CZ20032692A3 - Terapeutická činidla proti zánětlivým střevním onemocněním - Google Patents

Description

(57) Anotace:

Protilátky proti molekule AILIM (jinak zvané ICOS a 8F4), které významně potlačují vznik zánětlivých střevních onemocnění (konkrétně Crohnovy choroby a kolitidy (colitis ulcerosa apod.)) a mají výrazný léčebný efekt proti zánětlivým střevním onemocněním.

CO <

CM

O) co

CM

CM

N

O r

· · ·· ♦ 4 · «· « « · * «444 44

Terapeutická činidla proti zánětlivým střevním onemocněním

Oblast techniky

Předkládaný vynález se týká farmaceutických sloučenin obsahujících aktivní látku, která má schopnost ovlivňovat biologickou aktivitu „aktivační indukovateiné lymfocytické imunomodulační molekuly“ (AILIM), známé také jako „indukovatelný kostimulátor“ (ICOS), konkrétně signální transdukci, kterou zprostředkovává molekula AILIM.

Konkrétně se předkládaný vynález týká farmaceutických sloučenin obsahujících aktivní látku, která je schopna regulovat (např. inhibovat) proliferaci buněk produkujících AILIM, buněčnou smrt ( nebo apoptózu) nebo imunitní buněčnou lyži a nebo je schopná ovlivňovat (např. inhibovat) produkci cytokinu (např. interferonu - γ nebo interferonu - 4) u buněk produkujících AILIM.

Dále se předkládaný vynález týká aktivních látek, které jsou schopné ovlivňovat signální transdukci přes AILIM a dalšími vhodnými látkami, které jsou schopné indukovat buněčnou smrt, apoptózu nebo snížení počtu buněk produkujících AILIM. Předkládaný vynález se zabývá farmaceutickými sloučeninami, které se používají k potlačení, léčbě či prevenci chorob doprovázejících narušenou imunitu trávicího traktu (např. zánětlivých střevních onemocnění jako je kolitida např. colitis ulcerosa, Crohnova choroba či různé zažívací alergie).

Dosavadní stav techniky

Slizniční membrána trávicího traktu je neustále vystavena nejen antigenům pocházejících z jídla a střevní flóry, ale také různým antigenům z vnějšího prostředí, které jsou živému organismu škodlivé, např. patogenním organismům. Z toho důvodu slizniční membrány trávicího traktu vykazují cytotoxickou aktivitu, díky které se mohou těmto škodlivým antigenům z vnějšího prostředí bránit. Slizniční membrány mají nejen schopnost neustále vylučovat protilátky na neutralizaci toxinů, ale také jsou tyto membrány vyzbrojeny jedinečným imunitním mechanismem, který potlačuje nadměrné imunitní reakce proti antigenům jako je jídlo nebo střevní flóra (tento mechanismus se nazývá gastrointestinální slizniční imunita nebo také střevní imunita). Konkrétně je normální slizniční imunita nastavena tak, aby se udržovala rovnováha mezi pozitivní imunitní odpovědí proti patogenům a negativní imunitní

99 9

9 99

9

9 odpovědí proti nepatogenním organismům. Pokud se tato rovnováho imunologického homeostatického udržování poruší, začnou se objevovat alergie, záněty a infekce a pak dojde k vypuknutí střevních onemocnění obecně pojmenovaných jako zánětlivá střevní onemocnění (IBD) a zažívací alergie.

Nejznámějšími z těchto zánětlivých střevních onemocnění jsou Crohnova choroba (CD) a kolitida (konkrétně většinou colitis ulcerosa (UC). Pro obě tyto choroby je společné, že specifický patogen není známý a také že jsou to choroby chronické, při kterých se často vrací záchvaty spojené s bolestí břicha a průjmem. Tyto choroby způsobují zejména dětem a mladším pacientům dlouhotrvající obtíže v každodenním životě. Dále vzhledem ktomu, že se kolitida (a speciálně colitis ulcerosa) může stát jednou z příčin pozdější rakoviny tračníku, je velmi důležité objasnit mechanismy patogeneze kolitidy a vyvinout účinné metody na její léčbu.

Přestože při diskuzi o příčinách a mechanizmu vzniku střevních zánětlivých onemocnění se probíraly i možnosti přispění genetických faktorů a faktorů prostředí, současné studie se velmi silně přiklánějí k názoru, že možnou příčinou je zřejmě porušená (abnormální) imunita střeva (gastrointestinální slizniční imunita). Konkrétně se zánět nebo alergie objevuje na slizniční membráně střeva díky nadměrné imunitní odpovědi, která je v některých případech odpovědí na antigeny přítomné ve střevě, které jsou normálně nepatogenní a mají nízkou imunogenicitu, což má za následek vypuknutí zánětlivého střevního onemocnění.

Předpokládá se, že právě abnormální imunitní odpověď proti cizorodým patogenům, antigenům pocházejících z jídla nebo autoantigenům je úzce spjata se záněty a alergiemi střeva. Současné studie ukazují, že abnormální imunitní odpovědi proti určitým vlastním baktériím se mohou projevovat navenek jako chronické zánětlivé reakce.

Mechanismus vzniku zánětů a alergií střeva díky abnormální, porušené imunitě střeva je podpořen analýzami funkce a diferenciace T buněk pacientů, stejně tak i skladbou produkovaných cytokinů v lézích či v séru. V současné době bylo vyvinuto několik zvířecích modelů, na kterých byly provedeny analýzy vztahující se kzánětlivým střevním onemocněním. Tyto analýzy odhalily skutečnost, že narušená slizniční imunita způsobuje chronický zánět ve střevě (Gastroenterology, Vol. 109, p. 1344-1367,1995).

Bylo zjištěno, že zánět střeva se vyvíjí spontánně u myší s knokautovaným ařetězcem receptorů (TCR) T buněk (TCR a'⁷' myši) (Cell, Vol.75, p.275-282, 1993; J.

« · fc fcfc · • ··

Exp. Med., Vol.183, p.847-856, 1996). Z tohoto příkladu je jasné, že T buňky se zcela určitě nějakým způsobem podílí na vzniku chronické enteritidy. Během zánětu střev u těchto TCRa'^/' myší se ve střevě zvyšuje produkce IFN-γ a v počátečním stádiu zánětu bylo pozorováno zvýšení hladiny IL-1a a IL-Ιβ (Laboratory Investigation, Vol.76, p.385-397, 1997). Dále byla v zažívacím traktu a lymfatických uzlinách zpozorována přítomnost TCRp (p^d,m) T buněk, které mají specifický Vp soubor a také produkce IL-4 (Gastroenterology, Vol. 112, p.1876-1886, 1997). U tohoto modelu se předpokládá, že úbytek TCRap T buněk způsobuje zvětšení frakce abnormálních T buněk, které potom způsobují abnormální regulaci produkce cytokinu, jenž pak způsobuje zánět.

U modelu, ve kterém se do imunodeficientních myší (tzv. SCID myši) zavedou CD4⁺/CD45RB^h'^9h T buňky, začne vznikat závažná enteritida provázená hyperplázií slizniční vrstvy a do střeva začnou pronikat lymfocyty. Ovšem pokud se současně zavedou myším i nerozdělené CD4⁺ buňky, zmíněná enteritida nevzniká (J. Exp. Med., Vol.178, p.237-244, 1993; Int. Immunol., Vol.5, p.1461-1471, 1993). CD4+ buňky SCID myší, u kterých se vyvinula enteritida, produkují IFN-γ. Na druhé straně však vzhledem k tomu, že se enteritida potlačuje podáváním protilátek proti IFN-γ, předpokládá se, že zánět způsobuje Th1 typ T buněk (Immunity, Vol.1, p.553-562, 1994).

Na základě těchto informací je nepochybné, že CD4⁺ T buňky střeva a jejich nadměrná aktivace jsou důležitými faktory u zánětlivých střevních onemocněních.

Dále se zdá, že ústup enteritidy, spojený s poklesem množství CD4⁺ T buněk u pacientů trpících jak zánětlivým střevním onemocněním, tak HIV, podporuje předpoklad, že abnormální CD4⁺ buňky se velkou měrou podílí na vzniku zánětlivých střevních onemocněních (J. Clin. Gastroenterology, Vol.23, p.24-28, 1996).

Na základě těchto zjištění byly provedeny pokusy léčit zánětlivá střevní onemocnění anti-CD4 protilátkami a je potvrzeno, že podáváním anti-CD4 protilátek se zánětlivé léze potlačují (Gut, Vol.40, p.320-327, 1997).

Na druhou stranu ovšem tato abnormální funkční regulace T buněk ukazuje, že rovnováha produkce regulačního cytokinu byla velmi hrubě porušena.

Bylo zjištěno, že enteritida také spontánně vzniká u IL-2 a IL-10 knokautovaných myší (Cell, Vol.75, p.235-261, 1993; Cell, Vol.75, p.263-274, 1993). Navíc u těchto modelů byla pozorována nadměrná produkce IFN-γ, což podporuje

0000 hypotézu, že se uplatňuje nadměrná Th1 odpověď. Nadprodukce IFN-γ u těchto modelů je v souladu s pozorováním zvýšené exprese IFN-γ v lézích vznikajících při Crohnově chorobě. Zánět střev se u IL-10 deficientních myší léčí podáváním IL-10. Bylo zjištěno, že touto metodou je možné potlačit enteritidu u SCID myší, kterým byly zavedeny CD4⁺/CD45RB^h'^9h T buňky (Immunity, Vol.1, p.553-562, 1994).

Jak bylo zmíněno výše, analýza mechanismu vzniku zánětlivých střevních onemocnění se vyvinula z rozboru narušené slizniční imunity trávicího traktu, což naznačilo možnost léčby zánětlivých střevních onemocnění potlačením zvýšené aktivace CD4⁺ T buněk a nadprodukce cytokinů. Ovšem skutečná patogeneze zánětlivých střevních onemocnění ještě nebyla úplně odhalena a navíc zatím nebyla objevena účinná metoda léčby.

Aktivace T buněk (tj. nabytí antigenní specifity) vzniká poté, co T buňky rozpoznají antigeny přítomné na povrchu antigen-prezentujících buněk (APC), jako jsou makrofágy, B-buňky nebo dendritické buňky. APC buňky zpracovávají inkorporované antigeny a tyto zpracované antigeny jsou pak navázány na hlavní histokompatibilní komplex (MHC) a vystaveny na povrch buňky. T-buňky dostanou první signál pro svojí aktivaci (nabytí specifity) poté, co rozpoznají zpracovaný antigen vystavený na povrchu APC buňky díky komplexu tvořeném receptorem Tbuňky (TCR) na povrchové membráně T buňky a antigenem (TCR/CD3 komplex).

Pro dostatečnou aktivaci T buněk je nutný další, tzv. kostimulační signál. Tbuňky jsou stimulovány antigen-specificky po obdržení kostimulačního signálu poté, co obdržely první signál.

Pro tuto druhou signální transdukci je nesmírně důležité, aby došlo k interakci (konkrétně k intracelulární adhezi zprostředkované vazbami, které se vytváří mezi následujícími molekulami) mezi CD28 (známé také jakoTp44, T44 nebo 9,3 antigen), což je molekula povrchové membrány antigen-prezentujících buněk (makrofágů, monocytů, dendritických buněk apod.), a CD86 (známé také jako B7-2 nebo B70), což je také molekula povrchové membrány antigen-prezentujících buněk.

Dále bylo experimentálně zjištěno, že interakce (konkrétně intracelulární adheze zprostředkovaná vazbami, které se vytváří mezi následujícími molekulami) mezi antigenem 4 asociovaným s cytolytickým T-lymfocytem (CTLA-4), jehož exprese je usnadňována v závislosti na sekundárním signálu, CD80 (B7-1) a CD86 (B7-2), hrají důležitou roli při regulaci aktivace T-buněk tímto druhotným signálem. Konkrétně bylo zjištěno, že regulace aktivace T-buněk pomocí druhé signální » · ·· «· ···· transdukce zahrnuje přinejmenším interakci mezi CD28 a CD80/CD86, přičemž na této interakci závisí usnadnění exprese CTLA-4, a dále interakci mezi CTLA-4 a CD80/CD86.

Navíc bylo v současné době zjištěno, podobně jako u výše popsaných CTLA4 a CD28, že molekula, nazvaná aktivační indukovatelná lymfocytická imunomodulační molekula (AILIM; lidská, myší a krysí; Int Immunol., 12(1), p.51-55, 2000; také zvaná indukovatelný kostimulátor (ICOS; lidský; Nátuře, 397(6716), p.263-266, 1999); J. Immunol., 166(1), p.1, 2001; J. Immunol., 165(9), p.5035, 2000; Biochem. Biophys. Res. Commun., 276(1), p.335, 2000; Immunity, 13(1), p.95, 2000; J. Exp. Med., 192(1), p.53, 2000; Eur. J. Immunol., 30(4), p.1040, 2000) slouží jako třetí kostimulační přenášející molekula, která přivádí druhý signál (kostimulační signál), nezbytný pro aktivaci lymfocytů, jako jsou např. T-buňky. Spolu s tímto signálem reguluje funkci aktivovaných lymfocytů, jako jsou např. aktivované T-buňky.

Dále byla určena nová molekula, nazvaná B7h, B7RP-1, GL50 nebo LICOS, u které se předpokládá, že je ligandem, který účinkuje spolu s kostimulační přenosnou molekulou AILIM (Nátuře. Vol.402, No.6763, pp.827-832, 1999; Nátuře Medicine, Vol.5, No.12, pp.1365-1369, 1999; J. Immunology, Vol.164, pp.1653-1657, 2000; Curr. Biol., Vol. 10, No.6, pp.333-336, 2000).

V současné době se provádí vyčerpávající studie, které se zabývají biologickými funkcemi těchto dvou nových molekul, funkční kontrolou lymfocytů, jako jsou např. T-buňky, pomocí třetího kostimulačního přenosu signálu těmito molekulami.

Na druhé straně se ovšem zatím neobjasnil vztah mezi AILIM (ICOS), což je třetí kostimulační transdukční molekula, o které se předpokládá, že je nezbytná k aktivaci T-buněk jako jsou CD4⁺ T-buňky, a vznikem výše popsané narušené imunity střevní slizniční membrány a zánětlivých střevních onemocnění (Crohnova choroba a kolitida - colitis ulcerosa apod.). Také se zatím neobjevily žádné nové přístupy, jak léčit zánětlivé střevní onemocnění regulací funkce této AILIM molekuly.

Podstata vynálezu

Předmětem tohoto vynálezu je zajistit metody a farmaceutická činidla pro potlačení, léčbu nebo prevenci onemocnění, které vznikají pokud je porušená imunita (dochází k abnormální aktivaci T-buněk, zvýší se množství CD4⁺ buněk) trávicího traktu, jako jsou zánětlivá střevní onemocnění (Crohnova choroba a kolitida - colitis ·· ···· ulcerosa apod.). Pomocí medicínských a farmaceutických metod (používají se např. farmaceutická činidla, jako jsou sloučeniny s nízkou molekulovou hmotností a protilátky) se pozmění biologická funkce nově objevené molekuly AILIM, o které se předpokládá, že přenáší druhotný signál, který je nezbytný pro aktivaci lymfocytů jako jsou T-buňky (kostimulační signál), a reguluje funkci aktivovaných lymfocytů jako jsou aktivované T-buňky.

Dále je předmětem tohoto vynálezu použití takových farmaceutických činidel, která mění biologickou funkci AILIM (např. farmaceutická činidla, jako jsou sloučeniny s nízkou molekulovou hmotností a protilátky), aby byly zajištěny metody, díky kterým se zlepší léčebný efekt již existujících farmaceutických činidel běžně používaných při léčbě zánětlivých střevních onemocnění (adrenokortikoidní hormony, salazosulfapyridin atd.).

Byly provedeny rozsáhlé studie metod potlačujících biologickou funkci savčí molekuly AILIM (ICOS) a zažívacích alergií a zánětlivých střevních onemocnění, se kterými je úzce spjata abnormálně fungující imunita trávicího traktu (konkrétně Crohnova choroba a kolitida - colitis ulcerosa apod.). Tyto studie vedly k poznatku, že farmaceutická činidla, která regulují funkci molekuly AILIM, významně potlačují zánětlivá střevní onemocnění (Crohnovu chorobu a kolitidu - colitis ulcerosa apod.). Díky těmto poznatkům byl předkládaný vynález sepsán.

Farmaceutická sloučenina předkládaného vynálezu je užitečná zejména jako léčivo, které dokáže ovlivňovat různé reakce v in vivo systémech, kde je přenos kostimulačního signálu buňkám exprimujících AILIM zprostředkován molekulou AILIM 0'edná se např. o proliferaci buněk exprimujících AILIM, produkci cytokinů buňkami exprimujícími AILIM, imunitní cytolýzu nebo buněčnou smrt, apoptózu nebo snížení počtu buněk exprimujících AILIM a aktivitu k indukování buněčné toxicity závislé na protilátkách proti buňkám exprimujících AILIM), a/nebo jako léčivo, které předchází vzniku a/nebo rozvinutí různých chorob, u kterých je přenos signálu zajišťován molekulou AILIM, a pro léčbu nebo profylaxi chorob.

Konkrétně může farmaceutická sloučenina předkládaného vynálezu ovlivňovat (potlačovat nebo podporovat) proliferaci buněk exprimujících AILIM, apoptózu, buněčnou smrt nebo snížení jejich počtu, nebo ovlivňuje imunitní cytolýzu nebo může ovlivňovat (potlačovat nebo podporovat) produkci cytokinů (např. interferonu γ nebo interleukinu 4) buňkami exprimujícími AILIM. Dále také sloučenina předkládaného vynálezu může předcházet různým podmínkám nutným ke vzniku onemocnění, které ·· ···· se spouští různými fyziologickými stavy, kde je signální transdukce zprostředkována molekulou AILIM. Také tato sloučenina usnadňuje léčbu nebo prevenci různých chorob.

Zvláštním provedením farmaceutických sloučenin tohoto vynálezu jsou farmaceutické sloučeniny obsahující látku indukující buněčnou smrt, apoptózu nebo snížení počtu buněk exprimujících AILIM.

Použitím farmaceutických sloučenin tohoto vynálezu se potlačují, předchází a/nebo léčí zažívací alergie a choroby, které jsou způsobeny porušenou imunitou trávicího traktu, konkrétně jde o zánětlivá střevní onemocnění (Crohnovu chorobu a kolitidu - colitis ulcerosa apod.).

Navíc farmaceutické sloučeniny tohoto vynálezu zlepšují léčebný efekt proti zánětlivým střevním onemocněním, zejména pokud se použijí v kombinaci sjiž používaným farmaceutickým činidlem předepisovaným k léčbě zánětlívých střevních onemocnění.

Konkrétně je předkládaný vynález popsán v následujících bodech 1) až 10).

1) Farmaceutická sloučenina na potlačení, léčbu nebo prevenci choroby, která vzniká v souvislosti s porušenou imunitou trávicího traktu, kde tato farmaceutická sloučenina obsahuje látku, která se vyznačuje tím, že má schopnost ovlivňovat signální transdukci pomocí molekuly, AILIM a farmaceuticky přijatelného nosiče.

2) Farmaceutická sloučenina z bodu 1), která se vyznačuje tím, že je schopná indukovat buněčnou smrt buněk exprimujících AILIM.

3) Farmaceutická sloučenina z bodu 1) nebo 2), která se vyznačuje tím, že zmíněnou chorobou je zánětlivé střevní onemocnění.

4) Farmaceutická sloučenina z bodu 3), která se vyznačuje tím, že zmíněným zánětlivým onemocněním je kolitida.

5) Farmaceutická sloučenina z bodu 3), která se vyznačuje tím, že zmíněným zánětlivým onemocněním je Crohnova choroba.

6) Farmaceutická sloučenina z bodu 1) nebo 2), která se vyznačuje tím, že zmíněnou chorobou je zažívací alergie.

7) Farmaceutická sloučenina jakéhokoliv z bodů 1) až 6), která se vyznačuje tím, že zmíněnou látkou je bílkovinná látka.

8) Farmaceutická sloučenina z bodu 3), která se vyznačuje tím, že obsahuje bílkovinnou látku vybranou ze skupiny zahrnující:

·· ····

a) protilátku, která se váže na AILIM nebo část této protilátky

b) polypeptid obsahující celou extracelulární oblast AILIM nebo její část;

c) fúzní polypeptid, obsahující celou nebo část extracelulární oblasti AILIM a celou nebo část konzervované oblasti těžkého řetězce imunoglobulinu; a,

d) polypeptid, který se váže k AILIM.

9) Farmaceutická sloučenina jakéhokoliv z bodů 1) až 6), která se vyznačuje tím, že zmíněnou látkou je látka nebílkovinné povahy.

10) Farmaceutická sloučenina z bodu 9), která se vyznačuje tím, že látka nebílkovinné povahy je RNA, DNA nebo chemicky vyrobená sloučenina.

Předkládaný vynález je do detailu popsán níže. Definují se zde termíny a metody, které jsou třeba na výrobu látek používaných v tomto vynálezu.

V tomto vynálezu se pod pojmem „savec“ rozumí člověk, kráva, koza, králík, myš, potkan, křeček a morče; přednostně se jím rozumí člověk, kráva, myš, potkan nebo křeček a nejlépe pouze člověk.

„AILIM“ je zkratka z „aktivační indukovatelná lymfocytická imunomodulační molekula“ a označuje molekulu z povrchové membrány buněk savců, která má strukturu a funkci popsanou v předcházejících zprávách (J. Immunol., 166(1), p.1, 2001; J. Immunol., 165(9), p.5035, 2000; Biochem. Biophys. Res. Commun., 276(1), p.335, 2000; Immunity, 13(1), p.95, 2000; J. Exp. Med., 192(1), p.53, 2000; Eur. J. Immunol., 30(4), p.1040, 2000; Int. Immunol., 12(1), p.51, 2000; Nátuře, 397(6716), p.263, 1999; GenBank Accession Number: BAA82129 (člověk); BAA82128 (potkan); BAA82127 (kurantní kmen potkana); BAA82126 (myš)).

Přednost se dává zejména termínu, který popisuje AILIM odvozenou od člověka (např. International Immunology, Vol. 12, No. 1, p.51-55, 2000; GenBank Accession Number: BAA82129).

Tento druh AILIM se také nazývá ICOS (Nátuře, Vol.397, No.6716, p.263-266, 1999) nebo JTT-1 antigen/JTT-2 antigen (Nepřezkoumaný publikovaný japonský patent č. (JP-A) Hei 11-29599, International Patent Application No. WO98/38216) a tyto molekuly jsou jedna a tatáž molekula.

Navíc molekuly AILIM tohoto vynálezu obsahují aminokyselinové sekvence všech savců popsaných v předešlých zprávách a zejména se dává přednost polypeptidu, který má stejnou aminokyselinovou sekvenci jako lidská AILIM molekula. Dále jsou součástí AILIM tohoto vynálezu i lidské AILIM mutanty, podobné již dříve popsaným AILIM mutantám z potkanů (GenBank Accession Number: BAA82127).

0000 • «··· 0 «0

0 0· · ·

V tomto vynálezu výraz „mající v podstatě stejnou aminokyselinovou sekvenci“ znamená, že AILIM předkládaného vynálezu zahrnuje polypeptidy s aminokyselinovými sekvencemi, u kterých bylo několik aminokyselin, většinou 1 až 10, přednostně 1 až 5 aminokyselin, vyměněno, odstraněno a/nebo modifikováno, dále zahrnuje polypeptidy s aminokyselinovými sekvencemi, u kterých bylo několik aminokyselin, většinou 1 až 10, přednostně 1 až 5, přidáno, a to tak, že tyto polypeptidy mají v podstatě stejné biologické vlastnosti jako polypeptidy s aminokyselinovými sekvencemi popsanými v předchozích zprávách.

Tyto substituce, delece nebo inzerce aminokyselin se provádí podle běžných metod (Experimental Medicine: SUPPLEMENT, “Handbook of Genetic Engineering” (1992), atd.).

Příkladem jsou metody jako např. mutageneze řízená syntetickým oligonukleotidem (mezerová duplexová metoda), bodová mutageneze, u které se bodová mutace zanese pomocí náhodného ošetření dusitanem nebo siřičitanem, metoda, při které se deleční mutanta připraví enzymem Bal31 apod., kazetová mutageneze, metoda skenování linkerů, misinkorporační metoda, metoda primerů s mutací, metoda syntézy DNA segmentu atd.

Mutageneze řízená syntetickým oligonukleotidem (mezerová duplexová metoda) se provádí kupříkladu následujícím způsobem. Oblast, kterou si přejeme mutovat, se klonuje do fágového vektoru M13, který má amber mutaci. Takto připravíme jednořetězcovou fágovou DNA. Poté, co se RF I DNA vektoru M13 linearizuje pomocí restrikčních enzymů, se DNA smíchá s jednořetězcovou fágovou DNA popsanou výše, směs se denaturuje a řetězce se nechají znovu spojit tak, že vznikne struktura „duplexové DNA s mezerou“. Poté se k této DNA přidá syntetický oligonukleotid sjiž zavedenými mutacemi a směs se nechá hybridizovat. Reakcí s DNA polymerázou a DNA lipázou se připraví kruhovitá uzavřená dvojřetězcová DNA. Touto DNA se pak transfekují mutantní buňky E. coli mutS, které nemají tzv. mismatch opravnou aktivitu. Buňky E. coli bez schopnosti suprese se infikují narostlými tágy a sledují se pouze ty transformanty, které nemají amber mutaci.

Metoda, kterou se za použití dusitanu zavádí bodová mutace, využívá následující princip. Pokud se DNA ošetří dusitanem, dojde k tomu, že se nukleotidy deaminují a adenin se tak mění na hypoxantin, cytosin na uráčil a guanin na xantin. Pokud se takto deaminovaná DNA vnese do buněk, dvojice A-T a G-C se zamění za dvojice G-C a A-T, protože hypoxantin, uráčil a xantin se při DNA replikaci párují fcfc fc··· • · s cytosinem, adeninem a thyminem. Jednořetězcové DNA fragmenty, ošetřené dusitanem se nechají hybridizovat s „duplexovou DNA s mezerou“ a poté jsou kurantní kmeny odděleny úplně stejným způsobem jako při mutagenezi řízené syntetickým oligonukleotidem (mezerová duplexová metoda).

Termín „cytokin“, použitý např. ve výrazu „produkce cytokinů buňkami exprimujícími AILIM“ předkládaného vynálezu znamená libovolný cytokin, produkovaný buňkami, které exprimují AILIM (zejména T-buňky).

Příklady T-buněk jsou T-buňky Th1 nebo Th2 typu a cytokin předkládaného vynálezu je konkrétně cytokin produkovaný T-buňkami Th1 typu a/nebo libovolný cytokin produkovaný T-buňkami Th2 typu.

Cytokiny produkované T-buňkami Th1 typu zahrnují IFN-γ, IL-2, TNF, IL-3 a cytokiny produkované T-buňkami Th2 typu zahrnují IL-3, IL-4, IL-5, IL-10 a TNF (Cell, Vol.30, No.9, pp.343-346, 1998).

Termín „látka“, „látka, která má schopnost ovlivňovat signální transdukci zprostředkovanou pomocí AILIM“, „látka, která má schopnost zastavit proliferaci buněk exprimujících AILIM nebo zastavit produkci cytokinů buňkami exprimující AILIM“ nebo „látka, která má schopnost indukovat buněčnou smrt buněk exprimujících AILIM“, použité v předkládaném vynálezu, označují látku, která se v přírodě běžně vyskytuje nebo uměle připravenou libovolnou látku.

Nejvhodnější provedení „látky“ je podle předkládaného vynálezu látka, která má schopnost indukovat buněčnou smrt, apoptózu nebo snížení počtu buněk exprimujících AILIM.

V tomto vynálezu znamená výraz „signální transdukce zprostředkovaná molekulou AILIM“ signální transdukci přes AILIM, která vede ke změně jakéhokoli výše popsaného fenotypu v buňkách exprimujících AILIM nebo v následujících příkladech (jedná se např. o změnu v buněčné proliferaci, aktivaci buněk, inaktivaci buněk, apoptóze a/nebo o změny ve schopnosti buněk exprimujících AILIM produkovat libovolný cytokin).

„Látka“ se většinou dělí na „látku bílkovinné povahy“ a „látku nebílkovinné povahy“.

Příkladem „bílkovinných látek“ jsou následující polypeptidy, protilátky (polyklonální protilátky, monoklonální protilátky nebo části monoklonálních protilátek).

Pokud je látka protilátkou, je vhodné, aby to byla protilátka monoklonální. Pokud je látka monoklonální protilátkou, jedná se nejen o savčí odvozené ·· ···· monoklonální protilátky, ale také rekombinantní chimérické monoklonální protilátky, rekombinantní lidské monoklonální protilátky a lidské monoklonální protilátky.

Pokud je látka polypeptid, pak zahrnuje polypeptidy, polypeptidické fragmenty (oligopeptidy), fúzní polypeptidy a chemicky modifikované polypeptidy. Příkladem oligopeptidů jsou peptidy obsahující 5 až 30 aminokyselin, s výhodou 5 až 20 aminokyselin. Chemická modifikace se navrhuje za různým účelem, např. aby se zvýšil poločas života protilátek v krvi v případě in vivo podávání nebo aby se zvýšila odolnost proti rozpadu nebo aby se zvýšila absorpce v trávicím traktu při orálním podávání.

Příklady polypeptidů jsou následující:

1) Polypeptid obsahující celou nebo část extracelulární oblasti AILIM

2) Fúzní polypeptid obsahující celou nebo část extracelulární oblasti AILIM a celou nebo část konzervované oblasti těžkého řetězce imunoglobulinu; nebo

3) Polypeptid, který se váže na AILIM

Příklady „látek nebílkovinné povahy“ jsou DNA, RNA a chemicky připravené sloučeniny.

V tomto vynálezu termín „DNA“ znamená „DNA obsahující částečnou nukleotidovou sekvenci antisens DNA, navrženou na základě nukleotidové sekvence DNA (včetně cDNA a genomové DNA), která kóduje výše popsanou AILIM (s výhodou je to lidská AILIM) nebo stejně připravená, ale chemicky modifikovaná DNA“, která se používá jako antisens DNA léčivo. Konkrétně antisens DNA inhibuje transkripci DNA kódující AILIM na mRNA nebo translaci mRNA na protein tím, že hybridizuje s DNA nebo RNA kódující AILIM.

Výraz „částečná nukleotidová sekvence“, jak se k němu odkazuje v tomto vynálezu, je nukleotidová sekvence obsahující libovolný počet nukleotidů v libovolné oblasti. Částečná aminokyselinová sekvence obsahuje 5 až 100 po sobě jdoucích nukleotidů, lépe 5 až 70 po sobě jdoucích nukleotidů, ještě lépe 5 až 50 po sobě jdoucích nukleotidů a vůbec nejlépe 5 až 30 po sobě jdoucích nukleotidů.

Pokud se DNA použije jako antisens DNA léčivo, DNA sekvence se částečně chemicky modifikuje tak, aby se prodloužil poločas života (stabilita) v krvi při podávání pacientům, aby se zvýšila prostupnost intracytoplasmatické membrány pro DNA nebo aby se zvýšila odolnost proti degradaci nebo absorpci v trávicím traktu v případě orálního podávání. Chemická modifikace zahrnuje například modifikaci ·· Φ··· fosfátové vazby, ribózy, nukleotidu, cukerného zbytku a 3'konce a/nebo 5' konce ve struktuře oligonukleotidu DNA.

Změny fosfátových vazeb zahrnují například konverzi jedné nebo více vazeb na fofodiesterové vazby (D-oligo), foforothioátové vazby, foforodithionátové vazby (Soligo), methylfosfonátové (MP-oligo) vazby, fosforoamidátové vazby, nefosfátové vazby nebo methylfosfothioátové vazby nebo jejich kombinace. Modifikace ribózy zahrnuje například konverzi na 2'-fluororibózu nebo 2'-O-methylribózu. Modifikace nukleotidu zahrnuje například konverzi na 5-propynyluracil nebo 2-aminoadenin.

V tomto vynálezu termín „RNA“ znamená „RNA obsahující částečnou nukleotidovou sekvenci antisens RNA, navrženou na základě nukleotidové sekvence RNA, která kóduje výše popsanou AILIM (vhodně je to lidská AILIM) nebo stejně připravená, ale chemicky modifikovaná RNA“, která se používá jako antisens RNA léčivo. Antisens RNA inhibuje transkripci DNA kódující AILIM na mRNA nebo translaci mRNA na protein tím, že hybridizuje s DNA nebo RNA kódující AILIM.

Výraz „částečná nukleotidové sekvence“, jak se v tomto vynálezu používá, je částečná nukleotidové sekvence obsahující libovolný počet nukleotidů v libovolné oblasti. Částečná aminokyselinová sekvence obsahuje 5 až 100 po sobě jdoucích nukleotidů, lépe 5 až 70 po sobě jdoucích nukleotidů, ještě lépe 5 až 50 po sobě jdoucích nukleotidů a vůbec nejlépe 5 až 30 po sobě jdoucích nukleotidů.

Antisens RNA sekvence se částečně chemicky modifikuje tak, aby se prodloužil poločas života (stabilita) v krvi při podávání RNA pacientům, aby se zvýšila prostupnost intracytoplasmatické membrány pro RNA nebo aby se zvýšila odolnost proti degradaci nebo absorpci v trávicím traktu v případě orálního podávání RNA. Chemická modifikace zahrnuje takové modifikace, jako se uplatnily u výše popsané antisens DNA.

Příklady „chemicky syntetizovaných sloučenin“ jsou libovolné sloučeniny kromě výše uvedených DNA, RNA a látek bílkovinné povahy, které mají molekulovou hmotnost 100 až 1000 nebo méně, s výhodou je to sloučenina s molekulovou hmotností 100 až 800, nejlépe však s molekulovou hmotností 100 až 600.

Výraz „polypeptid“, obsažený ve výše uvedené definici „látky“, označuje část (fragment) polypeptidického řetězce tvořícího AILIM (přednostně lidskou AILIM), pokud možno celou nebo část extracelulární oblasti polypeptidu tvořícího AILIM (1 až 5 aminokyselin je možno přidat na N-konec a/nebo C-konec oblasti).

·· φφφφ

ΦΦΦ ΦΦΦ • ΦΦΦ φφφφ φ φ ΦΦΦ φφφφ φ φ φ φ φ φ φφφφ φφ φφ

AILIM je podle předkládaného vynálezu transmembránová molekula, která jde napříč buněčnou membránou a je složena z 1 nebo 2 polypeptidických řetězců.

V tomto vynálezu znamená výraz „transmembránový protein“ takový protein, který je spojen s buněčnou membránou přes hydrofobní peptidickou oblast, která jde napříč lipidickou dvojvrstvou buď jednou nebo vícekrát, a jehož struktura je jako celek tvořena třemi hlavními oblastmi, a to - extracelulární oblastí, transmembránovou oblastí a cytoplazmatickou oblastí, tak jak je to známé u mnoha receptorů nebo membránových povrchových molekul. Takový transmembránový protein tvoří receptor nebo povrchovou membránovou molekulu buď jako monomer nebo jako homodimer, heterodimer nebo oligomer propojený s jedním nebo více řetězci, které mají stejnou nebo rozdílnou aminokyselinovou sekvenci.

V tomto vynálezu znamená výraz „ extracelulární oblast“ celou nebo kus částečné struktury (částečné oblasti) celkové struktury výše zmíněného transmembránového proteinu, kde se částečná struktura nachází vně membrány. Jinými slovy to označuje část nebo celou oblast transembránového proteinu kromě oblasti včleněné do membrány (transmembránová oblast) a oblasti v cytoplazmě, která za transmembránovou oblastí následuje (cytoplazmatická oblast).

Termín „fúzní protein“, který je součástí výše uvedeného výrazu „látka bílkovinné povahy“, znamená fúzní polypeptid, obsahující celou nebo část extracelulární oblasti polypeptidu tvořícího AILIM (přednostně lidský AILIM) a „celou nebo část konzervované oblasti těžkého řetězce imunoglobulinu (Ig, přednostně lidský Ig)“. Pokud je to možné, fúzní polypeptid je takový fúzní polypeptid, který obsahuje extracelulární oblast AILIM a část konzervované oblasti těžkého řetězce lidského IgG a ještě lépe fúzní polypeptid extracelulární oblasti AILIM a Fc oblasti lidského IgG imunoglobulinu, který obsahuje oblast pantu, Ch2 doménu a Ch3 doménu. V případě IgG je vhodné použít lgG1, v případě AILIM je vhodné použít lidský myší nebo potkaní AILIM (nejlépe však lidský).

Výraz „celou nebo část konzervované oblasti těžkého řetězce imunoglobulinu (Ig)“ jak se používá v tomto vynálezu, označuje konzervovanou oblast nebo Fc oblast těžkého řetězce imunoglobulinu odvozeného od lidského (H řetězec) nebo jeho část. Imunoglobulin může být jakýkoliv imunoglobulin patřící do jakékoli třídy či podtřídy. Konkrétně imunoglobulin zahrnuje IgG imunoglobuliny (lgG1, lgG2, lgG3 a lgG4), IgM, imunoglobuliny IgA (lgA1 a lgA2) IgD a IgE. Přednostně je imunoglobulin IgG (lgG1, lgG2, lgG3 a lgG4) nebo IgM. Příklady konkrétních vhodných imunoglobulinů ·· *···

·.

předkládaného vynálezu jsou ty, které patří do skupiny imunoglobulinů IgG odvozených od lidských (lgG1, lgG2, lgG3 a lgG4).

Imunoglobulin má strukturní jednotku ve tvaru písmene Y, která je tvořena čtyřmi řetězci - dvěma homologickými lehkými řetězci (L řetězce) a dvěma homologickými těžkými řetězci (H řetězce), které jsou propojeny přes disulfidické můstky (S-S vazby). Lehký řetězec je tvořen variabilní oblastí lehkého řetězce (V_L) a konzervativní oblastí lehkého řetězce (Cl). Těžký řetězec se skládá z variabilní oblasti těžkého řetězce (Vh) a konzervativní oblasti těžkého řetězce (Ch).

Konzervativní oblast těžkého řetězce se skládá z několika domén, které mají aminokyselinové sekvence, patřící unikátně k jednotlivým třídám (IgG, IgM, IgA, IgD a IgE) a jejich podtřídám (lgG1, lgG2, lgG3 a lgG4, lgA1 a lgA2).

Těžký řetězec imunoglobulinů IgG (lgG1, lgG2, lgG3 a lgG4) se skládá z domén Vh, Ch1, oblasti pantu, Ch2 domény a Ch3 domény, bráno od N-konce.

Podobně se těžký řetězec lgG1 imunoglobulinů skládá z domén Vh, Cy-|1, oblasti pantu, Cyi2 domény a Cyi3 domény, bráno od N-konce. Těžký řetězec lgG2 se skládá z domén Vh, Cy₂1, oblasti pantu, Cy₂2 domény a Cy₂3 domény, bráno od N-konce. Těžký řetězec lgG3 se skládá z domén Vh, Cy₃1, oblasti pantu, Cy₃2 domény a Cy₃3 domény, bráno od N-konce. Těžký řetězec lgG4 se skládá z domén Vh, Cy₄1, oblasti pantu, Cy₄2 domény a Cy₄3 domény, bráno od N-konce.

Těžký řetězec IgA se skládá z domén V_H, Ca1, oblasti pantu, Ca2 domény a Ca3 domény, bráno od N-konce.

Podobně, těžký řetězec lgA1 se skládá z domén Vh, Cai1, oblasti pantu, Cai2 domény a Ca-|3 domény, bráno od N-konce. Těžký řetězec lgA2 se skládá z domén Vh, Ca₂1, oblasti pantu, Ca₂2 domény a Ca₂3 domény, bráno od N-konce.

Těžký řetězec IgD se skládá z domén Vh, C31, oblasti pantu, C52 domény a C53 domény, bráno od N-konce.

Těžký řetězec IgM se skládá z domén V_H, Cp1, Cp2, Cp3 domény a Cp4 domény, bráno od N-konce, a nemá žádnou oblast pantu, tak jak je to např. u IgG, IgA a IgD.

Těžký řetězec IgE se skládá z domén V_H, Cs1, Ce2, Ce3 domény a Cs4 domény, bráno od N-konce, a nemá žádnou oblast pantu, tak jak je to např. u IgG, IgA a IgD.

• 444

444 * 4

4444

Pokud se například IgG ošetří papainem, je štěpen spíše na N-koncové straně mimo disulfidických můstků, které se vyskytují v oblasti pantu, kde se disulfidické vazby pojí se dvěma těžkými řetězci a tvoří tak dva homologické Fab, u nichž je část těžkého řetězce, složená z Vh a Ch1, propojena s jedním lehkým řetězcem přes disulfidickou vazbu; a jeden Fc, u kterého jsou fragmenty dvou homologických těžkých řetězců původně pantové oblasti, Ch2 a Ch3 doména, spojeny disulfidickými vazbami (Viz “Immunology lllustrated”, originál 2nd ed., Nankodo, pp.65-75 (1992); a “Focus of Newest Medical Science ‘Recognition Mechanism of Immune System’”, Nankodo, pp.4-7 (1991); apod.).

Konkrétně výraz „část konzervativní oblasti těžkého řetězce imunoglobulinu“, zmíněný již výše, označuje část konzervativní oblasti těžkého řetězce imunoglobulinu, která má strukturní charakteristiky, o kterých byla řeč již dříve a s výhodou je to konzervativní oblast bez C1 domény nebo Fc oblast. Konkrétně příkladem je oblast skládající se z pantové oblasti, C2 domény a C3 domény každého z imunoglobulinů IgG, IgA a IgD, nebo je to oblast skládající se z C2 domény, C3 domény a C4 domény každého a imunoglobulinů IgM a IgE. Zvlášť vhodným příkladem je Fc oblast IgG 1, která je odvozená od lidského imunoglobulinu.

Výše zmíněný fúzní polypeptid má výhodu zejména vtom, že je velmi jednoduché ho purifikovat afinitní sloupcovou chromatografií za použití proteinu A, který se váže specificky k fragmentu imunoglobulinu, protože fúzní polypeptid předkládaného vynálezu obsahuje jako fúzního partnera část konzervativní oblasti (např. Fc) imunoglobulinu, jako je např. výše zmíněný IgG. Navíc vzhledem k tomu, že jsou k dispozici různé protilátky proti Fc různých imunoglobulinů, snadno se tak pro fúzní polypeptid provede důkaz pomocí protilátek proti Fc.

„Polypeptid, který se váže na AILIM“ je obsažen ve výrazu „polypeptid“, zahrnutý do výše uvedené definice „látka“.

Konkrétním příkladem „polypeptidu, který se váže na AILIM“, je celý nebo část polypeptidu, tvořící známou molekulu zvanou B7h, B7RP-1, GL50 nebo LICOS, což je ligand, interagující s AILIM (Nátuře, Vol.402, No.6763, pp.827-832, 1999; Nátuře Medicine, Vol.5, No.12, pp.1365-1369, 1999; J. Immunology, Vol.164, pp.1653-1657, 2000; Curr. Biol., Vol.10, No 6, pp.333-336, 2000).

Přednostně je polypeptid takový polypeptid, který obsahuje celou nebo část extracelulární oblasti výše uvedeného ligandu (B7h, B7RP-1, GL50, LICOS) nebo fúzní polypeptid obsahující polypeptid a celou nebo část konzervované oblasti •9 ···· • ··*· * ·· ·· · ······ · • «·· · · · · · • · · · · * · · · • · · · ···· ··· ··· ··« ···· ·· *· těžkého řetězce imunoglobulinu (vhodný je lidský imunoglobulin). V tomto vynálezu výrazy „extracelulární oblast“ a „konzervovaná oblast těžkého řetězce imunoglobulinuů mají stejný význam jako bylo zmíněno již výše.

Polypeptidy, části polypeptidů (fragmenty) a výše zmíněné fúzní polypetidy se vyrábí nejen pomocí technologie rekombinantní DNA, jak je uvedeno níže, ale také způsobem známým mezi odborníky, např. chemickou syntézou nebo metodou buněčné kultury nebo jejich obměnami.

„Protilátka“ předkládaného vynálezu je polyklonální protilátka (antisérum) nebo monoklonální protilátka proti savčí AILIM (nejvhodněji proti lidské AILIM), definované již dříve, s výhodou je to monoklonální protilátka.

Konkrétně protilátka je látka, která má schopnost inhibovat proliferací buněk exprimujících AILIM tak, že se váže na AILIM nebo že inhibuje produkci interferonu-γ nebo interleukinu-4 buňkami exprimujícími AILIM díky vazbě na AILIM.

Protilátky předkládaného vynálezu jsou přirozené protilátky získané imunizací savců jako jsou myši, potkani, křečci, morčata a králíci antigenem, jako jsou buňky (normální buňky, buněčné linie, nádorové buňky apod.), které exprimují AILIM předkládaného vynálezu, transformanty připravené technologií rekombinantní DNA tak, aby na jejich povrchu docházelo k nadprodukci molekuly AILIM, polypeptidy tvořící AILIM nebo výše zmíněné fúzní polypeptidy obsahující polypeptid AILIM nebo extracelulární oblast AILIM. Mezi protilátky předkládaného vynálezu také patří chimérické protilátky a umělé protilátky odvozené od lidských (CDR-roubované protilátky), které se vyrábí technologií rekombinantní DNA, a lidské protilátky, které jsou produkovány pomocí transgenních zvířat produkujících lidské protilátky.

Monoklonální protilátky zahrnují ty, které mají jeden izotyp ze skupiny IgG, IgM, IgA, IgD nebo IgE. Vhodné jsou zejména IgG a IgM.

Polyklonální protilátky (antiséra) nebo monoklonální protilátky se vyrábí známými metodami. Konkrétně se savec, např. myš, potkan, křeček, morče, králík, kočka, pes, prase, koza, kůň nebo kráva, vhodnější je myš, potkan, křeček, morče nebo králík, imunizuje výše zmíněným antigenem a pokud je to nutné, s Freundovým adjuvans.

Polyklonální protilátka se získává ze séra imunizovaných zvířat. Monoklonální protilátky se vyrábí následujícím způsobem. Nejprve se připraví hybridomy. Ty se získají z buněk imunizovaných zvířat, které produkují protilátky a myelomové buňky, které nejsou schopné produkovat autoprotilátky. Hybridomy se klonují a hledají se ty • · · · · · klony, které produkují monoklonální protilátky a které vykazují specifickou afinitu k antigenu použitém pro imunizaci savce.

Konkrétně se monoklonální protilátky vyrábí následujícím způsobem. Imunizace se provádí jednou či vícekrát injekcí nebo implantací výše zmíněné protilátky jako imunogenu , pokud je to nutné s Freundovým adjuvans. Imunizace se provádí subkutánně, do svalu, do žíly, přes polštářek chodidla nebo intraperitonálně u savců jiných než je člověk, konkrétně u myši, potkana, křečka, morčete nebo králíka, zejména je vhodná myš, potkan nebo křeček (včetně transgenních zvířat vyšlechtěných speciálně k produkci protilátek odvozených z jiných savců, příkladem je transgenní myš produkující lidské protilátky, o které bude zmíněno níže). Většinou se imunizace opakuje jednou až čtyřikrát, jeden až čtrnáct dní po první imunizaci. Frekvence a interval imunizací se musí řádně naplánovat v závislosti na tom, jaký se například použije imunogen.

Hybridomy, které produkují monoklonální protilátky, se připraví metodou Kóhlera a Milsteina (Nátuře, Vol.256, pp.495-497 (1975)) nebo odvozenou metodou. Konkrétně se hybridomy připraví fúzí buněk ze sleziny, lymfatických uzlin, kostní dřeně nebo mandlí, které produkují protilátky a které se získávají ze savců, jiných než je člověk, imunizovaných tak, jak bylo popsáno výše, vhodné jsou zejména buňky ze sleziny, s buňkami myelomu, které nejsou schopné produkovat autoprotilátky a které jsou odvozeny s výhodou ze savců jako myš, potkan, morče, křeček, králík nebo člověk nebo ještě výhodněji ze savců jako je myš, potkan nebo člověk.

Například pro fúzi jsou velmi vhodné buňky myelomu odvozené z myši P3/X63-AG8.653 (653), P3/NSI/1-Ag4-1 (NS-1), P3/X63-Ag8.U1 (P3U1), SP2/0Ag14 (Sp2/0, Sp2), PAI, FO, NSO nebo BW5147, buňky myelomu odvozené od potkana 210RCY3-Ag.2.3. nebo buňky myelomu odvozené od člověka U-266AR1, GM1500-6TG-A1-2, UC729-6, CEM-AGR, D1R11 nebo CEM-T15.

Hybridomy produkující protilátky se testují při kultivaci hybridomů například na mikrotitračních destičkách měřením reaktivity supernatantu z kultury v jamkách, ve kterých je zjištěn růst, k imunogenu, který se použil pro výše zmíněnou imunizaci, například enzymatickým imunotestem, jako je např. RIA a ELISA.

Monoklonální protilátky se získávají v systémech in vitro při kultivaci hybridomů nebo in vivo při kultivaci v ascitové tekutině myši, potkana, morčete nebo křečka, s výhodou pak zejména myši nebo potkana a ještě výhodněji pouze myši.

• ·

Protilátky se pak izolují z výsledného supernatantu kultury nebo z ascitové tekutiny savce.

Kultivace hybridomů in vitro je závislá zejména na vlastnosti kultivovaných buněk, objektu studia a na různých podmínkách kultivační metody. Používají se všeobecně známá živná média nebo jakákoliv živná média odvozená od známých základních médií vyvinutých pro růst, udržování a skladování hybridomů určených k produkci monoklonálních protilátek do supernatantu kultury.

Příkladem bazálního média je médium s nízkým obsahem vápníku, jako je Ham'F12 médium, MCDB153 médium nebo MEM médium s nízkou koncentrací vápníku. Nebo média s vysokým obsahem vápníku jako je MCDB104 médium, MEM médium, D-MEM médium, RPMI1640 médium, ASF104 médium nebo RD médium. Základní média kromě toho mohou obsahovat například sérum, hormony, cytokiny a/nebo různé anorganické nebo organické látky v závislosti na tom, za jakým účelem se hybridomy budou kultivovat.

Monoklonální protilátky se izolují a čistí ze supernatantu kultury nebo výše zmíněné ascitové tekutiny srážením pomocí nasyceného síranu amonného, metodou euglobulinového srážení, metodou kyseliny kapronové a kaprylové a afinitní chromatografií (DEAE nebo DE52) za pomoci anti-imunoglobulinového sloupce nebo sloupce s proteinem A.

„Chimérická rekombinantní monoklonální protilátka“ je monoklonální protilátka, připravená pomocí genového inženýrství a konkrétně označuje chimérickou protilátku jako je myší/lidská chimérická monoklonální protilátka, jejíž variabilní regiony jsou odvozené od imunoglobulinu savce jiného než je člověk (myš, potkan, křeček atd.) a jejíž konzervované domény jsou odvozené od lidského imunoglobulinu.

Konzervovaná oblast odvozená od lidského imunoglobulinu má aminokyselinovou sekvenci, která je unikátní pro každý izotyp jako je IgG (lgG1, lgG2, lgG3, lgG4), IgM, IgA, IgD a IGE. Konzervovaná oblast rekombinantní chimérické monoklonální protilátky je odvozená od lidského imunoglobulinu, který může patřit k jakémukoli isotypu. Vhodné je, aby se jednalo o konzervovanou doménu lidského IgG imunoglobulinu.

Chimérická monoklonální protilátka se vyrábí například následujícím způsobem. Není však nutné proto říkat, že je výroba protilátky vázána pouze a výlučně na tuto metodu.

Myší/lidská monoklonální protilátka se připraví dle Experimental Medicíně: SUPPLEMENT, Vol. 1.6, No. 10 (1988); a přezkoumaného publikovaného japonského patentu č. (JP-B) Hei 3-73280. Konkrétně se připraví vložením Ch genu (C gen kódující konzervovanou oblast H řetězce), který se získá z DNA kódující lidský imunoglobulin za aktivními geny V_H (přeskupené VDJ geny kódující variabilní oblast H řetězce), které se získají z DNA kódující myší monoklonální protilátku izolovanou z hybridomu produkujícího myší monoklonální protilátku a C_L genu (C gen kódující konzervovanou oblast L řetězce), který se získá z DNA kódující lidský imuoglobulin v oblasti za aktivními geny Vl (přeskupené VJ geny kódující variabilní oblast L řetězce), které se získají z DNA kódující myší monoklonální protilátku izolovanou z hybridomu, do stejného vektoru nebo odlišného vektoru tak, aby docházelo k expresi. Poté následuje transformace hostitelských buněk expresním vektorem a kultivace transformantů.

Konkrétně se nejprve z hybridomů, produkujících myší monoklonální protilátky, běžnými metodami izoluje DNA, ošetří se vhodnými restrikčními enzymy (např. EcoRI a Hind III), DNA se prověří na elektroforéze (použije se např. 0,7 % agarózový gel) a DNA se analyzuje Southern blotem. Poté, co se gel z elektroforézy nabarví, např. ethidiumbromidem, a vyfotografuje, se na gelu označí pozice standartu molekulové hmotnosti, gel se promyje dvakrát vodou a nechá se nasakovat 0,25M HCl po dobu 15 minut. Poté se gel na 10 minut ponoří do 0,4N roztoku NaOH za stálého jemného míchání roztoku. DNA se pak běžným způsobem přenese během 4 hodin na filtr. Filtr se poté promývá dvakrát 2x SSC. Poté, co se filtr dostatečně nechá vyschnout, peče se 3 hodiny při teplotě 75 °C. Poté se filtr ošetří 0,1x SSC/0,1% SDS po dobu 30 minut a teplotě 65 °C. Poté se nechá nasáknout v3xSSC/0,1% SDS. Získaný filtr se pak ošetří prehybridizačním roztokem v plastikovém sáčku po dobu 3 až 4 hodin a teplotě 65 °C.

Dále se do plastikového sáčku přidá DNA sonda značená ³²P a hybridizační roztok a vše se nechá reagovat při teplotě 65 °C po dobu 12 hodin. Po hybridizaci se filtr promyje roztokem o vhodné koncentraci solí, reakční teplotě a času (např. 2x SSC/0,1% SDS, při teplotě místnosti, 10 minut). Filtr se pak umístí do plastikového sáčku s malým množstvím 2x SSC a poté, co se sáček zapečetí, se filtr nechá vyvolávat.

Přeskupené VDJ a VJ geny, kódující H řetězec a L řetězec myší monoklonální protilátky, se určují pomocí Southern blotu, tak jak bylo uvedeno výše. Oblast, • ΦΦΦ • φ · φ · · · φ Φ * • ··· · · Φ 9 · • · Φ Φ φφφφ φ obsahující určený DNA fragment se oddělí na sacharózovém gradientu centrifugací a vloží se do fágového vektoru (např. Charon 4A, Charon 28, XEMBL3 a λΕΜΒΙ_4). Buňky E. coli (např. LE392 a NM539) jsou transformovány fágovým vektorem tak, aby se vytvořila genomická knihovna. Genomická knihovna se pak testuje pomocí hybridizační plakové techniky jako je např. Benton-Davisonova metoda (Science, Vol. 196, pp. 180-182 (1977)), která využívá vhodných sond (H řetězec J genu, L řetězec (k) J genu atd.) tak, aby byly získány pozitivní klony obsahující přeskupené VDJ geny nebo VJ geny. Vytvořením restrikční mapy a určením nukleotidové sekvence získaných klonů se potvrdí, zda byly opravdu získány geny obsahující požadovaný přeskupený Vh (VDJ) gen nebo V_L (VJ) gen.

Odděleně se izoluje lidský Ch gen a lidský Cl gen, určené pro chimerizaci. Například pokud se připravuje chimérická protilátka s lidským lgG1, izoluje se Cy1 gen jako Ch gen a Ck gen jako Cl gen. Tyto geny se izolují z lidské genomové knihovny s myším Cy1 genem a myším Ck genem, které odpovídají lidskému Cy1 a Ck genu, jako sondou. Výhodou je hlavně vysoká homologie mezi nukleotidovou sekvencí genu pro myší imunoglobulin a genem pro lidský imunoglobulin.

Konkrétně se z lidského λ Charon 4A Haelll-Alul genomové knihovny (Cell, Vol. 15, pp. 1157-1174 (1978)) izolují DNA fragmenty obsahující lidský Cy1 gen a pomocnou oblast, a to např. za pomoci sond - 3 kb fragmentu HindlII-BamHI fragmentu klonu Ig146 (Proč. Nati. Acad. Sci. USA, Vol.75, pp.4709-4713 (1978)) a 6,8 kb EcoRI fragmentu klonu MEP10 (Proč. Nati. Acad. Sci. USA, Vol.78, pp.474478 (1981)). Navíc, hned co se rozštěpí DNA lidských fetálních hepatocytů např. pomocí Hindlll a DNA se rozdělí podle velikosti na agarózové elektroforéze, vloží se do λ788 fragment velký 5,9 kb a poté se pomocí výše zmíněných sond izoluje lidský Cy1 gen.

Použitím takto získaného myšího genu Vh, myšího genu Vl, lidského genu Ch a lidského genu Cl, a po uvážení, kde je promotor a řídící oblast genu, se vloží lidský gen Ch za myší gen V_H a lidský C_L gen se vloží za myší Vl gen do expresního vektoru, jako je např. pSV2gpt nebo pSV2neo pomocí vhodných restrikčních enzymů a DNA ligázy poměrně běžnými metodami. V tomto případě se chimérické geny myší gen Vh/ lidský gen Ch a myší Vl gen/ lidský Cl gen mohou vkládat do stejného expresního vektoru nebo do odlišných expresních vektorů.

• · · · · ·

Takto připravené chimérické expresní vektor(y) s vloženým genem se vloží do myelomových buněk, které nejsou schopné produkovat protilátky, např. buňky P3X63.Ag8.653 nebo buňky SP210, metodou protoplastové fúze, DEAEdextranovou metodou, metodou fosforečnanu vápenatého nebo elektroporací. Transformanty se nechají růst na médiu obsahující jedovatou látku, proti které je ve vektoru zároveň vložen gen pro rezistenci, a tak se získají jen ty buňky, které produkují požadované chimérické monoklonální protilátky.

Požadované chimérické monoklonální protilátky se získávají ze supernatantu kultury těch buněk, které produkují protilátky.

„Monoklonální protilátka odvozená od lidských (CDR-roubovaná protilátka)“ předkládaného vynálezu označuje takovou protilátku, která se připraví pomocí genetického inženýrství a konkrétně to znamená monoklonální protilátku odvozenou od lidské, kde část nebo celá oblast, která určuje komplementaritu hypervariabilní oblasti, je odvozena od oblastí určující komplementaritu hypervariabilní oblasti u monoklonálních protilátek savců jiných než je člověk (myš, potkan, křeček atd.), základní oblasti variabilní části jsou odvozeny od základních oblastí variabilní části lidského imunoglobulinu a konzervovaná oblast je odvozena od konzervované oblasti imunoglobulinu odvozeného od lidského.

Oblasti určující komplementaritu hypervariabilní části se nachází v hypervariabilní oblasti variabilní části protilátky a jsou to tři části, které jsou přímo a komplementárně navázané na protilátku (jsou to zbytky určující komplementaritu, CDR1, CDR2 a CDR3). Oblasti, které tvoří kostru variabilní oblasti, jsou čtyři poměrně konzervované oblasti, které leží nad, pod nebo mezi třemi oblastmi určujícími komplementaritu (oblast tvořící kostru, FR1, FR2, FR3 a FR4).

Jinými slovy označení monoklonální protilátka odvozená od lidských znamená, že se všechny oblasti, mimo částí nebo celých oblastí určujících komplementaritu hypervariabilní oblasti monoklonální protilátky, která je savčí, ale jiná než lidská, nahradí jejich odpovídajícími oblastmi odvozenými od lidských imunoglobulinů.

Konzervovaná oblast odvozená od lidského imunoglobulinu má aminokyselinovou sekvenci unikátní pro každý izotyp jako je IgG (lgG1, lgG2, igG3, lgG4), IgM, IgA, IgD a IGE. Konzervovaná oblast monoklonální protilátky odvozené od lidské předkládaného vynálezu může být odvozená od lidského imunoglobulinu, patřící k jakémukoli izotypu. Přednostně je to konzervovaná oblast oblast lidského

IgG. Části tvořící kostru konzervované oblasti, odvozené od lidských imunoglobulinů, nejsou nijak omezeny.

Monoklonální protilátka odvozená od lidských se připraví například následovně. Není však nutné proto tvrdit, že je výroba protilátky vázána pouze a výlučně na tuto metodu.

Rekombinantní monoklonální protilátka odvozená od lidské a zároveň od myší protilátky se připraví pomocí metod genetického inženýrství, viz publikovaný japonský překlad mezinárodní publikace (JP-WA) No. Hei 4-506458 a JP-A Sho 62296890. Konkrétně se z hybridomu, který produkuje myší monoklonální protilátky, izoluje nejméně jeden myší gen pro CDR H řetězec a nejméně jeden myší gen pro CDR L řetězec odpovídající myšímu genu pro CDR H řetězec a z lidských imunoglobulinových genů se izoluje také gen pro lidský CDR H řetězec, kódující celou oblast kromě části lidského CDR H řetězce, který odpovídá myšímu CDR H řetězci uvedeném výše a gen pro lidský L řetězec, kódující celou oblast kromě části lidského CDR L řetězce, který odpovídá myšímu CDR L řetězci uvedeném výše.

Takto izolované myší geny pro CDR H řetězec a lidské geny pro H řetězec se vhodně vloží do vektoru tak, aby mohla probíhat exprese. Podobně se myší geny pro CDR L řetězec a lidské geny pro L řetězec vhodně vloží do odlišného vektoru tak, aby mohla probíhat exprese. Alternativně se mohou vložit myší gen(y) pro CDR H řetězec/ lidský(é) gen(y) pro H řetězec a myší gen(y) pro CDR L řetězec/ lidský(é) gen(y) pro L řetězec do stejného expresního vektoru tak, aby mohla probíhat exprese. Takto připraveným expresním vektorem se transformují hostitelské buňky a získají se tak transformanty, které produkují monoklonální protilátky odvozené od lidských. Kultivací transformantů se ze supernatantu kultury získá požadovaná monoklonální protilátka, odvozená od lidské.

Termín „lidská monoklonální protilátka“ označuje takový imunoglobulin, u kterého všechny oblasti, obsahující variabilní a konzervovanou oblast H řetězce a variabilní a konzervovanou oblast L řetězce tvořící imunoglobulin, jsou odvozeny z genů kódující lidský imunoglobulin.

Lidská protilátka (přednostně je to lidská monoklonální protilátka) se připraví různými běžně známými metodami, například stejným způsobem, jako se vyrábí polyklonální a monoklonální protilátky uvedené výše, a to antigenní imunizací transgenního zvířete, vyšlechtěného vložením nejméně jednoho lidského genu pro imunoglobulin do genového lokusu savce jiného než je člověk, např. myši.

• · · · · · • · · · · · · · · * • · · · · · · · · • ··· · · · · «

Transgenní myš určená k produkci lidských protilátek se například připraví tak, jak je popsáno v Nátuře Genetics, Vol.7, pp.13-21 (1994); Nátuře Genetics, Vol.15, pp.146-156 (1997); JP-WA Hei 4-504365; JP-WA Hei 7-509137; Nikkei Science, No.6, pp.40-50 (1995); WO94/25585; Nátuře, Vol.368, pp.856-859 (1994); and JPWA No. Hei 6-500233.

Navíc je možné použít v nedávné době vyvinutou metodu, kdy se protein, odvozený od lidského, získá z mléka transgenní krávy nebo prasete (Nikkei Science, pp.78-84 (April, 1997)).

Výraz „část protilátky“ označuje v předkládaném vynálezu částečnou oblast monoklonální protilátky jak bylo uvedeno výše. Konkrétně to označuje F(ab’)2, Fab’, Fab, Fv (variabilní fragment protilátky), sFv, dsFv (disulfidicky stabilizovaný Fv), nebo dAb (protilátka s jednou doménou) (Exp. Opin. Ther. Patents, Vol.6, No.5, pp.441456 (1996)).

„F(ab’)2“ a „Fab’“ se připraví ošetřením imunoglobulinů (monoklonální protilátky) proteázou jako je pepsin a papain a označují část protilátky vzniklé naštěpením imunoglobulinů v blízkosti disulfidických vazeb v pantové oblasti, která se nachází mezi dvěma H řetězci. Například papain štěpí IgG nad disulfidickými vazbami v pantové oblasti, která se nachází mezi dvěma H řetězci, tak, že vzniknou dva homologní fragmenty protilátky, u kterých je fragment L řetězce složený z Vl (variabilní oblast L řetězce) a Cl (konzervovaná oblast L řetězce) a fragment H řetězce složený zVh (variabilní oblast H řetězce) a Cny1 (γ1 oblast konzervované oblasti H řetězce) propojen C koncovou oblastí přes disulfidickou vazbu. Každý z takto vzniklých homologních fragmentů protilátky se nazývá Fab’. Pepsin štěpí IgG pod disulfidickými vazbami v pantových oblastech, nacházejících se mezi dvěma H řetězci a štěpením vzniká o něco větší fragment protilátky než výše uvedený fragment, u kterého jsou dva Fab' propojeny v pantové oblasti. Tento fragment protilátky se nazývá F(ab’)₂.

Výrazy „imunita trávicího traktu“, „gastrointestinální imunita“ a „slizniční imunita“ se v tomto vynálezu používají ve stejném významu.

Vhodným příkladem termínu „choroba, která doprovází narušenou imunitu trávicího traktu“ tohoto vynálezu je zánětlivé střevní onemocnění nebo trávicí alergie.

Vhodným příkladem termínu „zánětlivé střevní onemocnění“ tohoto vynálezu je kolitida (konkrétně colitis ulcerosa (UC)) nebo Crohnova choroba (CD), které mají následující vlastnosti.

·· ····

Zánětlivé střevní onemocnění (IBD) je buď kolitida (konkrétně colitis ulcerosa) anebo Crohnova choroba. Tato onemocnění se velmi často vyvíjí v mladém věku a je o nich známo, že jsou to chronická zánětlivá onemocnění, u kterých se často opakují remise a recidivy a které mají neznámé příčiny.

Crohnova choroba je takové onemocnění, při kterém se v celém zažívacím traktu od jícnu až k řitnímu otvoru vytváří chronické granulomatózní záněty a vřídky, zejména však v oblasti tenkého a tlustého střeva. Tato choroba se symptomaticky projevuje bolestmi břicha, průjmem, horečkou, abnormalitami okolo konečníku včetně hemeroidů a/nebo úbytkem váhy. Z histologického hlediska pak dochází k hromadnému průniku lymfocytů a vzniku nekaseózního epiteliálního granulomu, což napovídá hlavně na abnormální chování T-buněk a antigen-prezentujících buněk.

Kolitida (konkrétně colitis ulcerosa) je chronický zánět, který se vyvíjí místně v tlustém střevě. Zasahuje hlavně slizniční membránu a tvoří se boláky a hnisavá ložiska. Z histologického hlediska pak dochází k výraznému průniku lymfocytů, plazmatických buněk, makrofágů a ve slizniční membráně a slizniční lamina propria se objevují mastocyty, dále dochází ke vzniku kryptických vředů provázejících průnik neutrofilů a pohárkové buňky začnou zanikat.

Existující farmaceutická činidla užívaná k léčbě zánětlivých střevních onemocnění tohoto vynálezu se týkají jednoho či více farmaceutických činidel, klinicky předepisovaných k léčbě kolitidy (colitis ulcerosa apod.) a Crohnovy choroby a konkrétními příklady jsou adrenokortikoidní hormony a salazosulfapyridin.

Výraz „farmaceuticky přijatelný nosič“ tohoto vynálezu označuje masťový základ, rozpouštědlo, plnidlo, rozkladné činidlo, stabilizátor, konzervační látka, pufr, emulgátor, aromatická látka, barvivo, sladidlo, činidlo zvyšující viskozitu, příchuť, činidlo zvyšující rozpustnost nebo některé další přídavky. Použitím jednoho nebo více těchto nosičů se farmaceutická sloučenina může podat jako tableta, prášek, granule, injekce, roztok, kapsle, pastilka, elixír, suspenze, emulze, sirup atd.

Farmaceutická sloučenina se podává orálně nebo mimostřevně. Jiné formy mimostřevního podávání zahrnují vnější aplikaci roztoku, čípku a pesaru, které je možné běžně předepsat a které navíc obsahují jednu nebo více aktivních přísad.

Dávkování závisí na věku, pohlaví, váze a symptomech pacienta, účinnosti léčby, způsobu podávání léku, době podávání, druhu aktivní sloučeniny („látky“ podle předkládaného vynálezu, uvedené výše) obsažené ve farmaceutické sloučenině, atd.

• · · · · · ♦ · · ·.» · · ·

0· ♦ · · · · · · · • · · » · · ··«

Většinou se farmaceutická sloučenina podává dospělým v dávce 10 pg až 1000 pg (nebo 10 pg až 500 mg) při jednom podávání. V závislosti na různých podmínkách může být v některých případech nižší dávka, než je výše uvedeno, dostatečná, a v jiných případech je nutná naopak vyšší dávka.

V případě podávání injekcí se roztok připraví rozpuštěním protilátky v neškodném, farmaceuticky přijatelném nosiči, jako je např. fyziologický roztok nebo komerčně dostupná destilovaná voda určená výhradně pro injekce. Koncentrace se pohybuje v rozmezí 0,1 pg protilátky / ml nosiče až 10 mg protilátky / ml nosiče. Takto připravená injekce se může podávat lidským pacientům, u kterých je nutná léčba, v dávce v rozmezí 1 pg až 100 mg/ kg tělesné váhy, vhodněji v rozmezí 50 pg až 50 mg/ kg tělesné váhy, jednou nebo vícekrát denně. Příkladem vhodného způsobu podávání je medicínsky řádný způsob podávání, např. nitrožilní injekcí, subkutánní injekcí, intradermální injekcí, injekcí do svalu, intraperitonální injekcí apod. vhodná je zejména nitrožilní injekce.

Injekce se může připravit také jako suspenze nebo emulze rozpuštěním v rozpouštědle jiném než je voda (jako je např. propylenglykol, polyethylenglykol, rostlinný olej jako např. olivový olej a alkohol, např. ethanol).

Injekce se sterilizuje filtrací na filtru oddělující bakterie, smícháním s bakteriocidem nebo ozářením. Injekce se připravuje tak, aby byla vždy před použitím čerstvá. Konkrétně to znamená, že je vysušená vymražením na sterilní pevnou sloučeninu, která se rozpustí ve sterilní destilované vodě nebo v jiném rozpouštědle vždy až těsně před použitím.

Použitím farmaceutických sloučenin tohoto vynálezu se potlačují, léčí a/nebo předcházejí nemoci, které jsou způsobené narušenou imunitou trávicího traktu, konkrétně zánětlivé střevní onemocnění (Crohnova choroba a kolitida - colitis ulcerosa) a zažívací alergie.

Dále při použití farmaceutické sloučeniny tohoto vynálezu je možné zlepšit léčebný efekt existujících farmaceutických činidel, které se běžně předepisují k léčbě těchto zánětlivých onemocnění.

Krátký popis obrázků

Obr. 1 ukazuje supresivní efekt anti-AILIM protilátky na vznik zánětlivého střevního onemocnění, pokud se protilátka podává souvisle (před nástupem choroby nebo poté, co se choroba rozvine) a léčebný efekt na zánětlivé střevní onemocnění podáváním anti-AILIM protilátky, kde je indexem úbytek tělesné váhy, znak charakteristický pro kolitidu.

Obr. 2 je fotografie, která ukazuje stav tlustého střeva - normální myši, u které se zánětlivé střevní onemocnění nevyvinulo, nemocné myši, trpící zánětlivým střevním onemocněním a myši, u které byl nástup zánětlivého střevního onemocnění potlačen podáváním anti-AILIM protilátkou.

Obr. 3 ukazuje supresivní efekt anti-AILIM protilátky na vznik zánětlivého střevního onemocnění při souvislém podávání protilátky, kde je indexem úbytek tělesné váhy, znak charakteristický pro kolitidu.

·: kontrola negativní protilátky (n=20)

O: anti-AILIM/ICOS protilátka (n=20) □: anti-B7RP-1 (n=7) : podávání protilátky negativní kontroly BALB/c scid/scid myším, u kterých byly T buňky CD4⁺CD45RB^high jsou nahrazeny T buňkami CD4⁺CD45RB^|OW (n=7)

Obr. 4 ukazuje stupeň závažnosti kolitidy, vyjádřený histologickým počtem bodů.

Obr. 5 ukazuje počet CD4⁺ buněk, které proniknou do slizniční membrány (lamina propria) kolonu.

Obr. 6 ukazuje stupeň apoptózy buněk ve tkáních kolonu.

Obr. 7 ukazuje léčebný efekt podávání anti-AILIM protilátky (podávání začalo až poté, co se choroba rozvinula) na zánětlivé střevní onemocnění, kde je indexem úbytek tělesné váhy, znak charakteristický pro kolitidu.

·: kontrola negativní protilátky

O: anti-AILIM/ICOS protilátka

Obr. 8 ukazuje stupeň vážnosti kolitidy, vyjádřený histologickým počtem bodů.

Obr. 9 ukazuje počet CD4⁺ buněk, které proniknou do slizniční membrány (lamina propria) kolonu.

Obr. 10 ukazuje supresivní efekt souvislého podávání anti-AILIM protilátky na vznik zánětlivého střevního onemocnění, kde je indexem úbytek tělesné váhy, znak charakteristický pro kolitidu.

·: kontrola negativní protilátky (n=7)

O: anti-AILIM/ICOS protilátka (n=7)

Obr. 11 ukazuje stupeň vážnosti kolitidy, vyjádřený histologickým počtem bodů.

Obr. 12 ukazuje počet CD4⁺ buněk, které proniknou do slizniční membrány (lamina propria) kolonu.

Příklady

Předkládaný vynález je v následujících řádkách představen na příkladech, ale je samozřejmé, že tento vynález není limitován pouze následujícími příklady.

Příklad 1

Léčebný efekt na kolitidu u modelu myší kolitidy (klinická zkouška 1) (1-1) Zvířata

Byly použity BALB/c scid/scid myši, myši s vážnou imunodeficiencí (6 až 8 týdnů staré samice; CLEA Japonsko) a normální BALB/c myši (6 až 8 týdnů staří samci; CLEA Japonsko).

(1-2) Příprava anti-myší AILIM protilátky

Protilátka se připravila následujícím způsobem.

Použila se cDNA kódující úplnou aminokyselinovou sekvenci dříve popsané myší AILIM (Int. Immunol., Vol.12, No.1, p.51-55, 2000). Za použití běžných metod technologie genetické rekombinace se připravily transformované buňky, exprimující myší AILIM.

Transformované buňky byly homogenizovány a ultra-centrifugovány (100 OOOx g) a zbytek z centrifugace, který obsahoval frakci s buněčnými membránami, se oddělil a resuspendoval v PBS. Získaná frakce s buněčnými membránami pak byla podána injekcí spolu s úplným Freundovým adjuvans do polštářku chodidla Wistar potkanů, aby proběhla počáteční imunizace (den 0). Navíc se tato frakce podávala jako antigen do polštářku chodidla další 7. den, 14. den a 28. den. Dva dny po konečné imunizaci pak byly získány ze zvířat lymfatické uzliny.

Buňky lymfatických uzlin a buňky myšího myelomu PAI JCR No. B0113; Res. Disclosure, Vol.217, p.155, 1982) se poté smíchaly v poměru 5:1 a fúzí se za pomoci polyethylenglykolu 4000 (boehringer Manheim), jako fúzního činidla, připravil hybridom produkující monoklonální protilátky. Hybridom byl selektován kultivací na ASF104 médiu obsahující HAT (Ajinomoto), které dále obsahovalo 10% fetální bovinní sérum a aminopterin.

• · fcfc··

Poté byla měřena fluorescenční intenzita buněk obarvených reakcí supernatantu z kultury hybridomu s výše uvedenými transfekovanými rekombinantními myšími buňkami, které produkují AILIM, a poté reakcí těchto buněk s anti-krysí IgG protilátkou značenou FITC. Fluorescenční intenzita se měřila pomocí EPICS-ELITE průtokového cytometru, aby se potvrdila reaktivita produkovaných monoklonálních protilátek v supernatantu kultury hybridomů proti myší AILIM. Výsledkem bylo získání několika hybridomů, které produkovaly monoklonální protilátky, které reagovaly s myší AILIM.

Jeden z těchto hybridomů byl nazván „B10,5“. Tento hybridom (10⁶ až 10⁷ buněk/0,5 ml/myš) se podal injekčně intraperitonálně ICR nu/nu myším (samice, 7 až 8 týdnů staré). O deset až dvacet dní později byla provedena za úplné anestezie u těchto myší laparotomie a z ascitu tak bylo získáno standardním způsobem velké množství anti-myších AILIM monoklonálních protilátek (lgG2a). Dále se tato protilátka nazývá jednoduše jako „anti-AILIM protilátka“.

(1-3) Vznik zánětlivého střevního onemocnění

Jak je popsáno níže, k indukci zánětlivého střevního onemocnění (kolitidy) došlo vložením CD45RB^h'^9h buněk dříve popsaným způsobem do BALB/c scid/scid myši. Je známo, že vznik a rozvinutí zánětlivého střevního onemocnění provází úbytek tělesné váhy. Tento symptom se objevuje 3 až 5 týdnů po vložení CD45RB^h'^9h buněk do tohoto modelu zánětlivého střevního onemocnění.

Pomocí MACS magnetického separačního systému (Miltenyi Biotec) a antiCD4⁺ protilátky (L3T4) byly z jednojaderných buněk sleziny zdravých BALB/c myší odděleny a získány CD4⁺ T-buňky. Konkrétně se buňky sleziny, izolované z myši, kultivovaly při 4 °C po dobu 30 minut s magnetickými kuličkami, na které byla navázána anti-CD4⁺ protilátka, a poté byly tyto buňky promyty a zahuštěny přepuštěním přes magnetický průtokový sloupec.

Po naznačení získaných CD4⁺ T-buněk (čistota 96 až 97 % se potvrdila na průtokovém cytometru) anti-myší CD4 protilátkou (RM4-5; PharMingen), která byla označena fykoerytrinem (PE), a anti CD4 protilátkou (16A; PharMingen), která byla označena fluoresceinisothiokyanátem (FITC), se buňky roztřídily pomocí FACS Vantage (Becton Dickinson) a rozdělily na frakci obsahující T-buňky s vysokou expresí CD45RB (CD45RB^h'^9h) a na frakci obsahující T-buňky s nízkou expresí CD45RB (CD45RB^|OW).

Nakonec se BALB/c scid/scid myším intraperitonálně (i.p.) zavedly CD45RB^hlgh T-buňky (5x 10⁵ buněk/200 μΙ PBS) tak, aby došlo ke vzniku kolitidy.

(1-4) Podávání anti-AILIM protilátek

Jednotlivé skupiny výše zmíněných SCID myší, kterým byly zavedeny CD45RB^high T-buňky, byly ošetřeny následujícím způsobem.

Skupina 1

Anti-AILIM protilátka (250 pg/250 μΙ PBS) se intraperitonálně podávala ihned po zavedení CD45RB^h,gh T-buněk (po prvním podání) a poté stále každý týden s frekvencí 3 krát za týden.

Skupina 2

Protilátka negativní kontroly (krysí IgG, Sigma, 250 pg/250 μΙ PBS) se intraperitonálně podávala ihned po zavedení CD45RB^high T-buněk (po prvním podání) a poté stále každý týden s frekvencí 3 krát za týden. Současně po osmém týdnu po prvním podání CD45RB^high T-buněk, se navíc kromě protilátky negativní kontroly se stejnou frekvencí stále každý týden podávala intraperitonálně i anti-AILIM protilátka (250 pg/250 μΙ PBS).

Skupina 3

Protilátka negativní kontroly (krysí IgG, Sigma, 250 pg/250 μΙ PBS) se intraperitonálně podávala ihned po zavedení CD45RB^high T-buněk (po prvním podání) a poté stále každý týden s frekvencí 3 krát za týden.

Stupeň pokročilosti zánětlivého střevního onemocnění, stupeň potlačení a léčby vzniku a rozvinutí choroby vzhledem k přítomnosti anti-AILIM protilátky byly analyzovány měřením tělesné hmotnosti všech skupin v čase od prvního podání a ještě úplně na začátku před zavedením T buněk.

Výsledky jsou uvedeny na Obr. 1.

Proto, jak se předpokládalo, se u skupiny, u které byla podávána pouze protilátka negativní kontroly (Skupina 3), objevil významný úbytek tělesné hmotnosti, který je symptomem rozvoje zánětlivého střevního onemocnění. V případě skupiny, u které byla souvisle podávána anti-AILIM protilátka ihned po zavedení CD45RB^high Tbuněk, nebyl pozorován jakýkoli úbytek tělesné hmotnosti a vznik zánětlivého střevního onemocnění byl úplně potlačen (Skupina 1).

Dále ve skupině, u které byla podávána ihned po zavedení CD45RB^h'^gh Tbuněk pouze samotná protilátka negativní kontroly až do 7 týdne a od 8 týdne byla

99··· · ·· • •9 9 · · · ♦ · «

9··9 9 9 ···

99 9 9 · ♦ « ·

9· ···· navíc k protilátce negativní kontroly podávána i anti-AILIM protilátka (Skupina 2), se výrazně zvýšila tělesná hmotnost ihned po začátku podávání anti-AILIM protilátky, alespoň ve srovnání se skupinou, u které byla podávána pouze protilátka negativní kontroly, a to i po 8 týdnu (Skupina 3). Z tohoto důvodu bylo zjištěno, že anti-AILIM je schopna léčit zánětlivá střevní onemocnění.

Dále byl analyzován stupeň rozvinutí zánětlivého střevního onemocněni, stejně jako i stupeň potlačení a léčby vzniku a rozvinutí choroby pomocí anti-AILIM. Z myší ze Skupiny 1 a Skupiny 3 byly získány 6 týdnů po zavedení T buněk tlustá střeva a jejich stav byl opticky vyšetřen. Jako kontrola se podobná vyšetření provedla na tlustých střevech BALB/c scid/scid myší, kterým byly zavedeny CD45RB^h,gh Tbuňky a nepodávaly se žádné protilátky.

Tyto výsledky jsou na Obr. 2.

Výsledkem bylo poškození tlustého střeva (ztluštění a zkrácení trávicího traktu), které provází rozvoj zánětlivého střevního onemocnění a u skupiny, kde byla podávána pouze protilátka negativní kontroly (Skupina 3), se objevila nezdravá stolice. Ovšem stav tlustého střeva skupiny, u které byla souvisle podávána antiAILIM protilátka (Skupina 1), byl podobný jako stav tlustého střeva normální kontrolní skupiny. Bylo zjištěno, že anti-AILIM výrazně potlačuje vznik a rozvinutí zánětlivého střevního onemocnění.

Příklad 2

Léčebný efekt na zánětlivé střevní onemocnění u modelu myší kolitidy (klinická zkouška 2) (2-1) Zvířata

Byly použity BALB/c scid/scid myši, C57BL/6scid/scid myši a normální BALB/c myši (6 až 8 týdnů staří samci; CLEA Japonsko).

(2-2) Monoklonální protilátky

Byla použita monoklonální protilátka proti myšímu AILIM (ICOS), monoklonální protilátka proti myšímu B7RP-1, což je ligand myší AILIM (ICOS) a protilátka negativní kontroly.

Na produkci anti-myších AILIM/ICOS monoklonálních protilátek byl použit B10,5 hybridom.

Anti-myší B7RP-1 monoklonální protilátka se připravila následujícím způsobem. SD potkan se imunizoval běžným způsobem připravenými «· ·

Φ· <·»· rekombinantními L buňkami, které exprimují myší B7RP-1. Z imunizovaného potkana byly získány buňky sleziny a buněčnou fúzí s buňkami myelomu se připravily běžným způsobem hybridomy. Poté se supernatant kultury jednotlivých hybridomů použil k měření stupně vazby anti-myší B7RP-1 monoklonální protilátky v supernatantu kultury k rekombinantním buňkám (NRK buňky), které exprimují myší B7RP-1, metodou EIA a tak byly vybrány ty hybridomy, které produkovaly protilátky, které se vázaly k myší B7RP-1. Pro další výzkum se ze supernatantů kultur vybraných hybridomů izolovala anti-myší B7RP-1 monoklonální protilátka. Navíc bylo potvrzeno, že anti-myší B7RP-1 monoklonální protilátka má schopnost inhibovat vazbu myší AILIM-Ig (fúzní polypeptid obsahující rozpustnou oblast myší AILIM/ICOS a Fc imunoglobulinu) k rekombinantním buňkám, které exprimují myší B7RP-1.

Potkaní IgG (Sigma), která nereaguje s myší AILIM/ICOS nebo B7RP-1 byla použita jako protilátka negativní kontroly.

(2-3) Indukce kolitidy (zánětlivého střevního onemocnění)

Zánětlivé střevní onemocněni kolitida bylo indukováno zavedením CD4⁺CD45RB^h'^9h T-buněk do BALB/c scid/scid myší (J. Immunol., Vol.164, p.48784882, 2000).

Dle následujících instrukcí byly pomocí MACS magnetického separačního systému (Miltenyi Biotec) a anti-CD4⁺ protilátky (L3T4) z buněk sleziny zdravých BALB/c myší získány CD4⁺ T-buňky. CD4⁺ T-buňky (čistota 96 až 97 % byla analyzována pomocí FACS) byly označeny PE-značenou anti-myší CD4 protilátkou (RM4-5; PharMingen) a FITC-značenou anti CD45RB protilátkou (16A; PharMingen). Buňky se pak roztřídily na CD45RB^hígh T-buňky a CD45RB^|OW T-buňky pomocí FACS Vantage (Becton Dickinson).

Zánětlivé střevní onemocnění (kolitida) bylo indukováno intraperitonálním zavedením CD45RB^h'^9h T-buněk (5x 10⁵ buněk/ 200 μΙ PBS) do BALB/c scid/scid myší.

(2-4) Léčba zánětlivé kolitidy anti-AILIM protilátkou

Anti-myší AILIM/ICOS monoklonální protilátka (250 pg/250 μΙ PBS), anti-myší B7RP-1 monoklonální protilátka (250 pg/250 μΙ PBS) nebo protilátka negativní kontroly (250 pg/250 μΙ PBS) byla podávána intraperitonálně s frekvencí 3 krát za týden po dobu 7 týdnů od doby zavedení (týden 0) CD45RB^h'^9h T-buněk myším, u kterých se tak indukovala zánětlivá kolitida.

Μ ΦΦΦΦ • ΦΦΦΦ Φ ΦΦ ·· · ΦΦ Φ Φ Φ φ φ • ♦ ·· Φ Φφφφ • ΦΦΦ ΦΦΦΦ φ

Na druhé straně, aby bylo možné zkoumat léčebný efekt anti-AILIM/ICOS protilátky za podmínek rozvinuté zánětlivé kolitidy, byla podávána anti-AILIM/ICOS monoklonální protilátka (v koncentraci 250 pg/tělo; 3krát týdně; i.p.) za podmínek podobných výše popsaným podmínkám od 3 týdne po zavedení CD45RB^h'^9h T-buněk myším, u kterých byla indukována zánětlivá kolitida. O sedm týdnů po zavedení CD45RB^h'^9h T-buněk byla testovaná zvířata utracena a zjišťoval se stav zánětu v tlustém střevě.

(2-5) Zavedení patogenních CD4⁺ T-buněk z myší jiným myším

Z lamina propria (LP) tlustého střeva BALB/c scid/scid myší, u kterých byly zavedeny CD4⁺CD45RB^h'^9h T-buňky (adoptivní přenos), se pomocí výše zmíněných MACS magnetických kuliček izolovaly 7 týdnů po zavedení T-buněk CD4⁺ buňky (LP CD4⁺ T-buňky). Hodnota čistoty 95 % a více izolovaných LP CD4⁺ T-buněk byla potvrzena FACS.

LP CD4⁺ T-buňky (1x 10⁶ buněk/ 200 pl PBS; i.p.) se podaly BALB/c scid/scid myším. Poté se podávaly anti-AILIM/ICOS protilátky (250 pg/250 μΙ PBS) nebo protilátky negativní kontroly (potkaní IgG; 250 pg/250 μΙ PBS) s frekvencí 3krát do týdne. Čtyři týdny po podání LP CD4⁺ T-buněk se myši šetrně utratily, vypitvala se tlustá střeva a poté se histologicky zanalyzovala.

(2-6) Histologické vyšetření a imunohistochemické barvení

Vzorky tkáně tlustého střeva získané zvýše uvedených zvířat se imobilizují v PBS, které obsahuje 6% formalin. Řezy tkání tlustého střeva (5 μίτι) zalité v parafínu se obarví hematoxylinem a eosinem (HE barvení). Všechny druhy tkáňových řezů se pak analyzují. Stupeň zánětu tlustého střeva se převede na počet bodů podle návodu v předchozí zprávě (Gastroenterology, Vol. 119, p.715-723, 2000).

Na druhé straně vzorky tlustého střeva určené pro imunohistochemickou analýzu byly imobilizovány V OCT sloučenině, zmraženy a uloženy do -80 °C. Barvení tkáňových řezů se pak provádělo avidin-biotinovou metodou.

Tkáňové řezy (6 μίτι) se inkubovaly s biotinylovanou anti-AILIM/ICOS monoklonální protilátkou, biotinylovanou anti-B7RP-1 monoklonální protilátkou, biotinylovanou anti-myší CD4 monoklonální protilátkou (RM4-5; potkaní lgG1; PharMingen), biotinylovanou anti-myší F4/80 monoklonální protilátkou (potkaní lgG2; PharMingen) nebo biotynylovanou kontrolní protilátkou odpovídající stejnému izotypu ·· · · · ·

(PharMingen). Biotinylovaná protilátka byla detekována pomocí komplexu streptavidin-biotinylované křenové peroxidázy (Vectastain ABC Kit; Vector) a zviditelnila se pomocí diaminobenzidinu. Dále byl každý řez obarven hematoxylinem. (2-7) Detekce apoptotických buněk

Apoptotické buňky v tkáňových řezech byly detekovány pomocí ApoTag Kitu (Intergen), podle metody TUNEL popsané v předchozích pracích. Při pozorování pod mikroskopem se mezi 500 jednojaderných buněk lamina propria (LPMC), které pronikly do 5 částí jednoho řezu, vyhledají a spočítají TUNEL pozitivní buňky. Procentuální poměr pozitivních buněk v 500 LPMC byl ustanoven jako index apoptózy.

(2-8) Výsledky

Výsledky jsou uvedeny na Obr. 3 až Obr. 12.

(2-8-1) Potlačení kolitidy podáváním anti-AILIM/ICOS protilátek

U testované myši (kontrolní myši), které byla podávána pouze protilátka negativní konroly (IgG), se rozvinula těžká kolitida již 4 až 7 týdnů po zavedení CD45RB^h'^9h T-buněk, přičemž došlo nejen k úbytku tělesné hmotnosti (Obr. 3), ale také výraznému ztluštění stěny tlustého střeva, pozorovány byly i průjem a zánět.

U kontrolní myši byla průměrná hodnota (během 7 týdne) histologických bodů (určující vážnost kolitidy), charakterizující transmurální zánět, při kterém se ve vrstvě lamina propria a submukosa objevuje velké množství lymfocytů a objevuje se nápadná epiteliální hyperplázie doprovázená snížením počtu pohárkových buněk, 5,9+1,2.

Na druhé straně byly myši, které byly léčeny anti-AILIM/ICOS protilátkou, absolutně zdravé a žádné příznaky kolitidy a ztlušťování stěny kolonu nebyly pozorovány. Pozorován byl i přírůstek hmotnosti (Obr. 3). Dále histologický počet bodů tkáně stěny kolonu byl u těchto myší, léčených anti-AILIM/ICOS protilátkou (n=7), 0,8+0,7 a pozorovány nebyly ani žádné další jasně viditelné chorobné změny (Obr. 4).

Průměrný počet CD4⁺ T-buněk, pozorovaných v lamina propria tlustého střeva myší s kolitidou (kontrolní myši), u kterých se rozvinul zánět, byl 44±9x 10⁵ buněk/ tlusté střevo, zatímco u myší, které byly léčeny anti-AILIM/ICOS protilátkou, to bylo 21±3x 10⁵ buněk/ tlusté střevo (p<0,01) (Obr. 5).

·· »··· ♦ · · • Φ Φ • · · · • · · · ♦ · ·· (2-8-2) Indukce apoptózy v jednojaderných buňkách, které pronikly do tkáně, antiAILIM/ICOS protilátkou

V tlustém střevě myší, které byly léčeny anti-AILIM/ICOS protilátkou, bylo pozorováno významné zvýšení apoptotických buněk ( většina z nich byly jednojaderné buňky, které pronikly do tkáně) oproti myším, kterým byla podávána protilátka negativní kontroly (kontrolní myši).

Apoptotický index, který vyšel z kvantitativní analýzy apoptotických buněk v tlustém střevě, byl výrazně vyšší u myší, které byly léčeny anti-AILIM/ICOS protilátkou (n=5) oproti myším, kterým byla podávána protilátka negativní kontroly (kontrolní myši) (Obr. 6).

Tyto výsledky ukázaly, že supresivní efekt na kolitidu, způsobený léčbou antiAILIM/ICOS protilátkou, je spojen se snížením počtu patogenních T-buněk, které exprimují AILIM (ICOS).

(2-8-3) Supresivní efekt na kolitidu, způsobený podáváním anti-AILIM/ICOS protilátky po rozvinutí symptomů choroby.

Úbytek váhy a průnik lymfocytů do tkání kolonu, tj. vysilující onemocnění, které je jedním ze symptomů u výše zmíněného myšího modelu, se začíná objevovat 3 nebo 2 týdny po zavedení CD45RB^high T-buněk. Proto, jak bylo uvedeno výše, se začalo s podáváním anti-AILIM/ICOS protilátky 3 týdny po zavedení T-buněk.

Ve skupině, kde se podávala anti-AILIM/ICOS protilátka, bylo pozorováno výrazné zlepšení úbytku váhy (Obr. 7) a průjem se již neobjevil.

Histologická analýza tkáňových řezů kolonu myší ze všech skupin ukázala, že s případě skupiny, u které se podávala anti-AILIM/ICOS protilátka, bylo pozorováno výrazné snížení granulomatózního zánětu, lymfocytického průniku a ztlušťování epithelia, ve srovnání se skupinou myší, u kterých byla podávána pouze protilátka negativní kontroly (kontrolní myši). Změny v zánětu byly pozorovány v lamina propria a v některých případech v lézích objevujících se spolu s lehkým průnikem lymfocytů do submukózy, ale ne ve svalové vrstvě. Dále, výše uvedený histologický počet bodů určující vážnost kolitidy (tlustá střeva byla získána v 7 týdnu) se výrazně snížil ve skupině, kde se podávala anti-AILIM/ICOS protilátka (1,62±0,81), ve srovnání se skupinou myší, u kterých byla podávána pouze protilátka negativní kontroly (kontrolní myši; 5,93±1,23) (p<0,05; Obr. 8). Dále, počet pronikajících CD4⁺ T-buněk (7. týden) byl výrazně nižší ve skupině, kde se podávala anti-AILIM/ICOS protilátka (5,50+0,7x • ««fcfc · fcfc fcfc · ····>· · • ··· · · · · « • fc ····

10® buněk), ve srovnání se skupinou kontrolních myší (31,3±7,7x 10⁶ buněk) (p<0,05; Obr. 9).

(2-8-4) Supresivní efekt anti-AILIM/ICOS protilátky na kolitidu indukovanou zavedením CD4⁺ T buněk lamina propria odvozených od kolitidového dárce.

Aby se mohl posoudit léčebný efekt anti-AILIM/ICOS protilátky na patogenní T buňky, jak bylo popsáno výše, musela se nejdříve indukovat kolitida u BALB/c scid/scid myší zavedením LP CD4⁺ T buněk odvozených od myší s kolitidou, po které následovalo podávání anti-AILIM/ICOS protilátky.

U myší, kde se podávala anti-AILIM/ICOS protilátka, bylo dosaženo výrazného snížení úbytku tělesné hmotnosti. (Obr. 10). Navíc histologický počet bodů určující závažnost kolitidy (tlusté střevo zvířat bylo získáno během 4. týdne; Obr. 11) a průnik CD4⁺ T buněk do lamina propria kolonu ( 4. týden) byly výrazně sníženy ve srovnání s se skupinou myší, u kterých byla podávána pouze protilátka negativní kontroly (kontrolní myši).

Průmyslová využitelnost

Farmaceutické sloučeniny předkládaného vynálezu (přednostně ty, které obsahují látku, která má schopnost indukovat buněčnou smrt, apoptózu nebo snížení počtu buněk, které exprimují AILIM/ICOS) jsou velmi užitečné k potlačování, předcházení a/nebo léčbě onemocnění, které jsou způsobeny narušenou imunitou trávicího traktu, konkrétně jde o zánětlivá střevní onemocnění (hlavně Crohnova choroba a kolitida (colitis ulcerosa apod.)) a zažívací alergie.

Farmaceutické sloučeniny tohoto vynálezu zlepšují léčebný efekt u zánětlivých střevních onemocnění a zažívacích alergií, zejména pokud se použijí v kombinaci sjiž existujícími farmaceutickými činidly, které se běžně předepisují na léčbu takových zánětlivých onemocnění a zažívacích alergií.

Dále, farmaceutická sloučenina obsahující lidskou protilátku proti AILIM, která je součástí farmaceutické sloučeniny tohoto vynálezu, je velmi užitečná látka, protože nemá žádné vedlejší účinky jako jsou alergie, které je možno pozorovat po podání protilátek odvozených z myší a člověka.

Claims (10)

1. PATENTOVÉ NÁROKY

   1. Farmaceutická sloučenina na potlačení, léčbu nebo prevenci choroby, která doprovází narušenou imunitu trávicího traktu, vyznačující se tím, že obsahuje látku, která má schopnost ovlivňovat signální transdukci přes AILIM a farmaceuticky přijatelný nosič.
2. 2. Farmaceutická sloučenina podle nároku 1, vyznačující se tím, že zmíněná látka má schopnost indukovat buněčnou smrt buněk exprimujících AILIM.
3. 3. Farmaceutická sloučenina podle nároku 1 a 2, vyznačující se tím, že zmíněná choroba je zánětlivé střevní onemocnění.
4. 4. Farmaceutická sloučenina podle nároku 3, vyznačující se tím, že zmíněné zánětlivé střevní onemocnění je kolitida.
5. 5. Farmaceutická sloučenina podle nároku 3, vyznačující se tím, že zmíněné zánětlivé střevní onemocnění je Crohnova choroba.
6. 6. Farmaceutická sloučenina podle nároku 1 a 2, vyznačující se tím, že zmíněná choroba je zažívací alergie.
7. 7. Farmaceutická sloučenina podle jakéhokoli z nároků 1 až 6, vyznačující se tím, že zmíněná látka je látka bílkovinné povahy.
8. 8. Farmaceutická sloučenina podle nároku 7, vyznačující se tím, že je látka bílkovinné povahy vybrána ze skupiny zahrnující

   a) protilátku, která se váže k AILIM nebo část této protilátky;

   b) polypeptid obsahující celou extracelulární oblast ALIM nebo jeho část;

   c) fúzní polypeptid obsahující celou nebo část extracelulární oblasti AILIM a celou nebo část konzervované oblasti těžkého řetězce imunoglobulinu; a,

   d) polypeptid, který se váže na AILIM.

   ··»· • ·· 99 ·

   99 9 9 9 9 • 9 · 9
9. 9 9 9 9 9

   9 9 9 9 9

   999 9999 99

   9. Farmaceutická sloučenina podle jakéhokoli z nároků 1 až 6, vyznačující se tím, že zmíněná látka je látka nebílkovinné povahy.
10. 10. Farmaceutická sloučenina podle nároku 9, vyznačující se tím, že zmíněná látka nebílkovinné povahy je DNA, RNA nebo chemicky vyrobená sloučenina.