CZ20032820A3

CZ20032820A3 - Enzymatický způsob enantioselektivní redukce ketosloučenin

Info

Publication number: CZ20032820A3
Application number: CZ20032820A
Authority: CZ
Inventors: Antje Gupta; Klaus Breese; Gert Bange; Peter Neubauer
Original assignee: Juelich Enzyme Products Gmbh
Priority date: 2001-04-20
Filing date: 2002-04-15
Publication date: 2004-02-18
Also published as: PL207271B1; US20090017510A1; HU229667B1; PT1383899E; ES2334016T3; DK1383899T3; HUP0303803A2; WO2002086126A2; US8361765B2; EP2123760A1; JP2009207499A; DE10119274A1; JP2004527251A; WO2002086126A3; EP1383899A2; JP4417628B2; DE50213871D1; SK288326B6; SK12692003A3; EP1383899B1

Description

Oblast techniky

Vynález se týká enzymatického způsobu enantioselektivní redukce organických ketosloučenin na odpovídající chirální hydroxysloučeniny, alkohol-dehydrogenázy z Lactobacillus minor a enzymatického způsobu enantioselektivního získání (S)-hydroxysloučeniny z racemátů.

Dosavadní stav techniky

Opticky aktivní hydroxysloučeniny jsou cennými syntézními produkty pro výrobu velkého množství farmakologicky důležitých sloučenin. Tyto sloučeniny jsou často obtížně vyrobitelné klasickými chemickými způsoby a mohou jen zřídka poskytnout enantiomerní čistotu požadovanou pro farmakologická použití. Proto se k výrobě chirálních sloučenin zpravidla používají biotechnologické způsoby, přičemž stereoselektivní reakce je provedena buď celými mikroorganismy nebo za použití izolovaných enzymů.

Přitom se ukázalo jako výhodné použití izolovaných enzymů, neboť se při jejich použití zpravidla dosáhne vyšších výtěžků a vyšší enantiomerní čistoty.

Dehydrogenázy a zejména alkhol-dehydrogenázy jsou cennými katalyzátory pro získání chirálních produktů • · · · · · stereoselektivní redukcí organických ketosloučenin na

V podstatě jsou známé koňských jater nebo z enzymy potřebují jako odpovídající chirální alkoholy odpovídající enzymy z kvasnic,

Thermoanaerobium brockii. Tyto koenzym NADH (nikotinadenindinukleotid) nebo NADPH (nikotinadenindinukleotidfosfát). Dalšími známými alkohol-dehydrogenázami jsou například (S)-specifická alkohol-dehydrogenáza z Rhodococcus erythropolis nebo (R)-specifická alkohol-dehydrogenáza z rodu Lactobacillus. Oba tyto enzymy mají široké substrátové spektrum na ketosloučeniny a vykazují vysokou enantioselektivitu. Alkohol-dehydrogenázy z Lactobacillu kefir (DE 40 14 573) a Lactobacillus brevis (DE 196 10 984) se hodí zejména pro získání chirálních (R)-alkoholů.

Nevýhodou použití alkohol-dehydrogenáz je ovšem malá enzymová stabilita a enzymová účinnost alkohol-dehydrogenáz v organických rozpouštědlech a mnohdy jen nepatrná rozpustnost ve vodě ketosloučenin určených k redukci. Kromě toho je dalším limitujícím faktorem použití alkohol-dehydrogenáz v organických rozpouštědlech nutnost použití NADP nebo NAD jako kofaktoru vzhledem k tomu, že kofaktor (NADP, NAD) je ve vodě rozpustný a při ekonomických způsobem se regeneruje.

Cílem modifikací vynálezu vynálezu procesních dosaženo obsahuj ícího alkohol-dehydrogenázu, je odstranit uvedené nedostatky podmínek. Tohoto cíle je podle použitím dvoufázového systému, aorganické rozpouštědlo, vodu, kofaktor a ketosloučer.inu.

Způsob podle vynálezu vykazuje vysokou životnost enzymu v důsledku enzym-stabilizujícího účinku rozpouštědla, ···· · ·· ·· ···· • »····· · enantiomerní čistotu vyšší než 99,9 % vyrobené chirální hydroxysloučeniny a vysoký výtěžek vztažený na použité množství ketosloučeniny.

Podstata vynálezu

Vynález se proto týká způsobu enantioselektivní redukce ketosloučeniny obecného vzorce I

1^-0(0) “R² (I) ve kterém

2

R a R , ktere jsou nezávisle jeden na druhem stejne nebo odlišné a znamenají

1. atom vodíku,

2. alkylovou skupinu obsahující 1 až 20 uhlíkových atomů, přičemž tato alkylová skupina je přímá nebo rozvětvená,

3. alkenylovou skupinu obsahující 2 až 20 uhlíkových atomů, přičemž tato alkenylová skupina je přímá nebo rozvětvená a případně obsahuje jednu, dvě, tři nebo čtyři dvojné vazby,

4. alkinylovou skupinu obsahující 2 až 20 uhlíkových atomů, přičemž tato alkinylová skupina je přímá nebo rozvětvená a případně obsahuje jednu, dvě, tři nebo čtyři trojné vazby,

5. arylovou skupinu obsahující 6 až 14 uhlíkových atomů, • · · · • ··«· ♦ * · · * e · · · · · ♦ · · ···· β·· · ·

6. alkylarylovou skupinu, ve které alkylový zbytek obsahuje 1 až 8 uhlíkových atomů a arylový zbytek obsahuje 6 až 14 uhlíkových atomů, nebo

2

7. R a R tvoří společně se zbytkem -C(0)- arylovou skupinu obsahující 6 až 14 uhlíkových atomů nebo heterocyklickou skupinu obsahující 5 až 14 uhlíkových atomů, přičemž skupiny uvedené výše v odstavcích 1. až 7. jsou nesubstituované nebo nezávisle na sobě jednou až třikrát substituované

a) skupinou -OH,

b) atomem halogenu, jakým je atom fluoru, atom chloru, atom bromu nebo atom jodu,

c) skupinou -N0₂,

d) -C(0)-O-alkylovou skupinou, ve které alkylový zbytek obsahuje 1 až 20 uhlíkových atomů v přímém nebo rozvětveném řetězci a je nesubstituován nebo jednou až třikrát substituován atomem halogenu, hydroxylovou skupinou, aminoskupinou nebo nitroskupinou, nebo

e) heterocyklickou skupinou obsahující 5 až 14 uhlíkových atomů, která je nesubstituovaná nebo jednou až třikrát substituovaná atomem halogenu, hydroxylovou skupinou, aminoskupinou nebo nitroskupinou, jehož podstata spočívá v tom, že se

a) sloučenina obecného vzorce I, alkohol-dehydrogenáza, voda, kofaktor a organické rozpouštědlo s hodnotou logP rovnou 0,5 až 4,0

b) inkubuje ve dvoufázovém systému a

c) vytvořená chirální hydroxysloučenina se izoluje.

• · · · · ·· ·· ···· • ··*··· * ··· ··· ·· « ·· · · ··· · · • ··· ···· • · · ·· · ·· · * ^J·

Arylovými skupinami obsahujícími 6 až 14 uhlíkových atomů jsou například fenylová skupina a naftylová skupina.

Pod pojmem arylová skupina se rozumí aromatické uhlovodíkové skupiny obsahující 6 až 14 uhlíkových atomů v kruhu, například 1-naftylová skupina, 2-naftylová skupina, bifenylylová skupina, například 2-bifenylylová skupina a 4-bifenylylová skupina, anthrylová skupina nebo fluorenylová skupina. Výhodnými arylovými skupinami jsou bifenylylová skupina, naftylová skupina a zejména fenylová skupina.

Pod pojmem atom halogenu se rozumí atom fluoru, atom chloru, atom bromu nebo atom jodu.

Pod pojmem alkylová skupina obsahující 1 až 20 uhlíkových atomů se rozumí uhlovodíková skupina, jejíž uhlíkatý řetězec je přímý nebo rozvětvený a obsahuje 1 až 20 uhlíkových atomů.

Pod pojmem heterocyklické skupina obsahující 5 až 14 uhlíkových atomů se rozumí monocyklický nebo bicyklický 5-členný až 14-členný heterocyklický kruh, který je částečně nasycený nebo zcela nasycený. Příklady heteroatomů jsou atom dusíku, atom kyslíku a atom síry. Příklady heterocyklických skupin obsahujících 5 až 14 uhlíkových atomů jsou skupiny, které jsou odvozené od pyrrolu, furanu, thiofenu, ímidazolu, pyrazolu, oxazolu, isoxazolu, thiazolu, isothiazolu, tetrazolu, 1,2,3,5-oxathiadiazol-2-oxidu, triazolonu, oxadiazolonu, isoxazolcnu, oxadiazolidindionu a triazolu, které jsou substituovány atomem fluoru, skupinou -CN, skupinou -CF, nebo -C(O)-O-skupinou obsahující v alkylovém zbytku 1 až 4 uhlíkové atomy, 3-hydroxypyrro-2,4-dionu, » · · · »

I · · pyrimidinu, chinolinu, cinnolinu,

5-oxo-l,2,4-thiadiazolu, pyridinu, pyrazinu, indolu, isoindolu, indazolu, ftalazinu, isochinolinu, chinoxalinu, chinazolinu, karbolinu a benzoanelovaných , cyklopenta-, cyklohexa- nebo cykloheptaanelovaných derivátů uvedených heterocyklů. Obzvláště výhodné jsou 2-pyrrolylový zbytek, 3-pyrrolylový zbytek, fenylpyrrolylový zbytek, jako například

4-fenyl-2-pyrrolylový zbytek nebo 5-fenyl-2-pyrrolylový zbytek, 2-furylový zbytek, 2-thienylový 4-imidazolylový zbytek, methylimidazolylový například 1-methyl-2-imidazolylový zbytek, zbytek, zbytek, nebo

1-methyl-4-imidazolylový 1-methyl-5-imidazolylový zbytek, 2-pyridylový 4-pyridylový zbytek, zbytek zbytek, 1,3-thiazol-2-ylový zbytek, 3-pyridylový zbytek,

2-pyridyl-N-oxidový zbytek,

3- pyridyl-N-oxidový zbytek nebo 4-pyridyl-N-oxidový zbytek,

2-pyrimidinylový zbytek, 4-pyrimidinylový zbytek nebo

5-pyrimidinylový zbytek, 2-indolylový zbytek, 3-indolylový zbytek nebo 5-indolylový zbytek, substituovaný indolylový zbytek, například Ι-methyl-, 5-methyl-, 5-benzyloxy-, 5-chlor- nebo 4,5-dimethyl-2-indolylový zbytek, l-benzyl-2nebo -3-indolylový zbytek, 4,5,6,7-tetrahydro-2-indolylový zbytek, cyklohepta[ b] -5-pyrrolylový zbytek, 2-chinolylový zbytek, 3-chinolylový zbytek, 4-chinolylový zbytek,

1- isochinolylový zbytek, 3-isochinolylový zbytek,

4- isochinolylový zbytek, 1-oxo-l,2-dihydro-3-isochinolylový zbytek, 2-chinoxalinylový zbytek, 2-benzofuranylový zbytek,

2- benzothienylový zbytek nebo benzothiazolylový zbytek nebo dihydropyridinylový zbytek, pyrrolidinylový zbytek, například 2-(N-methylpyrrolidinyl)ový zbytek nebo

3- (N-methylpyrrolidinyl)ový zbytek, piperazinylový zbytek, morfolinylový zbytek, thiomorfolinylový zbytek, tetrahydrothienylový zbytek nebo benzodioxolanylový zbytek.

Výhodnými sloučeninami obecného vzorce I jsou ethylester kyseliny 4-chlor-3-oxobutanové acetofenon, methylester kyseliny octové, ethyl-2-oxo-4-fenylbutyrát, 2,5-hexandion, pyrohroznan ethylnatý nebo 2-oktanon, přičemž obzvláště výhodný je ethylester kyseliny

4-chlor-3-oxobutanové.

Sloučeniny obecného vzorce I se v rámci způsobu podle vynálezu použijí v množství 2 až 30 %, vztaženo na celkový objem, přičemž výhodně se tyto sloučeniny použijí v množství 1% až 25 %, zejména v množství 15 až 22 %, vztaženo na celkový objem.

K vodě se výhodně přidá pufr, například fosforečnan draselný, Tris/HCl-pufr nebo triethanolaminový pufr s hodnotou pH 5 až 10, výhodně s hodnotou pH 6 až 9. Koncentrace pufru činí 10 až 150 mM, výhodně 90 až 110 mM, zejména 100 mM. Dodatečně pufr obsahuje také hořečnaté ionty, například ve formě chloridu hořečnatého, v koncentraci 0,2 až 10 mM, výhodně v koncentraci 0,5 až 2 mM, zejmnéna v koncentraci 1 mM.

Teplota se například pohybuje od asi 10 do 7 0 °C, výhodně od 30 do 60 °C.

Organická rozpouštědla použitelná v rámci vynálezu mají výhodně logP 0,6 až 2,0, zejména 0,6 až 1,9, obzvláště výhodně 0,63 až 1,75. Výhodnými organickými rozpouštědly ksou například diethylether, terc-butylmethylether, dibutylether nebo ethylester kyseliny obzvláště výhodným rozpouštědlem je diisopropylether, ocrové, přičemž ethylester kyseliny octové. Ethylester kyseliny octové může • » · · být například použit v množství 1 až 90 %, vztaženo na celkový objem reakčních složek, výhodně v množství 15 až 60 %, vztaženo na celkový objem reakčních složek, zejména v množství 20 až 50 %, vztaženo na celkový objem reakčních složek.

Poměr organického rozpouštědla k vodě činí 9:1 až 1:9, výhodně 1:1 až 1:3.

Voda tvoří ve dvoufázovém systému podle vynálezu jednu kapalnou fázi a organické rozpouštědlo tvoří druhou kapalnou fázi. Také může být ještě případně přítomná pevná fáze nebo další kapalná fáze, která je například tvořena ne zcela rozpuštěnou alkohol-dehydrogenázou nebo sloučeninou obecného vzorce I. Výhodné jsou však obě kapalné fáze bez pevné fáze. Uvedené dvě kapalné fáze se výhodně mechanicky promísí, takže se dosáhne velkého povrchu mezi oběma kapalnými fázemi.

Koncentrace kofaktoru NADPH nebo NADH, vztaženo na vodnou fázi činí 0,05 až 0,25 mM, zejména 0,06 až 0,2 mM.

Výhodně se při způsobu podle vynálezu použije ještě další stabilizátor alkohoi-dehydrogenázy. Vhodnými stabilizátory jsou například glycerin, sorbitol nebo dimethylsulfoxid (DMSO).

Množství glycerinu činí 5 až 30 %, vztaženo na objem celkové násady. Výhodně množství glycerinu činí 10 až 20 %, zejména 20 %, vztaženo na objem celkové násady.

Za účelem regenerace použitého NADH nebo NADPH může být v rámci vynálezu dodatečně přidán isopropanol. Například isopropanol a NADP zreaguje s alkohol-dehydrogenázou na NADPH a aceton. Použité množství isopropanolu činí 5 až 30 %, vztaženo na objem celkové násady. Výhodné množství isopropanolu činí 10 až 20 %, zejména 10 %.

Vhodné alkohol-dehydrogenázy pocházejí například z kvasnic, koňských jater nebo z Rhodococcus erythropolis, přičemž tyto enzymy potřebují jako koenzym NADH, anebo z Thermoanaerobium brockii, Lactobacillus kefir nebo Lactobacillus brevis, přičemž tyto enzymy potřebují jako koenzyn NADPH.

Použije-li se alkohol-dehydrogenáza v rámci vynálezu z kvasnic, koňských

Thermoanaerobium brockii nebo z Rhodococcus erythropolis, potom se ze sloučeniny obecného vzorce I získá odpovídající (S)-hydroxysloučenina. Použije-li se v rámci vynálezu například alkohol-dehydrogenáza z Lactobacillus kefir nebo Lactobacillus brevis, potom se sloučeniny obecného vzorce I získá odpovídající (R)-hydroxysloučenina.

například jater, z

Alkohol-hydrogenáza může být v rámci vynálezu použita buď zcela vyčištěná nebo částečně vyčištěná nebo může být v rámci tohoto použití obsažena v buňkách. Použité buňky přitom mohou být v nativním stavu, v permeabilizovaném stavu nebo ve stavu buněčné léze.

Objemová účinnost použité alkohol-dehydrogenázy činí

100 jednotek/ml (U/ml) až 2000 U/mk, výhodně asi 800 U/ml, při obsahu proteinu asi 20 až 22 mg/ml. Výhodně má použitá • 99«

9 9 alkohol-dehydrogenáza specifickou aktivitu asi 35 až 40 U/mg proteinu. Na každý kilogram zreagované sloučeniny obecného vzorce I se použije asi 20 000 až 200 000 U výhodně asi 100

Enzymová jednotka 1 odpovídá množství enzymu, které je zapotřebí k tomu, aby každou minutu zreagoval 1 pmol sloučeniny obecného vzorce

I.

000 U U přitom alkoholdehydrogenázy, alkohol-dehydrogenázy.

Způsob podle vynálezu se například provádí v uzavřené reakční nádobě ze skla nebo z kovu. Za tím účelem se reakční složky jednotlivě zavedou do reakční nádoby, kde se míchají pod atmosférou například dusíku nebo vzduchu. V závislosti na charakteru substrátu a použité sloučeniny

obecného vzorce I činí reakční až 7 dnů.	doba 1 až 14 dnů, výhodně 4
Získaná	reakční směs se	následně zpracuje. Za tím
účelem se	oddělí vodná fáze	a ethylacetátová fáze se
zfiltruje.	Vodná fáze může	být případně ještě jednou

extrahována a dále zpracována jako ethylacetátová fáze. Potom se zfiltrovaná fáze odpaří za sníženého tlaku. Takto se získá například produkt tvořený ethylesterem kyseliny 4-chlor-3-(S)-hydroxybutanové, který má enantiomerní čistotou vyšší než 99,9 % a který je v podstatě prostý produktu ethylesteru kyseliny 4-chlor-3-oxo-butanové. Celkový výtěžek uvedeného způsobu činí po destilování produktu 82 až 88 %, vztaženo na použité množství eduktu.

S překvapením bylo zjištěno, že organická rozpouštědla s hodnotou logP rovnou 0 až 4 mají stabilizační účinek na alkohol-dehydrogenázu, zatímco v rámci dosavadního stavu techniky se od použití dvoufázového systému s organickými rozpouštědla odrazuje (M. R. Kula, U. Kragel; kap.28, Dehydrogenases in Synthesis of Chiral Compounds; R. N. Patel, Stereoselective Biocatalyses, 2000; Peters J. 9. Dehydrogenases-Characteristics, Design of Reaction Conditions, and Application, In: H. J. Rehm, G. Reed Biotechlogy, sv.3, Bioprocessing, VCH Weinheim, 1993; J. Lynda a kol., Solvent selection strategies for extractive Biocatalysis, Biotechnol. Prog. 1991, 7, str.116-124). Při způsobu podle vynálezu se jako organická fáze použije ethylester kyseliny octové (ethylacetát), přičemž tato organická fáze slouží jako zásobník pro sloučeninu obecného vzorce I, ale také současně extrahuje z vodné fáze reakční produkt, kterým je chirální hydroxysloučenina.

Na rozdíl od dosavadního stavu techniky vede použití organického rozpouštědla s hodnotou logP rovnou 0 až 3 v průběhu času ke zvýšené stabilizaci alkohol-dehydrogenázy. Podle dosavadního stavu techniky mají zejména organická rozpouštědla s hodnotou logP (logaritmus rozdělovacího koeficientu oktanol/voda) 0 až 2 výrazný destabilizující vliv na enzymy a přicházejí takto ztěží v úvahu jako organická fáze ve dvoufázových systémech (K. Faber, Biotransformations in organic chemistry, 3.vyd. 1997, Springer Verlag, kap.3.Bis 3.17).

Vynález se dále týká alkohol-dehydrogenázy z Lactobacillus minor s vysokým teplotním optimem. Alkohol-hydrogenáza z Lactobacillus minor má DNA-sekvenci podle SEQ ID NO: 3 a aminokyselinovou sekvenci podle SEQ ID NO: 4 v rámci přiloženého sekvenčního protokolu. Tato alkohol-dehydrogenáza z Lactobacillus minor je R-specifická, přičemž například ze sloučeniny obecného vzorce I může být získána odpovídající (R)-hydroxysloučenina. Enantioselektivní • · · · · · alkohol-dehydrogenáza z Lactobacillus minor může být překvapivě superexprimována v Escherichia coli RB 791, zatímco z ostatních druhů rodu Lactobacillus se alkohol-dehydrogenáza exprimuje podstatně omezeněji. To je o to víc překvapující, že se alkohol-dehydrogenáza jen velmi málo exprimuje v divokém kmenu Lactobacillus minor, a takto je nedetekovatelná běžnými metodami screeningu (biotransformace celých buněk, aktivitní test). Bylo proto velmi překvapující, že došlo ke klonování R-enantioselektivní alkohol-hydrogenázy z Lactobacillus minor a že tato alkohol-dehydrogenáza je tak výrazně silně superexprimována v Escherichia coli (50 % buněčného proteinu klonu, 20 000 U/g vlhké hmotnosti).

Vyčištěný enzym z Lactobacillus minor je stabilní v rozmezí pH asi 5,5 až 8,5. Tento enzym je stabilní do teploty asi 40 °C a pH-optimum enzymatické reakce leží v rozmezí od pH 7 do pH 7,5. Teplotní optimum této enzymatické reakce leží v blízkosti 55 °C a enzym vykazuje široké substrátové spektrum.

Uvedený enzym může být pomocí hydrofobní interakční chromatografií vyčištěn až k dosažení specifické aktivity 35 až 40 U/mg proteinu.

Vynález se rovněž týká způsobu získání alkohol-dehydrogenázy z Lactobacillus minor. Za tím účelem se ve vhodném prokaryotickém nebo eukaryotickém mikroorganizmu exprimuje DNA, která kóduje alkohoi-dehydrogenázu z Lactobacillus mincr. Výhodně se alkohol-dehydrogenáza z Lactobacillus minor transformuje a exprimuje v kmenu Escherichia coli, výhodně v Escherichia coli RB 791.

• · · ·

Alkohol-dehydrogenázu je možné z Lactobacillus minor získat například tak, že se kultivují rekombinantní buňky Escherichia coli, načež se indukuje exprese alkohol-dehydrogenázi a po asi 10 až 18 hodinách (h) se buňky otevřou působením ultrazvuku nebo v lisu French (Gaullin, Siemens). Získaný buněčný extrakt může být buď přímo použit nebo ještě dále čištěn. Za tím účelem se buněčný extrakt například odstředí a získaný supernatant se podrobí hydrofobní interakční chromatografií. Tato chromatografie se výhodně provádí při hodnotě pH 7,0 ve vodném pufru, který obsahuje také horečnaté ionty.

Vynález se dále týká způsobu získání enantioselektivní (S)-hydroxysloučeniny obecného vzorce II

Í^-C (OH) -R² (II) ve kterém

2

R a R , které jsou nezávisle jeden na druhém stejné nebo odlišné a znamenají

1. atom vodíku,

4. alkinylovou skupinu obsahující 2 až 20 uhlíkových atomů, přičemž tato alkinylová skupina je přímá • 9 9 ·· · ·· · • · 9 · · · « • · · · • 9 · · · · · · · ·· ·· · · nebo rozvětvená a případně obsahuje jednu, dvě, tři nebo čtyři trojné vazby,

5. arylovou skupinu obsahující 6 až 14 uhlíkových atomů,

2

7. R a R tvoří společně se zbytkem -C(0)~ arylovou skupinu obsahující 6 až 14 uhlíkových atomů nebo heterocyklickou skupinu obsahující 5 až 14 uhlíkových atomů, přičemž skupiny uvedené výše v odstavcích 1. až 7. jsou nesubstituované nebo nezávisle na sobě jednou až třikrát substituované

a) skupinou -OH,

c) skupinou -N0₂,

e) heterocyklickou skupinou obsahující 6 až 14 uhlíkových atomů, která je nesubstituovaná nebo jednou až třikrát substituovaná atomem halogenu, hydroxylovou skupinou, aminoskupinou nebo nitroskupinou, jehož podstata spočívá v tom, že se

a) racemická směs obsahující sloučeninu obecného vzorce

II, alkohol-dehydrogenázu podle vynálezu, vodu, ko-

faktor a organické rozpouštědlo s hodnotou logP rovnou 0,5 až 4,0, například z množiny zahrnující diethylether, terc-butylmethylether, diisopropylether a ethylester kyseliny octové,

b) inkubuje ve dvoufázovém systému a

c) vytvořená enantiomerně čistá (S)-hydroxysloučenina se izoluje.

Reakční podmínky jsou v podstatě stejné jako při výše uvedeném způsobu enantiospecifické redukce ketosloučeniny obecného vzorce I. Při tomto způsobu se však místo enantioselektivní redukce ketosloučeniny obecného vzorce I oxiduje odpovídající (R)-hydroxysloučenina·obecného vzorce II na odpovídající ketosloučeninu. Dále se při tomto způsobu k regeneraci NADP používá namísto isopropanolu aceton. Takto se například aceton a NADPH zreagují s alkohol-dehydrogenázou na NADP a isopropanol. Použité množství acetonu činí 5 až 30 %, vztaženo na objem celkové násady. Výhodná množství acetonu činí 10 až 20 %, zejména 10 %, vztaženo na objem celkové násady.

Alkohol-dehydrogenáza může být při výrobě sloučeniny obecného vzorce II buď ve zcela nebo částečně vyčištěném stavu anebo může být také obsažena v buňkách. Tyto buňky mohou být přitom v nativním nebo permeabilizovaném stavu nebo ve stavu buněčné léze.

Předmětem vynálezu je také rekombinantní klon Escherichia coli RB 791, který exprimuje alkohol-dehydrogenázu z Lactobacillus minor a který byl 26. března 2001 uložen za podmínek Budapešťské smlouvy v Německé sbírce mikroorganizmů a buněčných kultur se sídlem • « · ·

Mascheroder Weg lb, 38124 Braunschweig pod depozitním číslem DSM 14196.

V následující části popisu bude vynález blíže objasněn pomocí konkrétních příkladů jeho provedení, přičemž tyto příklady mají pouze ilustrační charakter a nikterak neomezují rozsah vynálezu, který je jednoznačně vymezen definici patentových nároků a obsahem popisné části.

Příklady provedení vynálezu

Příklad 1

Screening R-Alkohol-dehydrogenázy v kmenech rodu Laktobacillus pomocí biotransformace celých buněk

Za účelem screeningu byly kultivovány různé kmeny Lactobacillus v následujících prostředích (údaje jsou vyjádřeny ve všech případech v g/1):

glukóza (20), kvasničný extrakt (5), masový extrakt (10), hydrogencitran dvoj sodný (2), octan sodný (5), síran hořečnatý (0,2), síran manganatý (0,05), hydrogenfosforečnan dvoj sodný (2) .

Uvedené prostředí bylo sterilizováno při teplotě 121 °C a kmeny rodu Lactobacillus (dále zkráceně jen L.) byly na

tomto prostředí kultivovány bez další regulace pH nebo přívodu kyslíku. Potom byly buňky odstředěny a resuspendovány pro celobuněčnou biotransformací, přičemž vždy 4 g buněk bylo suspendováno v koncovém objemu 10 ml kaliumfosforečnanového pufru (KPi-pufr) (50 mM, pH = 7,0). Po přidání 0,1 g glukózy byly buňky vystány třepání po dobu 15 minut při teplotě 30 °C. K získané buněčné suspenzi byl přidán ethylester kyseliny 4-chlor-3-oxo-butanové a po 10 minutách a 120 minutách byla provedena analýza prostředí pomocí plynové chromatografie. Potom byly buňky odstředěny, supernatant byl zfiltrován a zředěn chloroformem až k dosažení koncové koncentrace 10 až 15 gg/ml ethylesteru kyseliny 4-chlor-3-oxobutanové.

Jako substrát použitý ethylester kyseliny 4-chlor-3-oxobutanové byl jednotlivými kmeny Lactobacillus převeden na ethyl- (S)-4-chlor-3-hydroxybutyrát mající následující enantiomerní čistoty.

Enantiomerní přebytek se vypočte následujícím způsobem: ee(%)=((R-alkohol- S-alkohol)/(R-alkohol+ S-alkohol))xlOO.

• · · · · · • · ·

Tabulka 1

Kmen Lactobacillus	ee ethylesteru kyseliny 4-chlor-3-(S)-hydroxybu- tanové (%)
L. reuteri	34,6
L. kandleri	90,0
L. collinoides	71,3
L. bifermentans	53,6
L. oris	63,4
L. brevis	74,0
L. halotolerans	67,2
L. minor	18, 6
L. parabuchneri	78,5
L. kefir	87,8
L. fructosus	28, 9

• · • · · ·

Příklad 2

Získání rekombinantní R-specifické alkohol-dehydrogenázy

A) Příprava genomové DNA z kmenů rodu Lactobacillus

Buněčná peleta z asi 2 ml kapalné kultury rodu Lactobacillus se resuspenduje ve 300 μΐ TE-pufru (obsahujícího 10 mM Tris/HCl, pH=8, 1 mM EDTA), načež se k získané suspenzi přidá 20 mg/ml lysozymu a směs se inkubuje po dobu 10 minut při teplotě 37 °C. Potom se ke kultivační směsi přidá 100 μΐ dodecylsulfátu sodného (SDS) (10%), 100 μΐ chloristanu sodného a 500 μΐ směsi chloroformu a isoamylalkoholu v objemovém poměru 24:1. Po intentivním promíchání se protein odstředí a vodná fáze se převede do nové Eppendorfovy nádobky. Potom se přidá 800 μ ethanolu (EtOH) (96%). Eppendorfova nádoba se několikrá obrátí a vyloučená chromosomální DNA se převede do nové Eppendorfovy nádoby a promyje 200 μΐ EtOH. Získaná DNA se opětovně převede do nové Eppendorfovy nádoby, kde se vysuší za sníženého tlaku a rozpustí ve 100 μΐ TE-pufru.

B) Oligonukleotid jako 5^Z- a 3'-primer pro PCR (polymerázová řetězová reakce)

Primery použité pro PCR byly odvozeny od známé N-terminální a C-terminální sekvence alkohol-dehydrogenázy z L. kefir. Přitom byly zohledněny známé preference pro určité kodony v laktobacillech. Takto byl před každý 5-primer předřazen kodon ATG (Met) jako startovací kodon, dále bylo na 5'-primeru startovacímu místu předřazeno místo střihu pro restrikční enzym Bam HI (GGATCC), aby bylo umožněno pozdější klonování na expresní sektor. Za • · · · «

3'-primer byly zařazeny stop-kodon (TAG) a místo střihu pro Hind III (AAGCTT). Primerové konstrukty jsou uvedeny dále.

N = A,T,C nebo G;

Y = T nebo C;

R = A nebo B

5'-primer

5'-GCGGATCCATGACNGAYCGNTTRAARGGNAAEGTNGC3' (SEQ ID NO:1)

3'B-primer

5'GGGAAGCTTCTAYTGNGCNGTRTANCCNCCRTCNAC3' (SEQ ID NO:2).

Primery byly vyrobeny o sobě známým způsobem.

C) PCR (polymerázová řetězová reakce) s genomovou DNA z kmenů rodu Lactobacillus.

• · · · • · • ·

PCR-násada (ΙΟΟμΙ)

	Násada pro reakci	Koncentrace
dNTP's	8 μΐ	každý ΝΤΡ 2,5 nmol/μΐ
Oligos	každý oligo 10 μΐ: 20 μΐ	2 pmol/μΐ
Chromosomová DNA	3 μΐ	asi 1 μg/μl
10 x pufr (Promega)	10 μΐ
Taq-polymeráza (Promega)	1 μΐ	2U/V1
h₂o	58 μΐ

dNTP's jsou směsí desoxynukleotidtrifosfátů jako dATP, dGTP, dCTP, dTTP.

Cyklus:

°C, 2 minuty, potom °C výdrž horký start, potom °C, 30 sekund, potom °C, 1 min 30x potom vždy 30 krát 95 °C, 30 sekund a 40 °C, 1 min, potom °C, 2,5 min • · · · potom °C výdrž.

Za účelem analýzy bylo na 1% agarozový gel naneseno 10 μΐ násady a nanesená násada byla při konstantní hodnotě 100 V elektrogoreticky rozdělena. PCG ukázala zřetelnou amplifikaci kusu DNA s asi 750 bp.

Izolace PCR-fragmentů z gelu

Za účelem získání PCR-fragmentů byla celá PCR-násada nanesena na 1% agarozový gel a rozdělena 'elektroforeticky při konstantní hodnotě 100 V. Gel by potom rozdělen do dvou stop, z nichž jedna obsahovala kompletní PCR-násadu a druhá obsahovala pouze 5μ1 vzorek, takže za účelem oddělení PCR-fragmentů z gelu byla pro orientaci vybarvena ethidíumbromidem pouze stopa se vzorkem, aby se vyloučilo poškození PCR-fragmentů, který má být izolován, ethidiumbromidem.

Izolace z gelu byla provedena pomocí soupravy QIAquick Gel Extraction Kit, která je komerčně dostupná u společnosti Qiagen z Hilden.

Stanovení koncentrace poskytlo celkovou koncentraci 20 nG/μΙ DNA.

E) Ligace • · · * · » · · •»· · »

Za účelem přípravy ligace byly vyčištěný PCR-fragment a použitý klonovací vektor pQE 70 (oba komerčně dostupné u firmy Quiagen) seříznuty pomocí Bam HI a Hind III (4 μΐ DNA= 200 ng DNA) , 1 μΐ x lOxpufr, Ιμΐ enzym, BSA a H₂O (Biolab, New England).

Seříznutý plasmid byl potom znovu přečištěn za použití soupravy QIAquick Gel Extraction Kit, vyjmut vodou a defosforylován alkalickou fosfatázou (USB, Amershan Life Science) .

Za účelem čistění byly odpovídající reakční násady naneseny na 1% agarozový gel a takto strávený amplifikát, jakož i plasmid byly z gelu izolovány způsobem popsaným v odstavci D. Koncentrace plasmidu a amplifikátu činila po čistění asi 20 ng/μΐ.

Za účelem ligace byla použita násada tvořená 3 μΐ pQE30 nebo pQE (60 ng), 2,5 μΐ amplifikátu (50 ng), 2 μΐ ligačního pufru (Boehringen, Manheim), 1,5 μΐ H₂O a 1 μΐ

T4-ligázy (Boehringer, Mannheim). Celá násada byla inkubována přes noc při teplotě 16 °C.

Potom bylo 40 μΐ elektrokomponentních buněk Escherichia coli RB791 transformováno elektroporací za použití 1,5 μΐ ligační násady. Buňky byly zavedeny do 500 μΐ SOC-prostředí, inkubovány 45 minut při teplotě 37 °C a potom byly naneseny v objemech 250 μΐ na LB -agarové desky. SOC-prostředí obsahuje v litru vody 20 g tryptonu, 5 g kvasničného extraktu, 0,5 g chloridu sodného, 10 ml IM MgSO₄ a 10 ml IM MgCl₂. LB_ama-agarové desky obsahují na litr vody 10 g tryptonu, 5 g kvasničného extraktu, 10 g NaCl, 20 g agaru a 50 mg ampicilinu při pH 7,0.

Vzrostlé kolonie byly přeočkovány a kultivovány ve 4 ml kapalného kultivačního prostředí (LB -prostředí) přes noc při teplotě 37 °C. Z této buněčné suspenze byly vždy použity 2 ml pro přípravu piasmidu (podle minipreparačního protokolu Quiagen (Quiagen, Hilden). Z plasmidového preparátu byla získána restrikční směs za použití Bam HI a HindlII. Kompletní restrikční směs byla potom nanesena na 1% agarózový gel, kde byla elektroforeticky rozdělena při 100 V (identifikace 750 kp insertu) a plasmidy byly potom případně použity pro sekvencování.

F) Sekvencování plasmidů

Sekvencování bylo provedeno pomocí soupravy SequiThermEXCEL II Long-Read DNA Sequencing Kit (Biozym, Oldendorf) a sekvenčního zařízení Li-Cor-Sequencer (MWG Biotec, Ebersberg) podle instrukcí výrobce. Jako primery byly použity standardní sekvenční primery pro pQE-vektory.

G) Screening klonu pokud jde o expresi v roztoku R-ADH

Klony s inserty 750 kp byly zkoumány s cílem stanovit jejich enzymatickou aktivitu a stereoselektivitu. Za tím účelem byly kolonie z agarových ploten přeočkovány do 20 ml tekuté kultivačního prostředí (LB -prostředí), kde byly kultivovány při 25 °C. Při buněčné hustotě (OD_5Q0) 0,5 následovala indukce za použití 1 mM isopropyl-beta-D-thiogalaktopyranosidu (IPTG). Po 18 • · · · hodinách byly buňky odstředěny a vždy 4 0 mg buněk bylo vyjmuto 350 mikrolitry Kpi-pufru (50 mM, pH = 7, 1 mM MgCl₂) . Uvolnění enzymu z buněk bylo dosaženo mokrým mletím pomocí skleněných perel (0,5 g, 0,3 mm). Potom následovala 20 minutová desintegrace pomocí Retschova mlýnu při teplotě 4 °C.

V rámci enzymového testu bylo použito 870 mikrolitrů triethanolaminového pufru 100 mikrolitrů lOOmM 4-chloracetooctové, 10 (100 mM, pH = 7,0, 1 mM MgCl₂) , roztoku ethylesteru kyseliny mikrolitrů

NAPDH (finální koncentrace 0,19 mM) a 20 mikrolitrů roztoku enzymu.

Definice enzymové jednotky: 1U odpovídá množství enzymu, které je potřeba k tomu, aby došlo ke konverzi 1 mikromolu substrátu (ethylester kyseliny 4-chlor-3-oxobutanové) za 1 minutu.

Za účelem stanovení stereosektivity bylo inkubováno 480 mikrolitrů triethanolaminového pufru (100 mM, pH =7,0, 1 mM MgCl₂) s 1,0 mM ethylesteru kyseliny 4-chlor-3-oxobutanové, 1,9 mM NADPH (vždy finální koncentrace) a 20 mikrolitry roztoku enzymu. Po 15 minutách inkubace se reakční směs zfiltruje a zředí v poměru 1:10 chloroformem, načež se vzorek zředěné reakční směsi analyzuje pomocí plynového chromatografu sdruženého s hmotovým spektrometrem.

Podmínky plynové chromatografie:

chirální sloupec: Lipodex E, ID = 0,25 mm, I = 25 m (Macherey-Nagel),

1. 2 minuty při 60 °C, v průběhu 28 minut z 60 °C na 130 °C při rychlosti zvy-

• · · · šování teploty 2,5 °C za minutu,

3. 15 minut při 130 °C.

(R)-Specifická alkohol-dehydrogenáza může být klonována a aktivně superexprimována z kmenů Lactobacillus uvedených v následující tabulce.

* · · ·

Tabulka

Kmen	Plasmid	Číslo klonu	Aktivita U/g buněk*	ee v %
L. para-
buchneri	pQE 30	12	450	>99, 9
L. para-
buchneri	pQE 30	14	170	>99, 9
L. kand-
ieri	pQE 30	11	280	>99,9
L. kand-
leri	pQE 7 0	17	710	>99, 9
L. minor	pQE 30	2	2830	>99, 9
L. minor	pQE 70	3	680	>99,9
L. minor	pQE 7 0	4	700	>99,9

*) Aktivita vypočtena podle G) (mokré mletí); aktivity po fermentaci a desintegraci za použití French-lisu jsou výrazně vyšší.

Za účelem získání enzymu se kmen s největší enzymatickou aktivitou kultivuje ve fermentoru (vsázka 10

1). K indukci dochází při OD_50Q 40 za použití 1 mM IPTG. Po hodinách se provede sběr buněk, přičemž 300 g těchto buněk se vyjme 3 litry Kpi-pufru (50 mM, pH - 7, 1 mM

MgCl₂) , načež se provede desintegrace buněk pomocí French-lisu (Gaullin, Siemens). Zbytek získaný po odstředění bude dále uváděn jako surový extrakt a má objemovou aktivitu asi 2000 U/ml (20 000 U/g vlhké hmoty).

H) Získání enzymu a čistění enzymu

Za účelem charakterizace enzymu se ·část získaného enzymu přečistí hydrofobní interakční chromatografií na Q-Sepharóze ff (fast flow). Použitý sloupec byl uveden do rovnováhy s 50mM Kpi-pufrem, pH=7,0, lmM MgCl₂. Po nanesení surového extraktu na sloupec a krátkém propláchnutí ekviribračním pufrem se enzym eluuje při stoupajícím lineárním solném gradientu (0-1M NaCl, 1 ml/min) při koncentraci soli asi 0,3 M NaCl. Po přečištění frakcí s obsahem enzymu se získá asi 25 ml vyčištěného enzymu s objemovou aktivitou asi 800 U/ml a obsahem proteinu 20 až 22 mg/mol. Takto vyčištěný enzym má tedy specifickou aktivitu asi 35 až 40 U/mg proteinu.

Všechny enzymatické aktivity byly stanoveny při teplotě 25 °C. Enzymatická aktivita byla vypočtena následujícím způsobem:

Výpočet: 1 jednotka = 1 mikromol násady substrátu/min,

Lambert-Beerschův zákon.

·· ·· ·«··

Úbytek NADPH byl sledován při 340 nm (viz enzymatická testová násada) - ÁE/min,

N = zřeďovací faktor enzymu,

V - objem enzymu v ml (0,01), ^Vkyveta = objem kyvety = 1 ml, d = tloušťka vsázky v kyvetě = 1 cm, ^eNADPH ⁼ extinkční koeficient NADPH = 6,22 [mM-l*cm , aktivita = (ΔΕ/min*N*V_kyvgta) / (e_NADPH*V*d) .

Stanovení proteinu bylo provedeno podle Bradforda (Bio-Rad-Laboratoites GmbH, Protein Assay).

Příklad 3

Enzymem katalyzovaná výroba ethyl-(S)-4-chlor-3-hydroxybutyrátu

A) V 5 litrovém měřítku

Pro enzymem katalyzovanou syntézu ethyl-(S)-4-chlor-3-hydroxybutyrátu z ethylesteru kyseliny

4-chlor-3-oxo-butanové se použijí surový extrakt alkohol-dehydrogenázy získaný v příkladu 2 a koenzym NADP. Oxidovaný koenzym je současnou přítomností isopropanolu kontinuálně regenerován, takže reakce potřebuje pouze katalytické množství koenzymu.

Násada obsahuje:

litry triethanolaminového pufru 100 mM pH=7,0, lmM MgCl₂, 10% glycerin,

400 mg NADP,

600 ml· isopropanolu,

800 ml ethylesteru kyseliny octové,

600 ml ethylesteru kyseliny 4-chlor-3-oxobutanové a asi 100 000 jednotek alkohol-dehydrogenázy.

Po 3 dnech míchání při teplotě místnosti byla plynovou chromatografií prokázána úplná konverze ethylesteru kyseliny 4-chlor-3-oxobutanové na ethyl-(S)-4-chlor-3-hydroxybutyrát s více než 99,9% enantiomerní čistotou.

Po oddělení vodné fáze, odpaření -rozpouštědla a případné destilaci se získá čistý ethyl-(S)-4-chlor-3-hydroxybutyrát s více než 99,9% enantiomerní čistotou.

Β) V 50 litrovém měřítku

Reakční násada pro konverzi 10 1 ethylesteru kyseliny 4-chlor-3-oxobutanové má následující složení:

litrů triethanolaminového pufru 100 mM pH=7,0, lmM MgCl₂, 10% glycerin, g NADP, litrů isopropanolu, litrů ethylesteru kyseliny octové, litrů ethylesteru kyseliny 4-chlor-3-oxobutanové a asi 2 miliony jednotek alkohol-dehydrogenázy (1,25 1 surového extraktu).

Po 7 dnech míchání při teplotě místnosti byla plynovou chromatografií prokázána úplná konverze ethylesteru kyseliny 4-chlor-3-oxobutanové na ethyl-(S)-4-chlor-3-hydroxybutyrát s více než 99,9% enantiomerní čistotou.

Příklad 4

Biochemická charakterizace klonované alkohol-dehydrogenázy z Lactobacillus minor

A) pH-Stabilita

Závislost aktivity enzymu při skladování v pufrech s rozdílnými hodnotami pH byla zkoumána v rozmezí pH 4 až 11. K tomu účelu byly použity různé pufry (50 mM) v rozmezí pH 4 až 11, přičemž se inkubuje po dobu 30 minut enzym vyčištěný podle příkladu 2 a zředění v pufru v poměru 1:100. Všechny použité pufry obsahovaly 1 mM MgCl₂. 10 mikrolitrů bylo potom použito při normálním enzymovém testu (triethanolaminový pufr 100 mM pH=7,0, 1 mM MgCl₂, 10 mM ethylesteru kyseliny 4-chlor-3-oxobutanové a 0,19 mM NADPH). Reakce byla provedena po dobu 1 minuty při teplotě 30 °C a 340 nm. Výchozí hodnota je přitom naměřená hodnota, která se získá bezprostředně po zředění enzymu v triethanoiovém pufru 50 mM pH=7,0. Tato hodnota odpovídala za předem daných podmínek změně extinkce 0,20/min a byla určena jako hodnota 100 %, přičemž všechny následně získané naměřené hodnoty byly k této hodnotě vztaženy. Získané výsledky jsou uvedeny v následující tabulce 2.

Tabulka 2

Hodnota	Pufrovací	Aktivita	Pufrovací	Aktivita
pH	systém	v % (n=2)	systém	%(n=2)
4	Na-acetát/ kyselina octová	87,5±6,5
4,5	Na-acetát/ kyselina octová	94,5±3,0
5	Na-acetát kyselina octová	94,5±1,5	MES/NaOH	55±5
5,5	kh₂po₄/ k₂po₄	93±3	MES/NaOH	77,1±2,1
6	kh₂po₄/	100±0	Triethanol
	K₂PO₄		amin/NaOH	100±0
6,5	kh₂po₄/	97,5±2,5	Triethanol··
	K₂PO₄		amin/NaOH	100±0
7	kh₂po₄/	100±Q	Triethanol·
	K₂PO₄		amin/NaOH	97,9±2,1
7,5	kh₂po₄/ k₂po₄	97,5±7,5	Tris/HCl	94,6±1,3
8	kh₂eo₍/ K₂PO₄	93,0±3,0	Tris/HCl	89,2+0

Tabulka 2 (pokračování)

8,5	kh₂po₄/ K₂PO₄	102,5±2,5	Tris/HCl	60±4,2
9	Glycin/ NaOH	76,5±1,5	Tris/HCl	63,1±4,8
9,5	Glycin/ NaOH	52,5±7,5
10	Glycin/ NaOH	52,5±7,5
11	Glycin/	0,0+0

NaOH

Tabulka 2 ukazuje, že enzym má dobrou pH-stabilitu zejména v kyselé oblasti pH, přičemž se zdá, že tato stabilita je závislá nejen na hodnotě pH, nýbrž také na použitém pufrovacím systému. Tak například při použití TRIS- a MES-pufru při stejné hodnotě pH lze pozorovat silnou inaktivaci enzymu. U KPi-pufru nedochází v rozmezí pH 5,5 až 8,5 k žádné významné inaktivaci.

b) Teplotní stabilita

Způsobem, který je analogický se způsobem popsaným v odstavci A), se stanoví teplotní stabilita v rozmezí teplot 25 až 50 °C. Za tím účelem se vždy· zředění 1:100 vyčištěného enzymu inkubuje při udané teplotě po dobu 30 minut, načež se výše uvedeným postupem změří při 30 °C aktivita enzymu. Také zde se jako výchozí hodnota použije hodnota, která se získá bezprostředně po zředění enzymu v triethanolaminovém pufru 50 mM pH=7,0. Tato hodnota se také zde určí jako hodnota 100 %. Alkohol-hydrogenáza z Lactobacillus minor se stabilní až do teploty 40 °C. Potom její aktivita rychle klesá, což je zřejmé z následující tabulky 3.

• · · ·

Tabulka 3

Teplota	Aktivita v %(n=4)	Teplota	Aktivita v %(n=4)
25	101+3,2	40	33,4+3,8
30	81,2+5,8	42	0+0
35	67,0+1,6	45	0+0
37	20,2+2,4	50	0+0

C) pH-Optimum

Za účelem stanovení uvedeného pH-optima byla sledována enzymatická reakce v pufrech uvedených v tabulce 3. Koncentrace ethylesteru kyseliny 4-chlor-3-oxobutanové činila jako při standardním testu 10 mM, zatímco koncentrace NADPH činila 0,19 mM. Reakce byla prováděna při teplotě 30 °C. Peo enzym podle vynálezu bylo takto nalezeno pH-optimum mezi 7 a 7,5. Získané výsledky jsou uvedeny v následující tabulce 4.

Tabulka 4

Hodnota pH	Pufrovací systém	Aktivita v U/ml ne- zředěného enzymu
4	Na-acetát/kyselina octová	85
4,5	Na-acetát/kyselina octová	132
5	MES/NaOH	218
5,5	MES/NaOH	240
6	Triethanolamin/NaOH	381
6,5	Triethanolamin/NaOH	349
7	Triethanolamin/NaOH	510
7,5	Tris/HCl	707
8	Tris/HCl	585
8,5	Tris/HCl	486
9	Tris/HCl	488
10	Glycin/NaOH	131
11	Glycin/NaOH	0

• · · ·

D) Teplotní optimum

Za účelem stanovení optimální teploty účinnosti enzymu byla aktivita enzymu měřena při teplotách od 25 do 60 °C. Násada použitá při tomto testu odpovídala standardní koncentraci ethylesteru kyseliny 4-chlor-3-oxobutanové. Jak je to patrné z tabulky 5 má enzym optimální teplotu při teplotě 55 °C, přičemž potom aktivita enzymu se zvyšující se teplotou rychle klesá.

Tabulka 5

Teplota (°C)	Účinnost v U/ml nezředěného enzymu
25	540
30	1235
35	1968
40	1621
45	2469
50	2469
55	2855
60	0

• · · ·

E) Substrátové spektrum

Dále byly v testovaných násadách namísto ethylesteru kyseliny 4-chlor-3-oxobutanové použity ještě další substráty. K tomu účelu byla použita následující testovací násada:

970 mikrolitru triethanoiaminového pufru (100 mM, pH=7,0, 1 mM MgCl₂ s 10 mM ketonové sloučeniny), mikrolitru enzymu (1:100).

Za těchto podmínek byla stanovená aktivita pro ethylester kyseliny 4-chlor-3-oxobutanové považována za 100 % a stanovené aktivity enzymu při použití jiných substrátu byly vztaženy k této 100% hodnotě. Získané výsledky jsou uvedeny v následující tabulce 6.

Tabulka 6

Substrát	Aktivita v % (n=2)
Ethylester kyseliny 4-
chlor-3-oxobutanové	100
Pyrohroznan ethylnatý	192,3±11,5
2-Oktanon	90,8±1,2
Methylesteracetoacetát	120±7,7

Ethylester kyseliny 2-oxo4-fenylbutanové

62,7±4,

F) Stabilita enzymu v organických rozpouštědlech

Za účelem studia stability enzymu při jeho styku s organickými rozpouštědly byla alkohol-dehydroganáza z Lactobacillus minor zředěna v uvedených rozpouštědlových směsích a inkubována při teplotě místnosti (u rozpouštědel nemísitelných s vodou se zředění vztahuje k vodné fázi). Při testu bylo zajištěno stálé promíchávání obou fází (třepačka, 200 otáček za minutu) . Následně bylo 10 mikrolitru roztoku enzymu použito ve standardní testové násadě. Také zde byla výchozí hodnota po zředění v pufru (triethanolaminový pufr 100 mM, pH=7,0, 1 mM MgCl₂) určena jako hodnota 100 % a všechny dále zjištěné hodnoty byly k této výchozí hodnotě vztaženy. Získané hodnoty jsou uvedeny v následujících tabulkách 7 A a 7B.

Tabulka 7A

S vodou mísitelná rozpouštědla

Rozpouštědlo	LogP	t=2h	t=8h	t=2 4h	t=4 8h
Pufr		86	70	3	0
10 % isopropanolu	0,28	32	34	16	0
20 % isopropanolu	0,28	16	17	7	0
10 % DMSO	-1,3	73	54	60	40
20 % DMSO	-1,3	73	54	57	40
1M Sorbitol		93	74	60	6
10 % Glycerínu	-3,0	120	64	62	28
20 % Glycerínu	-3,0	120	100	100	104

Jak je zřejmé z tabulky 7A, působí glycerín, DMSO a sorbitol na použitou alkohol-dehydrogenázu aktivačně, popřípadě stabilizačně. Při testu použitý isopropanol naopak působí deaktivačně.

• · · ·

Tabulka 7B

Rozpouštědla nemísitelná s vodou

Rozpouštědlo	LogP	t=2h	t=8h	t=24h	t=4 8h
Pufr		86	70	3	0
20 % Ethylesteru kyselinu octové	0,68	87	50	10	8
20 % Diethyletheru 0,85	53	42	37	23
20 % terc-Butyl- methyletheru	1,21	67	51	38	24
20 % Diisopropyl- etheru	1,55	100	57	41	29
20 % Pentanu	3,0	74	55	7	6
20 % Hexanu	3,5	80	39	2	5
20 % Heptanu	4	51	49	7	6
20 % Oktanu	4,5	87	47	2	1
Jak je zřejmé z	tabulky	7B,	vykazuje zkoumaná

alkohol-dehydrogenáza ve rozpouštědel pozoruhodnou rozDouštědla s hodnotami velkém stabilitu. logP mezi zkoumanou alkohol-dehydrogenázu silněj počtu organických

Nápadné je to, že a 3 neinhibují i než rozpouštědla s

• · * · hodnotami logP mezi 3 a 4,5, přičemž pokud jde o delší inkubační doby (24 g a 48 h), mají rozpouštědla s hodnotami logP mezi 0 a 3 na zkoumanou alkohol-dehydrogenázu stabilizující účinek ve srovnání s odpovídajícím hodnotami stanovenými pro pufr. Zkoumaná alifatická rozpouštědla pentan, hexan, heptan a oktan tento stabilizační účinek při dlouhodobé inkubaci nevykazují.

Hodnota logP složky X je logaritmus rozdělovacího koeficientu složky X ve dvoufázovém systému oktanol/voda v objemovém poměru 50:50. P = koncentrace složky X v oktanolové fázi/koncentrace složky X ve vodné fázi.

G) Stabilita enzymu za procesních podmínek

Za účelem zkoumání stability enzymu za procesních podmínek byla alkohol-dehydrogenáza z Lactobacillus minor zředěna v rozpouštědlových směsích použitých v rámci dvoufázového systému v poměru 1:100 a inkubována při teplotě místnosti. Následně bylo 10 mikrolitru roztoku enzymu použito v násadě standardního aktivitního testu. V následující tabulce 8 jsou aktivity enzymu vyjádřeny v procentických hodnotách vztažených k výchozí hodnotě.

* φ

Tabulka 8

	6h	20h	46h	60h	84h
Triethanolamino- vý pufr, 100 mM, 1 mM Mg₂Cl₂	100	75	0	0	0
Směs B	100	85	80	60	55
Směs C	110	95	95	85	80
Směs D	100	65	55	50·	50

Směs	B:	pufr,	10%	glycerín,	10% isopropanol,
směs	C:	pufr,	20%	glyceín,	10% isopropanol,
směs	D:	pufr,	10%	glycerín,	10% isopropanol + 20%
		ethylester kyseliny	octové.

Bylo zjištěno, že rekombinantní alkohol-dehydrogenáza z Lactobacillus minor je stabilní a aktivní po dobu několika dnů v kombinaci rozpouštědel použitých v uvedeném dvoufázovém systému.

Claims

PATENTOVÉ NÁROKY

1. Způsov enantiomerní redukce ketosloučenin obecného vzorce I

R¹-C(O)-R² (I) ve kterém

1 2

R a R , které jsou nezávisle jeden na druhém stejné nebo odlišné a znamenají

1. atom vodíku,
2. alkylovou skupinu obsahující 1 až 20 uhlíkových atomů, přičemž tato alkylová skupina je přímá nebo rozvětvená,
3. alkenylovou skupinu obsahující 2 až 20 uhlíkových atomů, přičemž tato alkenylová skupina je přímá nebo rozvětvená a případně obsahuje jednu, dvě, tři nebo čtyři dvojné vazby,
4. alkinylovou skupinu obsahující 2 až 20 uhlíkových atomů, přičemž tato alkinylová skupina je přímá nebo rozvětvená a případně obsahuje jednu, dvě, tři nebo čtyři trojné vazby,
5. arylovou skupinu obsahující 6 až 14 uhlíkových atomů,
6. alkylarylovou skupinu, ve které alkylový zbytek obsahuje 1 až 8 uhlíkových atomů a arylový zbytek obsahuje 6 až 14 uhlíkových atomů, nebo ·· ·· ···· • · · · · · ·
7. R¹ a R² tvoří společně se zbytkem -C(0)- arylovou skupinu obsahující 6 až 14 uhlíkových atomů nebo heterocyklickou skupinu obsahující 5 až 14 uhlíkových atomů, přičemž skupiny uvedené výše v odstavcích 1. až 7. jsou nesubstituované nebo nezávisle na sobě jednou až třikrát substituované

a) skupinou -OH,

b) atomem halogenu, jakým je atom fluoru, atom chloru, atom bromu nebo atom jodu,

c) skupinou -N0₂,

d) -C(O)-O-alkylovou skupinou, ve které alkylový zbytek obsahuje 1 až 20 uhlíkových atomů v přímém nebo rozvětveném řetězci a je nesubstituován nebo jednou až třikrát substituován atomem halogenu, hydroxylovou skupinou, aminoskupinou nebo nitroskupinou, nebo

e) heterocyklickou skupinou obsahující 5 až 14 uhlíkových atomů, která je nesubstituovaná nebo jednou až třikrát substituovaná atomem halogenu, hydroxylovou skupinou, aminoskupinou nebo nitroskupinou, vyznačený tím, že se

a) sloučenina obecného vzorce I, alkohol-dehydrogenáza, voda, kofaktor a organické rozpouštědlo s hodnotou logP rovnou 0,5 až 4,0

b) inkubuje ve dvoufázovém systému a

c) vytvořená chirální hydroxysloučenina se izoluje.

ί ···· · ·· · · · · · · • ····«· *

2. Způsob podle nároku 1,vyznačený tím, že se použije sloučenina obecného vzorce I zvolená z množiny zahrnující ethylester kyseliny 4-chlor-3-oxobutanové, acetofenon, methylester kyseliny acetooctové, ethyl-2-oxo-4-fenylbutyrát, 2,5-hexandion, pyrohroznan ethylnatý a 2-oktanon.

3. Způsob podle nároku 1 nebo 2, vyznačený tím, že se použije organické rozpouštědlo s hodnotou logP rovnou 0,6 až 3,0, zejména rovnou 0,6 až 1,9.

4. Způsob podle nároku 3,vyznačený tím, že se použije organické rozpouštědlo s hodnotou logP rovnou 0,63 až 1,75.

5. Způsob podle nároku 1,vyznačený tím, že se jako organické rozpouštědlo použije diethylether, terc-butylmethylether, diisopropylether nebo ethylester kyseliny octové.

6. Způsob podle jednoho nebo několika z nároků 1 až 5, vyznačený tím, že se použije alkohol-dehydrogenáza z kvasnic, z koňských jater, z thermoanaerobium brocki, z Rhodococcus erythropolis, z Lactobacillus kefir, z Lactobacillus brevis, z Lactobacillus minor nebo alkohol-dehydrogenáza s aminokyselinovou sekvencí podle SEQ ID NO: 4.

7. Způsob podle jednoho nebo několika z nároků 1 až 8, vyznačený tím, že se přidá pufr, jako kaliumfosforečnanový pufr, Tris/HCl-pufr nebo ····· · ·· ···· ··· · · · · · · triethanolaminový pufr s hodnotou pH 5 až 10, výhodně s hodnotou pH 6 až 9.
8. Způsob podle nároku 7,vyznačený tím, že se k pufru přidají hořečnaté ionty, jako MgCl₂, v koncentraci 0,2 až 10 mM, výhodně v koncentraci 0,5 až 2 mM.
9. Způsob podle jednoho nebo několika z nároků 1 až 8, vyznačený tím, že se jako kofaktor přidá NADPH nebo NADH v množství 0,05 až 0,25 mM, zejména v množství 0,06 až 0,2 mM, vztaženo na vodnou fázi.
10. Způsob podle jednoho nebo vyznačený tí alkohol-dehydrogenázy přidá dimethylsulfoxid.
11. Způsob podle jednoho nebo vyznačený tím, že
12. Způsob podle jednoho nebo vyznačený tím, že I použije v množství 2 až 30 výhoddně v množství 10 až 25 zejména v množství 15 až 22 %, několika z nároků 1 až 9, m, že se jako stabilizátor glycerín, sorbitol nebo několika z nároků 1 až 10, se přidá isopropanol.

několika z nároků 1 až 11, se sloučenina obecného vzorce %, vztaženo na celkový objem, %, vztaženo na celkový objem, vztaženo na celkový objem.
13. Způsob podle jednoho nebo několika z nároků 1 až 12, vyznačený tím, že se reakce provádí při teplotě asi 10 až 70 °C, výhodně při teplotě 30 až 60 °C.

• · · ·
14. Způsob podle jednoho nebo několika z nároků 1 až 13, vyznačený tím, že se organické rozpouštědlo použije v množství 1 až 90 %, vztaženo na celkový objem reakční násady, výhodně v množství 15 až 60 %, vztaženo na celkový objem reakční násady, zejména v množství 20 až 50 %, vztaženo na celkový objem reakční násady.
15. Způsob podle jednoho nebo několika z nároků 1 až 14, vyznačený tím, že poměr organického rozpouštědla k vodě je roven 9:1 až 1:9, výhodně 1:1 až 1:3.
16. Způsob podle nároku 10, vyznačený tím, že se stabilizátor použije v množství 5 až 30 %, vztaženo na celkový objem rerakčni násady, výhodně v množství 10 až 20 %, vztaženo na celkový objem reakční násady, zejména v množství 10 až 20 %, vztaženo na celkový objem reakční násady.
17. Způsob podle nároku 11, vyznačený tím, že se isopropanol použije v množství 5 až 30 %, vztaženo na celkový objem reakční násady, výhodně v množství 10 až 20 %, vztaženo na celkový objem reakční násady, zejména v množství 10 %, vztaženo na celkový objem reakční násady.
18. Způsob podle nároku 6, vyznačený tím, že se alkohol-dehydrogenáza použije v množství 20 000 až 200 000 U na kilogram sloučeniny obecného vzorce I určené ke konverzi, výhodně v množství asi 100 000 U na kilogram sloučeniny obecného vzorce I určené ke konverzi.

• · · ·
19. Alkohol-dehydrogenáza z Lactobacillus minor s aminokyselinovou sekvencí podle SEQ ID NO: 4.
20. DNA-sekvence podle SEQ ID NO: 3.
21. Mutované buňky Escherichia coli uložené pod depozitním kódem DSM 14196.
22. Způsob získání alkohol-dehydrogenázy z Lactobacillus minor podle nároku 19, vyznačený tím, že se ve vhodném prokaryotickém nebo eukaryotickém mikroorganismu, zejména v buňkách Escherichia coli uložených pod depozitním kódem DSM 14196, exprimuje DNA, která kóduje alkohol-dehydrogenázu z Lactobacillus minor, a alkohol-dehydrogenáza se případně vyčistí.
23. Způsob získání enantioselektivní (S)-hydroxysloučeniny obecného vzorce II

R¹-C(OH)-R² (II) ve kterém

1 2

R a R , které jsou nezávisle jeden na druhém stejné nebo odlišné a znamenají

1. atom vodíku,

2. alkylovou skupinu obsahující 1 až 20 uhlíkových atomů, přičemž tato alkylová skupina je přímá nebo rozvětvená, • ·

3. alkenylovou skupinu obsahující 2 až 20 uhlíkových atomů, přičemž tato alkenylová skupina je přímá nebo rozvětvená a případně obsahuje jednu, dvě, tři nebo čtyři dvojné vazby,

4. alkinylovou skupinu obsahující 2 až 20 uhlíkových atomů, přičemž tato alkinylová skupina je přímá nebo rozvětvená a případně obsahuje jednu, dvě, tři nebo čtyři trojné vazby,

5. arylovou skupinu obsahující 6 až 14 uhlíkových atomů,

6. alkylarylovou skupinu, ve které alkylový zbytek obsahuje 1 až 8 uhlíkových atomů a arylový zbytek obsahuje 6 až 14 uhlíkových atomů, nebo

1 2

7. R a R tvoří společně se zbytkem -C(O)-· arylovou skupinu obsahující 6 až 14 uhlíkových atomů nebo heterocyklickou skupinu obsahující 5 až 14 uhlíkových atomů, přičemž skupiny uvedené výše v odstavcích 1. až 7. jsou nesubstituované nebo nezávisle na sobě jednou až třikrát substituované

a) skupinou -OH,

b) atomem halogenu, jakým je atom fluoru, atom chloru, atom bromu nebo atom jodu,

c) skupinou -NO₂,

d) -C(O)-O-alkylovou skupinou, ve které alkylový zbytek obsahuje 1 až 20 uhlíkových atomů v přímém nebo rozvětveném řetězci a je nesubstituován nebo jednou až třikrát substituován atomem halogenu, hydroxylovou skupinou, aminoskupinou nebo nitroskupinou, nebo

e) heterocyklickou skupinou obsahující 6 až 14 uhlíkových atomů, která je nesubstituovaná nebo jednou až třikrát substituovaná atomem halogenu, hydroxylovou skupinou, aminoskupinou nebo nitroskupinou, vyznačený tím, že se

a) racemická směs obsahující sloučeninu obecného vzorce II, alkohol-dehydrogenázu podle vynálezu, vodu, kofaktor a organické rozpouštědlo s hodnotou logP rovnou 0,5 až 4,0, například z množiny zahrnující diethylether, terc-butylmethylether, diisopropylether a ethylester kyseliny octové,

b) inkubuje ve dvoufázovém systému a

c) vytvořená enantiomerně čistá (S)-hydroxysloučenina se izoluje.
24. Způsob podle nároku 23, vyznačený tím, že se přidá aceton.