RS51011B

RS51011B - Prirodna antitela aktivna protiv hiv virusa

Info

Publication number: RS51011B
Application number: YUP-701/03A
Authority: RS
Inventors: Radmila Metlas
Original assignee: Diapharm, Limited
Priority date: 2001-03-09
Filing date: 2002-03-06
Publication date: 2010-10-31
Also published as: JP2004532198A; CA2440131A1; BR0207931A; CN1494554A; US20040106771A1; HUP0303423A2; NO20033934D0; JP4601252B2; AP2003002852A0; CZ20032418A3; IL157753A0; KR100871455B1; WO2002072637A1; DE60216422D1; CY1108852T1; NO20033934L; EP1366080A1; HUP0303423A3; PL366785A1; RU2003125554A

Abstract

Upotreba humanih antitela protiv ukupne frakcije humanog IgG, naznačena time što su pomenuta humana antitela dobijena afinitetnom hromatografijom seruma poreklom od normalnih individua koje nisu - inficirane sa HIV, koristeći smole vezane za ukupnu frakciju humanog IgG i što su sposobna da neutralizuju HIV-1, za pripremanje medikamenta za pasivnu imunoterapiju HIV-1 infekcija.

Description

OBLAST PRONALASKA

Predmetni pronalazak odnosi se na antitela koja neutralizuju virus humne imunode-ficijencije. Pomenuta antitela su prisutna u serumu poreklom od normalnih osoba i mogu se upotrebiti da se spreči HIV infekcija ili da se odloži razvoj bolesti kod serumum pozitivnih pacijenata. Predmetni pronalazak se dalje odnosi na farmaceutske preparate koji sadrže pomenuta antitela i njihovu upotrebu u pasivnoj imunoterapiji HIV infekcije.

STANJE TEHNIKE

Indukcija efektivnog imunog odgovora na HIV-1 je vrlo često ograničena nesposobnošću bilo koje vakcine kandidata da izazove antitela sposobna da neutralizuju infektivnost primarnih HIV izolata poreklom od inficiranih jedinki (1,2). S druge strane, iz analize seruma inficiranih subjekata pokazale su kao rezultat da neutralizacija primarnih virusa ima tendenciju da bude slaba i sporadična (3,4). Međutim, i ako je teško da se stvore antitela, bilo tokom infekcije ili sa eksperimentalnim vakcinama, monoklonalna antitela postoje, kao što su lgG1b12, 2F5 i 2G12 (5-7), koja su sposobna da neutralizuju primame viruse subtipova A - E. Pomenuta antitela na-stala su iz subtipa B - inficiranih jedinki i nisu pobuđena vakcinacijom (8).

HIV-1 specifično antitelo koje sev najranije detektuje je IgG izotip (12), što sugeriše nekonvencionalni primarni odgovor (13). Štaviše, postoje nalazi koji ukazuju da HIV-1 antigeni reaguju sa prethodno-postojećim receptorima antitela (14). Prikazana su unakrsno rektivna antitela koja prepoznaju omotač HIV-1 (15).

Sugerisano je da jak rani humoralni odgovor u HIV-1 infekciji ne mora biti koristan (16) pošto on može rezultirati populacijom monoktonalnih i poliklonalnih antitela umesto normalnim polikionalnim odgovorom (13). Sugerisano je da anti-idiopatsko antitelo 1F7 može proširiti imuni odgovor na HIV antigene (17).

U našim ranijim ispitivanjima, predviđena je homologija proteina omotača HIV sa IgG varijabilnim proteinom (18, 19). Međutim, nedavni podaci sugerišu da imunodominantni epitop HIV-1 gp 120 i frakcija IgG antitela koja se prirodno javlja imaju komplementarnu strukturu (20, 21).

OPIS PRONALASKA

Sada je otkriveno da je grupa antitela prisutnih u serumu poreklom od normalnih, a ne od onih jedinki inficiranih sa HIV, sposobna da neutrališe HIV virus.

Aktivna frakcija antitela je prečišćena iz seruma normalnih subjekata putem afinitetne hromatografije koristeći Sepharose smolu za koju se ukupni humani IgG vezao. Zapažanja su dokazala da je takva frakcija anti-lgG antitela sposobna za neutralisanje HIV-1 infekcije u PBMC. Eksperimenti su ponovljeni koristeći različite anti-lgG preparacije raznih koncentracija, dobijenih iz komercijalnih primeraka seruma, koristeći afinitetno prečišćena totalna IgG antitela kao negativnu kontrolu i HIVIG i mAb 4117C antitela kao pozitivnu kontrolu. Ovo poslednje se pokazalo inaktivnim za 92HT593B. Krive neutralizacije pokazane na slici 1 odnose se na repre-zentativne eksperimente izvedene sa HIV-1 primarnim izolatima 92HT593B i SF162VVT kao i sa NLHX-ADA rekombinantnim virusom. Anti-lgG antitela pokazala su se aktivnim protiv 92HT593B

i NLHX-ADA na koncentraciji inhibiranja od 50% u rasponu od manje od 1 do 7 jag/ml.

Postoji malo mogućnosti da su efekti neutralizacije zapaženi sa preparacijom anti-lgG antitela rezultat ko-prečišćenih hemokina iz normalnih seruma, pošto koncentracija ovih supstanci ne prelazi 20 ng po ml seruma i nisu otkrivene specifične trake sa PAGE. Dalje, molekuli ispod 50 kDa su uklonjeni dijalizom preparacija antitela. PAGE analiza anti-lgG preparacija otkrila je preovlađujuće prisustvo IgG i vrlo male tragove proteina kontaminanata.

Moguće objašnjenje zapaženih efekata je da HIV-1 antigene determinante dele komplementarnu strukturu sa varijabilnim regionima prirodnih antitela koja pripadaju imunoj mreži (9, 23), ali ovo ili druga objašnjenja ni na koji način ne ograničavaju pronalazak.

Prema tome, prvi aspekt pronalaska odnosi se na pripremanje humanih antitela pobuđenih protiv ukupne humane IgG frakcije, sposobnih da neutralizuju HIV-1. Pomenuta preparacija može biti dobijena podvrgavanjem seruma poreklom od normalnih subjekata koji nisu inficirani sa HIV, afinitetnoj hromatografiji koristeći smole vezane za ukupnu humanu IgG frakciju. Konačna koncentracija izolovanog anti-lgG antitela radije će biti sadržana u rasponu od 0.1-1000 (og/ml, još poželjnije u rasponu od 0.1-100 ug/ml. Polazni materijal sastoji se od skupa seruma poreklom od normalnih subjekata. Prema daljem aspektu, pronalazak se odnosi na upotrebu preparacija pronalaska u profilaktičkom ili terapeutskom tretmanu HIV infekcije, poželjno HIV-1 infekcije.

Za upotrebu u terapiji, preparacija pronalaska će biti pogodno formulisna sa farmaceutski prihvatljivim ekscipijentima. Ovi poslednji uključuju puferske agense, stabilizujuće agense, rastvarače, razblaživače, agense izotoničnosti i tome slično. Preparacija će poželjno biti davana parenteralno, poželjno intravenskim, intradermalnim ili intramuskulamim putem. U skladu sa po-željnim oblikom, preparat će se upotrebljavati u pasivnoj imunoterapiji HIV-1 infekcije.

OPIS SLIKA

Slika 1

Neutralizacija primarnih HIV-1 izolata SF162VVT i 92HT593B i rekombinantnog NL-HX-ADA virusa sa anti-lgG antitelima. Svaka kriva titracije predstavlja podatke iz pojedinačnog eksperimenta. Koncentracije anti-lgG u različitim eksperimentima bile su respektivno 109.7, 12.3 i 80.0 ug/ml, za ukupni IgG između 1000 i 3333 u.g/ml i za HIVIG (10000 mg/ml). Anti-lgG i ukupne IgG preparacije su dobijene kao što je opisano u onom što sledi. HIVIG je pripremljen iz seruma HIV-1 inficiranih subjekata.

Slika 2

SDS-PAGE razdvajanje afinitetno prečišćenih antitela. Anti-lgG i ukupna IgG antitela su pripremljena kao što je opisano dole. Elektroforetsko razdvajanje anti-lgG antitela dalo je preo-vlađujući sadržaj IgG. Sem toga, i ako slabe, trake proteina visoke molekulske težine, takođe su bile prisutne.

PRIMEELL- Piiimc[ lff$ 8-- ar] Mg& £DaMa

Anti-lgG antitela su pripremljena iz skupa od dva normalna humana seruma putem afinitetne hromatografije koristeći Sepharose perlice (CNBr-aktivirana Sepharose 4B) na koju su ukupna humana IgG (prečišćena na afinitetnoj koloni GammaBind Sepharose 4B) bila prethodno vezana. U principu, 5-7 mg IgG antitela / 0.5-0.6 g Sepharose perlica je bilo upotrebljeno. Vezivanje je obavljeno sledeći uputstva proizvođača. Kolona je uravnotežena sa 5xPBS i serum inaktiviranim toplotom (1ml) je napunjen i razblažen 1:1 sa 5xPBS. Inkubacija je obavljena tokom 1 časa na sobnoj temperaturi ili tokom noći na 4°C. Nakon ispiranja sa 30 ml 5xPBS, vezana antitela su isprana koristeći 0.1 M citrat, pH=2.5 u test tube koje su sadržale bazni TRIS. Sakupljeni ispirak je koncentrisan, dijaliziran (Centricon YM, 30000 MW otsečak) i analiziran kroz 10% SDS-PAGE, preovlađujuće dajući IgG traku (slika 2).

PRIMER 2 - Neutraliaanje HJV-1 izolata sa anti-lgG antitelima

Neutralizacija virusom je procenjena u PBMC sledeći prethodno publikovani protokol (22). Ogledi neutralizacije izvedeni su sa četiri različite preparacije antitela u pet odvojenih ekspe-rimenata.

Tabela 1 sumarizuje podatke neutralisanja protiv dva primarna HIV izolata (92HT593B, SF162VVT) i rekombinantnog NL-HX-ADA virusa.

HIVtG i mAb4117C su upotrebljeni kao pozitivne kontrole; Protein-G IgG je upotrebljen kao negativna kontrola.

U ovom testu sve preparacije anti-lgG antitela pokazale su se sposobne u inhibiranju PBMC infekcije sa 92HT593B i NL-HX-ADA, dok nije zapaženo da nema aktivnosti neutralizacije protiv SF162VVT.

LITERATURA

1. Mascola, JR, Snyder, SW, Weislow, OS. Belay, SM, Belshe, RB, Schwartz, DH, Clements, ML, Dolin, R, Graham, BS, Gorse, GJ, Keefer, MC, McEIrath, MJ, Walker, MC, VVagner, KF, McNell, JG, McCutchan, FE, and Biirke, DS: Immunization witri envelope subunit vacclne products elicits neutralizlng antibodies against laboratory-adapted but not prlmarv isolates of human immunod8ficiency virus tvpe 1. J Infect Dis 1996; 173:340-348. 2. Montefiori, DC, and Evans, TG: Toward and HIV type 1 vaccine that generates potent, broadly cross-reactive neutralizlng antibodies. AIDS Res Hum Retroviruses 1999;15:689-698; 3. Moore, JP, Coa, Y, Leu, Qin, L, Korber, B, and Ho, DD: Inter and intraclade neutralization of human itnmunodeficiency virus type 1: genetic clades do not correspond to neutralization serotypes but partially correspond to gpl20 antigenic serotypes. J Virol 1996;70:427-444; 4. VVeber, J, Fenyo, EM, Beddows, S, Kaleeby, P, Bjorndal, A, and the WHO Netvvork for HIV Isolation and Characterization: Neutralization serotypes of HIV- 1 field isolates are not predicted by genetic subtype. J Virol 1996;70:7827-7832; 5. Burton, DR, Pyatl, J, Koduri, R, Sharp, SJ, Thomton, GB, Parren, PWHI, Sawyer, LSW, Hendry, RM, Dunlop, N, Nara, PL, Lamacchia, M, Garratty, E, Stiehm, ER, Bryson, YJ, Cao, Y, Moore, JO, Ho, DD, and Barbas III, CF: Efficient neutralization of primary isolates of HIV-1 by a recombinant human monoclonal antibody. Science 1994;266: 1024-1027; 6. Mascola, JR, Louder, MK, VanCott, TC, Sapan, CV, Lambert, JS, Muenz, LR, Bunow, B, Birx, DL, and 'Robb, ML: Potent and synergistic neutralization of human immunodeficiency virus (HIV) type 1 primary isolates by hyperimmune anti-HIV immunoglobulin combined with monoclonal antibodies 2F5 and 2G12. J Virol 1997;71:7198-7206; 7. Trkola, A, Pomaies, AB, Yuan, H, Kober, B, Maddon, PJ, Allaway, GP, Katinger, H, Barbas III, CF, Burton, DR, Ho, DD, and Moore, JP: Cross-dade neutralization of primary isolates of human immunodeficiency virus type 1 by human monoclonal antibodies and tetrameric CD4-lgG. J Virol 1995;69:6609-6617; 8. Moore, JP, and Trkola, A: JIV type I coreceptors, neutralization serotypes, and vaccine development. AIDS Res Human Retroviruses 1997;13:733-736; 9. Coutinho A: Bevond clonal seLection and netvvork. Immunological Reviews I989;l 10:63-67; 10. Avrames, 5: Natural autoantibodies: from tthorror autotexicus" to "gnothi seauton". Irnmunol Today 1991; 12:154-159; 11. Moller, G: Effect of anti-imrnunoglobulin sera on B lymphocyte functions. Scand J Irnmunol1978;8:469-474;" 12. Race, EM, Ramsey, KM, Lucia, HL, and Cloyd, MW: Human immunodeficiency virus elicits antibody not detected by standard tests; implications for diagnostics and viral immunology. Virology 1991;184:716-722; 13. Nara, PL, and Garrity, R: Deceptive imprinting: a cosmopolitan strategy for complicating vaccination. Vaccine 1998;16:1780-17787; 14. Zubler, RH, Perrin, LH, Doucet, A, Zhang, X, Huang, YP, and Miescher, PA: Frequencies of HlV-reactive B cells in seropositive. and seronegative individuals. Clin Exp Irnmunol 1991; 87:31-36; 15. Daviš, D, Chaudhri, B, Stephens, DM, Čame, CA, -VVillers, C, and Lachtnann, PJ: The immunodominance of epitopes vvithin the transmnembrane protein (gp4l) of human immunodeficiency virus type 1 may be determined by the host's previous exposure to similar epitopes on unrelated antigens. J Gen Virol 1990;71:1975-1983; 16. Velijovic, V, Metlas, R, Kohler. H, Umovitz, HB, Prljic, J, Velikovic, N, Jolmson, E, and Muller, 8: AIDS epidemie at the beginning of the third millennium: time for a new A4ĐS vaccine strategy. Vaccine 2000;19:1855-1863; 17. Wang, QL, VVang, HT, Blalock, E, Moller, S, and K"hlerm H: Identification of an idiotvpic peptide recognized by autoantibodies in inimunodeficiency virus-i-infected individuals. ldiotype-specific autoantibodies in AIDS 1 995;96:775-780; 18. Veljkovic, V, and Metlas, R: Identification of immunoglobulin recombination elements in HIV-I envelope gene. Lmmunoi Lett 1991;31:11-14; 19. Metlas, R, Veljkovic, V, Paladini, DR, and Pongor, 8: Protein and DNA sequence homology between the V3 loop of human immunodeficiency virus type I envelope protein gpi20 and immunoglobulin variable region. Biochem Biophvs Res Commun 199 l;179:1056-1062; 20. Metlas, R. Skerl, V, Veljkovic, V, Colombatti, A, and Pongor, 5: Immunoglobulin-like domain of HIV-1envelope givcoprotein gpl20 encodes putative internal image of some common human proteins. Viral Irnmunol 1994;7:215-219; 21. Metlas, R, Trajkovic, D, Srdic, T, Veljkovic, V, and Colombatti, A: Anti-V3 and anti-lgG antibodies of normal individuals share complementarin/structures. JAIDS 1 999;2 1:266-270; 22. Pinter, A, Honnen, WJ, Tilley, SA: Conformational changes affecting the V3 and CD4-binding domains of human immgnodeficiency virus type 1 gpl20 associated with env processing and with binding of ligands to these sites. J Virol 1993;67:5692-5697; 23. Holrnberg, D, Andersson, A, Carlsson, L, and Forsgren, S: Establishment and functional implications of B-cell connectivity. Immunological Revievvs 1989;110:89-103; 24. Ochsenbein, AF, and Zinkemagel, RM: Natural antibodies and complement link innate and acquired immunity. Irnmunol Today 2000;2 1:624-629; 25. Fearon, DT, and Locksley, RM: The instructive role of innate immunity in the acquired immune response. Science 1996;272:50-54.

Claims

1. Upotreba humanih antitela protiv ukupne frakcije humanog IgG, naznačena time što su pomenuta humana antitela dobijena afinitetnom hromatografijom seruma poreklom od normalnih individua koje nisu inficirane sa HIV, koristeći smole vezane za ukupnu frakciju humanog IgG i što su sposobna da neutralizuju HIV-1, za pripremanje medikamenta za pasivnu imunoterapiju HIV-1 infekcija.