CZ2003537A3

CZ2003537A3 - Izolovaný polynukleotid

Info

Publication number: CZ2003537A3
Application number: CZ2003537A
Authority: CZ
Inventors: Jean-Pol Cassart; Thierry Coche; Remi M. Palmantier; Y De Bassols Carlota Vinals
Original assignee: Glaxosmithkline Biologicals S. A.
Priority date: 2000-08-24
Filing date: 2001-08-20
Publication date: 2003-09-17
Also published as: CA2420087A1; US20040138112A1; EP1311678A2; KR20030045041A; US20040054142A1; BR0113491A; WO2002016413A2; MXPA03001634A; WO2002016413A8; PL363005A1; JP2004506441A; CN1471579A; NO20030823D0; AR032173A1; NO20030823L; US7439320B2; HUP0302824A2; IL154533A0; WO2002016413A3; AU2001295498A1

Description

Oblast techniky

Předkládaný vynález se obecně týká léčení rakoviny jako je rakovina tlustého střeva, kolorektální rakovina, rakovina prsu, močového měchýře, plic a endometria. Vynález se zvláště týká polypeptidů obsahujících alespoň část tumorového proteinu cripto a polynukleotidů kódujících tyto polypeptidy, a dále farmaceutických prostředků, např. vakcin a jiných prostředků pro léčení rakoviny, kterými jsou karcinomy exprimující protein cripto jako jsou některé karcinomy jiných než malých buněk plic, prsu, tlustého střeva a kolorektální rakoviny.

Dosavadní stav techniky

Cripto je protein o délce 188 aminokyselin, který sdílí homologické části se skupinou epidermálního růstového faktoru (EGF) (EMBO Journal (1989) díl 8 (7) str. 1987 - 1991).

mRNA lidského proteinu cripto (huCRIPTO mRNA) je detekována pouze v nediferencovaných buňkách a mizí po diferenciaci. mCRIPTO je exprimován v průběhu těhotenství a laktace (indukuje rozvětvující morfogenezi v epiteliálních buňkách mléčné žlázy) a předpokládá se, že je autokrinním růstovým faktorem normálních buněk mléčné žlázy. Protein cripto je nezbytný pro správnou orientaci předozadní osy myšího embrya.

Exprese lidského genu cripto byla již popsána v US 5,654,140.

Rakovina představuje vážný celosvětový zdravotní problém. I když bylo dosaženo při detekci a léčení rakoviny určitých pokroků, dosud není dostupná žádná univerzálně použitelná metoda nebo vakcina pro prevenci a/nebo léčení. V současnosti používané způsoby • * · · · ·

léčení, které jsou obecně založeny na kombinaci chemoterapie nebo chirurgického zákroku a záření se ukazují u mnoha pacientů jako nedostatečné.

Rakovina tlustého střeva je druhým nejčastěji diagnostikovaným maligním stavem v USA a druhou nejběžnější příčinou úmrtí na rakovinu. V roce 1998 se odhaduje diagnostikování 95 600 nových případů rakoviny tlustého střeva s odhadovaným počtem 47 700 úmrtí. Míra přežití pět let u pacientů s kolorektální rakovinou detekovanou v časném lokalizovaném stadiu je 92 %, ale v tomto stadiu je bohužel diagnostikováno použe 37 % případů kolorektální rakoviny. Míra přežití klesá na 64 %, jestliže se rakovina ponechá rozšířit do sousedních orgánů nebo lymfatických uzlin a na 7 % u pacientů se vzdálenými metastázami.

Prognóza rakoviny tlustého střeva přímo souvisí se stupněm proniknutí tumoru přes stěnu tlustého střeva, mírou metastáz a přítomností nebo nepřítomností postižení uzlin, a proto je zvláště důležitá časná detekce a léčení. V současnosti se při diagnostice využívá screeningových testů na přítomnost okultní krve ve stolici, sigmoidoskopie, kolonoskopie a baryových nálevů s dvojím kontrastem. Režimy léčení se určují na základě typu a stadia rakoviny a zahrnují chirurgický zákrok, ozařování a/nebo chemoterapii. Recidiva po chirurgickém zákroku (nejčastější forma terapie) je hlavním problémem a často je konečnou příčinou smrti. Přes podstatný pokrok ve výzkumu způsobů léčení tohoto onemocnění, zůstávají diagnostika a léčení rakoviny tlustého střeva stále obtížné. Je tedy zapotřebí získat zlepšené způsoby léčení těchto druhů rakovin. Předkládaný vynález splňuje tyto potřeby a poskytuje i další výhody.

Významný zdravotní problém u žen ve Spojených státech a v celém světě je rakovina prsu. I když bylo i při detekci a léčení tohoto onemocnění dosaženo pokroku, rakovina prsu zůstává druhou hlavní příčinou úmrtí u žen souvisejících s rakovinou, přičemž postiženo je

• · · · ve Spojených státech, prsu v průběhu života je každoročně více než 180 000 žen Pravděpodobnost onemocnění rakovinou u žen v severní Americe nyní 1 : 8.

V současnosti není dostupná žádná vakcína nebo jiná univerzálně použitelná metoda pro prevenci nebo léčení rakoviny prsu. Léčení onemocnění je v současnosti založeno na kombinaci časné diagnózy (pomocí rutinních screeningových postupů) a agresivního léčení, které může zahrnovat jeden nebo více z řady způsobů léčení, jako je chirurgický zákrok, radioterapie, chemoterapie a hormonální terapie. Průběh léčení pro konkrétní případ rakoviny se často volí na základě různých prognostických parametrů včetně analýzy specifických tumorových markérů, viz např. Porter-Jordan a Lippman, Breast Cancer 8: 73 - 100 (1994). Použití zavedených markérů však často vede k výsledku, který lze obtížně interpretovat, a vysoká úmrtnost pozorovaná u pacientů s rakovinou prsu ukazuje na potřebu zlepšení při léčení a prevenci tohoto onemocnění.

Primární příčinou úmrtí na rakovinu jak u mužů, tak i u žen v USA je rakovina plic s odhadovaným počtem 172 000 nových případů v roce 1994. Míra přežití pět let u všech pacientů s rakovinou plic bez ohledu na stav onemocnění při diagnóze je pouze 13 %. To je v kontrastu s mírou přežití pět let 46 % u případů, které byly detekovány v ještě lokalizovaném stadiu onemocnění. Před rozšířením onemocnění je však odhaleno pouze 16 % případů rakoviny plic.

Přes podstatný pokrok ve výzkumu způsobů léčení těchto a jiných druhů rakovin zůstávají účinná diagnostika a léčení rakoviny prsu, tlustého střeva a kolorektální rakoviny obtížné. Proto je zapotřebí získat zlepšené způsoby léčení a prevence těchto druhů rakovin. Předkládaný vynález tyto potřeby spolu s dalšími výhodami splňuje.

• · · ·

-*4‘Podstata vynálezu

V jednom provedení předkládaný vynález poskytuje polynukleotidové prostředky obsahující sekvenci zvolenou ze skupiny (a) sekvencí složených z alespoň 20 za sebou následujících zbytků ze SEQ ID No. 1 nebo 3, které nejsou úplnou sekvencí ID NO: 1 nebo 3;

(b) sekvencí složených ze SEQ ID No. 1 nebo 3, nebo sekvencí, které se skládají z alespoň 20 za sebou následujících nukleotidů ze SEQ ID No. 1 nebo 3 a polypeptidu, který kóduje heterologního fuzního partnera.

Předkládaný vynález poskytuje v další provedení polypeptidové prostředky obsahující aminokyselinovou sekvenci, která je kódována výše popsanou polynukleotidovou sekvencí.

Polypeptidy a/nebo polynukleotidy podle předkládaného vynálezu jsou imunogenní, tj. jsou schopné vyvolat imunitní odpověď, zvláště humorální a/nebo buněčnou imunitní odpověď, jestliže jsou v případě potřeby konjugovány s vhodným nosičem a/nebo opatřeny vhodným adjuvans.

Předkládaný vynález dále poskytuje fragmenty, varianty a/nebo deriváty popisovaných polypeptidových a/nebo polynukleotidových sekvencí, přičemž fragmenty, varianty a/nebo deriváty mají s výhodou míru imunogenní aktivity alespoň přibližně 50 %, s výhodou alespoň přibližně 70 % a výhodněji alespoň přibližně 90 % míry imunogenní aktivity polypeptidové sekvence uvedené v SEQ ID No. 2 nebo 4 nebo polypeptidové sekvence kódované polynukleotidovou sekvencí uvedenou v SEQ ID No. 1 nebo 3.

Předkládaný vynález dále poskytuje polynukleotidy kódující výše popsaný polypeptid, expresní vektory obsahující tyto polynukleotidy a hostitelské buňky transformované nebo transfekované těmito expresními vektory.

V rámci dalších provedení poskytuje předkládaný vynález farmaceutické prostředky s obsahem polypeptidu nebo polynukleotidu popsiovaných výše a fyziologicky přijatelného nosiče.

V souvisejícím provedení poskytuje předkládaný vynález farmaceutické prostředky, např. vakcíny, pro preventivní nebo léčebné aplikace. Tyto prostředky obecně obsahují imunogenní polypeptid nebo polynukleotid podle předkládaného vynálezu a imunostimulační látku jako je adjuvans.

V dalším provedení předkládaný vynález poskytuje farmaceutické prostředky obsahující: (a) buňku předkládající antigen, která exprimuje polypeptid popsaný výše, a (b) farmaceuticky přijatelný nosič nebo pomocnou látku. Ilustrativní příklady buňky předkládající antigen zahrnují dendritické buňky, makrofágy, monocyty, fibroblasty a B-buňky.

V dalších provedeních se poskytují farmaceutické prostředky, které obsahují: (a) buňku předkládající antigen exprimující polypeptid popisovaný výše, a (b) imunostimulační látku.

Předkládaný vynález v dalším provedení poskytuje fuzní proteiny obsahující alespoň jeden polypeptid popsaný výše a polynukleotidy kódující tyto fuzní proteiny, typicky ve formě farmaceutických prostředků, např. vakcin, obsahujících fyziologicky přijatelný nosič a/nebo imunostimulační látku. Fuzní proteiny mohou obsahovat větší počet imunogenních polypeptidů nebo jejich částí/variant, jak se zde popisuje, a mohou dále obsahovat jeden nebo více úseků polypeptidů pro umožnění exprese, čištění a/nebo dosažení imunogenicity tohoto polypeptidu nebo polypeptidů.

V dalším provedení předkládaný vynález poskytuje způsoby stimulace imunitní odpovědi u pacienta, s výhodou odpovědi T-buněk u člověka, které zahrnují podávání farmaceutického prostředku popisovaného v přihlášce. Pacient může být postižen rakovinou plic nebo tlustého střeva nebo kolorektální rakovinou nebo rakovinou prsu,

přičemž způsoby zahrnují léčení onemocění, nebo může být pacient s rizikem takového onemocnění léčen preventivně. Konkrétně půjde o pacienty s tumory exprimujícími antigeny cripto.

V dalších provedeních poskytuje předkládaný vynález způsoby inhibice rozvoje rakoviny u pacienta, které zahrnují podávání farmaceutického prostředku uvedeného výše pacientovi. Pacient může být postižen rakovinou plic, tlustého střeva, kolorektální rakovinou nebo rakovinou prsu, přičemž způsoby zahrnují léčení onemocnění, nebo může být pacient s rizikem takového onemocnění léčen preventivně.

Předkládaný vynález v dalším provedení poskytuje způsoby odstraňování tumorových buněk z biologického vzorku, který zahrnuje přivedení biologického vzorku do styku s T-buňkami, které specificky reagují s polypeptídem podle předkládaného vynálezu, přičemž přivedení do styku se provádí za podmínek a po dostatečnou dobu pro umožnění odstranění buněk exprimujících protein ze vzorku.

V souvisejících provedeních se poskytují způsoby inhibice rozvoje rakoviny u pacienta, které zahrnují podávání biologického vzorku ošetřeného způsobem popsaným výše pacientovi.

V dalších provedeních se poskytují způsoby stimulace a/nebo expanze T-buněk specifických pro polypeptid podle předkládaného vynálezu, které zahrnují přivedení T-buněk do styku s jedním nebo více následujícími materiály: (i) polypeptídem popisovaným výše; (ii) polynukleotidem kódujícím tento polypeptid; a/nebo (iii) buňkou předkládající antigen, která exprimuje takový polypeptid; za podmínek a po dostatečně dlouhou dobu pro umožnění stimulace a/nebo expanze T-buněk. Poskytují se také izolované populace T-buněk obsahující T-buňky připravené způsoby popsanými výše.

V dalším provedení předkládaný vynález poskytuje způsoby inhibice rozvoje rakoviny u pacienta, které zahrnují podávání účinného množství populace T-buněk popisované výše pacientovi.

• ·

Předkládaný vynález dále poskytuje způsoby inhibice rozvoje rakoviny u pcienta, který zahrnuje kroky: (a) inkubace CD4+ a/nebo CD8+ T-buněk izolovaných z pacienta s jedním nebo více z následujících materiálů: (i) polypeptidem obsahujícím alespoň imunogenní část zde popisovaného polypeptidu cripto; (ii) polynukleotidem kódujícím takový polypeptid; a (iii) buňkou předkládající antigen exprimující takový polypeptid; a (b) podávání účinného množství proliferovaných T-buněk pacientovi a tím inhibici rozvoje rakoviny u pacienta. Proliferované buňky mohou ale nemusí být před podáváním pacientovi klonovány.

Tato a jiná provedení podle předkládaného vynálezu budou zřejmá na základě odkazů na následující podrobný popis. Všechny odkazy uváděné v přihlášce jsou zařazeny odkazem ve svém celku, tak jako by byly zařazeny jednotlivě.

Přehled obrázků na výkresech a identifikace sekvencí

SEQ ID No. 1 polynukleotid Cripto 1

SEQ ID No. 2 polynukleotid Cripto 3

SEQ ID No. 2 polypeptid 1 Cripto 3

SEQ ID No. 3 polypeptid Cripto 1

SEQ ID No. 3 polypeptid Cripto 3

SEQ ID No. 5 polynukleotid Cripto popsaný v US 5654 140 SEQ ID No. 6 polynukleotid Cripto popsaný v US 5654 140 SEQ ID No. 7-10 PCR primery

SEQ ID No. 11 & 12 syntetické peptidy Cripto 1 SEQ ID No. 13-94 epitopy z Cripto 1 a 3 SEQ ID No. 95 varianta polynukleotidu Cripto 1 SEQ ID No. 96 varianta polypeptidu Cripto 1 • ·

Podrobný popis vynálezu

Předkládaný vynález je obecně zaměřen na farmaceutické prostředky a jejich použití při léčení a diagnostice rakoviny, zvláště rakoviny a metastáz exprimujících protein cripto, včetně rakovin plic, tlustého střeva, kolorektální rakoviny a rakoviny prsu exprimující protein cripto. Jak bude popsáno dále, ilustrativní prostředky podle předkládaného vynálezu zahrnují bez omezení polypeptidy, zvláště imunogenní polypeptidy, polynukleotidy kódující tyto polypeptidy, protilátky a jiné vazebné antigeny, buňky předkládající antigen (APC) a buňky imunitního systému (např. T-buňky).

Při provádění předkládaného vynálezu se bude používat, pokud není v konkrétním případě uvedeno jinak, běžných metod virologie, imunologie, mikrobiologie, molekulární biologie a technik rekombinantní DNA, které jsou známé odborníkům v oboru a mnoho z nich se popisuje dále pro ilustraci. Tyto techniky jsou podrobně vysvětleny v literatuře, viz např. Sambrook, a další, Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2. vydání, 1989); Maniatis a další, Molecular Cloning: A Laboratory Manual (1982); DNA Cloning: A Practical Approach, díl I & II (D. Glover, ed.); Oligonucleotide Synthesis (N. Gait, ed., 1984); Nucleic Acid Hybridization (B. Hames & S. Higgins, ed., 1985); Transcription a Translation (B. Hames & S. Higgins, ed., 1984); Animal Cell Culture (R. Freshney, ed., 1986); Perbal, A Practical Guide to Molecular Cloning (1984).

Všechny publikace, patenty a patentové přihlášky citované v předkládané přihlášce jsou zařaženy ve svém celku odkazem.

Jak se používá v přihlášce a nárocích, formy jednotného čísla zahrnují i významy množného čísla, pokud není ze souvislosti jasně zřejmý opak.

-9 Polypeptidové prostředky

Jak se zde používá, termín „polypeptid“ má svůj běžný význam, tj. sekvence aminokyselin. Polypeptidy nejsou omezeny na produkt specifické délky; v definici polypeptidu jsou tedy zahrnuty peptidy, oligopeptidy a proteiny, a tyto termíny se mohou používat zaměnitelně, pokud není konkrétně uvedeno jinak. Tento termín také neoznačuje nebo nevylučuje postexpresní modifikace polypeptidu, např. glykosylace, acetylace, fosforylace apod., stejně jako další modifikace známé v oboru, ať už se vyskytují v přírodě nebo nevyskytují. Polypeptidem může být úplný protein nebo jeho podsekvence. Konkrétní polypeptidy v souvislosti tohoto vynálezu jsou podsekvence aminokyselin obsahující epitopy, tj. antigenní determinanty v podstatě odpovědné za imunogenní vlastnosti polypeptidu a schopné vyvolat imunitní odpověď.

Konkrétní ilustrativní polypeptidy podle předkládaného vynálezu zahrnují sekvenci alespoň 10 za sebou náseldujících aminokyselin, s výhodou 20, výhodněji 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180 aminokyselin proteinu cripto se sekvencí SEQ ID No. 2 nebo 4.

V některých výhodných provedeních jsou polypeptidy podle vynálezu imunogenní, tj. reagují detekovatelným způsobem v imunologickém testu (jako je ELISA nebo test stimulace T-buněk) s antisérem a/nebo T-buňkami pacienta s rakovinou exprimující protein cripto. Screening imunogenní aktivity se může provádět použitím technik známých odborníkům v oboru. Tento screening se může např. provádět použitím metod jako jsou metody popisované v Harlow a Lané, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988. V jednom ilustrativním příkladu může být polypeptid imobilizován na pevném nosiči a přiveden do styku se sérem pacienta, aby se umožnilo navázání protilátek v séru na imobilizovaný • · • · • · · · polypeptid. Nenavázané sérum může být potom odstraněno a navázané protilátky detekovány například s použitím proteinu A ¹²⁵l.

Jak bude odborníkovi v oboru zřejmé, předkládaný vynález také zahrnuje imunogenní části popisovaných polypeptidů. Termín „imunogenní část“, jak se zde používá, je fragment imunogenního polypeptidu podle vynálezu, který je sám o sobě imunologicky reaktivní (tj. specificky se váže) na receptory povrchového antigenu B-buněk a/nebo T-buněk, které rozpoznávají polypeptid. Imunogenní části mohou být obecně identifikovány použitím známých technik, které jsou zahrnuty v publikaci Paul, Fundamental Immunology, 3. vyd., 243 247 (Raven Press, 1993) a tam uvedených odkazech. Tyto techniky zahrnují screening polypeptidů na schopnost reagovat s protilátkami specifickými pro antigen, antiséry a/nebo liniemi nebo klony T-buněk. Jak se zde používá, antiséra a protilátky jsou „specifické pro antigen“, jestliže se specificky váží na antigen (tj. jestliže reagují s proteinem v testu ELISA nebo jiném imunologickém testu a jestliže detekovatelně nereagují s nepříbuznými proteiny). Taková antiséra a protilátky mohou být připraveny podle popisu uvedeného v přihlášce i s použitím známých postupů.

V jednom výhodném provedení je imunogenní částí polypeptidu podle předkládaného vynálezu protein, který reaguje s antisérem a/nebo T-buňkami v míře, která není podstatně nižší než reaktivita polypeptidu s plnou délkou (např. v testu ELISA a/nebo testu reaktivity T-buněk). S výhodou je míra imunogenní aktivity imunogenní části alespoň přibližně 50 %, s výhodou alespoň přibližně 70 %, nejvýhodněji je vyšší než přibližně 90 % imunogenicity úplného polypeptidu. V některých případech budou identifikovány imunogenní části, které mají míru imunogenní aktivity vyšší než je aktivita odpovídajícího úplného polypeptidu, např. s více než přibližně 100% nebo 150% nebo vyšší imunogenní aktivitou.

• · • · ·

- Ϊ1 ·• · · • · · • · · • · · · • · 9 ·

V některých dalších provedeních mohou ilustrativní imunogenní části zahrnovat peptidy, ve kterých byla odstraněna N-koncová úvodní sekvence a/nebo transmembránová doména. Jiné ilustrativní imunogenní části budou obsahovat malé N-koncové a/nebo C-koncové delece (např. 1 - 30 aminokyselin, s výhodou 5 - 15 aminokyselin), vzhledem k zralému proteinu.

V dalším provedení může polypeptidový prostředek podle vynálezu obsahovat také jeden nebo více polypeptidů, které jsou imunologicky reaktivní s T-buňkami a/nebo protilátkami vytvořenými proti polypeptidů podle předkládaného vynálezu, zvláště polypeptidů se zde uvedenou aminokyselinovou sekvencí, nebo s jeho imunogenním fragmentem nebo variantou.

V dalším provedení vynálezu se poskytují polypeptidy, které obsahují jeden nebo více polypeptidů schopných vyvolat T-buňky a/nebo protilátky, které jsou imunologicky reaktivní s jedním nebo více popisovanými polypeptidy, nebo jedním nebo více polypeptidy kódovanými souvislými sekvencemi nukleových kyselin obsaženými ve zde popisovaných polynukleotidových sekvencích, nebo jejich imunogenními fragmenty nebo variantami, nebo jednou nebo více sekvencí nukleových kyselin, které hybridizují s jednou nebo více těchto sekvencí za podmínek střední až vysoké stringentnosti.

Předkládaný vynález poskytuje v dalším provedení fragmenty polypeptidů obsahující přibližně alespoň 5, 10, 15, 20, 25, 50, 100 nebo 150 souvislých aminokyselin nebo více, včetně všech mezilehlých délek, polypeptidových prostředků popisovaných ve vynálezu, jako jsou polypeptidy uvedené v SEQ ID No. 2 nebo 4 nebo kódované polynukleotidovou sekvencí uvedenou v sekvenci SEQ ID No. 1 nebo 3. Je výhodné, jestliže polypeptidy obsahují alespoň jeden, s výhodou větší počet epitopů uvedených v SEQ ID No. 13 až 94. Tyto fragmenty jsou popřípadě fúzovány nebo jinak konjugovány k heterolognimu nosiči.

• « ♦ · · «

V dalším provedení poskytuje předkládaný vynález varianty zde popisovaných polypeptidových prostředků (compositions). Polypeptidové varianty obecně zahrnuté do předkládaného vynálezu budou typicky vykazovat alespoň přibližně 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, nebo 99% nebo vyšší identitu (zjištěnou způsoby popsanými dále) podél své délky, s uváděnými polypeptidovými sekvencemi.

V jednom výhodném provedení jsou polypeptidové fragmenty a varianty poskytované předkládaným vynálezem imunologicky reaktivní s protilátkou a/nebo T-buňkou, která reaguje s úplným polypeptidem, který se zde specificky uvádí.

V dalším výhodném provedení vykazují polypeptidové fragmenty a varianty poskytované předkládaným vynálezem míru imunogenní aktivity alespoň přibližně 50 %, s výhodou alespoň přibližně 70 %, nejvýhodněji alespoň přibližně 90 % nebo více ve srovnání s polypeptidovou sekvencí úplné délky, která se zde specificky uvádí.

Polypeptidové „varianta“ ve zde používaném významu je polypeptid, který se typicky liší od polypeptidu, který se zde specificky uvádí, v jedné nebo více substitucích, delecích, adicích a/nebo inzercích. Tyto varianty se mohou vskytovat v přírodě nebo mohou být vytvořeny synteticky, např. modifikací jedné nebo více výše uvedených polypeptidových sekvencí podle vynálezu a vyhodnocením jejich imunogenní aktivity podle zde uvedeného popisu a/nebo s použitím kteréhokoli z řady způsobů dobře známých v oboru.

Např. některé ilustrativní varianty polypeptidů podle vynálezu zahrnují polypeptidy, ve kterých byla odstraněna jedna nebo více částí, jako je N-koncová úvodní sekvence nebo transmembránové doména. Další ilustrativní varianty zahrnují varianty, ve kterých byla odstraněna malá část (např. 1 - 30 aminokyselin, s výhodou 5-15 aminokyselin) z N- a/nebo C-koncové části zralého proteinu.

V mnoha případech bude varianta obsahovat konzervativní substituce. „Konzervativní substituce“ je substituce, při které je aminokyselina nahrazena jinou aminokyselinou, která má podobné vlastnosti, které by odborník v oboru chemie peptidů očekával na základě sekundární struktury a hydropatické povahy v podstatě nezměněného polypeptidu. Jak se uvádí výše, modifikace se mohou provádět ve struktuře polynukleotidů a polypeptidů podle předkládaného vynálezu, přičemž se stále získá funkční molekula, která kóduje variantu nebo derivát polypeptidu s požadovanými vlastnostmi, např. s požadovanými imunogenními vlastnostmi. Jestliže je žádoucí změnit aminokyselinovou sekvenci polypeptidu pro vytvoření ekvivalentu, nebo dokonce zlepšené imunogenní varianty nebo části polypeptidu podle vynálezu, odborník v oboru bude typicky měnit jeden nebo více kodonů kódující sekvence DNA podle tabulky 1.

Například některé aminokyseliny mohou být substituovány za jiné aminokyseliny ve struktuře proteinu, aniž by došlo k významnému úbytku interaktivní vazebné kapacity se strukturami, jako jsou např. oblasti vazby na antigen protilátek nebo vazebná místa na molekulách substrátu. Protože biologickou funkční aktivitu proteinu určuje právě interakční kapacita a povaha proteinu, mohou být provedeny v sekvenci proteinu a samozřejmě v příslušné kódující sekvenci DNA některé substituce v aminokyselinové sekvenci, a přesto se získá protein s podobnými vlastnostmi. Je tedy zřejmé, že v peptidových sekvencích popisovaných prostředků nebo odpovídajících sekvencích DNA kódujících tyto peptidy je možno provádět různé změny bez významného úbytku jejich biologické použitelnosti nebo aktivity.

·« ·· ·

-.-14-99 » ·· * ♦· « * * * · · * . « ♦ · · ► * · , ·· ·»

Tabulka 1

Aminokyseliny Kodony

Alanin	Ala	A	GCA	GCC	GCG	GCU
Cystein	Cys	C	UGC	UGU
Kyselina asparagová	Asp	D	GAC	GAU
Kyselina glutamová	Glu	E	GAA	GAG
Fenylalanin	Phe	F	UUC	UUU
Glycin	Gly	G	GGA	GGC	GGG	GGU
Histidin	His	H	CAC	CAU
Isoleucin	Ile	I	AUA	AUC	AUU
Lysin	Lys	K	AAA	AAG
Leucin	Leu	L	UUA	UUG	CUA	CUC	CUG	CUU
Methionin	Met	M	AUG
Asparagin	Asn	N	AAC	AAU
Prolin	Pro	P	CCA	CCC	CCG	CCU
Glutamin	Gin	Q	CAA	CAG
Arginin	Arg	R	AGA	AGG	CGA	CGC	CGG	CGU
Serin	Ser	S	AGC	AGU	UCA	UCC	UCG	UCU
Threonin	Thr	T	ACA	ACC	ACG	ACU
Valin	Val	v	GUA	GUC	GUG	GUU
Tryptofan	Trp	w	UGG
Tyrosin	Tyr	Y	UAC	UAU

Při přípravě takovýchto změn je třeba brát v úvahu hydropatický index aminokyselin. Důležitost hydropatického indexu aminokyselin při dosahování biologické funkce proteinu z hlediska interakce je v oboru obecně známá (Kyte a Doolittle, 1982, zařazeno odkazem). Všeobecně přijímaný názor je, že relativní hydropatický charakter aminokyseliny přispívá k sekundární struktuře výsledného proteinu, • · • · ♦ · která zase určuje interakci proteinu s jinými molekulami, např. enzymy, substráty, receptory, DNA, protilátkami, antigeny apod. Každé aminokyselině byl přiřazen hydropatický index na základě jejích vlastností z hlediska hydrofobnosti a náboje (Kyte a Doolittle, 1982). Tyto hodnoty jsou: isoleucin (+4,5); valin (+4,2); leucin (+3,8); fenylalanin (+2,8); cystein/cystin (+2,5); methionin (+1,9); alanin (+1,8); glycin (-0,4); threonin (-0,7); serin (-0,8); tryptofan (-0,9); tyrosin (-1,3); prolin (-1,6); histidin (-3,2); glutamát (-3,5); glutamin (-3,5); aspartát (-3,5); asparagin (3,5); lysin (-3,9); a arginin (-4,5).

V oboru je známo, že některé aminokyseliny mohou být substituovány jinými aminokyselinami s podobným hydropatickým indexem nebo hodnocením, přičemž stále se získá protein s podobnou biologickou aktivitou, tj. biologicky funkční ekvivalentní protein. Při přípravě takových změn je výhodná substituce aminokyselin, jejichž hydropatické indexy jsou v rozmezí ±2, zvláště výhodně ±1 a ještě výhodněji ±0,5. V oboru je také známo, že substituce podobných aminokyselin může být účinně provedena na základě hydrofilních vlastností. US patent 4,554,101 (zařazený zde zvláště ve svém celku odkazem) uvádí, že nejvyšší lokální průměrná hydrofilnost proteinu řízená hydrofilností sousedních aminokyselin koreluje s biologickými vlastnostmi proteinu.

Jak se podrobně popisuje v US patentu 4,554,101, aminokyselinovým zbytkům byly přiřazeny následující hodnoty hydrofilností: arginin (+3,0); lysin (+3,0); aspartát (+3,0 ±1); glutamát (+3,0 ±1); serin (+0,3); asparagin (+0,2); glutamin (+0,2); glycin (0); threonin (-0,4); prolin (-0,5 ±1); alanin (-0,5); histidin (-0,5); cystein (-1,0); methionin (-1,3); valin (-1,5); leucin (-1,8); isoleucin (-1,8); tyrosin (-2,3); fenylalanin (-2,5); tryptofan (-3,4). Rozumí se, že aminokyselina může být substituována za jinou aminokyselinu s podobnou hodnotou hydrofilností, a stále se dosáhne biologicky ekvivalentního, zvláště imunologicky ekvivalentního proteinu. Při • · · · · · • · · ·

Λν těchto změnách je výhodná substituce aminokyselin, jejichž hodnoty hydrofilnosti jsou v rozmezí ±2, přičemž hodnoty ±1 jsou zvláště výhodné a hodnoty v rozmezí ±0,5 jsou ještě výhodnější.

Jak je uvedeno výše, substituce aminokyselin jsou z těchto důvodů obecně založeny na relativní podobnosti substituentů vedlejších řetězců aminokyselin, např. na jejich hydrofobnosti, hydrofilnosti, náboji, velikosti apod. Příklady substitucí, při kterých se berou v úvahu různé výše uvedené vlastnosti, jsou odborníkům v oboru dobře známé, a zahrnují substituce argininu a lysinu; glutamátu a aspartátu; šeřinu a threoninu; glutaminu a asparaginu; a valinu, leucinu a isoleucinu.

Jakýkoli polynukleotid může být navíc dále modifikován pro zvýšení stability in vivo. Možné modifikace bez omezení zahrnují adici obklopujících sekvencí na 5’ a/nebo 3’ konci; použití fosforothioátových nebo 2’-O-methylových vazeb namísto fosfodiesterázových vazeb v kostře; a/nebo zavedení netradičních bází jako je inosin, queosin a wybutosin, stejně jako acetylmethyl-, methyl-, thio- a jinak modifikovaných forem adeninu, cytidinu, guaninu, thyminu a uridinu.

Substituce aminokyselin se mohou dále provádět na základě podobnosti polarity, náboje, rozpustnosti, hydrofobnosti, hydrofilnosti a/nebo amfipatické povahy zbytků. Například záporně nabité aminokyseliny zahrnují kyselinu asparagovou a kyselinu glutamovou; kladně nabité aminokyseliny zahrnují lysin a arginin; a aminokyseliny s nenabitými polárními hlavními skupinami s podobnými hodnotami hydrofilnosti zahrnují leucin, isoleucin a valin; glycin a alanin; asparagin a glutamin; a serin, threonin, fenylalanin a tyrosin. Jiné skupiny aminokyselin, které mohou představovat konzervativní změny, zahrnují: (1) ala, pro, gly, glu, asp, gin, asn, ser, thr; (2) cys, ser, tyr, thr; (3) val, ile, leu, met, ala, phe; (4) lys, arg, his; a (5) phe, tyr, trp, his. Varianta může také nebo alternativně obsahovat nekonzervativní • · · · · · změny. Ve výhodném provedení se varianty polypeptidu liší od nativní sekvence substitucí, delecí nebo adicí pěti nebo méně aminokyselin. Varianty mohou být také (nebo alternativně) modifikovány například delecí nebo adicí aminokyselin, které mají minimální vliv na imunogenicitu, sekundární strukturu a hydropatickou povahu polypeptidu.

Jak bylo uvedno výše, polypeptidy mohou obsahovat signální (nebo úvodní) sekvenci na N-konci proteinu, která kotranslačně nebo posttranslačně řídí přenos proteinu. Polypeptid může být také konjugován k propojovací nebo jiné sekvenci pro usnadnění syntézy, čištění nebo identifikace polypeptidu (např. poly-His), nebo pro zesílení vazby polypeptidu na pevný nosič. Polypeptid může být například konjugován k imunoglobulinové oblasti Fc.

Při porovnávání polypeptidových sekvencí se uvádějí dvě sekvence jako „identické“, jestliže je sekvence aminokyselin v těchto dvou sekvencích stejná při uspořádání z hlediska maximální shody, jak se bude popisovat dále. Porovnávání mezi dvěma sekvencemi se typicky provádí srovnáním sekvencí srovnávacím okénkem pro identifikaci a porovnání lokálních oblastí nebo podobnosti sekvence. Výraz „srovnávací okénko“, jak se zde používá, označuje segment alespoň přibližně 20 za sebou následujících poloh, obvykle 30 až přibližně 75, 40 až přibližně 50, ve kterých může být sekvence srovnávána s referenční sekvencí se stejným počtem za sebou následujících poloh po optimálním uspořádání těchto dvou sekvencí.

Optimální uspořádání sekvencí pro účely porovnání se může provést použitím programu Megalign program v softwarovém balíku Lasergen suitě of bioinformatics software (DNASTAR, lne., Madison, Wl), s použitím výrobcem nastavených parametrů, ento program provádí několik schémat uspořádání, která se popisují v následujících odkazech: Dayhoff, M. O. (1978), A model of evolutionary change in proteins - Matrices for detecting distant relationships, Dayhoff, M. O.

• · • · · ·

(ed.) Atlas of Protein Sequence and Structure, National Biomedical Research Foundation, Washington DC, díl 5, kap. 3, str. 345 - 358; Hein J. (1990) Unified Approach to Alignment and Phylogenes, str. 626 - 645 Methods in Enzymology, díl 183, Academie Press, lne, San Diego, CA; Higgins, D. G. a Sharp, P. M. (1989) CABIOS 5: 151 - 153; Myers, E. W. a Muller W. (1988) CABIOS 4: 11-17; Robinson, E. D. (1971) Comb. Theor 11: 105; Santou, N., Nes, M. (1987) Mol. Biol. Ěvol. 4: 406 - 425; Sneath, P. H. A. a Sokal, R. R. (1973) Numerical Taxonomy - the Principles and Practice of Numerical Taxonomy, Freeman Press, San Francisco, CA; Wilbur, W. J. a Lipman, D. J. (1983) Proč. Nati. Acad, Sci. USA 80: 726 - 730.

Alternativně se může optimální uspořádání sekvencí pro účely porovnání dosáhnout použitím algoritmu lokální identity autorů Smith and Waterman (1981) Add. APL. Math 2: 482, algoritmem uspořádání identity autorů Needleman and Wunsch (1970) J. Mol. Biol. 48: 443, hledáním způsobů podobnosti autorů Pearson a Lipman (1988) Proč. Nati. Acad. Sci. USA 85: 2444, počítačovým použitím těchto algoritmů (GAP, BESTFIT, BLAST, FASTA, a TFASTA v softwarovém balíku Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group (GCG), 575 Science Dr, Madison, WI), nebo prohlídkou.

Jeden výhodný příklad algoritmů, které jsou vhodné pro zjištění procenta identity sekvence a podobnosti sekvence jsou algoritmy BLAST a BLAST 2.0, které se popisují v článcích Altschul a další, (1977) Nucl. Acids Res. 25: 3389 - 3402 a Altschul a další, (1990) J. Mol. Biol. 215: 403 - 410. BLAST a BLAST 2.0 mohou být použity například s dále popisovanými parametry pro zjištění procenta identity sekvence pro polynukleotidy a polypeptidy podle vynálezu. Software pro provádění analýz BLAST je veřejně dostupný prostřednictvím National Center for Biotechnology Information. Pro sekvence aminokyselin může být pro výpočet kumulativního skóre použita bodovací matrice. Prodlužování shody slova v každém směru se zastaví, jestliže: kumulativní skóre shody se odchýlí o hodnotu X od

maximální dosažené hodnoty; kumulativní skóre se blíží k 0 nebo nabývá hodnoty nižší než 0 v důsledku nahromadění jednoho nebo více srovnání zbytků s negativním skóre; nebo se dosáhne konce kterékoli sekvence. V algoritmu BLAST určují citlivost a rychlost porovnání parametry W, T a X.

Ve výhodném provedení se hodnota „procenta identity sekvence“ zjistí srovnáním dvou optimálně uspořádaných sekvencí přes okénko pro porovnání o délce alespoň 20 poloh, kde část polypeptidové sekvence v porovnávacím okénku může obsahovat adice nebo delece (tj. mezery) 20 % nebo nižší, obvykle 5 až 15 %, nebo 10 až 12 %, v porovnání s referenčními sekvencemi (které adice nebo delece neobsahují) pro optimální uspořádání těchto dvou sekvencí. Procento se vypočte určením počtu poloh, ve kterých se vyskytuje u obou sekvencí identický aminokyselinový zbytek, čímž se získá počet souhlasných poloh, počet souhlasných poloh se vydělí celkovým počtem poloh v referenční sekvenci (tj. velikostí okénka) a výsledky se vynásobí 100 pro získání procenta identity sekvence.

V jiných ilustrativních provedeních může být polypeptidem fuzní polypeptid, který obsahuje větší počet polypeptidů, které se zde popisují, nebo který obsahuje alespoň jeden zde popisovaný polypeptid a nepříbuznou sekvenci jako je známý tumorový protein. Fuzní partner může např. napomáhat při poskytování T-pomocných epitopů (imunologický fuzní partner), s výhodou T-pomocných epitopú rozpoznávaných člověkem, nebo může napomáhat při expresi proteinu (zesilovač exprese) pro dosažení vyšších výtěžků než u nativního rekombinantního proteinu. Někteří výhodní fuzní partneři jsou jak imunologického, tak i expresi zesilujícího typu. Další fuzní partneři mohou být vybráni tak, aby zvyšovali rozpustnost polypeptidu, nebo umožnili směrování polypeptidu do požadovaných intracelulárních oddílů. Mezi další fuzní partnery patří afinitní značky, které umožní čištění polypeptidu.

·· · · ·

- 20 Fúzní polypeptidy se mohou obecně připravit použitím standardních technik včetně chemické konjugace. Fuzní polypeptid je s výhodou exprimován jako rekombinantní polypeptid umožňující v expresním systému produkci zvýšených hladin vzhledem k nefuzovanému polypeptidu. Ve stručnosti, sekvence DNA kódující složky polypeptidu mohou být sestaveny odděleně a vloženy do vhodného expresního vektoru. 3’-konec sekvence DNA kódující jednu složku polypeptidu se naváže s nebo bez peptidové propojovací skupiny na 5’-konec sekvence DNA kódující druhou polypeptidovou složku tak, že čtecí rámce těchto sekvencí jsou ve fázi. To umožní překlad do jediného fúzního polypeptidu, který si zachová biologickou aktivitu obou složek polypeptidů.

Peptidová propojovací (linkerová) sekvence může být použita pro oddělení první a druhé polypeptidové složky vzdáleností, která je dostatečná pro zajištění složení každého polypeptidu do své sekundární a terciární struktury. Taková peptidová propojovací sekvence se do fúzního polypeptidu zavádí použitím standardních technik dobře známých v oboru. Vhodné peptidové propojovací sekvence mohou být zvoleny na základě následujících faktorů:

(1) jejich schopnosti přijímat pružnou prodlouženou konformaci;

(2) jejich neschopnosti přijímat sekundární strukturu, která by mohla interagovat s funkčními epitopy na prvním a druhém polypeptidu: a (3) nepřítomnost hydrofobních nebo nabitých zbytků, které by mohly reagovat s funkčními epitopy polypeptidů. Výhodné peptidové propojovací sekvence zahrnují zbytky Gly, Asn a Ser. Jako propojovací sekvence mohou být také použity jiné aminokyseliny s téměř neutrální povahou, jako je Thr a Ala. Aminokyselinové sekvence, které jsou použitelné jako propojovací skupiny, zahrnují sekvence popsané v Maratea a další, Gene 40: 39 - 46,1985; Murphy a další, Proč. Nati. Acad. Sci. USA 83: 8258 - 8262, 1986; US patent No. 4,935,233 a US patent No. 4,751,180. Propojovací sekvence může mít obecně délku od 1 do přibližně 50 aminokyselin. Propojovací sekvence nejsou • · • ·

nezbytné, jestliže mají první a druhý polypeptid N-koncové úseky aminokyselin, které nejsou pro jejich funkci nezbytné, a které mohou být použity pro oddělení funkčních domén a zabránění prostorovým interferencím.

Navázané sekvence DNA jsou operativně napojeny na vhodné transkripční nebo translační řídící prvky. Řídící prvky odpovědné za expresi DNA jsou umístěny pouze na 5’straně vzhledem k sekvenci DNA kódující první polypeptidy. Podobně stop kodony nezbytné pro ukončení translace a signály ukončení transkripce jsou přítomné pouze na 3’ straně vzhledem k sekvenci DNA kódující druhý polypeptid.

Fuzní polypeptid může obsahovat polypeptid popsaný v předkládaném vynálezu společně s nepříbuzným imunogenním proteinem, jako je imunogenní protein schopný vyvolat zpětnou odpověď. Příklady těchto proteinů zahrnují proteiny tetanu, tuberkulózy a hepatitidy (viz například Stoute a další, New Engl. J. Med., 336: 86 91, 1997).

V jednom výhodném provedení je imunologický fuzní partner odvozený od druhu Mycobacterium sp., jako je fragment Ra12 odvozený od Mycobacterium tuberculosis. Prostředky s obsahem Ra12 a způsoby jejich použití při zvyšování exprese a/nebo imunogenicity heterologních polynukleotidových/polypeptidových sekvencí se popisují v US patentové přihlášce 60/158,585, jejíž obsah se zahrnuje jako celek odkazem. Ve stručnosti, Ra12 označuje polynukleotidovou oblast, která má sekvenci nukleové kyseliny MTB32A Mycobacterium tuberculosis. MTB32A je serinová proteáza s molekulovou hmotností 32 kD (32 000) kódovaná genem ve virulentních a nevirulentních kmenech M. tuberculosis. Nukleotidová sekvence a aminokyselinová sekvence MTB32A byla popsána (viz např. US patentová přihláška 60/158,585; viz také Skeiky a další, Infection and Immun. (1999) 67: 3998 - 4007, zařazená odkazem). C-koncové fragmenty kódující

-22 ·-* sekvence MTB32A se exprimují ve vysokých hladinách a v průběhu procesu čištění zůstávají ve formě rozpustných polypeptidů. Navíc může Ra12 zvyšovat imunogenicitu heterologních imunogenních polypeptidů, s kterými je fúzován. Jeden výhodný fuzní polypeptid obsahující Ra12 obsahuje C-koncový fragment 14 kD (14 000) odpovídající aminokyselinovým zbytkům 192 až 323 MTB32A. Jiné výhodné polynukleotidy Ra12 obecně obsahují alespoň přibližně 15 za sebou následujících nukleotidů, alespoň přibližně 30 nukleotidů, alespoň přibližně 60 nukleotidů, alespoň přibližně 100 nukleotidů, alespoň přibližně 200 nukleotidů, nebo alespoň přibližně 300 nukleotidů, které kódují část polypeptidu Ra12. Polynukleotidy Ra12 mohou obsahovat nativní sekvenci (tj. endogenní sekvenci, která kóduje polypeptid Ra12 nebo jeho část), nebo mohou obsahovat variantu takové sekvence. Varianty polynukleotidu Ra12 mohou obsahovat jednu nebo více substitucí, adicí, delecí a/nebo inzercí tak, že biologická aktivita kódovaného fuzního polypeptidu není podstatně snížena vzhledem k fuznímu polypeptidu obsahujícímu nativní polypeptid Ra12. Varianty mají s výhodou alespoň přibližně 70% identitu, výhodněji alespoň přibližně 80% identitu a nejvýhodněji alespoň přibližně 90% identitu vzhledem k polynukleotidové sekvenci kódující nativní polypeptid Ra12 nebo jeho část.

V rámci jiných výhodných provedení je imunologický fuzní partner odvozený od proteinu D, což je povrchový protein gramnegativní bakterie Haemophilus influenzae B (WO 91/18926). S výhodou obsahuje derivát proteinu D přibližně první třetinu proteinu (např. prvních 100 až 110 N-koncových aminokyselin), přičemž derivát proteinu D může být lipidován. V některých výhodných provedeních je na N-konci obsaženo prvních 109 zbytků fuzního partnera lipoproteinů D, aby byl získán polypeptid s dalšími exogenními epitopy T-buněk, a aby byla zvýšena míra exprese v E. coli (funguje tedy jako zesilovač exprese). Lipidický konec zajišťuje optimální předkládání antigenu buňkám předkládajícím antigen. Mezi další fuzní partnery patří nestrukturní protein viru chřipky, NS1 (hemaglutinin). Typicky se používá N-koncových 81 aminokyselin, ačkoli mohou být použity i jiné fragmenty obsahující epitopy T-pomocných buněk.

V dalším provedení je imunologickým fuzním partnerem protein známý jako LYTA, nebo jeho část (s výhodou C-koncová část). LYTA je odvozen od Streptococcus pneumoniae, který syntetizuje N-acetylL-alaninamidázu známou jako amidáza LYTA (kódovaná genem LytA; Gene 43: 265 - 292, 1986). LYTA je autolysin, který specificky degraduje některé vazby v peptidoglykanové kostře. C-koncová doména proteinu LYTA je odpovědná za afinitu k cholinu nebo některým analogům cholinu, jako je DEAE. Tato vlastnost byla využívána při vývoji plasmidů E. coli exprimujících C-LYTA použitelných pro expresi fuzních proteinů. Čištění hybridních proteinů obsahujících fragment C-LYTA na aminovém konci již bylo popsáno (viz Biotechnology 10: 795 - 798, 1992). Ve výhodném provedení může být do fuzního polypeptidu zahrnuta opakující se část LYTA. Opakující se část se nachází v C-koncové oblasti počínaje zbytkem 178. Zvláště výhodná opakující se část obsahuje zbytky 188 - 305.

Ještě další ilustrativní provedení zahrnuje fuzní polypeptidy a je kódující polynukleotidy, kde fuzní partner obsahuje směrovací signál schopný směrovat polypeptid do endozomálního/lysozomálního oddílu, jak se popisuje v US patentu No. 5,633,234. imunogenní polypeptid podle vynálezu, jestliže se fuzuje s tímto směrovacím signálem, se bude snadněji asociovat s molekulami MHC třídy II, takže bude lépe in vivo stimulovat CD4+ T-buňky specifické pro daný polypeptid.

Část cripto fuzní molekuly může být s výhodou úplný protein o délce 188 aminokyselin, cripto 1 nebo cripto 3 nebo jejich fragment, jak se zde popisuje.

Polypeptidy podle vynálezu se připravují jakoukoli z dobře známých syntetických a/nebo rekombinantních technik, přičemž rekombinantní techniky se budou podrobněji popisovat dále.

.-24-Polypeptidy, jejich části a jejich varianty o délce obecně nižší než přibližně 150 aminokyselin se mohou vytvářet synteticky použitím způsobů dobře známých odborníkům v oboru. V jednom ilustrativním příkladu se tyto polypeptidy syntetizují použitím kterékoli z komerčně dostupných technik syntézy na pevné fázi, jako je Merrifieldova metoda syntézy na pevné fázi, kde se aminokyseliny postupně přidávají rostoucí aminokyselinový řetězec, viz Merrifield, J. Am. Chem. Soc. 85: 2149 - 2146, 1963. Vybavení pro automatickou syntézu polypeptidů je komerčně dostupné od firem jako je Perkin Elmer/Applied BioSystems Division (Foster City, CA), a může se používat podle instrukcí výrobce.

Obecně jsou polypeptidové prostředky (s výhodou fuzní polypeptidy) podle vynálezu izolované. „Izolovaný“ polypeptid je polypeptid, který je vyjmutý ze svého původního prostředí. Např. v přírodě se vyskytující protein nebo polypeptid je izolovaný, jestliže je oddělený od některého nebo všech koexistujících materiálů v přirozeném systému. S výhodou jsou tyto polypeptidy také čištěné, tj. mají čistotu alespoň přibližně 90 %, výhodněji alespoň přibližně 95 % a nejvýhodněji alespoň přibližně 99 %.

Polynukleotidové prostředky

Předkládaný vynález poskytuje v dalších provedeních polynukleotidové prostředky, které kódují polypeptidy podle vynálezu. Termíny „DNA“ a „polynukleotid“ se používají v podstatě zaměnitelně pro označení molekuly DNA, která byla izolována a zbavena celkové genomické DNA určitého druhu. „Izolovaný“, jak se zde používá, znamená, že polynukleotid je v podstatě prostý jiných kódujících sekvencí, a že molekula DNA neobsahuje větší části nepříbuzné kódující DNA, jako jsou velké chromozomální fragmenty nebo jiné funkční geny nebo oblasti kódující polypeptid. To se samozřejmě týká molekuly DNA tak jak byla původně izolována, a nejsou vyloučeny geny nebo kódující oblasti přidané později k segmentu umělé.

Jak bude odborníkovi v oboru zřejmé, polynukleotidové prostředky podle vynálezu mohou obsahovat genomické sekvence, mimogenomické a plasmidy kódované sekvence a menší úseky genu získané genetickým inženýrstvím, které exprimují nebo které mohou být upraveny pro expresi proteinů, polypeptidů, peptidů apod. Tyto segmenty mohou být izolovány z přírody nebo mohou být synteticky modifikovány člověkem.

Jak bude také odborníkovi v oboru zřejmé, polynukleotidy podle vynálezu mohou být jednořetězcové (kódující nebo nekódující) nebo dvojřetězcové, a může jít o DNA (genomická, cDNA nebo syntetická) nebo RNA. Molekuly RNA mohou obsahovat molekuly HnRNA, které obsahují introny a odpovídají molekule DNA 1 ; 1 a molekuly mRNA, které introny neobsahují. Další kódující nebo nekódující sekvence mohou ale nemusí být přítomny v polynukleotidu podle předkládaného vynálezu a polynukleotid může nebo nemusí být spojen s jinými molekulami a/nebo nosnými materiály.

Polynukleotidy mohou obsahovat nativní sekvenci (tj. endogenní sekvenci, která kóduje polypeptid/protein podle vynálezu nebo jeho část) nebo mohou obsahovat sekvenci kódující variantu nebo derivát, s výhodou imunogenní variantu nebo derivát takové sekvence.

Varianty polynukleotidu budou typicky obsahovat jednu nebo více substitucí, adicí, deiecí a/nebo inzercí, s výhodou tak, že není podstatně zmenšena imunogenicita polypeptidu kódovaného variantou polynukleotidu, vzhledem k polypeptidu kódovanému polynukleotidovou sekvencí specificky uváděnou v předkládaném vynálezu. Termín „varianty“ by měl být také chápán tak, že zahrnuje homologní geny xenogenního původu.

V dalších provedeních předkládaný vynález poskytuje polynukleotidové fragmenty obsahující různé délky souvislých úseků

• · ·

sekvence identické nebo komplementární s jednou nebo více ze sekvencí SEQ ID No. 1 nebo 3. Poskytují se například polynukleotidy, které obsahují alespoň přibližně 10, 15, 20, 30, 40, 50, 75, 100, 150, 200, 300, 400 nukleotidů ze SEQ ID No. 1 stejně jako všechny mezilehlé délky. Bude zřejmé, že výraz „mezilehlé délky“ znamená v této souvislosti jakoukoli délku mezi uvedenými hodnotami, jako je 16, 17, 18, 19 atd.; 21, 22, 23 atd.; 30, 31, 32 atd.; 50, 51, 52, 53 atd.; 100, 101, 102, 103 atd.; 150, 151, 152, 153 atd.; včetně všech celočíselných délek 200 - 500; 500 - 1000, apod. Zvláště výhodné polynukleotidy jsou polynukleotidy kódující epitopy uvedené jako SEQ ID No. 13 - 94.

V dalším provedení vynálezu se poskytují polynukleotídové prostředky, které jsou schopné hybridizovat za mírně až vysoce stringentních podmínek s polynukleotídovou sekvencí poskytovanou vynálezem nebo jejím fragmentem nebo její komplementární sekvencí. Hybridizační techniky jsou v oboru molekulární biologie dobře známé. Pro účely ilustrace jsou vhodné mírně stringentní podmínky pro testování hybridizace polynukleotidu podle vynálezu s jinými polynukleotidy následující: předběžný oplach v roztoku 5 x SSC, 0,5% SDS, 1,0 mM EDTA (pH 8,0); hybridizace při 50 °C až 60 °C, 5 x SSC, přes noc; následné dvojnásobné promytí při 65 °C 20 min vždy s koncentrací 2 x, 0,5 x a 0,2 x SSC s obsahem 0,1% SDS. Odborníkovi v oboru bude zřejmé, že míra stringentnosti hybridizace se může snadno upravit např. změnou koncentrace solí v hybridizačním roztoku a/nebo teplotou, při které se hybridizace provádí. V dalším provedení zahrnují například vhodné vysoce stringentní podmínky hybridizace výše popsané podmínky s tím rozdílem, že se zvýší teplota při hybridizaci např. na 60 až 65 °C nebo 65 až 70 °C.

V některých výhodných provedeních kódují zde popisované polynukleotidy, např. varianty polynukleotidů, jejich fragmenty a s nimi hybridizující sekvence, polypeptidy, které jsou imunologicky křížově

• · · · reagující s polypeptidovou sekvencí konkrétně uvedenou v SEQ ID No. 1 nebo SEQ ID No. 3. V dalších výhodných provedeních kódují tyto polynukleotidy polypeptidy, které mají míru imunogenní aktivity alespoň přibližně 50 %, s výhodou alespoň přibližně 70 % a výhodněji alespoň přibližně 90 % aktivity konkrétně zde uváděné polypeptidové sekvence.

Polynukleotidy podle předkládaného vynálezu nebo jejich fragmenty bez ohledu na délku samotné kódující sekvence mohou být kombinovány s jinými sekvencemi DNA jako jsou promotory, polyadenylační signály, další místa štěpení restrikčních enzymů, mnohonásobná klonující místa, další kódující úseky apod. tak, že se celková délka může značně lišit. Proto se uvažuje, že může být použit fragment nukleové kyseliny téměř jakékoli délky, přičemž celková délka je s výhodou omezena snadností přípravy a použitím v zamýšleném protokolu rekombinantní DNA. V mnoha provedeních předkládaného vynálezu jsou například jako použitelné uvažovány ilustrativní segmenty polynukleotidů s celkovými délkami přibližně 10 000, přibližně 5000, přibližně 3000, přibližně 2000, přibližně 1000, přibližně 500, přibližně 200, přibližně 100, přibližně 50 párů bází apod. (včetně všech mezilehlých délek).

Při porovnávání nukleotidových sekvencí se dvě sekvence označují jako „identické“, jestliže je sekvence nukleotidů těchto dvou sekvencí stejná při uspořádání pro dosažení maximální shody, jak bude popsáno dále. Porovnání mezi dvěma sekvencemi se typicky provádí srovnáním sekvencí v porovnávacím okénku pro identifikaci a porovnání lokálních úseků podobnosti sekvence. Termín „porovnávací okénko“, jak se zde používá, označuje úsek alespoň přibližně 20 za sebou následujících poloh, obvykle 30 až přibližně 75, 40 až přibližně 50, ve kterém může být porovnávána sekvence s referenční sekvencí se stejným počtem za sebou následujících poloh po optimálním uspořádání těchto dvou sekvencí.

• *> · ·

Optimální uspořádání sekvencí pro účely srovnání může být prováděno použitím programu Megalign balíku bioinformatického softwaru Lasergene (DNASTAR, lne., Madison, WI), s použitím výrobcem nastavených parametrů. Tento program zahrnuje několik schémt uspořádání, která se popisují v následujících odkazech: Dayhoff, M. O. (1978), A model of evolutionary change in proteins Matrices for detecting distant relationships. V Dayhoff, M. O. (ed.), Atlas of Protein Sequence and Structure, National Biomedical Research Foundation, Washington DC, díl 5, kap. 3, str. 345 - 358; Hein J. (1990), Unified Approach to Alignment and Phylogenes, str. 626 - 645, Methods in Enzymology, díl 183, Academie Press, lne., San Diego, CA; Higgins, D. G. a Sharp, P. M. (1989), CABIOS 5: 151 153; Myers, E. W. a Muller W. (1988), CABIOS 4: 11 - 17; Robinson, E. D. (1971), Comb. Theor. 11: 105; Santou, N. Nes, M. (1987), Mol. Biol. Evol. 4: 406 - 425; Sneath, P. H. A. a Sokal, R. R. (1973), Numerical Taxonomy - the Principles and Practice of Numerical Taxonomy, Freeman Press, San Francisco, CA; Wilbur, W. J. a Lipman, D. J. (1983), Proč. Nati. Acad, Sci. USA 80: 726 - 730.

Alternativně může být uspořádání sekvencí pro účely srovnání provedeno algoritmem lokální identity autorů Smith a Waterman (1981), Add. APL. Math 2: 482, algoritmem uspořádání identity autorů Needleman a Wunsch (1970), J. Mol. Biol. 48: 443, hledáním metod podobnosti autorů Pearson a Lipman (1988), Proč. Nati. Acad. Sci. USA 85: 2444, počítačovým provedením těchto algoritmů (GAP, BESTFIT, BLAST, FASTA a TFASTA a programy z balíku Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group (GCG), 575 Science Dr., Madison, WI), nebo manuální prohlídkou.

Jedním výhodným příkladem algoritmů, které jsou vhodné pro určování procenta identity sekvence a podobnosti sekvence jsou algoritmy BLAST a BLAST 2.0, které se popisují v Altschul a další (1977), Nucl. Acids Res. 25: 3389 - 3402 a Altschul a další (1990), J. Mol. Biol. 215: 403 - 410. BLAST a BLAST 2.0 mohou být použity např. s dále popisovanými parametry pro určení procenta identity sekvence pro polynukleotidy podle vynálezu. Software pro provádění analýz BLAST je veřejně dostupný prostřednictvím instituce National Center for Biotechnology Information. V jednom ilustrativním příkladu mohou být vypočtena kumulativní hodnocení (skoré) s použitím, pro sekvence nukleotidů, parametrů M (prospěšné body, reward score pro pár souhlasných zbytků, vždy >0) a N (trestné body, penalty score, pro nesouhlasné zbytky; vždy <0). Prodlužování délky úseku na základě souhlasu v každém směru se zastaví, jestliže: hodnocení kumulativního souhlasu bude mimo hodnotu X od maximální dosažené hodnoty; kumulativní hodnocení se sníží na 0 nebo na hodnotu nižší než 0 v důsledku nahromadění jednoho nebo více porovnávaných zbytků s negativním hodnocením; nebo se dosáhne konce kterékoli ze sekvencí. Parametry algoritmu BLAST W, T a X určují citlivost a rychlost uspořádání. Program BLASTN (pro sekvence nukleotidů) používá jako přednastavené hodnoty délku slova (W) 11, a očekávanou hodnotu (E) 10, a matrice hodnocení BLOSUM62 (viz Henikoff a Henikoff (1989), Proč. Nati. Acad. Sci. USA 89: 10915) používá uspořádání (alignments, B) 50, očekávanou hodnotu (E) 10, M = 5, N = -4 a srovnání obou řetězců.

S výhodou se „procento identity sekvence“ zjistí porovnáním dvou optimálně uspořádaných sekvencí podél srovnávacího okénka o délce alespoň 20 poloh, kde část polynukleotidové sekvence ve srovnávacím okénku může obsahovat adice nebo delece (tj. mezery) v množství 20 % nebo méně, obvykle 5 až 15 %, nebo 10 až 12 %, ve srovnání s referenčními sekvencemi (neobsahujícími adice nebo delece) pro optimální uspořádání těchto dvou sekvencí. Procento se vypočte zjištěním počtu poloh, ve kterých se v obou sekvencích vyskytují identické báze nukleových kyselin, čímž se získá počet souhlasných poloh, vydělením počtu souhlasných poloh celkovým počtem poloh v referenční sekvenci (tj. velikostí okénka) a vynásobením výsledků 100 pro získání procenta identity sekvence.

Odborníkům v oboru bude zřejmé, že v důsledku degenerace genetického kódu může existovat mnoho nukleotidových sekvencí, které kódují zde popsaný polypeptid. Některé z těchto polynukleotidů mají minimální homologii s nukleotidovou sekvencí kteréhokoli přírodního genu. Nicméně polynukleotidy, které jsou odlišné v důsledku odlišného použití kodonů, jsou do předkládaného vynálezu zvláště zahrnuty. V rámci vynálezu dále jsou alely genů obsahující polynukleotidové sekvence podle předkládaného vynálezu. Alely jsou endogenní geny, které jsou změněné v důsledku jedné nebo více mutací, jako jsou delece, adice a/nebo substituce nukleotidů. Výsledná mRNA a protein mohou, ale nemusí mít změněnou strukturu nebo funkci. Alely mohou být identifikovány použitím standardních technik (jako je hybridizace, amplifikace a/nebo porovnání s databází sekvencí).

V dalším provedení vynálezu se proto používá přístup mutageneze, jako je místně specifická mutageneze, pro přípravu imunogenních variant a/nebo derivátů zde popisovaných polypeptidů. Tímto přístupem je možno získat specifické modifikace polypeptidové sekvence pomocí mutageneze základních polypeptidů, které je kódují. Tyto techniky poskytují přímý přístup pro přípravu a testování variant sekvencí, např. jestliže se vezme v úvahu jeden nebo více z následujících předpokladů, zavedením jedné nebo více změn nukleotidové sekvence do polynukleotidů.

Místně specifická mutageneze umožní produkci mutant použitím specifických oligonukleotidových sekvencí, které kódují sekvenci DNA požadované mutace stejně jako dostatečného počtu sousedících nukleotidů, aby byla získána sekvence primerů s dostatečnou velikostí a komplexností pro vytvoření stabilního duplexu na obou místech přemostění delečního spojení. Mutace mohou být použity v určité polynukleotidové sekvenci pro zlepšení, změnu, snížení, modifikaci nebo jinou změnu vlastností samotného polynukleotidů a/nebo pro ·· ···* změnu vlastností, aktivity, složení, stability nebo primární sekvence kódovaného polypeptidů.

V některých provedeních podle předkládaného vynálezu zahrnuje vynález mutagenezi popsaných polynukleotidových sekvencí pro dosažení změny jedné nebo více vlastností kódovaného polypeptidů, jako je např. imunogenicita polypeptidové vakciny. Techniky místně specifické mutageneze jsou dobře známé v oboru a široce se používají pro získání variant polypeptidů i polynukleotidů. Místně specifická mutageneze se často např. používá pro změnu specifického úseku molekuly DNA. V těchto provedeních se používá primer obsahující typicky přibližně 14 až přibližně 25 nukleotidů apod., přičemž se mění přibližně 5 až přibližně 10 zbytků na obou stranách spojení sekvence.

Jak bude odborníkovi v oboru zřejmé, při technikách místně specifické mutageneze se často používá fágový vektor, který existuje jak v jednořetězcové, tak i dvojřetězcové formě. Typické vektory použitelné při místně specifické mutagenezi zahrnují vektory jako je fág M13. Tyto fágy jsou snadno komerčně dostupné a jejich použití je odborníkům v oboru dobře známé. Při místně specifické mutagenezi se také rutinně používají dvojřetězcové plasmidy, což odstraňuje nutnost kroku převedení sledovaného genu z plasmidu do fága.

Místně specifická mutageneze podle vynálezu se obecně provádí nejprve získáním jednořetězcového vektoru nebo oddělením dvou řetězců dvojřetězcového vektoru, který v sobě obsahuje sekvenci DNA kódující požadovaný peptid. Připraví se oligonukleotidový primer nesoucí požadovanou mutovanou sekvenci, obecně synteticky. Tento primer se potom teplotně hybridizuje s jednořetězcovým vektorem a vystaví se působení enzymů polymerujících DNA jako je Klenowův fragment E. coli polymerázy I, pro ukončení syntézy řetězce nesoucího mutaci. Tak se vytvoří heteroduplexní molekula, ve které jeden řetězec kóduje původní nemutovanou sekvenci a druhý řetězec nese

- 32·požadovanou mutaci. Tento heteroduplexní vektor se potom použije pro transformaci vhodných buněk jako jsou buňky E. coli a vyberou se klony, které obsahují rekombinantní vektory nesoucí uspořádání mutované sekvence.

Příprava sekvenčních variant vybraných segmentů DNA kódujících peptidy použitím místně specifické mutageneze poskytuje prostředky pro výrobu potenciálně použitelných látek a není míněna jako limitující, protože jsou i jiné způsoby, kterými lze získat varianty sekvencí peptidů a sekvencí DNA, které je kódují. Například na rekombinantní vektory kódující požadovanou peptidovou sekvenci je možno působit mutagenními prostředky jako je hydroxylamin za získání variant sekvencí. Konkrétní podrobnosti týkající se těchto metod a protokolů se uvádějí v Maloy a další, 1994; Segal, 1976; Prokop a Bajpai, 1991; Kuby, 1994; a Maniatis a další, 1982, které se všechny pro tento účel uvádějí odkazem.

Jak se zde používá, termín „oligonukleotidem řízený postup mutageneze“, označuje proces závislý na templátu a pomnožení zprostředkované vektorem, které vedou ke zvýšení koncentrace specifické molekuly nukleové kyseliny vzhledem k její počáteční koncentraci, nebo ke zvýšení koncentrace detekovatelného signálu například amplifikaci. Jak se zde používá, „oligonukleotidem řízený postup mutageneze“ má označovat způsob, který zahrnuje prodlužování molekuly primeru závislé na templátu. Termín „proces závislý na templátu“ se týká syntézy nukleových kyselin RNA nebo DNA, kde je sekvence nově syntetizovaného řetězce nukleové kyseliny řízena známými pravidly komplementárního párování bází (viz například Watson, 1987). Typicky zahrnují tyto metody zprostředkované vektory zavedení fragmentu nukleové kyseliny do vektoru DNA nebo RNA, klonovací amplifikaci vektoru a izolaci amplifikovaného fragmentu nukleové kyseliny. Příklady těchto metod se poskytují v US patentu No. 4,237,224, který se tímto zařazuje jako celek odkazem.

• · · · ···· ··· • ·· · · ··· · · »'

- 353’-·· ·· ··* *··’ *··*

Může být použit další přístup k produkci variant polypeptidů podle předkládaného vynálezu nazvaný rekurzivní sekvencí rekombinace, popsaný v US patentu No. 5,837,458. Při tomto přístupu se provádějí iterační cykly rekombinace a screeningu nebo selekce pro „vyvinutí“ jednotlivých variant polynukleotidů podle vynálezu, které např. mají zesílenou imunogenní aktivitu.

Podle dalšího provedení předkládaného vynálezu se poskytují polynukleotidové prostředky obsahující nekódující oligonukleotidy. Bylo ukázáno, že nekódující oligonukleotidy jsou účinné a cílené inhibitory syntézy proteinů, a tím poskytují terapeutický přístup, kterým je možno léčit onemocnění inhibici syntézy proteinů, které přispívají k onemocnění. Účinnost nekódujících oligonukleotidů pro inhibici syntézy proteinů je již dobře poznána. Např. syntéza polygalaktauronázy a acetylcholinového receptoru muskarinového typu 2 jsou inhibovány nekódujícími oligonukleotidy zaměřenými na jejich příslušné sekvence mRNA (US patent 5,739,119 a US patent 5,759,829). Další příklady inhibice nekódujícími molekulami byly ukázány na jaderném proteinu cyklinu, genu pro vícečetnou rezistenci na léčiva (MDG1), ICAM-1, E-selektin, STK-1, striatální receptor GABAA a lidský EGF (Jaskulski a další, Science, 10. června 1988; 240 (4858): 1544 - 6; Vasanthakumar a Ahmed, Cancer Gommun. 1989; 1(4): 225 - 32; Peris a další, Brain Res. Mol. Brain Res., 15. června 1998; 57(2): 310 - 20; US patent 5,801,154; US patent 5,789,573; US patent 5,718,709 a US patent 5,610,288). Nekódující konstrukty jsou také podle výzkumů schopny inhibovat řadu abnormálních proliferací buněk, např. rakoviny, a mohou být tedy použity pro léčení (US patent 5,747,470; US patent 5,591,317 a US patent 5,783,683).

V některých provedeních proto předkládaný vynález poskytuje oligonukleotidové sekvence, které obsahují veškerou nebo část kterékoli sekvence, která je schopná specificky se vázat na zde popisovanou polynukleotidovou sekvenci nebo komplementární sekvenci. V jednom provedení zahrnují nekódující oligonukleotidy DNA

- 34 · nebo její deriváty. V dalším provedení zahrnují oligonukleotidy RNA nebo její deriváty. Ve třetím provedení jsou oligonukleotid modifikované DNA obsahující fosforthioátovou modifikovanou kostru. Ve čtvrtém provedení obsahují oligonukleotidové sekvence nukleové kyseliny peptidu nebo jejich deriváty. V každém případě obsahují výhodné prostředky oblast sekvence, která je komplementární a výhodněji v podstatě komplementární a ještě výhodněji zcela Komplementární s jednou nebo více částmi zde popisovaných polynukleotidů.

Volba nekódujících prostředků specifických pro danou sekvenci genu je založena na analýze zvolené cílové sekvence (tj. v těchto ilustrativních příkladech sekvence krysy a člověka) a určení sekundární struktury, Tm, vazebné energie a relativní stability, a nekódující prostředky byly zvoleny na základě své relativní neschopnosti tvořit dimery, vlásenky nebo jiné sekundární struktury, které by mohly snížit nebo zabránit specifické vazbě na cílovou molekulu mRNA v buňce hostitele.

Vysoce výhodné cílové oblasti mRNA jsou oblasti, které jsou v nebo v blízkosti kodonu iniciace translace AUG a ty sekvence, které jsou v podstatě komplementární s 5’-oblastmi mRNA. Analýzy sekundární struktury a volba cílového místa se mohou provádět například s použitím softwaru v.4 OLIGO pro analýzu primerů a/nebo algoritmu BLASTN 2.0.5 (Altschul a další, Nucleic Acids Res. 1. září 1997; 25(17): 3389 - 402).

Uvažuje se také použití způsobu dodávání antimolekul s použitím krátkého peptidového vektoru nazývaného MPG (27 zbytků). Peptid MPG obsahuje hydrofobní doménu odvozenou od fuzní sekvence HIV gp41 a hydrofilní doménu ze sekvence nukleární lokalizace SV40 T-antigenu (Morris a další, Nucleic Acids Res. 15. července 1997; 25(14): 2730 - 6). Bylo ukázáno, že několik molekul peptidu MPG potáhne nekódující oligonukleotidy a může být dodáno

- 35· -·· do kultivovaných savčích buněk v méně než 1 hodině s relativně vysokou účinností (90 %). Navíc interakce s MPG silně zvyšuje jak stabilitu oligonukleotidu vůči nukleázám, tak i schopnost překračovat plasmatickou membránu.

Podle dalšího provedení vynálezu se polynukleotidové prostředky používané v rámci vynálezu využívají při návrhu a přípravě ribozymových molekul pro inhibici exprese tumorových polypeptidů a proteinů podle předkládaného vynálezu v tumorových buňkách. Ribozymy jsou komplexy RNA-protein, které štěpí nukleové kyseliny místně specifickým způsobem. Ribozymy mají specifické katalytické domény, které mají endonukleázovou aktivitu (Kim a Cech, Proč. Nati. Acad. Sci. USA, prosinec 1987; 84(24): 8788 - 92; Forster a Symons, Cell, 24. dubna 1987; 49(2): 211 - 20). Například velký počet ribozymů urychluje reakce fosfoesterového přenosu s vysokým stupněm specificity, přičemž často se štěpí pouze jeden z několika fosfoesterů v oligonukleotidovém substrátu (Cech a další, Cell, prosinec 1981; 27 (3 Pt 2): 487 - 96; Michei a Westhof, J. Mol. Biol., 5. prosince 1990; 216(3): 585 - 610; Reinhold-Hurek a Shub, Nátuře, 14. května 1992; 357 (6374): 173 - 6). Tato specificita byla přičítána požadavku, aby se substrát vázal specifickými interakcemi založenými na párování bází na vnitřní vodící sekvenci (internal guide sequence, „IGS“) ribozymů před chemickou reakcí.

V současnosti je známých šest základních druhů v přírodě se vyskytujících enzymatických RNA. Každá může za fyziologických podmínek katalyzovat hydrolýzu fosfodiesterových vazeb v RNA v trans (a tak může štěpit jiné molekuly RNA). Obecně působí enzymatické nukleové kyseliny nejprve vazbou na cílovou RNA. Tato vazba vzniká prostřednictvím cílové vazebné části enzymatické nukleové kyseliny, která se drží v těsné blízkosti enzymatické části molekuly, která štěpí cílovou RNA. Enzymatická nukleová kyselina tedy nejprve rozpozná a potom se váže na cílovou RNA pomocí komplementárního párování bází a po navázání na správné místo • ·

- 3δ· působí enzymaticky pro přestřižení cílové RNA. Strategické štěpení takové cílové RNA zruší její schopnost řídit syntézu kódovaného proteinu. Po navázání enzymatické nukleové kyseliny a rozštěpení jejího cíle RNA se kyselina uvolní z této RNA, aby hledala další cíl a mohla se opakovaně vázat a štěpit nové cíle.

Enzymatická povaha ribozymu je výhodná pro mnoho technologií, jako je nekódující (antisense) technologie, (kde se molekula nukleové kyseliny jednoduše váže na cílovou nukleovou kyselinu a blokuje její translaci), protože koncentrace ribozymu nezbytného pro dosažení terapeutického působení je nižší než u nekódujícího oligonukleotidu. Jednotlivá molekula ribozymu je tedy schopna rozštěpit mnoho molekul RNA. Navíc je ribozym vysoce specifický inhibitor, přičemž specificita inhibice závisí při vazbě na cílovou RNA nejen na mechanismu párování bází, ale také na mechanismu štěpení cílové RNA. Jednotlivé nesrovnalosti nebo substituce báze v blízkosti místa štěpení mohou zcela eliminovat katalytickou aktivitu ribozymu. Podobné nesrovnalosti v nekódujících molekulách nezabrání jejich působení (Woolf a další, Proč. Nati. Acad. Sci. USA, 15. srpna 1992; 89(16): 7305 - 9). Specificita působení ribozymu je tedy vyšší než specificita nekódujícího oligonukleotidu vázajícího se na stejné místo RNA.

Molekula enzymatické nukleové kyseliny může být vytvořena jako typ „hammerhead“, vlásenky, viru hepatitidy δ, intronu skupiny I nebo RNA RNázy P (spolu s úvodní sekvencí RNA) nebo jako motiv Neurospora VS RNA. Příklady motivů „hammerhead“ se popisují v Rossi a další, Nucleic Acids Res. 11. listopadu 1992; 20(17): 4559 65. Příklady vlásenkových motivů se popisují v Hampel a další (Eur. Pat. Appl. Publ. No. EP 0360257), Hampel a Tritz, Biochemistry, 13. června 1989; 28(12): 4929 - 33; Hampel a další, Nucleic Acids Res., 25. ledna 1990; 18(2): 299 - 304 a US patentu 5,631,359. Příklad motivu viru hepatitidy δ se popisuje v Perrotta a Been, Biochemistry, 1. prosince 1992; 31(47): 11843 - 52; příklad motivu RNázy P se • ·

- 3·?

popisuje v Guerrier-Takada a další, Cell, prosinec 1983; 35(3 Pt 2): 849 - 57; motiv ribozymu Neurospora VS RNA se popisuje v Collins (Saville a Collins, Cell, 18. května 1990; 61(4): 685 - 96; Saville a Collins, Proč. Nati. Acad. Sci. USA. , 1. října 1991; 88(19): 8826 - 30; Collins a Olivě, Biochemistry, 23. března 1993; 32(11): 2795 - 9); a příklad intronu skupiny l se popisuje v US patentu 4,987,071. Důležité na molekule enzymatické nukleové kyseliny podle tohoto vynálezu je pouze to, že obsahuje specifické místo vazby na substrát, které je komplementární s jednou nebo více oblastmi cílového genu RNA, a že obsahuje nukleotidové sekvence uvnitř nebo v okolí místa vazby na substrát, které propůjčují molekule RNA štěpící aktivitu. Ribozymové konstrukty tedy nemusí být omezeny na zde uváděné specifické motivy.

Ribozymy mohou být navrženy jak je popsáno v mezinárodní zveřejněné patentové přihlášce No. WO 93/23569 a v mezinárodní zveřejněné patentové přihlášce No. WO 94/02595, které se obě zařazují odkazem, a mohou být syntetizovány pro testování in vitro a in vivo, jak se zde popisuje. Tyto ribozymy mohou být také optimalizované pro dodávání. I když se poskytují konkrétní příklady, odborníkům v oboru bude zřejmé, že v případě potřeby mohou být použity ekvivalentní cíle RNA v jiných druzích.

Aktivita ribozymu může být optimalizována změnou délky vazebných ramének ribozymu nebo chemicky syntézou ribozymu s modifikacemi, které zabrání jejich degradaci sérovými ribonukleázami (viz např. mezinárodní zveřejněná patentová přihláška No. WO 92/07065; mezinárodní zveřejněná patentová přihláška No. WO 93/15187; mezinárodní zveřejněná patentová přihláška No. WO 91/03162; evropská zveřejněná patentová přihláška No. 92110298,4; US patent 5,334,711; a mezinárodní zveřejněná patentová přihláška No. WO 94/13688, které popisují různé chemické modifikace cukerných skupin molekul enzymatické RNA) modifikacemi, které zesilují jejich účinnost v buňkách a odstraněním bází stem II pro • · · · · · ·

zkrácení času syntézy RNA a snížení požadavků na chemickou syntézu.

Sullivan a další (mezinárodní zveřejněná patentová přihláška No. WO 94/02595) popisuje obecné metody dodávání enzymatických molekul RNA. Ribozymy se mohou podávat do buněk řadou způsobů známých odborníkům v oboru, včetně bez omezení zapouzdření do lipozomů, iontoforézou nebo inkorporaci do jiných vehikul, jako jsou hydrogely, cyklodextriny, biodegradovatelné nanokapsle a bioadhezivní mikrokuličky. Pro některé indikace mohou být ribozymy přímo dodány ex vivo do buněk nebo tkání s nebo bez výše uvedených vehikul. Alternativně může být lokálně dodána kombinaceRNA/vehikulum přímou inhalací, přímou injekcí nebo použitím katétru, infuzní pumpy nebo stentu. Další způsoby dodávání zahrnují bez omezení intravaskulární, intramuskulární, subkutánní nebo kloubní injekce, inhalace aerosolu, orální (forma tablety nebo pilulky), místní, systémové, oční, intraperitoneální a/nebo intrathekální dodávání. Podrobnější popis dodávání ribozymů a podávání se poskytuje v mezinárodní zveřejněná patentové přihlášce No. WO 94/02595 a mezinárodní zveřejněná patentové přihlášce No. WO 93/23569, které se obě zařazují jako celek odkazem.

Další prostředky pro akumulaci vysokých koncentrací ribozymů nebo ribozymů v buňkách je inkorporace sekvencí kódujících ribozym do expresního vektoru DNA. Transkripce ribozymových sekvencí jsou odvozeny od promotoru pro eukaryotickou RNA polymerázu I (pol I), RNA polymerázu II (pol II), nebo RNA polymerázu III (pol III). Transkripty z promotorů pol II nebo pol III budou exprimovány v buňkách ve vysokých koncentracích; hladiny daného promotoru pol II v daném typu buňky budou záviset na povaze regulačních sekvencí genu (zesilujících nebo zeslabujících sekvencí atd.) umístěných v okolí. Mohou být také použity promotory prokaryotické RNA polymerázy za předpokladu, že enzym prokaryotické RNA polymerázy je exprimován v příslušných buňkách. Bylo ukázáno, že ribozymy exprimované z těchto promotorů fungují v savčích buňkách. Tyto transkripční jednotky budou inkorporovány do řady vektorů pro zavádění do savčích buněk, včetně bez omezení plasmidových DNA vektorů, virových DNA vektorů (jako je adenovirus nebo adenoasociované vektory), nebo virových RNA vektorů (jako jsou retrovirové vektory, vektory viru semliki forest a viru sindbis).

V dalším provedení vynálezu se poskytují peptidové nukleové kyseliny (PNA). PNA je molekula napodobující DNA, ve které jsou nukleotidové báze navázány na pseudopeptidovou kostru (Good a Nielsen, Antisense Nucleic Acid Drug Dev. 1997, 7(4), 431 - 37). PNA může být využita v řadě metod, při kterých se tradičně používalo RNA nebo DNA. Často se sekvence PNA chovají lépe v používaných technikách než odpovídající sekvence RNA nebo DNA a mohou být použity v oblastech, kde nelze použít RNA nebo DNA. Přehled PNA včetně způsobů výroby, vlastností a způsobů použití se poskytuje v Corey (Trends Biotechnol, červen 1997; 15(6): 224 - 9). V některých provedeních lze připravit sekvence PNA, které jsou komplementární k jedné nebo více částem sekvence mRNA ACE, a tyto prostředky PNA mohou být použity pro regulaci, změnu, snížení nebo omezení translace ACE-specifické mRNA a tím změnit hladinu aktivity ACE v hostitelské buňce, do které byly tyto prostředky PNA podány.

PNA mají 2-aminoethylglycinové vazby nahrazující normální fosfodiesterovou kostru DNA (Nielsen a další, Science, 6. prosince 1991; 254(5037): 1497 - 500; Hanvey a další, Science, 27. listopadu 1992; 258(5087): 1481 - 5; Hyrup a Nielsen, Bioorg Med. Chem., leden 1996; 4(1): 5 - 23). Toto chemické složení má tři důležité důsledky: za prvé, na rozdíl od DNA nebo fosforothioátových oligonukleotidů jsou PNA neutrální molekuly; za druhé jsou PNA achirální, takže není nutno používat stereoselektivní syntézy; a za třetí se při syntéze PNA používá standardních protokolů Boc nebo Fmoc pro syntézu na pevné fázi, i když mohou být použity i jiné metody včetně modifikované Merrifieldovy metody.

• · · · · · *

Monomery PNA nebo hotové oligomery jsou komerčně dostupné u firmy PerSeptive Biosystems (Framingham, MA). Syntézy PNA protokoly Boc nebo Fmoc jsou přímočaré s použitím manuálních nebo automatizovaných protokolů (Norton a další, Bioorg Med. Chem., duben 1995; 3(4): 437 - 45). Manuální protokol vede k produkci chemicky modifikovaných PNA nebo simultánní syntéze skupin molekul těsně příbuzných molekulám PNA.

Stejně jako u syntézy peptidů bude úspěch syntézy konkrétní PNA záviset na vlastnostech zvolené sekvence. Například jestliže teoreticky mohou PNA obsahovat jakoukoli kombinaci nukleotidových bází, přítomnost sousedních purinů může vést k delecím jednoho nebo více zbytků v produktu. Protože se s tím počítá, navrhuje se při produkci PNA se sousedními puriny opakování vazby zbytků, o kterých lze předpokládat, že se budou navazovat s nižší účinností. Pak by mělo následovat čištění molekul PNA vysokotlakou kapalinovou chromatografií s reverzními fázemi, čímž se dosáhne výtěžků a čistoty produktu podobných jako se pozoruje při syntéze peptidů.

Modifikace PNA pro dané použití se může provádět vazbou aminokyselin v průběhu syntézy na pevné fázi nebo vazbou sloučenin, které obsahují skupinu karboxylové kyseliny, na exponovaný Nkoncový amin. Alternativně mohou být PNA modifikovány po syntéze vazbou na zavedený lysin nebo cystein. Snadnost, s jakou mohou být PNA modifikovány, umožňuje optimalizaci pro lepší rozpustnost nebo pro specifické funkční požadavky. Jakmile byla provedena syntéza, je možno ověřit identitu PNA a jejich derivátů hmotnostní spektrometrií. Bylo provedeno několik studií využití modifikací PNA (například Norton a další, Bioorg. Med. Chem., duben 1995; 3(4): 437 - 45; Petersen a další, J. Pept. Sci., květen-červen 1995; 1(3): 175 - 83; Orum a další, Biotechniques, říjen 1995; 19(3): 472 - 80; Footer a další,

Biochemistry, 20. srpna 1996; 35(33): 10673 - 9; Griffith a další, Nucleic Acids Res., 11. srpna 1995; 23(15): 3003 - 8; Pardridge a další, Proč. Nati. Acad. Sci. USA, 6. června 1995; 92(12): 5592 - 6;

• · · · • ·

-4T-··

Boffa a další, Proč. Nati. Acad. Sci. USA, 14. března 1995; 92(6): 1901 - 5; Gambacorti-Passerini a další, Blood, 15. srpna 1996; 88(4): 1411 - 7; Armitage a další, Proč. Nati. Acad. Sci. USA, 11. listopadu 1997; 94(23): 12320 - 5; Seeger a další, Biotechniques, říjen 1997; 23(3): 512 - 7). US patent No. 5,700,922 popisuje chomérní molekuly PNA-DNA-PNA a jejich použití v diagnostice, modulaci proteinů v organismech a při léčení stavů citlivých na léčiva.

Způsoby charakterizace nekódujících vazebných vlastností PNA se diskutují v Rose (Anal. Chem., 15. prosince 1993; 65(24): 3545 - 9) a Jensen a další, (Biochemistry, 11. dubna 1997; 36(16): 5072 - 7). Rose používá kapilární gelovou elektroforézu pro určení vazby molekul PNA na komplementární oligonukleotid a měření relativní kinetiky vazby a její stechiometrie. Podobné typy měření byly prováděny autory Jensen a další, s použitím technologie BIAcore™.

Další použití PNA, která byla popsána a budou zřejmá odborníkům v oboru, zahrnují použití při zasahování do řetězce DNA, inhibici antimolekulami, mutační analýze, zesilování transkripce, čištění nukleových kyselin, izolaci transkripčně aktivních genů, blokování vazby transkripčního faktoru, štěpení genomu, biologických senzorech, hybridizaci in šitu apod.

Exprese a charakterizace polynukleotidů

Příprava a/nebo manipulace s polynukleotidovými prostředky podle předkládaného vynálezu se může provádět řadou zavedených postupů (viz obecně Sambrook a další, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratories, Cold Spring Harbor, NY, 1989, a tam uvedené odkazy).

V dalších provedeních vynálezu mohou být v rekombinantních molekulách DNA použity polynukleotidové sekvence nebo jejich fragmenty kódující polypeptidy podle vynálezu, nebo fuzní proteiny • · · · nebo jejich funkční ekvivalenty pro směrování exprese polypeptidu do vhodných hostitelských buněk. V důsledku přítomné degenerace genetického kódu mohou být vyrobeny jiné sekvence DNA, které kódují v podstatě stejnou nebo funkčně ekvivalentní aminokyselinovou sekvenci, kde tyto sekvence mohou být použity pro klonování a expresi daného polypeptidu.

Jak bude odborníkům v oboru zřejmé, v některých případech může být výhodné produkovat nukleotidové sekvence kódující polypeptid s použitím kodonů, které se přirozeně nevyskytují. Například je možno zvolit kodony výhodné v konkrétní prokaryotické nebo eukaryotické hostitelské buňce pro zvýšení míry exprese proteinu nebo pro vytvoření rekombinantního transkriptu RNA s požadovanými vlastnostmi jako je poločas delší než poločas transkriptu vytvořeného ze sekvence vyskytující se v přírodě.

Navíc je možno získat polynukleotidové sekvence podle předkládaného vynálezu metodami genetického inženýrství, které jsou obecně v oboru známé, aby bylo možno změnit kódující sekvence polypeptidu z řady důvodů, včetně bez omezení změn modifikujících klonování, Processing a/nebo expresi genového produktu. Například míchání DNA náhodnou fragmentací a PCR přeuspořádá genové fragmenty a pro sestavení nukleotidových sekvencí mohou být použity syntetické oligonukleotidy. Navíc může být použita pro vložení nových restrikčních míst, změnu rozložení glykosylace, změnu preference kodonů, poskytnutí sestřihaných variant nebo zavedení mutací atd. místně specifická mutageneze.

V dalším provedení vynálezu mohou být na heterologní sekvenci navázány přirozené, modifikované nebo rekombinantní sekvence nukleové kyseliny pro kódování fúzního proteinu. Například pro screening peptidových knihoven na inhibitory aktivity polypeptidů může být vhodné kódovat chimérní protein, který může být rozpoznán komerčně dostupnou protilátkou. Fuzní protein může být také upraven

- 43* metodami genetického inženýrství tak, aby obsahoval štěpící místo mezi sekvencí kódující polypeptid a sekvencí heterologního proteinu tak, že polypeptid může být rozštěpen a čištěn mimo heterologní část.

Sekvence kódující požadovaný polypeptid mohou být syntetizovány, úplně nebo částečně, použitím chemických metod dobře známých v oboru (viz Caruthers, Μ. H. a další (1980), Nud. Acids Res. Symp. Ser. 215 - 223, Horn, T. a další (1980), Nud. Adds Res. Symp. Ser. 225 - 232). Alternativně může být produkován samotný protein použitím chemických metod pro syntézu aminokyselinové sekvence polypeptidu nebo jeho části. Syntéza peptidů se může např. provádět použitím různých technik na pevné fázi (Roberge, J. Y. a další (1995), Science 269: 202 - 204) a automatická syntéza se může provádět například na syntezátoru ABI 431A Peptide Synthesizer (Perkin Elmer, Palo Alto, CA).

Nově syntetizovaný peptid může být v podstatě vyčištěn preparativní kapalinovou chromatografií s vysokou účinností (např. Creighton, T. (1983), Proteins, Structures and Molecular Principles, WH Freeman a Co., New York, NY) nebo jinými srovnatelnými technikami dostupnými v oboru. Složení syntetických peptidů může být potvrzeno analýzou aminokyselin nebo sekvenováním (např. Edmanovým postupem degradace). Navíc může být sekvence aminokyseliny nebo polypeptidu nebo jakékoli jejich části změněna v průběhu přímé syntézy a/nebo kombinována s použitím chemických metod se sekvencemi z jiných proteinů nebo s jakoukoli jejich částí za vytvoření varianty polypeptidu.

Pro expresi požadovaného polypeptidu mohou být nukleotidové sekvence kódující polypeptid nebo jejich funkční ekvivalenty vloženy do vhodného expresního vektoru, tj. vektoru obsahujícího nezbytné prvky pro transkripci a translaci vložené kódující sekvence. Pro konstrukci expresních vektorů s obsahem sekvencí kódujících sledovaný polypeptid a příslušné transkripční a translační řídící prvky

-4*4 mohou být použity metody, které jsou dobře známé odborníkům v oboru. Tyto metody zahrnují rekombinantní techniky DNA in vitro, syntetické techniky a genetickou rekombinaci in vivo. Tyto techniky se popisují např. v Sambrook, J. a další (1989), Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, Plainview, NY, a Ausubel, F. M. a další (1989), Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York, NY.

Pro udržení a expresi polynukleotidových sekvencí může být použita řada systémů expresní vektor/hostitel. Sem patří bez omezení mikroorganismy jako jsou bakterie transformované rekombinantním bakteriofágem plasmidem nebo expresními vektory kosmidové DNA; kvasinky transformované kvasinkovými expresními vektory; systémy hmyzích buněk infikované virovými expresními vektory (např. bakulovirem); systémy rostlinných buněk transformované virovými expresními vektory (např. virus květákové mozaiky, CaMV; virus tabákové mozaiky, TMV) nebo bakteriálními expresními vektory (např. plasmidy Ti nebo pBR322); nebo systémy živočišných buněk.

„Řídící prvky“ nebo „regulační sekvence“ přítomné v expresním vektoru jsou takové nepřekládané oblasti vektoru - zesilující sekvence, promotory, 5’- a 3’-nepřekládané oblasti - které interagují s proteiny hostitelské buňky a provádějí tak transkripci a translaci. Tyto prvky se mohou lišit podle své síly a specificity. V závislosti na použitém systému vektoru a hostitele může být použit jakýkoli počet vhodných transkripčních a translačních prvků včetně konstitutivních a inducibilních promotorů. Například při klonování do bakteriálních systémů mohou být použity inducibiiní promotory jako je hybridní promotor lacZ fágmidu PBLUESCRIPT (Stratagen, La Jolla, Kalifornie) nebo plasmid PSPORT1 (Gibco BRL, Gaithersburg, MD) apod. V systémech savčích buněk jsou obecně výhodné promotory savčích genů nebo promotory ze savčích virů. Jestliže je nutné vytvořit buněčnou linii obsahující větší počet kopií sekvence kódující polypeptid, mohou být použity s výhodou vektory založené na SV40

-45nebo EBV s vhodným markérem umožňujícím selekci.

V bakteriálních systémech může být zvolen jakýkoli počet expresních vektorů v závislosti na zamýšleném použití exprimovaného polypeptidu. Například pokud jsou zapotřebí velká množství např. pro indukci tvorby protilátek, mohou být použity vektory poskytující vysokou míru exprese nebo fuzní proteiny umožňující snadné čištění. Tyto vektory bez omezení zahrnují multifunkční klonovací a expresní vektory E. coli jako je BLUESCRIPT (Stratagene), ve kterých mohou být sekvence kódující sledovaný polypeptid ligovány do vektoru ve čtecím rámci se sekvencemi aminokoncového Met a následujících sedmi zbytků beta-galaktosidázy za vytvoření hybridního proteinu; vektory plN (Van Heeke, G. a S. M. Schuster (1989), J. Biol. Chem. 264: 5503 - 5509); apod. Pro expresi cizích polypeptidů mohou být také použity vektory pGEX Vectors (Promega, Madison, Wis.), přičemž polypeptidy jsou ve formě fúzních proteinů s glutathion Stransferázou (GST). Obecně jsou takové fuzní proteiny rozpustné a snadno čistitelné z lyžovaných buněk pomocí adsorpce na kuličky glutathion-agarózy a následné eluce v přítomnosti volného glutathionu. Proteiny vyrobené v těchto systémech mohou navrženy tak, aby obsahovaly proteázová štěpící místa heparinu, thrombinu, nebo faktoru XA, takže tímto způsobem je umožněno v případě potřeby uvolnit sledovaný klonovaný polypeptid ze skupiny GST.

V kvasinkách Saccharomyces cerevisiae může být použita řada vektorů obsahujících konstitutivní nebo inducibilní promotory jako je alfa faktor, alkoholoxidáza a PGH. Přehledný článek viz Ausubel a další (výše) a Grant a další (1987), Methods Enzymol. 153: 516 - 544.

V případech, kdy se využívá rostlinných expresních vektorů, může být exprese sekvencí kódujících polypeptidy řízena jakýmkoli počtem promotorů. Například virové promotory jako jsou promotory 35S a 19S viru CaMV mohou být použity samostatně nebo v kombinaci s úvodní sekvencí omega z TMV (Takamatsu, N. (1987), EMBO J. 6:

307 - 311. Alternativně mohou být použity rostlinné promotory jako je malá podjednotka RUBISCO nebo teplem indukovatelné promotory (heat shock) (Coruzzi, G. a další (1984), EMBO J. 3; 1671 - 1680; Broglie, R. a další (1984), Science 224: 838 - 843; a Winter, J. a další (1991), Resuits Probl. Cell Differ. 17: 85 - 105). Tyto konstrukty mohou být zaváděny do rostlinných buněk přímou transformací DNA nebo transfekcí zprostředkovanou patogenem. Tyto techniky se popisují v řadě obecně dostupných přehledných článků (viz například Hobbs, S. nebo Murry, L. E. v McGraw Hill Yearbook of Science and Technology (1992), McGraw Hill, New York, NY; str. 191 - 196).

Pro expresi sledovaného polypeptidu může být také použit hmyzí systém. V jednom takovém systému se například používá jaderný polyhedrozový virus Autographa californica nuclear polyhedrosis virus (AcNPV) jako vektor pro expresi cizích genů v buňkách Spodoptera frugiperda nebo larvách Trichoplusia. Sekvence kódující polypeptid mohou být klonovány do jiné než nezbytné oblasti viru, jako je polyhedrinový gen, a umístěny pod řízení polyhedrinového promotoru. Úspěšné vložení sekvence kódující polypeptid způsobí inaktivací polyhedrinového genu za vytvoření rekombinantního viru postrádajícího obalový protein. Tyto rekombinantní viry mohou být potom použity pro infekci např. buněk S. frugiperda nebo larev Trichoplusia, ve kterých může být exprimován sledovaný polypeptid (Engelhard, Ε. K. a další (1994), Proč. Nati. Acad. Sci. 91: 3224 3227).

V savčích hostitelských buňkách je obecně dostupná řada expresních systémů založených na virech. Například v případech, kdy se jako expresní vektor používá adenoviru, mohou být do adenovirového transkripčního/translačního komplexu složeného z promotoru pozdní fáze a tripartitní úvodní sekvence, vloženy sekvence kódující sledovaný polypeptid. Inzerce do postradatelné oblasti E1 nebo E3 virového genomu může být použita pro získání životaschopného viru, který je schopen exprimovat v infikovaných • · · 9 • · ·

• » · « • · » · • · 9 9 * « • · · 9 9 · • · 9 · « hostitelských buňkách polypeptid (Logan, J. a Shenk, T. (1984), Proč. Nati. Acad. Sci. 81: 3655 - 3659). Navíc mohou být pro zvýšení exprese v savčích hostitelských buňkách použity sekvence zesilující transkripci jako je zesilující sekvence viru Rousova sarkomu (RSV).

Pro dosažení účinnější translace sekvencí kódujících sledovaný polypeptid mohou být také použity specifické iniciační signály. Tyto signály zahrnují iniciační kodon ATG a přilehlé sekvence. V případech, kdy se vloží sekvence kódující polypeptid, jeho iniciační kodon a sekvence proti směru exprese do vhodného expresního vektoru, nemusí být potřebné žádné další signály pro řízení transkripce nebo translace. V případech, kdy se však vloží pouze kódující sekvence nebo její část, by měly být přítomny exogenní řídící translační signály včetně iniciačního kodonu ATG. Navíc by měl být iniciační kodon ve správném čtecím rámci pro zajištění translace celého exprimovaného peptidú. Exogenní translační prvky a iniciační kodony mohou být různého původu, jak přírodního tak i syntetického. Účinnost exprese může být zesílena zavedením zesilujících sekvencí vhodných pro konkrétní buněčný systém, jako jsou sekvence popisované v literatuře (Scharf, D. a další (1994), Results Probl. Cell Differ. 20: 125 - 162).

Navíc může být vybrán kmen hostitelských buněk z hlediska schopnosti modulovat expresi vložených sekvencí nebo zpracovat exprimovaný protein požadovaným způsobem. Tyto modifikace polypeptidů zahrnují bez omezení acetylaci, karboxylaci, glykosylaci, fosforylaci, lipidaci a acylaci. Posttranslační zpracování (Processing), při kterém se odštěpuje forma „prepro“ od proteinu, se může pro umožnění správného vložení, skládání a/nebo funkci proteinu uskutečnit také. Pro zajištění správné modifikace a zpracování cizího proteinu je možno zvolit různé hostitelské buňky jako jsou buňky CHO, COS, HeLa, MDCK, HEK293, a WI38, které mají specifické buněčné vybavení a charakteristické mechanismy pro tyto posttranslační úpravy.

·* *4 ·9 • · 9 · 9 • ·· · »···

- 4H’-......

Z hlediska dlouhodobé produkce rekombinantních proteinů s vysokými výtěžky je obecně výhodná stabilní exprese. Například buněčné linie, které stabilně exprimují sledovaný polynukleotid, mohou být transformovány s použitím expresních vektorů, které mohou obsahovat virové počátky replikace a/nebo endogenní expresní prvky a markerový gen umožňující selekci na stejném nebo na odděleném vektoru. Po zavedení vektoru mohou být buňky ponechány růst jeden áž dva dny v obohaceném médiu před změnou média na selektivní. Účelem markéru umožňujícího selekci je vyvolat rezistenci na selekční činidlo a v jeho přítomnosti umožnit růst a izolaci buněk, které zavedené sekvence s dostatečnou mírou exprimují. Rezistentní klony stabilně transformovaných buněk mohou být pomnoženy s použitím technik tkáňové kultivace vhodných pro konkrétní typ.

Pro izolaci transformovaných buněčných linií může být použit jakýkoli počet selekčních systémů. Patří sem bez omezení geny pro thymidinkinázu viru herpes simplex (Wigler, M. a další (1977), Cell 11: 223 - 32) a adeninfosforibosyltransferázu (Lowy, I. a další (1990), Cell 22: 817 - 23), které mohou být použity v buňkách tk. sup.-, popř. aprt. sup.-. Selekce může být také založena na rezistenci na antimetabolity, antibiotika nebo herbicidy; například na dhfr, který propůjčuje rezistenci na methotrexát (Wigler, M. a další (1980), Proč. Nati. Acad. Sci. 77: 3567 - 70); npt, který propůjčuje rezistenci na aminoglykosidy, neomycin a G-418 (Colbere-Garapin, F. a další (1981), J. Mol. Biol. 150: 1 - 14); a ais nebo pat, které propůjčují rezistenci na chlorsulfuron, popř. fosfinotricinacetyltransferázu (Murry, výše). Byly také popsány další geny umožňující selekci, například trpB, který umožňuje využití indolu buňkami namísto tryptofanu nebo hisD, který umožňuje buňkám využívat histinol namísto histidinu (Hartman, S. C. a R. C. Mulligan (1988), Proč. Nati. Acad. Sci. 85: 8047 - 51). V oboru markérů získalo popularitu využití viditelných markérů, jako jsou antocyaniny, beta-glukuronidáza a její substrát GUS a luciferáza a její substrát luciferin, které se široce používají nejen pro identifikaci transformantů, ale také pro kvantifikaci množství tranzientní nebo stabilní exprese proteinu v souvislosti se specifickým vektorovým systémem (Rhodes, C. A. a další (1995), Methods Mol. Biol. 55: 121 131).

Ačkoli přítomnost/nepřítomnost exprese markerového genu ukazuje, že je také přítomen sledovaný gen, může být nezbytné potvrzení jeho přítomnosti a exprese. Například jestliže se do sekvence markerového genu vloží sekvence kódující polypeptid, rekombinantní buňky obsahující tyto sekvence mohou být identifikovány nepřítomností funkce markerového genu. Alternativně může být markerový gen umístěn v tandemu se sekvencí kódující polypeptid pod řízením jediného promotoru. Exprese markerového genu jako odpověď na indukci nebo selekci obvykle ukazuje na současnou expresi tandemového genu.

Hostitelské buňky obsahující a exprimující danou polynukleotidovou sekvenci mohou být alternativně identifikovány řadou postupů známých odborníkům v oboru. Mezi tyto postupy patří bez omezení hybridizace DNA-DNA nebo DNA-RNA a biologický test nebo imunologický test na určitý protein, jako jsou např. technologie založené na membránách, roztocích nebo čipech pro detekci a/nebo kvantifikaci nukleové kyseliny nebo proteinu.

Hostitelské buňky transformované sledovanou polynukleotidovou sekvencí mohou být také kultivovány za podmínek vhodných pro expresi a izolaci proteinu z buněčné kultury. Protein produkovaný rekombinantní buňkou může být sekrenován nebo může být obsažen intracelulárně v závislosti na použité sekvenci a/nebo vektoru. Jak bude odborníkům v oboru zřejmé, exprese vektorů obsahujících polynukleotidy podle vynálezu může být navržena tak, aby byly obsaženy signální sekvence směrující sekreci kódovaného polypeptidu přes membránu prokaryotické nebo eukaryotické buňky. Jiné rekombinantní konstrukce mohou být použity pro spojení sekvencí • 99 • 9 9 9 • 99 • l « ··· ·*

- 50 99 99 · # * • 4 44« « • * β » · « • » 4 · 4 ·· 9999

Φ ·

Φ t

Φ 4 < « · ·« kódujících sledovaný polypeptid s nukleotidovou sekvencí kódující polypeptidovou doménu, která umožní čištění rozpustných proteinů. Mezi takové domény umožňující čištění patří bez omezení peptidy chelatující kovy jako jsou moduly histidin-tryptofan, které umožňují čištění na imobilizovaných kovech, domény proteinu A, které umožňují čištění na imobilizovaném imunoglobulinu, a domény používané v systému čištění prodloužení/afinity FLAGS (Immunex Corp., Seattle, Wash.). Zavedení rozštěpitelných propojovacích sekvencí jako jsou sekvence specifické pro faktor XA nebo enterokinázu (Invitrogen. San Diego, Calif.) mezi purifikační doménu a kódovaný polypeptid může být použito pro umožnění purifikace. Jeden z takových expresních vektorů poskytne expresi fuzního proteinu obsahujícího sledovaný polypeptid a nukleovou kyselinu kódující 6 histidinových zbytků předcházejících štěpícímu místu pro thioredoxin nebo enterokinázu. Histidinové zbytky umožní čištění chromatografií IMIAC (immobilized metal ion affinity chromatography) jak se popisuje v Porath, J. a další (1992, Prot. Exp. Purif. 3: 263 - 281), zatímco enterokinázové štěpící místo poskytne prostředek pro uvolnění požadovaného peptidů z fuzního proteinu. Článek obsahující diskusi vektorů s obsahem fuzních proteinů je například Kroll, D. J. a další (1993; DNA Cell Biol. 12 : 441 - 453).

Navíc k rekombinantním způsobům produkce mohou být polypeptidy podle vynálezu a jejich fragmenty produkovány přímou syntézou peptidů technikami na pevné fázi (Merrifield J. (1963), J. Am. Chem. Soc. 85: 2149 - 2154). Syntéza proteinů se může provádět použitím manuálních způsobů nebo automaticky. Automatizovaná syntéza se může provádět např. na syntezátoru Applied Biosystems 431A Peptide Synthesizer (Perkin Elmer). Alternativně je možno chemicky syntetizovat různé fragmenty odděleně a tyto fragmenty kombinovat chemickými metodami za získání úplné molekuly.

-51”-

Prostředky T-buněk

Předkládaný vynález poskytuje v dalším provedení T-buňky specifické pro zde popisovaný polypeptid nebo jejich variantu nebo derivát. Tyto buňky se obecně mohou připravovat in vitro nebo ex vivo s použitím standardních postupů. Například T-buňky mohou být izolovány z kostní dřeně, periferní krve nebo frakce kostní dřeně nebo periferní krve pacienta s použitím komerčně dostupných systémů pro separaci buněk jako je Isolex™ System, dostupný od firmy Nexell Therapeutics, lne. (Irvin, CA; viz také US patent No. 5,240,856; US patent No. 5,215,926; WO 89/06280; WO 91/16116 a WO 92/07243). Alternativně mohou být T-buňky odvozené z příbuzných nebo nepříbuzných dárců, savců odlišných od člověka, buněčných linií nebo kultur.

T-buňky mohou být stimulovány polypeptidem, polynukleotídem kódujícím polypeptid a/nebo buňkou předkládající antigen (APC), která exprimuje takový polypeptid. Tato stimulace se provádí za podmínek a po dobu dostatečnou pro umožnění vytvoření T-buněk specifických pro sledovaný polypeptid. S výhodou je přítomen tumorový polypeptid nebo polynukleotid podle vynálezu v dodávacím vehikulu jako jsou mikrokuličky pro umožnění vytvoření specifických T-buněk.

T-buňky jsou považovány za specifické pro polypeptid podle předkládaného vynálezu, jestliže tyto T-buňky specificky proliferují, sekrenují cytokiny nebo usmrcují cílové buňky potažené polypeptidem nebo exprimující gen kódující polypeptid. specificita T-buněk může být hodnocena řadou standardních technik. Například použitím testu uvolňování ohromu nebo proliferačního testu ukazuje specificitu Tbuněk index stimulace více než dvojnásobně zvýšený v případě lyže a/nebo proliferace ve srovnání s negativními kontrolami. Tyto testy mohou být prováděny např. podle popisu v článku Chen a další, Cancer Res. 54: 1065 - 1070, 1994. Alternativně může být detekce proliferace T-buněk provedena řadou známých způsobů. Např.

• · · ·

- 52*-·

proliferace T-buněk může být detekována měřením zvýšené míry syntézy DNA (např. u kultur T-buněk pulzně značených triciovaným thymidinem měřením množství triciovaného thymidinu inkorporovaného do DNA). Kontakt s tumorovým polypeptidem (100 ng/ml - 100 pg/ml, s výhodou 200 ng/ml - 25 pg/ml) po dobu 3 až 7 dnů typicky vede k alespoň dvojnásobnému zvýšení proliferace Tbuněk. Kontakt popsaný výše po dobu 2 až 3 hod by měl vést k aktivaci T-buněk při použití měření standardními cytokinovými testy, při kterých nastane dvojnásobné zvýšení míry uvolňování cytokinu (např. TNF nebo lFN-γ) jako indikátoru aktivace T-buněk (viz Coligan a další, Current Protocols in Immunology, díl 1, Wiley Interscience (Green 1998)). T-buňky, které byly aktivovány jako odpověď na tumorový polypeptid, polynukleotid nebo polypeptid exprimující APC, mohou být buňky CD4⁺ a/nebo CD8⁺. T-buňky specifické pro tumorový polypeptid mohou být pomnoženy standardními způsoby. Ve výhodných provedeních jsou T-buňky odvozené z pacienta, příbuzného dárce nebo nepříbuzného dárce a jsou pacientovi podávány po stimulaci a pomnožení.

Pro terapeutické účely mohou být CD4⁺ nebo CD8⁺ T-buňky, které proliferují jako odpověď na tumorový polypeptid, polynukleotid nebo APC, pomnoženy na vyšší počet buď in vitro nebo in vivo. Proliferace takových T-buněk in vitro se může provádět řadou způsobů. Například T-buňky mohou být znovu vystaveny působení tumorového polypeptidu nebo krátkého peptidu odpovídajícího imunogenní části takového polypeptidu, s nebo bez přídavku růstových faktorů T-buněk jako je interleukin-2, a/nebo stimulátorových buněk syntetizujících tumorový polypeptid. alternativně je možno pomnožit jednu nebo více T-buněk proliferujících v přítomnosti tumorového polypeptidu klonováním. Způsoby klonování buněk jsou dobře známé v oboru a zahrnují například limitující ředění.

• · • · · ·

-53 Farmaceutické prostředky

V dalších provedeních se předkládaný vynález týká formulace jednoho nebo více zde popisovaných polynukleotidů, polypeptidů nebo T-buněk do farmaceuticky přijatelných roztoků pro podávání buňce nebo živočichovi, buď samostatně nebo v kombinaci s jedním nebo více dalších způsobů léčení. Předkládaný vynález se týká zvláště využití polynukleotidů, polypeptidů, fragmentů, fúzních molekul a variant cripto ve farmaceutickém prostředku pro léčení tumorů. Ve výhodném provedení se jako cripto použije cripto 1.

Bude zřejmé, že v případě potřeby může být popisovaný farmaceutický prostředek podáván v kombinaci s jinými prostředky, jako jsou např. jiné proteiny nebo polypeptidy nebo různé farmaceuticky účinné prostředky. Ve skutečnosti neexistuje v podstatě žádné omezení přítomnosti jiných složek za předpokladu, že další látky nezpůsobí významný nepříznivý efekt po styku s cílovými buňkami nebo hostitelskými tkáněmi. Prostředky mohou být tedy dodávány spolu s různými dalšími prostředky, jak to konkrétní případ vyžaduje. Tyto prostředky mohou být vyčištěny z hostitelských buněk nebo jiných biologických zdrojů, nebo mohou být alternativně chemicky syntetizovány, jak se zde popisuje. Tyto prostředky mohou podobně dále obsahovat substituované nebo derivatizované RNA nebo DNA.

V dalším provedení předkládaného vynálezu se tedy poskytují farmaceutické prostředky obsahující jeden nebo více polynukleotidových, polypeptidových a/nebo T-buněčných prostředků popsaných v předkládaném vynálezu v kombinaci s fyziologicky přijatelným nosičem. V některých výhodných provedeních obsahují farmaceutické prostředky podle vynálezu imunogenní polynukleotidové a/nebo polypeptidové prostředky podle vynálezu pro použití v preventivních a terapeutických vakcinách. Příprava vakcin se obecně popisuje například v publikaci M. F. Powell a M. J. Newman, ed., „Vaccine Design (the subunit a adjuvant approach)“, Plenům Press

(NY, 1995). Tyto prostředky budou obecně obsahovat jeden nebo více polynukleotidových a/nebo polypeptidových prostředků podle předkládaného vynálezu v kombinaci s jednou nebo více imunostimulačními látkami.

Bude zřejmé, že kterýkoli zde popisovaný farmaceutický prostředek může obsahovat farmaceuticky přijatelné soli polynukleotidů a polypeptidů podle vynálezu. Tyto soli mohou být připraveny např. z farmaceuticky přijatelných netoxických bází včetně organických bází (např. solí primárních, sekundárních a terciárních aminů a bazických aminokyselin) a anorganických bází (např. sodné, draselné, lithné, amonné, vápenaté a hořečnaté soli).

V dalším provedení obsahují ilustrativní imunogenní prostředky, např. vakcíny podle předkládaného vynálezu, DNA kódující jeden nebo více výše popsaných polypeptidů, tak, že polypeptid se vytváří in sítu. Jak bylo uvedeno výše, polynukleotid může být podáván v jakémkoli z řady známých dodávacích systémů. V oboru je znám velký počet způsobů pro dodávání genů, jak se např. popisuje v Rolland, Crit. Rev. Therap. Drug Carrier Systems 15: 143 - 198, 1998, a tam uvedených odkazech. Vhodné polynukleotidové expresní systémy budou samozřejmě obsahovat nezbytné řídící sekvence DNA pro expresi v buňkách pacienta (jako je vhodný promotor a terminační signál). Alternativně mohou bakteriální dodávací systémy zahrnovat podání bakterie (jako je Bacillus-Calmette-Guerrin), která exprimuje imunogenní část polypeptidu na svém povrchu nebo tento epitop sekrenuje.

Proto se v některých provedeních zavádějí do vhodných savčích hostitelských buněk polynukleotidy kódující imunogenní polypeptidy popisované v předkládaném vynálezu pro dosažení exprese s použitím kteréhokoli z řady známých systémů na bázi virů. V jednom ilustrativním provedení poskytuje pohodlnou a účinnou metodu pro systémy dodávání genů retrovirus. Zvolená nukleotidová sekvence kódující polypeptid podle předkládaného vynálezu může být vložena do vektoru a zabalena do retrovirových částic použitím technik známých v oboru. Rekombinantní virus může být potom izolován a dodán pacientovi. Byla již popsána celá řada ilustrativních retrovirálních systémů (např. US patent No. 5,219,740; Miller a Rosman (1989), BioTechniques 7: 980 - 990; Miller, A. D. (1990), Human Gene Therapy 1: 5 - 14; Scarpa a další (1991), Virology 180: 849 - 852; Burns a další (1993), Proč. Nati. Acad. Sci. USA 90: 8033 8037; a Boris-Lawrie a Temin (1993), Cur. Opin. Genet. Develop. 3: 102 - 109.

Dále byla popsána řada systémů založených na adenovirech. Na rozdíl od retrovirů, které se integrují do genomu hostitele, přetrvávají adenoviry extrachomozomálně a minimalizují tak rizika spojená s inzerční mutagenezí (Haj-Ahmad a Graham (1986), J. Virol. 57: 267 274; Bett a další (1993), J. Virol. 67: 5911 - 5921; Mittereder a další (1994), Human Gene Therapy 5: 717 - 729; Seth a další (1994), J. Virol. 68: 933 - 940; Barr a další (1994), Gene Therapy 1: 51 - 58; Berkner, K. L. (1988), BioTechniques 6: 616 - 629; a Rich a další (1993), Human Gene Therapy 4: 461 - 476).

Pro dádávání polynukleotidu byly také vyvinuty různé vektorové systémy na bázi adenoasociovaného viru (AAV). Vektory AAV je možno snadno zkonstruovat známými způsoby, viz např. US patenty No. 5,173,414 a 5,139,941; mezinárodní patentové přihlášky No. WO 92/01070 a WO 93/03769; Lebkowski a další (1988), Molec. Cell. Biol. 8: 3988 - 3996; Vincent a další (1990) Vaccines 90 (Cold Spring Harbor Laboratory Press); Carter, B. J. (1992), Current Opinion in Biotechnology 3: 533 - 539; Muzyczka, N. (1992), Current Topics in Microbiol. a Immunol. 158: 97 - 129; Kotin, R. M. (1994), Human Gene Therapy 5: 793 - 801; Shelling a Smith (1994), Gene Therapy 1: 165 169; a Zhou a další (1994), J. Exp. Med. 179: 1867 - 1875.

• ·

Mezi další virové vektory použitelné pro dodávání molekul nukleové kyseliny kódujících polypeptidy podle předkládaného vynálezu přenosem genů patři vektory odvozené ze skupiny poxvirů, jako je virus vakcinie a ptačí poxvirus. Například rekombinanty viru vakcinie exprimující nové molekuly mohou být zkonstruovány následujícím způsobem. DNA kódující polypeptid se nejprve vloží do vhodného vektoru tak, že sousedí s promotorem vakcinie a obklopujícími sekvencemi DNA vakcinie, jako je sekvence kódující thymidinkinkinázu (TK). Tento vektor se potom použije pro transfekci buněk, které jsou současně infikovány vakcinií. Pro vložení promotoru vakcinie plus genu kódujícího sledovaný polypeptid do virového genu slouží homologní rekombinace. Výsledná rekombinanta TK. sup. (-) může být selektována kultivací buněk v přítomnosti 5bromdeoxyuridinu a odpíchnutím virových plaků rezistentních na tuto látku.

Infekční/transfekční systém založený na viru vakcinie může být pohodlně použit pro získání indukovatelné, přechodné exprese nebo koexprese jednoho nebo více zde popisovaných polypeptidů v hostitelských buňkách organismu. V tomto konkrétním systému se buňky nejprve infikují in vitro rekombinantou viru vakcinie kódující RNA polymerázu bakteriofága T7. Tato polymeráza se vyznačuje výlučnou specificitou v tom, že přepisuje pouze templáty obsahující promotory T7. Po infekci se buňky transfekují sledovaným polynukleotidem nebo polynukleotidy za řízení promotorem T7. Polymeráza exprimované v cytoplazmě rekombinantním virem vakcinie přepisuje transfekovanou DNA do RNA, která je potom překládána na polypeptid translačním mechanismem hostitele. Tento způsob poskytuje vysokou přechodnou cytoplazmatickou produkci velkých množství RNA a jejích translačních produktů, viz např. Elroy-Stein a Moss, Proč. Nati. Acad. Sci. USA (1990) 87: 6743 - 6747; Fuerst a další, Proč. Nati. Acad. Sci. USA (1986) 83: 8122 - 8126.

Alternativně mohou být pro dodávání sledovaných kódujících sekvencí používány ptačí poxviry, jako jsou viry drůbežích neštovic a kanárcích neštovic. Rekombinantní ptačí poxviry exprimující imunogeny ze savčích patogenů jsou známé tím, že poskytují při podávání druhům odlišným od ptáků ochrannou imunitu. Použití vektoru Avipox je zvláště vhodné u člověka a jiných savčích druhů, protože rod Avipox se může produktivně replikovat pouze ve vnímavých ptačích druzích, a proto není infekční v savčích buňkách. Způsoby produkce rekombinantních Avipox virů jsou známé v oboru a využívají genetické rekombinace popisované výše pro produkci virů vakcinie, viz např. WO 91/12882; WO 89/03429; a WO 92/03545.

Pro dodávání polynukleotidů podle předkládaného vynálezu může být také použit kterýkoli z řady alfavirových vektorů, jako jsou vektory popsané v US patentech No. 5,843,723; 6,015,686; 6,008,035 a 6,015,694. Mohou být také použity některé vektory založené na venezuelské koňské encefalitidě (VEE), přičemž ilustrativní příklady je možno nalézt v US patentech No. 5,505,947 a 5,643,576.

Pro dodávání genů podle vynálezu mohou být dále použity molekulární konjugované vektory, jako jsou adenovirové chimérní vektory popsané v Michael a další, J. Biol. Chem. (1993) 268: 6866 6869 a Wagner a další, Proč. Nati. Acad. Sci. USA (1992) 89: 6099 6103.

Další informace týkající se těchto a dalších známých dodávacích systémů založených na virech je možno nalézt například ve FisherHoch a další, Proč. Nati. Acad. Sci. USA 86: 317 - 321, 1989; Flexner a další, Ann. NY Acad. Sci. 569: 86 - 103, 1989; Flexner a další, Vaccine 8: 17 - 21, 1990; US patenty No. 4,603,112, 4,769,330 a 5,017,487; WO 89/01973; US patent No. 4,777,127; GB 2,200,651; EP 0,345,242; WO 91/02805; Berkner, Biotechniques 6: 616 - 627, 1988; Rosenfeld a další, Science 252: 431 - 434, 1991; Kolls a další, Proč. Nati. Acad. Sci. USA 91: 215 - 219, 1994; Kass-Eisler a další, Proč.

• · ·

Nati. Acad. Sci. USA 90: 11498 - 11502, 1993; Guzman a další, Circulation 88: 2838 - 2848, 1993; a Guzman a další, Cir. Res. 73: 1202 - 1207, 1993.

V dalším provedení vynálezu se polynukleotid podává/dodává jako „nahá“ DNA, například jak se popisuje v Ulmer a další, Science 259: 1745 - 1749, 1993 a jak je přehledně zpracováno v Cohen, Science 259: 1691 - 1692, 1993. Příjem nahé DNA se může zvýšit potažením DNA na biodegradovatelné kuličky, které se účinně transportují do buněk.

V ještě dalším provedení se může prostředek podle předkládaného vynálezu dodávat technikou bombardování částicemi, která byla již v mnoha provedeních popsána. V jednom ilustrativním příkladu se může dosáhnout urychlení částic plynem v zařízeních např. vyráběných firmou Powderject Pharmaceuticals PLC (Oxford, UK) a Powderject Vaccines lne. (Madison, Wl), přičemž některé případy se popisují v US patentech No. 5,846,796; 6,010,478; 5,865,796; 5,584,807; a EP patentu No. 0500 799. Tento přístup nabízí dodávání bez použití jehly s použitím suchého práškového prostředku ve formě mikroskopických částic jako jsou částice polynukleotidu nebo polypeptidu urychlených na vysokou rychlost proudem plynného helia vytvářeným ručním zařízením, a vypuzením částic do cílové tkáně. Částice při dodávání nukleové kyseliny jsou s výhodou kuličky zlata o průměru 0,4 až 4,0 pm, výhodněji 0,6 až 2,0 pm a konjugát DNA je potažený na těchto kuličkách a kuličky jsou potom uzavřeny v patrone pro umístění do vystřelovacího zařízení typu „gene gun“. Tyto částice se typicky a s výhodou dodávají do kůže. Jiné prostředky pro dodávání do kůže zahrnují použití jehly ve formě kapalného prostředku.

Vakcíny na bázi DNA se obvykle skládají z bakteriálního plasmidového vektoru, do kterého je vložen silný, normálně virový promotor, sledovaný gen kódující antigenní peptid a polyadenylační

sekvence/sekvence ukončující transkripci. Sledovaný gen může kódovat úplný protein cripto jednoduše v sekvenci antigenního peptidů popisovaného v SEQ ID No. 13 - 94. Plasmid je možno pěstovat v bakterii, jako je např. E. coli, a potom izolovat a připravit ve vhodném médiu v závislosti na zamýšleném způsobu podání před podáním hostiteli. Po podání se plasmid převede do buněk hostitele, kde je produkován kódovaný peptid. Plasmidový vektor se bude s výhodou připravovat bez počátku replikace, který je funkční v eukaryotických buňkách, aby se zabránilo replikaci plasmidů v savčím hostiteli a integraci do chromozomální DNA příjemce.

Existuje celá řada výhod vakcinace DNA proti tradičním způsobům vakcinace. Za prvé se předpokládá, že z důvodů syntézy proteinů kódovaných sekvencí DNA až v hostiteli bude struktura nebo konformace proteinu podobná nativnímu proteinu souvisejícímu se stavem onemocnění. Je také pravděpodobné, že vakcinace DNA poskytne ochranu proti různým kmenům viru vytvořením odpovědi cytotoxických T-lymfocytů, které rozpoznávají epitopy z konzervovaných proteinů. Navíc, protože plasmidy jsou přebírány hostitelskými buňkami, ve kterých může být produkován antigenní protein, bude vyvolána dlouhotrvající imunitní odpověď. Tato technologie také nabízí možnost kombinace rozdílných imunogenů/epitopů do jediného prostředku.

Dobré informace týkající se vakcinace DNA je možno nalézt v Donnelly a další, „DNA vaccines“, Ann. Rev. Immunol. 1997 15: 617 - 648, přičemž obsah tohoto článku se zahrnuje jako celek odkazem.

V souvisejícím provedení zahrnují jiná zařízení a způsoby použitelné pro aplikaci prostředků podle předkládaného vynálezu pomocí plynu bez použití jehly způsoby firmy Bioject, lne. (Portland, OR), z nichž některé příklady se popisují v US patentech No. 4,790,824; 5,064,413; 5,312,335; 5,383,851; 5,399,163; 5,520,639 a 5,993,412.

• · · ·

Podle dalšího provedení budou zde popisované farmaceutické prostředky obsahovat jednu nebo více dalších imunostimulačních látek navíc k imunogennímu polynukleotidu, polypeptidu, T-buňkám a/nebo APC podle předkládaného vynálezu. Imunostimulační látka označuje v podstatě jakoukoli látku, která zvyšuje nebo umocňuje imunitní odpověď (protilátkovou a/nebo zprostředkovanou buňkami) na exogenní antigen. Výhodným typem imunostimulační látky je např. adjuvans. Mnoho adjuvans obsahuje látku navrženou pro ochranu antigenů před rychlým katabolismem, jako je hydroxid hlinitý nebo minerální olej, a látku stimulující imunitní odpovědi, jako je lipid A a proteiny odvozené od Bordatella pertussis nebo Mycobacterium tuberculosis. Některá adjuvans jsou komerčně dostupná, jako například Freundovo neúplné adjuvans a úplné adjuvans (Difco Laboratories, Detroit, Ml); Merck Adjuvant 65 (Merck a Company, lne., Rahway, NJ); AS-2 (SmithKline Beecham, Philadelphia, PA); hlinité soli jako je gel hydroxidu hlinitého (alum) nebo fosforečnan hlinitý; soli vápníku, železa nebo zinku; nerozpustná suspenze acylovaného tyrosinu; acylované cukry; kationtově nebo aniontově derivatizované polysacharidy; polyfosfazeny; biodegradovatelné mikrokuličky; monofosforyllipid A a quil A. Jako adjuvans mohou být také použity cytokiny, jako je GM-CSF, interleukin-2, -7, -12, a jiné růstové faktory.

V některých provedeních vynálezu je adjuvans s výhodou takové adjuvans, které indukuje imunitní odpověď převážně typu Th1. Vysoké hladiny cytokinů typu Th1 (např. IFN-γ, TNF-α, IL-2 a IL-12) zvýhodňují indukci imunitních odpovědí zprostředkovaných buňkami na podávaný antigen. Naopak vysoké hladiny cytokinů Th2 (např. IL-4, IL-5, IL-6 a IL-10) zvýhodňují indukci humorálních imunitních odpovědí. Po aplikaci vakciny poskytované vynálezem bude u pacienta podporována imunitní odpověď zahrnující odpovědi typu Th1 a Th2. Ve výhodném provedení, ve kterém je odpověď převážně typu Th1, bude stoupat hladina cytokinů typu Th1, ve větší míře než hladina cytokinů typu Th2. Hladiny těchto cytokinů mohou být snadno zjišťovány • « · ·

standardními metodami. Přehledný článek týkající se těchto skupin cytokinů je Mosmann a Coffman, Ann. Rev. Immunol. 7: 145 - 173, 1989.

Některá výhodná adjuvans pro vyvolání odpovědi převážně typu Th1 zahrnují například kombinaci monofosforyllipidu A, s výhodou 3de-O-acylovaného monofosforyllipidu A spolu se solí hliníku. Adjuvans typu MPL® jsou dostupná od firmy Corixa Corporation (Seattle, WA; viz například US patent No. 4,436,727; 4,877,611; 4,866,034 a 4,912,094). Oligonukleotidy obsahující CpG (ve kterých dinukleotid CpG nemethylovaný) vyvolávají také převážně odpověď typu Th1. Tyto oligonukleotidy jsou dobře známé a popisují se například ve WO 96/02555, WO 99/33488 a US patentech No. 6,008,200 a 5,856,462. Popisují se také imunostimulační sekvence DNA, například autory Sáto a další, Science 273: 352, 1996. Další výhodná adjuvans zahrnují saponin, jako je Quil A, nebo jeho deriváty včetně QS21 a QS7 (Aquila Biopharmaceuticals lne., Framingham, MA); Escin; Digitonin; nebo saponiny Gypsophila nebo Chenopodium quinoa. Mezi další výhodné formulace patří kombinace podle předkládaného vynálezu obsahující více než jeden saponin, například kombinace alespoň dvou látek z následující skupiny QS21, QS7, Quil A, β-escin, nebo digitonin.

Alternativně mohou být formulace obsahující saponin kombinovány s vehikuly vakcin složenými z chitosanu nebo jiných polykationtových polymerů, částic polylaktidu a polylaktid-ko-glykolidu, částic složených z monoesterů glycerolu atd. Saponiny mohou být také ve formulacích spolu s cholesterolem za vytvoření částicových struktur jako jsou liposomy nebo materiály ISCOM. Saponiny mohou být dále formulovány s polyoxyethylenetherem nebo -esterem, buď v roztoku nebo suspenzi neobsahující částice, nebo ve strukturách částic, jako je několikavrstevný liposom nebo ISCOM. Saponiny mohou být také formulovány s pomocnými látkami jako je Carbopol® pro zvýšení viskozity, nebo mohou být formulovány ve formě suchého prášku s práškovou pomocnou látkou jako je laktóza.

4

V jednom výhodném provedení obsahuje adjuvantní systém kombinaci monofosforyllipidu A a saponinového derivátu, jako je kombinace QS21 a 3D-MPL® adjuvans, jak se popisuje ve WO 94/00153, nebo méně reaktogenní prostředek, kde je QS21 oslaben cholesterolem, jak se popisuje ve WO 96/33739. Jiné výhodné formulace obsahují emulzi typu olej ve vodě a tokoferol. Další zvláště výhodná adjuvantní formulace obsahující QS21, 3D-MPL® a tokoferol vě formě emulze typu olej ve vodě se popisuje ve WO 95/17210.

Další zlepšený adjuvantní systém obsahuje kombinaci oligonukleotidu obsahujícího CpG a saponinový derivát, zvláště kombinaci CpG a QS21, jak se popisuje ve WO 00/09159. Tato formulace s výhodou obsahuje emulzi typu olej ve vodě a tokoferol.

Další ilustrativní adjuvans použitelná ve farmaceutických prostředcích podle vynálezu jsou např. Montanide ISA 720 (Seppic, Francie), SAF (Chiron, California, USA), ISCOMS (CSL), MF-59 (Chiron), a řady adjuvans SBAS (např. SBAS-2 nebo SBAS-4, dostupné od firmy SmithKline Beecham, Rixensart, Belgie), Detox (Enhanzyn®) (Corixa, Hamilton, MT), RC-529 (Corixa, Hamilton, MT) a jiné aminoalkylglukosaminid-4-fosfáty (AGP), jako jsou látky popisované v US patentových přihláškách No. 08/853,826 a 09/074,720, jejichž obsah se zařazuje odkazem, a adjuvans na bázi polyoxyethylenetheru jako jsou látky popisované ve WO 99/52549A1.

Mezi další výhodná adjuvans patří adjuvantní molekuly obecného vzorce (I):

HO(CH₂CH₂O)_n-A-R, kde n je 1 až 50, A je vazba nebo -C(O)-, R je C1.50 alkyl nebo fenyl Ci-₅₀ alkyl.

Jedno provedení předkládaného vynálezu se týká vakcíny obsahující polyoxyethylenether obecného vzorce (I), kde n je mezi 1 a 50, s výhodou 4 až 24, nejvýhodněji 9; složka R je C1-50, s výhodou

C4-C20 alkyl, nejvýhodněji C₁₂ alkyl, a A znamená vazbu. Koncentrace polyoxyethylenetherů by měla být v rozmezí 0,1 až 20 %, s výhodou od 0,1 do 10 %, nejvýhodněji v rozmezí 0,1 až 1 %. Výhodné polyoxyethylenethery jsou zvoleny z následující skupiny: polyoxyethylen-9-laurylether, polyoxyethylen-9-steorylether, polyoxy-ethylen-8-steorylether, polyoxyethylen-4-laurylether, polyoxyethylen35-laurylether a polyoxyethylen-23-laurylether. Polyoxyethylenethery jáko je polyoxyethylenlaurylether se popisují v Merckově indexu (12. vydání: položka 7717). Tyto adjuvantní molekuly se popisují ve WO 99/52549.

Polyoxyethylenether obecného vzorce (I) výše může být v případě potřeby kombinován s dalším adjuvans. Výhodná adjuvantní kombinace je s výhodou s CpG, jak se popisuje v UK patentové přihlášce GB 9820956.2.

Podle dalšího provedení vynálezu se imunogenní prostředek popisovaný ve vynálezu hostiteli dodává prostřednictvím buněk předkládajících antigen (APC), jako jsou dendritické buňky, makrofágy, B-buňky, monocyty a jiné buňky, které mohou být upraveny metodami genetického inženýrství pro zvýšení účinnosti. Tyto buňky mohou, ale nemusí být geneticky modifikovány pro zvýšení schopnosti předkládat antigen, pro aktivaci a/nebo udržení odpovědi T-buněk, pro dosažení antitumorových účinků per se a pro imunologickou kompatibilitu s příjemcem (například souhlasný haplotyp HLA). Buňky APC mohou být obecně izolovány z kterékoli biologické kapaliny nebo orgánu, včetně tumorových tkání a tkání v okolí tumorů, a mohou být autologní, alogenní, syngenní nebo xenogenní.

Některá výhodná provedení předkládaného vynálezu využívají dendritických buněk nebo jejich prekurzorů jako buněk předkládajících antigen. Dendritické buňky jsou vysoce účinné APC (Banchereau a Steinman, Nátuře 392: 245 - 251, 1998) a bylo ukázáno, že jsou účinné jako fyziologické adjuvans pro vyvolání preventivní nebo « ·« ·· * φ φ φφ > » «

·* ··· · ' » · • « Φ Φ

Φ· ·» léčebné antitumorové imunity (viz Timmerman a Levý, Ann. Rev. Med. 50: 507 - 529, 1999). Obecně mohou být dendritické buňky identifikovány na základě jejich typického tvaru (hvězdicový tvar in šitu, s vyznačenými cytoplazmatickými výběžky (dendrity) viditelnými in vitro), jejich schopnosti přebírat, zpracovávat a předkládat antigeny s vysokou účinností a jejich schopnosti aktivovat odpovědi naivních Tbuněk. Dendritické buňky mohou být samozřejmě upraveny metodami genetického inženýrství pro expresi specifických receptorů buněčného povrchu nebo ligandů, které se na dendritických buňkách in vivo nebo ex vivo běžně nenacházejí, přičemž takto modifikované dendritické buňky jsou rovněž zařazeny do rámce předkládaného vynálezu. Jako alternativa k dendritickým buňkám mohou být ve vakcině použity dendritické buňky se sekrenovanými váčky s obsahem antigenu (nazývanými exozomy) (viz Zitvogel a další, Nátuře Med. 4: 594 - 600, 1998).

Dendritické buňky a prekurzory mohou být získány z periferní krve, kostní dřeně, buněk infiltrujících tumor, buněk infiltrujících peritumorové tkáně, lymfatických uzlin, sleziny, kůže, pupečníkové krve nebo jakékoli jiné vhodné tkáně nebo tekutiny. Dendritické buňky mohou být např. diferencovány ex vivo přidáním kombinace cytokinů jako je GM-CSF, IL-4, IL-13 a/nebo TNFa ke kulturám monocytů získaných z periferní krve. Alternativně mohou být CD34 pozitivní buňky získané z periferní krve, pupečníkové krve nebo kostní dřeně, diferencovány na dendritické buňky přidáním kombinací GM-CSF, IL-3, TNFcc, ligandu CD40, LPS, ligandu flt3 a/nebo jiných složek indukujících diferenciaci, zrání a proliferaci dendritických buněk, ke kultivačnímu médiu.

Dendritrické buňky jsou běžně kategorizovány jako „nezralé“ a „zralé“ buňky, což umožňuje jednoduchý způsob rozlišení mezi těmito dvěma dobře charakterizovanými fenotypy. Toto označení by však nemělo vylučovat všechny možné stupně diferenciace. Nezralé . · : ::.. · :

··. . : . · · · : .

dendritické buňky jsou charakterizovány jako APC s vysokou schopností přijímat a zpracovávat antigen, což koreluje s vysokou expresí receptoru Fcy a mannózového receptoru. Zralý fenotyp je typicky charakterizován nižší expresí těchto markérů, ale vysokou expresí molekul buněčného povrchu odpovědných za aktivaci T-buněk, jako jsou MHC třídy I a třídy II, adhezní molekuly (např. CD54 a CD11) a pomocné stimulační molekuly (např. CD40, CD80, CD86 a 4-1BB).

Buňky APC mohou být obecně transfekovány polynukleotidem podle vynálezu (nebo jeho částí nebo variantou), takže na buněčném povrchu je exprimován kódovaný polypeptid nebo jeho imunogenní část. Tato transfekce může probíhat ex vivo, a farmaceutický prostředek s obsahem těchto transfekovaných buněk může být potom použit pro terapeutické účely, jak se zde popisuje. Alternativně je možno pacientovi podat vehikulum dodávající gen, které je nasměrováno na dendritické nebo jiné antigen předkládající buňky, což vede k transfekcí probíhající in vivo. Transfekce dendritických buněk in vivo a ex vivo se například může provádět jakýmikoli způsoby známými v oboru, jako jsou způsoby popisované ve WO 97/24447, nebo technologií gene gun popsanou v Mahvi a další, Immunology a cell Biology 75: 456 - 460, 1997. Vnášení antigenů do dendritických buněk se může provádět inkubací dendritických nebo prekurzorových buněk s tumorovým polypeptidem, DNA (nahou nebo obsaženou v plasmidovém vektoru) nebo RNA; nebo s rekombinantními bakteriemi nebo viry exprimujícími antigen (např. vektory na bázi vakcinie, drůbežích neštovic, adenoviru nebo lentiviru). Před vnesením může být polypeptid kovalentně navázán na imunologického partnera, který napomáhá T-buňkám (např. na nosnou molekulu), alternativně může být k dendritickým buňkám jednorázově přidán nekonjugovaný imunologický partner, odděleně nebo v přítomnosti polypeptidu.

I když může být ve farmaceutických prostředcích podle vynálezu použit jakýkoli vhodný nosič známý odborníkům v oboru, typ nosiče • · . · ··· :·: ···..'· ·· ··

-66 bude typicky záviset na způsobu podávání. Prostředky podle předkládaného vynálezu mohou být formulovány pro jakýkoli způsob podávání, jako je například topické, orální, nazální, mukosální, intravenózní, intrakraniální, intraperitoneální, subkutánní a intramuskulární podání.

Nosiče pro použití s těmito farmaceutickými prostředky jsou biologicky kompatibilní a mohou být biologicky odbouratelné. V některých provedeních poskytuje farmaceutický prostředek relativně konstantní hladinu uvolňování účinné složky. V jiných provedeních však může být požadováno rychlejší uvolnění bezprostředně po podání. Formulace takových prostředků spadá do znalostí odborníka v oboru a využívá se přitom známých technik. Ilustrativní nosiče použitelné v tomto smyslu zahrnují mikročástice poly(laktid-koglykolidu), polyakrylát, latex, škrob, celulózu, dextran apod. Mezi další ilustrativní nosiče s opožděným uvolňováním patří nadmolekulární biologické vektory, které obsahují nekapalné hydrofilní jádro (např. zesítěný polysacharid nebo oligosacharid) a popřípadě vnější vrstvu obsahující amfifilní sloučeninu jako je fosfolipid (viz např. US patent No. 5,151,254 a PCT přihlášky WO 94/20078, WO/94/23701 a WO 96/06638). Množství účinné sloučeniny obsažené ve formulaci s prodlouženým uvolňováním závisí na místě implantace, rychlosti a očekávaném trvání působení a povaze stavu, který se léčí nebo proti kterému se provádí prevence.

V dalším ilustrativním provedení se jako nosiče pro prostředky podle vynálezu používají biodegradovatelné mikrokuličky (např. polylaktát polyglykolát). Vhodné biodegradovatelné mikrokuličky se popisují například v US patentech No. 4,897,268; 5,075,109;

5,928,647; 5,811,128; 5,820,883; 5,853,763; 5,814,344,5,407,609 a 5,942,252. Pro mnoho aplikací budou také použitelné nosné systémy na bázi modifikovaného jaderného proteinu hepatitidy B, např. jak se popisuje ve WO/99 40934, a tam uvedených odkazech. Další ilustrativní nosný/dodávací systém používá nosiče obsahující

- 67·:· • » > · · 1 . · · · ·· ·· proteinové komplexy ve formě částic, jako se popisuje v US patentu No. 5,928,647, které jsou schopné indukovat odpovědi cytotoxických T-lymfocytů omezené na třídu I u hostitele.

Farmaceutické prostředky podle vynálezu budou často dále obsahovat jeden nebo více pufrů (např. neutrální pufrovaný fyziologický roztok nebo fyziologický roztok s fosfátovým pufrem), sacharidy (např. glukóza, mannóza, sacharóza nebo dextrany), mannitol, proteiny, polypeptidy nebo aminokyseliny jako je glycin, antioxidanty, bakteriostatické látky, chelatační látky jako je EDTA nebo glutathion, adjuvans (např. hydroxid hlinitý), rozpuštěné látky pro úpravu osmotického tlaku formulace do isotonické, hypotonické nebo slabě hypertonické oblasti ve srovnání s krví příjemce, suspendující látky, zahušťující látky a/nebo ochranné látky. Alternativně mohou být prostředky podle předkládaného vynálezu formulovány jako lyofilizát.

Farmaceutické prostředky popisované v předkládaném vynálezu mohou být ve formě jednotkové dávky nebo zásobníků pro více dávek, jako jsou uzavřené ampule nebo lahvičky. Tyto zásobníky jsou typicky uzavřené takovým způsobem, aby uchovaly sterilitu a stabilitu formulace až do použití. Formulace mohou být obecně uchovávány ve formě suspenzí, roztoků nebo emulzí nebo olejovitých nebo vodných vehikul. alternativně může být farmaceutický prostředek uchován v lyofilizovaném stavu, což vyžaduje pouze přidání sterilního kapalného nosiče bezprostředně před použitím.

Vytváření vhodných dávkovačích a léčebných režimů pro použití s konkrétními zde popisovanými prostředky v léčebných režimech zahrnující např. orální, parenterální, intravenózní, intranazální a intramuskulární podávání a prostředky, je dobře známé v oboru a některé z těchto forem budou pro obecné účely ilustrace stručně diskutovány dále.

V některých provedeních mohou být farmaceutické prostředky popisované ve vynálezu dodávány živočichovi prostřednictvím orálního • ·

podávání. Jako takové mohou být tyto prostředky formulovány s inertním ředivem nebo s asimilovatelným jedlým nosičem, nebo mohou být uzavřeny v tvrdých nebo měkkých želatinových kapslích, nebo mohou být lisovány do tablet, nebo mohou být přidávány přímo do diety.

Aktivní sloučeniny mohou být obsaženy s pomocnými látkami a použity ve formě tablet pro polykání, bukálních tablet, pastilek, kapslí, elixírů, suspenzí, sirupů, oplatek apod. (viz například Mathiowitz a další, Nátuře, 27. března 1997; 386 (6623): 410 - 4; Hwang a další, Crit. Rev. Ther, Drug Carrier Syst. 1998; 15(3): 243 - 84; US patent 5,641,515; US patent 5,580,579 a US patent 5,792,451). Tablety, pilulky, kapsle apod. mohou také obsahovat kteroukoli z řady dalších složek, např. pojivo jako je tragakantová guma, akácie, kukuřičný škrob nebo želatina; pomocné látky jako je fosforečnan vápenatý; rozvolňovadlo jako je kukuřičný škrob, bramborový škrob, kyselina alginová apod; kluznou látku jako je stearan hořečnatý; a sladidlo jako je sacharóza, laktóza nebo sacharin, nebo příchuť jako je máta, libavka položená nebo třešňová příchuť. Pokud je dávkovou jednotkou kapsle, může obsahovat navíc k materiálům výše uvedeného typu kapalný nosič. Různé další materiály mohou být přítomné jako povlaky nebo pro jinou modifikaci fyzikální formy dávkové jednotky. Například tablety, pilulky nebo kapsle mohou být potaženy šelakem, cukrem nebo oběma. Kterýkoli materiál použitý při přípravě kterékoli dávkové jednotky by měl být samozřejmě farmaceuticky čistý a v podstatě netoxický v použitých množstvích. Navíc mohou být účinné látky přidány do prostředků a formulací s prodlouženým uvolňováním.

Tyto formulace budou typicky obsahovat alespoň přibližně 0,1 % účinné sloučeniny nebo větší množství, i když procento účinné složky nebo složek se může samozřejmě měnit a může být vhodně v rozmezí mezi přibližně 1 nebo 2 % a přibližně 60 % nebo 70 % nebo více z hmotnosti nebo objemu celkové formulace. Množství účinné složky nebo složek v každém terapeuticky použitelném prostředku může být

samozřejmě zvoleno tak, aby se v dané jednotkové dávce dosáhlo požadovaného vhodného dávkování sloučeniny. Při přípravě těchto farmaceutických prostředků bude brát odborník v oboru v úvahu faktory jako je rozpustnost, biologická dostupnost, biologický poločas, způsob podávání, skladovatelnost produktu stejně jako jiné farmakologické vlastnosti, přičemž může být vhodné použití celé řady dávek a léčebných režimů.

Pro orální podávání mohou být prostředky podle předkládaného vynálezu alternativně přidávány spolu s jednou nebo více pomocnými látkami do ústních vod, zubních past, bukálních tablet, orálních sprejů nebo sublingválně orálně podávaných prostředků. Alternativně může být účinná složka přidávána dc orálního roztoku jako je roztok obsahující boritan, glycerol a hydrogenuhličitan draselný, nebo dispergován v zubní pastě, nebo přidáván v terapeuticky účinném množství do prostředku, který může obsahovat vodu, pojivá, abrazivní látky, příchuti, pěnotvorné látky a látky udržující vlhkost. Alternativně mohou být prostředky upraveny do formy tablety nebo roztoku, které mohou být vkládány pod jazyk nebo jinak rozpouštěny v ústech.

Za některých okolností bude žádoucí dodávat popisované farmaceutické prostředky parenterálně, intravenózně, intramuskulárně nebo i intraperitoneálně nebo intradermálně. Tyto způsoby jsou dobře známé odborníkům v oboru a rěkteré se popisují například v US patentu 5,543,158; US patentu 5,641,515 a US patentu 5,399,363. V některých provedeních mohou být roztoky účinných sloučenin ve formě volné báze nebo farmakologicky přijatelných solí připraveny ve vodě vhodně smísené s povrchově aktivní látkou jako je hydroxypropylceluióza. Disperze mohou být také připraveny v glycerolu, kapalných polyethylenglykolech a směsích těchto látek a olejů. Za běžných podmínek skladování a použití budou tyto prostředky obecně obsahovat ochrannou látku pro zabránění růstu mikroorganismů.

• ·

-70·-· “

Ilustrativní farmaceutické formy vhodné pro injekční použití zahrnují sterilní vodné roztoky nebo disperze a sterilní prášky pro přípravu před aplikací nebo sterilní injekční roztoky nebo disperze (např. viz US patent 5,466,468). Ve všech případech musí být tato forma sterilní a musí být kapalná do té míry, že může být snadno aplikována stříkačkou. Musí být stabilní za podmínek výroby a skladování a musí být chráněna proti kontaminujícímu působení mikroorganismů jako jsou bakterie a houby. Nosičem může být rozpouštědlo nebo disperzní prostředí obsahující například vodu, ethanol, polyol (např. glycerol, propylenglykol, a kapalný polyethylenglykol, apod.), jejich vhodné směsi a/nebo rostlinné oleje. Správná tekutost může být udržena např. použitím povlaku jako je lecitin nebo udržením požadované velikosti částic v případě disperze a/nebo použitím povrchově aktivních látek. Působení mikroorganismů lze zabránit různými antibakteriálními a antifungálními prostředky, například parabeny, chlorbutanolem, fenolem, kyselinou sorbovou, thimerosalem, apod. V mnoha případech bude výhodné přidat látky upravující osmotický tlak, například cukry nebo chlorid sodný. Prodloužená absorpce injekčních prostředků může být dosažena použitím prostředků nebo látek zpožďujících absorpci jako je např. monostearan hlinitý a želatina.

V jednom provedení by měl být roztok pro parenterální podávání ve formě vodného roztoku v případě potřeby vhodně pufrován a kapalné ředivo by nejprve mělo být převedeno do isotonického stavu dostatečným množstvím fyziologického roztoku nebo glukózy. Tyto konkrétní vodné roztoky jsou zvláště vhodné pro intravenózní, intramuskulární, subkutánní a intraperitoneální podávání. V této souvislosti bude sterilní vodné médium použitelné v rámci předkládaného vynálezu dobře známé odborníkům v oboru. Jedna dávka může být např. rozpuštěna v 1 ml isotonického roztoku NaCl a buď přidána do 1000 ml kapaliny pro podkožní infuze nebo vstříknuta ve vhodném místě infuze (viz například „Remingtonů Pharmaceutical • ·

Sciences“, 15. vyd., str. 1035 - 1038 a 1570 - 1580). Některé variace dávkování budou nutné v závislosti na léčeném stavu a pacientovi. Pro podávání člověku by navíc měly prostředky splňovat požadavky sterility, apyrogenity a obecné standardy bezpečnosti a čistoty vyžadované např. organizací FDA Office of Biologics standards.

V dalším provedení vynálezu mohou být popisované prostředky formulovány v neutrální formě nebo ve formě soli. Ilustrativní farmaceuticky přijatelné soli zahrnují soli s kyselinami (vytvořené s volnými aminovými skupinami proteinu), které jsou vytvořené s anorganickými kyselinami jako je například kyselina chlorovodíková nebo fosforečná, nebo organickými kyselinami jako je kyselina octová, šťavelová, vinná, mandlová apod. Soli vytvořené s volnými karboxylovými skupinami mohou být také odvozené od anorganických bází jako je např. sodík, draslík, amonium, vápník nebo hydroxydy železa a od organických bází jako je isopropylamin, trimethylamin, histidin, prokain apod. Po formulaci se budou roztoky podávat způsobem kompatibilním s dávkováním formulace a v takovém množství, aby bylo terapeuticky účinné. Nosiče mohou dále obsahovat kterákoli rozpouštědla, disperzní prostředky, vehikula, povlaky, řediva, antibakteriální a antifungální prostředky, isotonické látky a látky zpožďující absorpci, pufry, nosné roztoky, suspenze, koloidy apod. Použití těchto médií a prostředků pro farmaceuticky účinné látky je v oboru dobře známé. Použití v terapeutických prostředích je možné v případě, kdy nejsou běžná média nebo prostředky nekompatibilní s účinnou složkou.

Do prostředků mohou být také přidány další účinné složky. Výraz „farmaceuticky přijatelný“ označuje druhy molekul a prostředky, které nevyvolávají alergické nebo podobné nežádoucí reakce při podávání člověku.

V některých provedeních mohou být farmaceutické prostředky dodávány ve formě intranazálních sprejů, inhalace a/nebo jiných aerosolově dodávných vehikul. Byly popsány způsoby dodávání genů, nukleových kyselin a peptidových prostředků přímo do plic prostřednictvím nosných aerosolových sprejů, jak se popisuje např. v US patentu 5,756,353 a US patentu 5,804,212. Podobně je v oboru farmacie známé dodávání léčiv ve formě intranazálních mikročástic pryskyřic (Takenaga a další, J. Controlled Release, 2. března 1998; 52(1-2): 81 - 7) a lysofosfatidyl-glycerolových sloučenin (US patent 5,725,871). Podobně se popisuje dodávání léčiva přes sliznice ve formě polytetrafluorethyienové nosné matrice v US patentu 5,780,045.

V některých provedeních se pro vnášení prostředků podle předkládaného vynálezu do vhodné hostitelské buňky/organismu používají liposomy, nanokapsle, mikročástice, lipidové částice, váčky apod. Prostředky podle předkládaného vynálezu mohou být zvláště formulovány pro dodávání buď v zapouzdřeném stavu v kapalné částici, liposomů, váčku, nanokuličce nebo nanočástici nebo podobně. Alternativně mohou být prostředky podle předkládaného vynálezu navázány buď kovalentně nebo nekovalentně na povrch těchto nosných vehikul.

Tvorba a použití liposomů a prostředků podobných liposomům jako potenciálních nosičů léčiv jsou odborníkům v oboru dobře známé (viz např. Lasic, Trends Biotechnol, červenec 1998; 16(7): 307 - 21; Takakura, Nippon Rinsho, březen 1998; 56(3): 691 - 5; Chandran a další, Indián J. Exp. Biol., srpen 1997; 35(8): 801 - 9; Margalit, Crit. Rev. Ther. Drug Carrier Syst. 1995; 12(2-3): 233 - 61; US patent 5,567,434; US patent 5,552,157; US patent 5,565,213; US patent 5,738,868 a US patent 5,795,587, přičemž všechny tyto prameny se zařazují jako celek odkazem). Liposomy se s úspěchem používaly u řady typů buněk, které je normálně obtížné jinými postupy transfekovat včetně suspenzí T-buněk, primárních kultur jaterních buněk a buněk PC 12 (Renneisen a další, J. Biol. Chem., 25. září 1990; 265(27): 16337 - 42; Muller a další, DNA Cell Biol., duben 1990; 9(3): 221 - 9). Navíc se u liposomů nevyskytují omezení související s délkou DNA, • I» • » >· > « • · * * · ·

i. (ř ·

i 1 • » • ¹··

-73’-· ‘ která jsou typická pro dodávací systémy založené na virech. Liposomy byly účinně používány pro zavádění genů, různých léčiv, radioterapeutických látek, enzymů, virů, transkripčních faktorů, alosterických efektorů apod. do řady kultivovaných buněčných linií a živočichů. Navíc se zdá, že použití liposomů není spojeno s autoimunitními reakcemi nebo nepřijatelnou toxicitou po systémovém podání.

V některých provedeních se liposomy vytvářejí z fosfolipidů, které jsou dispergovány ve vodném prostředí a spontánně tvoří multilamelární soustředné váčky tvořené dvojvrstvami (označované také multilamelární váčky, MLV).

Alternativně poskytuje vynález v dalších provedeních farmaceuticky přijatelné nanokapsle s obsahem prostředků podle předkládaného vynálezu. Nanokapsle se obecně vyrábějí zachycením sloučenin stabilním a reprodukovatelným způsobem do kapslí (viz například Chintanar-Guerrero a další, Drug Dev. Ind. Pharm. prosinec 1998; 24(12): 1113 - 28). Pro zabránění nežádoucím účinkům v důsledku intracelulárního předávkování polymerem mohou být tyto ultrajemné částice (velikost kolem 0,1 pm) navrženy s použitím polymerů degradovatefných in vivo. Tyto částice mohou být vyráběné jak se popisuje např. v Couvreur a další, Crit. Rev. Ther. Drug Carrier Syst. 1988; 5(1) : 1 - 20; zur Muhlen a další, Eur. J. Pharm. Biopharm., březen 1998; 45(2): 149 - 55; Zambaux a další, J. Controlled Release, 2. ledna 1998; 50(1 - 3): 31 - 40; a US patent 5,145,684.

Způsoby léčení rakoviny

V dalších provedeních podle předkládaného vynálezu mohou být popisované farmaceutické prostředky použity pro léčení rakoviny, zvláště pro imunoterapii rakoviny tlustého střeva nebo kolorektální rakoviny. V jiných provedeních mohou být prostředky používány pro léčení rakoviny prsu nebo rakoviny jiných než malých plicních buněk.

····· ·· ·· ·· ··

Typicky budou tyto prostředky použitelné pro léčení pacientů, jejichž rakovinné buňky exprimují antigen cripto a/nebo metastázy exprimují antigen cripto. Těmito způsoby se farmaceutické prostředky podávají pacientovi, typicky tepfokrevnému živočichovi, s výhodou člověku. Pacient může nebo nemusí být postižen rakovinou. Výše uvedené farmaceutické prostředky mohou být tedy používány pro prevenci rozvinutí rakoviny nebo pro léčení pacienta postiženého rakovinou. Farmaceutické prostředky a vakcíny mohou být podávány buď před nebo po chirurgickém odstranění primárních tumorů a/nebo léčení jako je radioterapie nebo běžná chemoterapeutika. Jak se popisuje výše, farmaceutické prostředky mohou být podávány jakýmkoli vhodným způsobem, včetně podávání intravenózní, intraperitoneální, intramuskulární, subkutánní, intranazální, intradermální, anální, vaginální, místní a orální cestou.

V některých provedeních může být jako imunoterapie použita aktivní imunoterapie, při které je léčení založené na stimulaci endogenního imunitního systému hostitele in vivo k reakci proti tumorům podáním prostředků modifikujících imunitní odpověď (jako jsou polypeptidy a polynukleotidy podle vynálezu).

V jiných provedeních může být jako imunoterapie použita pasivní imunoterapie, při které léčení spočívá v dodání prostředků s vytvořenou imunitní reaktivitou proti tumorům (jako jsou efektorové buňky), které mohou přímo nebo nepřímo ovlivňovat antitumorové účinky a nezávisí nutně na neporušeném imunitním systému hostitele. Mezi příklady efektorových buněk patří T-buňky diskutované výše, Tlymfocyty (jako jsou CD8+ cytotoxické T- lymfocyty a CD4+ T-pomocné lymfocyty infiltrující tumory), buňky-zabíječi (jako jsou přirozené buňkyzabíječi a buňky-zabíječi aktivované lymfokiny), B-buňky a buňky předkládající antigen (jako jsou dendritické buňky a makrofágy) exprimující polypeptid podle vynálezu. Receptory T-buněk a receptory pro protilátky specifické pro polypeptidy podle vynálezu mohou být klonovány, exprimovány a převedeny do jiných vektorů nebo efektorových buněk pro adoptivní imunoterapii.

Efektorové buňky se mohou obecně získávat v dostatečných množstvích pro adoptivní imunoterapii pěstováním in vitro, jak se zde popisuje. Kultivační podmínky pro expandující efektorové buňky specifické pro jediný antigen na počet několik miliard s uchováním rozpoznávání antigenů in vivo jsou v oboru dobře známé. Podmínky této kultivace in vitro typicky využívají přerušované stimulace antigenem, často v přítomnosti cytokinů (jako je IL-2) a nedělících se podnožových buněk. Jak je uvedeno výše, zde poskytované imunoreaktivní peptidy mohou být použity pro rychlé pomnožení kultur T-buněk specifických pro určitý antigen pro vytvoření dostatečného počtu buněk pro imunoterapii. Zvláště k buňkám jako jsou buňky předkládající antigen jako jsou dendritické buňky, makrofágy, monocyty, fibroblasty a/nebo B-buňky, je možno krátkodobě přidávat imunoreaktivní polypeptidy nebo mohou být transfekovány jedním nebo více polynukleotidy použitím standardních technik známých v oboru. Například buňky předkládající antigen mohou být transfekovány polynukleotidem obsahujícím promotor vhodný pro zvýšenou expresi v rekombinantním viru nebo jiném expresním systému. Kultivované efektorové buňky pro použití v terapii musí být schopné růstu a široké distribuce a musí dlouho přežívat in vivo. Byly ukázány studie, že kultivované efektorové buňky mohou být indukovány pro růst in vivo a mohou dlouhodobě přežívat ve významných množstvích pomocí opakované stimulace antigenem doplněným IL-2 (viz například Cheever a další, Immunological Reviews 157: 177, 1997).

Alternativně může být do buněk předkládajících antigen odebraných pacientovi a pomnožených jako klony ex vivo pro transplantaci zpět témuž pacientovi zaveden vektor exprimující polypeptid podle vynálezu.

Způsoby a četnost podávání terapeutických prostředků popisovaných ve vynálezu stejně jako dávkování se bude mezi jednotlivci lišit, a může být snadno zjištěno standardními způsoby. Farmaceutické prostředky a vakciny mohou být obecně podávány injekcí (např. intrakutánní, intramuskulární, intravenózní, intradermální nebo), intranazálně (např. aspirací) nebo orálně. S výhodou může být 1 až 10 dávek podáváno po dobu 52 týdnů. S výhodou se podává 6 dávek v intervalu 1 měsíc, a potom mohou být periodicky podávány zesilující vakcinace. Pro jednotlivé pacienty mohou být vhodné jiné protokoly. Vhodná dávka je množství sloučeniny, která při podání výše popsaným způsobem je schopna podporovat antitumorovou imunitní odpověď, která je alespoň o 10 až 50 % výše než bazální hladina (bez léčení). Tato odpověď může být monitorována měřením antitumorových protilátek u pacienta, nebo tvorbou cytolytických efektorových buněk v závislosti na vakcině schopných usmrcovat tumorové buňky pacienta in vitro. Tyto vakciny by také měly být schopné vyvolat imunitní odpověď, která vede ke zlepšené klinické vyhlídce (např. častější zlepšení stavu, úplné nebo částečné nebo dlouhodobé přežití bez příznaků nemoci) u vakcinovaných pacientů ve srovnání s pacienty nevakcinovanými. Obecně bude pro farmaceutické prostředky a vakciny obsahující jeden nebo více polypeptidů množství každého polypeptidu přítomného v dávce od přibližně 25 pg do 5 mg na kg hostitele. Vhodné velikosti dávky také budou záviset na velikosti pacienta, ale typicky budou v rozmezí přibližně 0,1 ml až přibližně 5 ml.

Vhodné dávkování a léčebný režim obecně poskytují účinnou sloučeninu nebo účinné sloučeniny v dostatečném množství pro poskytnutí terapeutického a/nebo preventivního prospěšného účinku. Tato odpověď může být monitorována dosažením zlepšené klinické vyhlídky (např. častější zlepšení stavu, úplné nebo částečné nebo dlouhodobé přežití bez příznaků nemoci) u léčených pacientů ve srovnání s pacienty neléčenými. Zvýšení již existujících imunitních odpovědí na tumorový protein obecně koreluje se zlepšenými klinickými vyhlídkami. Tyto imunitní odpovědi mohou být obecně vyhodnoceny použitím standardních testů proliferace, cytotoxicity nebo cytokinů, které mohou být prováděny na vzorcích získaných od pacienta před a po léčení.

Příklady provedení vynálezu

Příklad 1a

Exprese imunoreaktivního proteinu cripto-1 v postižených lidských tkáních

Tkáň	Nepoškozené epitelium	Předmaligní	Poškozená	Karcinom
		TA	TVA
Tlusté střevo	25/193 (13)	26/65 (40)	10/13 (77)	122/168 (73)**
		IM		17/37 (46)**
Žaludek	1/37 (3)	16/30 (53)
Pankreas	10/58 (17)	Hyperplasie	Adenomy	58/98 (59)**
Žlučník	N. D.	6/9 (67)	4/7 (58)	89/132 (68)**
			DCIS
Prs	5/33 (15)		26/55 (47)	497/631 (79)**
Jiné než malé plicní buňky				178/195 (91)**
Tkáň	Nepoškozené epitelium	Cystadenomy	Serózní	Mukózní
		Serózní	Mukózní
Vaječníky	6/7 (86) post- menopauzální	6/14 (43)	0/7 4/10 (40) 4/5 (80)

Endometrium

10/28 (36) postmenopauzální

3/9 (33)

Čípek

Varle

4/25 (17)

0/3

23/40 (58) 25/48 (52)

3/8(38) 4/8 (50) 9/10 (90)

Hranice:

10/10

53/91 (58)*

Hyperplasie

18/30 (60) 68/96 (71)*

40/74 (54)*

29/51 (57)**

Embryonální karcinomy Seminomy

Kůra nadledvin

Močový měchýř

Ledvina

Prostata

TA = TVC = IM

19/19 10/32(31) (100) **

1/3 (33)

0/6 23/39 (60)**

0/18

0/9 tubulární adenom tubulovilózní adenom intestinální metaplasie

Statisticky významná exprese v karcinomech ve srovnání s nepostiženými tkáněmi • ·

Příklady

Příklad 1.6

Zvýšená exprese cripto v rakovinných tkáních

RT-PCR v reálném čase (U. Gibson, 1996, Genome Research: 6, 996) se používá pro porovnání nadbytku transkriptu mRNA cílového proteinu ve skupině normálních a tumorových tkání a/nebo buněčných linií. Tato analýza je kritická pro zjištění specificity exprese cripto u tumorů, což je důležité kritérium, které musí dobrý kandidát na vakcinu splňovat.

Celková RNA se extrahuje z rychle zmrazených bioptických vzorků nebo buněčných linií použitím činidla TriPure reagent (Roche). Celková RNA z normálních tkání se získá u firmy InVitrogen. Poly-A+ mRNA se vyčistí z celkové RNA po štěpení DNázou s použitím oligodT magnetických kuliček (Dynal). Kvantifikace mRNA se provádí spektrofluorimetricky (VersaFluor, BioRad) s použitím barviva RiboGreen (Molecular Probes).

Primery TaqMan (sekvence dopředného primerů: TGGGTAGGAAAGAGGAAGCAAAT, SEQ ID No. 7; sekvence reverzního primerů TGCTTCTCTACCACCACCTAATCA, SEQ ID No. 8) a sondy pro amplifikací RT-PCR v reálném čase se navrhnou pomocí softwaru Perkin-Elmer Primer Express s použitím výrobcem nastavených parametrů pro podmínky amplifikace TaqMan.

Reakce v reálném čase se sestaví podle standardních protokolů PCR s použitím 2 ng reverzně transkribované mRNA (Expand RT, Roche) pro každou reakci. Provede se detekce buď Sybrl nebo TaqMan v závislosti na hodnoceném vzorku. V případě detekce Sybrl se přidává barvivo Sybrl (Molecular Probes) na konečné ředění 1/75 000 pro detekci v reálném čase a vynechá se sonda TaqMan. Amplifikace (40 cyklů) a detekce v reálném čase se provádí na systému Perkin-Elmer Biosystems PE7700 s použitím běžných nastavení přístroje. Hodnoty Ct se vypočtou pomocí softwaru PE7700 Sequence Detector Software. Hodnoty Ct se získají pro každý vzorek tkáně pro cílovou mRNA (CtX) a pro aktinovou mRNA (CtA).

Protože účinnost amplifikace PCR za převládajících experimentálních podmínek je blízká teoretické účinnosti amplifikace, hodnota 2^(CtA'^ctX) je odhadem pro relativní koncentraci cílového transkriptu ve vzorku standardizovanou na koncentraci transkriptu áktinu. Hodnota 1 tedy znamená, že sledovaný antigen a aktin mají stejnou míru exprese.

Analýza RT-PCR s použitím detekce Sybrl byla prováděna na souboru tumorů tlustého střeva a odpovídajícím normálním tlustém střevě z šesti různých pacientů a 48 normálních vzorků tkáně. Detekce TaqMan byla prováděna na souboru tumorů tlustého střeva a odpovídajících vzorcích normálního tlustého střeva šesti jiných pacientů (reakce byly prováděny v triplikátech) a 48 normálních vzorcích tkáně. Testované normální tkáně (a zkratky používané v grafech) jsou ukázán níže:

nadledvina (Ad_GI) aorta (Ao) močový měchýř (Bl) kostní dřeň Bo_Ma mozek (Bra, Bral, Bra2, Bra3, Bra4, Bra5) čípek (Ce) tlusté střevo (Co) vejcovod (Fa_Tu) srdce (He) ileum (II) ledvina (Ki) játra (Li, Lil, Li2) plíce (Lu) lymfatická uzlina (Ly_No) • ·· · · ·· ·· ···· • · · · ··· ·· · • ·· · ···· · · · jícen (Oe) vaječník (Ov) pankreas (Pa, Pand, Panc2) příštítná tělíska (Pa_Thy) placenta (Pl) prostata (Pr) rektum (Re) kůže (Sk) kosterní sval (Sk_Mu) tenké střevo (Smjn) slezina (Sp) žaludek (St) varle (Te) štítná žláza (Thyr, Thy, Thy1, Thy2) thymus (Thyml) Thym2 průdušnice (Tr, Tra)

Reakce RT-PCR v reálném čase s použitím detekce Sybrl byly také prováděny na souboru sedmi linií plicních buněk:

CRL-5803 (karcinom, rakovina jiných než malých plicních buněk, velkých buněk, neuroendokrinní, místo metastáz: lymfatické uzliny)

CRL-5807 (bronchioalveolární karcinom, rakovina jiných než malých plicních buněk)

CRL-5810 (adenokarcinom, rakovina jiných než malých plicních buněk)

CRL-5815 (karcinoid, plicní průdušky)

CRL-5865 (adenokarcinom, místo metastáz: prosáknutí pohrudnice)

CRL-9609 (normální plíce, průduška, epiteliální, transformováno virem)

HTB-177 (karcinom, rakovina velkých plicních buněk, prosáknutí pohrudnice) a dvou buněčných liniích tlustého střeva:

CRL-2159 (karcinom, cekům, Dukes'B)

CCL-250

Čerstvé bioptické vzorky z normálních plicních tkání (Lu(ucl), Lu(IVG)) a tumorové plicní tkáně (LuTum) byly získány jako kontroly. Výsledky RT-PCR na vzorcích kolorektálních biopsií a normálních tkání jsou ukázány na obr. 1, 2, 3 a 4, a v tabulce 1. Výsledky RT-PCR na buněčných liniích jsou ukázány na obr. 5.

Tabulka 1

Exprese cripto v kolorektálních tumorech a normálních tkáních

	Detekce Sybr¹	Detekce TaqMan ¹
Kolorektální tumor ve srovnání s normální sousední tkání tlustého střeva²
Počet pacientů se zvýšenou expresí	5/6	5/6
Průměrný násobek zvýšené exprese u pacientů se zvýšenou expresí	200	90
Medián násobku zvýšené exprese (minimum - maximum)	64 (22-724)	20 (4-397)
	Kolorektální tumor proti průměrným normálním tkáním²
Počet pacientů se zvýšenou expresí	5/6	4/6
Průměrný násobek zvýšené exprese u pacientů se zvýšenou expresí	10	12

Medián násobku zvýšené exprese (minimum - maximum)	11 (3-22)	7 (3-32)
Normální tkáně se zvýšenou úrovní transkripce³ (poměr normální k tumorové tkáni)	Slezina (0,5)	Slezina (0,75), vaječník (2)⁴

1. Hladiny transkriptu byly vypočteny v kolorektálních tumorech a souboru normálních tkání použitím dvou detekčních technik:

TaqMan a Sybr. Co se týče proteinu cripto, detekce TaqMan byla provedena u šesti pacientů a měření byla prováděna v triplikátech, zatímco detekce Sybr byla provedena u šesti různých pacientů.

2. Hladina transkriptu v kolorektálních tumorech byla srovnávána pro odpovídající normální tkáň tlustého střeva a průměr hladin transkriptu normální tkáně.

3. Normální tkáň má vysokou hladinu transkriptu, která je vyšší než 1/5 hladiny transkriptu u kolorektálních tumorů.

4. Vaječníky nebyly v experimentu cripto Sybr vyhodnocovány.

Tabulka 1, obr. 1, 2, 3 a 4 jasně ukazují, že protein cripto, i když je okrajově exprimován v normálních tkáních dospělých lidí, je vysoce nadměrně exprimován u většiny kolorektálních tumorů, přičemž poměr zvýšení exprese je více než desetinásobný. Navíc obr. 5 ukazuje, že exprese proteinu cripto je dramaticky zvýšena u buněčné linie plicního tumoru (CRL-5815). Antigen asociovaný s tumorovým proteinem cripto je proto vhodným kandidátem na vakcinu jak pro léčení kolorektální rakoviny, tak i rakoviny plic u pacientů.

Příklad 2

Klonování cripto-1 c-DNA z buněčných linií plicních tumorů

Celková RNA byla extrahována použitím činidla TriPure z 10⁷kultivovaných buněk ze sedmi různých plicních buněčných linií (úplný

-84 • · seznam buněčných linií viz část 1). Celkové RNA byly spojeny a mRNA byla vyčištěna ze spojené celkové RNA na magnetických kuličkách oligo-d(T) (Dynal). 250 ng mRNA bylo použito pro syntézu cDNA. Kvantifikace mRNA se provádí spektrofluorimetricky (VersaFluor, BioRad) použitím barviva RiboGreen (Molecular Probes). cDNA byla syntetizována technologií GeneRacer (Invitrogen), která zajišťuje amplifikaci pouze transkriptů s úplnou délkou. mRNA byla zpracována CIP. 5’-konce mRNA byly zbaveny koncových skupin TAP (Tobacco Acid Pyrofosfatase) a byly navázány na specifický oligonukleotid RNA. Navázaná mRNA byla zpětně přepsána do cDNA použitím primeru se zakončením oligo-d(T). Amplifikace cDNA byla prováděna použitím obou obklopujících primerů GeneRacer (Advantage, Clontech). Amplifikace cripto byla prováděna na 10 ng GeneRacer cDNA s použitím primerů PCR specifických pro gen (sekvence dopředného primeru: CGTCCAAGGCCGAAAGCCCTCCAGTT, SEQ ID No. 9; a sekvence reverzního primeru TTGGGAGAGGGCAGGGCAAAGAAGTAAGAA, SEQ ID No. 10). Reakce PCR byla prováděna Advantage II Taq DNA polymerázou (Clontech) za standardních podmínek. Produkt PCR byl klonován do plasmidu pCR4-TOPO (Invitrogen). Amplifikovaná sekvence (SEQ ID No. 95) měla variaci na kodonu 22 (SEQ ID No. 96): Ala (GCC) namísto Val (GTC) v nativní verzi (SEQ ID No. 6). Nativní verze byla obnovena mutagenezí PCR.

Příklad 3

Imunogenicita antigenů cripto asociovaného s tumorem na zvířecích modelech

Imunogenicita antigenů podle předkládaného vynálezu může být ověřena imunizací králíků a myší různými způsoby imunizace. Imunizace různými formami cripto, buď ve formě peptidu nebo rekombinantního proteinu, by samozřejmě mohla indukovat humorální • · · · imunitní odpověď s tvorbou specifických protilátek proti cripto a/nebo by mohla indukovat specifickou buněčnou imunitní odpověď na cripto. Dodání proteinu cripto in vivo použitím např. nahé DNA ve vhodném vektoru kódujícím cripto nebo fragmenty cripto, dodání genů cripto virovým vektorem kódujícím cripto nebo fragmenty cripto by mohly také být použity pro prokázání imunogenicity cripto.

3.1

Imunizace syntetickým peptidem

Syntetické peptidy z lidské aminokyselinové sekvence cripto-1 vybrané pro imunizaci králíků jsou GHQEFARPSRGYL (13 aminokyselin, SEQ ID No. 11), a QEEPAIRPRSSQRVPPMG (18 aminokyselin, SEQ ID No. 12). Syntetické peptidy se potom konjugují na nosný protein (KLH). Konjugáty se formulují s Freundovým adjuvans a každým z těchto konjugátů se imunizují dva králíci. O 4 týdny později se provede druhá imunizace a o 4 týdny později třetí imunizace, přičemž po každé imunizaci se odeberou vzorky krve. Titry protilátky proti cripto se zjišťují v séru metodou ELISA a/nebo westernovým přenosem použitím standardních protokolů (viz část 3.5).

3.2

Imunizace nukleovymi kyselinami

Pro konstrukci vakcinačního plasmidu se použije vektor pcDNA3.1 (Invitrogen). Pro podporu sekrece proteinu překládaného in vivo a tím pro indukci humorální odpovědi proti antigenu podle předkládaného vynálezu se vloží sekvence nukleové kyseliny kódující cripto-1 s jeho vlastním signálním peptidem do vícečetného klonovacího místa vektoru. Rekombinantní expresní plasmid se použije pro transformaci hostitelského kmene E. coli jako je BL21.

Výše popsaný rekombinantní kmen se pěstuje v běžném médiu pro kultivaci buněk. Bakterie se sklidí před dosažením stacionární fáze. Potom se provede příprava plasmidu systémem Quiagen pro injekci myším.

Šesti až osmitýdenní myši Balb/c dostanou intramuskulární injekce rekombinantního expresního plasmidu. Dva týdny po poslední injekci se odebere vzorek krve. Titry specifických protilátek vzniklých proti antigenu podle předkládaného vynálezu se zjistí metodou ELISA a/nebo westernovým přenosem (viz část 3.5).

3.3 Imunizace virovým vektorem použitím adenovirů

Rekombinantní adenoviry jsou účinné vektory pro vakcinaci založenou na genech, protože jsou schopny vyvolat humorální a buněčné imunitní odpovědi proti kódovanému antigenu. Nukleotidové sekvence kódující protein cripto-1 s její vlastní signální sekvencí by mohla být vložena do vhodného virového vektoru, který je derivátem adenovirů. Adenovirový rekombinantní vektor by mohl být podáván myším různými způsoby (intramuskulárně, intranazálně, intradermálně, subkutánně nebo intraperitoneálně). Po dvou týdnech by mohly být odebrány vzorky krve a zjištěny titry protilátek. Mohly by být také provedeny další experimenty pro měření buněčné imunitní odpovědi.

3.4 Imunizace rekombinantním proteinem

3.4.1 Exprese a purifikace rekombinantního proteinu cripto-1

Exprese v mikrobiálních hostitelích se používá pro produkci úplného proteinu nebo fragmentů antigenu podle vynálezu pro účely imunizace. Rekombinantní proteiny mohou být exprimovány ve dvou mikrobiálních hostitelích, v E. coli a v kvasinkách (jako je Saccharomyces cerevisiae nebo Pichia pastoris). To umožňuje volbu • ·

-87 expresního systému s nejlepšími vlastnostmi pro produkci konkrétního antigenu.

Expresní strategie zahrnuje nejprve navržení primární struktury rekombinantního antigenu. Obecně se vloží expresní fuzní partner (EFP) pro zvýšení míry exprese a/nebo imunitní fuzní partner (IFP) pro modulaci imunogenních vlastností antigenu na N-koncovou část. Navíc se vloží do C-koncové části afinitní fuzní partner (AFP) užitečný pro umožnění dalšího čištění.

Když jsou dostupné rekombinantní kmeny, rekombinantní produkt se charakterizuje vyhodnocením hladiny exprese a předpovědí další rozpustnosti získaného proteinu analýzou jeho chování ve formě surového extraktu.

Po růstu ve vhodném kultivačním médiu a indukci exprese rekombinantního proteinu se celkové extrakty analyzují SDS-PAGE. Rekombinantní proteiny se vizualizují na barvených gelech a identifikují analýzou westernovým přenosem s použitím specifických protilátek proti danému peptidů vytvořených imunizací králíka peptidem (viz část 3.1).

Srovnávací hodnocení různých verzí exprimovaného antigenu a expresních hostitelů umožní volbu nejvhodnějšího kandidáta a hostitele, který se bude používat pro další čištění a další imunologické hodnocení.

Schémata čištění jsou založena na klasickém přístupu s přítomností histidinového afinitního zakončení na rekombinantním proteinu. V typickém experimentu se rozbité buňky filtrují a bezbuněčné extrakty se nanášejí na kolonu Ion Metal Affinity Chromatography (IMAC; NÍ++NTA firmy Qiagen), která specificky zachytí rekombinantní protein. Zachycené proteiny se eluují gradientem 0 až 500 mM imidazolu (v případě potřeby v přítomnosti detergentu) ve fosfátovém pufru.

• · • · · ·

3.4.2 Imunizace proteinem

Králíci se imunizují intramuskulárně několikrát v intervalech několika týdnů rekombinantním čištěným proteinem formulovaným v adjuvans 3D-MPL/QS21. Tři týdny po každé imunizaci se odeberou vzorky krve. Titr protilátky proti cripto se odhadne v séru metodou ELISA. Specificita protilátek proti cripto se testuje westernovým přenosem (viz část 3.5) s použitím čištěného proteinu a vhodných kontrol.

3.5 Testy imunologické odpovědi u zvířat imunizovaných cripto

Humorální odpověď na imunizaci cripto se zjišťuje měřením titrů protilátek specifických pro cripto ve zvířecích sérech metodou ELISA a westernovým přenosem. Pro tento test mohou být použity následující materiály obsahující peptidy odvozené od cripto-1 nebo úplný protein:

Syntetické peptidy cripto (viz část 3.1, kde jsou uvedeny možné peptidy), nebo proteinové extrakty z kultur buněčných linií exprimujících cripto (viz část 1, kde jsou uvedeny možné buněčné linie), nebo lyzáty buněk COS, které byly upraveny genetickým inženýrstvím pro přechodnou expresi rekombinantního plasmidu cripto (viz níže), nebo proteinové extrakty rekombinantních kmenů E. coli nebo kvasinek (viz část 3.3.1, kde se popisuje tvorba rekombinantního kmenu), nebo čištěný rekombinantní antigen (viz část 3.3.1, kde se popisuje čištění antigenu).

Přechodné exprese cripto v buňkách COS se dosáhne přechodnou transfekci buněk COS rekombinantním plasmidem pcDNA3.1 připraveným pro vakcinaci nukleovou kyselinou (viz část 3.2).

-89 • ·

Pro reakce ELISA se jeden z výše uvedených antigenů potáhne na mikrotitrační destičky (výhodný je vyčištěný rekombinantní protein). Potom se provede analýza ELISA podle standardního protokolu.

Westernové přenosy se provádějí za standardních podmínek s použitím jednoho nebo více uvedených antigenů (výhodný je rekombinantní protein, syntetické peptidy se nepoužívají).

Buněčná odpověď může být také zjišťována stimulací slezinných buněk vakcinovaných myší in vitro peptidy použitými pro imunizaci myší, nebo překrývajícími se peptidy odvozenými od antigenů pokrývajícími celou sekvenci antigenů.

Příklad 4

Důkaz lidských T-buněk specifických pro cripto metodou primingu in vitro

Imunologická příslušnost cripto-1 může být dále potvrzena metodou primingu in vitro na lidských T-buňkách. Všechny T-buněčné lymfocyty, linie T-buněk a dendritické buňky jsou odvozeny z PBMC (mononukleární buňky periferní krve) zdravých dárců nebo pacientů s rakovinou (s výhodou dárců subtypu HLA-A2).

Předpověď vazby epitopů HLA alel sekvence vazebného peptidů HLA třídy I (nonamery, dekamery) se předpovídají buď Parkerovým algoritmem [Parker K., a další, 1994] (http://bimas.dcrt.nih.gov/molbio/hla_bind/), a Rammenseeovou methodou [Rammensee, a další, 1997] [Rammensee, a další, 1995] (http://syfpeithi.bmiheidelberg.com/Scripts/MHCServer.dll/EpPredict. htm).

Sekvence vzebného peptidů HLA třídy II (nonamery) se předpovídají algoritmem Tepitope [Sturniolo, a další, 1999].

• · » flflflfl

-90 • fl ·· ·· fl·

Odpověď CD8+ T-buněk

Používají se dvě strategie pro vyvolání tvorby linií CD8+ Τ'buněk: přístup založený na peptidech a přístup založený na úplném genu. Oba přístupy vyžadují cDNA s úplnou délkou ve správném čtecím rámci klonovanou do vhodného dodávacího systému pro použití pro předpovězení sekvence peptidů vázajících HLA.

Přístup založený na peptidech

Pro tento přístup se použije model transgenních myší HLAA2.1/Kb pro screening peptidů HLA-A2.1. Ve stručnosti, transgenní myši se imunizují peptidy HLA-A2 s adjuvans a peptidy schopné indukovat odpověď CD8 (definovanou účinnou lyží nebo produkcí γIFN u cílových buněk po pulzním přidání peptidů) se dále analyzují v lidském systému.

Lidské dendritické buňky (kultivované metodou [Romani a další]) se vystaví na krátkou dobu působení zvolených peptidů a použijí pro stimulaci vytříděných CD8+ T-buněk (metodou Facs). Po několikatýdenní stimulaci se nejprve testují linie CD8+ na autologní BLCL po pulzním přídavku peptidů (buněčné linie transformované EBV-B). Pro ověření správného zpracování peptidů in vivo se potom testují linie CD8+ na tumorových buňkách transfekovaných cDNA (HLA-A2 transfekované LnCaP, Skov3 nebo CAMA tumorové buňky).

Přístup založeny na úplném genu

Provede se priming a stimulace linie CD8+ T-buněk buď dendritickými buňkami transfekovanými metodou gene-gun, retrovirově transdukovanými B7.1-transfekovanými fibroblasty, rekombinantními dendritickými buňkami infikovanými poxvirem [Kim a další] nebo adenovirem [Butterfield a další]. Buňky infikované virem jsou velmi · · ·

účinné při předkládání antigenních peptidů, protože antigen je exprimován ve vysoké koncentraci, ale mohou být použity pouze jednou, aby se zamezilo přerůstání virových linií T-buněk.

Po změněné stimulaci se buněčné linie CD8+ testují na tumorové buňky transfekované cDNA jak bylo uvedeno výše. Pro potvrzení imunologické funkce antigenů podle předkládaného vynálezu se určí specificita a identita peptidů.

Odpověď CD4+ T-buněk

Podobným způsobem může být také zjišťována imunitní odpověď CD4+ T-buněk. Tvorba specifických CD4+ T-buněk se provádí použitím dendritických buněk, do kterých byl vnesen rekombinantní vyčištěný protein nebo peptidy pro stimulaci T-buněk.

Výsledky

A - Předpověď epitopů třídy I použitím Parkerovy metody

A-Epitopy cripto-1 a -3 třídy I

Alela HLA	Velikost epitopu	Poloha začátku	Sekvence	Skoré	SEQ ID No.
A68	Dekamer	12	SVIWIMAISK	240,000	SEQ ID NO: 13
A68	Dekamer	117	SVPHDTWLPK	120,000	SEQ ID NO: 14
B2705	Nonamer	33	HQEFARPSR	100,000	SEQ ID NO: 15
B2705	Nonamer	59	IRPRSSQRV	600,000	SEQ ID NO: 16
B2705	Nonamer	72	IQHSKELNR	100,000	SEQ ID NO: 17
B2705	Nonamer	103	GRNCEHDVR	1 000,000	SEQ ID NO: 18
B2705	Nonamer	110	VRKENCGSV	600,000	SEQ ID NO: 19
B2705	Nonamer	138	LRCFPQAFL	2 000,000	SEQ ID NO: 20

« ·* ·· ·» • · · · 9 · » • ·· · »··· * · «·· ·«. « ·»» »· ·· ««

B2705	Nonamer	161	SRTPELPPS	200,000	SEQ ID NO: 21
B2705	Dekamer	65	QRVPPMGIQH	200,000	SEQ ID NO: 22
B2705	Dekamer	79	NRTCCLNGGT	200,000	SEQ ID NO: 23
B2705	Dekamer	103	GRNCEHDVRK	2 000,000	SEQ ID NO: 93
B2705	Dekamer	136	GQLRCFPQAF	100,000	SEQ ID NO: 24
B2705	Dekamer	161	SRTPELPPSA	200,000	SEQ ID NO: 94
B5101	Dekamer	143	QAFLPGCDGL	110,000	SEQ ID NO: 25
B5102	Dekamer	143	QAFLPGCDGL	302,500	SEQ ID NO: 25
B5102	Dekamer	150	DGLVMDEHLV	120,000	SEQ ID NO: 26
B60	Nonamer	23	FELGLVAGL	325,000	SEQ ID NO: 27
B60	Nonamer	76	KELNRTCCL	320,000	SEQ ID NO: 28
B62	Nonamer	137	QLRCFPQAF	240,000	SEQ ID NO: 29
B62	Dekamer	136	GQLRCFPQAF	160,000	SEQ ID NO: 24
B7	Nonamer	169	SARTTTFML	120,000	SEQ ID NO: 30

Α-2 Epitopy specifické pro cripto-1 třídy I

Alela HLA	Velikost epitopu	Poloha začátku	Sekvence	Skoré	SEQ ID No.
A0201	Nonamer	5	KMARFSYSV	668,086	SEQ ID NO: 31
A0201	Dekamer	16	IMAISKVFEL	349,885	SEQ ID NO: 32
A0201	Dekamer	13	VIWIMAISK	310,361	SEQ ID NO: 33
A0201	Dekamer	175	FMLVGICLSI	128,242	SEQ ID NO: 34
B2702	Nonamer	7	ARFSYSVIW	500,000	SEQ ID NO: 35
B2702	Nonamer	3	CRKMARFSY	200,000	SEQ ID NO: 36
B2702	Dekamer	7	ARFSYSVIWI	300,000	SEQ ID NO: 37
B2702	Dekamer	37	ARPSRGYLAF	200,000	SEQ ID NO: 38
B2705	Nonamer	7	ARFSYSVIW	1 000,000	SEQ ID NO: 35
B2705	Nonamer	3	CRKMARFSY	1 000,000	SEQ ID NO: 36

·· ···· · » »» ·♦ * · * « • * » · * • · · * · «.

» » » · « ·* * Μ ·· • W * * * 9 • · * · · « ’ » · · » 9 • · · · tt*

B2705	Nonamer	170	ARTTTFMLV	600,000	SEQ ID NO: 39
B2705	Nonamer	37	ARPSRGYLA	200,000	SEQ ID NO: 40
B2705	Dekamer	7	ARFSYSVIWI	3 000,000	SEQ ID NO: 37
B2705	Dekamer	37	ARPSRGYLAF	1 000,000	SEQ ID NO: 38
B2705	Dekamer	3	CRKMARFSYS	200,000	SEQ ID NO: 41
B4403	Dekamer	34	QEFARPSRGY	120,000	SEQ ID NO: 42
B5101	Nonamer	6	MARFSYSVI	286,000	SEQ ID NO: 43
B5101	Dekamer	169	SARTTTFMLV	110,000	SEQ ID NO: 44
B5102	Nonamer	17	MAISKVFEL	150,000	SEQ ID NO: 45
B5102	Nonamer	6	MARFSYSVI	100,000	SEQ ID NO: 43
B5103	Nonamer	6	MARFSYSVI	100,000	SEQ ID NO: 43
B5103	Dekamer	169	SARTTTFMLV	121,000	SEQ ID NO: 44
B7	Nonamer	36	FARPSRGYL	180,000	SEQ ID NO: 46

Α-3 Epitopy specifické pro cripto-3 třídy I

Alela HLA	Velikost epitopu	Poloha začátku	Sekvence	Skoré	SEQ ID No.
A0201	Nonamer	5	KMVRFSYSV	668,086	SEQ ID NO: 47
A0201	Nonamer	89	CMLESFCAC	103,417	SEQ ID NO: 48
A0201	Dekamer	16	IMAISKAFEL	152,124	SEQ ID NO: 49
A0201	Dekamer	175	FMLAGICLSI	128,242	SEQ ID NO: 50
B2702	Nonamer	7	VRFSYSVIW	500,000	SEQ ID NO: 51
B2702	Nonamer	3	CRKMVRFSY	200,000	SEQ ID NO: 52
B2702	Dekamer	7	VRFSYSVIWI	300,000	SEQ ID NO: 53
B2702	Dekamer	37	ARPSRGDLAF	200,000	SEQ ID NO: 54
B2705	Nonamer	3	CRKMVRFSY	1 000,000	SEQ ID NO: 52
B2705	Nonamer	7	VRFSYSVIW	1 000,000	SEQ ID NO: 51
B2705	Nonamer	37	ARPSRGDLA	200,000	SEQ ID NO: 55

*· ·· ···· • 4· ·» ·· 4 · · » * *» · .

• » » · · * · · » « ··· ·· ·· «

ti • *

B2705	Nonamer	170	ARTTTFMLA	200,000	SEQ ID NO; 56
B2705	Dekamer	7	VRFSYSVIWI	3 000,000	SEQ ID NO; 53
B2705	Dekamer	37	ARPSRGDLAF	1 000,000	SEQ ID NO; 54
B2705	Dekamer	59	IRPRSSQRVL	600,000	SEQ ID NO: 57
B2705	Dekamer	3	CRKMVRFSYS	200,000	SEQ ID NO: 58
B2705	Dekamer	65	QRVLPMGIQH	200,000	SEQ ID NO: 59
B5101	Nonamer	60	RPRSSQRVL	120,000	SEQ ID NO: 60
B5102	Nonamer	17	MAISKAFEL	150,000	SEQ ID NO: 61
B7	Nonamer	60	RPRSSQRVL	800,000	SEQ ID NO: 60
B7	Nonamer	36	FARPSRGDL	180,000	SEQ ID NO: 62

Skoré je odhad poločasu rozpadu (disasociace) molekuly s obsahem této subsekvence.

B - Předpověď epitopů třídy I použitím Rammenseeovy metody

B-1 Epitopy cripto-1 a -3 třídy I

Alela HLA	Velikost epitopu	Poloha začátku	Sekvence	Skoré	SEQ ID No.
A26	Nonamer	179	GICLSIQSY	27	SEQ ID NO: 63
A26	Dekamer	27	LVAGLGHQE	25	SEQ ID NO: 64
A26	Dekamer	121	DTWLPKKCSL	25	SEQ ID NO: 65
A3	Nonamer	58	AIRPRSSQR	29	SEQ ID NO: 66
A3	Nonamer	13	VIWIMAISK	24	SEQ ID NO: 67
A3	Dekamer	12	SVIWIMAISK	29	SEQ ID NO: 13
A3	Dekamer	117	SVPHDTWLP	24	SEQ ID NO: 14
B2705	Nonamer	103	GRNCEHDVR	25	SEQ ID NO: 18
B2705	Nonamer	138	LRCFPQAFL	24	SEQ ID NO: 20

• · · ·

-·’^5·-* ’·* ’*

Β-2 Epitopy specifické pro cripto-1 třídy I

Alela HLA	Velikost epitopu	Poloha začátku	Sekvence	Skoré	SEQ ID No.
A0201	Nonamer	83	CLNGGTCML	27	SEQ ID NO: 68
A0201	Nonamer	5	KMARFSYSV	25	SEQ ID NO: 31
A0201	Dekamer	16	IMAISKVFEL	28	SEQ ID NO: 32
A0201	Dekamer	13	VIWIMAISKV	26	SEQ ID NO: 33
A26	Nonamer	35	EFARPSRGY	24	SEQ ID NO: 69
A3	Nonamer	66	RVPPMGIQH	27	SEQ ID NO: 70
A3	Nonamer	21	KVFELGLVA	24	SEQ ID NO: 71
B08	Nonamer	17	MAISKVFEL	26	SEQ ID NO: 45
B5101	Nonamer	6	MARFSYSVI	25	SEQ ID NO: 43

B-3 Epitopy specifické pro cripto-3 třídy l

Alela HLA	Velikost epitopu	Poloha začátku	Sekvence	Skoré	SEQ ID No.
A0201	Nonamer	83	CLNGGTCML	27	SEQ ID NO: 68
A0201	Nonamer	176	MLAGICLSI	25	SEQ ID NO: 72
A0201	Dekamer	16	IMAISKAFEL	24	SEQ ID NO: 49
A3	Nonamer	66	RVLPMGIQH	29	SEQ ID NO: 73
B0702	Nonamer	60	RPRSSQRVL	24	SEQ ID NO: 60
B08	Nonamer	17	MAISKAFEL	25	SEQ ID NO: 61

C - Předpověď epitopů třídy II použitím metody Tepitope

C-1 Epitopy cripto-1 a -3 třídy II

Alela HLA	Velikost epitopu	Poloha začátku	Sekvence	Skoré	SEQ ID No.
DRB1*0102	Nonamer	70	MGIQHSKEL	1,8	SEQ ID NO: 74

• · •-•96··-

DRB1*0301	Nonamer	152	LVMDEHLVA	5,9	SEQ ID NO: 75
DRB1*0301	Nonamer	158	LVASRTPEL	4,3	SEQ ID NO: 76
DRB1*0401	Nonamer	152	LVMDEHLVA	3,2	SEQ ID NO: 75
DRB1*0402	Nonamer	59	IRPRSSQRV	4,9	SEQ ID NO: 16
DRB1*0703	Nonamer	11	YSVIWIMAI	6	SEQ ID NO: 77
DRB1*0703	Nonamer	158	LVASRTPEL	5,7	SEQ ID NO: 76
DRB*0802	Nonamer	59	IRPRSSQRV	1,8	SEQ ID NO: 16
DRB1*0802	Nonamer	123	WLPKKCSLC	2,3	SEQ ID NO: 78
DRBV0804	Nonamer	59	IRPRSSQRV	2,8	SEQ ID NO: 16
DRB1*0806	Nonamer	59	IRPRSSQRV	3,1	SEQ ID NO: 16
DRB1*1101	Nonamer	11	YSVIWIMAI	2,8	SEQ ID NO: 77
DRB1*1101	Nonamer	152	LVMDEHLVA	2,2	SEQ ID NO: 75
DRB1*1102	Nonamer	152	LVMDEHLVA	2,4	SEQ ID NO: 75
DRB1*1104	Nonamer	25	LGLVAGLGH	2,8	SEQ ID NO: 79
DRB1*1104	Nonamer	152	LVMDEHLVA	3,2	SEQ ID NO: 75
DRB1*1106	Nonamer	25	LGLVAGLGH	2,8	SEQ ID NO: 79
DRB1*1106	Nonamer	152	LVMDEHLVA	3,2	SEQ ID NO: 75
DRB1*1107	Nonamer	46	FRDDSIWPQ	2,8	SEQ ID NO: 80
DRB1*1107	Nonamer	152	LVMDEHLVA	5,9	SEQ ID NO: 75
DRB1*1107	Nonamer	158	LVASRTPEL	3,3	SEQ ID NO: 76
DRB1*1305	Nonamer	11	YSVIWIMAI	3,7	SEQ ID NO: 77
DRB1*1307	Nonamer	11	YSVIWIMAI	1,2	SEQ ID NO: 77
DRB1*1501	Nonamer	138	LRCFPQAFL	4,3	SEQ ID NO: 20
DRB1*1501	Nonamer	152	LVMDEHLVA	4,5	SEQ ID NO: 75
DRB1*1502	Nonamer	152	LVMDEHLVA	3,5	SEQ ID NO: 75
DRB5*0101	Nonamer	13	VIWIMAISK	5,3	SEQ ID NO: 67

• ·

C-2 Epitopy specifické pro cripto-1 třídy II

Alela HLA	Velikost epitopů	Poloha začátku	Sekvence	Skoré	SEQ ID No.
DRB1*0101	Nonamer	15	WIMAISKVF	1,3	SEQ ID NO: 81
DRB1*0102	Nonamer	176	MLVGICLSI	1,8	SEQ ID NO: 82
DRB1*0102	Nonamer	178	VGICLSIQS	1,7	SEQ ID NO; 83
DRBV0301	Nonamer	17	MAISKVFEL	3,9	SEQ ID NO; 45
DRB1*0401	Nonamer	178	VGICLSIQS	2,8	SEQ ID NO; 83
DRBV0402	Nonamer	178	VGICLSIQS	4,2	SEQ ID NO: 83
DRB1*0404	Nonamer	14	IWIMAISKV	2,9	SEQ ID NO: 84
DRB1*0404	Nonamer	177	LVGICLSIQ	3,3	SEQ ID NO: 85
DRB1*0404	Nonamer	178	VGICLSIQS	3,8	SEQ ID NO: 83
DRB1*0405	Nonamer	175	FMLVGICLS	3,2	SEQ ID NO: 86
DRB1*0405	Nonamer	177	LVGICLSIQ	3,1	SEQ ID NO: 85
DRB1*0405	Nonamer	178	VGICLSIQS	2,8	SEQ ID NO: 83
DRB1*0703	Nonamer	15	WIMAISKVF	5,7	SEQ ID NO: 81
DRB1*0703	Nonamer	17	MAISKVFEL	7,6	SEQ ID NO: 45
DRB1*0703	Nonamer	176	MLVGICLSI	5	SEQ ID NO: 82
DRB*0801	Nonamer	175	FMLVGICLS	3,8	SEQ ID NO: 86
DRB1*0802	Nonamer	175	FMLVGICLS	3,8	SEQ ID NO: 86
DRB1*0804	Nonamer	175	FMLVGICLS	2,8	SEQ ID NO: 86
DRB1*1101	Nonamer	175	FMLVGICLS	3,9	SEQ ID NO: 86
DRB1*1101	Nonamer	178	VGICLSiQS	2,4	SEQ ID NO: 83
DRB1*1104	Nonamer	175	FMLVGICLS	2,9	SEQ ID NO: 86
DRB1*1104	Nonamer	177	LVGICLSIQ	2,6	SEQ ID NO: 85
DRB1*1104	Nonamer	178	VGICLSIQS	3,4	SEQ ID NO: 83
DRB1*1106	Nonamer	175	FMLVGICLS	2,9	SEQ ID NO: 86
DRB1*1106	Nonamer	177	LVGICLSIQ	2,6	SEQ ID NO: 85

·· ··· ·

-υδ·-

DRB1*1106	Nonamer	178	VGICLSIQS	3,4	SEQ ID NO: 83
DRBI*1107	Nonamer	17	MAISKVFEL	2,9	SEQ ID NO: 45
DRB1*1107	Nonamer	177	LVGICLSIQ	3,6	SEQ ID NO: 85
DRB1*1107	Nonamer	178	VGICLSIQS	3	SEQ ID NO: 83
DRB1*1302	Nonamer	15	WIMAISKVF	3,3	SEQ ID NO: 81
DRB1*1302	Nonamer	175	FMLVGICLS	3	SEQ ID NO: 86
DRB1M305	Nonamer	15	WIMAISKVF	3,1	SEQ ID NO: 81
DRB1*1305	Nonamer	175	FMLVGICLS	4,3	SEQ ID NO: 86
DRB1M307	Nonamer	175	FMLVGICLS	3,9	SEQ ID NO: 86
DRB1*1307	Nonamer	177	LVGICLSIQ	1,6	SEQ ID NO: 85
DRB1*1501	Nonamer	6	MARFSYSVI	4,5	SEQ ID NO: 43
DRB1*1501	Nonamer	176	MLVGICLSI	4,1	SEQ ID NO: 82
DRB1*1502	Nonamer	6	MARFSYSVI	3,5	SEQ ID NO: 43
DRB5*0101	Nonamer	15	WIMAISKVF	4,1	SEQ ID NO: 81

C-2 Epitopy specifické pro cripto-3 třídy II

Alela HLA	Velikost epitopu	Poloha začátku	Sekvence	Skoré	SEQ ID No.
DRB1*0101	Nonamer	15	WIMAISKAF	1,3	SEQ ID NO: 87
DRB1*0102	Nonamer	6	MVRFSYSVI	1,4	SEQ ID NO: 88
DRB1*0102	Nonamer	17	MAISKAFEL	1,6	SEQ ID NO: 61
DRB1*0401	Nonamer	7	VRFSYSVIW	2,9	SEQ ID NO: 51
DRBV0401	Nonamer	175	FMLAGICLS	2,7	SEQ ID NO: 89
DRB1*0402	Nonamer	67	VLPMGIQHS	3,6	SEQ ID NO: 90
DRB1*0404	Nonamer	6	MVRFSYSVI	2,5	SEQ ID NO: 88
DRB1*0404	Nonamer	14	IWIMAISKA	3,6	SEQ ID NO: 91
DRB1*0404	Nonamer	67	VLPMGIQHS	3,5	SEQ ID NO: 90
DRB1*0405	Nonamer	175	FMLAGICLS	2,7	SEQ ID NO: 89

« w* · •-•99·’-

DRB1*0703	Nonamer	7	VRFSYSVIW	6,5	SEQ ID NO: 51
DRBV0703	Nonamer	15	WIMAISKAF	5,7	SEQ ID NO: 87
DRB1*0703	Nonamer	17	MAISKAFEL	7,5	SEQ ID NO: 61
DRB1*0801	Nonamer	16	IMAISKAFE	3	SEQ ID NO: 92
DRB1*0801	Nonamer	175	FMLAGICLS	3,5	SEQ ID NO: 89
DRB1*0802	Nonamer	67	VLPMGIQHS	1,9	SEQ ID NO: 90
DRB1*0802	Nonamer	175	FMLAGICLS	3,5	SEQ ID NO: 89
DRB1*0804	Nonamer	67	VLPMGIQHS	2,9	SEQ ID NO: 90
DRB1*0804	Nonamer	175	FMLAGICLS	2,5	SEQ ID NO: 89
DRB1*0806	Nonamer	16	IMAISKAFE	4	SEQ ID NO: 92
DRB1*1101	Nonamer	175	FMLAGICLS	3,5	SEQ ID NO: 89
DRB1M102	Nonamer	67	VLPMGIQHS	3,1	SEQ ID NO: 90
DRB1*1102	Nonamer	175	FMLAGICLS	2,5	SEQ ID NO: 89
DRB1*1107	Nonamer	7	VRFSYSVIW	2,8	SEQ ID NO: 51
DRB1*1310	Nonamer	67	VLPMGIQHS	3,5	SEQ ID NO: 90
DRB1*1302	Nonamer	15	WIMAISKAF	3,3	SEQ ID NO: 87
DRB1*1302	Nonamer	175	FMLAGICLS	3,9	SEQ ID NO: 89
DRB1*1305	Nonamer	15	WIMAISKAF	3,1	SEQ ID NO: 87
DRB1*1305	Nonamer	175	FMLAGICLS	3,9	SEQ ID NO: 89
DRB1*1307	Nonamer	67	VLPMGIQHS	1,5	SEQ ID NO: 90
DRB1*1307	Nonamer	175	FMLAGICLS	3,5	SEQ ID NO: 89
DRB1*1501	Nonamer	6	MVRFSYSVI	6,6	SEQ ID NO: 88
DRB1*1502	Nonamer	6	MVRFSYSVI	5,6	SEQ ID NO: 88
DRB5*0101	Nonamer	15	WIMAISKAF	4,1	SEQ ID NO: 87

» *

4 >00**♦ * :

< i «

4 « » 4·

Příklad 5

Schopnost protitumorového působení humorální odpovědi indukované vakcinami cripto

Je možno provést řadu experimentů zaměřených na hodnocení inhibičního účinku humorální odpovědi specifické pro cripto na patofyziologické aktivity proteinu cripto u rakoviny použitím různých standardních testů in vitro. Testy in vitro mohou být bez omezení test inhibice růstu, test inhibice pohyblivosti buněk, test inhibice chemotaxe, inhibice invaze buněk prostřednictvím proteinu extralulární matrice (extracellular matrix protein, ECM) a inhibice biochemické cesty přenosu růstového signálu. Účinky sér zvířat imunizovaných peptidy cripto nebo proteiny s adjuvans nebo plasmidovou DNA nebo virovým dodávacím systémem, např. adenovirovým vektorem kódujícím protein cripto, mohou být hodnoceny v těch testech in vitro, které měří biologické účinky způsobené proteinem cripto na buněčné linie exprimující cripto. Paralelně je možno jako negativní kontrolu testovat účinek sér ze stejných zvířat odebraných před imunizací. Buněčné linie použité v těchto testech mohou být bez omezení linie lidských tumorů exprimujících cripto jako jsou buňky GEO, buňky NTERA2, buněčná linie CRL-5815 nebo myší tumorové buněčné linie s přirozenou zvýšenou expresí cripto. Jako příklad byla ukázána již dříve inhibice růstu in vitro jak buněk GEO, tak i NTERA2, působením nekódujících oligonukleotidů navržených pro zabránění translaci mRNA cripto [Baldassarre a další, 1996; Ciardiello a další, 1994; Alper a další, 2000],

5.1 Protokol imunizace

Myši nebo králíci mohou být imunizováni ve dnech 0, 14 a 21 injekcemi do tlapky buď peptidů nebo proteinů s adjuvans, intradermálními injekcemi plasmidové DNA kódující cripto s použitím zařízení gene-gun nebo intradermálními injekcemi dodávacího

- 101 • · · · ·· ·· ···· ····* ·· · ·· · ···· · · · systému na bázi virového vektoru, např. adenovirového vektoru kódujícího cripto.

5.2 Test inhibice proliferace buněk

Séra imunizovaných zvířat se budou odebírat a přidávat v různých ředěních ke kultivačnímu médiu buněk vysetých do 96jamkových destiček. Podobně se budou také k buňkám přidávat séra stejných zvířat před imunizací jako negativní kontroly. Buňky budou vystaveny působení testovaných látek 3 až 7 dnů. Růst buněk se bude měřit standardními metodami jako je test inkorporace ³H-thymidinu, test MTT, barvení krystalovou violetí nebo počítání kolonií pro zjištění proliferace v měkkém agarovém médiu.

5.3 Testy inhibice invaze buněk, pohyblivosti buněk a chemotaxe

Séra z imunizovaných zvířat se budou odebírat před a po imunizaci a přidávat v různých ředěních k buněčným suspenzím používaným pro standardní testy na invazi, pohyblivost a chemotaxi. Inhibice invaze, pohyblivosti a chemotaxe zprostředkovaných cripto mohly být testovány použitím např. bez omezení komerčně dostupných komůrek Falcon s matrigelovými vložkami (Collaborative Research), testů pohyblivosti v agarózové kapičce [Yamamoto a další, 1990] a komerčně dostupného zařízení Boyden (Neuro Probe).

5.4 Testy inhibice přenosu signálů

Séra imunizovaných zvířat se budou odebírat před a po imunizaci a budou se přidávat v různých ředěních k tumorovým buňkám exprimujícím cripto v buněčné kultuře. Potom se ke kultivačnímu médiu buněk bude přidávat exogenní protein cripto nebo lidské sérum nebo mléko obsahující nejvyšší koncentraci cripto zjištěnou detekcí metodou ELISA [Bianco a další, 2001]. Po různých dobách inkubace se buňky sklidí a zpracují standardními metodami a

- 102 provede se analýza imunologickým přenosem. Potom se bude hodnotit fosforylační stav různých klíčových biochemických cest přenosu signálů účastnících se proliferace buněk v těchto buňkách stimulovaných cripto v přítomnosti sér před imunizací nebo po imunizaci. Například stav fosforylace tyrosinu skupiny kináz erb B-4 a mitogeny aktivovaného proteinu (MAP) jako je ERK1, ERK-2, a P38, se bude zjišťovat imunologickým přenosem s protilátkami rozpoznávajícími fosforylovanou, aktivní formu těchto enzymů, jak bylo popsáno dříve [Bianco a další, 1999; Pain a další, 2000].

Příklad 6

Antitumorový účinek imunitní odpovědi indukované vakcinami cripto ve zvířecích modelech in vivo

Preventivní nebo léčebná schopnost vakcin obsahujících lidský protein cripto, peptidy cripto nebo gen cripto může být hodnocena na myších, kterým byla podána syngenní myší tumorová linie exprimující cripto. Tumorové buněčné linie by mohly být myší tumorové buněčné linie transfekované lidským genem cripto. Např. transfekované buněčné linie by mohly být buněčné linie TC1 transfekované lidským genem cripto. Na druhé straně, vysoká míra homologie mezi lidským cripto a jeho myším homologem ukazuje, že imunitní odpovědi zkřížené reaktivity indukované lidskou vakcinou mohou chránit proti myším tumorům exprimujícím cripto. Gen cripto (TDGF-1) kóduje ovšem protein o délce 171 aminokyselin, který má 93% identitu se svým lidským protějškem [Liguori a další, 1996]. Proto mohly být myši chráněny imunizací vakcinou obsahující lidský cripto před testovacím podáním myšího tumoru nebo spontánně vzniklým tumorem, o kterém je známo, že endogenně nadměrně exprimuje protein cripto. V této souvislosti bylo ukázáno, že spontánní tumory u transgenních myší navržené pro zvýšenou expresi několika různých onkogenů jako je střední antigen T MMTV-Polyoma viru, MMTV-c-ErbB2 a MT-hTGF

- 103 alfa, rovněž exprimují vyšší hladiny cripto [Kenney a další, 1996; Niemeyer a další, 1999],

Alternativně by mohly být myši nesoucí tumor pro vakcinaci syngenním genem vakcinovány plasmidovou DNA nebo virovým dodávacím systémem, např. adenovirovým vektorem, kódujícím myší protein cripto, pro ochranu před růstem tumorů u myší.

6.1 Návrh profylaktického experimentu

Myši by byly vakcinovány v den 0 a 14 před testovacím podáním tumoru buď injekcemi do tlapky 5 pg proteinu cripto v adjuvans, intradermálními injekcemi DNA plasmidu kódujícího cripto použitím technologie gene-gun nebo intradermálními injekcemi virového vektoru, např. adenovirového vektoru kódujícího cripto. Potom by mohlo být subkutánně vstříknuto 10⁶ buněk TC1-CR-1, což jsou lidské tumorové buňky exprimující cripto, co boku imunokompetentních myší C57BL/6 1 nebo 2 týdny po vakcinaci. Růst tumoru by měl být monitorován in vivo měřením jednotlivých tumorů dvakrát týdně po dobu několika týdnů po testovacím podání tumoru.

Na druhé straně by mohla být zjišťována účinnost preventivní vakcinace inhibici vývoje spontánních tumorů exprimujících cripto u transgenních myší [Niemeyer a další, 1999] imunizovaných vícekrát před nástupem hmatatelného tumoru kteroukoli z vakcin cripto.

6.2 Návrh terapeutického experimentu

10⁶ buněk TCI-CR-1, lidských tumorových buněk exprimujících cripto, by mohlo být vstříknuto subkutánně do tlapky imunokompetentních myší C57BL/6. Myši by mohly být vakcinovány ve dnech 7 a 14 po podání tumoru buď injekcemi 5 pg proteinu cripto v adjuvans do tlapky, intradermálními injekcemi DNA plasmidu kódujícího cripto technologií gene-gun nebo intradermálními injekcemi virového vektoru, např. adenovirového vektoru kódujícího cripto. Růst

- 104 tumoru by měl být monitorován in vivo měřením jednotlivých tumorů dvakrát za týden. Jeden až čtyři týdny po druhé imunizací se usmrtí několik myší ve skupině pro získání buněk sleziny, odsátí lymfatických uzlin a sér pro analýzu imunitních odpovědí pro vytvoření korelace mezi indukcí imunitní odpovědi specifické pro cripto a antitumorovým účinkem. Analýza imunitní odpovědi specifické pro cripto indukované imunizací by mohla být prováděna měřením titrů protilátek, isotypovým profilem protilátek, proliferační odpovědí CD4+ T-buněk a odpověďmi CTL CD8⁺ T-buněk včetně produkce cytokinů a lyzační aktivity na cílové buňky exprimující cripto. Všechny testy by se prováděly podle standardních protokolů.

Podobný typ experimentů by se mohl provádět testovacím podáním transplantovatelných linií myších tumorů mléčné žlázy s nadměrnou expresí cripto myším s mláďaty. Tyto buňky by se získaly ze spontánních tumorů pocházejících z různých onkogenních kmenů transgenních myší, jako jsou transgenní myši nesoucí střední antigen T MMTV-Polyoma viru, MMTV-c-ErbB2 a MT-hTGF alfa [Niemeyer a další, 1999],

Odkazy

Alper O., De Santis M. L., Stromberg K., Hacker N. F., Cho-Chung Y.

S., Salomon D. S. (2000), Anti-sense suppression of epidermal growth factor receptor expression alters cellular proliferation, cell-adhesion and tumorigenicity in ovarian cancer cells. Int. J. Cancer 88: 566 - 574

Baldassarre G., Bianco C., Tortora G., Ruggiero A., Moasser M.,

Dmitrovsky E., Bianco A. R., Ciardiello F. (1996), Transfection with a CRIPTO anti-sense plasmid suppresses endogenous CRIPTO expression and inhibits transformation in a human embryonal carcinoma cell line. Int. J. Cancer 66: 538 - 543

- 105

Bianco C., Kannan S., De Santis M., Seno M., Tang C. K., MartinezLacaci I., Kim N., Wallace-Jons B., Lippman Μ. E., Ebert A. D., Wechselberger C., Salomon D. S. (1999), Cripto-1 indirectly stimulates the tyrosin fosforylation of erb B-4 through a novel receptor. J. Biol. Chem. 274: 8624 - 8629

Bianco C., Wechselberger C., Ebert A., Khan N. I., Sun Y., Salomon D. S. (2001), Identification of Cripto-1 in human milk. Breast Cancer Res. TreatQQ: 1 -7

Butterfield L. H., Jilani S. M., Chakraborty N. G., Bui L. A., Ribas A., Dissette V. B., Lau R., Gamradt S. C., Glaspy J. A., McBride W. H., Mukherji B., Economou J. S. (1998), Generation of melanoma-specific cytotoxic T lymphocytes by dendritic celíš transduced with a MART-1 adenovirus. J. Immunol. 161: 560713

Ciardiello F., Tortora G., Bianco C., Selvam Μ. P., Basolo F., Fontanini G., Pacifico F., Normanno N., Brandt R., Persico M. G. (1994), Inhibition of CRIPTO expression and tumorigenicity in human colon cancer celíš by antisense RNA and oligodeoxynukleotides. Oncogen 9: 291 - 298

Kenney N. J., Smith G. H., Maroulakou I. G., Green J. H., Muller W. J., Callahan R., Salomon D. S., Dickson R. B. (1996), Detection of amphiregulin and Cripto-1 in mammary tumors from transgenic mice. Mol. Carcinog. 15: 44 - 56

Kim C. J., Prevette T., Cormier J., Overwijk W., Roden M., Restifo N. P., Rosenberg S. A., Marincola F. M. (1997), Dendritic celíš infected with poxviruses encoding MART-1/Melan A sensitize T lymphocytes in vitro. J. Immunother. 20: 276 - 286

Liguori G., Tucci M., Montuori N., Dono R., Lago C. T., Pacifico F., Armenante F., Persico M. G. (1996), Characterization of the mouše Tdgfl gene and Tdgf pseudogenes. Mamm Genome 7: 344 - 348

- 106

Niemeyer C. C., Spencer-Dene B., Wu J. X., Adamson E. D. (1999), Preneoplastic mammary tumor markers: Cripto and Amphiregulin are overexpressed in hyperplastic stages of tumor progression in transgenic mice. Int. J. Cancer 81: 588 - 591

Paine E., Palmantier R., Akiyama S. K., Olden K., Roberts J. D. (2000), Arachidonic acid activates mitogen-activated protein (MAP) kinase-activated protein kinase 2 and mediates adhesion of a human breast carcinoma cell line to collagen type IV through a p38 MAP kinase-dependent pathway. J. Biol. Chem. 275: 11284 - 11290

Parker K., Bednarek M., Coligan J. (1994), Scheme for ranking potential HLA-A2 binding peptides based on independent binding of individual peptide side-chains. J. Immunol. 152: 163

Rammensee, Bachmann, Stevanovic (1997), MHC ligands and peptide motifs. Landes Bioscience

Rammensee, Friede, Stevanovic (1995), MHC ligands and peptide motifs: 1 st listing, Immunogenetics 41, 178 - 228

Romani N., Gruner S., Brang D., Kampgen E., Lenz A., Trockenbacher B., Konwalinka G., Fritsch P. O., Steinman R. M., Schuler G. (1994), Proliferating dendritic cell progenitors in human blood. J. Exp. Med. 180: 83 - 93

Sturniolo T., Bono E., Ding J., Raddrizzani L., Tuereci O., Sahin U., Braxenthaler M., Gallazzi F., Protti Μ. P., Sinigaglia F., Hammer J. (1999), Generation of tissue-specific and promiscuous HLA ligand databases using DNA microarrays and Virtual HLA class II matrices. Nat. Biotechnol. 17: 555 - 61

Yamamoto T., Varani J., Soong Η. K., Lichter P. R. (1990), Effects of 5-fluoruracil and mitomycin C on cultured rabbit subconjunctival fibroblasts. Ophthalmology 97: 1204 - 1210

- 107

Výpis sekvencí

SEQIDNO:1 ggagaatccccggaaaggctgagtctccagctcaaggtcaaaacgtccaaggccgaa

AGCCCTCCAGTTTCCCCTGGACGCCTTGCTCCTGCTTCTGCTACGACCTTCTGGGGA

AAACGAATTTCTCATTTTCTTCTTAAATTGCCATTTTCGCTTTAGGAGATGAATGTT

TTCCTTTGGCTGTTTTGGCAATGACTCTGAATTAAAGCGATGCTAACGCCTCTTTTC

CCCCTAATTGTTAAAAGCTATGGACTGCAGGAAGATGGCCCGCTTCTCTTACAGTGT

GATTTGGATCATGGCCATTTCTAAAGTCTTTGAACTGGGATTAGTTGCCGGGCTGGG

CCATCAGGAATTTGCTCGTCCATCTCGGGGATACCTGGCCTTCAGAGATGACAGCAT

TTGGCCCCAGGAGGAGCCTGCAATTCGGCCTCGGTCTTCCCAGCGTGTGCCGCCCAT

GGGGATACAGCACAGTAAGGAGCTAAACAGAACCTGCTGCCTGAATGGGGGAACCTG

CATGCTGGGGTCCTTTTGTGCCTGCCCTCCCTCCTTCTACGGACGGAACTGTGAGCA

CGATGTGCGCAAAGAGAACTGTGGGTCTGTGCCCCATGACACCTGGCTGCCCAAGAA

GTGTTCCCTGTGTAAATGCTGGCACGGTCAGCTCCGCTGCTTTCCTCAGGCATTTCT

ACCCGGCTGTGATGGCCTTGTGATGGATGAGCACCTCGTGGCTTCCAGGACTCCAGA

ACTACCACCGTCTGCACGTACTACCACTTTTATGCTAGTTGGCATCTGCCTTTCTAT

ACAAAGCTACTATTAATCGACATTGACCTATTTCCAGAAATACAATTTTAGATATCA

TGCAAATTTCATGACCAGTAAAGGCTGCTGCTACAATGTCCTAACTGAAAGATGATC

ATTTGTAGTTGCCTTAAAATAATGAATACAATTTCCAAAATGGTCTCTAACATTTCC

TTACAGAACTACTTCTTACTTCTTTGCCCTGCCCTCTCCCAAAAAACTACTTCTTTT

TTCAAAAGAAAGTCAGCCATATCTCCATTGTGCCTAAGTCCAGTGTTTCTTTTTTTT

TTTTTTTTTGAGACGGAGTCTCACTCTGTCACCCAGGCTGGACTGCAATGACGCGAT

CTTGGTTCACTGCAACCTCCGCATCCGGGGTTCAAGCCATTCTCCTGCCTAAGCCTC

CCAAGTAACTGGGATTACAGGCATGTGTCACCATGCCCAGCTAATTTTTTTGTATTT

TAGTAGAGATGGGGGTTTCACCATATTGGCCAGTCTGGTCTCGAACTCTGACCTTGT

GATCCATCGATCAGCCTCTCGAGTGCTGAGATTACACACGTGAGCAACTGTGCAAGG

CCTGGTGTTTCTTGATACATGTAATTCTACCAAGGTCTTCTTAATATGTTCTTTTAA

ATGATTGAATTATATGTTCAGATTATTC-GAGACTAATTCTAATGTGGACCTTAGAAT

ACAGTTTTGAGTAGAGTTGATCAAAATCAATTAAAATAGTCTCTTTAAAAGGAAAC-A

AAACATCTTTAAGGGGAGGAACCAGAGTGCTGAAGGAATGGAAGTCCATCTGCGTGT

GTGCAGGGAGACTGGGTAGGAAAGAGGAAGCAAATAC-AAGAGAGAGGTTGAAAAACA

AAATGGGTTACTTGATTGGTGATTAGGTGGTGGTAGAGAAGCAAGTAAAAAGGCTAA

ATGGAAGGGCAAGTTTCCATCATCTATAGAAAGCTATATAAGACAAGAACTCCCCTT

TTTTTCCCAAAGGCATTATAAAAAGAATGAAGCCTCCTTAGAAAAAAAATTATACCT

CAATGTCCCCAACAAGATTGCTTAATAAATTGTGTTTCCTCCAAGCTATTCAATTCT

TTTAACTGTTGTAGAAGACAAAATGTTCACAATATATTTAGTTGTAAACCAAGTGAT

CAAACTACATATTGTAAAGCCCATTTTTAAAATACATTGTATATAŤGTGTATGCAČA

GTAAAAATGGAAACTATATTGACCTAAAAAAAAAAAAA

SEQEDNO:2

- 108

AAGCTTGCGCGCCATGTAAGGTAAAGTGACTGATTCTATAGCAATCCAATTGTTCCT

TTGTCTGCCCGTTTACATATAACAATGTTGTCAATGTTTGATTGAAAATACCTAGCA

GGCGACACACACACACCTAGCTCCTCAGGCGGAGAGCACCCCTTTCTTGGCCACCCG

GGTATCCCCCAGGGAGTACGGGGCTCAAAACACCCTTTTGGAGAACAAGGTGGAAGC

AAATTTCAGGAAGTAAAACTTCCTGAAATAAAATAAAATATCGAATGCCTTGAGACC

CATACATTTTCAGGTTTTCCTAATTAAAGCAATTACTTTCCACCACCCCTCCAACCT

GGAATCACCAACTTGGTTAGAGAAACTGArTTTTCTTTTTTCTTTTTTTTTCCCAAA

AGAGTACATCTGATCATTTTAGCCTGCAACTAATGATAGAGATATTAGGGCTAGTTA

ACCACAGTTTTACAAGACTCCTCTCCCGCGTGTGGGCCATTGTCATGCTGTCGGTCC

CGCCCACCTGAAAGGTCTCCCCGCCCCGACTGGGGTTTGTTGTTGAAGAAGGAGAAT

CCCCGGAAAGGCTGAGTCTCCAGCTCAAGGTCAAAACGTCCAAGGCCGAAAGCCCTC

CAGTTTCCCCTGGACACCTTGCTCCTGCTTCTGCTACGACCTTCTGGGAACGCGAAT

TTCTCATTTTCTTCTTAAATTGCCATTTTCGCTTTAGGAGATGAATGTTTTCCTTTG

GCTGTTTTGGCAATGACTCTGAATTAAAGCGATGCTAACGCCTCTTTTCCCCCTAAT

TGTTAAAAGCTATGGACTGCAGGAAGATGGTCCGCTTCTCTTACAGTGTGATTTGGA

TCATGGCCATTTCTAAAGCCTTTGAACTGGGATTAGTTGCCGGGCTGGGCCATCAGG

AATTTGCTCGTCCATCTCGGGGAGACCTGGCCTTCAGAGATGACAGCATTTGGCCCC

AGGAGGAGCCTGCAATTCGGCCTCGGTCTTCCCAGCGTGTGCTGCCCATGGGAATAC

AGCACAGTAAGGAGCTAAACAGAACCTGCTGCCTGAATGGGGGAACCTGCATGCTGG

AGTCCTTTTGTGCCTGCCCTCCCTCCTTCTACGGACGGAACTGTGAGCACGATGTGC

GCAAAGAGAACTGTGGGTCTGTGCCCCATGACACCTGGCTGCCCAAGAAGTGTTCCC

TGTGTAAATGCTGGCACGGTCAGCTCCGCTGCTTTCCTCAGGCATTTCTACCCGGCT

GTGATGGCCTTGTGATGGATGAGCACCTCGTGGCTTCCAGGACTCCAGAACTACCAC

CGTCTGCACGTACTACCACTTTTATGCTAGCTGGCATCTGCCTTTCTATACAAAGCT

ACTATTAATCGACATTGACCTATTTCCAGAAATACAATTTTAGATATTATGCAAATT

TCATGACCCGTAAAGGCTGCTGCTACAATGTCCTAACTGAAAGATGATCATTTGTA.G

TTGCCTTAAAATAATGAATACAATTTCCAAAACGGTCTCTAACATTTCCTTACAGAA

CTAACTACTTCTTACCTCTTTGCCCTGCCCTCTCCCAAAAAACTACTTCTTTTTTCA

AAAGAAAGTCAGCCATATCTCCATTGTGCCCAAGTCCAGTGTTTCTTTTTTTTTTTT

GAGACGGAGTCTCACTCTGTCACCCAGGCTGGACTGCAATGACGCGATCTCGGTTCA

CTGCAACCTCCGCATCCGGGGTTCAAGCCATTCTCCTGCCTCAGCCTCCCAAGTAGC

TGGGATTACAGGCATGTGTCACCATGCCGGCTAATTTTTTTGTATTTTAGTAGAGAC

GGGGG7TTCACCATATTGGCCAGCTGGTC7CGAACTCTGACCTTGTGATCCATCGCT

CGCCTCTCGAGTGCTGAGATTACACACGTGAGCAACTGTGCAAGGCCTGGTGTTTCT

TGATACATGTAATTCTACCAAGGTCTTCTTAATATGTTCTTTTAAATGATTGAATTA _

TACACTCAGATTATTGGAGACTAAGTCTAATGTGGACCTTAGAATACAGTGTTGAGT

AGAGTTGATCAAAATCAATTAAAATAGTCTCTTTAAAAGGAAAGAAAACATCTTTAA

GGGGAGGAACCAGAGGGCTGAAGGAATGGAAGTCCATCTC-CGTGTGTGCAGGGAGAC

TGGGTAGGAAAGAGGAAGCAAATAGAAGAGAGAGGTTGAAAAACAAAATGGGTTACT

TGATTGGTGATTAGGTGGTGGTAGAGAAGCAAGTAAAAAGGCTAAATGGAAGGGCAA

GTTTCCATCATCTATAGAAAGCTATGTAAGACAAGGACTCCCCTTTTTTTCCCAAAG

GCATTGTAAAAAGAATGAAGTCTCCTTAGAAAAAAAATTATACCTCAATGTCCCCAA

CAAGATTGCTTAATAAATTGTGTTTCCTCCAAGCTATTCAATTCTTTTAACTGTTGT agaagagaaaatgttcacaatatatttagttgtaaaccaagtgatcaaactacatat

TGTAAAGCCCATTTTTAAAATACATTGTATATATGTGTATGCACAGTAAAAATGGAA

- 109 * * · ·· ·· ·· ···« ···· · · · · » · • · · · ···· « · »

ACTATATTGACCTAAAAAAAAAAAAAGGAAACCACCCTTAGGCAGGCAGGACATGCT

CTTCAGAACTCTGCTCTTCAGAGTTCCAAAGAAGGGATAAAACATCTTTTATNNCCA

TCAAATAGC

SEQEDNO:3

MDCRKMARFSYSVIWIMAISKVFELGLVAGLGHQEFARPSRGYLAFRDDSIWPQEEP

AIRPRSSQRVPPMGIQHSKELNRTCCLNGGTCMLGSFCACPPSFYGRNCEHDVRKEN

CGSVPHDTWLPKKCSLCKCWHGQLRCFPQAFLPGCDGLVMDEHLVASRTPELPPSAR

TTTFMLVGICLSIQSYY

SEQEDNO:4

MDCRKMVRFSYSVIWIMAISKAFELGLVAGLGHQEFARPSRGDLAFRDDSIWPQEEP

AIRPRSSQRVLPMGIQHSKELNRTCCLNGGTCMLESFCACPPSFYGRNCEHDVRKEN

CGSVPHDTWLPKKCSLCKCWHGQLRCEPQAFLPGCDGLVMDEHLVASRTPELPPSAR

TTTFMLAGICLSIQSYY

SEQIDNO:5

GGAGAATCCCCGGAAAGGCTGAGTCTCCAGCTCAAGGTCAAAACGTCCAAGGCCGAA

AGCCCTCCAGTTTCCCCTGGACGCCTTGCTCCTGCTTCTGCTACGACCTTCTGGGGA

AAACGAATTTCTCATTTTCTTCTTAAATTGCCATTTTCGCTTTAGGAGATGAATGTT

TTCCTTTGGCTGTTTTGGCAATGACTCTGAATTAAAGCGATGCTAACGCCTCTTTTC

CCCCTAATTGTTAAAAGCTATGGACTGCAGGAAGATGGCCCGCTTCTCTTACAGTGT

GATTTGGATCATGGCCATTTCTAAAGTCTTTGAACTGGGATTAGTTGCCGGGCTGGG

CCATCAGGAATTTGCTCGTCCATCTCGGGGATACCTGGCCTTCAGAGATGACAGCAT

TTGGCCCCAGGAGGAGCCTGCAATTCGGCCTCGGTCTTCCCAGCGTGTGCCGCCCAT

GGGGATACAGCACAGTAAGGAGCTAAACAGAACCTGCTGCCTGAATGGGGGAACCTG

CATGCTGGGGTCCTTTTGTGCCTGCCCTCCCTCCTTCTACGGACGGAACTGTGAGCA

CGATGTGCGCAAAGAGAACTGTGGGTCTGTGCCCCATGACACCTGGCTGCCCAAGAA

GTGTTCCCTGTGTAAATGCTGGCACGGTCAGCTCČGCTGCTTTCCTCAGGCATTTCT

ACCCGGCTGTGATGGCCTTGTGATGGATGAGCACCTCGTGGCTTCCAGGACTCCAGA

ACTACCACCGTCTGCACGTACTACCACTTTTATGCTAGTTGGCATCTGCCTTTCTAT

ACAAAGCTACTATTAATCGACATTGACCTATTTCCAGAAATACAATTTTAGATATCA

TGCAAATTTCATGACCAGTAAAGGCTGCTGCTACAATGTCCTAACTGAAAGATGATC

ATTTGTAGTTGCCTTAAAATAATGAATACAATTTCCAAAATGGTCTCTAACATTTCC

TTACAGAACTACTTCTTACTTCTTTGCCCTGCCCTCTCCCAAAAAACTACTTCTTTT

TTCAAAAGAAAGTCAGCCATATCTCCATTGTGCCTAAGTCCAGTGTTTCTTTTTTTT

TTTTTTTTTGAGACGGAGTCTCACTCTGTCACCCAGGCTGGACTGCAATGACGCGAT

CTTGGTTCACTGCAACCTCCGCATCCGGGGTTCAAGCCATTCTCCTGCCTAAGCCTC

CCAAGTAACTGGGATTACAGGCATGTGTCACCATGCCCAGCTAATTTTTTTGTATTT

- 110

TAGTAGAGATGGGGGTTTCACCATATTGGCCAGTCTGGTCTCGAACTCTGACCTTGT GATCCATCGATCAGCCTCTCGAGTGCTGAGATTACACACGTGAGCAACTGTGCAAGG CCTGGTGTTTCTTGATACATGTAATTCTACCAAGGTCTTCTTAATATGTTCTTTTAA ATGATTGAATTATATGTTCAGATTATTGGAGACTAATTCTAATGTGGACCTTAGAAT ACAGTTTTGAGTAGAGTTGATCAAAATCAATTAAAATAGTCTCTTTAAAAGGAAAGA AAACATCTTTAAGGGGAGGAACCAGAGTGCTGAAGGAATGGAAGTCCATCTGCGTGT GTGCAGGGAGACTGGGTAGGAAAGAGGAAGCAAATAGAAGAGAGAGGTTGAAAAACA AAATGGGTTACTTGATTGGTGATTAGGTGGTGGTAGAGAAGCAAGTAAAAAGGCTAA ATGGAAGGGCAAGTTTCCATCATCTATAGAAAGCTATATAAGACAAGAACTCCCCTT TTTTTCCCAAAGGCATTATAAAAAGAATGAAGCCTCCTTAGAAAAAAAATTATACCT CAATGTCCCCAACAAGATTGCTTAATAAATTGTGTTTCCTCCAAGCTATTCAATTCT TTTAACTGTTGTAGAAGACAAAATGTTCACAATATATTTAGTTGTAAACCAAGTGAT CAAACTACATATTGTAAAGCCCATTTTTAAAATACATTGTATATATGTGTATGCACA GTAAAAATGGAAACTATATTGACCTAAAAAAAAAAAAA

SEQ ID NO:6

MDCRKMARFSYSVIWIMAISKVFELGLVAGLGHQEFARPSRGYLAFRDDSIWPQEEP

AIRPRSSQRVPPMGIQHSKELNRTCCLNGGTCMLGSFCACPPSFYGRNCEHDVRKEN

CGSVPHDTWLPKKCSLCKCWHGQLRCFPQAFLPGCDGLVMDEHLVASRTPELPPSAR

TTTFMLVGICLSIQSYY

SEQIDNO:7

TGGGTAGGAAAGAGGAAGCAAAT

SEQ Π) NO:8

TGCTTCTCTACCACCACCTAATCA

SEQIDNO:9

CGTCCAAGGCCGAAAGCCCTCCAGTT

TTGGGAGAGGGCAGGGCAAAGAAGTAAGAA

SEQIDNOílO- 111

SEQIDNO:11

GHQEFARPSRGYL

SEQIDNO:12

QEEPAIRPRSSQRVPPMG

SEQIDN0:13

SVIWIMAISK

SEQ Π) N0:14

SVPHDTWLPK

SEQ Π) N0:15

HQEFARPSR

SEQ ID N0:16

IRPRSSQRV

SEQ Π) N0:17

IQHSKELNR

SEQIDN0:18

GRNCEHDVR

SEQLDN0:19

VRKENCGSV

LRCFPQAFL

SRTPELPPS

QRVPPMGIQH

NRTCCLNGGT

GQLRCFPQAF

QAFLPGCDGL

DGLVMDEHLV

FELGLVAGL

KELNRTCCL

- 112 SEQ ID NO:20

SEQIDN0:21

SEQ Π) NO:22

SEQ Π) NO:23

SEQ ID NO:24

SEQ Π) NO:25

SEQ Π) NO:26

SEQEDNO:27

SEQ ID NO:28

- 113 ··· ·* ·· ·· ·· ··

QLRCFPQAF

SARTTTFML

KMARFSYSV

IMAISKVFEL

VIWIMAISKV

FMLVGICLSI

ARFSYSVIW

CRKMARFSY

ARFSYSVIWI

SEQIDNO:29

SEQ ID NO:30

SEQIDN0:31

SEQIDNO:32

SEQIDNO:33

SEQIDNO:34

SEQIDNO:35

SEQ ID NO:36

SEQIDNO:37

ARPSRGYLAF • ARTTTFMLV

ARPSRGYLA

CRKMARFSYS

QEFARPSRGY

MARFSYSVI

SARTTTFMLV

MAISKVFEL

FARPSRGYL

- 114 SEQ ID NO:38

SEQ ID NO:39

SEQ Π) NO:40

SEQ Π) NO:41

SEQEDNO:42

SEQ ID NO:43

SEQ ID NO:44

SEQ ID NO:45

SEQ ID NO:46

KMVRFSYSV

CMLESFCAC

IMAISKAFEL

FMLAGICLSI

VRFSYSVIW

CRKMVRFSY.

VRFSYSVIWI

ARPSRGDLAF

ARPSRGDLA

- 115 SEQIDNO:47

SEQ ED NO:48

SEQIDNO:49

SEQ ID NO:50

SEQ ID N0:51

SEQ ID NO:52

SEQ ID NO:53

SEQ ID NO:54

SEQIDNO:55

ARTTTFMLA

TRPRSSQRVL

CRKMVRFSYS

QRVLPMGIQH

RPRSSQRVL

MAISKAFEL

FARPSRGDL

GICLSIQSY

LVAGLGHQEF

- 116

SEQIDNO:56

SEQIDNO:57

SEQEDNO:58

SEQEDNO:59

SEQIDNO:60

SEQIDN0:61

SEQIDNO:62

SEQ ID NO:63

SEQIDNO:64

- 117

SEQIDNO:65

DTWLPKKCSL

SEQ JJD NO:66

AIRPRSSQR

SEQIDNO:67

VIWIMAISK

SEQ ID NO:68

CLNGGTCML

SEQ ID NO:69

EFARPSRGY

SEQ ID NO:70

RVPPMGIQH

SEQIDN0:71

KVFELGLVA

MLAGICLSI

RVLPMGIQH

SEQ ID NO:72

SEQIDNO:73 • ·

SEQ ID NO:74

MGIQHSKEL

LVMDEHLVA

LVASRTPEL

YSVIWIMAI

WLPKKCSLC

LGLVAGLGH

FRDDSIWPQ

WIMAISKVF

MLVGICLSI

SEQ Π) NO:75

SEQ ID NO:76

SEQIDNO:77

SEQ ID NO:78

SEQ Π) NO:79

SEQEDNO:80

SEQIDNO:82

SEQIDNO:81

VGICLSIQS

IWIMAISKV

LVGICLSIQ

FMLVGICLS

WIMAISKAF

MVRFSYSVI

FMLAGICLS

VLFMGIQHS

IWIMAISKA

- 119

SEQIDNO:83

SEQEDNO:84

SEQIDNO:85

SEQEDNO:86

SEQIDNO:87

SEQ ED NO:88

SEQEDNO:89

SEQEDNO:90

SEQEDN0:91

- 120

SEQIDNO:92

IMAISKAEE

SEQEDNO:93

GRNCEHDVRK

SEQEDNO:94

SRTPELPPSA

SEQEDNO:95

CGTCCAAGGCCGAAAGCCCTCCAGTTTCCCCTGGACGCCTTGCTCCTGCTTCTGCTA

CGACCTTCTGGGGAAAACGAATTTCTCATTTTCTTCTTAAATTGCCATTTTCGCTTT

AGGAGATGAATGTTTTCCTTTGGCTGTTTTGGCAATGACTCTGAATTAAAGCGATGC

TAACGCCTCTTTTCCCCCTAATTGTTAAAAGCTATGGACTGCAGGAAGATGGCCCGC

TTCTCTTACAGTGTGATTTGGATCATGGCCATTTCTAAAGcCTTTGAACTGGGATTA gttgccgggctgggccatcaggaatttgctcgtccatctcggggatacctggccttc

AGAGATGACAGCATTTGGCCCCAGGAGGAGCCTGCAATTCGGCCTCGGTCTTCCCAG

CGTGTGCCGCCCATGGGGATACAGCACAGTAAGGAGCTAAACAGAACCTGCTGCCTG

AATGGGGGAACCTGCATGCTGGGGTCCTTTTGTGCCTGCCCTCCCTCCTTCTACGGA

CGGAACTGTGAGCACGATGTGCGCAAAGAGAACTGTGGGTCTGTGCCCCATGACACC

TGGCTGCCCAAGAAGTGTTCCCTGTGTAAATGCTGGCACGGTCAGCTCCGCTGCTTT

CCTCAGGCATTTCTACCCGGCTGTGATGGCCTTGTGATGGATGAGCACCTCGTGGCT

TCCAGGACTCCAGAACTACCACCGTCTGCACGTACTACCACTTTTATGCTAGTTGGC.

ATCTGCCTTTCTATACAAAGCTACTATTAATCGACATTGACCTATTTCCAGAAATAC

AATTTTAGATÁTCATGCAAATTTCATGACCAGTAAAGGCTGCTGCTACAATGTCCTA

ACTGAAAGATGATCATTTGTAGTTGCCTTAAAATAATGAATACAATTTCCAAAATGG

TCTCTAACATTTCCTTACAGAACTACTTCTTACTTCTTTGCCCTGCCCTCTCCCAA

SEQ ID NO-.96

MDCRKMARFSYSVIWIMAISKAFELGLVAGLGHQEFARPSRGYLAFRDDSIWPQEEP

AIRPRSSQRVPPMGIQHSKELNRTCCLNGGTCMLGSFCACPPSFYGRNCEHDVRKEN CGSVPHDTWLPKKCSLCKCWHGQLRCFPQAFLPGCDC-LVMDEHIVASRTPELPPSAR TTT FMLVGICLSIQS YY

Claims

PATENTOVÉ NÁROKY

1. Imunogenní fragment polypeptidů cripto, kde tento imunogenní fragment je imunologicky reaktivní s protilátkou a/nebo Tbuňkou, která reaguje s úplným polypeptidem SEQ ID No. 3 nebo SEQ ID No. 4, přičemž tento imunogenní fragment má délku alespoň 20 za sebou následujících aminokyselin, obsahuje alespoň jednu sekvenci zvolenou ze SEQ ID No. 11 a SEQ ID No. 12, a zároveň nejde o úplnou sekvenci SEQ ID No. 3 nebo SEQ ID No. 4.
2. Imunogenní fragment podle nároku 1, kde tento fragment dále obsahuje jednu nebo více sekvencí ze skupiny SEQ ID No. 13 až SEQ ID No. 94.
3. Imunogenní fragment podle nároku 1 nebo 2, kde tento fragment je součástí většího fúzního proteinu.
4. Imunogenní fragment podle nároku 1 nebo 2, který je chemicky konjugovaný k nosnému proteinu.
5. Izolovaný polynukleotid kódující imunogenní fragment podle některého z nároků 1 až 4.
6. Expresní vektor obsahující izolovaný polynukleotid podle nároku 5 operativně navázaný na sekvenci řídící expresi.

♦ « · 4 44» *4 4 • 4 · t * 4 4 * » » · «« · 4 1 » · 4 4 4 4 4

- 122 - ··· ·· «· ·· ·· ··
7. Rekombinantní virový nebo bakteriální dodávací systém obsahující izolovaný polynukleotid podle nároku 5.
8. Hostitelská buňka transformovaná nebo transfekovaná expresním vektorem podle nároku 6, rekombinantním dodávacím systémem podle nároku 7 nebo izolovaným polynukleotidem podle nároku 5.
9. Způsob stimulace a/nebo expanze T-buněk specifických pro tumorový protein, vyznačující se tím, že se T-buňky uvedou do styku s alespoň jednou složkou zvolenou ze skupiny:

(a) imunogenních fragmentů podle kteréhokoli z nároků 1 až 4;

(b) polypeptidů se SEQ ID No. 3 nebo 4;

(c) polynukleotidu podle nároku 5; a (d) buněk předkládajících antigen exprimujících imunogenní fragment podle některého z nároků 1 nebo 4 nebo polypeptidy se SEQ ID No. 3 nebo 4, za podmínek a po dobu dostatečných pro umožnění stimulace a/nebo expanze T-buněk.
10. Izolovaná populace T-buněk obsahujících T-buňky připravené způsobem podle nároku 9.
11. Imunogenní prostředek, vyznačující se tím, ž e obsahuje první složku zvolenou ze skupiny fyziologicky přijatelných nosičů a imunostimulačních látek a adjuvans, a druhou složku zvolenou z následující skupiny:

- 123 • ·· 4· 4» ··<· «*· 4 • · · 4 ř β 4 » » • · *41 · *· 4 » < 4 *4 444» ·»♦ *· ·· 4* (a) polypeptid obsahující aminokyselinovou sekvenci složenou z alespoň 10 za sebou následujících aminokyselinových zbytků se sekvencí poskytnutou v SEQ ID No. 3 nebo SEQ ID No. 4;

(b) polypeptid se SEQ ID No. 3 nebo SEQ ID No. 4 nebo heterologní fuzní protein s obsahem těchto sekvencí;

(c) imunogenní fragment polypeptidu cripto podle některého z nároků 1 až 4;

(d) izolovaný polynukleotid obsahující sekvenci složenou z alespoň dvaceti za sebou následujících zbytků polynukleotidové sekvence poskytnuté v SEQ ID No. 1 nebo SEQ ID No. 2 nebo jejích degenerovaných variant;

(e) polynukleotid se SEQ ID No. 1 nebo 2 a jeho degenerované varianty;

(f) protilátky schopné reagovat s proteinem se SEQ ID No. 3 nebo SEQ ID No. 4;

(g) populace T-buněk podle nároku 10; a (h) buňky předkládající antigen, které exprimují polypeptid definovaný v bodu (a) nebo (b), nebo imunogenní fragment podle některého z nároků 1 až 4.
12. Imunogenní prostředek podle nároku 11, vyznačující se tím, že imunostimulační látkou je adjuvans indukující odpověď TH-1.
13. Imunogenní prostředek podle nároku 12, vyznačující se tím, že adjuvans indukující odpověď TH-1 je _ zvoleno ze skupiny adjuvans zahrnující 3D-MPL, QS21, směs QS21 a cholesterolu a oligonukleotid CpG, nebo směs dvou nebo více uvedených adjuvans.

- 124

4» ·· 44 *· 44 4444 • 4 ♦ · 4 * * «0 *

4 4 4 4 ««-44 ® * «

44 444 * - 4 > « »- 4 «44 4 4 4 4 β 4 * 4 • 44 44 44 44 44 44
14. Způsob stimulace imunitní odpovědi u pacienta, který zahrnuje podávání imunogenního prostředku podle některého z nároků 11 až 13 pacientovi.
15. Způsob léčení rakoviny u pacienta, vyznačující se tím, že zahrnuje podávání imunogenního prostředku podle některého z nároků 11 až 13 pacientovi.
16. Způsob inhibice rozvoje rakoviny u pacienta, který zahrnuje následující kroky:

(a) CD4+ a/nebo CD8+ T-buňky izolované z pacienta se inkubují s alespoň jednou složkou zvolenou ze skupiny:

(i) polypeptidů definovaných v nároku 11 (a) až (c);

(ii) polynukleotidů definovaných v nároku 11 (d) až (e); a (iii) buněk předkládajících antigen exprimujících polypeptid podle nároku 2, takže dojde k proliferaci T-buněk; a (b) pacientovi se podá účinné množství proliferovaných Tbuněk, čímž dojde k inhibici rozvoje rakoviny u pacienta.
17. Imunogenní prostředek podle některého z nároků 9 až 11 pro použití v lékařství.
18. Imunogenní prostředek podle některého z nároků 9 až 11 pro použití při léčení tumorů exprimujících antigen cripto.
19. Použití složky zvolené ze skupiny:

- 125 (a) polypeptid obsahující aminokyselinovou sekvenci složenou z alespoň 10 za sebou následujících aminokyselinových zbytků se sekvencí poskytnutou v SEQ ID No. 3 nebo SEQ ID No. 4;

(b) polypeptid se SEQ ID No. 3 nebo SEQ ID No. 4 nebo heterologní fuzní protein s obsahem těchto sekvencí;

(c) imunogenní fragment polypeptidu cripto podle některého z nároků 1 až 4;

(d) izolovaný polynukleotid obsahující sekvenci složenou z alespoň dvaceti za sebou následujících zbytků polynukleotidové sekvence poskytnuté v SEQ ID No. 1 nebo SEQ ID No. 2 nebo jejích degenerovaných variant;

(e) polynukleotid se SEQ ID No. 1 nebo 2 a jeho degenerované varianty;

(f) protilátky schopné reagovat s proteinem se SEQ ID No. 3 nebo SEQ ID No. 4;

(g) populace T-buněk podle nároku 10; a (h) buňky předkládající antigen, které exprimují polypeptid definovaný v bodu (a) nebo (b), nebo imunogenní fragment podle některého z nároků 1 až 4 při výrobě léčiva pro léčení tumorů exprimujících antigen cripto.
20. Způsob výroby imunogenního prostředku podle některého z nároků 11 až 13, vyznačující se tím, že polypeptid definovaný v nároku 11 (a) až (c) nebo imunogenní fragment podle některého z nároků 1 až 4, nebo polynukleotid podle nároku 11 (d) až (e) se mísí s vhodným adjuvans, ředivem nebo jiným farmaceuticky přijatelným nosičem.

- 126 • · · ·
21. Způsob výroby polypeptidů definovaného v nároku 11 (a) až (c) nebo imunogenního fragmentu podle některého z nároků 1 až 4, vyznačující se tím, že se hostitelská buňka podle nároku 8 kultivuje za vhodných podmínek pro produkci uvedeného polypeptidů, a polypeptid se izoluje z kultivačního média.