CZ20032418A3

CZ20032418A3 - Farmaceutický prostředek

Info

Publication number: CZ20032418A3
Application number: CZ20032418A
Authority: CZ
Inventors: Radmila Metlas
Original assignee: Diapharm Limited
Priority date: 2001-03-09
Filing date: 2002-03-06
Publication date: 2004-02-18
Also published as: JP2004532198A; CA2440131A1; BR0207931A; CN1494554A; US20040106771A1; HUP0303423A2; NO20033934D0; JP4601252B2; AP2003002852A0; IL157753A0; KR100871455B1; WO2002072637A1; DE60216422D1; CY1108852T1; RS51011B; NO20033934L; EP1366080A1; HUP0303423A3; PL366785A1; RU2003125554A

Description

Oblast techniky

Vynález se týká přírodních protilátek, neutralizujících virus lidské imunodeficience HIV. Tyto protilátky se nacházejí v séru normálních osob a je možno je použít k prevenci infekce HIV nebo k oddálení choroby u / seropozitivních nemocných. Vynález se rovněž týká farmaceutického prostředku s obsahem těchto protilátek a jeho použití pro pasivní imunotherapii infekce HIV.

Dosavadní stav techniky

Indukce účinné odpovědi imunitního systému na HIV-1 je často omezována neschopností jakékoliv potenciální vakcíny vyvolat tvorbu protilátek, schopných neutralizovat infekčnost primárních isolátů HIV z infikovaných jedinců (1, 2) . Na druhé straně je z analýzy sér infikovaných jedinců zřejmé, že neutralizace primárního viru je obvykle slabá a sporadická (3, 4) . Je obtížné vytvořit protilátky v průběhu infekce nebo při použití pokusných fakcín, přesto však existují monoklonální protilátky, například IgGlbl2, 2F5 a 2G12 (5-7), které jsou schopné neutralizovat primární ' viry podtypů A až E. Tyto protilátky jsou odvozeny od jednotlivců, infikovaných podtypem B a nevyvinuly se na základě vakcinace (8).

Nejdříve zjistitelnou specifickou protilátkou proti HIV-1 je protilátka isotypu IgG (12), což ukazuje na neobvyklou primární odpověď (13) . Mimoto se zdá, že antigeny HIV-1 reagují s předem existujícími protilátkami ·· ♦· (14) . Byly již podány zprávy o protilátkách, které zkříženě reagují s obalovým materiálem HIV-1 (15) .

Existuje názor, že silná časná humorální odpověď na infekci HIV-1 nemusí být příznivá (16) vzhledem k tomu, že na jejím základě může dojít ke tvorbě monoklonálních a polyklonálních protilátek místo ke vzniku obvyklé polyklonální odpovědi (13). Je pravděpodobné, že (' antiidiotypická protilátka 1F7 může rozšířit odpověď imunitního systému na antigeny HIV (17) .

V našich dřívějších studiích bylo možno předpovědět homologii obalového proteinu HIV. s variabilním proteinem IgG (18, 19). Avšak podle posledních poznatků je pravděpodobné, že HIV-1 gpl20 imunodominantní epitop a frakce přírodně se vyskytujících IgG protilátek mají společnou komplementární strukturu (2 0, 21) .

Podstata vynálezu

Nyní bylo zjištěno, že skupina protilátek, nacházejících se v séru normálních, nikoliv

HIV-infikovaných jednotlivců je schopná neutralizovat virus HIV.

t

Aktivní frakce protilátek byla čištěna ze séra normálních osob afinitivní chromatografií při použití Sepharosy, na niž byl vázán úplný lidský IgG. Bylo možno prokázat, že tato frakce protilátek proti IgG je schopna neutralizovat infekci HIV-1 u PBMC. Pokus byl opakován při použití odlišných prostředků proti IgG v různých koncentracích, získaných z běžně dodávaných vzorků séra, přičemž jako negativní kontrola byly použity celkové ··· ·· ·«·· • * · • · · • ♦ · ·, · · · ·· ·· protilátky IgG, čištěné afinitní chromatografií a jako pozitivní kontrola byly použity protilátky HIVIG a mAb 4117C. Druhá z uvedených protilátek byla neúčinná proti 92HT593B. Netralizační křivky, znázorněné na obr. 1 se týkají reprezentativního pokusu, který byl proveden s HIV-1 primárními izoláty 92HT593B a SF162WT a také s rekombinantním virem HLHX-ADA. Bylo prokázáno, že protilátky proti IgG jsou účinné proti 92HT593B a NLHX-ADA, přičemž 50% inhibiční koncentrace byla méně než 1 až 7 gg/ml.

V případě neutralizačních účinků, pozorovaných v případě protilátek proti IgG je jen malá možnost, že by tyto účinky mohly být způsobeny současně čištěnými chemokiny z normálního séra vzhledem k tomu, že koncentrace těchto· látek nepřevyšuje 2 0 ng/ml séra a nebylo také možno pozorovat žádné specifické pásy při provádění PAGE. Mimoto byly molekuly s molekulovou hmotností nižší než 50 000 odstraněny dialýzou protilátek. Analýza PAGE v případě protilátek proti IgG potvrdila převážnou přítomnost IgG a velmi malé stopy kontaminujících proteinů.

Možné vysvětlení pozorovaných skutečností spočívá v tom, že antigenní determinanty HIV-1 patrně mají společnou komplementární strukturu s různými oblastmi přirozených protilátek, které náleží k běžnému imunitnímu systému (9, 23), toto vysvětlení však žádným způsobem nemůže omezit vynález.

Vynález se tedy týká prostředků s obsahem lidských protilátek proti celkové frakci lidského IgG, schopných neutralizovat HIV-1. Tento prostředek je možno získat tak, že se sérum normálních, nikoliv HlV-infikovaných jedinců ·· ····

podrobí afinitní chromatografií při použití pryskyřic, na něž byly navázány celkové frakce lidského IgG. Konečná koncentrace izolovaných protilátek proti IgG bude s výhodou 0,1 až 1000 pg/ml, zvláště 0,1 až 100 pg/ml. Výchozí materiál je tvořen směsí sér z normálních osob. Vynález se rovněž týká použití prostředku podle vynálezu k prevenci nebo léčení infekce HIV, s výhodou HIV-1.

Pro použití k léčebným účelům bude prostředek podle vynálezu zpracováván spolu s vhodnými farmaceuticky přijatelnými pomocnými látkami. Může jít o pufry, stabilizační činidla, pomocná rozpouštědla, ředidla, látky pro úpravu osmotického tlaku a podobně. Prostředek bude pravděpodobně podáván parenterálně, s výhodou nitrožilně, intradermálně nebo nitrosvalově. Podle výhodného provedení je možno prostředek užít při pasivní imunotherapii infekcí HIV-1.

Praktické provedení vynálezu bude osvětleno v souvislosti s přiloženými výkresy.

Na obr. 1 je znázorněna neutralizační křivka pro neutralizaci primárních HIV-1 izolátů SF162WT a 92HT593B a pro rekombinantní virus NL-HX-ADA protilátkami proti IgG. Každá titrační křivka uvádí údaje z jediného pokusu. Koncentrace protilátek proti IgG v různých pokusech byly 109,7, 12,3 a 80,0 pg/ml, v případě celkového IgG v rozmezí 1000 a 3333 pg/ml a v případě HIVIG 10 000 mg/ml.

Prostředky s protilátkou proti IgG a celkovým IgG byly získány tak, jak je dále popsáno. Protilátka HIVIG byla připravena ze séra osob, infikovaných HIV-1.

·· ····

Na obr. 2 je znázorněno dělení protilátek, čištěných afinitní chromatografií na SDS-PAGE. Protilátky proti IgG a celkové protilátky IgG byly připraveny dále popsaným způsobem. Elektroforetické dělení protilátek proti IgG prokázalo převážný obsah IgG. Mimoto byly také přítomny pásy pro proteiny s vysokou molekulovou hmotností, i když tyto pásy byly slabé.

Praktické provedení vynálezu bude osvětleno následujícími příklady, které však nemají sloužit k omezení rozsahu vynálezu.

Příklady provedení vynálezu

Příklad 1

Příprava protilátek proti IgG

Protilátky proti IgG byly připraveny ze směsi dvou normálních lidských sér afinitní chromatografií při použití kuliček Sepharózy (CNBr-aktivovaná Sepharose 4B), na tyto kuličky byl předem navázán celkový lidský IgG, čištěný na afinitním sloupci s obsahem GammaBind Sepharosa 4B. Bylo použito 5 až 7 mg protilátek IgG na 0,5 až 0,6 g kuliček Sepharózy. Vazba byla uskutečněna podle návodu výrobce. Sloupec byl uveden do rovnovážného stavu v 5xPBS, pak byl nanesen 1 ml séra, inaktivovaného teplem a zředěného 1:1 přidáním 5xPBS. Inkubace trvala 1 hodinu při teplotě místnosti a pak přes noc při teplotě 4 °C. Po promytí 30 ml 5xPBS byly navázané protilátky vymývány při použití 0,1 M citrátu o pH 2,5 do zkumavek, obsahujících volný TRIS.

Eluát byl koncentrován, dialyzován (Centricon YM, oddělení látek od molekulové hmotnosti 30 000) a analyzován při

použiti 10% SDS-PAGE, převážně bylo možno prokázat pás pro IgG, jak je také zřejmé z obr. 2.

.Příklad 2

Neutralizace HIV-1 izolátů protilátkami proti IgG

Neutralizace viru byla vyhodnocena v PBMC podle protokolu, popsaného v literatuře (22). Pokusy na f neutralizaci byly prováděny se 4 různými preparáty protilátek v pěti oddělených pokusech.

V tabulce 1 jsou shrnuty údaje pro neutralizaci dvou primárních isolátů HIV (92HT593B, SF162WT) a pro rekombinantní virus NL-HX-ADA.

Jako pozitivní kontroly byly použity HIVIG a mAb411.7C. Jako negativní kontrola byl použit protein-G IgG.

V těchto pokusech bylo prokázáno, že všechny protilátky proti IgG byly schopné vyvolat inhibici infekce PBMC ižoláty 92HT593B a NL-HX-ADA, nebylo možno pozorovat žádnou neutralizační účinnost proti SF162WT.

• ···· • 9 • 9 • 9 • 9 «

Tabulka 1.

Neutralizace titru viru v čištěném Ig ze séra HIV-1 infikovaných a) a' normálních b) subj ektů .__:' _

Rekombinantní virus \|	NLHX-ADA \|	% neutr. \|		CO kO 'í 1 1 1	o o cm u? CD kO Lh ΟΊ co ON cn Lf) CN 1	CO CN CN tn co rp cn > on on on co ío in	Q a	o a	O ’Φ ? kD H ^H	Q a	68,7 54,0 45,0
rH ε cn λ		150 50 16,7	o 'Ί ý r- cn ^1-1 S H ^{M H}	_o η η η h o - - X OJ v H S > 4 o'	8,00 2,67 0,89	10,97 3,66 1,22
Primární isolát \|	SF162WT \|	% neutr. \|		σ\ + S CM ™	o o o o o o - ^{H H 1-1} š En	« m h £ S 7 ° 7	NA	a	a
i—1 £ cn 3.		150 50 16,7	o h/ r· (n H C? + cn h CO rH	^K CO Η H O
92HT593B 1	% neutr. 1		8,3 1,1 2,2	7 O (Ί ^t¹ý?l LO O 3	O O kP cn _ω co cn cn cn CD k£) Π Ω	H £ £«	71.8 48.9 14,4	42,0 24,1 5,7	46,4 27,1 3,3	39,8 i
1-i ε σι		150 50 16,7	O l> (N 5 o h i ? rH · _, CO H co i—i	§7^ s 3 H ” H o'	> (N H CO NO (N H O O	CO l-Η CN H t—1 O O	8,00 2,67 0,89	2,17 0,72 0,24	10,97 3,66 1,22
			4J ω <D				j—i	(N	i—!	i—i	T—i
			>M 4-> ω 0				i—l	i—l	CN	CO
			Protilátky	Neg. kontrola: protein G IgG b)	Positivní kontrola: mAb4117C a)	Positivní kontrola: HIVIG a)	Anti-IgG b)	Anti-IgG b)	3 o cn H 1 Ή 4-) á	Anti-IgG b)	Anti-IgG b)

·· ····

Literatura

1. Mascola, JR, Snyder, SW, Weislow, OS. Belay, SM, Belshe, RB, Schwartz, DH, Clements, ML, Dolin, R, Graham, BS, Gorse, GJ, Keefer, MC, McElrath, MJ, Walker, MC, Warner, KF, McNeil. JG, McCutchan, FE, and Burke, DS: Immunization with envelope subunit vaccine products elicits neutralizing antibodies against laboratory-adapted but not primary isolates of human immunodeficiency virus type 1. J Infect Dis 1996;173:340-348.

2. Montefíori, DC, and Evans, TG: Toward and HIV type 1 vaccine that generates potent, broadly cross-reactive neutralizing antibodies. AIDS Res Hum Retroviruses 1999; 15:689-698;

3. Moore, JP, Coa, Y, Leu, Qin, L, Korber, B, and Ho, DD: Inter and intraclade neutralization of human immunodeficiency virus type 1: genetic clades do not correspond to neutralization serotypes but partially correspond to.gpl20 antigenic serotypes. J Virol 1996;70:427-444:

4. Weber, J, Fenyo, EM, Beddows, S, Kaleeby, P, Bjomdal, A, and the W^ZHO Network Tor HIV Isolation and Characterization: Neutralization serotypes of HIV-1 field isolates are not predicted by genetic subtype. J Virol 1996;70:7827-7832;

5. Burton, DR. Pyati, J, Koduri, R, Sharp, SJ, Thomton, GB, Parren, PWHI, Sawyer, LSW, Hendrv, RM, Dunlop, N, Nara, PL, Lamacchia, M, Garratty, E, Stiehm, ER, Brvson, YJ, Cao, Y, Moore, JO, Ho, DD, and Barbas III, CF: Effřcient neurralization of primary isolates of HIV-1 by a recombinant human monoclonal antibody. Science 1994;266:1024-1027;

6. Mascola, JR, Louder, MK, VanCott, TC, Sapan, CV, Lambert, JS, Muenz, LR, Bunow, B, Birx, DL, and Robb, ML: Potent and synergistic neutralization of human immunodeficiency virus (HIV) type 1 primary

• ····	4
• * • ·	44 •	4 4·	• 4 4 4
• · 4	•	•	4 4
• · 4		4	• 4 <
·· 4 4	• · ·	4 4··	4 · 4 4

·· 44 isolates by hyperimmune anti-HIV immunoglobulin combined with monoclonal antibodies 2F5 and 2G12. J Virol 1997;71:7198-7206;

7. Trkola, A, Pomales, AB, Yuan, H, Kober, B, Maddon, PJ, Allaway, GP, Katinger, H, Barbas III, CF, Burton, DR, Ho, DD, and Moore, JP: Cross-clade neutralizaíion of primary isolates of human immunodeficiency virus type 1 by human monoclonal antibodies and tetrameric CD4-IgG. J Virol 1995;69:6609-6617;

8. Moore, JP, and Trkola, A: JIV type 1 coreceptors, neutralization serotypes, and vaccine development. AIDS Res Human Retroviruses 1997;13:733-736;

9. Coutinho A: Beyond clonal selection and network. Immunologicai Reviews 1989; 110:63-67;

10. Avrames, S: Natural autoantibodies: from horror autotexicus” to gnothi seauton. Immunol Today 1991;12:154-159;

11. Moller, G: Effect of anti-immunoglobulin sera on B lymphocyte functions. Scand J Immunol 1978;8:469-474;

12. Race, EM, Ramsey, KM, Lucia, HL, and Cloyd, MW: Human immunodeficiency virus elicits aníibody not detected by standard tests; implications for diagnostics and viral immunology. Virology 1991; 184:716722;

13. Nara, PL, and Garrity, R: Deceptive imprinting: a cosmopolitan stratégy for complicating vaccination. Vaccine 1998;16:1780-17787;

14. Zubler, RH, Perrin, LH, Doucet, A, Zhang, X, Huang, YP, and Miescber, PA: Frequencies of HlV-reactive B cells in seropositive and seronegative individuals. Clin Exp Immunol 1991; 87:31-36;

15. Davis, D, Chaudhri, B, Stephens, DM, Came, CA, Willers, C, and Lachmann, PJ: The immunodominance of epitopes within the transmembrane protein (gp41) of human immunodeficiency virus type 1 ·· ···· may be determined by the hosťs previous exposure to similar epitopes on unrelated antigens. J Gen Virol 1990;71:1975-1983;

16. Velijovic, V, Meílas, R, Kóhler, H, Umoviíz, HB, Prljic, J, Velikovic, N, Johnson, E, and Muller, S: AIDS epidemie at the beginning of the third millennium: time for a new AIDS vaccine stratégy. Vaccine 2000;19:18551S63;

17. Wang, QL, Wang, HT, Blalock, E, Moller, S, and K”hlerm H: Identification of an idiotypic peptide recognized by autoantibodies in immunodefíciency virus- 1-infected individuals. Idiotype-specifíc autoantibodies in AIDS 1995;96:775-780;

18. Veljkovic, V, and Metlas, R: Identification of immunoglobulin recombination elements in HIV-1 envelope gene. Immunol Lett 1991 ;31:1114;

19. Metlas, R, Veljkovic, V, Paladini, DR, and Pongor, S: Protein and DNA sequcnce homology between the V3 loop of human immunodefíciency virus type 1 envelope protein gpl20 and immunoglobulin variahle region. Biochem BiophysRes Commun 1991;179:1056-1062;

20. Metlas, R. Skerl, V, Veljkovic, V, Colombatti, A, and Pongor, S: Immunoglobulin-like domain of HIV-1 envelope glycoprotein gpl20 eneodes putative intemal image of some common human proteins. Viral Immunol 1994;7:215-219;

21. Metlas, R, Trajkovic, D, Srdic, T, Veljkovic, V, and Colombatti, A: Anti-V3 ' and anti-IgG antibodies of normál individuals share complementariry structures. JAIDS 1999;21:266-270;

22. Pinter, A, Honnen, WJ, Tilley, SA: Conformational changes affecting the V3 and CD4-binding domains of human immunodefíciency virus type 1 gpl20 associated with env processing and with binding of ligands to these sites. J Virol 1993;67:5692-5697;

• · li ··· ·· ··· ··

23. Holniberg, D, Andersson, A, Carlsson, L, and Forsgren, S: Establishment and functional implicaíions of B-cell connectiviíy. Immunological Revíews 1989;110:89-103;

24. Ochsenbein, AF, and Zinkernagel, RM: Natural antiboďies and complement link innate and acquired immunity. Immunol Today 2000;21:624-629;

25. Fearon, DT, and Locksley, RM: The instructive role of innate immunity in tbe acquired immune response. Science 1996;272:50-54.

Claims

PATENTOVÉ NÁROKY

1. Farmaceutický prostředek, vyznačující se tím, že jako účinnou složku obsahuje protilátky proti celkové frakci lidského IgG.
2. Farmaceutický prostředek podle nároku 1, vyznačující se tím, že protilátky byly získány afinitní chromatografií séra normálních,

HIV-neinfikovaných jednotlivců při použití pryskyřice, navázané na celkovou frakci lidského IgG.
3. Použití lidských protilátek proti celkové frakci lidského IgG pro výrobu farmaceutického prostředku pro prevenci nebo léčení infekce HIV.
4. Použití podle nároku 3, při němž jde o pasivní imunotherapii infekce HIV-1.
5. Použití podle nároku 3 a 4, při němž se lidské protilátky získávají afinitní chromatografií séra normálních, HIV-neinfikovaných jedinců při použití pryskyřice, navázané na celkovou frakci lidského IgG.