PL207271B1

PL207271B1 - Sposób enancjoselektywnej redukcji związku ketonowego

Info

Publication number: PL207271B1
Application number: PL367043A
Authority: PL
Inventors: Antje Gupta; Klaus Breese; Gert Bange; Peter Neubauer
Original assignee: Iep Gmbh
Priority date: 2001-04-20
Filing date: 2002-04-15
Publication date: 2010-11-30
Also published as: US20090017510A1; HU229667B1; PT1383899E; ES2334016T3; DK1383899T3; HUP0303803A2; WO2002086126A2; US8361765B2; EP2123760A1; JP2009207499A; DE10119274A1; JP2004527251A; CZ20032820A3; WO2002086126A3; EP1383899A2; JP4417628B2; DE50213871D1; SK288326B6; SK12692003A3; EP1383899B1

Description

Opis wynalazku

Przedmiotem wynalazku jest sposób enancjoselektywnej redukcji związku ketonowego.

Optycznie czynne hydroksyzwiązki są wartościowymi syntetycznymi jednostkami budulcowymi do wytwarzania wielu farmakologicznie ważnych związków. Związki te są często trudne do wytworzenia za pomocą klasycznych chemicznych sposobów i tylko rzadko mogą uzyskiwać wymagane do zastosowań farmakologicznych czystości enancjomerów. Dlatego też zazwyczaj do wytwarzania związków chiralnych są stosowane sposoby biotechnologiczne, gdzie stereoselektywne reakcje są przeprowadzane albo przez całe mikroorganizmy albo przez izolowane enzymy.

Często korzystne okazało się stosowanie izolowanych enzymów, ponieważ z nimi z reguły uzyskiwane są wyższe wydajności jak i wyższa czystość enancjomerów.

Dehydrogenazy, a w szczególności dehydrogenazy alkoholowe, są wartościowymi katalizatorami do uzyskiwania produktów chiralnych przez stereoselektywną redukcję organicznych związków ketonowych do odpowiednich chiralnych alkoholi. Zasadniczo znane są odpowiednie enzymy z drożdży, wątroby konia lub Thermoanaerobium brockii. Enzymy te jako koenzymy wymagają NADH (dinukleotyd nikotynoadeninowy) lub NADPH (fosforan dinukleotydu nikotynoadeninowego). Dalszymi znanymi dehydrogenazami alkoholowymi są, na przykład, (S)-specyficzna dehydrogenaza alkoholowa z Rhodococcus erythropolis i (R)-specyficzna dehydrogenaza alkoholowa z rodzaju Lactobacillus. Oba typy enzymów mają szerokie spektrum substratów ketonowych i wykazują wysoką enancjoselektywność. Do uzyskiwania chiralnych (R)-alkoholi szczególnie nadają się dehydrogenazy alkoholowe z Lactobacillus kefir (DE 40 14 573) i Lactobacillus brevis (DE 196 10 984).

Niekorzystne dla stosowania dehydrogenaz alkoholowych są jednak niska stabilność enzymu i aktywność enzymatyczna dehydrogenaz alkoholowych w rozpuszczalnikach organicznych i czę sto tylko słaba rozpuszczalność w wodzie związków ketonowych, które mają być redukowane. Dalszym czynnikiem ograniczającym stosowanie dehydrogenaz alkoholowych w organicznych rozpuszczalnikach jest konieczne zastosowanie NADE lub NAD ze względu na potrzebę kofaktora, ponieważ kofaktor (NADP, NAD) jest rozpuszczalny w wodzie i jest regenerowany ekonomicznymi sposobami.

Wynalazek ma na celu poprawienie wymienionych wad przez modyfikację warunków sposobu. To zadanie jest rozwiązane według wynalazku przez zastosowanie układu dwufazowego, zawierającego organiczny rozpuszczalnik, dehydrogenazę alkoholową, wodę, kofaktor i związek ketonowy.

Wynalazek dotyczy sposobu enancjoselektywnej redukcji związku ketonowego o wzorze I R¹-C-(O)-R² (I) w którym R¹ i R² niezależ nie od siebie są takie same lub inne i oznaczają

1. atom wodoru,

2. -(C1-C20)-alkil, który ma łańcuch prosty lub rozgałęziony

3. -(C2-C20)-alkenyl, który ma łańcuch prosty lub rozgałęziony i ewentualnie zawiera jedno, dwa, trzy lub cztery wiązania podwójne

4. -(C2-C20)-alkinyl, który ma łańcuch prosty lub rozgałęziony i ewentualnie zawiera jedno, dwa, trzy lub cztery wiązania potrójne

5. - (C6-C14)-aryl,

6. - (C1-C8)-alkilo-(C6-C14)-aryl, lub

7. R¹ i R² razem z resztą -C(O)- tworzą -(C6-C14-aryl) lub -(C5-C14)-heterocykl, przy czym wymienione powyżej w 1. do 7. reszty są niepodstawione lub podstawione 1 do 3 podstawnikami i są niezależnie od siebie podstawione podstawnikiem wybranym spośród następujących:

a) -OH,

b) halogen, taki jak fluor, chlor, brom lub jod,

c) -NO2,

d) -C(O)-O-(C1-C20)-alkil, który ma łańcuch prosty lub rozgałęziony i jest niepodstawiony lub podstawiony 1, 2 lub 3 podstawnikami wybranymi spośród halogenu, hydroksylu, grupy aminowej lub nitrowej, lub

e) -(C5-C14)-heterocykl, który jest niepodstawiony lub podstawiony od 1 do 3 podstawnikami, takimi jak halogen, hydroksyl, grupa aminowa lub nitrowa,

PL 207 271 B1 przy czym

a) związek o wzorze I w ilości od 10% do 25% w stosunku do całkowitej objętości mieszaniny reakcyjnej, dehydrogenazę alkoholową, wodę, kofaktor NADPH lub NADH i rozpuszczalnik organiczny z logP od 0,5 do 4,0;

b) inkubuje się w układzie dwufazowym obejmującym wodę, organiczny rozpuszczalnik i związek o wzorze (I);

c) regeneruje się w sposób ciągły tworzony przez dehydrogenazę alkoholową utleniony kofaktor i

d) izoluje się wytworzony chiralny hydroksyzwiązek.

Sposób według wynalazku wykazuje długi okres trwałości przez działanie stabilizujące rozpuszczalnika na enzym, czystość enancjomeryczną ponad 99,9% wytworzonych chiralnych związków hydroksylowych i wysoką wydajność w stosunku do użytej ilości związku ketonowego.

Resztami -(C6-C14)arylowymi są, na przykład, fenyl, naftyl. Określenie „aryl oznacza aromatyczne reszty zawierające od 6 do 14 atomów węgla, na przykład, 1-naftyl, 2-naftyl, bifenylil, na przykład, 2-bifenylil, 3-bifenylil i 4-bifenylil, antryl lub fluorenyl. Korzystnymi resztami arylowymi są reszty bifenylilowe, naftylowe, a zwłaszcza reszty fenylowe. Określenie „halogen oznacza pierwiastek z grupy obejmującej fluor, chlor, brom i jod. Określenie -(C1-C20)-alkil oznacza grupę węglowodorową o łańcuchu prostym lub rozgałęzionym, zawierającą 1 do 20 atomów węgla.

Termin -(C5-C14)-heterocykl oznacza monocykliczny lub bicykliczny 5 do 14-członowy pierścień heterocykliczny, który jest częściowo lub całkowicie nasycony. Przykładami heteroatomów są atomy N, O i S. Przykładami -(C5-C14)-heterocykl są reszty, które pochodzą od pirolu, furanu, tiofenu, imidazolu, pirazolu, oksazolu, izoksazolu, tiazolu, izotiazolu, tetrazolu, 2-tlenków 1,2,3,5-oksatiadiazolu, triazolonów, oksadiazolonów, izoksazolonów, oksadiazolidynodionów, triazoli, które są podstawione przez F, -CN, -CF3 lub -C(O)-O-(C1-C4)-alkil, 3-hydroksypiro-2,4-dionów, 5-okso-1,2,4-tiadiazoli, pirydyny, pirazyny, pirymidyny, indolu, izoindolu, indazolu, ftalazyny, chinoliny, izochinoliny, chinoksaliny, chinazoliny, cynnoliny, karboliny i pochodnych tych heterocykli skondensowanych z benzenem z cyklopentanem, cykloheksanem lub cykloheptanem. Szczególnie korzystny jest 2- lub 3-pirolil, fenylopirolil taki jak 4- lub 5-fenylo-2-pirolil, 2-furyl, 2-tienyl, 4-imidazolil, metyloimidazolil, na przykład, 1-metylo-2-, -4- lub -5-imidazolil, 1,3-tiazol-2-il, 2-pirydyl, 3-pirydyl, 4-pirydyl, N-tlenek 2-, 3- lub 4-pirydylu, 2-pirazynyl, 2-, 4- lub 5-pirymidynyl, 2-, 3- lub 5-indolil, podstawiony 2-indolil, na przykład, 1-metylo-, 5-metylo-, 5-metoksy-, 5-benzyloksy-, 5-chloro- lub 4,5-dimetylo-2-indolil, 1-benzylo-2- lub -3-indolil, 4,5,6,7-tetrahydro-2-indolil, cyclohepta[b]-5-pirolil, 2-, 3- lub 4-chinolil, 1-, 3- lub 4-izochinolil, 1-okso-1,2-dihydro-3-izochinolil, 2-chinoksalinyl, 2-benzofuranyl, 2-benzotienyl, 2-benzoksazolil lub benzotiazolil lub dihydropyridynyl, pirolidynyl, na przykład, 2- lub 3-(N-tiomorfolidynyl), piperazynyl, morfolinyl, tiomorfolinyl, tetrahydrotienyl lub benzodioksoalanyl.

Korzystnie stosuje się związek o wzorze I wybrany spośród estru etylowego kwasu 4-chloro-3-okso-butanowego, acetofenonu, acetooctanu metylu, 2-okso-4-fenylomaślanu etylu, 2,5-heksanodionu, pirogronianu etylu i 2-oktanonu.

Korzystnie stosuje się rozpuszczalnik organiczny z logP od 0,6 do 3,0, szczególnie od 0,6 do 1,9, jeszcze korzystniej z logP od 0,63 do 1,75.

Korzystnie jako rozpuszczalnik organiczny stosuje się eter dietylowy, eter tert-butylowo-metylowy, eter diizopropylowy lub octan etylu.

Korzystnie w powyższych sposobach stosuje się dehydrogenazę alkoholową z drożdży, wątroby konia, Thermoanaerobium brockii lub Rhodococcus erythropolis Lactobacillus kefir, Lactobacillus brevis, Lactobacillus minor lub dehydrogenazę alkoholową z sekwencją aminokwasów Sekw. Id. Nr: 4.

Jeśli dehydrogenaza alkoholowa pochodzi, na przykład, z drożdży, wątroby konia, Thermoanaerobium brockii lub Rhodococcus erythropolis w sposobie według wynalazku, uzyskuje się ze związku o wzorze I odpowiedni zwią zek (S)-hydroksy. Jeś li dehydrogenaza alkoholowa stosowana w sposobie według wynalazku pochodzi, na przykład, z Lactobacillus kefir lub Lactobacillus brevis, ze związku o wzorze I powstaje odpowiedni związek (R)-hydroksy.

Korzystnie w sposobie dodaje się bufor, taki jak fosforan potasu, Tris/HCl lub bufor trietanoloaminowy o pH od 5 do 10, korzystnie o pH od 6 do 9. Korzystnie do buforu dodaje się jony magnezu, takie jak MgCl2, w stężeniu od 0,2 mM do 10 mM, korzystnie od 0,5 mM do 2 mM.

W sposobie wedł ug wynalazku moż e być stosowana dehydrogenaza alkoholowa w peł ni oczyszczona albo częściowo oczyszczona lub zawarta w komórkach. Wprowadzone komórki mogą być przy tym natywne, permeabilizowane lub lizowane.

PL 207 271 B1

Aktywność objętościowa stosowanej dehydrogenazy alkoholowej wynosi od 100 jednostek/ml (U/ml) do 2000 U/ml, korzystnie około 800 U/ml, przy zawartości białka od około 20 mg/ml do 22 mg/ml. Korzystnie stosowana dehydrogenaza alkoholowa ma aktywność specyficzną od około 35 do 40 U/mg białka.

Korzystnie na kilogram przekształconego związku o wzorze I stosuje się 20 000 do 200 000 U dehydrogenazy alkoholowej, korzystnie około 100 000 U.

Jednostka enzymu 1 U odpowiada przy tym ilości enzymu, która jest wymagana do przekształcenia 1 μmol związku o wzorze I w ciągu minuty (min).

Woda tworzy w dwufazowym układzie według wynalazku jedną fazę ciekłą, a organiczny rozpuszczalnik tworzy drugą fazę ciekłą. Ewentualnie może być też obecna jeszcze jedna faza stała lub ciekła, która, na przykład, powstaje z nie całkowicie rozpuszczonej dehydrogenazy alkoholowej lub ze związku o wzorze I. Korzystne są jednak dwie fazy ciekłe bez fazy stałej. Dwie fazy ciekłe są korzystnie mieszane mechanicznie tak, że powstają duże powierzchnie między obydwiema fazami ciekłymi.

Korzystnie jako kofaktor dodaje się NADPH lub NADH w ilości od 0,05 mM do 0,25 mM, zwłaszcza od 0,06 mM do 0,2 mM, w stosunku do fazy wodnej. Korzystnie w sposobie według wynalazku stosuje się jeszcze kolejny stabilizator dehydrogenazy alkoholowej.

Korzystnie jako stabilizator dla dehydrogenazy alkoholowej dodaje się glicerol, sorbitol lub sulfotlenek dimetylu (DMSO).

Korzystnie stabilizator stosuje się w ilości od 5% do 30% w stosunku do objętości całej mieszaniny reakcyjnej, korzystnie od 10% do 20%, szczególnie 20%. W celu regeneracji zużytego NADH lub NADPH w sposobie według wynalazku korzystnie dodaje się izopropanol. Na przykład izopropanol i NADP są dodawane z dehydrogenazą alkoholową do NADPH i acetonu. Korzystnie izopropanol stosuje się w ilości 5% do 30% w stosunku do objętości całej mieszaniny reakcyjnej, korzystnie od 10% do 20%, szczególnie 10%.

Korzystnie w sposobie według wynalazku związki o wzorze I stosuje się w ilości od 15% do 22% w stosunku do całkowitej objętości.

Korzystnie reakcję prowadzi się w zakresie temperatur od około 10°C do 70°C, korzystnie od 30°C do 60°C.

Korzystnie organiczny rozpuszczalnik stosuje się w ilości od 1% do 90% w stosunku do całkowitej objętości mieszaniny reakcyjnej, korzystnie od 15% do 60%, szczególnie od 20% do 50%.

Korzystnie stosunek organicznego rozpuszczalnika do wody wynosi od 9:1 do 1:9, korzystnie od 1:1 do 1:3.

Sposób według wynalazku, na przykład, przeprowadza się w zamkniętym naczyniu reakcyjnym ze szkła lub metalu. W tym celu składniki pojedynczo wprowadza się do naczynia reakcyjnego i miesza w atmosferze, na przykład, azotu lub w atmosferze powietrza. W zależności od substratu i stosowanego związku o wzorze I czas reakcji wynosi od 1 dnia do 14 dni, korzystnie 4 do 7 dni.

Następnie mieszaninę reakcyjną poddaje się obróbce. W tym celu usuwa się fazę wodną i sączy się fazę octanu etylu. Fazę wodną można ewentualnie jeszcze raz ekstrahować i dalej obrabiać jak fazę octanu etylu. Następnie przesączoną fazę odparowuje się pod zmniejszonym ciśnieniem. W ten sposób uzyskuje się, na przykład, jako produkt 4-chloro-3-(S)-hydroksybutanian etylu o czystości enancjomerycznej ponad 99,9%, i zasadniczo wolny od reagenta 4-chloro-3-oksy-butanianu etylu. Całkowita wydajność procesu wynosi po destylacji produktu od 82% do 88% w stosunku do użytej ilości reagenta.

Nieoczekiwanie, stosowane rozpuszczalniki organiczne z wartością log-P od 0 do 4 wykazywały stabilizujące działanie na dehydrogenazę alkoholową, podczas gdy w stanie techniki odradzane jest stosowanie układu dwufazowego z rozpuszczalnikami organicznymi (M. R. Kula, U. Kragel; Rozdział 28, Dehydrogenases in Synthesis of Chiral Compounds; R. N. Patel, Stereoselective Biocatalyses, 2000; Peters J. 9. Dehydrogenases-Characteristics, Design of Reaction Conditions, and Application, W: H. J. Rehm, G. Reed Biotechnology, tom 3, Bioprocessing, VCH Weinheim, 1993; J. Lynda i wsp., Solvent selection strategies for extractive Biocatalysis, Biotechnol. Prog. 1991, 7, strony 116-124). W sposobie według wynalazku jako fazę organiczną stosuje się octan etylu, przy czym faza organiczna z jednej strony służy jako zbiornik związku o wzorze I, ale także ekstrahuje produkt reakcji, chiralny związek hydroksylowy, z fazy wodnej.

W przeciwieństwie do stanu techniki zastosowanie rozpuszczalników organicznych o wartości log-P od 0 do 3 prowadzi do dodatkowej wzrastającej z upływem czasu stabilizacji dehydrogenazy alkoholowej. Według stanu techniki, szczególnie rozpuszczalniki organiczne o wartości log-P (logaPL 207 271 B1 rytm współczynnika rozdziału oktanol/woda) od 0 do 2 mają destabilizujące działanie na enzymy i w zwią zku z tym prawie nie są brane pod uwagę , jako faza organiczna w ukł adzie dwufazowym (K. Faber, Biotransformations in organic chemistry, wyd. 3 1997, Springer Verlag, Rozdział 3. do 3.17).

Dehydrogenaza alkoholowa z Lactobacillus minor o wysokiej temperaturze optymalnej ma sekwencję DNA według Sekw Id. Nr: 3 i sekwencję aminokwasową według Sekw Id. Nr: 4 jak na załączonej liście sekwencji. Ta dehydrogenaza alkoholowa z Lactobacillus minor jest R-specyficzna, i na przykład, ze związku o wzorze I można uzyskać odpowiedni (R)-hydroksyzwiązek. Nieoczekiwanie enancjoselektywna dehydrogenaza alkoholowa z Lactobacillus minor może być nadwyrażana w Escherichia coli RB 791, podczas gdy dehydrogenazy alkoholowe z innych gatunków rodzaju Lactobacillus były wyrażane tylko w znacznie mniejszym stopniu. Jest to tym bardziej nieoczekiwane, ponieważ szczep Lactobacillus minor typu dzikiego wyraża tylko bardzo małą ilość dehydrogenazy alkoholowej, która jest zatem niewykrywalna powszechnymi metodami skirininowymi (biotransformacja całych komórek, test aktywności). Nieoczekiwane było zatem, że możliwe było sklonowanie R-enancjoselektywnej dehydrogenazy alkoholowej z Lactobacillus minor i nadwyrażanie jej w Escherichia coli w tak dużej ilości (50% białka komórkowego klonu, 20000 U/g mokrej masy).

Oczyszczony enzym z Lactobacillus minor jest stabilny w zakresie pH od około 5,5 do 8,5. Enzym jest stabilny do około 40°C, a optimum pH reakcji enzymatycznej leży w zakresie od pH 7 do pH 7,5. Optimum temperatury reakcji enzymatycznej wynosi około 55°C. Enzym wykazuje szerokie spektrum substratów.

Za pomocą hydrofobowej chromatografii interakcyjnej możliwe jest oczyszczenie enzymu do aktywności specyficznej od 35 do 40 U/mg białka.

Dehydrogenazę alkoholową z Lactobacillus minor uzyskuje się przez ekspresję DNA, który koduje dehydrogenazę alkoholową z Lactobacillus minor, w odpowiednim mikroorganizmie prokariotycznym lub eukariotycznym. Korzystnie dehydrogenaza alkoholowa z Lactobacillus minor jest transformowana i wyrażana w szczepie Escherichia coli, szczególnie w Escherichia coli RB 791.

Dehydrogenazę alkoholową z Lactobacillus minor można otrzymać, na przykład, w hodowli zrekombinowanych komórek Escherichia coli, gdzie indukuje się ekspresję dehydrogenazy alkoholowej, a następnie po około 10 do 18 godzinach komórki rozrywa się przez działanie ultradź więkami lub prasą Frencha (Gaullin, Siemens). Uzyskany ekstrakt komórkowy może być albo bezpośrednio stosowany albo dalej oczyszczany. W tym celu ekstrakt komórkowy, na przykład, wiruje się, a uzyskany supernatant poddaje się hydrofobowej chromatografii interakcyjnej. Chromatografię tę korzystnie przeprowadza się przy pH 7,0 w wodnym buforze, który zawiera także jony magnezu.

Zrekombinowany klon Escherichia coli RB 791, który wyraża dehydrogenazę alkoholową z Lactobacillus minor został zdeponowany 26 marca 2001 zgodnie z warunkami Traktatu Budapeszteńskiego w Deutsche Sammlung far Microorganismen Und Zelkulturen, Mascheroder Weg 1b, 38124 Braunschweig pod numerem DSM 14196.

Wynalazek jest zilustrowany następującymi przykładami.

P r z y k ł a d 1

Skrining dehydrogenaz R-alkoholowych w szczepach rodzaju Lactobacillus za pomocą biotransformacji całych komórek

W celu skriningu różne szczepy Lactobacillus hodowano w następującej pożywce: (w każdym przypadku ilość w g/l,): glukoza (20), ekstrakt z drożdży (5), ekstrakt mięsny (10), wodorocytrynian diamonowy (2), octan sodu (5), siarczan magnezu (0,2), siarczan manganu (0,05), fosforan dipotasu (2).

Pożywkę sterylizowano w 121°C i szczepy rodzaju Lactobacillus (dalej w skrócie oznaczane jako L.) hodowano bez dalszej regulacji pH lub dodawania tlenu. Następnie komórki odwirowano i w celu biotransformacji całych komórek zawieszano po 4 g komórek w końcowej objętości 10 ml buforu -fosforanu potasowego (bufor KPi) (50 mM, pH = 7,0). Po dodaniu 0,1 g glukozy komórki wytrząsano przez 15 minut w 30°C. Do zawiesiny komórek dodano 4-chloro-3-okso-butanian etylu w stężeniu końcowym 40 mM i po 10 i 120 minutach przeprowadzono analizę pożywki za pomocą chromatografii gazowej. W tym celu komórki odwirowano, supernatant przesączono i rozcieńczono chloroformem do końcowego stężenia 10-15 μg/ml w 4-chloro-3-okso-butanianie etylu.

Stosowany jako substrat 4-chloro-3-okso-butanian etylu był przekształcany przez różne szczepy Lactobacillus do (S)-4-chloro-3-hydroksymaślanu etylu z następującą czystością enancjomerów.

Nadmiar enancjomerów oblicza siew następujący sposób: ee(%) = ((R-alkohol - S-alkohol)/(Ralkohol + S-alkohol)) x 100.

PL 207 271 B1

T a b e l a 1

Szczep Lactobacillus	ee 4-chloro-3-(S)-hydroksy-butanian etylu w %
L. reuteri	34,6
L. kandleri	90,0
L. collinoides	71,3
L. bifermentans	53,6
L. oris	63,4
L. brevis	74,0
L. halotolerans	67,2
L. minor	18,6
L. parabuchneri	78,5
L. kefir	87,8
L. fructosus	28,9

P r z y k ł a d 2

Otrzymywanie zrekombinowanych R-specyficznych dehydrogenaz alkoholowych

A.) Wytwarzanie genomowego DNA ze szczepów z rodzaju Lactobacillus

Osad komórkowy z około 2 ml płynnej hodowli rodzaju Lactobacillus zawieszono w 300 μΐ buforu TE (zawierającego 10 mM Tris/HCl, pH = 8,1 mM EDTA), dodano 20 mg/ml lizozymu i inkubowano 10 minut przy 37°C. Następnie dodano 100 μl dodecylosiarczanu sodu(SDS) (10%), 100 μl nadchloranu sodu (5 M) i 500 μl chloroformu/alkoholu izoamylowego (24:1). Po silnym wytrząsaniu białko usunięto przez odwirowanie i przeniesiono fazę wodną do nowej probówki Eppendorfa. Następnie dodano 800 μl etanolu (EtOH) (96%). Probówkę Eppendorfa parokrotnie odwrócono, a następnie wytrącony DNA chromosomalny przeniesiono do nowej probówki Eppendorfa i przepłukano 200 μl EtOH. DNA ponownie przeniesiono do nowej probówki Eppendorfa, wysuszono pod zmniejszonym ciśnieniem i rozpuszczono w 100 μl buforu TE.

B. ) Oligonukleotydy jako startery 5' i 3' do PGR (reakcja łańcuchowa polimerazy)

Startery stosowane do PCR opracowano na podstawie znanych sekwencji N-końcowych i C- końcowych dehydrogenazy alkoholowej z L. kefir. Uwzględniono przy tym znane preferencje dla określonych kodonów u Lactobacillus. Zatem w każdym starterze 5' stosowano kodon ATG (Met) jako kodon start i wstawiano, powyżej kodonu start wstawiono w starterze 5' miejsce dla enzymu restrykcyjnego Bam HI (GGATGG) dla umożliwienia późniejszego klonowania w wektorze ekspresyjnym. Za starterem 3' wstawiono kodon stop (TAG) i miejsce cięcia dla Hind III (AAGGTT). Konstrukty dla starterów są podane poniżej

N = A,,C lub G; Y = T lub C; R = A lub G

Starter 5'

5'GCGGATCCATGACNGAYCGNTTRAARGGNAARGTNGC3' (Sekw. Id. Nr:1)

Starter 3'

5'GGGAAGCTTCTAYTGNGCNGTRTANCCNCCRTCNAC3' (Sekw. Id. Nr:2)

Startery wytworzono przygotowano zgodnie ze znanymi metodami.

C. ) PCR (Reakcja łańcuchowa polimerazy) z genomowym DNA ze szczepów z rodzaju Lactobacillus

Mieszanina PCR (100 μθ

	Ilość stosowana na reakcję	Stężenie
dNTP	8 pl	na dNTP 2,5 nmol/pl
Oligo	na oligo 10 pl; 20 pl	2 pmol/pl
Chromosomalny DNA	3 pl	Około 1 pg/pl
10 x Bufor (Promega)	10 pl
Polimeraza Taq (Promega)	1 pl	2U/pl
H2O	58 pl

PL 207 271 B1

DTP są mieszaniną trifosforanów deoksyrybonukleotydów, takich jak dATP, dGTP, dCTP, dTTP

Cykl:

95°C przez 2 minuty z późniejszym utrzymaniem temperatury

80°C gorący start, następnie

95°C przez 30 sekund, następnie

40°C przez 1 minutę, 30x następnie 30 razy 95°C przez 30 sekund, i 40°C przez 1 minutę, następnie

72°C przez 2,5 minuty następnie

72°C przez 2,5 minuty następnie utrzymywanie 10° C

W celu analizy naniesiono 10 μΐ mieszaniny na 1% żel agarozowy i rozdzielono elektroforetycznie przy stałym 100 V. PCR wykazała wyraźną amplifikację fragmentu DNA o około 750 bp.

D. ) Izolacja fragmentów PCR z żelu

W celu uzyskania fragmentu PCR całą mieszaninę PCR naniesiono na 1% żel agarozowy i rozdzielono elektroforetycznie przy stałym 100 V. W tym celu podzielono żel na dwie ścieżki, z których jedna zawierała całą mieszaninę PCR, a druga tylko próbkę 5 μ!, tak że do wycięcia fragmentu PCR z żelu w celu orientacji barwiono bromkiem etydyny tylko ścieżkę z próbką, aby wykluczyć uszkodzenie fragmentu PCR bromkiem etydyny i światłem UV.

Izolację z żelu przeprowadzono stosując zestaw QIAquick Gel Extraction Kit firmy Qiagen z Hilden. Określono całkowite stężenie 20 ng/ąl DNA.

E. ) Ligacja

Do przygotowania ligacji oczyszczony fragment PCR i stosowany do klonowania wektor pQE30 lub pQE70, oba firmy Quiagen, przecięto trawiono Bam HI i Hind III (4 ąl DNA = 200 ng DNA, 1 ąl 10 x buforu, 1 ąl enzymu, BSA i H₂O (Biolabs, New England)).

Następnie przecięty plazmid ponownie czyszczono za pomocą zestawu QIAquick Gel Extraction, zawieszono w wodzie i defosforylowano za pomocą alkalicznej fosfatazy (USB, Amersham Life Science).

W celu oczyszczenia odpowiednią mieszaninę reakcyjną ponownie naniesiono na 1% żel agarozowy, a następnie trawiony amplikont i plazmid wyizolowano, jak opisano w D.)Stężenie plazmidu i amplikonu po oczyszczeniu wynosiło około 20 nq/ąl.

Do ligacji użyto 3 ąl pQE30 lub pQE70 (60 ng), 2,5 ąl amplikonu (50 ng), 2 ąl buforu do ligazy (Boehringer; Mannheim), 1,5 ąl H2O i 1 ąl ligazy T4 (Boehringer; Mannheim). Mieszaninę inkubowano przez noc w 16°C.

Następnie transformowano przez elektroporację 40 ąl elektrokompetentnych komórek Escherichia coli RB791 1,5 ąl mieszaniny ligacyjnej. Komórki umieszczono w 500 ąl pożywki SOC, inkubowano 45 minut w 37°C, a następnie wysiano po 250 ąl na płytki z agarem LBamp. Pożywka SOC zawiera 20 g tryptonu, 5 g ekstraktu z drożdży, 0,5 g NaCl, 10 ml 1 M MgSO4 i 10 ml 1 M MgCl2 na litr wody. Płytki agarowe LBamp zawierają na litr wody 10 g tryptonu, 5 g ekstraktu z drożdży, 10 g NaCl, 20 g agaru, pH 7,0 i 50 mg ampicyliny.

Wyrośnięte kolonie usunięto i hodowano przez noc w 37°C w 4 ml płynnej hodowli (pożywka LBamp). W każdym przypadku z tej zawiesiny komórek pobierano po 2 ml do wytworzenia plazmidu (według protokołu Quiagen miniprep (Quiagen, Hilden)). Plazmid wytworzono zaczynając od trawienia enzymami restrykcyjnymi Bam HI i Hind III. Po całkowitym trawieniu naniesiono na 1% żel agarozowy i rozdzielono elektroforetycznie przy 100 V (wykazanie wstawki 750 kp) i te plazmidy ewentualnie zastosowano do sekwencjonowania.

Klony ze wstawką 750 kp następnie wysiewano na płytkach agarowych LBamp.

F. ) Sekwencjonowanie plazmidów

Sekwencjonowanie przeprowadzono za pomocą zestawu SequiThermEXCEL II Long-Read DNA Sequencing Kit (Biozym, Oldendorf) na sekwenatorze Li-Cor (MWG Biotech, Ebersberg) według zaleceń producenta. Jako startery stosowano standardowe startery do sekwencjonowania dla wektorów pQE.

G. ) Skrining klonów w odniesieniu do ekspresji rozpuszczalnego R-ADH Klony ze wstawkami 750 kp badano pod kątem aktywności enzymatycznej i stereoselektywności. W tym celu kolonie usunięto z płytek z agarem LBamp i hodowano w 20 ml płynnych hodowlach (pożywka LBamp) w 25°C, a następnie przy gęstości komórek (OD₅₀₀) 0,5 przeprowadzono indukcję 1 mM izopropylo-e-D-tiogalaktopiranozydem (IPTG). Po 18 godzinach komórki odwirowano i w każdym przypadku rozpuszczono

PL 207 271 B1 po 40 mg komórek w 350 μΐ buforu Kpi (50 mM, pH = 7, 1 mM MgCl₂). Enzym uwolniono z komórek przez mielenie na mokro za pomocą szklanych kuleczek (0,5 g, 0,3 mm). Dodatkowo komórki były rozrywane za pomocą młynka Retsch w 4°C przez 20 minut.

Test enzymatyczny zawierał 870 μl buforu trietyloaminowego (100 mM, pH = 7,0, 1 mM MgCl₂), 100 μl 100 mM roztworu 4-chloroacetooctanu etylu, 10 μl NADPH (stężenie końcowe 0,19 mM) i 20 μl roztworu enzymu.

Definicja jednostki enzymu: 1 U odpowiada ilości enzymu, która jest potrzebna do przekształcenia 1 μ mol substratu (etylo 4-chloro-3-oksy-butanian etylu w ciągu 1 minuty.

Dla wykazania stereoselektywności inkubowano 480 μl buforu trietanoloaminowego (100 mM, pH = 7,0, 1 mM MgCl2) z 1,0 mM 4-chloro-3-oksy-butanianu etylu, 1,9 mM NADPH (stężenia końcowe) i 20 μl roztworu enzymu. Po 15 minutach inkubacji mieszaninę reakcyjną sączono i rozcieńczono 1:10 chloroformem i analizowano próbkę za pomocą GC-MS.

Warunki chromatografii gazowej (GC):

chiralna kolumna: Lipodex E, ID = 0,25 mm, I = 25 m (Macherey-Nagel)

1. 2 minuty 60°C

2. w 28 minut od 60° C do 130°C z tempem 2,5°C na minutę

3. 15 minut w 130°C.

Z następujących szczepów Lactobacillus było możliwe wyizolowanie (R)-specyficznej dehydrogenazy alkoholowej i jej aktywna nadekspresja:

Szczep	Plazmid	Numer klonu	Aktywność w U/g komórek*	ee w %
L. parabuchneri	pQE 30	12	450	>99,9
L. parabuchneri	pQE 30	14	170	>99,9
L. kandleri	pQE 30	11	280	>99,9
L. kandleri	pQE 70	17	710	>99,9
L. minor	pQE30	2	2.830	>99,9
L. minor	PQE 70	3	680	>99,9
L. minor	pQE 70	4	700	>99,9

*Aktywność wyliczona z G) (mielenie na mokro).

Aktywności po fermentacji i rozerwaniu prasą Frencha są znacząco wyższe.

H.) Otrzymanie i czyszczenie enzymu

Enzym otrzymano przez hodowanie szczepu o najwyższej aktywności w fermentorze (Fed batch, 10 l) i indukcji przy OD500 40 za pomocą 1 mM IPTG. Po 18 godzinach zbierano komórki, przy czym wprowadzano 300 g komórek do 3 l buforu Kpi (50 mM, pH = 7, 1 mM MgCl2), następnie rozrywano komórki za pomocą prasy Frencha (Gaullin, Siemens). Supernatant uzyskany po odwirowaniu dalej był określany jako surowy ekstrakt i wykazywał aktywność około 2000 U/ml (20 000 U/g wilgotnej masy).

W celu scharakteryzowania enzymu, część uzyskanego enzymu oczyszczono za pomocą hydrofobowej chromatografii interakcyjnej na Q-Sepharose ff (fast flow - szybki przepływ). Zastosowana kolumna była równoważona 50 mM buforem Kpi pH = 7,0, 1 mM MgCl2. Po naniesieniu surowego ekstraktu na kolumnę i krótkim płukaniu buforem do równoważenia enzym eluowano rosnącym liniowo gradientem soli (0-1 M NaCl, 1 ml/min) przy stężeniu soli około 0,3 M NaCl. Po połączeniu oczyszczonych frakcji zawierających enzym uzyskano około 25 ml oczyszczonego enzymu o aktywności objętościowej 800 U/ml i zawartości białka od 20 do 22 mg/ml. Oczyszczony w ten sposób enzym ma specyficzną aktywność od około 35 do 40 U/mg białka.

Wszystkie aktywności enzymatyczne oznaczano w 25°C. Aktywność enzymatyczną wyliczano, jak następuje:

Obliczenie: 1 jednostka = konwersja 1 μmol substratu/min Prawo Lamberta-Beera

Zużycie NADPH monitorowano przy 340 nm (patrz enzymatyczna próba testowa) = ΔΕ/min

N = czynnik rozcieńczenia enzymu

V = objętość enzymu w ml (0,01)

Vkiuwety = Objętość kiuwety = 1 ml

PL 207 271 B1 d = ś cież ka ś wiatł a kiuwety = 1 cm eNADPH = współczynnik ekstynkcji NADPH = 6,22 [Mm^-1*cm^-1]

Aktywność = ^E/min*N*Vk,uwety)/(eNADPH*V*d)

Oznaczenie białka przeprowadzono według analizy Bradforda (BioRad- Laboratories GmbH,

Protein Assay)

P r z y k ł a d 3

Wytworzenie (S)-4 chloro-3-hydroksymaślanu etylu katalizowane enzymatycznie

A) Na skalę 5 litrów

Do katalizowanej enzymatycznie syntezy (S)-4 chloro-3-hydroksymaślanu etylu z 4-chloro-3-oksy-butanianu etylu, stosowano uzyskany w Przykładzie 2 surowy ekstrakt dehydrogenazy alkoholowej i koenzym NADP. Utleniony koenzym regenerowano w sposób ciągły przez równoczesną obecność izopropanolu, tak że reakcja wymagała tylko katalitycznych ilości koenzymu.

Mieszanina zawierała:

l 100 mM buforu trietanoloaminowego pH = 7,0, 1 mM MgCl2,

10% glicerol,

400 mg NADP,

600 ml izopropanolu,

800 ml octanu etylu,

600 ml 4-chloro-3-oksy-butanianu etylu i około 100 000 jednostek dehydrogenazy alkoholowej

Po 3 dniach mieszania w temperaturze pokojowej można było wykazać za pomocą chromatografii gazowej całkowite przekształcenie 4-chloro-3-oksy-butanianu etylu do (S)-4 chloro-3-hydroksymaślanu etylu z czystością enancjomeru ponad 99,9%. Po usunięciu fazy wodnej, odparowaniu rozpuszczalnika i ewentualnie destylacji uzyskuje się czysty (S)-4 chloro-3-hydroksymaślan etylu z czystością enancjomeryczną ponad 99,9%.

B.) Na skalę 50 l

Mieszanina reakcyjna do przekształcenia 10 l 4-chloro-3-oksy-butanianu etylu, składa się z:

l 100 mM buforu trietanoloaminowego pH = 7.0, l mM MgCl2, 10% glicerolu, g NADP, l izopropanolu, l octanu etylu, l 4-chloro-3-oksy-butanianu etylu, i około 2 milionów jednostek dehydrogenazy alkoholowej (1,251 surowego ekstraktu).

Po 7 dniach mieszania w temperaturze pokojowej można było wykazać za pomocą chromatografii gazowej całkowitą konwersją 4-chloro-3-oksy-butanianu etylu, do (S)-4-chloro-3-hydroksymaślanu etylu z czystością enancjomeryczną ponad 99,9%.

P r z y k ł a d 4

Charakterystyka biochemiczna klonowanej dehydrogenazy alkoholowej z Lactobacillus minor

A.) Stabilność w pH

Aktywność enzymu jako funkację przechowywania w buforach o różnych wartościach pH badano w zakresie od pH 4 do 11. W tym celu przygotowano różne bufory (50 mM) w zakresie od pH 4 do 11 i rozcieńczano w nich 1:100 oczyszczony w przykładzie 2 enzym i inkubowano 30 minut. Wszystkie bufory zawierały 1 mM MgCl₂. Następnie stosowano z tego 10 μΐ w normalnym teście enzymatycznym (bufor trietanoloaminowy 100 mM pH = 7,0, 1 mM MgCl2, 10 mM 4-chloro-3-oksy-butanianu etylu, i 0,19 mM NADPH). Reakcję monitorowano przez 1 minutę w 30° C i przy 340 nm.

Wartością wyjściową jest wartość mierzona, którą uzyskuje się bezpośrednio po rozcieńczeniu enzymu w 50 mM buforze trietanoloaminowym pH = 7,0. Ta wartość odpowiada w podanych uprzednio warunkach zmianie ekstynkcji o 0,20/minut i stosowano ją jako wartość 100%, a wszystkie następne mierzone wartości były odnoszone do tej wartości.

T a b e l a 2

PH	Układ buforowy	Aktywność w % (n=2)	Układ buforowy	Aktywność w % (n=2)
1	2	3	4	5
4	Octan sodu/kwas octowy	87,5 ± 6,5

PL 207 271 B1 cd. tabeli 2

1	2	3	4	5
4,5	Octan sodu/kwas octowy	94,5 ± 3,0
5	Octan N/kwas octowy	94,5 ± 1,5	MES/NaOH	55 ± 5
5,5	KH2PO4/K2PO4	96 ± 3	MES/NaOH	77,1 ± 2,1
6	KH2PO4/K2PO4	100 ± 0	T rietanoloamina/NaOH	100 ± 0
6,5	KH2PO4/K2PO4	97,5 ± 2,5	T rietanoloamina/NaOH	100 ± 0
7	KH2PO4/K2PO4	100 ± 0	T rietanoloamina/NaOH	97,9 ± 2,1
7,5	KH2PO4/K2PO4	97,5 ± 7,5	Tris/HCl	94,6 ± 1,3
8	KH2PO4/K2PO4	93,0 ± 3,0	Tris/HCl	89,2 ± 0
8,5	KH2PO4/K2PO4	102,5 ± 2,5	Tris/HCl	60 ± 4,2
9	Glicyna/NaOH	76,5 ± 1,5	Tris/HCl	63,1 ± 4,8
9,5	Glicyna/NaOH	52,5 ± 7,5
10	Glicyna/NaOH	52,5 ± 7,5
11	Glicyna/NaOH	0,0 ± 0

W Tabeli 2 wskazano, że enzym wykazuje dobrą stabilność szczególnie przy pH w kwaśnym zakresie, przy czym stabilność, enzymu wydaje się zależeć nie tylko od pH ale także od stosowanego układu buforowego. Na przykład, przy stosowaniu buforów TRIS i MES przy tym samym pH stwierdza się silniejszą inaktywację enzymu niż w buforze Kpi przy tym samym pH.

W buforze Kpi nie stwierdzono żadnej znaczącej inaktywacji w zakresie pH od 5,5 do 8,5.

B.) Stabilność w temperaturze

W analogiczny sposób jak opisano w A.) badano stabilność w temperaturze w zakresie od 25°C do 50°C. W tym celu w każdym przypadku rozcieńczenia 1 : 100 oczyszczonego enzymu inkubowano po 30 minut w odpowiedniej temperaturze, a następnie mierzono w 30°C stosując powyższą procedurę. Tutaj także jako wartość wyjściową przyjęto wartość pomiaru, który uzyskano bezpośrednio po rozcieńczeniu enzymu w 50 mM buforze trietanoloaminowym pH = 7,0. Tę wartość także uznano tutaj jako wartość 100%. Dehydrogenaza alkoholowa z L. minor jest stabilna do temperatury 40°C. Następnie aktywność szybko spada.

T a b e l a 3

Temperatura	Aktywność w % (n=4)	Temperatura	Aktywność w % (n=4)
25	101 ± 3,2	40	33,4 ± 3,8
30	81,2 ± 5,8	42	0 ± 0
35	67,0 ± 1,6	45	0 ± 0
37	20,2 ± 2,4	50	0 ± 0

C.) Optimum pH

W celu określenia optimum pH przeprowadzono reakcję enzymatyczną w odpowiednim buforze podanym w Tabeli 3. Stężenie 4-chloro-3-oksy-butanianu etylu wynosiło tak jak w teście standardowym 10 mM, a NADPH 0,19 mM. Reakcję prowadzono w 30°C. W ten sposób dla enzymu według wynalazku ustalono optimum pH między 7 i 7,5.

T a b e l a 4

PH	Układ buforowy	Aktywność w U/ml nierozcieńczonego enzymu
1	2	3
4	Octan sodu/kwas octowy	85

PL 207 271 B1 cd. tabeli 4

1	2	3
4,5	Octan sodu/kwas octowy	132
5	MES/NaOH	218
5,5	MES/NaOH	240
6	T rietanoloamina/NaOH	381
6,5	T rietanoloamina/NaOH	349
7	T rietanoloamina/NaOH	510
7,5	Tris/HCl	707
8	Tris/HCl	585
8,5	Tris/HCl	486
9	Tris/HCl	488
10	Glicyna/NaOH	131
11	Glicyna/NaOH	0

D.) Optimum temperatury

Aby ustalić temperaturę optymalną, mierzono aktywność enzymatyczną w zakresie od 25°C do 60°C. Próba odpowiadała standardowym stężeniom 4-chloro-3-oksy-butanianu etylu i NADPH. Jak widać w Tabeli 5 optymalna temperatura dla enzymu wynosi 55° C, następnie aktywność szybko spada.

T a b e l a 5

Temperatura	Aktywność w U/ml nierozcieńczonego enzymu	Temperatura	Aktywność w U/ml nierozcieńczonego enzymu
25	540	45	2469
30	1235	50	2469
35	1968	55	2855
40	1621	60	0

E.) Specyficzność względem substratu

Dalej w mieszaninie reakcyjnej zamiast 4-chloro-3-oksy-butanianu etylu stosowano inne substraty. W tym celu stosowano następującą mieszaninę reakcyjną:

970 μl buforu trietanoloaminowego (100 mM, pH = 7,0 1 mM MgCl₂ z 10 mM związku ketonowego) 20 μl NADPH (0,19 mM w badanej mieszaninie 10 μ enzymu (1 : 100)

Aktywność uzyskaną z 4-chloro-3-oksy-butanianem etylu uznawano za 100% i aktywności enzymatyczne innych substratów odnoszono do tej wartości.

T a b e l a 6

Substrat	Aktywność w % (n=2)
4-chloro-3-oksy-butanian etylu	100
Pirogronian etylu	192,3 ± 11,5
2-oktanon	90,8 ± 1,2
Acetooctan metylu	120 ± 7,7
2-okso-4-fenylobutanian etylu	62,7 ± 4,8

F.) Stabilność enzymu w rozpuszczalnikach organicznych

W celu zbadania stabilności enzymu przy kontakcie z rozpuszczalnikami organicznymi rozcieńczano dehydrogenazę alkoholową z L. minor w podanych rozpuszczalnikach organicznych 1 : 100

PL 207 271 B1 i inkubowano w temperaturze pokojowej (dla niemieszających się z wodą rozpuszczalników organicznych rozcieńczenie dotyczy fazy wodnej). Zapewniono ciągłe mieszanie obu faz (wytrząsanie przy 200 obr./min.). Następnie 10 μl roztworu enzymu stosowano w standardowej badanej mieszaninie. Także tutaj wartość wyjściowa po rozcieńczeniu buforem (bufor trietanoloaminowy 100 mM, pH = 7,0, 1 mM MgCl2) była ustalana na 100% i wszystkie dalsze wartości były do niej odnoszone.

T a b e l a 7

A.) Rozpuszczalniki mieszające się z wodą

Rozpuszczalnik	log	t = 2 godz.	t = 4 godz.	t = 24 godz.	t = 48 godz.
Bufor		86	70	3	0
10% izopropanol	0,28	32	34	16	0
20% izopropanol	0,28	16	17	7	0
10% DMSO	1,3	73	54	60	40
20% DMSO	1,3	73	54	57	40
1M sorbitol		93	74	60	6
10% glicerol	-3,0	120	64	62	28
20% glicerol	-3,0	120	100	100	104

Jak widać z Tabeli 7A glicerol, DMSO i sorbitol działają aktywująco i odpowiednio stabilizująco na użytą dehydrogenazę alkoholową. Zastosowany w procesie izopropanol działa natomiast inaktywująco.

B.) Rozpuszczalniki niemieszające się z wodą

Rozpuszczalnik	log P	t = 2 godz.	t = 4 godz.	t = 24 godz.	t = 48 godz.
Bufor		86	70	3	0
20% octan etylowy	0, 68	87	50	10	8
20% eter dietylu	0,85	53	42	37	23
20% eter tert-butylowometylowy	1,21	67	51	38	24
20 eter diizopropylowy	1,55	100	57	41	29
20% eter dibutylowy	2,9	92	71	23	6
20% pentan	3,0	74	55	7	6
20% heksan	3,5	80	39	2	5
20% heptan	4	51	49	7	6
20% oktan	4,5	87	47	2	1

Jak widać z Tabeli 7B badana dehydrogenaza alkoholowa wykazuje znaczącą stabilność w szerokim zakresie rozpuszczalników organicznych. Nieoczekiwanie rozpuszczalniki z wartościami logP między 0 13 hamują badaną dehydrogenazę alkoholową nie bardziej niż te, które mają wartości logP między 3 i 4,5, szczególnie ze względu na dłuższe czasy inkubacji (24 godziny i 48 godzin), rozpuszczalniki z wartościami logP między 0 i 3 mają stabilizujące działanie na badaną ADH w porównaniu z odpowiednimi wartościami w buforze. Badane alifatyczne rozpuszczalniki, pentan, heksan, heptan i octan nie wykazują tego stabilizującego działania przy długiej inkubacji.

Wartość logP składnika X jest logarytmem współczynnika podziału X w dwufazowym układzie oktanol/woda (50/50) P = stężenie X w fazie oktanolowej/stężenie X w fazie wodnej

G. Stabilność enzymu w warunkach procesu

W celu zbadania stabilności enzymu w warunkach procesu rozcieńczano dehydrogenazę alkoholową z L. minor stosowanymi w dwufazowym układzie mieszaninami rozpuszczalników 1 : 100 i inkubowano w temperaturze pokojowej. Następnie w standardowej badanej mieszaninie stosowano μl roztworu enzymu.

PL 207 271 B1

W Tabeli 8 podano aktywności enzymatyczne w % w stosunku do wartości wyjściowej. T a b e l a 8

	0 godz.	20 godz.	46 godz.	60 godz.	84 godz.
Bufor trietanoloaminowy 100 mM, 1 mM MgCl2	100	75	0	0	0
Mieszanina B	100	85	80	60	55
Mieszanina C	110	95	95	85	80
Mieszanina B	100	65	55	50	50

Mieszanina B: bufor, 10% glicerol, 10% izopropanol Mieszanina C: bufor, 20% glicerol, 10% izopropanol Mieszanina D: bufor, 10% glicerol, 10% izopropanol + 20% octan etylu

Stwierdzono, że zrekombinowana dehydrogenaza alkoholowa z L. minor jest stabilna i aktywna przez kilka dni w stosowanej w dwufazowym układzie kombinacji rozpuszczalników.

Claims

Zastrzeżenia patentowe

1. atom wodoru,

1. Sposób enancjoselektywnej redukcji związku ketonowego o wzorze I R¹-C(O)-R² (I) w którym R¹ i R² niezależnie od siebie są takie same lub inne i oznaczają

2. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że stosuje się związek o wzorze I wybrany spośród estru etylowego kwasu 4-chloro-3-okso-butanowego, acetofenonu, acetooctanu metylu, -2-okso-4-fenylomaślanu etylu, 2,5-heksanodionu, pirogronianu etylu i 2-oktanonu.

PL 207 271 B1

2. -(C1-C20)-alkil, który ma łańcuch prosty lub rozgałęziony

3. Sposób według zastrz. 1 albo 2, znamienny tym, że stosuje się rozpuszczalnik organiczny z logP od 0,6 do 3,0, szczególnie od 0,6 do 1,9.

3. -(C2-C20)-alkenyl, który ma łańcuch prosty lub rozgałęziony i ewentualnie zawiera jedno, dwa, trzy lub cztery wiązania podwójnie

4. Sposób według zastrz. 3, znamienny tym, że stosuje się rozpuszczalnik organiczny z logP od 0,63 do 1,75.

5. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że jako rozpuszczalnik organiczny stosuje się eter dietylowy, eter tert-butylowo-metylowy, eter diizopropylowy lub octan etylu.

5. -(C6-C14)-aryl,

6. Sposób według jednego lub więcej z zastrz. 1 do 5, znamienny tym, że stosuje się dehydrogenazę alkoholową z drożdży, wątroby konia, Thermoanaerobium brockii lub Rhodococcus erythropolis, Lactobacillus kefir, Lactobacillus brevis, Lactobacillus minor lub dehydrogenazę alkoholową z sekwencją aminokwasów Sekw. Id. Nr: 4.

6. -(C1-C8)-alkilo-(C6-C14)-aryl, lub

7. Sposób według zastrz. 6, znamienny tym, że dehydrogenazę alkoholową stosuje się w ilości od 20 000 U do 200 000 U na kg przekształcanego związku o wzorze I, korzystnie około 100000 U.

a) -OH,

b) halogen, taki jak fluor, chlor, brom lub jod,

c) -NO2,

e) -(C5-C14)-heterocykl, który jest niepodstawiony lub podstawiony od 1 do 3 podstawnikami, takimi jak halogen, hydroksyl, grupa aminowa lub nitrowa, znamienny tym, że

a) związek o wzorze I w ilości od 10% do 25% w stosunku do całkowitej objętości mieszaniny reakcyjnej, dehydrogenazę alkoholową, wodę, kofaktor NADPH lub NADH i rozpuszczalnik organiczny z logP od 0,5 do 4,0'.

c) regeneruje się w sposób ciągły tworzony przez dehydrogenazę alkoholową utleniony kofaktor, i

d) izoluje się wytworzony chiralny hydroksyzwiązek.

8.Sposób według jednego lub więcej z zastrz. 1 do 7, znamienny tym, że dodaje się bufor, taki jak fosforan potasu, Tris/HCl lub bufor trietanoloaminowy o pH od 5 do 10, korzystnie o pH od 6 do 9.

9. Sposób według zastrz. 8, znamienny tym, że do buforu dodaje się jony magnezu, takie jak MgCl2, w stężeniu od 0,2 mM do 10 mM, korzystnie od 0,5 mM do 2 mM.

10. Sposób według jednego lub więcej z zastrz. 1 do 9, znamienny tym, że jako kofaktor dodaje się NADPH lub NADH w ilości od 0,05 mM do 0,25 mM, zwłaszcza od 0,06 mM do 0,2 mM, w stosunku do fazy wodnej.

11. Sposób według jednego lub więcej z zastrz. 1 do 10, znamienny tym, jako stabilizator dla dehydrogenazy alkoholowej dodaje się glicerol, sorbitol lub sulfotlenek dimetylu.

12. Sposób według zastrz. 10, znamienny tym, że stabilizator stosuje się w ilości od 5% do 30% w stosunku do objętości całej mieszaniny reakcyjnej, korzystnie od 10% do 20%, szczególnie 20%.

13. Sposób według jednego lub więcej z zastrz. 1 do 15, znamienny tym, że dodaje się izopropanol.

14. Sposób według zastrz. 11, znamienny tym, że izopropanol stosuje się w ilości 5% do 30% w stosunku do objętości całej mieszaniny reakcyjnej, korzystnie od 10% do 20%, szczególnie 10%.

15. Sposób według jednego lub więcej z zastrz. 1 do 14, znamienny tym, że związki o wzorze I stosuje się w ilości od 15% do 22% w stosunku do całkowitej objętości.

16. Sposób według jednego lub więcej z zastrz. 1 do 12, znamienny tym, że reakcję prowadzi się w zakresie temperatur od około 10°C do 70°C, korzystnie od 30°C do 60°C.

17. Sposób według jednego lub więcej z zastrz. 1 do 16, znamienny tym, że organiczny rozpuszczalnik stosuje się w ilości od 1% do 90% w stosunku do całkowitej objętości mieszaniny reakcyjnej, korzystnie od 15% do 60%, szczególnie od 20% do 50%.

18. Sposób według jednego lub więcej z zastrz. 1 do 17, znamienny tym, że stosunek organicznego rozpuszczalnika do wody wynosi od 9:1 do 1:9, korzystnie od 1:1 do 1:3.