PL207087B1 - Przeciwciało, które wiąże się swoiście z białkiem Cripto, zawierająca je kompozycja farmaceutyczna i zastosowanie przeciwciała - Google Patents

Przeciwciało, które wiąże się swoiście z białkiem Cripto, zawierająca je kompozycja farmaceutyczna i zastosowanie przeciwciała

Info

Publication number
PL207087B1
PL207087B1 PL373513A PL37351302A PL207087B1 PL 207087 B1 PL207087 B1 PL 207087B1 PL 373513 A PL373513 A PL 373513A PL 37351302 A PL37351302 A PL 37351302A PL 207087 B1 PL207087 B1 PL 207087B1
Authority
PL
Poland
Prior art keywords
antibody
cripto
antibodies
protein
cells
Prior art date
Application number
PL373513A
Other languages
English (en)
Other versions
PL373513A1 (pl
Inventor
Michele Sanicola-Nadel
Kevin Williams
Susan Schiffer
Paul Rayhorn
Original Assignee
Biogen
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=27501437&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=PL207087(B1) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by Biogen filed Critical Biogen
Publication of PL373513A1 publication Critical patent/PL373513A1/pl
Publication of PL207087B1 publication Critical patent/PL207087B1/pl

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/30—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/34—Identification of a linear epitope shorter than 20 amino acid residues or of a conformational epitope defined by amino acid residues
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/73—Inducing cell death, e.g. apoptosis, necrosis or inhibition of cell proliferation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/76—Antagonist effect on antigen, e.g. neutralization or inhibition of binding
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/30—Non-immunoglobulin-derived peptide or protein having an immunoglobulin constant or Fc region, or a fragment thereof, attached thereto

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)

Description

Techniczna dziedzina wynalazku
Wynalazek dotyczy przeciwciała, które wiąże się swoiście z białkiem Cripto, kompozycji farmaceutycznej zawierającej co najmniej jedno z takich przeciwciał oraz zastosowanie tego przeciwciała do redukowania wzrostu komórek nowotworowych in vitro i leczenia niepożądanej proliferacji komórek.
Tło wynalazku
Cripto jest białkiem powierzchniowym składającym się ze 188 reszt aminokwasowych, wyizolowanym przy okazji przeszukiwania biblioteki cDNA pochodzącej z ludzkich zarodkowych komórek rakowych (Ciccodicola i wsp., 1989, EMBO J, 8(7):1987-1991). W białku Cripto wyodrębnić można co najmniej dwie domeny: domenę bogatą w cysteinę oraz domenę scharakteryzowaną początkowo jako domenę podobną do domeny występującej w rodzinie naskórkowych czynników wzrostu (EGF). Białko Cripto zostało także początkowo zaklasyfikowane do rodziny białek EGF (Ciccodicola i wsp., jw.), jednakże dalsza analiza wykazała, że Cripto nie wiąże się z żadnym spośród znanych receptorów EGF, a jego domena podobna do domeny EGF w rzeczywistości różni się od nich (Bianco i wsp., 1999, J Biol Chem, 274:8624-8629).
Pomimo prowadzenia ciągłych badań, szlak sygnałowy Cripto pozostaje wciąż nierozpoznany, przy czym dotychczasowa literatura sugeruje aktywację kilku różnych szlaków, takich jak szlak kinazy MAP (DeSantis i wsp., 1997, Cell Growth Differ, 8:1257-1266; Kannan i wsp., 1997, J Biol Chem,
272:3330-3335), szlak TGF-β (Gritsman i wsp., 1999, Development, 127:921-932; Schier i wsp., 2000, Nature, 403:385-389), możliwe interakcje ze szlakiem Wnt (Salomon i wsp., 2000, Endocr Relat Cancer, 7 (4):199-226) oraz współdziałanie ze szlakiem EGF (Bianco i wsp., 1999, J Biol Chem, 274:8624-8629).
W opisie patentowym USA nr 5 256 643 oraz w dwóch zgłoszeniach wydzielonych (opisy patentowe USA nr 5 654 140 i 5 792 616) ujawniono ludzki gen Cripto, białko Cripto i przeciwciała wobec Cripto.
W opisie patentowym USA nr 5 264 557 i trzech zgłoszeniach wydzielonych (opisy patentowe USA nr 5 620 886, 5 650 285 i 5 854 399) ujawniono związany z Cripto ludzki gen i odpowiadające mu białko. Przedstawiono tam również przeciwciała, które wiążą się z białkiem spokrewnionym z Cripto, lecz nie wykazują reakcji krzyżowej z samym białkiem Cripto.
Wytwarzanie poliklonalnych przeciwciał wobec Cripto z użyciem peptydu odpowiadającego resztom 97-113 Cripto-1 opisał Brandt i in., J. Biol. Chem. (1994), 269:17320-17328.
Nadekspresja białka Cripto związana jest z wieloma typami nowotworów (obejmującymi, ale nie wyłącznie, nowotwory sutka, jąder, okrężnicy, płuc, jajników, pęcherza moczowego, macicy, szyjki macicy, trzustki i żołądka), co wykazano poprzez immunohistochemiczne barwienie ludzkich tkanek przy pomocy króliczych przeciwciał poliklonalnych skierowanych przeciwko małym peptydom pochodzącym z białka Cripto (Panico i wsp., 1996, Int. J. Cancer, 65:51-56; Byrne i wsp., 1998, J. Pathology, 185:108-111; De Angelis i wsp., 1999, Int. J. Oncology, 14:437-440). Dlatego też poszukiwane są środki pozwalające na kontrolowanie, ograniczanie i/lub zapobieganie takiej nadekspresji, modulowanie szlaku sygnałowego Cripto, a także modulowanie skutków ekspresji Cripto (tj. promowania i/lub utrzymywania transformacji komórkowej).
Streszczenie wynalazku
Wynalazek dotyczy przeciwciała, które wiąże się swoiście z białkiem Cripto, charakteryzującego się tym, że wiąże się z epitopem białka Cripto zlokalizowanym w domenie obejmującej reszty aminokwasowe od 46 aminokwasu do 62 aminokwasu w SEQ ID NO: 1 lub SEQ ID NO: 2.
Korzystnie przeciwciało wiąże się z epitopem wybranym z grupy obejmującej epitopy wiązane przez przeciwciała produkowane przez hybrydoma wybrane spośród A10B2.18 (ATCC, nr dostępu PTA-3311) i B3F6.17 (ATCC, nr dostępu PTA-3319).
Także korzystnie przeciwciało zdolne jest do internalizacji białka Cripto.
Wynalazek dotyczy także przeciwciała, które wiąże się swoiście z białkiem Cripto, charakteryzującego się tym, że wiąże się z epitopem białka Cripto zlokalizowanym w domenie bogatej w cysteinę, obejmującej reszty aminokwasowe od 114 aminokwasu do 150 aminokwasu w SEQ ID NO: 1 lub SEQ ID NO: 2.
Korzystnie przeciwciało wiąże się swoiście z epitopem wybranym z grupy obejmującej epitopy wiązane przez przeciwciała produkowane przez hybrydoma wybrane spośród A6.C12.11, A8G3.5 (ATCC, nr dostępu PTA-3317) i A6F8.6 (ATCC, nr dostępu PTA-3318).
PL 207 087 B1
Także korzystnie przeciwciało hamuje oddziaływanie białka Cripto z ALK4.
Korzystnie przeciwciało jest fragmentem przeciwciała wybranym z grupy obejmującej fragment Fab, Fab' i F(ab)2.
W innej korzystnej postaci przeciwciało jest przeciwciałem pełnej długości.
W kolejnej korzystnej postaci przeciwciało jest przeciwciałem jednołańcuchowym.
W jeszcze innej korzystnej postaci przeciwciało jest skoniugowane z czynnikiem chemioterapeutycznym.
W kolejnej korzystnej postaci przeciwciało jest podawane w połączeniu z nieskoniugowanym czynnikiem chemioterapeutycznym.
Korzystniej czynnik chemioterapeutyczny jest wybrany z grupy obejmującej aktywowany przez nowotwór prolek, radionuklid i toksynę wybraną z grupy obejmującej rycynę, toksynę błonicy i egzotoksynę bakterii Pseudomonas. Jeszcze korzystniej czynnikiem jest majtanzynoid.
Korzystnie przeciwciało jest przeciwciałem ludzkim. W kolejnej korzystnej postaci przeciwciało jest przeciwciałem monoklonalnym.
W jeszcze innej korzystnej postaci przeciwciało jest przeciwciałem humanizowanym.
Wynalazek dotyczy także kompozycji farmaceutycznej, charakteryzującej się tym, że zawiera, co najmniej jedno z przeciwciał zdefiniowanych powyżej oraz nośnik.
Korzystnie kompozycja zawiera ponadto nieskoniugowany czynnik chemioterapeutyczny.
Także korzystnie kompozycja zawiera przeciwciało, które jest przeciwciałem humanizowanym B3F6.17.
Wynalazek dotyczy również zastosowania przeciwciała zdefiniowanego powyżej albo kompozycji zdefiniowanej powyżej do redukowania wzrostu komórek nowotworowych in vitro.
Wynalazek dotyczy również zastosowania przeciwciała zdefiniowanego powyżej albo kompozycji zdefiniowanej powyżej do wytwarzania leku do redukowania wzrostu komórek nowotworowych in vivo.
W korzystnej postaci komórka nowotworowa wybrana jest z grupy obejmującej komórki nowotworu sutka, jąder, okrężnicy, płuc, jajnika, pęcherza moczowego, macicy, szyjki macicy, trzustki oraz żołądka.
Wynalazek dotyczy również zastosowania przeciwciała zdefiniowanego powyżej albo kompozycji zdefiniowanej powyżej do wytwarzania leku do leczenia niepożądanej proliferacji komórek.
Niniejszy wynalazek dostarcza zatem nowych przeciwciał wiążących się swoiście z Cripto, oraz sposobów ich otrzymywania i zastosowania. Wynalazek dostarcza zatem również przeciwciał, które wiążą się z Cripto i modulują szlak sygnałowy Cripto lub modulują oddziaływania białka Cripto, np. przeciwciała wiążącego się z Cripto w taki sposób, że sygnał będący konsekwencją oddziaływania Cripto jest modulowany w dół. Wynalazek dostarcza zatem także przeciwciał, które wiążą się z Cripto i blokują oddziaływanie tego białka z ALK4. Wynalazek dostarcza również przeciwciał, które wiążą się z Cripto i modulują wzrost nowotworu. Wynalazek dostarcza także przeciwciał, które wiążą się z Cripto i modulują szlak sygnałowy Cripto oraz modulują wzrost nowotworu. Wynalazek dostarcza ponadto przeciwciał, które wiążą się z Cripto, blokują oddziaływanie pomiędzy Cripto a ALK4 oraz modulują wzrost nowotworu.
Wynalazek pozwala na modulowanie wzrostu komórek nowotworowych in vitro w próbce, obejmujące etap dodania do próbki opisanych powyżej kompozycji, jak też Sposoby modulowania wzrostu komórek nowotworowych in vivo w osobniku, które to sposoby obejmują etap podania osobnikowi skutecznej ilości opisanych powyżej kompozycji. Osobnikiem tym może być człowiek.
Przeciwciała i kompozycje według wynalazku umożliwiają leczenie osobników z nowotworami z nadekspresja Cripto, które polega na podawaniu osobnikowi opisanych powyżej kompozycji w skutecznej ilości. Podawane kompozycje mogą zawierać farmaceutycznie dopuszczalne zarobki, przeciwciała sprzężone ze środkami chemioterapeutycznymi oraz przeciwciała podawane w połączeniu z niesprzężonymi środkami chemioterapeutycznymi.
Sposoby takie są szczególnie użyteczne w przypadku modulowania wzrostu komórek nowotworowych i/lub leczenia osobnika (człowieka) z nowotworem, zwłaszcza w przypadku komórek nowotworowych raka sutka, jądra, okrężnicy, płuc, jajnika, pęcherza moczowego, macicy, szyjki macicy, trzustki, lub żołądka.
Możliwe jest także ustalanie, czy tkanka eksprymuje Cripto, obejmujące etap analizowania tkanki od osobnika w teście immunologicznym przy użyciu któregokolwiek spośród opisanych powyżej przeciwciał, a także czy zachodzi nadekspresja Cripto w linii komórkowej, co obejmuje etap analizowania linii komórkowej w teście immunologicznym przy użyciu któregokolwiek spośród opisanych powyżej przeciwciał.
PL 207 087 B1
Te i inne aspekty niniejszego wynalazku omówiono bardziej szczegółowo poniżej w szczegółowym opisie wynalazku.
Szczegółowy opis wynalazku
Odkryto przeciwciała wiążące się swoiście z Cripto oraz ich zastosowanie do modulowania szlaku sygnałowego Cripto lub oddziaływania tego białka z innymi białkami, i/lub blokowania oddziaływań pomiędzy Cripto i ALK4, i/lub modulowania wzrostu komórek nowotworowych. Odkryto rozmaite klasy przeciwciał, które wiążą się swoiście z białkiem Cripto, w tym np, przeciwciała wiążące się swoiście z epitopem w domenie wiążącej ligand/receptor w natywnym białku Cripto, lub też w zdenaturowanej postaci Cripto; przeciwciała wiążące domenę podobną do domeny EGF, domenę bogatą w cysteinę, lub peptyd (np. o długości od około 3 do około 20 aminokwasów) z regionu obejmującego reszty aminokwasowe 46 - 150; przeciwciała wiążące Cripto i modulujące szlak sygnałowy Cripto; oraz przeciwciała wiążące Cripto i modulujące wzrost komórek nowotworowych; a także przeciwciała wiążące się z Cripto, modulujące szlak sygnałowy Cripto i modulujące wzrost komórek nowotworowych. Przeciwciała te selekcjonowane są przy użyciu konwencjonalnych testów in vitro, w których selekcjonuje się przeciwciała wiążące się z domeną wiążącą ligand/receptor, modulujące szlak sygnałowy Cripto lub modulujące wzrost komórek nowotworowych.
Przeciwciała według niniejszego wynalazku są użyteczne w leczeniu tych złośliwych i łagodnych nowotworów ssaków, w których szybkość wzrostu nowotworu (która odbiega od szybkości wzrostu zdrowej tkanki) jest przynajmniej częściowo zależna od Cripto. Odbiegająca od normy szybkość wzrostu jest to taka szybkość wzrostu, która przewyższa szybkość wymaganą dla prawidłowej homeostazy i przewyższa szybkość charakterystyczną dla zdrowej tkanki o tym samym pochodzeniu.
Definicje
W dokumencie tym przyjęto rozmaite definicje. Większość słów ma znaczenie, które jest im przypisywane przez fachowców. Słowa konkretnie zdefiniowane poniżej lub w jakimkolwiek innym miejscu dokumentu mają znaczenie wynikające z kontekstu niniejszego wynalazku jako całości i są zazwyczaj rozumiane przez fachowców.
Określenie „region”, w użytym tutaj znaczeniu, oznacza wykazujący ciągłość fizyczną część pierwotnej struktury cząsteczki biologicznej. W przypadku białek region definiuje się jako ciągłą część sekwencji aminokwasowej białka.
Określenie „domena”, w użytym tutaj znaczeniu, dotyczy strukturalnej części cząstki biologicznej, która to część odpowiada za znaną lub podejrzewaną funkcję cząsteczki biologicznej. Domeny mogą pokrywać się z regionami lub ich częściami; oprócz całego danego regionu, lub też jego części, domeny mogą również obejmować fragment cząsteczki, który jest różny od danego regionu. Przykłady domen białkowych obejmują, między innymi, domenę zewnątrzkomórkową (obejmującą reszty od 31 do 188 w sekwencji Cripto, zarówno w przypadku Cripto, jak i CR-1 (NR ID SEK:1) oraz CR-3 (NR ID SEK:2)), oraz domenę przezbłonową (obejmującą reszty od 169 do 188 w sekwencji Cripto, zarówno w przypadku Cripto, jak i CR-1 (NR ID SEK:1) oraz CR-3 (NR ID SEK:2)). Domena wiążąca ligand/receptor w Cripto obejmuje reszty od 75 do 150 w sekwencji Cripto, zarówno w przypadku Cripto, jak i CR-1 (NR ID SEK:1) oraz CR-3 (NR ID SEK:2), przy czym obejmuje ona domenę podobną do domeny EGF, obejmującą np. reszty od 75 do 112 w sekwencji Cripto, zarówno w przypadku Cripto, jak i CR-1 (NR ID SEK:1) oraz CR-3 (NR ID SEK:2), oraz domenę bogatą w cysteinę, obejmującą np. reszty od 114 do 150 w sekwencji Cripto, zarówno w przypadku Cripto, jak i CR-1 (NR ID SEK:1) oraz CR-3 (NR ID SEK:2). Przykładowo, wiele przeciwciał monoklonalnych według niniejszego wynalazku zidentyfikowano jako przeciwciała wiążące domenę podobną do domeny EGF, lub domenę bogatą w cysteinę. Ponadto, przeciwciała monoklonalne A10B2.18 (ATCC, nr dostępu PTA-3311), B3F6.17 (ATCC, nr dostępu PTA-3319) oraz A17A2.16 zidentyfikowano jako przeciwciała wiążące się z epitopem tworzonym w domenie w regionie obejmującym aminokwasy 46-62, powyżej domeny podobnej do domeny EGF (patrz przykład 3 poniżej). Epitop w domenie wiążącej ligand/receptor jest epitopem, z którym może wiązać się przeciwciało niezależnie od tego, czy występuje w konformacyjnym natywnym białku Cripto, czy też w zdenaturowanym białku Cripto.
Określenie „przeciwciało”, w użytym tutaj znaczeniu, odnosi się do kompletnych, całych przeciwciał, a także do Fab, Fab', F(ab)2 oraz do innych ich fragmentów. Kompletne, całe przeciwciała obejmują, ale nie wyłącznie, przeciwciała monoklonalne, takie jak mysie przeciwciała monoklonalne, przeciwciała poliklonalne, przeciwciała chimeryczne, przeciwciała ludzkie oraz przeciwciała humanizowane. Rozmaite formy przeciwciał Można wytworzyć przy użyciu standardowych technik rekombinacji DNA (Winter i Milstein, 1991, Nature, 349: 293-299). Przykładowo, można skonstruować przeciwciała „chimeryczne”,
PL 207 087 B1 w których domena wiążąca antygen z przeciwciała zwierzęcego jest połączona ze stałą domeną ludzką (przeciwciało pochodzące początkowo od ssaka innego niż człowiek, do którego zastosowano technikę rekombinacji DNA w celu zastąpienia całego zawiasu lub jego części, oraz regionów stałych ciężkiego łańcucha i/lub regionów stałych lekkiego łańcucha, z odpowiadającymi im regionami z ciężkiego łańcucha lub lekkiego łańcucha ludzkiej immunoglobuliny) (patrz np. Cabilly I wsp., Patent USA nr 4,816,567; Morrison i wsp., 1984, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81:6851-6855). Przeciwciała chimeryczne osłabiają odpowiedzi odpornościowe wywoływane przez zwierzęce przeciwciała, gdy są użyte do klinicznego leczenia ludzi.
Ponadto, syntetyzować można również rekombinowane przeciwciała „humanizowane”. Przeciwciałami humanizowanymi są przeciwciała uzyskane początkowo od ssaka innego niż człowiek, w których przy użyciu techniki rekombinacji DNA zastąpiono niektóre lub wszystkie aminokwasy, które nie są wymagane do wiązania antygenu, aminokwasami z odpowiadających im regionów lekkiego lub ciężkiego łańcucha ludzkiej immunoglobuliny. Przeciwciała te są więc chimerami zawierającymi głównie sekwencje ludzkiej immunoglobuliny, w które wstawiono regiony odpowiedzialne za swoiste wiązanie antygenu (patrz np. zgłoszenie patentowe PCT WO 94/04679). Zwierzęta immunizuje się żądanym antygenem, izoluje się odpowiednie przeciwciała, a następnie wycina się sekwencje regionu zmiennego, odpowiedzialne za swoiste wiązanie antygenu. Uzyskane od zwierzęcia regiony wiążące antygen są następnie klonowane w odpowiedniej pozycji genów kodujących ludzkie przeciwciała, w których to genach usunięto wcześniej regiony wiążące antygen. Humanizowane przeciwciała minimalizują użycie heterologicznych (międzygatunkowych) sekwencji w przeciwciałach wykorzystywanych do leczenia ludzi i obniżają ryzyko wywołania niepożądanych odpowiedzi odpornościowych. W podobny sposób można też produkować przeciwciała prymatyzowane.
Inna postać niniejszego wynalazku obejmuje zastosowanie przeciwciał ludzkich, które mogą być wytwarzane przez zwierzęta, takie jak np. zwierzęta transgeniczne posiadające jeden lub większą liczbę ludzkich transgenów immunoglobulinowych. Zwierzęta takie mogą stanowić źródło limfocytów śledzionowych do produkcji hybrydom, jak to opisano w patencie USA nr 5 569 825.
W sposobach i kompozycjach według niniejszego wynalazku można również wykorzystywać fragmenty przeciwciał oraz przeciwciała jednoreceptorowe. Przeciwciała jednoreceptorowe zawierają dimer tworzony przez ciężki i lekki łańcuch przeciwciała, połączony z regionem Fc drugiego łańcucha ciężkiego.
„Region Fab” odnosi się do tych części łańcuchów, które są mniej więcej ekwiwalentne lub analogiczne w stosunku do sekwencji obejmujących części ciężkiego łańcucha tworzące rozgałęzienie Y przeciwciała oraz cały łańcuch lekki. Takie fragmenty Fab występujące grupowo (w postaci agregatu) wykazują aktywność przeciwciała. Białko Fab obejmuje agregaty złożone z jednego łańcucha ciężkiego i jednego łańcucha lekkiego (nazywane powszechnie Fab'), a także jako tetramery odpowiadające dwóm gałęziom Y przeciwciała (nazywane powszechnie F(ab)2), przy czym agregacja tak może mieć zarówno charakter kowalencyjny jak i niekowalencyjny, pod warunkiem, że agregat taki jest w stanie wiązać się swoiście z określonym antygenem lub rodziną antygenów.
Każde z przeciwciał według wynalazku może być ewentualnie sprzężone ze środkiem chemioterapeutycznym, zdefiniowanym poniżej.
Określenie „wiązanie”, w użytym tutaj znaczeniu, oznacza fizyczne lub chemiczne oddziaływanie pomiędzy dwoma białkami lub związkami, lub pomiędzy asocjowanymi białkami lub związkami, lub pomiędzy kombinacjami tych elementów, obejmujące oddziaływanie pomiędzy przeciwciałem i białkiem. Może to więc być wiązanie jonowe, niejonowe, wodorowe, Van der Waalsa, oddziaływanie hydrofobowe itp. Fizyczne oddziaływanie w takim wiązaniu może mieć charakter bezpośredni lub pośredni, przy czym w wiązaniu pośrednim musi brać udział inne białko lub związek. Wiązanie bezpośrednie odnosi się do oddziaływania, które nie przebiega poprzez udział lub na skutek udziału innego białka lub związku, lecz zachodzi właśnie bez znacznego udziału innych pośredniczących związków chemicznych. Wiązanie może być wykrywane na wiele sposobów. Sposoby wykrywania wiązania są dobrze znane fachowcom.
Określenie „przeciwciało zdolne do internalizacji Cripto”, w użytym tutaj znaczeniu, oznacza przeciwciało, które wnika do wnętrza komórki usuwając Cripto z powierzchni komórki. Przeciwciała, które zdolne są do wywoływania internalizacji Cripto, mogą być wyszukiwane przy użyciu fluorescencyjnego znakowania monoklonalnych przeciwciał przeciwko Cripto. W celu określenia, które przeciwciała ulegają internalizacji w komórkach wyrażających Cripto, należy dokonać pomiaru wychwytu sygnału fluorescencyjnego przez komórki obserwowane pod mikroskopem fluorescencyjnym i/lub konfokalnym. Te prze6
PL 207 087 B1 ciwciała, które ulegną internalizacji, będą obserwowane jako sygnały fluorescencyjne w pęcherzykach cytoplazmatycznych i/lub komórkowych. Przykłady przeciwciał skierowanych przeciwko Cripto, które zdolne są do internalizacji Cripto, obejmują A27F6.1 oraz B3F6.17.
Określenie „związek”, w użytym tutaj znaczeniu oznacza dowolny, możliwy do identyfikacji, samodzielny element chemiczny lub cząsteczkę i obejmuje, ale nie wyłącznie, jon, atom, małą cząsteczkę, peptyd, białko, cukier, nukleotyd lub kwas nukleinowy, przy czym taki związek może być naturalny lub syntetyczny.
Określenia „moduluje” lub „modyfikuje”, zastosowane w użytym tutaj znaczeniu, oznaczają wzrost lub spadek ilości, jakości lub działania określonej aktywności białka.
Określenie „modulowanie szlaku sygnałowego Cripto”, w użytym tutaj znaczeniu, oznacza podwyższenie lub obniżenie ilości, jakości, lub efektu aktywności Cripto o około 5%, korzystnie o 10%, korzystniej o 20%, korzystniej o 30%, korzystniej o 40%, korzystniej o 50%, korzystniej o 60%, korzystniej o 70%, korzystniej o 80%, korzystniej o 90%, a najkorzystniej o 100%. Aktywność można mierzyć w znanych testach, np, w teście z komórkami Null opisanym w przykładzie 3. W innej postaci modulowanie polega na zmniejszaniu stopnia oddziaływania pomiędzy Cripto i innym białkiem poprzez wiązanie przeciwciał według wynalazku.
Określenie „blokowanie oddziaływania pomiędzy Cripto i ALK4”, w użytym tutaj znaczeniu, oznacza podwyższenie lub obniżenie oddziaływania, tj. wiązania, zachodzącego pomiędzy Cripto i ALK4 o około 5%, korzystnie o 10%, korzystniej o 20%, korzystniej o 30%, bardziej korzystnie o 40%, korzystniej o 50%, korzystniej o 60%, korzystnie o 70%, bardziej korzystnie o 80%, korzystniej o 90%, a najkorzystniej o 100%. Aktywność można mierzyć w znanych testach, np. w teście wiązania, który został przedstawiony w przykładzie 8.
Określenie „modulowanie wzrostu komórek nowotworowych in vitro”, w użytym tutaj znaczeniu, oznacza podwyższenie lub obniżenie liczby komórek nowotworowych, w warunkach in vitro, o około 5%, korzystnie o 10%, korzystniej o 20%, korzystniej o 30%, bardziej korzystnie o 40%, korzystniej o 50%, korzystniej o 60%, korzystnie o 70%, korzystnie o 80%, korzystnie o 90%, a najkorzystniej o 100%. Modulowanie wzrostu komórek nowotworowych in vitro można mierzyć w znanych testach, np. w teście komórkowym GEO w miękkim agarze, który to test przedstawiono w przykładzie 4.
Określenie „modulowanie wzrostu komórek nowotworowych in vivo”, w użytym tutaj znaczeniu, oznacza podwyższenie lub obniżenie liczby komórek nowotworowych, w warunkach in vivo, o około 5%, korzystnie o 10%, korzystniej o 20%, korzystniej o 30%, bardziej korzystnie o 40%, korzystniej o 50%, bardziej korzystnie o 60%, korzystniej o 70%, korzystniej o 80%, korzystniej o 90%, a najkorzystniej o 100%. Modulowanie wzrostu komórek nowotworowych in vivo można mierzyć w znanych testach, np. w teście przedstawionym w przykładzie 5.
Termin „zapobieganie” odnosi się do zmniejszania prawdopodobieństwa zarażenia organizmu lub rozwoju nienormalnego stanu.
Termin „leczenie” odnosi się do faktu wywierania leczniczego działania oraz powodowania przynajmniej częściowego łagodzenia lub usuwania nienormalnego stanu w organizmie. Leczenie obejmuje utrzymywanie zahamowania wzrostu nowotworu oraz indukcję remisji.
Termin „działanie terapeutyczne” odnosi się do hamowania nienormalnego stanu. Działanie terapeutyczne łagodzi w pewnym stopniu jeden lub większą liczbę objawów choroby. W odniesieniu do leczenia nienormalnych stanów działanie terapeutyczne może dotyczyć jednego lub większej liczby następujących zjawisk: (a) wzrost lub spadek proliferacji, wzrostu i/lub różnicowania komórek; (b) zahamowanie (czyli spowolnienie lub zatrzymanie) albo indukcja śmierci komórkowej; (c) zahamowanie zmian zwyrodnieniowych; (d) łagodzenie w pewnym zakresie jednego lub większej liczby objawów choroby; oraz (e) wzmocnienie działania populacji komórek. Związki wykazujące skuteczność w przypadku nienormalnych stanów mogą być identyfikowane przy użyciu opisanych tu sposobów.
Termin „podawanie” odnosi się do sposobu wprowadzania związku do komórek lub tkanek organizmu. Można zapobiegać lub leczyć nienormalny stan dotyczący komórek lub tkanek organizmu znajdujących się w obrębie lub poza organizmem. Komórki znajdujące się poza organizmem można utrzymywać lub hodować na płytkach hodowlanych, lub w innym organizmie. Jeśli chodzi o komórki znajdujące się wewnątrz organizmu, istnieje wiele znanych technik, które umożliwiają podawanie odpowiednich związków tym komórkom, obejmujących, ale nie wyłącznie, podawanie doustne, pozajelitowe, naskórne, drogą iniekcji, a także techniki wykorzystujące aerozole. W przypadku komórek znajdujących się poza organizmem istnieje także wiele znanych technik, umożliwiających podawanie tym komórkom wybranych związków, a techniki te obejmują między innymi techniki mikroiniekcji, techniki
PL 207 087 B1 transformacyjne oraz techniki wykorzystujące odpowiednie nośniki. Podawanie może odbywać się przy wykorzystaniu różnych dróg, np. jako podawanie doustne, dożylne, śródotrzewnowe, domięśniowe itp. W przypadku leczenia in vivo przeciwciała według wynalazku podaje się pacjentowi w skutecznej ilości. Określenie „skuteczna ilość”, w użytym tutaj znaczeniu, odnosi się do ilości wystarczającej do otrzymania korzystnych lub pożądanych rezultatów klinicznych (czyli ilości eliminującej lub redukującej rozwój guza u pacjenta). Skuteczną ilość można dostarczać pacjentowi w jednym podaniu lub w większej ich liczbie. W niniejszym opisie skuteczna ilość przeciwciał według niniejszego wynalazku oznacza ilość przeciwciał, która jest wystarczająca do osiągnięcia złagodzenia, stabilizacji, lub opóźnienia rozwoju stanu chorobowego związanego z Cripto, a zwłaszcza nowotworów związanych z Cripto. Wykrywanie i pomiar poziomu tych wskaźników skuteczności przedstawiono poniżej. Przykładem typowego zabiegu leczniczego może być podawanie osobnikowi w trybie tygodniowym przeciwciał według wynalazku poprzez wlew dożylny, w dawce około 2-5 mg/kg. Przeciwciała podawane są pacjentowi ambulatoryjnie, o ile pacjent nie wymaga hospitalizacji. Możliwe są również inne znane procedury podawania związku leczniczego.
Zapobieganie lub leczenie nienormalnego stanu można również osiągnąć przez podawanie przeciwciała według wynalazku grupie komórek o nieprawidłowym szlaku przesyłania sygnałów do organizmu. Umożliwia to monitorowanie wpływu podawania związku na funkcjonowanie organizmu. Organizmem tym jest korzystnie organizm ludzki.
Termin „nadekspresja Cripto” oznacza wykazywanie przez tkankę takiego poziomu ekspresji Cripto, który jest w statystycznie znaczący sposób wyższy od poziomu ekspresji Cripto w sąsiadujących zdrowych tkankach.
Termin „chemioterapeutyki” odnosi się do dowolnych środków, które zostały zidentyfikowane w dziedzinie jako środki wykazujące działanie terapeutyczne, polegające na hamowaniu wzrostu guza, utrzymywaniu zahamowanego wzrostu guza i/lub indukcji remisji, przy czym mogą to być związki naturalne, związki syntetyczne, białka, modyfikowane białka, oraz związki radioaktywne. Brane tu pod uwagę środki chemioterapeutyczne obejmują środki, które mogą być sprzężone z przeciwciałami według niniejszego wynalazku, a także alternatywnie środki, które mogą być użyte w połączeniu z przeciwciałami według niniejszego wynalazku, nie będąc jednak z nimi sprzężone. Przykładowe chemioterapeutyki, które mogą być sprzężone z przeciwciałami według niniejszego wynalazku obejmują, ale nie wyłącznie, radiokoniugaty (90Y, 131II, 99mTc, 111ln, 186Rh, itp.), aktywowane przez nowotwór proleki (majtanzynoidy, analogi CC-1065, pochodne klicheamycyny, antracykliny, alkaloidy barwinka itp.), rycynę, toksynę błonicy, egzotoksynę Pseudomonas.
Środki chemioterapeutyczne, które mogą być użyte w kombinacji z przeciwciałami według wynalazku a nie sprzężone z nimi (tj. niesprzężone chemioterapeutyki) obejmują, ale nie wyłącznie, platynę (np. cis-platynę), antracykliny, analogi nukleozydowe (purynowe i pirymidynowe), taksany, kamptotecyny, epidofilotoksyny, środki alkilujące DNA, antagoniści folanów, alkaloidy barwinka, inhibitory reduktazy rybonukleotydowej, inhibitory estrogenu, inhibitory progesteronu, inhibitory androgenu, inhibitory aromatazy, interferony, interleukiny, przeciwciała monoklonalne, taksol, kamptozar, adriamycynę (dox), 5-FU oraz gemcytabinę. Chemioterapeutyki te można wykorzystać w praktycznych zastosowaniach wynalazku w połączeniu z przeciwciałami według wynalazku, stosując jednoczesne podawanie przeciwciała oraz niesprzężonego chemioterapeutyku.
Termin „farmaceutycznie dopuszczalny nośnik lub zaróbka” odnosi się do biologicznie nieczynnych związków, znanych i stosowanych przy podawaniu przeciwciał według wynalazku. Dopuszczalne nośniki są doskonale znane i opisane między innymi w Remington's Pharmaceutical Sciences, wyd. Gennaro, Mack Publishing Co., 1990. Dopuszczalne nośniki mogą obejmować bio-zgodne, obojętne lub bioabsorbowalne sole, środki buforujące, oligosacharydy lub polisacharydy, polimery, związki lepko-sprężyste (takie jak kwas hialuronowy), środki poprawiające lepkość, konserwanty itp.
Określenie „osobnik” odnosi się do przedstawicieli kręgowców, zwłaszcza ssaków, i obejmuje, ale nie wyłącznie, zwierzęta domowe, zwierzęta, które wykorzystuje się w zawodach sportowych, a także naczelne, w tym ludzi.
Przeciwciała według wynalazku
Przeciwciała według wynalazku wiążą się swoiście z Cripto. Termin „Cripto” obejmuje tutaj białko Cripto CR-1, białko Cripto CR-3, a także ich fragmenty. Fragmenty takie mogą obejmować całe domeny, takie jak domeny zewnątrzkomórkowe i wewnątrzkomórkowe, domenę podobną do EGF, domenę bogatą w cysteinę, domenę wiążącą receptor itp. Fragmenty te mogą także obejmować ciągłe i nieciągłe epitopy zlokalizowane w którejkolwiek domenie białka Cripto.
PL 207 087 B1
Sekwencja białka CR-1 o długości 188 aminokwasów [NR ID SEK:1] przedstawia się następująco:
MDCRKMARFSYSVIWIMAISKVFELGLVAGLGHQEFARPSRGYLAFRDDS
IWPQEEPAIRPRSSQRVPPMGIQHSKELNRTCCLNGGTCMLGSFCACPPS
FYGRNCEHDVRKENCGSVPHDTWLPKKCSLCKCWHGQLRCFPQAFLPGCD
GLVMDEHLVASRTPELPPSARTTTFMLVGICLSIQSYY
Sekwencja białka CR-3 o długości 188 aminokwasów [NR ID SEK:2] przedstawia się następująco:
MDCRKMVRFSYSVIWIMAISKAFELGLVAGLGHQEFARPSRGDLAFRDDS
IWPQEEPAIRPRSSQRVLPMGIQHSKELNRTCCLNGGTCMLESFCACPPS
FYGRNCEHDVRKENCGSVPHDTWLPKKCSLCKCWHGQLRCFPQAFLPGCD
GLVMDEHLVASRTPELPPSARTTTFMLAGICLSIQSYY
W jednej postaci przeciwciała według wynalazku wiążą się z epitopem w podobnej do EGF domenie Cripto. Domena podobna do EGF obejmuje reszty aminokwasowe od około 75 do około 112 dojrzałego białka Cripto. Epitopy w obrębie domeny podobnej do EGF mogą obejmować liniowe lub nieliniowe sekwencje reszt aminokwasowych. Przykłady epitopów liniowych obejmują, ale nie wyłącznie, odcinki odpowiadające w przybliżeniu resztom 75-85, 80-90, 85-95, 90-100, 95-105, 100-110, lub 105-112. W jednej postaci epitop w domenie EGF jest epitopem tworzonym w białku Cripto przyjmującym natywną konformację, w odróżnieniu od denaturowanego białka Cripto.
W innej postaci, przeciwciała według wynalazku wiążą się z epitopem w domenie Cripto bogatej w cysteinę. Domena bogata w cysteinę obejmuje reszty aminokwasowe od 114 do 150 dojrzałego białka Cripto. Epitopy w obrębie domeny bogatej w cysteinę mogą obejmować liniowe lub nieliniowe sekwencje reszt aminokwasowych. Przykłady epitopów liniowych obejmują, ale nie wyłącznie, odcinki odpowiadające mniej więcej resztom 114-125, 120-130, 125-135, 130-140, 135-145, lub 140-150. W jednej postaci epitop w obrębie domeny bogatej w cysteinę jest epitopem tworzonym w białku Cripto przyjmującym natywną konformację, w odróżnieniu od zdenaturowanego białka Cripto.
Po wytworzeniu przeciwciał można ocenić wiązania przeciwciał z Cripto, wykorzystując do tego znane standardowe techniki, takie jak ELISA, podczas gdy obecność białka Cripto na powierzchni komórek można ocenić przy użyciu cytometrii przepływowej (FACS), jak to przedstawiono w przykładzie 2. Alternatywnie, zastosować można dowolne inne techniki pomiaru takiego wiązania.
Niniejszy wynalazek dostarcza przeciwciał (np. przeciwciał monoklonalnych i poliklonalnych, przeciwciał jednołańcuchowych, przeciwciał chimerycznych, przeciwciał o podwójnej funkcji/bispecyficznych, przeciwciał humanizowanych, przeciwciał ludzkich, przeciwciał szczepionych regionem określającym komplementarność (CDR), obejmujących związki zawierające sekwencje CDR rozpoznające swoiście polipeptyd), które to przeciwciała wykazują swoistość wobec Cripto lub jego fragmentów. Wynalazek ten dostarcza również fragmentów przeciwciał, takie jak Fab, Fab', F(ab)2, oraz Fv. Terminy „swoisty” oraz „selektywny”, stosowane tu do opisania wiązania przeciwciał według wynalazku, wskazują, że zmienne regiony przeciwciał według wynalazku rozpoznają i wiążą polipeptydy Cripto. Należy również zdawać sobie sprawę, że swoiste przeciwciała według wynalazku mogą także oddziaływać z innymi białkami (np. z białkiem A S. aureus lub z innymi przeciwciałami stosowanymi w technikach ELISA) poprzez interakcje z sekwencjami położonymi poza regionem zmiennym przeciwciał, w szczególności sekwencji regionu stałego cząsteczki. Testy przesiewowe określające swoistość wiązania przeciwciała według wynalazku (tj. przeciwciał wiążących się swoiście z epitopem w domenie wiążącej ligand/receptor lub w domenie obejmującej reszty aminokwasowe 46-62) są dobrze znane i wykorzystywane rutynowo w praktyce. Wyczerpujące omówienie tych technik można znaleźć w publikacji Harlow i wsp. (red.), Antibodies. A Laboratory Manual; Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY, USA (1988), rozdział 6. Wynalazek obejmuje także przeciwciała, które rozpoznają i wiążą fragmenty białka Cripto, pod warunkiem, że przeciwciała te są swoiste wobec polipeptydów Cripto. Przeciwciała według niniejszego wynalazku można wytwarzać dowolnym znanym sposobem i stosowanym rutynowo w praktyce.
W jednej postaci wynalazek dostarcza przeciwciał, które wiążą się swoiście z epitopem w domenie Cripto wiążącej ligand/receptor. Swoistość przeciwciała jest opisana bardziej szczegółowo poniżej. Należy jednakże podkreślić, że przeciwciała, które zostały wytworzone z innych polipeptydów, opisanych uprzednio w literaturze, i zdolnych do przypadkowych reakcji krzyżowych z Cripto (np. wskutek przypadkowej obecności podobnego epitopu w obu polipeptydach), są uważane za przeciwciała zdolne do reakcji krzyżowych. Przeciwciała takie nie są przeciwciałami „swoistymi” wobec Cripto. Określenie, czy przeciwciało wiąże się swoiście z epitopem Cripto, można przeprowadzić przy użyciu jednego z szeregu testów, takiego jak chociażby dobrze znany test „Western-blot”. Do identyfikowania
PL 207 087 B1 komórek, które eksprymują Cripto, a także do modulowania aktywności wiązania ligandu/receptora przez Cripto, szczególnie użyteczne są przeciwciała, które wiążą się swoiście z zewnątrzkomórkowym epitopem białka Cripto (tj. z częścią białka Cripto, która wystaje ponad powierzchnię komórki).
W jednej postaci wynalazek dostarcza bezkomórkowej kompozycji obejmującej przeciwciała poliklonalne, w której przynajmniej jedno z przeciwciał jest przeciwciałem według wynalazku, swoistym wobec Cripto. Przykładem takiej kompozycji może być zwierzęca surowica odpornościowa, lub też kompozycja zawierająca frakcję przeciwciałową takiej surowicy, która została ponownie przeprowadzona w zawiesinę w wodzie lub innym rozcieńczalniku, zaróbce albo nośniku.
W innym wykonaniu wynalazek dostarcza przeciwciał monoklonalnych. Przeciwciała monoklonalne są wysoce specyficzne, gdyż są skierowane przeciwko pojedynczemu miejscu antygenowemu. Ponadto, w przeciwieństwie do preparatów poliklonalnych, które zazwyczaj zawierają różne przeciwciała skierowane przeciwko różnym epitopom, każde przeciwciało monoklonalne jest skierowane przeciwko pojedynczej determinancie na antygenie. Przeciwciała monoklonalne są użyteczne w przypadku zwiększania selektywności i swoistości testów diagnostycznych i analitycznych wykorzystujących wiązanie między przeciwciałem i antygenem. Inną zaletą przeciwciał monoklonalnych jest to, że produkowane są przez hodowlę hybrydomy, niezanieczyszczoną innymi immunoglobulinami.
W jeszcze innej pokrewnej postaci wynalazek dostarcza przeciwciała przeciwidiotypowego, swoistego wobec przeciwciała, które jest swoiste wobec Cripto. Bardziej szczegółowe omówienie zagadnienia przeciwciał przeciwidiotypowych można znaleźć w patentach USA nr 6 063 379 i 5 780 029.
Wiadomo dobrze, iż przeciwciała zawierają stosunkowo małe domeny wiążące antygen, które mogą być z nich wyizolowane chemicznie lub przy zastosowaniu technik rekombinacyjnych. Domeny takie są same w sobie użytecznymi cząsteczkami wiążącymi Cripto, a mogą być ponadto wprowadzane ponownie do przeciwciał ludzkich, lub mogą być poddawane fuzji z chemioterapeutykami lub polipeptydami. Tak więc w kolejnym z wykonań, wynalazek niniejszy dostarcza polipeptydu, obejmującego fragment przeciwciała swoistego wobec Cripto, który to fragment i związana z nim ewentualnie cząsteczka wiąże się z Cripto. Przykładowo, wynalazek niniejszy dostarcza też polipeptydów będących przeciwciałami jednołańcuchowymi oraz przeciwciałami powstałymi w wyniku przeszczepienia sekwencji CDR. Bardziej szczegółowe omówienie tej ostatniej grupy przeciwciał znaleźć można w patencie USA nr 5 859 205.
Przeciwciała zwierzęce mogą być poddane humanizacji sposobami znanymi w technice. Humanizowane przeciwciała są użyteczne w przypadku leczenia in vivo. Ponadto, syntetyzować można rekombinowane „humanizowane” przeciwciała. Humanizowane przeciwciała są przeciwciałami uzyskanymi początkowo od ssaka innego niż człowiek, w których przy użyciu techniki rekombinacji DNA zastąpiono niektóre lub wszystkie aminokwasy, które nie są wymagane do wiązania antygenu, aminokwasami z odpowiadających im regionów lekkiego lub ciężkiego łańcucha ludzkiej immunoglobuliny. Przeciwciała te są więc chimerami zawierającymi głównie sekwencje ludzkiej immunoglobuliny, w które wstawiono regiony odpowiedzialne za swoiste wiązanie antygenu (patrz np. zgłoszenie patentowe PCT WO 94/04679). Zwierzęta immunizuje się żądanym antygenem, izoluje się odpowiednie przeciwciała, a następnie wycina się sekwencje regionu zmiennego, odpowiedzialne za swoiste wiązanie antygenu. Pochodzące od zwierzęcia regiony wiążące antygen są następnie klonowane w odpowiedniej pozycji genów kodujących ludzkie przeciwciała, w których usunięto wcześniej regiony wiążące antygen. Humanizowane przeciwciała minimalizują użycie heterologicznych (międzygatunkowych) sekwencji w przeciwciałach wykorzystywanych do leczenia ludzi i obniżają w ten sposób ryzyko wywołania niepożądanych odpowiedzi odpornościowych. W podobny sposób można też produkować tzw. przeciwciała prymatyzowane, wykorzystując w tym przypadku geny kodujące przeciwciała naczelnych (np. rezusa, pawiana i szympansa). Następnie można wprowadzać kolejne zmiany w strukturze przeciwciał, modulując w ten sposób ich powinowactwo oraz immunogenność (patrz np. patenty USA nr 5 585 089, 5 693 761, 5 693 762 i 6 180 370).
Możliwe jest też zastosowanie ludzkich przeciwciał, które mogą być produkowane przez zwierzęta, takie jak np. zwierzęta transgeniczne posiadające jeden lub większą liczbę ludzkich transgenów immunoglobulinowych. Zwierzęta takie mogą być wykorzystane jako źródło limfocytów śledzionowych do produkcji hybrydoma, jak to opisano w patencie USA nr 5 569 825 oraz w zgłoszeniach WO 00076310, WO 00058499 oraz WO 00037504.
Modulowanie sygnału
Przeciwciała według niniejszego wynalazku wiążą się z Cripto i modulują szlak sygnałowy Cripto lub interakcje Cripto z innymi białkami. Nadekspresja aktywności Cripto może prowadzić do utraty
PL 207 087 B1 uzyskanego poprzednio stanu zróżnicowania komórkowego i przybierania stanu charakterystycznego dla komórek mezenchymalnych, do zwiększonej proliferacji oraz migracji komórek (Salomon i wsp., BioEssays, 21:61-70, 1999; Ciardiello i wsp., Oncogene, 9:291-298, 1994; oraz Baldassarre i wsp., Int. J. Cancer, 66:538-543, 1996), a także do fenotypów związanych z transformacją komórkową, obserwowaną w nowotworach.
Jednym ze sposobów testowania aktywności przeciwciał skierowanych przeciwko Cripto oraz ich zdolności do modulowania szlaku sygnałowego Cripto jest sposób wykorzystujący nokautową (KO) linię komórkową F9-Cripto (Minchiotti i wsp.. Mech. Dev., 90:133-142, 2000). Cripto stymuluje fosforylację smad2, a także aktywność czynnika transkrypcyjnego FAST w zarodkach Xenopus, która to aktywność może być monitorowana poprzez pomiary aktywności lucyferazy z reporterowego genu lucyferazy, znajdującego się pod kontrolą elementu regulacyjnego FAST (Saijoh i wsp., Mol. Cell, 5:35-47, 2000). Komórki z linii komórkowej F9-Cripto KO zawierają delecję w obrębie genu Cripto i w związku z tym nie wykazują aktywności Cripto, ani szlaku sygnałowego zależnego od Cripto (Minchiotti i wsp., Mech. Dev., 90:133-142, 2000). Aktywność szlaku sygnałowego Cripto można ocenić wprowadzając drogą transfekcji do komórek F9-Cripto KO geny Cripto, FAST, oraz konstrukt obejmujący element regulatorowy FAST i gen lucyferazy. W komórkach tych nie będzie można zaobserwować żadnej zależnej od Cripto aktywności FAST-lucyferazy, dopóki nie wprowadzi się do nich drogą transfekcji cDNA kodujących Cripto i FAST. Przeciwciała zdolne do blokowania zależnego od Cripto szlaku sygnałowego Nodal są przeciwciałami blokującymi funkcję szlaku sygnałowego Cripto.
Fachowcy mogą zastosować również inne testy nadające się do pomiaru aktywności Cripto, takie jak test obejmujący hodowlę na miękkim agarze (patrz Przykład 4 poniżej). Zdolność komórek do wzrostu w miękkim agarze jest związana z transformacją komórkową, a test ten jest klasycznym testem in vitro, stosowanym do pomiaru inhibicji wzrostu komórek nowotworowych. Inne testy użyteczne przy ocenianiu inhibicji aktywności obejmują testy in vitro na podłożu z tworzywa sztucznego, itp.
Zastosowania lecznicze
Przeciwciała według niniejszego wynalazku są także użyteczne dla celów leczniczych, takich jak modulowanie wzrostu komórek nowotworowych, dla celów diagnostycznych związanych z wykrywaniem i oceną ilościową Cripto, a także dla oczyszczania Cripto.
Przeciwciała zdolne są do swoistego wiązania się z Cripto oraz do modulowania szybkości wzrostu komórek nowotworowych u pacjenta. Komórki nowotworowe mogą być komórkami nowotworu jąder, sutka, okrężnicy, płuc, jajnika, pęcherza moczowego, macicy, szyjki macicy, trzustki oraz żołądka.
Przeciwciała mogą być zdolne do swoistego wiązania się z Cripto oraz do modulowania szybkości wzrostu komórek nowotworowych, które wykazują nadekspresję Cripto. Takimi komórkami nowotworowymi są linie komórek, wykazujących nadekspresję Cripto, takie jak linie komórkowe pochodzące z nowotworu sutka, jąder, okrężnicy, płuc, jajnika, pęcherza moczowego, macicy, szyjki macicy, trzustki oraz żołądka.
Przeciwciała skierowane przeciwko Cripto mogą być przesiewane pod kątem aktywności in vivo, jako potencjalne środki przeciwrakowe, do czego wykorzystać można standardowe protokoły stosowane przez fachowców, co przedstawiono poniżej w przykładzie 4. Przykłady takich protokołów są opracowane przez Narodowy Instytut Rakowy (NCI) w USA. Protokoły te („in vivo cancer models screening protocols”) opublikowane zostały przez NIH pod numerem 84-2635 (luty 1984).
Przeciwciała według wynalazku można stosować do leczenia pacjentów ze złośliwym nowotworem.
Przeciwciała według niniejszego wynalazku można łączyć z dopuszczalną farmaceutycznie zaróbką i podawane pacjentowi w skutecznej leczniczo dawce. Omówienie sposobów hamowania wzrostu nowotworu znaleźć można np. w patencie USA nr 6 165 464.
Sposoby leczenia osobników cierpiących na choroby związane z nieprawidłowym (tj. podwyższonym lub obniżonym) poziomem Cripto obejmują podawanie osobnikowi skutecznej dawki przeciwciała wiążącego się swoiście z epitopem Cripto, zlokalizowanym w domenie wiążącej ligand/receptor, co między innymi obejmuje epitopy zlokalizowane w domenie podobnej do domeny EGF oraz w domenie bogatej w cysteinę.
Sposoby leczenia osobników cierpiących na chorobę związaną z nieprawidłowym (tj. podwyższonym lub obniżonym) poziomem Cripto obejmują podanie osobnikowi skutecznej dawki przeciwciała tworzącego swoisty kompleks z Cripto i skierowanego przeciwko epitopowi rozpoznawanemu przez przeciwciało wybrane z grupy obejmującej A6C12.11, A6F8.6 (ATCC, nr dostępu PTA-3318), A7H1.19, A8F1.30, A8G3.5 (ATCC, nr dostępu PTA-3317), A8H3.1 (ATCC, nr dostępu PTA-3315), A8H3.2, A19A10.30, A10B2.18 (ATCC, nr dostępu PTA-3311), A27F6.1 (ATCC, nr dostępu PTA-3310),
PL 207 087 B1
A40G12.8 (ATCC, nr dostępu PTA-3316), A2D3.23, A7A10.29, A9G9.9, A15C12.10, A15E4.14, A17A2.16, A17C12.28, A17G12.1 (ATCC, nr dostępu PTA-3314), A17H6.1, A18B3.11 (ATCC, nr dostępu PTA-3312), A19E2.7, B3F6.17 (ATCC, nr dostępu PTA-3319), B6G7.10 (ATCC, nr dostępu PTA-3313).
Diagnozowanie oparte na detekcji Cripto można łatwo osiągnąć przy użyciu standardowych testów wiązania, z wykorzystaniem nowych przeciwciał według niniejszego wynalazku, co pozwoli fachowcom na swoiste wykrywanie obecności Cripto w rozmaitych próbkach, hodowlach, itp.
Możliwe są też zestawy, zawierające przeciwciało według wynalazku, przeznaczone do wykorzystania dla opisanych tu celów. W zasadzie, zestaw taki zawiera także kontrolny antygen, wobec którego dane przeciwciało wykazuje swoistość. Zestawy mogą zawierać wszystkie odczynniki oraz instrukcje ich użycia.
Dodatkowe cechy wynalazku staną się oczywiste w świetle przedstawionych poniżej przykładów.
P r z y k ł a d y
P r z y k ł a d 1: Ekspresja i oczyszczanie Cripto
Plazmid ekspresyjny, oznaczony jako pSGS480, skonstruowano poprzez subklonowanie cząsteczki cDNA, kodującej aminokwasy 1-169 ludzkiego Cripto [aminokwasy 1-169 w NR ID SEK:1] i poddanej fuzji z domeną Fc ludzkiej immunoglobuliny IgG1 (tj. „CR(del C)-Fc”), do wektora pEAG1100. Bardziej szczegółowy opis tego wektora znaleźć można w będącym jednocześnie w trakcie postępowania zgłoszeniu patentowym USA nr 60/233 148, złożonym 18 września 2000 r. Wektor pEAG1100 jest pochodną plazmidu pCMV-Sport-Betagal (GIBCO-BRL Life Technologies), którego zastosowanie do przejściowych transfekcji komórek CHO opisane zostało przez Schifferli i wsp., 1999, Focus, 21:16). Otrzymano go przez usunięcie fragmentu Notl, zawierającego gen reporterowy betagalaktozydazy, z plazmidu pCMV-Sport-Betagal (numer katalogowy 10586-014) w następujący sposób: Plazmid strawiono enzymami Notl i EcoRV, po czym izolowano z żelu, oczyszczano i poddawano ligacji fragment Notl o wielkości 4,38 kpz, zawierający podstawową część wektora. Zligowany DNA wykorzystano do transformacji kompetentnych bakterii E. coli DH5a. Wektor pEAG1100 wyizolowano z wyizolowanej pojedynczej kolonii jako plazmid zawierający żądany rekombinant. Ponadto, potwierdzono sekwencję tego plazmidu, obejmującą region promotora, polilinkera oraz sygnału terminacji transkrypcji.
Plazmid pSGS480 użyto do przejściowej transfekcji komórek CHO, po czym komórki te były hodowane przez 7 dni w temperaturze 28°C. Obecność białka CR(del C)-Fc w tych komórkach oraz w pożywce hodowlanej była testowana przy użyciu analizy Western-blot. W celu przeprowadzenia analizy Western-blot, pożywka hodowlana oraz komórki transfekowane Cripto poddawano SDS-PAGE w 4-20% żelu gradientowym w warunkach redukujących, po czym rozdzielone białka przenoszono na membrany nitrocelulozowe techniką elektroforezy i wykrywano białko fuzyjne Cripto przy użyciu król iczej surowicy odpornościowej skierowanej przeciwko 17-merowemu peptydowi Cripto (obejmującemu reszty 97-113 z NR ID SEK:1) sprzężonemu z hemocyjaniną ze skałoczepu. Analiza Western-blot przeprowadzona na pożywce pozostałej po odwirowaniu komórek wykazała, że białko CR(del C)-Fc było efektywnie wydzielane do pożywki hodowlanej (supernatantu). Supernatant ten nanoszono na sefarozę z białkiem A (Pharmacia), a związane białko eluowano przy użyciu 25 mM fosforanu sodu pH 2,8, 100 mM NaCl. Otrzymane białko zobojętniano 0,5 M fosforanem sodu pH 8,6 i analizowano pod kątem całkowitej obecności białka na podstawie pomiarów absorbancji przy długości fali 240-340 nm i pod kątem czystości preparatu metodą SDS-PAGE. Otrzymane białko sączono przez filtr o średnicy porów 0,2 μm i przechowywano w temperaturze -70°C.
P r z y k ł a d 2: Wytwarzanie i przesiewanie przeciwciał
Wyeluowane białko CR(del C)Fc wstrzykiwano myszom, po czym stosowano standardowe techniki produkcji hybrydoma, znane fachowcom, w celu otrzymania przeciwciał monoklonalnych.
A. Tworzenie przeciwciał
Samice myszy odmiany Robertsonian (Jackson Labs) immunizowano śródotrzewnowo przy użyciu 25 μg oczyszczonego ludzkiego CR del C-Fc z dodatkiem kompletnego adiuwanta Freunda (GibcoBRL #15721-012). Dawkę przypominającą, zawierającą 25 μg CR del C-Fc z dodatkiem niekompletnego adiuwanta Freunda (GibcoBRL #15720-014), podawano śródotrzewnowo dwukrotnie, i jeszcze raz perełkami z białkiem A. Surowice analizowano pod kątem obecności przeciwciał, a po trzech tygodniach od ostatniej dawki przypominającej (na trzy dni przed fuzją) podawano śródotrzewnowo kolejną dawkę przypominającą (50 μq rozpuszczalnego CR del C-Fc) myszy wykazującej najwyższe miano przeciwciał. Myszy tej podawano dożylnie następną dawkę przypominającą (50 μg CR
PL 207 087 B1 del C-Fc) w dzień poprzedzający fuzję. Limfocyty śledzionowe myszy poddawano fuzji z komórkami szpiczaka FL653 (przy stosunku limfocytów do komórek szpiczaka wynoszącym 1:6), a następnie wysiewano do studzienek 96-studzienkowej płytki z pożywką selekcyjną (przy gęstości wynoszącej 100 000, 33 000 i 11 000 komórek na studzienkę). Studzienki wykazujące wzrost były analizowane przy użyciu FACS i testu ELISA po upływie tygodnia. Wykonano dwie fuzje.
B. Przesiewanie przeciwciał
Supernatanty pochodzące z pierwszej i drugiej fuzji przesiewano w płytkowym teście ELISA pod kątem zdolności do rozpoznawania Cripto del C i/lub Cripto EGF-like (domeny podobnej do domeny EGF). Płytki pokrywano kontrolnym białkiem fuzyjnym (LT-beta receptor-Fc) w celu wyeliminowania przeciwciał monoklonalnych rozpoznających ludzki epitop Fc. Test ELISA przeprowadzano według opisu przedstawionego poniżej w części C. W przypadku pierwszej fuzji, pierwotne supernatanty były także przesiewane pod kątem zdolności do rozpoznawania powierzchniowego białka Cripto na komórkach nowotworowej linii komórkowej otrzymanej z nowotworu jąder (NCCIT) przy użyciu FACS. W przypadku drugiej fuzji, analizowano metodą FACS zdolność supernatantu do rozpoznawania Cripto na komórkach dwóch nowotworowych linii komórkowych, NCCIT oraz DU4475 (linii wywodzącej się z komórek raka sutka). Drugi przesiew obejmował testowanie przeciwciał monoklonalnych z supernatantu pod kątem zdolności do rozpoznawania powierzchniowego Cripto na panelu nowotworowych linii komórkowych (patrz wyniki w tabelach 1 i 2), pod kątem zdolności do rozpoznawania ludzkiego Cripto immunohistochemicznie na preparatach ludzkich tkanek nowotworowych z nowotworu sutka i okrężnicy, pod kątem zdolności do blokowania w teście szlaku sygnałowego Cripto-Nodal, pod kątem zdolności do blokowania wzrostu nowotworowych linii komórkowych na plastiku lub w miękkim agarze, oraz pod kątem zdolności do internalizacji Cripto z powierzchni komórkowej.
C. ELISA
Testy ELISA przeprowadzano w następujący sposób:
Materiały:
Płytki: Płytki silnie wiążące Easy-wash 96W z Costar (nr kat. 07-200-642)
Przeciwciało 2': Kozie przeciwciało anti-Ms IgG (H+L)-HRP (Pierce, nr kat. P131430)
Substrat: Zestaw TMB (Pierce, nr kat. 34021)
Roztwór zatrzymujący reakcję barwną: 1 N H2SO4
Bufory:
Bufor wiążący: 0,1 M NaHPO4 pH 9,0
Bufor blokujący: PBS + 10% surowica (Donor Calf Serum)
Bufor do płukania: PBS + 0,1% tween-20
Antygeny CR-del-C-Fc i CR-EGF-Fc oraz kontrolne białko fuzyjne zawierające ludzką immunoglobulinę IgG1 rozcieńczono w buforze wiążącym do 500 ng/ml. Do każdej studzienki dodawano 100 μΐ i inkubowano przez godzinę w temperaturze 37°C lub przez noc w temperaturze 4°C. Następnie płyn dekantowano, a płytkę odwracano i suszono bibułą. Dodawano 250 μΐ buforu blokującego na studzienkę, po czym inkubowano przez 30 minut w temperaturze 37°C. Następnie ponownie usuwano płyn, odwracano płytkę i suszono bibułą. Supernatanty rozcieńczano 1:50 buforem do płukania, po czym wysiewano w ilości 50 μl/studzienkę i inkubowano przez godzinę w temperaturze pokojowej. Płytki przemywano intensywnie (trzykrotnie) przy użyciu 250 μl buforu do płukania na studzienkę. Następnie dodawano do studzienek po 100 μl przeciwciała drugorzędowego (2') rozcieńczonego 1:10 000 buforem do płukania. Po 30 minutach inkubacji w temperaturze pokojowej płukano płytki intensywnie (trzykrotnie) przy użyciu 250 μl buforu do płukania na studzienkę, po czym dodawano po 100 μΐ substratu na studzienkę. Pozwalano na rozwinięcie reakcji barwnej do momentu otrzymania wystarczająco ciemnej barwy, po czym dodawano do studzienek po 100 μl buforu zatrzymującego reakcję barwną i odczytywano absorbancję przy 450 nm.
D. Cytometria przepływowa
Linie komórkowe wykazujące ekspresję Cripto można zastosować do testowania przeciwciał monoklonalnych pod kątem ich zdolności do wiązania Cripto. Osiągnąć to można przy użyciu barwienia powierzchni komórek i analizy z wykorzystaniem cytometrii przepływowej, w następujący sposób:
Uwolnić komórki hodowane w kolbach hodowlanych T162, dodając do nich 2 ml buforu PBS zawierającego 5 mM EDTA i inkubując je przez 10 minut w temperaturze 37°C. Dodać pożywkę z surowicą (do końcowej objętości 20 ml) i rozbić skupiska komórek poprzez kilkukrotne pipetowanie. Wirować przez 5 minut z prędkością 1200 obrotów na minutę. Przemyć komórki 5-10 ml buforu do płukania (0,1% BSA w PBS) o temperaturze 4°C. Wirować przez 5 minut przy 1200 obrotach na
PL 207 087 B1 minutę, przeprowadzić ponownie komórki w zawiesinę w buforze do płukania, tak aby osiągnąć gęstość 4 x 106-107/ml. Trzymać zawiesinę w lodzie.
Przygotować przeciwciała do barwienia. Oczyszczone przeciwciała rozcieńcza się buforem do płukania do 1-10 μg/ml. Dodać po 50 μΐ zawiesiny komórek do studzienek 96-studzienkowej płytki Linbro z dnem w kształcie litery V (ICN 7632105). Przeznaczyć po jednej studzience z komórkami na każdą z kontroli planowanych dla każdej analizowanej linii komórkowej, obejmujących komórki bez dodanych przeciwciał, tylko z przeciwciałem 2', pożywka dla hybrydomy, supernatantu z pozytywnej kontroli dla przeciwciał (jeśli jest dostępny) lub oczyszczone przeciwciała, oraz kontrole dla danej podklasy IgG (jeśli stosowane są oczyszczone przeciwciała).
Przeznaczyć po jednej studzience z komórkami na każdą doświadczalną próbkę odpowiadającą analizowanej linii komórkowej. Wirować płytkę przez 5 minut przy prędkości 1200 obrotów na minutę w temperaturze 4°C. Odwrócić płytkę i zasadniczo w całości usunąć bufor ze studzienek poprzez potrząsanie. Dodać do studzienek po 40-50 μΐ przeciwciał (lub buforu do płukania w przypadku studzienki kontrolnej bez przeciwciał oraz tylko z przeciwciałem 2'). Po inkubacji w temperaturze 4°C, trwającej od 30 minut do 1 godziny, wirować przez 5 minut przy 1200 obrotach na minutę. Wytrząsnąć roztwór z przeciwciałami i przemyć studzienki dwukrotnie przy użyciu 200 μΐ buforu do płukania na studzienkę, z wirowaniem po każdym płukaniu. Wytrząsnąć bufor.
Komórki w każdej studzience przeprowadzić ponownie w zawiesinę w 50 μΐ buforu do płukania, zawierającego kozie przeciwciało (IgG) swoiste wobec mysiego regionu Fc i znakowane R-PE (Jackson Immunoresearch Laboratories, nr kat. 115-116-071) w rozcieńczeniu 1:200. Po 20 minutach inkubacji w ciemności w temperaturze 4°C dodać do komórek w każdej studzience po 150 μl buforu do płukania i wirować płytkę przez 5 minut przy 1200 obrotach na minutę. Przepłukać komórki 200 μΐ buforu do płukania i przeprowadzić je ponownie w zawiesinę w 150 μΐ 1% PFA w PBS. Przenieść zawartość każdej studzienki do oddzielnej probówki (okrągłodenne 5 ml probówki polistyrenowe - Falcon, nr kat. 352052). Owinąć probówki folią cynową.
Zawartość probówek analizuje się metodą cytometrii przepływowej.
Wyniki dwóch testów przesiewowych dla przeciwciał monoklonalnych, otrzymane przy użyciu niniejszego sposobu, podano w tabelach 1 i 2, przedstawionych poniżej, przy czym w pierwszej kolumnie podano przypisane nazwy podklonów hybrydoma, następne dwie kolumny przedstawiają wyniki testu przesiewowego ELISA, natomiast pozostałe kolumny przedstawiają wyniki cytometrii przepływowej dla czterech linii komórkowych, wykazujących ekspresję Cripto. Wyniki podano w jednostkach średniego wskaźnika fluorescencji (MFI).
T a b e l a 1. Charakterystyka przeciwciał monoklonalnych skierowanych przeciwko Cripto
Podklon hybrydomy Nr depozytu w ATCC ELISA Supernat. Cripto delC ELISA Supernat. Cripto domena EGFpodobna DU4475 MFI NCCIT MFI GEO MFI HT3 MFI
1 2 3 4 5 6 7 8
Kontrola dla ELISA 0,06 0,07
Kontrola-mysia Ig 14 9 37 18
A6C12.11 2,21 0,07 11 35 29 8
A6F8.6 PTA-3318 2,32 0,08 11 50 29 10
A7H1.19 2,14 0,09 14 34 27 12
A8F1.30 2,15 0,1 17 27 32 28
A8G3.5 PTA-3317 2,39 0,09 9 30 25 15
A8H3.1 PTA-3315 2,4 1,7 9 44 23 10
A8H3.2 2,54 0,07 13 13 16 14
PL 207 087 B1 ciąg dalszy tabeli 1
1 2 3 4 5 6 7 8
A19A10.30 2,02 0,09 9 40 20 10
A10B2.18 PTA-3311 2,36 0,07 40 63 100 43
A27F6.1 PTA-3310 2,28 1,19 9 44 26 17
A40G12.8 PTA-3316 2,27 1,59 10 47 26 16
T a b e l a 2. Charakterystyka przeciwciał monoklonalnych skierowanych przeciwko Cripto
Podklon hybrydomy Nr depozytu w ATCC ELISA Supernat. Cripto delC ELISA Supernat. Cripto domena EGF-podobna DU4475 MFI NCCIT MFI GEO MFI HT3 MFI
Kontrola dla ELISA 0,05 0,05
Kontrola- mysia Ig 10 6 4 6
A2D3.23 0,93 0,90 73 138 37 27
A7A10.29 1,37 0,07 75 83 33 83
A9G9.9 1,39 0,07 52 62 32 82
A15C12.10 1,42 0,06 46 55 25 93
A15E4.14 1,38 0,06 50 63 23 95
A17A2.16 1,40 0,06 76 97 41 81
A17C12.28 0,96 0,97 6 16 3 22
A17G12.1 PTA-3314 1,30 1,37 61 66 28 78
A17H6.1 1,38 0,05 35 30 5 28
A18B3.11 PTA-3312 1,36 1,38 50 42 33 65
A19E2.7 1,40 0,06 53 59 26 99
B3F6.17 PTA-3319 1,37 0,06 77 51 39 89
B6G7.10 PTA-3313 1,38 1,40 28 22 22 56
B11H8.4 1,41 0,06 59 101 39 107
B12C12.5 1,10 1,04 27 14 23 59
B15A2.6 1,40 0,06 36 44 22 59
C4A2.16 1,40 0,06 24 36 22 65
P r z y k ł a d 3: Test hamowania szlaku sygnałowego Cripto wykorzystujący komórki Null Poniżej przedstawiono opis testu hamowania szlaku sygnałowego Cripto z wykorzystaniem komórek F9 Cripto Null.
Dzień 0. Pokryć 6-studzienkowe płytki roztworem 0,1% żelatyny (2 ml/studzienkę) przez 15 mi5 nut w temperaturze 37°C. Wysiać komórki F9 CRIPTO NULL, tak aby otrzymać liczbę 6 x 105 komórek na studzienkę.
Dzień 2. Transfekcja: Każdą z przedstawionych poniżej próbek dodaje się do 300 μΐ pożywki OptiMem1, tak aby otrzymać roztwór A dla każdej próbki.
Próbka 1: 0,5 μg reporterowego cDNA dla (N2)7 lucyferazy-FAST oraz 1,5 μg cDNA pustego wektora.
Próbka 2: 0,5 μg cDNA (N2)7 lucyferazy, 0,5 μg FAST oraz 1 μg cDNA pustego wektora.
Próbka 3: 0,5 μg cDNA (N2)7 lucyferazy, 0,5 μg Cripto, 0,5 μg FAST oraz 0,5 μg cDNA pustego wektora.
Próbka 4: 0,5 μg cDNA (N2)7 lucyferazy, 0,5 μg Cripto, 0,5 μg FAST oraz 0,5 μg cDNA pustego wektora.
PL 207 087 B1
Próbka 5: 0,5 μg cDNA (N2)7 lucyferazy, 0,5 μg Cripto, 0,5 μg FAST oraz 0,5 μg cDNA pustego wektora.
Próbka 6: 0,5 μg cDNA (N2)7 lucyferazy, 0,5 μg Cripto, 0,5 μg FAST oraz 0,5 μg cDNA pustego wektora.
Próbka 7: 0,5 μg cDNA (N2)7 lucyferazy, 0,5 μg Cripto, 0,5 μg FAST oraz 0,5 μg cDNA pustego wektora.
Próbka 8: 0,5 μg cDNA (N2)7 lucyferazy, 0,5 μg Cripto, 0,5 μg FAST oraz 0,5 μg cDNA pustego wektora.
Próbka 9: 0,5 μg cDNA (N2)7 lucyferazy, 0,5 μg Cripto, 0,5 μg FAST oraz 0,5 μg cDNA pustego wektora.
Roztwór B zawiera 30 μl lipofektaminy oraz 270 μΐ pożywki OptiMem1.
Dla każdej próbki zmieszać roztwór A z roztworem B. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 45 minut. Przemyć studzienki 2 ml pożywki OptiMem1. Odessać tuż przed następnym etapem.
Do każdej mieszaniny roztworów A i B dodać 2,4 ml OptiMem1, wymieszać i dodać po 1,5 ml do studzienki, tak aby otrzymać duplikat każdej próbki. Po 5 godzinach inkubacji w temperaturze 37°C dodać do wszystkich studzienek, które otrzymały próbki 1-3, po 1,5 ml pożywki DMEM zawierającej 20% FCS, 2 mM Gln oraz P/S (penicylinę/streptomycynę). Dodać przeciwciała przeciwko Cripto w następujący sposób: A27F6.1 (10 μg/ml) do studzienek z próbką 4; A27F6.1 (2 μg/ml) do studzienek z próbką 5, A40G12.8 (10 μg/ml) do studzienek z próbką 6; A40G12.8 (2 μg/ml) do studzienek z próbką 7, A10B12.18 (10 μg/ml) do studzienek z próbką 8; A10B12.18 (2 μg/ml) do studzienek z próbką 9.
Dzień 2. Usunąć pożywki i przepłukać komórki PBS (2 ml/studzienkę). Dodać DMEM z 0,5% FCS, 2 mM Gln, P/S oraz taką samą ilość przeciwciał przeciwko Cripto jak poprzedniego dnia (do tych samych studzienek).
Dzień 3. Wywołać sygnał lucyferazy. Przepłukać komórki buforem PBS z Ca2+ i Mg2+ (2 ml/studzienkę). Zastosować zestaw LucLite (Packard, nr kat. 6016911). Doprowadzić bufor i substrat do temperatury pokojowej. Przyciemnić światło. Ponownie roztworzyć substrat w 10 ml buforu i rozcieńczyć 1:1 buforem PBS z Ca2+ i Mg2+. Odessać płyn ze studzienek i dodać do nich szybko po 250 μl rozcieńczonego substratu przy użyciu powtarzalnego pipetora. Zamieszać roztwór i przenieść po 200 μl do studzienek 96-studzienkowej płytki o białym nieprzezroczystym dnie (Falcon, 35-3296). Odczytać wynik w luminometrze przy użyciu oprogramowania Winglow, eksportując dane do programu Excel.
Wyniki tego testu podsumowano poniżej w tabeli 3.
T a b e l a 3. Test szlaku sygnałowego Cripto. Inhibicja przy użyciu przeciwciał monoklonalnych skierowanych przeciwko Cripto.
cDNA użyty do transfekcji Przeciwciało przeciwko Cripto Względne jednostki luminescencji
(N2)7 brak 123
(N2)7, FAST brak 259
(N2)7, FAST, Cripto brak 3091
(N2)7, FAST, Cripto A27F6.1 (10 pg/ml) 1507
(N2)7, FAST, Cripto A27F6.1 (2 pg/ml) 2297
(N2)7, FAST, Cripto A40G12.8 (10 pg/ml) 1213
(N2)7, FAST, Cripto A40G12.8(2 pg/ml) 2626
(N2)7, FAST, Cripto A10B2.18 (10 pg/ml) 3466
(N2)7, FAST, Cripto A10B2.18 (2 pg/ml) 3103
P r z y k ł a d 4: Test na inhibicję wzrostu komórek nowotworowych in vitro
Inhibicję szlaku sygnałowego Cripto można również badać mierząc szybkość wzrostu komórek
GEO w miękkim agarze (patrz Ciardiello i wsp., 1994, Oncogene, 9(1):291-298; Ciardiello i wsp., 1991, Cancer Res, 51 (3): 1051-1054.
PL 207 087 B1
Najpierw stopić 3% baktoagaru i trzymać w łaźni wodnej w temperaturze 42°C. Następnie zmieszać
3% baktoagaru z podgrzaną wcześniej kompletną pożywką, tak aby otrzymać 0,6% roztwór baktoagaru, który trzymać w temperaturze 42°C. Wylać po 4 ml roztworu na płytki 6 cm i pozostawić do ostygnięcia przez przynajmniej 30 minut, tworząc w ten sposób dolną warstwę agaru. Poddać komórki GEO 5 trypsynizacji i przeprowadzić ponownie w zawiesinę w kompletnej pożywce do osiągnięcia 105 komórek/ml. Do zawiesiny komórek dodać przeciwciała poddawane analizie lub kontrole, tak aby otrzymać serię rozcieńczeń w zakresie od 20 do 1 μg/ml. Zmieszać równe objętości zawiesiny komórek GEO oraz 0,6% baktoagaru i wylać 2 ml tej mieszaniny na spodnią warstwę agaru. Pozostawić do ostygnięcia przez przynajmniej 1 godzinę, a następnie inkubować przez 14 dni w temperaturze 37°C w inkubatorze CO2. Zliczyć kolonie, które są widoczne bez użycia mikroskopu. Zmniejszenie liczby kolonii (w porównaniu do negatywnej kontroli) wskazuje na to, że testowane przeciwciało hamuje wzrost komórek nowotworowych in vitro.
Przy użyciu tego testu otrzymano wyniki dla przeciwciał ) A27F6.1 oraz B6G7.10, przedstawione w Tabeli 4. Oba testowane przeciwciała wykazywały zdolność do hamowania wzrostu kolonii komórek GEO.
T a b e l a 4. Wyniki testu wzrostu w miękkim agarze
Przeciwciało Średnia liczba kolonii
brak 109,0
brak 104,3
A27F6.1 (20 pg/ml) 82,0
A27F6.1 (10 pg/ml) 78,3
A27F6.1 (5 pg/ml) 79,0
A27F6.1 (1 pg/mI) 108,7
B6G7.10 (20 pg/ml) 102,3
B6G7.10(10 pg/ml) 71,7
P r z y k ł a d 5: Test na hamowanie wzrostu komórek nowotworowych in vivo
W celu dokonania oceny hamowania wzrostu komórek nowotworowych, pozbawionym grasicy nagim myszom wszczepiano podskórnie ludzką linię komórek nowotworowych, po czym obserwowano wpływ przeciwciał według wynalazku (podawanych równocześnie z chemioterapeutykami lub bez, tak aby ocenić ewentualny synergistyczny lub addytywny wpływ na hamowanie nowotworu).
Test ten można wykonać alternatywnie przy użyciu innych nowotworowych linii komórkowych, takich jak np. GEO (dobrze zróżnicowana ludzka linia komórkowa wywodząca się z komórek raka okrężnicy, otrzymana z ATCC), DU-4475 (linia komórek nowotworowych z raka sutka, otrzymana z ATCC), NCCIT (linia komórkowa wywodząca się z nowotworu jąder, otrzymana z ATCC), lub też inne znane linie komórkowe. Jeden z przykładów tego testu jest następujący:
Zwierzęta są indywidualnie oznaczone poprzez przekłucie uszu. Linia komórkowa GEO jest utrzymywana in vitro lub in vivo przez 1 do 4 pasaże. Komórki GEO wszczepia się myszom podskórnie na prawym boku. Można zastosować następujące grupy zwierząt:
Nr grupy Leczenie Liczba myszy
1. Kontrola z solą fizjologiczną, 0,2 ml/mysz, śródotrzewnowo, trzy razy w tygodniu (pon., śr., piąt.) 20
2. mAb, mała dawka, śródotrzewnowo 10
3. mAb, średnia dawka, śródotrzewnowo 10
4. mAb, duża dawka, śródotrzewnowo 10
5. 5-FU, 30 mg/kg/iniekcja, śródotrzewnowo, trzy razy w tygodniu (pon., śr., piąt.) 10
6. Cis-platyna, 2 mg/kg/iniekcja, podskórnie, trzy razy w tygodniu (pon., śr., piąt.) 10
7. Adriamycyna, 1,6 mg/kg/iniekcja, śródotrzewnowo, trzy razy w tygodniu (pon., śr., piąt.) 10
8. Irinotecan, 10 mg/kg/iniekcja, śródotrzewnowo, pięć razy w tygodniu 10 (od pon. do piąt.)
PL 207 087 B1
9. mAb, mała dawka, śródotrzewnowo + 5-FU (pośrednia dawka) 10
10. mAb, średnia dawka, śródotrzewnowo + 5-FU (pośrednia dawka) 10
11. mAb, duża dawka, śródotrzewnowo + 5-FU (pośrednia dawka) 10
12. mAb, mała dawka, śródotrzewnowo + Cis-platyna (pośrednia dawka) 10
13. mAb, średnia dawka, śródotrzewnowo + Cis-platyna (pośrednia dawka) 10
14. mAb, duża dawka, śródotrzewnowo + Cis-platyna (pośrednia dawka) 10
15. mAb, mała dawka, śródotrzewnowo + Adriamycyna (pośrednia dawka) 10
16. mAb, średnia dawka, śródotrzewnowo + Adriamycyna (pośrednia dawka) 10
17. mAb, duża dawka, śródotrzewnowo + Adriamycyna (pośrednia dawka) 10
18. mAb, mała dawka, śródotrzewnowo + Irinotecan (pośrednia dawka) 10
19. mAb, średnia dawka, śródotrzewnowo + Irinotecan (pośrednia dawka) 10
20. mAb, duża dawka, śródotrzewnowo + Irinotecan (pośrednia dawka) 10
Dzień 0: Wszczepić nowotwór, zarejestrować początkową masę zwierząt.
Dzień 1: Rozpocząć leczenie według powyższego schematu.
Dzień 5: Rozpocząć pomiary wielkości nowotworu oraz masy ciała i kontynuować je dwa razy tygodniowo aż do momentu zakończenia doświadczenia.
W celu dokonania analizy ekspresji Cripto, wzrostu nowotworu i jego inhibicji dokonuje się pomiarów początkowej masy ciała, a następnych pomiarów wielkości nowotworu oraz masy ciała, a także przeprowadza się analizę histologiczną i immunohistochemiczną tkanki nowotworowej po uśmierceniu myszy.
P r z y k ł a d 6: Model nowotworowy in vivo z wykorzystaniem heterologicznego przeszczepu Przeciwciało blokujące Cripto, skierowane przeciwko domenie bogatej w cysteinę
W celu dokonania oceny odpowiedzi linii komórkowej NCCIT, tą ludzką nowotworową linię komórkową wywodzącą się z nowotworu jąder wszczepiono podskórnie razem z przeciwciałem, które wiąże się z domeną Cripto bogatą w cysteinę. Poniżej zaprezentowano schemat doświadczenia, którego wyniki przedstawiono w figurze 1.
Sposoby i materiały
Zwierzęta: Wykorzystano pozbawione grasicy nagie samce myszy. Zwierzęta te były indywidualnie oznaczone poprzez przekłucie uszu.
Nowotwór: NNCIT, ludzka linia komórkowa, hodowana in vitro i wywodząca się z raka jąder, oryginalnie otrzymana American Tissue Type Collection. Linię tę pasażowano in vitro sześciokrotnie, hodując ją w pożywce RPMI-1640/10% FBS bez antybiotyków. Zwierzętom wszczepiano podskórnie (do ich prawego boku) 5 x 106 komórek/0,2 ml matrigelu.
Nr grupy Leczenie Liczba myszy
1. Kontrola nośnika, (25 mM fosforan sodu, 100 mM 20 chlorek sodu, pH 7,2), 0,2 ml na mysz, śródotrzewnowo, Q14D
Leczenie rozpoczęte w dniu -1
2. A8G3.5, 1 mg/kg/iniekcja, śródotrzewnowo, Q14D 10
Leczenie rozpoczęte w dniu -1
3. A8G3.5, 3 mg/kg/iniekcja, śródotrzewnowo, Q14D 10
Leczenie rozpoczęte w dniu -1
4. A8G3.5, 10 mg/kg/iniekcja, śródotrzewnowo, Q14D 10
Leczenie rozpoczęte w dniu -1
5. Cis-platyna, 2 mg/kg/iniekcja, podskórnie, 10 trzy razy w tygodniu (pon., śr., piąt.) - łącznie 6 zabiegów Leczenie rozpoczęte w dniu 1
Procedura leczenia
Dzień -1: Losowy przydział myszy do grup kontrolnych i doświadczalnych. Rejestracja początkowej masy ciała zwierząt. Rozpoczęcie leczenia dla grup antybiotykowych. Dozowanie poszczególnych roztworów. Podział na grupy otrzymujące poszczególne formy leczenia był utajniony dla techników do momentu zakończenia doświadczenia.
Dzień 0: Wszczepienie komórek nowotworowych. Prowadzenie hodowli bakterii na nowotworze wszczepionym myszom.
Dzień 1: Rozpoczęcie leczenia pozytywnej grupy kontrolnej leczonej chemioterapeutycznie.
PL 207 087 B1
Dzień 4: Rejestracja pierwszego pomiaru wielkości nowotworu w odniesieniu do linii podstawowej na matrigelu. Kontynuowanie (2 razy w tygodniu) pomiaru wielkości nowotworu oraz masy ciała przez następny okres. Codzienne monitorowanie badania i notowanie wszelkich nietypowych obserwacji w odniesieniu do zwierząt.
Wyniki końcowe: Początkowa masa ciała. Wyniki pomiarów wielkości nowotworu i masy ciała.
P r z y k ł a d 7: Model nowotworowy in vivo z wykorzystaniem heterologicznego przeszczepu Przeciwciało blokujące Cripto, skierowane przeciwko domenie podobnej do domeny EGF,
W celu dokonania oceny odpowiedzi linii komórkowej NCCIT, tą ludzką nowotworową linię komórkową wywodzącą się z nowotworu jąder wszczepiono podskórnie razem z przeciwciałem, które wiąże się z domeną Cripto podobną do domeny EGF. Poniżej zaprezentowano schemat doświadczenia, którego wyniki przedstawiono w figurze 2.
Sposoby i materiały
Zwierzęta: Wykorzystano pozbawione grasicy nagie samce myszy. Zwierzęta te były indywidualnie oznaczone poprzez przekłucie uszu.
Nowotwór: NNCIT, ludzka linia komórkowa, hodowana in vitro i wywodząca się z raka jąder, była otrzymana z American Tissue Type Collection. Linię tę pasażowano in vitro ośmiokrotnie, hodując ją w pożywce RPMI-1640/10% FBS bez antybiotyków. Zwierzętom wszczepiano podskórnie (na ich prawym boku) 5 x 106 komórek/0,2 ml matrigelu.
Nr grupy Leczenie Liczba myszy
1. Kontrola nośnika, (25 mM fosforan sodu, 100 mM 18 chlorek sodu, pH 7,2), 0,2 ml na mysz, śródotrzewnowo, Q14D Leczenie rozpoczęte w dniu -1
2. A27F6.1, 1 mg/kg/iniekcja, śródotrzewnowo, Q14D 10
Leczenie rozpoczęte w dniu -1 z zastosowaniem dawki 2,6 mg/kg/mysz
3. A27F6.1, 10 mg/kg/iniekcja, śródotrzewnowo, Q14D 10
Leczenie rozpoczęte w dniu -1 z zastosowaniem dawki 21,2 mg/kg/mysz
4. Cis-platyna, 2 mg/kg/iniekcja, podskórnie, 10 trzy razy w tygodniu (pon., śr., piąt.) - łącznie 6 zabiegów
Leczenie rozpoczęte w dniu 1
Procedura leczenia
Dzień -1: Losowy przydział myszy do grup kontrolnych i doświadczalnych. Rejestracja początkowej masy ciała zwierząt. Rozpoczęcie leczenia dla grup antybiotykowych. Dozowanie poszczególnych roztworów. Podział na grupy otrzymujące poszczególne formy leczenia był utajniony dla techników do momentu zakończenia doświadczenia.
Dzień 0: Wszczepienie komórek nowotworowych. Prowadzenie hodowli bakterii na nowotworze wszczepionym myszom. Hodowle bakteryjne nie wykazywały zakażenia po upływie 24 i 48 godzin po pobraniu próbki.
Dzień 1: Rozpoczęcie leczenia pozytywnej grupy kontrolnej leczonej chemioterapeutycznie.
Dzień 4: Rejestracja pierwszego pomiaru wielkości nowotworu w odniesieniu do linii podstawowej na matrigelu. Kontynuowanie (2 razy w tygodniu) pomiaru wielkości nowotworu oraz masy ciała przez następny okres. Codzienne monitorowanie badania i notowanie wszelkich nietypowych obserwacji w odniesieniu do zwierząt.
Wyniki końcowe: Początkowa masa ciała. Wyniki pomiarów wielkości nowotworu i masy ciała.
P r z y k ł a d 8: Przeciwciała monoklonalne przeciwko Cripto, które blokują wiązanie ALK4
W celu zbadania, czy przeciwciała monoklonalne swoiste wobec Cripto mogą zakłócać zdolność Cripto do wiązania Alk4, receptora aktywiny typu I, wykonano analizę z wykorzystaniem cytometrii przepływowej z użyciem linii komórkowej 293, wykazującej stabilną ekspresję Alk4. W celu otrzymania tej linii przeprowadzono kotransfekcję komórek 293 plazmidem eksprymującym białko Alk4, znakowane epitopem HA na C-końcu, oraz plazmidem eksprymującym lek, puromycynę, w stosunku 10 : 1. Transfekowane komórki selekcjonowano następnie w podłożu zawierającym puromycynę, do momentu powstania kolonii. Komórki następnie wyjęto, ekspandowano i zanalizowano pod kątem ekspresji Alk4 drogą analizy Western-blot (z przeciwciałami skierowanymi przeciwko HA). Stwierdzono,
PL 207 087 B1 że klon 21 (293-Alk4-21) wykazywał wysoki poziom ekspresji Alk4, w porównaniu do kontrolnych komórek 293, niepoddanych transfekcji.
Do analizy wiązania Cripto-Alk4 metodą cytometrii przepływowej zastosowano oczyszczoną rozpuszczalną postać ludzkiego Cripto (aminokwasy 1-169) poddaną fuzji z częścią Fc ludzkiej IgG 5 (CrdelC-Fc). Około 5 μg/ml CrdelC-Fc lub kontrolnego białka Fc inkubowano na lodzie z 3 x 10 komórek 293-Alk4-21 przez 30 minut w końcowej objętości 50 μl buforu do FACS (0,1% BSA w PBS). W przypadku próbek zawierających przeciwciała przeciwko Cripto białko CrdelC-Fc (5 μg/ml) preinkubowano na lodzie z każdym spośród testowanych przeciwciał przeciwko Cripto (A10.B2.18, A40.G12.8, A27.F6.1, A8.H3.1, A19.A10.30, A6.F8.6, A8.G3.5, A6.C12.11) (50 pg/ml), przed dodaniem komórek. Komórki przemyto następnie buforem do FACS, a związane białko Fc wykrywano inkubując komórki ze sprzężonym z R-fikoeryteryną kozim przeciwciałem skierowanym przeciwko ludzkiej IgG (wykazującym swoistość wobec fragmentu Fc), uzyskanym z Jackson Immunologics. Próbki następnie ponownie przemywano, utrwalano w 1% paraformaldehydzie w PBS i analizowane przy zastosowaniu standardowych procedur cytometrii przepływowej. Wyniki analizy FACS przedstawiono w figurze 3.
PL 207 087 B1
LISTA SEKWENCJI <110> Biogen, Inc.
Sanicola-Nadel, Michele Williams, Kevin Schiffer, Susan Rayhorn, Paul
<;120> Przeciwciała blokujące białko Cripto oraz ich zastosowanie
<130> Al 17 PCT
<140> jeszcze nie nadano
<141> 2002-04-16
<150> 60/286,782
<151> 2001-04-26
<150> 60/293,020
<151> 2001-05-17
<150> 60/301,091
<151> 2001-06-26
<150> 60/367,002
<151> 2002-03-22
<160> 2
<170> FastSEQ for Windows Version 4 , 0
<210> 1 <211> 188 <212> PRT <213> Homo Sapiens <4G0> 1
Met Asp Cys Arg Lys Met Ala Arg Phe Ser Tyr Ser Val Ile Trp Ile
1 5 10 15
Met Ala Ile Ser Lys Val Phe Glu Leu Gly Leu Val Ala Gly Leu Gly
20 25 30
His Gin Glu Phe Ala Arg Pro Ser Arg Gly Tyr Leu Ala Phe Arg Asp
35 40 45
Asp Ser Ile Trp Pro Gin Glu Glu Pro Ala Ile Arg Pro Arg Ser Ser
50 55 60
Gin Arg Val Pro Pro Met Gly Ile Gin His Ser Lys Glu Leu Asn Arg
65 70 75 80
Thr Cys Cys Leu Asn Gly Gly Thr Cys Met Leu Gly Ser Phe Cys Ala
85 90 95
Cys Pro Pro Ser Phe Tyr Gly Arg Asn Cys Glu His Asp val Arg Lys
100 105 110
Glu Asn Cys Gly Ser Val Pro His Asp Thr Trp Leu Pro Lys Lys Cys
115 120 125
Ser Leu Cys Lys Cys Trp His Gly Gin Leu Arg Cys Phe Pro Gin Ala
130 135 140
PL 207 087 B1
Phe Leu Pro Gly Cys Asp Gly Leu Val Met Asp Glu His Leu Val Ala
145 150 155 160
Ser Arg Thr Pro Glu Leu Pro Pro Ser Ala Arg Thr Thr Thr Phe Met
165 170 175
Leu Val Gly Ile Cys Leu Ser Ile Gin Ser Tyr Tyr
180 185 <210> 2 <211> 188 <212> PRT <213> Homo Sapiens <400> 2
Met Asp Cys Arg Lys Met Val Arg Phe Ser Tyr Ser Val Ile Trp Ile
1 5 10 15
Met Ala Ile Ser Lys Ala Phe Glu Leu Gly Leu Val Ala Gly Leu Gly
20 25 30
His Gin Glu Phe Ala Arg Pro Ser Arg Gly Asp Leu Ala Phe Arg Asp
35 40 45
Asp Ser Ile Trp Pro Gin Glu Glu Pro Ala Ile Arg Pro Arg Ser Ser
50 55 60
Gin Arg Val Leu Pro Met Gly Ile Gin His Ser Lys Glu Leu Asn Arg
65 70 75 80
Thr Cys Cys Leu Asn Gly Gly Thr Cys Met Leu Glu Ser Phe Cys Ala
85 90 95
Cys Pro Pro Ser Phe Tyr Gly Arg Asn Cys Glu His Asp Val Arg Lys
100 105 110
Glu Asn Cys Gly Ser Val Pro His Asp Thr Trp Leu Pro Lys Lys Cys
115 120 125
Ser Leu Cys Lys Cys Trp His Gly Gin Leu Arg Cys Phe Pro Gin Ala
130 135 140
Phe Leu Pro Gly Cys Asp Gly Leu Val Met Asp Glu His Leu Val Ala
145 150 155 160
Ser Arg Thr Pro Glu Leu Pro Pro Ser Ala Arg Thr Thr Thr Phe Met
165 170 175
Leu Al a Gly Ile Cys Leu Ser Ile Gin Ser Tyr Tyr
180 185

Claims (24)

  1. Zastrzeżenia patentowe
    1. Przeciwciało, które wiąże się swoiście z białkiem Cripto, znamienne tym, że wiąże się z epitopem białka Cripto zlokalizowanym w domenie obejmującej reszty aminokwasowe od 46 aminokwasu do 62 aminokwasu w SEQ ID NO: 1 lub SEQ ID NO: 2.
  2. 2. Przeciwciało według zastrz. 1, znamienne tym, że wiąże się z epitopem wybranym z grupy obejmującej epitopy wiązane przez przeciwciała produkowane przez hybrydoma wybrane spośród A10B2.18 (ATCC, nr dostępu PTA-3311) i B3F6.17 (ATCC, nr dostępu PTA-3319).
  3. 3. Przeciwciało według zastrz. 1 albo 2, znamienne tym, że zdolne jest do internalizacji białka
    Cripto.
  4. 4. Przeciwciało, które wiąże się swoiście z białkiem Cripto, znamienne tym, że wiąże się z epitopem białka Cripto zlokalizowanym w domenie bogatej w cysteinę, obejmującej reszty aminokwasowe od 114 aminokwasu do 150 aminokwasu w SEQ ID NO: 1 lub SEQ ID NO: 2.
  5. 5. Przeciwciało według zastrz. 4, znamienne tym, że wiąże się swoiście z epitopem wybranym z grupy obejmującej epitopy wiązane przez przeciwciała produkowane przez hybrydoma wybrane spośród A6.C12.11, A8G3.5 (ATCC, nr dostępu PTA-3317) i A6F8.6 (ATCC, nr dostępu PTA-3318).
  6. 6. Przeciwciało według zastrz. 4 albo 5, znamienne tym, że hamuje oddziaływanie białka Cripto z ALK4.
  7. 7. Przeciwciało według zastrz. 1-6, znamienne tym, że jest fragmentem przeciwciała wybranym z grupy obejmującej fragment Fab, Fab' i F(ab)2.
  8. 8. Przeciwciało według zastrz. 1-6, znamienne tym, że jest przeciwciałem pełnej długości.
  9. 9. Przeciwciało według zastrz. 1-6, znamienne tym, że jest przeciwciałem jednołańcuchowym.
  10. 10. Przeciwciało według zastrz. 1-9, znamienne tym, że jest skoniugowane z czynnikiem chemioterapeutycznym.
  11. 11. Przeciwciało według zastrz. 1-9, znamienne tym, że jest podawane w połączeniu z nieskoniugowanym czynnikiem chemioterapeutycznym.
  12. 12. Przeciwciało według zastrz. 10, znamienne tym, że czynnik chemioterapeutyczny jest wybrany z grupy obejmującej aktywowany przez nowotwór prolek, radionuklid i toksynę wybraną z grupy obejmującej rycynę, toksynę błonicy i egzotoksynę bakterii Pseudomonas.
  13. 13. Przeciwciało według zastrz. 12, znamienne tym, że czynnikiem jest majtanzynoid.
  14. 14. Przeciwciało według zastrz. 1-13, znamienne tym, że jest przeciwciałem ludzkim.
  15. 15. Przeciwciało według zastrz. 1-13, znamienne tym, że jest przeciwciałem monoklonalnym.
  16. 16. Przeciwciało według zastrz. 13, znamienne tym, że jest przeciwciałem humanizowanym.
  17. 17. Kompozycja farmaceutyczna, znamienna tym, że zawiera co najmniej jedno z przeciwciał zdefiniowanych w zastrz. 1 - 10 oraz w zastrz. 12 - 16 i nośnik.
  18. 18. Kompozycja farmaceutyczna według zastrz. 17, znamienna tym, że zawiera ponadto nieskoniugowany czynnik chemioterapeutyczny.
  19. 19. Kompozycja farmaceutyczna według zastrz. 17 albo 18, znamienna tym, że przeciwciało jest przeciwciałem humanizowanym B3F6.17.
  20. 20. Zastosowanie przeciwciała zdefiniowanego w zastrz. 1-16 albo kompozycji zdefiniowanej w zastrz. 17 - 19 do redukowania wzrostu komórek nowotworowych in vitro.
  21. 21. Zastosowanie przeciwciała zdefiniowanego w zastrz. 1-16 albo kompozycji zdefiniowanej w zastrz. 17 - 19 do wytwarzania leku do redukowania wzrostu komórek nowotworowych in vivo.
  22. 22. Zastosowanie według zastrz. 20, gdzie komórka nowotworowa wybrana jest z grupy obejmującej komórki nowotworu sutka, jąder, okrężnicy, płuc, jajnika, pęcherza moczowego, macicy, szyjki macicy, trzustki oraz żołądka.
  23. 23. Zastosowanie według zastrz. 21, gdzie komórka nowotworowa wybrana jest z grupy obejmującej komórki nowotworu sutka, jąder, okrężnicy, płuc, jajnika, pęcherza moczowego, macicy, szyjki macicy, trzustki oraz żołądka.
  24. 24. Zastosowanie przeciwciała zdefiniowanego w zastrz. 1-16 albo kompozycji zdefiniowanej w zastrz. 17 - 19 do wytwarzania leku do leczenia niepożądanej proliferacji komórek.
PL373513A 2001-04-26 2002-04-17 Przeciwciało, które wiąże się swoiście z białkiem Cripto, zawierająca je kompozycja farmaceutyczna i zastosowanie przeciwciała PL207087B1 (pl)

Applications Claiming Priority (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US28678201P 2001-04-26 2001-04-26
US29302001P 2001-05-17 2001-05-17
US30109101P 2001-06-26 2001-06-26
US36700202P 2002-03-22 2002-03-22

Publications (2)

Publication Number Publication Date
PL373513A1 PL373513A1 (pl) 2005-09-05
PL207087B1 true PL207087B1 (pl) 2010-10-29

Family

ID=27501437

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PL373513A PL207087B1 (pl) 2001-04-26 2002-04-17 Przeciwciało, które wiąże się swoiście z białkiem Cripto, zawierająca je kompozycja farmaceutyczna i zastosowanie przeciwciała

Country Status (33)

Country Link
US (6) US7531174B2 (pl)
EP (3) EP2316486A3 (pl)
JP (4) JP4307845B2 (pl)
KR (1) KR100592357B1 (pl)
CN (1) CN100352501C (pl)
AR (3) AR037223A1 (pl)
AT (2) ATE533508T1 (pl)
BG (1) BG108363A (pl)
BR (1) BR0209254A (pl)
CA (2) CA2443840C (pl)
CL (1) CL2009002199A1 (pl)
CY (1) CY1108960T1 (pl)
CZ (1) CZ20033208A3 (pl)
DE (1) DE60230868D1 (pl)
DK (1) DK1390389T3 (pl)
EA (1) EA007469B1 (pl)
EE (1) EE200300528A (pl)
ES (1) ES2321065T3 (pl)
GE (1) GEP20074091B (pl)
HU (1) HUP0501113A3 (pl)
IS (1) IS2662B (pl)
MX (1) MXPA03009797A (pl)
MY (2) MY157382A (pl)
NO (1) NO20034805L (pl)
NZ (1) NZ566268A (pl)
PL (1) PL207087B1 (pl)
PT (1) PT1390389E (pl)
RS (2) RS20110024A (pl)
SG (1) SG157951A1 (pl)
SI (1) SI1390389T1 (pl)
SK (1) SK14432003A3 (pl)
TR (1) TR200301846T2 (pl)
WO (1) WO2002088170A2 (pl)

Families Citing this family (106)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20090123470A1 (en) * 2001-03-26 2009-05-14 The Macfarlane Burnet Istitute For Medical Research And Public Health Ltd. Antibodies Against Cancer
AUPR395801A0 (en) 2001-03-26 2001-04-26 Austin Research Institute, The Antibodies against cancer
US7582299B2 (en) 2001-04-26 2009-09-01 Biogen Idec Ma Inc. Cripto-specific antibodies
AU2002334799B2 (en) * 2001-04-26 2009-05-07 Biogen Ma Inc. Cripto-specific antibodies
ES2321065T3 (es) * 2001-04-26 2009-06-02 Biogen Idec Ma Inc. Anticuerpos bloqueantes de cripto y usos de los mismos.
US7700097B2 (en) 2003-06-27 2010-04-20 Biogen Idec Ma Inc. Purification and preferential synthesis of binding molecules
EP2135952A3 (en) 2003-09-15 2010-09-29 Research Development Foundation Cripto antagonism of activin and TGF-beta signaling
EP3434275A1 (en) 2003-11-06 2019-01-30 Seattle Genetics, Inc. Assay for cancer cells based on the use of auristatin conjugates with antibodies
EP2385069A3 (en) 2003-11-12 2012-05-30 Biogen Idec MA Inc. Neonatal Fc rReceptor (FcRn)- binding polypeptide variants, dimeric Fc binding proteins and methods related thereto
MXPA06014065A (es) 2004-06-01 2007-01-31 Genentech Inc Conjugados de droga-anticuerpo y metodos.
ES2579805T3 (es) 2004-09-23 2016-08-16 Genentech, Inc. Anticuerpos y conjugados modificados por ingeniería genética con cisteína
US20100111856A1 (en) 2004-09-23 2010-05-06 Herman Gill Zirconium-radiolabeled, cysteine engineered antibody conjugates
AU2006203889A1 (en) * 2005-01-05 2006-07-13 Biogen Idec Ma Inc. CRIPTO binding molecules
WO2006074399A2 (en) 2005-01-05 2006-07-13 Biogen Idec Ma Inc. Multispecific binding molecules comprising connecting peptides
AU2007279205B2 (en) * 2006-07-28 2013-09-26 Children's Memorial Hospital Methods of inhibiting tumor cell aggressiveness using the microenvironment of human embryonic stem cells
JP2010529024A (ja) * 2007-06-01 2010-08-26 バイオジェン・アイデック・エムエイ・インコーポレイテッド Ｃｒｉｐｔｏ結合分子
JP2011522224A (ja) * 2008-04-21 2011-07-28 メルク・シャープ・エンド・ドーム・コーポレイション 膵ベータ細胞質量生物マーカー
WO2010054328A2 (en) * 2008-11-07 2010-05-14 Research Development Foundation Compositions and methods for the inhibition of cripto/grp78 complex formation and signaling
JP2013504585A (ja) 2009-09-09 2013-02-07 セントローズ， エルエルシー 細胞外標的化薬物複合体
WO2011130598A1 (en) 2010-04-15 2011-10-20 Spirogen Limited Pyrrolobenzodiazepines and conjugates thereof
SG185428A1 (en) 2010-06-08 2012-12-28 Genentech Inc Cysteine engineered antibodies and conjugates
WO2012074757A1 (en) 2010-11-17 2012-06-07 Genentech, Inc. Alaninyl maytansinol antibody conjugates
US9402916B2 (en) 2011-03-17 2016-08-02 The University Of Birmingham Re-directed immunotherapy
EP3501546A3 (de) 2011-04-21 2019-09-18 Seattle Genetics, Inc. Cystein-wirkstoff konjugate und ihre verwendung
US8679767B2 (en) 2011-05-12 2014-03-25 Genentech, Inc. Multiple reaction monitoring LC-MS/MS method to detect therapeutic antibodies in animal samples using framework signature peptides
US9738707B2 (en) 2011-07-15 2017-08-22 Biogen Ma Inc. Heterodimeric Fc regions, binding molecules comprising same, and methods relating thereto
PT2750713E (pt) 2011-10-14 2016-01-20 Genentech Inc Pirrolobenzodiazepinas e conjugados das mesmas
WO2013130093A1 (en) 2012-03-02 2013-09-06 Genentech, Inc. Biomarkers for treatment with anti-tubulin chemotherapeutic compounds
ES2738310T3 (es) 2012-10-12 2020-01-21 Medimmune Ltd Pirrolobenzodiazepinas y conjugados de las mismas
WO2014057114A1 (en) 2012-10-12 2014-04-17 Adc Therapeutics Sàrl Pyrrolobenzodiazepine-anti-psma antibody conjugates
NZ707486A (en) 2012-10-12 2018-09-28 Adc Therapeutics Sa Pyrrolobenzodiazepine - anti-psma antibody conjugates
WO2014057120A1 (en) 2012-10-12 2014-04-17 Adc Therapeutics Sàrl Pyrrolobenzodiazepine-antibody conjugates
US9931414B2 (en) 2012-10-12 2018-04-03 Medimmune Limited Pyrrolobenzodiazepine-antibody conjugates
ES2649990T3 (es) 2012-10-12 2018-01-16 Medimmune Limited Conjugados de anticuerpos anti-CD22-pirrolobenzodiazepinas
EP2906296B1 (en) 2012-10-12 2018-03-21 ADC Therapeutics SA Pyrrolobenzodiazepine-antibody conjugates
BR112015014669B1 (pt) 2012-12-21 2023-09-26 Medimmune Limited Compostos pirrolobenzodiazepinas, conjugados compreendendo os mesmos e uso destes para tratar uma doença proliferativa
HK1216176A1 (zh) 2012-12-21 2016-10-21 Medlmmune Limited 用於治疗增殖性和自身免疫疾病的非对称吡咯并苯并二氮杂卓二聚物
CA2905181C (en) 2013-03-13 2020-06-02 Medimmune Limited Pyrrolobenzodiazepines and conjugates thereof for providing targeted therapy
CN105142674B (zh) 2013-03-13 2018-11-13 麦迪穆有限责任公司 吡咯并苯并二氮杂卓和其结合物
AU2014244245C1 (en) 2013-03-13 2018-04-19 Genentech, Inc. Pyrrolobenzodiazepines and conjugates thereof
JP6993084B2 (ja) 2013-08-12 2022-02-03 ジェネンテック， インコーポレイテッド １－（クロロメチル）－２，３－ジヒドロ－１ｈ－ベンゾ［ｅ］インドール二量体抗体 － 薬物コンジュゲート化合物、並びに使用及び処置の方法
EP3054985B1 (en) 2013-10-11 2018-12-26 Medimmune Limited Pyrrolobenzodiazepine-antibody conjugates
GB201317982D0 (en) 2013-10-11 2013-11-27 Spirogen Sarl Pyrrolobenzodiazepines and conjugates thereof
EP3054983B1 (en) 2013-10-11 2019-03-20 Medimmune Limited Pyrrolobenzodiazepine-antibody conjugates
EP3054986B1 (en) 2013-10-11 2019-03-20 Medimmune Limited Pyrrolobenzodiazepine-antibody conjugates
CA2928952A1 (en) 2013-12-16 2015-06-25 Genentech, Inc. Peptidomimetic compounds and antibody-drug conjugates thereof
UA118113C2 (uk) 2013-12-16 2018-11-26 Дженентек, Інк. Пептидоміметичні сполуки та їх кон'югати антитіла з лікарським засобом
EP3082876B1 (en) 2013-12-16 2018-01-17 Genentech, Inc. 1-(chloromethyl)-2,3-dihydro-1h-benzo[e]indole dimer antibody-drug conjugate compounds, and methods of use and treatment
CA2934617A1 (en) 2013-12-23 2015-07-02 Bayer Pharma Aktiengesellschaft Antibody drug conjugates (adcs) with kinesin spindle protein (ksp)
US10188746B2 (en) 2014-09-10 2019-01-29 Medimmune Limited Pyrrolobenzodiazepines and conjugates thereof
GB201416112D0 (en) 2014-09-12 2014-10-29 Medimmune Ltd Pyrrolobenzodiazepines and conjugates thereof
TW201625688A (zh) 2014-09-12 2016-07-16 建南德克公司 經半胱胺酸改造之抗體及接合物
US10149913B2 (en) 2014-09-12 2018-12-11 Genentech, Inc. Anthracycline disulfide intermediates, antibody-drug conjugates and methods
JP2017533887A (ja) 2014-09-17 2017-11-16 ジェネンテック， インコーポレイテッド ピロロベンゾジアゼピン類及びその抗体ジスルフィドコンジュゲート
EP3223854A1 (en) 2014-11-25 2017-10-04 ADC Therapeutics SA Pyrrolobenzodiazepine-antibody conjugates
MX2017007169A (es) 2014-12-03 2018-05-02 Genentech Inc Compuestos de amina cuaternaria y conjugados de anticuerpofármaco de los mismos.
EP3280409A4 (en) * 2015-04-07 2018-12-05 Paranta Biosciences Limited A method of treating neoplasias
GB201506411D0 (en) 2015-04-15 2015-05-27 Bergenbio As Humanized anti-axl antibodies
GB201506402D0 (en) 2015-04-15 2015-05-27 Berkel Patricius H C Van And Howard Philip W Site-specific antibody-drug conjugates
AU2016282723B2 (en) 2015-06-22 2021-09-23 Bayer Pharma Aktiengesellschaft Antibody drug conjugates (ADCs) and antibody prodrug conjugates (APDCs) with enzymatically cleavable groups
KR102111338B1 (ko) 2015-10-02 2020-05-15 제넨테크, 인크. 피롤로벤조디아제핀 항체 약물 콘쥬게이트 및 이의 사용 방법
WO2017060322A2 (en) 2015-10-10 2017-04-13 Bayer Pharma Aktiengesellschaft Ptefb-inhibitor-adc
WO2017064675A1 (en) 2015-10-16 2017-04-20 Genentech, Inc. Hindered disulfide drug conjugates
EP3365025B1 (en) 2015-10-20 2020-07-15 Genentech, Inc. Calicheamicin-antibody-drug conjugates and methods of use
GB201601431D0 (en) 2016-01-26 2016-03-09 Medimmune Ltd Pyrrolobenzodiazepines
GB201602356D0 (en) 2016-02-10 2016-03-23 Medimmune Ltd Pyrrolobenzodiazepine Conjugates
GB201602359D0 (en) 2016-02-10 2016-03-23 Medimmune Ltd Pyrrolobenzodiazepine Conjugates
JP7251981B2 (ja) 2016-03-24 2023-04-04 バイエル ファーマ アクチエンゲゼルシャフト 酵素開裂基を有する細胞毒性活性剤のプロドラッグ
US20170315132A1 (en) 2016-03-25 2017-11-02 Genentech, Inc. Multiplexed total antibody and antibody-conjugated drug quantification assay
GB201607478D0 (en) 2016-04-29 2016-06-15 Medimmune Ltd Pyrrolobenzodiazepine Conjugates
CN118436801A (zh) 2016-05-20 2024-08-06 豪夫迈·罗氏有限公司 Protac抗体缀合物及其使用方法
JP7022080B2 (ja) 2016-05-27 2022-02-17 ジェネンテック， インコーポレイテッド 部位特異的抗体－薬物複合体の特徴付けのための生化学分析的方法
US10639378B2 (en) 2016-06-06 2020-05-05 Genentech, Inc. Silvestrol antibody-drug conjugates and methods of use
WO2017216028A1 (en) 2016-06-15 2017-12-21 Bayer Pharma Aktiengesellschaft Specific antibody-drug-conjugates (adcs) with ksp inhibitors and anti-cd123-antibodies
EP3496763B1 (en) 2016-08-11 2026-04-01 Genentech, Inc. Pyrrolobenzodiazepine prodrugs and antibody conjugates thereof
EP3522933B1 (en) 2016-10-05 2021-12-15 F. Hoffmann-La Roche AG Methods for preparing antibody drug conjugates
GB201617466D0 (en) 2016-10-14 2016-11-30 Medimmune Ltd Pyrrolobenzodiazepine conjugates
JP7685735B2 (ja) 2016-12-02 2025-05-30 アンヘレス セラピューティクス インコーポレイテッド 合成免疫受容体およびその使用方法
WO2018114804A1 (de) 2016-12-21 2018-06-28 Bayer Pharma Aktiengesellschaft Spezifische antikörper-wirkstoff-konjugate (adcs) mit ksp-inhibitoren
CA3047491A1 (en) 2016-12-21 2018-06-28 Bayer Aktiengesellschaft Prodrugs of cytotoxic active agents having enzymatically cleavable groups
KR102556826B1 (ko) 2016-12-21 2023-07-18 바이엘 파마 악티엔게젤샤프트 효소적으로 절단가능한 기를 갖는 항체 약물 접합체 (adc)
GB201702031D0 (en) 2017-02-08 2017-03-22 Medlmmune Ltd Pyrrolobenzodiazepine-antibody conjugates
US11160872B2 (en) 2017-02-08 2021-11-02 Adc Therapeutics Sa Pyrrolobenzodiazepine-antibody conjugates
EP3612537B1 (en) 2017-04-18 2022-07-13 Medimmune Limited Pyrrolobenzodiazepine conjugates
CN110536703B (zh) 2017-04-20 2024-07-12 Adc治疗有限公司 使用抗axl抗体-药物缀合物的组合疗法
UA127900C2 (uk) 2017-06-14 2024-02-07 Ейдісі Терапьютікс Са Схема дозування для введення adc до cd19
RS62928B1 (sr) 2017-08-18 2022-03-31 Medimmune Ltd Konjugati pirolobenzodiazepina
US10301319B2 (en) 2017-09-20 2019-05-28 Ph Pharma Co., Ltd. Thailanstatin analogs
GB201803342D0 (en) 2018-03-01 2018-04-18 Medimmune Ltd Methods
GB201806022D0 (en) 2018-04-12 2018-05-30 Medimmune Ltd Pyrrolobenzodiazepines and conjugates thereof
US12172986B2 (en) 2018-06-01 2024-12-24 Eisai R&D Management Co., Ltd Splicing modulator antibody-drug conjugates and methods of use
GB201814281D0 (en) 2018-09-03 2018-10-17 Femtogenix Ltd Cytotoxic agents
TW202037381A (zh) 2018-10-24 2020-10-16 瑞士商赫孚孟拉羅股份公司 綴合化學降解誘導劑及使用方法
EP3894427A1 (en) 2018-12-10 2021-10-20 Genentech, Inc. Photocrosslinking peptides for site specific conjugation to fc-containing proteins
PE20211473A1 (es) 2018-12-13 2021-08-05 Eisai Randd Man Co Ltd Conjugados de anticuerpo-farmaco de herboxidieno y metodos de uso
EP3897851A2 (en) 2018-12-17 2021-10-27 Revitope Limited Twin immune cell engager
GB201901197D0 (en) 2019-01-29 2019-03-20 Femtogenix Ltd G-A Crosslinking cytotoxic agents
ES2967878T3 (es) 2019-03-15 2024-05-06 Medimmune Ltd Dímeros de azetidobenzodiazepina y conjugados que los comprenden para uso en el tratamiento del cáncer
GB2597532A (en) 2020-07-28 2022-02-02 Femtogenix Ltd Cytotoxic compounds
CN117980327A (zh) 2021-11-03 2024-05-03 杭州多禧生物科技有限公司 抗体的特异性偶联
EP4637833A2 (en) 2022-12-23 2025-10-29 Genentech, Inc. Cereblon degrader conjugates, and uses thereof
AU2024257248A1 (en) 2023-04-17 2025-11-06 Peak Bio, Inc. Antibodies and antibody-drug conjugates and methods of use and synthetic processes and intermediates
WO2025132976A1 (en) * 2023-12-19 2025-06-26 BioNTech SE Cfc1 binding molecule
WO2025132978A1 (en) * 2023-12-19 2025-06-26 BioNTech SE Cfc1 binding molecule
WO2026006689A2 (en) 2024-06-28 2026-01-02 Firefly Bio, Inc. Bcl-xl degrader antibody conjugates and uses thereof
WO2026006688A2 (en) 2024-06-28 2026-01-02 Firefly Bio, Inc. Degrader antibody conjugates and uses thereof

Family Cites Families (39)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
NZ207394A (en) * 1983-03-08 1987-03-06 Commw Serum Lab Commission Detecting or determining sequence of amino acids
US4816567A (en) 1983-04-08 1989-03-28 Genentech, Inc. Recombinant immunoglobin preparations
WO1989006692A1 (en) 1988-01-12 1989-07-27 Genentech, Inc. Method of treating tumor cells by inhibiting growth factor receptor function
US5530101A (en) 1988-12-28 1996-06-25 Protein Design Labs, Inc. Humanized immunoglobulins
US5208020A (en) 1989-10-25 1993-05-04 Immunogen Inc. Cytotoxic agents comprising maytansinoids and their therapeutic use
US5780029A (en) 1989-11-14 1998-07-14 New York Medical College Antidiotypic monoclonal antibodies for treatment of melanoma
US5859205A (en) 1989-12-21 1999-01-12 Celltech Limited Humanised antibodies
US5256643A (en) 1990-05-29 1993-10-26 The Government Of The United States Human cripto protein
AU8507191A (en) 1990-08-29 1992-03-30 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies
WO1994004679A1 (en) 1991-06-14 1994-03-03 Genentech, Inc. Method for making humanized antibodies
US5264557A (en) 1991-08-23 1993-11-23 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Polypeptide of a human cripto-related gene, CR-3
US6063379A (en) 1993-12-09 2000-05-16 Centro De Inmunologia Molecular Anti-idiotypic monoclonal antibodies and compositions including the anti-idiotypic monoclonal antibodies
US5981215A (en) * 1995-06-06 1999-11-09 Human Genome Sciences, Inc. Human criptin growth factor
CN1201005C (zh) * 1996-05-22 2005-05-11 维文蒂阿生物技术股份有限公司 特异性检测癌细胞的抗原结合片段、编码所述片段的dna、以及它们在预防和检测癌症上的用途
IL125608A0 (en) 1998-07-30 1999-03-12 Yeda Res & Dev Tumor associated antigen peptides and use of same as anti-tumor vaccines
HRP20130077A2 (hr) 1998-12-23 2013-07-31 Pfizer Inc. Humana monoklonalna protutjela za ctla-4
AU3316600A (en) * 1999-02-22 2000-09-21 Torben F. Orntoft Gene expression in bladder tumors
AU754808B2 (en) 1999-03-30 2002-11-28 Amgen Fremont Inc. Method for preparing Monoclonal Antibody
EP1179178A1 (en) * 1999-04-20 2002-02-13 William J. Kokolus Improved method of identifying and locating immunobiologically-active linear peptides
US6833268B1 (en) 1999-06-10 2004-12-21 Abgenix, Inc. Transgenic animals for producing specific isotypes of human antibodies via non-cognate switch regions
JP2001046066A (ja) 1999-08-03 2001-02-20 Kyowa Hakko Kogyo Co Ltd 新規な相補性決定領域を有するヒトｖｅｇｆ受容体ｋｄｒに対する抗体
BR0015224A (pt) 1999-10-29 2002-07-09 Genentech Inc Anticorpo anti-antìgeno de célula estaminal prostática (psca) isolado, anticorpo monoclonal anti-psca, ácido nucleico isolado, vetor de expressão, célula, célula hospedeira, método de produção de anticorpo, composição método in vitro para matar uma célula cancerosa que expresse psca, uso de uma anticorpo monoclonal anti-psca e artigo industrializado
US6663613B1 (en) 2000-01-25 2003-12-16 Bacchus Vascular, Inc. System and methods for clot dissolution
WO2001064754A1 (en) 2000-03-03 2001-09-07 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Gene recombinant antibody and its fragment
US6333410B1 (en) * 2000-08-18 2001-12-25 Immunogen, Inc. Process for the preparation and purification of thiol-containing maytansinoids
GB0020953D0 (en) 2000-08-24 2000-10-11 Smithkline Beecham Biolog Vaccine
CA2422814A1 (en) * 2000-09-18 2002-03-21 Biogen, Inc. Cripto mutant and uses thereof
AU2002236871B2 (en) 2001-01-26 2006-09-28 The Government Of The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Detection and quantification of CRIPTO-1
KR20030091978A (ko) 2001-01-29 2003-12-03 아이덱 파마슈티칼즈 코포레이션 변형된 항체 및 사용 방법
WO2002096948A2 (en) 2001-01-29 2002-12-05 Idec Pharmaceuticals Corporation Engineered tetravalent antibodies and methods of use
AUPR395801A0 (en) 2001-03-26 2001-04-26 Austin Research Institute, The Antibodies against cancer
AU2002334799B2 (en) * 2001-04-26 2009-05-07 Biogen Ma Inc. Cripto-specific antibodies
US7582299B2 (en) * 2001-04-26 2009-09-01 Biogen Idec Ma Inc. Cripto-specific antibodies
ES2321065T3 (es) 2001-04-26 2009-06-02 Biogen Idec Ma Inc. Anticuerpos bloqueantes de cripto y usos de los mismos.
ES2431929T3 (es) * 2001-09-18 2013-11-28 Genentech, Inc. Composiciones y procedimientos para el diagnóstico y el tratamiento de tumores
US20040014690A1 (en) * 2002-02-13 2004-01-22 Zhenkun Ma Macrolides with activity against methicillin-resistant staphylococcus aureus
EP2135952A3 (en) * 2003-09-15 2010-09-29 Research Development Foundation Cripto antagonism of activin and TGF-beta signaling
AU2006203889A1 (en) 2005-01-05 2006-07-13 Biogen Idec Ma Inc. CRIPTO binding molecules
CN101479391A (zh) 2006-04-28 2009-07-08 比奥根艾迪克Ma公司 用于检测cripto-3的组合物及方法

Also Published As

Publication number Publication date
JP4307845B2 (ja) 2009-08-05
ATE420659T1 (de) 2009-01-15
US7674462B2 (en) 2010-03-09
CN100352501C (zh) 2007-12-05
NZ566268A (en) 2009-09-25
IS6999A (is) 2003-10-24
CA2443840C (en) 2010-10-26
HUP0501113A3 (en) 2007-12-28
JP4575983B2 (ja) 2010-11-04
US20120195912A1 (en) 2012-08-02
US20100202962A1 (en) 2010-08-12
CA2715570A1 (en) 2002-11-07
EP2316486A2 (en) 2011-05-04
PT1390389E (pt) 2009-04-03
JP2009108100A (ja) 2009-05-21
ATE533508T1 (de) 2011-12-15
AR037223A1 (es) 2004-11-03
KR100592357B1 (ko) 2006-06-22
EP1390389A2 (en) 2004-02-25
WO2002088170A3 (en) 2003-12-24
US8673303B2 (en) 2014-03-18
CL2009002199A1 (es) 2010-05-07
YU84903A (sh) 2006-05-25
EA200301158A1 (ru) 2005-06-30
WO2002088170A2 (en) 2002-11-07
SG157951A1 (en) 2010-01-29
EE200300528A (et) 2004-08-16
EA007469B1 (ru) 2006-10-27
JP2005314436A (ja) 2005-11-10
SK14432003A3 (sk) 2004-07-07
SI1390389T1 (sl) 2009-06-30
CA2443840A1 (en) 2002-11-07
RS51635B (sr) 2011-08-31
MY150237A (en) 2013-12-31
NO20034805D0 (no) 2003-10-27
EP2316486A3 (en) 2011-09-07
US20090285818A1 (en) 2009-11-19
MY157382A (en) 2016-06-15
NO20034805L (no) 2003-12-23
TR200301846T2 (tr) 2006-10-26
MXPA03009797A (es) 2004-01-29
EP1974749B1 (en) 2011-11-16
AR072554A2 (es) 2010-09-08
DK1390389T3 (da) 2009-04-20
EP1974749A1 (en) 2008-10-01
US7531174B2 (en) 2009-05-12
AR077759A2 (es) 2011-09-21
US7888052B2 (en) 2011-02-15
GEP20074091B (en) 2007-04-25
DE60230868D1 (de) 2009-03-05
CZ20033208A3 (en) 2004-03-17
BG108363A (bg) 2004-09-30
RS20110024A (sr) 2011-08-31
US20040146940A1 (en) 2004-07-29
EP1390389B1 (en) 2009-01-14
JP2004534020A (ja) 2004-11-11
HK1058935A1 (en) 2004-06-11
US20080166341A1 (en) 2008-07-10
CN1606453A (zh) 2005-04-13
CY1108960T1 (el) 2014-07-02
US8003763B2 (en) 2011-08-23
BR0209254A (pt) 2006-10-03
ES2321065T3 (es) 2009-06-02
HUP0501113A2 (en) 2007-05-02
IS2662B (is) 2010-08-15
PL373513A1 (pl) 2005-09-05
KR20040028744A (ko) 2004-04-03
EP1390389A4 (en) 2004-09-22
JP2010163438A (ja) 2010-07-29
US20090286265A1 (en) 2009-11-19

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CA2443840C (en) Cripto blocking antibodies and uses thereof
AU2002334799A1 (en) Cripto-specific antibodies
AU2007200809B2 (en) Cripto Blocking Antibodies and Uses Thereof
CA2480119C (en) Cripto-specific antibodies
NZ578287A (en) Cripto blocking antibodies and uses thereof
AU2002303364A1 (en) Cripto blocking antibodies and uses thereof
ZA200606338B (en) Cripto blocking antibodies and uses thereof
HK1058935B (en) Cripto blocking antibodies and uses thereof
AU2010202840A1 (en) Cripto Blocking Antibodies and Uses Thereof
HK1122509A (en) Cripto blocking antibodies and uses thereof
HK1155081A (en) Cripto blocking antibodies and uses thereof

Legal Events

Date Code Title Description
RECP Rectifications of patent specification