450-472

0RF2654

Oligopeptid ový ABC transportér , domnělý maltózový

ABC transportér , domnělý

5-61,72-84,87-99,104109,124-145,158-170

80-188,190-216,223264,270-275,296-336

355-372 ,1

4-21,71-79,99-105,110121,143-161,199-205, 219-235,244-258,265270,285-291,300-308, 310-318,322-328,346351,355-361,409-416

č.

vybraných klonů na ORF i vyhledání

F:6

F-.4

D:5

F:1

MÍ3to identifiko váné imunogénní oblasti aminokysel iny 694708 aminokysel iny 790800 aminokysel iny 12881305

Reaktivita séra s relevantní oblastí (pozitivní/ celkový)

F:SALBD82(12 88-1303): 9/41 aminokysel F:SALAW60(10 iny 106- 6-125):3/41 1$9 aminokysel my

209

182aminokysel iny 306323

D:

n.d.

F:SALBCOS(30 6-323):2/41

Sekv. ID č. : (DNA +Prot)

209,228

210,229

321,349

ORF2662

211,230 • ·

S. a ureu: antigenní c protein	Domnělá funkce (podle homologie)	Predikované imunogenní ak**	č. vybraných klonů na ORF a vyhledání	Místo identifiko váné imunogenní oblasti	Reaktivita séra s relevantní oblastí (pozitivní/ celkový)	Sekv. ID č.: (DNA +Prot)
ORF2710	sorbitol dehydrogená za	4-12,19-40,61-111, 117-138,140-IS3,161180, 182-207,226-235, 237-249,253-264,267274, 277-292,311-323	B:2,F:4	aminokysel iny 244257	F:SALAX93(249256):6/41	212,231
ORF2742	Hypotetický protein	4-41,49-56,61-67,7582,88-104,114-125, 129-145,151-165, lilii 8,187-221,224-230, 238-250,252-275, 277304, 306-385	D: 188, H:4	aminokysel iny 303323	D:n.d.	322,350
ORF2780	brnQ	4-29, 41-63,74-95, 97103,107-189,193-209, 220-248,260-270,273299,301-326,328-355, 366-397,399-428	D:3	aminokysel iny 26-40	D:n.d.	323,351
ORF2806	Fágu příbuzný protein	10-17,23-29,31-37, 54-59,74-81,102-115, 127-137,145-152,158- 165,178-186,188-196, 203-210,221-227,232- 237	F:3	Aminokysel iny 104- 116	F:SALBC34:1/1	213,232
ORF2900	Konzervován ý hypotetick ý protein	4-27,34-43,62-73,81- 90,103-116,125-136, 180-205,213-218,227235,238-243,251-259, 261-269,275-280,284294,297-308,312-342, 355-380,394-408,433458,470-510,514-536, 542-567	D:24	aminokysel iny 360376	D-.n.d.	324,352
0RF2931	konzervován ý hypotetický protein	4-19,43-54,56-62, 84-90,96-102,127-135, 157-164, 181-187	E:6	aminokysel iny 22-37	E:GSBZA13(2237):7/41	214, 233
ORF2958	Exotoxin 2	7-19,26-39,44-53, 58-69,82-88,91-107. 129-141,149-155,165- 178,188-194	F:1	aminokysel iny 154168	F:SA1BBS9(154168):4/41	215,234
ORF2970	Povrchový protein, domnělý	9-23,38-43,55-60,69- 78,93-101,103-112, 132-148,187-193,201208,216-229,300-312, 327-352,364-369,374383,390-396,402-410, 419-426,463-475,482491	H:5	aminokysel inyl-70	H:GSBYU66: n.d.	399,400

Tabulka 2a: Imunogenní proteiny povrchovým a ribosomovým zobrazením: S identifikované epidermidis.

bakteriálním

Bakteriální povrchové zobrazení: A, LSE150 knihovna ve fhuA se sérem pacienta 2 (957); B, LSE70 knihovna v lamB se sérem pacienta 2 (1420); C, LSE7Q knihovna v lamB se sérem pacienta 1 (551)* Ribosomové zobrazení: D, LSE150 v pMAL4.31 s P2 (1235): **, predikce antigenních sekvencí delších než 5 aminokyselin byla provedena program ANTIGENIC (Kolaskar a Tongaonkar, 1990). ORF, open čtecí rámec; ARF, alternativní čtecí rámec; CRF, čtecí rámec na komplementárním vlákně. ORF, otevřený čtecí rámec; CRF, čtecí rámec • · • · • · · · ···· • · · · · · · ·· ····· • · · · · · · •· · · ··· ·· · na komplementárním vlákně:

s. epidermidis antigenní protein	Domnělá funkce (podle homologie )	Predikované imunogenní ak**	č. vybraných klonů na ORF a vyhledání	Místo identifikova né imunogenní oblasti	Reaktivita séra s relevantní oblastí (pozitivní/ celkový)	Sekv. ID č.: (DNA +Prot)
ARFOI72	Kationy transport ující ATPáza, EI-E2 rodina	4-34, 37-43	D:6	aminokyselin y 3-32	D:nd	497, 548
ARF0183	Kondenzuj ící enzym, domnělý, Příbuzný s FabH	4-22,24-49	D:4	amihokyselin y 1-52	D:nd	498, 549
ARF245S	NADH dehydroge náza, Domnělá	4-29	D:3	aminokyselin y 1-22	D:nd	499, 550
CRF0001	Neznámá	4-14, 16-26	D:3	aminokyselin y 5-21	D:nd	500,551
CRF0002	Neznámá	4-13,15-23,36-62	D:5	aminokyselin y 21-70	D:nd	501, 552
CRF0003	Neznámá	4-12, 14-28	D:3	aminokyselin y 4-31	D:nd	502,553
CRF0004	Neznámá	5-15,35-71,86-94	D:4	aminokyselin y 31-72	D:nd	503,554
CRFOOOS	Neznámá	8-26, 28-34	D:3	aminokyselin y :9-33	D:nd	504,555
CRF0006	Neznámá	4-11,15-28	D:3	aminokyselin y 10-22	D:nd	505, 556
CRF0007	Neznámá	4-19, 30-36	D:3	aminokyselin y 7-44	D:nd	506, 557
CRFO008	Neznámá	Ϊ0-48	D:4	aminokyselin y 9-44	D:nd	507, 558
CRFOOOS	Neznámá	41883	D:3	aminokyselin y 5-14	D:nd	508, 559
CRF0192	Domnělý protein	4-23,25-68	C:4	aminokyselin y 15-34	C:GSBBM10(1534): n.d.	445, 446

• · · · ·

s. epidemii dis antigenr i protein	Domnělá funkce (podle homologie)	Predikované imunogenni ak**	č. vybraných klonů na ORF a vyhledání	Místo identifiko váné imunogenni oblasti	Reaktivita séra s relevantní oblastí (pozitivní/ celkový)	Sekv č.: (DNA +Prot	ID :)
CRF0275	Domnělý protein	4-40,49-65	B:5	aminokysel iny 35-68	B:SELAK28(3568): n.d.	447,	448
CRF0622	Domnělý protein	4-12, 17-57, 62-70, 75- 84, 86-100	C:4	aminokysel iny 75-99	C:GSBBR74(7699): n.d.	449,	450
CRF0879	Domnělý protein	4-14,38-44	A:3,B:10	aminokysel iny 9-40	B:SELAC39(1O 40):n.d.	451,	452
CRF1004	Domnělý protein	4-40	A:3,B:5	aminokysel iny 29-65	B:SELAI63(3563): n.d.	453,	454
CRF2248	Domnělý protein	4-10, 19-40, 53-64, 7491	C:30	Aminokysel iny 74-111	C :GSBBN64 (1635,: n.d	455,	456
CRF2307	Domnělý protein	4-19,35-41,80-89	A: 19	aminokysel iny 41-87	A:SEFAL47(41— 87):n.d.	457,	458
CRF2309	Domnělý protein	15-21	B:6	aminokysel iny 4-16	B:SELAL02(416): n.d.	459,	460
CRF2409	Domnělý protein	6-25	B:6	aminokysel iny 2-24	B:SELAB48(524):n.d	461,462
ORF0005	hypotetický protein	13-27,33-67,73-99,114129,132-158,167-190, 193-234,237-267,269-299, 316-330,339-351,359-382, 384-423	D:3	aminokysel iny 105128	D:nd	509,	560
ORF0008	Streptokoko vý hemaglutini n	9-14,16-24,26-32,41-50, 71-79,90-96,177-184, 232-237,271-278,293-301, 322-330,332-339,349-354, 375-386,390-396,403-409, 453-459, 466-472, 478- 486, 504-509, 518-525, 530-541, 546-552, 573- 586, 595-600, 603-622, 643-660, 668-673, 675-681, 691-697,699-711,713-726, 732-749,753-759,798-807, 814-826,831-841,846-852, 871-878,897-904,921-930, 997-1003,1026-1031, 1033-1039,1050-1057, 1069-1075, 1097-1103, 1105-1111, 1134-1139, 1141-1147, 1168-1175, 1177-1183, 1205-1211, 1213-1219, 1231-1237, 1241-1247, 1267-1273, 1304-1309, 1311-1317, 1329-1335, 1339-1345, 1347-1353, 1382-1389, 1401-1407, 1411-1417, 1447-1453, Í455-Í461, 1483-1489, 1491-1497, 1527-1533, 1545-1551, 1556-1561, 1581-1587, 1591-1597, 1627-1638, 1661-1667, 1684-1689, 1691-1697, 1708-1715, 1719-1725, 1765-1771, 1813-1820, 1823-1830, 1835-1856	B:2	aminokysel iny 895926	B:SELAF79(895 -926): 7/12	239,	268

s.

epiderm idis antigen ní protein

Domnělá funkce (podle homologie)

Predikované imunogenní ak**

c.

vybraných klonů na ORF vyhledání

Místo identifikov ané imunogenní oblasti

Reaktivita séra s relevantní oblasti (pozitivní/ celkový)

Sekv. ID č. :

(DNA +Prot)

ORF0038

ORF0099

ORF0101

ORF121

ORFO143 extracelulá rní prekurzor elastázy hypotetický protein hypotetický protein transportér

C4dikarboxylá tu, anaerobní;

domnělý aminokyseli nová permeáza

ORF0162 Imunodomina ntní antigen

ORF020I čapa protein, domnělý

ORF0207

Ribokináza (rbsK)

6-25,29-35,39-45,64-71, 82-88,96-102,107-113, 119-131,170-176,186192,196-202,215-220, 243-248,302-312,345360,362-371,378-384, 458-470,478-489,495504

6-18,31-37,42-49,5167,73-85,87-93,102109.119-126,150-157, 170-179,-185-191,204214,217-223,237-248, 269-275,278-316,320340,359-365

4-10,15-27,67-94,123129,167-173,179-184, 187-198,217-222, 229235,238-246

4-20,24-62,73-86,89106,110-122,131-164, 169-193,204-213,219236,252-2S9,263-281, 296-306;318-324.328352,356-397,410-429

25-79,91-103,105-127, 132-150,157-174,184206, 208-219,231-249, 267-294,310-329,336343,346-405,417-468

4-27,35-45,52-68,8389,113-119,133—150.158166,171-176,198-204, 219-230

10-17,27-53,81-86, 98105,126-135,170-176, 182-188,203-217, 223232,246-252,254-269, 274-280.308-314

C:6

D:5

D:18

D:S

D:35

A:ll,

B:ll;

C:153

D:9 aminokyseli ny 136-165 aminokyseli ny 218-265 aminokyseli ny 26-109 aminokyseli ny 323-379 aminokyseli ny 247-339 aminokyseli ny 90-227 aminokyseli ny 11-53 aminokyseli ny 20-45

C:GSBBN08(136165):1/1

353, 359

D:nd

D:nd

D:nd

D:nd

B-.SELAAl 9(100118): 1/1 B:SELAE24(170190): 11/12

D: nd

B-.SELAQ30 (2045): 12/12

510, 561

511, 562

512, 563

513, 564

240, 269

514, 565

5-11,15-23,47-55,82-90,

98-103,108-114,126-132,

134-156,161-186,191197,210-224,228-235,

239-248,258-264,275-290

B:10

241, 270

ORF0288

LrgB

7-28,34-56,.68-119,127146,149-180,182-189,

193-200,211-230 aminokyseli ny 112-149

D:4

D:nd

515, 566 • ·

s.

epidermi dis antigenn í protein.

Domnělá funkce (podle homologie)

Predikované imunogenni ak‘*

č.

vybraných klonů na ORF vyhledáni

Místo identifikované imunogenni oblasti

Reaktivita séra s relevant ní oblastí (pozitivní / celkový)

Sekv. ID č. : (DNA +Prot)

ORF0304

ÓRF0340

ORF0346

ORF0355

ORF0356

ORF0406

ORF0425

ORF0442

ORF0448

ORF0503

ORF0551

Herpesvirus saimiri

ORF73 homolog, domnělý nitrátový transportér hypotetický protein konzervován ý

hypotetický protein konzervován

Ý hypotetický protein hypotetický protein aminokyselí nová permeáza

SceB prekurzor

SsaA prekurzor

Ribosomální protein

L2

Konzervován

Ý hypotetický protein

8-16, 30-36, 83-106,116122,135-143,152165,177-188,216-225

7-21,24-93,101-124,126139,141-156,163-179, 187-199,202-242,244261, 267-308, 313-322, 340-353,355-376

8-27,65-73,87-93,95-105

5-30,37-43,57-66,85-94, 103-111, 118-125

4-14, 21-53, 60-146,161173,175-182,190-198, 200-211

12-32,35-63,68-102,106137,139-145,154-168, 173-185,203-222,230259, 357-364, 366-374

40-58,75-86,93-110,117144,150-173,199-19,229260,264-300,317-323, 329-356,360-374,377390,392-398,408-424, 427-452

7-22,42-48,55-66,83-90, 109-118,136-141

6-25,39-47,120-125,127135,140-148,157-168,

200-208,210-220,236243,245-254

31-39,48-54,61-67,7583,90-98,103-115,123145,160-167,169-176, 182-193,195-206,267-273

D:8

D:5

D:8

C:5

D:5

D:19

D:3

C:38

C:170

D:3 aminokyseliny

69-117 aminokyseliny

238-309 aminokyseliny

1-29 aminokyseliny

63-86 aminokyseliny

51-91 aminokyseliny

1-48, aminokyseliny

69-102 aminokyseliny

401-440 aminokyseliny

60-102 aminokyseliny

15-208 aminokyseliny

212-273 aminokyseliny

1-26

D:nd

D:nd

D:nd

C:OSBBL39( 63-86) :1/1

D:nd

D:nd

D:nd

C:GSBBM6O( 65-84):1/1

C:GSBBL58( 81-105): 1/1

C:GSBBL13( 167-184): 1/1

C:GSBBL25( 22-45):1/1

B:SELAA 47(238259) : 12/12

B:SELAL12( 164-197): 8/12

516, 567

517,595

518,568

354,360

519,569

520,570

521,571

355,361

356,362

242,271

A:1,B:3

5-25,29-36,45-53,62-67,

73-82,84-91,99-105,121142,161-177,187-193,

203-224,242-251,266271,278-285 aminokyseliny

162-213

A:16,B:9

243,272

ORF0556 hypotetický protein

4-24,30-41,43-68,82-90,

107-114,123-143,155-168

D:nd

522,596

100 ·· »

··· ·· ··· · · ♦

S. epidermidis antigenní protein	Domnělá funkce (podle homologie)	Predíkované imunogenní ak**	č. vybraných klonů na ORF a vyhledání	Místo identifikované imunogenní oblasti	Reaktivita séra s relevant ní oblastí (pozitivní / celkový)	Sekv. ID č. : (DNA +Prot)
ORF0623	Fumble, domnělý	10-17,32-38,55- 72,77-84,88-96,126- 134,152-160,176- 185,190- 203,208-214,217- 225,233-252,257-262	A:10, B:12;C:1	aminokyseliny 95-150	B:SELAB86( 95-128) : 3/12	244,273
ORF0740	Hypotetick ý protein	18-24,47-61,69-83, 90-96,125-132,140163,171-188,222-249, 281-296,305-315,322330,335-351,354-368, 390-397,411-422,424431,451-469,479-485, 501-507,517-524,539550, 5-60-568,588-599, 619-627,662-673,678689,735-742,744-749, 780-786,797-814,821827,839-847,857-863, 866-876,902-911,919924,967-982,10051015,1020-1026,10621070,1078-1090,11251131,1145-1150,11641182,1208-1213,12151234,1239-1251,12561270,1298-1303,13161325,1339-1349,13621369,1373-1384,14181427,1440-1448,14681475,1523-1532,15361542,1566-1573,15751593,1603-1619,16261636,1657-1667,16791687,1692-1703,17111718,1740-1746,17491757,1760-1769,18151849,1884-1890,19051914,1919-1925,19371947,1955-1963,19701978,2003-2032,20752089,2117-2124,21332140,2146-2151,21612167,2173-2179,21842196, 2204-2220,2244^2254,2259-2264,22852296,2300-2318,23282334,2347-2354,23812388,2396-2408,24192446,2481-2486,2493— 2500,2506-2516,25332540,2555-2567,25762592,2599-2606,26152639,2647-2655	B:3	aminokyseliny 1093- 1114	B:SELAB23( 10971114): 7/12	245,274
ORF07S7	hypotetick ý protein	13-20,22-28,33-40, 60-76,79-86,90-102, 112-122,129-147,157170,178-185,188-193, 200-205,218-228,234240,243-250,265-273, 285-291,310-316,330348,361-380,399-405, 427-446,453-464.	C:6	aminokyseliny 260-284	C:GSBBNO1 (260-284) : 1/1	357,363

• ·

101 .

s. epidermidj s antigenni protein	Domnělá funkce (podle homologie)	Predikované imunogenní ak**	č. vybraných klonů na ORF a vyhledání	Místo identifikov ané imunogenní oblasti	Reaktivita séra s relevantní oblastí (pozitivní/ celkový)	Sekv. ID č.: (DNA +Prot)
ORF09I2	DNA mismatch repair protein	9-16,28-39,47-56,6976,104-121,124-130, 137-144,185-195,199214, 238-243, 293-307, 317-337,351-370,385390,411-428,472-488, 498-516,518-525, 528535,538-545,553-559, 563-568,579-588,592607,615-622,632-638, 641-648,658-674, 676705,709-720,727-739, 742-750,753-760, 768773,783-788.811-819, 827-838	A:25	aminokyseli ny 242-304	SEEAT31(242290): n.d.	441, 442
ORF0923	GTP- vazebný protein	4-10,18-27,42-55,64- 62,77-92,114-126,132- 157,186-196,206-217, 236-243,257-280,287- 300,306-312,321-328, 338-351,360-367,371- 382,385-399	B:13	Aminokyseli ny 144-163	B:SELAD55(151163):8/12	246,275
ORF0979	Konzervová ný hypotetick ý protein	4—28,44-51,53-84,88- 107,113-92	A:9,B:18	Aminokyseli ny 12-51	B:SELAH01(2649):5/12	247,276
ORF0982	sodno/alan inový symportér (alsT)	13-21,24-50,73-84,91118,126-133,142-149, 156-175,189-249,251273,294-332,339-347, 358-381,393-413,425448,458-463	D-3	Aminokyseli ny 277-305	D:nd	523,572
ORF1230	Signální peptidáza I	6-33,44-59,61-69,7482,92-98,133-146,163175	D:14	Aminokyseli ny 1-53	D:nd	524,573
ORF1232	Exonucleáz á RexA	4-12,16-32,36-48,50- 65,97-127,136-142,144165,176-190,196-202, 211-222,231-238,245251,268-274,280-286, 305-316,334-356,368376,395-402,410-417, 426-440,443-449,474486,499-508,510-525, 540-549,568-576,608617,624-639,646-661, 672-678,688-703,706717,727-734,743-755, 767-773,783-797,806814,830-8^9,853-859, 863-871,877-895,899— 918,935-948,976-990, 998-1007,1020-1030, 1050-1062,1070-1077, 1111-1125,1137-1149, 1153-1160,1195-1211	B:6	Aminokyseli ny 188-219	B:SELAA13 (188216):n.d.	443,444
ORF1284	Permeáza PerM, domnělá	10-60,72-96,103-109, 127-133,146-177,182- 189,196-271,277-289, 301-319,323-344,347- 354	D:27	Aminokyseli ny 55-106	D:nd	525,574

102 • · epidermi dis antigenn i protein

Domnělá funkce (podle homologie)

Predikované imunogenní ak**

č.

vybraných klonů na ORF vyhledání

Místo identifikované imunogenní oblasti

Reaktivita séra s relevant ní oblastí (pozitivní / celkový)

Sekv. č. : (DNA +Prot)

ID

ORF13I9

ORF1326

ORF1333

ORF13S6

ORF1373

2oxoglutarát dekarboxylá za (menD) autolysin

AtlE (lytD) chinol oxidáza polypeptid iv (ec 1.9.3.-) (chinol oxidáza aminokyseli ny 3-600, podjednotka qoxd) hypotetický protein dihýdrolipo amid acetyltrans feráza hypotetický proteih

9-31,36

86-94,96

127-140,

211,218256-270,

305,310345-353,

379,3844(17-423,

464,470540-554

45,59-67,71-81,

107,111-122,

153-168,180224,226-251, 272-289,299323,334-341, 358-364,369390,396-410, 429-442,454477,497-505,

6-25, 40-46, 75-81,150155,200-205,237-243,

288-295,297-306,308320,341-347,356-363,

384-391,417-429,440452,465-473,481-514,

540-546,554-560, 565577,585-590,602-609,

611-617,625-634,636643,661-668,676-684,

718-724,734-742,747754,766-773,775-781,

785-798,800-807,825832,840-857,859-879,

886-892,917-923,950956,972-978,987-1002,

1028-1035,1049-1065,

1071-1099,1111-1124,

1150-1172,1185-1190,

1196-1207,1234-1241,

1261-1271,1276-1281,

1311-1320,1325-1332

4-27,33-55,66-88

9-36,44-67,74-97, 99149,161-181,189-198, 211-224,245-253,267273,285-290,303-324, 342-394,396-427

33-39, 42-78,103-109, 126-136,184-191,225232,258-279,287-294, 306-315,329-334,362379,381-404,425-430

B:5;C:1

B:7;C:5

D:4

D:32

A:3,B:1 aminokyseliny

400-413 aminokyseliny

12821298 aminokyseliny

3-93 aminokyseliny

54-95 aminokyseliny

124-188 aminokyseliny

7-44

B.-SELAF54 ( 404-413): 11/12

B:SELAD20( 12821298): 10/12

D:nd

D:nd

A:SEFAP57( 124-188) : 2/12

248,

277

249,

278

526,

575

527,

597

250,

279

D:nd

528,

576

ORF1381

21-45,62-67,74-106,108142,154-160,230-236,

245-251,298-305

D:5

103

s.

epiderm idis antigen ní protein

ORF1420

ORF1443

ORFI500

ORF1665

ORF1707

ORF1786

Domnělá funkce (podle homologie)

Muts2 protein, domnělý

Protein buněčného dělení (divIB)

Protein buněčného dělení FtsY aminoyselin ový ABC transportér

Z permeázový protein

Domnělý na

Povrchu hostitelské buňky exponovaný lipoprotein

D-3Fosfoglycer át dehydrogená za, domnělá yhjN protein

Predikované imunogenní ak**

8-32,34-41, 76,81-89,97 148,153-159 175-188,207 276,280-289 321-335,341 360,364-371 420-440,449 502,505-516 573-588,598 614,616-624 702-717

46-55,70115,140,165-171, 239,256,297-319, -347,352,384-411, 460,495,560-566, -605,607,674-694,

61-66,111-117,148-155,

173-182,194-224,263293,297-303,313-321,

334-343,345-356,375381,384-395,408-429,

448-454

100-107,154-167,182193,200-206,223-231,

233-243,249-257,265273,298-310,326-336,

343-362,370-384

4-25,44-55,66-76,82-90, 93-99;104-109,176-209, 227-242,276-283,287328,331-345.347-376, 400-407,409-416,418438,441-474

12-31,40-69,129-137, 140-151,163-171,195202,213-218

4-10,16

78,87-95

124,135166-174,

207,225266-304,

347,351411-423,

450,454508-515

32,45-55,66,103-115,118150,154-161,

182-193,197231,252-261,

310-315,339359,387-402,

429-436,439464,498-505,

č.

vybraných klonů na ORF vyhledání

B-7

D:4

A:2,B:3

D:5

D:4

D:5

Místo identifikov ané imunogenní oblasti aminokyseli ny 58 1-608 aminokyseli ny 175-229 aminokyseli ny 77-182 aminokyseli ny 1-52 aminokyseli ny 20-76 aminokyseli ny 400-442 aminokyseli ny 254-301

Reaktivita séra s relevantní oblastí (pozitivní/ celkový)

B:SELAM40(58 1-604): 9/12

D:nd

B:SE1AP37 (139-162): 9/12

D:nd

D;nd

D:nd

Sekv. č.: (DNA +Prot)

251,

280

529,

577

252,

281

530,

578

531,

598

532,

579

ID

D:5

D:nd

533,

580

ORF1849

8-51,53-69,73-79,85132,139-146,148-167,

179-205,212-224,231257,264-293,298-304,

309-317,322-351 • ·

Predikované ak**

Sekv. ID

č.:

(DNA +Prot)

104

s.

epiderm idís antigen ní

Domnělá funkce (podle homologie) imunogenni protein

ORF1877 próteinexport membránový protein SecD(secD-1)

6-19,26-39,41-51, 59-67

72-85,91-98,104-111,

120-126,147-153,158164,171-178,199-209,

211-218,233-249,251257,269-329,362-368,

370-385,392-420,424432,454-489,506-523,

534-539,550-556,563573,576-596, 603-642,

644-651,655-666,685704,706-733,747-753

ORF1912 neznámý konzervovaný protein (konzervován ý)

23-35,37-70,75-84,90112,129-135,137-151, 155-180,183-209,211217,219-225,230-248, 250-269,274-284,289320,325-353,357-371, 374-380,384-399,401411,

ORF2015

Trehalóza-68-17,30-54,82-89,94ORF2018

QRF2040 fosfát hydroláza

Glukóza-6— fosfát 1-DH

LysM doména protein protein

PUB příbuzný protein

Protein z rodiny sodnosulfátových symportérů, domnělý

č.

vybraných klonů na ORF vyhledání

Místo identifikov ané imunogenni oblasti

Reaktivita séra s relevantní oblastí (pozitivní/ celkový)

D:7

D:4

A3,B:8 aminokyseli ny 367-409 aminokyseli ny 131-187

D:nd

D:nd

534,

581

535,

582

103,157-166,178-183, 196-204,212-219,222227,282-289,297-307, 345-364,380-393, 399405,434-439,443-449, 453-475,486-492,498507,512-535,538-548

4-16,21-27,39-51,6069,26-83,97-118,126132,159-167,171-177, 192-204,226-240,247259,281-286,294-305, 314-320,330-338,353361,367-372,382-392, 401-413,427-434,441447,457-463_

51-56,98-108,128-135,

138-144,152-158,177192,217-222,232-251,

283-305,406-431,433-439

13-18,36-43,45-50,ISIS, 95-100,111-126,133139

7-12,22-97,105-112,121128,130-146,152-164,

169-189,192-203,211230,238-246,260-281,

304-309,313-325,327357,367-386,398-444,

447-476,491-512

R-17

D:23

A: 60

D:41 aminokyseli ny 465-498 aminokyseli ny 250-287 aminokyseli ny 259-331 aminokyseli ny 42-118

B:SELAH62(465 -498): 5/12

B:SELAII9{250 -279): 3/12

D:nd

A:SEFAQ50{1557): 5/12

Di nd

253,

282

254,

283

536,

583 aminokyseli ny 1-57

255,

284

ORF2098

537,

584

ORF2139 • ·

Místo identifikované imunogénní oblasti

105

s.

epidermi dis antigenr i protein

Domnělá funkce (podle homologie)

Predikované imunogénní ak**

č.

vybraných klonů na ORF a| vyhledání

Reaktivita séra s relevant ní oblastí (pozitivní / celkový)

Sekv. č.: (DNA +Prot)

ID

ORF2172

ORF2200

ORF2248

ORF2260

ORF2282

ORF2376

ORF2439

SceB prekurzor (lytE) zinkový ABC transportér

I permeázový protein, domnělý membránový protein,

MmpL rodina, domnělý

Neznámý konzervoaný protein mezi dalšími konzervován ý

hypotetický protein

DivIC homolog, domnělý

Membránově vázaná lytická murein transglykos idáza

D, domnělá konzervován ý

hypotetický protein

4-23,28-34,38-43,45-51, 63-71,85-96,98-112,118126,167-174,179-185, 219-228,234-239,256—

263

4-31,33-40,48-64,66-82,

92-114,118-133,137159,173-246,248-266

4-11,17-34,

137,178-227

262-334,352

405,413-419

462-467,478

509,517-558

571-576,582

629,631-654

741-746,762

777,788-793

72-78,127,229-255,

-380,397,447—454,

-490,503— ,560-568,

-609,623,659-710,

-767,771,856-867

5-10,18-29,31-37,66178,196-204,206-213

16-22,41-50,52-64, 6674,89-95,107-114,123130,135-159,167-181,

193-199,223-231,249264,279-289

27-56,102-107,111-116

4-9,11-26,36-56,59-73, 83-100,116-130,148163,179-193,264-270, 277-287,311-321

5-28,71-81,101-107,128135,146-52,178-188,209214,224-233,279-294,

300-306,318-325,342347,351-357

A:438, B:40, D:4

D:19

D:17

B:4

A:4

D:7

A:459,

B:2,D:53 aminokyseliny

6-215 aminokyseliny

162-225 aminokyseliny

1-59, aminokyseliny

159-225, aminokyseliny

634-674 aminokyseliny

123-142 aminokyseliny

51-97 aminokyseliny

15-58 aminokyseliny

10-217 amino kyseliny 69-113

B:SELAH53(1 88-209): 3/12

D:nd

D:nd

B:SEIAG77(1 23-142): 12/12

A:SÉFAR88(5 1-97): 3/12

D:nd

B:SELAC31(7 5-129): 12/12

D:nd

256,

285

538,

585

539,

586

257,

286

258,

287

540,

587

259,

288

541,

588

ORF2493

4-29,37-77,80-119

D:6 aminokyseliny

1-65

D:nd

542,

589

D:8

ORF2535

ATPvazebnému kazetovému transportér u podobný protein, domnělý

106

s.

epiderm idis antigen ní protein

ORF2 627

ORF2635

ORF2669

ORF2671

ORF2673

ORF2694

ORF2695

ORF2719

Domnělá funkce (podle homologie) kationty transportuj íci

ATPáza, ElE2 rodina, domnělé

Hypotetický protein

Hypotetický protein

Hypotetický protein

Hypotetický protein

Hypotetický protein

Hypotetický protein dvousložkov ý

senzor histidin kináza, domnělá

S akumulací asociovaný protein

Predikované ak** imunogenní

8-31,34-80,125-132, 143153,159-165,176-189,193198,200-206,215-242,244262,264-273,281-289,292304,318-325,327-338,347371,404-416,422-429,432450,480-488,503-508,517525,539-544,551-562, 574587,600-631,645-670

4-10,17-24,26-42,61-71, 90-96,102-111,117-125, 158-164,173-182,193-201, 241-255,268-283,289-298, 305-319,340-353,360-376, 384-390,394-406

4-21,35-42,85-90,99-105, 120-125,148-155,175-185, 190-196,205-210,217-225

4-23,43-49,73-84,93-98, 107-113,156-163,179190,197-204,208-218,225231,248-255

4-20,65-71,99-105,148155,171-182,190-196,204210,221-228,240-246

4-26,93-98,121-132,156163,179-192,198-204,212220,225-238

4-26,43113,156204,212254

50,93-98,107163,179-190,198218,225-231,2475-52,60-71,75-84,91-109, 127-135,141-156,163-177, 185-193,201-214,222-243, 256-262,270-279,287-293, 298-303,321-328,334-384, 390-404,411-418,427-435, 438-448,453-479,481-498, 503-509

4-13,36-44,76-86,122141,164-172,204-214,235242,250-269,291-299,331337,362-369,377-396, 419427,459-469,505-524,547555,587-597,618-625, 633652,675-683,715-727,740753,761-780,803-811,842853,962-968,1006-1020

č. vybraných klonů na ORF 2 vyhledání

D:3

A:2.B:2

A:14,B:8

A: 44, B.-14

A:16,B-J

A: 19, B:30

A:7

B:4

A:265, B:448; C:4, D:9

Místo identifikované imunogenní oblasti aminokyseliny

61-105 aminokyseliny

139-169 aminokyseliny

22-81 aminokyseliny

23-68 aminokyseliny

23-68 aminokyseliny

25-82 aminokyseliny

22-78 aminokyseliny

123-132 aminokyseliny

803-1001

Reaktivita séra s relevant ní oblastí (pozitivní / celkový)

D:nd

B:SELAB6X1 38-163): 7/12

B:SELAE27( 22-51): 5/12

B:SELAD21( 36-61) : 5/12

B:SELAE25( 23-54): 2/12

B:SELAB26( 27-60): 5/12

A:SEFAH77( 22-66): 6/12

B.-SELAA62 (123-132): 6/12

B:SELAA10 (850-878): 11/12

Sekv. č.: (DNA +Prot)

543,

590

260,

289

261,

290

262,

291

263,

292

264,

293

265,

294

266,

295

ID

ORF2728

267,

296 « ·

Místo identifikované imunogenní oblasti

107

s.

epiderm idis antigen ní protein

Domnělá funkce (podle homologie)

Predikované imunogenní ak**

δ. vybraných klonů na ORF a vyhledání

Reaktivita séra s relevant ní oblastí (pozitivní /

Sekv. ID č.: (DNA +Prot)

ORF2740 prekurzor lipázy

4-21,190-200,218-228,

233-241,243-261,276297,303-312,316-325,

346-352,381-387,436442,457-462,495-505,

518-532,543-557,574-593

C:3

ORF2764

ORF2767

ORF2809

ORF28SI celkový) aminokyseliny C:GSBBL80 110-177 (1*70-177)

1/1

358

364

Oligopeptid ový ABC transportér permeázový protein, domnělý neznámý konzervován ý protein mezi dalšími

Protein z rodiny sodnosulfát ových symportérů domnělý transmembrá nový efluxni protein

14-36,62-131,137-147 149-162,164—174,181207,212-222,248-268, 279-285

7-20,22-35.40-50,52-61, 63-92,94-101,103-126, 129-155,161-178,192198,200-208,210-229, 232-241,246-273,279332,338-359,369-383

4-29,37-53,56-82,87100,108-117,121-138, 150-160,175-180,189195,202-214,220-247, 269-315,324-337,341355,361-412,414-423, 425-440,447-467

7-13,20-32,37-90,93103,107-126,129-155, 159-173,178-189,195221,234-247,249-255, 268-303,308-379

D:4

D:4

D:9

D:ll aminokyseliny

D:nd

6-41 aminokyseliny

276-316 aminokyseliny

266-317, aminokyseliny

357-401 aminokyseliny

137-185

D:nd

D:nd

D:nd

544

591 '545

592

546

593

547

594

108

Tabulka 2d: Imunogenní proteiny identifikované bakteriálním povrchovým a ribosomovým zobrazením: S. aureus (nová anotace)

Bakteriální povrchové zobrazení: A, LSA250/1 knihovna ve fhuA se sérem pacienta 1 -(655); B, LSA50/6 knihovna v lainB se sérem pacienta 1 (484); C, LSA250/1 knihovna ve fhuA s 1C sérem 1 (571); E, LSA50/6 knihovna v lamB s 1C sétem 2 (454); F, LSA50/6 knihovna v lamB se sérem pacienta Pi (1105) ; G, LSA50/6 knihovna v lamb s 1C sérem 1 (471). Ribosomové zobrazení: Q, LSA250/1 knihovna s 1C sérem (1686). ★*, predikce antigenních sekvencí delších než 5 aminokyselin byla provedena programem ANTIGENIC (Kolaskar a Tongaonkar, 1990); #, identické sekvence přítomné dvakrát v ORF.

S. aureuf antigenni protein

Staré číslo ORF

Domnělá funkce (podle homologie)

Predikované imunogenní ak** vybraných klonů na ORF vyhledáni

Místo identifikované imunogenní oblasti

Reaktivit a séra s relevan tni oblastí (pozitivn i/

Sekv. č.: (DNA +Prot)

ID

SaA0003

ORF2967 &

ORF2963 nepC

7-19,46-57,8591,110-117,125133,140-149,

156-163,198204,236-251,

269-275,283290,318-323,

347-363

B:3, C:14; F:29 aminokyseliny

9-42 aminokys eliny

156-241 aminokyseliny

300-3 14 aminokyseliny

343-420

C:GSBYI53 (9-42) : 1/1

C:GSBYG39 (156-41): 1/1

C:GSBYM94 (343-20): 26/30

394,

396

ORF0123

ORF0160

ORF0657

ORF1050

ORF1344

ORF1909 aminokysel in v oblasti N-konce

ORF1941 aminokysel in v oblasti N-konce

ORF neznámý

ORF1307 aminokysel iny v oblasti N-konce

ORF02I210 aminokysel in v oblasti N-konce neznámá neznámá

LPXTGVI protein neznámá

NifS protein homolog

4-10,25-30,3857,91-108,110123,125-144,

146-177,179198,216-224,

226-233

4-26,34-70,7282,86-155,160166,173-205,

207-228,230252,260-268,

280-313

9-33,56-62,7584,99-105,122127,163-180,

186-192,206228,233-240,

254-262,275283,289-296,

322-330,348355,416-424,

426-438,441452,484-491,

541-549,563—

569,578-584,

624-641

45-68,72-79,91101,131-142,

144-160,179-201

13-26,40-49,6168,92-112,114123,138-152,

154-183,194—

200,207-225,

229-240,259265,271-284,

289-309,319324,330-336,

346-352,363-372

B:3,E:7,

G:1

A:1

A:2,B:27,

F:15

A:1,H:45

A: 11 aminokyseliny

145-163 aminokyseliny

96-172 aminokyseliny

526-544 aminokyseliny

53-124 aminokyseliny

24-84

B:GSBXF80 (150-63): 5/27

E.-GSBZC17 (150-63): 25/41

A:GSBXO07 (96-172): 5/30

B-.GSBXE07

-bdbl (527542) :

11/71

F:SA1AX7O (526—

544):H/41

A:GSBXM26 (53-124): 7/30

A:GSBXK59 bmd21(2484) :-6/28

409,

410

411,

412

413,

414

415,

416

417,

418

Místo identifikov ané imunogenní oblašti

109

s.

aureus antiger ní proteir

Staré číslo

ORF

Domnělá funkce (podle homolog ie)

Predikované imunogenní ak**

č.

vybraných klonů na ORF vyhledání

Reaktivita séra s relevantní oblastí (pozitivní/ celkový)

Sekv. ID č.: (DNA +Prot)

ORF1632IORF1163 -4 aminokys eliny v oblast i Nkonce

SdrH homolog

4-31,50-55,243-257,259268,298-316,326-335,

364-370,378-407

B:6,E:11,

F:34 aminokyseli ny 101-115 aminokyseli ny 115-139 aminokyseli ny 158-186

B:GSBXG53(164 -182):39/71 F-.SALAP07 (101 -115):11/41

419,

420

ORF218QORFOS94 aminokys eliny v oblast i Nkonce

LPXTGIV protein

9-17,24-45,67-73,82-90,

100-107,117-134,137145,158-168,176-183,

188-194,206-213,£23231,243-248,263-270,

275-282,298-304,344355,371-377,382-388,

427-433,469-479,500505,534-559,597-607,

662-687,790-815,918943,1032-1037,10461060,1104-1112,11281137,117?-1184,11971204,1209-1214,12211239

A:3,C:3,

E:6,F:2,

H:6 aminokyseli ny 491-587 aminokyseli ny 633-715 aminokyseli ny 702-757 aminokyseli ny 758-830 (aminokysel iny 830885)

A:GSBXS61 (491-555):1/1 A:GSBXL64(494 -585): 1/1 A:GSBXS92(758 -841):1/1 A:bmd4(702757) :16/30 (A:bmd4(830885):16/30) F:SALBC43(519 -533):4/41

421,

422

ORF2184

ORF0590 aminokys elin v oblast i Nkonce

FnbpB

10-29,96 146-158, 182,185227-236, 284,291348-356, 396,422480-487, 527,543579-585, 623,643706-718, 796,810833-839, 885,887116,131-137, 167-173,177191,195-?01, 260-266,270299,301—312, 367-376,382432,442-453, 497-503,519548,559-565, 591-601,616648,657-663, 746-758,791817,819-825,

847-853,868895,919-932

A:2, G4, G:9 aminokyseli ny 694-769 aminokyseli ny 774-847

A:GSBXM62(694 -769):28/28 A:GSBXR22(774 -847):1/1

423,

424

ORF247CJORF0299 -14 aminokys elin v oblast i N— konce

Konzerv ováný hypotet ický protein

4-27,36-42,49-55,68-73, 94-101,131-137,193-200, 230-235,270-276,294302, 309-324,334-344, 347-364,396-405,431437,498-508,513-519, 526-532,539-544,547561,587-594,618-630, 642-653,687-699,713719,752-766

C:3 aminokyseli ny 400-441

C:GSBYH60(400 -441):28/31

425,

426

ORF249Í

ORF0267

ORF přibl. o 580 aminokys elin delšív oblasti

N-konce;

plus další změny

Konzerv ováný hypotet ický protein

8-19,21-44,63-76,86-92,

281-286,303-322, 327338,344-354,364-373,

379-394,405-412, 453460,501-506,512-518,

526-542,560-570,577583,585-604,622-630,

645-673,677-691,702715,727-741,748-753,

770-785,789-796,851858,863-869,876-881,

898-913,917-924,979986,991-997,10041009,1026-1041,10451052,1107-1114,11191125,1132-1137,11541169,1173-1192,11981204,1240-1254,12671274,1290-1298,16121627

D:12,F:6 aminokyseli ny 358-411 aminokyseli ny 588-606 aminokyseli ny 895-909

D:17/21 F:SALAT38(895 -909):8/41

427,

428

110 • «

S. aureu; antigenní protein	Staré čislo QRF	Domnělá funkce (podle homologie)	Predikované imunogenni ak**	č. vybraných klonů na ORF a vyhledání	Místo identifikované imunogenni oblasti	Reaktivita séra s relevantní oblastí (pozitivní/ celkový)	Sekv. ID č. : (DNA +Prot)
ORF2548	ORF2711 -12 aminokys elin v oblasti N- konce	IgG vazebný protein	4-37,44-53,65-71, 75-82,105-112, 126-132,136-143, 164-170,184-190, 194-201,222-232, 242-248,252-259, 280-291, 300-317, 413-420,452-460, 485-503	A:55, B:54, C:35, F:59, G: 5 6, H:38	aminokyseliny 1123 aminokyseliny 207-273 amino kys eliny 310-410	A:GSBXK68(173):21/30 A-.GSBXK41 (35 -123) :1/1 A:GSBXN38(20 7-273):19/30 A:GSBXIill (31 0-363):10/30 B:GSBXB22(39 4-406):37/71 F:SALAM17(39 4-406):29/41	429, 430
ORF2746	ORF2S07 -3 aminokys eliny v oblast i N- konce	homologie s ORFl	4-9,12-17,40-46, 91-103,106-113, 116-125,150-160, 172-177,182-188, 195-206,241-261, 263-270,277-285, 287-294	A:1,H:13	aminokyseliny 63126	A:GSBX040(66 -123):8/29	431, 432
ORF2797	ORF2470 -24 aminokys elin v oblast i N- konce	neznámá	13-32,40-75,82- 85,97-112,115- 121,124-154,166- 192,201-225,227- 252,268-273,288- 297,308-375,379- 434	B:3, E:2, F:13,R:3	aminokyseliny 159-176 aminokyseliny 325-339	B:GSBXE85(15 9-176):11/27 F:SALAQ47(15 9-176):8/41	433, 434
ORF2960	ORF2298 -5 aminokys elin v oblast i N- konce	domnělý Exotoxin	8-31,35-44,106- 113,129-135,154- 159,168-178,203- 215,227-236,240- 249,257-266,275- 281,290-296,298- 305,314-319,327- 334	C:101, E:2,H:58	aminokyseliny 180 aminokyseliny 48121 aminokyseliny 98190	C:GSBYG32(180) -.:6/7 C:GSBYG61bhe2(48116):26/30 C:GSBYN80(98 -190): 13/17	435, 436
ORF2963	ORF2295 -5 aminokys elin v oblasti N- konce	domnělý Exotoxin	8-23,35-41,64-70, 81-87,109-115, 121-132,150-167, 177-188,194-201, 208-216,227-233, 238-248,265-271, 279-285	C:3,E:3, G:1	aminokyseliny 1795	C:GSBYJ58(17 -95):9/15	437, 438

111

S.	Staré	Domnělá	Predikované imunogenní	č.	Misto	Reaktivita	Sekv. ID
aureus	číslo	funkce	ak**	vybraných)identifikov	séra	č.:
antigen ní proteir	ORF	(podle homologie )		klonů na ORF a vyhledání	ané imunogenní oblasti	s relevantní oblastí (pozitivní/ celkový)	(DNA +Prot)
ORF320C	0RF13	domnělý	8-32,45-52,92-103,154-	a: 11,	aminokyseli	A:GSBXL07(854	439,
	31 +8506 amino kysel in v obl asti N- konce	extracelu lárni matrix vázající protein	159,162-168,207-214, 232-248,274-280,297303,343-349,362-375, 425-442,477-487,493498,505-512,522-533, 543-550,558-564,568574,580-600,618-630, 647-652,658-672,692705,71Í-727,765-771, 788-798,812-836,847858,870-898,903-910, 1005-1015,1018-1025, 1028-1036,1058-1069, 1075-1080,1095-1109, 1111-1117,1119-1133, 1166-1172,1183-1194, 1200-1205,1215-1222, 1248-1254,1274-1280, 1307-1317,1334-1340, 1381-1391,1414-1420, 1429-1439,1445-1467, 1478-1495,1499-1505, 1519-1528,1538-1550, 1557-1562,1572-1583, 1593-1599,1654-1662, 1668-1692,1701-1707, 1718-1724,1738-1746, 1757-1783,1786-1793, 1806-1812,1815-1829, 1838-1848,1853-1860, 1875-1881,1887-1893, 1899-1908,1933-1940, 1952-1961,1964-1970, 1977-1983,1990-1996, 2011-2018,2025-2038, 2086-2101,2103-2117, 2177-2191,2195-2213, 2220-2225,2237-2249, 2273-2279,2298-2305, 2319-2327,2349-2354, 2375-2381,2391-2398, 2426-2433,2436-2444, 2449-2454,2463-2469, 2493-2499,2574-2589, 2593-2599,2605-2611, 2615-2624,2670-2684, 2687-2698,2720-2727, 2734-2754,2762-2774, 2846-2866,2903-2923, 2950-2956,2985-2998, 3011-3031,3057-3064, 3102-3117,3137-3143, 3186-3195,3211-3219, 3255-3270,3290-3300, 3327-3334,3337-3343, 3390-3396,3412-3419, 3439-3446,3465-3470, 3492-3500,3504-3510, 3565-3573,3642-3650, 3691-3698,3766-3775, 3777-3788,3822-3828, 3837-3847,3859-3864, 3868-3879,3895-3902, 3943-3951,3963-3971, 3991-3997,4018-4030, 4054-4060,4074-4099, 4123-4129,4147-4153, 4195-4201,4250-4255, 4262-4267,4270-4277, 4303-4310,4321-4330, 4343-4352,4396-4408, 4446-4451,4471-4481,	B:ll, C:36, H:32	ny 8543— 8601 aminokyseli ny 84618475	3-8601):6/28	440

112 • »·

4503-4509,45164534,4596-4604,46384658,4698-4710,471941732, 4776-4783,48254833,4851-4862, 48824868,4894-4909,49374942,5047-5054,50945100,5102-5112,51205125,5146-5153,51555164,5203-5214,52265236,5278-5284,53155321,5328-5342,53485359,5410-5420,54545466,5481-5489,55225538,5597-5602,56075614,5623-5629,56505665,5707-5719,57345742,5772-5778,57855790,5833-5845,58575863,5899-5904,59085921,5959-5971,59815989,6010-6017,60346043,6058-6064,61126120,6154-6169,62106217,6231-6240,62616268,6288-6294,63186324,6340-6349,63586369,6402-6407,64336438,6483-6493,65136519,6527-6546,65616574,6599-6608,66106616,6662-6673,66966705,6729-6743,67696775,6792-6801,68196828,6840-6846,68606870,6915-6928,69666972,7021-7028,70327047,7096-7101,71097117,7138-7149,71577162,7201-7206,72387253,7283-7294,72967302,7344-7365,73677376,7389-7404,74137433,7475-7482,74937500,7535-7549,75967608,7646-7651,76617678,7722-7731,77417754,7764-7769,77767782,7791-7806,78257837,7862-7875.78917897,7922-7931,79747981,7999-8005,80398045,8049-8065, 80708075,8099-8112,81198125, 8151-815.8, 81698181,8226-8232,82588264,8291-8299,83018310, 8325-8335,83*758389,8394-8400,84058412,8421-8436,84788485,8512-8521,85288538,8564-8579,85878594,8603-8615,86268637,8640-8646,86578672,8684-8691,87258736,8748-8761,87778783,8794-8799,88108825,8851-8862,88748887,8903-8912,89148926,8933-8943,89548960,8979-8988,90049011,9035-9041,90569069,9077-9086, 90889096,9106-9111,91249133,9183-^191,92249231,9235-9241,92509265,9279-9290,92959300,9326-9343,94089414,9422-9427,94359441,9455-9461,9507113

9517,9532-9538,95809589,9594-9600,96149623,9643-9648,96659683,9688-9700,97209726,9742-9758,97679775,9795-9800,98179835,9842-9847,99129919,9925-9938,99439963,9970-10009,1002510031,10037-10043,

10045-10063,1006610073,10117-10124,

10126-10136,1020310210,10218-10225,

10232-10242,102S710292,10303-10323,

10352-10360,1038510396,10425-10431,

10452-10459,10480-10485 • · · · · · · * · ·· ··· · · · ···· • ····· · · ·· ·····

114 ····· ·· ··· ·· ·

Tabulka 3. Serologická proteomová analýza povrchových proteinů S. aureus za použití lidského séra

a) S. aureus/agr zátěžové podmínky

Spot ID/séra	IC40 1:20000	IC35, N26, C4 1:50000 každý	dětský pool C2,5,6,10,12 1:10,000	N22 1:10000 IC40 1:50000
PCK2	+	+		+
PCK4	+	+++		+++
PCK5	-	(+)		+
PCK6	+	+		+

Spot ID/sér	IC35,40 1:50,000 N22 1:10000	P-pool (P6,18,25,28, 29) 1:50000	Dětský pool C2,5,6,10,12 1:10000
PAC1	++	++	-
PAC2	++	+++	-
PAC 3		+	-
PAC5	-	++

Spot	P-pool	Dítě	14	IC	pool/IgG	IC pool /IgA
ID/séra	(P6,18,25,28, 29) 1:50000 každý	1:10000		(N26, IC34, 35) 1:30000 každý	(N26, IC34,35) 1:30000 každý
PACH	++	-	++	++
PAC 12	++	-	++	++
PAC 13	-	-	-	++
PAC 14	-	-	+	+
PAC 15	-	-		+++	+++
PAC 16	+	-	+	+
PAC 17	+	-	+	+
PAC 18	++	-		-
PAC 19	-	-	++	++
PAC20	++	-	-	-
POV31	+++	-	-	-
P0V32	+	-	-	-
POV33	+	-	-	-
POV34	+	-	-	-
POV35	+	-	-	-
POV36	+	-	-	-
POV37	++	-	-	-

• ·· ·· · ··* ··· · · · ·· · · · ··· ·· · ···· ····· · · ·« ·····

115 • · · e · · · ··· · · ·

POV38	++	-	-	-
POV39	+++	-	-	-
POV40	+++	-	-	-

b) S. aureus/COL „standardní podmínky

Spot	IC pool	IC35	P18	P25	PÍ	P29	Dítě 18
ID/séra	(N26, IC34, 35)	1:20000	1:10000	1:10000	1:5000	1:2500	1:10000
P0V2	+++	+++	+++	+++	+ + +	-	-
P0V3.1	+++	+++	+++	+++	+ + +	-	-
POV3.2	+++	+++	+++	+++	+++	-
POV4	+	+++	-	-	-	-	-
P0V7	-	-	+++	-	-	-	-
POVIO	-	-H-	(+)	(+)	-	(+)
POV12	-		-	-	-	+++
POVÍ 3	++	+++	+++	+++	++	++	-
POVÍ 4	++	+++	+++	++	+ +	++	-
POVÍ 5	+	+		+	(+)	-	-

c) S. aureus/COL 'stress podmínky

Spot	P-pool	IC34+IC35	?18	P29	Infant 14
(D/séra	(P6,18,25, 28, 29) 1:50000	1:20000 každý	1:10000	1:10000	1:10000
POVÍ 6	-	+++			-
POVÍ 7	-	+++	(+)		-
POVÍ 8	+		F+	-	-
POVÍ 9	(+)	-	F++	-	-
POV21	-		F	-	-
POV23	-	+			-
POV24	-	+	-	-	-
POV25	+	-	-		-

• ·

110

Tabulka 4. Antigeny S. aureus identifikované pomocí MALDI-TOFMS sekvenování (ORF vyznačené tučně byly také identifikovány bakteriálním povrchovým zobrazením)

Predikce antigenních oblastí vybraných antigenů identifikovaných serologickou proteomovou analýzou za použití lidského séra

spot ID	S. aureus protein (ORF č./ zkratka)	Domnělá funkce (podle homologie)	Sekv. ID č.: (DNA, Prot)	Domnělá lokalizace
PCK2	ORF0599	Glycinamid-ribosylsyntháza	107, 108	Cytoplazma
PCK5	ORF0484 yitU	konzervovaný hypot. protein (yitU)	109,110	cytoplazma
PCK6	ORF2309 mgo	S membránou-asociovaná malátchinonoxidáza	111,112	periferní membrána
POV2	ORF0766 auxl	proteinová fosfatáza podílející se na methicilinové rezistenci	113,114	transmembránov ě
POV4,17 PAC14,19	ORF0078 EFTu	C-terminální část 44 kDa proteinu podobného elongačnímu faktoru Tu	115,116	cytoplazma/ sekretovaný
P0V5 11	ORF0782	reduktáza 3-ketoacyl-acyl nosičového proteinu (fabG)	117,118	cytoplazma
POV7	ORF0317SecA	proteinový transport přes membránu SecA	39, 91	cytoplazma
POVIO	ORF1252yrzC	hypotetický BACSD 11.9 kD protein (upf0074 (rff2) rodina)	119,120	cytoplazma
POVÍ 2	ORF0621 pdhB	Dihydrolipoamidacetyl transferáza (pdhB)	121,122	cytoplazma
POVÍ 4	ORF0072 rpoB	Na DNA-namířená RNA polymeráty B	125, 126	cytoplazma
POV15	ORF0077 EFG	85 kD vitronektin vázající protein	127, 128	cytoplazma
POVÍ 8	nenalezen YLY1	Obecný stresový protein YLY1	129,130	cytoplazma
POV30 11	ORF0069 RL7	ribosomální protein L7	131,132	cytoplazma
POV21	ORF0103 yckG	pravděpodobná héxulóza-6- fosfátsyntáza (yckG)	133-, 134	cytoplazma
,POV24	ORF0419 yurX	konzervovaný hypotetický protein (yurX)	137, 138	cytoplazma

117

spot ID	S. aureus protein (ORF č./ zkratka)	Domnělá funkce (podle homologie)	Sekv. ID č.: (DNA, Prot)	Domnělá lokalizace
POV25	ORF2441 gidA	Protein inhibujíci glukózou buněčné dělení (gidA]	139, 140	cytoplazma
PAC1	ORF1490 prsA	prekurzor protein export proteinu prsa (prsA)	173, 174	Periplazma
PAC2	ORF1931 ModA	periplazmatický molybdát vázající protein (ModA)	175, 176	povrch
PAC3	ORF2053	Na těžkých kovech závislý transkripční aktivátor, domnělý regulátor efluxní pumpy rezistence pro mnoho léků pmrA	177, 178	cytoplazma
PAC5	ORF2233 ydaP	pyruvátoxidáza (ydaP)	179,180	cytoplazma
PACH	ORF1361	LPXTGV, extracelulární matrixbdg.	3,56	povrch
PAC12	ORF1244 alaS	alanyl-tRNA syntetáza	159, 160	cytoplazma
PAC13	ORF0835 ymfA	Enzym zpracovávající RNA/ATPbdg.	161,162	cytoplazma
PAC15	ORF1124 bfmBB	lipoamid acyltransferázová složka dehydrogenázového komplexu větvených alfa-keto kyselin	163, 164	cytoplazma
PAC16	ORF0340 GAPDH	glyceraldehyd-3-fosfát dehydrogenáza	165, 166	cytoplazma
PAC17	not found ContigBS	5'-metylthioadenosin nukleosidáza/Sadenosylhomocystein nudeosidáza		cytoplazma
PAC20	ORF2711	75% identita s ORF2715 podobnému hypotetickým proteinům	167, 168	neznámá
P0V31	ORF0659	29 kDa povrchový protein	236, 238	povrch
POV32	ORF06S9	29 kDa povrchový protein	236, 238	povrch
POV33	ORF0659	29 kDa povrchový protein	236, 238	povrch
POV34	ORF0659	29 kDa povrchový protein	236, 238	povrch
POV35	ORF0659	29 kDa povrchový protein	236, 238	povrch
POV36	ORF00661	LPXTG-motiv domény proteinu ukotvujícího buněčnou stěnu	235, 237	povrch
POV37	ORF0659	29 kDa povrchový protein	236, 238	povrch

• ·

118

spot ID	S. aureus protein (ORF č./ zkratka)	Domnělá funkce homologie)	(podle	Sekv. ID č. : (DNA, Prot)	Domnělá lokalizace
POV38	ORF0659	29 kDa povrchový protein	236, 238	povrch
POV39	ORF0657	LPXT G-ukotvený protein	povrchový	1,142	povrch
POV40	neidentifik ováný

Sekv. IE č. : (Protein)	spot ID	S. aureus, ORF č./ zkratka	Domnělá lokalizace	Domnělé antigenní povrchové oblasti (Antigenní balíček)
112	PCK6	ORF2309 mqo	periferní membrána	61-75, 82-87, 97-104, 113-123, 128133, 203-216, 224-229, 236-246, 251-258, 271-286, 288-294, 301-310, 316-329, 337-346, 348-371, 394-406, 418-435, 440-452
114	P0V2	ORF766 auxl	transmembrán ový	30-37, 44-55, 83-91, 101-118, 121128, 136-149, 175-183, 185-193, 206-212, 222-229, 235-242
116	P0V4	ORF078 EF- Tu	Cytoplazma/ sekretovaný	28-38, 76-91, 102-109, 118-141, 146-153, 155-161, 165-179, 186-202,215-221, 234-249, 262-269, 276-282, 289-302, 306-314, 321-326, 338-345, 360-369, 385-391
176	PAC2	ORF1931 ModA	Periplazma	29-44, 74-83, 105-113, 119-125, 130-148, 155-175, 182-190, 198-211, 238-245
174	PAC1	ORF1490 prsA	Periplazma	5-24, 38-44, 100-106, 1 18-130, 144-154, 204-210, 218-223, 228-243, 257-264, 266-286, 292-299
168	PAC2 0	ORF2711	neznámá	7-14, 21-30, 34-50, 52-63, 65-72, 77-84, 109-124, 129-152, 158-163, 175-190, 193-216,219-234

spot ID	GI č. nebo TIGR č.	S. aureus protein (ORF 5./zkrátka)	Domnělá funkce (podle homologie)	Sekv. ID č. : (DNA, Prot)
PCK2	TIGR1280	DRF0599	Glycinamid-ribosylsyntáza	107, 108

119

PCK4	7672793	ORF2268 IsaA	možná adheze/agregace	12,64
PCK5	TIGR6209	ORF0484 yiti)	konzervovaný hypot. protein (yitu)	109,110
PCK6	TIGR6182	ORF2309	S membránou-asociovaná malátchinonoxidáza	111,112
P0V2	6434044	ORF0766 auxl	proteinová fosfatáza podílející se na methicilinové rezistenci	113,114
POV3.1	7672993	ORF2268 IsaA	možná adheze/agregace	12, 64
POV3.2	7672993	ORF2268 IsaA	možná adheze/agregace	12,64
P0V4	TIGR8079	ORF0078 EFTu	C-terminální část 44 kDa proteinu podobného elongačnímu faktoru Tu	115,116
POV5 11	TIGR8091	ORF0782	reduktáza 3-ketoacyl-acyl nosičového proteinu (fabG)	117,118
POV7	2500720	ORF0317SecA	proteinový transport přes membránu SecA	39,91
POVIO	TIGR8097	ORF1252yrzC	hypotetický BACSU 11.9 kD protein (upf0074(rff2) rodina)	119,120
POVÍ 2	2499415	ORF0621 pdhB	dihydrolipoamid acetyltransferáza (pdhB)	121,122
POVÍ 3	7470965	ORF0094 SdrD	fibrinogen-bdg. (LPXTG) protein homolog (SdrD)	123, 124
POVÍ 4	1350849	ORF0072 rpoB	Na DNA-namiřená RNA polymeráza B	125, 126
POVÍ 5	6920067	ORF0077 EF-G	85 kD vitronektin vazebný protein	127, 128
POVÍ 7	TIGR8079	ORF0078	C-terminální část 44 kDa proteinu podobného elongačnímu faktoru Tu	115,116
POVÍ 8	3025223	nenalezen	Obecný stresový protein YLY1	129, 130
POV30 11	350771	ORF0069 RL7	ribosomálni protein L7	131,132
POV21		ORF0103	pravděpodobná hexulóza-6-fosfát syntéza (yckG)	133,134
POV23		ORF0182	lipoprotein (S.epidermis)	135, 136

^1J identifikováno z celkového lyzátu ze S. aureus 8325-4 spakultivovaného za standardních podmínek. Séroreaktivita s 1/1 sérem pacienta a 2/4 normálním sérem, ale ne s dětským sérem (C5).

• · · · ·

120 « · ·>

References

Aichinger G., Karlsson L., Jackson M.R., Vestberg M., Vaughau J.H., Teyton L., Lechler R.I. a Peterson P A. Major Histocompatibility Complex class II-dependent unfolding, transport a degradation of endogenous proteiny. J. Biol. Chem., sv. 272, 1997, str. 29127-29136

Ausubel, P.M., Brent, R., Kingston, R.E., Moore, D.D., Seidman, J.G., Smith, J.A. a Struhl, K. Eds.(1994). Current protocols in molecular biology. John Wiley & Sons, lne.

Betley, M.J., Lofdahl, S., Kreiswirth, B.N., Bergdoll, M.S. a Novick, R.P. (1984). Staphylococcal enterotoxin gene is associated with variable genetic element. Proč. Nati. Acad. Sci. U.S.A. 81:5179-5183.

Bruggemann M, Neuberger MS (1996) Imunol. Today 17:391-397

Bumie, J.P., Matthews, R.C., Carter, T., Beaulíeu, E., Donohoe, M., Chapman, C., Williamson, P. a Hodgetts, S.J. (2000). Identification of imunodominant ABC transportér in methicillinrezistentní Staphylococcus aureus infection. Infect. Immun. 68:32.00-3209.

Chen, H.Z. a Zubay, G. (1983). Methods Enzymol. 101:674-690.

Coloque-Navarro, P., Soderquist, B., Hplmberg, H., Blomqvist, L., Olcen, P., and Mollby, R. (1998) Antibody response in Staphylococcus aureus septicaemia - a prospective study. J. Med. Microbiol. 47, 217-25.

Crossley, K.B. a Archer G.L., eds. (1997). The Staphylococci in Human Disease. Churchill Livingston lne.

Flock, J.I. (1999). Extracellular-matrix-binding proteins as targets for the prevention of Staphylococcus aureus infections. Molecular Medicine Today 5.: 532-537.

Forrer, P., Jung, S. a Pltickthun, A. (1999). Beyond binding: using phage display to select for structure, folding and

121 • · * · · · ··· • · · · · ··· · ·· enzymatic activity in proteins. Curr. Opin. Struct. Biol. 9:514520.

Foster, T.J. a Hook, M. (1998). Surface protein adhesins of Staphylococcus aureus. Trends Microbiol. 6:484-488.

Frenay, Η. Μ. E., Theelen, J. P. G., Schouls, L. M., Vandenbroucke-Grauls, C. M. J. E., Vernoef, J., van Leeuwen, W. J., a Mooi, F. R. (1994). Discrimination of epidemie and nonepidemic methicillin-resistant Staphylococcus aureus on the basis of protein A gene polymorphism. J. Clin. Microbiol. 32:846-847.

Georgiou, G., Stathopoulos, C., Daugherty, P.S., Nayak, A.R., Iverson, B.L. a Curtiss III, R. (1997). Display of heterologous proteins on the surface of microorganisms: From the sereening of combinatorial libraries to live recombinant vaccines. Nátuře Biotechnology 15:29-34.

Goh, S.H., Byrne, S. K., Zhang, J. L., a Chow, A. W. (1992). Molecular typing of Staphylococcus aureus on the basis of coagulase gene polymorphisms. J. Clin. Microbiol. 30:1642-1645.

Graziano et al. (1995) J. Immunol. 155:4996-5002

Hammer et al. J. Exp. Med (1995) 181: 1847-1855

Hanes, J. a Pluckthun, A. (1997). In vitro selection and evolution of functional proteins by using ribosome display. PNAS 94:49374942.

Hashemzadeh-Bonehi, L., Mehraein-Ghomi, F., Mitsopoulos, C., Jacob, J.P., Hennessey, E.S. a Broome-Smith, J.K. (1998). Importance of using lac rather than ara promotér vectors for modulating the levels of toxic gene products in Escherichia coli. Mol. Microbiol. 30:676-678.

Hryniewicz, W. (1999). Epidemiology of MRSA. Infection 27:313-16.

Immler, D., Gremm, D., Kirsch, D., Spengler, E., Presek, P., Meyer, H.E. (1998). Electrophoresis 19:1015-1023.

122

Kajava, A.V. , Zolov, S.N., Kalinin, A.E. a Nesmeyanova, M.A.

(2000) . The net charge of the first 18 residues of the mature sequence affects protein translocation across the cytoplasmic membráně of Gram-negative bacteria. J. Bacteriol. 182:2163-2169.

Kluytmans, J., van Belkum, A. a Verbrugh, H. (1997). Nasal carriage of Staphylococcus aureus: epidemiology, underlying mechanisms, a associated risks. Clin. Microbiol. Rev. 10:505-520.

Kolaskar, A.S. a Tongaonkar, B.C. (1990). A semi-empirical method for prediction of antigenic determinants on protein antigens. FEBS Lett. 276:172-174.

Lim, Y., Shin, S.H., Jang, I.Y., Rhee, J.H. a Kim, I.S. (1998). Human transferring-binding protein of Staphylococcus aureus is immunogenic in vivo and has an epitope in common with human transferring receptor. FEMS Microbiol. Letters 166:225-230.

Lorenz, U., Ohlsen, K., Karch, H., Hecker, M., Thiede, A. a Hacker, J. (2000). Human antibody response during sepsis against targets expressed by methicillin resistant Staphylococcus aureus. FEMS Immunol. Med. Microbiol. 29:145-153.

Mamo, W., Jonsson, P. a Muller, H.P. (1995). Opsonization of Staphylococcus aureus with a fibronectin-binding protein antiserum induces protection in mice. Microb. Pathog. 19:49-55.

McGuiness BT et al. (1996) Nátuře Biotech. 14:1149.

Modun, B., Evans, R.W., Joannou, C.L. a Williams, P. (1998). Receptor-mediated recognition and uptake of iron from human transferring by Staphylococcus aureus and Staphylococcus epidermidis. Infect. Imiňun. 66:3591-3596.

Nilsson, I., Patti, J.M., Bremell, T., Hook, M. a Tarkowski, A. (1998). Vaccination with a Recombinant Fragment of Collagen Adhesin provides Protection against Staphylococcus aureus-mediated Septic Death. J. Clin. Invest. 101:2640-2649.

Parker, K. C., M. A. Bednarek, a J. E. Coligan (1994). Scheme for

123

• · ranking potential HLA-A2 binding peptides based on independent binding of individual peptide side-chains. J. Immunol. 152:163.

Pasquali, C., Fialka, I. & Huber, L.A. (1997). Electrophoresis 18:2573-2581.

Phillips-Quagliata, J.M., Patel, S., Han, J.K., Arakelov, S., Rao, T.D., shulman, M.J., Fazel, S., Corley, R.B., Everett, M., Klein, M.H., Underdown, B.J. a Corthesy, B. (2000). The IgA/IgM receptor expressed on a murine B cell lymphoma is poly-Ig receptor. J. Immunol. 165:2544-2555.

Rammensee, Hans-Georg, Jutta Bachmann, Niels Nikolaus Emmerich, Oskar Alexander Bachor, Stefan Stevanovic (1999) SYFPEITHI: database for MHC ligands and peptide motifs. Immunogenetics 50: 213219

Recsei P., Kreiswirth, B., 0'Reilly, M., Schlievert, P., Gruss, A. a Novick, R.P. (1986). Regulation of exoprotein gene expression in Staphylococcus aureus by agr. Mol. Gen. Genet. 202:58-61.

Rodi, D.J. and Makowski, L. (1999). Phage-display technology— finding a needle in a vast molecular haystack. Curr. Opin. Biotechnol. 10:87-93^

Schaffitzel et al., Ribosome display: an in vitro method for selection and evolution of antibodies from libraries; Journal of Immunological Methods 231, 119-135 (1999).

Sanchez-Campillo, M., Bini, L., Comanducci, M., Raggiaschi, R., Marzocchi, B., Pallini, V. a Ratti, G. (1999}. Electrophoresis 20:2269-2279.

Schmittel A, Keilholz U, Thiel E, Scheibenbogen C. (2000) Quantification of tumor-specific T lymphocytes with the ELISPOT assay. J Immunother 23(3):289-95.

Sester M, Sester U, Kohler H, Schneider T, Demi L, Wagner R, Mueller-Lantzsch N, Pees HW, Meyerháns A. (2000) Rapid whole blood analysis of virus-specific CD4 and CDS T cell responses in persistent HIV infection. AIDS 14(17):2653-60.

124

Shafer, W.M. a Iandolo, J.J. (1979). Genetics of staphylococcal enterotoxin B in methicillin-resistant isolates of Staphylococcus aureus. Infect. Iiranun. 25:902-911.

Shibuya, A., Sakamoto, N., Shimizu, Y., Shibuya, K., Osawa M., Hiroyama, T. , Eyre, H.J., Sutherland, G.R., Endo, Y., Fujita, T., Miyabayashi, T., Sakano, S, Tsuji, T., Nakayama, E., Phillips, J.H., Lanier, L.L. a Nakauchi, H. (2000). Fc_a/_g receptor mediates endocytosis of IgM-coated microbes. Nátuře Immunology 1:441-446.

Skerra, A. (1994). Use of the tetracycline promotér for the tightly regulated production of a murine antibody fragment in Escherichia coli. Gene 151:131-135.

Sohail, M. (1998). A simple and rapid method for preparing genomic DNA from Gram-positive bacteria. Mol. Biotech. 10:191-193.

Senderstrup G, Cope AP, Patel S, Congia M, Hain N, Halí FC, Parry SL, Fugger LH, Michie S, McDevitt HO (1999). HLA class II transgenic mice: models of the human CD4+ T-cell immune response. Im-munol Rev 172:335-43.

Sturniolo, T. et al., E Bono, J Ding, L Raddrizzani, 0. Tuereci, U Sahin, M Braxenthaler, F Gallazzi, MP Protti, F Sinigaglia, a J Hammer (1999). Generation of tissue-specific and promiscuous HLA ligand databases uslng DNA chips and Virtual HLA class II matrices. Nátuře Biotechnology 17: 555-562.

Valli et al. J. Clin. Invest. (1993) 91: 616-62.

VandenBergh M. F. Q., Yzerman E. P. F., van Belkum, A., Boelens, H.

A. M., Sijmpns, M., a Verbrugh, H. A. (1999). Follow-up of Staphylococcus aureus nasal carriage after 8 years: redining the persistent carrier statě. J. Clin. Microbiol. 37:3133-3140.

Wessel, D. a Fluegge, U.I. (1984). Anal. Biochem. 138:141-143.

Claims (33)

1. Patentové nároky

   1. Způsob identifikace, izolace a reaktivních s hyperimunním sérem z alergenu nebo tkáně nebo hostitele náchylného k autoimunitě, kde řečené antigeny jsou upraveny pro použití ve vakcíně pro daný typ zvířete nebo pro člověka, kterýžto způsob je charakterizovaný následujícími kroky:

   • poskytnutí přípravku s protilátkou ze sbírané plazmy řečeného daného typu zvířete nebo ze sbírané plazmy produkce antigenů patogenů, nádoru, nebo jednotlivých sér s řečenému specifickému patogenů, nádoru, alergenu nebo tkáni nebo hostiteli náchylnému k autoimunitě, poskytnutí alespoň jedné expresní knihovny řečeného specifického patogenů, nádoru, alergenu nebo tkáně nebo hostitele náchylného k autoimunitě, vyhledávání řečené alespoň jedné expresní knihovny s řečeným přípravkem s protilátkou, identifikace antigenů, které se váží v řečeném způsobu k protilátkám v člověka protilátkami proti vyhledávání protilátkou, vyhledávání řečeném přípravku identifikovaných přípravky s protilátkami z jednotlivých sér od jedinců s protilátkami proti řečenému specifickému patogenů, nádoru, alergenu nebo tkáni nebo hostiteli náchylnému k autoimunitě, identifikace části antigenů reaktivního s hyperimunním sérem řečených identifikovaných antigenů, kteréžto antigeny reaktivní s hyperimunním sérem se váží k relevantníní části řečených jednotlivých přípravků protilátky z řečených jednotlivých sér, a volitelně izolace řečených antigenů reaktivních s hyperimunním sérem a produkce řečených antigenů reaktivních s hyperimunním sérem chemickými nebo rekombinantními způsoby.

   antigenů jednotlivými

   126 • · · · · • · · · ·
2. 2. Způsob identifikace, izolace a produkce prakticky celého souboru antigenů specifického patogenu reagujících s hyperimunním sérem, kde řečené antigeny jsou upraveny pro použití ve vakcíně pro daný typ zvířete nebo pro člověka, kterýžto způsob je charakterizovaný následujícími kroky:

   • poskytnutí přípravku s protilátkou ze sbírané plazmy řečeného daného typu zvířete nebo ze sbírané plazmy člověka nebo jednotlivých sér s protilátkami proti řečenému specifickému patogenu, • poskytnutí řečených alespoň třech expresních knihoven řečeného specifického patogenu, • vyhledávání řečených alespoň třech různých expresních knihoven řečeným přípravkem s protilátkou, • identifikace antigenů, které se váží v alespoň jednom z řečených třech vyhledávání k protilátkám v řečeném přípravku s protilátkou, • vyhledávání identifikovaných antigenů jednotlivými přípravky s protilátkami z jednotlivých sér od jedinců s protilátkami proti řečenému specifickému patogenu, • identifikace části antigenů reaktivního s hyperimunním sérem řečených identifikovaných antigenů, kteréžto antigeny reaktivní s hyperimunním sérem se váží k relevantní části řečených jednotlivých přípravků protilátky z řečených jednotlivých sér, • opakování řečených vyhledávacích a identifikačních kroků alespoň jedenkrát, • srovnání identifikovaných antigenů reaktivních s hyperimunním sérem identifikovaných v opakovaných vyhledávacích a identifikačních krocích s antigeny reaktivními s hyperimunním sérem identifikovanými v iniciálních vyhledávacích a identifikačních krocích, • další opakování řečených vyhledávacích a identifikačních kroků, pokud alespoň 5% antigenů reaktivních s hyperimunním sérem bylo identifikováno v opakovaných vyhledávacích a identifikačních krocích pouze, až do té

   127 doby, než je identifikováno v dalším opakovaném kroku méně než 5 % antigenů reaktivních s hyperimunním sérem pouze k získání úplného souboru antigenů reaktivních s hyperimunním sérem specifického patogenu, a • volitelně izolace řečených antigenů reaktivních s hyperimunním sérem a produkce řečených antigenů reaktivních s hyperimunním sérem chemickými nebo rekombinantními způsoby.
3. 3. Způsob podle patentového nároku 1 nebo 2 charakterizovaný tím, že je vybrána alespoň jedna z řečených expresních knihoven z ribozomální zobrazovací knihovny, bakteriální povrchové knihovny a proteomu.
4. 4. Způsob podle patentového nároku 2 charakterizovaný tím, že alespoň tři různé expresní knihovny jsou alespoň ribozomální zobrazovací knihovna, bakteriální povrchová knihovna a proteom.
5. 5. Způsob podle jakéhokoli z patentových nároků 1 až 4 charakterizovaný tím, že řečená sbíraná plazma je lidská sbíraná plazma odebraná od jedinců prodělavších nebo prodělávajících infekci řečeným patogenem.
6. 6. Způsob podle jakéhokoli z patentových nároků 1 až 5 charakterizovaný tím, že řečené expresní knihovny jsou genomické expresní knihovny řečeného patogenu.
7. 7. Způsob podle jakéhokoli z patentových nároků 1 až 6 charakterizovaný tím, že řečené expresní knihovny jsou úplné genomické expresní knihovny, přednostně s nadbytkem alespoň 2x, přednostněji alespoň 5x, obzvláště alespoň lOx.
8. 8. Způsob podle jakéhokoli z patentových nároků 1 až 7 charakterizovaný tím, že tento způsob zahrnuje kroky vyhledávání alespoň ribosomální zobrazovací knihovny, bakteriální povrchové zobrazovací knihovny a pro• · *

   128 teomu řečeným přípravkem protilátky a identifikaci antigenů, které se váží v alespoň dvou řečených vyhledávání, přednostně, které se váží ke všem protilátkám v řečeném přípravku protilátky,
9. 9. Způsob podle jakéhokoli z patentových nároků 1 až 8 charakterizovaný tím, že řečený patogen je vybrán ze skupiny bakteriálních, virových, fungálních a protozoálních patogenů.
10. 10. Způsob podle jakéhokoli z patentových nároků 1 až 9 charakterizovaný tím, že řečený patogen je vybrán ze skupiny obsahující virus lidské imunodeficience, virus hepatitidy A, virus hepatitidy B, virus hepatitidy C, virus Rousova sarkomu, virus Epstein-Barrové, virus chřipky, rotavirus, Staphylococcus aureus, Staphylococcús epidermidis, Chlamydia pneumoniae, Chlamydia trachomatis, Mycobacterium tuberculosis, Mycobacterium leprae, Streptococcus pneumoniae, Streptococcus pyogenes, Streptococcus agalactiae, Enterococcus faecalis, Bácillus anthracis, Vibrio cholerae, Borrelia burgdorferi, Plasmodium sp., Aspergillus sp. nebo Candida albicans.
11. 11. Způsob podle jakéhokoli z patentových nároků 1 až 10 charakterizovaný tím, že alespoň jedna z řečených expresních knihoven je ribosomální zobrazovací knihovna nebo bakteriální povrchová zobrazovací knihovna a řečené antigeny reaktivní s hyperimunním sérem jsou produkovány expresí kódujících sekvencí řečených antigenů reaktivních s hyperimunním sérem obsažených v řečené knihovně.
12. 12. Způsob podle jakéhokoli z patentových nároků 1 až 11 charakterizovaný tím, že řečené produkované antigeny reaktivní s hyperimunním sérem jsou zkompletovány do farmaceutického přípravku, volitelně přidáním farmaceuticky přijatelného nosiče a/nebo excipientní látky.
13. 13. Způsob podle patentového nároku 12 charakterizovaný tím, že řečený farmaceutický přípravek je vakcína.

    129
14. 14. Způsob podle patentového nároku 12 nebo 13 charakterizovaný tím, že řečený farmaceuticky přijatelný nosič a/nebo excipientní látka je imunostimulační sloučenina.
15. 15. Způsob podle patentového nároku 14 charakterizovaný tím, že řečená immunostimulační sloučenina je vybrána ze skupiny polykationických látek, obzvláště polykationických peptidů, imunostimulačních deoxynukleotidů, adjuvans, Freundova neúplného sloučenin, obzvláště lidského růstového hormonu, nebo jejich kombinací.

    alumn, Freundova úplného adjuvans, neuroaktivních
16. 16. Způsob podle jakéhokoli z patentových nároků 1 až 15 charakterizovaný tím, že řečené jednotlivé přípravky protilátek jsou získány od pacientů s akutní infekcí řečeným patógenem, obzvláště od pacientů s titrem protilátek k řečenému patogenu, který je vyšší než u 80%, přednostně vyšší než 90%, obzvláště vyšší než u 95% testovaných sér lidského pacienta nebo nosiče.
17. 17. Způsob podle jakéhokoli z patentových nároků 1 až 16 charakterizovaný tím, že alespoň 10, přednostně alespoň 30, obzvláště alespoň 50 jednotlivých přípravků protilátek je použito k identifikaci řečených antigenů reaktivních s hyperimunním sérem.
18. 18. Způsob podle jakéhokoli z řečených patentových nároků 1 až 17 charakterizovaný tím, že řečená relevantní část řečených jednotlivých přípravků protilátek z řečených jednotlivých sér je alespoň 10, přednostně alespoň 30, obzvláště alespoň 50 jednotlivých přípravků protilátek, a/nebo alespoň 20%, přednostně alespoň 30%, obzvláště alespoň jednotlivých přípravků protilátek vyhledávání.

    všech řečeném použitých v
19. 19. Způsob podle jakéhokoli z charakterizovaný tím, že řečená patentových nároků 1 až 18 jednotlivá séra jsou vybrána

    130 podle IgA titru proti lysátu, složkám buněčné stěny nebo rekombinantním proteinům řéčeného patogenu, kterýžto titr je vyšší než 4000 U, obzvláště vyšší než 6000 U, a/nebo podle IgG titru, který je vyšší než 10000 U, přednostně vyšší než 12000 U.

    19. Způsob podle jakéhokoli z patentových nároků 1 až 19 charakterizovaný tím, že řečený patogen je Staphylokokový patogen, obzvláště Staphylococcus Staphylococcus epidermidis.

    aureus, a/nebo
20. 21. Antigen reaktivní s hyperimunním sérem vybraný ze skupiny obsahující sekvence uvedené v jakékoli z Tabulek 2a, 2b,

    2c, 2d, 3, 4 a 5, obzvláště vybraný ze skupiny obsahující

    Sekv . ID č. 56, 57, 59, 60, 67 , 70, 72, 73, 74, 75, 76, 77 78, 79, 80, 81, 82, 85, 87, 88 , 89, 90, 92, 95, 96, 97, 99 100, 101, 102, 103, 104, 106, 108, 110, 112, 114, 116, 118 120, 122, 126, 128, 130, 132, 134, 138, 140, 142, 151, 152

    154, 155 a jejich hyperimunní fragmenty.
21. 22. Antigen reaktivní s hyperimunním sérem, který je možno získat způsobem podle jakéhokoli z patentových nároků 1 až 20, a který je vybrán ze skupiny obsahující sekvence uvedené v jakékoli z Tabulek 2a, 2b, 2c, 2d, 3, 4 a 5, obzvláště vybraný ze skupiny obsahující Sekv. ID č. 56, 57, 59, 60, 67,.70, 72,

    73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 85, 87, 88 , 89, 90, 92, 95, 96, 97, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 106, 108, 110, 112, 114, 116, 118, 120, 122, 126, 128, 130, 132, 134, 138,

    140, 142, 151, 152, 154, 155 a jejich hyperimunní fragmenty.
22. 23. Použití antigenu reaktivního s hyperimunním sérem vybraného ze skupiny obsahující sekvence uvedené v jakékoli z Tabulek 2a, 2b, 2c, 2d, 3, 4 a 5, obzvláště vybraného ze skupiny obsahující Sekv. ID č. 55, 56, 57, 58, 59, 60, 62, 66, 67, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 87, 88, 89, 90, 92, 94/95, 96, 97, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 106, 108, 110, 112, 114, 116, 118, 120, 122, 126, 128, • · • · · · · ·» · ·· · · · * » · * • · · · · « 9 Λ * »···· • · · · « · · ····· · · ·«· ·· ·

    130, 132, 134, 138, 140, 142, 151, 152, 154, 155, 158 a jejich hyperimunní fragmenty pro výrobu farmaceutického přípravku, obzvláště pro výrobu vakcíny proti stafylokokové infekci nebo kolonizaci obzvláště proti Staphylococcus aureus nebo Staphylococcus epidermidis.
23. 24. Hyperimunní fragment antigenů reaktivního s hyperimunním sérem vybraný ze skupiny obsahující peptidy obsahující aminokyselinové sekvence ve sloupcích predikované imunogenni aminokyseliny, Umístění identifikované imunogenni oblasti a Sérová reaktivita s relevantní oblastí z Tabulek 2a, 2b, 2c a 2d a aminokyselinové sekvence ve sloupcích Domnělé antigenní povrchové oblasti z Tabulek 4 a 5, obzvláště peptidy obsahující aminokyseliny č. aminokyseliny 12-29, 3440, 63-71, 101-110, 114-122, 130-138, 140-195, 197-209, 215229, 239-253, 255-274 a 39-94 ze Sekv. ID č, 55, aminokyseliny 5-39, 111-117, 125-132, 134-141, 167-191, 196202, 214-232, 236-241, 244-249, 292-297, 319-328, 336-341, 365-380, 385-391, 407-416, 420-429, 435-441, 452-461, 477-488, 491-498, 518-532, 545-556, 569-576, 581-587, 595-602, 604-609, 617-640, 643-651, 702-715, 723-731, 786-793, 805-811, 826-839, 874-889, 37-49-, 63-77 a 274-334, ze Sekv. ID č.56, aminokyseliny 28-55, 82-100, 105-111, 125-131, 137-143, 1-49, ze Sekv. ID č. 57, aminokyseliny 33-43, 45-51, 57-63, 65-72, 80-96, 99-110, 123129, 161-171, 173-179, 185-191, 193-200, 208-224, 227-246, 252-258, 294-308, C 321-329, 344-352, 691-707, 358-411 a 588606, ze Sekv. ID č. 58, aminokyseliny 16-38, 71-77, 87-94, 105-112, 124-144, 158-164, 169-177, 180-186, 194-204, 221-228, 236-245, 250-267, 336-343, 363-378, 385-394, 406-412, 423-440, 443-449, 401-494, ze Sekv. ID Č. 59, aminokyseliny 18-23, 42-55, 69-77, 85-98, 129-136, 182-188,

    214-220, 229-235, 242-248, 251-258, 281-292, 309-316, 333-343,

    348-354, 361367, 393-407,

    517-527, 530-535,

    540-549,

    441-447, 481-488, 493-505, 510-515, 564-583, 593-599, 608-621, 636-645, • · ··

    132

    656-670, 674-687, 697-708, 726-734, 755-760, 765-772, 785-792, 798-815, 819-824, 826-838, 846-852, 889-904, 907-913, 932-939, 956-964, 982-1000, 1008-1015, 1017-1024, 1028-1034, 1059-1065, 1078-1084, 1122-1129, 1134-1143, 1180-1186, 1188-1194, 12051215, 1224-1230, 1276-1283, 1333-1339, 1377-1382, 1415-1421, 1448-1459, 1467-1472, 1537-1545, 1556-1566, 1647-1654, 16661675, 1683-1689, 1722-1737, 1740-1754, 1756-1762, 1764-1773,

    1775-1783, 1800-1809, 1811-1819, 1839-1851, 1859-1866, 18761882, 1930-1939, 1947-1954, 1978-1985, 1999-2007, 2015-2029, 2080-2086, 2094-2100, 2112-2118, 2196-2205, 2232-2243, 198258, 646-727 a 2104-2206, ze Sekv. ID č. 60, aminokyseliny 10-29, 46-56, 63-74, 83-105, 107-114, 138-145, 170-184, 186-193, 216-221, 242-248, 277-289, 303-311, 346-360, 379-389, 422-428, 446-453, 459-469, 479-489, 496-501, 83-156, ze Sekv. ID č. 62,

    aminokyseliny 14-22, 32-40, 52-58, 138, 151 -190, 193-214, 224-244, 326-332, 348-355, 357-362, 384-394, 503-510, 516-522, 528-539, 541-547, 602-624, 626-632, 651-667, 673-689, 403-462, ze Sekv, ID č. 66,

    253-277,

    397-434

    552-558

    694-706

    92-98,

    196-224 , 84-92,

    208-215 373-379 791-816 aminokyseliny 49-56, 62-68, 83-89, 142-159, 161-167, 169-175, 177-188, 34-46, ze Sekv, ID č. 67,

    61-77, 81-93, 111-117, 124287-295,

    437-460,

    563-573,

    712-739,

    10.9-115,

    230-243,

    102-109,

    225-233,

    384-390,

    905-910,

    307-324,

    489-496,

    589-595,

    756-790,

    124-131,

    246-252,

    119-136,

    245-250,

    429-435,

    919-933, aminokyseliny 11-20, 26-47, 69-75

    139-147, 160-170, 178-185, 190-196, 265-272, 277-284, 300-306, 346-357, 471-481, 502-507, 536-561, .663-688,

    977-985, 1001-1010, 1052-1057, 1070-1077, 1082-1087, 10941112, 493-587, 633-715 a 704-760, ze Sekv. ID Č.7Q, aminokyseliny 6-20, 53-63, 83-90, 135-146, 195-208, 244-259,

    263-314, 319-327, 337-349, 353-362, 365-374, 380-390, 397-405, 407-415, 208-287 a 286-314, ze Sekv. ID č. 71, aminokyseliny 10-26, 31-43, 46-58, 61-66, 69-79, 85-92, 100115, 120-126, 128-135, 149-155, 167-173, 178-187, 189-196,

    202-222, 225-231, 233-240, 245-251, 257-263, 271-292, 314-322, • »

    133 • ·« ·· · • * • · · * • ·· · · • v · • w · · · • · · · • · · · · • · · * • « · · · • · « • « w • · «»«.«·· • * · • · · 325-334, 339-345, 59-74, ze Sekv. ID Č. 72, aminokyseliny 4-9, 15-26, 65-76, 108-115, 119-128, 144-153, 38-52 a 66-114, ze Sekv. ID Č, 73, aminokyseliny 5-22, 42-50, 74-81, 139-145, 167-178, 220-230, 246-253, 255-264, 137-237 a 250-267, ze Sekv. ID č, 74 r aminokyseliny 10-26, 31-44 , 60-66, 99-104, 146-153, 163-169, 197-205, 216-223, 226-238, 241-258, 271-280, 295-315, 346-351, 371-385, 396-407, 440-446, 452-457, 460-466, 492-510, 537-543, 546-551, 565-582, 590-595, 635-650, 672-678, 686-701, 705-712, 714-721, 725-731, 762-768, 800-805, 672-727 , ze Sekv. ID č. 75, aminokyseliny 5-32, 35-48, 55-76, ze Sekv. ID č. 76, aminokyseliny 7-35, 54-59, 247-261, 263-272, 302-320, 330-339, 368-374, 382- 411, 126-143 a 168-186 , ze Sekv . ID č. 77, aminokyseliny 5-24, 88-94, 102-113, 132-143, 163-173, 216-224, 254-269, 273-278, 305-313, 321-327, 334-341, 31-61 a 58-74, ze

    Sekv. ID č. 78, aminokyseliny 16-24, 32-39, 43-49, 64-71, 93-99, 126-141, 144156, 210-218, 226-233, 265-273, 276-284, 158-220, ze Sekv. ID č. 79, aminokyseliny 49-72, 76-83, 95-105, 135-146, 148-164, 183-205, 57-128, ze Sekv, ID Č. 80, aminokyseliny 6-15, 22-32, 58-73, 82-88, 97-109, 120-131, 134140, 151-163, 179-185, 219-230, 242-255, 271-277, 288-293,

    305-319, 345-356, 368-381, 397-406, 408-420, 427-437, 448-454,

    473-482, 498-505, 529-535, 550-563, 573-580, 582-590, 600-605,

    618-627, 677-685, 718-725, 729-735, 744-759, 773-784, 789-794,

    820-837, 902-908, 916-921, 929-935, 949-955, 1001-1008, 10261032, 1074-1083, 1088-1094, 1108-1117, 1137-1142, 1159-1177,

    1183-1194, 1214-1220, 1236-1252, 1261-1269, 1289-1294, 13111329, 1336-1341, 1406-1413, 1419-1432, 1437-1457, 1464-1503,

    1519-1525, 1531-1537, 1539-1557, 1560-1567, 1611-1618, 16201629, 1697-1704, .1712-1719, 1726-1736, 1781-1786, 1797-1817,

    1848-1854, 1879-1890, 1919-1925, 1946-1953, 1974-1979, 5 až

    134, ze Sekv. ID č. 81, aminokyseliny 6-33, 40-46, 51-59, 61-77, 84-104, 112-118, 124• · · · ·

    134

    187, 194-248, 252-296, 308-325, 327-361, 367-393, 396-437,

    452-479, 484-520, 535-545, 558-574, 582-614, 627-633, 656-663, 671-678, 698-704, 713-722, 725-742, 816-822, 827-837, 483-511, ze Sekv. 744-755, ID č. 82, 770-784, 786-800, aminokyseliny 4-19, 57-70, 79-88, 126-132, 144-159, 161-167, 180-198, 200-212, 233-240, 248-255, 276-286, 298-304, 309-323, 332-346, 357-366, 374-391, 394-406, 450-456, 466-473, 479-487, 498-505, 507-519, 521-530, 532-540, 555-565, 571-581, 600-611, 619-625, 634-642, 650-656, 658-665, 676-682, 690-699, 724-733, 740-771, 774-784, 791-797, 808-815; 821-828, 832-838, 876-881, 893-906, 922-929, 938-943, 948-953; , 969-976, 1002-1008, 1015- 1035, 1056-1069, 1105-1116, 1124-1135, 1144 -1151, 1173-1181, 1186-1191, 1206-1215, 1225-1230, 590-604, ze Sekv. ID č. 83, 1235-1242, 6-66, 65-124 a aminokyseliny 5-32, 66-72, 87-98, 104-112, 116-124, 128-137, 162-168, 174-183, 248-254, 261-266, 289-303, 312-331, 174-249,

    ze Sekv. ID č. 84, aminokyseliny 4-21, 28-40, 45-52, 59-71, 92-107, 123-137, 159174, 190-202, 220-229, 232-241, 282-296, 302-308, 312-331, 21118, ze Sekv, ID č, 85, aminokyseliny 9-28, 43-48, 56-75, 109-126, 128-141, 143-162, 164-195, 197-216, 234-242, 244-251, 168-181, ze Sekv. ID č, 87, aminokyseliny 4-10, 20-42, 50-86, 88-98, 102-171, 176-182, 189-221, 223-244, 246-268, 276-284, 296-329, 112-188, ze Sekv, ID Č. 88, aminokyseliny 4-9, 13-24, 26-34, 37-43, 45-51, 59-73, 90-96, 99-113, 160-173, 178-184, 218-228, 233-238, 255-262, 45-105, 103-166 a 66-153, ze Sekv, ID č. 89, aminokyseliny 13-27, 42-63, 107-191, 198-215, 218-225, 233250, 474-367, ze Sekv. ID č. 90;

    aminokyseliny 26-53, 95-123, 164-176, 189-199, 8^Λ-48, ze Sekv. ID č. 92, aminokyseliny 7-13, 15-23, 26-33, 68-81, 84-90, 106-117, 129137, 140-159, 165-172, 177-230, 234-240, 258-278, 295-319, 2256, 23-99, 97-115, 233-250 a 245-265, ze Sekv, ID č. 94,

    135 aminokyseliny 13-36, 40-49, 111-118, 134-140, 159-164, 173183, 208-220, 232-241, 245-254, 262-271, 280-286, 295-301,

    303-310, 319-324, 332-339, 1-85, 54-121 a 103-185, ze Sekv. ID č. 95, aminokyseliny 39-44, 46-80, 92-98, 105-113, 118-123, 133-165,

    176-208, 226-238, 240-255, 279-285, 298-330, 338-345, 350-357,

    365-372, 397-402, 409-415, 465-473, 488-515, 517-535, 542-550,

    554-590, 593-601, 603-620, 627-653, 660-665, 674-687, 698-718,

    726-739, 386-402, ze Sekv. ID č. 96, aminokyseliny 5-32, 34-49, 1-43, ze Sekv. ID č. 97, aminokyseliny 10-27, 37-56, 64-99, 106-119, 121-136, 139-145,

    148-178, 190-216, 225-249, 251-276, 292-297, 312-321, 332-399, 403-458, 183-200, ze Sekv, ID č. 99, aminokyseliny 5-12, 15-20, 43-49, 94-106, 110-116, 119-128,

    153-163, 175-180, 185-191, 198-209, 244-252, 254-264, 266-273, 280-288, 290-297, 63-126, ze Sekv. ID č. 100, aminokyseliny 5-44, 47-55, 62-68, 70-78, 93-100, 128-151, 166171, 176-308, 1-59, ze Sekv. ID č. 101, aminokyseliny 18-28, 36-49, 56-62, 67-84, 86-95, 102-153,

    180r-195, 198-218, 254-280, 284-296, 301-325, 327-348, 353390, 397-402, 407-414, 431-455, 328-394, ze Sekv. ID č. 102, aminokyseliny 7-37, 56-71, 74-150, 155-162, 183-203, 211-222, 224-234, 242-272, 77-128, ze Sekv. ID č, 103, aminokyseliny 34-58, 63-69, 74-86, 92-101, 130-138, 142-150,

    158-191, 199-207, 210-221, 234-249, 252-271, 5-48, ze Sekv. ID Č, 104, aminokyseliny 12-36, 43-50, 58-65, 73-78, 80-87, 108-139, 147153, 159-172, 190-203, 211-216, 224-232, 234-246, 256-261,

    273-279, 286-293, 299-306, 340-346, 354-366, 167-181, ze Sekv. ID č. 106, aminokyseliny 61-75, 82-87, 97-104, 113-123, 128-133, 203-216, 224-229, 236-246, 251-258, 271-286, 288-294, 301-310, 316-329, 337-346, 348-371, 394-406, 418-435, 440-452 ze Sekv. ID č.

    112, aminokyseliny 30-37, 44-55, 83-91,.101-118, 121-128, 136-149, 175-183, 185-193, 206-212, 222-229, 235-242 ze Sekv. ID č.

    • ·

    136 • · · · · · ·

    114, aminokyseliny 28-38, 76-91, 102-109, 118-141, 146-153, 155161, 165-179, 186-202, 215-221, 234-249, 262-269, 276-282,

    289-302, 306-314, 321-326, 338-345, 360-369, 385-391 ze Sekv. ID č. 116, aminokyseliny 9-33, 56-62,75-84, 99-105, 122-127, 163-180,

    186-192, 206-228, 233-240, 254-262, 275-283, 289-296, 322-330, 348-355, 416-424, 426-438, 441-452, 484-491, 522-528, 541-549, 563-569, 578-584, 624-641, 527-544, ze Sekv. ID č. 142, aminokyseliny 37-42, 57-62, 121-135, 139-145, 183-190, 204212, 220-227, 242-248, 278-288, 295-303, 304-309, 335-341,

    396-404, 412-433, 443-449, 497-503, 505-513, 539-545, 552-558,

    601-617, 629-649, 702-711, 736-745, 793-804, 814-829, 843-858,

    864-885, 889-895, 905-913, 919-929, 937-943, 957-965, 970-986,

    990-1030, 1038-1049, 1063-1072, 1080-1091, 1093-1116, 11261136, 1145-1157, 1163-1171, 1177-1183, 1189-1196, 1211-1218,

    1225-1235, 1242-1256, 1261-1269, 624-684, ze Sekv, ID č. 151, aminokyseliny 8-23, 31-38, 42-49, 61-77, 83-90, 99-108, 110119, 140-147, 149-155, 159-171, 180-185, 189-209, 228-234,

    245-262, 264-275, 280-302, 304-330, 343-360, 391-409, 432-437,

    454-463, 467-474, 478-485, 515-528, 532-539, 553-567, 569-581,

    586-592, 605-612, 627-635, 639-656, 671-682, 700-714, 731-747,

    754-770, 775-791, 797-834, 838-848, 872-891, 927-933, 935-942,

    948-968, 976-986, 1000-1007, 1029-1037, 630-700, ze Sekv. ID

    č. 152, aminokyseliny 17-25, 27-55, 84-90, 95-101, 115-121, 55-101, ze Sekv. ID č. 154, aminokyseliny 13-28, 40-46, 69-75, 86-92, 114-120, 126-137,

    155- 172, 182-193, 199-206, 213-221, 232-238, 243-253, 270-276, 284-290, 22-100, ze Sekv. ID č. 155, a aminokyseliny 7-19, 46-57, 85-91, 110-117, 125-133, 140-149,

    156- 163, 198-204, 236-251, 269-275, 283-290, 318-323, 347-363, 9-42 a 158-174, ze Sekv. ID č, 158, aminokyseliny 7-14, 21-30, 34-50, 52-63, 65-72, 77-84, 109124, 129-152, 158-163, 175-190, 193-216, 219-234 ze Sekv. ID č. 168,

    137 • · aminokyseliny 5-24, 38-44, 100-106, 118-130, 144-154, 204-210, 218-223, 228-243, 257-264, 266-286, 292-299 ze Sekv. ID, č. 174, aminokyseliny 29-44, 74-83, 105-113, 119-125, 130-148, 155175, 182-190, 198-211, 238-245 ze Sekv. ID č. 176, a fragmenty, jak je uvedeno v Tabulkách 2 a 4 a fragmenty obsahující alespoň 6, přednostně více než 8, obzvláště více než 10 aminokyselin řečených sekvencí.
24. 25. Pomocné epitopy antigenů nebo fragmentu, jak je definováno v jakémkoli z patentových nároků 21 až 24, obzvláště peptidů obsahujících fragmenty vybrané z peptidů uvedených ve sloupci Domnělé antigenní povrchové oblasti v Tabulkách 4 a 5, a ze skupiny aminokyselin 6-40, 583-598, 620-646 a 871-896 ze Sekv. ID. č. 56, aminokyselin 24-53 ze Sekv. ID č. 70, aminokyselin 240-260 ze Sekv. ID č. 74, aminokyselin 1660-1682 a 1746-1790 ze Sekv. ID č. 81, aminokyselin 1-29, 680-709, a 878-902 ze Sekv. ID č. 83, aminokyselin 96-136 ze Sekv. ID č. 89, aminokyselin 1-29, 226-269 a 275-326 ze Sekv. ID č. 94, aminokyselin 23-47 a 107-156 ze Sekv. ID č. 114 a aminokyselin

    24-53 ze Sekv. ID č. epitopy T lymfocytů.

    142 a jejich fragmenty, které jsou
25. 26. Vakcína obsahující antigen reaktivní s hyperimunním sérem nebo jeho fragment, jak je definováno v jakémkoli z patentových nároků 21 až 25.
26. 27. Vakcína podle patentového nároku 26 charakterizovaná tím, že dále obsahuje imunostimulační látku, přednostně vybranou ze skupiny obsahující polykationické polymery, obzvláště polykationické peptidy, imunostimulační deoxynukleotidy (ODN), neuroaktivní sloučeniny, obzvláště lidský růstový hormon, alumn, Freundovo úplné nebo neúplné adjuvans nebo jejich kombinace.
27. 28. Přípravek obsahující protilátky proti alespoň jednomu antigenů nebo jeho fragmentu, jak je definováno v jakémkoli z • ·

    138 patentových nároků 21 až 25.
28. 29. Přípravek podle patentového nároku 28 charakterizovaný tím, že řečené protilátky jsou monoklonální protilátky.
29. 30. Způsob produkce přípravku podle patentového nároku 29, charakterizovaný následujícími kroky:

    • iniciací imunitní odpovědi u živočicha, kterým není člověk, podáním antigenu nebo jeho fragmentu, jak je definováno v jakémkoli z patentových nároků 21 až 25 řečenému živočichovi, • vyjmutím sleziny nebo buněk sleziny z řečeného živočicha, • produkci hybridomových buněk z řečené sleziny nebo slezinných buněk, • výběrem klonovaných hybridomových buněk specifických pro řečený antigen, a • produkcí přípravku protilátky kultivací řečených klonovaných hybridomových buněk a volitelně použití dalších purífikačních kroků.
30. 31. Způsob podle patentového nároku 29 charakterizovaný tím, že řečené vyjmutí sleziny nebo slezinných buněk je přednostně spojeno s usmrcením živočicha.
31. 32. Způsob produkce přípravku podle patentového nároku 28 charakterizovaný následujícími kroky * iniciací imunitní odpovědi u živočicha, kterým není člověk, podáním stafylokokového antigenu nebo jeho fragmentu, jak je definováno v jakémkoli z patentových nároků 21 až 25, řečenému živočichovi, ♦ vyjmutím tělní tekutiny obsahující protilátku z řečeného zvířete, a » produkcí přípravku protilátky použitím dalších purifIkačních kroků pro purifikací řečené tělní tekutiny obsahující protilátku.

    139
32. 33. Použití přípravku podle patentového nároku 30 pro výrobu léku pro léčbu nebo prevenci staphylokokové infekce nebo kolonizace obzvláště proti Staphylococcus aureus nebo Staphylococcus epidermidis.
33. 34. Vyhledávací způsob posuzující následky funkční inhibice alespoň jednoho antigenu nebo jeho fragmentu, jak je definováno v jakémkoli z patentového nároků 21 až 25.