CZ2004356A3 - Farmaceutická kompozice pro léčení nebo prevenci rakovin a použití účinných látek - Google Patents

Description

Oblast techniky

Předložený vynález se týká farmaceutické kompozice pro léčení nebo prevence rakovin, zejména neoplazií pomocí inhibitorů tyrosin-specifických protein kináz v kombinaci s inhibitory cyklooxygenázy, konkrétně se selektivními inhibitory cyklooxygenázy-2, jakož i použití účinných látek.

Dosavadní stav techniky

Neoplazmus nebo nádor je abnormální, nekontrolovatelná a dezorganizovaná proliferace (růst) buněk. Neoplazmus je maligní nebo rakovinný, má-li destruktivní růst, invazívnost a metastázuje. Invazívnost zahrnuje lokální rozšíření neoplazmu infiltrací nebo destrukcí sousední tkáně, většinou proražením skrz bazální membrány, které rozdělují tkáně, čímž velmi často dochází ke vstupu do cirkulačního systému těla. Metastáze se typicky týká diseminace nádorových buněk lymfocytámí proliferací nebo krevními cévami. Metastáze také zahrnuje migraci nádorových buněk přímou extenzí přes serózní kavity nebo subarachnoidální nebo jiné prostory. Procesem metastáze, resp. migrací nádorových buněk do dalších oblastí těla, se stabilizují neoplazmy ve vzdálených oblastech od místa prvotního vzniku.

V současné době je rakovina druhou nej rozšířenější nemocí způsobující smrt v USA a více než 8000000 lidem v USA byla diagnostikována rakovina. V roce 1995 zemřelo v USA na rakovinu 23,3 % lidí (viz U.S. Dept. Of Health and Human Services, National Center for Health Statistics, Health United States 1996 - 97 a Injury Chartbook 117(1997)).

Z molekulárního pohledu není mechanizmus rakoviny ještě zcela objasněn. Ví se, že vystavení buněk karcinogenům, např. určité viry, chemikálie nebo záření, způsobuje změnu v DNA, která inaktivuje supresivní gen nebo aktivuje onkogen. Supresivní geny jsou růstové regulační geny, které po mutaci již nemohou regulovat buněčný růst. Onkogeny jsou původně normální geny (nazývané proonkogeny), které se mutací nebo změnou obsahu exprese stávají transformujícími geny. Produkty transformujících genů způsobují nepřiměřený buněčný růst. Více než dvacet různých normálních buněčných genů se díky genetické změně stává onkogeny. Transformované buňky se liší od normálních buněk v mnoha faktorech, včetně morfologie buňky, interakcí mezi buňkami, obsahem membrány, strukturou buněčné kostry, sekrecí proteinů, expresí genů a mortalitou (transformované buňky mohou růst nekontrolovatelným způsobem).

Rakovina je nyní hlavně léčena jednou nebo kombinací tří typů terapií: chirurgicky, ozařováním a chemoterapií. Chirurgie zahrnuje odstranění celé nemocné tkáně. I když chirurgie je někdy účinná při odstraňování nádorů lokalizovaných v určitých místech, např. prsu, střeva a kůže, nelze ji použít při léčení nádorů lokalizovaných v dalších místech, např. páteř, ani při léčení diseminovaných neoplastických stavů, např. leukémie.

Chemoterapie zahrnuje zničení replikace buněk nebo buněčného metabolizmu. Často je využívána při léčení rakoviny prsu, plic a varlat.

Pacienti podrobující se léčení rakoviny se nejvíce obávají vedlejších účinků v průběhu systémové terapie při léčení neoplastického onemocnění. Z těchto vedlejších účinků patří mezi nejrozšířenější a nejtěžší vedlejší účinky nauzea a vomitus. Další vedlejší účinky zahrnují cytopenii, infekci, kachexii, mukositózu u pacientů vystaveným vysokým dávkám chemoterapie, u kterých probíhá záchrana kostní dřeně nebo ozařovací terapie; alopecii (vypadávání vlasů); kožní komplikace (viz M. D. Abeloff, et al: Alopecia and Cutaneous Complications. P. 755-56. In Abeloff, M. D., Armitage, J. O., Lichter, A. S., and Niederhuber, J. E. (eds) Clinical Oncology. Churchill Livingston, New York, 1992, for cutaneous reactions to chemotherapy agents), např. svědění, kopřivka a angioedém; neurologické komplikace; plicní a srdeční komplikace u pacientů při ozařování nebo chemoterapii; a reprodukční a endokrinní komplikace.

Vedlejší účinky indukované chemoterapií výrazně zasahují do kvality života pacienta a mohou dramaticky ovlivňovat kompliance nemocného při léčení.

Obecně jsou hlavními ukazateli dávky limitující toxicitu (DLT) při aplikaci těchto léků vedlejší účinky spojené s chemoterapeutiky. Například mukositóza je jedním z hlavních faktorů limitujících toxicitu u několika kancerostatik, včetně antimetabolických cytotoxických agens 5-FU, metotrexát a protinádorových antibiotik, např. doxorubicin. Velký počet z těchto vedlejších účinků indukovaných chemoterapií, pokud jsou závažné, může vést k hospitalizaci nebo je díky těmto účinkům potřeba léčení analgetiky na bolest.

Nepříznivé vedlejší účinky indukované chemoterapeutiky a ozařovací terapie nabyly velkého významu při klinickém ošetřování pacientů s rakovinami.

V současné době se vědci pokoušejí léčit rakoviny prostřednictvím antiangiogenních agens. Předpokládá se, že při angiogenezi jsou k dalšímu růstu a ·· · • · • · · · • · · ··· ·· · ···· ·· · · · · · · · · · · · ♦ • · · ··· · · · β ······ ··· ·· · metastázi do dalších oblastí těla potřeba nutrienty. Antiangiogenní agens interferují s těmito procesy a ničí nebo regulují nádory.

Například patent US č. 5 854 205 popisuje izolovaný endostatin, což je protein fungující jako inhibitor proliferace endoteliálních buněk a angiogeneze; patent US č. 5 843 925 popisuje způsob inhibice angiogeneze a proliferace endoteliálních buněk pomocí 7-[substituovaného amino]-9-[(substituovaného glycyloamido]-6-demethyl-6deoxytetracyklinu; patent US č. 5 861 372 popisuje použití endoteliálního inhibitoru, angiostatinu, a jeho použití při inhibici angiogeneze, PCT/GB97/00650 popisuje použití cinnolinových derivátů pro použití při produkci antiangiogenního a/nebo permeabilitu redukujícího účinku; Tai-Ping, D. popisuje potenciální antiangiogenní terapie, viz Trends Pharmacol. Sci. 16, No. 2,57-66, 1995; Lodě, H. et al. popisuje synergii mezi antiangiogenním integrinem alpha nebo antagonistou a fózním proteinem z protilátky a cytokinu, který eradikuje spontánní metastázi nádoru, viz Proč. Nat. Acad. Sci. USA. , 96 (4), 1591-1596,1999 ; Giannis, A. et al. popisuje antagonisty integrinu a další nízkomolekulámí sloučeniny jako inhibitory angiogeneze, viz New drugs in cancer therapy. Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 36 (6), 588-590,1997; WO 97/41,844 popisuje způsob použití kombinací angiostatických sloučenin pro prevenci a/nebo léčení neovaskularizace na lidských pacientech; WO 98/22101 popisuje způsob použití [pyrozoll-yl]benzensulfonamidů jako antiangiogenních agens; a patent US č. 5 792 783 popisuje použití 3-heteroaryl-2-indolinonů, které jsou inhibitory protein kinázy a antiangiogenní agens pro léčení různých rakovin.

V poslední době bylo publikováno, že léčení kolorektální rakoviny inhibitorem cyklooxygenázy-2, konkrétně Celecoxib®, v kombinaci s inhibitorem ART-2, konkrétně Herceptin®, je účinnější než použití obou agens samostatně. Tudíž zde existuje stálá potřeba vyvíjet nové kombinace chemoterapeutik, které jsou díky společnému použití mnohem účinnější. Předložený vynález splňuje tyto potřeby.

Podstata vynálezu

Farmaceutická kompozice pro léčení nebo prevenci rakovin, která zahrnuje účinné látky a popřípadě nosič a/nebo pomocné látky, která jako účinné látky obsahuje inhibitor protein kinázy obecného vzorce (I):

·· ····

kde substituent R je vybrán ze skupiny sestávající z atomu vodíku, piperazin-1 -ylmethylu, 4-methylpiperazin-1 -ylmethylu, piperidin-1 -ylmethylu, 2-hydroxy-methylpyrrolidin-l-ylmethylu, 2-karboxypynOlidin-l -ylmethylu a pyrrolidin-1ylmethylu;

substituent R¹ je vybrán ze skupiny sestávající z atomu vodíku, halogenu, alkylu, substituovaného alkylu, cykloalkylu, substituovaného cykloalkylu, arylu, heteroarylu, heteroalicyklu, hydroxyskupiny, alkoxyskupiny, -C(O)NR R ,

-NR¹³R¹⁴, -(CO)R¹⁵ a -(CH₂)_rR¹⁶;

substituent R² je vybrán ze skupiny sestávající z atomu vodíku, halogenu, alkylu, substituovaného alkylu, trihalogenmethylu, hydroxyskupiny, alkoxyskupiny, kyanoskupiny, -NR¹³R¹⁴, -NR¹³C(O)R¹⁴, -C(O)R¹⁵, arylu, heteroarylu a -S(O)₂NR¹³R¹⁴;

substituent R³ je vybrán ze skupiny sestávající z atomu vodíku, halogenu, alkylu, substituovaného alkylu, trihalogenmethylu, hydroxyskupiny, alkoxyskupiny, arylu, heteroarylu, -NR¹³R¹⁴, -NR¹³S(O)2R¹⁴, -S(O)2NR¹³R¹⁴,

-NR¹³C(O)R¹⁴, -NR¹³C(O)OR¹⁴, -(CO)R¹⁵ a -SO₂R¹⁹;

substituent R⁴ je vybrán ze skupiny sestávající z atomu vodíku, halogenu, alkylu, substituovaného alkylu, hydroxyskupiny, alkoxyskupiny a -NR¹³R¹⁴;

substituent R⁵ je vybrán ze skupiny sestávající z atomu vodíku, alkylu, substituovaného alkylu a -C(O)R¹⁰;

substituent R⁶ je vybrán ze skupiny sestávající z atomu vodíku, alkylu, substituovaného alkylu a -C(O)R¹⁰;

*7 substituent R je vybrán ze skupiny sestávající z atomu vodíku, alkylu, substituovaného alkylu, arylu, heteroarylu, -C(O)R¹⁷ a -C(O)R¹⁰ za předpokladu, že pokud substituent R je atom vodíku, pak alespoň jeden ze substituentů R⁵, R⁶ a R⁷ je -C(O)R¹⁰;

nebo ·· ·» • · · ·

·· ·

··· ·· · • · · · • · · · · • · · · ···· • · · ·

Λ «7 substituent R a substituent R mohou dohromady tvořit skupinu vybranou ze skupiny sestávající z -(CH₂)₄-, -(CH₂)5-a -(CH₂)₆-;

substituent R a substituent R jsou nezávisle vybrány ze skupiny sestávající z atomu vodíku, alkylu, substituovaného alkylu a arylu;

substituent R¹⁰ je vybrán ze skupiny sestávající z hydroxyskupiny, alkoxyskupiny, aryloxyskupiny, -N(Rⁿ)(alkylen)_nR¹², kde alkylenová skupina je případně substituovaná hydroxyskupinou a -NR¹³R¹⁴;

substituent Rⁿ je vybrán ze skupiny sestávající z atomu vodíku, alkylu a substituovaného alkylu;

substituent R¹² je vybrán ze skupiny sestávající z -NR¹³R¹⁴, hydroxyskupiny, C(O)R¹⁵, arylu, heteroarylu, -N+(O')R¹³R¹⁴, -N(OH)R¹³ a

-NHC(O)R¹⁸, kde substituent R¹⁸ je alkyl, substituovaný alkyl, halogenalkyl nebo aralkyl; substituent R¹³ a substituent R¹⁴ jsou nezávisle vybrány ze skupiny sestávající z atomu vodíku, alkylu, substituovaného alkylu, nižšího alkylu substituovaného hydroxyalkylaminoskupinou, kyanoalkylu, cykloalkylu, substituovaného cykloalkylu, arylu a heteroarylu; nebo substituenty R¹³ a R¹⁴ mohou dohromady tvořit heterocykloskupinu; substituent R¹⁵ je vybrán ze skupiny sestávající z atomu vodíku, hydroxyskupiny, alkoxyskupiny a aryloxyskupiny;

substituent R¹⁶ je vybrán ze skupiny sestávající z hydroxyskupiny,

-NR¹³R¹⁴, -C(O)R¹⁵ a -C(O)NR¹³R¹⁴;

substituent R¹⁷ je vybrán ze skupiny sestávající z alkylu, substituovaného alkylu, cykloalkylu, arylu a heteroarylu;

substituent R¹⁹ je vybrán ze skupiny sestávající z alkylu, substituovaného alkylu, arylu, aralkylu, heteoarylu nebo heteroaralkylu; a n a r jsou nezávisle 1,2, 3 nebo 4; nebo jeho farmaceuticky přijatelná sůl a inhibitor cyklooxygenázy, nebo jeho farmaceuticky přijatelou sůl;

uvedená farmaceutická kompozice je případně přítomna v oddělených dávkových formách pro současné nebo následné podání.

Výhodně je inhibitor protein kinázy obecného vzorce (I) používán v kombinaci se selektivním inhibitorem cyklooxygenázy-2 vybraným ze skupiny sestávající z:

(i) sloučeniny obecného vzorce (II):

kde:

G je vybráno ze skupiny sestávající z O, S a -NR^a-, kde substituent R^a je atom vodíku nebo alkyl;

substituent R^10a je vybrán ze skupiny sestávající z atomu vodíku a arylu; substituent R^lla je vybrán ze skupiny sestávající z karboxylu, alkylu, aralkylu, aminokarbonylu, alkylsulfonylaminokarbonylu a alkoxykarbonylu;

substituent R^12a je vybrán ze skupiny sestávající z halogenalkylu, alkylu, aralkylu, cykloalkylu a arylu případně substituovaného jedním nebo více radikály vybranými z alkylthioskupiny, nitroskupiny a alkylsulfonylu; a substituent R^13a je jeden nebo více radikálů nezávisle vybraných ze skupiny sestávající z atomu vodíku, halogenu, alkylu, aralkylu, alkoxyskupiny, aryloxyskupiny, heteroaryloxyskupiny, aralkyloxyskupiny, heteroaralkyloxyskupiny, halogenalkylu, halogenalkoxyskupiny, alkylaminoskupiny, arylaminoskupiny, aralkylaminoskupiny, heteroarylaminoskupiny, heteroarylalkylaminoskupiny, nitroskupiny, aminoskupiny, aminosulfonylu, alkylaminosulfonylu, arylaminosulfonylu, heteroarylaminosulfonylu, aralkylaminosulfonylu, heteroaralkylaminosulfonylu, heterocyklosulfonylu, alkylsulfonylu, hydroxyarylkarbonylu, nitroarylu, případně substituovaného arylu, případně substituovaného heteroarylu, aralkylkarbonylu, heteroarylkarbonylu, arylkarbonylu, aminokarbonylu a alkylkarbonylu;

nebo substituent R^13a společně s kruhem E vytváří nafitylový kruh; nebo (ii) sloučeniny obecného vzorce (III):

(III) • ·♦·· * kde:

A je vybráno ze skupiny sestávající z částečně nasyceného nebo nenasyceného heterocyklylu a částečně nasycených nebo nenasycených karbocyklických kruhů;

t.

substituent R je vybrán ze skupiny sestávající z heterocyklylu, cykloalkylu, cykloalkenylu a arylu, kde substituent R^lb je případně substituovaný do výhodně substituované polohy jedním nebo více radikály nezávisle vybranými z alkylu, halogenalkylu, kyanoskupiny, karboxylu, alkoxykarbonylu, hydroxylu, hydroxyalkylu, halogenalkoxyskupiny, aminoskupiny, alkylaminoskupiny, arylaminoskupiny, nitroskupiny, alkoxyalkylu, alkylsulfinylu, halogenu, alkoxyskupiny a alkylthioskupiny;

substituent R^2b je vybrán ze skupiny sestávající z methylu a aminoskupiny; a substituent R^3b je vybrán ze skupiny sestávající z radikálu vybraného z atomu vodíku, halogenu, alkylu, alkenylu, alkynylu, oxoskupiny, kyanoskupiny, karboxylu, kyanoalkylu, heterocyklyloxyskupiny, alkyloxyskupiny, alkylthioskupiny, alkylkarbonylu, cykloalkylu, arylu, halogenalkylu, heterocyklylu, cykloalkenylu, aralkylu, heterocyklylalkylu, acylu, alkylthioalkylu, hydroxyalkylu, alkoxykarbonylu, arylkarbonylu, aralkylkarbonylu, aralkenylu, alkoxyalkylu, arylthioalkylu, aryloxyalkylu, aralkylthioalkylu, aralkoxyalkylu, alkoxyaralkoxyalkylu, alkoxykarbonylalkylu, aminokarbonylu, aminokarbonylalkylu, alkylaminokarbonylu, A-arylaminokarbonylu, TV-alkyl-A-arylaminokarbonylu, alkylaminokarbonylalkylu, karboxyalkylu, alkylaminoskupiny, ŤV-arylaminoskupiny, V-aralkylaminoskupiny, V-alkyl-Aaralkylaminoskupiny, V-alkyl-V-arylaminoskupiny, aminoalkylu, alkylaminoalkylu, TV-arylaminoalkylu, TV-aralkylaminoalkylu, V-alkyl-TV-aralkylaminoalkylu, V-alkyl-Varylaminoalkyl, aryloxyskupiny, aralkoxyskupiny, arylthioskupiny, aralkylthioskupiny, alkylsulfinylu, alkylsulfonylu, aminosulfonylu, alkylaminosulfonylu,

A-arylaminosulfonylu, arylsulfonylu a A-alkyl-A-arylaminosulfonylu;

nebo jeho farmaceuticky přijatelná sůl.

Výhodně jsou výše uvedené sloučeniny podávány jako farmaceutický přípravek obsahující jeden nebo více shora uvedených sloučenin a farmaceuticky přijatelný excipient. Specificky mohou být terapeautická agens podle předloženého vynálezu připravena jako formulace ve formě separovaných přípravků, které jsou podávány ve stejnou nebo různou dobu nebo mohou být terapeutická agens podávána jako jediný přípravek.

·· «* « * · · · · • · · · · e » · · · · • · · · · ···· ·· ·· ·« ·»·« • · · • · · · • · · · · • · · · ··« · • · · · • ·· *

Farmaceutické kompozice podle předloženého vynálezu jsou použitelné k léčení nebo prevenci neoplazií, včetně akrálního lentiginózního melanomu, keratózy ze záření, adenokarcinomu, adenoidního cystického karcinomu, adenomů, adenosarkomu, adenoskvamózního karcinomu, astrocytámích nádorů, karcinomu bartholiniho žlázy, karcinomu bazálních buněk, karcinomů bronchiálních žláz, kapilární, karcinoidů, karcinomu, karcinosarkomu, kavemózní, cholangiokarcinomu, chondosarkomu, papilomu/karcinomu plexus chorioideus, karcinomu z jasných buněk, cystadenomu, endodermálního sinus tumor, endometriální hyperplazii, endometriálního stromálního sarkomu, endometrioidního adenokarcinomu, ependymalní, epitheloidu, Ewingova sarkomu, fibrolamelámí, fokální nodulámí hyperplazie, gastrinomu, nádorů ze zárodečných buněk, glioblastomu, glukagonomu, hemangiblastomů, hemangioendotheliomu, hemangiomů, hepatického adenomu, hepatické adenomatózy, hepatocelulámího karcinomu, insulinomu, intaepiteliální neoplazii, interepiteliální skvamózní buněčné neoplazie, invazivního skvamózního buněčného karcinomu, karcinomu velkých buněk, liomyosarkomu, maligních melanomů z pigmentu, maligního melanomu, maligních mezoteliálních nádorů, meduloblastomu, meduloepiteliomu, melanomu, meningeálního, mezoteliálního, metastatického karcinomu, mukoepidermoidního karcinomu, neuroblastomu, neuroepiteliálního adenokarcinomu, nodulámího melanomu, ovískového karcinomu, oligodendrogliálního, osteosarkomu, pankreatického polypeptidu, papilámího serózního adenokarcinomu, epifyzámích buněk, hypofyzámích nádorů, plasmacytomu, pseudosarkomu, plicního blastomu, karcinomu z renálních buněk, retinoblastomu, rhabdomyosarkomu, sarkomu, serózního karcinomu, karcinomu z malých buněk, karcinomů měkké tkáně, somatostatin-sekretujícího nádoru, skvamózního karcinomu, skvamózního buněčného karcinomu, submezoteliálního, povrchově šířícího se melanomu, nediferenciovaného karcinomu, uveálního melanomu, verukózního karcinomu, vipomu, buněčného diferenciovaného karcinomu a Wilmova nádoru.

Farmaceutické kompozice a použití účinných látek pro přípravu léčiv poskytuje jednu nebo více výhod. Jedna z výhod spočívá v tom, že přípravky, agens a terapie podle předloženého vynálezu jsou podávány v kombinaci v nižší dávce než byla dávka používána v klinických případech u každé z konkrétních, samostatně aplikovaných složek.

Výhoda ve snižování dávky sloučenin, přípravků, agens a terapií podle předloženého vynálezu aplikovaných savci zahrnuje snížení výskytu vedlejších účinků • · ·· · · · · · • · · · · · * * • · · ···« · • · · · · ·····*· • ♦ · · · · · · · ······ ·· · ·· · spojených s vyššími dávkami. Například snižováním dávky chemoterapeutika, např. methotrexatu, povede ke snížení frekvence a závažnosti nauzey a zvracení v porovnání s vyššími dávkami. Podobné výhody jsou i v případě, kdy inhibitor protein kinázy podle předloženého vynálezu je používán v kombinaci s inhibitorem cyklooxygenázy, konkrétně selektivním inhibitorem cykloxygenázy-2.

Snižováním výskytu vedlejších účinků je zamýšleno zlepšení kvality života pacienta, u kterého probíhá léčení rakoviny. Další výhody snižování výskytu vedlejších účinků zahrnují zlepšení kompliance nemocného, snížení počtu hospitalizací potřebných k léčení vedlejších účinků a snížení aplikace analgetik potřebných k léčení bolesti spojené s vedlejšími účinky.

Další výhodou má být inhibice nádorů, která je větší v případě aplikace inhibitoru protein kinázy v kombinaci s inhibitorem cykloxygenázy, výhodně selektivním inhibitorem cyklooxygenázy-2, než v případy aplikace kteréhokoliv samotného agens.

Předložený vynález dále zahrnuje kity obsahující inhibitor COX-2 a inhibitor protein kinázy obecného vzorce (I).

Detailní popis vynálezu

Pokud není uvedeno jinak, mají termíny používané v popisné části a nárocích níže uvedené významy:

Termín alkyl se vztahuje na nasycený alifatický uhlovodíkový radikál mající lineární nebo rozvětvený řetězec o 1 až 20 atomech uhlíku (číselné rozmezí, např. 1-20, znamená, že skupina, v tomto případě alkylová skupina, může obsahovat 1 atom uhlíku, 2 atomy uhlíku, 3 atomy uhlíku, atd. až 20 atomů uhlíku). Alkylové skupiny mající 1 až 4 atomy uhlíku jsou považovány za nižší alkylové skupiny. Pokud uvedené alkylové skupiny nemají substituenty, jsou označovány za nižší alkylové skupiny. Výhodněji je alkylová skupina alkyl o střední velikosti mající 1 až 10 atomů uhlíku, např. methyl, ethyl, propyl, 2-propyl, rz-butyl, Ao-butyl, terc-butyl, pentyl, atp. Nej výhodněji nižší alkyl mající 1 až 4 atomy uhlíku, např. methyl, ethyl, propyl, 2-propyl, zz-butyl, wo-butyl nebo /erc-butyl, atd.

Termín substituovaný alkyl znamená shora definovanou alkylovou skupinu substituovanou jedním nebo více, výhodněji jedním až třemi, ještě výhodněji jedním nebo dvěma, substituenty nezávisle vybranými ze skupiny sestávající z halogenu, • · • · ·· · · · • · · ······· • · · · · ·· ·

hydroxyskupiny, nižší alkoxyskupiny, arylu případně substituovaného jedním nebo více skupinami, výhodně jedním, dvěma nebo třemi skupinami, které jsou nezávisle jedna na druhé halogen, hydroxyskupina, nižší alkyl nebo nižší alkoxyskupiny, aryloxyskupina případně substituovaná jedním nebo více skupinami, výhodně jedním, dvěma nebo třemi skupinami, které jsou nezávisle jedna na druhé halogen, hydroxyskupina, nižší alkyl nebo nižší alkoxyskupina, 6-ti členný heteroaryl mající 1 až 3 atomy dusíku v kruhu, přičemž uhlíky v kruhu jsou případně substituovány jednou nebo více skupinami, výhodně jednou, dvěma nebo třemi skupinami, které jsou nezávisle jedna na druhé halogen, hydroxyskupina, nižší alkyl nebo nižší alkoxyskupiny, 5-ti členný heteroaryl mající 1 až 3 heteroatomy vybrané ze skupiny sestávající z dusíku, kyslíku a síry, přičemž atomy uhlíku a dusíku ve skupině jsou případně substituovány jednou nebo více skupinami, výhodně jednou, dvěma nebo třemi skupinami, které jsou nezávisle jedna na druhé halogen, hydroxyskupina, nižší alkyl nebo nižší alkoxyskupiny, 5-ti nebo 6-ti členná heteroalicyklická skupina mající 1 až 3 heteroatomy vybrané ze skupiny sestávající z dusíku, kyslíku a síry, přičemž atomy uhlíku a dusíku (pokud jsou přítomné) ve skupině jsou případně substituovány jednou nebo více skupinami, výhodně jednou, dvěma nebo třemi skupinami, které jsou nezávisle jedna na druhé halogen, hydroxyskupina, nižší alkyl nebo nižší alkoxyskupiny, merkaptoskupina, (nižší alkyl)thioskupina, arylthioskupina případně substituovaná jednou nebo více skupinami, výhodně jednou, dvěma nebo třemi skupinami, které jsou nezávisle jedna na druhé halogen, hydroxyskupina, nižší alkyl nebo nižší alkoxyskupiny, kyanoskupina, acyl, thioacyl, (9-karbamyl, V-karbamyl, (9-thiokarbamyl, V-thiokarbamyl, C-amidoskupina, TV-amidoskupina, nitroskupina, V-sulfonamidoskupina, 5-sulfonamidoskupina, R¹⁸S(O)-, R¹⁸S(O)2-, -C(O)OR¹⁸, substituent R¹⁸C(O)O-a -NR¹⁸R¹⁹, kde substituenty R¹⁸ a R¹⁹ jsou nezávisle vybrány ze skupiny sestávající z atomu vodíku, nižšího alkylu, trihalogenmethylu, (C3-C6)cykloalkylu, nižšího alkenylu, nižšího alkynylu a arylu případně substituovaného jednou nebo více skupinami, výhodně jednou, dvěma nebo třemi skupinami, které jsou nezávisle jedna na druhé halogen, hydroxyskupina, nižší alkyl nebo nižší alkoxyskupiny.

Výhodně je alkylová skupina substituovaná jedním nebo dvěma substituenty nezávisle vybranými ze skupiny sestávající z hydroxyskupiny, 5-ti nebo 6-ti členné heteroalicyklické skupiny mající 1 až 3 heteroatomy vybrané ze skupiny sestávající z dusíku, kyslíku a síry, přičemž atomy uhlíku a dusíku (pokud jsou přítomné) ve skupině ·· ·· ·· · ·· · • · · · ··· « · · ·· · · · ♦ · · ··· • · · · · · ···· · · · ···· • · · ··· ··· ······ ·· · ·· · jsou případně substituovány jednou nebo více skupinami, výhodně jednou, dvěma nebo třemi skupinami, které jsou nezávisle jedna na druhé halogen, hydroxyskupina, nižší alkyl nebo nižší alkoxyskupiny, 5-ti členný heteroaryl mající 1 až 3 heteroatomy vybrané ze skupiny sestávající z dusíku, kyslíku a síry, přičemž atomy uhlíku a dusíku ve skupině jsou případně substituovány jednou nebo více skupinami, výhodně jednou, dvěma nebo třemi skupinami, které jsou nezávisle jedna na druhé halogen, hydroxyskupina, nižší alkyl nebo nižší alkoxy skupiny, 6-ti členný heteroaryl mající 1 až 3 atomy dusíku v kruhu, přičemž uhlíky v kruhu jsou případně substituovány jednou nebo více skupinami, výhodně jednou, dvěma nebo třemi skupinami, které jsou nezávisle jedna na druhé halogen,

O IQ . 10 hydroxyskupina, nižší alkyl nebo nižší alkoxyskupiny nebo -NR R , kde substituenty R a R¹⁹ jsou nezávisle vybrány ze skupiny sestávající z atomu vodíku, nižšího alkylu. Ještě výhodněji je alkylová skupina substituována jedním nebo dvěma substituenty, které jsou nezávisle jeden na druhém hydroxyskupina, dimethylaminoskupina, ethy lamino skupina, diethylaminoskupina, dipropylaminoskupina, pyrrolidinoskupina, piperidinoskupina, morfolinoskupina, piperazinoskupina, 4-nižší alkylpiperazinoskupina, fenyl, imidazolyl, pyridinyl, pyridazinyl, pyrimidinyl, oxazolyl, triazinyl, atd.

Termín cykloalkyl se vztahuje na 3 až 8 členný plně uhlíkový monocyklický kruh, plně uhlíkový 5-ti členný/6-ti členný nebo 6-ti členný/6-ti členný kondenzovaný bicyklický kruh nebo multicyklický kondenzovaný kruh (kondenzovaný kruhový systém znamená, že každý kruh v systému vlastní pár atomů uhlíku patřící oběma kruhům současně),kde jeden nebo více kruhů může obsahovat jednu nebo více dvojných vazeb, ale žádný z kruhů nemá zcela konjugovaných pí-elektronový systém.

Příklady, bez jakékoliv limitace, cykloalkylových skupin zahrnují cyklopropan, cyklobutan, cyklopentan, cyklopenten, cyklohexan, cyklohexadien, adamantan, cykloheptan, cykloheptatrien, atd.

Termín substituovaný cykloalkyl znamená shora definovanou cykloalkylovou skupinu, která je substituována jedním nebo více, výhodněji jedním nebo dvěma substituenty, nezávisle vybranými ze skupiny sestávající z nižšího alkylu, trihalogenalkylu, halogenu, hydroxyskupiny, nižší alkoxyskupiny, arylu případně substituovaného jednou nebo více, výhodně jednou nebo dvěma, skupinami nezávisle jedna na druhé halogen, hydroxyskupina, nižší alkyl nebo nižší alkoxyskupiny, aryloxyskupinou případně substituovanou jednou nebo více, výhodně jednou nebo dvěma, skupinami nezávisle jedna *

• · * • · · · • · ···· • · · na druhé halogen, hydroxyskupina, nižší alkyl nebo nižší alkoxyskupiny, 6-ti členného heteroarylu majícího 1 až 3 atomy dusíku v kruhu, přičemž uhlíky v kruhu jsou případně substituovány jednou nebo více, výhodně jednou nebo dvěma, skupinami nezávisle jedna na druhé halogen, hydroxyskupina, nižší alkyl nebo nižší alkoxyskupina, 5-ti členného heteroarylu majícího 1 až 3 heteroatomy vybrané ze skupiny sestávající z dusíku, kyslíku a síry, atomů uhlíku a dusíku ze skupiny, která je případně substituována jednou nebo více, výhodně jednou nebo dvěma, skupinami nezávisle jedna na druhé halogen, hydroxyskupina, nižší alkyl nebo nižší alkoxyskupiny,

5- nebo 6-ti členného heteroalicyklické skupiny mající 1 až 3 heteroatomy vybrané ze skupiny sestávající z dusíku, kyslíku a síry, atomy uhlíku a dusíku (pokud jsou přítomné) ve skupině jsou případně substituované jednou nebo více, výhodně jednou nebo dvěma, skupinami nezávisle jedna na druhé halogen, hydroxyskupina, nižší alkyl nebo nižší alkoxyskupina, merkaptoskupiny, (nižší alkyljthioskupiny, arylthioskupiny případně substituované jednou nebo více, výhodně jednou nebo dvěma, skupinami nezávisle jedna na druhé halogen, hydroxyskupina, nižší alkyl nebo nižší alkoxyskupina, kyanoskupiny, acylu, thioacylu, O-karbamylu, JV-karbamylu, <?-thiokarbamylu,

A-thiokarbamylu, C-amidoskupiny, A-amidoskupiny, nitroskupiny, A-sulfonamido, 5-sulfonamidoskupiny, R¹⁸S(O)-, R¹⁸S(O)₂-, -C(O)OR¹⁸, R¹⁸C(O)O- a -NR¹⁸R¹⁹ mající shora definovaný význam.

Termín alkenyl se vztahuje na shora definovanou nižší alkylovou skupinu sestávající z alespoň dvou atomů uhlíků a alespoň jedné dvojné vazby typu uhlík-uhlík. Reprezentativní příklady zahrnují, ale není to nikterak limitováno, ethenyl, 1-propenyl, 2-propenyl, 1-, 2- nebo 3-butenyl, atd.

Termín alkynyl se vztahuje na shora definovanou nižší alkylovou skupinu sestávající z alespoň dvou atomů uhlíku a alespoň jedné trojné vazby typu uhlík-uhlík. Reprezentativní příklady zahrnují, ale není to nikterak limitováno, ethynyl, 1-propynyl, 2-propynyl, 1-, 2- nebo 3-butynyl, atd.

Termín aryl se vztahuje na plně uhlíkové monocyklické nebo polycyklické skupiny s kondenzovaným kruhem (tzn. kruhy, které mají sousedící páry atomů uhlíku) mající 1 až 12 atomů uhlíku a se zcela konjugovaným pí-elektronovým systémem. Příklady, ale není to nikterak limitováno, arylových skupin zahrnují fenyl, naftalenyl a anthracenyl. Arylová skupina může být substituovaná nebo nesubstituovaná. Pokud jsou skupiny(a) substituovány, pak výhodně jedním nebo více, výhodněji jedním, dvěma nebo ·· ·» ·· · ·« · • · · · ··· · · · ·· · · · · · · · · · ft · · · · « ···· · · · »·· ··· · · φ · · · ·····« ·· · · · * třemi, ještě výhodněji jedním nebo dvěma, substituenty nezávisle vybranými ze skupiny sestávající z nižšího alkylu, trihalogenalkylu, halogenu, hydroxyskupiny, nižší alkoxyskupiny, merkaptoskupiny, (nižší alkyljthioskupiny, kyanoskupiny, acylu, thioacylu, C-karbamylu, TV-karbamylu, O-thiokarbamylu, TV-thiokarbamylu, C-amidoskupiny, V-amidoskupiny, nitroskupiny, V-sulfonamidoskupiny, S-sulfonamidoskupiny, R¹⁸S(O)-, R¹⁸S(O)₂-, -C(O)OR¹⁸, R¹⁸C(O)O- a -NR¹⁸R¹⁹, přičemž substituenty R¹⁸ a R¹⁹ mají shora definovaný význam. Výhodně je arylová skupina případně substituována jedním nebo dvěma substituenty nezávisle vybranými z halogenu, nižšího alkylu, trihalogenalkylu, hydroxyskupiny, merkaptoskupiny, kyanoskupiny, V-amidoskupin, mono- nebo dialkylaminoskupiny, karboxyskupiny nebo V-sulfonamidoskupiny.

Termín heteroaryl se vztahuje na skupiny s monocyklickým nebo kondenzovaným kruhem (tzn. kruhy, které mají sousedící páry atomů) mající 5 až 12 atomů v kruhu a obsahující jeden, dva nebo tři heteroatomy vybrané z N, O nebo S, přičemž zbývající atomy kruhu jsou C, a kromě toho navíc zcela konjugovaný píelektronový systém. Příklady, ale není to nikterak limitováno, nesubstituovaných heteroarylových skupin zahrnují pyrrol, furan, thiofen, imidazol, oxazol, thiazol, pyrazol, pyridin, pyrimidin, chinolin, izochinolin, purin a karbazol. Heteroarylová skupina může být substituovaná nebo nesubstituovaná. Pokud je substituovaná, pak výhodně jedním nebo více, výhodně jedním, dvěma nebo třemi, ještě výhodněji jedním nebo dvěma, jsou substituenty nezávisle vybranými ze skupiny sestávající z nižšího alkylu, trihalogenalkylu, halogenu, hydroxyskupiny, nižší alkoxyskupiny, merkaptoskupiny, (nižší alkyl)thioskupiny, kyanoskupiny, acylu, thioacylu, O-karbamylu, yV-karbamylu, Othiokarbamylu, TV-thiokarbamylu, C-amidoskupiny, TV-amidoskupiny, nitroskupiny, V-sulfonamidoskupiny, 5-sulfonamidoskupiny, R¹⁸S(O)-, R¹⁸O)₂-, -C(O)OR¹⁸, R¹⁸C(O)Oa -NR¹⁸R¹⁹, přičemž substituenty R¹⁸ a R¹⁹ mají shora definovaný význam. Výhodně je heteroarylová skupina případně substituována jedním nebo dvěma substituenty nezávisle vybranými z halogenu, nižšího alkylu, trihalogenalkylu, hydroxyskupiny, merkaptoskupiny, kyanoskupiny, V-amidoskupiny, mono- nebo di-alkylaminoskupiny, karboxyskupiny nebo JV-sulfonamidoskupiny.

Termín heteroalicykl se vztahuje na skupinu monocyklického nebo kondenzovaného kruhu majícího v kruhu(zích) 5 až 9 atomů, kde jeden nebo dva atomy v kruhu jsou heteroatomy vybrané z N, O nebo S(O)„ (kde n je celé číslo od 0 do 2), přičemž zbývající atomy v kruhu jsou C. Kruhy mohou mít také jednu nebo více dvojných vazeb, ·< « • · · • · · · • · · ···· • · · ·« · ·· * « · · • · ·« • · ····· • · · ·« « *

• · · • · · ···· · · nicméně neobsahují plně konjugovaný pí-elektronovaný systém. Příklady, ale není to nikterak limitováno, nesubstituovaných heteroalicyklických skupin zahrnují pyrrolidinoskupinu, piperidinoskupinu, piperazinoskupinu, morfolinoskupinpl ₍ thiomorfolinoskupinu, homopiperazinoskupinu, atd. Heteroalicyklický kruh může být substituovaný nebo nesubstituovaný. Pokud je substituovaný, pak je výhodně jedním nebo více, výhodně jedním, dvěma nebo třemi, ještě výhodněji jedním nebo dvěma, substituenty nezávisle vybranými ze skupiny sestávající z nižšího alkylu, trihalogenalkylu, halogenu, hydroxyskupiny, nižší alkoxyskupiny, merkaptoskupiny, (nižší alkyljthioskupiny, kyanoskupiny, acylu, thioacylu, (9-karbamylu, V-karbamylu, (9-thiokarbamylu, V-thiokarbamylu, C-amidoskupiny, /V-amidoskupiny, nitroskupiny,

V-sulfonamidoskupiny, S-sulfonamidoskupiny, R¹⁸S(O)-, R¹⁸S(O)2-, -C(O)OR¹⁸,

R¹⁸C(O)O- a -NR¹⁸R¹⁹, přičemž substituenty R¹⁸ a R¹⁹ mají shora definovaný význam. Výhodně je heteroalicyklická skupina případně substituována jedním nebo dvěma substituenty nezávisle vybranými z halogenu, nižšího alkylu, trihalogenalkylu, hydroxyskupiny, merkaptoskupiny, kyanoskupiny, V-amidoskupiny, mono- nebo dialkylaminoskupiny, karboxyskupiny nebo V-sulfonamidoskupiny.

Výhodně je heteroalicyklická skupina případně substituována jedním nebo dvěma substituenty nezávisle vybranými z halogenu, nižšího alkylu, trihalogenalkylu, hydroxyskupiny, merkaptoskupiny, kyanoskupiny, V-amidoskupiny, mono- nebo dialkylaminoskupiny, karboxyskupiny nebo V-sulfonamidoskupiny.

Termín heterocykl znamená nasycený cyklický radikál mající 3 až 8 atomů v kruhu, ve kterém jsou jeden nebo dva atomy heteroatomy vybrané z N, O nebo S(O)_n (kde n je celé číslo od 0 do 2), přičemž zbývající atomy v kruhu jsou C, kde jeden nebo dva C atomy mohou být případně nahrazeny karbonylovou skupinou. Heterocyklylový kruh může být případně substituován nezávisle jedním, dvěma nebo třemi substituenty vybranými z případně substituovaného nižšího alkylu (substituovaného 1 nebo 2 substituenty nezávisle vybranými z karboxyskupiny nebo esteru), halogenalkylu, kyanoalkylu, halogenu, nitroskupiny, kyanoskupiny, hydroxyskupiny, alkoxyskupiny, aminoskupiny, monoalkylaminoskupiny, dialkylaminoskupiny, aralkylu, heteroaralkylu, -COR (kde substituent R je alkyl) nebo -COOR, kde substituent R je (atom vodíku nebo alkyl). Konkrétněji zahrnuje termín heterocyklyl, ale není to nikterak limitováno, tetrahydropyranyl, 2,2-dimethyl-l,3-dioxolan, piperidinoskupinu, V-methylpiperidin-3-yl, piperazinoskupinu, V-methylpyrrolidin-3-yl, 3-pyrrolidinoskupinu, morfolinoskupinu, thiomorfolinoskupinu, thiomorfolino-1 -oxid, • · • · ·

thiomorfolino-1,1 -dioxid,

4-ethyloxykarbonylpiperazinoskupinu, 3 -oxopiperazinoskupinu, 2-imidazolidon,

2-pyrrolidinon, 2-oxohomopiperazinoskupinu, tetrahydropyrimidin-2-on a jejich deriváty. Výhodně je heterocyklická skupina případně substituována jedním nebo dvěma substituenty nezávisle vybranými z halogenu, nižšího alkylu, nižšího alkylu substituovaného karboxyskupinou, ester hydroxyskupinou, mono- nebo dialkylaminoskupiny.

Termín hydroxyskupina se vztahuje na -OH skupinu.

Termín alkoxyskupina se vztahuje na -O-(alkyl) i na -O-(cykloalkyl) skupinu. Reprezentativní příklady zahrnují, ale není to nikterak limitováno, např. methoxyskupinu, ethoxyskupinu, propoxyskupinu, butoxyskupinu, cyklopropyloxyskupinu, cyklobutyloxyskupinu, cyklopentyloxyskupinu, cyklohexyloxyskupinu, atd.

Termín aryloxyskupina se vztahuje na shora definovanou -O-arylovou i na -Oheteroarylovou skupinu. Reprezentativní příklady zahrnují, ale není to nikterak limitováno, fenoxyskupinu, pyridinyloxyskupinu, furanyloxyskupinu, thienyloxyskupinu, pyrimidinyloxyskupinu, pyrazinyloxyskupinu, atd. a jejich deriváty.

Termín merkaptoskupina se vztahuje na -SH skupinu.

Termín alkylthioskupina se vztahuje na -S-alkylovou i na -S-cykloalkylovou skupinu. Reprezentativní příklady zahrnují, ale není to nikterak limitováno, např. methylthioskupinu, ethylthioskupinu, propylthioskupinu, butylthioskupinu, cyklopropylthioskupinu, cyklobutylthioskupinu, cyklopentylthioskupinu, cyklohexylthioskupinu, atd.

Termín arylthioskupina se vztahuje na shora definovanou -S-arylovou i na -Sheteroarylovou skupinu. Reprezentativní příklady zahrnují, ale není to nikterak limitováno, fenylthioskupinu, pyridinylthioskupinu, furanylthioskupinu, thientylthioskupinu, pyrimidinylthioskupinu, atd. a jejich deriváty.

Termín acyl se vztahuje na -C(O)-R skupinu, kde substituent R je vybrán ze skupiny sestávající z atomu vodíku, nižšího alkylu, trihalogenmethylu, cykloalkylu, arylu případně substituovaného jedním nebo více, výhodně jedním, dvěma nebo třemi substituenty vybranými ze skupiny sestávající z nižšího alkylu, trihalogenmethylu, nižší alkoxyskupiny, halogenu a -NR¹⁸R¹⁹ skupin, heteroarylu (vázaný přes uhlík kruhu) případně substituované jedním nebo více, výhodně jedním, dvěma nebo třemi, substituenty vybranými ze skupiny sestávající z nižšího alkylu, trihalogenalkylu, nižší • · alkoxyskupiny, halogenu a -NR¹⁸R¹⁹ skupin a heteroalicyklické skupiny (vázané přes uhlík v kruhu) případně substituovaného jedním nebo více, výhodně jedním, dvěma nebo třemi substituenty vybranými ze skupiny sestávající z nižšího alkylu, trihalogenalkylu, nižší alkoxyskupiny, halogenu a -NR⁸R¹⁹ skupin. Reprezentativní acylové skupiny zahrnují, ale není to nikterak limitováno, acetyl, trifluoracetyl, benzoyl, atd.

Termín aldehyd se vztahuje na acylovou skupinu, ve které substituent R je atom vodíku.

Termín thioacyl se vztahuje na -C(S)-R skupinu, přičemž substituent R má shora definovaný význam.

Termín ester se vztahuje na -C(O)O-R skupinu, přičemž substituent R má shora definovaný význam kromě toho, že substituent R nemůže být atom vodíku.

Termín acetylová skupina se vztahuje na -C(O)CH₃ skupinu.

Termín halogen se vztahuje na fluor, chlor, brom nebo jod, výhodně fluor nebo chlor.

Termín trihalogenmethylová skupina se vztahuje na -CX3 skupinu, kde X je halogen mající shora definovaný význam.

Termín trihalogenmethansulfonylová skupina se vztahuje na X3CS(=O)2skupiny, kde X má shora definovaný význam.

Termín kyanoskupina se vztahuje na -CsN skupinu.

Termín methylendioxyskupina se vztahuje na -OChUO-skupinu, kde dva atomy kyslíku jsou připojeny k sousedním atomům uhlíku.

Termín ethylendioxy skupina se vztahuje na -OCH2CH2O-, kde dva atomy kyslíku jsou připojeny k sousedícím atomům uhlíku.

Termín S-sulfonamidoskupina se vztahuje na -S(O)2NR¹⁸R¹⁹ skupinu, přičemž substituenty R¹⁸ a R¹⁹ mají shora definovaný význam.

Termín 'W-sulfonamidoskupina se vztahuje na -NR¹⁸S(O)2R¹⁹ skupinu, přičemž substituenty R¹⁸ a R¹⁹ mají shora definovaný význam.

Termín O-karbamylová skupina se vztahuje na -OC(O)NR¹⁸R¹⁹ skupinu, přičemž substituenty R¹⁸ a R¹⁹ mají shora definovaný význam.

Termín W-karbamylová skupina se vztahuje na R¹⁸OC(O)NR¹⁹- skupinu, přičemž substituenty R¹⁸ a R¹⁹ mají shora definovaný význam.

Termín O-thiokarbamylová skupina se vztahuje na -OC(S)NR¹⁸R¹⁹ skupinu, přičemž substituenty R¹⁸ a R¹⁹ mají shora definovaný význam.

Termín 'W-thiokarbamylová skupina se vztahuje na R¹⁸OC(S)NR¹⁹- skupinu, přičemž substituenty R¹⁸ a R¹⁹ má shora definovaný význam.

Termín aminoskupina se vztahuje na -NR¹⁸R¹⁹ skupinu, kde substituenty R¹⁸ a R¹⁹ jsou oba atomy vodíku.

Termín C-amidoskupina se vztahuje na -C(O)NR¹⁸R¹⁹ skupinu, přičemž substituenty R¹⁸ a R¹⁹ mají shora definovaný význam.

Termín 'W-amidoskupina se vztahuje na R¹⁸C(O)NR¹⁹-skupinu, přičemž substituenty R¹⁸ a R¹⁹ mají shora definovaný význam.

Termín nitroskupina se vztahuje na -NO2 skupinu.

Termín halogenalkyl znamená alkyl, výhodně nižší, shora definovaný alkyl, který je substituován jedním nebo více stejnými nebo rozdílnými halogeny, např. -CH2CI, -CF3, CH2CF3, -CH2CCI3, atd.

Termín aralkyl znamená alkyl, výhodně nižší, shora definovaný, alkyl, který je substituován shora definovanou arylovou skupinou, např. -CFfefenyl, -(CH^fenyl, -(CF^fenyl, CH3CH(CH3)CH2fenyl, atd. a jejich deriváty.

Termín heteroaralkyl skupina znamená alkyl, výhodně nižší, shora definovaný, alkyl, který je substituován heteroarylovou skupinou, např. -CH₂pyridinylem, -(CH2)2pyrimidinylem, -(CFFbimidazolylem, atd. a jejich deriváty.

Termín monoalkylaminoskupina znamená radikál -NHR, kde substituent R je nesubstituovaná, shora definovaná, alkylová nebo cykloalkylová skupina, např. methylaminoskupina, (l-methylethyl)aminoskupina, cyklohexylaminoskupina, atd.

t,

Termín dialkylaminoskupina znamená radikál -NRR, kde každý substituent R je nezávisle nesubstituovaná, shora definovaná, alkylová nebo cykloalkylová skupina, např. dimethylaminoskupina, diethylaminoskupina, (1 -methylethylj-ethylaminoskupina, cyklohexylmethylaminoskupina, cyklopentylmethylaminoskupina, atd.

Termín kyanoalkyl znamená alkyl, výhodně nižší, shora definovaný, alkyl, který je substituovaný 1 nebo 2 kyanoskupinami.

Termín případně nebo popřípadě znamená, že následně popsané případy nebo okolnosti mohou, ale nemusejí být, a že popis zahrnuje situace, kdy se daný případ nebo okolnosti vyskytují a situace, kdy se nevyskytují. Například termín heterocyklická skupina případně substituovaná alkylovou skupinou znamená, že alkyl může, ale taky nemusí být přítomen, a popis také zahrnuje situace, ve kterých heterocyklická skupina je • · substituována alkylovou skupinou, a situace, ve kterých heterocyklická skupina není substituována alkylovou skupinou.

Termín 2-indolinon, indolin-2-on a 2-oxindol jsou zde používány zaměnitelným způsobem a vztahují se na molekulu mající následující chemickou strukturu:

Termín pyrrol se vztahuje na molekulu mající následující chemickou strukturu:

_zRs-7

H

Termín 2-indolinon substituovaný pyrrolem a 3-pyrrolidenyl-2-indolinon jsou zde používány zaměnitelným způsobem a vztahují se na chemickou sloučeninu mající obecnou strukturu uvedenou na obecném vzorci (I).

Termín sloučeniny, které mají stejný molekulový vzorec, ale liší se v původu nebo sekvenci vazeb svých atomů nebo uspořádáním svých atomů v prostoru jsou označovány jako izomery. Izomery, které se liší v uspořádání svých atomů v prostoru se označují jako stereoizomery.

Stereoizomery, které nejsou navzájem zrcadlovými obrazy, jsou označovány diastereoizomery, a stereoizomery, které jsou navzájem zrcadlovými obrazy, jsou označovány enantiomery. Pokud má sloučenina asymetrické centrum, např. je vázána ke čtyřem různým skupinám, existuje možnost vzniku obou enantiomerů. Enantiomer může být charakterizován absolutní konfigurací svého asymetrického centra a je popsán R a S systémem označení podle Cahna a Preloga nebo charakteristickým stáčením roviny polarizovaného světla o označována jako pravotočivý nebo levotočivý (tzn. jako (+) nebo (-)-izomery). Chirální sloučenina může existovat buď jako konkrétní enantiomer nebo jeho směs. Směs obsahující ekvivalentní podíly enantiomerů se nazývá racemická směs.

Sloučeniny podle předloženého vynálezu mohou mít jedno nebo více asymetrických center, např. sloučeniny tedy mohou být připraveny jako (R)- nebo (S)-stereoizomery nebo jako jejich směsi. Například pokud substituent R⁶ ve sloučenině obecného vzorce (I) je 2-hydroxyethyl, pak uhlík, ke kterému je hydroxyskupina připojena vytváří asymetrické centrum a tudíž sloučenina obecného vzorce (I) může existovat jako (R)- nebo (S)-stereoizomer. Pokud není uvedeno jinak, má popis nebo označení konkrétní sloučeniny v popisu a nárocích zahrnovat jednotlivé enantiomery a jejich směsi, racemické nebo jiné. Způsoby určení stereochemie a separace stereoizomerů jsou dobře známy z literatury (viz Chapter 4 of Advanced Organic Chemistry, 4th edition J. March, John Wiley and Sons, New York, 1992).

Sloučeniny podle předloženého vynálezu mohou vykazovat tautomerii a strukturní izomerii. Například sloučeniny obecného vzorce (I) popsané v předloženém vynálezu mohou mít E nebo Z konfiguraci okolo dvojné vazby spojující 2-indolinonovou část s pyrrolovou částí nebo mohou být směs E a Z. Do předloženého vynálezu spadá jakákoliv tautomerní nebo strukturní izomerní forma a jejich směsi, které mají schopnost modulovat RTK, CTK a/nebo STK aktivitu, a předložený vynález není omezen na jakoukoliv tautomerní nebo strukturní formu.

Termín farmaceutický přípravek se vztahuje na směs jedné nebo více sloučenin popsaných v předloženém vynálezu nebo jejich fyziologicky/farmaceuticky přijatelných solí nebo proléčiv s dalšími chemickými složkami, např. fyziologicky/farmaceuticky přijatelnými nosiči a excipienty. Účel farmaceutického přípravku spočívá v usnadnění aplikace sloučeniny do organizmu.

Sloučeniny podle předloženého vynálezu mohou také fungovat jako proléčivo. Termín proléčivo se vztahuje na agens, které se konvertuje na mateřské léčivo in vivo. V některých případech jsou proléčiva velmi praktická, jelikož je lze snadněji aplikovat než mateřské léčivo. Například mohou být biologicky dostupná perorálním podáním, zatímco mateřské léčivo nikoliv. Proléčivo může také mít zlepšenou rozpustnost ve farmaceutických přípravcích než mateřské léčivo. Například bez jakéhokoliv omezení by proléčivem mohla být sloučenina podle předloženého vynálezu, která je podávána jako ester (proléčivo) k usnadnění prostupu skrz buněčnou membránu, kde rozpustnost ve vodě je v neprospěch mobilitě, nicméně poté dojde k metabolické hydrolýze na karboxylovou kyselinu, aktivní entitu, a vstupem sloučeniny do vnitřku buňky je rozpustnost výhodná.

• · · • ··· • * «···

Dalším příkladem pro léčiva může být krátký polypeptid, například bez jakéhokoliv omezení polypeptid o 2 -10 aminokyselinách vázaný přes koncovou aminoskupinu ke karboxyskupině sloučeniny podle předloženého vynálezu, přičemž polypeptid je hydrolyzován nebo metabolizován in vivo k uvolnění aktivní molekuly. Proléčiva sloučenin obecného vzorce (I) spadají rovněž do předloženého vynálezu.

Navíc se předpokládá, že sloučeniny obecného vzorce (I) by mohly být metabolizovány enzymy v těle organizmu, např. v lidech, a tím vytvořit metabolit, který by moduloval aktivitu protein kináz. Tyto metabolity spadají rovněž do předloženého vynálezu.

Termín fyziologicky/farmaceuticky přijatelný nosič, jak používán v předloženém vynálezu, se vztahuje na nosič nebo rozpouštědlo, které nezpůsobuje výraznou iritaci organizmu a neruší biologickou aktivitu a vlastnosti aplikované sloučeniny.

Termín farmaceuticky přijatelný excipient se vztahuje na inertní látku přidávanou do farmaceutického přípravku k dalšímu usnadnění aplikace sloučeniny. Příklady excipientů, které nemají nikterak limitovat, zahrnují uhličitan vápenatý, fosforečnan vápenatý, různé cukry a typy škrobů, deriváty celulózy, želatinu, rostlinné oleje a polyethylenglykoly.

Termín farmaceuticky přijatelná sůl, jak je používán v předloženém vynálezu, se vztahuje na ty soli, které si uchovávají biologickou účinnost a vlastnosti mateřské sloučeniny. Takové soli zahrnují:

(i) adiční soli s kyselinou připravené reakcí volné báze mateřské sloučeniny s anorganickými kyselinami, např. kyselinou chlorovodíkovou, bromovodíkovou, dusičnou, fosforečnou, sírovou a chloristou, atd. nebo s organickými kyselinami, např. kyselinou octovou, oxalovou, (D) nebo (L) jablečnou kyselinou, kyselinou maleinovou, methanosulfonovou, ethansulfonovou, p-toluensulfonovou, salicylovou, vinnou, citrónovou, sukcinovou nebo malonovou, atd., výhodně kyselinou chlorovodíkovou nebo (L)-jablečnou kyselinou, např. L-malát (2-diethylaminoethyl)amidu 5-(5-fluor-2-oxo-l,2dihydroindol-3-ylidenmethyl)-2,4-dimethyl-l//-pyrrol-3-karboxylové kyseliny; nebo (ii) soli připravené v případě přítomnosti kyselého protonu v mateřské sloučenině buď nahrazením iontu kovu, např. iont alkalického kovu, iont kovu alkalických zemin; nebo koordinací s organickou bází. Názorné příklady iontů zahrnují hliník, vápník, lithium, hořčík, draslík, sodík a zinek ve svých obvyklých valencích. Výhodné organické báze zahrnují protonované terciární aminy a kvartemí amoniové kationty, včetně • · • ··· trimethylaminu, diethylaminu, ΛζιΥ'-dibenzylethylendiaminu, chloroprokainu, cholinu, diethanolaminu, ethylendiaminu, megluminu (jV-methylglukaminu) a prokainu.

Termín způsob se vztahuje na způsoby, prostředky, techniky a procedury používané k dosažení požadovaného úkolu zahrnující, ale není to nikterak limitováno, ty způsoby, prostředky, techniky a procedury, které jsou známé nebo snadno vyvinutelné ze známých způsobů, prostředků, technik a procedur odborníky v oboru chemie, farmacie, biologie, biochemie a medicíny.

Termín ošetření a léčení se vztahuje na jakýkoliv proces, účinek, aplikaci, terapii, atd., při které je savec, včetně lidí, podroben lékařskému zákroku se záměrem zlepšit stav savce, ať přímo či nepřímo. Konkrétně, co se týče rakoviny, tak tyto termíny znamenají, že délka života jedince postiženého rakovinou bude prodloužena, nebo že jeden nebo více symptomů onemocnění bude zlepšen, což může být sledováno mimo jiné zpožděným výskytem primárních nebo sekundárních nádorů, zpomalením vývoje primárních nebo sekundárních nádorů, snížením výskytu primárních nebo sekundárních nádorů, zpomalením nebo snížením závažnosti sekundárních účinků onemocnění, zastavením růstu nádoru a regresí nádorů.

Termín prevence zahrnuje buď prevenci před vypuknutím klinicky evidentní celkové neoplazie nebo prevenci před vypuknutním preklinicky evidentního stádia neoplazie u jedinců s tímto rizikem. Do této definice rovněž patří prevence iniciace maligních buněk nebo zastavení nebo reverze progrese premaligních buněk na maligní buňky, což zahrnuje profylaktické ošetření jedinců, kteří jsou v riziku vypuknutí neoplazie.

Fráze terapeuticky účinné znamená určení množství každého z agens, kterým bude dosaženo požadované zlepšení závažnosti neoplastického onemocnění a frekvence neoplastického onemocnění nad ošetřením každého samotného agens, přičemž nebude docházet k nežádoucím vedlejším účinkům, které jsou typicky spojeny s alternativními terapiemi.

Termín terapeutický účinek nebo terapeuticky účinné množství má určovat množství kancerostatického agens potřebného ke zmírnění (do jisté míry) jednoho nebo více symptomů neoplazie zahrnující, ale není to nikterak limitováno: 1) snížení počtu rakovinových buněk; 2) snížení velikosti nádoru; 3) inhibici (tzn. zpomalení do jisté míry, výhodně zastavení) infiltrace rakovinových buněk do periferních orgánů; 3) inhibici (tzn. zpomalení, výhodně zastavení) metastáze nádoru; 4) inhibice (do jisté míry) růstu nádoru; 5) zmírnění nebo snížení (do jisté míry) jednoho nebo více symptomů spojených s ·· · onemocněním; a/nebo 6) zmírnění nebo snížení vedlejších účinků spojených s podáním kancerostatických agens.

Fráze kombinovaná terapie (nebo ko-terapie) zahrnuje podání inhibitoru protein kinázy a inhibitoru cyklooxygenázy-2 v rámci specifického ošetřovacího režimu, který má poskytovat prospěšný účinek společného působení těchto terapeutických agens. Prospěšný účinek kombinace zahrnuje, ale není to nikterak limitováno, farmakokinetický nebo farmakodynamický společný účinek vyplývající z kombinace terapeutických agens. Podání těchto terapeutických agens v kombinaci je typicky prováděno po předem definovanou dobu (obvykle minuty, hodiny, dny nebo týdny v závislosti na vybrané kombinaci). Kombinovaná terapie nemá obecně zahrnovat podání dvou nebo více těchto terapeutických agens v rámci oddělených monoterapeutických režimů, které náhodně nebo libovolně vedou ke kombinacím podle předloženého vynálezu. Kombinovaná terapie má zahrnovat podání těchto terapeutických agens po sobě, tzn. každé terapeutické agens je podáváno v rozdílnou dobu, jakož i zahrnovat podání těchto terapeutických agens, nebo alespoň dvou terapeutických agens, v podstatě najednou. V podstatě současné podání může být provedeno například podáním jednorázové kapsle mající fixní poměr každého terapeutického agens subjektu nebo rozdělených, jednorázových kapslí s každým z terapeutických agens. Postupné nebo v podstatě současné podání každého z terapeutických agens může být provedeno jakýmkoliv vhodným způsobem zahrnujícím, ale není to nikterak limitováno, perorální způsoby, intravenózní způsoby, intramuskulámí způsoby a přímou absorpcí skrz tkání s mukózní membránou. Terapeutická agens mohou být podávána stejným způsobem nebo rozdílnými způsoby. Například první terapeutické agens z vybrané kombinace může být podáváno intravenózní injekcí, přičemž další terapeutická agens z kombinace mohou být podávána perorálně. Alternativně mohou být například obě terapeutická agens podávána perorálně nebo mohou být obě terapeutická agens podávána intravenózní injekcí. Pořadí, kterým se terapeutická agens podávají, je velice důležité. Kombinovaná terapie také může zahrnovat podání shora popsaných terapeutických agens v další kombinaci s jinými biologicky aktivními složkami (například, ale není to nikterak limitováno, chirurgicky nebo ozařováním). Pokud kombinovaná terapie dále zahrnuje ozařování, může být toto ozařování prováděno tak dlouho, dokud bude dosahováno výhodného účinku společného působení kombinace terapeutických agens a ozařování. Například ve vhodných případech je výhodného účinku stále dosahováno i při dočasném vynechání ozařování při podávání terapeutických agens, asi dny nebo i týdny.

• · · • ···· * • · • · · • ···· • ♦

Termín adjunkční terapie zahrnuje ošetření subjektu agens, který snižuje nebo ruší vedlejší účinky spojené s kombinovanou terapií podle předloženého vynálezu, například včetně těch agens, ale není to nikterak limitováno, které snižují toxický účinek kancerostatik, např. inhibitory resorpce kosti, kardioprotektiva; zabraňují nebo snižují výskytu nauzey a vomitu spojeného s chemoterapií, radioterapií nebo operací; nebo snižují výskyt infekce spojené s podáním myelosupresivních kancerostatik.

Výhodná provedení

I když nej širší definice byla uvedena v podstatě vynálezu, jsou určité sloučeniny obecného vzorce (I), (II) a (III) uvedené níže v provedení podle předloženého vynálezu výhodné.

A. Inhibitor tyrosin-specifické protein kinázy - sloučeniny obecného vzorce (I):

(1) Výhodná skupina sloučenin obecného vzorce (I) je ta, ve které substituenty R , R a

R⁴ jsou atom vodíku.

(2) Další výhodná skupina sloučenin obecného vzorce (I) je ta, ve které substituenty

R¹, R² a R⁴ jsou atom vodíku.

(3) Další výhodná skupina sloučenin obecného vzorce (I) je ta, ve které substituenty

R¹, R² a R³ jsou atom vodíku.

(4) Další výhodná skupina sloučenin obecného vzorce (I) je ta, ve které substituenty

R², R³ a R⁴ jsou atom vodíku.

(5) Další výhodná skupina sloučenin obecného vzorce (I) je ta, ve které substituenty

R¹, R², R³ a R⁴ jsou atom vodíku.

(6) Další výhodná skupina sloučenin obecného vzorce (I) je ta, ve které substituenty

R⁵, R⁶ nebo R⁷, výhodně substituenty R⁵ nebo R⁶, výhodněji substituent R⁶ je

-COR¹⁰, kde substituent R¹⁰ je -NR¹¹(CH₂)_nR¹², kde:

substituent R¹¹ je atom vodíku nebo nižší alkyl, výhodně atom vodíku nebo methyl;

n je 2, 3 nebo 4, výhodně 2 nebo 3; a substituent R¹² je -NR¹³R¹⁴, kde substituenty R¹³ a R¹⁴ jsou nezávisle alkyl, výhodněji nižší nižší alkyl nebo substituenty R¹³ a R¹⁴ spojeny dohromady vytvářejí skupinu vybranou z -(0¾)^, -(CITžjs-, -(CH2)2-O-(CH2)2- nebo (CH2)2N(CH3)(CH2)2-, výhodně substituenty R¹³ a R¹⁴ jsou nezávisle atom vodíku, • · • ·<

• · • · · • ··· methyl, ethyl nebo spojeny dohromady vytvářejí morfolin-4-yl, pyrrolidin-l-yl, piperazin-l-yl nebo 4-methylpiperazin-l-yl.

Výhodněji, substituent R⁵ nebo R⁶ v bodě (6) výše je N-(2dimethylaminoethyl)aminokarbonyl, V-(2-ethylaminoethyl)-Vmethylaminokarbonyl, N-(3 -dimethylaminopropyl)-aminokarbonyl,

V-(2-diethylaminoethyl)aminokarbonyl, V-(3-ethylaminopropyl)aminokarbonyl, N-(3 -diethy laminopropy ljaminokarbonyl, 3 -pyrrolidin-1 -yl-propylaminokarbonyl, 3 -morfolin-4-ylpropyl-aminokarbonyl, 2-pyrrolidin-1 -ylethylaminokarbonyl,

2-morfolin-4-ylethylaminokarbonyl, 2-(4-methylpiperazin-1 -y l)ethy 1aminokarbonyl, 2-(4-methylpiperazin-1 -yl)propylaminokarbonyl, 2-(3,5dimethylpiperazin-1 -y)ethylaminokarbonyl nebo 2-(3,5-dimethylpiperazin-1 yl)propylaminokarbonyl, ještě výhodněji V-(2-diethylaminoethyl)aminokarbonyl nebo V-(2-ethylaminoethyl)amino-karbonyl.

(7) Další výhodná skupina sloučenin obecného vzorce (I) je ta, ve které substituenty R⁵, R⁶ nebo R⁷, výhodně substituent R^{5 *} nebo R⁶, výhodněji substituent R⁶ je -COR¹⁰, kde substituent R¹⁰ je -NR¹³R¹⁴, kde substituent R¹³ je atom vodíku a substituent R¹⁴ je alkyl, výhodně nižší alkyl substituovaný hydroxyskupinou, ary lem, heteroarylem, heteroalicyklem nebo karboxy skupinou, výhodněji methyl, ethyl, propyl nebo butyl substituovaný hydroxyskupinou, arylem, heteroalicyklem, např. piperidin, piperazin, morfolin atd., heteroaryl nebo karboxyskupina. Ještě výhodněji v rámci této skupiny (7), substituent R⁵ nebo R⁶ je

2- ethoxykarbonylmethyl-aminokarbonyl, karboxymethylaminokarbonyl,

3- hydroxypropyl-aminokarbonyl, 2-hydroxyethylaminokarbonyl, 3-triazin-1 ylpropylamino-karbonyl, triazin-1 -ylethylaminokarbonyl, 4-hydroxyfenylethylaminokarbonyl, 3 -imidazol-1 -ylpropyl-aminokarbonyl, pyridin-4ylmethylaminokarbonyl, 2-pyridin-2-ylethylaminokarbonyl nebo 2-imidazol-ly lethylaminokarbonyl.

(8) Další výhodná skupina sloučenin obecného vzorce (I) je ta, ve které substituenty

R⁵, R⁶ nebo R⁷, výhodně substituenty R⁵ nebo R⁶, výhodněji substituent R⁶ je

-COR¹⁰, kde substituent R¹⁰ je -NR^CHijnR¹², kde:

substituent R¹¹ je atom vodíku nebo alkyl, výhodně atom vodíku nebo methyl;

n je 2, 3 nebo 4, výhodně 2 nebo 3; a substituent R¹² je -NR¹³R¹⁴, kde substituenty R¹³ a R¹⁴ spojeny dohromady vytvářejí heterocykl, výhodně 5, 6 nebo 7 členný heterocykl obsahující karbonylovou skupinu a 1 nebo 2 atomy dusíku. Výhodně je substituent R⁵ nebo R⁶ 2-(3-ethoxykarbonylmethylpiperazin-1 -yl)ethylaminokarbonyl, 2-(3 -oxopiperazin1 -yl)ethylaminokarbonyl, 2-(imidazolidin-1 -yl-2-on)ethylaminokarbonyl,

2-(tetrahydropyrimidin-1 -yl-2-on)ethylaminokarbonyl, 2-(2-oxopyrrolidin-1 -yl)ethylaminokarbonyl, 3 -(4-methylpiperazin-1 -yl)propylaminokarbonyl,

-(3 -ethoxykarbonylmethylpiperazin-1 -yl)propylaminokarbony 1, 3 -(3 oxopiperazin-1 -y l)propyl-aminokarbonyl, 3 -(imidazolidin-1 -yl-2-on)propylaminokarbonyl, 3 -(tetrahydropyrimidin-1 -yl-2-on)propylaminokarbonyl, 3 -(2oxopyrrolidin-1 -yl)propyl-aminokarbonyl, 2-(2-oxohomopiperidin-1 -y 1)ethylamino-karbonyl nebo 3 -(2-oxohomopiperidin-1 -yl)propylaminokarbonyl.

(9) Další výhodná skupina sloučenin obecného vzorce (I) je ta, ve které substituenty R⁵, R⁶ nebo R⁷, výhodně substituent R⁵ nebo R⁶, výhodněji substituent R⁶ je -COR^{10 *}, kde:

(a) substituent R¹⁰ je -NR^CI^nR¹², kde:

substituent R¹¹ je atom vodíku nebo alkyl, výhodně atom vodíku nebo methyl;

n je 2, 3 nebo 4, výhodně 2 nebo 3; a substituent R¹² je -NR¹³R¹⁴, kde substituent R¹³ je atom vodíku a substituent R¹⁴ je kyanoalkyl nebo -NCOR^a, kde substituent R^a je alkyl; nebo (b) substituent R¹⁰ je -NR¹³R¹⁴, kde substituenty R¹³ a R¹⁴ spojeny dohromady vytvářejí heterocykl neobsahující karbonylovou skupinu v tomto kruhu. Výhodně je substituent R⁵ nebo R⁶ 2-(2-kyanoethylamino)ethylaminokarbonyl, 2-(acetylamino)-ethylaminokarbonyl, morfolinokarbonyl, piperidin-1 -yl-karbonyl, 2-kyanomethylaminoethylaminokarbonyl nebo piperidin-1 -ylkarbonyl.

(10) Další výhodná skupina sloučenin obecného vzorce (I) je ta, ve které substituent R⁵ je -COR¹⁰, kde substituent R¹⁰ je -NR¹³R¹⁴, kde substituent R¹³ je atom vodíku a • · · • «·· substituent R^{12 13 14} je nižší alkyl substituovaný hydroxyskupinou, nižší alkyl substituovaný hydroxyalkylaminoskupinou, karboxyskupina nebo -NR¹⁸R¹⁹, kde substituenty R¹⁸ a R¹⁹ jsou nezávisle atom vodíku nebo nižší alkyl, výhodněji substituent R⁵ je 2-[(diethylamino)-2-hydroxyethyl]aminokarbonyl, 2-(V-ethyl-V-2hydroxyethylaminojethylaminokarbonyl, karboxymethylamino-karbonyl nebo 2-(2hydroxyethylaminojethylamino-karbonyl.

(11) Další výhodná skupina sloučenin obecného vzorce (I) je ta, ve které substituent R je -COR¹⁰, kde substituent R¹⁰ je -NR¹³R¹⁴, kde substituent R¹³ je atom vodíku a substituent R^{14 *} je nižší alkyl substituovaný hydroxyskupinou, nižší alkyl substituovaný hydroxyalkylaminoskupinou, karboxyskupina nebo -NR¹⁸R¹⁹, kde substituenty R¹⁸ a R¹⁹ jsou nezávisle atom vodíku nebo nižší alkyl; výhodněji substituent R⁶ je [2-(diethylamino)-2-hydroxy]ethylaminokarbonyl, 2-(V-ethyl-2V-2hydroxyethylaminojethylaminokarbonyl, karboxymethylaminokarbonyl nebo 2-(2hydroxyethylaminojethylamino-karbonyl.

(12) Další výhodná skupina sloučenin obecného vzorce (I) je ta, ve které substituent R⁵ je -COR¹⁰, kde substituent R¹⁰ je -NR¹¹(CH2)nR¹², kde substituent R¹² je -N⁺(O)NR¹³R¹⁴ nebo -N(OH)R¹³, kde substituenty R¹³ a R¹⁴ jsou nezávisle vybrány ze skupiny sestávající z atomu vodíku a nižšího alkylu, výhodně substituent R⁵ je 2-(V-hydroxy-V-ethylamino)-ethylaminokarbonyl nebo 2- [N⁺(O‘)(C2H₅)₂] ethy 1-aminokarbonyl (13) Další výhodná skupina sloučenin obecného vzorce (I) je ta, ve které substituent R⁶ je -COR¹⁰, kde substituent R¹⁰ je -NR^CH^R¹², kde substituent R¹² je -N⁺(O')NR¹³R¹⁴ nebo -N(OH)R¹³, kde substituenty R¹³ a R¹⁴ jsou nezávisle vybrány ze skupiny sestávající z atomu vodíku a nižšího alkylu, výhodně substituent R⁶ je 2-(V-hydroxy-V-ethylamino)ethylaminokarbonyl nebo 2-[N⁺(O')(C₂H5)₂]ethyl-aminokarbonyl.

(14) Ve výše uvedených výhodných skupinách (6)-(13), pokud substituent R⁵ je -COR¹⁰, je ještě výhodnější skupina sloučenin ta, ve které:

substituent R⁶ je vybrán ze skupiny sestávající z atomu vodíku a alkylu, výhodně atom vodíku, methyl, ethyl, izopropyl, Zerc-butyl, izobutyl nebo nbutyl, výhodněji atom vodíku nebo methyl; a • * <· ·« • » • · ···· • · • » · • »··· • · »· « · • · · • ···« • · substituent R⁷ je vybrán ze skupiny sestávající z atomu vodíku, alkylu, arylu, heteroarylu a -C(O)R¹⁷, kde substituent R¹⁷ je hydroxyskupina, alkyl nebo aryl, výhodněji atom vodíku, methyl, ethyl, izopropyl, η-, izo nebo /erc-butyl, fenyl, benzoyl, acetyl nebo karboxyskupina. Ještě výhodněji methyl, atom vodíku nebo fenyl.

(15) Ve výše uvedených výhodných skupinách (6)-(13), pokud substituent R⁵ je -COR¹⁰, je ještě další výhodnější skupina sloučenin ta, ve které jsou substituenty R a R spojeny dohromady a vytvářejí -(CH2)4-.

(16) Ve výše uvedených výhodných skupinách (6)-(13), pokud substituent R⁶ je -COR¹⁰, je ještě výhodnější skupina sloučenin ta, ve které:

substituent R⁵ je vybrán ze skupiny sestávající z atomu vodíku a alkylu, výhodně atomu vodíku, methylu, ethylu, izopropylu, Zerc-butylu, izobutylu nebo n-butylu, výhodněji atom vodíku nebo methyl; a substituent R⁷ je vybrán ze skupiny sestávající z atomu vodíku, alkylu, arylu, heteroarylu a -C(O)R¹⁷, kde substituent R¹⁷ je hydroxyskupina, alkyl nebo aryl, výhodněji atom vodíku, methyl, ethyl, izopropyl, η-, izo- nebo íerc-butyl, fenyl, benzoyl, acetyl nebo karboxyskupina. Ještě výhodněji methyl, atom vodíku nebo fenyl.

(17) V rámci shora uvedených výhodných a výhodnějších skupin (6)-(16) je ještě výhodnější skupina sloučenin ta, ve které:

substituent R¹ je atom vodíku, alkyl, -C(O)NR⁸R⁹, cykloalkyl nebo aryl, výhodně atom vodíku, fenyl, 3,4-dimethoxyfenylaminokarbonyl, 4-methoxy-3chlorfenylaminokarbonyl, ještě výhodněji atom vodíku nebo methyl, nejvýhodněji atom vodíku;

substituent R² je kyanoskupina, atom vodíku, halogen, nižší alkoxy skupina, aryl nebo -S(O)2NR¹³R¹⁴, kde substituent R¹³ je atom vodíku a substituent R¹⁴ je atom vodíku, aryl nebo alkyl, výhodně substituent R je atom vodíku, chlor, brom, fluor, methoxyskupina, ethoxyskupina, fenyl, dimethylaminosulfonyl, 3-chlorfenylaminosulfonyl, karboxyskupina, methoxyskupina, aminosulfonyl, methylaminosulfonyl, fenylaminosulfonyl, pyridin-3 -yl-aminosulfonyl, dimethylaminosulfonyl, izopropylamino-sulfonyl, výhodněji atom vodíku, fluor nebo brom;

·· ·· ··· ·· · • · · · · · · ··· • · · · · · · · ··· « · « · · · ···· · · · ···· ······ · · · ······ ·· · ·· * substituent R je vybrán ze skupiny sestávající z atomu vodíku, nižší alkoxyskupiny, -C(O)R¹⁵, -NR¹³C(O)R¹⁴, arylu výhodně aryl případně substituovaného jedním nebo dvěma substituenty vybranými ze skupiny sestávající z nižšího alkylu, halogenu nebo nižší alkoxyskupiny a heteroarylu, výhodně heteroarylu případně substituovaného jedním nebo dvěma substituenty vybranými ze skupiny sestávající z nižšího alkylu, halogenu nebo nižší alkoxyskupiny; výhodně atom vodíku, methoxyskupina, karboxyskupina, fenyl, pyridin-3-yl, 3,4-dichlorfenyl, 2-methoxy-5-izopropylfenyl, 4-w-butylfenyl, 3-izopropylfenyl, výhodněji atom vodíku nebo fenyl; a substituent R⁴ je atom vodíku, (18) Další výhodnější skupina sloučenin obecného vzorce (I) je ta, ve které:

substituent R je atom vodíku, alkyl, -C(O)NR R , cykloalkyl nebo aryl, výhodně atom vodíku, 3,4-dimethoxy-fenyl-aminokarbonyl, 4-methoxy-3chlorfenylaminokarbonyl, ještě výhodněji atom vodíku nebo methyl, zejména pak atom vodíku;

substituent R²je kyanoskupina, atom vodíku, halogen, nižší alkoxyskupina, aryl nebo -S(O)2NR¹³R¹⁴, kde substituent R¹³ je atom vodíku a substituent R¹⁴ je atom vodíku, aryl nebo alkyl, výhodně substituent R²je atom vodíku, chlor, brom, fluor, methoxyskupina, ethoxyskupina, fenyl, dimethylaminosulfonyl, 3-chlorfenylaminosulfonyl, karboxyskupina, methoxyskupina, aminosulfonyl, methylaminosulfonyl, fenylaminosulfonyl, pyridin-3-yl-aminosulfonyl, dimethylaminosulfonyl, izopropylamino-sulfonyl, výhodněji atom vodíku, fluor nebo brom;

substituent R³ je vybrán ze skupiny sestávající z atomu vodíku, nižší alkoxyskupiny, -C(O)R¹⁵, -NR¹³C(O)R¹⁴, arylu výhodně arylu případně substituovaného jedním nebo dvěma substituenty vybranými ze skupiny sestávající z nižšího alkylu, halogenu nebo nižší alkoxyskupiny a heteroarylu, výhodně heteroarylu případně substituovaného jedním nebo dvěma substituenty vybranými ze skupiny sestávající z nižšího alkylu, halogenu nebo nižší alkoxyskupiny; výhodně atom vodíku, methoxyskupina, karboxyskupina, fenyl, pyridin-3-yl, 3,4-dichlorfenyl, 2-methoxy-5-izopropylfenyl, 4-w-butylfenyl, 3-izopropylfenyl, výhodněji atom vodíku nebo fenyl; a substituent R⁴ je atom vodíku, • · ·

V rámci shora uvedené výhodné skupiny (18) je výhodnější skupina sloučenin ta, ve které:

substituent R⁵ je -COR¹⁰, kde substituent R¹⁰ má význam definovaný v podstatě vynálezu, výhodně -NR(CH₂)_nR¹² nebo -NR¹³R¹⁴ jak jsou definovány v podstatě vynálezu, substituent R⁶ je vybrán ze skupiny sestávající z atomu vodíku a alkylu, výhodně atomu vodíku, methylu, ethylu, izopropylu, Zerc-butylu, izobutylu nebo «-butylu, výhodněji atomu vodíku nebo methyl; a substituent R⁷ je vybrán ze skupiny sestávající z atomu vodíku, alkylu, arylu, heteroarylu a -C(O)R¹⁷, kde substituent R¹⁷ je hydroxyskupina, alkyl nebo aryl, výhodněji atom vodíku, methyl, ethyl, izopropyl, η-, izo nebo Zerc-butyl, fenyl, benzoyl, acetyl nebo karboxyskupina, ještě výhodněji methyl, atom vodíku nebo fenyl.

Ve shora uvedené výhodné skupině (18) je další výhodnější skupina sloučenin ta, ve které:

substituent R⁶ je -COR¹⁰, kde substituent R¹⁰ má význam definovaný v podstatě vynálezu, výhodně -NR¹¹(CH₂)_nR¹² nebo -NR¹³R¹⁴, jak jsou definovány v podstatě vynálezu.

substituent R⁵ je vybrán ze skupiny sestávající z atomu vodíku a alkylu, výhodně atomu vodíku, methylu, ethylu, izopropylu, Zerc-butylu, izobutylu nebo n-butylu, výhodněji atomu vodíku nebo methylu; a substituent R⁷ je vybrán ze skupiny sestávající z atomu vodíku, alkylu, arylu, heteroarylu a -C(O)R¹⁷, kde substituent R¹⁷ je hydroxyskupina, alkyl nebo aryl, výhodněji atom vodíku, methyl, ethyl, izopropyl, η-, izo nebo Zerc-butyl, fenyl, benzoyl, acetyl nebo karboxyskupina, ještě výhodněji methyl, atom vodíku nebo fenyl.

(19) Další výhodnější skupina sloučenin obecného vzorce (I) je ta, ve které: substituenty R¹ a R⁴ jsou atom vodíku;

substituent R² je vybrán ze skupiny sestávající z atomu vodíku, halogenu, nižší alkoxyskupiny, -C(O)R¹⁵ a -S(O)₂NR¹³R¹⁴;

o substituent R je vybrán ze skupiny sestávající z atomu vodíku, nižší alkoxyskupiny, -C(O)R¹⁵, -S(O)₂NR¹³R¹⁴, arylu a heteroarylu;

substituent R⁵ je -C(O)R¹⁰;

substituent R⁶ je vybrán ze skupiny sestávající z atomu vodíku a nižšího alkylu; a • · ···· · · · · · · ·· · · ··· · · · · • · · · · · ···· · · · ··· ······ · · · ······ ·· · · · · substituent R⁷ je vybrán ze skupiny sestávající z atomu vodíku, nižšího alkylu a -C(O)R¹⁷.

Další výhodné provedení předloženého vynálezu je to, že ve sloučenině mající strukturu popsanou v bodě (15):

substituent R¹⁰ je vybrán ze skupiny sestávající z hydroxyskupiny, nižší alkoxyskupiny a -NRⁿ(CH2)_nR¹², kde n je 2 nebo 3;

substituent R je vybrán ze skupiny sestávající z atomu vodíku a nižšího alkylu; a substituent R¹² je vybrán ze skupiny sestávající z arylu a -NR¹³R¹⁴.

Další výhodné provedení předloženého vynálezu je to, že ve sloučenině mající strukturu popsanou v předešlých dvou odstavcích jsou substituenty R¹³ a R¹⁴ jsou nezávisle vybrány ze skupiny sestávající z atomu vodíku, nižšího alkylu a spojeny dohromady -(CH₂)₄-, -(CH₂)₅-, -CH₂)2O(CH₂)₂- nebo -(CH₂)2N(CH₃)(CH₂)2-.

(20) Další výhodné provedení předloženého vynálezu je to, že ve sloučenině: substituent R¹ je vybrán ze skupiny sestávající z atomu vodíku, nižšího alkylu, -(CH₂)_rR¹⁶ a -C(O)NR⁸R⁹;

substituent R² je vybrán ze skupiny sestávající z atomu vodíku, halogenu, arylu a -S(O)₂NR¹³R¹⁴;

substituent R³ je vybrán ze skupiny sestávající z atomu vodíku, nižšího alkylu, nižší alkoxyskupiny, arylu, heteroarylu a -C(O)R¹⁵; substituent R⁴ je atom vodíku;

substituent R⁵ je vybrán ze skupiny sestávající z atomu vodíku a nižšího alkylu; substituent R⁶ je -C(O)R¹⁰;

substituent R⁷ je vybrán ze skupiny sestávající z atomu vodíku, nižšího alkylu a arylu;

substituent R¹⁶ je vybrán ze skupiny sestávající z hydroxyskupiny a -C(O)R¹⁵; a r je 2 nebo 3,

Další výhodné provedení předloženého vynálezu je to, že ve sloučenině mající □ strukturu popsanou v předešlém odstavci je substituent R aryl případně substituovaný jednou nebo více skupinami vybranými ze skupiny sestávající z nižšího alkylu, nižší alkoxyskupiny a halogenu.

(21) Rovněž, výhodné provedení předloženého vynálezu je to, že ve sloučenině:

• · • · · · · · · · ··· • * ··· ······· ····· ······ · · · ······ ·· · · · · substituent R¹ je vybrán ze skupiny sestávající z atomu vodíku, nižšího alkylu, -(CH₂)_rR¹⁶ a -C(O)NR⁸R⁹;

substituent R² je vybrán ze skupiny sestávající z atomu vodíku, halogenu, arylu a -S(O)₂NR¹³R¹⁴;

substituent R³ je vybrán ze skupiny sestávající z atomu vodíku, nižšího alkylu, nižší alkoxyskupiny, arylu, heteroarylu a -C(O)R¹⁵;

substituent R⁴ je atom vodíku;

substituent R⁵ je vybrán ze skupiny sestávající z atomu vodíku a nižšího alkylu; substituent R⁶ je -C(O)R¹⁰;

substituent R⁷ je vybrán ze skupiny sestávající z atomu vodíku, nižšího alkylu a arylu;

substituent R¹⁶ je vybrán ze skupiny sestávající z hydroxyskupiny a -C(O)R¹⁵; a r je 2 nebo 3, substituent R¹⁰ je vybrán ze skupiny sestávající z hydroxyskupiny, nižší alkoxyskupiny, -NR¹³R¹⁴ a -NR^H(CH₂)_nR¹², kde n je 1,2 nebo 3, substituent R¹¹ je atom vodíku a substituent R¹² je vybrán ze skupiny sestávající z hydroxyskupiny, nižší alkoxyskupiny, -C(O)R¹⁵, heteroarylu a -NR¹³R¹⁴.

(22) Další výhodné provedení předloženého vynálezu je to, že ve sloučenině mající strukturu popsanou v předešlém odstavci jsou substituenty R¹³ a R¹⁴ nezávisle vybrány ze skupiny sestávající z atomu vodíku, nižšího alkylu, heteroarylu a spojeny dohromady vytvářejí -(CH₂)₄-, -(CH₂)₅-, -(CH₂)₂O(CH₂)-₂- nebo -(CH₂)₂N(CH₃)(CH₂)₂-.

(23) Další výhodné provedení předloženého vynálezu je to, že ve sloučenině: substituent R¹ je -C(O)NR⁸R⁹, kde substituent R⁸ je atom vodíku a substituent R⁹ je aryl případně substituovaný jednou nebo více skupinami vybranými ze skupiny sestávající z halogenu, hydroxyskupiny a nižší alkoxyskupiny;

substituent R² je vybrán ze skupiny sestávající z atomu vodíku, halogenu, arylu a -S(O)₂NR¹³R¹⁴;

substituent R je vybrán ze skupiny sestávající z atomu vodíku, nižšího alkylu, nižší alkoxyskupiny, arylu, heteroarylu a -C(O)R¹⁵; substituent R⁴ je atom vodíku;

substituent R⁵ je vybrán ze skupiny sestávající z atomu vodíku a nižšího alkylu; substituent R⁶ je -C(O)R¹⁰;

• · · •t substituent R je vybrán ze skupiny sestávající z atomu vodíku, nižšího alkylu a arylu;

substituent R¹⁶ je vybrán ze skupiny sestávající z hydroxyskupiny a -C(O)R⁵; a r je 2 nebo 3, (24) Další výhodné provedení předloženého vynálezu je to, že ve sloučenině:

substituent R¹ je vybrán ze skupiny sestávající z atomu vodíku a nižšího alkylu; substituent R je vybrán ze skupiny sestávající z atomu vodíku, halogenu, nižší alkoxyskupiny, arylu, -C(O)R¹⁵ a -S(O)₂NR¹³R¹⁴;

substituent R³ je vybrán ze skupiny sestávající z atomu vodíku, halogenu, arylu, heteroarylu a -C(O)R¹⁵; substituent R⁴ je atom vodíku; substituent R⁵ je -C(O)R¹⁰; a substituenty R⁶ a R⁷ spojeny dohromady vytvářejí -(CH2)4-skupinu.

Další výhodné provedení předloženého vynálezu je to, že ve sloučenině mající strukturu popsanou v předešlém odstavci je substituent R¹⁰ vybrán ze skupiny sestávající z hydroxyskupiny, alkoxyskupiny, -NR¹³R¹⁴ a -NH(CH₂)„NR¹³R¹⁴, kde n je 2 nebo 3.

Další výhodné provedení předloženého vynálezu je to, že ve sloučenině mající strukturu popsanou v předešlém odstavci jsou substituenty R¹³ a R¹⁴ nezávisle vybrány ze skupiny sestávající z atomu vodíku, nižšího alkylu a spojeny dohromady vytvářejí -(CH₂)₄-, -(CH₂)₅-, -(CH₂)₂O(CH₂)₂- nebo -(CH₂)₂N(CH₃)(CH₂)₂-. Reprezentativní sloučeniny obecného vzorce (I) jsou uvedeny v tabulce (I) níže.

Tabulka II

Příklad	Struktura	Název
1	o*-	4-Methyl- 5 -(2-oxo-1,2dihydroindol-3-ylidenmethyl)1 A-pyrrol-2-karboxylová kyselina
2		4-Methyl-5-( 1 -methyl-2-oxo-1,2dihydroindol-3 -ylidenmethyl)17/-pyrrol-2-karboxylová kyselina

• · · · ·· · ·· » • · · · ··· · · · • · · · ··· · · · · • · · · · · ···· · · · ··· ··· ··· · · · ······ ·· · ·· ·

3	0^°'	Methylester 4-methyl-5-(2-oxo1,2-dihydroindol-3 ylidenmethyl)-1 //-pyrrol-2karboxylové kyseliny
4	Cl zvj nV H	Ethylester 5-(5-chlor-2-oxo-l,2dihydroindol-3 -ylidenmethyl)-4methyl-1 //-pyrrol-2-karboxylové kyseliny
5	λ-^Λίτομ YYW ° H	5-(5-Chlor-2-oxo-l,2dihydroindol-3 -ylidenmethyl)-4methyl-1 H-pyrrol-2-karboxylová kyselina
6	B,YY& °	(3 -Pyrrolidin-1 -ylpropyl)amid 5-(5-brom-2-oxo-l ,2dihydroindol-3 -ylidenmethyl)-4methyl- l//-pyrrol-2-karboxylové kyseliny
7	BrO>ď 0	(3 -Diethylaminopropyl)amid 5-(5-brom-2-oxo-l ,2dihydroindol-3 -ylidenmethyl)-4methyl- l//-pyrrol-2-karboxylové kyseliny
8	η h _ γΛΑυν^ν yw °	(2-Diethylaminoethyl)amid 5-(5brom-2-oxo-1,2-dihydroindol-3 ylidenmethyl)-1 //-pyrrol-2karboxylové kyseliny
9	crCc<^“''C	(2-Diethylaminoethyl)amid 5-(2oxo-6-fenyl-l ,2-dihydroindol-3ylidenmethyl)-1//-pyrrol-2karboxylové kyseliny

10		(2-Diethylaminoethyl)methylamid 5-(5-brom-2oxo-1,2-dihydroindol-3ylidenmethyl)-1 //-pyrrol-2karboxylové kyseliny
11		(2-Diethylaminoethyl)methylamid 5-(2-oxo-6fenyl-1,2-dihydroindol-3 ylidenmethyl)-1 //-pyrrol-2karboxylové kyseliny
12	^TÍn___ „ n ΝΎ prw °	(3 -Diethylaminopropyl)amid 3-methyl-5-(2-oxo-l ,2dihydroindol-3 -ylidenmethyl)177-pyrrol -2-karboxylové kyseliny
13	BrTX0^~~ K	(3 -Diethylaminopropyl)amid 5-(5-brom-2-oxo-l,2dihydroindol-3 -ylidenmethyl)-3 methyl-1 H-pyrrol-2-karboxylové kyseliny
14	J~C # n Y pXX|fď 0	(3 -Diethylaminopropyl)amid 3-methyl-5-(2-oxo-6-fenyl-l ,2dihydroindol-3 -ylidenmethyl)1 77-pyrrol-2-karboxylové kyseliny
15	°υύΟ ° k>H	(3 -Diethylaminopropyl)amid 5 -(5-methoxy-2-oxo-1,2dihydroindol-3 -ylidenmethyl)-3 methyl-177-pyrrol-2-karboxylové kyseliny

• 9 ···<

• · · • · · · • · ····

16	'o^H	(3 -Diethylaminopropyl)amid 5-(6-methoxy-2-oxo-1,2dihydroindol-3 -ylidenmethyl)-3 methyl- lV-pyrrol-2-karboxylové kyseliny
17	-oTm	(2-Diethylaminoethyl)amid 3-(5-brom-2-oxo-l,2dihydroindol-3 -ylidenmethyl)4,5,6,7-tetrahydro-277-izoindol-1 karboxylové kyseliny
18	rNi	(3 -Diethylaminopropyl)amid 3 -(5 -brom-2-oxo-1,2dihydroindol-3 -ylidenmethyl)4,5,6,7-tetrahydro-2//-izoindol-1 karboxylové kyseliny
19	ů	(3 -Pyrrolidin-1 -ylpropyl)amid 3 -(5-brom-2-oxo-1,2dihydroindol-3 -ylidenmethyl)4,5,6,7-tetrahy-dro-27Z-izoindol1-karboxylové kyseliny
20	qp^w	(2-Diethylaminoethyl)amid 3-(2-oxo-6-pyridin-3-yl-1,2dihydroindol-3 -ylidenmethyl)4,5,6,7-tetrahydro-2H-izoindol-1 karboxylové kyseliny
21	•rfp’ H	(3 -Diethylaminopropyl)amid 4-benzoyl-5-(5-brom-2-oxo-l,2dihydroindol-3 -ylidenmethyl)-3 methyl-1 V-pyrrol-2-karboxylové kyseliny

• · • · · · · · · · ··· • · · · · · ·♦·· · · · ··· ··· ··· · · · ······ ·· · ·· ·

22	Ďfs	zvJ3		(3 -Morfolin-4-ylpropyl)amid 4-benzoyl-5-(5-brom-2-oxo-l ,2dihydroindol-3 -ylidenmethyl)-3 methyl- 177-pyrrol-2-karboxylové kyseliny
ť	fÍU 3
23					(3-Pyrrolidin-1 -ylpropyl)amid
		\=/ \—jZ	H .N^	jy	4-benzoyl-3-methyl-5-(2-oxo-
				1,2-dihydroindol-3-
	(	rw °		ylidenmethyl)-177-pyrrol-2-
		H			karboxylové kyseliny
24	Br	OL yyQl	SfR' A		(3 -Pyrrolidin-1 -ylpropyl)amid 4-benzoyl-5-(5 -brom-2-oxo-1,2dihydroindol-3-ylidenmethyl)-3-
			w		methyl- l/T-pyrrol-2-karboxylové kyseliny
25		ΛΟ		jy	(3 -Pyrrolidin-1 -ylpropyl)amid
		\s=/ \—/		4-benzoyl-3-methyl-5-(2-oxo-6-
		_ J N ri>cP	0		fenyl-1,2-dihydroindol-3 -
	c	J H			ylidenmethyl)-1 //-pyrrol-2karboxylové kyseliny
26		<x ,-v-Ú	o 0		(3 -Pyrrolidin-1 -ylpropyl)amid 4-benzoyl-5-(6-methoxy-2-oxo1,2-dihydroindol-3-
	K	°'^H		ylidenmethyl)-3 -methyl-1Hpyrrol-2-karboxylové kyseliny
27	1 0.,		b		(3 -Pyrrolidin-1 -ylpropyl)amid 4-benzoyl-5-(5-methoxy-2-oxo-
	-cy	0		1,2-dihydroindol-3 -ylidenmethyl)-3 -methyl-177-pyrrol2-karboxylové kyseliny

·· · ·· ·· • · · • · · • · · • · · • · · · • · · · · · •··· · · · · · ·

28	/“V? ΎχΟ o H	(3-Pyrrolidin-1 -ylpropyl)amid 4-benzoyl-5-(5-fluor-2-oxo-l ,2dihydroindol-3 -ylidenmethyl)-3 methyl- l/T-pyrrol-2-karboxylové kyseliny
29		(3 -Diethylaminopropyl)amid 4-acetyl-5 -(5-brom-2-oxo-1,2dihydroindol-3 -ylidenmethyl)-3 methyl-17/-pyrrol-2-karboxy lové kyseliny
30	Yxw 0 ^fl	(3 -Pyrrolidin-1 -ylpropyl)amid 4-acetyl-5 -(5 -brom-2-oxo-1,2dihydroindol-3 -ylidenmethyl)-3 methyl-1 H-pyrrol-2-karboxylové kyseliny
31	'T2p° M	(3 -Morfolin-4-ylpropyl)amid 4-acetyl-5-(5-brom-2-oxo-l,2dihydroindol-3 -ylidenmethyl)-3 methyl- l/7-pyrrol-2-karboxy lové kyseliny
32	0 Z}“O~^0h Βίγ^ΧίΓΧ ¥y>ď ° H .	(3 -Hydroxy-propyl)amid 4-acetyl-5 -(5 -brom-2-oxo-1,2dihydroindol-3 -ylidenmethyl)-3 methyl- 17/-pyrrol-2-karboxy lové kyseliny
33	χχί^	(2-Hydroxy-ethyl)amid 4-acetyl5-(5-brom-2-oxo-l ,2dihydroindol-3-ylidenmethyl)-3methyl- 17/-pyrrol-2-karboxylové kyseliny

34	0	(2-Morfolin-4-yl-ethyl)amid 4-acetyl-5-(5-brom-2-oxo-1,2dihydroindol-3 -ylidenmethyl)-3 methyl- l/7-pyrrol-2-karboxylové kyseliny
ΒΓχ	X! H	-Ck-MiTi ji 0 <°
35	χ	$	jM-n	(2-Pyrrolidin-1 -yl-ethyl)amid 4-acetyl-5-(5-brom-2-oxo-l ,2dihydroindol-3 -ylidenmethyl)-3 methyl-177-pyrrol-2-karboxylové kyseliny
36		_	f>	[2-(4-Hydroxy-fenyl)-ethyl]amid
			y~ť b	4-acetyl-5-(5-brom-2-oxo-1,2-
	’Χ	xř M		dihydroindol-3 -ylidenmethyl)-3 methyl-17/-pyrrol-2-karboxy lové kyseliny
37			j 0	(3-Diethylaminopropyl)amid 5-
	Br^z X		-λο 'L Ν'! -<J* ‘	(5-brom-2-oxo-1,2-dihydroindol3 -ylidenmethyl)-2-izopropyl-4feny 1-1 //-pyrrol-3 -karboxy lové kyseliny
38	Br^ l	ni	-JL K řrV” 1	(3 -Pyrrolidin-1 -ylpropyl)amid 5-(5-brom-2-oxo-l ,2dihydroindol-3 -ylidenmethyl)-2izopropy 1-4-feny 1-1//-pyrrol-3 karboxylové kyseliny
39			-. /	(2-Diethylaminoethyl)amid
			> ° z^N-7 ÍO	5-(5-brom-2-oxo-l ,2dihydroindol-3 -ylidenmethyl)-2-
	ζ	ni	-ď 1	izopropy 1-4-feny 1-1 //-pyrrol-3 karboxylové kyseliny

·« *« • * · · • · · • · · · • ♦ · ··>· ·♦ ·« · • * · • · · · • « ··«· • · · ·· · ·· * • · 9 • · · ·

9 9999

9 9 ·

40	-σΡ'	[3 -(4-Methyl-piperazin-1 -yl)propyl]amid 5-(5-brom-2-oxo1,2-dihydroindol-3ylidenmethyl)-2-izopropyl-4feny 1-1 //-pyrrol-3 -karboxy lové kyseliny
41	^“\_Λοη	5-(5-Brom-2-oxo-l,2dihydroindol-3 -ylidenmethyl)-2izopropyl-4-feny 1-1 //-pyrro 1 -3 karboxylová kyselina
42	Η	(2-Pyrrolidin-1 -yl-ethyl)amid 5-(5-brom-2-oxo-1,2dihydroindol-3 -ylidenmethyl)-2methyl-4-fenyl-1 //-pyrrol-3 karboxylové kyseliny
43	cr^~O Ο/» 1	(2-Pyrrolidin-1 -yl-ethyl)amid 5 - [6-(2-methoxy-fenyl)-2-oxo1,2-dihydroindol-3 ylidenmethyl] -2-methyl-4-fenyl1 //-pyrrol-3 -karboxylové kyseliny
44	0 Ζ^Ν” Wř Ί	(2-Dimethylamino-ethyl)amid 5-(5-brom-2-oxo-l ,2dihydroindol-3 -ylidenmethyl)-2methyl-4-fenyl-1 //-pyrrol-3karboxylové kyseliny
45	Ο Ο ΝίγΟ ΠΓ^ο 1	(2-Dimethylamino-ethyl)amid 5-[6-(2-methoxy-fenyl)-2-oxo1,2-dihydroindol-3ylidenmethyl] -2-methy 1-4-fenyl1 //-pyrrol-3 -karboxylové 1 1 ·

• · · · · • · · · · · · • ···· · · ·

		kyseliny
46		Ethylester 5-(5-brom-2-oxo-l,2dihydroindol-3 -ylidenmethyl)-2methyl-4-fenyl-1 H-pyrrol-3 karboxylové kyseliny
47	Cy ° 3-Λ H Op	(3 -Diethylaminopropyl)amid 5-(5-brom-2-oxo-l,2dihydroindol-3 -ylidenmethyl)-2methyl-4-fenyl- 177-pyrrol-3karboxylové kyseliny
48	y_%K s BXrU 'N~	(2-Dimethylamino-ethyl)amid 5-(5-brom-2-oxo-l,2dihydroindol-3 -ylidenmethyl)2,4-dimethyl-1 //-pyrrol-3karboxylové kyseliny
49	o H rjtT S“-	(2-Dimethylamino-ethyl)amid 2,4-dimethyl-5-(2-oxo-6-fenyl1,2-dihydroindol-3 ylidenmethyl)-1 /f-pyrrol-3 karboxylové kyseliny
50	•Á;-	(2-Dimethylamino-ethyl)amid 5-(5-chlor-2-oxo-l,2dihydroindol-3 -ylidenmethyl)2,4-dimethyl-1 H-pyrrol-3 karboxylové kyseliny
51	y7“ •OpA	(2-Diethylaminoethyl)amid 5-(5-brom-2-oxo-1,2dihydroindol-3-ylidenmethyl)2,4-dimethyl-1 /f-pyrrol-3karboxylové kyseliny

• · · · · • · · · · · · · ··· • · · · · · ···· · · · ··· • · · ··· · · ·

52	0 Μ \_Λν -cc<r 0 H	(2-Pyrrolidin-1 -yl-ethyl)amid 5-(5-brom-2-oxo-l,2dihydroindol-3 -ylidenmethyl)2,4-dimethyl-1 //-pyrrol-3 karboxylové kyseliny
53		(3 -Imidazol-1 -y lpropyl)amid 5-(5-brom-2-oxo-l,2dihydroindol-3 -ylidenmethyl)2,4-dimethyl- l/Z-pyrrol-3karboxylové kyseliny
54	y>H 1	(2-Dimethylamino-ethyl)amid 5 - [6-(2-methoxy-feny l)-2-oxo1,2-dihydroindol-3ylidenmethyl)-2,4-dimethyl- 1Hpyrrol-3-karboxylové kyseliny
55	CM ,0	(2-Dimethylamino-ethyl)amid 5- [6-(3 -methoxy-feny l)-2 -oxo1,2-dihydroindol-3 ylidenmethyl] -2,4-dimethyl-1Hpyrrol-3-karboxylové kyseliny
56	0 u H	(2-Diethylaminoethyl)amid 2,4-dimethyl-5-(2-oxo-5-fenyl1,2-dihydroindol-3 ylidenmethyl)-1 /7-pyrrol-3 karboxylové kyseliny
57	o H	(2-Pyrrolidin-1 -yl-ethyl)amid 2,4dimethyl-5-(2-oxo-5-fenyl-1,2dihydroindol-3 -ylidenmethyl)1 //-pyrrol-3 -karboxylové kyseliny

• · · · · · · · ··· • · · · · · ···· · · · ···

·..· : ·..· _;

58		(3 -Imidazol-1 -ylpropyl)amid 2,4-dimethyl-5-(2-oxo-5-fenyl1,2-dihydroindol-3ylidenmethyl)-1 //-pyrrol-3 karboxylové kyseliny
59	yj-n	(2-Diethylaminoethyl)amid 2,4-dimethyl-5-(2-oxo-6-fenyl1,2-dihydroindol-3-ylidenmethyl)-1//-pyrrol-3 karboxylové kyseliny
60	O H	(2-Pyrrolidin-1 -yl-ethyl)amid 2,4-dimethyl-5-(2-oxo-6-fenyl1,2-dihydroindol-3 -ylidenmethyl)-1 //-pyrrol-3 -karboxylové kyseliny
61		(3 -Imidazol-1 -ylpropyl)amid 2,4-dimethyl-5-(2-oxo-6-fenyl1,2-dihydroindol-3-ylidenmethyl)-1 //-pyrrol-3 -karboxylové kyseliny
62	0 < dpXXfo Cl	(2-Diethylaminoethyl)amid 5-[6(3,5-dichlor-fenyl)-2-oxo-1,2dihydroindol-3 -ylidenmethyl] 2,4-dimethyl-1 //-pyrrol-3 karboxylové kyseliny
63	c o N	(2-Diethylaminoethyl)amid 2,4-dimethyl-5-(2-oxo-6-pyridin3-yl-l ,2-dihydro-indol-3ylidenmethyl)-1 //-pyrrol-3 karboxylové kyseliny

64	N	ζ Ή	O y	r	(2-Pyrrolidin-1 -yl-ethyl)amid 2,4-dimethyl-5-(2-oxo-6-pyridin3 -yl-1,2-dihydroindol-3 ylidenmethyl)-1 //-pyrrol-3karboxylové kyseliny
65	N	N H	0 'NX' -ď	z ;« ‘	(3 -Dimethylamino-propy l)amid 2,4-dimethyl-5-(2-oxo-6-pyridin3 -yl-1,2-dihydroindol-3ylidenmethyl)-177-pyrrol-3 karboxylové kyseliny
66			o	—''“Ν'	(3 -Dimethylamino-propy l)amid
				H	2,4-dimethyl-5-(2-oxo-5-fenyl-
		f		1,2-dihydroindol-3 -
		-N	=cr		ylidenmethyl)-1 H-pyrrol-3 -
		H			karboxylové kyseliny
67		i		-H fc	(3 -Diethylaminopropyl)amid 2,4-dimethyl-5-(2-oxo-5-fenyll,2-dihydroindol-3ylidenmethyl)- l//-pyrrol-3-
		H			karboxylové kyseliny
68			0	H	(3 -Diethylaminopropyl)amid
			-Λ JI	N \r-	2,4-dimethyl-5-(2-oxo-6-fenyl1,2-dihydroindol-3-
	Ο Ί	'H	=0	ylidenmethyl)-1 H-pyrrol-3 karboxylové kyseliny
69	'0				(3 -Chlor-4-methoxy-fenyl)amid
	°ó		o		3-[4-(3-diethylamino-
	v N^O		λΥ	-N V f'“·	propylkarbamoyl)-3,5 -dimethyl177-pyrrol-2-ylmethylen] -2-oxo-
	Oc	N	=O		2,3-dihydro-17ř-indol-4karboxylové kyseliny

• · • · · · · · ···· · · ·· ·

70		(3 -Diethylaminopropyl)amid 5-(5-brom-2-oxo-1,2-dihydroindol-3-ylidenmethyl)-2,4dimethyl-1 //-pyrrol-3 karboxylové kyseliny
71		(2-Diethylaminoethyl)amid 5-(5-brotn-2-oxo-l,2dihydroindol-3 -ylidenmethyl)2,4-diizopropyl-1 //-pyrrol-3 karboxylové kyseliny
72	'Op ' c H	(3 -Diethylaminopropyl)amid 5-(5-brom-2-oxo-l,2dihydroindol-3 -ylidenmethyl)2,4-diizopropyl-1 //-pyrrol-3 karboxylové kyseliny
73	/ o u ΒΓγνΟ^ o	(3 -Pyrrolidin-1 -ylpropyl)amid 5-(5-brom-2-oxo-1,2dihydroindol-3 -ylidenmethyl)2,4-diizopropyl-1 H-pyrrol-3 karboxylové kyseliny
74	>Λ«~θ BOp	(Pyridin-4-ylmethyl)amid 5-(5-brom-2-oxo-l,2dihydroindol-3 -ylidenmethyl)2,4-dimethyl-1 //-pyrrol-3 karboxylové kyseliny
75	O	(2-Pyrrolidin-1 -yl-ethyl)amid 5-[6-(4-butyl-fenyl)-2-oxo-1,2dihydroindol-3 -ylidenmethyl] 2,4-dimethyl-1 H-pyrrol-3karboxylové kyseliny

• · • · · · « · · ·· · · · · · · ··· • · · · · · ···· · · · ···

76	0 v# ΐφΓΗΙ	(2-Pyrrolidin-1 -yl-ethyl)amid 5-[6-(5-izopropyl-2-methoxyfenyl)-2-oxo-1,2-dihydroindol-3ylidenmethyl]-2,4-dimethy 1-1Hpytrol-3-karboxylové kyseliny
77	o 0	(2-Pyrrolidin-1 -yl-ethyl)amid 5-[6-(4-ethyl-fenyl)-2-oxo-1,2dihydroindol-3-ylidenmethyl] 2,4-dimethyl-1 //-pyrrol-3 karboxylové kyseliny
78	frCcT '0-^0	(2-Pyrrolidin-1 -yl-ethyl)amid 5 - [6-(2,4-dimethoxy-fenyl)-2oxo-1,2-dihydroindol-3ylidenmethyl] -2,4-dimethyl-1Hpyrrol-3-karboxylové kyseliny
79	0 X	(2-Pyrrolidin-1 -yl-ethyl)amid 5 - [6-(3 -izopropyl-fenyl)-2-oxo1,2-dihydroindol-3 ylidenmethyl] -2,4-dimethyl-1Hpyrrol-3-karboxylové kyseliny
80	o FXXX H K	(2-Diethylaminoethyl)amid 5-(5-fluor-2-oxo-1,2dihydroindol-3 -ylidenmethyl)2,4-dimethyl-177-pyrrol-3karboxylové kyseliny

81	/. o _ OH H	3-[4-(2diethylaminoethylkarbamoyl)3,5-dimethyl-1 H-pyrrol-2ylmethylen]-2-oxo-2,3-dihydrol/Aindol-6-karboxylová kyselina
82	0 uQ*	(2-Pyrrolidin-1 -yl-ethyl)amid 5-(5-dimethylsulfamoyl-2-oxo1,2-dihydroindol-3 ylidenmethyl)-2,4-dimethyl-1Hpyrrol-3-karboxylové kyseliny
83	ΛςΛΓ	(2-Pyrrolidin-1 -yl-ethyl)amid 5 - [5 -(3 -chlor-fenylsulfamoyl)-2oxo-1,2-dihydroindol-3 ylidenmethyl]-2,4-dimethyl-177pyrrol-3-karboxylové kyseliny
84	JI ° V>0	(2-Pyrrolidin-1 -yl-ethyl)amid 2,4-dimethyl-5-[2-oxo-5(pyridin-3 -ylsulfamoyl)-1,2dihydroindol-3 -ylidenmethyl] 1 W-pyrrol-3 -karboxylové kyseliny
85	0 _ 9” >£θθΐ	3 -[3,5 -Dimethyl-4-(4-methylpiperazin-1 -karbonyl)-1 W-pyrrol2-ylmethylen] -4-(2-hydroxyethyl)-1,3-dihydroindol-2-on
86	ž&/°~	Fenylamid 3-[3,5-dimethyl-4-(4methyl-piperazin-1 -karbonyl)1 W-pyrrol-2-ylmethylen] -2-oxo2,3-dihydro-1//-indol-5sulfonové kyseliny

87	X	o		(2-Diethylaminoethyl)amid 5-(5-dimethylsulfamoyl-2-oxo1,2-dihydroindol-3ylidenmethyl)-2,4-dimethyl-177pyrrol-3-karboxylové kyseliny
I>o	Z N
88	Cl 0		O N	JR-J	(2-Diethylaminoethyl)amid 5 - [5 -(3 -chlor-fenylsulfamoyl)-2-
	/ή' V>o	í		oxo-1,2-dihydroindol-3 ylidenmethyl] -2,4-dimethyl-177pyrrol-3-karboxylové kyseliny
89		Á 3»o N	1 1		(2-Dimethylamino-ethyl)-amid 3-(5-brom-2-oxo-l ,2-dihydroindol-3-ylidenmethyl)-4,5,6,7-
		N		tetrahydro-277-izoindol-1 karboxylové kyseliny
90		iL			Ethylester 3 -(2-oxo-1,2-dihydroindol-3-ylidenmethyl)-4,5,6,7-
		„ í			tetrahydro-277-izoindol-1 -
	CQ	=0 υη			karboxylové kyseliny
91		P„			Ethylester 3-(4-methyl-2-oxo-l ,2dihydro-indol-3 -ylidenmethyl)-
		·· v			4,5,6,7-tetrahydro-277-izoindol-1 -
	CQ	=O			karboxylové kyseliny
92	“Ό				Ethylester 3-(5-brom-2-oxo-l,2dihydro-indol-3 -ylidenmethyl)4,5,6,7-tetrahydro-277-izoindol-1 -
	H		karboxylové kyseliny
93	0	O Λ< Τ\»π	x;		3-(3-Ethoxykarbonyl-4,5,6,7tetrahydro-277-izoindol-1 ylmethylen)-2-oxo-2,3-dihydro-
	L.				177-indol-5-karboxylová kyselina

·· ·· • · · · • · · • · · • · · ···· · * • · · · · • · · · · · · • ···· · * ···· • · · · »

94	‘cd	i		Ethylester 3-(5-methoxy-2-oxo1,2-dihydro-indol-3ylidenmethyl)-4,5,6,7-tetrahydro2/7-izoindol-1 -karboxylové kyseliny
95			rť	□	Ethylester 3-(2-oxo-5-fenyl-l,2dihydro-indol-3 -ylidenmethyl)-
				'1	4,5,6,7-tetrahydro-2/7-izoindol-1 -
	T jT	‘N	O C	karboxylové kyseliny
96				jL o	Ethylester 3-(2-oxo-5-sulfamoyl1,2-dihydro-indol-3-
			XN'		ylidenmethyl)-4,5,6,7-tetrahydro-
	0		>=o	°Ί	277-izoindol-1 -karboxylové kyseliny
97					Ethylester 3-(5-methylsulfamoyl2-oxo-1,2-dihydro-indol-3-
				ylidenmethyl)-4,5,6,7-tetrahydro-
		Γ-Ν	-0	°Λ	277-izoindol-1 -karboxylové kyseliny
98			ή''	L^°	Ethylester 3-(5-dimethylsulfamoyl-2-oxo1,2-dihydro-indol-3-
	0 *Y>	~N	—0	Λ	ylidenmethyl)-4,5,6,7-tetrahydro2/7-izoindol-1 -karboxylové kyseliny
99	Ol.			1 -O	Ethylester 3-(2-oxo-5fenylsulfamoyl-1,2-dihydro-
	λ		/ N~r	indol-3-ylidenmethyl)-4,5,6,7-
	l			Ί	tetrahydro-277-izoindol-1 karboxylové kyseliny

·· ·· • · · • · • · • · ···· ·· • · · • · · · • · · · · φ · • φ · • · • · · • ···

100		Ethylester 3-(6-brom-2-oxo-l,2dihydro-indol-3 -ylidenmethyl)4,5,6,7-tetrahydro-2A-izoindol-1 karboxylové kyseliny
101	_jCQ“° °ί	Ethylester 3-(2-oxo-6-fenyl-l,2dihydro-indol-3 -y lidenmethyl)4,5,6,7-tetrahydro-277-izoindol-lkarboxylové kyseliny
102		3 -(3 -Ethoxykarbonyl-4,5,6,7tetrahydro-2/7-izoindol-1 ylmethylen)-2-oxo-2,3-dihydro177-indol-6-karboxylová kyselina
103		Ethylester 3-(6-methoxy-2-oxo1,2-dihydro-indol-3 ylidenmethyl)-4,5,6,7-tetrahydro277-izoindol-1 -karboxylové kyseliny
104	-^ν π <oL0 ° ΊθΓ>θ %	Ethylester 3-(5izopropylsulfamoyl-2-oxo-1,2dihydro-indol-3 -ylidenmethyl)4,5,6,7-tetrahydro-2A-izoindol-1 karboxylové kyseliny
105		3-(3-Methylkarbamoy 1-4,5,6,7tetrahydro-2//-izoindol-1 ylmethylen)-2-oxo-2,3-dihydrol//-indol-5-karboxylová kyselina
106	0 £-0^*0 ο*γγ%0 Ν ,ικ	3-(3-Dimethylkarbamoyl-4,5,6,7tetrahydro-277-izoindol-1 ylmethylen)-2-oxo-2,3-dihydro177-indol-5-karboxylová kyselina

·· *· • · ♦ · • · · • · · • · ♦ ···· · ·

107	0	ó	2-Oxo-3 - [3 -(pyrrolidin-1 karbony 1)-4,5,6,7-tetrahydro-2//izoindol-1 -ylmethylen] -2,3 dihydro-1 //-indol- 5 -karboxylová kyselina
0 ΐ	_// ν j>o
108	o		C 0	3 - [3 -(Morfolin-4-karbonyl)4,5,6,7-tetrahydro-2//-izoindol-1 -
		Ν ν>=0	fk Q	ylmethylen] -2-oxo-2,3 -dihydrol//-indol-5-karboxylová kyselina
109			k.o	3 - [3 -(Morfolin-4-karbonyl)4,5,6,7-tetrahydro-2//-izoindol-1 -
	0 j	α ν τ Wa	ylmethylen]-2-oxo-2,3-dihydro-
	i ^r—w s^N	u	l//-indol-6-karboxylová kyselina
110		X	ζ.	Methylamid 3-(5-brom-2-oxo1,2-dihydro-indol-3-
	Bfv	X	ylidenmethy 1)-4,5,6,7-tetrahydro-
	k			277-izoindol-1 -karboxy lové kyseliny
111				Dimethylamid 3-(5-brom-2-oxo1,2-dihydro-indol-3-
	χ	zfi		ylidenmethyl)-4,5,6,7-tetrahydro2//-izoindol-1 -karboxylové kyseliny
112	βν		0	5 -Brom-3 - [3 -(pyrrolidin-1 karbonyl)-4,5,6,7-tetrahydro-2//izoindol-1 -ylmethylen] -1,3 -
	k*		dihydro-indol-2-on
113			L 0	5-Brom-3 - [3 -(morfolin-4karbonyl)-4,5,6,7-tetrahydro-2/7-
	ΒΚχΐ Η	^|\-Λ		izoindol-1 -ylmethylen] -1,3 -
	y	1	o	dihydro-indol-2-on

• · · · e · · • · · · · · · • · · · · · · • · · · · · ··· ······ ···· · · ·· ·

114	0		«=0 ,	O NK	3 -(3 -Dimethylkarbamoyl-4,5,6,7tetrahydro-277-izoindol-1 ylmethylen)-2-oxo-2,3-dihydro177-indol-6-karboxylová kyselina
115				o	4-Methyl-5-(5-methylsulfamoyl-
	O *		Jr 4 N	Ao 5	2-oxo-1,2-dihydro-indol-3ylidenmethyl)-1 H-pyrrol-3 -
	a |		>o N		karboxylová kyselina
116			o	0-/	Ethylester {[4-Methyl-5-(4-
			< An'* V-f N o	methyl-5-methylsulfamoyl-2-
	.áLl	<	v		oxo-1,2-dihydro-indol-3-
		N	0		ylidenmethyl)-1 /T-pyrrol-3 karbony 1] -amino} -octové kyseliny
117			0	v 0	Ethylester {[4-methyl-5 -(5 -
	N 0		-λί N	methylsulfamoyl-2-oxo-1,2dihydro-indol-3 -ylidenmethyl)-
	o T		<=o	\	177-pyrrol-3 -karbonyl] -amino} octové kyseliny
118			0	'V	{[4-Methyl-5-(5-
	1 í-|			methylsulfamoyl-2-oxo-1,2-
		/	N	o	dihydro-indol-3 -ylidenmethyl)-
	0 1	'M	=o		17Z-pyrrol-3 -karbonyl] -amino} octová kyselina
119			0	-o	Methylamid 3-[3-methyl-4-
			-ZŤ N	(piperidin-1 -karbonyl)-1 ZZ-pyrrol2-ylmethylen]-2-oxo-2,3-
	° M	ln	=o		dihydro-177-indol-5 -sulfonové kyseliny

** * · * # · ·9· .· ϊ · · · » « · ϊ · · • · · · · ······· .

·..· i ·..· :

120	O	O J N	O Λ =o	5-Methyl-2-(2-oxo-1,2-dihydroindol-3-ylidenmethyl)-1 H-pyrro1-3-karboxylová kyselina
121			0-^	Ethylester 5-methyl-2-(2-oxo-l ,2-
		O		dihydro-indol-3 -ylidenmethyl)-
		/	-«V	1 V-pyrrol-3 -karboxylové
	Cl		=0	kyseliny
		“N
122			o-/	Ethylester 2-(5-brom-2-oxo-l,2-
			O=\	dihydro-indol-3 -ylidenmethyl)-5 -
			Jl	methyl-1 V-pyrrol-3 -karboxylové
	Br^,		N Γ>=Ο	kyseliny
123			O o=<	2-(5-Brom-2-oxo-1,2-dihydro-
		♦		indol-3 -ylidenmethyl)-5 -methyl-
	ΒΓχ.			1 H-pyrrol-3 -karboxylová
	|í		'>=o	kyselina
124			«-/Ό	(2-Pyrrolidin-1 -yl-ethyl)-amid
			0=^	2-(5-brom-2-oxo-1,2-dihydro-in-
			F1	dol-3-ylidenmethyl)-5-methyl-
	Břv^			1 H-pyrrol-3 -karboxylové
	K		>=o N	kyseliny
125			>— fi	(2-Diethylamino-ethyl)-amid
			Λ_/	2-(5-brom-2-oxo-1,2-dihydro-
			y-i	indol-3-ylidenmethyl)-5-methyl-
			Ak	1 V-pyrrol-3 -karboxylové
			Z^O	kyseliny
	^4

* · · · ♦ · · • · · * · · · • * · · · · ···· · • · · · · · ···· ·> ·· * ·♦ ·» • · » • · · · • ·«·>9 • · » ·· *

133	Η rw ο N.,CH3 ΠΑΛν'' ΐ Αχ. Η αγνΓ«	(2-Acetylamino-ethyl)-amid 5-[5-chlor-2-oxo-l,2-dihydroindol-(32)-ylidenmethyl]-2,4dimethyl-1 //-pyrrol-3 karboxylové kyseliny	399 [Μ -1]
134	Η r-u 0 NxZCHl + _λ'Α I λί H B CH’ 1 7=0	(2-Acetylamino-ethyl)-amid 5-[5-fluor-2-oxo-1,2-dihydroindol-(3Z)-ylidenmethyl]-2,4dimethyl- 1 //-pyrrol-3 karboxylové kyseliny	383 [Μ -1]
135	o H ™. σΡ H	(2-Acetylamino-ethyl)-amid 2,4-dimethyl-5-[2-oxo-l,2dihydro-indol-(3Z)ylidenmethyl] -1 //-pyrrol-3 karboxylové kyseliny	365 [Μ -1]
136	0 ÚH HA >n í/Y H CH’ Ύ Y>°	[3 -(2-Oxo-tetrahydro-pyrimidinl-yl)-propyl]-amid 5-[5-brom-2oxo-1,2-dihydro-indol-(3Z)ylidenmethyl]-2,4-dimethyl-1/7pyrrol-3-karboxylové kyseliny	500 [M+l] 502 [M+l]
137	0 A M ηΛγ-Αν CH’ °	[3 -(2-Oxo-tetrahydro-pyrimidinl-yl)-propyl]-amid 5-[5-chlor-2oxo-1,2-dihydro-indol-(3Z)ylidenmethyl] -2,4-dimethyl-1 //pyrrol-3-karboxylové kyseliny	454 [M-l]
138	o ^Λ« η>\Λ-η^ vJ FYvC”	[3 -(2-Oxo-tetrahydro-pyrimidinl-yl)-propyl]-amid 5-[5-fluor-2oxo-1,2-dihydro-indol-(3Z)ylidenmethyl] -2,4-dimethyl-1 /7pyrrol-3-karboxylové kyseliny	438 [Μ -1]

• · ·· · ·· · • ·

139	X jíH CH> 0 I >=o	[3 -(2-Oxo-tetrahydro-pyrimidinl-yl)-propyl]-amid 2,4-dimethyl5-[2-oxo-l ,2-dihydro-indol-(3Z)ylidenmethyl]- lH-pyrrol-3karboxylové kyseliny	422 [M+l]
140	O /~~N Ί HsCvXN^^ IfiH fí N CH3 X^N H	[3 -(2-Oxo-tetrahydro-pyrimidinl-yl)-propyl]-amid 5-[5-kyano-2oxo-1,2-dihydro-indol-(3 Z)ylidenmethyl]-2,4-dimethyl-1Hpyrrol-3-karboxylové kyseliny	447 [M+l]
141	0 Č5 o *\>r »'wO CH· F 1 I T>° Y+ F-1	Trifluor-acetát 4-[2-({5-[5-brom2-oxo-1,2-dihydro-indol-(3Z)ylidenmethyl] -2,4-dimethyl-1Hpyrrol-3-karbonyl-} -amino)ethyl]-2-oxo-piperazin-1 -ia;	486 [M+l] 488 [M+l]
126	/— CH, 0 XN 5 Η’°\—Z^*H ^“CH, CHí	(2-Diethylaminoethyl)-amid 2,4-dimethyl-5-[2-oxo-l ,2dihydro-indol-(3Z)ylidenmethyl] -1 //-pyrrol-3 karboxylové kyseliny	381 [M+l]
127	<CH3 0 N H^CyX/--- *^CH3 Clw\ CHí r°	(2-Diethylaminoethyl)-amid 5-[5-chlor-2-oxo-1,2-dihydroindol-(3 Z)-ylidenmethyl] -2,4dimethyl- 1 //-pyrrol-3 karboxylové kyseliny	415 [M+l]
128	n3c V B lO rvCo” CH’ H	(2-Pyrrolidin-1 -ylethyl)-amid 2,4-dimethyl-5-[2-oxo-l,2dihydro-indol-(3Z)ylidenmethyl]-2,4-dimethyl-1Hpyrrol-3-karboxylové kyseliny	379 [M + 1]

• ·

129	H c V 3>— CHa	(2-Pyrrolidin-1 -ylethyl)-amid 5- [5-fluor-2-oxo-1,2-dihydroindol-(3Z)-ylidenmethyl]-2,4dimethyl-1 Tf-pyrrol-3 karboxylové kyseliny	397 [M + 1]
130	h,c I I >°	(2-Pyrrolidin-1 -ylethyl)-amid 5-[5-chlor-2-oxo-l ,2-dihydroindol-(3 Z)-ylidenmethyl] -1Hpyrrol-3-karboxylová kyselina	413 [M+ 1]
131	CH. 1 3 0. ^N“CH, h3c ’ ři^CH3 f jO==°	(2-Dimethylaminoethyl)-amid 2,4-dimethyl-5-[2-oxo-l,2dihydro-indol-(3Z)ylidenmethyl]-2,4-dimethyl- IHpyrrol-3-karboxylové kyseliny	353 [M + 1]
132	o. CH. H’Cx>-< CHS Fy^Qj CH’ H	(2-Dimethylaminoethyl)-amid 5-[5-fluor-2-oxo-l ,2-dihydroindol-(3Z)-ylidenmethyl]-2,4dimethyl-1 H-pyrrol-3 karboxylové kyseliny	371 [M + 1]
142	O-iT^Ó n\v€r CHs	[3 -(2-Oxo-pyrrolidin-1 -yl)propyl]-amid 5-[5-kyano-2-oxo1,2-dihydro-indol-(3Z)ylidenmethyl] -2,4-dimethyl-1Hpyrrol-3-karboxylové kyseliny	430 [Μ -1]
143	JMH o N~y 'O-n''' ° &γγζ/CH’ H	[2-(2-Oxo-imidazolidin-1 -yl)ethyl]-amid 5-[5-brom-2-oxo-l,2dihydro-indol-(3Z)ylidenmethyl] -2,4-dimethyl-1Hpyrrol-3-karboxylové kyseliny	470 [Μ - 1] 472 [Μ -1]

• · · · • ···· · · * · • · · • «··

144	CNH „ c S *¥y o β CHa H	[2-(2-Oxo-imidazolidin-1 -yl)ethyl]-amid 5-[5-chlor-2-oxo-1,2dihydro-indol-(3Z)ylidenmethyl] -2,4-dimethyl-1Hpyrrol-3-karboxylové kyseliny	428 [M + 1]
145	NH 0 h’VAb ° _ CH. FV/^Y\= H MíA-n H	[2-(2-Oxo-imidazolidin-1 -yl)ethyl]-amid 5-[5-fluor-2-oxo-l,2dihydro-indol-(3Z)ylidenmethyl]-2,4-dimethyl-1Hpyrrol-3-karboxylové kyseliny	412 [M + 1]
146	O» o _,N-< jj'— 0 _ j a' CH f I >=° H	[2-(2-Oxo-imidazolidin-1 -yl)ethyl]-amid 2,4-dimethyl-5-[2oxo-1,2-dihydro-indol-(3Z)ylidenmethyl] -1 //-pyrrol-3 karboxylové kyseliny	392 [Μ - 1]
147	f^NH 0 .N-/ o ur ΎΧ\>=οη H	[2-(2-Oxo-imidazolidin-1 -yl)ethyl]-amid 5-[5-kyano-2-oxo1,2-dihydro-indol-(3Z)ylidenmethyl]-2,4-dimethyl- 1Hpyrrol-3-karboxylové kyseliny	419 [M+ 1]
148	H,C fY>2 0 ^γγζΥ'0’ H	Ethylester {4-[2-({5-[5-brom-2oxo-1,2-dihydro-indol-(3Z)ylidenmethyl] -2,4-dimethyl-1Hpyrrol-3 -karbonyl} -amino)ethyl]-piperazin-1 -yl} -octové kyseliny	558 [M+ 1] 560 [M+l]
149	H,C ryvc? >Λ« ° o W<H CH· íl I >=o	Ethylester {4-[2-({5-[5-chlor-2oxo-1,2-dihydro-indol-(32)ylidenmethyl] -2,4-dimethyl-1Hpyrrol-3 -karbonyl} -amino)ethyl] -piperazin-1 -yl} -octové kyseliny	514 [M+l]

• · ···· · · · · • · · ···· · • · · · · ······· ······ · ···· · · ·· · • ··· • *

150	V Q Z^ZN J 0 Uy30	Ethylester {4-[2-({5-[5-fluor-2oxo-1,2-dihydro-indol-(3Z)ylidenmethyl]-2,4-dimethyl-1 //pyrrol-3 -karbonyl} -amino)ethyl] -piperazin-1 -yl} -octové kyseliny	498 [M + 1]
153	O NH ‘VAjT' » CH“	[2-(Kyanomethyl-amino)-ethyl]amid 2,4-dimethyl-5-[2-oxo-l,2dihydro-indol-(3Z)ylidenmethyl] -1 //-pyrrol-3 karboxylové kyseliny	362 [Μ -1]
154	CH> ΤΧρ	[3 -(2-Oxo-azepan-1 -yl)-propyl] amid 5-[5-brom-2-oxo-l,2dihydro-indol-(3Z)ylidenmethyl] -2,4-dimethyl-1 //pyrrol-3-karboxylové kyseliny	511 [Μ -1] 513 [Μ -1]
155	°wtin T χ>°	[3 -(2-Oxo-azepan-1 -yl)-propyl] amid 5-[5-chlor-2-oxo-l,2dihydro-indol-(3Z)ylidenmethyl] -2,4-dimethyl-1Hpyrrol-3-karboxylové kyseliny	469 [M+ 1]
156	0 /χ H CHs ULjf0	[3 -(2-Oxo-azepan-1 -yl)-propyl] amid 5-[5-fluor-2-oxo-l,2dihydro-indol-(3Z)ylidenmethyl] -2,4-dimethyl-1Hpyrrol-3-karboxylové kyseliny	453 [M+ 1]
157	-41 f Γ>ο <Aň	[3 -(2-Oxo-azepan-1 -yl)-propyl] amid 2,4-dimethyl-5-[2-oxo-l,2dihydro-indol-(3Z)ylidenmethyl] -1 //-pyrrol-3 karboxylové kyseliny	435 [M+l]

• · ·· ·· ·· · ·· • · · · · · * · • · · · · · · · ··· • · · · · · ···· · · · ···

158	x	0	0 Ja h )=0 '-N H	-b	[3 -(2-oxo-azepan-1 -yl)-propyl] amid 5-[5-kyano-2-oxo-l,2-dihydro-indol-(3Z)-ylidenmethyl] 2,4-dimethyl-1 //-pyrrol-3karboxylové kyseliny	460 [M+ 1]
159			Q	,bzCHi	(2-Acetylamino-ethyl)-amid 5-[5-	443 [Μ -1]
	Βκ 7	□	Η<_Λν & Jk H F Xch3 X H 3 ζ=θ	brom-2-oxo-1,2-dihydro-indol(3Z)-ylidenmethyl] -2,4-dimethyl1 //-pyrrol-3 -karboxylové kyseliny	445 [Μ -1]
160			o	O d	Trifluoracetát 4-[2-({5-[5-fluor2-oxo-1,2-dihydro-indol-(32)-	426 [M+ 1]
			JI		ylidenmethyl]-2,4-dimethyl-l//-
	F. 1		F pj CH, 7=0 B	X	pyrrol-3 -karbonyl} -amino)ethyl]-2-oxo-piperazin-1 -ia;
161			o.	b ZN^	Trifluoracetát 4-[2-({2,4dimethyl-5-[2-oxo-1,2-dihydro-	408 [M+ 1]
				indol-(3Z)-ylidenmethyl] -1H-
			B CH>	F	pyrrol-3 -karbonyl} -amino)-
	C	H	=0	ethyl]-2-oxo-piperazin-1 -ia;
162	NC<, X		CM % C|y* Λν fu ^ch Λ-οΗ H	Λ >-.» X-	Trifluoracetát 4-[2-({5-[5-kyano2-oxo-l ,2-dihydro-indol-(32)ylidenmethyl]-2,4-dimethyl-l//pyrrol-3 -karbonyl} -amino)ethyl]-2-oxo-piperazin-1 -ia;	433 [M+ 1]
163					[2-(2-Kyano-ethylamino)-ethyl]-	454 [Μ -1]
			o		amid 5-[5-brom-2-oxo-l,2-	456 [Μ -1]
			JU >=0 H	UN H	dihydro-indol-(3Z)-
	Brs	c	CH,	ylidenmethyl] -2,4-dimethyl-1Hpyrrol-3-karboxylové kyseliny

• · ·· · ·· · • · · · · · • · · · · · · ·

II »····«· · · · · • · · · · 1 • · β * ♦ *

164	ο hJ η CHí I Τ >=°	[2-(2-Kyano-ethylamino)-ethyl]amid 5-[5-chlor-2-oxo-l,2dihydro-indol-(3Z)ylidenmethyl] -2,4-dimethyl-1Hpyrrol-3-karboxylové kyseliny	410 [Μ -1]
165	Η3%_Λ·ν FrvQKcHs	[2-(2-Kyano-ethylamino)-ethyl] amid 5-[5-fluor-2-oxo-l,2dihydro-indol-(32)ylidenmethyl]-2,4-dimethyl-1//pyrrol-3 -karboxylové kyseliny	394 [Μ -1]
166	Η ) Ο ^aAt ν * Γ Τ>=ο Η	[2-(2-Kyano-ethylamino)-ethyl]amid 2,4-dimethyl-5-[2-oxo-l,2dihydro-indol-(3Z)ylidenmethyl] -1 //-pyrrol-3 karboxylové kyseliny	376 [Μ -1]
167	Η ) 0 η·\Λν \ý^N Η	[2-(2-Kyano-ethylamino)-ethyl] amid 5-[5-kyano-2-oxo-l,2dihydro-indol-(3Z)ylidenmethyl]-2,4-dimethyl-1Hpyrrol-3-karboxylové kyseliny	401 [Μ -1]
168	0 ο η-/ j-Zí η H N^CH, ο ΊΓγ>οΗ ρ>Ζόη ρ7	Trifluoracetát 4-[2-({5-[5-chlor2-oxo-l ,2-dihydro-indol-(3Z)ylidenmethyl] -2,4-dimethyl-1Hpyrrol-3 -karbonyl} -amino)ethyl]-2-oxo-piperazin-1 -ia;	440 [Μ -1]
168	9 rp Η3%_Α Tk » « CHa	[2-(4-Methyl-piperazin-1 -yl)ethyl]-amid 5-[5-fluor-2-oxo-l,2dihydro-indol-(3Z)ylidenmethyl] -2,4-dimethyl-1H-	424 [M-l]

• · • 9 · · • · · · · · · · ·· · · · · · · ··· • « ♦ · · · ···· · · · »··· ··· · · · · · · ··'···· · · · · · *

		pyrrol-3-karboxylové kyseliny
169	ο <X'CH* / X Η H CH’ ΎΤ>° Χί^'Ν Η	[2-(4-Methyl-piperazin-1 -yl)ethyl] -amid 5 - [5-chlor-2-oxo-1,2dihydro-indol-(3Z)ylidenmethyl] -2,4-dimethyl-1Hpyrrol-3-karboxylové kyseliny	440 [Μ -1]
170	? rXCH* VyA-v^ / 1 H H CH· γχν° Xí^N H	[2-(4-Methyl-piperazin-1 -yl)ethyl]-amid 5-[5-brom-2-oxo-l,2dihydro-indol-(3Z)ylidenmethyl]-2,4-dimethyl-177pyrrol-3-karboxylové kyseliny	484 [Μ -1] 486 [Μ -1]
171	o <X'CH’ II \ h CHs ÍX>° bb-N H	[2-(4-Methyl-piperazin-1 -yl)ethyl]-amid 2,4-dimethyl-5-[2oxo-1,2-dihydro-indol-(3Z)ylidenmethyl] -177-pyrrol-3 karboxylové kyseliny	406 [Μ -1]
172	ch3 0 I^NH H’CVY^nx^'n'^vch9 / X η 9 H CH9 (TT^0 O-N H	[2-(3,5-Dimethyl-piperazin-1 -yl)ethyl]-amid 2,4-dimethyl-5-[2oxo-1,2-dihydro-indol-(3 Z)ylidenmethyl] -177-pyrrol-3 karboxylové kyseliny	422 [M+l]
173	cn, 0 p NH Ύ 20=° Xť^N H	[2-(3,5-Dimethyl-piperazin-1 -yl)ethyl]-amid 5-[5-fluor-2-oxo-l,2dihydro-indol-(3Z)ylidenmethyl] -2,4-dimethyl-1Hpyrrol-3-karboxylové kyseliny	438 [Μ-1]
174	CH, o X„ Π’ΧΛ^^. # a CHs ^8 °	[2-(3,5-Dimethyl-piperazin-1 -yl)ethyl]-amid 5-[5-chlor-2-oxo-l,2dihydro-indol-(3Z)ylidenmethyl] -2,4-dimethyl-1Hpyrrol-3-karboxylové kyseliny	456 [M + 1]

175	CH, O TÁ H s H CHs	[2-(3,5-Dimethyl-piperazin-1 -yl)ethyl]-amid 5-[5-brom-2-oxo-l,2dihydro-indol-(3Z)ylidenmethyl]-2,4-dimethyl-1Hpyrrol-3-karboxylové kyseliny	498 [Μ -1] 500 [Μ - 1]
176	ηΛΧν— <^n-ch, H CH’ ř x>° H	[3 -(4-Methyl-piperazin-1 -y 1) propyl]-amid 2,4-dimethyl-5-[2oxo-1,2-dihydro-indol-(3Z)ylidenmethyl] -1 77-pyrrol-3 karboxylové kyseliny	422 [M+l]
177	H,C Fvv>C“ CHa °	[3 -(4-Methyl-piperazin-1 -yl)propyl]-amid 5-[5-fluor-2-oxo1,2-dihydro-indol-(3Z)ylidenmethyl]-2,4-dimethyl-177pyrrol-3-karboxylové kyseliny	438 [Μ - 1]
178	q WY Η3<\Λρ| V->N~CH* [J CH’ Yj>°	[3-(4-Methyl-piperazin-1 -yl)propyl]-amid 5-[5-chlor-2-oxo1,2-dihydro-indol-(3Z)ylidenmethyl] -2,4-dimethyl-177pyrrol-3-karboxylové kyseliny	454 [Μ -1]
179	n^yXrj V-/n'ch3 TXifo	[3 -(4-Methyl-piperazin-1 -yl)propyl]-amid 5-[5-brom-2-oxo1,2-dihydro-indol-(3Z)ylidenmethyl] -2,4-dimethyl-177pyrrol-3-karboxylové kyseliny	498 [Μ -1] 500 [Μ -1]
180	o N-> pJTCH’ IAR	[2-(4-Benzyl-piperazin-1 -yl)ethyl]-amid 2,4-dimethyl-5-[2oxo-1,2-dihydro-indol-(32)-ylidnmethyl]-177-pyrrol-3karboxylové kyseliny	482 [Μ -1]

·· · · ·· · ·· · • · ♦ · · · · ·«· • t · · · · · · ··· • · · · * * *«·· · · · «·φ • · · · · · · · · ······ ·· · ·· »

181	o N-Z H	[2-(4-Benzyl-piperazin-1 -yl)ethyl]-amid 5-[5-fluor-2-oxo-l,2dihydro-indol-(3Z)ylidenmethyl]-2,4-dimethyl-1Hpyrrol-3 -karboxylové kyseliny	500 [Μ -1]
182	rf-Q 0 N-Z řPCH’ τχν°	[2-(4-Benzyl-piperazin-1 -yl)ethyl]-amid 5-[5-chlor-2-oxo-l ,2dihydro-indol-(3Z)ylidenmethyl]-2,4-dimethyl-1Hpyrrol-3-karboxylové kyseliny	517 [M-l]
183	O N-Z Ί JZ/=°	[2-(4-Benzyl-piperazin-1 -yl)ethyl] -amid 5 - [5 -brom-2-oxo-1,2dihydro-indol-(3Z)ylidenmethyl]-2,4-dimethyl-\Hpyrrol-3-karboxylové kyseliny	560 [M-l] 562 [M-l]
184	^η3 0 Ο^ΊΤθ 0 op'	(3 -Pyrrolidin-1 -yl-2-on)-amid 5-[5-chlor-2-oxo-l ,2-dihydroindol-(3Z)-ylidenmethyl]-2,4dimethyl-1 //-pyrrol-3 karboxylové kyseliny	480 [M+l]
185	0 o H 3 C X M N ZX H I X >0 CF3CO2H H	Trifluoracetát 4-[2-({5-[5-Chlor2-oxo-1,2-dihydro-indol-(3Z)yliden-methyl] -2,4-dimethyl-1Hpyrrol-3 -karbonyl} amino)-ethyl] 2-oxo-piperazin-1 -ia	440 [Μ -1]
186	CM, H 1 T H	(3 -Pyrrolidin-1 -yl-2-on)-amid 5-[5-chlor-2-oxo-l ,2-dihydroindol-(3Z)-ylidenmethyl]-2,4dimethyl- 1 //-pyrrol-3 karboxylové kyseliny

·· «· ·· · ··· ·*·· ♦♦· · · · • « · · · ♦ · · ··· • · · · · · ···· · · · ··· ······ · 9 · «· ·

187	0 H,C. JU Ό Í1nh κ * CHí T jS>=o H	(3 -Pyrrolidin-1 -yl-2-on)-amid 5-[5-fluor-2-oxo-1,2-dihydroindol-(3Z)-ylidenmethyl]-2,4dimethyl-1 //-pyrrol-3 karboxylové kyseliny
188	Ů x,° ch3 H H	(3 -Pyrrolidin-1 -yl-2-on)-amid 5-[2-oxo-l ,2-dihydro-indol-(3Z)ylidenmethyl]-2,4-dimethyl- \Hpyrrol-3-karboxylové kyseliny
189	H CH* 1 JZ /=° CF,CO,H	(2-Pyridin-2-ylethyl)-amid 5-[5-chlor-2-oxo-1,2-dihydroindol-(3Z)-ylidenmethyl]-2,4dimethyl-1 //-pyrrol-3 karboxylové kyseliny
190	S ΓΠ « CH’ 7£>=O CFjCO2H H	Trifluroracetát (2-pyridin-2ylethyl)-amidu 5-[5-fluor-2-oxo1,2-dihydro-indol-(3Z)ylidenmethyl] -2,4-dimethyl-1Hpyrrol-3-karboxylové kyseliny
191	H'c,Áf'A' Ach· CA C.H H	Hydrochlorid (2-pyridin-2ylethyl)-amidu 5-[2-oxo-l,2dihydro-indol-(3Z)ylidenmethyl] -2,4-dimethyl-1Hpyrrol-3-karboxylové kyseliny
192	ϊ γΠ H,C X M •''V-Au > TÍh N ΒΓν^_< 9 CH° Y ΖΓ CF,CO,H 3 z H	Trifluroracetát (2-pyridin-2ylethyl)-amidu 5-[5-brom-2-oxo1,2-dihydro-indol-(32)ylidenmethyl] -2,4-dimethyl-1Hpyrrol-3-karboxylové kyseliny

• * · · · · » · · · • · · · ·«· φ · · · • * · · · · ···· · · · *·· ♦ ··«·· · · ' «····· ·· · ·* ♦

193	n H O >N CHj ΧίΑ'Ν H	(2-Ethylaminoethyl)-amid 5-[5fluor-2-oxo-1,2-dihydro-indol(3Z)-ylidenmethyl] -2,4-dimethyl1 H-pyrrol-3 -karboxylové kyseliny
194	O NH. ϊι> H	(2-Aminoethyl)-amid 5-[5-fluor2-oxo-1,2-dihydro-indol-(3Z)ylidenmethyl] -2,4-dimethyl-1Hpyrrol-3-karboxylové kyseliny
195	o F JlSN CHa 05=°	(2-Diethyl-A-oxoaminoethyl)amid 5-[5-fluor-2-oxo-l,2dihydro-indol-(3Z)ylidenmethyl] -2,4-dimethyl-2,4dimethyl-1 //-pyrrol-3 karboxylové kyseliny
196	OH h3c CH’	(2-Ethyl-A-hydroxy-aminoethyl)amid 5-[5-fluor-2-oxo-l,2dihydro-indol-(3Z)ylidenmethyl] -2,4-dimethyl-1Hpyrrol-3-karboxylové kyseliny
197	o Γ” K H OH ργγΟ 01 H	(2-Diethylamino-2hydroxyethyl)-amid 5-[5-fluor-2oxo-1,2-dihydro-indol-(3Z)ylidenmethyl] -1 H-pyrrol-3 karboxylové kyseliny
198	r 0 Ν'ν-χ ΆΛ H ΐ J >=° \í^N H	[2-Ethyl-2-(2hydroxyethy l)aminoethyl] -amid 5-[5-fluor-2-oxo-l ,2-dihydroindol-(3Z)-ylidenmethyl]-2,4dimethyl-1 //-pyrrol-3 karboxylové kyseliny

• · »· » · ♦ · · • · · ♦ ·♦ · ♦ · · ♦ · · « • · · ♦ »«· • · ♦

199	O Hí, K Ji & I I >°	[2-Ethyl-2-(lhydroxyethyl)aminoethyl] -amid 5-[5-fluor-2-oxo-l ,2-dihydroindol-(3Z)-ylidenmethyl]-2,4dimethyl-1 //-pyrrol-3 karboxylové kyseliny
200	H ^\_Λν F J-( H 0 NCV^C-\ H ^3 Ϊ x>=° H	(2-2V-acetylaminoethyl)-amid 5-[5-kyano-2-oxo-l ,2-dihydroindol-(3Z)-ylidenmethyl]-2,4dimethyl-1 //-pyrrol-3 karboxylové kyseliny
201	0 híV''»^ f\^-k B CHa TT>=°	(Karboxymethyl)-amid 5 - [5 -fluor-2-oxo-1,2-dihydroindol-(3Z)-ylidenmethyl]-2,4dimethyl-1 //-pyrrol-3 karboxylové kyseliny
202	o H HjC Ji^N •'Χζ'Ν QH I T >° H	[2-(2-Hydroxethylamino)ethyl]amid 5-[5-fluor-2-oxo-l,2dihydro-indol-(3Z)ylidenmethyl]-l//-pyrrol-3karboxylové kyseliny
203	o kjC NCy^yxfj CM* UXN >0 CF,CO,H H	Trifluoracetát (2-pyridin-2ylethyl)-amidu 5-[5-kyano-2-oxo1,2-dihydro-indol-(3Z)ylidenmethyl] -1 //-pyrrol-3 karboxylové kyseliny
204	o P ff CHí P i 7=0	Trifluoracetát (3-pyrrolidin-1-yl2-onpropy-l)-amidu 5-[5-brom-2oxo-1,2-dihydro-indol-(3Z)ylidenmethyl] -1 //-pyrrol-3 karboxylové kyseliny

i ·· «· • · ♦ · • ♦ * φ · · ♦ * · ··♦· ·* ·· · ♦ · * • * φ « • « 9«Μ • · · • Φ Φ • · Φ * • ΦΦΦΦΦ • » φ

Φ· ·

205	C H ,	3-(3,5-Dimethylpyrrol-2ylmethyliden)-1 -(4methylpiperazin-1 -ylmethyl)-2indolinon
206		3-(3,5-Dimethylpyrrol-2ylmethyliden)-1 -(pyrrolidin-1 ylmethyl)-2-indolinon

Čísla sloučenin odpovídají číslům příkladů v příkladech provedení vynálezu. To znamená, že syntéza sloučeniny 1 v Tabulce 1 je popsána v příkladu 1. Sloučeniny uvedené v tabulce 1 mají pouze ilustrativní charakter a nemají předložený vynález jakýmkoliv způsobem limitovat. Další inhibitory protein kinázy, které mohou být používány v tomto způsobu zahrnují 3-(3,5-dimethylpyrrol-2-ylmethyliden)-2-indolin (su 5416); 3-[3,5-dimethyl-4-(2-karboxyethyl)pyrrol-2-ylmethyliden]-2-indolin (su 6668) a 3-[3-(2-karboxyethyl)-5-methylpyrrol-2-ylmethyliden)-2-indolin.

B. Selektivní inhibitory cyklooxygenázy-2 - sloučeniny obecných vzorců (II) a (III):

Příklady inhibitorů COX-2, které mohou být používány v předloženém vynálenazu a nemají v žádném případě limitující charakter, jsou uvedeny v Tabulce II a III níže.

Tabulka III

Sloučenina	Značka/výzk.č.	Odkaz	Dávkování
l,5-Difenyl-3substituovaných pyrazolů		WO 97/13755
	radicicol	WO 96/25928, Kwon et al (Cancer Res (1992) 52 6296)

·· • · · 9 • ···* · * • · ♦ «·«

	GB-02283745
	TP-72	Cancer Res 1998 58 4717-723
1 -(4-chlorbenzoyl)-3-[4-(4fluor-fenyl)thiazol-2ylmethyl] -5 -methoxy-2methy lindol	A-l 83827.0
	GR-253035
4-(4-cyklohexyl-2methyloxazol-5-yl)-2fluorbenzensulfonamid	JTE-522	JP 9052882
5-chlor-3-(4(methylsulfonyl)fenyl)-2(methyl-5-pyridinyl)-pyridin
2-(3,5-difluor-fenyl)-3,4(methylsulfonyl)-fenyl)-2cyklopenten-l-on
	L-768277
	L-783003
	MK-966; VIOXX ®	US 5968974	12,5-100 mg po
indolalkanová kyselina odvozená od indomethacinu		WO 96/374679	200 mg/kg/denně
1 -methylsulfonyl-4- [1,1dimethyl-4-(4-fluorfenyl)cyklopenta-2,4-dien-3yl]benzen		WO 95/30656, WO 95/30652, WO 96/38418, WO 96/38442,
4,4-dimethyl-2-fenyl-3 - [4(methylsulfonyl)fenyl]cyklobutenon
2-(4-methoxyfenyl)-4methyl-l-(4sulfamoylfenyl)-pyrrol		EP 799823

9 ·

9 9 · · l 9 9

9999 • 9

9999

9 9 9 9

9999 9 9

/V-[5-(4-substituent fluorfenoxy]thiofen-2methansulfon-amid	RWJ-63556
5(£)-(3,5-di-/erc-butyl-4hydroxy)benzyliden-2-ethyl1,2-izothiazolidin-1,1 -dioxid	S-2474	EP 595546
3 -formy lamino-7 methylsulfonylamino-6fenoxy-477-1 -benzopyran-4on	T-614	D 38/34204
benzensulfonamid; 4-(5-(4methylfenyl)-3(trifluormethyl)-177-pyrazol1-yl)-	celecoxib	US 5466823
CS 502	(Sankyo)
2-[(2-chlor-6fluorfenyl)amino] -5 methylbenzenoctová kyselina	lumiracoxib(Cox189)	WO 99/11605
5-chlor-6'-methyl-3 -[4(methylsulfonyl)fenyl] -2,3'bipyridin	etoricoxib (MK 663)	WO 98/03484
	BMS 34070	US 6180651
	meloxicam	US 4233299	15-30 mg/denně
	nimesulid	US 3840597

WO 99/30721	WO 99/30729	US 5760068	WO 98/15528
WO 99/25695	WO 99/24404	WO 99/23087	FR 27/71005
EP 921119	FR 27/70131	WO 99/18960	WO 99/15505
WO 99/15503	WO 99/14205	WO 99/14195	WO 99/14194
WO 99/13799	GB 23/30833	US 5859036	WO 99/12930

♦ · • » » ···· ·♦ ·· · • · · * · « · • · ··<·♦ ♦ • · t * · ···

WO 99/11605	WO 99/10332	WO 99/10331	WO 99/09988
US 5869524	WO 99/05104	US 5859257	WO 98/47890
WO 98/47871	US 5830911	US 5824699	WO 98/45294
WO 98/43966	WO 98/41511	WO 98/41864	WO 98/41516
WO 98/37235	EP 86/3134	JP 10/175861	US 5776967
WO 98/29382	WO 98/25896	ZA 97/04806	EP 84/6,689
WO 98/21195	GB 23/19772	WO 98/11080	WO 98/06715
WO 98/06708	WO 98/07425	WO 98/04527	WO 98/03484
FR 27/51966	WO 97/38986	WO 97/46524	WO 97/44027
WO 97/34882	US 5681842	WO 97/37984	US 5686460
WO 97/36863	WO 97/40012	WO 97/36497	WO 97/29776
WO 97/29775	WO 97/29774	WO 97/28121	WO 97/28120
WO 97/27181	WO 95/11883	WO 97/14691	WO 97/13755
WO 97/13755	CA 21/80624	WO 97/11701	WO 96/41645
WO 96/41626	WO 96/41625	WO 96/38418	WO 96/37467
WO 96/37469	WO 96/36623	WO 96/36617	WO 96/31509
WO 96/25405	WO 96/24584	WO 96/23786	WO 96/19469
WO 96/16934	WO 96/13483	WO 96/03385	US 5510368
WO 96/09304	WO 96/06840	WO 96/06840	WO 96/03387
WO 95/21817	GB 22/83745	WO 94/27980	WO 94/26731
WO 94/20480	WO 94/13635	FR 27/70,131	US 5859036
WO 99/01131	WO 99/01455	WO 99/01452	WO 99/01130
WO 98/57966	WO 98/53814	WO 98/53818	WO 98/53817
WO 98/47890	US 5830911	US 5776967	WO 98/22101
DE 19/753463	WO 98/21195	WO 98/16227	US 5733909
WO 98/05639	WO 97/44028	WO 97/44027	WO 97/40012
WO 97/38986	US 5677318	WO 97/34882	WO 97/16435
WO 97/03678	WO 97/03667	WO 96/36623	WO 96/31509
WO 96/25928	WO 96/06840	WO 96/21667	WO 96/19469
US 5510368	WO 96/09304	GB 22/83745	WO 96/03392
WO 94/25431	WO 94/20480	WO 94/13635	JP 09052882
GB 22/94879	WO 95/15316	WO 95/15315	WO 96/03388

·♦ tt 99 9 99 9 • · · · · · · · · · • · · · · · · · ···

9 999 9 9999 99 9 999

9 9 9 9 9 9 9 9

999999 99 9 99 9

WO 96/24585	US 5344991	WO 95/00501	US 5968974
US 5945539	US 5994381	US 6180651

Pyrazoly mohou být připraveny způsoby popsanými v WO 95/15316. Pyrazoly mohou být dále připraveny způsoby popsanými v WO 95/15315. Pyrazoly mohou být také připraveny způsoby popsanými v WO 96/03385. Analoga thiofenu mohou být připravena způsoby popsanými v WO 95/00501. Příprava analog thiofenu je také popsána v WO 94/15932. Oxazoly mohou být připraveny způsoby popsanými v WO 95/00501. Příprava oxazolů je také popsána v WO 94/27980. Izoxazoly mohou být připraveny způsoby popsanými v WO 96/25405. Imidazoly mohou být připraveny způsoby popsanými v WO 96/03388. Příprava imidazolů je také popsána v WO 96/03387. Inhibitory cyklooxygenázy-2 na bázi cyklopentenu mohou být připraveny způsoby popsanými v patentu US č. 5,344,991. Příprava inhibitorů Cox-2 na bázi cyklopentanu je také popsána v WO 95/00501. Terfenylové sloučeniny mohou být připraveny způsoby popsanými v WO 96/16934. Thiazolové sloučeniny mohou být připraveny způsoby popsanými v WO 96/03,392. Pyridinové sloučeniny mohou být připraveny způsoby popsanými v WO 96/03392. Příprava pyridinových sloučenin je také popsána v WO 96/24585.

Celecoxib používaný v terapeutických kombinacích podle předloženého vynálezu může být připraven způsobem popsaným v patentu US č. 5,466,823.

Valdecoxib používaný v terapeutických kombinacích podle předloženého vynálezu může být připraven způsobem popsaným v patentu US č. 5,633,272.

Parecoxib používaný v terapeutických kombinacích podle předloženého vynálezu může být připraven způsobem popsaným v patentu US č. 5,932,598.

Rofecoxib používaný v terapeutických kombinacích podle předloženého vynálezu může být připraven způsobem popsaným v patentu US č. 5,968,974.

Japan Tobacco JTE-522 používaný v terapeutických kombinacích podle předloženého vynálezu může být připraven způsobem popsaným v JP90/52,882.

Lumiracoxib (Cox-189) používaný v terapeutických kombinacích podle předloženého vynálezu může být připraven způsobem popsaným v WO 99/11605.

Etoricoxib (MK 663) používaný v terapeutických kombinacích podle předloženého vynálezu může být připraven způsobem popsaným v WO 98/03484.

Φ· »· • · φ · ♦ · φ • φ · · φφφ • ΦΦΦ · · φφ · • · * • φφφ • φ ΦΦΦΦ φφφ φφ φ φφ φ φ φ φ φ φ φ φ φ φ φ φφφ φ φ φ φφ ·

Sloučenina BMS 34070 firmy Bristol Meyers Squibb používaná v terapeutických kombinacích podle předloženého vynálezu může být připraven způsobem popsaným v patentu US č. 6,180,651.

Odkazy uvedené výše v tabulce II a III popisují různé inhibitory COX-2 vhodné pro použití podle předloženého vynálezu a způsoby jejich přípravy, kteréžto jsou zde uvedeny jako odkazy.

Výhodné inhibitory COX-2, které mohou být používány v předloženém vynálezu

zahrnují, ale není to : Cl)	nikterak limitováno:
		u Ύ	I0/^cH3
	H2N^ Λ
	A 0 0	T F

JTE-522, 4-(4-cyklohexyl-2-methyloxazol-5-yl)-2-fluorbenzensulfonamid;

C2)

5-chlor-3-(4-(methylsulfonyl)fenyl)-2-(methyl-5-pyridinyl)pyridin,

C3)

2-(3,5-difluorfenyl)-3-4-(methylsulfonyl)fenyl)-2-cyklopenten-l-on;

C4)

C5)

rofecoxib, 4-(4-(methylsulfonyl)fenyl]-3-fenyl-2(57/)-furanon;

C6)

4-(5-methyl-3-fenylizoxazol-4-yl)benzensulfonamid;

C7)

A-[[4-(5-methyl-3-fenylizoxazol-4yl]fenyl]sulfonyl]propanamid;

C8)

C9)

CIO)

Cil)

6- [ [5 -(4-chlorbenzoyl)-1,4-dimethyl-1 V-pyrrol-2-yl]methyl]-3 (2 V)-pyridazinon;

02) • « ♦· · · · ··· • · · · · 4 · ·«· • · · 4 · · 4 « · 4 4

4 * · · 4 ··«· 4 4 4 444 ··· · · · 4 4 4

444444 4 4 4 4 4 ·

A-(4-nitro-2-fenoxyfenyl)methansulfonamid;

03)

04)

3-(3,4-difluorfenoxy)-5,5 -dimethyl-4- [4-(methylsulfonyl)fenyl]-2(5//)-furanon;

05)

TV- [6- [(2,4-difluorfenyl)thio] -2,3 -dihydro-1 -oxo-1 H-inden-5-yl]methansulfonamid;

«φ φφ #» · φφ · • » · · · · · φφφ φ φ · φ φ * φ φ φ · · • · φφφ · ··*· * φ « φφφ ······ ··· ···· φφ φφ · ·· ·

06)

3-(4-chlorfenyl)-4-[4-(methylsulfonyl)fenyl]-2(3//)-oxazolon;

07)

4- [3 -(4-fluorfenyl)-2,3 -dihydro-2-oxo-4-oxazolyl]benzensulfonamid;

08)

3-[4-(methylsulfonyl)fenyl]-2-fenyl-2-cyklopenten-1 -on;

09) «9

9 9 9

9 9

9 9

9 9

9999 9« • 9 9

9 9

9 9 9

9 9999

9 9

9

9 *

9 9

9 9 9

9 99 9

9 9

9

4-(2-methyl-4-fenyl-5-oxazolyl)benzensulfonamid;

C20)

3-(4-fluorfenyl)-4-[4-(methylsulfonyl)fenyl]-2(3V)-oxazolon,

C21)

5-(4-fluorfenyl)-1 - [4-(methylsulfony l)fenyl] -3 -(trifluormethyl)-177-pyrazol;

C22) ·· «· ·· · ·« » ···· · · · ··· • · · · · · · · ··· ♦ · · · · · ·99· · 9 · ···· ··· · · · ··· ···· ·· ·· * ·· ·

4-[5-fenyl)-3-(trifluormethyl)-177-pyrazol-l-yl)benzensulfonamid;

C23)

4- [ 1 -fenyl-3 -(trifluormethyl)-177-pyrazol-5-yl]benzensulfonamid;

C24)

4- [5 -(4-fluorfeny l)-3 -(trifluormethyl)-177-pyrazol-1 -yljbenzensulfonamid;

C25) • ·

A-[2-('cyklohexyloxy)-4-nitroíěnyl]methansulfonamid;

C26)

N- [6-(2,4-difluorfenoxy)-2,3 -dihydro-1 -oxo-1 A-inden-5-yl]methansulfonamid;

C27)

-(4-chlorfenoxy)-4- [(methylsulfonyl)amino]benzensulfonamid;

C28) • · · • · · · · • · · · · · ····· · · · · 4 • ·

3-(4-fluorfenoxy)-4-[(methylsulfonyl)amino]benzensulfonamid;

C29)

- [(1 -methyl-17/-imidazol-2-yl)thio] -4-[(methylsulfonyl)amino]benzensulfonamid;

C30)

5,5-dimethy]-4-[4-(methylsulfonyl)fenyl]-3-fenoxy-2(5H)-furanon;

C31) · 4 · · · • · · 4*4 • 4 4 4 · ···

4444444 4444

4 44 4

A- [6- [(4-ethy 1-2 -thiazolyl)thio] -1,3 -dihydro-1 -oxo-5 -izobenzo furanyl]methansulfonamid;

C32)

3-[(2,4-dichlorfenyl)thio]-4-[(methylsulfonyl)amino]benzensulfonamid;

C33)

-fluor-4-[2-[4-(methylsulfonyl)fenyl]cyklopenten-1 -yl]benzen;

C34) • · • 9 · 9 · 9 9 » · »· ·

4-[5-(4-chlorfenyl)-3-(difluormethyl)-177-pyrazol-l-yl]benzensulfonamid;

C35)

3-[l-[4-(methylsulfonyl)fenyl]-4-(trifluormethyl)-l//-imidazol-2-yl]pyridin;

C36)

·· · · ··· ··· • · · · · · · ··· ·· · · · · · · · · · • · · · · · ···· · · · ···· ··· ··· · · · ·»···· ·· ♦ · · ·

4- [2-(3 -pyridinyll)-4-(trifluormethyl)-1 //-imidazol-1 -yljbenzensulfonamid;

C37)

4-[5-(hydroxymethyl)-3-fenylizoxazol-4-yl]benzensulfonamid;

4- [3 -(4-chlorfeny 1)-2,3 -dihydro-2-oxo-4-oxazolyl]benzensulfonamid;

C39)

4-[5-(difluormethyl)-3-fenylizoxazol-4-yl]benzensulfonamid;

C40)

I · · · · · · ♦ · · · · · • · · · · · · • · · · · ····«

[1, Γ:2', 1 -terfenyl]-4-sulfonamid;

C41)

4-(methylsulfonyl)-1,1 ’,2], 1 -terfenyl;

C42)

4-(2-fenyl-3-pyridinyl)benzensulfonamid;

C43)

NHSO2CH3

Ο

Α-(2,3 -dihydro-1,1 -dioxido-6-fenoxy-1,2-benzizothiazol-5-yl)methansulfonamid; a

C44)

A-[3-(formylamino)-4-oxo-6-fenoxy-4H-l-benzopyran-7-yl]methansulfonamid;

C47)

44 44 4

4444 444 444

4 4 444 4 444

444 4 4444 44 4 444

444444 44 4 44 4

C48)

C49) lumiracoxib (COX-189) h₂ ho₂c—c

Me

2-[(2-chlor-6-fluorfenyl)amino]-5-methylbenzenoctová kyselina

C50) etoricoxib (MK 663)

9« ·

9

999« 999 999

9 9 999 9 999 • · 999 9999999 9999

999 999 999

9999 99 99 9 99 9

5-chlor-6'-methyl-3-[4-(methylsulfonyl)fenyl]-2,3'-bipyridin

C51) BMS 34070

Výhodnější inhibitory COX-2, které mohou být používány v předloženém vynálezu, jsou vybrány ze skupiny sestávající z:

I)

JTE-522, 4-(4-cyklohexyl-2-methyloxazol-5-yl)-2-fluorbenzensulfonamid;

φφφ φ φ φφφ φ φφφ φφ φ φ φ φ φ φφφ φφφ φ φφφ φφφ φφφ φφφ

ΦΦΦΦ φφ φφφ φφ φ

Π)

5-chlor-3-(4-methylsulfonyl)fenyl)-2-(methyl-5-pyridinyl)pyridin;

III)

2-(3,5-difluorfenyl)-3-4-(methylsulfonyl)fenyl)-2-cyklopenten-l-on;

IV)

4-[5-(4-methylfenyl)-3-(trifluormethyl)-l//-pyrazol-l-yl]-benzensulfonamid;

V)

rofecoxib, 4-(4-(methylsulfonyl)fenyl]-3-fenyl-2(5//)-furanon;

VI)

4-(5-methyl-3-fenylizoxazol-4-yl)benzensulfonamid;

• · 9 9

9999 9 9

9999 99

9 9 9 9

9 9 9

9 9 9 9

999 999 999

9999 99 99 9 99 9

VII)

V- [ [4-(5 -methy 1-3 -feny lizoxazol-4-yl] fenyl] sulfonyljpropanamid;

VIII)

9 9

999

4-[5-(4-chorofenyl)-3-(trifluormethyl)-l//-pyrazol-l-yl]benzensulfonamid; a

2-[(2-chlor-6-fluorfenyl)amino]-5-methylbenzenoctová kyselina

Výhodnější inhibitory COX-2, které mohou být používány v předloženém vynálezu, zahrnují, ale není to nikterak limitováno, celecoxib, valdecoxib, parecoxib, rofecoxib, lumiracoxib a Japan Tobacco JTE-522.

Do kombinace podle předloženého vynálezu také patří izomemí formy, proléčiva a tautomery popsaných sloučenin a jejich farmaceuticky přijatelné soli. Názorné, farmaceuticky přijatelné soli jsou připraveny z kyseliny mravenčí, octové, propionové, sukcinové, glykolové, glukonové, mléčné, jablečné, vinné, citrónové, askorbové, glukuronové, maleinové, fumarové, pyrohroznové, aspartové, glutamové, benzoové, anthranilové, mesylové, stearové, salicylové, /?-hydroxybenzoové, fenyloctové, mandelové, embonové (pamoové), methansulfonové, ethansulfonové, benzensulfonové, pantotenové, toluensulfonové, 2-hydroxyethansulfonové, sulfanilové, cyklohexylaminosulfonové, algenové, ó-hydroxybutyrové, galaktorové a galakturonové kyseliny.

Použitelnost ·» * • · · · · · ···· · · · ··· ··· · · · · · φ ······ ·· · ·· ·

Sloučeniny podle předloženého vynálezu jsou inhibitory protein kináz (PK) a enzymu cyklooxygenázy, konkrétně enzymu cyklooxygenázy-2, a tudíž jsou použitelné při ošetření rakoviny.

PK, jejichž katalytická aktivita je modulována sloučeninami obecného vzorce (I) podle předloženého vynálezu, zahrnují tyrosin-specifické protein kinázy, např. receptorové tyrosinkinázy (RTK), buněčné tyrosinkinázy (CTK) a serin-threoninkinázy (STK). Přenos signálu zprostředkovaný RTK je iniciován extracelulámí interakcí se specifickým růstovým faktorem (ligand), poté dimerizací receptoru, tranzitní stimulací aktivity intrinsické tyrosin-specifické protein kinázy a fosfory láce. Vazebná místa jsou tudíž vytvořena pro intracelulámí molekuly přenášející signál a vedou k tvorbě komplexů se spektrem cytoplazmatických signálních molekul, které usnadňují příslušnou buněčnou odpověď (např. buněčné dělení, metabolické efekty na extracelulámí mikroprostředí, atd.).

Viz Schlessinger and Ullrich, 1992, Neuron 9: 303 - 391.

Bylo zjištěno, že místa s fosfyralací tyrosinu na receptorech růstového faktoru fungují jako vazebná místa s vysokou afinitou pro SH2 (src homologie) domény signálních molekul. Fantl et al., 1992, Cell 69:413-423, Songyang et al., 1994, Mol. Cell. Biol. 14:2777-2785), Songyang et al., 1993, Cell 72:767-778, a Koch et al., 1991, Science 252:668-678. Bylo identifikováno několik intracelulámích substrátových proteinů, které asociují s receptorovými tyrosinkinázami (RTK). Mohou být rozděleny do dvou hlavních skupin: (1) substráty, které mají katalytickou doménu, a (2) substráty, které takovou doménu nemají, ale slouží jako adaptéry a asociují s katalyticky aktivními molekulami (Songyang etal., 1993, Cell 72: 767-778). Specificita interakcí mezi receptory a doménami SH2 svých substrátů je určována aminokyselinovými zbytky, bezprostředně obklopujícími fosforylovaný tyrosinový zbytek. Například rozdíly ve vazebné afinitě mezi SH2 doménami a aminokyselinovými sekvencemi obklopujícími fosfotyrosinové zbytky na konkrétních receptorech korelují s pozorovanými rozdíly ve fosforylačním profilu jejich substrátů (Songyang et al., 1993, Cell 72: 767-778). Zpozorování vyplývá, že funkce každé RTK je určována nejen profilem její exprese a dostupností ligandů, ale i souborem drah přenosu signálu po směru exprese, které jsou aktivovány konkrétním receptorem. Fosforylace tedy poskytuje významný regulační stupeň, který určuje selektivitu signálních drah, vyvolávaných specifickými receptory růstového faktoru, jakož i receptory diferenciačního faktoru.

·· ·« • · · · • · · • 99 • · 9

9999 99

9

9 9

9 9 9

9 9999

9 9 ·

• · ·

9 9

9 9 9

9 9999

9 9

STK, které jsou primárně cytosolové, ovlivňují interní biochemii buněk, často jako down-line odpověď na PTK. STK se podílejí na procesu přenosu signálu, který iniciuje syntézu DNA a následná mitóza vede k buněčné proliferaci.

Tudíž přenos signálu prostřednictvím PK vede mimo jiné i k buněčné proliferaci, diferenciaci, růstu a metabolizmu. Abnormální buněčná proliferace může vést k velkému počtu onemocnění a poruch, včetně vzniku neoplazie, např. karcinomu, sarkomu, glioblastomu a hemangiomu, poruch, např. leukémie psoriázy, arteriosklerózy, arthritidy a diabetické retinopatie a dalších poruch souvisejících s neregulovanou angiogenezí a/nebo vaskulogenezí.

K provádění předloženého vynálezu není třeba znát přesný mechanizmus, kterým sloučeniny podle předloženého vynálezu inhibují PK. Nicméně se předpokládá, a není to nikterak limitováno žádným mechanizmem nebo teorií, že sloučeniny obecného vzorce (I) interagují s aminokyselinami v katalytické oblasti PK. Typicky obsahují PK dvojlaločnou strukturu, na které se asi ATP váže, přesně do štěrbiny mezi dva laloky v oblasti, která má v rámci PK konzervativní výskyt aminokyselin. Předpokládá se, že inhibitory PK se vázají nekovalentními interakcemi, např. vodíkovými můstky, van der Waalsovými silami a iontovými interakcemi, ve stejné obecné oblasti, ve které se výše zmíněná ATP váže na PK. Konkrétněji se předpokládá, že 2-indolinonová složka sloučenin obecného vzorce (I) se váže v obecném prostoru běžně obsazovaném adeninovým kruhem ATP. Specifita konkrétní molekuly pro konkrétní PK může být výsledkem dalších interakcí mezi různými substituenty na 2-indolinonovém jádře a aminokyselinových domén specifických pro konkrétní PK. Díky schopnosti výběru sloučenin, které jsou aktivní v různých vazebných míst ATP (nebo jiný nukleotid), nacházejí sloučeniny obecného vzorce (I) použitelnost pro zasažení kteréhokoliv proteinu s takovým místem. Sloučeniny obecného vzorce (I) uvedené v předloženém vynálezu tedy mají použitelnost při in vitro testech takových proteinů a dále mají in vivo terapeutické účinky díky interakcím s takovými proteiny.

Navíc sloučeniny obecného vzorce (I) poskytují terapeutický přístup k léčení mnoha druhů pevných nádorů zahrnujících, ale není to nikterak limitováno, karcinomy, sarkomy, včetně Kaposiho sarkomu, erythroblastomu, glioblastomu, meningiomu, astrocytomu, melanomu a myoblastomu. Léčení nebo prevence rakovin typu nepevných nádorů, např. leukémie, patří rovněž do předloženého vynálezu. Indikace mohou zahrnovat, ale není to nikterak limitováno, rakoviny mozku, močového měchýře, ovárií, žaludku, pankreatu, střeva, krve, plic a kostí.

·· · · ·* · »99

9 · 9 999 999

9 9 999 9 999

999 9 9999 99 9 >999 9 99 99 9 99 «

9999 99 99 9 9» 9

Další příklady typů poruch spojených s nepřiměřenou aktivitou PK, ale není to nikterak limitováno, při kterých mohou být sloučeniny podle předloženého vynálezu použitelné v rámci prevence, léčby a studia, zahrnují poruchy buněčné proliferace, fibrotické poruchy a metabolické poruchy.

Poruchy buněčné proliferace, u kterých může být uplatněna prevence, léčba nebo další studium, podle předloženého vynálezu zahrnují rakovinu, poruchy proliferace krevních cév a poruchy proliferace mesangiální buněk.

Poruchy proliferace krevních cév se týkají poruch souvisejících s abnormální vaskulogenezí (tvorba krevních cév) a angiogenezí (šíření krevních cév). I když vaskulogeneze a angiogeneze mají důležité role při různých normálních fyziologických procesech, např. vývoj embrya, tvorba corpus luteum, hojení ran a regenerace orgánu, mohou mít klíčovou roli při vývoji rakoviny, kde mají za následek tvorbu nových kapilár potřebných k udržení životaschopného nádoru. Další příklady poruch proliferace krevních cév zahrnují artritidu, kde nové kapilární krevní cévy napadají kolena a ničí chrupavky, a oční onemocnění, jako diabetická retinopatie, kde nové kapiláry na sítnici napadají sklivec, spouští krvácení a způsobují slepotu.

Byly identifikovány dvě strukturně příbuzné RTK, které se vážou na VEGF s vysokou afinitou: receptorová tyrosin-1 typu fms (flt-1) (Shibuya et al., Oncogene 5: 519524; DeVries et a/.,1992, Science 255; 989-991) a receptor KDR/FLK-1 také známý jako VEGF-R2. Bylo publikováno, že vaskulámí endotheliální růstový faktor (VEGF) je endotheliální, buněčné specifický mitogen s in vitro aktivitou podporující endotheliální buněčný růst. Ferrara & Henzel, 1989, Biochein. Biofys. Res. Comm., 161:851-858; Vaisman et al., 1990, J. Biol. Chem., 265:19461-19566. Informace uvedené v přihlášce vynálezu US č. 08/193,829, 08/038,596 a 07/975,750 neochvějně tvrdí, že VEGF není odpovědné pouze za endotheliální buněčnou proliferaci, ale slouží i jako hlavní regulátor normální a patologické angiogeneze. Viz Klagsbum & Soker, 1993, Current Biology, 3(10)699-702; Houck, etal., 1992,7. Biol. Chem., 267:26031-26037.

Normální vaskulogeneze a angiogeneze mají důležitou roli při různých fyziologických procesech, např. vývoji embrya, hojení ran, regeneraci orgánu a samičích reprodukčních procesech, např. vývoji folikul v corpus luteum, během ovulace a růst placenty po těhotentství. Folkman & Shing, 1992, J. Biological Chem., 267(16):10931-34. Nekontrolovatelná vaskulogeneze a/nebo angiogeneze byla spojena s onemocněními, např. diabetes, jakož i s maligními pevnými nádory, které jsou kvůli růstu závislé na ·· ·· ·· · 99 9 • 9 · · · · · · · · • · · 9 9 9 9 9 9 9 9 · · · · · *··· 9 9 · 9999

9 9 9 9 9 Λ 9 9

9999 99 99 9 99 9 vaskularizaci. Klagsbum & Soker, 1993, Current Biology, 3(10):699-702; Folkham, 1991, J. Nati. Cancer Inst., 82:4-6; Weidner, et al., 1991, New Engl. J. Med., 324:1-5.

Předpokládaná role VEGF při endotheliální buněčné proliferaci a migraci během angiogeneze a vaskulogeneze ukazuje na důležitou roli receptoru KDR/FLK-1 při těchto procesech. Onemocnění, např. diabetes melitus (Folkman, 198, in Xlth Congress of Thrombosis a Haemostasis (Verstraeta, et al., eds,), 583-596, Leuven University Press, Luven) a arthritida, jakož i růst maligního nádoru vyplývá z nekontrolovatelné angiogeneze. Viz např. Folkman, 1971, N. Engl. J. Med,, 285:1182-1186. Receptory, na které se VEGF specificky váže, jsou důležité a účinné terapeutické cíle pro regulaci a modulaci vaskulogeneze a/nebo angiogeneze a různých závažných onemocnění, které se podílejí na abnormálním buněčném růstu způsobeném takovými procesy. Plowman, et al., 1994, DN&P, 7(6): 334-339. Konkrétně díky vysoce specifické roli receptoru KDR/FLK-1 při neovaskularizaci se stává tento receptor cílem pro terapeutické přístupy zaměřené na léčení rakoviny a onemocnění s nekontrolovatelnou tvorbou krevních cév.

Předložený vynález tedy poskytuje sloučeniny, které jsou schopné regulovat a/nebo modulovat tyrosinkinázový přenos signálu zahrnující přenos signálu přes receptor KDR/FLK-1 díky inhibici nebo podpoře angiogeneze a/nebo vaskulogeneze, tzn. sloučeniny, které jsou schopné inhibice, prevence nebo interference se signálem přenášeným KDR/FLK-1 v případě, kdy jsou aktivovány ligandy jako např. VEGF. Ačkoliv se předpokládá, že sloučeniny podle předloženého vynálezu působí na receptor nebo jinou složku společně s tyrosinkinázovou dráhou přenosu signálu, mohou také působit přímo na nádorové buňky, které vznikají v důsledku nekontrolovatelné angiogeneze.

Ačkoliv se nomenklatura lidských a myších ekvivalentů generického receptoru flk-I liší, mohou být v mnoha ohledech zaměnitelné. Myší receptory, Flk-1, a jeho lidský ekvivalent, KDR, mají v rámci intracelulámí domény 93,4% sekvenční homologii. Podobně váže myší FLK-I lidský VEGF se stejnou afinitou jako myší VEGF, a tudíž je aktivován ligandem odvozeným od jiných species. Millauer et al., 1993, Cell, 72:835-846; Chinn et al., 1993, Proč. Nati. Acad. Sci. USA, 90:7533-7537. Dochází k jejímu spojení s FLK-1 také a následně tyrosin fosforyluje lidské RTK substráty (např. PLC-γ nebo p85) v případě, kdy jsou koexprimovány s buňkami 293 (lidské embryonální ledvinové fibroblasty).

• ·

Modely na bázi receptoru FLK-1 jsou tedy přímo použitelné k rozpoznání funkce receptoru KDR. Například použití myšího receptoru FLK-1 v metodách, které indentifikují sloučeniny regulující myší dráhu přenosu signálu, je přímo aplikovatelné k rozpoznání sloučenin, které mohou být používány k regulaci lidské dráhy přenosu signálu, tzn. sloučenin, které regulují aktivitu související s receptorem KDR. Tudíž chemické sloučeniny identifikované jako inhibitory KDR/FLK-1 in vitro mohou být potvrzeny ve vhodných in vivo modelech. Ukázalo se, že in vivo myší i krysí modely jsou výborné ke zkoumání klinického potenciálu agens působících na dráhu přenosu signálu indukovaného KDR/FLK-1.

Předložený vynález tedy poskytuje sloučeniny, které regulují, modulují a/nebo inhibují vaskulogenezi a/nebo angiogenezi ovlivněním enzymatické aktivity receptoru KDR/FLK-1 a interferencí se signálem přenášeným KDR/FLK-1. Předložený vynález tedy poskytuje terapeutický přístup k léčení mnoho typů pevných nádorů zahrnujících, ale není to nikterak limitováno, glioblastom, melanom a Kaposiho sarkom a ovariální, plicní, mamámí, prostatický, pankreatický, střevní a epidermoidní karcinom. Navíc z dat lze předpokládat, že podání sloučenin, které inhibují dráhu přenosu signálu zprostředkovaného KDR/Flk-1, může být také používáno při léčení hemangiomu, restenózy a diabetické retinopatie.

Dále se předložený vynález týká inhibice vaskulogeneze a angiogeneze drah zprostředkovaných jinými receptory včetně dráhy zahrnující receptor flt-1.

Přenos signálu zprostředkovaný receptorovou tyrosinkinázou je přitom zahájen extracelulámí interakcí se specifickým růstovým faktorem (ligandem), po níž typicky následuje dimerizace receptoru, stimulace vlastní aktivity proteinové tyrosinkinázy a autofosforylace receptoru. Vytvoří se tak vazebná místa pro přenosové molekuly intracelulámího signálu, což vede k tvorbě komplexů se spektrem cytoplasmatických signálních molekul, které usnadňují adekvátní buněčnou odpověď (například buněčné dělení, diferenciaci, metabolické efekty, změny extracelulámího mikroprostředí), viz Schlessinger a Ullrich, 1992, Neuron 9: 1-20.

Blízká homologie intracelulámích oblastí KDR/FLK-1 s oblastmi z receptoru PDGF-β (50,3% homologie) a/nebo příbuzným receptorem flt-1 ukazuje na překrývání drah přenosu signálu. Například u receptoru PDGF-β se zjistilo, že členové src rodiny (Twamly et al., 1993, Proč. Nati. Acad. Sci. USA, 90:7696-7700), fosfatidylinositol-3'kináza (Hu et al., 1992, Mol. Cell. Biol., 12:981-990), fosfolipáza cy (Kashishian &

• · · · φ φ · • ΦΦΦΦ · · ΦΦΦΦ • · · · » • φφ ·

Cooper, 1993, Mol. Cell. Biol., 4:49-51), ras-GTPázu-aktivující protein, (Kashishian et al.,

1992, EMBO J., 11:1373-1382), PTP-ID/syp (Kazlauskas et al., 1993, Proč. Nati. Acad.

Sci. USA, 10 90:6939-6943), Grb2 (Arvidsson et al., 1994, Mol. Cell. Biol., 14:6715-6726) a adaptérové molekuly Shc aNck (Nishimura et al., 1993, Mol. Cell. Biol., 13:6889-6896) se vážou na oblasti zahrnující různé autofosforylační místa. Viz Claesson-Welsh, 1994,

Prog. Growth Factor Res, 5:37-54. Tudíž je pravděpodobné, že dráhy přenosu signálu aktivované KDR/FLK-1 zahrnují dráhu ras (Rozakis et al, 1992, Nátuře, 360:689-692). PI3'-kinázu, src-zprostředkované a plcy-zprostředkované dráhy. Každá z těchto drah může hrát rozhodující roli při angiogenním a/nebo vaskulogenním účinku KDR/FLK-1 v endoteliálních buňkách. V důsledku toho se další aspekt předloženého vynálezu týká použití zde popsaných organických sloučenin k modulaci angiogeneze a vaskulogeneze, kde takové procesy jsou kontrolovány těmito dráhami.

Opačně, poruchy související se svraštěním, kontrakcí nebo se zavíráním krevních cév, např. restenóza, sem také patří a mohou být léčeny nebo může jim být zabráněno způsoby podle předloženého vynálezu.

Fibrotické poruchy se týkají abnormální tvorby extracelulámích matricí. Příklady fibrotických poruch zahrnují cirhózu jater a proliferativních poruch mesangiálních buněk. Cirhóza jater je charakterizována přírůstkem částí extracelulární matrix majících za následek tvorbu hepatických jizev. Zvýšená extracelulární matrix vedoucí k hepatickým jizvám může být také způsobena virovou infekcí, např. hepatitidou. Zdá se, že lipocyty mají hlavní roli při hepatické cirhóze. Další postižené fibrotické poruchy zahrnují aterosklerózu.

Proliferativní poruchy mesangiálních buněk se týkají poruch způsobených abnormální proliferací mesangiálních buněk. Mesangiální proliferativní poruchy zahrnují různá lidská renální onemocnění, např. glomerulonefritidu, diabetickou nefropatii a maligní nefrosklerózu, jakož i takové poruchy jako syndromy trombotické mikroangiopatie, rejekci transplantátu glomerulopatie. RTK PDGFR se podílely na udržení proliferace mesangiálních buněk. Floege et al., 1993, Kidney International 43:47S-54S.

Velký počet rakovin má charakter poruch buněčné proliferace a, jak bylo uvedeno výše, PK se na těchto poruchách podílejí. Tudíž není překvapující, že PK, např. členové rodiny RTK, se podílejí na vzniku rakoviny. Některé z těchto receptorů, jako EGFR (Tuzi etal., 1991, Br. J. Cancer 63:227-233, Torp etal., 1992, APMIS 100:713-719) HER2/neu (Slamon et al., 1989, Science 244:707-712) a PDGF-R (Kumabe et al., 1992, Oncogen,

7:627-633) jsou v mnoha nádorech přeexprímovány a/nebo jsou perzistentně aktivovány autokrinními smyčkami. Ve skutečnosti byla v nejběžnějších a nejtěžších rakovinách zjištěna přeexprimace těchto receptorů (Akbasak a Sunr-Akbasak et al., 1992, J. Neurol. Sci., 111:119-133, Dickson et al., 1992, Cancer Treatment Res, 61:249-273, Korc et al., 1992, J. Clin. Invest, 90:1352-1360) a autokrinní smyčky (Le a Donoghue, 1992, J. Cell. Biol., 118:1057-1070, Korc et al., supra, Akbasak a Sunr-Akbasak et al., supra). Například EGFR souvisí s karcinomem skvamózních buněk, astrocytomem, glioblastomem, rakovinou hlavy a krku, plic a močového měchýře. HER2 souvisí s rakovinou prsu, ovárií, žaludku, plic, pankreatu a měchýře. PDGFR souvisí s glioblastomem a melanomem, jakož i rakovinou plic, ovárií a prostaty. RTK c-met také souvisí s tvorbou maligního nádoru. Například c-met souvisí mimo jiné s rakovinami, kolorektální, thyroidními, pankreatickými, gastrickými a hepatocelulámími karcinomy a lymfomy. Navíc c-met souvisí s leukémií. Přeexprimace genu c-met byla také zjištěna u pacientů s Hodgkinsovou a Burkitsovou nemocí.

IGF-IR kromě toho, že je zahrnuto do nutriční podpory a diabetů 2. typu, se podílí rovněž na několika typech rakoviny. Například IGF-I se podílí jako autokrinní růstový stimulátor na několika typech nádorů, např. lidském typu rakoviny prsu (Arteaga et al., 1989, J. Clin. Invest. 84:1418-1423) a malobuněčném nádoru plic (Macauley et al., 1990, Cancer Res., 50:2511-2517). Navíc IGF-I, i když se integrálně podílí na normálním růstu a diferenciaci nervového systému, je také autokrinním stimulátorem lidských gliomů. Sandberg-Nordqvist et al., 1993, Cancer Res., 53: 2475-2478. Význam IGF-IR a jeho ligandů při buněčné proliferaci je dále podpořen faktem, že mnoho typů buněk v kultuře (fibroblasty, epiteliální buňky, buňky hladkého svalstva, T-lymfocyty, myeloidní buňky, chondrocyty a osteoblasty (kmenové buňky kostní dřeně) jsou stimulovány k růstu IGF-I. Goldring a Goldring, 1991, Eukaryotic Gene Expression, 1: 301-326. Baserga a Coppola předpokládají, že IGF-IR má hlavní roli v mechanizmu transformace a jako takový by mohl být výhodným cílem pro terapeutické zásahy na široké spektrum lidských zhoubných nádorů. Baserga, 1995, Cancer Res., 55:249-252, Baserga, 1994, Cell 79:927-930, Coppola et al., 1994, Mol. Cell. Biol., 14:4588-4595.

STK se podílejí na mnoha typech rakoviny včetně, a to významně, rakovinu prsu (Cance, etal., Int. J. Cancer, 54:571-77 (1993)).

Souvislost mezi abnormální aktivitou PK a onemocnění není omezena na rakovinu. Například RTK souvisí s onemocněními, např. psoriázou, diabetes melitus, endometriázou, • Φ φ φ φ φ φ φ φ φ φ φ φ φ φ

angiogenezí, vznikem ateromatózního plaku, Alzheimerovou nemocí, restenózou, von Hippel-Lindauovým onemocněním, epidermální hyperproliferací, neurodegenerativními onemocněními, makulární degenerací spojenou s věkem a hemangiomy. Například EGFR se podílejí na komeálním a dermálním hojení ran. Defekty při Insulin-R a IGF-1R jsou zaznamenávány při diabetes melitus 2.typu. Úplnější korelace mezi specifickými RTK a jejich terapeutickými indikacemi jsou uvedeny v Plowman et al., 1994, DN&P 7:334-339.

Jak již bylo uvedeno výše, tak nejenom RTK, ale i CTK včetně, ale není to nikterak limitováno, src, abl, fps, yes, fyn, lyn, lek, blk, hek, fgr a yrk (recenzovaný Bolen et al., 1992, FASEB J., 6:3403-3409) se podílejí na proliferativní a metabolické dráze přenosu signálu a na mnoha poruchách zprostředkovaných PTK, kterých se předložený vynález týká. Například bylo prokázáno, že zmutované src (v-src) je onkoprotein (pp60^v'^sre) u slepic. Navíc jeho buněčný homolog protoonkogen pp60^c_src přenáší onkogenní signály mnoha receptorů. Přeexprimace EGFR nebo HER2/neu v nádorech vede ke konstitutivní aktivaci pp60^c'^src, která je charakteristická pro maligní buňky, ale chybí v normálních buňkách. Na druhou stranu myši s nedostatkem exprese c-src vykazují osteopetrotický, fenotyp indikující klíčovou participaci c-src ve funkci osteoklastu a možného postižení v příbuzných poruchách.

Podobně se Zap70 podílí na T-buněčné signalizaci, která se může týkat autoimunitních poruch.

STK souvisí se zánětem, autoimunitním onemocněním, imunoodpověďmi a hyperproliferačními poruchami, např. restenózou, fibrózou, psoriázou, osteoarthritidou a revmatoidní arthtritidou.

PK se rovněž podílí na implantaci embrya. Tudíž sloučeniny podle předloženého vynálezu mohou poskytovat účinný způsob prevence takové implantace embrya, a tudíž mohou být účinné jako ochranné prostředky proti početí. Další poruchy, které mohou být léčeny, nebo kterým může být zabráněno pomocí sloučeniny podle předloženého vynálezu, jsou imunologické poruchy, např. autoimunitní onemocnění, AIDS a kardiovaskulární poruchy, např. atheroskleróza.

Nakonec RTK i CTK jsou v současné době podezřívány s podílu na hyperimunitních poruchách.

Příklady účinku mnoha reprezentativních sloučenin podle předloženého vynálezu na některé PTK jsou uvedeny v tabulce 2 níže. Sloučeniny a data uvedená nemají v žádné případě limitující charakter.

• 9

9 9 • ·

B. Termín inhibitor cyklooxygenázy-2 nebo inhibitor COX-2 zahrnuje agens, které specificky inhibují třídu enzymů, cyklooxygenázu-2, s výrazně menším inhibicí cyklooxygenázy-1. Výhodně termín zahrnuje sloučeniny, které mají hodnotu IC50 cyklooxygenázy menší než asi 0,2 μΜ, a také mají poměr selektivity inhibice cyklooxygenázy 2 nad inhibicí cyklooxygenázy-1 alespoň 50, výhodněji alespoň 100. Ještě výhodněji mají sloučeniny hodnotu IC50 cyklooxygenázy-1 větší než asi 1 μΜ, výhodněji větší než 10 μΜ.

Ze studií vyplývá, že prostaglandiny syntetizované cyklooxygenázami mají kruciální roli při iniciaci a podpoře rakoviny. Navíc COX-2 je přeexprimována při neoplastické lézi tlustého střeva, prsu, plic, prostaty, jícnu, pankreatu, střev, čípku, ovárií, močového měchýře, hlavy a krku. V několika in vitro a zvířecích modelech inhibovaly inhibitory COX-2 růst nádoru a metastázy.

Kromě rakovin je také COX-2 exprimován v rámci angiogenní vaskulatury a souvisejí s hyperplastickými a neoplastickými lézemi ukazujícími na roli COX-2 při angiogenezi. Jak u myší, tak i u krys inhibitory COX-2 zřetelně inhibují neovaskularizaci indukovanou bFGF. Použitelnost inhibitorů COX-2 jako chemopreventivních, antiangiogenních a chemoterapeutických agens je popsána v literatuře (Koki et al., Potential utility of COX-2 inhibitors in chemoprevention and chemotherapy, Exp. Opin. Inves. Drugs (1999) 8(10) pp, 1623-1638, zde je uvedeno pouze jako odkaz). Amplifikace a/nebo přeexprimace HER-2/nue (ErbB2) se vyskytuje u 20-30% lidských rakovin prsu a ovárií, stejně tako jako u 5-15% rakovin žaludku a jícnu. Dále souvisí se špatnou prognózou. Navíc bylo nedávno při in vitro studii zjištěno, že exprese COX-2 je zvýšená v buňkách s nadměrnou exprimací onkogenu HER-2/neu. (Subbaramaiah et al., Increased expression of cyklooxygenase-2 v HER-2/neu-overexpressing breast cancer, Cancer Research (submitted 1999), což je zde uvedeno jako odkaz). Při této studii byly detekovány významně zvýšené hladiny produkce PGE2, COX-2 proteinu a mRNA v HER2/neu transformovaných mamámích epiteliálních buňkách v porovnání s netransformovanou partnerskou buněčnou linií. Produkty aktivity COX-2, tzn. prostaglandiny, stimulují proliferaci, zvyšují invazívnost maligních buněk a zvyšují produkci vaskulámího endoteliálního růstového faktoru, který podporuje angiogenezi. Dále HER-2/neu indukuje produkci angiogenních faktorů, např. vaskulámího endoteliálního růstového faktoru.

• · ·· · • ♦ · ··♦· ···.

• · · * · · ···· · · · ····

Proto podání inhibitoru COX-2 v kombinaci s anti HER-2/neu protilátkami, např. trastuzumabem (Herceptin®) a další terapie zaměřené na inhibici HER-2/neu mají léčit rakoviny, u kterých je nadměrně exprimována HER-2/neu.

Rovněž se předpokládá, že hladiny COX-2 jsou zvýšeny u nádorů s amplifikací a/nebo nadměrnou exprimací dalších onkogenů zahrnujících, ale není to nikterak limitováno, c-myc, N-myc, L-myc, L-ras, H-ras, N-ras. Produkty aktivity COX-2 stimulují buněčnou proliferaci, inhibují imunitní kontrolu, zvyšují invazívnost maligních buněk a podporují angiogenezi.

Tudíž podání inhibitoru protein kinázy v kombinaci s inhibitorem COX-2 podle předloženého vynálezu je použitelné k léčení rakovin, u kterých jsou onkogeny nadměrně exprimovány.

Specifické inhibitory COX-2 jsou použitelné k léčení rakoviny (WO98/16227) a v několika zvířecích modelech snižují angiogenezi řízenou různými růstovými faktory (WO98/22101). Antiangiogeneze byla dosažena inhibitorem COX-2 u krys s implantovaným bFGF, vaskulámím endoteliálním růstovým faktorem (VEGF) nebo karagenanem, proteiny se známými angiogenními vlastnostmi. (Masferrer, et al., 89^th Annual Meeting of American Association for Cancer substituent Research, March 1998,)

Farmaceutický přípravek a jeho podání

Sloučeniny podle předloženého vynálezu nebo jejich farmaceuticky přijatelná sůl mohou být podávány lidským subjektům jako takové nebo ve farmaceutických přípravcích, ve kterých jsou smíchány s vhodnými nosiči nebo excipienty(tem) v dávkách. Techniky přípravy a podání sloučenin mohou být nalezeny v „Remingtonů Pharmacological Sciences“, Mack Publishing Co., Easton, PA, poslední vydání.

Termín podání, jak je používán v předloženém vynálezu, se vztahuje na dodání sloučeniny obecného vzorce (I) nebo její farmaceuticky přijatelné soli nebo farmaceutického přípravku obsahujícího sloučeninu obecného vzorce (I) nebo její farmaceuticky přijatelné soli do organizmu za účelem prevence nebo léčení poruch spojených s PK.

Vhodné způsoby podání mohou zahrnovat, ale není to nikterak limitováno, perorální, rektální, místní, transmukózní nebo intestinální podání nebo intramuskulámí, • · subkutánní, intramedulámí, intratekální, přímé intraventrikulámí, intravenózní, intravitreální, intraperitoneální, intranazální nebo intraokulámí injekce. Výhodné způsoby podání jsou perorální a parenterální.

Alternativně lze podávat sloučeninu spíše místním než systémovým způsobem, např. injekcí sloučeniny přímo do pevného nádoru, často v depotní nebo formulaci s trvalým uvolňováním.

Mimoto lze podávat léčivo v cíleně směrovaných lékových systémech, např. v lipozómu potaženém protilátkou specifickou vůči nádoru. Lipozómy budou zaměřeny a selektivně vychytávány nádorem.

Farmaceutické přípravky podle předloženého vynálezu mohou být vyrobeny procesy, které jsou z dosavadní techniky známé, např. standardními mícháním, rozpouštěním, granulací, výrobou dražé, leštěním, emulzifikací, enkapsulací, zachytáváním a lyofilizací.

Farmaceutické přípravky pro použití podle předloženého vynálezu mohou být připraveny standardním způsobem pomocí jednoho nebo více fyziologicky přijatelných nosičů obsahujících excipienty a pomocné látky, které usnadňují zabalení aktivních sloučenin do přípravku, který může být používán farmaceuticky. Vlastní formulace je závislá na vybraném způsobu podání.

Pro injekce mohou být agens podle předloženého vynálezu připraveny ve vodných roztocích, výhodně ve fyziologicky kompatibilních pufrech, např. Hanksův roztok, Ringerův roztok nebo pufru na bázi fyziologického roztoku. Pro transmukózní podání jsou ve formulaci používány takové penetrátory, které jsou vhodné pro překonání dané bariéry. Tyto penetrátory jsou obecně známy.

Pro perorální podání mohou být sloučeniny snadno připraveny spojením aktivních sloučenin se standardními farmaceuticky přijatelnými nosiči. Tyto nosiče umožňují připravit sloučeniny podle předloženého vynálezu ve formě tablet, pilulek, dražé, kapslí, roztoků, gelů, sirupů, injekčních směsí, suspenzí, atd., pro perorální požití léku pacientem, který má být ošetřován. Farmaceutické preparáty pro perorální použití mohou být připraveny spojením aktivní sloučeniny s tuhým excipientem, případně rozemletím výsledné směsi, pokud je třeba, zpracováním směsi granulí, čímž po přidání vhodných pomocných látek lze získat tablety nebo dražé. Vhodné excipienty jsou zejména plnidla, např. cukry, včetně laktózy, sacharózy, mannitolu nebo sorbitolu; celulózové preparáty, např. kukuřičný škrob, pšeničný škrob, rýžový škrob, bramborový škrob, želatina, tragant, • ·

• · · · • · ··· • · ·

100 methyl-celulosa, hydroxypropylmethyl-celulosa, sodná sůl karboxymethylcelulosy a/nebo polyvinylpyrrolidon (PVP). Pokud je třeba, mohou být přidány agens zajišťující rozpad tablety po požití, např. zesítěný polyvinylpyrrolidon, agar nebo kyselina alginová nebo jejich soli, např. alginát sodný.

Jádra dražé jsou opatřena vhodnými potahy. Pro tento účel mohou být používány koncentrované roztoky cukrů, které mohou případně obsahovat arabskou gumu, talek, polyvinylpyrrolidon, karbopolový gel, polyethylenglykol a/nebo oxid titaničitý, roztoky šelaku a vhodná organická rozpouštědla nebo směsi rozpouštědel. Organická barviva nebo pigmenty mohou být přidány do tablet nebo potahů dražé k identifikaci nebo charakterizaci rozdílných kombinací dávek aktivní sloučeniny.

Farmaceutické preparáty, které mohou být používány perorálně, zahrnují kapsle „push-fit“ vyrobené ze želatiny, jakož i měkké, uzavřené kapsle vyrobené ze želatiny a změkčovadla, např. glycerol nebo sorbitol. Kapsle „push-fit“ mohou obsahovat aktivní složky v příměsi s plnidlem, např. laktózou, pojivý, např. škroby, a/nebo lubrikanty, např. talek nebo stearát hořečnatý, a případně stabilizátory. V měkkých kapslích mohou být aktivní sloučeniny rozpuštěny nebo suspendovány ve vhodných roztocích, např. mastných olejích, minerálním oleji nebo tekutých polyethylenglykolech. Navíc mohou být přidávány stabilizátory.

Kapsle mohou být baleny do hnědého skla nebo plastických lahviček kvůli ochraně aktivní sloučeniny před světlem. Kontejnery obsahující aktivní sloučeninu ve formě kapsle musí být skladovány při kontrolované pokojové teplotě (15-30°C).

Pro podání inhalací jsou sloučeniny podle předloženého vynálezu standardně podávány ve formě aerosolového spreje v rozprašovači nebo v balení se stlačeným obsahem s vhodným propelantem, např. dichlordifluormethanem, trichlorfluormethanem, dichlortetrafluorethanem, oxidem uhličitým nebo jinými vhodnými plyny. V případě stlačeného aerosolu může být pro jednotkovou dávku využit „ventil“, který umožní uvolnění přesného množství látky. Kapsle a catridge, např. želatina, pro použití v inhalačním přístroji nebo insuflatoru mohou být připraveny způsobem, při kterém je spojena prášková směs sloučeniny a vhodná prášková báze, např. laktóza nebo škrob.

Sloučeniny mohou být připraveny pro parenterální podání, např. injekcí bolusu nebo kontinuální infuzí. Formulace pro injekce mohou být v jednotkových dávkovačích formách, např. v ampulích nebo v obalech pro více dávek, s přidanou konzervační látkou. Přípravky mohou být také ve formách suspenze, roztoků nebo emulzí v olejových nebo ·· ·» • · · · • · · • · · · • · · ···· ·· ·· · * · · • · · · • · · · · · • · ♦ ·· · ·· · • · · • · · · • · · ···♦ • · ♦ ·· *

101 vodných nosičích a mohou obsahovat pomocné agens, např. suspendační, stabilizační a/nebo dispergační prostředky.

Farmaceutické přípravky pro parenterální podání zahrnují vodné roztoky ve vodě rozpustných forem, např. bez omezení sůl aktivní sloučeniny. Dále mohou být suspenze aktivních sloučenin připraveny jako příslušné olej ovité injekční suspenze. Vhodná lipofilní rozpouštědla nebo nosiče zahrnují mastné oleje, např. sezamový olej, nebo estery syntetických mastných kyselin, např. ethyl-oleát a triglyceridy, nebo lipozómy. Vodné injekční suspenze mohou obsahovat látky, které zvyšují viskozitu suspenze, např. sodná sůl karboxymethyl-celulózy, sorbitol nebo dextran. Případně suspenze mohou také obsahovat vhodné stabilizátory nebo agens, které zvyšují rozpustnost sloučenin, čímž umožňují připravit vysoce koncentrované roztoky.

Nebo může být aktivní složka ve formě prášku určeného ke spojení s vhodným nosičem, např. sterilní voda bez pyrogenu.

Sloučeniny mohou být také připraveny jako rektální přípravky, např. čípky nebo retenční klyzma, obsahující standardní čípkové báze, např. kakaové máslo nebo jiné glyceridy.

Kromě výše uvedených formulací, mohou být také připraveny sloučeniny ve formě depotních preparátů. Tyto formulace s dlouhou dobou účinku mohou být podávány implantací (např. subkutánní nebo intramuskulámí podání) nebo intramuskulámí injekcí. Tímto způsobem mohou být připraveny sloučeniny s vhodnými polymemími nebo hydrofóbními materiály (např. jako emulze v přijatelném oleji) nebo ionexy nebo jako špatně rozpustné deriváty, např. bez omezení špatně rozpustné soli.

Nelimitující příklad farmaceutického nosiče pro hydrofóbní sloučeniny podle předloženého vynálezu je systém spolurozpouštědel obsahující benzylalkohol, nepolární surfaktant nebo organický polymer mísitelný s vodou a vodná fáze, např. systém spolurozpouštědel VPD. VPD je roztok 3 % obj. benzylalkoholu, 8 % obj. nepolárního surfaktantového polysorbátu 80 a 65 % obj. polyethylenglykolu 300 doplněný na konečný objem absolutním ethanolem. Systém spolurozpouštědel VPD (VPD-.5W) se sestává z VPD zředěného 1:1 5% dextrosou ve vodném roztoku. Tento systém spolurozpouštědel dobře rozpouští hydrofóbní sloučeniny a sám má po systémovém podání nízkou toxicitu. Přirozeně mohou být podíly systému spolurozpouštědel značně měněny, nicméně tak, aby se zachovaly charakteristické rysy jeho rozpustnosti a toxicity. Jednotlivé složky systému spolurozpouštědel mohou být měněny: např. místo polysorbátu 80 mohou být používány

102 ·· 9* ··· ·· · ♦ · 9 · 9 9 9 · · ·

9 9 · 9 9 9 · 9 9 9 «9 9 · 9 · 9999 · 9 9 999

9 9 9 9 9 · 9 9

999999 ·· · 9 9 « další nepolární surfaktanty o nízké toxicitě; velikost částic polyethylenglykolu může být různá; polyethylenglykol může být nahrazen dalšími biokompatibilními polymery, např. polyvinylpyrrolidonem; a další cukry nebo polysacharidy mohou nahradit dextrózu.

Nebo může být pro hydrofóbní farmaceutické sloučeniny použit jiný systém podání. Pro hydrofóbní léčiva jsou standardními příklady přenašečů a nosičů využívaných při tomto způsobu lipozómy a emulze. Mohou být používána určitá organická rozpouštědla, např. dimethylsulfoxid, nicméně obvykle na úkor větší toxicity. Navíc sloučeniny mohou být podávány systémem postupného uvolňování, např. semipermeabilními matricemi tuhých hydrofóbních polymerů obsahujících terapeutické agens. V této technice se používají různé látky s postupným uvolňováním a odborníci v oboru je jistě dobře znají. Kapsle s postupným uvolňováním mohou v závislosti na svém chemickém charakteru uvolňovat sloučeniny po dobu několika týdnů až 100 dnů.

V závislosti na chemickém charakteru a biologické stabilitě terapeutického reagens mohou být používány další strategie pro stabilizaci proteinu.

Farmaceutické přípravky také mohou obsahovat vhodnou pevnou látku nebo nosiče gelové fáze nebo excipienty. Příklady takových nosičů nebo excipientů zahrnují, ale není do nikterak limitováno, uhličitan vápenatý, fosforečnan vápenatý, různé cukry, škroby, deriváty celulózy, želatinu a polymery, např. polyethylenglykoly.

Velký počet PK modulujících sloučenin podle předloženého vynálezu může být poskytnuto ve formě farmaceuticky přijatelných solí, kde nárokované sloučeniny mohou tvořit negativně nebo pozitivně nabité zbytky. Příklady solí, ve kterých sloučeniny vytvářejí pozitivně nabité zbytky zahrnují, ale není to nikterak limitováno, kvartemí amoniové soli (definované kdekoliv v předloženém vynálezu), soli, např. hydrochlorid, sulfát, uhličitan, laktát, tartrát, malát, maleát, sukcinát, kde atom dusíku kvartemí amoniové skupiny je dusík vybrané sloučeniny podle předloženého vynálezu, který reagoval s příslušnou solí. Soli, ve kterých sloučeniny podle předloženého vynálezu vytvářejí negativně nabité zbytky zahrnují, ale není to nikterak limitováno, sodné, draselné, vápenaté a hořečnaté soli vzniklé reakcí skupiny karboxylové kyseliny ve sloučenině s příslušnou bází (např. hydroxid sodný (NaOH), hydroxid draselný (KOH), hydroxid vápenatý (Ca(OH)₂), atd.)

Farmaceutické přípravky vhodné pro použití v předloženém vynálezu zahrnují přípravky, ve kterých jsou aktivní složky obsaženy v množství, jenž je dostatečné k ·· »· • · · · • · · • · · ···· ··

• · ·· ·· • · ·· ·

103 dosažení určeného záměru, např. modulace aktivity PK nebo léčení nebo prevence poruch souvisejících s PK.

Konkrétněji znamená terapeuticky účinné množství sloučeniny takové množství sloučeniny, které je účinné k prevenci, zmírnění nebo zlepšení symptomů onemocnění nebo k prodloužení přežití subjektu, jenž je ošetřován.

Stanovení terapeuticky účinného množství spadá do schopností odborníků v oboru, zejména pak v závislosti na zde uvedených skutečnostech.

Pro jakoukoliv sloučeninu používanou ve způsobu podle předloženého vynálezu může být terapeuticky účinná dávka nejprve stanovena podle testů na buněčných kulturách. Například dávka může být testována na buněčných a zvířecích modelech k získání oběhové koncentrace, která zahrnuje hodnotu IC50 stanovenou podle testů na buněčných kulturách (tzn. koncentrace testované sloučeniny, která je potřebná k dosažení 50% inhibice aktivity PK). Tyto informace mohou být používány u lidských subjektů k přesnějšímu stanovení účinných dávek.

Toxicita a terapeutická účinnost zde popsaných sloučenin může být stanovena standardními farmaceutickými postupy na buněčných kulturách nebo experimentálních zvířatech, např. stanovením hodnoty IC₅o a LD50 (obě definované kdekoliv v předloženém vynálezu) sloučeniny. Data získaná z těchto testů na buněčné kultuře a zvířecích studií mohou být používána při vytváření rozmezí dávky k užití na lidech. Míra dávky se může lišit v závislosti na používané dávkovači formě a způsobu podání. Přesná formulace, způsob podání a dávka může být vybrána konkrétním lékařem v závislosti na stavu pacienta, (viz Fingl et al., 1975, v „Pharmacological Basis of Therapeutics“, Ch. 1 pl).

K dosažení plazmové hladiny aktivního podílu, které je dostatečné k udržení účinků modulujících kinázu nebo minimální účinné koncentrace (MEC) může být množství dávky a interval individuálně upraven. Hodnota MEC bude pro každou sloučeninu jiná, nicméně může být stanovena podle in vitro údajů; např. koncentrace potřebná k dosažení 50-90% inhibice protein kinázy pomocí testů popsaných v předloženém vynálezu. Dávka potřebná k dosažení MEC bude záviset na jednotlivých charakteristikách a způsobu podání. Nicméně ke stanovení plazmových koncentrací může být používána HPLC nebo biotesty.

Rozpětí dávky mohou být také stanovena pomocí hodnoty MEC. Sloučeniny by měly být podávány podle režimu, kterým se udržují plazmové hladiny nad hodnotou MEC v průběhu 10-90% doby, výhodně mezi 30-90% a nejvýhodněji 50-90%.

·· ·· • · · · • · · • · · · • · · ···· ·· ·* · • · · • · · · • * ···· • · · • · · ·· » • · · • · · · • · · ·»» • · · ·· ·

104

V přítomnosti terapeuticky účinných množství sloučenin obecného vzorce (I) se mohou rozpětí pohybovat přibližně od 0,25 mg/m² do 1500 mg/m² denně; výhodně asi 3 mg/m² denně. Ještě výhodněji 50 mg/qm qd až 400 mq/qd.

Terapeuticky účinná množství inhibitoru cyklooxygenázy se pohybují od asi 0,1 mg do asi 10000 mg pro léčení výše uvedených stavů, přičemž výhodné hladiny se pohybují od asi 1,0 mg do asi 1000 mg.

Množství aktivní složky, které může být kombinováno s dalšími kancerostatiky k vytvoření jediné dávkovači formy, se bude pohybovat v závislosti na ošetřovaném jedinci a konkrétním způsobu podání.

V případech místního podání nebo selektivního vychytávání by účinná místní koncentrace léčiva neměla odpovídat plazmové koncentraci a další by měly být použity procedury, které jsou známé z dosavadní techniky ke stanovení přesných množství dávky a rozmezí.

Množství podávaného přípravku bude samozřejmě záviset na ošetřovaném subjektu, závažnosti stavu, způsobu podání, rozhodnutí ošetřujícího lékaře, atd.

Přípravky mohou, pokud je třeba, být ve formě balení nebo zásobníku, např. kitu schváleného FD A, který může obsahovat jednu nebo více dávkovačích forem obsahujících aktivní složku. Balení může například obsahovat kovové nebo plastické fólie, např. měkké průhledné balení. Balení nebo dávkovač mohou být vybaveny letákem s textem předepsaným vládním orgánem regulujícím výrobu, použití nebo prodeje farmaceutik, na kterém je uvedeno povolení pro formu přípravků nebo aplikace lidem či zvířatům. Tento leták může být opatřen např. značkou U.S. Food and Drug Administration pro léčiva určená pouze na lékařský předpis nebo může být opatřen osvědčením k podání produktu. Přípravky obsahující sloučeninu podle předloženého vynálezu formulované do kompatibilního farmaceutického nosiče mohou být také připraveny, vloženy do vhodného obalu a vybaveny popisem k léčení indikovaného stavu. Vhodné stavy uvedené na letáku mohou zahrnovat léčení nádoru, inhibici angiogeneze, léčení fibrózy, diabetes, atd.

Další aspekt předloženého vynálezu poskytuje zde popsanou sloučeninu nebo její sůl nebo proléčivo, která může být kombinována s dalšími chemoterapeutiky pro léčení onemocnění a poruch popsaných v předloženém vynálezu. Například sloučenina, sůl nebo proléčivo podle předloženého vynálezu může být kombinována se samotnými alkylačními činidly, např. fluorouracilem (5-FU), nebo dále kombinována s leukovorinem; nebo dalšími alkylačními agens například, ale není to nikterak limitováno, další analoga *· ·· « · · · • · · • · · · • · · •··· ·· • v · • · · • · · · • · · e · · • · · *· · • · · • · · • · · · • · · ·· · • · · • · ·

105 pyrimidinu, např. UFT, kapecitabin, gemcitabin a cytarabin, alkylsulfonáty, např. busulfan (používaný k léčení chronické granulocytámí leukémie), improsulfan a piposulfan; aziridiny, např. benzodopa, karboquon, meturedopa a uredopa; ethyleniminy a methylmelaminy, např. altretamin, triethylenmelamin, triethylenfosforamid, triethylenthiofosforamid a trimethylolmelamin; a dusíkaté yperity, např. chlorambucil (používaný k léčení chronická lymfocytámí leukémie, primární makroglobulinémie a nonHodgkinova lymfomu), cyklofosfamid (používaný k léčení Hodgkinovy nemoci, mnohačetného myelomu, neuroblastomu, rakoviny prsu, rakoviny vaječníku, rakoviny plic, Wilmova nádoru a rhabdomyosarkomu), estramustin, ifosfamid, novembrichin, prednimustin a uracilový yperit (používaný k léčení primární thrombocytózy, nonHodgkinova lymfomu, Hodgkinovy nemoci a rakoviny vaječníku); a triaziny, např. dakarbazin (používaný při léčení sarkomu měkké tkáně).

Sloučenina, sůl nebo proléčivo podle předloženého vynálezu může být také používáno v kombinaci s dalšími antimetabolickými chemoterapeutiky například, ale není to nikterak limitováno, analoga kyseliny listové, např. methotrexát (používaný při léčení akutní lymfocytámí leukémie, choriokarcinomu, mykóz, rakoviny prsu, hlavy a krku a osteogenního sarkomu) a pteropterin; a purinová analoga, např. merkaptopurin a thioguanin, které nalezly uplatnění při léčení akutní, granulocytámí, akutní lymfocytámí a chronické granulocytámí leukémie.

Sloučenina, sůl nebo proléčivo podle předloženého vynálezu mohou být také používány v kombinaci s chemoterapeutikem na bázi přírodního produktu například, ale není to nikterak limitováno, vínkové alkaloidy, např. vinblastin (používaný při léčení rakoviny prsu a varlat), vinkristin a vindesin; epipodofylotoxiny, např. etoposid a teniposid, oba se používají při léčení rakoviny varlat a Kaposiho sarkomu; antibiotická chemotherapeutika, např. daunorubicin, doxorubicin, epirubicin, mitomycin (používaný k léčení rakoviny žaludku, čípku, střeva, prsu, močového měchýře a pankreatu), daktinomycin, temozolomid, plicamycin, blomycin (používaný při léčení rakoviny kůže, jícnu a genitourinámího traktu); a enzymatická chemoterapeutika, např. L-asparagináza.

Kromě shora uvedených použití by sloučeniny, soli nebo proléčiva mohla být používána v kombinaci s komplexy koordinujícími platinu (cisplatina, atd.); substituovanými močovinami, např. hydroxymočovina; methylhydrazinovými deriváty, např. prokarbazin; adrenokortikálními supresivy, např. mitotan, aminoglutethinin; a hormony a antagonisty hormonů, např. adrenokortikosteroidy (např. prednison), progestiny • · ···♦ • · · · • ·*«· « · • · ·

106 (např. hydroxyprogesteron-kapronát); estrogeny (např. diethylstilbesterol); antiestrogeny, např. tamoxifen; androgeny, např. testosteron-propionát; a inhibitory aromatázy, např. anastrozol.

Další antineoplastika známá z dosavadního stavu techniky mohou být používána společně s kombinovanou terapií podle předloženého vynálezu. Příklady těchto antineoplastik a jiných látek jsou uvedeny v Applicants' U.S. patent application Ser. No. 60/113,786, filed Dec, 23, 1998, a PCT Application Publication No. WO 00/38716, zde je uvedeno jako odkaz.

Dále má kombinace sloučeniny podle předloženého vynálezu být účinná v kombinaci s mitoxantronem nebo paclitaxelem pro léčení pevných nádorů nebo leukémií například, ale není to nikterak limitováno, akutní myeloidní (nelymfocytární) leukémie.

Příklad provedení vynálezu

Příklady syntéz

Následující postupy a příklady mají odborné veřejnosti umožnit lepší pochopení předloženého vynálezu a následně i jeho provádění. Dále nemají následující postupy a příklady nikterak předložený vynález limitovat.

Syntéza inhibitoru protein kinázy - sloučenin obecného vzorce (I) podle předloženého vynálezu

Obecné syntézy

Následující obecná metodologie může být používána k přípravě sloučenin podle předloženého vynálezu.

Vhodně substituovaný 2-oxindol (1 ekviv.), vhodně substituovaný aldehyd (1,2 ekviv.) a báze (0,1 ekviv.) se smíchají v rozpouštědle (1-2 ml/mmol 2-oxindol) a směs se pak zahřívá od asi 2 hodin do asi 12 hodin. Po ochlazení se vzniklý precipitát filtruje, promyje studeným ethanolem nebo etherem a suší za vakua, čímž se získá pevný produkt. Pokud nevznikne precipitát, tak se reakční směs koncentruje a zbytek se trituruje směsí dichlormethanu a etheru, čímž se získá pevný podíl, který se spojí filtrací a suší. Produkt může být dále purifikován chromatografií.

«· • · · 9

9 · • · · « • 9 9

9999 99

4· ·

9 9 • · · 9

9 9999

9 9

9

9

9 9 · · · • · 9 9999

9 9

9

107

Báze může být organického nebo anorganického původu. Pokud se používá organická báze, pak je to výhodně báze obsahující dusík. Příklady organických bází obsahujících dusík zahrnují, ale není to nikterak limitováno, diizopropylamin, trimethylamin, triethylamin, anilin, pyridin, l,8-diazabicyklo[5.4.1]undek-7-en, pyrrolidin a piperidin.

Příklady anorganických bází, ale není to nikterak limitováno, zahrnují amoniak, hydroxidy alkalického kovu nebo kovů alkalických zemin, fosfáty, uhličitany, hydrogenuhličitany, bisulfáty a amidy. Alkalické kovy zahrnují, ale není to nikterak limitováno, sodík, lithium a draslík, a kovy alkalických zemin zahrnují vápník, hořčík a barium.

Ve výhodném provedení předloženého vynálezu, pokud je rozpouštědlo protické, např. voda nebo alkohol, pak je bází anorganická báze s alkalickým kovem nebo kovem alkalické zeminy, výhodně hydroxid alkalického kovu nebo kovu alkalické zeminy.

Z hlediska obecně platných principů organické syntézy a zde uvedených údajů bude odborné veřejnosti zřejmé, která báze by měla být pro zamýšlenou reakci nej vhodnější.

Rozpouštědlo, ve kterém se reakce provádí může být protické nebo aprotické, výhodně protické rozpouštědlo. Termín protické rozpouštědlo je rozpouštědlo, které má atom vodíku(ů) kovalentně vázaný k atomům kyslíku nebo dusíku, díky čemuž je atom vodíku značně kyselejší, a tudíž schopný vodíkových můstků se solutem. Příklady protických rozpouštědel zahrnují, ale není to nikterak limitováno, vodu a alkoholy.

Termín aprotické rozpouštědlo, které může být polární nebo nepolární, v jakémkoliv případě neobsahuje kyselé atomy vodíku, a tudíž není schopné vodíkových můstků se solutem. Příklady nepolárních aprotických rozpouštědel, ale není to nikterak limitováno, zahrnují pentan, hexan, benzen, toluen, methylenchlorid a tetrachlormethan. Příklady polárních aprotických rozpouštědel zahrnují chloroform, tetrahydrofuran, dimethylsulfoxid a dimethylformamid.

Ve výhodném provedení předloženého vynálezu je rozpouštědlo protické rozpouštědlo, výhodně voda nebo alkohol, např. ethanol.

Reakce se provádí při teplotách, které jsou větší než pokojová teplota. Teplota se obecně pohybuje v rozmezí od asi 30°C do asi 150°C, výhodně od asi 80°C do asi 100°C, nejvýhodněji od asi 75°C do asi 85°C, což je přibližně teplota varu ethanolu. Termín asi znamená, že rozmezí teploty se výhodně pohybuje v rozmezí 10°C uvedené teploty,

108 rozmezí 5°C uvedené teploty, nejvýhodněji 2°C uvedené teploty. Například termín asi 75°C znamená 75°C ± 10°C, výhodně 75°C ± 5°C, nejvýhodněji 75°C ± 2°C.

2-Oxindoly a aldehydy mohou být snadno připraveny známými organickými způsoby. Odborníkům v oboru budou jistě zřejmé i jiné způsoby přípravy sloučenin podle předloženého vynálezu, a tedy následující příklady mají pouze ilustrativní charakter.

Způsob A: Formylace pyrrolů

POCI3 (1,1 ekviv.) se přidává po kapkách do dimethylformamidu (3 ekviv.) při teplotě -10°C, poté se přidá vhodný pyrrol rozpuštěný v dimethylformamidu. Po 2 hodinovém míchání se reakění směs zředí H₂O aalkalizuje napH 11 s ION KOH. Vzniklý precipitát se spojí filtrací, promyje H₂O a suší ve vakuové sušárně, čímž se získá požadovaný aldehyd.

Způsob B: Saponifikace esterů pyrrolkarboxylové kyseliny

Směs esteru pyrrolkarboxylové kyseliny a KOH (2-4 ekviv.) v EtOH se refluxuje, dokud není reakce podle TLC hotova. Ochlazená reakční směs se okyselí na pH 3 s 1 N HC1. Vzniklý precipitát se spojí filtrací, promyje H₂O a suší ve vakuové sušárně, čímž se získá požadovaná pyrrolkarboxylové kyselina.

Způsob C: Amidace

Do míchaného roztoku pyrrolkarboxylové kyseliny rozpuštěné v dimethylformamidu (0,3 M) se přidá l-ethyl-3-(3-dimethylamino-propyl)karbodiimid (1,2 ekviv.), 1-hydroxybenzotrizaol (1,2 ekviv.) a triethylamin (2 ekviv.). Přidá se vhodný amin (1 ekviv.) a reakce se míchá, dokud není podle TLC kompletní. Do reakční směsi se pak přidá ethylacetát a roztok se promyje nasyceným roztokem NaHCO₃ a solankou (s extra solí), suší nad bezvodým MgSCft a koncentruje, čímž se získá požadovaný amid.

• · · · · ·

109

Způsob D: Kondenzace aldehydů a oxindolů obsahujících substituenty karboxylové kyseliny

Směs oxindolů (1 ekviv.), 1 ekviv. aldehydu a 1 - 3 ekvivalenty piperidinu (nebo pyrrolidinu) v ethanolu (0,4 M) se míchá při teplotě 90 - 100°C, dokud není reakce podle TLC hotova. Směs se pak koncentruje a zbytek se alkalizuje 2N HC1. Vzniklý precipitát se promyje vodou a ethanolem a suší ve vakuové sušárně, čímž se získá produkt.

Způsob E: Kondenzace aldehydů a oxindolů neobsahujících substituenty karboxylové kyseliny

Směs oxindolů (1 ekviv.), 1 ekviv. aldehydu a 1 - 3 ekvivalenty piperidinu (nebo pyrrolidinu) v ethanolu (0,4 M) se míchá při teplotě 90 - 100°C, dokud není reakce podle TLC hotova. Směs se ochladí na pokojovou teplotu a vzniklý pevný podíl se spojí vakuovou filtrací, promyje ethanolem a suší, čímž se získá produkt. Pokud po ochlazení reakční směsi nevznikne precipitát, směs se koncentruje a purifikuje na sloupcové chromatografii.

C. Příklady oxindolových syntéz

Následující příklady syntéz reprezentativních oxindolů nemají jakýmkoliv způsobem limitovat rozsah předloženého vynálezu. Odborníkům v oboru budou na základě následujícího popisu jistě zřejmé alternativní způsoby přípravy oxindolů, jakož i další oxindoly, které mohou být používány při přípravě sloučenin podle předloženého vynálezu. Tyto syntézy a oxindoly rovněž patří do rozsahu a charakteru předloženého vynálezu.

5-Amino-2-oxindol

5-Nitro-2-oxindol (6,3 g) se hydrogenuje v methanolu s 10% palladiem na aktivním uhlí, čímž se získají 3,0 g (60% výtěžek) požadované sloučeniny ve formě bílé pevné látky.

• · • · · ···· ··· · · · ·· · · ··* · · · · • * · · · · ···· · · · ··· ······ · · · ·· ·

110

5-Brom-2-oxindol

2-Oxindol (1,3 g) v 20 ml acetonitrilu se ochladí na teplotu -10° C, pomalu se za míchání přidají 2,0 g V-bromsukcinimidu. Reakce se míchá po dobu 1 hodiny při teplotě -10° C a 2 hodiny při teplotě 0° C. Precipitát se spojí, promyje vodou a suší, čímž se získá 1,9 g (90% výtěžek) požadované sloučeniny.

4-Methyl-2-oxindol

Diethyloxalát (30 ml) v 20 ml suchého etheru se za míchání přidá do 19 g ethoxidu draselného suspendovaného v 50 ml suchého etheru. Směs se ochladí v ledové lázni a pomalu se přidá 20 ml 3-nitro-0-xylenu v 20 ml suchého etheru. Hustá tmavě červená směs se zahřívá k refluxu po dobu 0,5 hodiny, koncentruje na tmavě červený pevný podíl a nechá reagovat s 10% hydroxidem sodným, dokud se téměř veškerý pevný podíl nerozpustí. Tmavě červená směs se nechá reagovat s 30% peroxidem vodíku, dokud směs nezežloutne. Směs se nechá alternativně nechá reagovat s 10% hydroxidem sodným a 30% peroxidem vodíku, dokud nezmizí tmavě červená barva. Pevný podíl se odfiltruje a filtrát se okyselí 6N kyselinou chlorovodíkovou. Výsledný precipitát se spojí vakuovou filtrací, promyje vodou a suší za vakua, čímž se získá 9,8 g (45% výtěžek) 2-methyl-6nitrofenyloctové kyseliny ve formě bělavé pevné látky, která se hydrogenuje v methanolu s 10% palladiem na aktivním uhlí, čímž se získá 9,04 g požadované sloučeniny ve formě bílé pevné látky.

7-Brom-5-chIor-2-oxindol

5-Chlor-2-oxindol (16,8 g) a 19,6 g V-bromsukcinimidu se suspenduje v 140 ml acetonitrilu a refluxuje po dobu 3 hodin. Podle TLC (silikagel, ethylacetát) se po 2 hodinách refluxu detekuje určitý podíl 5-chlor-2-oxindolu nebo V-bromsukcinimidu (Rf 0,8), produkt (Rf 0,85) a druhý produkt (Rf 0,9), jejich podíl se nemění ani po další hodině refluxu. Směs se ochladí na teplotu 10° C. Precipitát se spojí vakuovou filtrací, promyje 25 ml ethanolu a odsává do sucha po dobu 20 minut v nálevce, čímž se získá 14,1 g vlhkého produktu (56% výtěžek). Pevný podíl se suspenduje v 200 ml denaturováného ethanolu a kaše se promývá za míchání a refluxování po dobu 10 minut. Směs se ochladí v ledové lázni na teplotu 10° C, pevný podíl se spojí vakuovou filtrací, promyje 25 ml ethanolu a • · ·

111 ethanolu a suší za vakua při teplotě 40° C, čímž se získá 12,7 g (51% výtěžek) 7-brom-5chlor-2-oxindolu.

5-Fluor-2-oxindol

5-Fluorisatin (8,2 g) se rozpustí v 50 ml hydrazin-hydrátu a refluxuje po dobu 1 hodiny. Reakční směs se pak nalije do ledové vody. Precipitát se pak filtruje, promyje vodou a suší ve vakuové sušárně, čímž se získá požadovaná sloučenina.

5-Nitro-2-oxindol

2-Oxindol (6,5 g) se rozpustí v 25 ml koncentrované kyseliny sírové a směs se udržuje při teplotě od -10 do -15° C, přičemž se po kapkách přidá 2,1 ml dýmavé kyseliny dusičné. Po přidání se reakční směs míchá při teplotě 0° C po dobu 0,5 hodiny a nalije do ledové vody, precipitát se spojí filtrací, promyje vodou a krystalizuje z 50% kyseliny octové. Krystalický produkt se pak filtruje, promyje vodou a suší za vakua, čímž se získá 6,3 g (70%) 5-nitro-2-oxindolu.

5-Aminosulfonyl-2-oxindol

Do 100 ml baňky naplněné 27 ml chlorsulfonové kyseliny se pomalu přidá 13,3 g 2-oxindolu. Během přidávání se teplota reakce udržuje pod 30° C, poté se reakční směs míchá při pokojové teplotě po dobu 1,5 hodiny, zahřívá při teplotě 68° C po dobu 1 hodiny, ochladí a nalije do vody, precipitát se promyje vodou a suší ve vakuové sušárně, čímž se získá 11,0 g 5-chlorsulfonyl-2-oxindolu (50% výtěžek), který se používá bez další purifikace.

5-Chlorsulfonyl-2-oxindol (2,1 g) se přidá do 10 ml hydroxidu amonného v 10 ml ethanolu a míchá při pokojové teplotě přes noc. Směs se koncentruje a pevný podíl se spojí vakuovou filtrací, čímž se získá 0,4 g (20% výtěžek) požadované sloučeniny ve formě bělavé pevné látky.

• · •· ··· ·· · • · · · · · · · · · • · · · · · · · · · · • · · · · · ···· 9 9 9 999

9 9 9 9 9 9 9 9

999999 99 9 99 9

112

5-Izopropylaminosulfonyl-2-oxindol

Do 100 ml baňky naplněné 27 ml chlorsulfonové kyseliny se pomalu přidá 13,3 g 2-oxindolu. Během přidávání se teplota reakce udržuje pod 30° C, poté se reakční směs míchá při pokojové teplotě po dobu 1,5 hodiny, zahřívá při teplotě 68° C po dobu 1 hodiny, ochladí a nalije do vody, precipitát se promyje vodou a suší ve vakuové sušárně, čímž se získá 11,0 g (50%) 5-chlorsulfonyl-2-oxindolu, který se používá bez další purifikace.

Suspenze 3 g 5-chlorsulfonyl-2-oxindolu, 1,15 g izopropylaminu a 1,2 ml pyridinu v 50 ml dichlormethanu se míchá při pokojové teplotě po dobu 4 hodin, během kterých se vytvoří bílý pevný podíl, který se spojí vakuovou filtrací, kaše se promyje horkým ethanolem, ochladí, spojí vakuovou filtrací a suší za vakua při teplotě 40° C přes noc, čímž se získá 1,5 g (45%) 5-izopropylaminosulfonyl-2-oxindolu.

‘HNMR (360 MHz, DMSO-d₆) δ 10,69 (s, br, 1H, NH), 7,63 (dd, J=2 a 8 Hz, 1H), 7,59 (d, >2 Hz, 1H), 7,32 (d, J=7 Hz, 1H, NH-SO₂-), 6,93 (d, J=8 Hz, 1H), 3,57 (s, 2H), 3,14-3,23 (m, 1H, CH-(CH₃)₂), 0,94 (d, J=7 Hz, 6H, 2 x CH₃).

5-Fenylaminosulfonyl-2-oxindol

Suspenze 5-chlorsulfonyl-2-oxindolu (1,62 g, 7 mmol), anilinu (0,782 ml, 8,4 mmol) a pyridinu (1 ml) v dichlormethanu (20 ml) se míchá při pokojové teplotě po dobu 4 hodin. Reakční směs se zředí ethylacetátem (300 ml) a okyselí IN kyselinou chlorovodíkovou (16 ml). Organická vrstva se promyje hydrogenuhličitanem sodným a solankou, suší a koncentruje. Zbytek se promyje ethanolem (3 ml) a pak chromatografuje na silikagelu s mobilní fází methanol/dichlormethan (1:9), čímž se získá 5-fenylaminosulfonyl-2-oxindol.

’HNMR (360 MHz, DMSO-d₆) δ 10,71 (s, br, 1H, NH), 10,10 (s, br, 1H, NH), 7,57-7,61 (m, 2H), 7,17-7,22 (m, 2H), 7,06-7,09 (m, 2H), 6,97-7,0 (m, 1H), 6,88 (d, J=8,4 Hz, 1H), 3,52 (s, 2H).

Pyridin-3-ylamid 2-oxo-2,3-dihydro-l//-indol-5-sulfonové kyseliny

Roztok 5-chlorsufonyl-2-oxindolu (3 g) a 3-aminopyridinu (1,46 g) v pyridinu (15 ml) se míchá při pokojové teplotě přes noc, po kterých vznikne hnědá pevná látka, která se

9 9 9 •··· ··

113 filtruje, promyje ethanolem a suší za vakua, čímž se získá 1,4 g (38%) pyridin-3-ylamidu 2-oxo-2,3-dihydro-l//-indol-5-sulfonové kyseliny.

’HNMR (360 MHz, DMSO-d₆) δ 10,74 (s, 1H, NH), 10,39 (s, 1H, SO₂NH), 8,27-8,28 (d, 1H), 8,21-8,23 (m, 1H), 7,59-7,62 (m, 2H), 7,44-7,68 (m, 1H), 7,24-7,28 (m, 1H), 6,696,71 (d, 1H), 3,54 (s, 2H).

MS m/z (APCI+) 290,2.

5-Fenyloxindol

5-Brom-2-oxindol (5 g, 23,5 mmol) se za míchání a jemného zahřátí rozpustí v 110 ml toluenu a 110 ml ethanolu. Přidá se tetrakis(trifenylfosfin)palladium (1,9 g, 1,6 mmol), poté 40 ml (80 mmol) 2M roztoku hydrogenuhličitanu sodného. Do této směsi se přidá benzenboritá kyselina (3,7 g, 30,6 mmol) a směs se zahřívá při teplotě 100° C v olejové lázni po dobu 12 hodin. Reakce se ochladí, zředí ethylacetátem (500 ml), promyje nasyceným roztokem hydrogenuhličitanu sodného (200 ml), vodou (200 ml), 1N HC1 (200 ml) a solankou (200 ml). Organická vrstva se suší nad síranem hořečnatým a koncentruje, čímž se získá hnědá pevná látka. Triturací dichlormethanem se získá 3,8 g (77%) 5-fenyl-2-oxindolu ve formě hnědé pevné látky.

^!H NMR (360 MHz, DMSO-d₆) δ 10,4 (br s, 1H, NH), 7,57 (dd, J=l,8 a 7,2 Hz, 1H), 7,5 to 7,35 (m, 5H), 7,29 (m, 1H), 6,89 (d, J=8,2 Hz, 1H), 3,51 (s, 2H, CH₂CO).

MS m/z 209 [M⁺].

Podobným způsobem mohou být připraveny následující oxindoly:

6-(3,5-Dichlorfenyl)-l,3-dihydroindoI-2-on ‘H NMR (360 MHz, DMSO-d₆) δ 10,46 (br, 1H, NH), 7,64 (d, J=l,8 Hz, 2H), 7,57 (m, 1H), 7,27 (m, 2H), 7,05 (d, J=1,1 Hz, 1H), 3,5 (s, 2H).

MS-EI m/z 277/279 [M]⁺.

6-(4-Buty lfeny 1)-1,3-dihy droindol-2-on ^!H NMR (360 MHz, DMSO-d₆) δ 10,39 (s, 1H, NH), 7,49 (d, J=8,0 Hz, 2H), 7,25 (d, J=8 Hz, 3H), 7,17 (dd, J=l,5 a 7,8 Hz, 1H), 6,99 (d, J=l,5 Hz, 1H), 3,48 (s, 2H, CH₂CO), 2,60

114 (t, J=7,5 Hz, 2 Hz, CH2CH3), 1,57 (m, 2H, CH₂), 1,32 (m, 2H, CH₂), 0,9 (t, J=7,5 Hz, 3H, CH₃).

6-(5-Izopropyl-2-methoxyfenyl)-l,3-dihydromdol-2-on ’H NMR (360 MHz, DMSO-d₆) δ 10,29 (br s, 1H, NH), 7,16-7,21 (m, 2H), 7,08 (d, J=2,4 Hz, 1H), 6,97-7,01 (m, 2H), 6,89 (d, J=0,8 Hz, 1H), 3,71 (s, 3H, OCH₃), 3,47 (s, 2H, CH2CO), 2,86 (m, 1H, CH(CH₃)₂), 1,19 (d, J=6,8 Hz, 6H, CH(CH₃)2).

MS-EI zw/z 281 [M]⁺.

6-(4-Ethylfenyl)-l,3-dihydroindol-2-on *H NMR (360 MHz, DMSO-d₆) δ 10,39 (br s, 1H, NH), 7,50 (d, J=8,2 Hz, 2H), 7,28 (d, J=8,2 Hz, 2H), 7,25 (d, J=7,5 Hz, 1H), 7,17 (dd, J=l,6 & 7,5 Hz, 1H), 6,99 (d, J=l,6 Hz, 1H), 3,48 (s, 2H, CH₂CO), 2,63 (q, J=7,6 Hz, 2H, CH₂CH₃), 1,20 (t, J=7,6 Hz, 3H, CH2CH3).

MS-EI m/z 237 [M]⁺,

6-(3-Izopropylfenyl)-l,3-dihydroindol-2-on *H NMR (360 MHz, DMSO-d₆) δ 10,37 (br s, 1H, NR), 7,43 (m, 1H), 7,35-7,39 (m, 1H), 7,17-7,27 (m, 3H), 7,01 (d, J=l,8 Hz, 1H), 3,49 (s, 2H, CH₂CO), 2,95 (m, 1H, CH(CH₃)₂), 1,24 (d, J=6,8 Hz, 6H, CH(CH₃)₂).

MS-EI m/z 251 [M]⁺.

6-(2,4-Dimethoxyfenyl)-l,3-dihydroindol-2-on ’H NMR (360 MHz, DMSO-d₆) δ 10,28 (br s, 1H, NH), 7,17 (m, 2H), 6,93 (dd, J=l,6 & 7,6 Hz, 1H), 6,86 (d, J=l,6 Hz, 1H), 6,63 (d, J=2,4 Hz, 1H), 6,58 (dd, J=2,4 & 8,5 Hz, 1H), 3,79 (s, 3H, OCH₃),3,74 (s, 3H, OCH₃), 3,45 (s, 2H, CH₂CO).

MS-EI m/z 269 [M]⁺.

115 ·· ·· ·· · ·· · • · · · · · t · · · • · · · ··· · ··· • · · · · · ···· · · · ··· ······ · · · ······ ·· · ·· ·

6-Py ridin-3-y 1-1,3-dihy droindol-2-on *H NMR (360 MHz, DMSO-d₆) δ 10,51 (s, 1H, NH), 8,81 (d, J=2,5 Hz, 1H), 8,55 (dd, J=l,8 a 5,7 Hz, 1H), 8 (m, 1H), 7,45 (dd, J=5,7 a 9,3 Hz, 1H), 7,3 (m, 2H), 7,05 (s, 1H), 3,51 (s, 2H, CH₂CO).

MS m/z 210 [M]⁺.

(3-chlor-4-ethoxyfenyl)-amid 2-oxo-2,3-dihydro-l//-indol-4-karboxylová kyselina

Do roztoku 4-karboxy-2-oxindolu (200 mg, 1,13 mmol) a 3-chlor-4methoxyfenylaminu (178 mg, 1,13 mmol) v dimethylformamidu (15 ml) při pokojové teplotě se přidá benzotriazol-l-yloxytris(dimethylamino)fosfonium-hexafluorfosfát (činidlo BOP, 997 mg, 2,26 mmol), poté 4-dimethylaminopyridin (206 mg, 1,69 mmol). Směs se míchá při pokojové teplotě po dobu 72 hodin. Reakce se pak zředí ethylacetátem (300 ml), promyje nasyceným roztokem hydrogenuhličitanu sodného (100 ml), vodou, 2N kyselinou chlorovodíkovou (100 ml), vodou (3 x 200 ml) a solankou, pak suší nad síranem hořečnatým a koncentruje. Zbytek se trituruje ethylacetátem, čímž se získá (3-chlor-4methoxyfenyl)-amid 2-oxo-2,3-dihydro- l/T-indol-4-karboxylové kyseliny ve formě růžové pevné látky.

*HNMR (360 MHz, DMSO-d₆) δ 10,50 (s, br, 1H, NH), 10,12 (s, br, 1H, NH), 7,9 (s, J=2,5 Hz, 1H), 7,62 (dd, J=2,5 & 9 Hz, 1H), 7,38 (d, J=7,6 Hz, 1H), 7,32 (t, J=7,6 Hz, 1H), 7,13 (d, J=9 Hz, 1H), 6,98 (d, J=7,6 Hz, 1H), 3,83 (s, 3H, OCH₃), 3,69 (s, 2H, CH₂).

MS-EI m/z 316 [M]⁺.

4-Karboxy-2-oxindol

Roztok trimethylsilyldiazomethanu v hexanu (2 M) se po kapkách přidává do roztoku 2,01 g 2-chlor-3-karboxy-nitrobenženu v 20 ml methanolu při pokojové teplotě, dokud se nepřestane vyvíjet plyn. Ke zhášení zbytku trimethylsilyldiazomethanu se přidá kyselina octová a reakční směs se odpařuje za vakua. Zbytek se suší ve vakuové sušárně přes noc. Získaný 2-chlor-3-methoxykarbonylnitrobenzen je dostatečně čistý pro následující reakci.

Dimethylmalonát (6,0 ml) se přidá do ledové suspenze 2,1 g hydridu sodného v 15 ml DMSO. Reakční směs se míchá při teplotě 100° C po dobu 1 hodiny, pak ochladí na ·· ·· • » · · • · · • · · • · · ···· ·♦ • · · • · · • · · · • · · · · · • · · *· · ··

116 pokojovou teplotu. Najednou se přidá 2-chlor-3-methoxykarbonylnitrobenzen (2,15 g) a směs se zahřívá při teplotě 100° C po dobu 1,5 hodiny. Reakční směs se pak ochladí na pokojovou teplotu, nalije do ledové vody, okyselí na pH 5 a extrahuje ethylacetátem. Organická vrstva se promyje solankou, suší nad bezvodým síranem sodným a koncentruje, čímž se získají 3,0 g dimethyl-2-methoxykarbonyl-6-nitrofenyl-malonátu.

Dimethyl-2-methoxykarbonyl-6-nitrofenylmalonát (3,0 g) se refluxuje v 50 ml 6 N kyselině chlorovodíkové přes noc. Směs se koncentruje do sucha, přidá se 20 ml ethanolu a 1,1 g chloridu cínatého a směs se refluxuje po dobu 2 hodin. Směs se filtruje přes Celit, koncentruje a chromatografuje na silikagelu s mobilní fází ethylacetát:hexan:kyselina octová jako eluentu, čímž se získá 0,65 g (37%) 4-karboxy-2-oxindolu ve formě bílé pevné látky.

’HNMR (360 MHz, DMSO-d₆) δ 12,96 (s, br, 1H, COOH), 10,74 (s, br, 1H, NH), 7,53 (d, >8 Hz, 1H), 7,39 (t, >8 Hz, 1H), 7,12 (d, >8 Hz, 1H), 3,67 (s, 2H).

D. Syntéza 2-indolinonů substituovaných pyrrolem

Příklad 1

4- Methyl-5-(2-oxo-l,2-dihydroindol-3-ylidenmethyl)-l//-pyrrol-2-karboxylová kyselina

Ethylester 4-methyl-2-pyrrolkarboxylové kyseliny (komerčně dostupný) se formyluje podle způsobu A, čímž se získá (73%) ethylester 5-formyl-4-methyl-2pyrrolkarboxylové kyseliny, který se pak hydro lyžuje podle způsobu B, čímž se získá

5- formyl-4-methyl-l//-pyrrol-2-karboxylová kyselina (58%).

Oxindol (133 mg, 1 mmol) se kondenzuje s 5-formyl-4-methyl-l//-pyrrol-2karboxylovou kyselinou (153 mg) podle způsobu D, čímž se získá 268 mg (100%) požadované sloučeniny ve formě oranžovo-červené pevné látky.

*HNMR (360 MHz, DMSO-d₆) δ 13,84 (s, br, 1H, NH), 12,84 (s, br, 1H, COOH), 10,98 (s, br, 1H, NH), 7,82 (d, >7,5 Hz, 1H), 7,67 (s, 1H, H-vinyl), 7,18 (t, >7,5 Hz, 1H), 7,01 (t, >7,5 Hz, 1H), 6,88 (d, >7,5 Hz, 1H), 6,71 (d, >2,2 Hz, 1H), 2,32 (s, 3H, CH₃).

MS (negativní mód) 266,8 [M-l]⁺.

• · • ·

·· · • ♦ · • · · · • * · · · ♦ ♦ ·

117

Příklad 2

4- Methyl-5-(l-methyl-2-oxo-l,2-dihydroindol-3-ylidenmethyl)-17/-pyrrol-2-karboxylová kyselina

1-Methyl-l,3-dihydroindol-2-on (147 mg, 1 mmol) se kondenzuje s 5-formyl-4methyl-177-pyrrol-2-karboxylovou kyselinou (153 mg) podle způsobu D, čímž se získá 250 mg (86%) požadované sloučeniny.

¹HNMR (360 MHz, DMSO-d₆) δ 13,82 (s, br, 1H, NH), 12,88 (s, br, 1H, 7,83 (d, J=7,5 Hz, 1H), 7,65 (s, 1H, H-vinyl), 7,26 (t, >7,5 Hz, 1H), 7,02-7,09 (m, 2H), 6,70 (d, J=2,2 Hz, 1H), 2,32 (s, 3H, CH₃).

MS m/z 283,0 [M+l]⁺.

Příklad 3

Methylester 4-methyl-5 -(2-oxo-1,2-dihydroindol-3 -ylidenmethyl)-1 //-pyrrol-2karboxylové kyseliny

Oxindol (105 mg, 0,79 mmol) se kondenzuje s methylesterem 5-formyl-4-methyl177-pyrrol-2-karboxylové kyseliny (110 mg, 0,67 mmol) podle způsobu E, čímž se získá 153,2 mg (81%) požadované sloučeniny.

*HNMR (360 MHz, DMSO-d₆) δ 13,98 (s, br, 1H, NH), 10,97 (s, br, 1H, NH), 7,82 (d, >7,6 Hz, 1H), 7,67 (s, 1H, H-vinyl), 7,2 (dt, >1,2 & 7,7 Hz, 1H), 7,01 (dt, >1,2, 7,7 Hz, 1H), 6,90 (d, >7,6 Hz, 1H), 6,77 (d, >2 Hz, 1H).

MS (ES) m/z 283 [M⁺+l].

Příklad 4

Ethylester 5-(5-chlor-2-oxo-l,2-dihydroindol-3-ylidenmethyl)-4-methyl-l/7-pyrrol-2karboxylové kyseliny

5-Chlor-l,3-dihydroindol-2-on (2,22 g, 13,2 mmol) se kondenzuje s ethylesterem

5- formyl-4-methyl-177-pyrrol-2-karboxylové kyseliny (2,43 g) podle způsobu E, čímž se získá 4,1 g (94%) požadované sloučeniny ve formě oranžové pevné látky.

'HNMR (360 MHz, DMSO-d₆) δ 13,95 (s, br, 1H, NH), 7,98 (d, >2,2 Hz, 1H, H-4), 7,78 (s, 1H, H-vinyl), 7,18 (dd, >2,2 & 8,3 Hz, 1H, H-6), 6,87 (d, >8,3 Hz, 1H, H-7), 7,34 (d, • · · · ··· ·»» • · · · · · « · · · · • * · · · · ···· * · t ··· • · · » · « ··· ···♦ ·« ·· · «· »

118 >1,8 Hz, 1H, H-3'), 4,27 (q, >7,2 Hz, 2H, OCH₂CH₃), 2,33 (s, 3H, CH₃), 1,29 (t, >7,2 Hz, 3H, OCH₂CH₃),

MS-EI m/z 330 [M⁺j.

Příklad 5

5-(5-Chlor-2-oxo-1,2-dihydroindol-3-ylidenmethyl)-4-methyl-1 H-pyrrol-2-karboxy lová kyselina

Směs ethylester 5-(5-chlor-2-oxo-l,2-dihydroindol-3-ylidenmethyl)-4-methyl-177pyrrol-2-karboxylové kyseliny (1,3 g, 4 mmol) a hydroxid draselný v methanolu (25 ml) a ethanolu (25 ml) se zahřívá k refluxu přes noc. Nerozpustné látky se odstraní filtrací a směs se neutralizuje 6N kyselinou chlorovodíkovou, čímž se získá 0,876 g (70%) požadované sloučeniny.

'HNMR (360 MHz, DMSO-d₆) δ 13,80 (s, br, 1H, NH), 12,90 (s, br, 1H, COOH), 11,06 (s, br, 1H, NH), 8,02 (d, >1,8 Hz, 1H, H-4), 7,81 (s, 1H, H-vinyl), 7,20 (dd, >1,8 & 8,3 Hz,

1H, H-6), 6,89 (d, >8,3 Hz, 1H, H-7), 6,72 (d, >1,8 Hz, 1H, H-3'), 2,35 (s, 3H, CH₃).

MS-EI m/z 302 [M⁺],

Příklad 6 (3-Pyrrolidin-l-yl-propyl)amid 5-(5-brom-2-oxo-l,2-dihydroindol-3-ylidenmethyl)-4methyl-177-pyrrol-2-karboxy lové kyseliny

5-Brom-l,3-dihydroindol-2-on (0,16 g, 0,76 mmol) se kondenzuje s (3-pyrrolidinl-ylpropyl)amidem 5-formyl-4-methyl-17/-pyrrol-2-karboxylové kyseliny (0,2 g, připravený podle způsobu C), čímž se získá 60 mg (17%) požadované sloučeniny ve formě oranžové pevné látky.

‘HNMR (300 MHz, DMSO-de) δ 13,61 (s, br, 1H, NH), 11,02 (s, br, 1H, NH), 8,42 (t, >5,8 Hz, 1H, CONHCH₂), 8,12 (d, >1,8 Hz, 1H, H-4), 7,78 (s, 1H, H-vinyl), 7,30 (dd, >1,8 & 8,4 Hz, 1H, H-6), 6,82 (d, >8,4 Hz, 1H, H-7), 6,77 (d, >2,4 Hz, 1H, H-3'), 3,223,31 (m, 2H, CH₂), 2,38-2,43 (m, 6H, 3 x CH₂), 2,35 (s, 3H, CH₃), 1,62-1,71 (m, 6H, 3 x CH₂).

MS-EI m/z 456 a 458 [M⁺-l a M⁺+2].

119

Příklad 7 (3-Diethylamino-propyl)amid 5-(5-brom-2-oxo-l,2-dihydroindol-3-ylidenmethyl)-4methyl-17/-pyrrol-2-karboxylové kyseliny

5-Brom-l,3-dihydroindol-2-on (0,16 g, 0,75 mmol) se kondenzuje s (3-diethylaminopropyl)amidem 5-formyl-4-methyl-177-pyrrol-2-karboxylové kyseliny (0,2 g, připravený podle způsobu C), čímž se získá 30 mg (8%) požadované sloučeniny ve formě oranžové pevné látky.

^!HNMR (300 MHz, DMSO-dé) δ 13,61 (s, br, 1H, NH), 11,02 (s, br, 1H, NH), 8,40 (m, 1H, CONHCH₂), 8,12 (d, >1,5 Hz, 1H, H-4), 7,78 (s, 1H, H-vinyl), 7,30 (dd, >1,5 & 8,2 Hz, 1H, H-6), 6,82 (d, >8,2 Hz, 1H, H-7), 6,78 (d, >2,4 Hz, 1H, H-3’), 3,23 (m, 2H, CH₂), 2,38-2,45 (m, 6H, CH₂ & N(CH₂CH₃)₂), 2,35 (s, 3H, CH₃), 1,61 (m, 2H, CH₂), 0,93 (t, >7,1 Hz, 6H, N(CH₂CH₃)₂).

MS-EI m/z 458 a 460 [M⁺-l a M⁺+2],

Příklad 8 (2-Diethylaminoethyl)amid 5-(5-brom-2-oxo-l,2-dihydroindol-3-ylidenmethyl)-177-pyrrol2-karboxylová kyselina

5-Brom-l,3-dihydroindol-2-on (212 mg, 1 mmol) se kondenzuje s (2-diethylaminoethyl)amidem 5-formyl-177-pyrrol-2-karboxylové kyseliny (připraveným z ethyl-pyrrol-2-karboxylátu podle způsobu A, B a pak C), čímž se získá 162 mg (38%) požadované sloučeniny.

'H NMR (300 MHz, DMSO-de) δ 13,53 (s, br, 1H, NH), 11,06 (s, br, 1H, NH), 8,37 (t, 1H, CONHCH2), 7,89 (m, 2H), 7,32 (dd, J=2,0 Hz, 1H), 6,96 (s, 1H), 6,80-6,84 (m, 2H), 3,3 (m, 2H, CH₂), 2,45-2,55 (m, 6H, N(CH₂CH₃)₂ & CH₂), 0,95 (t, >7,2 Hz, 6H, N(CH₂CH₃)₂).

MS-EI m/z 430 a 432 [M⁺-l a M⁺+l].

Příklad 9 (2-Diethylaminoethyl)amid 5-(2-oxo-6-fenyl-l,2-dihydroindol-3-ylidenmethyl)-177-pyrrol2-karboxylové kyseliny

120

6-Fenyl-l,3-dihydroindol-2-on (209 mg, 1 mmol) se kondenzuje s (2-diethylaminoethyl)amidem 5-formyl-l/f-pyrrol-2-karboxylové kyseliny, čímž se získá 182 mg (42%) požadované sloučeniny.

*HNMR (300 MHz, DMSO-d₆) δ 13,56 (s, br, 1H, NH), 11,06 (s, br, 1H, NH), 8,36 (t, 1H, CONHCH₂), 7,77 (s, 1H, H-vinyl), 7,73 (d, J=7,8 Hz, 1H), 7,64 (d, J=7,2 Hz, 2H), 7,46 (m, 2H), 7,32 (m, 2H), 7,11 (s, 1H), 6,96 (m, 1H), 6,80 (m, 1H), 3,31-3,32 (m, 2H, CH₂), 2,46-2,53 (m, 6H, N(CH₂CH₃)₂ & CH₂), 0,96 (t, J=6,9 Hz, 6H, N(CH₂CH₃)₂).

MS-EI w?/z 428 [M⁺].

Příklad 10 (2-Diethylaminoethyl)-methyl-amid 5-(5-brom-2-oxo-l,2-dihydroindol-3-ylidenmethyl)17/-pyrrol-2-karboxylové kyseliny

5- Brom-l,3-dihydroindol-2-on (212 mg, 1 mmol) se kondenzuje s (2-diethylaminoethyl)methylamidem 5-formyl-l/7-pyrrol-2-karboxylové kyseliny, čímž se získá 246 mg (55%) požadované sloučeniny.

’H NMR (360 MHz, DMSO-d₆) δ 13,54 (s, br, 1H, NH), 11,06 (s, br, 1H, NH), 7,90 (m, 2H), 7,33 (dd, J=l,8 & 8,4 Hz, 1H), 6,82-6,85 (m, 3H), 3,55 (s, br, 2H, CH₂), 3,25 (s, br, 3H, NCH₃), 2,57 (t, J=6,5 Hz, 2H, CH₂), 2,45 (m, 4H, N(CH₂CH₃)₂), 0,91 (m, 6H, N(CH₂CH₃)₂).

MS-EI m/z 444 a 446 [M⁺-l a M⁺+l],

Příklad 11 (2-Diethylaminoethyl)methylamid 5-(2-Oxo-6-fenyl-1,2-dihydroindol-3 -ylidenmethyl)177-pyrrol-2-karboxylové kyseliny

6- Fenyl-l,3-dihydroindol-2-on (209 mg, 1 mmol) se kondenzuje s (2-diethylaminoethyl)methylamidem 5-formyl-l/7-pyrrol-2-karboxylové kyseliny, čímž se získá 277 mg (63%) požadované sloučeniny.

‘H NMR (360 MHz, DMSO-d₆) δ 13,58 (s, br, 1H, NH), 11,04 (s, br, 1H, NH), 7,78 (s, 1H, H-vinyl), 7,73 (d, J=7,8 Hz, 1H), 7,64 (d, >7,5 Hz, 2H), 7,46 (m, 2H), 7,33-7,36 (m, 2H), 7,11 (s, 1H), 6,84 (m, 1H), 6,78 (m, 1H), 3,55 (s, br, 2H, CH₂), 3,25 (s, br, 3H, NCH₃), 2,58 (t, 2H, CH₂), 2,44 (m, 4H, N(CH₂CH₃)₂), 0,92 (m, 6H, N(CH₂CH₃)₂).

• *

121

Příklad 12 (3-Diethylaminopropyl)amid 3-methyl-5-(2-oxo-1,2-dihydroindol-3-ylidenmethyl)-l//pyrrol-2-karboxylové kyseliny

Oxindol (66,5 mg, 0,5 mmol) se kondenzuje s (3-diethylaminopropyl)amidem 5-formyl-3-methyl-l//-pyrrol-2-karboxylové kyseliny (připraveným z ethylesteru

3-formyl-3-methyl-l/7-pyrrol-2-karboxylové kyseliny podle způsobu B pak C), čímž se získá 39 mg (21%) požadované sloučeniny.

*H NMR (300 MHz, DMSO-dé) δ 13,34 (s, br, 1H, NH), 10,88 (s, br, 1H, NH), 7,62-7,67 (m, 3H), 7,17 (m, 1H), 6,99 (m, 1H), 6,87 (d, >7,6 Hz, 1H), 6,63 (d, >1 Hz, 1H), 3,263,32 (m, 2H, CH₂), 2,41-2,48 (m, 6H, CH₂ & N(CH₂CH₃)₂), 2,29 (s, 3H, CH₃), 1,63 (m, 2H, CH₂), 0,93 (t, >7,2 Hz, 6H, N(CH₂CH₃)₂).

MS-EI m/z 380 [M⁺],

Příklad 13 (3-Diethylamino-propyl)amid 5-(5-brom-2-oxo-l,2-dihydroindol-3-ylidenmethyl)-3methyl-1 //-pyrrol-2-karboxylové kyseliny

5-Brom-l,3-dihydroindol-2-on (106 mg, 0,5 mmol) se kondenzuje s (3-diethylaminopropyl)amidem 5-formyl-3-methyl-177-pyrrol-2-karboxylové kyseliny, čímž se získá 35 mg (15%) požadované sloučeniny.

*H NMR (300 MHz, DMSO-d_ó) δ 13,35 (s, br, 1H, NH), 11,00 (s, br, 1H, NH), 7,89 (d, >1,9 Hz, 1H, H-4), 7,80 (s, 1H, H-vinyl), 7,74 (t, >5,3 Hz, 1H, CONHCH₂), 7,31 (dd, >1,9 & 8,4 Hz, 1H, H-6), 6,83 (d, >8,4 Hz, 1H, H-7), 6,63 (s,lH, H-3'), 3,26 (m, 2H, CH₂), 2,41-2,48 (m, 6H, CH₂ & N(CH₂CH₃)₂), 2,29 (s, 3H, CH₃), 1,63 (m, 2H, CH₂), 0,93 (t, >7,1 Hz, 6H, N(CH₂CH₃)₂).

MS-EI m/z 458 a 460 [M⁺-l a M⁺+l].

Příklad 14 (3-Diethylaminopropyl)amid 3-methyl-5-(2-oxo-6-fenyl-l,2-dihydroindol-3ylidenmethyl)-1 /7-pyrrol-2-karboxylové kyseliny • · ·· · · · ··· ···· ··· ··· • · · · ··· · ··« • · · · · · ···· · · · ··· ··· ··· · · · ······ ·· » ·· ·

122

6-Fenyl-l,3-dihydroindol-2-on (105 mg, 0,5 mmol) se kondenzuje s (3 -diethylaminopropy l)amidem 5 -formyl-3 -methyl-1 H-pyrrol-2-karboxylo vé kyseliny, čímž se získá 67,8 (30%) požadované sloučeniny.

^JH NMR (300 MHz, DMSO-d₆) δ 13,37 (s, br, 1H, NH), 11,02 (s, br, 1H, NH), 7,23-7,73 (m, 11H), 3,29 (m, 2H, CH₂), 2,41-2,48 (m, 6H, CH₂ & N(CH₂CH₃)₂), 2,29 (s, 3H, CH₃), 1,64 (m, 2H, CH₂), 0,94 (t, >7,0 Hz, 6H, N(CH₂CH₃)₂).

MS-EI m/z 456 [M⁺],

Příklad 15 (3-Diethylamino-propyl)amid 5-(5-methoxy-2-oxo-l,2-dihydroindol-3-ylidenmethyl)-3methyl-1fí-pyrrol-2-karboxy lové kyseliny

5- Methoxy-l,3-dihydroindol-2-on (82,5 mg, 0,5 mmol) se kondenzuje s (3 -diethy laminopropy l)amidem 5 -formyl-3 -methyl-1 H-pyrrol-2-karboxylové kyseliny, čímž se získá 80 mg (39%) požadované sloučeniny.

*H NMR (300 MHz, DMSO-d₆) δ 13,45 (s, br, 1H, NH), 10,70 (s, br, 1H, NH), 7,68-7,70 (m, 2H), 7,32 (d, J=l,8 Hz, 1H), 6,72-6,79 (m, 2H), 6,60 (s, 1H), 3,73 (s, 3H, OCH₃), 3,28 (m, 2H, CH₂), 2,41-2,48 (m, 6H, CH₂ & N(CH₂CH₃)₂), 2,29 (s, 3H, CH₃), 1,63 (m, 2H, CH₂), 0,93 (t, J=7,0 Hz, 6H, N(CH₂CH₃)₂).

MS m/z 410 [M⁺],

Příklad 16 (3 -Diethylamino-propyl)amid 5-(6-methoxy-2-oxo-1,2-dihydroindol-3 -ylidenmethyl)-3 methyl-1 /7-pyrrol -2-karboxy lové kyseliny

6- Methoxy-l,3-dihydroindol-2-on (82,5 mg, 0,5 mmol) se kondenzuje s (3 -diethy laminopropy l)amidem 5 -formyl-3 -methyl-1 //-pyrrol-2-karboxylové kyseliny, čímž se získá 63 mg (31%) požadované sloučeniny.

’H NMR (300 MHz, DMSO-d₆) δ 13,22 (s, br, 1H, NH), 10,86 (s, br, 1H, NH), 7,39-7,63 a 6,37-6,55 (m, 6H), 3,73 (s, 3H, OCH₃), 3,3 (m, 2H, CH₂), 2,45 (m, 6H, CH₂ & N(CH₂CH₃)₂), 2,28 (s, 3H, CH₃), 1,63 (m, 2H, CH₂), 0,93 (m, 6H, N(CH₂CH₃)₂).

MS m/z 410 [M⁺],

123

Příklad 17 (2-Diethylamino-ethyl)amid 3-(5-brom-2-oxo-l,2-dihydroindol-3-ylidenmethyl)-4,5,6,7tetrahydro-2/7-izoindol-1 -karboxylové kyseliny

Ethylester 4,5,6,7-tetrahydro-2//-izoindol-l-karboxylové kyseliny (May, Donald A.; Lash, Timothy D.; J. Org. Chem., 1992, 57:18,4820-4828) se formyluje podle způsobu A pak B, čímž se získá 3-formyl-4,5,6,7-tetrahydro-2Z/-izoindol-l-karboxylová kyselina.

5-Brom-l,3-dihydroindol-2-on (1,43 g, 6,8 mmol) se kondenzuje s (2-diethylaminoethyl)amidem 3-formyl-4,5,6,7-tetrahydro-277-izoindol-l-karboxylové kyseliny (1,97 g), čímž se získá 2,2 g (67%) požadované sloučeniny ve formě žlutooranžové pevné látky.

'H NMR (360 MHz, DMSO-d₆) δ 13,47 (s, 1H, NH), 11,0 (s, 1H, NH), 8,0 (d, 1H, NH), 7,70 (s, 1H, CH), 7,28 (dd, J=2,l a 8,2 Hz, 1H, ArH), 7,16 (m, 1H, ArH), 6,8 (d, J=8,3 Hz, 1H, ArH), 3,3 (s, 2H, CONH), 2,5 (m, 6H, 3 x NCH₂), 2,78 (br m, 2H, pyrrol CH₂), 2,72 (br m, 2H, pyrrolCH₂), 1,7 (br m, 4H, N(CH₂CH₃)₂), 1,74 (br s, 4H, CH₂CH₂CH₂CH₂), 0,96 (t, J=7,4 Hz, 6H, N(CH₂CH₃)₂).

MS-EI m/z 484 a 486 [M⁺-l a M⁺+l].

Příklad 18 (3-Diethylamino-propyl)amid 3-(5-brom-2-oxo-l,2-dihydroindol-3-ylidenmethyl)-4,5,6,7tetrahydro-2/7-izoindol-1 -karboxylové kyseliny

5-Brom-l,3-dihydroindol-2-on (20 mg, 0,1 mmol) se kondenzuje s (3-diethylaminopropyl)amidem 3-formyl-4,5,6,7-tetrahydro-2_Jř/-izoindol-l-karboxylové kyseliny (30 mg), čímž se získá 33 mg (46%) požadované sloučeniny ve formě oranžové pevné látky.

'H NMR (360 MHz, DMSO-d₆) δ 10,9(s, 1H, NH), 8,0 (m, 1H, NH), 7,68 (m, 1H, ArH), 7,4 (m, 1H, ArH), 7,29 (d, J=l,9 a 8,5 Hz, 1H, ArH), 6,8 (d, J=8 Hz, 1H, ArH), 2,7 (br m, 4H, 2 x NCH₂), 2,4 (m, 8H, 4 x NCH₂), 1,7 (br m, 4H, N(CH₂CH₃)₂), 1,6 (br m, 2H, CH₂CH₂CH₂), 0,93 (t, J=7,4 Hz, 6H, N(CH₂CH₃)₂).

MS-EI m/z 499 a 501 [M⁺ a M⁺+2].

···· ·· • · • · · • ···· • · • · · • ···

124

Příklad 19 (3-Pyrrolidin-l-ylpropyl)amid 3-(5-brom-2-oxo-l,2-dihydroindol-3-ylidenmethyl)-4,5,6,7tetrahydro-2//-izoindol-1 -karboxylové kyseliny

5- Brom-l,3-dihydroindol-2-on (80 mg, 0,4 mmol) se kondenzuje s (3-pyrrolidin-1ylpropyl)amidem 3-formyl-4,5,6,7-tetrahydro-27/-izoindol-l-karboxylové kyseliny (120 mg), čímž se získá 43 mg (22%) požadované sloučeniny ve formě hnědo-oranžové pevné látky.

’H NMR (360 MHz, DMSO-d₆) δ 13,4 (s, 1H, NH), 10,9 (s, 1H, NH), 8,0 (m, 1H, NH), 7,69 (m, 1H, ArH), 7,49 (m, 1H, ArH), 7,28 (d, J=l,7 a 7,8 Hz, 1H, ArH), 6,8 (d, J=8 Hz, 1H, ArH), 3,3 (br m, 2H, 2 x NCH₂), 2,8 (m, 4H, 2 x pyrrolCH₂), 2,5 (br m, 4H, N(CH₂CH₃)₂), 1,6 (br m, 8H, 2 x pyrrolCH₂CH₂, CH₂CH₂CH₂ a CONHCH₂).

MS-EI m/z 497 a 499 [M⁺ a M⁺+2].

Příklad 20 (2-Diethylamino-ethyl)amid 3-(2-oxo-6-pyridin-3-yl-l,2-dihydroindol-3-ylidenmethyl)4,5,6,7-tetrahydro-2//-izoindol-l-karboxylové kyseliny

6- Pyridin-3-yl-l,3-dihydroindol-2-on (60 mg, 0,4 mmol) se kondenzuje s (2-diethylaminoethyl)amidem 3-formyl-4,5,6,7-tetrahydro-2//-izoindol-l-karboxylové kyseliny (80 mg), čímž se získá 50 mg (38%) požadované sloučeniny ve formě načervenalé pevné látky.

*H NMR (360 MHz, DMSO-d₆) δ 13,4 (s, 1H, NH), 11 (s, 1H, NH), 8,9 (d, 1H, NH), 8,7 (dd, 1H, ArH), 8,1 (dd, 1H, ArH), 7,9 (d, 1H, ArH), 7,6 (s, 1H, CH), 7,5 (dd, 1H, ArH), 7,3 (dd, 1H, ArH), 7,1 (m, 2H, ArH), 3,35 (m, 2H, CONHCH₂), 2,8 (m, 4H, 2 x pyrrolCH₂), 2,5 (br m, 6H, N(CH₂CH₃)₂ a NCH₂), 1,75 (br s, 4H, 2 x pyrrolCH₂CH₂), 0,9 (t, 6H, N(CH₂CH₃)₂).

MS-EI m/z 484 [M⁺].

Příklad 21 (3-Diethylamino-propyl)amid 4-benzoyl-5-(5-brom-2-oxo-l,2-dihydroindol-3ylidenmethyl)-3 -methyl-17/-pyrrol-2-karboxylové kyseliny ·· · · · · · · · · • · · · · # · · · · • · · · · · · · · · · • · · · * · ···· · · · ··· • · · ··· ··· ······ ·· · ·· ·

125

Do směsi benzoylchloridu (1 ekviv.) a chloridu hlinitého (1 ekviv.) v dichlorethanu při teplotě 0° C se přidá ethyl-3,5-dimethyl-2-pyrrolkarboxylát (1 ekviv.). Směs se míchá při teplotě 80° C po dobu 4 hodin. Směs se pak extrahuje ethylacetátem (EtOAc) a H₂O. Spojené organické extrakty se promyjí nasyceným roztokem hydrogenuhličitanu sodného a solankou, suší a koncentrují, čímž se získá (51%) 4-benzoyl-3,5-dimethyl-l//-pyrrol-2karboxylová kyselina.

Směs ethylesteru 4-benzoyl-3,5-dimethyl-l//-pyrrol-2-karboxylové kyseliny (4,13 g, 15,2 mmol) a dusičnanu ceričito-amonného (33 g, 4 ekviv.) ve směsi 50 ml tetrahydrofuranu (THF):octové kyseliny (HOAc):H₂O 1:1:1 se refluxuje přes noc. Reakční směs se pak ochladí, extrahuje EtOAc a pak alkalizuje na pH 9 uhličitanem sodným. Organická vrstva se pak promyje solankou, suší (MgSO4) a koncentruje, poté se podrobí sloupcové chromatografii, čímž se získá 3,25 g (75%) ethylesteru 4-benzoyl-5-formyl-3methyl-l/7-pyrrol-2-karboxylové kyseliny ve formě žluté pevné látky.

5-Brom-l,3-dihydro-indol-2-on se kondenzuje s 4-benzoyl-5-formyl-3-methyl-l//pyrrol-2-karboxylovou kyselinou podle způsobu D, čímž se získá 4-benzoyl-5-(5-brom-2oxo-1,2-dihydro-indol-3-ylidenmethyl)-3-methyl-l//-pyrrol-2-karboxylová kyselina.

Shora připravená karboxylová kyselina se pak kopuluje s A(/V-diethyl-l,3propandiaminem podle způsobu C, čímž se získá požadovaná sloučenina.

‘H NMR (360 MHz, DMSO-d₆) δ 7,96 (m, 1H, CONHCH₂), 7,76 (d, >7,0 Hz, 2H), 7,68 (t, 1H), 7,56 (m, 2H), 7,40 (s, 2H) 7,33 (dd, J=l,6 & 8,3 Hz, 1H, H-6), 6,84 (d, >8,3 Hz, 1H, H-7), 3,33 (m, 2H, CH₂), 2,42-2,46 (m, 6H, 3 x CH₂), 2,10 (s, 3H, CH₃), 1,65 (m, 2H, CH₂), 0,94 (t, J=7,0 Hz, 6H, N(CH₂CH₃)₂).

MS (ionizace nárazem elektronů) m/z 564 [M⁺+l],

Příklad 22 (3-Morfolin-4-ylpropyl)amid 4-benzoyl-5-(5-brom-2-oxo-l,2-dihydroindol-3ylidenmethyl)-3 -methyl-17/-pyrrol-2-karboxylové kyseliny *H NMR (360 MHz, DMSO-d₆) δ 14,10 (s, 1H, NH), 11,14 (br s, 1H, NH), 7,92 (m, 1H, CONHCH₂), 7,75 (m, 2H), 7,69 (t, 1H), 7,56 (m, 2H), 7,42 (m, 2H), 7,33 (dd, >1,9 & 8,3 Hz, 1H, H-6), 6,85 (d, J=8,3 Hz, 1H, H-7), 3,56 (m, 4H, 2 x CH₂), 3,33 (m, 2H, CH₂), 2,35 (m, 6H, 3 x CH₂), 2,10 (s, 3H, CH₃), 1,70 (m, 2H, CH₂).

·· φ φφ φ φ φ φ φ φ φ φ φφφ φ φφφ φ φ φφφφ φ φ φ φφφ φφφ φφφ

126

Příklad 23 (3 -Pyrrolidin-1 -ylpropyl)amid 4-benzoyl-3 -methyl-5-(2-oxo-1,2-dihydroindol-3 ylidenmethyl)- lA-pyrrol-2-karboxylové kyseliny

Ή NMR (300 MHz, DMSO-d₆) δ 14,18 (s, 1H, NH), 11,14 (br s, 1H, NH), 8,01 (m, 1H, CONHCH₂), 7,74 (m, 1H), 7,67 (m, 1H), 7,55 (m, 1H), 7,32 (s, 1H, H-vinyl), 7,17 (m, 1H), 6,92 (m, 1H), 3,36 (m, 2H, CH₂), 2,44 (m, 6H, 3 x CH₂), 2,11 (s, 3H, CH₃), 1,65-1,75 (m, 6H, 3 x CH₂).

MS (ionizace nárazem elektronů) m/z 482 [M⁺].

Příklad 24 (3-Pyrrolidin-l-ylpropyl)amid 4-benzoyl-5-(5-brom-2-oxo-l,2-dihydroindol-3ylidenmethyl)-3 -methyl-1 A-pyrrol-2-karboxylové kyseliny ^!H NMR (360 MHz, DMSO-d₆) δ 14,01 (s, 1H, NH), 11,18 (br s, 1H, NH), 7,98 (m, 1H, CONHCH₂), 7,75 (m, 2H), 7,68 (m, 1H), 7,55 (m, 2H), 7,40 (m, 2H), 7,33 (dd, >2,0 & 8,2 Hz, 1H, H-6), 6,84 (d, J=8,2 Hz, 1H, H-7), 3,34 (m, 2H, CH₂), 2,42-2,47 (m, 6H, 3 x CH₂), 2,09 (s, 3H, CH₃), 1,70 (m, 2H, CH₂), 1,64 (m, 4H, 2 x CH₂).

Příklad 25 (3 -Pyrrolidin-1 -ylpropyl)amid 4-benzoyl-3 -methyl-5-(2-oxo-6-fenyl-1,2-dihydroindol-3 ylidenmethyl)-1 H-pyrrol-2-karboxylové kyseliny ’H NMR (300 MHz, DMSO-d₆) δ 14,15 (s, 1H, NH), 11,16 (br s, 1H, NH), 7,98 (m, 1H, CONHCH₂), 7,77 (d, >7,7 Hz, 2H), 7,69 (m, 1H), 7,53-7,63 (m, 4H), 7,44 (m, 2H), 7,337,37 (m, 2H), 7,24 (s, 2H), 7,12 (s, 1H), 3,36 (m, 2H, CH₂), 2,43-2,48 (m, 6H, 3 x CH₂), 2,12 (s, 3H, CH₃), 1,74 (m, 2H, CH₂), 1,69 (m, 4H, 2 x CH₂).

MS (ionizace nárazem elektronů) m/z 558 [M⁺]·

Příklad 26 (3-Pyrrolidin-1-ylpropyl)amid 4-benzoyl-5-(6-methoxy-2-oxo-l,2-dihydroindol-3ylidenmethyl)-3 -methyl-1 /f-pyrrol-2-karboxylové kyseliny ···· ·· • · • · · • ···· • ♦ • · · • ···

127 ’Η NMR (300 MHz, DMSO-dg) δ 13,99 (s, 1H, NH), 11,05 (br s, 1H, NH), 7,93 (m, 1H, CONHCH₂), 7,72 (m, 2H), 7,65 (m, 1H), 7,54 (m, 2H), 7,15 (s, 1H, H-vinyl), 7,04 (d, J=8,4 Hz, 1H, H-4), 6,51 (dd, J=2,3 & 8,4 Hz, 1H, H-5), 6,44 (d, J=2,3 Hz, 1H, H-7), 3,74 (s, 3H, OCH₃), 3,35 (m, 2H, CH₂), 2,42-2,46 (m, 6H, 3 x CH₂), 2,10 (s, 3H, CH₃), 1,72 (m, 2H, CH₂), 1,65 (m, 4H, 2 x CH₂).

MS (ionizace nárazem elektronů) m/z 512 [M⁺],

Příklad 27 (3 -Pyrrolidin-1 -ylpropyl)amid 4-benzoyl-5-(5-methoxy-2-oxo-1,2-dihydroindol-3 ylidenmethyl)-3 -methyl-17/-pyrrol-2-karboxylové kyseliny *H NMR (360 MHz, DMSO-d₆) δ 14,24 (s, 1H, NH), 10,90 (br s, 1H, NH), 7,97 (m, 1H, CONHCH₂), 7,75 (d, J=7,2 Hz, 2H), 7,69 (m, 1H), 7,56 (m, 2H), 7,24 (s, 1H, H-vinyl), 6,79 (m, 2H), 6,66 (m, 1H), 3,67 (s, 3H, OCH₃), 3,34 (m, 2H, CH₂), 2,43-2,48 (m, 6H, 3 x CH₂), 2,14 (s, 3H, CH₃), 1,71 (m, 2H, CH₂), 1,66 (m, 4H, 2 x CH₂).

MS (ionizace nárazem elektronů) m/z 512 [M⁺].

Příklad 28 (3-Pyrrolidin-1 -ylpropyl)amid 4-benzoyl-5 -(5 -fluor-2-oxo-1,2-dihydroindol-3 ylidenmethyl)-3 -methyl-177-pyrrol-2-karboxylové kyseliny *H NMR (300 MHz, DMSO-d₆) δ 14,20 (s, 1H, NH), 11,14 (br s, 1H, NH), 8,03 (m, 1H, CONHCH₂), 7,75 (m, 2H), 7,68 (m, 1H), 7,55 (m, 2H), 7,38 (s, 1H, H-vinyl), 7,08 (m, 1H), 7,01 (m, 1H), 6,87 (m, 1H), 3,34 (m, 2H, CH₂), 2,42-2,48 (m, 6H, 3 x CH₂), 2,09 (s, 3H, CH₃), 1,70 (m, 2H, CH₂), 1,65 (m, 4H, 2 x CH₂).

MS (ionizace nárazem elektronů) m/z 500 [M⁺].

Příklad 29 (3-Diethylaminopropyl)amid 4-acetyl-5-(5-brom-2-oxo-l,2-dihydroindol-3-ylidenmethyl)3 -methyl-17/-pyrrol-2-karboxylové kyseliny

5-Brom-l,3-dihydro-indol-2-on se kondenzuje s (3-diethylaminopropyl)amidem

4-acetyl-5-formyl-3-methyl-l/7-pyrrol-2-karboxylové kyseliny (připraveným z ethylesteru

4

4

4

4 4 444 4 444

444 4 4444 44 4 4444

444 444 444

444444 44 4 44 4

128

4-acetyl-5-formyl-3-methyl-l//-pyrrol-2-karboxylové kyseliny podle způsobu B pak C), čímž se získá požadovaná sloučenina.

*H NMR (300 MHz, DMSO-d₆) δ 14,19 (s, 1H, NH), 11,19 (br s, 1H, NH), 8,15 (m, 1H, CONHCH₂), 8,11 (s, 1H, H-vinyl), 7,72 (d, J=l,8 Hz, 1H, H-4), 7,38 (dd, J=l,8 & 8,2 Hz, 1H, H-6), 6,87 (d, J=8,2 Hz, 1H, H-7), 3,27 (m, 2H, CH₂), 2,57 (s, 3H, CH₃CO), 2,46 (m, 9H, CH₃ & 3 x CH₂), 1,64 (m, 2H, CH₂), 0,93 (t, J=7,1 Hz, 6H, N(CH₂CH₃)₂).

Příklad 30 (3 -Pyrrolidin-1-ylpropyl)amid 4-acetyl-5-(5-brom-2-oxo-l,2-dihydroindol-3ylidenmethyl)-3 -methyl-1 H-pyrrol-2-karboxylové kyseliny

Ή NMR (300 MHz, DMSO-d₆) δ 8,14 (m, 1H, CONHCH₂), 8,10 (s, 1H, H-vinyl), 7,70 (d, 1H, H-4), 7,36 (dd, J=l,6 & 8,1 Hz, 1H, H-6), 6,85 (d, J=8,l Hz, 1H, H-7), 3,32 (m, 2H, CH₂), 2,57 (s, 3H, CH3CO), 2,44 (s, 3H, CH₃), 2,35-2,48 (m, 6H, 3 x CH₃), 1,65-1,71 (m, 6H, 3 x CH₂).

MS m/z 499 & 501 [M⁺] & [M⁺+2],

Příklad 31 (3 -Morfolin-4-ylpropyl)amid 4-acetyl-5 -(5 -brom-2-oxo-1,2-dihydroindol-3 -ylidenmethyl)3 -methyl-1 /7-pyrrol-2-karboxylové kyseliny *H NMR (300 MHz, DMSO-d₆) δ 14,20 (s, 1H, NH), 11,26 (br s, 1H, NH), 8,09 (m, 2H, H-vinyl & CONHCH₂), 7,73 (d, J=l,5 Hz, 1H, H-4), 7,38 (dd, J=l,5 & 8,3 Hz, 1H, H-6), 6,87 (d, J=8,3 Hz, 1H, H-7), 3,55 (m, 4H, 2 x CH₂), 3,26 (m, 2H, CH₂), 2,57 (s, 3H, CH3CO), 2,44 (s, 3H, CH₃), 2,35 (m, 6H, 3 x CH₃), 1,68 (m, 2H, CH₂).

MS-EI m/z 514 & 516 [M⁺-l] & [M⁺+l],

Příklad 32 (3-Hydroxypropyl)amid 4-acetyl-5-(5-brom-2-oxo-l,2-dihydroindol-3-ylidenmethyl)-3methyl-177-pyrrol-2-karboxylové kyseliny ‘HNMR (360 MHz, DMSO-d₆) δ 14,17 (s, 1H, NH), 11,25 (br s, 1H, NH), 8,10 (s, 1H, Hvinyl), 8,03 (m, 1H, CONHCH₂), 7,71 (br s, 1H, H-4), 7,37 (br d, J=8,4 Hz, 1H, H-6), 6,87 ·* «· »· « » e · · · · · · · · · • « » · ··· · · · · * · · · · ······· ···»· • · · · · ♦ · · · ····«« ·· · »· ·

129 (d, >8,4 Hz, 1H, H-7), 4,51 (br s, 1H, OH), 3,51 (br s, 2H, CH₂), 3,36 (m, 2H, CH₂), 2,57 (s, 3H, CH₃CO), 2,43 (s, 3H, CH₃), 1,70 (m, 2H, CH₂).

MS-EI m/z 445 & 447 [M⁺-l] & [M⁺+l].

Příklad 34 (2-Morfolin-4-ylethyl)amid 4-acetyl-5-(5-brom-2-oxo-l,2-dihydroindol-3-ylidenmethyl)3 -methyl-1 H-pyrrol-2-karboxy lové kyseliny *H NMR (360 MHz, DMSO-d₆) δ 14,19 (s, 1H, NH), 11,14 (br s, 1H, NH), 8,10 (s, 1H, Hvinyl), 7,84 (m, 1H, CONHCH₂), 7,71 (d, >1,8 Hz, 1H, H-4), 7,38 (dd, >1,8 & 8,2 Hz, 1H, H-6), 6,87 (d, >8,2 Hz, 1H, H-7), 3,58 (m, 4H, 2 x CH₂), 3,40 (m, 2H, CH₂), 2,57 (s, 3H, CH₃CO), 2,49 (m, 4H, 2 x CH₂), 2,45 (m, CH₃ & CH₂).

MS-EI m/z 500 & 502 [M⁺-l] & [M⁺+l],

Příklad 35 (2-Pyrrolidin-1 -ylethyl)amid 4-acetyl-5-(5-brom-2-oxo-1,2-dihydroindol-3 -ylidenmethyl)3 -methyl-17/-pyrrol-2-karboxylové kyseliny *H NMR (360 MHz, DMSO-d₆) δ 14,17 (s, 1H, NH), 11,23 (s, 1H, NH), 8,11 (s, 1H, Hvinyl), 7,91 (m, 1H, CONHCH₂), 7,73 (d, >1,9 Hz, 1H, H-4), 7,39 (dd, >1,9 & 8,3 Hz, 1H, H-6), 6,88 (d, J=8,3 Hz, 1H, H-7), 3,40 (m, 2H, CH₂), 2,62 (m, 2H, CH₂), 2,57 (s, 3H, CH₃CO), 2,49 (m, 4H, 2 x CH₂), 2,44 (s, 3H, CH₃), 1,69 (m, 4H, 2 x CH₂).

Příklad 36 [2-(4-Hydroxyfenyl)ethyl]amid 4-acetyl-5-(5-brom-2-oxo-l,2-dihydroindol-3ylidenmethyl)-3-methyl-l//-pyrrol-2 -karboxylové kyseliny *H NMR (300 MHz, DMSO-d₆) δ 14,21 (s, 1H, NH), 11,18 (s, ΙΗ,ΟΗ), 9,09 (s, 1H, NH), 8,06-8,10 (m, 2H), 7,73 (s, 1H), 7,38 (d, J=7,8 Hz, 1H), 7,04 (d, >7,1 Hz, 2H), 6,88 (d, >7,8 Hz, 1H), 6,67 (d, >7,1 Hz, 2H), 3,42 (m, 2H, CH₂), 2,72 (m, 2H, CH₂), 2,56 (s, 3H, CH₃CO), 2,37 (s, 3H, CH₃).

MS-EI m/z 507 & 509 [M⁺-l] & [M⁺+l], • · · · • · · • · · • · · »··· ·· • 9 · • · · • · · · • · ···· • · · ·

·· r • 9 · • · · · • · · «··· • · · ·

130

Příklad 37 (3-Diethylaminopropyl)amid 5-(5-brom-2-oxo-l,2-dihydroindol-3-ylidenmethyl)-2izopropy 1-4-feny 1-177-py rrol-3 -karboxylové kyseliny

Směs hydrochloridu 2-aminoacetofenonu (1 ekviv.), ethyl-izobutyrylacetátu (1,2 ekviv.) a octanu sodného (2,4 ekviv.) v H2O se míchá při teplotě 100° C po dobu 18 hodin a pak ochladí na pokojovou teplotu. Vodná vrstva se oddekantuje a olej se rozpustí v ethylacetátu, promyje vodou a solankou a pak suší, čímž se získá (93%) ethylester 2-izopropyl-4-fenyl-l//-pyrrol-3-karboxylové kyseliny ve formě červeno-hnědého oleje. ¹HNMR (300 MHz, DMSO-de) δ 11,21 (s, br, 1H, NH), 7,14-7,27 (m, 5H), 6,70 (d, >2,7 Hz, 1H), 4,02 (q, >7,1 Hz, 2H, OCH₂CH₃), 3,65 (m, 1H, CH(CH₃)₂), 1,22 (d, J=7,5 Hz, 6H, CH(CH₃)₂), 1,04 (t, J=7,l Hz, 3H, OCH₂CH₃).

MS-EI m/z 257 [M⁺j.

Shora připravený pyrrol se formyluje podle způsobu A, čímž se získá (41%) ethylester 5-formyl-2-izopropyl-4-fenyl-l//-pyrrol-3-karboxylové kyseliny načervenalé pevné látky.

’HNMR (300 MHz, DMSO-dó) δ 12,35 (s, br, 1H, NH), 9,14 (s, 1H, CHO), 7,36 (s, 5H), 3,96 (q, >7,1 Hz, 2H, OCH₂CH₃), 3,74 (m, 1H, CH(CH₃)₂), 1,29 (d, >6,9 Hz, 6H, CH(CH₃)₂), 0,90 (t, >7,1 Hz, 3H, OCH₂CH₃).

MS-EI m/z 285 [M⁺].

Ester pyrrolkarboxylové kyseliny se hydrolyzuje podle způsobu B, čímž se získá (57%) of 5-formyl-2-izopropyl-4-fenyl-17Z-pyrrol-3-karboxylová kyselina ve formě béžové pevné látky.

*HNMR (300 MHz, DMSO-d₆) δ 12,28 (s, br, 1H, COOH), 12,02 (s, br, 1H, NH), 9,10 (s, 1H, CHO), 7,35 (s, 5H), 3,81 (m, 1H, CH(CH₃)₂), 1,28 (d, >6,9 Hz, 6H, CH(CH₃)₂). MS-EI m/z 257 [M⁺].

5-Brom-l,3-dihydroindol-2-on (120 mg, 0,31 mmol) se kondenzuje s (3diethylaminopropyl)amid 5-formyl-2-izopropyl-4-fenyl-l//-pyrrol-3-karboxylové kyseliny (připravený podle způsobu C), čímž se získá 120 mg (71%) požadované sloučeniny. ’HNMR (300 MHz, DMSO-d₆) δ 14,23 (s, br, 1H, NH), 11,08 (s, br, 1H, NH), 7,38-7,55 (m, 7H, Ar-H & CONHCH₂), 7,30 (s, 1H, H-vinyl), 7,26 (dd, >1,8 & 7,8 Hz, 1H), 6,85 (d, >8,7 Hz, 1H), 3,36 (m, 1H, CH(CH₃)₂), 3,07 (m, 2H, CH₂), 2,34 (q, >7,1 Hz, 4H, • ···· · · ·· ·

131

N(CH₂CH₃)₂), 2,22 (t, J=6,9 Hz, 2H, CH₂), 1,40 (m, 2H, CH₂), 1,31 (d, J=6,9 Hz, 6H, CH(CH₃)₂), 0,86 (t, J=7,l Hz, 6H, N(CH₂CH₃)₂).

MS m/z 565,1 [M⁺+l].

Příklad 38 (3-Pyrrolidin-l-ylpropyl)amid 5-(5-brom-2-oxo-l,2-dihydroindol-3-ylidenmethyl)-2izopropy 1-4-feny 1-177-pyrrol-3 -karboxylové kyseliny

5-(5-brom-2-oxo-l,2-dihydroindol-3-ylidenmethyl)-2-izopropyl-4-fenyl-177-pyrrol3-karboxylová kyselina (127 mg, 0,28 mmol) se kondenzuje s 3-pyrrolidin-l-ylpropylaminem (43 mg, 0,336 mmol), čímž se získá 140 mg (66%) požadované sloučeniny. ¹HNMR (300 MHz, DMSO-dé) δ 14,40 (s, br, 1H, NH), 7,38-7,47 (m, 7H), 7,23-7,27 (m, 2H), 6,84 (d, J=8,l Hz, 1H), 3,36 (m, 1H, CH(CH₃)₂), 3,08 (m, 2H, CH₂), 2,30 (m, 4H, 2 x CH₂), 2,20 (t, J=7,0 Hz, 2H, CH₂), 1,62 (m, 4H, 2 x CH₂), 1,42 (t, J=7,0 Hz, 2H, CH₂), 1,31 (d, J=7,2 Hz, 6H, CH(CH₃)₂).

MS-EI m/z 560 a 562 [M⁺-l a M⁺+l].

Příklad 39 (2-Diethylaminoethyl)amid 5-(5-brom-2-oxo-l,2-dihydroindol-3-ylidenmethyl)-2izopropyl-4-fenyl-1 //-pyrrol-3 -karboxylové kyseliny

5-Brom-l,3-dihydroindol-2-on (57 g, 0,27 mmol) se kondenzuje s (2-diethylaminoethyl)amidem 5-formyl-2-izopropyl-4-fenyl-177-pyrrol-3-karboxylové kyseliny (120 mg), čímž se získá 78 mg (53%) požadované sloučeniny ve formě žluté pevné látky.

’HNMR (300 MHz, DMSO-d₆) δ 14,23 (s, br, 1H, NH), 11,09 (s, br, 1H, NH), 7,38-7,51 (m, 6H), 7,25-7,28 (m, 2H), 7,19 (t, 1H, CONHCH₂), 6,85 (d, J=7,8 Hz, 1H), 3,43 (m, 1H, CH(CH₃)₂), 3,11 (m, 2H, CH₂), 2,28-2,39 (m, 6H, N(CH₂CH₃)₂ & CH₂, 1,31 (d, >6,9 Hz, CH(CH₃)₂), 0,85 (t, >7,0 Hz, 6H, N(CH₂CH₃)₂.

MS-EI m/z 548 a 550 [M⁺-l a M⁺+l], • 9 • · • · ·· · · ··· 9 999

9 999 9999999 9999

99· 999 999

999999 99 9 99 9

132

Příklad 40 [3-(4-Methylpiperazin-l-yl)propyl]amid 5-(5-brom-2-oxo-l,2-dihydroindol-3ylidenmethyl)-2-izopropyl-4-fenyl-1 //-pyrrol-3 -karboxylové kyseliny

5-Brom-l,3-dihydroindol-2-on (53 mg, 0,25 mmol) se kondenzuje s [3-(4-methylpiperazin-l-yl)propyl] amidem 5-formyl-2-izopropyl-4-fenyl-l//-pyrrol-3karboxylové kyseliny (300 mg), čímž se získá 65 mg požadované sloučeniny.

’HNMR (300 MHz, DMSO-de) δ 14,22 (s, br, 1H, NH), 11,08 (s, br, 1H, NH), 7,23-7,50 (m, 9H), 6,85 (d, J=8,7 Hz, 1H), 3,37 (m, 1H, CH(CH₃)₂), 3,05 (m, 2H, CH₂), 2,24 (m, 8H, 4 x CH₂), 2,11 (m, 5H, CH₂ & CH₃),1,42 (m, 2H, CH₂), 1,31 (d, >7,2 Hz, 6H, CH(CH₃)₂). MS-EI m/z 589 a 591 [M⁺-l a M⁺+l],

Příklad 41

5-(5-Brom-2-oxo-l,2-dihydroindol-3-ylidenmethyl)-2-izopropyl-4-fenyl-l//-pyrrol-3 karboxylová kyselina

5-Brom-l,3-dihydroindol-2-on (170 mg, 0,8 mmol) se kondenzuje s 5-formyl-2izopropyl-4-fenyl-l//-pyrrol-3-karboxylovou kyselinou (205 mg) podle způsobu D, čímž se získá 210 mg (58%) požadované sloučeniny ve formě žluté pevné látky.

'HNMR (300 MHz, DMSO-d₆) δ 14,31 (s, br, 1H, NH), 11,16 (s, br, 1H, NH), 7,26-7,44 (m, 7H), 7,11 (s, 1H, H-vinyl), 6,85 (d, J=7,8 Hz, 1H), 3,78 (m, 1H, CH(CH₃)₂), 1,34 (d, >6,9 Hz, 6H, CH(CH₃)₂).

MS-EI m/z 452 [M⁺+l].

Příklad 42 (2-Pyrrolidin-l-ylethyl)amid 5-(5-brom-2-oxo-l,2-dihydroindol-3-ylidenmethyl)-2methyl-4-fenyl-1 //-pyrrol-3-karboxylové kyseliny

5-Brom-l,3-dihydroindol-2-on (44 mg, 0,21 mmol) se kondenzuje s (2-pyrrolidinl-ylethyl)amidem 5-formyl-2-methyl-4-fenyl-l //-pyrrol-3 -karboxylovou kyselinou (70 mg, připravenou stejným způsobem jako izopropylový analog výše), čímž se získá 0,03 g (27%) požadované sloučeniny ve formě žluté pevné látky.

*HNMR (300 MHz, DMSO-d₆) δ 13,87 (s, br, 1H, NH), 11,11 (s, br, 1H, NH), 7,36-7,51 (m, 6H), 7,26 (dd, >1,8 & 8,1 Hz, 1H), 7,2 (s, 1H, H-vinyl), 7,09 (m, 1H, CONHCH₂), • ·

133

6,83 (d, >8,1 Hz, 1H), 3,17 (m, 2H, NCH₂), 2,48 (m, CH₃), 2,29-2,35 (m, 6H, 3 x NCH₂), 1,59 (m, 4H, 2 x CH₂).

MS-EI Wz 518 a 520 [M⁺-l a M⁺+l].

Příklad 43 (2-Pyrrolidin-l-ylethyl)amid 5-[6-(2-methoxyfenyl)-2-oxo-l,2-dihydroindol-3ylidenmethyl]-2-methyl-4-fenyl-17/-pyrrol-3-karboxylové kyseliny

6-(2-Methoxyfenyl)-l,3-dihydroindol-2-on (50 mg, 0,21 mmol) se kondenzuje s (2-pyrrolidin-l-ylethyl)amidem 5-formyl-2-methyl-4-fenyl-177-pyrrol-3-karboxylové kyseliny (70 mg), čímž se získá 0,04 g (35%) požadované sloučeniny ve formě žlutooranžové pevné látky.

*HNMR (300 MHz, DMSO-d₆) δ 13,82 (s, br, 1H, NH), 11,02 (s, br, 1H, NH), 7,48 (m, 2H), 7,43 (m, 1H), 7,38 (m, 2H), 7,32 (m, 1H), 7,24 (m, 2H), 7,16 (s, 1H, H-vinyl), 7,08 (m, 2H), 7,03 (m, 1H), 7,0 (m, 2H), 3,74 (s, 3H, OCH₃), 3,19 (m, 2H, NCH₂), 2,49 (m, CH₃), 2,32-2,38 (m, 6H, 3 xNCH₂), 1,59 (m, 4H, 2 x CH₂).

MS-EI m/z 546 [M⁺].

Příklad 44 (2-Dimethylaminoethyl)amid 5-(5-brom-2-oxo-l,2-dihydroindol-3-ylidenmethyl)-2methyl-4-fenyl-177-pyrrol-3 -karboxylové kyseliny

5-Brom-l,3-dihydroindol-2-on (46 mg, 0,22 mmol) se kondenzuje s (2-dimethylaminoethyl)amidem 5-formyl-2-methyl-4-fenyl-177-pyrrol-3-karboxylové kyseliny (65 mg), čímž se získá 60 mg (55%) požadované sloučeniny ve formě žluté pevné látky.

¹HNMR (360 MHz, DMSO-d₆) δ 13,86 (s, br, 1H, NH), 11,09 (s, br, 1H, NH), 7,47-7,49 (m, 2H), 7,38-7,41 (m, 4H), 7,26 (dd, >2,2 & 8,3 Hz, 1H), 7,21 (s, 1H, H-vinyl), 7,04 (m, 1H, CONHCH₂), 6,77 (d, >8,3 Hz, 1H), 3,15 (m, 2H, NCH₂), 2,48 (m, CH₃), 2,16 (t, >6,8 Hz, 2H, 3 x NCH₂), 2,02 (s, 6H, 2 x NCH₃).

MS m/z 493 a 494,8 [M⁺ a M⁺+2], • · • · · · ··· · · · ·· · · ··· · · · · • · · * · · ···♦ « · · ··· • · · ··· · · · ······ ·· · ·· ·

134

Příklad 45 (2-Dimethylaminoethyl)amid 5-[6-(2-methoxyfenyl)-2-oxo-1,2-dihydroindol-3ylidenmethyl] -2-methyl-4-fenyl-1 //-pyrrol-3 -karboxylové kyseliny

6-(2-Methoxyfenyl)-l,3-dihydroindol-2-on (53 mg, 0,22 mmol) se kondenzuje s (2-dimethylaminoethyl)amidem 5-formyl-2-methyl-4-fenyl-l//-pyrrol-3-karboxylové kyseliny (65 mg), čímž se získá 0,05 g (44%) požadované sloučeniny ve formě oranžové gumy.

‘HNMR (300 MHz, DMSO-de) δ 13,82 (s, br, 1H, NH), 11,02 (s, br, 1H, NH), 7,37-7,52 (m, 5H), 7,32 (m, 1H), 7,22-7,27 (m, 2H), 7,16 (s, 1H), 7,08 (m, 2H), 7,03 (m, 1H), 7,0 (m, 2H), 3,74 (s, 3H, OCH₃), 3,15 (m, 2H, NCH₂), 2,49 (m, CH₃), 2,16 (t, J=6,5 Hz, 2H, NCH₂), 2,02 (s, 6H, 2 x NCH₃).

MS m/z 521 [M⁺+l].

Příklad 46

Ethylester 5-(5-brom-2-oxo-l,2-dihydroindol-3-ylidenmethyl)-2-methyl-4-fenyl-l//pyrrol-3-karboxylové kyseliny

5-Brom-l,3-dihydroindol-2-on (60 mg, 0,29 mmol) se kondenzuje s ethylesterem 5formyl-2-methyl-4-fenyl-l//-pyrrol-3-karboxylové kyseliny (75 mg), čímž se získá 78 mg (60%) požadované sloučeniny ve formě oranžové pevné látky.

‘HNMR (360 MHz, DMSO-d₆) δ 14,01 (s, br, 1H, NH), 11,13 (s, br, 1H, NH), 7,42-7,46 (m, 3H), 7,27-7,34 (m, 4H), 7,12 (s, 1H), 6,84 (dd, J=2,2 & 8,3 Hz, 1H), 3,99-4,03 (m, 2H, OCH₂CH₃), 2,61 (s, 3H, CH₃), 0,98-1,03 (m, 3H, OCH₂CH₃).

MS-EI m/z 450 a 452 [M⁺-l _a M⁺+l].

Příklad 47 (3-Diethylaminopropyl)amid 5-(5-brom-2-oxo-l,2-dihydroindol-3-ylidenmethyl)-2methyl-4-fenyl-1 //-pyrrol-3 -karboxylové kyseliny

5-Brom-l,3-dihydroindol-2-on (0,47 g, 2,2 mmol) se kondenzuje s (3-diethylaminopropyl)amidem 5-formyl-2-methyl-4-fenyl-1 Z/-pyrrol-3-karboxylové kyseliny (0,75 g), čímž se získá 0,11 g (42%) požadované sloučeniny ve formě oranžové pevné látky.

• ·

135 ‘HNMR (300 MHz, DMSO-de) δ 13,86 (s, br, 1H, NH), 7,42-7,46 (m, 3H), 7,37-7,50 (m, 7H), 7,24-7,28 (m, 2H), 6,83 (d, >8,1 Hz, 1H), 3,09 (m, 2H, NCH₂), 2,45 (s, 3H, CH₃), 2,38 (q, J=7,l Hz, 4H, 2 x NCH₂CH₃), 2,26 (t, >6,9 Hz, 2H, NCH₂), 1,42 (m, 2H, NCH₂), 0,87 (t, >7,1 Hz, 6H, 2 x NCH₂CH₃).

MS-EI m/z 535,0 a 537 [M⁺ a M⁺+2].

Příklad 48 (2-Dimethylamino-ethyl)amid 5-(5-brom-2-oxo-l,2-dihydroindol-3-ylidenmethyl)-2,4dimethyl-177-pyrrol-3 -karboxylové kyseliny

Směs terc-butyl-3-oxobutyrátu a dusitanu sodného (1 ekviv.) v octové kyselině se míchá při pokojové teplotě, čímž se získá řerc-butyl-2-hydroximino-3-oxobutyrát.

Ethyl-3-oxobutyrát (1 ekviv.), zinkový prach (3,8 ekviv.) a surový terc-butyl-2hydroximino-3-oxobutyrát v octové kyselině se míchají při teplotě 60° C po dobu 1 hodiny. Reakční směs se nalije do H₂O a filtrát se spojí, čímž se získá (65%) 2-řercbutyloxykarbonyl-3,5-dimethyl-4-ethoxykarbonylpyrrol.

Směs 2-Zerc-butyJoxykarbonyl-3,5-dimethyl-4-ethoxykarbonylpyrrolu a triethylorthoformiátu (1,5 ekviv.) v trifluoroctové kyselině se míchá při teplotě 15° C po dobu 1 hodiny. Reakce se koncentruje a zbytek se čistí, čímž se získá (64%) 2,4-dimethyl3-ethoxykarbonyl-5-formylpyrrol ve formě žlutých jehliček.

2,4-Dimethyl-3-ethoxykarbonyl-5-formylpyrrol se hydrolyzuje podle způsobu B, čímž se získá (90%) 5-formyl-2,4-dimethyl-l//-pyrrol-3-karboxylová kyselina.

*H NMR (360 MHz, DMSO-d₆) δ 12 (br s, 2H, NH a CO₂H), 9,58 (s, 1H, CHO), 2,44 (s, 3H, CH₃), 2,40 (s, 3H, CH₃).

MS m/z 267 [M⁺],

5-Brom-l,3-dihydroindol-2-on (0,17 g, 0,8 mmol) se kondenzuje s (2-dimethylaminoethyl)amidem 5-formyl-2,4-dimethyl-177-pyrrol-3-karboxylové kyseliny (0,2 g, připravený podle způsobu C) podle způsobu B, čímž se získá 0,3 g (83%) požadované sloučeniny ve formě žluté pevné látky.

'HNMR (360 MHz, DMSO-d₆) δ 13,60 (s, br, 1H, NH), 10,94 (s, br, 1H, NH), 8,07 (d, >1,8 Hz, 1H, H-4), 7,75 (s, 1H, H-vinyl), 7,44 (t, >5,2 Hz, 1H, CONHCH₂), 7,24 (dd, >1,8 & 8,4 Hz, 1H, H-6), 6,82 (d, >8,4 Hz, 1H, H-7), 3,26-3,33 (m, 2H, NCH₂), 2,42 (s, 3H, CH₃), 2,41 (s, 3H, CH₃), 2,38 (t, >6,7 Hz, 2H, NCH₂), 2,18 (s, 6H, N(CH₃)₂).

·· · · ··· · · · · • · · · · ······· ···· ··· ··· · · · ······ ·· · ·· ·

136

MS-EI m/z 430 a 432 [M⁺-l a M⁺+l],

Příklad 49 (2-Dimethylaminoethyl)amid 2,4-dimethyl-5-(2-oxo-6-fenyl-l,2-dihydroindol-3ylidenmethyl)-1//-pyrrol-3-karboxylové kyseliny

6-Fenyl-l,3-dihydroindol-2-on (0,17 g, 0,8 mmol) se kondenzuje s (2-dimethylaminoethyl)amidem 5-formyl-2,4-dimethyl-l//-pyrrol-3-karboxylové kyseliny (0,2 g), čímž se získá 0,13 g (36%) požadované sloučeniny ve formě žluto-oranžové pevné látky.

*HNMR (360 MHz, DMSO-d₆) δ 13,59 (s, br, 1H, NH), 10,93 (br, 1H, NH), 7,85 (d, >7,92 Hz, 1H, H-4), 7,63-7,65 (m, 3H), 7,40-7,47 (m, 3H,), 7,32-7,36 (m, 1H, Ar-H), 7,30 (dd, >1,6 & 7,9 Hz, 1H, H-5), 7,11 (d, >1,6 Hz, 1H, H-7), 3,28-3,34 (m, 2H, NCH₂), 2,43 (s, 3H, CH₃), 2,41 (s, 3H, CH₃), 2,38 (t, >6,8 Hz, 2H, NCH₂), 2,18 (s, 6H, N(CH₃)₂).

MS-EI m/z 428 [M⁺].

Příklad 50 (2-Dimethylamino-ethyl)amid 5-(5-chlor-2-oxo-1,2-dihydroindol-3-ylidenmethyl)-2,4dimethyl-1 //-pyrrol-3 -karboxylové kyseliny

5-Chlor-l,3-dihydroindol-2-on (0,1 g, 0,6 mmol) se kondenzuje s (2-dimethylaminoethyl)amidem 5-formyl-2,4-dimethyl-l//-pyrrol-3-karboxylové kyseliny (0,15 g), čímž se získá 0,22 g (90%) požadované sloučeniny ve formě žluté pevné látky.

’HNMR (300 MHz, DMSO-dé) δ 13,61 (s, br, 1H, NH), 10,98 (br, 1H, NH), 7,96 (d, >2,0 Hz, 1H, H-4), 7,75 (s, 1H, H-vinyl), 7,50 (t, >5,5 Hz, 1H, CONHCH₂), 7,12 (dd, >2,0 &

8,3 Hz, 1H, H-6), 6,86 (d, >8,3 Hz, 1H, H-7), 3,26-3,31 (m, 2H, NCH₂), 2,42 (s, 3H,

CH₃), 2,40 (s, 3H, CH₃), 2,36 (t, >6,6 Hz, 2H, NCH₂), 2,17 (s, 6H, N(CH₃)₂).

MS-EI m/z 386 [M⁺].

Příklad 51 (2-Diethylamino-ethyl)amid 5-(5-brom-2-oxo-l,2-dihydroindol-3-ylidenmethyl)-2,4dimethyl-1//-pyrrol-3-karboxylové kyseliny • · • · · · · · · · « · « • · · · · ······· · ···· • · · ♦ · · ··· ······ ·· · · · ·

137

5-Brom-l,3-dihydroindol-2-on (0,17 g, 0,8 mmol) se kondenzuje s (2-diethylaminoethyl)amidem 5-formyl-2,4-dimethyl-l/7-pyrrol-3-karboxylové kyseliny (0,2 g), čímž se získá 0,09 g (26%) požadované sloučeniny ve formě žluté pevné látky.

’HNMR (360 MHz, DMSO-d₆) δ 13,61 (s, br, 1H, NH), 10,98 (br, 1H, NH), 8,09 (d, >1,7 Hz, 1H, H-4), 7,76 (s, 1H, H-vinyl), 7,42 (t, >5,5 Hz, 1H, CONHCH₂), 7,24 (dd, >1,7 &

8,0 Hz, 1H, H-6), 6,82 (d, >8,0 Hz, 1H, H-7), 3,23-3,32 (m, 2H, NCH₂), 2,46-2,55 (m,

6H, 3 x NCH₂), 2,43 (s, 3H, CH₃), 2,42 (s, 3H, CH₃), 0,96 (t, >7,2 Hz, 6H, 2 x NCH₂CH₃).

MS-EI m/z 458 a 460 [M⁺-l a M⁺+l].

Příklad 52 (2-Pyrrolidin-l-yl-ethyl)amid 5-(5-brom-2-oxo-l,2-dihydroindol-3-ylidenmethyl)-2,4dimethyl-1 //-pyrrol-3 -karboxylové kyseliny

5-Brom-l,3-dihydroindol-2-on (0,09 g, 0,4 mmol) se kondenzuje s (2-pyrrolidin-lylethyl)amidem 5-formyl-2,4-dimethyl-lH-pyrrol-3-karboxylové kyseliny (0,1 g), čímž se získá 0,14 g (81%) požadované sloučeniny ve formě žluto-oranžové pevné látky.

'HNMR (300 MHz, DMSO-d₆) δ 13,61 (s, br, 1H, NH), 10,98 (br, 1H, NH), 8,09 (d, >1,9 Hz, 1H, H-4), 7,76 (s, 1H, H-vinyl), 7,53 (t, >5,5 Hz, 1H, CONHCH₂), 7,24 (dd, >1,9 &

8,5 Hz, 1H, H-6), 6,81 (d, >8,5 Hz, 1H, H-7), 3,29-3,35 (m, 2H, NCH₂), 2,54 (t, >6,9 Hz,

2H, NCH₂), 2,47 (m, schovaný pod pikem DMSO), 2,42 (s, 3H, CH₃), 2,40 (s, 3H, CH₃),

1,66-1,69 (m, 4H,2xCH₂).

MS-EI m/z 456 a 458 [M⁺-l a M⁺+l].

Příklad 53 (3-Imidazol-l-yl-propyl)amid 5-(5-brom-2-oxo-l,2-dihydroindol-3-ylidenmethyl)-2,4dimethyl- 177-pyrrol-3-karboxylové kyseliny

5-Brom-l,3-dihydroindol-2-on (0,09 g, 0,4 mmol) se kondenzuje s (3-imidazol-lylpropyl)amidem 5-formyl-2,4-dimethyl-17/-pyrrol-3-karboxylové kyseliny (0,1 g), čímž se získá 0,1 g (59%) požadované sloučeniny ve formě oranžové pevné látky.

'HNMR (300 MHz, DMSO-d₆) δ 13,63 (s, br, 1H, NH), 10,99 (, br, 1H, NH), 8,09 (d, >2,2 Hz, 1H, H-4), 7,77 (s, 1H, H-vinyl), 7,71 (t, >5,7 Hz, 1H, CONHCH₂), 7,65 (s, 1H, ·· ·

138

Ar-H), 7,25 (dd, J=2,2 & 8,4 Hz, 1H, H-6), 7,20 (s, 1H, Ar-H), 6,89 (s, 1H, Ar-H), 6,81 (d, >8,4 Hz, 1H, H-7), 4,02 (t, >6,7 Hz, 2H, NCH₂), 3,18 (q, >6,7 Hz, 2H, NCH₂), 2,43 (s, 3H, CH₃), 2,41 (s, 3H, CH₃), 1,93 (m, 2H, CH₂).

MS-EI m/z 467 a 469 [M⁺-l a M⁺+l],

Příklad 54 (2-Dimethylaminoethyl)amid 5 - [6-(2-methoxyfenyl)-2-oxo-1,2-dihydroindol-3 ylidenmethyl]-2,4-dimethyl-l//-pyrrol-3-karboxylové kyseliny

6-(2-Methoxyfenyl)-l,3-dihydroindol-2-on (30 mg, 0,13 mmol) se kondenzuje s (2-dimethylaminoethyl)amidem 5-formyl-2,4-dimethyl-177-pyrrol-3-karboxylové kyseliny (30 mg), čímž se získá 0,06 g (100%) požadované sloučeniny ve formě žluto-oranžové gumy.

*HNMR (300 MHz, DMSO-dé) δ 13,60 (s, br, 1H, NH), 10,89 (s, br, 1H, NH), 7,79 (d, >8,4 Hz, 1H), 7,63 (s, 1H, H-vinyl), 7,46 (t, >5,5 Hz, 1H, CONHCH₂), 7,28-7,35 (m, 2H), 6,99-7,11 (m, 4H), 3,76 (s, 3H, OCH₃), 3,27-3,31 (m, 2H, NCH₂), 2,43 (s, 3H, CH₃), 2,39 (s, 3H, CH₃), 2,37 (m, 2H, NCH₂), 2,18 (s, 6H, N(CH₃)₂).

MS-EI m/z 458 [M⁺],

Příklad 55 (2-Dimethylaminoethyl)amid 5-[6-(3-methoxyfenyl)-2-oxo-l,2-dihydroindol-3ylidenmethyl]-2,4-dimethyl-l//-pyrrol-3-karboxylové kyseliny

6-(3-Methoxyfenyl)-l,3-dihydroindol-2-on (30 mg, 0,13 mmol) se kondenzuje s (2-dimethylaminoethyl)amidem 5-formyl-2,4-dimethyl-l//-pyrrol-3-karboxylové kyseliny (30 mg), čímž se získá 8 mg (14%) požadované sloučeniny ve formě žluto-oranžové pevné látky.

'HNMR (360 MHz, DMSO-d₆) δ 13,59 (s, br, 1H, NH), 10,92 (s, br, 1H, NH), 7,84 (d, >7,6 Hz, 1H), 7,65 (s, 1H, H-vinyl), 7,42 (m, 1H, CONHCH₂), 7,36 (d, >7,8 Hz, 1H), 7,29 (dd, >1,6 & 7,6 Hz, 1H), 7,20 (d, >7,8 Hz, 1H), 7,14 (d, >2,8 Hz, 1H), 7,11 (d, >1,6 Hz, 1H), 6,91 (dd, >2,8 & 7,8 Hz, 1H), 3,82 (s, 3H, OCH₃), 3,21-3,33 (m, 2H, NCH₂), 2,43 (s, 3H, CH₃), 2,40 (s, 3H, CH₃), 2,36-2,40 (m, 2H, NCH₂), 2,18 (s, 6H, N(CH₃)₂).

139 • · · « • · ♦ • · • · • · • · « • ·· · · ·· · • ·

MS-EI m/z 458 [M⁺].

Příklad 56 (2-Diethylaminoethyl)amid 2,4-dimethyl-5-(2-oxo-5-fenyl-1,2-dihydroindol-3ylidenmethyl)-1 //-pyrrol-3 -karboxylové kyseliny

5-Fenyl-l,3-dihydroindol-2-on (80 mg, 0,4 mmol) se kondenzuje s (2diethylaminoethyl)amidem 5-formyl-2,4-dimethyl-l//-pyrrol-3-karboxylové kyseliny (0,1 g) podle způsobu B, čímž se získá 79 mg (46%) požadované sloučeniny.

‘HNMR (300 MHz, DMSO-de) δ 13,66 (s, br, 1H, NH), 10,95 (br, 1H, NH), 8,15 (d, >1,2 Hz, 1H), 7,81 (s, 1H, H-vinyl), 7,71 (d, >7,5 Hz, 1H), 7,40-7,47 (m, 4H), 7,31 (m, 1H), 6,95 (d, >8,1 Hz, 1H), 3,2-3,31 (m, 2H, NCH₂), 2,46-2,55 (m, 6H, 3 x NCH₂), 2,44 (s, 6H, 2 x CH₃), 0,96 (t, >7,4 Hz, 6H, 2 x NCH₂CH₃).

MS-EI m/z 456 [M⁺].

Příklad 57 (2-Pyrrolidin-l-ylethyl)amid 2,4-dimethyl-5-(2-oxo-5-fenyl-l,2-dihydroindol-3ylidenmethyl)-1 //-pyrrol-3 -karboxylové kyseliny

5-Fenyl-l,3-dihydroindol-2-on (0,04 g, 0,2 mmol) se kondenzuje s (2-pyrrolidin-1ylethyl)amidem 5-formyl-2,4-dimethyl-l //-pyrrol-3 -karboxylové kyseliny (0,04 g), čímž se získá požadovaná sloučenina ve formě žluto-oranžové pevné látky.

^lHNMR (300 MHz, DMSO-d₆) δ 13,65 (s, br, 1H, NH), 10,96 (br, 1H, NH), 8,15 (d, >1,0 Hz, 1H), 7,80 (s, 1H, H-vinyl), 7,71 (d, >7,2 Hz, 2H), 7,49 (t, >6,3 Hz, 1H, CONHCH₂), 7,41-7,46 (m, 3H), 7,31 (m, 1H), 6,95 (d, >7,8 Hz, 1H), 4,08 (m, 4H, 2 x NCH₂), 3,32 (m, 2H, NCH₂), 2,55 (t, >7,1 Hz, 2H, NCH₂), 2,47 (m, schovaný pod pikem DMSO), 2,43 (s, 6H, 2 x CH₃), 1,66 (m, 4H, 2 x CH₂).

MS-EI m/z 454 [M⁺].

Příklad 58 (3-Imidazol-l-ylpropyl)amid 2,4-dimethyl-5-(2-oxo-5-fenyl-l,2-dihydroindol-3ylidenmethyl)-1 //-pyrrol-3 -karboxylové kyseliny *· ·

140

5- Fenyl-l,3-dihydroindol-2-on (8 mg, 0,04 mmol) se kondenzuje s (3-imidazol-lylpropyl)amidem 5-formyl-2,4-dimethyl-lH-pyrrol-3-karboxylové kyseliny (10 mg), čímž se získá 10 mg (59%) požadované sloučeniny ve formě oranžové pevné látky.

¹HNMR (300 MHz, DMSO-dé) δ 13,67 (s, br, 1H, NH), 10,96 (br, 1H, NH), 8,16 (d, >1,2 Hz, 1H), 7,81 (s, 1H, H-vinyl), 7,65-7,72 (m, 4H), 7,44 (m, 3H), 7,31 (m, 1H, CONHCH₂), 7,21 (s, 1H, Ar-H), 4,02 (t, >6,5 Hz, 2H, NCH₂), 3,19 (q, J=6,5 Hz, 2H, CONHCH₂), 2,44 (s, 6H, 2 x CH₃), 1,93 (m, 2H, CH₂CH₂CH₂).

MS-EI m/z 465 [M⁺].

Příklad 59 (2-Diethylaminoethyl)amid 2,4-dimethyl-5-(2-oxo-6-fenyl-1,2-dihydroindol-3ylidenmethyl)-1 //-pyrrol-3 -karboxylové kyseliny

6- Fenyl-l,3-dihydroindol-2-on (0,08 g, 0,4 mmol) se kondenzuje s (2-diethylaminoethyl)amidem 5-formyl-2,4-dimethyl-17/-pyrrol-3-karboxylové kyseliny (0,1 g), čímž se získá 65 mg (38%) požadované sloučeniny ve formě žluté pevné látky. *HNMR (300 MHz, DMSO-dé) δ 13,61 (s, br, 1H, NH), 10,99 (br, 1H, NH), 7,86 (d, >7,8 Hz, 1H), 7,62-7,66 (m, 3H), 7,40-7,47 (m, 3H), 7,28-7,36 (m, 2H), 7,10 (d, >1,2 Hz, 1H), 3,26 (m, 2H, NCH₂), 2,46-2,55 (m, 6H, 3 x NCH₂), 2,44 (s, 3H, CH₃), 2,41 (s, 3H, CH₃), 0,97 (t, >7,2 Hz, 6H, 2 x NCH₂CH₃).

MS-EI m/z 456 [M⁺],

Příklad 60 (2-Pyrrolidin-l-ylethyl)amid 2,4-dimethyl-5-(2-oxo-6-fenyl-l,2-dihydroindol-3ylidenmethyl)-1 H-pyrrol-3-karboxylové kyseliny

6-Fenyl-l,3-dihydroindol-2-on (30 mg, 0,15 mmol) se kondenzuje s (2-pyrrolidinl-ylethyl)amidem 5-formyl-2,4-dimethyl-17/-pyrrol-3-karboxylové kyseliny (40 mg), čímž se získá 5,9 mg (8,5%) požadované sloučeniny ve formě žluto-oranžové pevné látky. 'HNMR (300 MHz, DMSO-dé) δ 13,60 (s, br, 1H, NH), 10,99 (br, 1H, NH), 7,86 (d, >7,8 Hz, 1H), 7,63-7,66 (m, 3H), 7,51 (m, 1H, CONHCH₂), 7,45 (m, 2H), 7,28-7,36 (m, 2H), 7,10 (d, >1,5 Hz, 1H), 3,31 (m, 6H, 3 xNCH₂), 2,55 (t, >6,6 Hz, 2H, NCH₂), 2,43 (s, 3H, CH₃), 2,40 (s, 3H, CH₃), 1,67 (m, 4H, 2 x CH₂).

141 • · • · · • · · · ♦ ···· · · • · · • · • · • · · • ···· • ·

MS-EI m/z 454 [M⁺],

Příklad 61 (3-Imidazol-l-ylpropyl)amid 2,4-dimethyl-5-(2-oxo-6-fenyl-l,2-dihydroindol-3ylidenmethyl)-1//-pyrrol-3-karboxylové kyseliny

6-Fenyl-l,3-dihydroindol-2-on (8 mg, 0,04 mmol) se kondenzuje s (3-imidazol-lylpropyl)amidem 5-formyl-2,4-dimethyl-l//-pyrrol-3-karboxylové kyseliny (10 mg), Čímž se získá 7,3 mg (43%) požadované sloučeniny ve formě oranžové pevné látky.

*HNMR (300 MHz, DMSO-dó) δ 13,62 (s, br, 1H, NH), 10,99 (br, 1H, NH), 7,86 (d, J=8,2 Hz, 1H), 7,62-7,70 (m, 5H), 7,45 (m, 2H), 7,35 (m, 1H), 7,30 (dd, >1,4 & 8,2 Hz, 1H), 7,21 (s, 1H), 7,10 (d, >1,4 Hz, 1H), 6,89 (s, 1H), 4,02 (t, >6,9 Hz, 2H, CH₂), 3,19 (m, 2H, NCH₂CH₂), 2,43 (s, 3H, CH₃), 2,41 (s, 3H, CH₃), 1,93 (t, >6,9 Hz, 2H, NCH₂).

MS-EI m/z 465 [M⁺],

Příklad 62 (2-Diethylaminoethyl)amid 5-[6-(3,5-dichlorfenyl)-2-oxo-l,2-dihydroindol-3ylidenmethyl]-2,4-dimethyl-1//-pyrrol-3-karboxylové kyseliny

6-(3,5-Dichlorfenyl)-l,3-dihydroindol-2-on (64 mg, 0,23 mmol) se kondenzuje s (2-diethylaminoethyl)amidem 5-formyl-2,4-dimethyl-l//-pyrrol-3-karboxylové kyseliny (60 mg), čímž se získá 53 mg (44%) požadované sloučeniny ve formě světle hnědé pevné látky.

*HNMR (360 MHz, DMSO-d₆) δ 13,62 (s, br, 1H, NH), 10,99 (s, 1H, NH), 7,89 (d, >7,9 Hz, 1H, H-4), 7,69-7,71 (m, 3H), 7,55 (m, 1H, CONHCH₂), 7,37 (m, 2H), 7,14 (d, >1,4 Hz, 1H, H-7), 3,27 (m, 2H, NCH₂), 2,48-2,58 (m, 6H, 3 x NCH₂), 2,45 (s, 3H, CH₃), 2,42 (s, 3H, CH₃), 0,97 (t, >6,8 Hz, 6H, 3 x NCH₂CH₃).

MS m/z 526,9 [M⁺+l].

Příklad 63 (2-Diethylaminoethyl)amid 2,4-dimethyl-5-(2-oxo-6-pyridin-3-yl-l,2-dihydroindol-3ylidenmethyl)-1 //-pyrrol-3 -karboxylové kyseliny φφ φφ • · φ • · • φ ·· φ φφ φ • · φ « φ • φ φ φ φφφ φ φφφφ φ φ φ φφφ • · φφφ φφ φ φφ φ

142

6-Pyridin-3-yl-l,3-dihydroindol-2-on (40 mg, 0,19 mmol) se kondenzuje s (2-diethylaminoethyl)amidem 5-formyl-2,4-dimethyl- lA-pyrrol-3 -karboxylové kyseliny (50 mg), čímž se získá 29 mg (33%) požadované sloučeniny ve formě světle oranžové pevné látky.

*HNMR (300 MHz, DMSO-d₆) δ 13,62 (s, br, 1H, NH), 11,05 (s, br, 1H, NH), 8,86 (s, br, 1H), 8,53 (d, >5,8 Hz, 1H), 8,04 (m, 1H), 7,91 (d, >8,1 Hz, 1H), 7,70 (s, 1H, H-vinyl), 7,40-7,48 (m, 2H), 7,35 (d, >7,5 Hz, 1H), 7,14 (s, 1H), 3,26 (m, 2H, NCH₂), 2,48-2,55 (m, 3 x NCH₂), 2,42 (s, 3H, CH₃), 2,38 (s, 3H, CH₃), 0,96 (t, >6,9 Hz, 6H, 2 x NCH₂CH₃). MS-EI m/z 457 [M⁺]·

Příklad 64 (2-Pyrrolidin-l-ylethyl)amid 2,4-dimethyl-5-(2-oxo-6-pyridin-3-yl-l,2-dihydroindol-3ylidenmethyl)-1 Tf-pyrrol-3 -karboxylové kyseliny

6-Pyridin-3-yl-l,3-dihydroindol-2-on (60 mg, 0,28 mmol) se kondenzuje s (2-pyrrolidin-l-ylethyl)amidem 5-formyl-2,4-dimethyl-177-pyrrol-3-karboxylové kyseliny (75 mg), čímž se získá 90 mg (71%) požadované sloučeniny ve formě světle oranžové pevné látky.

'HNMR (300 MHz, DMSO-dé) δ 13,61 (s, br, 1H, NH), 11,05 (s, br, 1H, NH), 8,86 (d, >1,5 Hz, 1H), 8,54 (dd, >1,5 & 4,8 Hz, 1H), 8,05 (m, 1H), 7,91 (d, >7,8 Hz, 1H), 7,70 (s, 1H, H-vinyl), 7,44-7,53 (m, 2H), 7,36 (dd, >1,5 & 8,1 Hz, 1H), 7,15 (d, >1,2 Hz, 1H), 3,33 (m, 2H, NCH₂), 2,47-2,57 (m, 6H, 3 x NCH₂), 2,43 (s, 3H, CH₃), 2,41 (s, 3H, CH₃), 1,67 (m, 4H, 2 x CH₂).

MS-EI m/z 455 [M⁺].

Příklad 65 (3-Dimethylaminopropyl)amid 2,4-dimethyl-5-(2-oxo-6-pyridin-3-yl-l,2-dihydroindol-3ylidenmethyl)-177-pyrrol-3 -karboxylové kyseliny

6-Pyridin-3-yl-l,3-dihydroindol-2-on (42 mg, 0,2 mmol) se kondenzuje s (3-dimethylaminopropyl)amidem 5-formyl-2,4-dimethyl-17f-pyrrol-3-karboxylové kyseliny (50 mg), čímž se získá 67 mg (75%) požadované sloučeniny ve formě žluto-hnědé pevné látky.

• · ·· · · ·· * · · · v · • · · · · • · · · · · · • ···· · · · ··· • · · · · ·· · ·· «

143 ‘HNMR (360 MHz, DMSO-d_ó) δ 13,61 (s, br, 1H, NH), 11,00 (s, br, 1H, NH), 8,86 (s, br, 1H), 8,54 (s, br, 1H), 8,04 (m, 1H), 7,90 (d, J=8,0 Hz, 1H), 7,69 (s, 1H, H-vinyl), 7,63 (m, 1H), 7,45-7,48 (m, 1H), 7,35 (dd, J=l,7 & 8,0 Hz, 1H), 7,15 (d, J=l,7 Hz, 1H), 3,21-3,27 (m, 2H, NCH₂), 2,43 (s, 3H, CH₃), 2,41 (s, 3H, CH₃), 2,28 (m, 2H, NCH₂), 2,14 (s, 6H, 2 x NCH₃), 1,64 (m, 2H, CH₂).

MS-EI m/z 443 [M⁺].

Příklad 66 (3-Dimethylaminopropyl)amid 2,4-dimethyl-5-(2-oxo-5-fenyl-l,2-dihydroindol-3ylidenmethyl)-1 //-pyrrol-3-karboxylové kyseliny

5-Fenyl-l,3-dihydroindol-2-on (67 mg, 0,32 mmol) se kondenzuje s (3-dimethylaminopropyl)amidem 5-formyl-2,4-dimethyl-l//-pyrrol-3-karboxylové kyseliny (81 mg), čímž se získá 40 mg (28%) požadované sloučeniny ve formě oranžové pevné látky.

'HNMR (360 MHz, DMSO-d₆) δ 13,66 (s, br, 1H, NH), 10,92 (s, br, 1H, NH), 8,14 (s, 1H), 7,79 (s, 1H), 7,71 (m, 2H), 7,62 (m, 1H), 7,44 (m, 3H), 7,32 (m, 1H), 6,95 (m, 1H), 3,33 (m, 2H, NCH₂), 2,43 (s, 6H, 2 x CH₃), 2,27 (m, 2H, NCH₂), 2,13 (s, 6H, 2 x NCH₃), 1,63 (m, 2H, CH₂).

MS-EI m/z 442 [M⁺].

Příklad 67 (3-Diethylaminopropyl)amid 2,4-dimethyl-5-(2-oxo-5-fenyl-l,2-dihydroindol-3ylidenmethyl)-l//-pyrrol-3-karboxylové kyseliny

5-Fenyl-l,3-dihydroindol-2-on (1,5 g, 7,16 mmol) se kondenzuje s (3-diethylaminopropyl)amidem 5-formyl-2,4-dimethyl-l//-pyrrol-3-karboxylové kyseliny (2 g), čímž se získá 1,3 g (40%) požadované sloučeniny ve formě žluto-oranžové pevné látky.

'HNMR (360 MHz, DMSO-d₆) δ 13,64 (s, 1H, NH), 10,91 (s, 1H, NH), 8,14 (d, J=1,4 Hz, 1H, ArH), 7,8 (s, 1H, ArH), 7,7 (dd, J=l,2 a 8,5 Hz, 2H, ArH), 7,6 (t, J=5,3 Hz, 1H, CONHCH₂), 7,4(m, 3H, ArH), 7,3 (t, J=7,4 Hz, 1H, ArH), 6,9 (d, J=8,0 Hz, 1H, ArH), 3,2 »9 » 9 9 « • 9 «

9 9

9« «999 99

9 β · · • · · · • · 9 999

9 9 *

144 (m, 2Η, CONHCH2), 2,5 (m, 12H, 3 x NCH₂ a 2 x CH₃), 1,61 (m, 2H, CH₂CH₂CH₂), 0,93 (t, J=6,7 Hz, 6H, NCH₂CH₃).

MS-EI m/z 470 [M⁺],

Příklad 68 (3-Diethylaminopropyl)amid 2,4-dimethyl-5-(2-oxo-6-fenyl-l,2-dihydroindol-3ylidenmethyl)-l//-pyrrol-3-karboxylové kyseliny

6-Fenyl-l,3-dihydroindol-2-on (1,5 g, 7,16 mmol) se kondenzuje s (3-diethylaminopropyl)amidem 5-formyl-2,4-dimethyl-l//-pyrrol-3-karboxylové kyseliny (2 g), čímž se získá 1,9 g (57%) požadované sloučeniny ve formě oranžové pevné látky.

¹HNMR (360 MHz, DMSO-d₆) δ 13,58 (s, 1H, NH), 10,94 (s, 1H, NH), 7,8 (d, >7,9 Hz,

1H, ArH), 7,6 (m, 4H, ArH), 7,4 (t, J=7,5 Hz, 2H, ArH), 7,3 (m, 2H), 7,1 (d, J=l,4 Hz, 1H,

ArH), 3,2 (m, 2H, CONHCH₂), 2,5 (m, 12H, 3 x NCH₂ a 2 x CH₃), 1,61 (m, 2H,

CH₂CH₂CH₂), 0,93 (t, J=6,7 Hz, 6H, NCH₂CH₃).

MS-EI m/z 470 [M⁺].

Příklad 69 (3-Chlor-4-methoxyfenyl)amid 3-[4-(3-diethylaminopropylkarbamoyl)-3,5-dimethyl-l//pyrrol-2-ylmethylen]-2-oxo-2,3-dihydro-l//-indol-4-karboxylové kyseliny (3-Chlor-4-methoxyfenyl)amid 2-oxo-2,3-dihydro-l//-indol-4-karboxylové kyseliny (1 g, 3,16 mmol) se kondenzuje s (3-diethylaminopropyl)amidem 5-formyl-2,4dimethyl-1//-pyrrol-3-karboxylové kyseliny (1 g, 3,58 mmol), čímž se získá 1,7 g (85%) požadované sloučeniny ve formě žluto-oranžové pevné látky.

MS-EI m/z 578,2 [M⁺],

Příklad 70 (3-Diethylamino-propyl)amid 5-(5-brom-2-oxo-l,2-dihydroindol-3-ylidenmethyl)-2,4dimethyl-1 //-pyrrol-3 -karboxylové kyseliny

5-Brom-l,3-dihydroindol-2-on (0,5 g, 2,36 mmol) se kondenzuje s (3-diethylaminopropyl)amidem 5-formyl-2,4-dimethyl-l//-pyrrol-3-karboxylové kyseliny • φ · · • · φ φ φ φ φ • φ φ

ΦΦΦΦ φφ φφ φ φ · φ φ φφφ φ « ΦΦΦΦ φφφ φφ φ φφ φ φ » φ φ φφφ φ φ φ φφφ • φ φ φφ φ

145 (0,51 g), čímž se získá 0,84 g požadované sloučeniny ve formě červeno-oranžové pevné látky.

’HNMR (360 MHz, DMSO-d₆) δ 13,61 (s, 1H, NH), 10,99 (s, 1H, NH), 8,09 (d, J=, 1,8 Hz, 1H, ArH), 7,7 (m, 4H), 7,2 (dd, J=1,8 a 8,3 Hz, 2H, ArH), 6,8 (d, J=7,8 Hz, 1H, ArH), 3,3 (br s, 4H, 2 x NCH₂), 3,2 (m, 2H, CONHCH₂), 2,6 (br s, 2H, NCH₂ a 2 x CH₃), 2,4 (s, 6H, 2 x CH₃), 1,66 (m, 2H, CH₂CH₂CH₂), 0,98 (t, J=7,l Hz, 6H, NCH₂CH₃).

MS-EI m/z 472 a 474 [M⁺-l a M⁺+l],

Příklad 71 (2-Diethylamino-ethyl)amid 5-(5-brom-2-oxo-1,2-dihydroindol-3-ylidenmethyl)-2,4diizopropy 1-1 //-pyrrol-3 -karboxylové kyseliny

5-Brom-l,3-dihydroindol-2-on (100 mg, 0,47 mmol) se kondenzuje s (2-diethylaminoethyl)amidem 5-formyl-2,4-diizopropyl-l//-pyrrol-3-karboxylové kyseliny (150 mg), čímž se získá 0,15 g (62%) požadované sloučeniny ve formě žluto-oranžové pevné látky.

¹HNMR (300 MHz, DMSO-dg) δ 13,97 (s, 1H, NH), 10,95 (s, 1H, NH), 8,09 (d, J=l,3 Hz, 1H, ArH), 7,84 (m, 1H), 7,79 (s, 1H), 7,23 (dd, J=l,3 a 8,1 Hz, 1H, ArH), 6,8 (d, J=8,l Hz, 1H, ArH), 3,5 (m, 1H, CH), 3,3 (m, 3H, CH aNHCH₂), 2,5 (br m, 6H, 3 x NCH₂), 1,28 (d, J=6,9 Hz, 6H, 2 x CH₃), 1,23 (d, J=6,6 Hz, 6H, 2 x CH₃), 0,96 (m, 6H, 2 x CH₂CH₃).

MS-EI m/z 514 a 516 [M⁺-l aM⁺+l],

Příklad 72 (3-Diethylamino-propyl)amid 5-(5-brom-2-oxo-l,2-dihydroindol-3-ylidenmethyl)-2,4diizopropyl-1 //-pyrrol-3 -karboxylové kyseliny

5-Brom-l,3-dihydroindol-2-on (90 mg, 0,42 mmol) se kondenzuje s (3-diethylaminopropyl)amidem 5-formyl-2,4-diizopropyl-l//-pyrrol-3-karboxylové kyseliny (140 mg), čímž se získá 54 mg (25%) požadované sloučeniny ve formě červenohnědé pevné látky.

'HNMR (300 MHz, DMSO-de) δ 13,98 (s, 1H, NH), 10,96 (s, 1H, NH), 8,09 (d, J=1,7 Hz, 2H), 7,78 (s, 1H, H-vinyl), 7,23 (dd, J=l,7 a 8,1 Hz, 1H, ArH), 6,82 (d, J=8,l Hz, 1H, ArH), 3,5 (m, 1H, CH), 3,25 (m, 2H, NHCH₂), 3,15 (m, 1H, CH), 2,7 (br s, 6H, 3 xNCH₂), ·· ·· • · · • · • · • · · • · · · · ·

146

1,7 (br m, 2H, CH₂CH₂CH₂), 1,28 (d, >6,9 Hz, 6H, 2 x CH₃), 1,24 (d, >5,9 Hz, 6H, 2 x CH₃), 1,06 (m, 6H, 2 x CH₂CH₃).

MS-EI m/z 528 a 530 [M⁺-l a M⁺+l],

Příklad 73 (3-Pyrrolidin-1 -ylpropyl)amid 5-(5-brom-2-oxo-1,2-dihydroindol-3-ylidenmethyl)-2,4diizopropyl-1 V-pyrrol-3 -karboxylové kyseliny

5-Brom-l,3-dihydroindol-2-on (130 mg, 0,6 mmol) se kondenzuje s (3-pyrrolidinl-ylpropyl)amidem 5-formyl-2,4-diizopropyl-177-pyrrol-3-karboxylové kyseliny (150 mg, 0,45 mmol), čímž se získá 36 mg (15%) požadované sloučeniny ve formě světle hnědooranžové pevné látky.

’HNMR (300 MHz, DMSO-de) δ 13,98 (s, 1H, NH), 10,97 (s, 1H, NH), 8,10 (d, >1,6 Hz, 2H), 7,78 (s, 1H, H-vinyl), 7,23 (dd, >1,6 a 7,6 Hz, 1H, ArH), 6,82 (d, >7,6 Hz, 1H, ArH), 3,5 (m, 1H, CH), 3,25 (m, 2H, NHCH₂),3,15 (m, 1H, CH), 2,7 (br s, 6H, 3 x NCH₂), 1,7 (br m, 6H, 3 x NCH₂CH₂), 1,28 (d, >5,6 Hz, 6H, 2 x CH₃), 1,24 (d, >5,7 Hz, 6H, 2 x CH_?).

MS-EI m/z 526 a 528 [M⁺-l a M⁺+lj.

Příklad 74 (Pyridin-4-ylmethyl)-amid 5-(5-brom-2-oxo-1,2-dihydroindol-3-ylidenmethyl)-2,4dimethyl- lV-pyrrol-3 -karboxylové kyseliny

5-Brom-l,3-dihydroindol-2-on (170 mg, 0,8 mmol) se kondenzuje s (pyridin-4ylmethyl)amidem 5-formyl-2,4-dimethyl-177-pyrrol-3-karboxylové kyseliny (200 mg), čímž se získá 14 mg (4%) požadované sloučeniny ve formě žluté pevné látky.

¹HNMR (300 MHz, DMSO-d₆) δ 13,67 (s, 1H, NH), 11,01 (s, br, 1H, NH), 8,51 (dd, >1,6 & 4,3 Hz, 2H), 8,23 (t, >6,0 Hz, 1H, CONHCH₂), 8,11 (d, >1,9 Hz, 1H), 7,78 (s, 1H, Hvinyl), 7,31 (d, >6,0 Hz, 2H), 7,25 (dd, >1,9 & 8,1 Hz, 1H), 6,82 (d, >8,1 Hz, 1H), 4,45 (d, >6,0 Hz, 2H, NCH₂), 2,46 (s, 6H, 2 x CH₃).

MS-EI m/z 450 a 452 [M⁺-l a M⁺+l], • · · · · ·

147

Příklad 75 (2-Pyrrolidin-1 -ylethyl)amid 5-[6-(4-butylfenyl)-2-oxo-1,2-dihydroindol-3-ylidenmethyl]2.4- dimethyl-l//-pyrrol-3-karboxylové kyseliny

5- [6-(4-Butylfenyl)]-l,3-dihydroindol-2-on (50 mg, 0,19 mmol) se kondenzuje s (2-pyrrolidin-l-ylethyl)amidem 5-formyl-2,4-dimethyl-l//-pyrrol-3-karboxylové kyseliny (50 mg), čímž se získá 74 mg (76%) požadované sloučeniny ve formě oranžové pevné látky.

¹HNMR (360 MHz, DMSO-d₆) δ 13,58 (s, 1H, NH), 10,93 (s, br, 1H, NH), 7,82 (d, J=7,9 Hz, 1H), 7,63 (s, 1H, H-vinyl), 7,54 (d, >7,9 Hz, 2H), 7,46 (m, 1H, CONH), 7,26 (m, 3H), 7,09 (s, 1H), 3,30 (m, 2H, CH₂), 2,52-2,63 (m, 4H, 2 x CH₂), 2,49 (m, 4H, 2 x CH₂), 2,43 (s, 3H, CH₃), 2,40 (s, 3H, CH₃), 1,68 (m, 4H, 2 x CH₂), 1,58 (m, 2H, CH₂), 1,34 (m, 2H, CH₂), 0,91 (t, >7,2 Hz, 3H, CH₂CH₃).

MS-EI m/z 510 [M⁺],

Příklad 76 (2-Pyrrolidin-l-ylethyl)-amid 5-[6-(5-izopropyl-2-methoxyfenyl)-2-oxo-l,2-dihydroindol3-ylidenmethyl]-2,4-dimethyl-l//-pyrrol-3-karboxylové kyseliny

6- (5-Izopropyl-2-methoxyfenyl)-l,3-dihydroindol-2-on (50 mg, 0,17 mmol) se kondenzuje s (2-pyrrolidin-l-yl-ethyl)amidem 5-formyl-2,4-dimethyl-l//-pyrrol-3karboxylové kyseliny (45 mg), čímž se získá 67 mg (75%) požadované sloučeniny ve formě oranžové pevné látky.

^!HNMR (360 MHz, DMSO-d₆) δ 13,60 (s, 1H, NH), 10,82 (s, br, 1H, NH), 7,77 (d, >7,9 Hz, 1H), 7,61 (s, 1H, H-vinyl), 7,45 (m, 1H, CONH), 7,0-7,19 (m, 5H), 3,73 (s, 3H, OCH₃), 3,32 (m, 2H, CH₂), 2,87 (m, 1H, CH(CH₃)₂), 2,56 (m, 2H, CH₂), 2,48 (m, 4H, 2 x CH₂), 2,43 (s, 3H, CH₃), 2,40 (s, 3H, CH₃), 1,68 (m, 4H, 2 x CH₂), 1,21 (d, >6,8 Hz, 6H, CH(CH₃)₂).

MS m/z 527,2 [M⁺+l].

Příklad 77 (2-Pyrrolidin-1 -ylethyl)amid 5- [6-(4-ethylfenyl)-2-oxo-1,2-dihydroindol-3 -ylidenmethyl]2.4- dimethyl-1 //-pyrrol-3 -karboxylové kyseliny

4 ·

• · 4 • 4 4 4 4

148

6-(4-Ethylfenyl)-l,3-dihydroindol-2-on (45 mg, 0,19 mmol) se kondenzuje s (2pyrrolidin-l-ylethyl)amidem 5-formyl-2,4-dimethyl-l//-pyrrol-3-karboxylové kyseliny (50 mg), čímž se získá 60 mg (65%) požadované sloučeniny ve formě žluto-oranžové pevné látky.

'HNMR (300 MHz, DMSO-d₆) δ 13,59 (s, 1H, NH), 10,96 (s, br, 1H, NH), 7,83 (d, J=8,4 Hz, 1H), 7,64 (s, 1H, H-vinyl), 7,51-7,56 (m, 3H), 7,25-7,30 (m, 3H), 7,08 (d, J=1 Hz, 1H), 3,31 (m, 2H, CH₂), 2,63 (m, 2H, CH₂CH₃), 2,55 (m, 2H, CH₂), 2,49 (m, 4H, 2 x CH₂), 2,42 (s, 3H, CH₃), 2,40 (s, 3H, CH₃), 1,67 (m, 4H, 2 x CH₂), 1,20 (t, J=7,5 Hz, 3H, CH₂CH₃).

MS-EI m/z 482 [M⁺],

Příklad 78 (2-Pyrrolidin-l-ylethyl)amid 5-[6-(2,4-dimethoxyfenyl)-2-oxo-l,2-dihydroindol-3ylidenmethyl] -2,4-dimethyl-1 //-pyrrol-3 -karboxylové kyseliny

6-(2,4-Dimethoxyfenyl)-l,3-dihydroindol-2-on (51 mg, 0,19 mmol) se kondenzuje s (2-pyrrolidin-1 -ylethyl)amidem 5-formyl-2,4-dimethyl-1 //-pyrrol-3 -karboxylové kyseliny (50 mg), čímž se získá 30 mg (31%) požadované sloučeniny ve formě oranžové pevné látky.

¹HNMR (300 MHz, DMSO-d₆) δ 13,59 (s, 1H, NH), 10,86 (s, br, 1H, NH), 7,75 (d, J=7,8 Hz, 1H), 7,60 (s, 1H, H-vinyl), 749 (m, 1H, CONH), 7,22 (d, J=8,4 Hz, 1H), 7,03 (m, 1H), 6,97 (s, 1H), 6,58-6,65 (m, 2H), 3,79 (s, 3H, OCH₃), 3,76 (s, 3H, OCH₃), 3,33 (m, 2H, CH₂), 2,55 (m, 2H, CH₂), 2,50 (m, 4H, 2 x CH₂), 2,42 (s, 3H, CH₃), 2,39 (s, 3H, CH₃), 1,67 (m, 4H, 2 x CH₂).

MS-EI m/z 514 [M⁺].

Příklad 79 (2-Pyrrolidin-l-ylethyl)amid 5-[6-(3-izopropylfenyl)-2-oxo-l,2-dihydroindol-3ylidenmethyl]-2, -4-dimethyl-l //-pyrrol-3 -karboxylové kyseliny

6-(3-Izopropylfenyl)-l,3-dihydroindol-2-on (48 mg, 0,19 mmol) se kondenzuje s (2-pyrrolidin-l-ylethyl)amidem 5-formyl-2,4-dimethyl-l//-pyrrol-3-karboxylové kyseliny • · · * ···· ·

149 (50 mg), čímž se získá 59 mg (63%) požadované sloučeniny ve formě oranžové pevné látky.

‘HNMR (300 MHz, DMSO-de) δ 13,63 (s, 1H, NH), 10,97 (s, br, 1H, NH), 7,87 (d, J=7,8 Hz, 1H), 7,68 (s, 1H, H-vinyl), 7,24-7,55 (m, 6H), 7,13 (s, 1H), 3,34 (m, 2H, CH₂), 3,30 (m, 1H, CH(CH₃)₂), 2,60 (m, 2H, CH₂), 2,50 (m, 4H, 2 x CH₂), 2,45 (s, 3H, CH₃), 2,43 (s, 3H, CH₃), 1,70 (m, 4H, 2 x CH₂), 1,27 (d, >6,9 Hz, 6H, CH(CH₃)₂).

MS-EI m/z 496 [M⁺],

Příklad 80 (2-Diethylamino-ethyl)amid 5-(5-fluor-2-oxo-l,2-dihydroindol-3-ylidenmethyl)-2,4dimethyl- lH-pyrrol-3-karboxylové kyseliny

5-Fluor-l,3-dihydroindol-2-on (0,54 g, 3,8 mmol) se kondenzuje s (2-diethylaminoethyl)amidem 5-formyl-2,4-dimethyl-17/-pyrrol-3 -karboxylové kyseliny, čímž se získá 0,83 g (55%) požadované sloučeniny ve formě žluto-zelené pevné látky. ‘HNMR (360 MHz, DMSO-d₆) δ 13,66 (s, 1H, NH), 10,83 (s, br, 1H, NH), 7,73 (dd, >2,5 & 9,4 Hz, 1H), 7,69 (s, 1H, H-vinyl), 7,37 (t, 1H, CONHCH₂CH₂), 6,91 (m, 1H), 6,81-6,85 (m, 1H), 3,27 (m, 2H, CH₂), 2,51 (m, 6H, 3 x CH₂), 2,43 (s, 3H, CH₃), 2,41 (s, 3H, CH₃), 0,96 (t, >6,9 Hz, 6H, N(CH₂CH₃)₂).

MS-EI m/z 398 [M⁺],

Příklad 80 (Alternativní syntézy) (2-Diethylamino-ethyl)-amid 5-[5-fluor-2-oxo-l,2-dihydro-indol-(3Z)-ylidenmethyl]-2,4dimethyl-1 //-pyrrol-3 -karboxylové kyseliny

Hydrazin-hydrát (55%, 3000 ml) a 5-fluoroisatin (300 g) se zahřívají na teplotu 100°C. V průběhu 120 minut se za míchání po částech přidá další 5-fluoroisatin (500 g) (100 g). Směs se zahřívá na teplotu 110° C a míchá po dobu 4 hodin. Směs se ochladí na pokojovou teplotu a pevné podíly spojí vakuovou filtrací, čímž se získá surový hydrazid (2-amino-5-fluor-fenyl)-octové kyseliny (748 g). Hydrazid se suspenduje ve vodě (700 ml) a pH směsi se upraví na < pH 3 pomocí 12 N kyseliny chlorovodíkové. Směs se míchá po dobu 12 hodin při pokojové teplotě. Pevné podíly se spojí vakuovou filtrací a promyjí .**..··. ·· .

.· · :·: ::····: ::.: ........ : ·..· ;

150 dvakrát vodou. Produkt se suší za vakua, čímž se získá 5-fluor-l,3-dihydro-indol-2-on (600 g, 73% výtěžek) ve formě hnědého prášku.

*H-NMR (dimethylsulfoxid-dó) δ 3,46 (s, 2H, CH₂), 6,75, 6,95, 7,05 (3 x m, 3H, aromatické), 10,35 (s, 1H, NH). MS m/z 152 [M+l].

2-7erc-butylester 4-ethylester 3,5-dimethyl-l//-pyrrol-2,4-dikarboxylové kyseliny (2600 g) a ethanol (7800 ml) se intenzivně míchají a opatrně se přidává 10 N kyselina chlorovodíková (3650 ml). Teplota se zvýší z 25° C na 35° C, čímž dojde k uvolňování plynu. Směs se ohřeje na teplotu 54°C a míchá za dalšího zahřívání po dobu jedné hodiny na teplotu 67° C. Směs se ochladí na teplotu 5° C a za míchání se pomalu přidá 32 litrů ledu a vody. Pevný podíl se spojí vakuovou filtrací a promyje 3x vodou. Pevný podíl se suší na vzduchu do konstantní hmotnosti, čímž se získá ethylester 2,4-dimethyl- 177-pyrrol3-karboxylové kyseliny (1418 g, 87% výtěžek) ve formě narůžovělé pevné látky.

'H-NMR (dimethylsulfoxid-dé) δ 2,10, 2,35 (2 x s, 2 x 3H, 2 x CH₃), 4,13 (q, 2H, CH₂), 6,37 (s, 1H, CH), 10,85 (s, 1H, NH). MS m/z 167 [M+l].

Dimethylformamid (322 g) a dichlormethan (3700 ml) se ochladí v ledové lázni na teplotu 4° C, za míchání se přidá a oxychlorid fosforečný (684 g). Pomalu se v průběhu 15 minut a v alikvótních podílech přidá ethylester 2,4-dimethyl-l//-pyrrol-3-karboxylové kyseliny (670 g), přičemž maximální dosažená teplota je 18° C. Směs se zahřívá k refluxu po dobu jedné hodiny, ochladí na teplotu 10° C v ledové lázni a za intenzivního míchání se ihned přidá 1,6 litrů vody. Teplota se zvýší na 15° C a za intenzivního míchání se přidá 10 N kyselina chlorovodíková (1,6 litrů). Teplota se zvýší na 22° C. Směs se nechá stát po dobu 30 minut a vrstvy se separují. Maximální dosažená teplota byla 40° C. Hodnota pH vodné vrstvy se upraví na 12-13 pomocí 10 N hydroxidu draselného (3,8 litrů) takovým způsobem, aby teplota během přidávání nepřesáhla 55° C. Po přidání se směs ochladí 10° C a míchá po dobu 1 hodiny. Pevný podíl se spojí vakuovou filtrací a promyje 4 x vodou, čímž se získá ethylester 5-formy 1-2,4-dimethy 1-1//-pyrrol-3-karboxylové kyseliny (778 g, 100% výtěžek) ve formě žluté pevné látky.

’H NMR (DMSO-d₆) δ 1,25 (t, 3H, CH₃), 2,44, 2,48 (2 x s, 2 x 3H, 2 x CH₃), 4,16 (q, 2H, CH₂), 9,59 (s, 1H, CHO), 12,15 (br s, 1H, NH), MS m/z 195 [M+l],

Ethylester 5-formyl-2,4-dimethyl-l//-pyrrol-3-karboxylové kyseliny (806 g), hydroxid draselný (548 g), voda (2400 ml) a methanol (300 ml) se refluxují po dobu dvou hodin za míchání a pak ochladí na teplotu 8° C. Směs se extrahuje dvakrát dichlormethanem. Vodná vrstva se upraví na pH 4 1000 ml 10 N kyseliny chlorovodíkové, ·· ·· * · · * · · · • · · · · · · • · · • · · • · · • · · • · · · • · ♦ · ♦ · • · · ·· ·

151 přičemž teplota se udržuje pod 15° C. K usnadnění míchání se přidá voda. Pevný podíl se spojí vakuovou filtrací, promyje 3x vodou a suší za vakua při teplotě 50° C, čímž se získá 5-formyl-2,4-dimethyl-l//-pyrrol-3-karboxylová kyselina (645 g, 93,5% výtěžek) ve formě žluté pevné látky.

*H NMR (DMSO-de) δ 2,40, 2,43 (2 x s, 2 x 3H, 2 x CH₃), 9,57 (s, 1H, CHO), 12,07 (br s, 2H, NH+COOH), MS m/z 168 [M+l].

5-Formyl-2,4-dimethyl-l//-pyrrol-3-karboxylová kyselina (1204 g) a 6020 ml dimethylformamidu se míchají při pokojové teplotě, přičemž se přidávají hydrochlorid 1(3-dimethyl-aminopropyl-3-ethylkarbodiimidu (2071 g), hydroxybenzotriazol (1460 g), triethylamin (2016 ml) a diethylethylendiamin (1215 ml). Směs se míchá po dobu 20 hodin při pokojové teplotě. Směs se zředí 3000 ml vody, 2000 ml solanky a 3000 ml nasyceného roztoku hydrogenuhličitanu sodného a pH se upraví na > 10 pomocí 10 N hydroxidu sodného. Směs se extrahuje dvakrát 5000 ml (pokaždé) 10% methanolu v dichlormethanu a extrakty se spojí, suší nad bezvodým síranem hořečnatým a zahušťují do sucha. Směs se zředí 1950 ml toluenu a znovu zahušťuje do sucha. Zbytek se trituruje směsí hexan:diethylether (4000 ml) (3:1). Pevné podíly se spojí vakuovou filtrací, promyjí dvakrát 400 ml ethylacetátu a suší za vakua při teplotě 34° C po dobu 21 hodin, čímž se získá (2-diethylamino-ethyl)-amid 5-formyl-2,4-dimethyl-l//-pyrrol-3-karboxylové kyseliny (819 g, 43% výtěžek) ve formě světle hnědé pevné látky.

'H-NMR (dimethylsulfoxid-de) δ 0,96 (t, 6H, 2 x CH₃), 2,31, 2,38 (2 x s, 2 x CH₃), 2,51 (m, 6H 3 x CH₂), 3,28 (m, 2H, CH₂), 7,34 (m, 1H, amidNH), 9,56 (s, 1H, CHO), 11,86 (s, 1H, pyrrol NH).

MS m/z 266 [M+l].

(2-Diethylaminoethyl)-amid 5-formyl-2,4-dimethyl-l//-pyrrol-3-karboxylové kyseliny (809 g), 5-fluor-l,3-dihydro-indol-2-on (438 g), ethanol (8000 ml) a pyrrolidin (13 ml) se zahřívají při teplotě 78° C po dobu 3 hodin. Směs se ochladí na pokojovou teplotu a pevné podíly se spojí vakuovou filtrací a promyjí ethanolem. Pevné podíly se smíchají s ethanolem (5900 ml) při teplotě 72° C po dobu 30 minut. Směs se ochladí na pokojovou teplotu, pevné podíly se spojí vakuovou filtrací, promyjí ethanolem a suší za vakua při teplotě 54° C dalších 130 hodin, čímž se získá (2-diethylamino-ethyl)-amid 5-[5fluor-2-oxo-1,2-dihydro-indol-(3Z)-ylidenmethyl]-2,4-dimethyl-1 //-pyrrol-3-karboxylové kyseliny (1013 g, 88% výtěžek) ve formě oranžové pevné látky.

152 ’Η-NMR (dimethylsulfoxid-d₆) δ 0,98 (t, 6H, 2 x CH₃), 2,43, 2,44 (2 x s, 6H, 2 x CH₃), 2,50 (m, 6H, 3 x CH₂), 3,28 (q, 2H, CH₂), 6,84, 6,92, 7,42, 7,71, 7,50 (5 x m, 5H, aromatický, vinyl, CONH), 10,88 (s, 1H, CONH), 13,68 (s, 1H, pyrrolNH).

MS m/z 397 [M-l],

Příklad 81

-[4-(2-Diethylaminoethylkarbamoyl)-3,5-dimethyl-1 //-pyrrol-2-ylmethylen] -2-oxo-2,3 dihydro-1 //-indol-6-karboxy lová kyselina

2-Oxo-2,3-dihydro-l//-indol-6-karboxylová kyselina (80 mg, 0,45 mmol) se kondenzuje s (2-diethylaminoethyl)amidem 5-formyl-2,4-dimethyl-l//-pyrrol-3karboxylové kyseliny, čímž se získá 210 mg (92%) požadované sloučeniny ve formě žlutooranžové pevné látky.

’HNMR (360 MHz, DMSO-d₆) δ 13,6 (s, 1H, NH), 7,76 (d, J=8,0 Hz, 1H), 7,66 (s, 1H, Hvinyl), 7,57 (dd, >1,5 & 8,0 Hz, 1H), 7,40-7,42 (m, 2H), 3,28 (m, 2H, CH₂), 2,88 (m, Hpiperidin), 2,54 (m, 6H, 3 x CH₂), 2,44 (s, 3H, CH₃), 2,40 (s, 3H, CH₃), 1,56 (m, Hpiperidin), 0,97 (t, J=6,98 Hz, 6H, N(CH₂CH₃)₂).

MS m/z 424 [M⁺].

Příklad 82 (2-Pyrrolidin-1 -ylethyl)amid 5-(5-dimethylsulfamoyl-2-oxo-1,2-dihydroindol-3ylidenmethyl)-2,4-dimethyl-1//-pyrrol-3-karboxylové kyseliny

Dimethylamid 2-oxo-2,3-dihydro-l//-indol-5-sulfonové kyseliny (90 mg, 0,38 mmol) se kondenzuje s (2-pyrrolidin-l-ylethyl)amidem 5-formyl-2,4-dimethyl-l//-pyrrol3-karboxylové kyseliny (100 mg), čímž se získá 100 mg (54%) požadované sloučeniny ve formě žluté pevné látky.

‘HNMR (360 MHz, DMSO-d₆) δ 13,65 (s, 1H, NH), 11,30 (s, br, 1H, NH), 8,25 (d, 1H), 7,92 (s, 1H, H-vinyl), 7,48-7,53 (m, 2H), 7,07 (d, >8,2 Hz, 1H), 3,33 (m, 2H, CH₂), 2,61 (s, 6H, N(CH₃)₂), 2,56 (t, 2H, CH₂), 2,49 (m, 4H, 2 x CH₂), 2,45 (s, 3H, CH₃), 2,44 (s, 3H, CH₃), 1,67 (m, 4H, 2 x CH₂).

MS-EI m/z 485 [M⁺].

·· ·· • · « • · 9 ••99 99

9 9 9 9 • 9999

9

9 9 • 9··

153

Příklad 83 (2-Pyrrolidin-1 -ylethyl)amid 5 - [5 -(3 -chlorfenylsulfamoyl)-2-oxo-1,2-dihydroindol-3 ylidenmethyl] -2,4-dimethyl-1 //-pyrrol-3 -karboxylové kyseliny (3-Chlor-fenyl)amid 2-oxo-2,3-dihydro-l//-indol-5-sulfonové kyseliny (120 mg, 0,38 mmol) se kondenzuje s (2-pyrrolidin-l-ylethyl)amidem 5-formyl-2,4-dimethyl-l//pyrrol-3-karboxylové kyseliny (100 mg), čímž se získá 150 mg (69%) požadované sloučeniny ve formě žluto-oranžové pevné látky.

^!HNMR (360 MHz, DMSO-d₆) δ 13,55 (s, 1H, NH), 11,26 (br s, 1H, NH), 10,30 (br s,lH, NH), 8,26 (d, 1H), 7,79 (s, 1H, H-vinyl), 7,51-7,57 (m, 2H), 7,22 (t, >8,1 Hz, 1H), 7,15 (m, 1H), 7,07 (m, 1H), 7,0 (m, 2H), 3,44 (m, 2H, CH₂), 2,57 (t, >7,0 Hz, 2H, CH₂), 2,49 (m, 4H, 2 x CH₂), 2,44 (s, 3H, CH₃), 2,43 (s, 3H, CH₃), 1,68 (m, 4H, 2 x CH₂).

MS m/z 568 [M⁺],

Příklad 84 (2-Pyrrolidin-l-ylethyl)amid 2,4-dimethyl-5-[2-oxo-5-(pyridin-3-ylsulfamoyl)-l,2dihydroindol-3 -ylidenmethyl] -1 //-pyrrol-3 -karboxylové kyseliny

Pyridin-3-ylamid 2-oxo-2,3-dihydro-l//-indol-5-sulfonové kyseliny (110 mg, 0,38 mmol) se kondenzuje s (2-pyrrolidin-l-ylethyl)amidem 5-formyl-2,4-dimethyl-l//-pyrrol3-karboxylové kyseliny (100 mg), čímž se získá 150 mg (74%) požadované sloučeniny ve formě oranžové pevné látky.

'HNMR (360 MHz, DMSO-d₆) δ 13,58 (s, 1H, NH), 8,21 (d, >2,0 Hz, 2H), 8,04 (m, 1H), 7,76 (s, 1H, H-vinyl), 7,49-7,54 (m, 2H), 7,41 (m, 1H), 7,14 (m, 1H), 6,94 (d, >8,5 Hz, 1H), 3,33 (m, 2H, CH₂), 2,56 (t, >7,06 Hz, 2H, CH₂), 2,49 (m, 4H, 2 x CH₂), 2,43 (s, 6H, x CH₃), 1,68 (m, 4H, 2 x CH₂).

MS m/z 535 [M⁺],

Příklad 85

- [3,5 -Dimethyl-4-(4-methylpiperazin-1 -karbonyl)-1 //-pyrrol-2-ylmethylen] -4-(2hydroxyethyl)-1,3-dihydroindol-2-on • · ·· ♦♦ • · · • · • · • · ···· ·· • · · · • · ···· • · · ·· ·

154

4-(2-Hydroxyethyl)-l,3-dihydroindol-2-on (71 mg, 0,4 mmol) se kondenzuje s 3,5-dimethyl-4-(4-methyl-piperazin-1 -karbonyl)-1 //-pyrrol-2-karbaldehydem, čímž se získá 90 mg (55%) požadované sloučeniny ve formě oranžové pevné látky.

'HNMR (300 MHz, DMSO-d₆) δ 14,25(s, 1H, NH), 10,88 (s, 1H, NH), 7,57 (s, 1H, Hvinyl), 7,03 (m, 1H), 6,75-6,82 (m, 2H), 4,86 (m, 1H, OH), 3,70 (m, 2H, CH₂), 3,04 (m, 2H, CH₂), 2,48 (m, 4H, 2 x CH₂), 2,28 (br s, 7H), 2,19 (s, 3H, CH₃), 2,18 (s, 3H, CH₃).

MS m/z (+ve) 4,09,3 [M⁺],

Příklad 86

Fenylamid 3-[3,5-dimethyl-4-(4-methylpiperazin-l-karbonyl)-l//-pyrrol-2-ylmethylen]-2oxo-2,3-dihydro-l//-indol-5-sulfonové kyseliny

Fenylamid 2-oxo-2,3-dihydro-l//-indol-5-sulfonové kyseliny (110 mg, 0,4 mmol) se kondenzuje s 3,5-dimethyl-4-(4-methylpiperazin-l-karbonyl)-l//-pyrrol-2karbaldehydem (100 mg), čímž se získá 50 mg (24%) požadované sloučeniny ve formě žluté pevné látky.

'HNMR (300 MHz, DMSO-d₆) δ 13,52(s, 1H, NH), 11,26 (s, 1H, NH), 10,08 (s, 1H, NH), 8,21 (d, >1,6 Hz, 1H), 7,75 (s, 1H, H-vinyl), 7,50 (dd, >1,6 & 8,3 Hz, 1H), 7,19 (m, 2H), 7,10 (m, 2H), 6,97 (m, 2H), 2,49 (m, 4H, 2 x CH₂), 2,28 (m, 10H, 2 x CH₃ & 2 x CH₂), 2,18 (s,3H, CH₃).

MS-EI m/z 519 [M⁺].

Příklad 87 (2-Diethylaminoethyl)amid 5-(5-dimethylsulfamoyl-2-oxo-l,2-dihydroindol-3ylidenmethyl)-2,4-dimethyl-1//-pyrrol-3-karboxylové kyseliny

Dimethylamid 2-oxo-2,3-dihydro-l//-indol-5-sulfonové kyseliny (90 mg, 0,38 mmol) se kondenzuje s (2-diethylaminoethyl)amidem 5-formyl-2,4-dimethyl-l//-pyrrol-3karboxylové kyseliny (100 mg), čímž se získá 80 mg (43%) požadované sloučeniny ve formě žluté pevné látky.

'HNMR (300 MHz, DMSO-dé) δ 11,30 (s, 1H, NH), 8,27 (d, >1,7 Hz, 1H), 7,94 (s, 1H, H-vinyl), 7,49 (dd, >1,7 & 8,0 Hz, 1H), 7,44 (m, 1H, CONHCH₂CH₂), 7,07 (d, >8,0 Hz, • · · • · ·· ·· · • · · • ♦ · · • ♦ ·♦·· • · ·

155

1H), 3,26 (m, 2H, CH₂), 2,60 (s, 6H, N(CH₃)₂), 2,53 (m, 2H, CH₂), 2,45-2,50 (m, 10H, 2 x CH₃ & N(CH₂CH₃)₂, 0,96 (t, J=7,2 Hz, 6H, N(CH₂CH₃)₂).

MS-EI m/z 487 [M⁺j.

Příklad 88 (2-Diethylaminoethyl)amid 5 -[5 -(3 -chlorfenylsulfamoyl)-2 -oxo-1,2-dihydroindol-3 ylidenmethyl]-2,4-dimethyl-lH-pyrrol-3-karboxylové kyseliny (3-Chlor-fenyl)amid 2-oxo-2,3-dihydro-l//-indol-5-sulfonové kyseliny (120 mg, 3,8 mmol) se kondenzuje s (2-diethylaminoethyl)amidem 5-formyl-2,4-dimethyl-lHpyrrol-3-karboxylové kyseliny (100 mg), čímž se získá 80 mg (37%) požadované sloučeniny ve formě žluté pevné látky.

*HNMR (360 MHz, DMSO-d₆) δ 13,55 (s, 1H, NH), 11,24 (s, 1H, NH), 10,29 (s, 1H, NH), 8,25 (d, >1,87 Hz, 1H), 7,79 (s, 1H, H-vinyl), 7,52 (dd, >1,87 & 8,3 Hz, 1H), 7,42 (m, 1H, CONHCH₂CH₂), 7,22 (t, >8,02 Hz, 1H), 7,15 (t, >2 Hz, 1H), 7,08 (m, 1H), 7,0 (m, 2H), 3,27 (m, 2H, CH₂), 2,48-2,57 (m, 6H, 3 x CH₂), 2,45 (s, 3H, CH₃), 2,44 (s, 3H, CH₃), 0,97 (t, >7,0 Hz, 6H, N(CH₂CH₃)₂).

MS m/z 570,1 [M⁺].

Příklad 95

Ethyl ester 3 -(2-oxo-5 -fenyl-1,2-dihydroindol-3 -ylidenmethyl)-4,5,6,7-tetrahydro-2/7izoindol-1-karboxylové kyseliny ’HNMR (360 MHz, DMSO-d₆) δ 13,74 (s, 1H, NH), 11,00 (s, 1H, NH), 8,13 (d, >1,7 Hz, 1H), 7,74 (s, 1H, H-vinyl), 7,70 (d, >7,7 Hz, 2H), 7,49 (dd, >1,7 & 8,0 Hz, 1H), 7,44 (t, >7,7 Hz, 2H), 7,32 (m, 1H), 6,96 (d, >8,0 Hz, 1H), 4,26 (q, >7,0 Hz, 2H, OCH₂CH₃), 2,79 (m, 2H, CH₂), 2,72 (m, 2H, CH₂), 1,73 (m, 4H, 2 x CH₂), 1,30 (t, >7,0 Hz, 3H, OCH₂CH₃).

MS-EI m/z 412 [M⁺].

Příklad 99

Ethylester 3-(2-oxo-5-fenylsulfamoyl-l,2-dihydroindol-3-ylidenmethyl)-4,5,6,7tetrahydro-2//-izoindol-1 -karboxylové kyseliny • · · · · · ♦ · «· • · · · • · · • · · • · · ···· ·· ·* · • * · • · · · • ····· • ♦ · ·· ·

156 'HNMR (360 MHz, DMSO-d₆) δ 13,64 (s, 1H, NH), 11,33 (s, 1H, NH), 10,07 (s, 1H, NH), 8,24 (d, >1,8 Hz, 1H), 7,74 (s, 1H, H-vinyl), 7,57 (dd, >1,8 & 8,0 Hz, 1H), 7,21 (t, >7,6 Hz, 2H), 7,11 (d, >7,6 Hz, 2H), 6,99 (d, >8,0 Hz, 1H), 6,98 (d, >7,6 Hz, 1H), 4,27 (q, >7,0 Hz, 2H, OCH2CH3), 2,80 (m, 2H, CH₂), 2,73 (m, 2H, CH₂), 1,73 (m, 4H, 2 x CH₂), 1,30 (t, >7,0 Hz, 3H, OCH₂CH₃).

MS-EI m/z 491 [M⁺].

Příklad 109

3-[3-(Morfolin-4-karbonyl)-4,5,6,7-tetrahydro-277-izoindol-l-ylmethylen]-2-oxo-2,3dihydro-1 H-indol-6-karboxylová kyselina 'HNMR (360 MHz, DMSO-d₆) δ 13,60 (s, 1H, NH), 12,75 (br s, 1H, COOH), 11,08 (s, 1H, NH), 7,85 (d, >7,8 Hz, 1H), 7,71 (s, 1H, H-vinyl), 7,62 (dd, >1,4 & 7,8 Hz, 1H), 7,41 (d, >1,4 Hz, 1H), 3,65 (m, 4H, 2 x CH₂), 3,55 (m, 4H, 2 x CH₂), 2,81 (m, 2H, CH₂), 2,54 (m, 2H, CH₂),1,73 (m, 4H, 2 x CH₂).

MS-EI m/z 421 [M⁺],

Příklad 112

5-Brom-3-[3-(pyrrolidin-l-karbonyl)-4,5,6,7-tetrahydro-2H-izoindol-l-ylmethylen]-l,3dihydro-indol-2-on 'HNMR (360 MHz, DMSO-d₆) δ 13,56 (s, 1H, NH), 11,00 (s, 1H, NH), 8,05 (d, >1,8 Hz, 1H), 7,74 (s, 1H, H-vinyl), 7,28 (dd, >1,3 & 8,3 Hz, 1H), 6,83 (d, >8,3 Hz, 1H), 3,57 (m, 4H, 2 x CH₂), 2,79 (m, 2H, CH₂), 2,65 (m, 2H, CH₂), 1,88 (m, 4H, 2 x CH₂), 1,71 (m, 4H, 2 x CH₂).

MS-EI m/z 439 & 441 [M⁺-l] & [M⁺+l],

Příklad 114

3-(3-Dimethylkarbamoyl-4,5,6,7-tetrahydro-2Z/-izoindol-l-ylmethylen)-2-oxo-2,3dihydro-1H-indol-6-karboxylová kyselina 'HNMR (360 MHz, DMSO-d₆) δ 13,60 (s, 1H, NH), 12,72 (br s, 1H, COOH), 11,05 (s, 1H, NH), 7,85 (d, >7,9 Hz, 1H), 7,72 (s, 1H, H-vinyl), 7,62 (dd, >1,3 & 7,9 Hz, 1H), • · β ···· ·« • · ♦ · · • ···· • · ·· · • · · • · · · • ·♦··· • ♦ · ·· Λ

157

7,42 (d, >1,3 Hz, 1H), 3,03 (s, 6H, N(CH₃)₂), 2,81 (m, 2H, CH₂), 2,55 (m, 2H, CH₂), 1,73 (m, 4H, 2 x CH₂).

MS-EI m/z 379 [M⁺j.

Příklad 115

4-Methyl-5-(5-methylsulfamoyl-2-oxo-l,2-dihydro-indol-3-ylidenmethyl)-l//-pyrrol-3karboxylová kyselina ’HNMR (300 MHz, DMSO-d₆) 13,56 (br s, 1H, NH), 8,24 (d, >1,5 Hz, 1H), 7,86 (s, 1H, H-vinyl), 7,74 (d, >2,96 Hz, 1H), 7,56 (dd, >1,5 & 8,1 Hz, 1H), 7,20 (br m, 1H, NHCH₃), 7,03 (d, >8,1 Hz, 1H), 2,57 (s, 3H, CH₃), 2,41 (s, 3H, CH₃).

MS-EI m/z 361 [M⁺].

Příklad 116

Ethylester {[4-methyl-5 -(4-methyl-5 -methylsulfamoyl-2-oxo-1,2-dihydro-indol-3 ylidenmethyl)-1 //-pyrrol-3-karbony 1]-amino} -octové kyseliny

Ethylester 4-methyl-1//-pyrrol-3-karboxylové kyseliny (odkaz D. O. Cheng, T. L. Bowman a E. LeGoff; J. Heterocyclic Chem.; 1976; 13; 1145-1147) se formyluje podle způsobu A, hydrolyzuje podle způsobu B, poté amiduje (způsob C), čímž se získá ethylester [(5 -formyl-4-methyl-1 //-pyrrol-3 -karbonyl)-amino] -octové kyseliny.

4-Methyl-5-methylaminosulfonyl-2-oxindol (50 mg, 0,21 mmol) se kondenzuje s ethylesterem [(5-formyl-4-methyl-l //-pyrrol-3 -karbonyl)-amino]-octové kyseliny (100 mg, 0,42 mmol) a piperidinem (0,1 ml) v ethanolu (2 ml), čímž se získá 50 mg (52%) požadované sloučeniny.

^NMR (360 MHz, DMSO-d₆) δ 13,59 (s, 1H, NH), 11,29 (v,br, s, 1H, NH-CO), 8,33 (t, >5,8 Hz, 1H, CONHCH₂), 7,83 (d, >3,11 Hz, 1H), 7,80 (s, 1H, H-vinyl), 7,71 (d, >8,5 Hz, 1H), 7,34 (br m, 1H, NHCH₃), 6,89 (d, >8,5 Hz, 1H), 4,11 (q, >7,1 Hz, 2H, OCH₂CH₃), 3,92 (d, >5,8 Hz, 2H, GlyCH₂), 2,86 (s, 3H, CH₃), 2,48 (s, 3H, CH₃), 2,42 (d, >4,71 Hz, 3H, HNCH₃), 1,20 (t, >7,1 Hz, 3H, OCH₂CH₃).

MS-EI m/z 460 [M⁺],

• · · ···· · · • · · • · · • · · · • * ···· • » ♦ • * * • · · · • ····· • · · ·· ·

158

Příklad 117

Ethylester {[4-methyl-5-(5-methylsulfamoyl-2-oxo-l,2-dihydro-indol-3-ylidenmethyl)-177pyrrol-3 -karbonyl] -amino} -octové kyseliny

Směs 5-methylaminosulfonyl-2-oxindolu (0,06 g, 0,22 mmol), ethylesteru [(5formyl-4-methyl-17/-pyrrol-3-karbonyl)-amino]-octové kyseliny (0,075 g, 0,27 mmol) a piperidinu (2 kapky) v ethanolu (5 ml) se zahřívá v uzavřené baňce při teplotě 90° C po dobu 12 hodin. Po ochlazení se precipitát spojí vakuovou filtrací, promyje ethanolem, trituruje směsí dichlormethan/ether a suší, čímž se získá 0,035 g (36%) požadované sloučeniny ve formě nažloutlé hnědé pevné látky.

'H NMR (360 MHz, DMSO-d₆) δ 13,6 (s, 1H, NH), 11 (v,br, s, 1H, NH-CO), 8,30 (t, >5,7 Hz, 1H, CONHCH2), 8,25 (d, >1,2 Hz, 1H), 7,88 (s, 1H, H-vinyl), 7,84 (d, >3,3 Hz, 1H), 7,57 (dd, >1,9 & 8,5 Hz, 1H), 7,14 (br m, 1H, NHCH₃), 7,04 (d, >8,5 Hz, 1H), 4,11 (q, >6,7 Hz, 2H, OCH₂CH₃), 3,92 (d, >5,7 Hz, 2H, GlyCH₂), 2,55 (s, 3H, CH₃),

2.41 (m, 3H, NCH₃), 1,20 (t, >6,7 Hz, 3H, OCH₂CH₃).

MS m/z 446 [M⁺],

Příklad 118 {[4-Methyl-5-(5-methylsulfamoyl-2-oxo-l,2-dihydro-indol-3-ylidenmethyl)-l/7-pyrrol-3karbonyl]-amino}-octová kyselina

Směs ethylesteru [(5-formyl-4-methyl- 17/-pyrrol-3-karbonyl)-amino]-octové kyseliny (0,142 g, 0,59 mmol) a 1N NaOH (1,2 ml) v methanolu (10 ml) se míchá při pokojové teplotě po dobu 1 hodiny. Reakce se koncentruje a zbytek se kondenzuje s

5-methylaminosulfonyl-2-oxindolem (0,13 g, 0,48 mmol) a piperidinem (0,12 ml) v ethanolu (12 ml), čímž se získá 0,11 g (52%) požadované sloučeniny.

'HNMR (300 MHz, DMSO-d₆) δ 13,98 (br s, 1H, NH), 8,17 (s, 1H), 7,80 (s, 1H), 7,75 (d, >3,1 Hz, 1H), 7,51 (dd, >2 & 8,2 Hz, 1H), 7,21 (m on br s, 2H), 6,97 (d, >8,1 Hz, 1H),

3.41 (d, >4,2 Hz, 2H, CH₂NH), 2,54 (s, 3H, pyrrol-CH₃), 2,39 (s, 3H, ArCH₃).

MS m/z 417 [M-l]⁺.

Příklad 120

5-Methyl-2-(2-oxo-l,2-dihydro-indol-3-ylidenmethyl)-17/-pyrrol-3-karboxylová kyselina «

9 9 • 9999 ···· ··

9 •99 9 9999 • 9

159 'HNMR (300 MHz, DMSO-dg) δ 13,77 (br s, 1H, NH), 12,49 (s, 1H, COOH), 11,07 (s, 1H, NH), 8,39 (s, 1H, H-vinyl), 7,43 (d, >7,47 Hz, 1H), 7,20 (t, >7,47 Hz, 1H), 7,03 (t, >7,47 Hz, 1H), 6,91 (d, >7,47 Hz, 1H), 6,49 (d, >1,53 Hz, 1H), 2,34 (s, 3H, CH₃).

MS m/z 269 [M+H]⁺.

Příklad 121

Ethylester 5-methyl-2-(2-oxo-1,2-dihydro-indol-3 -ylidenmethyl)-1 //-pyrrol-3 -karboxylové kyseliny 'HNMR (300 MHz, DMSO-dg) δ 13,79 (s, 1H, NH), 11,08 (s, 1H, NH), 8,31 (s, 1H, Hvinyl), 7,45 (d, >7,52 Hz, 1H), 7,20 (t, >7,52 Hz, 1H), 7,03 (t, >7,52 Hz, 1H), 6,91 (d, >7,52 Hz, 1H), 6,50 (d, >2,1 Hz, 1H), 4,26 (q, >7,2 Hz, 2H, OCH₂CH₃), 2,33 (s, 3H, CH₃), 1,32 (t, >7,2 Hz, 3H, OCH₂CH₃).

MS m/z 297,1 [M+H]⁺.

Příklad 122

Ethylester 2-(5-brom-2-oxo-l,2-dihydroindol-3-ylidenmethyl)-5-methyl-l//-pyrrol-3karboxylové kyseliny 'HNMR (360 MHz, DMSO-dg) δ 13,72(s, 1H, NH), 11,16 (s, 1H, NH), 8,29 (s, 1H, Hvinyl), 7,53 (d, >2,0 Hz, 1H), 7,35 (dd, >2,0 & 8,05 Hz, 1H), 6,87 (t, >8,05 Hz, 1H), 6,53 (d, >2,4 Hz, 1H), 4,28 (q, >7,03 Hz, 2H, OCH₂CH₃), 2,35 (s, 3H, CH₃), 1,33 (t, >7,03 Hz, 3H, OCH₂CH₃).

MS m/z 375 & 377 [M+H]⁺.

Příklad 123

2-(5-Brom-2-oxo-l,2-dihydroindol-3-ylidenmethyl)-5-methyl-l//-pyrrol-3-karboxylová kyselina 'HNMR (300 MHz, DMSO-dg) δ 13,72(s, 1H, NH), 12,57 (s, 1H, COOH), 11,19 (s, 1H, NH), 8,36 (s, 1H, H-vinyl), 7,51 (d, >1,4 Hz, 1H), 7,34 (dd, >1,4 & 8,17 Hz, 1H), 6,87 (t, >8,17 Hz, 1H), 6,52 (d, >2,5 Hz, 1H), 2,35 (s, 3H, CH₃).

MS m/z 347 & 349 [M+H]⁺ • 4 ·» · * · · • · · · • · ··*· • · · ·* ♦ ·» * • · · • ♦ · · • ····· • · « ·· *

160

Příklad 124 (2-Pyrrolidin-l-ylethyl)-amid 2-(5-brom-2-oxo-l,2-dihydroindol-3-ylidenmethyl)-5methyl-177-pyrrol-3 -karboxylové kyseliny

Do roztoku 2-formyl-5-methyl-l//-pyrrol-3-karboxylové kyseliny (250 mg, 1,63 mmol) v dimethylformamidu (3 ml) se přidá l-ethyl-3-(3dimethylaminopropyl)karbodiimid (376 mg, 1,2 ekviv.), 1-hydroxybenzotríazol (265 mg, 1,2 ekviv.), triethylamin (0,45 ml, 2 ekviv.) a l-(2-aminoethyl)pyrrolidin (0,23 ml, 1,1 ekviv.). Po míchání při pokojové teplotě přes noc se reakce zředí nasyceným roztokem hydrogenuhličitanu sodného a solankou (s extra solí) a extrahuje 10% methanolem v dichlormethanu. Spojené organické vrstvy se promyjí solankou, suší nad bezvodým síranem sodným a koncentrují, čímž se získá 130 mg (2-pyrrolidin-l-yl-ethyl)-amidu 2-formyl-5-methyl-177-pyrrol-3-karboxylové kyseliny.

Směs 5-brom-2-oxindolu (106 mg, 0,5 mmol), (2-pyrrolidin-l-yl-ethyl)-amidu 2-formyl-5-methyl-l//-pyrrol-3-karboxylové kyseliny (125 mg, 1 ekviv.) apiperidinu (0,2 ml) v ethanolu (2 ml) se zahřívá v uzavřené baňce při teplotě 80° C po dobu 1 hodiny a pak ochladí. Vzniklý precipitát se spojí vakuovou filtrací, promyje ethanolem a ethylacetátem a suší, čímž se získá požadovaná sloučenina ve formě oranžové pevné látky.

'HNMR (300 MHz, DMSO-dé) δ 13,62 (s, 1H, NH), 11,06 (br s, 1H, NH), 8,56 (s, 1H, Hvinyl), 8,15 (m, 1H, CONHCH₂), 7,48 (d, >1,8 Hz, 1H), 7,31 (dd, >1,8 & 7,9 Hz, 1H), 6,86 (d, >7,9 Hz, 1H), 6,60 (d, >2,3 Hz, 1H), 3,35 (m, 2H, HNCH₂CH₂), 2,56 (t, >6,91 Hz, 2H, HNCH₂CH₂), 2,35 (s, 3H, CH₃), 1,67 (m, 4H, 2 x CH₂).

MS m/z 443/445 [M⁺ a M⁺+2].

Příklad 125 (2-Diethylaminoethyl)-amid 2-(5 -brom-2-oxo-1,2-dihydroindol-3 -ylidenmethyl)-5 -methyll/Y-pyrrol-3-karboxylové kyseliny

Do roztoku 2-formyl-5-methyl-17/-pyrrol-3-karboxylové kyseliny (320 mg, 2,1 mmol) v dimethylformamidu (3 ml) se přidá 1-ethy 1-3-(3dimethylaminopropyl)karbodiimid (483 mg, 1,2 ekviv.), 1-hydroxybenzotriazol (340 mg, 1,2 ekviv.), triethylamin (0,59 ml, 2 ekviv.) a V,/V-diethylethylendiamin (0,32 ml, 1,1 ekviv.). Po míchání při pokojové teplotě přes noc se reakce zředí nasyceným roztokem hydrogenuhličitanu sodného a solankou (s extra solí) a extrahuje 10% methanolem v • · • · · · · · ···· · · · ···· ······ · · · ······ ·· · ·· ·

161 dichlormethanu. Spojené organické vrstvy se promyjí solankou, suší nad bezvodým síranem sodným a koncentrují, čímž se získá (2-diethylaminoethyl)-amid 2-formyl-5methyl-1 //-pyrrol-3 -karboxylové kyseliny.

Směs 5-brom-2-oxindolu (106 mg, 0,5 mmol), (2-diethylamino-ethyl)-amidu 2-formyl-5-methyl-l//-pyrrol-3-karboxylové kyseliny (126 mg, 1 ekviv.) a piperidinu (0,2 ml) v ethanolu (2 ml) se zahřívá v uzavřené baňce při teplotě 80° C po dobu 1 hodiny a pak ochladí. Precipitát se spojí vakuovou filtrací, promyje ethanolem a ethylacetátem a suší, čímž se získá požadovaná sloučenina ve formě oranžové pevné látky.

‘HNMR (360 MHz, DMSO-dg) δ 13,62 (s, 1H, NH), 11,11 (br s, 1H, NH), 8,54 (s, 1H, Hvinyl), 8,1 (m, 1H, CONHCH₂), 7,49 (d, J=2,2 Hz, 1H), 7,31 (dd, J=2,2 & 8,3 Hz, 1H), 6,86 (d, J=8,3 Hz, 1H), 6,58 (d, J=2,24 Hz, 1H), 3,31 (m, 2H, HNCH₂CH₂), 2,59 (m, 6H, 3 x CH₂), 2,36 (s, 3H, CH₃), 0,99 (t, J=6,8 Hz, 6H, N(CH₂CH₃)₂).

MS m/z 445/447 [M⁺ a M⁺+2],

Příklad 126 (2-Diethylamino-ethyl)-amid 2,4-dimethyl-5-(2-oxo-1,2-dihydro-indol-3-ylidenmethyl)1//-pyrrol-3-karboxylové kyseliny

Směs l,3-dihydro-indol-2-onu (266 mg, 2 mmol), (2-diethylamino-ethyl)-amidu 5-formyl-2,4-dimethyl-l//-pyrrol-3-karboxylové kyseliny (530 mg, 2 mmol) a piperidinu (1 kapka) v ethanolu se zahřívá při teplotě 90° C po dobu 2 hodin. Reakce se ochladí na pokojovou teplotu, výsledný precipitát se spojí vakuovou filtrací, promyje ethanolem a suší, čímž se získá 422 mg (55%) požadované sloučeniny ve formě světle žluté pevné látky.

‘H NMR (400 MHz, DMSO-d₆) δ 13,7 (s, 1H, NH), 10,9 (s, 1H, NH), 7,88 (d, J=7,6 Hz, 1H), 7,64 (s, 1H, H-vinyl), 7,41 (t, J=5,4 Hz, 1H, NH), 7,13 (dt, J=1,2 & 7,6 Hz, 1H), 6,99 (dt, J=l,2 & 7,6 Hz, 1H), 6,88 (d, J=7,6 Hz, 1H), 3,28 (m, 2H), 2,48-2,55 (m, 6H), 2,44 (s, 3H, CH₃), 2,41 (s, 3H, CH₃), 0,97 (t, J=7,2 Hz, 6H, N(CH₂CH₃)₂).

MS+veAPCI381 [M⁺+lj.

• · • · ·

162

Příklad 127 (2-Diethylamino-ethyl)-amid 5-(5-chlor-2-oxo-l,2-dihydro-indol-3-ylidenmethyl)-2,4dimethyl-1 //-pyrrol-3 -karboxylové kyseliny

Směs 5-chlor-l,3-dihydro-indol-2-onu (335 mg, 2 mmol), (2-diethyíamino-ethyl)amidu 5-formyl-2,4-dimethyl-l//-pyrrol-3-karboxylové kyseliny (530 mg, 2 mmol) a piperidinu (1 kapka) v ethanolu se zahřívá při teplotě 90° C po dobu 2 hodin. Reakce se ochladí na pokojovou teplotu, výsledný precipitát se spojí vakuovou filtrací, promyje ethanolem a suší, čímž se získá 565 mg (68%) požadované sloučeniny ve formě oranžové pevné látky.

*H NMR (400 MHz, DMSO-d₆) δ 13,65 (s, 1H, NH), 11,0 (s, 1H, NH), 7,98 (d, >2,1 Hz, 1H) 7,77 (s, 1H H-vinyl), 7,44 (t, NH), 7,13 (dd, >2,1 & 8,4 Hz, 1H) 6,87 (d, >8,4 Hz, 1H), 3,28 (g, 2H), 2,48-2,53 (m, 6H), 2,44 (s, 3H, CH₃), 2,43 (s, 3H, CH₃), 0,97 (t, >7,0 Hz, 6H,N(CH₂CH₃)₂)

MS+ve APCI 415 [M⁺+l],

Příklad 128 (2-Pyrrolidin-1 -ethyl)-amid 2,4-dimethyl-5-(2-oxo-1,2-dihydro-indol-3-ylidenmethyl)-1Hpyrrol-3-karboxylové kyseliny l,3-Dihydro-indol-2-on se kondenzuje s (2-pyrrolidin-l-yl-ethyl)-amidem 5-formyl-2,4-dimethyl-l//-pyrrol-3-karboxylové kyseliny, čímž se získá požadovaná sloučenina.

MS+ve APCI 379 [M⁺+l],

Příklad 129 (2-Pyrrolidin-l-yl-ethyl)-amid 5-(5-fluor-2-oxo-l,2-dihydro-indol-3-ylidenmethyl)-2,4dimethyl-1 //-pyrrol-3 -karboxylové kyseliny

5-Fluor-l,3-dihydro-indol-2-on se kondenzuje s (2-pyrrolidin-1-yl-ethyl)-amidem 5-formyl-2,4-dimethyl-l//-pyrrol-3-karboxylové kyseliny, čímž se získá požadovaná sloučenina.

MS+ve APCI 397 [M⁺+l].

163

Poloprovozní příprava:

5-Formyl-2,4-dimethyl-l/f-pyrrol-3-karboxylová kyselina (61 g), 5-fluor-l,3dihydro-indol-2-on (79 g), ethanol (300 ml) a pyrrolidin (32 ml) se refluxují po dobu 4,5 hodiny. Octová kyselina (24 ml) se přidá do směsi a v refluxování se pokračuje dalších 30 minut. Směs se ochladí na pokojovou teplotu a pevný podíl se spojí vakuovou filtrací a promyje dvakrát ethanolem. Pevný podíl se míchá po dobu 130 minut v 40% acetonu ve vodě (400 ml) obsahujícím 12 N kyselinu chlorovodíkovou (6,5 ml). Pevný podíl se spojí vakuovou filtrací a promyje dvakrát 40% acetonem ve vodě. Dále se pevný podíl se suší za vakua, čímž se získá 5-[5-fhior-2-oxo-l,2-dihydro-indol-(3Z)-ylidenmethyl]-2,4-dimethyl177-pyrrol-3-karboxylová kyselina (86 g, 79% výtěžek) ve formě oranžové pevné látky. ^d-NMR (dimethylsulfoxid-dó) δ 2,48, 2,50 (2 x s, 6H, 2 x CH₃), 6,80, 6,88, 7,68, 7,72 (4 x m, 4H, aromatický a vinyl), 10,88 (s, 1H, CONH), 12,12 (s, 1H, COOH), 13,82 (s, 1H, pyrrol NH).

MS w/z 299 [M-l].

5-[5-Fluor-2-oxo-l,2-dihydro-indol-(3Z)-ylidenmethyl]-2,4-dimethyl-l/f-pyrrol-3karboxylová kyselina (100 g) a dimethylformamid (500 ml) se míchají, pak se přidá benzotriazol-l-yloxytris(dimethylamino)fosfonium-hexafluorfosfát (221 g), l-(2aminoethyl)pyrrolidin (45,6 g) a triethylamin (93 ml). Směs se míchá po dobu 2 hodin při pokojové teplotě. Pevný produkt se spojí vakuovou filtrací a promyje ethanolem. Pevný podíl se míchá s ethanolem (500 ml) po dobu 1 hodiny při teplotě 64° C a ochladí na pokojovou teplotu. Pevný podíl se spojí vakuovou filtrací, promyje ethanolem a suší za vakua, čímž se získá (2-pyrrolidin-l-yl-ethyl)-amid 5-[5-fluor-2-oxo-l,2-dihydro-indol(3Z)-yhdenmethyl]-2,4-dimethyl-l?/-pyrrol-3-karboxylové kyseliny (101,5 g, 77% výtěžek).

'H-NMR (dimethylsulfoxid-dó) δ 1,60 (m, 4H, 2 x CH₂), 2,40, 2,44 (2 x s, 6H, 2 x CH₃), 2,50 (m, 4H, 2 x CH₂), 2,57, 3,35 (2 x m, 4H, 2 x CH₂), 7,53, 7,70, 7,73, 7,76 (4 x m, 4H, aromatický a vinyl), 10,88 (s, 1H, CONH), 13,67 (s, 1H, pyrrol NH).

MS w/z 396 [M+l].

Příklad 130 (2-Pyrrolidin-l-yl-ethyl)-amid 5-(5-chlor-2-oxo-l,2-dihydro-indol-3-ylidenmethyl)-2,4dimethyl- l/f-pyrrol-3-karboxylové kyseliny • ·

164

5-Chlor-l,3-dihydro-indol-2-on se kondenzuje s (2-pyrrolidin-l-yl-ethyl)-amidem 5-formyl-2,4-dimethyl-l//-pyrrol-3 -karboxylové kyseliny, čímž se získá požadovaná sloučenina

MS+ve APCI 413 [M++1],

Příklad 131 (2-Dimethylaminoethyl)-amid 2,4-dimethyl-5-(2-oxo-1,2-dihydro-indol-3 -ylidenmethyl)1//-pyrrol-3-karboxylové kyseliny l,3-Dihydro-indol-2-on se kondenzuje s (2-dimethylamino-ethyl)amidem 5-formyl2,4-dimethyl-l//-pyrrol-3-karboxylové kyseliny, čímž se získá požadovaná sloučenina.

*H NMR (400 MHz, DMSO-d₆) δ 13,63 (s, 1H, NH), 10,90 (s, 1H, NH), 7,78 (d, >7,8 Hz, 1H), 7,63 (s, 1H H-vinyl), 7,48 (t, 1H, NH), 7,13 (dt, 1H), 6,98 (dt, 1H), 6,88 (d, J=7,7 Hz, 1H), 3,31 (q, >6,6 Hz, 2H), 2,43 (s, 3H, CH₃), 2,40 (s, 3H, CH₃), 2,38 (t, J=6,6 Hz, 2H), 2,19 (s, 6H, N(CH₂CH₃)₂).

MS+ve APCI 353 [M⁺+l].

Příklad 132 (2-Dimethylaminoethyl)-amid 5-(5-fluor-2-oxo-1,2-dihydro-indol-3-ylidenmethyl)-2,4dimethyl-1 //-pyrrol-3 -karboxylové kyseliny

5-Fluor-l,3-dihydro-indol-2-on se kondenzuje s (2-dimethylaminoethyl)amidem 5-formyl-2,4-dimethyl-1 //-pyrrol-3 -karboxylové kyseliny, čímž se získá požadovaná sloučenina.

’H NMR (400 MHz, DMSO-d₆) δ 13,68 (s, 1H, NH), 10,90 (s, 1H, NH), 7,76 (dd, >2,4 & 9,4 Hz, 1H), 7,71 (s, 1H H-vinyl), 7,51 (t, 1H, NH), 6,93 (m, 1H), 6,84 (dd, >4,6 & 8,4 Hz, 1H), 3,31 (q, >6,6 Hz, 2H), 2,43 (s, 3H, CH₃), 2,41 (s, 3H, CH₃), 2,38 (t, >6,6 Hz, 2H), 2,19 (s, 6H, N(CH₂CH₃)₂).

MS+ve APCI 371 [M⁺+l],

Příklad 193 (2-Ethylamino-ethyl)-amid 5-[5-fluor-2-oxo-l,2-dihydro-indol-(3Z)-ylidenmethyl]-2,4dimethyl-1 //-pyrrol-3 -karboxylové kyseliny ·« ·

165 (2-Ethylamino-ethyl)-amid 5-formyl-2,4-dimethyl-l//-pyrrol-3-karboxylové kyseliny (99 g), ethanol (400 ml), 5-fluor-2-oxindol (32 g) a pyrrolidin (1,5 g) se za míchání refluxují po dobu 3 hodin. Směs se ochladí na pokojovou teplotu a pevné podíly se spojí vakuovou filtrací, míchají v ethanolu při teplotě 60° C, ochladí na pokojovou teplotu a spojí vakuovou filtrací. Produkt se suší za vakua, čímž se získá (2-ethylamino-ethyl)amid 5-[5-fluor-2-oxo-1,2-dihydro-indol-(3Z)-ylidenmethyl]-2,4-dimethyl-l//-pyrrol-3karboxylové kyseliny (75 g, 95% výtěžek).

'H-NMR (dimethylsulfoxid-dó) δ 1,03 (t, 3H, CH₃), 2,42, 2,44 (2 x s, 6H, 2 x CH₃), 2,56 (q, 2H, CH₂), 2,70, 3,30 (2 x t, 4H, 2 x CH₂), 6,85, 6,92, 7,58, 7,72, 7,76 (5 x m, SH, aromatic, vinyl a CONEÍ), 10,90 (br s, 1H, CONH), 13,65 (br s, 1H, pyrrol N). MS m/z 369 [M-l].

Příklad 195 (2-DiethylJV-oxoamino-ethyl)-amid 5-[5-fluor-2-oxo-l,2-dihydro-indol-(3Z)ylidenmethyl] -2,4-dimethyl-1 H-pyrro 1-3 -karboxylové kyseliny

Způsob A:

(2-Diethylamino-ethyl)-amid 5-[5-fluor-2-oxo-1,2-dihydro-indol-(3Z)-ylidenmethyl]-2,4-dimethyl-l//-pyrrol-3-karboxylové kyseliny (598 mg) a dichlormethan (60 ml) v ledové lázni se nechají reagovat s 3-chlorperbenzoovou kyselinou (336 mg) a směs míchá se při pokojové teplotě přes noc. Rozpouštědlo se odpařuje na rotační odparce a zbytek se suspenduje v methanolu (20 ml). Přidá se voda (20 ml) obsahující hydroxid sodný (240 mg) a směs se míchá po dobu jedné hodiny. Precipitát se spojí vakuovou filtrací, promyje 5 ml vody a suší za vakua, čímž se získá (2-diethyl-A-oxoamino-ethyl)amid 5-[5 -fluor-2-oxo-1,2-dihydro-indol-(3Z)-ylidenmethyl] -2,4-dimethyl-1 //-pyrrol-3 karboxylové kyseliny (510 mg, 82% výtěžek) ve formě oranžové pevné látky.

‘H-NMR (DMSO-d₆) δ 13,72 (br s, 1H, NH), 11,02 (br s, 1H, CONH), 9,81 (br s, 1H, CONH), 7,75 (dd, 1H, aromatické), 7,70 (s, 1H, aromatické), 6,93 (td, 1H, aromatické), 6,84 (m, 1H, aromatické), 3,63 (m, 2H, CH₂), 3,29 (m, 2H, CH₂), 3,14 (m, 4H, 2 x CH₂), 2,47 (s, 1H, CH₃), 2,45 (s, 3H, CH₃), 1,64 (t, 6H, 2 x CH₃). MS m/z 415 [M+l].

• ·

166 « ···· · · ·· · »

Způsob B:

(2-Diethylamino-ethyl)-amid 5-formyl-2,4-dimethyl-l//-pyrrol-3-karboxylové kyseliny (10 g) se suspenduje v dichlormethanu (100 ml) a ochladí v ledové lázni. Za míchání se přidá 3-chlor-peroxybenzoová kyselina (13,1 g) a směs nechá ohřát na pokojovou teplotu, pak míchá přes noc. Směs se odpařuje na rotační odparce do sucha a chromatografuje na sloupci silikagelu s mobilní fází 20% methanol v dichlormethanu. Frakce obsahující produkt se spojí a odpařují na rotační odparce do sucha, čímž se získá (2-diethyl-7V-oxoamino-ethyl)-amid 5-formyl-2,4-dimethyl-l //-pyrrol-3 -karboxylové kyseliny (9 g, 83% výtěžek).

(2-Diethyl-7V-oxoamino-ethyl)-amid 5-formyl-2,4-dimethyl-l//-pyrrol-3karboxylové kyseliny (9 g), 5-fluor-l,3-dihydro-indol-2-on (9 g, 83% výtěžek) apyrrolidin (9 g, 83% výtěžek (0,1 g) se refluxují v ethanolu (30 ml) po dobu 4 hodin. Směs se ochladí v ledové lázni a precipitát spojí vakuovou filtrací a promyje ethanolem. Pevné podíly se míchá v ethylacetátu (30 ml), spojí vakuovou filtrací, promyjí ethylacetátem a suší za vakua, čímž se získá (2-diethyl-A-oxoamino-ethyl)-amid 5-[5-fluor-2-oxo-l,2-dihydroindol-(3Z)-ylidenmethyl] -2,4-dimethyl-1 //-pyrrol-3 -karboxylové kyseliny (10,3 g 80% výtěžek) ve formě oranžové pevné látky.

'H-NMR (DMSO-de) δ 13,72 (br s, 1H, NH), 11,02 (br s, 1H, CONH), 9,81 (br s, 1H, CONH), 7,75 (dd, 1H, aromatické), 7,70 (s, 1H, aromatické), 6,93 (td, 1H, aromatické), 6,84 (m, 1H, aromatické), 3,63 (m, 2H, CH₂), 3,29 (m, 2H, CH₂), 3,14 (m, 4H, 2 x CH₂), 2,47 (s, 1H, CH₃), 2,45 (s, 3H, CH₃), 1,64 (t, 6H, 2 x CH₃), MS m/z 415 [M+l],

Příklad 190 [2-(pyridin-l-yl)ethyl]-amid 5-[5-fluor-2-oxo-l,2-dihydro-indol-(3Z)-ylidenmethyl]-2,4dimethyl-l//-pyrrol-3-karboxylové kyseliny

5-[5-Fluor-2-oxo-l,2-dihydro-indol-(3Z)-ylidenmethyl]-2,4-dimethyl-l//-pyrrol-3karboxylová kyselina (120 mg, 0,4 mmol) se třepe s EDC, HC1 (96 mg, 0,5 mmol), bezvodým 1-hydroxy-benztriazolem (68 mg, 0,5 mmol) a 2-(2-aminoethylpyridinem koupeným u Aldrich v bezvodém DMF (3 ml) po dobu 2-3 dnů při pokojové teplotě. Reakční směs se zředí 1M NaHCO₃ (1,5 ml), pak 8 ml vody. Precipitovaný surový produkt se spojí filtrací, promyje vodou suší a purifikuje krystalizací nebo chromatografií, čímž se • 9

167 získá [2-(pyridin-l-yl)-ethyl]amid 5-[5-fluor-2-oxo-l,2-dihydro-indol-(3Z)-ylidenmethyl]2,4-dimethyl-l/7-pyrrol-3-karboxylové kyseliny.

Příklad 189 [2-(Pyridin-1 -yl)ethyl]amid 5-[5 -chlor-2-oxo-1,2-dihydro-indol-(3Z)-ylidenmethyl] -2,4dimethyl- 1 TT-pyrrol-3 -karboxylové kyseliny

Postupuje se podle shora uvedeného příkladu s tím, že se nahradí 5-[5-fluor-2-oxol,2-dihydro-indol-(3Z)-ylidenmethyl]-2,4-dimethyl-lH-pyrrol-3-karboxylová kyselina 5-[5-chlor-2-oxo-l,2-dihydro-indol-(3Z)-ylidenmethyl]-2,4-dimethyl-177-pyrrol-3karboxylovou kyselinou (127 mg), čímž se získá [2-(pyridin-l-yl)ethyl]amid 5-[5-chlor-2oxo-1,2-dihydro-indol-(3Z)-ylidenmethyl]-2,4-dimethyl- 177-pyrrol-3-karboxylové kyseliny.

Příklad 192 [2-(Pyridin-l-yl)ethyl]amid 5-[5-brom-2-oxo-l,2-dihydro-indol-(3Z)-ylidenmethyl]-2,4dimethyl- l/T-pyrrol-3-karboxylové kyseliny

Postupuje se podle způsobu z příkladu 190 výše s tím, že se nahradí 5-[5-fluor-2oxo-1,2-dihydro-indol-(3Z)-ylidenmethyl]-2,4-dimethyl-177-pyrrol-3-karboxylová kyselina 5-[5-brom-2-oxo-l,2-dihydro-indol-(3Z)-ylidenmethyl]-2,4-dimethyl-177-pyrrol-3karboxylovou kyselinou (145 mg), čímž se získá [2-(pyridin-l-yl)ethyl]amid 5-[5-brom-2oxo-1,2-dihydro-indol-(3Z)-ylidenmethyl]-2,4-dimethyl-l//-pyrrol-3-karboxylové kyseliny.

Příklad 191 [2-(Pyridin-l-yl)ethyl]amid 5-[2-oxo-l,2-dihydro-indol-(3Z)-ylidenmethyl]-2,4-dimethyl17/-pyrrol-3-karboxylové kyseliny

Postupuje se podle způsobu z příkladu 190 výše s tím, že se nahradí 5-[5-fluor-2oxo-1,2-dihydro-indol-(3Z)-yliden-methyl]-2,4-dimethyl-l//-pyrrol-3-karboxylová kyselina 5-[2-oxo-1,2-dihydro-indol-(3Z)-ylidenmethyl]-2,4-dimethyl-1 H-pyrrol-3 karboxylovou kyselinou (113 mg), čímž se získá [2-(pyridin-l-yl)ethyl]amid 5-[2-oxo-l,2dihydro-indol-(3Z)-ylidenmethyl]-2,4-dimethyl-l//-pyrrol-3-karboxylové kyseliny.

·

168

99

I 9 9 ·

9 ·

9999 99

9999 *9 9

9 * • 9 9 9

9 999

9 9

9 9

Příklad 203 [2-(Pyridin-l-yl)ethyl]amid 5-[5-kyano-2-oxo-l,2-dihydro-indol-(3Z)-ylidenmethyl]-2,4dimethyl-1 //-pyrrol-3 -karboxylové kyseliny

Postupuje se podle způsobu z příkladu 190 výše s tím, že se nahradí 5-[5-ťluor-2oxo-1,2-dihydro-indol-(3Z)-ylidenmethyl]-2,4-dimethyl-l//-pyrrol-3-karboxylová kyselina 5-[5-kyano-2-oxo-l,2-dihydro-indol-(3Z)-ylidenmethyl]-2,4-dimethyl-l//-pyrrol-3karboxylovou kyselinou (123 mg), čímž se získá [2-(pyridin-l-yl)ethyl]amid 5-[5-kyano-2oxo-1,2-dihydro-indol-(3Z)-ylidenmethyl]-2,4-dimethyl-l//-pyrrol-3-karboxylové kyseliny.

Příklady 142,186,187,188 a 204

Postupuje se podle způsobu z příkladů 190, 189, 191, 192, a 203 výše s tím, že se nahradí 2-(2-aminoethyl)pyridin l-(2-aminoethyl)pyrrolidinem zakoupeným u Aldrich Chemical Company, lne., čímž se získají požadované sloučeniny.

Příklady 143-147

Postupuje se podle způsobu z příkladů 190, 189, 191, 192, a 203 výše s tím, že se nahradí 2-(2-aminoethyl)pyridin l-(2-aminoethyl)imidazolin-2-onem (připraveným zahříváním dimethylkarbonátu s bis(2-aminoethyl)aminem (2 ekvivalenty) v uzavřené baňce při teplotě 150° C po dobu 30 minut, poté se postupuje podle způsobu popsaném v patentu US č. 2,613,212 (1950), patřícímu Rohm & Haas Co. Surový produkt se čistí na silikagelu s mobilní fázi chloroform-methanol-vodný amoniak (80:25:2), čímž se získají požadované sloučeniny.

Příklady 148-151 a 184

Postupuje se podle způsobu z příkladů 190, 189, 191, 192, a 203 výše s tím, že se nahradí 2-(2-aminoethyl)pyridin ethylesterem 4-(2-aminoethyl)piperazin-l-octové kyseliny (připraveným následujícím způsobem: ethylester piperazin-1-octové kyseliny (11,22 g) se nechá reagovat s jodacetonitrilem (5,0 ml) v přítomnosti uhličitanu draselného (6,9 g) v ethylacetátu (260 ml) při teplotě 0° C. Po přidání jodacetonitrilu (45 min) se reakční směs

169 *· ·· • · · · • · · • · · · • · · ···· ·· ···· ·· · • « » • · · · • · ···· • · · ·· 4 míchá při pokojové teplotě po dobu 11 hodin, filtruje a filtráty se odpařují. Zbytek se hydrogenuje v přítomnosti boridu kobaltu (připraveným z C0CI2 a borohydridu sodného) při pokojové teplotě při tlaku 50 psi po dobu 2 dnů v ethanolu. Filtrací, odpařováním a chromatografickou purifikací s mobilní fází chlorform-methanol-vodný amoniak (80:25:2) se získá požadovaný amin (3,306 g) ve formě světle žlutého oleje. Tímto způsobem se získají i další požadované sloučeniny.

Příklad 152-153

Postupuje se podle způsobu z příkladů 190, 189, 191, 192, a 203 výše s tím, že se nahradí 2-(2-aminoethyl)pyridin 2-[(2-aminoethylamino)]acetonitrilem (připraveným následujícím způsobem: roztok jodacetonitrilu (50 mmol) v ethylalkoholu (80 ml) se přidává do roztoku ethylendiaminu (150 ml) v ethylalkoholu (60 ml) při teplotě 0° C v průběhu 30 minut. V míchání se pokračuje další 1 hodinu při teplotě 0° C, pak při pokojové teplotě po dobu 14 hodin, přidá se 55 mmol uhličitanu draselného a směs se míchá dalších 30 minut, filtruje a filtrát se koncentruje při pokojové teplotě. Zbytek se čistí na silikagelu s mobilní fázi chloroform-methanol-vodný amoniak (80:15:1,5), čímž se získá 2-[(2aminoethylamino)]-acetonitril (3,550 g), který se ihned použije). Tímto způsobem se připraví i další požadované sloučeniny.

Příklad 154-158

Postupuje se podle způsobu z příkladů 190, 189, 191, 192, a 203 výše s tím, že se nahradí 2-(2-aminoethyl)pyridin l-(3-aminopropyl)-azepin-2-onem (připraveným podle Kraft A.: J. Chem. Soc. Perkin Trans. 1, 6, 1999, 705-14, s výjimkou toho, že hydrolýza s DBU se provádí přesně při teplotě 145° C v přítomnosti hydroxidu lithného (1 hodina, 5 ml DBU, 2 ml vody, 420 mg hydrátu hydroxidu lithného). Purifikací surového produktu na silikagelu s mobilní fází chlorform-methanol-vodný amoniak (80:40:4) se získá l-(3aminopropyl)azepin-2-on (4,973 g, 87% výtěžek)). Tímto způsobem se připraví požadované sloučeniny.

170 • · · • · » · · ·

I · · · · · · • · • · · • ···

Příklady 133-135,159 a 200

Postupuje se podle způsobu z příkladů 190, 189, 191, 192, a 203 výše s tím, že se nahradí 2-(2-aminoethyl)pyridin V-acetylethylendiaminem, (připraveným zahříváním směsi ethylacetátu s ethylendiaminem (1,5 ekvivalent) na teplotu 160° C po dobu 1 hodiny v uzavřené nádobě. Vakuovou destilací se získá požadovaný produkt v 56% výtěžku, V-acetylethylendiamin lze také zakoupit u Aldrich) . Tímto způsobem se připraví požadované sloučeniny.

Příklady 146-140

Postupuje se podle způsobu z příkladů 190, 189, 191, 192, a 203 výše s tím, že se nahradí 2-(2-aminoethyl)pyridin 1 -(3-aminopropyl)-tetrahydro-pyrimidin-2-onem (připraveným stejným způsobem jako l-(3-aminopropyl)-azepin-2-on podle Kraft A.: J. Chem. Soc. Perkin Trans. 1, 6, 1999, 705-14: l,3,4,6,7,8-hexahydro-2/f-pyrimido[l,2tífjpyrimidin (4,939 g), hydrát hydroxidu lithného (918 mg) a 2 ml vody se zahřívají bez rozpouštědla v uzavřené nádobě při teplotě 145° C po dobu 1 hodiny. Surový produkt se čistí na sloupci silikagelu s mobilní fází chlorform-methanol-vodný amoniak (80:40:4), čímž se získá čistý amin (5,265 g, 94% výtěžek).

Příklady 141,160-162 a 185

Postupuje se podle způsobu z příkladů 190, 189, 191, 192, a 203 výše s tím, že se nahradí 2-(2-aminoethyl)pyrídin l-(2-aminoethyl)-piperazin-2-onem (připraveným následujícím způsobem: čistý fórc-butyldifenylsilylchlorid (25 ml, 97,7 mmol) se přidá po kapkách do roztoku DBU (19,5 ml, 130 mmol) a bis(2-aminoethyl)aminu (4,32 ml, 40 mmol) v bezvodém dimethylacetamidu (80 ml) po chlazení v ledové lázni po dobu asi 5 minut. Směs se míchá po dobu 5 hodin. Po ochlazení na pokojovou teplotu se přidá ethylester bromoctové kyseliny (6,70 ml, 60 mmol). Reakce se míchá po dobu 25 minut, pak odpařuje za vysokého vakua. Zbytek se rozpustí v methanolu (200 ml), přidá se KHCO3 (10 g) a KF (12 g, 200 mmol) a směs se míchá při teplotě 60° C po dobu 5 hodin, přidá se 10 g Na₂CO₃, směs se míchá po dobu 10 minut, ochladí a filtruje. Filtráty se odpařují, zbytek se extrahuje hexany (2 x 250 ml). Látky nerozpustné v hexanu se rozpustí v ethanolu (60 ml), filtrují a odpařují. Zbytek se čistí na sloupci silikagelu s mobilní fází ·· ·· ·· · ·· · • 9·· ··· · · · • · · · · · · · · · · • · 9 · 9 9999999 9 9··· ······ ·· · · ^β *

171 chlorform-methanol-vodný amoniak (80:40:4), čímž se získá čistý amin (4,245 g, 74% výtěžek)). Tímto způsobem se získají požadované sloučeniny.

Příklady 163-167

Postupuje se podle způsobu z příkladů 190, 189, 191, 192, a 203 výše s tím, že se nahradí 2-(2-aminoethyl)pyridin 3-[(2-aminoethyl)amino]propionitrilem (připraveným z ethylendiaminu (150 mmol) a akrylonitrilu (50 mmol) v THF při pokojové teplotě, jak je popsáno v Israel, M, et al: J. Med. Chem. Ί, 1964, 710-16, čímž se získá požadovaný amin (4,294 g)). Tímto způsobem se získají požadované sloučeniny.

Příklad 168 [2-(4-Methylpiperazin-l-yl)-ethyl]-amid 5-(5-fluor-2-oxo-l,2-dihydro-indol-3ylidenmethyl)-2,4-dimethyl-1 //-pyrrol-3 -karboxylové kyseliny

Do míchané žluté kalné směsi 5-[5-fluor-2-oxo-l,2-dihydro-indol-(3Z)ylidenmethyl]-2,4-dimethyl-l//-pyrrol-3-karboxylové kyseliny (90 mg), DMF (0,8 ml) a TEA (0,084 ml) v 20 ml reakční baňce se přidá činidlo BOP (199 mg). Směs pak během 5 minut vyčeří. Do čiré směsi se přidá 2-(4-methylpiperazin-l-yl)ethylamin¹ (51 mg). Výsledný roztok se míchá při pokojové teplotě přes noc. Žluté pevné produkty vyprecipitují z reakčního systému. Podle TLC (10% methanol v methylenchloridu) dojde k úplné konverzi výchozí látky na produkt. Pevný podíl se izoluje vakuovou filtrací a promyje jednou ethanolem (1 ml), sonikuje v diethyletheru (2 ml) po dobu 20 minut a spojí vakuovou filtrací. Po sušení za vakua se získá (4-methylpiperazin-l-yl-ethyl)-amid 5-(5fluor-2-oxo-1,2-dihydro-indol-3 -ylidenmethyl)-2,4-dimethyl-1 //-pyrrol-3 -karboxylové kyseliny (79 mg, 62% výtěžek).

‘H NMR (DMSO-de) δ 2,13 (s, 3H, CH₃), 2,40, 2,42 (2 x s, 6H, 2 x CH₃), 2,41 (m, 2H,

CH₂), 2,47 (m, 8H, 4 x CH₂), 3,30 (m, 2H, CH₂), 6,82 (dd, J=4,5, 8,7 Hz, 1H), 6,9l(td,

J=2,4,³J=8,8 Hz, 1H), 7,43 (t, >5,6 Hz, 1H), 7,70 (s, 1H), 7,75 (dd, >2,8, 9,6 Hz, 1H) (aromatický a vinyl), 10,88 (s, 1H, CONH), 13,67 (s, 1H, NH), LC-MS (m/z) 424,4 (M-l).

172

Příklad 169 (4-Methylpiperazin-l-yl-ethyl)-amid 5-(5-chlor-2-oxo-l,2-dihydro-indol-3-ylidenmethyl)2.4- dimethyl-l//-pyrrol-3-karboxylové kyseliny

Postupuje se podle způsobu z příkladu 168 výše, ale nahradí se 5-[5-fluor-2-oxo1.2- dihydro-indol-(3Z)-ylidenmethyl]-2,4-dimethyl-1//-pyrrol-3-karboxylová kyselina

5- [5-chlor-2-oxo-1,2-dihydro-indol-(3Z)-ylidenmethyl] -2,4-dimethyl-1 //-pyrrol-3 karboxylovou kyselinou (95 mg, 0,3 mmol), čímž se získá (4-methylpiperazin-l-yl-ethyl)amid 5-(5-chlor-2-oxo-l,2-dihydro-indol-3-ylidenmethyl)-2,4-dimethyl-l//-pyrrol-3karboxylové kyseliny(76 mg, 58%).

*H NMR (DMSO-dg) δ 2,13 (s, 3H, CH₃), 2,41, 2,42 (2 x s, 6H, 2 x CH₃), 2,42 (m, 2H, CH₂), 2,48 (m, 8H, 4 x CH₂), 3,30 (m, 2H, CH₂), 6,84 (d, >8,0 Hz, 1H), 7,11 (dd, >2,0, 8,0 Ηζ,ΙΗ), 7,44 (t, >5,6 Hz, 1H), 7,76 (s, 1H), 7,97 (d, >2,0 Hz, 1H) (aromatický a vinyl), 10,98 (s, 1H, CONH), 13,62 (s, 1H, NH), LC-MS (m/z) 440,2 (M-l).

Příklad 170 (4-Methylpiperazin-l-yl-ethyl)-amid 5-(5-brom-2-oxo-l,2-dihydro-indol-3-ylidenmethyl)2.4- dimethyl-l //-pyrrol-3-karboxylové kyseliny

Postupuje se podle způsobu z příkladu 168 výše, ale nahradí se 5-(5-chlor-2-oxo1.2- dihydro-indol-3-ylidenmethyl)-2,4-dimethyl-l//-pyrrol-3-karboxylová kyselina

5-(5-brom-2-oxo-1,2-dihydro-indol-3-ylidenmethyl)-2,4-dimethyl-l//-pyrrol-3karboxylovou kyselinou, čímž se získá (4-methylpiperazin-l-yl-ethyl)-amid 5-(5-brom-2oxo-1,2-dihydro-indol-3-ylidenmethyl)-2,4-dimethyl-l//-pyrrol-3-karboxylové kyseliny (39 mg, 54%) z SU011670 (54 mg, 0,15 mmol).

'H NMR (DMSO-dg) δ 2,14 (s, 3H, CH₃), 2,41, 2,42 (2 x s, 6H, 2 x CH₃), 2,42 (m, 2H, CH₂), 2,48 (m, 8H, 4 x CH₂), 3,31 (m, 2H, CH₂), 6,80 (d, >8,0 Hz, 1H), 7,23 (dd, >2,0, 8,0 Hz, 1H), 7,44 (t, >5,6 Hz, 1H), 7,76 (s, 1H), 8,09 (d, >2,0 Hz, 1H) (aromatický a vinyl), 10,99 (s, 1H, CONH), 13,61 (s, 1H, NH), LC-MS (m/z) 486,6 (M).

Příklad 172 (4-Methylpiperazin-l-yl-ethyl)-amid 5-(2-oxo-l,2-dihydro-indol-3-ylidenmethyl)-2,4dimethyl-1 //-pyrrol-3 -karboxylové kyseliny • · · • · · · · · · · · · · • · · · · · ···· · · · ··· ······ ··· ······ ·· · ·· ·

173

Postupuje se podle způsobu z příkladu 168 výše, ale nahradí se 5-(5-fluor-2-oxol,2-dihydro-indol-3-ylidenmethyl)-2,4-dimethyl-l//-pyrrol-3-karboxylová kyselina

SUO14900 5-(2-oxo-1,2-dihydro-indol-3 -ylidenmethyl)-2,4-dimethyl-1 //-pyrrol-3 karboxylovou kyselinou, čímž se získá (4-methylpiperazin-l-yl-ethyl)-amid 5-(2-oxo-l,2dihydro-indol-3-ylidenmethyl)-2,4-dimethyl-l//-pyrrol-3-karboxylové kyseliny, (136 mg, 84%) a (112,8 mg, 0,4 mmol).

^-NMR (DMSO-dg) δ 2,13 (s, 3H, CH₃), 2,39, 2,42 (2 x s, 6H, 2 x CH₃), 2,42 (m, 2H, CH₂), 2,48 (m, 8H, 4 x CH₂), 3,30 (t, 2H, CH₂), 6,86 (d, >8,0 Hz, 1H), 6,96 (t, >7,4 Hz,

1H), 7,10 (t, >7,8 Hz, 1H), 7,41 (t, >5,4 Hz, 1H), 7,62 (s, 1H), 7,76 (d, >7,6 Hz, 1H) (aromatický a vinyl), 10,88 (s, 1H, CONH), 13,61 (s, 1H, NH), LC-MS (m/z) 406,6 (M-l).

Příklad 171 [2-(3,5-Dimethylpiperazin-1 -yl)ethyl)amid 5-[2-oxo-1,2-dihydro-indol-(3Z)ylidenmethyl]-2,4-dimethyl-1//-pyrrol-3-karboxylové kyseliny

Do míchané žluté kalné směsi 5-[2-oxo-l,2-dihydro-indol-(3Z-)-ylidenmethyl]-2,4dimethyl-1//-pyrrol-3-karboxylové kyseliny (112,8 mg, 0,4 mmol), DMF (0,5 ml) a triethylaminu (0,111 ml) v 20 ml reakční baňce se přidá činidlo BOP (265 mg). Směs je během 5 minut čirá. Do této čiré směsi se přidá 2-(2,6-dimethylpiperazin-l-yl)ethylamin (68,6 mg) (viz Tapia, L. Alonso-Cires, P. Lopez-Tudanca, R. Mosquera, L. Labeaga, A. Innerarity, A. Orjales, J. Med. Chem., 1999, 42, 2870-2880). Výsledný roztok se míchá při pokojové teplotě přes noc. Podle TLC (10% methanol v methylenchloridu) dojde k úplné konverzi výchozí látky na produkt. Reakční směs se odpařuje do sucha a pak purifikuje zrychlenou chromatografii (CH2Cl2/CH₃OH=20/l-15/l), poté rekrystalizací, čímž se získá [2-(3,5-dimethylpiperazin-l-yl-)ethyl)amid 5-[2-oxo-l,2-dihydro-indol-(3Z)ylidenmethyl]-2,4-dimethyl-l//-pyrrol-3-karboxylové kyseliny (83 mg, 50% výtěžek).

^!H NMR (DMSO-dg) 61,15, 1,16 (2 x s, 6H, 2 x CH₃), 1,95 (t, >11,6 Hz, 2H, CH₂), 2,41,2,47 (2 x s, 6H, 2 x CH₃), 2,50 (m, 2H, CH₂), 3,03 (d, >10 Hz, 2H), 3,19 (m, 2H),

3,30 (m, 2H, CH₂), 6,86 (d, >8,0 Hz, 1H), 6,97 (t, >7,2 Hz, 1H), 7,11 (t, >7,8 Hz, 1H),

7,48 (t, >5,6 Hz, 1H), 7,61 (s, 1H), 7,75 (d, >7,6 Hz, 1H) (aromatický a vinyl), 10,88 (s,

1H, CONH), 13,62 (s, 1H, NH), LC-MS (m/z) 422,2 (M+l).

• ·

174

• · · ··· • · · ·· ·

Příklad 173 [2-(3,5-Dimethylpiperazin-1 -yl)ethyl)amid 5-[5-fluor-2-oxo-1,2-dihydro-indol-(3Z)ylidenmethyl] -2,4-dimethyl-1 //-pyrrol-3 -karboxylové kyseliny

Postupuje se podle způsobu z příkladu 168 výše a požadovaná sloučenina se získá ve výtěžku (60 mg, 0,2 mmol).

[0966] 'H NMR (DMSO-d₆) δ 0,891, 0,907 (2 x s, 6H, 2 x CH₃), 1,49 (t, >10,4 Hz, 2H), 2,40, 2,42 (2 x s, 6H, 2 x CH₃), 2,41 (m, 2H, CH₂), 2,74 (m, 4H), 3,30 (m, 2H), 6,82 (dd, >4,5, 8,7 Hz, 1H), 6,90 (td, ²>2,4,³>8,4 Hz, 1H), 7,42 (t, >5,6 Hz, 1H), 7,70 (s, 1H), 7,74 (dd, >4,6, 8,4 Hz, 1H) (aromatický a vinyl), 10,88 (s, 1H, CONH), 13,65 (s, 1H, NH), LC-MS (m/z) 438,4 (M-l).

Příklad 174 [2-(3,5-Dimethylpiperazin-1 -yl)ethyl)amid 5-[5-chlor-2-oxo-1,2-dihydro-indol-(3Z)ylidenmethyl]-2,4-dimethyl-1 //-pyrrol-3 -karboxylové kyseliny

Postupuje se podle způsobu z příkladu 171 výše a požadovaná sloučenina se získá ve výtěžku (31,2 mg, 34%) z 5-[5-chlor-2-oxo-l,2-dihydro-indol-(32)-ylideíimethyl]-2,4dimethyl-1//-pyrrol-3-karboxylové kyseliny (63 mg, 0,2 mmol).

*H NMR (DMSO-d₆) δ 1,15, 1,16 (2 x s, 6H, 2 x CH₃), 1,95 (t, >11,6 Hz, 2H, CH₂),

2.40.2.42 (2 x s, 6H, 2 x CH₃), 2,50 (m, 2H, CH₂), 3,03 (d, >11,2 Hz, 2H), 3,19 (m, 2H), 3,30 (m, 2H, CH₂), 6,85 (d, >8,4 Hz, 1H), 7,11 (dd, >2,0, 8,0 Ηζ,ΙΗ), 7,52 (t, >5,6 Hz, 1H), 7,76 (s, 1H), 7,97 (d, >2,0 Hz, 1H) (aromatický a vinyl), 10,99 (s, 1H, CONH), 13,63 (s, 1H, NH), LC-MS (m/z) 456,2 (M+l).

Příklad 175 [2-(3,5-Dimethylpiperazin-1 -yl)ethyl)amid 5-[5-brom-2-oxo-1,2-dihydro-indol-(3Z)ylidenmethyl]-2,4-dimethyl-l//-pyrrol-3-karboxylové kyseliny

Postupuje se podle způsobu z příkladu 171 výše a požadovaná sloučenina se získá ve výtěžku (40 mg, 40%) z 5-[5-brom-2-oxo-l,2-dihydro-indol-(3Z)-ylidenmethyl]-2,4dimethyl-1//-pyrrol-3-karboxylové kyseliny (74 mg, 0,2 mmol).

'H NMR (DMSO-dó) δ 1,15,1,16 (2 x s, 6H, 2 x CH₃), 1,95 (t, >11,6 Hz, 2H, CH₂), 2,40,

2.42 (2 x s, 6H, 2 x CH₃), 2,50 (m, 2H, CH₂), 3,03 (d, >10,4 Hz, 2H), 3,19 (m, 2H), 3,30 •999 999 99 9

9 9 9 9 9 9 9 9 9 • 9 · · · · ♦ φ · · · • · 9 9 9 9999999 9999

999999 9 9 9 99 φ

175 (m, 2Η, CH₂), 6,81 (d, >8,4 Hz, 1H), 7,24 (dd, >2,0, 8,4 Hz, 1H), 7,51 (t, >5,6 Hz, 1H),

7,76 (s, 1H), 8,10 (d, >2,0 Hz, 1H) (aromatický a vinyl), 10,99 (s, 1H, CONH), 13,62 (s,

1H, NH), LC-MS (m/z) 498,4 (M-l).

Příklad 205 (32)-3 -[(3,5 -dimethyl-1 H-pyrrol-2-yl)-methyliden]-1 -[1 -(4-methylpiperazinyl)methyl] -1,3dihydro-2//-indol-2-on

A-Methylpiperazin (10 g, 100 mmol) se přidá do míchaného roztoku vodného formaldehydu (10 g z 38% roztoku, 100 mmol) a 3-(3,5-dimethyl-l//-pyrrol-2ylmethyliden)-l,3-dihydro-indol-2-onu (2,38 g, 10 mmol) v methanolu (100 ml). Roztok se zahřívá při teplotě 60° C po dobu 1 hodiny, koncentruje na malý objem a precipitát se odfiltruje, promyje methanolem a suší, čímž se získá 2,38 g požadované sloučeniny. Teplota tání 160-164° C. HPLC Rt 4,72 min.

‘H NMR (CDC1₃) δ 2,26 (s, 3H), 2,33 (s, 3H), 2,38 (s, 3H), 2,43 (br s, 4H), 2,70 (br s, 4H),

4,59 (s, 2H), 5,96 (d, 1H), 7,02-7,08 (m, 2H), 7,15 (dd, 1H), 7,38 (s, 1H), 7,48 (dd, 1H) a 13,0 (br s, 1H), Analyticky vypočteno pro C₂iH₂₆N4O: C, 71,97; H, 7,48; N, 15,99. Naměřeno: C, 71,75; H, 7,46; N, 15,87.

(3Z)-3 - [(3,5-Dimethyl-1 //-pyrrol-2-yl)-methyliden]-1 -[ 1 -(4-methylpiperazinyl)-methyl] l,3-dihydro-2/7-indol-2-on se konvertuje na dihydrochlorid.

Příklad 206

Syntéza (3Z)-3 - [(3,5-dimethyl-177-pyrrol-2-yl)-methylidenj-1 -(-1 -pyrrolidinylmethyl)-1,3dihydro-2//-indol-2-onu

Pyrrolidin (450 mg, 6,3 mmol) se přidá do míchaného roztoku vodného formaldehydu (500 mg z 38% roztoku, 6,0 mmol) a 3-(3,5-dimethyl-l//-pyrrol-2ylmethyliden)-l,3-dihydro-indol-2-onu (900 mg, 3,8 mmol) v methanolu (50 ml). Po 15 minutách se roztok ochladí na teplotu 0° C a precipitát se odfiltruje, promyje vodou a suší, čímž se získá 1,08 g požadované sloučeniny. Teplota tání 129-132° C, HPLC Rt 4,87 minut.

• · • ·

176 ‘H NMR [(CD₃)₂SO] δ 1,65 (m, 4H), 2,32 (s, 3H), 2,34 (s, 3H), 2,62 (m, 4H), 4,72 (s, 2H) 6,07 (d, 1H), 7,00 (m, 1H), 7,15 (m, 2H), 7,61 (s, 1H), 7,76 (d, 2H) a 13,1 (br s, 1H), Analyticky vypočteno pro C₂₀H₂₃N₃O: C, 74,74; H, 7,21; N, 13,07. Naměřeno: C, 74,61; H, 7,25; N, 13,03.

Biologické testy

Inhibitory protein kinázy obecného vzorce (I):

Následující testy mohou být používány ke stanovení hladiny aktivity a účinku sloučenin obecného vzorce (I) na jedné nebo více protein kináz (dále PK). Podobné testy mohou být navrženy se stejnými liniemi pro kterékoliv PK pomocí dobře známých technik.

Postupy

Několik testů popsaných v předloženém vynálezu je prováděno technikou ELIS A (Enzyme-Linked Immunosorbent Sandwich Assay) (Voliér, et al, 1980, Enzyme-Linked Immunosorbent Assay, Manual of Clinical Immunology, 2d ed., Rose a Friedman, Am. Soc. Of Microbiology. Washington, D.C., 359-371). Obecný způsob je následující: sloučenina obecného vzorce (I) se zavádí do buněk exprimujících testovanou kinázu, buď přirozenou nebo rekombinantní, po vybranou dobu, po které se k testované kináze, pokud je receptorová, přidá k aktivaci známý ligand. Buňky se lyžují a lyzát se převede do jamek ELIS A destičky předem potažených specifickou protilátkou rozpoznávající substrát enzymatické fosforylační reakce. Nesubstrátové komponenty buněčného lyzátu se odmyjí a míra fosfory láce substrátu se stanoví s protilátkou specificky rozpoznávající fosfotyrosin v porovnání s kontrolními buňkami, které nepřišly v kontakt s testovanou sloučeninou.

Uvedené výhodné postupy provádění ELIS A experimentů se specifickými PK jsou uvedeny níže. Nicméně adaptace těchto postupů určených ke stanovení aktivity sloučenin vůči jiným receptorovým tyrosinkinázám (RTK), jakož i cytoplazmovým tyrosinkinázám (CTK) a serin/threoninkinázám (STK) spadají rovněž mezi znalosti odborníků v oboru. V dalších testech popisovaných v předloženém vynálezu je měřena míra tvorby DNA jako odpovědi na aktivaci testované kinázy, která je hlavní mírou proliferativní odpovědi. Obecný postup testu je následující: sloučenina se zavede do buněk exprimujících testovanou kinázu, buď přirozenou nebo rekombinantní, po vybranou dobu, po které se k

177 ·» ·· • · * · · • · · · • · · · · • · · ♦ ···· ·· • · • · · • ···· • · • · · • ··· testované kináze, pokud je receptorová, přidá k aktivaci známý ligand. Po inkubaci alespoň přes noc se přidá činidlo značící DNA, např. 5-bromdeoxyuridin (BrdU) nebo H³-thymidin. Množství značené DNA se detekuje buď protilátkou anti-BrdU nebo měřením radioaktivity a srovnání s kontrolními buňkami, které nepřišly do kontaktu s testovanou sloučeninou.

Biologický test s GST-FLK-1

Tento test analyzuje tyrosinkinázovou aktivitu GST-Flkl na poly(glu,tyr) peptidech.

Materiály a činidla:

1. Corning 96-jamkové ELISA destičky (Corning Catalog No. 5805-96).

2. poly(glu,tyr) 4:1, lyofilizát (Sigma Catalog #PO275).

3. Příprava poly(glu,tyr)(pEY) potažených destiček k testům: Potažení 2 pg/jamka poly(glu,tyr)(pEY) v 100 μΐ PBS, uchovávání při pokojové teplotě po dobu 2 hodin nebo při teplotě 4° C přes noc. Potažení jamek destiček k zabránění odpařování.

4. PBS pufr: na 1 litr, smíchání 0,2 g KH2PO4,1,15 g Na₂HPO4, 0,2 g KC1 a 8 g NaCl v přibližně 900 ml dH₂O. Pokud se všechny činidla rozpustí, pH se upraví na 7,2 s HC1. Upravení objemu na 1 litr s dH₂O.

5. PBST pufr: na 1 litr PBS pufru, přidání 1,0 ml Tween-20.

6. TBB-blokovací pufr: na 1 litr, smíchání 1,21 g TRIS, 8,77 g NaCl, 1 ml TWEEN20 v přibližně 900 ml dH₂O. Upravení pH na 7,2 s HC1. Přidání 10 g BSA, míchání za účelem rozpuštění. Upravení celkového objemu na 1 litr s dH₂O. Filtrování k odstranění pevných částic.

7. 1% BSA v PBS: K připravení 1 x pracovního roztoku, přidání 10 g BSA na přibližně 990 ml PBS pufru, míchání za účelem rozpuštění. Upravení celkového objemu na 1 litr s PBS pufřem, filtrování k odstranění pevných částic.

8. 50 mM Hepes pH 7,5.

9. GST-Flkl cd purifikovaný od sf9 transformace rekombinantního baculoviru (SUGEN, lne.).

10. 4%DMSOvdH₂O.

11. 10 mM ATP v dH₂O.

178 • Φ ··

I Φ Φ <

• · 4 • · <

φφ φ • φ · • φ φ · « · ···· • · · ·· · • Φ · • φ φ • φ · · • · φφφφ • φ φ ·· ·

12. 40 mM MnCl₂

13. Kinázový ředící pufr (KDB): smíchání 10 ml Hepes (pH 7,5), 1 ml 5M NaCl, 40 μΐ 100 mM orthovanadičnanu sodného a 0,4 ml z 5% BSA v dH₂O s 88,56 ml dH₂O.

14. NUNC 96-jamkové V destičky s polypropylenovým dnem. Applied Scientific Catalog #AS-72092.

15. EDTA: smíchání 14,12 g ethylendiamintetraoctové kyseliny (EDTA) s přibližně 70 ml dH₂O. Přidávání 10N NaOH, dokud se EDTA nerozpustí. Upravení pH na 8,0. Upravení celkového objemu na 100 ml s dH₂O.

16. 1° protilátkový ředící pufr: smíchání 10 ml z 5% BSA v PBS pufru s 89,5 ml TBST.

17. Anti-fosfotyrosinová monoklonální protilátka konjugovaná s křenovou peroxidázou (PY99 HRP, Santa Cruz Biotech).

18. 2,2'-Azinobis(3-ethylbenzthiazolin-6-sulfonová kyselina (ABTS, Moss, Cat. No. ABST).

19. 10%SDS.

Postup:

1. Potažení Corning 96-jamkové ELIS A destičky s 2 pg polyEY peptidem ve sterilním PBS Jak je popsáno v kroku 3 této sekce.

2. Odstranění nenavázané tekutiny z jamek překlopením destiček. Promytí 1 x s TBST. Poklepání destičky na papírovém ručníku k odstranění přebývající tekutiny.

3. Přidání 100 μΐ 1% BSA v PBS do každé jamky. Inkubace s třepáním po dobu 1 hodiny při pokojové teplotě.

4. Opakování kroku 2.

5. Navlhčení jamek 50 mM HEPES (pH 7,5) (150 μΐ/jamka).

6. Čtyřnásobné naředění testované sloučeniny s dH₂O/4% DMSO na požadovanou finální koncentraci k testu v 96-jamkových destičkách s polypropylenovým dnem.

7. Přidání 25 μΐ zředěné testované sloučeniny do ELISA destičky. V kontrolních jamkách přidání 25 μΐ z dH₂O/4% DMSO.

8. Přidání 25 μΐ 40 mM MnCl₂ s 4 x ATP (2 μΜ) do každé jamky.

9. Přidání 25 μΐ 0,5M EDTA do negativních kontrolních jamek.

10. Zředění GST-Flkl na 0,005 μg (5 ng)/jamku s KDB.

11. Přidání 50 μΐ zředěného enzymu do každé jamky.

179 ·· ··

9 9

9 9 9

9

9999 99

9

9 9

9 9 9

9 9999

9 9

9

12. Inkubace s třepáním po dobu 15 minut při pokojové teplotě.

13. Zastavení reakce přidáním 50 μΐ z 250 mM EDTA (pH 8,0).

14. Promytí 3 x s TBST a poklepání destičky na papírovém ručníku k odstranění přebývající tekutiny.

15. Přidání 100 μΐ/jamka anti-fosfotyrosin HRP konjugátu, zředění 1:5,000 v protilátkovém ředícím pufru. Inkubace s třepáním po dobu 90 minut při pokojové teplotě.

16. Promytí j ako v kroku 14.

17. Přidání 100 μΐ z ABTS roztoku při pokojové teplotě do každé jamky.

18. Inkubace s třepáním po dobu 10 až 15 minut. Odstranění všech bublinek.

19. Zastavení reakce přidáním 20 μΐ 10% SDS do každé jamky.

20. Změření na přístroji Dynatech MR7000 ELISA reader s testovacím filtrem při 410 nM a referenčním filtrem při 630 nM.

Biologický test s PYK2

Tento test je používán k měření in vitro kinázové aktivity HA epitopem značené celé pyk2 (FL.pyk2-HA) na ELISA testu.

Materiály a činidla:

1. Corning 96-jamkové ELISA destičky.

2. 12CA5 monoklonální anti-HA protilátka (SUGEN, lne.)

3. PBS (Dulbecco's Phosphate-Buffered Salině (Gibco Catalog #450-1300EB)

4. TBST pufr: na 1 litr, smíchání 8,766 g NaCl, 6,057 g TRIS a 1 ml 0,1% Triton X100 v přibližně 900 ml dH₂O. Upravení pH na 7,2, upravení objemu na 1 litr.

5. Blokovací pufr: na 1 litr, smíchání 100 g 10% BSA, 12,1 g 100 mM TRIS, 58,44 g

1M NaCl a 10 ml 1 % TWEEN-20.

6. FL.pyk2-HA z sf9 buněčných lyzátů (SUGEN, lne.).

7. 4% DMSO v MilliQue H₂O.

8. 10 mM ATP v dH₂O,

9. 1M MnCl₂,

10. lMMgCl₂,

11. 1M Dithiothreitol (DTT).

·· ·· ·· · ·· · • · · · · · * · » · • · · · ··· · · · · • · · · · · ···· · · · ·»·· • · · ··· · · · ·«·· ·· ·· · ·· ♦

180

12. 10 x kinázový fosforylační pufr: smíchání 5,0 ml 1M Hepes (pH 7,5), 0,2 ml 1M MnCl₂, 1,0 ml 1 M MgCl₂, 1,0 ml 10% Triton X-100 v 2,8 ml dH₂O. Těsně před použitím přidání 0,1 ml 1M DTT.

13. NUNC 96-jamkové V destičky s polypropylenovým dnem.

14. 500 mM EDTA v dH₂O.

15. Protilátkový ředící pufr: na 100 ml, 1 ml 5% BSA/PBS a 1 ml 10% Tween-20 v 88 ml TBS.

16. HRP-konjugovaná anti-Ptyr PY99), Santa Cruz Biotech Cat, No. SC-7020.

17. ABTS, Moss, Cat. No. ABST-2000.

18. 10%SDS.

Postup:

1. Potažení Corning 96-jamkových ELISA destiček 0,5 pg/jamku 12CA5 anti-HA protilátky v 100 μΐ PBS. Skladování přes noc při teplotě 4° C.

2. Odstranění nenavázané HA protilátky z jamek překlopením destičky. Promytí destičky s dH₂O. Poklepání destičky na papírovém ručníku k odstranění přebývající tekutiny.

3. Přidání 150 μΐ blokovacího pufru do každé jamky. Inkubace s třepáním po dobu 30 minut při pokojové teplotě.

4. Promytí destičky 4 x s TBS-T.

5. Zředění lyzátu v PBS (1,5 pg lyzát/100 μΐ PBS).

6. Přidání 100 μΐ zředěného lyzátu do každé jamky. Třepání při pokojové teplotě po dobu 1 hodiny.

7. Promytí jako v kroku 4.

8. Přidání 50 μΐ z 2X kinázového pufru do ELISA destičky obsahující zachycenou pyk2-HA.

9. Přidání 25 μΐ 400 μΜ testované sloučeniny v 4% DMSO do každé jamky. U kontrolních jamek použití samotného 4% DMSO.

10. Přidání 25 μΐ 0,5 M EDTA do negativních kontrolních jamek.

11. Přidání 25 μΐ 20 μΜ ATP do všech jamek. Inkubace s třepáním po dobu 10 minut.

12. Zastavení reakce přidáním 25 μΐ 500 mM EDTA (pH 8,0) do všech jamek.

13. Promytí j ako v kroku 4.

• ·

181 • 9 9 • · • · • 9 ···· ·· · • · · • · · · • · ·· · • · 9

9

9 9

9 9 9

9 999

9 9

9

14. Přidání 100 μΐ HRP konjugované anti-Ptyr zředěné 1:6000 v protilátkovém ředícím pufru do každé jamky. Inkubace s třepáním po dobu 1 hodiny při pokojové teplotě.

15. Promytí destičky 3X TBST a IX s PBS.

16. Přidání 100 μΐ ABST roztoku do každé jamky.

17. Pokud je třeba, zastavení reakce přidáním 20 μΐ 10% SDS do každé jamky.

18. Měření destiček na přístroji ELIS A reader s testovacím filtrem při 410 nM a referenčním filtrem při 630 nM.

Biologický test s FGFR1

Tento test je používán k měření in vitro kinázové aktivity FGF1-R na ELISA testu. Materiály a činidla:

1. Costar 96-jamkové ELISA destičky (Corning Catalog #3369).

2. Poly(Glu-Tyr) (Sigma Catalog #PO275).

3. PBS (Gibco Catalog #450-1300EB)

4. 50 mM Hepes pufrovací roztok.

5. Blokovací pufr (5% BSA/PBS).

6. Purifikovaná GST-FGFR1 (SUGEN, lne.)

7. Kinázový ředící pufr.

Smíchání 500 μΐ 1M Hepes (GIBCO), 20 μΐ 5% BSA/PBS, 10 μΐ 100 mM orthovanadičnanu sodného a 50 μΐ 5M NaCl.

8. lOmMATP

9. ATP/MnCL fosforylační mix: smíchání 20 μΐ ATP, 400 μΐ 1M MnCl₂ a 9,56 ml dH₂O.

10. NUNC 96-jamkové V destičky s polypropylenovým dnem (Applied Scientific Catalog #AS-72092).

11. 0,5MEDTA.

12. 0,05% TBST

Přidání 500 μΐ TWEEN do 1 litru TBS.

13. Králičí polyklonální anti-fosfotyrosinové sérum (SUGEN, lne.).

14. Kozí anti-králičí IgG peroxidázový konjugát (Biosource, Catalog #ALI0404).

15. ABTS roztok.

16. ABTS/H₂O₂ roztok.

182 ♦· ·· · ·* * • · · · · · · · « ♦ • · · · ··· · · * · • · · · · · ···· · · · ···· ··· · · · ·«· ··*· ·· ·· * ·· *

Postup:

1. Potažení Costar 96-jamkových ELISA destiček s 1 pg/jamka Poly(Glu,Tyr) v 100 μΐ PBS. Skladování přes noc při teplotě 4° C.

2. Promytí potažených destiček 1 x PBS.

3. Přidání 150 μΐ 5%BSA/PBS blokovacího pufru do každé jamky. Inkubace za třepáním po dobu 1 hodiny při pokojové teplotě.

4. Promytí destičky 2 x PBS, pak 1 x 50 mM Hepes. Poklepání destiček na papírovém ručníku k odstranění přebývající tekutiny a bublinek.

5. Přidání 25 μΐ 0,4 mM testované sloučeniny v 4% DMSO nebo samotného 4% DMSO (kontroly) do destiček.

6. Zředění purifikované GST-FGFR1 v kinázovém ředícím pufru (5 ng kináza/50 μΐ KDB/jamku).

7. Přidání 50 μΐ zředěné kinázy do každé jamky.

8. Nastartování kinázové reakce přidáním 25 μΐ/jamka čerstvě připraveného ATP/Mn++ (0,4 ml 1M MnCl₂, 40 μΐ 10 mM ATP, 9,56 ml dH₂O), rovněž čerstvě připravený).

9. Toto je rychlá kinázová reakce a musí být zastavena 25 μΐ 0,5M EDTA podobným způsobem jako je přidání ATP.

10. Promytí destičky 4 x čerstvým TBST.

11. Připravení protilátkového ředícího pufru: na 50 ml:

Smíchání 5 ml 5% BSA, 250 μΐ 5% mléka a 50 μΐ 100 mM vanadičnanu sodného, upravení finálního objemu s 0,05% TBST.

12. Přidání 100 μΐ/jamka anti-fosfotyrosinu (1:10000 zředění v ADB).

Inkubace za třepání po dobu 1 hodiny při pokojové teplotě.

13. Promytí jako v kroku 10.

14. Přidání 100 μΐ/jamka kozího anti-králičího IgG peroxidázového konjugátu od Biosource (1:6000 zředění v ADB). Inkubace za třepání po dobu 1 hodiny při pokojové teplotě.

15. Promytí j ako v kroku 10,paksPBSk odstranění bublinek a přebývaj í cí T WEEN.

16. Přidání 100 μΐ ABTS/H₂O₂ roztoku do každé jamky.

17. Inkubace za třepáním po dobu 10 až 20 minut. Odstranění všech bublinek.

• · ·

183

18. Měření na přístroji Dynatech MR7000 elisa reader s testovacím filtrem při 410 nM a referenčním filtrem při 630 nM.

Biologický test EGFR

Tento test je používán pro stanovení in vitro kinázové aktivity FGF1-R na ELISA testu.

Materiály a činidla:

1. Corning 96-j amkové ELISA destičky.

2. SUMO1 monoklonální anti-EGFR protilátka (SUGEN, lne.).

3. PBS

4. TBST pufr

5. Blokovací pufr: na 100 ml, smíchání 5,0 g Camation Instant Non-fat Milk® s 100 ml PBS.

6. A431 buněčný lyzát (SUGEN, lne.).

7. TBS pufr:

8. TBS+10% DMSO: na 1 litr, smíchání 1,514 g TRIS, 2,192 g NaCl a 25 ml DMSO; doplnění dH₂O na celkový objem 1 litr.

9. ATP (Adenosin-5'-trifosfát, z koňského svalu, Sigma Cat. No. A-5394), 1,0 mM roztok v dH₂O. Toto činidlo by mělo být připraveno těsně před použitím a uchováváno v ledu.

10. l,0mMMnCl₂.

11. ATP/MnCl₂ fosforylační mix: k připravení 10 ml, smíchání 300 μΐ 1 mM ATP, 500 μΐ MnCl₂ a 9,2 ml dH₂O. Připraveno těsně před použitím a uchovávání v ledu.

12. NUNC 96-jamkové V destičky s polypropylenovým dnem.

13. EDTA.

14. Králičí polyklonální anti-fosfotyrosinové sérum (SUGEN, lne.).

15. Kozí anti-králičí IgG peroxidázový konjugát (Biosource Cat. No. ALI0404).

16. ABTS.

17. 30% peroxid vodíku.

18. ABTS/H₂O₂

19. 0,2 MHC1.

Postup:

• · • ·

184

1. Potažení Corning 96-jamkových ELIS A destiček s 0,5 pg SUMO1 v 100 μΐ PBS/jamka, skladování přes noc při teplotě 4° C.

2. Odstranění nenavázané SUMO1 z jamek překlopením destiček k odstranění tekutiny. Promytí 1 x dH₂O. Poklepání destičky na papírovém ručníku k odstranění přebývající tekutiny.

3. Přidání 150 μΐ blokovacího pufru do každé jamky. Inkubace za třepáním po dobu 30 minut při pokojové teplotě.

4. Promytí destičky 3 x deionizovanou vodou, pak 1 x TBST. Poklepání destičky na papírovém ručníku k odstranění přebývající tekutiny a bublinek.

5. Zředění lyzátu v PBS (7 pg lyzát/100 μΐ PBS).

6. Přidání 100 μΐ zředěného lyzátu do každé jamky. Třepání při pokojové teplotě po dobu 1 hodiny.

7. Promytí destičky jako v bodě 4 výše.

8. Přidání 120 μΐ TBS do ELISA destičky obsahující zachycenou EGFR.

9. Zředění testované sloučeniny 1:10 v TBS, nanesení do jamek.

10. Přidání 13,5 μΐ zředěné testované sloučeniny do ELISA destičky. Přidání do kontrolních jamek 13,5 μΐ TBS v 10% DMSO.

11. Inkubace za třepáním po dobu 30 minut při pokojové teplotě.

12. Přidání 15 μΐ fosforylačního mixu do všech jamek kromě negativních kontrolních jamek. Finální objem v jamce by měl přibližně být 150 μΐ s finální koncentrací 3 μΜ ATP/5 mM MnCl₂ v každé jamce. Inkubace za třepání po dobu 5 minut.

13. Zastavení reakce přidáním 16,5 μΐ EDTA roztoku za třepání. Třepání další 1 minutu.

14. Promytí 4 x deionizovanou vodou, 2 x TBST.

15. Přidání 100 μΐ anti-fosfotyrosinu (1:3000 zředění v TBST)/jamka. Inkubace za třepáním po dobu 30-45 minut, při pokojové teplotě.

16. Promytí jako v bodě 4 výše.

17. Přidání 100 μΐ kozího anti-králičího IgG peroxidázového konjugátu od Biosource (1:2000 zředění v TBST) do každé jamky. Inkubace za třepání po dobu 30 minut při pokojové teplotě.

18. Promytí jako v bodě 4 výše.

19. Přidání 100 μΐ ABTS/H₂O₂ roztoku do každé jamky.

. · · · . ·· ·· · , · · ·· · ·« · ·· I · · · ·^: ;·Η^:Τ

185

20. Inkubace 5 až 10 minut za třepání. Odstranění všech bublinek.

21. Pokud je třeba, zastavení reakce přidáním 100 μΐ 0,2 M HCl/jamka.

22. Měření na přístroji Dynatech MR7000 ELISA reader s testovacím filtrem při 410 nM a referenčním filtrem při 630 nM.

Biologický test s PDGFR

Tento test je používán pro stanovení in vitro kinázové aktivity FGF1-R na ELISA testu.

Materiály a činidla:

1. Corning 96-jamkové ELISA destičky

2. 28D4C10 monoklonální anti-PDGFR protilátka (SUGEN, lne.).

3. PBS.

4. TBST pufr.

5. Blokovací pufr (stejný jako při biologickém testu s EGFR).

6. PDGFR-β exprimující NIH 3T3 buněčný lyzát (SUGEN, lne.).

7. TBS pufr.

8. TBS+10%DMSO.

9. ATP.

10. MnCl₂.

11. Kinázový pufrový fosforylační mix: na 10 ml, smíchání 250 μΐ 1M TRIS, 200 μΐ 5M NaCl, 100 μΐ 1M MnCl₂ a 50 μΐ 100 mM Triton X-100 v dostatečném množství dH₂O k připravení 10 ml.

12. NUNC 96-jamkové V destičky s polypropylenovým dnem.

13. EDTA.

14. Králičí polyklonální anti-fosfotyrosinové sérum (SUGEN, lne.).

15. Kozí anti-králičí IgG peroxidázový konjugát (Biosource Cat, No. ALI0404).

16. ABTS.

17. Peroxid vodíku, 30% roztok,

18. ABTS/H₂O₂.

19. O,2MHC1.

Postup:

186

1. Potažení Corning 96-jamkových ELIS A destiček 0,5 pg 28D4C10 v 100 μΐ PBS/jamka, skladování přes noc při teplotě 4° C.

2. Odstranění nenavázané 28D4C10 z jamek překlopením destiček k odstranění tekutiny.

Promytí 1 x dH₂O. Poklepání destičky na papírovém ručníku k odstranění přebývající tekutiny.

3. Přidání 150 μΐ blokovacího pufru do každé jamky. Inkubace po dobu 30 minut při pokojové teplotě za třepání.

4. Promytí destičky 3 x deionizovanou vodou, pak 1 x TBST. Poklepání destičky na papírovém ručníku k odstranění přebývající tekutiny a bublinek.

5. Zředění lyzátu v HNTG (10 pg lyzát/100 μΐ HNTG).

6. Přidání 100 μΐ zředěného lyzátu do každé jamky. Třepání při pokojové teplotě po dobu 60 minut.

7. Promytí destiček, jak je popsáno v kroku 4.

8. Přidání 80 μΐ pracovního kinázového pufrovacího mixu do ELISA destičky obsahující zachycenou PDGFR.

9. Zředění testované sloučeniny 1:10 v TBS v 96-jamkových polypropylenových destičkách.

10. Přidání 10 μΐ zředěné testované sloučeniny do ELISA destičky. Přidání 10 μΐ TBS+10% DMSO do kontrolních jamek. Inkubace za třepání po dobu 30 minut při pokojové teplotě.

11. Přidání 10 μΐ ATP přímo do všech jamek kromě negativních kontrolních jamek (finální objem v jamce by měl být přibližně 100 μΐ 20 μΜ ATP v každé jamce) Inkubace 30 minut za třepání.

12. Zastavení reakce přidáním 10 μΐ EDTA roztoku do každé jamky.

13. Promytí 4 x deionizovanou vodou, dvakrát s TBST.

14. Přidání 100 μΐ anti-fosfotyrosinu (1:3000 zředění v TBST)/jamka. Inkubace za třepání po dobu 30-45 minut při pokojové teplotě.

15. Promytí j ako v kroku 4.

16. Přidání 100 μΐ kozího anti-králičího IgG peroxidázového konjugátu Biosource (1:2000 zředění v TBST) do každé jamky. Inkubace za třepání po dobu 30 minut při pokojové teplotě.

• ·

187 ····

• ···

17. Promytí j ako v kroku 4.

18. Přidání 100 μΐ ABTS/H2O2 roztoku do každé jamky.

19. Inkubace 10 až 30 minut za třepání. Odstranění všech bublinek.

20. Pokud je třeba zastavení reakce přidáním 100 μΐ 0,2 M HCl/jamka.

21. Měření na přístroji Dynatech MR7000 ELIS A reader s testovacím filtrem při 410 nM a referenčním filtrem při 630 nM.

Test s buněčnou HER-2 kinázou

Tento test je používán pro měření HER-2 kinázové aktivity v celých buňkách v ELISA formátu.

Materiály a činidla:

1. DMEM (GIBCO Catalog #11965-092).

2. Fetální bovinní sérum (FBS, GIBCO Catalog #16000-044), inaktivace záhřevem ve vodní lázni po dobu 30 minut při teplotě 56° C.

3. Trypsin (GIBCO Catalog #25200-056).

4. L-Glutamin (GIBCO Catalog #25030-081)

5. HEPES (GIBCO Catalog #15630-080).

6. Růstové médium

Smíchání 500 ml DMEM, 55 ml záhřevem inaktivovaného FBS, 10 ml HEPES a

5,5 ml L-Glutaminu.

7. Starvační médium

Smíchání 500 ml DMEM, 2,5 ml záhřevem inaktivovaného FBS, 10 ml HEPES a

5,5 ml L-Glutaminu.

8. PBS.

9. 96-jamkové mikrotitrační destičky pro tkáňovou kulturu (Corning Catalog #25860).

10. 15 cm misky pro tkáňovou kulturu (Corning Catalog #08757148).

11. Corning 96-jamkové ELISA destičky.

12. NUNC 96-jamkové V destičky s polypropylenovým dnem.

13. Costar Transfer Catridge pro Transtar 96 (Costar Catalog #7610).

14. SUMO 1: monoklonální anti-EGFR protilátka (SUGEN, lne.).

15. TBSTpufr.

16. Blokovací pufr: 5% Camation Instant Milk® v PBS.

188

17. EGF Ligand: EGF-201, Shinko American, Japan. Prášek suspendovaný v 100 μΐ 10 mM HC1. Přidání 100 μΐ 10 mM NaOH. Přidání 800 μΐ PBS a převedení od eppendorfových zkumavek, do použití skladování při teplotě -20° C.

18. HNT G lyzovací pufr

Pro zásobní roztok 5 x HNTG, smíchání 23,83 g Hepes, 43,83 g NaCl, 500 ml glycerol a 100 ml Triton X-100 a dostatečné množství dH₂O k vytvoření 1 litru celkového roztoku.

Pro 1 x HNTG*, smíchání 2 ml HNTG, 100 μΐ 0,1Μ Na₃VO4, 250 μΐ 0,2M Na4P₂O7 a 100 μΐ EDTA.

19. EDTA.

20. Na₃VO4, k vytvoření zásobního roztoku, smíchání 1,84 g Na₃VO4 s 90 ml dH₂O. Upravení pH na 10. Vaření v mikrovlnné troubě po dobu jedné minuty (roztok se vyčeří).

Ochlazení na pokojovou teplotu. Upravení pH na 10. Opakování cyklu zahřívání/chlazení, dokud pH nezůstane na 10.

21. 200mMNa4P₂O₇.

22. Králičí polyklonální antisérum specifické pro fosfotyrosin (anti-Ptyr protilátka, SUGEN, lne.).

23. Afínitně purifíkované antisérum, kozí anti-králičí IgG protilátka, peroxidázový konjugát (Biosource Cat #ALI0404).

24. ABTS roztok.

25. 30% roztok peroxidu vodíku.

26. ABTS/H₂O₂.

27. 0,2 M HC1.

Postup:

1. Potažení Corning 96-jamkových ELISA destiček se SUMO1 v 1,0 pg/jamka v PBS, 100 μΐ finální objem/jamka. Skladování přes noc při teplotě 4° C.

2. V den použití odstranění potahovacího pufru a promytí destičky 3 x dH₂O a 1 x TBST pufrem. Veškeré promývání by mělo být provedeno tímto způsobem, pokud není uvedeno jinak.

3. Přidání 100 μΐ blokovacího pufru do každé jamky. Inkubace destičky s třepáním po dobu 30 minut při pokojové teplotě. Těsně před použitím promytí destičky.

4. U tohoto testu použití EGFr/HER-2 chimera/3T3-C7 buněčné linie.

189 ♦ · · * • ···· • · • · ···· ··

5. Vybrání misek majících 80-90% konfluenci. Sbírání buněk trypsinizací a centrifugací při 1000 rpm při pokojové teplotě po dobu 5 minut.

6. Resuspendování buněk ve starvačním médiu a vyhodnocení s trypanovou modří. Vyžadována je životnosti nad 90%. Naočkování buněk ve starvačním médiu o hustotě 2500 buněk/jamka, 90 μΐ/jamka v 96-jamkových mikrotitračních destičkách. Inkubace naočkovaných buněk přes noc při teplotě 37° za atmosféry 5% CO₂.

7. Začátek testu dva dny po naočkování.

8. Testované sloučeniny se rozpustí v 4% DMSO. Vzorky se pak dále zředí přímo na destičkách s starve-DMEM. Typicky bude zředění 1:10 nebo větší. Všechny jamky jsou pak převedeny do buněčné destičky s dalším zředěním 1:10 (10 μΐ vzorek a médium do 90 μΐ starvačního média. Finální koncentrace DMSO by měla být 1% nebo nižší. Může být také používáno standardní sériové zředění.

9. Inkubace za atmosféry 5% CO₂ při teplotě 37° C po dobu 2 hodin.

10. Připravení EGF ligandu zředěním zásobního EGF (16,5 μΜ v horkém DMEM na 150 nM.

11. Připravení čerstvého HNTG* v dostatečném množství pro 100 μΐ/jamka; umístnění do ledu.

12. Po 2 hodinách inkubace s testovanou sloučeninou přidání připraveného EGF ligandu do buněk, 50 μΐ/jamku, na finální koncentraci 50 nM. Do pozitivních kontrolních jamek přidání stejného množství EGF. Do negativních kontrolních jamek se nepřidá EGF. Inkubace při teplotě 37° C po dobu 10 minut.

13. Odstranění testované sloučeniny, EGF a DMEM. Promytí buněk 1 x PBS.

14. Převedení HNTG* do buněk, 100 μΐ/jamka. Vložení do ledu na 5 minut.

Mezitím odstranění blokovacího pufru z ELISA destičky a promytí.

15. Sundání buněk z destiček mikropipetorem a homogenizace buněčného materiálu opakovanou aspirací a dispenzací HNTG* lyzovacího pufru. Převedení lyzátu do potažené, blokované, promyté ELISA destičky. Nebo použití transferového catridge k přenosu lyzátu na destičku.

16. Inkubace za třepáním při pokojové teplotě po dobu 1 hodiny.

17. Odstranění lyzátu, promytí, převedení čerstvě zředěné anti-Ptyr protilátky (1:3000 v TBST) na ELISA destičku, 100 μΐ/jamka.

190

18. Inkubace za třepáním při pokojové teplotě po dobu 30 minut.

19. Odstranění anti-Ptyr protilátky, promytí. Převedení čerstvě zředěné BIOSOURCE protilátky do ELISA destičky (1:8000 v TBST, 100 μΐ/jamka).

20. Inkubace za třepáním při pokojové teplotě po dobu 30 minut.

21. Odstranění BIOSOURCE protilátky, promytí. Převedení čerstvě připraveného ABTS/H2O2 roztoku do ELISA destičky, 100 μΐ/jamka.

22. Inkubace za třepáním po dobu 5-10 minut. Odstranění všech bublinek.

23. Zastavení reakce přidáním 100 μΐ 0,2M HCl/jamka.

24. Měření na přístroji Dynatech MR7000 ELISA reader s testovacím filtrem nastaveným na 410 nM a referenčním filtrem při 630 nM.

Test s CDK2/CYCLIN A

Tento test je používán pro měření aktivity in vitro serin/threoninkinázy lidské cdk2/cyclin A pomocí SPA (Scíntillation Proximity Assay).

Materiály a činidla

1. Wallac 96-jamkové polyethylen-terefthalátové (flexi) destičky (Wallac Catalog #1450-401).

2. Amersham Redivue [γ³³Ρ] ATP (Amersham catalog #AH 9968).

3. Polyvinyltoluenové SPA perličky potažené Amersham streptavidinem (Amersham catalog #RPNQ0007). Perličky by měly být rekonstituované v PBS bez hořčíku nebo vápníku při 20 mg/ml.

4. Aktivovaný cdk2/cyclin A enzymový komplex purifikovaný od Sf9 buněk (SUGEN, lne.).

5. Biotinylovaný peptidový substrát (Debtid). Peptid biotin-X-PKTPKKAKKL se rozpustí v dH₂O v koncentraci 5 mg/ml.

6. Peptid/ATP směs: na 10 ml, smíchání 9,979 ml dH₂O, 0,00125 ml studeného ATP, 0,010 ml Debtidu a 0,010 ml γ³³Ρ ATP. Konečná koncentrace na jamku bude 0,5 μΜ studeného ATP, 0,1 μg Debtidu a 0,2 μ^ γ³³Ρ ATP.

7. Kinázový pufr: na 10 ml, smíchání 8,85 ml dH₂O, 0,625 ml TRIS (pH 7,4), 0,25 ml 1 M MgCl₂, 0,25 ml 10% NP40 a 0,025 ml 1 M DTT, přidání čerstvě připraveného těsně před použitím.

8. lOmM ATP vdH₂O.

• ···*

191 ♦ ·· · ···· · ·

9. lMTris, pH upravené na 7,4 sHCl.

10. lMMgCl₂.

11. 1MDTT.

12. PBS (Gibco Catalog #14190-144).

13. 0,5MEDTA.

14. Zastavovací roztok: na 10 ml, smíchání 9,25 ml PBS, 0,005 ml 100 mM ATP, 0,1 ml 0,5 M EDTA, 0,1 ml 10% Triton X-100 a 1,25 ml 20 mg/ml SPA perliček.

Postup:

1. Připravení roztoků testované sloučeniny v 5 x požadované finální koncentraci v 5%

DMSO. Přidání 10 μΐ do každé jamky. Pro negativní kontroly použití v jamkách pouze 10 μΐ samotného 5% DMSO.

2. Zředění 5 μΐ cdk2/cyclin A roztoku s 2,1 ml 2 x kinázového pufru.

3. Přidání 20 μΐ enzymu do každé jamky.

4. Přidání 10 μΐ 0,5 M EDTA do negativních kontrolních jamek.

5. K nastartování kinázové reakce přidání 20 μΐ směsi peptid/ATP do každé jamky.

Inkubace po dobu 1 hodiny bez třepání.

6. Přidání 200 μΐ zastavovacího roztoku do každé jamky.

7. Držení alespoň po dobu 10 minut.

8. Centrifugace destiček při rychlosti přibližně 2300 otáček po dobu 3-5 minut.

9. Měření destiček na přístroji Trilux nebo podobném zařízení.

Průkaz MET transfosforylace

Tento test je používán pro měření fosfotyrosinových hladin na poly(glutamová kyselina.-tyrosin (4:1)) substrátu jako prostředků k identifikaci agonistů/antagonistů met transfosforylace substrátu.

Materiály a činidla:

1. Corning 96-jamkové ELISA destičky, Corning Catalog #25805-96.

2. Poly(glu, tyr) 4:1, Sigma, Cat. No; P 0275.

3. PBS, Gibco Catalog #450-1300EB

4. 50 mM HEPES

5. Blokovací pufr: Rozpuštění 25 g bovinního sérum albuminu, Sigma Cat. No

A-7888 v 500 ml PBS, filtrování přes 4 pm filtr.

192 ·· · • ::

• · • · ···· « • · ···· ·· * < 4 4 • · · · • ····· • · :

·· ·

6. Purifikovaný GST fuzní protein obsahující Met kinázovou doménu, Sugen, lne.

7. TBSTpufr.

8. 10% vodný (MilliQue H₂O) DMSO.

9. 10 mM vodný (dH₂O) Adenosin-5'-trifosfát, Sigma Cat. No. A-5394.

10. 2 x Kinázový ředící pufr: na 100 ml, smíchání 10 ml 1M HEPES při pH 7,5 s 0,4 ml 5% BSA/PBS, 0,2 ml 0,1 M orthovanadičnanu sodného a 1 ml 5M chloridu sodného v 88,4 ml dH₂O.

11. 4X ATP reakční směs: na 10 ml, smíchání 0,4 ml 1 M chloridu hořeěnatého a 0,02 ml 0,1 M ATP v 9,56 ml dH₂O.

12. 4X negativní kontrolní směs: na 10 ml, smíchání 0,4 ml 1 M chloridu hořeěnatého v 9,6 ml dH₂O.

13. NUNC 96-jamkové V destičky s polypropylenovým dnem. Applied Scientific Catalog #S-72092

14. 500 mM EDTA.

15. Protilátkový ředící pufr: na 100 ml, smíchání 10 ml 5% BSA/PBS, 0,5 ml 5% Camation Instant Milk® v PBS a 0,1 ml 0,1 M orthovanadičnan sodný v 88,4 ml TBST.

16. Králičí polyklonální antofosfotyrosinová protilátka, Sugen, lne.

17. Kozí anti-králičí křenová peroxidázová konjugovaná protilátka, Biosource, lne.

18. ABTS roztok: na 1 litr, smíchání 19,21 g citrónové kyseliny, 35,49 g Na₂HPO₄ a 500 mg ABTS s dostatečným množstvím dH₂O na 1 litr.

19. ABTS/H₂O₂: smíchání 15 ml ABST roztoku s 2 μΐ H₂O₂ pět minut před použitím.

20. 0,2 M HC1.

Postup:

1. Potažení ELISA destiček s 2 pg Poly(Glu-Tyr) v 100 μΐ PBS, skladování přes noc při teplotě 4° C.

2. Blokování destiček s 150 μΐ 5% BSA/PBS po dobu 60 minut.

3. Promytí destičky dvakrát s PBS, 1 x 50 mM Hepes pufru pH 7,4.

4. Přidání 50 μΐ zředěné kinázy do všech jamek. (Purifikovaná kináza se zředí s kinázovým ředícím pufrem. Finální koncentrace by měla být 10 ng/jamku)

5. Přidání 25 μΐ testované sloučeniny (v 4% DMSO) nebo samotného DMSO (4% v dH₂O) do destiček jako kontroly.

6. Inkubace směsi kináza/sloučenina po dobu 15 minut.

• · • · • ·

193

7. Přidání 25 μΐ 40 mM MnCl₂ do negativních kontrolních jamek.

8. Přidání 25 μΐ směsi ATP/MnCl₂ do všech dalších jamek (kromě negativních kontrol). Inkubace po dobu 5 minut.

9. Přidání 25 μΐ 500 mM EDTA k zastavení reakce.

10. Promytí destičky 3 x TBST.

11. Přidání 100 μΐ králičí polyklonální anti-Ptyr zředěné 1:10000 v protilátkovém ředícím pufru do každé jamky. Inkubace za třepáním při pokojové teplotě po dobu jedné hodiny.

12. Promytí destičky 3 x TBST.

13. Zředění Biosource HRP konjugované anti-králičí protilátky 1:6000 v protilátkovém ředícím pufru. Přidání 100 μΐ/jamka a inkubace při pokojové teplotě s třepáním po dobu jedné hodiny.

14. Promytí destičky IX PBS.

15. Přidání 100 μΐ ABTS/H₂O₂ roztoku do každé jamky.

16. Pokud je třeba, zastavení reakce přidáním 100 μΐ 0,2M HCl/jamka.

17. Měření destiček na přístroji Dynatech MR7000 ELISA reader s testovacím filtrem při 410 nM a referenčním filtrem při 630 nM.

Průkaz IGF-1 transfosforylace

Tento test je používán pro měření fosfotyrosinové hladiny v poly(glutamová kyselina:tyrosin)(4:l) k identifikaci agonistů/antagonistů gst-IGF-1 transfosforylace substrátu.

Materiály a činidla:

1. Corning 96-jamkové ELISA destičky.

2. Póly (Glu-tyr) (4:1), Sigma Cat. No. P 0275.

3. PBS, Gibco Catalog #450-1300EB.

4. 50 mM HEPES

5. TBB blokovací pufr: na 1 litr, smíchání 100 g BSA, 12,1 gTRIS (pH 7,5), 58,44 g chloridu sodného a 10 ml 1%TWEEN-2O.

6. Purifikovaný GST fúzní protein obsahující IGF-1 kinázovou doménu (Sugen, lne.)

7. TBST pufr: na 1 litr, smíchání 6,057 g Tris, 8,766 g chloridu sodného a 0,5 ml

TWEEN-20 s dostatečným množstvím dH₂O k připravení 1 litru.

• ·

194

8. 4% DMSO v Milli-Q H₂O.

9. 10 mM ATP v dH₂O.

10. 2X Kinázový ředící pufr: na 100 ml, smíchání 10 ml 1 M HEPES (pH 7,5), 0,4 ml 5% BSA v dH₂O, 0,2 ml 0,1 M orthovanadičnanu sodného a 1 ml 5 M chloridu sodného s dostatečným množstvím dH₂O k připravení 100 ml.

11. 4X ATP reakční směs: na 10 ml, smíchání 0,4 ml 1 M MnCl₂ a 0,008 ml 0,01 M ATP a 9,56 ml dH₂O.

12. 4X negativní kontrolní směs: smíchání 0,4 ml 1 M chloridu hořečnatého v 9,60 ml dH₂O.

13. NUNC 96-jamkové V destičky s polypropylenovým dnem.

14. 500 mM EDTA v dH₂O.

15. Protilátkový ředící pufr: na 100 ml, smíchání 10 ml 5% BSA v PBS, 0,5 ml 5% Carnation Instant Non-fat Milk® v PBS a 0,1 ml 0,1 M orthovanadičnanu sodného v 88,4 ml TBST.

16. Králičí polyklonální antifosfotyrosinová protilátka, Sugen, lne.

17. Kozí anti-králičí HRP konjugovaná protilátka, Biosource.

18. ABTS roztok.

20. ABTS/H₂O₂: smíchání 15 ml ABTS s 2 μΐ H₂O₂ 5 minut před použitím.

21. 0,2 M HC1 v dH₂O.

Postup:

1. Potažení ELISA destičky s 2,0 pg/jamka Poly(Glu, Tyr) 4:1 (Sigma PO275) v 100 μΐ PBS. Skladování destičky přes noc při teplotě 4° C.

2. Promytí destičky 1 x PBS,

3. Přidání 100 μΐ TBB blokovacího pufru do každé jamky. Inkubace destičky po dobu 1 hodiny za třepání při pokojové teplotě.

4. Promytí destičky 1 x PBS, pak dvakrát s 50 mM Hepes pufrem pH 7,5.

5. Přidání 25 μΐ testované sloučeniny v 4% DMSO (připravené zředěním zásobního roztoku z 10 mM testované sloučeniny v 100% DMSO s dH₂O) do destičky.

6. Přidání 10,0 ng gst-IGF-1 kinázy v 50 μΐ kinázového ředícího pufru) do všech jamek.

7. Nastartování kinázové reakce přidáním 25 μΐ 4X ATP reakční směsi do všech testovaných jamek a pozitivních kontrolních jamek. Přidání 25 μΐ 4X negativní • · · • ···· 9

195 kontrolní směsi do všech negativních kontrolních jamek. Inkubace po dobu 10 minut za třepání při pokojové teplotě.

8. Přidání 25 μΐ 0,5M EDTA (pH 8,0) do všech jamek.

9. Promytí destičky 4 x TBST pufrem.

10. Přidání králičího polyklonálního anti-fosfotyrosinového antiséra ve zředění 1:10000 v 100 μΐ protilátkovém ředícím puftu do všech jamek. Inkubace za třepáním při pokojové teplotě po dobu 1 hodiny.

11. Promytí destičky jako v kroku 9.

12. Přidání 100 μΐ Biosource anti-králičí HRP ve zředění 1:10000 v protilátkovém ředícím pufru do všech jamek. Inkubace za třepáním při pokojové teplotě po dobu 1 hodiny.

13. Promytí destičky jako v kroku 9, poté promytí (lx) s PBS kvůli snížení množství bublinek a přebývajícího Tween-20.

14. Vyvolání přidáním 100 μΐ/jamku ABTS/H2O2 do každé jamky.

15. Po asi 5 minutách měření na ELISA readeru s testovacím filtrem při 410 nm a referenčním filtrem při 630 nm.

Test inkorporace BRDU

Následující testy využívají geneticky upravené buňky k exprimování vybraného receptoru a následně ke stanovení účinku požadované sloučeniny na aktivitu syntézy DNA indukované ligandem stanovením inkorporace BrdU do DNA.

Následující materiály, činidla a postupy jsou obecné vzhledem ke každému z následujících testů inkorporace BrdU.

Materiály a činidla:

1. Vhodný ligand.

2. Vhodné geneticky upravené buňky.

3. BrdU značící činidlo: 10 mM, v PBS (pH 7,4)(Boehringer Mannheim, Germany).

4. FixDenat: fixační roztok (připravený k použití)(Boehringer Mannheim, Germany).

5. Anti-BrdU-POD: myší monoklonální protilátka konjugovaná s peroxidázou (Boehringer Mannheim, Germany).

6. TMB substrát roztok: tetramethylbenzidin (TMB, Boehringer Mannheim,

Germany).

• ·

196

7. PBS promývací roztok: IX PBS, pH 7,4.

8. Albumin, bovinní (BSA), frakce V prášková (Sigma Chemical Co., USA).

Obecný postup:

1. Buňky se naočkují v hustotě 8000 buněk/jamka v 10% CS, 2 mM Gin v DMEM, v 96-jamkové destičce. Buňky se inkubují přes noc při teplotě 37° C v atmosféře 5% CO₂.

2. Po 24 hodinách se buňky promyjí s PBS, pak se vyhladoví v médiu bez séra (0% CS DMEM s 0,1% BSA) po dobu 24 hodin.

3. 3.den se k buňkám přidá najednou vhodný ligand a testovaná sloučenina. Do negativních kontrolních jamek se přidá DMEM bez séra pouze s 0,1% BSA; k pozitivním kontrolním buňkám se přidá ligand bez testované sloučeniny. Testované sloučeniny se připraví v DMEM bez séra s ligandem v 96-jamkové destičce a sériově zředěné na 7 testovacích koncentrací.

4. Po 18 hodinách aktivace ligandem se přidá zředěné BrdU značící činidlo (1:100 v DMEM, 0,1% BSA) a buňky se inkubují s BrdU (finální koncentrace = 10 μΜ) po dobu 1,5 hodiny.

5. Po inkubaci se značícím činidlem se médium odstraní dekantováním a poklepáním převrácené destičky na papírovém ručníku. Přidá se roztok FixDenat (50 μΐ/jamka) a destičky se inkubují při pokojové teplotě po dobu 45 minut na destičkové třepačce.

6. Roztok FixDenat se důkladně odstraní dekantací a poklepáním na převrácenou destičku na papírovém ručníku. Přidá se mléko (5% dehydrované mléko v PBS, 200 μΐ/jamka) jako blokovací roztok a destičky se inkubují po dobu 30 minut při pokojové teplotě na destičkové třepačce.

7. Blokovací roztok se odstraní dekantací a jamky se promyjí 1 x PBS, přidá se AntiBrdU-POD roztok (1:200 zředění v PBS, 1%, BSA) (50 μΐ/jamku) a destičky se inkubují po dobu 90 minut při pokojové teplotě na destičkové třepačce.

8. Konjugát protilátky se dokonale odstraní dekantací a promytím jamek 5 x PBS a destička se suší překlopením a proklepáváním na papírovém ručníku.

9. Přidá se TMB substrátový roztok (100 μΐ/jamka) a inkubuje se po dobu 20 minut při pokojové teplotě na destičkové třepačce, dokud není zbarvení dostatečné k fotometrické detekci.

* · • · ·

197

10. Absorbance vzorků se měří při 410 nm (v módu duální vlnové délky s filtrem při 490 run jako referenční vlnovou délkou) na přístroji Dynatech ELISA reader.

Průkaz inkorporace BrdU indukované EGF

Materiály a činidla:

1. Myšší EGF, 201 (Toyobo Co., Ltd., Japan).

2. 3T3/EGFRc7.

Průkaz inkorporace BrdU indukované EGF a řízené Her-2

Materiály a činidla:

1. Myší EGF, 201 (Toyobo Co., Ltd., Japan).

2. 3T3/EGFr/Her2/EGFr (EGFr s Her-2 kinázovou doménou).

Průkaz inkorporace BrdU indukované EGF a řízené Her-4

Materiály a činidla:

1. Myší EGF, 201 (Toyobo Co., Ltd., Japan).

2. 3T3/EGFr/Her4/EGFr (EGFr s Her-4 kinázovou doménou).

Průkaz inkorporace BrdU indukované PDGF

Materiály a činidla:

1. Lidská PDGF B/B (Boehringer Mannheim, Germany).

2. 3T3/EGFRc7.

Průkaz inkorporace BrdU indukované FGF

Materiály a činidla:

1. Lidská FGF2/bFGF (Gibco BRL, USA).

2. 3T3c7/EGFr • · ·

198

Průkaz inkorporace BrdU indukované FGF1

Materiály a činidla:

1. Lidská, rekombinantní (G511, Promega Corp., USA)

2. 3T3/IGFlr.

Průkaz inkorporace BrdU indukované insulinem

Materiály a činidla:

1. Insulin, krystalický, bovinní, zinek (13007, Gibco BRL, USA).

2. 3T3/H25.

Průkaz inkorporace BrdU indukované HGF

Materiály a činidla:

1. Rekombinantní lidská HGF (Cat. No. 249-HG, R&D Systems, lne. USA).

2. BxPC-3 buněk (ATCC CRL-1687).

Postup:

1. Buňky se naočkují v hustotě 9000 buněk/jamka v RPMI 10% FBS v 96-jamkové destičce. Buňky se inkubují přes noc při teplotě 37° C v 5% CO₂.

2. Po 24 hodinách se buňky promyjí PBS, pak se vyhladoví v 100 μΐ média bez séra (RPMI s 0,1% BSA) po dobu 24 hodin.

3. 3. den se k buňkám přidá 25 μΐ obsahujícího ligand (připravený v koncentraci 1 pg/ml v RPMI s 0,1% BSA; finální HGF koncentrace je 200 ng/ml) a testované sloučeniny se přidají do buněk. Do negativních kontrolních jamek se přidá pouze 25 μΐ RPMI s 0,1% BSA bez séra; k pozitivním kontrolním buňkám se přidá ligand (HGF) bez testované sloučeniny. Testované sloučeniny se připraví 5 násobku své finální koncentrace v RPMI s ligandem bez séra v 96-jamkové destičce a sériově zředí, čímž se získá 7 testovacích koncentrací. Typicky je nejvyšší finální koncentrace testované sloučeniny 100 μΜ a používají se zředění 1:3 (tzn. rozmezí koncentrace finální testované sloučeniny se pohybuje od 0,137 do 100 μΜ).

199 ···· · · • · · • · · ♦ • · ·· · · • · ·

4. Po 18 hodinách aktivace ligandu se do každé jamky přidá 12,5 μΐ zředěného BrdU značícího činidla (1:100 v RPMI, 0,1% BSA) a buňky se inkubují s BrdU (finální koncentrace je 10 μΜ) po dobu 1 hodiny.

5. Stejně jako v obecném postupu.

6. Stej ně j ako v obecném postupu.

7. Blokovací roztok se odstraní dekantací a jamky se promyjí 1 x PBS, přidá se AntiBrdU-POD roztok (1:100 zředění v PBS, 1% BSA) (100 μΐ/jamka) a destičky se inkubují po dobu 90 minut při pokojové teplotě na destičkové třepačce.

8. Stejně jako v obecném postupu.

9. Stejně j ako v obecném postupu.

10. Stej ně j ako v obecném postupu.

Průkaz HUV-EC-C

Tento test je používán pro měření aktivity sloučeniny proti PDGF-R, FGF-R,

VEGF, aFGF nebo Flk-1/KDR, přičemž všechny jsou přirozeně exprimovány HUV-EC buňkami.

Den 0

1. Promytí a trypsinizace HUV-EC-C buněk (lidské umbilikální venózní endotheliální buňky, (American Type Culture Collection, catalogue no. 1730 CRL). Promytí Dulbecco fyziologickým roztokem tlumeným fosfátem (D-PBS, získaným u Gibco BRL, catalogue no. 14190-029) 2 x s koncentrací asi 1 ml/10 cm² z baňky s tkáňovou kulturou. Trypsinizace s 0,05% trypsin-EDTA v neenzymatickém buněčném disociačním roztoku (Sigma Chemical Company, catalogue no. C-1544). 0,05% trypsin se připraví zředěním 0,25% trypsin/1 mM EDTA (Gibco, catalogue no. 25200-049) v buněčném disociačním roztoku. Trypsinizace s asi 1 ml/25-30 cm z baňky s tkáňovou kulturou po dobu asi 5 minut při teplotě 37°C. Po uvolnění buněk z baňky se přidá ekvivalentní objem testovacího média a převede se do 50 ml sterilní centrifugační kyvety (Fisher Scientific, catalogue no. 05-539-6).

2. Promytí buněk asi s 35 ml testovacího média v 50 ml sterilní centrifugační kyvetě přidáním testovacího média, centrifugace po dobu 10 minut přibližně při 200 x g, aspirace supematantu a resuspendování s 35 ml D-PBS. Opakování promytí 2 x D-PBS, resuspendování buněk v asi 1 ml testovacího média/15 cm² z baňky s tkáňovou kulturou.

·· * • ·

200 • ···· · ···· ·· • · · • · · · • ····· • · ·

Testovací médium se sestává z F12K média (Gibco BRL, catalogue no. 21127-014) a 0,5% fetálního bovinního séra inaktivovaného záhřevem. Měření buněk na Coulter Counter® (Coulter Electronics, lne.) a přidání testovacího média do buněk, čímž se získá koncentrace 0,8-1,0 x 10⁵ buněk/ml.

3. Přidání buněk do 96-jamkové destičky s plochým dnem v koncentraci 100 μΐ/jamka nebo 0,8-1,0 x 10⁴ buněk/jamka, inkubace asi 24 hodin při teplotě 37° C při atmosféře 5% CO₂.

Den 1

1. Připravení (dvojmo) titrací testované sloučeniny v separovaných 96jamkových destičkách, obecně 50 μΜ až do 0 μΜ. Použití stejného testovacího média jako v den 0, krok 2 výše. Titrace se připraví přidáním 90 μΐ/jamku testované sloučeniny v koncentraci 200 μΜ (4X finální koncentrace v jamce) až na vrch jamek konkrétního destičkového sloupce. Poněvadž zásobní roztok testované sloučeniny je obvykle 20 mM v DMSO, obsahuje 200 μΜ koncentrace léčiva 2% DMSO.

Jako rozpouštědlo pro titrace testované sloučeniny je používáno zředění až do 2% DMSO v testovacím médiu (F12K + 0,5% fetální bovinní sérum), aby se testovaná sloučenina zředila, ale zůstala koncentrace DMSO konstantní. Přidání tohoto zředění do zbývajících jamek ve sloupci v koncentraci 60 μΐ/jamka. Odebrání 60 μΐ ze 120 μΐ z 200 μΜ zředění testované sloučeniny na vrchu jamky sloupce a smíchání s 60 μΐ v druhé jamce sloupce. Odebrání 60 μΐ z této jamky a smíchání s 60 μΐ ve třetí jamce sloupce, a tak dále dokud se nedosáhne dvojnásobné titrace. Pokud jsou jamky míchány stylem next-to-thelast, odebere se 60 μΐ ze 120 μΐ v této jamce a vyhodí se. V poslední jamce se nechá 60 μΐ DMSO/ředícího média jako kontrola neobsahující testovanou sloučeninu. Připraví se 9 sloupců titrované testované sloučeniny v dostatečném množství pro přidání do každé z jamek (3x): (1) VEGF (získané z Pepro Tech lne., catalogue no. 100-200, (2) endoteliální buněčný růstový faktor (ECGF) (také známý jako kyselý fibroblastový růstový faktor nebo aFGF) (zakoupený u Boehringer Mannheim Biochemica, catalogue no. 1439 600) nebo (3) lidská PDGF B/B (1276-956, Boehringer Mannheim, Germany) a testovací kontrolní médium. ECGF je ve formě preparátu se sodnou solí heparinu.

2. Převedení 50 μΐ/jamku zředění testované sloučeniny do 96-jamkových testovacích destiček obsahujících 0,8-1,0 x 10⁴ buněk/100 μΐ/jamku HUV-EC-C buněk ze dne 0 a inkubace po dobu asi 2 hodin při teplotě 37° C v atmosféře 5% CO₂.

201 ·· · • · · • · · · • · · · · · • · · ·· ·

3. Přidání (3x) 50 μΐ/jamku z 80 μg/ml VEGF, 20 ng/ml ECGF nebo kontrolního média do každé testované sloučeniny. Stejně jako u testovaných sloučenin jsou koncentrace růstového faktoru 4X požadované finální koncentrace. K vytvoření koncentrací růstových faktorů se použije testovací médium ze dne 0 krok 2. Provede se inkubace po dobu přibližně 24 hodin při teplotě 37°C v atmosféře 5% CO₂. Každá jamka má 50 μΐ zředění testované sloučeniny, 50 μΐ růstového faktoru nebo média a 100 μΐ buněk, což je vypočteno na celkových 200 μΐ/jamka. Jakmile se tedy vše přidá do jamek, stanou se 4X koncentrace testované sloučeniny a růstových faktorů pouze IX.

Den 2

1. Přidání ³H-thymidinu (Amersham, catalogue no. TRK-686) v 1 pCi/jamka (10 μΐ/jamka z 100 pCi/ml roztoku připraveného v RPMI médiu + 10% fetální bovinní sérum inaktivované záhřevem) a inkubace po dobu asi 24 hodin při teplotě 37° C v atmosféře 5% CO₂, RPMI bylo zakoupeno u Gibco BRL, catalogue no. 11875-051.

Den 3

1. Zmrazení destiček přes noc při teplotě -20° C.

Den 4

Rozmražení destiček a sbírání pomocí 96-jamkové destičkového sběrače (Tomtec Harvester 96®) na filtrační plachetky (Wallac, catalogue no. 1205-401), změření záření na tekutém scintilačním počítači Wallac Betaplate™.

V tabulce 2 jsou uvedeny výsledky biologických testů některých reprezentativních sloučenin obecného vzorce (I). Výsledky jsou vyjádřeny jako IC50, mikromolámí (μΜ) koncentrace testované sloučeniny, která způsobí 50% změnu aktivity cílové PKT v porovnání s aktivitou PTK, která byla měřena jako kontrola bez přidané testované sloučeniny. Specificky, uvedené výsledky ukazují koncentraci testované sloučeniny, která je potřebná k tomu, aby způsobila 50% snížení aktivity cílové PTK. Biologické testy, které byly nebo mohou být používány k vyhodnocení vlastností sloučenin, jsou detailněji popsány níže.

• 9

202 ·· • · ·

9

9 9

9 9 9

9 9999 9

9 9

9

9 • 9 9 • 9 9 9 • 9 999 • 99

9

Tabulka 2

Př.	bio flkGST IC50 (μΜ)	bio FGFR1 IC50 (μΜ)	bio PDGF IC50 (μΜ)	bio EGF IC50 (μΜ)	buněčná EGF IC50 (μΜ)	Her2 kináza IC50 (μΜ)	cdk2spa IC50 (μΜ)	bio pyk2 (μΜ)
1	57,68	15,16	>100	>100	>100			>100
2	>100		>100	>100	>100
3	9,85	9,62	>100	>100	>100			>100
4	3,57	>20	>100	>100	>100	>100
5	8,3	16,06	>100	>100	>100	>100
6	4,04		>100	3,26	7,82	2,43
7	7,74		>100	5,07	9,8	4,24
8	12,1		>100	51,34	20,08	5,5
9	0,96		>100	>100	>100	16,38
10	5,72		>100	94,04	15,86	8,06
11	9,77		>100	>100	>100	>100
12	>20		21,46	>100		27,73
13	>20		81,92	8,17		2,66
14	13,01		42,41	>100		66,02
15	>20		>100	>100		98,61
16	>20		98,06	>100		23,32
17	8,25	2,47	94,35	0,83	11,47	15,94	>10
18	2,67			2,57	9,23	4,99
19	7,5			6,86	34,18	8,37
20	11,53			>100	41,16	8
21	7,18		>100	40,34		27,69
22	>20		>100	>100		87,67
23	>20		>100	36,64		4,05
24			>100	16,84		5,31
25	12,55		>100	23,48		7,9

203 ·· • 9 · · • · · • · · · • · · • · · · · · • · · • · · · • · · · · · • · · ·· · ·· · • · ♦ • · · · • · · · · e · • « · ·· «

26	16,03		66,87	34,67		10,04
27			>100	26,5		3,91
28	4,5		71,27	53,66		2,67
29	10,12		>100	26,72		3,98
30	9,4		>100	18,69		4,1
31	>50		>100	9,83		47,19
32	45,74		5,94	>100		>100
34	>50		>100	>100		>100
35	>20		>100	80,4		54,14
36	>20		>100	>100		>100
37	0,22		3,06	10,78	9,84	1,4
38	4,17		3,06	6,04	8,97	2,16
39	3,38		4,69	3,67	14,54	3,53
40	4,5		7,9	6,52		6,27
42	0,1		0,12	11,95	74,55	20,43
43	1,12		8,38	>100	37,33	53,37
44	<0,05		0,02	20,73	67,46	6,99
45	1,71		>100	>100	29,95	>100
46	30,62		6,18	>100	>100	>100
47	0,08	1,56	0,06	11,42	41,54	8,4	>20	1,05
48	0,006	0,3	<0,78	17,88	21,58	7,93		0,09
49			<0,78	>100	43,86	>100
50			<0,78	>100	20,34	>100
51	0,006	1,66	0,01	18,1	21,61	23,24	16,69	0,35
52	0,08	1,26	<0,78	12,53	>100	>100	10,66	0,45
53			<0,78	>100	>100	>100
54	1,98		<0,78	23,88	9,76	7,02
55	0,27		0,53	6,03	35,99	77,82
56	2,32		3,19	>100	10,03	7,11
57	0,06		7,98	>100	9,97	6,94
58			21,14	>100	>100	>100
59			<0,78	>100	>100	>100

····

204 ·* r· • · · · • · · • · · • · · ···· ·« ·· · • · » • · · · • · ···· • · · ·· «

60			<0,78	>100	>100	>100
61			<0,78	>100	>100	>100
62	8,00		8,32	>100	>100	>100
63	0,21		<0,78	8,59	>100	>100
64	0,55		<0,78	30,49	>100	>100
65	0,37		<0,05	>100	74,36	15,97
66	<0,05			>100	11,84	2,76
67	0,39		24,77	31,38	19,79	2,56
68	1,16		0,03	>100	23,52	34,13
69	0,3		56,55	>100	97,54	>100
70	0,09	1,50	0,0030	10,57	6,42	7,99	12,62	0,63
71	15,21		22,5	>100		9,91
72	6,06		10,54	>100	39,94	9,65
73	5,95		14,12	>100	39,5	8,59
74	1,2		0,09	46,75		>100
75	2,7		61,55	>100		>100
76	3,33		19,18	5,11		3,01
77	0,49		25,01	>100		>100
78	1,94		70,62	9,33		4,25
79	1,49		>100	27,39		>100
80	0,13	4,29	0,001	>100		50,19	17,19	0,28
81	0,21		0,18	>100		>100
82	2,03	7,69	6,88	>100		>100		0,31
83	0,34	0,41	9,46	2,18		86,9		0,008
84	1,38		12,51	67,2		5,86		0,006
85	0,2	0,8	2,59	>100		3,76
86	1,45	1,3	19,6	41,8		>100		3,58
87	3,27	7,56	6,46	>100		9,1		0,17
88	0,35	1,18	8,06	2,36		>100		0,09
89	7,84		47,58	8,53	9,67	15,97
115	7,3		7,48	>100		>100	0,006
116	>20		>100	>100		>100	<0,0005

205 «» « · · · · · <

• · · · · · · • · · · · · ···· « • · · 9 9 · ···» ·· ·· * *

« « 9 • · · · • ····» • · « ·· «

117	0,91		12,9	>100		>100	0,006
118	1,93		1,2	>100		>100	0,002
119	1,38		61,63	>100		>100	<0,0005

In vivo zvířecí modely

Model zvířecího xenoimplantátu

Schopnost lidských nádorů růst jako xenoimplantát v athymických myší (např. Balb/c, nu/nu) poskytuje použitelný in vivo model pro studium biologické odpovědi na terapie lidských nádorů. Díky první úspěšné xenotransplantaci lidského nádoru do athymických myší (Ryggard a Povlsen, 1969, Ada Pathol. Microbial. Scand. 77:758-760) bylo mnoho různých lidských nádorových buněčných linií (např. mamámí, plicní, genitourinámí, gastro-intestinální, hlavy, krku, glioblastoma, kostní a maligní melanomy) transplantováno a úspěšně kultivováno v nahých myších. Následující testy mohou být používány ke stanovení hladiny aktivity, specificity a účinku různých sloučenin obecného vzorce (I).

Tři obecné typy testů jsou použitelné ke stanovení sloučenin obecného vzorce (I): buněčné/katalytické, buněčné/biologické a in vivo. Záměrem buněčných/katalytických testů je stanovit účinek sloučeniny obecného vzorce (I) na schopnost TK fosforylovat tyrosiny na známém substrátu v buňce. Záměr buněčných/biologických testů je stanovit účinek sloučeniny obecného vzorce (I) na biologickou odpověď stimulovanou TK v buňce. Záměr in vivo testů je stanovit účinek sloučeniny obecného vzorce (I) na zvířecím modelu konkrétní poruchy, např. rakoviny.

Vhodné buněčné linie pro subkutánní xenoimplantátové experimenty zahrnují C6 buňky (gliom, ATCC #CCL 107), A375 buňky (melanom, ATCC #CRL 1619), A431 buňky (epidermoidní karcinom, ATCC #CRL 1555), Calu 6 buňky (plíce, ATCC #HTB 56), PC3 buňky (prostata, ATCC #CRL 1435), SKOV3TP5 buňky a NIH 3T3 fibroblasty geneticky upravené k exprimaci EGFR, PDGFR, IGF-IR nebo kterékoliv další testované kinázy. Následující postup může být používán k provádění xenoimplantátových experimentů:

206

Samičí athymické myši (BALB/c, nu/nu) byly získány u Simonsen Laboratories (Gilroy, CA). Všechna zvířata byla přechovávána v čistých mikroizolačních klecích s podestýlkou Alfa-dri a byla jim podána sterilní potrava a voda pro hlodavce podle libosti.

Buněčné linie byly kultivovány ve vhodném médiu (např. MEM, DMEM, Ham's F10 nebo Ham's F12 plus 5%-10% fetální bovinní sérum (FBS) a 2 mM glutamin (GLN)). Všechna buněčná kultivační média, glutamin a fetální bovinní sérum byly zakoupeny u Gibco Life Technologies (Grand Island, NY), pokud není uvedeno jinak. Všechny buňky byly kultivovány ve vlhkém ovzduší 90-95% a 5-10% CO₂ při teplotě 37° C. Všechny buněčné linie byly rutinně subkultivovány 2 x týdně a byly negativní na mykoplazmu podle Mycotect method (Gibco).

Buňky byly sbírány při nebo téměř při konfluenci s 0,05% Trypsin-EDTA a peleto vány při 450 g po dobu 10 minut. Pellety byly resuspendovány ve sterilním PBS nebo médiu (bez FBS) na konkrétní koncentraci a buňky byly implantovány do zadní tlapky myši (8-10 myší na skupinu, 2 - 10 x 10⁶ buněk/zvíře). Růst nádoru byl měřen po dobu 3 až 6 týdnů pomocí venierových kaliperů. Byly vypočteny objemy nádorů, délka x šířka x hmotnost, pokud není uvedeno jinak. Hodnoty P byly vypočteny pomocí Studentského t-testu. Testované sloučeniny obecného vzorce (I) mohou být podány v 50 100 μΐ excipientu (DMSO nebo VPD:D5W) pomocí IP injekce v různých koncentracích, přičemž obecně se začíná první den po implantaci.

Model invaze nádoru

Byl vyvinut následující model invaze nádoru a může být používán pro stanovení terapeutické hodnoty a účinnosti sloučenin obecného vzorce (I) určených k selektivní inhibici receptoru KDR/FLK-1.

Postup

Jako experimentální zvířata byly používány osm týdnů staré nahé myši (samičí) (Simonsen lne.). Implantace nádorových buněk může být provedena do hřebene s laminámím prouděním hood. Pro anestezii byl podávány intraperitoneálně kokteil Xylazin/Ketamin (100 mg/kg ketaminu a 5 mg/kg Xylazinu). Byla provedena inzice ve střední linii k obnažení břišní dutiny (přibližně 1,5 cm v délce) a injektování 10 nádorových buněk v objemu 100 μΐ média. Buňky byly injektovány buď do duodenálního lalůčku pankreatu nebo pod serózou střeva. Peritoneum a svalstvo byly zavřeny pomocí 6• ·

207 hedvábné kontinuální sutury a kůže byla spojena svorkami. Zvířata byla denně pozorována.

Analýza

Po 2 - 6 týdnech v závislosti na makroskopických pozorováních zvířat byly myši usmrceny a lokální nádorové metastáze do různých orgánů (plíce, játra, mozek, žaludek, slezina, srdce, svalstvo) byly excidovány a analyzovány (měření velikosti nádoru, stupeň zasažení, imunochemie, určení in šitu hybridizace, atd.)

Test s C-KIT

Tento test byl používán k detekování hladiny fosforylace c-kit tyrosinu.

MO7E (lidská akutní myeloidní leukémie) buňky byly přes noc vyhladověny v 0,1% séru. Buňky byly předem ošetřovány sloučeninou obecného vzorce (I) (současně s vyhladověnín buněk) před stimulací ligandem. Buňky byly stimulovány 250 ng/ml rh-SCF po dobu 15 minut. Po stimulaci byly buňky lyžovány a imunoprecipitovány s anti-c-kit protilátkou. Hladiny fosfotyrosinu a proteinu byly stanoveny metodou Western blotting.

Test MTT proliferace

MO7E buňky byly vyhladověny a předem ošetřovány sloučeninou obecného vzorce (I), jak je popsáno pro fosforylační experimenty. Buňky byly umístněny do @ 4X10⁵ buněk/jamku v 96-jamkové misce v 100 μΐ RPMI + 10% séra. Pak bylo přidáno rh-SCF (100 ng/ml) a destičky byly inkubovány po dobu 48 hodin. Po 48 hodinách bylo přidáno 10 μΐ z 5 mg/ml MTT [3-(4,5-dimethythiazol-2-yl)-2,5-difenyltetrazolium-bromid) a provedla se inkubace po dobu 4 hodin. Přidal se kyselý izopropanol (100 μΐ z 0,04N HC1 v izopropanolu) a optická hustota se změřila při 550 nm.

Průkaz apoptózy

MO7E buňky byly inkubovány +/-SCF a +/- sloučeninou obecného vzorce (I) v 10% FBS s rh-GM-CSF (10 ng/ml) a rh-IL-3 (10 ng/ml). Vzorky byly testovány po dobu 24 a 48 hodin. K měření aktivované kaspázy-3 byly vzorky promývány s PBS a permeabilizovány s ledovým 70% ethanolem. Poté byly buňky značeny PE-konjugovanou

208

polyklonální králičí anti-aktivní kaspázou-3 a analyzovány FACS. K měření štěpené PARP byly vzorky lyžovány a analyzovány metodou Western blotting s anti-PARP protilátkou.

Další testy

Další testy, které mohou být používány ke stanovení sloučenin obecného vzorce (I), zahrnují bez jakékoliv limitace test s bio-flk-1, test s EGF receptor-HER2 chimérickým receptorem na celých buňkách, test s bio-src, test s bio-lck a měření fosforylační funkce raf. Postupy pro každý z těchto testů lze nalézt v U.S. přihlášce č. 09/099,842, což je zde uvedeno jako odkaz, včetně veškerých obrázků.

Měření buněčné toxicity

Terapeutické sloučeniny by měly být lepší při inhibici aktivity receptorové tyrosinkinázy než v projevování cytotoxického účinku. Měření účinnosti a buněčné toxicity sloučeniny může být provedeno stanovením terapeutického indexu, tzn. IC50/LD50. Hodnota IC50, což je dávka potřebná k dosažení 50% inhibice, může být změřena standardními technikami, např. technikami popsanými v předloženém vynálezu. Hodnota LD50, což je dávka způsobující 50% toxicitu, může být také změřena standardními technikami (Mossman, 1983, J. Immunol. Methods., 65:55-63), změřena množstvím uvolněného LDH (Korzeniewski and Callewaert, 1983, J. Immunol. Methods., 64:313, Decker and Lohmann-Matthes, 1988, J. Immunol. Methods., 115:61) nebo změřením letální dávky na zvířecích modelech. Preferovány jsou sloučeniny s velkým terapeutickým indexem. Terapeutický index by měl být větší než 2, výhodně alespoň 10, ještě výhodněji alespoň 50.

B. Příklad výsledků z testů na buňkách provedených s (2-diethylaminoethyl)amidem 5-(5-fluor-2-oxo-l,2-di-hydroindol-3-ylidenmethyl)-2,4-dimethyl-lřfpyrrol-3-karboxylové kyseliny (Sloučenina 80).

K potvrzení účinnosti (2-diethylamino-ethyl)amidu 5-(5-fluor-2-oxo-l,2dihydroindol-3-ylidenmethyl)-2,4-dimethyl-17ř-pyrrol-3-karboxylové kyseliny (sloučenina 80) detekované při biochemických testech (vide infra} byla měřena schopnost uvedené sloučeniny inhibovat ligand-dependentní RTK fosforylaci na buňkách, konkrétně na NIH• ·

209

3T3 myších buňkách geneticky upravených k nadměrné expresi Flk-1 nebo lidské PDGFRp. (2-Diethylamino-ethyl)amid 5-(5-fluor-2-oxo-l ,2-dihydroindol-3ylidenmethyl)-2,4-dimethyl-l//-pyrro-1-3-karboxylové kyseliny (Sloučenina 80) inhiboval VEGF-dependentní fosforylaci Flk-1 tyrosinu s hodnotou IC50 přibližně 0,03 μΜ. Tato hodnota je podobná 0,009 μΜ K, hodnotě změřené při inhibici Flk-1 (2-diethylaminoethyl)amidem 5-(5-fluor-2-oxo-1,2-dihydroindol-3-ylidenmethyl)-2,4-dimethyl-1 //-pyrrol3-karboxylové kyseliny (Sloučenina 80) v biochemických testech, což ukazuje, že (2-diethylamino-ethyl)amid 5-(5-fluor-2-oxo-l,2-dihydroindol-3-ylidenmethyl)-2,4dimethyl-1//-pyrrol-3-karboxylové kyseliny (Sloučenina 80) snadno penetruje do buněk. V souladu s biochemickými daty (vide infrd) ukazujícími, že (2-diethylamino-ethyl)amid 5 -(5 -fluor-2-oxo-1,2-dihydroindol-3 -ylidenmethy l)-2,4-dimethyl-1 //-pyrro-1-3 karboxylové kyseliny (Sloučenina 80) měl srovnatelnou aktivitu vůči Flk-1 a PDGFRp, bylo také zjištěno, že inhibuje PDGF-dependentní fosforylaci receptoru v buňkách s hodnotou IC₅₀ přibližně 0,03 μΜ. Schopnost (2-diethylamino-ethyl)amidu 5-(5-fluor-2oxo-1,2-dihydroindol-3-ylidenmethyl)-2,4-dimethyl-l//-pyrrol-3-karboxylové kyseliny (Sloučenina 80) inhibovat c-kit, velmi podobnou RTK, která váže faktor kmenových buněk (SCF), byla stanovena na MO7E buňkách, které exprimují tento receptor. V těchto buňkách inhiboval (2-diethylamino-ethyl)amid 5-(5-fluor-2-oxo-l,2-dihydroindol-3ylidenmethyl)-2,4-dimethyl-l//-pyrro-1-3-karboxylové kyseliny (Sloučenina 80) SCFdependentní c-kit fosforylaci s hodnotou IC50 0,01-0,1 μΜ. Tato sloučenina také inhibovala SCF-stimulovanou c-kit fosforylaci při akutní myeloidní leukémii (AML) blastů izolovaných z periferní krve pacientů.

Kromě testování schopnosti (2-diethylamino-ethyl)amidu 5-(5-fluor-2-oxo-l,2dihydro-indol-3-ylidenmethyl)-2,4-dimethyl-l//-pyrrol-3-karboxylové kyseliny (Sloučenina 80) inhibovat ligand-dependentní fosforylaci receptoru v buňkách, byla také in vitro zkoumána ligand-dependentní proliferativní odpověď buněk (viz tabulka 4). Při těchto studiích byly buňky uvedeny nejprve do klidového stádia vyhladověním (přes noc), poté u nich byla vyvolána syntéza DNA podáním vhodného mitogenního ligandu. Jak je uvedeno v tabulce 3, inhiboval (2-diethylamino-ethyl)amid 5-(5-fluor-2-oxo-l,2dihydroindol-3-ylidenmethyl)-2,4-dimethyl-l//-pyrrol-3-karboxylové kyseliny (Sloučenina 80) PDGF-indukovanou proliferaci NIH-3T3 buněk nadměrně exprimujících PDGFRp

210 nebo PDGFRa s hodnotami IC50 0,031, resp. 0,069 μΜ, a SCF-indukovanou proliferaci MO7E buněk s hodnotou IC50 0,007 μΜ.

Tabulka 3

	Biochemická	Buněčná IC50
Receptor	K? (μΜ)	Fosforylace receptoru (μΜ)	Ligand-dependentní proliferace (μΜ)
Flk-1/KDR	0,009	0,032	0,0043
PDGFRa	0,008	0,034	0,0314
PDGFRfl	ND	ND	0,0695
FGFR	0,83	ND	O/73
c-kit	ND	0,01-0,16	0,0076

ND = nebylo stanoveno ¹ změřeno pomocí rekombinantního enzymu ² změřeno na vyhladověných HIH-3T3 buňkách exprimujících Flk-1 ³ změřeno na vyhladověných HUVEC buňkách ⁴ změřeno na vyhladověných HIH-3T3 buňkách exprimujících PDGFRa ⁵ změřeno na vyhladověných EÍIH-3T3 buňkách exprimujících PDGFRp ⁶ změřeno na vyhladověných MO7E buňkách

Jak je uvedeno v tabulce 3, je zde obecná shoda mezi biochemickými a buněčnými aktivitami (2-diethylamino-ethyl)amidu 5-(5-fluor-2-oxo-l ,2-dihydroindol-3ylidenmethyl)-2,4-dimethyl-l//-pyrrol-3-karboxylové kyseliny (Sloučenina 80) podporující závěr, že tato sloučenina prostupuje buněčnými membránami. Dále lze říci, že buněčné odpovědi jsou výsledkem aktivity sloučeniny 80 vůči uvedeným cílům. Na rozdíl od případu, kdy (2-diethylamino-ethyl)amid 5-(5-fluor-2-oxo-l,2-dihydroindol-3ylidenmethyl)-2,4-dimethyl-17/-pyrro-l-3-karboxylové kyseliny (Sloučenina 80) testovaný v přítomnosti kompletního růstového média in vitro vyžadoval k inhibici růstu různých lidských nádorových buněk podstatně vyšší koncentrace (>10 μΜ) (viz tabulka 4), což ukazuje, že sloučenina nepřímo inhibuje růst těchto buněk v koncentracích potřebných k inhibici ligand-dependentní fosforylace receptoru a buněčné proliferace.

• ·

• · é • ···

211

Tabulka 4

Buněčná linie	Původ	IC50 (μΜ)	LDso (μΜ)
HT29	Karcinom střeva	10	22
A549	Karciom plic	9,5	22
NCI-H460	NSC plicní karcinom	8,9	20
SF767T	gliom	7,9	14
A431	Epidermoidní karcinom	6,0	18

Výsledky uvedené v tabulce 4 byly získány inkubací buněk po dobu 48 hodin v kompletním růstovém médiu v přítomnosti sériových zředění (2-diethylaminoethyl)amidu 5-(5-fluor-2-oxo-l,2-dihydroindol-3-ylidenmethyl)-2,4-dimethyl-l//-pyrrol-3-karboxylové kyseliny. Na konci doby růstu byl stanoven relativní poěet buněk. Hodnoty IC50 byly vypočteny jako koncentrace sloučeniny, která inhibovala růst buněk z 50% vzhledem k neošetřovaným buňkám. Hodnoty LD50 byly vypočteny jako koncentrace sloučeniny, která způsobila 50% snížení počtu buněk v porovnání s počtem buněk na začátku.

Relevantnější buněčný test, ve kterém byl vyhodnocován antiangiogenní účinek (2diethylamino-ethyl)amidu 5-(5-fluor-2-oxo-l,2-dihydroindol-3-yliden-methyl)-2,4dimethyl-1//-pyrrol-3-karboxylové kyseliny (Sloučenina 80) byl in vitro test mitogeneze s lidskými umbilikálními endoteliálními kmenovými buňkami (HUVEC) jako modelovým systémem proliferace endoteliálních buněk při angiogenním procesu. Při tomto testu byla mitogenní odpověď měřená jako zvýšení syntézy DNA indukována na vyhladověných HUVEC buňkách přidáním VEGF nebo FGF. V těchto buňkách inhiboval (2-diethylamino-ethyljamid 5-(5-fluor-2-oxo-1,2-dihydroindol-3-ylidenmethyl)-2,4dimethyl-l//-pyrrol-3-karboxylové kyseliny (Sloučenina 80) VEGF- a FGF-indukovanou mitogenní odpověď na dávce závislým způsobem s hodnoty IC50 0,004 μΜ, resp. 0,7 μΜ, v případě, kdy sloučenina byla přítomná celých 48 hodin testu.

Shora uvedené výsledky byly získány na vyhladověných HUVEC buňkách, které byly inkubovány s mitogenními koncentracemi VEGF (100 ng/ml) nebo FGF (30 ng/ml) v přítomnosti sériových zředění (2-diethylamino-ethyl)amidu 5-(5-fluor-2-oxo-l,2dihydroindol-3-ylidenmethyl)-2,4-dimethyl-l//-pyrro-l-3-karboxylové kyseliny (Sloučenina 80) po dobu 24 hodin. Mitogenní odpověď v průběhu následujících 24 hodin v

212 • « • · · • · · · · · • · přítomnosti ligandu a inhibitoru byla kvantifikována měřením syntézy DNA na bázi inkorporace bromodeoxyuridinu do buněčných DNA.

V oddělených experimentech inhibovala sloučenina 80 VEGF-dependentní fosforylaci ERK 1/2 (p42/44MAP kináza), časná sekvence po směru cíle Flk-1/KDR, na dávce závislým způsobem. Byla také prokázána dlouhotrvající inhibiční aktivita sloučeniny 80 v tomto systému; inhibice VEGF-dependentní fosforylace ERK 1/2 po dobu až 48 hodin po odstranění (2-diethylamino-ethyl)amidu 5-(5-fluor-2-oxo-l,2-dihydroindol3-ylidenmethyl)-2,4-dimethyl-l//-pyrrol-3-karboxylové kyseliny (Sloučenina 80) z média, následované krátkou expozicí (2 hodiny) mikromolámím koncentracím sloučeniny.

Bylo zjištěno, že VEGF je důležitým faktorem přežití endoteliálních buněk. Díky tomu, že (2-diethylamino-ethyl)amid 5-(5-fluor-2-oxo-l,2-dihydroindol-3-ylidenmethyl)2,4-dimethyl-l//-pyrrol-3-karboxylové kyseliny (Sloučenina 80) inhiboval VEGFdependentní mitogenní odpověď HUVEC buněk, byl pozorován účinek sloučeniny na přežití EÍUVEC buněk. V těchto experimentech bylo k indikaci apoptózi využito štěpení substrátu kaspázy 3 poly-ADP-ribosyl polymerázy (PARP). Buňky HUVEC kultivované bez séra po dobu 24 hodin vykazovaly výrazné hladiny PARP štěpení měřené akumulací 23 kDa PARP štěpícího fragmentu. Tomuto štěpení bylo velmi zásadním způsobem zabráněno přidáním VEGF do buněčného média, což ukazuje, že v tomto testu funguje VEGF jako faktor přežití. Bylo prokázáno, že (2-diethylamino-ethyl)amid 5-(5-fluor-2oxo-1,2-dihydroindol-3-ylidenmethyl)-2,4-dimethyl-l//-pyrrol-3-karboxylové kyseliny (Sloučenina 80) inhibuje přenos signálu KDR. Tudíž (2-diethylamino-ethyl)amid 5-(5fluor-2-oxo-l,2-dihydroindol-3-ylidenmethyl)-2,4-dimethyl-l//-pyrrol-3-karboxylové kyseliny (Sloučenina 80) inhiboval VEGF-zprostředkované přežití buněk HUVEC na dávce závislým způsobem. Tudíž tato data ukazují, že sloučenina 80 indukuje apoptózu v endoteliálních buňkách v kultuře za přítomnosti VEGF.

C. Studie účinnosti in vivo

i. Účinnost proti stabilizovanému xenoimplantátu nádoru

In vivo účinnost (2-diethylamino-ethyl)amidu 5-(5-fluor-2-oxo-l,2-dihydroindol-3yIidenmethyl)-2,4-dimethyl-l//-pyrrol-3 -karboxylové kyseliny (Sloučenina 80) byla studována v subkutánních (SC) xenoimplantátových modelech s lidskými nádorovými

• ···

213 buňkami implantovanými do oblasti zadní tlapky athymické myši. Po implantaci se před započetím perorálního ošetřování sloučeninou nechaly nádory narůst do velikosti 100-550 mm³.

Denní perorální podání sloučeniny 80 způsobovalo na dávce závislou inhibici růstu A431 nádoru v případě, kdy bylo ošetřování započato po dosažení velikosti nádoru 400 mm³. Statisticky signifikantní (P<0,05) inhibici růstu nádoru byla pozorována při dávkách 40 mg/kg/denně (74% inhibice) a 80 mg/kg/denně (84% inhibice) (viz tabulka 6). V předběžných experimentech nebyly vyšší dávky (160 mg/kg/denně) sloučeniny nijak účinnější vůči stabilizovaným A431 nádorům než při dávce 80 mg/kg/denně. Navíc myši ošetřované v dávce 160 mg/kg/denně ztrácely na hmotnosti, což ukazovalo na fakt, že vyšší dávka nebyla dobře tolerována. Podobné výsledky byly dosaženy v experimentu, ve o

kterém se A431 nádory nechaly vyrůst jen do velikosti 100 mm (viz tabulka 4). V tomto druhém experimentu byla pozorována úplná regrese nádorů u šesti z osmi zvířat ošetřovaných 80 mg/kg/denně po dobu 21 dnů. U těchto šesti zvířat nedošlo během 110 dnů pozorovací doby po konci ošetřování k opětovnému růstu nádoru. U dvou zvířat, ve o

kterých nádory opětovně vyrostly do velkých rozměrů (2000-3000 mm), byly nádory potlačeny v důsledku druhého kola ošetřování sloučeninou 80. Je důležité, že (2diethylamino-ethyl)amid 5-(5-fluor-2-oxo-l,2-dihydroindol-3-yliden-methyl)-2,4dimethyl-l/f-pyrrol-3-karboxylové kyseliny (Sloučenina 80) v dávce 80 mg/kg/denně byl dobře tolerován, i když dávkování bylo delší než 100 dnů.

Tabulka 5

Počáteční objem nádoru (mm3)	Sloučenina1 (mg/kg/denně)	% inhibice (dny)	P-hodnota
400	80	84 (36)	0,001
40	74 (36)	0,003
20	51 (36)	0,130
100 1 Sloučenina 80	80	93 (40)	0,002
40	75 (40)	0,015
10	61 (40)	0,059

• · • · · • ··· *

214

Výsledky uvedené v tabulce 5 byly získány s A431 buňkami (0,5 x 106 buněk/myš), které byly implantovány SC do oblasti zadní tlapky athymických myší. Denní perorální podání (2-diethylamino-ethyl)amidu 5-(5-fluor-2-oxo-l,2-dihydroindol-3ylidenmethyl)-2,4-dimethyl-l//-pyrro-l-3-karboxylové kyseliny (Sloučenina 80) v nosiči na bázi Cremophore nebo kontrolním nosiči bylo započato v případech, kdy nádory dosáhly uvedeného průměrného objemu. Nádory byly měřeny vemierovými kalipery a objem nádoru byl charakterizován způsobem délka x šířka x hmotnost. P-hodnoty byly vypočteny srovnáním velikosti nádorů u zvířat ošetřovaných sloučeninou 80 (n = 8) se zvířaty ošetřovanými nosičem (n - 16) v poslední den experimentu pomocí dvoustranného Studentova t-testu.

Účinnost sloučeniny 80 proti stabilizovaným lidským nádorům různých původů byla stanovena na xenoimplantátech Colo25 (karcinom střeva), SF763T (gliom) a NCIH460 (nemalobuněčný plicní karcinom) (viz tabulka 6). Tyto experimenty byly prováděny s (2-diethylamino-ethyl)amidem 5-(5-fluor-2-oxo-1,2-dihydroindol-3 -ylidenmethyl)-2,4dimethyl-1//-pyrrol-3-karboxylové kyseliny (Sloučenina 80) podávaným perorálně v dávce 80 mg/kg/denně, což je dávka, která je účinná a dobře tolerovaná.

Tabulka 6

	Typ nádoru	Počáteční objem nádoru (mm3)	% inhibice (dny)	P-hodnota
A4311	epidermoidní	100	93 (40)	0,002
A4311	epidermoidní	400	84 (36)	0,001
Colo205	střevní	370	77 (54)	0,028
NCI-H460	plicní	300	61 (54)	0,003
SF763T	gliom	550	53 (30)	0,001
1 Data jsou získána z experimentu uvedeného v tabulce 5

Ve výše uvedených experimentech byla sloučenina 80 podávána jednou denně v dávce 80 mg/kg v nosiči na bázi Cremophor, jakmile nádory dosáhly uvedené velikosti. Na konci experimentů byla vypočtena procentuální inhibice v porovnání s kontrolní skupinou ošetřovanou pouze nosičem. P-hodnoty byly vypočteny srovnáním velikostí nádorů u • · · • · · · ·

215 • ·

• ♦ · ···· · · zvířat, která byla ošetřována se sloučeninou, s velikostmi nádorů těch zvířat, která byla ošetřována nosičem, pomocí dvoustranného Studentova t-testu.

Ačkoliv (2-diethylamino-ethyl)amid 5-(5-fluor-2-oxo-l,2-dihydroindol-3ylidenmethyl)-2,4-dimethyl-l //-pyrrol-3 -karboxylové kyseliny (Sloučenina 80) inhiboval růst všech typu nádorů uvedených v tabulce 7, byl zde pozorován rozdíl při odpovědi různých xenoimplantátových modelů. Specificky byl růst NCI-H460 a SF763T nádorů zastaven nebo z velké většiny zpomalen, kdežto nádory Colo205 tumors, jako A431 nádory, po ošetření (2-diethylamino-ethyl)amidem 5-(5-fluor-2-oxo-l,2-dihydroindol-3ylidenmethyl)-2,4-dimethyl-1 //-pyrrol-3 -karboxylové kyseliny ustoupily.

Kvůli určení molekulárního charakteru rozdílu v odpovědi mezi jednotlivými xenoimplantátovými modely byly studovány SF763T nádory. SF763T nádory, které méně responzivní na ošetřování (2-diethylamino-ethyl)amidem 5-(5-fluor-2-oxo-l,2dihydroindol-3-ylidenmethyl)-2,4-dimethyl-l//-pyrro-l-3-karboxylové kyseliny, byly tedy vyhodnocovány v molekulárních hladinách pomocí imunohistologických technik na účinek ošetření sloučeninou. Tyto studie byly zpočátku prováděny na tomto typu nádoru, protože SF763T nádory jsou vysoce vaskularizované s mikrocévkami, které velmi intenzivně exprimují endoteliální buněčný markér CD31, a jsou tudíž velmi vhodné ke studiím hustoty mikrocévek nádoru (MVD). Imunohistologická vyhodnocení SF763T nádorů ukazují, že nádory z ošetřovaných zvířat měly sníženou MVD v porovnání s kontrolními skupinami ošetřovanými nosičem, což je v souladu s antiangiogenním mechanizmem účinku sloučeniny 80; MVD bylo 24,2 ± 4,1 u zvířat ošetřovaných sloučeninou 80 v porovnání s 39,3 ± 5,7 u zvířat ošetřovaných pouze nosičem. Jak se předpokládalo na základě zastavení růstu nádoru, byla uvedená inhibice proliferaci nádorových buněk evidentní u nádorů, které byly ošetřovány sloučeninou 80. Tyto nádory měly poloviční mitotický index u nádorů ošetřovaných nosičem (data nejsou uvedena). Účinek sloučeniny 80 na MVD a proliferaci nádorových buněk ukazuje, že sloučenina má silný antiangiogenní a protinádorový účinek, a to i v případech, kdy nádory neustupují.

Schopnost sloučeniny 80 inhibovat fosforylaci PDGFR a následný přenos signálu in vivo byl také stanoven na SF763T nádorech, které exprimují vysoké hladiny PDGFRp. Ošetřování SF763T nádorů sloučeninou 80 velmi silně inhibovalo PDGFRp fosforylaci tyrosinu ve stabilizovaných SF763T nádorech. Sloučenina 80 také snižovala hladiny fosforylované (aktivované) fosfolipázy C gamma (PLC-γ), přímý downstreamový indikátor

216 • Φ Μ · • * Φ · • · · • Φ Φ Φ • · Φ

ΦΦΦΦ ΦΦ ♦ ♦ ·

Φ Φ Φ

Φ Φ Φ Φ • Φ ΦΦΦΦ • Φ Φ ·· φ

ΦΦ · • « Φ • Φ Φ Φ • Φ < ΦΦΦΦ • · Φ

ΦΦ Φ aktivace PDGFR. Tato data ukazují, že perorální podání sloučeniny 80 má přímý účinek na cílovou (PDGFR) aktivitu v nádorech in vivo.

Na základě zjištění, že schopnost sloučeniny 80 inhibovat VEGF-dependentní přenos signálu v buňkách HUVEC in vitro je dlouhotrvající (vide infra), byla vyhodnocena účinnost sloučeniny při občasné aplikaci této sloučeniny v modelu nádoru Colo205. Jak je vidět z tabulky 7, byly dávky ve výši 80 mg/kg (91% inhibice) a 40 mg/kg (84% inhibice) účinné v případě denního podávání, nikoliv však při podávání dvakrát týdně. Na rozdíl od vyšší dávky sloučeniny 80 (160 mg/kg), která inhibovala (52% inhibice) růst stabilizovaných nádorů Colo205, při podání dvakrát týdně, což ukazuje, že sloučenina může být účinná, i když je podávána občas ve vyšší dávce. Mělo by být uvedeno, že dávkovači režimy mohou být určeny odborníky v oboru na základě experimentu.

Tabulka 7

Dávka (mg/kg)	Frekvence	% inhibice	P-hodnota
160	Dvakrát týdně	52	0,085
	Jednou týdně	17	NS
80	Denně	91	0,039
	Dvakrát týdně	19	NS
	Jednou týdně	0	NS
40	Denně	84	0,028
	Dvakrát týdně	36	NS
NS: bezvýznamná hoc	nota (P > 0,05)

Výsledky uvedené v tabulce 7 byly získány s buňkami Colo 205 (0,5 x 10⁶ buněk/myš), které byly implantovány do oblasti zadní tlapky athymických myší. Perorální podání sloučeniny 80 podle uvedeného režimu bylo započato až po dosažení velikosti nádorů 400 mm³. Nádory byly změřeny vemierovými kalipery a objem nádoru byl vyhodnocen jako délka x šířka x hmotnost. P-hodnoty byly vypočteny srovnáním velikosti nádorů zvířat, která byla ošetřována sloučeninou 80, s velikostmi nádorů u zvířat, která byla poslední den experimentu ošetřována pouze nosičem, pomocí dvoustranného Studentova t-testu.

• · • ···· 9 • · • ·

217 ·· «· * · · • · ···· ·· ii. Účinnost sloučeniny 80 na modelu diseminovaného onemocnění

Kromě podpory trvalého růstu pevných primárních nádorů je také angiogeneze významným faktorem podporujícím vývoj diseminovaného onemocnění v důsledku metastáze z primárního nádoru. Účinek sloučeniny 80 na vývoj diseminovaného onemocnění byl zkoumán na modelu kolonizace plicního melanomu u B16-F1 myší. Jak je z tabulky 7 vidět, tak perorální podání sloučeniny 80 v dávce 80 mg/kg/denně účinně snižovalo zátěž B16-F1 buněk v plicích, což bylo stanoveno změřením celkové hmotnosti plic. Z těchto dat je vidět, že sloučenina 80 může inhibovat diseminované onemocnění in vivo.

Tabulka 8

	Hmotnost plic (g)	% Inhibice	P-hodnota
Nosič	0,83 ± 0,07	-	-
Sloučenina1	0,41 ±0,04	50	<0,001
'Sloučenina 80

Výsledky uvedené v tabulce 8 byly získány na athymických myší, které byly inokulovány B16-F1 nádorovými buňkami (5 x 10⁵ buněk/myš) ocasní vénou. Myši byly ošetřovány denně perorálně podávanou sloučeninou 80 v dávce 80 mg/kg/denně (n = 10) nebo nosičem (n = 18) po dobu 24 hodin po inokulaci nádorových buněk. Na konci experimentu byly myši usmrceny a jejich plíce byly odstraněny a zváženy. Procentuální inhibice byla vypočtena srovnáním hmotnosti plic zvířat, která byla ošetřována sloučeninou 80, s plícemi zvířat, která byla ošetřována pouze nosičem. P-hodnoty byly stanoveny dvoustranným Studentovým t-testem.

II. Inhibitory COX-2

Schopnost inhibitorů COX-2 zpomalit růst nádorů byla testována na Lewisově plicním modelu, který je detailněji popsán níže.

Myším byla provedena subkutánní injekce do levé tlapky (1 x 10⁶ nádorových buněk suspendovaných v 30% Matrigelu) a objem nádoru byl vyhodnocován phlethysmometrem dvakrát týdně po dobu 30-60 dnů. Krev byla odebírána dvakrát během

218 • · · • · · ···· ·· • · · • · · • · * · • * ···· « • · · ·« · • · ♦ • · · · • · ···· • · · ·· « hodin experimentu ke stanovení plazmové koncentrace a celkové expozice pomocí AUC analýzy. Data jsou vyjádřena jako průměr ± SEM. Ke stanovení rozdílů mezi průměry pomocí souboru programů InStat byly používány Studentův a Mann-Whitneyův test. Celecoxib podávaný v rámci stravy v dávkách v rozmezí 160 - 3200 ppm zpomaloval růst těchto nádorů. Inhibiční účinek celecoxibu byl na dávce závislý a pohyboval se od 48% do 85% v porovnání s kontrolními nádory. Analýza plicních metastází byla provedena u všech zvířat spočítáním jednotlivých metastází pomocí stereomikroskopu a histochemickou analýzou konsekutivních plicních řezů. Celecoxib neovlivňoval plicní metastázy při nižší dávce 160 ppm, nicméně povrchová metastáze byla snížena z více než 50% při dávkách v rozmezí od 480 do 3200 ppm. Navíc histopatologickou analýzou bylo zjištěno, že celecoxib na dávce závislým způsobem snižuje velikost metastatických lézí v plicích.

2. HT-29 model:

Myším byla provedena subkutánní injekce do levé tlapky (1 x 10⁶ nádorových buněk suspendovaných v 30% Matrigelu) a objem nádoru byl vyhodnocován phlethysmometrem dvakrát týdně po dobu 30 - 60 dnů. Implantace lidských střevních rakovinových buněk (HT-29) do nahých myší produkovala nádory, které dosahovaly 0,6 2 ml mezi 30 - 50 dny. Krev byla odebírána dvakrát během 24 hodin experimentu ke stanovení plazmové koncentrace a celkové expozice pomocí AUC analýzy. Data jsou vyjádřena jako průměr ± SEM. Ke stanovení rozdílů mezi průměry pomocí souboru programů InStat byly používány Studentův a Mann-Whitneyův test.

A. Myši, kterým byly injektovány HT-29 rakovinové buňky, byly ošetřovány cytoxinem i.p. v dávce 50 mg/kg ve dnech 5, 7 a 9 v přítomnosti nebo absenci celecoxibu v potravě. Účinnost obou agens byla stanovena měřením objemu nádoru. Ošetření inhibitorem COX-2 podobným celecoxibu (SC-58236) snižovalo objem nádoru z 89%. V tomto testu inhiboval indomethacin podávaný téměř v maximální tolerovatelné dávce 2 mg/kg/denně v pitné vodě tvorbu nádoru ze 77%. Navíc selektivní inhibitor COX-2 zcela inhiboval tvorbu plicní metastáze, zatímco neselektivní NSAID indomethacin byl neúčinný. Výsledky z těchto studií ukazují, že celecoxib podávaného v potravě myším majícím nádor může zpomalit růst nádorů a metastází, pokud je podáván v rámci výhradní • · · • · · · ♦ • · 9

219 • * 9 • · • ' • · ···· ·· ·· · terapie. Navíc byla pozorována pozitivní výhoda v případě, kdy celecoxib byl podáván v kombinaci s cytotoxickým agens, např. cyklofosfamidem.

B. V druhém testu byly myši s injektovanými HT-29 střevními rakovinovými buňkami ošetřovány celecoxibem (10, 40 nebo 160 ppm) v potravě počínaje desátým dnem. Byl pozorován účinek přibližně závislý na dávce.

Tabulka 9

Dny	Nosič	10 ppm	40 ppm	160 ppm
14	0,114	0,124	0,125	0,120
22	0,25	0,25	0,19	0,14
28	0,45	0,36	0,27	0,21
35	0,79	0,57	0,4	0,3
42	1,38	0,89	0,68	0,49
50	1,9	1,49	1,04	0,8

Objem (ml)

III. In vivo test pomocí protein kínáz v kombinaci se selektivním inhibitorem cyklooxygenázy-2 pro léčení rakoviny

Schopnost inhibitoru protein kinázy zpomalovat růst nádorů v kombinaci se selektivním inhibitorem COX-2 může být testována v 1483 xenoimplantátovém modelu, který je detailněji popsán níže.

1483 xenoimplantát je zvířecího původu a modeluje lidské epiteliální rakoviny exprimující cyklooxygenázu-2 (COX-2) v nádorových buňkách a ve vaskulatuře.

Lidský nádorový xenoimplantátový model karcinomu na nahé myši skvamózních buněk hlavy a krku (1483 buněčná linie), které exprimují COX-2 v nádorových buňkách a ve vaskulatuře, je podobný lidským epiteliálním rakovinám. Předpokládáme, že tento model reprezentuje lidské epiteliální rakoviny a mohl by být dobrým modelem ke korelaci účinnosti protirakovinových léků, včetně účinnosti inhibitorů COX-2 na lidských subjektech.

• · • ···· • ·

220 ·· • · · • · • · • · ··»· ·· ·· * • · ·

- * · · · • · ·*··· • · ·

Materiály a metody:

Buněčná kultura:

1483 Buňky karcinomu skvamózních buněk hlavy a krku (HNSCC) byly skladovány ve zmražených ampulkách obsahujících 3 x 10⁶ buněk, 90% fetální bovinní sérum (FBS) a 10% dimethylsulfoxid (DMSO). Zmrazená ampulka se rychle ohřála na teplotu 37° C a umístnila do T-162 cm² (Corning) baňky obsahující D-MEM/F12 médium (GibcoBRL) s 15 mM Hepes pufrem, L-glutaminem, pyridoxin-hydrochloridem a 10% FBS. Buňky byly kultivovány v inkubátoru s 5% CO₂ a při teplotě 37° C. Médium bylo vyměňováno každý den a buňky byly promývány po dosažení 80-90% konfluence. Při promývání buněk byla baňka promyta 10 ml fyziologického roztoku tlumeného fosfátem (PBS), odaspirována, pak byly přidány 2 ml trypsin/EDTA (0,25% 1 mM, GibcoBRL) a umístněny zpátky do inkubátoru na 5 minut. Buňky se oddělí. Poté bylo přidáno 8 ml shora uvedeného média do baňky k promytí a převedení do sterilní 50 ml centrifugační kyvety. Bylo přidáno dalších 30 ml média, promícháno a buňky byly měřeny hemacytometrem, nanesení buněk do T-162 cm² obsahujícího 3-4 x 10⁶ buněk.

1483 zvířecí model:

Médium bylo vyměněno 24 hodin před sbíráním 1483 buněk a aplikací do nahých myší (injekcí). Provedla se trypsinizace 1483 buněk popsaných výše v odstavci o buněčné kultuře, spočítání a měření počtu buněk, centrifugace buněk při 1000 ot./min. po dobu 5 minut za pokojové teploty. Dále bylo provedeno resuspendování buněčných pelet a jejich uložení (pokud bylo více 50 ml centrifugační ch kyvet) do jedné 50 ml centrifugační kyvety s fyziologickým roztokem pufrovaným Hankovým roztokem (HBSS, GibcoBRL). Dále je možné získat o 25% více buněk než je skutečně potřeba mít k injekci pro zajištění extra podílu buněk. Pokud se injektuje 72 myší a člověk má 100 x 10⁶ buněk, je třeba připravit všechny buňky k injekci do myši. Injektování 1483 buněk při 1 x 10⁶ buněk v 0,03 ml/myš.

Bylo provedeno injektování buněk s 30% Matrigelem (Collaborative Biomedical Products) a 70% HBSS, resuspendování uložené pelety s 2,1 ml (70%) studeného HBSS, pak přidání 0,9 ml (30%) rozmraženého zkapalněného studeného Matrigelu a míchání jamek na ledu. Buněčný preparát byl před injektací myším po celou dobu uchováván na ·· ·· ··· · · · • · · · · ·· · · · ·· · · ··· · ··· • · · · · ···*··· · ···· ··· · · · · · · ······ ·· · ·· ·

221 ledu. V této studií byly používány samčí nahé myši staré 4-6 týdnů (Harlen). Myši byly anestetizovány plynem CO2/O2, poté jim byla injektována do středu pravé zadní tlapky 0,5cc tuberkulinová injekce (Beckerson & Dickerson). Dále bylo provedeno zjištění hmotnosti myší v den injekce (den 0) kvůli určení základní hmotnosti na začátku studie.

Myši byly zváženy sedmý den a rovněž byla zvážena pravá zadní tlapka kvůli, změření objemu nádoru pomocí plethysmometru (Stoelting Co.). Plethysmometr je přístroj k měření objemu tlapky (na vodní bázi). Dále bylo provedeno měření několika levých neinjektovaných tlapek a stanovení průměrného pozadí měření k odečtení od hodnot získaných s pravou tlapkou s nádorem.

Pokud nádory dosahovaly 100 - 200 ul velikosti, byla zvířatům podávána strava s testovanými sloučeninami, přičemž v podávání stravy společně se sloučeninami pokračovalo v průběhu studie. Některé myši obdržely pouze inhibitor protein kinázy nebo selektivní inhibitor cyklooxygenázy-2. Některým myším byl denně podáván inhibitor protein kinázy i selektivní inhibitor cyklooxygenázy-2 ve vhodných dávkách určených na základě výsledků z in vitro studie.

Myši byly v průběhu studie v 7., 10., 14., 17., 21., 24. a 28. dni zváženy a měřeny. Zvířatům lze začít ošetřovat sloučeninou v den 0 (profylakticky), nebo jakmile dojde ke stabilizaci nádoru kolem sedmého dne (terapeuticky). Okolo třicátého dne bude v kontrolní skupině myší ošetřovaných pouze nosičem dosahovat velikost nádoru přibližně 1,0 - 1,5 ml a začne se u nich projevovat ztráta hmotnosti. V této fázi se provede ukončení podávání nosiče. Pokud je u ošetřovaných skupin vidět inhibice nádoru a jsou v dobrém zdravotním stavu, provede se usmrcení poloviny zvířat z ošetřovaných skupin a druhá polovina se nechá naživu ke stanovení opoždění růstu nádoru.

Pracovníci v oboru rychle ocení, že tento vynález je dobře přizpůsoben k provedení cílů a k dosažení konců a uvedených výhod včetně těch, které jsou součástí vynálezu. Molekulové komplexy a metody, postupy, léčby, molekuly, specifické sloučeniny zde popsané jsou v současnosti představiteli výhodných provedení, jsou exemplární a nejsou zamýšleny jako omezení rozsahu tohoto vynálezu. Jejich změny a další využití, ke kterým pracovníci v oboru znalí povahy tohoto vynálezu dospějí, jsou definovány rozsahem patentových nároků.

Pracovníkům v oboru bude také jasně zřejmé, že ve zde předkládaném vynálezu mohou být provedeny variace substitucí a modifikací bez odklonu od jeho smyslu a rozsahu.

• · ·· ··· · · · • · · · ··· · · · • · · · ··· · · · · • · · · · · ···· · · · ···· ······ ··· ······ ·· · ·· ·

222

Veškeré patenty a publikace uvedené v podlohách jsou příznačné pro úroveň pracovníků v oboru, kterých se tento vynález týká. Všechny patenty a publikace jsou zde začleněny pomocí odkazů se stejným rozsahem, v jakém by byla každá jednotlivá publikace specificky a individuálně označena pro začlenění odkazem.

• · · · φ φ

223

Claims (72)

1. PATENTOVÉ NÁROKY

   1. Farmaceutická kompozice pro léčení nebo prevenci rakovin, která zahrnuje účinné látky a popřípadě nosič a/nebo pomocné látky, vyznačující se tím, že jako účinné látky obsahuje inhibitor protein kinázy obecného vzorce (I):

   kde substituent R je vybrán ze skupiny sestávající z atomu vodíku, piperazin-1 -ylmethylu, 4-methylpiperazin-1 -ylmethylu, piperidin-1 -ylmethylu, 2-hydroxy-methylpyrrolidin-1 -ylmethylu, 2-karboxypyrrolidin-1 -ylmethylu a pyrrolidin-1 -ylmethylu;

   substituent R¹ je vybrán ze skupiny sestávající z atomu vodíku, halogenu, alkylu, substituovaného alkylu, cykloalkylu, substituovaného cykloalkylu, arylu, heteroarylu, heteroalicyklu, hydroxyskupiny, alkoxyskupiny, -C(O)NR R , -NR¹³R¹⁴,-(CO)R¹⁵ a-(CH₂)_rR¹⁶;

   substituent R² je vybrán ze skupiny sestávající z atomu vodíku, halogenu, alkylu, substituovaného alkylu, trihalogenmethylu, hydroxyskupiny, alkoxyskupiny, kyanoskupiny, -NR¹³R¹⁴, -NR¹³C(O)R¹⁴, -C(O)R¹⁵, arylu, heteroarylu a -S(O)₂NR¹³R¹⁴;

   substituent R³ je vybrán ze skupiny sestávající z atomu vodíku, halogenu, alkylu, substituovaného alkylu, trihalogenmethylu, hydroxyskupiny, alkoxyskupiny, arylu, heteroarylu, -NR¹³R¹⁴, -NR¹³S(O)2R¹⁴, -S(O)2NR¹³R¹⁴, -NR¹³C(O)R¹⁴, -NR¹³C(O)OR¹⁴, -(CO)R¹⁵ a -SO₂R¹⁹;

   substituent R⁴ je vybrán ze skupiny sestávající z atomu vodíku, halogenu, alkylu, substituovaného alkylu, hydroxyskupiny, alkoxyskupiny a -NR¹³R¹⁴;

   • · • · · · ♦ · • · · • » · ·· · ···· • · ··· · · · · · · · · ··· ··· · · · ······ ·· · · · ·

   224 substituent R⁵ je vybrán ze skupiny sestávající z atomu vodíku, alkylu, substituovaného alkylu a -C(O)R^l°;

   substituent R⁶ je vybrán ze skupiny sestávající z atomu vodíku, alkylu, substituovaného alkylu a -C(O)R¹⁰;

   substituent R⁷ je vybrán ze skupiny sestávající z atomu vodíku, alkylu, substituovaného alkylu, arylu, heteroarylu, -C(O)R¹⁷ a -C(O)R¹⁰ za předpokladu, že pokud substituent R je atom vodíku, pak alespoň jeden ze substituentů R⁵, R⁶ a R⁷ je-C(O)R¹⁰; nebo substituent R⁶ a substituent R⁷ mohou dohromady tvořit skupinu vybranou ze skupiny sestávající z -(CH₂)4-, -(CH₂)s-a -(CH₂)6-;

   substituent R⁸ a substituent R⁹ jsou nezávisle vybrány ze skupiny sestávající z atomu vodíku, alkylu, substituovaného alkylu a arylu;

   substituent R¹⁰ je vybrán ze skupiny sestávající z hydroxyskupiny, alkoxyskupiny, aryloxyskupiny, -N(Rⁿ)(alkylen)_nR¹², kde alkylenová skupina je případně substituovaná hydroxyskupinou a -NR¹³R¹⁴;

   substituent R¹¹ je vybrán ze skupiny sestávající z atomu vodíku, alkylu a substituovaného alkylu;

   substituent R¹² je vybrán ze skupiny sestávající z -NR¹³R¹⁴, hydroxyskupiny, -C(O)R¹⁵, arylu, heteroarylu, -N⁺(O')R¹³R¹⁴, -N(OH)R¹³ a -NHC(O)R¹⁸, kde substituent R¹⁸ je alkyl, substituovaný alkyl, halogenalkyl nebo aralkyl;

   substituent R¹³ a substituent R¹⁴ jsou nezávisle vybrány ze skupiny sestávající z atomu vodíku, alkylu, substituovaného alkylu, nižšího alkylu substituovaného hydroxyalkylaminoskupinou, kyanoalkylu, cykloalkylu, substituovaného cykloalkylu, arylu a heteroarylu; nebo substituenty R¹³ a R¹⁴ mohou dohromady tvořit heterocykloskupinu; substituent R¹⁵ je vybrán ze skupiny sestávající z atomu vodíku, hydroxyskupiny, alkoxyskupiny a aryloxyskupiny;

   substituent R¹⁶ je vybrán ze skupiny sestávající z hydroxyskupiny,

   -NR¹³R¹⁴, -C(O)R¹⁵ a -C(O)NR¹³R¹⁴;

   substituent R¹⁷ je vybrán ze skupiny sestávající z alkylu, substituovaného alkylu, cykloalkylu, arylu a heteroarylu;

   • · • · ·

   225 substituent R¹⁹ je vybrán ze skupiny sestávající z alkylu, substituovaného alkylu, arylu, aralkylu, heteoarylu nebo heteroaralkylu; a n a r jsou nezávisle 1, 2, 3 nebo 4; nebo jeho farmaceuticky přijatelná sůl a inhibitor cyklooxygenázy, nebo jeho farmaceuticky přijatelou sůl;

   uvedená farmaceutická kompozice je případně přítomna v oddělených dávkových formách pro současné nebo následné podání.
2. 2. Farmaceutická kompozice podle nároku 1, vyznačující se tím, že inhibitor cyklooxygenázy je selektivní inhibitor 2-cyklooxygenázy vybraný ze skupiny sestávající z:

   (i) sloučeniny obecného vzorce (II):

   kde:

   G je vybráno ze skupiny sestávající z O, S a -NR^a-, kde substituent R^a je atom vodíku nebo alkyl;

   substituent R^10a je vybrán ze skupiny sestávající z atomu vodíku a arylu; substituent R^lla je vybrán ze skupiny sestávající z karboxylu, alkylu, aralkylu, aminokarbonylu, alkylsulfonylaminokarbonylu a alkoxykarbonylu;

   substituent R^12a je vybrán ze skupiny sestávající z halogenalkylu, alkylu, aralkylu, cykloalkylu a arylu případně substituovaného jedním nebo více radikály vybranými z alkylthioskupiny, nitroskupiny a alkylsulfonylu; a substituent R^13a je jeden nebo více radikálů nezávisle vybraných ze skupiny sestávající z atomu vodíku, halogenu, alkylu, aryloxyskupiny, heteroaralkyloxyskupiny, alkylaminoskupiny, heteroaryloxyskupiny, halogenalkylu, arylaminoskupiny, aralkylu, alkoxyskupiny, aralkyloxyskupiny, halogenalkoxyskupiny, aralkylaminoskupiny, ··· ·· · · · · ··· ·· · · · · · • · · · · « · · · · ··· heteroarylaminoskupiny, heteroarylalkylaminoskupiny, nitroskupiny, aminoskupiny, aminosulfonylu, alkylaminosulfonylu, arylaminosulfonylu, heteroarylaminosulfonylu, aralkylaminosulfonylu, heteroaralkylaminosulfonylu, heterocyklosulfonylu, alkylsulfonylu, hydroxyarylkarbonylu, nitroarylu, případně substituovaného arylu, případně substituovaného heteroarylu, aralkylkarbonylu, heteroarylkarbonylu, arylkarbonylu, aminokarbonylu a alkylkarbonylu;

   nebo substituent R^13a společně s kruhem E vytváří naftylový kruh; nebo (ii) sloučeniny obecného vzorce (III):

   (III) kde:

   A je vybráno ze skupiny sestávající z částečně nenasyceného nebo nenasyceného heterocyklylu a částečně nenasycených nebo nenasycených karbocyklických kruhů;

   substituent R^lb je vybrán ze skupiny sestávající z heterocyklylu, cykloalkylu, cykloalkenylu a arylu, kde substituent R^lb je případně substituovaný do substituovatelné polohy jedním nebo více radikály nezávisle vybranými z alkylu, halogenalkylu, kyanoskupiny, karboxylu, alkoxykarbonylu, hydroxylu, hydroxy alkylu, halogenalkoxyskupiny, aminoskupiny, alkylaminoskupiny, arylaminoskupiny, nitroskupiny, alkoxyalkylu, alkylsulfinylu, halogenu, alkoxyskupiny a alkylthioskupiny;

   substituent R^2b je vybrán ze skupiny sestávající z methylu a aminoskupiny; a substituent R je vybrán ze skupiny sestávající z radikálu vybraného z atomu vodíku, halogenu, alkylu, alkenylu, alkynylu, oxoskupiny, kyanoskupiny, karboxylu, kyanoalkylu, heterocyklyloxyskupiny, alkyloxyskupiny, alkylthioskupiny, alkylkarbonylu, cykloalkylu, arylu, halogenalkylu, heterocyklylu, cykloalkenylu, aralkylu, heterocyklylalkylu, acylu, alkylthioalkylu, hydroxyalkylu, alkoxykarbonylu, arylkarbonylu, aralkylkarbonylu, aralkenylu, • · ··· · • · · · ···· · · · · · ♦ ··· · · · ··· • « ··· · · · · · · • · · ··· · · ······ ·· · · ·

   227 alkoxyalkylu, arylthioalkylu, aryloxyalkylu, aralkylthioalkylu, aralkoxyalkylu, alkoxyaralkoxyalkylu, alkoxykarbonylalkylu, aminokarbonylu, aminokarbonylalkylu, alkyl aminokarbonylu, TV-arylaminokarbonylu,

   TV-alkyl-TV-arylaminokarbonylu, alkylaminokarbonylalkylu, karboxyalkylu, alkylaminoskupiny, A-arylaminoskupiny, N-aralkylaminoskupiny, /V-alkyl-Naralkylaminoskupiny, /V-alkyl-TV-arylaminoskupiny, aminoalkylu, alkylaminoalkylu, TV-arylaminoalkylu, N-aralkylaminoalkylu, /V-alkyl-Naralkylaminoalkylu, 7V-alkyl-N-arylaminoalkylu, aryloxyskupiny, aralkoxyskupiny, arylthioskupiny, aralkylthioskupiny, alkylsulfinylu, alkylsulfonylu, aminosulfonylu, alkylaminosulfonylu, TV-arylaminosulfonylu, arylsulfonylu a Nalkyl-TV-arylaminosulfonylu;

   nebo jejich farmaceuticky přijatelné soli.
3. 3. Farmaceutická kompozice podle nároku 2, vyznačující se tím, že selektivním inhibitorem cyklooxygenázy-2 je sloučenina obecného vzorce (II), kde:

   G je vybráno ze skupiny sestávající z kyslíku a síry;

   substituent R^lla je vybrán ze skupiny sestávající z karboxylu, nižšího alkylu, nižšího aralkylu a nižšího alkoxykarbonylu;

   substituent R^12a je vybrán ze skupiny sestávající z nižšího halogenalkylu, nižšího cykloalkylu a fenylu; a substituent R^13a je jeden nebo více radikálů vybraných ze skupiny sestávající z H, halogenu, nižšího alkylu, nižší alkoxyskupiny, nižšího halogenalkylu, nižší halogenalkoxyskupiny, nižší alkylaminoskupiny, nitroskupiny, aminoskupiny, aminosulfonylu, nižšího alkylaminosulfonylu, 5-ti členného heteroarylalkylaminosulfonylu, 6-ti členného heteroarylalkylaminosulfonylu, nižšího aralkylaminosulfonylu, 5-ti členného heterocyklosulfonylu obsahujícího dusík, 6-ti členného heterocyklosulfonylu obsahujícího dusík, nižšího alkylsulfonylu, případně substituovaného fenylu, nižšího aralkylkarbonylu a nižšího alkylkarbonylu; nebo substituent R^13a společně s kruhem E vytváří naftylový radikál.
4. 4.

   Farmaceutická kompozice podle nároku 3, vyznačující se tím, že:

   • · • · ···· ·· · · • · · · · · ···· • · · · · ·· · · · ·· · ··· ··· ··· ······ ·· · ·· ·

   228 substituent R^lla je karboxyl; substituent R^12a je nižší halogenalkyl; a substituent R^13a je jeden nebo více radikálů vybraných ze skupiny sestávající z H, halogenu, nižšího alkylu, nižšího halogenalkylu, nižší halogenalkoxyskupiny, nižší alkylaminoskupiny, aminoskupiny, aminosulfonylu, nižšího alkylaminosulfonylu, 5-ti členného heteroarylalkylaminosulfonylu, 6-ti členného heteroarylalkylaminosulfonylu, nižšího aralkylaminosulfonylu, nižšího alkylsulfonylu, 6-ti členného heterocyklosulfonylu obsahujícího dusík, případně substituovaného fenylu, nižšího aralkylkarbonylu a nižšího alkylkarbonylu; nebo substituent R^13a společně s kruhem E vytváří naftylový radikál.
5. 5. Farmaceutická kompozice podle nároku 4, vyznačující se tím, že: substituent R^12a je vybrán ze skupiny sestávající z fluormethylu, chlormethylu, dichlormethylu, trichlormethylu, pentafluorethylu, heptafluorpropylu, difluorethylu, difluorpropylu, dichlorethylu, dichlorpropylu, difluormethylu a trifluormethylu; a substituent R^13a je jeden nebo více radikálů vybraných ze skupiny sestávající z hydridoskupiny, chloru, fluoru, bromu, jodu, methylu, ethylu, izopropylu, íerc-butylu, butylu, izobutylu, pentylu, hexylu, methoxyskupiny, ethoxyskupiny, izopropyloxyskupiny, íerc-butyloxyskupiny, trifluormethylu, difluormethylu, trifluormethoxyskupiny, aminoskupiny, 7/,/V-dimethylaminoskupiny, /V,7V-diethylaminoskupiny, TV-fenylmethylaminosulfonylu, TV-fenylethylaminosulfonylu, 2V-(2-furylmethyl)aminosulfonylu, nitroskupiny, 2V,/V-dimethylaminosulfonylu, aminosulfonylu, TV-methylaminosulfonylu, 7V-ethylsulfonylu,

   2.2- dimethylethylaminosulfonylu, 7V,7/-dimethylaminosulfonylu, 7V-(2-methylpropyl)aminosulfonylu, /V-morfolinosulfonylu, methylsulfonylu, benzylkarbonylu,

   2.2- dimethylpropylkarbonylu, fenylacetylu a fenylu; nebo substituent R^13a společně s kruhem E vytváří naftylový radikál.
6. 6. Farmaceutická kompozice podle nároku 5, vyznačující se tím, že: substituent R^12a je vybrán ze skupiny sestávající z trifluormethylu a pentafluorethylu; a • · φ φ · · · ·

   229 • · • · · · · • · · · • · · · · • ΦΦΦ • · · φ · · • φ φ φ · φ φφφ • φ substituent R^13a je jeden nebo více radikálů vybraných ze skupiny sestávající z hydridoskupiny, chloru, fluoru, bromu, jodu, methylu, ethylu, izopropylu, terc-butylu, methoxyskupiny, trifluormethylu, trifluormethoxyskupiny, A-fenylmethylaminosulfonylu, A-fenylethylaminosulfonylu, N-(2-furylmethyl)aminosulfonylu, 7V,7V-dimethylaminosulfonylu, TV-methylaminosulfonylu, /V-(2,2-dimethylethyl)aminosulfonylu, dimethylaminosulfonylu, 2-methylpropylaminosulfonylu, TV-morfolinosulfonylu, methylsulfonylu, benzylkarbonylu a fenylu; nebo kde substituent R^13a společně s kruhem E vytváří naftylový radikál.
7. 7. Farmaceutická kompozice podle nároku 2, vyznačující se tím, že selektivní inhibitor cyklooxygenázy-2 je vybrán ze skupiny sestávající z:

   6-chlor-2-trifluormethyl-2//-l-benzopyran-3-karboxylové kyseliny;

   6-chlor-7-methyl-2-trifluormethyl-2H-l-benzopyran-3-karboxylové kyseliny;
8. 8-( 1 -methylethyl)-2-trifluormethyl-2/Z-1 -benzopyran-3-karboxylové kyseliny;

   6-chlor-7-(l,l-dimethylethyl)-2-trifluormethyl-2//-l-benzopyran-3-karboxylové kyseliny;

   6- chlor-8-( 1 -methylethyl)-2-trifluormethyl-2H-1 -benzopyran-3 -karboxylové kyseliny;

   2-trifluormethyl-3J/-naftopyran-3-karboxylové kyseliny;

   7- (1,1 -dimethylethyl)-2-trifluormethyl-2H-1 -benzopyran-3-karboxylové kyseliny; 6-brom-2-trifluormethyl-2/í-l-benzopyran-3-karboxylové kyseliny;

   8- chlor-2-trifluormethyl-2/ř-l-benzopyran-3-karboxylové kyseliny;

   6- trifluormethoxy-2-trifluormethyl-27/-l-benzopyran-3-karboxylové kyseliny;

   5.7- dichlor-2-trifluormethyl-2//-l-benzopyran-3-karboxylové kyseliny; 8-fenyl-2-trifluormethyl-2//-l-benzopyran-3-karboxylové kyseliny;

   7.8- dimethyl-2-trifluormethyl-2H-l-benzopyran-3-karboxylové kyseliny;

   6.8- bis(dimethylethyl)-2-trifluormethyl-2//-l-benzopyran-3-karboxylové kyseliny;

   7- (l-methylethyl)-2-trifluormethyl-2//-l-benzopyran-3-karboxylové kyseliny;

   7-fenyl-2-trifluormethyl-2H-l-benzopyran-3-karboxylové kyseliny; 6-chlor-7-ethyl-2-trifluormethyl-2//-l-benzopyran-3-karboxylové kyseliny; 6-chlor-8-ethyl-2-trifluormethyl-2//-l-benzopyran-3-karboxylové kyseliny; 6-chlor-7-fenyl-2-trifluormethyl-2//-l-benzopyran-3-karboxylové kyseliny;

   ·· ··*·

   230 • · · · · • · · · · • · * · · · · • · · · ·

   6.7- dichlor-2-trifluormethyl-2//-l-benzopyran-3-karboxylové kyseliny;

   6.8- dichlor-2-trifluormethyl-2/M-benzopyran-3-karboxylové kyseliny; 2-trifluormethyl-3//-nafto[2,l-b]pyran-3-karboxylové kyseliny; 6-chlor-8-methyl-2-trifluormethyl-277-l-benzopyran-3-karboxylové kyseliny;

   8-chlor-6-methyl-2-trifluormethyl-2Z/-l-benzopyran-3-karboxylové kyseliny;

   8-chlor-6-methoxy-2-trifluormethyl-27/-l-benzopyran-3-karboxylové kyseliny; 6-brom-8-chlor-2-trifluormethyl-2//-l-benzopyran-3-karboxylové kyseliny; 8-brom-6-fluor-2-trifluormethyl-2//-1 -benzopyran-3-karboxylové kyseliny; 8-brom-6-methyl-2-trifluormethyl-2//-l-benzopyran-3-karboxylové kyseliny; 8-brom-5-fluor-2-trifluormethyl-2//-l-benzopyran-3-karboxylové kyseliny; 6-chlor-8-fluor-2-trifluormethyl-2//-l-benzopyran-3-karboxylové kyseliny; 6-brom-8-methoxy-2-trifluormethyl-2//-l-benzopyran-3-karboxylové kyseliny; 6-[[(fenylmethyl)amino]sulfonyl]-2-trifIuormethyl-2Z/-l-benzopyran-3karboxylové kyseliny;

   6-[(dimethylamino)sulfbnyl]-2-trifluormethyl-2//-l-benzopyran-3-karboxylové kyseliny;

   6-[(methylamino)sulfonyl]-2-trifluormethyl-2//-l-benzopyran-3-karboxylové kyseliny;

   6-[(4-morfblino)sulťbnyl]-2-trifluormethyl-2/M-benzopyran-3-karboxylové kyseliny;

   6-[(l,l-dimethylethyl)aminosulfonyl]-2-trifluormethyl-2//-l-benzopyran-3karboxylové kyseliny;

   6-[(2-methylpropyl)aminosulfonyl]-2-trifluormethyl-2//-l-benzopyran-3karboxylové kyseliny;

   6-methylsulfonyl-2-trifluormethyl-2//-l-benzopyran-3-karboxylové kyseliny; 8-chlor-6-[[(fenylmethyl)amino]sulfonyl]-2-trifluormethyl-2//-l-benzopyran-3karboxylové kyseliny;

   6-fenylacetyl-2-trifluormethyl-2//-l-benzopyran-3-karboxylové kyseliny;

   6.8- dibrom-2-trifluormethyl-2//-l-benzopyran-3-karboxylové kyseliny; 8-chlor-5,6-dimethyl-2-trifluormethyl-2//-l-benzopyran-3-karboxylové kyseliny;

   6.8- dichlor-(5)-2-trifluormethyl-2//-l-benzopyran-3-karboxylové kyseliny; 6-benzylsulfonyl-2-trifluormethyl-2//-l-benzopyran-3-karboxylové kyseliny;

   231 •φ φφφφ • v φφφφ φ · φφφ φ φ φ φ φφφ φ φφφ φ φ φφφφ φφ φφ φφ φ φ φφφ φ φφφφ φ φφφ φφφ φ φφφ φ φφ φ

   6-[[A-(2-furylmethyl)amino]sulfonyl]-2-trifluormethyl-27f-l-benzopyran-3karboxylové kyseliny;

   6-[[A-(2-fenylethyl)amino]sulfonyl]-2-trifluormethyl-2H-l-benzopyran-3karboxylové kyseliny;

   6- jod-2-trifluormethyl-2/f-l-benzopyran-3-karboxylové kyseliny;

   7- (l,l-dimethylethyl)-2-pentafluorethyl-2/f-l-benzopyran-3-karboxylové kyseliny;

   6-chlor-2-trifluormethyl-2/Z-l-benzothiopyran-3-karboxylové kyseliny;

   6-Nitro-2-trifluormethyl-2H-l-benzopyran-3-karboxylové kyseliny;

   6-Chlor-8-methyl-2-trifluormethyl-2/f-l-benzopyran-3-karboxylové kyseliny;

   ((5)-6-Chlor-7-( 1,1 -dimethylethyl)-2-(trifluormethyl-2/f-1 -benzopyran-3karboxylové kyseliny;

   ····

   232 • · · · ·· · « · · ··· · · · ···· ······ t ♦ · · ··· • · · ··· ··« ··*· ·· ·♦ · ·» *

   2-Trifluormethyl-277-nafto[2,3-b]pyran-3-karboxylové kyseliny;

   6-Chlor-7-(4-nitrofenoxy)-2-(trifluormethyl)-277-l-benzopyran-3-karboxylové kyseliny;

   ((5)-6,8-Dichlor-2-(trifluormethyl)-277-l-benzopyran-3-karboxylové kyseliny;

   6-Chlor-2-(trifhiormethyl)-4-fenyl-2/7-1 -benzopyran-3-karboxylové kyseliny;

   '0 • · ·· ······ · · · ···· · · · · · · ··· · · · ···· • · · · · · · · * · · · ·

   233

   6-(4-Hydroxybenzoyl)-2-(trifluormethyl)-2//-l-benzopyran-3-karboxylové kyseliny;

   2-(Trifluormethyl)-6-[(trifluormethyl)thio]-27/-l-benzothiopyran-3-karboxylové kyseliny;

   6,8-Dichlor-2-trifluormethyl-2//-l-benzothiopyran-3-karboxylové kyseliny;

   6-(1,1 -Dimethylethyl)-2-(trifluormethyl)-2/7-1 -benzothiopyran-3 -karboxylové kyseliny;

   6,7-Difluor-l,2-dihydro-2-(trifluormethyl)-3-chinolinkarboxylové kyseliny;

   • · · · ·· · • ·

   234

   6-Chlor-l,2-dihydro-l-methyl-2-(trifluormethyl)-3-chinolinkarboxylové kyseliny;

   6-Chlor-2-(trifluormethyl)-l,2-dihydro[l,8]naftyridin-3-karboxylové kyseliny;

   ((5')-6-Chlor-l,2-dihydro-2-(trifluormethyl)-3-cliinolinkarboxylové kyseliny;

   • · • · 9 · 9 ·
9. 9 • · · · · · • · · ·

   236 nebo jejich farmaceuticky přijatelná sůl; a kterákoliv jejich kombinace.

   8. Farmaceutická kompozice podle nároku 2, vyznačující se tím, že uvedený selektivní inhibitor cyklooxygenázy-2 je vybrán ze skupiny sestávající z

   4-[4-(methyl)-sulfonyl)fenyl]-3-fenyl-2(577)-furanonu, • · ··· · ·· φ • ΦΦΦ Μ · Φ φφ·

   ΦΦΦ ΦΦ · ΦΦΦΦ

   ΦΦ ΦΦΦ ΦΦ ΦΦ ΦΦΦΦ • ΦΦ ΦΦΦ ΦΦΦ

   ΦΦΦ··· Φ· Φ ·· ·

   237

   4-[(5-methyl-3-fenyl)-4-izoxazolyl]fenylsulfonamidu,

   2-(6-methylpyrid-3-yl)-3-(4-methylsulfonylfenyl)-5-chlorpyridinu,

   4-[5-(4-methylfenyl)-3-(trifluormethyl)-l//-pyrazol-l-yl]fenylsulfonamidu,

   4-[(2-methyl-4-cyklohexyl)-5-oxazolyl]fenylsulfonamidu,

   4-[5-(3-fluor-4-methoxyfenyl)-3-(difluormethyl)-l//-pyrazol-l-yl]benzensulfonamidu, (5)-6,8-dichlor-2-(trifluormethyl)-2H-l-benzopyran-3-karboxylové kyseliny nebo jejich farmaceuticky přijatelné soli.

   9. Farmaceutická kompozice podle nároku 2, vyznačující se tím, že uvedený selektivní inhibitor cyklooxygenázy-2 je sloučenina obecného vzorce:

   kde:

   X je O nebo S;

   substituent R^12b je nižší halogenalkyl;

   substituent R^3b je vybrán ze skupiny sestávající z hydridoskupiny a halogenu;

   substituent R^13b je vybrán ze skupiny sestávající z hydridoskupiny, halogenu, nižšího alkylu, nižší halogenalkoxyskupiny, nižší alkoxyskupiny, nižšího aralkylkarbonylu, nižšího dialkylaminosulfonylu, nižšího alkylaminosulfonylu, nižšího aralkylaminosulfonylu, nižšího heteroaralkylaminosulfonylu a 5-ti členného heterocyklosulfonylu obsahujícího dusík a 6-ti členného heterocyklosulfonylu obsahujícího dusík;

   substituent R^13b je vybrán ze skupiny sestávající z hydridoskupiny, nižšího alkylu, halogenu, nižší alkoxyskupiny a arylu; a

   9

   999 99 99 9999

   999 999 999

   999999 99 9 99 9

   238 substituent R^13b je vybrán ze skupiny sestávající z hydridoskupiny, halogenu, nižšího alkylu, nižší alkoxyskupiny a arylu; nebo její farmaceuticky přijatelná sůl.
10. 10. Farmaceutická kompozice podle nároku 2, vyznačující se tím, že:

    substituent R^12b je vybrán ze skupiny sestávající z trifluormethylu a pentafluorethylu;

    substituent R^13b je vybrán ze skupiny sestávající z hydridoskupiny, chloru a fluoru;

    substituent R^13b je vybrán ze skupiny sestávající z hydridoskupiny, chloru, bromu, fluoru, jodu, methoxyskupiny, izopropylaminosulfonylu, fenylethylaminosulfonylu, morfolinosulfonylu;

    ,13b methylu, íerc-butylu, benzylkarbonylu, methylaminosulfonylu, trifluormethoxyskupiny, dimethylaminosulfonylu, benzylaminosulfonylu, methylpropylaminosulfonylu, methyl sul fonylu a substituent R^1JD je vybrán ze skupiny sestávající z hydridoskupiny, methylu, ethylu, izopropylu, diethylaminoskupiny a fenylu; a terc-butylu, chloru, methoxyskupiny, substituent R^13b je vybrán ze skupiny sestávající z hydridoskupiny, chloru, bromu, fluoru, methylu, ethylu, terc-butylu, methoxyskupiny a fenylu.
11. 11. Farmaceutická kompozice podle nároku 1, vyznačující se tím, že inhibitor protein kinázy je sloučenina obecného vzorce (I), kde:

    substituent R¹ je vybrán ze skupiny sestávající z atomu vodíku, halogenu, alkylu, cykloalkylu, arylu, heteroarylu, heteroalicyklu, hydroxyskupiny, alkoxyskupiny, -C(O)R¹⁵, -NR¹³R¹⁴, -(CH₂)_rR¹⁶ a -C(O)NR⁸R⁹;

    substituent R² je vybrán ze skupiny sestávající z atomu vodíku, halogenu, alkylu, trihalogenmethylu, hydroxyskupiny, alkoxyskupiny, -NR¹³R¹⁴, -NR¹³C(O)R¹⁴, -C(O)R¹⁵ arylu, heteroarylu a -S(O)₂NR¹³R¹⁴;

    substituent R³ je vybrán ze skupiny sestávající z atomu vodíku, halogenu, alkylu, trihalogenmethylu, hydroxyskupiny, alkoxyskupiny, -(CO)R¹⁵, -NR¹³R¹⁴, arylu, heteroarylu, -NR¹³S(O)2R¹⁴, -S(O)2NR¹³R¹⁴, -NR¹³C(O)R¹⁴ a

    -NR¹³C(O)OR¹⁴;

    239 • · · ·· · « · · · • · · · · • · · · · ·« • · · · * ·· · substituent R⁴ je vybrán ze skupiny sestávající z atomu vodíku, halogenu, alkylu, hydroxyskupiny, alkoxyskupiny a -NR¹³R¹⁴;

    substituent R⁵ je vybrán ze skupiny sestávající z atomu vodíku, alkylu a -C(O)R¹⁰;

    substituent R⁶ je vybrán ze skupiny sestávající z atomu vodíku, alkylu a -C(O)R¹⁰;

    substituent R⁷ je vybrán ze skupiny sestávající z atomu vodíku, alkylu, arylu, 3-karboxypropylu, heteroarylu, -C(O)R¹⁷ a -C(O)R¹⁰;

    substituenty R⁶ a R⁷ mohou dohromady tvořit skupinu vybranou ze skupiny sestávající z -(CH₂)4-, -(CH₂)₅- a -(CH₂)₆;

    substituenty R⁸ a R⁹ jsou nezávisle vybrány ze skupiny sestávající z atomu vodíku, alkylu a arylu;

    substituent R¹⁰ je vybrán ze skupiny sestávající z hydroxyskupiny, alkoxyskupiny, aryloxyskupiny, -N(Rⁿ)(CH₂)_nR¹² a -NR^I3R¹⁴;

    substituent R¹¹ je vybrán ze skupiny sestávající z atomu vodíku a alkylu; substituent R¹² je vybrán ze skupiny sestávající z -NR¹³R¹⁴, hydroxyskupiny, -C(O)R¹⁵, arylu a heteroarylu;

    substituenty R¹³ a R¹⁴ jsou nezávisle vybrány ze skupiny sestávající z atomu vodíku, alkylu, cykloalkylu, arylu a heteroarylu;

    substituenty R¹³ a R¹⁴ mohou dohromady tvořit skupinu vybranou ze skupiny sestávající z -(CH₂)₄-, -(CH₂)₅-, -(CH₂)₂O(CH₂)₂- a

    -(CH₂)₂N(CH₃)(CH₂)₂-;

    substituent R¹⁵ je vybrán ze skupiny sestávající z atomu vodíku, hydroxyskupiny, alkoxyskupiny a aryloxyskupiny;

    substituent R¹⁶ je vybrán ze skupiny sestávající z hydroxyskupiny,

    -C(O)R¹⁵, -NR¹³R¹⁴ a -C(O)NR¹³R¹⁴;

    substituent R¹⁷ je vybrán ze skupiny sestávající z alkylu, cykloalkylu, arylu a heteroarylu; a n a r jsou nezávisle 1, 2, 3 nebo 4; nebo její farmaceuticky přijatelná sůl.
12. 12. Farmaceutická kompozice podle nároku 1, vyznačující se tím, že inhibitor protein kinázy je sloučenina obecného vzorce (I), kde:

    240 ·· · • · · » • ♦ · · · • ·· ····· • · · · ·· · substituent R⁶ je -COR¹⁰, kde substituent R¹⁰ je -NR¹¹(CH₂)_nR¹², kde: substituent R¹¹ je atom vodíku nebo nižší alkyl; n je 2 nebo 3; a substituent R¹² je -NR¹³R¹⁴, kde substituenty R¹³ a R¹⁴ jsou nezávisle nižší alkyl.
13. 13. Farmaceutická kompozice podle nároku 1, vyznačující se tím, že inhibitor protein kinázy je sloučenina obecného vzorce (I), kde:

    substituent R⁶ je -COR¹⁰, kde substituent R¹⁰ je -NR¹¹(CH₂)_nR¹², kde: substituent R¹¹ je atom vodíku nebo nižší alkyl; n je 2 nebo 3; a substituent R¹² je -NR¹³R¹⁴, kde substituenty R¹³ a R¹⁴ spojeny dohromady vytvářejí skupinu vybranou z -(CH2)4-, -(CH₂)s-, -(CH₂)₂-O-(CH₂)₂- nebo -(CH₂)₂N(CH₃)(CH₂)₂-.
14. 14. Farmaceutická kompozice podle nároku 1, vyznačující se tím, že inhibitor protein kinázy je sloučenina obecného vzorce (I), kde:

    substituent R⁶ je //-(2-diethyl-aminoethyl)-/V-methylaminokarbonyl, /V-(3-dimethylamino-propyl)-aminokarbonyl, 2V-(2-di ethyl amino ethyl) aminokarbonyl, 2V-(3-ethylaminopropyl)-aminokarbonyl, //-(3-diethylaminopropyl)aminokarbonyl, nebo N-(2-ethylamino-ethyl)aminokarbonyl.
15. 15. Farmaceutická kompozice podle nároku 1, vyznačující se tím, že inhibitor protein kinázy je sloučenina obecného vzorce (I), kde:

    substituent R⁶ je 3-pyrrolidin- 1-ylpropylaminokarbonyl,

    3-morfolin-4-ylpropylaminokarbonyl,

    2-pyrrolidin-1 -ylethylamino-karbonyl,

    2-morfolin-4-ylethylaminokarbonyl,

    2-(4-methylpiperazin-1 -yl)ethyl-aminokarbonyl,

    2- (3,5-dimethylpiperazin-l-yl)ethyl-aminokarbonyl,

    3- (4-methylpiperazin-1 -yl)propylamino-karbonyl nebo

    3-(3,5-dimethylpiperazin-1 -yl)propylamino-karbonyl.

    241 • · · · • · 9 • · · • · · • 9 9 9 9

    9 9 9 9 9

    9 99 99999 • 9 9 9 9

    99 9
16. 16. Farmaceutická kompozice podle nároku 1, vyznačující se tím, že inhibitor protein kinázy je sloučenina obecného vzorce (I), kde: substituent R⁶ je -COR¹⁰, kde substituent R¹⁰ je -NR¹³R¹⁴, kde substituent R¹³ je atom vodíku a substituent R¹⁴ je nižší alkyl substituovaný hydroxyskupinou, aryl, heteroalicykl, heteroaryl nebo karboxy skupina.
17. 17. Farmaceutická kompozice podle nároku 1, vyznačující se tím, že inhibitor protein kinázy je sloučenina obecného vzorce (I), kde: substituent R⁶ je 2-triazin-l-ylpropylaminokarbonyl,

    2- triazin-1 -ylethylaminokarbonyl,

    3- imidazol-l-ylpropylaminokarbonyl, pyridin-4-ylmethyl-aminokarbonyl,

    2-pyridin-2-ylethylaminokarbonyl nebo 2-imidazol-1 -yl ethylaminokarbonyl.
18. 18. Farmaceutická kompozice podle nároku 1, vyznačující se tím, že inhibitor protein kinázy je sloučenina obecného vzorce (I), kde:

    substituent R⁶ je -COR¹⁰, kde substituent R¹⁰ je -NRⁿ(CH₂)_nR¹², kde: substituent R¹¹ je atom vodíku nebo nižší alkyl; n je 2 nebo 3; a substituent R¹² je -NR¹³R¹⁴, kde substituenty R¹³ a R¹⁴ spojeny dohromady vytvářejí heterocykl.
19. 19. Farmaceutická kompozice podle nároku 1, vyznačující se tím, že inhibitor protein kinázy je sloučenina obecného vzorce (I), kde:

    substituent R⁶ je -COR¹⁰, kde substituent R¹⁰ je -NR^H(CH₂)_nR¹², kde: substituent R¹¹ je atom vodíku nebo nižší alkyl; n je 2 nebo 3; a substituent R¹² je -NR¹³R¹⁴, kde substituenty R¹³ a R¹⁴ spojeny dohromady vytvářejí a 5, 6 nebo 7 členný heterocykl obsahující karbonylovou skupinu a jeden nebo dva atomy dusíku v kruhu.

    242 • * ·« ·· · · · · ·· · ···· ·· · · t · ··· ·· · · · · · • « · · · * · · · · · · · · ······ ·· · ·· ·
20. 20. Farmaceutická kompozice podle nároku 1, vyznačující se tím, že inhibitor protein kinázy je sloučenina obecného vzorce (I), kde substituent R⁶ je 2-(3-oxopiperazin-l-yl)ethylaminokarbonyl,

    2-(imidazolidin-1 -yl-2-on)ethylaminokarbonyl,

    2-(tetrahydropyrimidin-1 -yl-2-on)ethylaminokarbonyl,

    2- (2-oxopyrrolidin-1 -yl)-ethylaminokarbonyl,

    3- (3-oxopiperazin-l-yl)propyl-aminokarbonyl,

    3-(imidazolidin-l-yl-2-on)propyl-aminokarbonyl,

    3-(tetrahydropyrimidin-l-yl-2-on)-propylaminokarbonyl nebo

    3-(2-oxopyrrolidin-1-yl)propyl-aminokarbonyl.
21. 21. Farmaceutická kompozice podle kteréhokoliv z nároků 11 až 20, vyznačující se tím, že inhibitor protein kinázy je sloučenina obecného vzorce (I), kde:

    substituent R⁵ je vybrán ze skupiny sestávající z atomu vodíku a nižšího alkylu; a substituent R⁷ je vybrán ze skupiny sestávající z atomu vodíku, alkylu, arylu, heteroarylu a -C(O)R¹⁷, kde substituent R¹⁷ je hydroxyskupina, nižší alkyl nebo aryl.
22. 22. Farmaceutická kompozice podle nároku 21, vyznačující se tím, že: substituent R¹ je atom vodíku, nižší alkyl, -C(O)NR⁸R⁹, cykloalkyl nebo aryl;

    substituent R² je atom vodíku, halogen, nižší alkoxyskupina, kyanoskupina, aryl, -SO2R²⁰ nebo -S(O)2NR¹³R¹⁴, kde substituent R¹³ je atom vodíku a substituent R¹⁴ je atom vodíku, aryl nebo alkyl;

    substituent R³ je vybrán ze skupiny sestávající z atomu vodíku, nižší alkoxyskupiny, -C(O)R¹⁵, -NR¹³C(O)R¹⁴, arylu a heteroarylu; a substituent R⁴ je atom vodíku.
23. 23. Farmaceutická kompozice podle nároku 22, vyznačující se tím, že:

    243 •4 4444 ·· 4

    4 4 4 4

    4 4 4 4 4

    4 4 4 4 4444

    4 4 4 4 substituent R¹ je atom vodíku nebo fenyl;

    substituent R² je atom vodíku, chlor, brom, fluor, methoxyskupina, ethoxyskupina, fenyl, dimethylaminosulfonyl, kyanoskupina, methylsulfonyl, ethylsulfonyl, benzylsulfonyl, 3-chlorfenyl-aminosulfonyl, karboxyskupina, methoxyskupina, aminosulfonyl, methylaminosulfonyl, fenylaminosulfonyl, pyridin-3-yl-aminosulfonyl, dimethylaminosulfonyl nebo izopropylaminosulfonyl;

    substituent R³ je atom vodíku, methoxyskupina, karboxyskupina, fenyl, pyridin-3-yl, 3,4-dichlorfenyl, 2-methoxy-5-izopropylfenyl, 4-n-butylfenyl, 3-izopropylfenyl; a substituent R⁴ je atom vodíku.
24. 24. Farmaceutická kompozice podle nároku 23, vyznačující se tím, že: substituent R¹ je atom vodíku;

    substituent R² je atom vodíku, kyanoskupina, fluor, chlor nebo brom;

    <3 substituent R je fenyl; a substituent R⁴ je atom vodíku.
25. 25. Farmaceutická kompozice podle nároku 1, vyznačující se tím, že: substituent R¹ je atom vodíku, nižší alkyl, -C(O)NR⁸R⁹, cykloalkyl nebo aryl;

    substituent R² je atom vodíku, halogen, nižší alkoxyskupina, kyanoskupina, aryl nebo -S(O)2NR¹³R¹⁴, kde substituent R¹³ je atom vodíku a substituent R¹⁴ je atom vodíku, aryl nebo alkyl;

    substituent R³ je vybrán ze skupiny sestávající z atomu vodíku, nižší alkoxyskupiny, -C(O)R¹⁵, -NR¹³C(O)R¹⁴, arylu a heteroarylu; a substituent R⁴ je atom vodíku.
26. 26. Farmaceutická kompozice podle nároku 1, vyznačující se tím, že: substituent R¹ je atom vodíku nebo methyl;

    substituent R² je atom vodíku, kyanoskupina, chlor, fluor nebo brom; substituent R³ je vybrán ze skupiny sestávající z atomu vodíku nebo fenylu;

    a substituent R⁴ je atom vodíku.

    244

    ΦΦ φ® φ · · · · • · φ φ φ φ φ φ φ φ φ φ φ φ φ φ φφφφ φφ φφ φφ φφφφ φφ φ φ φ φ φ φ φφφφ φ φφ φ φφφφ φ φ φ φ
27. 27. Farmaceutická kompozice podle nároku 1, vyznačující se tím, že: substituent R⁶ je -COR¹⁰, kde substituent R¹⁰ je -NR¹³R¹⁴, kde substituent R¹³ je atom vodíku a substituent R¹⁴ je nižší alkyl substituovaný hydroxyskupinou, nižší alkyl substituovaný hydroxyalkylaminoskupinou, karboxyskupina nebo -NR¹⁸R¹⁹, kde substituenty R¹⁸ a R¹⁹ jsou nezávisle atom vodíku nebo nižší alkyl.
28. 28. Farmaceutická kompozice podle nároku 1, vyznačující se tím, že substituent R⁶ je [2-(diethylamino)-2-hydroxy]ethylaminokarbonyl, 2-(A-ethyl-A-2-hydroxyethylamino)-ethylaminokarbonyl, karboxymethylaminokarbonyl nebo

    2-hydroxyethyl-aminokarbonyl.
29. 29. Farmaceutická kompozice podle nároku 1, vyznačující se tím, že substituent R⁶ je -COR¹⁰, kde substituent R¹⁰ je -NR^H(CH2)_nR¹², kde substituent R¹² je -N⁺(O')NR¹³R¹⁴ nebo -N(OH)R¹³, kde substituenty R¹³ a R¹⁴ jsou nezávisle vybrány ze skupiny sestávající z nižšího alkylu.
30. 30. Farmaceutická kompozice podle nároku 1, vyznačující se tím, že substituent R⁶ je 2-(/V-hydroxy-7V-ethylamino)ethylaminokarbonyl nebo 2-[N⁺(O')(C2Hs)2]ethyl-aminokarbonyl.
31. 31. Farmaceutická kompozice podle nároku 29 nebo 30, vyznačující se tím, že: substituent R⁵ je vybrán ze skupiny sestávající z atomu vodíku nebo methylu; a substituent R⁷ je vybrán ze skupiny sestávající z methylu, atomu vodíku nebo fenylu.
32. 32. Farmaceutická kompozice podle nároku 1, vyznačující se tím, že: substituent R¹ je atom vodíku;

    substituent R² je atom vodíku, kyanoskupina, chlor, fluor nebo brom;

    substituent R³ je atom vodíku; a ··

    9999

    245 ···· ··

    9 9

    9 9 9 9 • 9 9 9 9 9

    9 9 9 9 999

    9 9 9 9

    9 9 9 substituent R⁴ je atom vodíku.
33. 33. Farmaceutická kompozice podle nároku 1, vyznačující se tím, že inhibitor kinázy je vybrán ze skupiny sestávající z:

    nebo jeho L-malátová sůl.
34. 34. Farmaceutická kompozice podle nároku 1, vyznačující se tím, že inhibitor protein kinázy je sloučenina vzorce:

    ·* »··· • · 9 · · · • ♦ 9 9 9 9 9

    99 99 9 9999

    9 9 9 9 9

    9 99 9
35. 35. Farmaceutická kompozice podle nároku 1, vyznačující se tím, že inhibitor protein kinázy je sloučenina vzorce:

    nebo jejich farmaceuticky přijatelné soli.

    ·« ·· ···

    247 • · · • · ·· ··

    9 • · ·

    9 9 9

    9 999

    9 9

    9
36. 36. Farmaceutická kompozice podle nároku 34, vyznačující se tím, že selektivní inhibitor cyklooxygenázy-2 je vybrán ze sloučenin vzorce:

    nebo jejich farmaceuticky přijatelné soli.
37. 37. Použití inhibitoru protein kinázy obecného vzorce (I):

    (O kde: substituent R je vybrán ze skupiny sestávající z atomu vodíku, piperazin-1 -ylmethylu, 4-methylpiperazin-1 -ylmethylu, piperidin-1 -ylmethylu, 2-hydroxy-methylpyrrolidin-1 -ylmethylu, 2-karboxypyrrolidin-1 -ylmethylu a pyrrolidin-1 -ylmethylu;

    substituent R¹ je vybrán ze skupiny sestávající z atomu vodíku, halogenu, alkylu, substituovaného alkylu, cykloalkylu, substituovaného cykloalkylu, arylu, n Q heteroarylu, heteroalicyklu, hydroxyskupiny, alkoxyskupiny, -C(O)NR R , * · • · · · · 9 · 9 ·

    9 9 9· 9 9999

    999 99 99 9 999

    999 999 999

    9999 99 99 9 99 9

    248

    -NR¹³R¹⁴, -(CO)R¹⁵ a -(CH₂)_rR¹⁶;

    substituent R² je vybrán ze skupiny sestávající z atomu vodíku, halogenu, alkylu, substituovaného alkylu, trihalogenmethylu, hydroxyskupiny, alkoxyskupiny, kyanoskupiny, -NR¹³R¹⁴, -NR¹³C(O)R¹⁴, -C(O)R¹⁵, arylu, heteroarylu a -S(O)₂NR¹³R¹⁴;

    substituent R³ je vybrán ze skupiny sestávající z atomu vodíku, halogenu, alkylu, substituovaného alkylu, trihalogenmethylu, hydroxyskupiny, alkoxyskupiny, arylu, heteroarylu, -NR^l3R¹⁴, -NR¹³S(O)2R¹⁴, -S(O)2NR¹³R¹⁴, -NR¹³C(O)R¹⁴, -NR¹³C(O)OR¹⁴, -(CO)R¹⁵ a -SO₂R¹⁹;

    substituent R⁴ je vybrán ze skupiny sestávající z atomu vodíku, halogenu, alkylu, substituovaného alkylu, hydroxyskupiny, alkoxyskupiny a -NR¹³R¹⁴;

    substituent R⁵ je vybrán ze skupiny sestávající z atomu vodíku, alkylu, substituovaného alkylu a -C(O)R¹⁰;

    substituent R⁶ je vybrán ze skupiny sestávající z atomu vodíku, alkylu, substituovaného alkylu a -C(O)R¹⁰;

    substituent R⁷ je vybrán ze skupiny sestávající z atomu vodíku, alkylu, substituovaného alkylu, arylu, heteroarylu, -C(O)R¹⁷ a -C(O)R¹⁰ za předpokladu, že pokud substituent R je atom vodíku, pak alespoň jeden ze substituentů R⁵, R⁶ a R⁷ je -C(O)R¹⁰; nebo substituent R⁶ a substituent R⁷ mohou dohromady tvořit skupinu vybranou ze skupiny sestávající z -(CH₂)4-, -(CH₂)₅-a -(CH₂)6-;

    substituent R⁸ a substituent R⁹ jsou nezávisle vybrány ze skupiny sestávající z atomu vodíku, alkylu, substituovaného alkylu a arylu;

    substituent R¹⁰ je vybrán ze skupiny sestávající z hydroxyskupiny, alkoxyskupiny, aryloxyskupiny, -N(Rⁿ)(alkylen)„R¹², kde alkylenová skupina je případně substituovaná hydroxyskupinou a -NR¹³R¹⁴;

    substituent R¹¹ je vybrán ze skupiny sestávající z atomu vodíku, alkylu a substituovaného alkylu;

    substituent R¹² je vybrán ze skupiny sestávající z -NR¹³R¹⁴, hydroxyskupiny, -C(O)R¹⁵, arylu, heteroarylu, -N⁺(O')R¹³R¹⁴, -N(OH)R¹³ a -NHC(O)R¹⁸, kde substituent R¹⁸ je alkyl, substituovaný alkyl, halogenalkyl nebo aralkyl;

    • » ··« · • · · « · · • « · « · · · • * · · · · ···· ·· ·· ·

    249 substituent R¹³ a substituent R¹⁴ jsou nezávisle vybrány ze skupiny sestávající z atomu vodíku, alkylu, substituovaného alkylu, nižšího alkylu substituovaného hydroxyalkylaminoskupinou, kyanoalkylu, cykloalkylu, substituovaného cykloalkylu, arylu a heteroarylu; nebo substituenty R¹³ a R¹⁴ mohou dohromady tvořit heterocykloskupinu; substituent R¹⁵ je vybrán ze skupiny sestávající z atomu vodíku, hydroxyskupiny, alkoxyskupiny a aryloxyskupiny;

    substituent R¹⁶ je vybrán ze skupiny sestávající z hydroxyskupiny,

    -NR¹³R¹⁴, -C(O)R¹⁵ a -C(O)NR¹³R¹⁴;

    7 substituent R je vybrán ze skupiny sestávající z alkylu, substituovaného alkylu, cykloalkylu, arylu a heteroarylu;

    substituent R¹⁹ je vybrán ze skupiny sestávající z alkylu, substituovaného alkylu, arylu, aralkylu, heteoarylu nebo heteroaralkylu; a n a r jsou nezávisle 1, 2, 3 nebo 4; nebo jeho farmaceuticky přijatelné soli;

    v kombinaci s inhibitorem cyklooxygenázy, nebo jeho farmaceuticky přijatelnou solí; pro přípravu léčiva pro léčení nebo prevenci rakovin, přičemž uvedené léčivo je případně přítomno v oddělených dávkových formách pro současné nebo následné podání.
38. 38. Použití podle nároku 37, kde inhibitor cyklooxygenázy je selektivní inhibitor cyklooxygenázy-2, který je vybrán ze skupiny sestávající z:

    (i) sloučeniny obecného vzorce (II):

    kde:

    250 ·· ·· ·* • · * · · · • · · · t • · · · · ♦ • · · · · ··«· ·· ·· ·»·· ·· · • · · · • · · · · • · · · ·»· • · · · • ·· ·

    G je vybráno ze skupiny sestávající z O, S a -NR^a-, kde substituent R^a je atom vodíku nebo alkyl;

    substituent R^10a je vybrán ze skupiny sestávající z atomu vodíku a arylu; substituent R^lla je vybrán ze skupiny sestávající z karboxylu, alkylu, aralkylu, aminokarbonylu, alkylsulfonylaminokarbonylu a alkoxykarbonylu;

    substituent R^12a je vybrán ze skupiny sestávající z halogenalkylu, alkylu, aralkylu, cykloalkylu a arylu případně substituovaného jedním nebo více radikály vybranými z alkylthioskupiny, nitroskupiny a alkylsulfonylu; a substituent R^13a je jeden nebo více radikálů nezávisle vybraných ze skupiny sestávající z atomu vodíku, halogenu, alkylu, aryloxyskupiny, heteroaralkyloxyskupiny, alkylaminoskupiny, heteroarylaminoskupiny, aralkylu, alkoxyskupiny, aralkyloxyskupiny, halogenalkoxyskupiny, aralkyl aminoskupiny, heteroaryloxyskupiny, halogenalkylu, arylaminoskupiny, heteroarylalkylaminoskupiny, nitroskupiny, aminoskupiny, aminosulfonylu, alkylaminosulfonylu, arylaminosulfonylu, heteroarylaminosulfonylu, aralkylaminosulfonylu, heteroaralkylaminosulfonylu, heterocyklosulfonylu, alkylsulfonylu, hydroxyarylkarbonylu, nitroarylu, případně substituovaného arylu, případně substituovaného heteroarylu, aralkylkarbonylu, heteroarylkarbonylu, arylkarbonylu, aminokarbonylu a alkylkarbonylu;

    nebo substituent R^13a společně s kruhem E vytváří naftylový kruh; nebo (ii) sloučeniny obecného vzorce (III):

    (ΙΠ) kde:

    A je vybráno ze skupiny sestávající z částečně nenasyceného nebo nenasyceného heterocyklylu a částečně nenasycených nebo nenasycených karbocyklických kruhů;

    substituent R^lb je vybrán ze skupiny sestávající z heterocyklylu, cykloalkylu, cykloalkenylu a arylu, kde substituent R^lb je případně substituovaný

    251 «· ·· • · · · · • * · · • · · · · • · · · ···· ·* «··· • · • · • · · • · ·« · • · · • · · · • · *«· r · · ·· · do substituovatelné polohy jedním nebo více radikály nezávisle vybranými z alkylu, halogenalkylu, kyanoskupiny, karboxylu, alkoxykarbonylu, hydroxylu, hydroxyalkylu, halogenalkoxyskupiny, aminoskupiny, alkylaminoskupiny, arylaminoskupiny, nitroskupiny, alkoxyalkylu, alkylsulfinylu, halogenu, alkoxyskupiny a alkylthioskupiny;

    substituent R^2b je vybrán ze skupiny sestávající z methylu a aminoskupiny; a substituent R^3b je vybrán ze skupiny sestávající z radikálu vybraného z atomu vodíku, halogenu, alkylu, alkenylu, alkynylu, oxoskupiny, kyanoskupiny, karboxylu, kyanoalkylu, heterocyklyloxyskupiny, alkyloxyskupiny, alkylthioskupiny, alkylkarbonylu, cykloalkylu, arylu, halogenalkylu, heterocyklylu, cykloalkenylu, aralkylu, heterocyklylalkylu, acylu, alkylthioalkylu, hydroxyalkylu, alkoxykarbonylu, arylkarbonylu, aralkylkarbonylu, aralkenylu, alkoxyalkylu, arylthioalkylu, aryloxyalkylu, aralkylthioalkylu, aralkoxyalkylu, alkoxyaralkoxyalkylu, alkoxykarbonylalkylu, aminokarbonylu, aminokarbonylalkylu, alkylaminokarbonylu, TV-arylaminokarbonylu,

    N-alkyl-N-arylaminokarbonylu, alkylaminokarbonylalkylu, karboxyalkylu, alkylaminoskupiny, TV-arylaminoskupiny, ÝV-aralkylaminoskupiny, TV-alkyl-TVaralkylaminoskupiny, N-alkyl-N-arylaminoskupiny, aminoalkylu, alkylaminoalkylu, /V-arylaminoalkylu, 2V-aralkylaminoalkylu, TV-alkyl-//aralkylaminoalkylu, /V-alkyl-/V-arylaminoalkylu, aryloxyskupiny, aralkoxyskupiny, arylthioskupiny, aralkylthioskupiny, alkylsulfinylu, alkylsulfonylu, aminosulfonylu, alkylaminosulfonylu, TV-arylaminosulfonylu, arylsulfonylu a Nalkyl-7V-arylaminosulfonylu;

    nebo jeho farmaceuticky přijatelné soli.
39. 39. Použití podle nároku 38, kde selektivní inhibitor cyklooxygenázy-2 je sloučenina obecného vzorce II, kde:

    G je vybráno ze skupiny sestávající z kyslíku a síry;

    substituent R^lla je vybrán ze skupiny sestávající z karboxylu, nižšího alkylu, nižšího aralkylu a nižšího alkoxykarbonylu;

    substituent R^12a je vybrán ze skupiny sestávající z nižšího halogenalkylu, nižšího cykloalkylu a fenylu; a • · · · • · • 4 • 444 · · 4 4 4 4

    4 4 ·· · ···· ·· · 4 4 · · 44 4 4 4 4

    4 4 · 4 4 444

    444444 44 4 44 4

    252 substituent R^13a je jeden nebo více radikálů vybraných ze skupiny sestávající z H, halogenu, nižšího alkylu, nižší alkoxyskupiny, nižšího halogenalkylu, nižší halogenalkoxyskupiny, nižší alkylaminoskupiny, nitroskupiny, aminoskupiny, aminosulfonylu, nižšího alkylaminosulfonylu, 5-ti členného heteroarylalkylaminosulfonylu, 6-ti členného heteroarylalkylaminosulfonylu, nižšího aralkylaminosulfonylu, 5-ti členného heterocyklosulfonylu obsahujícího dusík, 6-ti členného heterocyklosulfonylu obsahujícího dusík, nižšího alkylsulfonylu, případně substituovaného fenylu, nižšího aralkylkarbonylu a nižšího alkylkarbonylu; nebo substituent R^13a společně s kruhem E vytváří naftylový radikál.
40. 40. Použití podle nároku 39, kde substituent R^lla je karboxyl; substituent R^12a je nižší halogenalkyl; a substituent R^13a je jeden nebo více radikálů vybraných ze skupiny sestávající z H, halogenu, nižšího alkylu, nižšího halogenalkylu, nižší halogenalkoxyskupiny, nižší alkylaminoskupiny, aminoskupiny, aminosulfonylu, nižšího alkylaminosulfonylu, 5-ti členného heteroarylalkylaminosulfonylu, 6-ti členného heteroarylalkylaminosulfonylu, nižšího aralkylaminosulfonylu, nižšího alkylsulfonylu, 6-ti členného heterocyklosulfonylu obsahujícího dusík, případně substituovaného fenylu, nižšího aralkylkarbonylu a nižšího alkylkarbonylu; nebo substituent R^13a společně s kruhem E vytváří naftylový radikál.
41. 41. Použití podle nároku 40, kde substituent R^12a je vybrán ze skupiny sestávající z fluormethylu, chlormethylu, dichlormethylu, trichlormethylu, pentafluorethylu, heptafluorpropylu, difluorethylu, difluorpropylu, dichlorethylu, dichlorpropylu, difluormethylu a trifluormethylu; a substituent R^13a je jeden nebo více radikálů vybraných ze skupiny sestávající z hydridoskupiny, chloru, fluoru, bromu, jodu, methylu, ethylu, izopropylu, řerc-butylu, butylu, izobutylu, pentylu, hexylu, methoxyskupiny, ethoxyskupiny, izopropyloxyskupiny, terc-butyloxyskupiny, trifluormethylu, difluormethylu, trifluormethoxyskupiny, aminoskupiny, 7V,/V-dimethylamino• · · · • · · · · · ···· • · ··· · 9 99 9 9 9 9

    9 9 9 9 9 9 9 9

    999999 99 9 99 ·

    253 skupiny, N,2V-diethylaminoskupiny, 77-fenylmethylaminosulfonylu, 7V-fenylethylaminosulfonylu, 77-(2-furylmethyl)aminosulfonylu, nitroskupiny, 7V,2V-dimethylaminosulfonylu, aminosulfonylu, A-methylamino sulfonylu, TV-ethylsulfonylu,

    2.2- dimethylethylaminosulfonylu, 77,77-dimethylaminosulfonylu, 2V-(2-methylpropyl)aminosulfonylu, TV-morfolinosulfonylu, methylsulfonylu, benzylkarbonylu,

    2.2- dimethylpropylkarbonylu, fenylacetylu a fenylu; nebo substituent R^13a společně s kruhem E vytváří naftylový radikál.
42. 42. Použití podle nároku 41, kde substituent R^12a je vybrán ze skupiny sestávající z trifluormethylu a pentafluorethylu; a substituent R^13a je jeden nebo více radikálů vybraných ze skupiny sestávající z hydridoskupiny, chloru, fluoru, bromu, jodu, methylu, ethylu, izopropylu, íerc-butylu, methoxyskupiny, trifluormethylu, trifluormethoxyskupiny, 77-fenylmethylaminosulfonylu, jV-fenylethylaminosulfonylu, N-(2-furylmethyl)aminosulfonylu, 77,/7-dimethylaminosulfonylu, 77-methylaminosulfonylu, 2V-(2,2-dimethylethyl)aminosulfonylu, dimethylaminosulfonylu, 2-methylpropylaminosulfonylu, TV-morfolinosulfonylu, methylsulfonylu, benzylkarbonylu a fenylu; nebo kde substituent R^13a společně s kruhem E vytváří naftylový radikál.
43. 43. Použití podle nároku 38, kde selektivní inhibitor cyklooxygenázy-2 je vybrán ze skupiny sestávající z:

    6-chlor-2-trifluormethyl-277-l-benzopyran-3-karboxylové kyseliny;

    6-chlor-7-methyl-2-trifluormethyl-277-l-benzopyran-3-karboxylové kyseliny; 8-(l-methylethyl)-2-trifluormethyl-277-l-benzopyran-3-karboxylové kyseliny;

    6-chlor-7-( 1,1 -dimethylethyl)-2-trifluormethyl-277-1 -benzopyran-3 -karboxylové kyseliny;

    6- chlor-8-(l-methylethyl)-2-trifluormethyl-277-l-benzopyran-3-karboxylové kyseliny;

    2-trifluormethyl-3//-naftopyran-3-karboxylové kyseliny;

    7- (1,1 -dimethylethyl)-2-trifluormethyl-277-1 -benzopyran-3-karboxylové kyseliny; 6-brom-2-trifluormethyl-277-l-benzopyran-3-karboxylové kyseliny;

    • ·

    9

    9 9 9

    254

    9 9 9 9

    9 9 9

    9999 99 99

    9» ·

    8-chlor-2-trifluormethyl-2/7-l-benzopyran-3-karboxylové kyseliny;

    6- trifluormethoxy-2-trifluormethyl-277-1 -benzopyran-3 -karboxylové kyseliny;

    5.7- dichlor-2-trifluormethyl-2H-l-benzopyran-3-karboxylové kyseliny; 8-fenyl-2-trifluormethyl-2//-l -benzopyran-3-karboxylové kyseliny;

    7.8- dimethyl-2-trifluormethyl-2//-l-benzopyran-3-karboxylové kyseliny;

    6.8- bis(dimethylethyl)-2-trifluormethyl-2//-l-benzopyran-3-karboxylové kyseliny;

    7- (l-methylethyl)-2-trifluormethyl-2//-l-benzopyran-3-karboxylové kyseliny;

    7- fenyl-2-trifluormethyl-2//-l-benzopyran-3-karboxylové kyseliny;

    6-chlor-7-ethyl-2-trifluormethyl-2//-l-benzopyran-3-karboxylové kyseliny; 6-chlor-8-ethyl-2-trifluormethyl-2//-1 -benzopyran-3-karboxylové kyseliny; 6-chlor-7-fenyl-2-trifluormethyl-2//-l-benzopyran-3-karboxylové kyseliny;

    6.7- dichlor-2-trifluormethyl-27/-l-benzopyran-3-karboxylové kyseliny;

    6.8- dichlor-2-trifluormethyl-2//-l-benzopyran-3-karboxylové kyseliny; 2-trifluormethyl-3//-nafto[2,l-b]pyran-3-karboxylové kyseliny; 6-chlor-8-methyl-2-trifluormethyl-2J/-l -benzopyran-3-karboxylové kyseliny;

    8- chlor-6-methyl-2-trifluormethyl-2//-l-benzopyran-3-karboxylové kyseliny;

    8-chlor-6-methoxy-2-trifluormethyl-2//-l-benzopyran-3-karboxylové kyseliny; 6-brom-8-chlor-2-trifluormethyl-277-l-benzopyran-3-karboxylové kyseliny; 8-brom-6-fluor-2-trifluormethyl-2/7-1 -benzopyran-3-karboxylové kyseliny; 8-brom-6-methyl-2-trifluormethyl-2//-l-benzopyran-3-karboxylové kyseliny; 8-brom-5-fluor-2-trifluormethyl-2/ř-l-benzopyran-3-karboxylové kyseliny; 6-chlor-8-fluor-2-trifluormethyl-2//-l-benzopyran-3-karboxylové kyseliny; 6-brom-8-methoxy-2-trifluormethyl-2//-l -benzopyran-3-karboxylové kyseliny; 6-[[(fenylmethyl)amino]sulfbnyl]-2-trifluormethyl-2.ř/-l-benzopyran-3karboxylové kyseliny;

    6-[(dimethylamino)sulfonyl]-2-trifluormethyl-2//-l-benzopyran-3-karboxylové kyseliny;

    6-[(methylamino)sulfonyl]-2-trifluormethyl-2//-l-benzopyran-3-karboxylové kyseliny;

    6-[(4-morfolino)sulfonyl]-2-trifluormethyl-2//-l-benzopyran-3-karboxylové kyseliny;

    6-[( 1,1 -dimethylethyl)aminosulfonyl]-2-trifluormethyl-2H-1 -benzopyran-3karboxylové kyseliny;

    • · · · ·· · · · · ·· · » · · · · · · · · · ··· · · · · · · · • · · · * · · » · · · · · • · ♦ * · · · · · ···· ·* ·· * ·» · 255

    6-[(2-methylpropyl)aminosulfonyl]-2-trifluormethyl-27/-l-benzopyran-3karboxylové kyseliny;

    6-methylsulfonyl-2-trifluormethyl-2//-l-benzopyran-3-karboxylové kyseliny; 8-chlor-6-[[(fenylmethyl)amino]sulfonyl]-2-trifluormethyl-2//-l-benzopyran-3karboxylové kyseliny;

    6-fenylacetyl-2-trifluormethyl-2//-l-benzopyran-3-karboxylové kyseliny;

    6.8- dibrom-2-trifluormethyl-2Z/-l-benzopyran-3-karboxylové kyseliny;

    8-chlor-5,6-dimethyl-2-trifluormethyl-27/-l-benzopyran-3-karboxylové kyseliny;

    6.8- dichlor-(5)-2-trifluormethyl-27/-l-benzopyran-3-karboxylové kyseliny; 6-benzylsulfonyl-2-trifluormethyl-2//-l-benzopyran-3-karboxylové kyseliny; 6-[[2V-(2-furylmethyl)amino]sulfonyl]-2-trifluormethyl-2//-l-benzopyran-3 karboxylové kyseliny;

    6-[[7/-(2-fenylethyl)amino]sulfonyl]-2-trifluormethyl-2//-l-benzopyran-3 karboxylové kyseliny;

    6- jod-2-trifluormethyl-2//-l-benzopyran-3-karboxylové kyseliny;

    7- (1,1 -dimethylethyl)-2-pentafluorethyl-2//-1 -benzopyran-3 -karboxylové kyseliny;

    6-chlor-2-trifluormethyl-2//-l-benzothiopyran-3-karboxylové kyseliny;

    6-Chlor-8-methyl-2-trifluormethyl-2//-l-benzopyran-3-karboxylové kyseliny;

    ·· · · ·· ···· • · ·

    256 • · · · * · • · · · · * β • · * · · * «·· · ·· · • · · · • · · · · • · » ®· · ((S^,)-6-Chlor-7-(l,l-dimethylethyl)-2-(trifluormethyl-27/-l-benzopyran-3karboxylové kyseliny;

    2-Trifluormethyl-2//-nafto[2,3-b]pyran-3-karboxylové kyseliny;

    6-Chlor-7-(4-nitrofenoxy)-2-(trifluormethyl)-2//-l-benzopyran-3-karboxylové kyseliny;

    ((5)-6,8-Dichlor-2-(trifluormethyl)-27/-l-benzopyran-3-karboxylové kyseliny;

    • · • ·

    6-(4-Hydroxybenzoyl)-2-(trifluormethyl)-2//-l-benzopyran-3-karboxylové kyseliny;

    2-(Trifluormethyl)-6-[(trifluormethyl)thio]-2//-l-benzothiopyran-3-karboxylové kyseliny;

    6,8-Dichlor-2-trifluormethyl-2/Z-l-benzothiopyran-3-karboxylové kyseliny;

    ΌΗ

    258 ·· «· · » · · * · ·· · 9··· · · * · · * ··· «« ♦ ···· ·· ·«· « · · · · ·· · • · · · · · · · · • · · · «Λ · · * · * ·

    6-( l,l-Dimethylethy])-2-(trifluormethyl)-2//-l-benzothiopyran-3 -karboxylové kyseliny;

    6,7-Difluor-l,2-dihydro-2-(trifluormethyl)-3-chinolinkarboxylové kyseliny;

    6-Chlor-l,2-dihydro-l-methyl-2-(trifluormethyl)-3-chinolinkarboxylové kyseliny;

    6-Chlor-2-(trifluormethyl)-l,2-dihydro[l,8]naftyridin-3-karboxylové kyseliny;

    ((5)-6-Chlor-l,2-dihydro-2-(trifluormethyl)-3-chinolinkarboxylové kyseliny;

    • · • · nebo jejich farmaceuticky přijatelná sůl; a kterákoliv jejich kombinace.
44. 44. Použití podle nároku 38, kde uvedený selektivní inhibitor cyklooxygenázy-2 je vybrán ze skupiny sestávající z:

    • · · « · * · · · ···♦ ·· · · · · • · · · · · β · · » ♦ · · · · · · « · · · · *«·>·· ·» * ··

    261

    4-[4-(methyl)-sulfonyl)fenyl]-3-fenyl-2(577)-furanonu,

    4-[(5-methyl-3-fenyl)-4-izoxazolyl]fenylsulfonamidu,

    2-(6-methylpyrid-3-yl)-3-(4-methylsulfonylfenyl)-5-chlorpyridinu,

    4-[5-(4-methylfenyl)-3-(trifluormethyl)-17f-pyrazol-l-yl]fenylsulfonamidu,

    4-[(2-methyl-4-cyklohexyl)-5-oxazolyl]fenylsulfonamidu,

    4-[5-(3-fluor-4-methoxyfenyl)-3-(difhiormethyl)-l/ř-pyrazol-l-yl]benzensulfonamidu, (5)-6,8-dichlor-2-(trifluormethyl)-2H-l-benzopyran-3-karboxylové kyseliny nebo jejich farmaceuticky přijatelná sůl.
45. 45. Použití podle nároku 38, kde selektivní inhibitor cyklooxygenázy-2 je sloučenina obecného vzorce:

    CO₂H _R12b kde:

    X je O nebo S;

    substituent R^12b je nižší halogenalkyl;

    substituent R je vybrán ze skupiny sestávající z hydridoskupiny a halogenu;

    ··99 ·»

    262 • 9 9

    99 • · · ♦ • « ·999

    9 9

    9 substituent R^13b' je vybrán ze skupiny sestávající z hydridoskupiny, halogenu, nižšího alkylu, nižší halogenalkoxyskupiny, nižší alkoxyskupiny, nižšího aralkylkarbonylu, nižšího dialkylaminosulfonylu, nižšího alkylaminosulfonylu, nižšího aralkylaminosulfonylu, nižšího heteroaralkylaminosulfonylu a 5-ti členného heterocyklosulfonylu obsahujícího dusík a 6-ti členného heterocyklosulfonylu obsahujícího dusík;

    substituent R^13b je vybrán ze skupiny sestávající z hydridoskupiny, nižšího alkylu, halogenu, nižší alkoxyskupiny a arylu; a substituent R^13b je vybrán ze skupiny sestávající z hydridoskupiny, halogenu, nižšího alkylu, nižší alkoxyskupiny a arylu; nebo její farmaceuticky přijatelná sůl.
46. 46. Použití podle nároku 38, kde substituent R^12b je vybrán ze skupiny sestávající z trifluormethylu a pentafluorethylu;

    substituent R^13b je vybrán ze skupiny sestávající z hydridoskupiny, chloru a methoxyskupiny, izopropylaminosulfonylu, dimethylaminosulfonylu, benzylaminosulfonylu, a fluoru;

    substituent R^13b je vybrán ze skupiny sestávající z hydridoskupiny, chloru, bromu, fluoru, jodu, methylu, íerc-butylu, trifluormethoxyskupiny, benzylkarbonylu, methylaminosulfonylu, fenylethylaminosulfonylu, methylpropylaminosulfonylu, methylsulfonylu morfolinosulfonylu;

    substituent R^13b je vybrán ze skupiny sestávající z hydridoskupiny, methylu, ethylu, izopropylu, řerc-butylu, chloru, methoxyskupiny, diethylaminoskupiny a fenylu; a substituent R^13b je vybrán ze skupiny sestávající z hydridoskupiny, chloru, bromu, fluoru, methylu, ethylu, terc-butylu, methoxyskupiny a fenylu.
47. 47. Použití podle nároku 37, kde inhibitor proteinkinázy je sloučenina obecného vzorce (I), kde

    263

    ΦΦ ·· · • · · φ • φ φ · φ • · φ Φ··

    ΦΦΦΦ substituent R¹ je vybrán ze skupiny sestávající z atomu vodíku, halogenu, alkylu, cykloalkylu, arylu, heteroarylu, heteroalicyklu, hydroxyskupiny, alkoxyskupiny, -NR¹³R¹⁴, -(CO)R¹⁵ a -(CH₂)_rR¹⁶; a -C(O)NR⁸R⁹;

    substituent R² je vybrán ze skupiny sestávající z atomu vodíku, halogenu, alkylu, trihalogenmethylu, hydroxyskupiny, alkoxyskupiny, -NR¹³R¹⁴, -NR¹³C(O)R¹⁴, -C(O)R¹⁵, arylu, heteroarylu a -S(O)₂NR^I3R¹⁴;

    substituent R je vybrán ze skupiny sestávající z atomu vodíku, halogenu, alkylu, trihalogenmethylu, hydroxyskupiny, alkoxyskupiny, -(CO)R¹⁵, -NR¹³R¹⁴, arylu, heteroarylu, -NR¹³S(O)2R¹⁴, -S(O)2NR¹³R¹⁴, -NR¹³C(O)R¹⁴, a

    -NR¹³C(O)OR¹⁴;

    substituent R⁴ je vybrán ze skupiny sestávající z atomu vodíku, halogenu, alkylu, hydroxyskupiny, alkoxyskupiny a -NR¹³R¹⁴;

    substituent R⁵ je vybrán ze skupiny sestávající z atomu vodíku, alkylu, a -C(O)R¹⁰;

    substituent R⁶ je vybrán ze skupiny sestávající z atomu vodíku, alkylu, a -C(O)R¹⁰;

    substituent R⁷ je vybrán ze skupiny sestávající z atomu vodíku, alkylu, arylu, 3-karboxypropylu, heteroarylu, -C(O)R¹⁷ a -C(O)R¹⁰;

    substituent R⁶ a substituent R⁷ mohou dohromady tvořit skupinu vybranou ze skupiny sestávající z -(CH₂)4-, -(CH₂)₅-a -(CH₂)6-;

    substituent R⁸ a substituent R⁹ jsou nezávisle vybrány ze skupiny sestávající z atomu vodíku, alkylu, a arylu;

    substituent R¹⁰ je vybrán ze skupiny sestávající z hydroxyskupiny, alkoxyskupiny, aryloxyskupiny, -N(R^u)(CH₂)_nR¹², a -NR¹³R¹⁴;

    substituent R¹¹ je vybrán ze skupiny sestávající z atomu vodíku a alkylu; substituent R¹² je vybrán ze skupiny sestávající z -NR¹³R¹⁴, hydroxyskupiny, -C(O)R¹⁵, arylu a heteroarylu;

    substituent R¹³ a substituent R¹⁴ jsou nezávisle vybrány ze skupiny sestávající z atomu vodíku, alkylu, cykloalkylu, arylu a heteroarylu;

    substituenty R¹³ a R¹⁴ mohou dohromady tvořit skupinu vybranou ze skupiny sestávající z -(CH₂)₄-, -(CH₂)₅-, -(CH₂)₂O(CH₂)₂-, a (CH₂)₂N(CH₃)(CH₂)₂-;

    « · · 9 99 9 999

    999 99 9 9999

    9 999 9 9 9« 99999

    999 999 999

    999999 99 * 99 9

    264 substituent R¹⁵ je vybrán ze skupiny sestávající z atomu vodíku, hydroxyskupiny, alkoxyskupiny a aryloxyskupiny;

    substituent R¹⁶ je vybrán ze skupiny sestávající z hydroxyskupiny,

    -NR¹³R¹⁴, -C(O)R¹⁵ a -C(O)NR¹³R¹⁴;

    substituent R¹⁷ je vybrán ze skupiny sestávající z alkylu, substituovaného alkylu, cykloalkylu, arylu a heteroarylu; a n a r jsou nezávisle 1, 2, 3 nebo 4; nebo její farmaceuticky přijatelná sůl.
48. 48. Použití podle nároku 37, kde inhibitor protein kinázy je sloučenina obecného vzorce (I), kde substituent R⁶ je -COR¹⁰, kde substituent R¹⁰ je -NR^H(CH₂)_nR¹², kde: substituent R¹¹ je atom vodíku nebo nižší alkyl; n je 2 nebo 3; a substituent R¹² je -NR¹³R¹⁴, kde substituenty R¹³ a R¹⁴ jsou nezávisle nižší alkyl.
49. 49. Použití podle nároku 37, kde inhibitor protein kinázy je sloučenina obecného vzorce (I), kde substituent R⁶ je -COR¹⁰, kde substituent R¹⁰ je -NR¹¹(CH₂)_nR¹², kde: substituent R¹¹ je atom vodíku nebo nižší alkyl; n je 2 nebo 3; a substituent R¹² je -NR¹³R¹⁴, kde substituenty R¹³ a R¹⁴ spojeny dohromady vytvářejí skupinu vybranou z -(CH₂)₄-, -(CH₂)₅-, -(CH₂)₂-O-(CH₂)₂- nebo -(CH₂)₂N(CH₃)(CH₂)₂-.
50. 50. Použití podle nároku 37, kde inhibitor protein kinázy je sloučenina vzorce (I), kde substituent R⁶ je #-(2-diethyl-aminoethyl)-2V-methylaminokarbonyl, ?/-(3-dimethylamino-propyl)-aminokarbonyl,

    7V-(2-diethylaminoethyl)-aminokarbonyl, V-(3-ethylaminopropyl)-aminokarbonyl, 7V-(3-diethylamino-propyl)aminokarbonyl, nebo N-(2-ethylaminoethyl) aminokarbonyl.

    9

    9 9

    9 9 9

    9 9999

    265 « · · · · · ♦ · · 9 ♦ · · * • · · · ·
51. 51. Použití podle nároku 37, kde inhibitor protein kinázy je sloučenina obecného vzorce (I), kde:

    substituent R⁶ je 3-pyrrolidin-l-ylpropylaminokarbonyl, 3-morfolin-4-ylpropylaminokarbonyl,

    2-pyrrolidin-1 -ylethylamino-karbonyl,

    2-morfolin-4-ylethylaminokarbonyl,

    2-(4-methylpiperazin-1 -yl)ethyl-aminokarbonyl,

    2- (3,5-dimethylpiperazin-l-yl)ethyl-aminokarbonyl,

    3- (4-methylpiperazin-l-yl)propylamino-karbonyl nebo 3-(3,5 -dimethylpiperazin-1 -yl)propylamino-karbonyl.
52. 52. Použití podle nároku 37, kde inhibitor protein kinázy je sloučenina obecného vzorce (I), kde:

    substituent R⁶ je -COR¹⁰, kde substituent R¹⁰ je -NR¹³R¹⁴, kde substituent R¹³ je atom vodíku a substituent R¹⁴ je nižší alkyl substituovaný hydroxyskupinou, aryl, heteroalicykl, heteroaryl nebo karboxy skupina.
53. 53. Použití podle nároku 37, kde inhibitor protein kinázy je sloučenina obecného vzorce (I), kde:

    substituent R⁶ je 2-triazin-l-ylpropylaminokarbonyl,

    2- triazin-1 -ylethylaminokarbonyl,

    3- imidazol-l-ylpropylaminokarbonyl, pyridin-4-ylmethyl-aminokarbonyl,

    2-pyridin-2-ylethylaminokarbonyl nebo 2-imidazol-l-yl ethylaminokarbonyl.
54. 54. Použití podle nároku 37, kde inhibitor protein kinázy je sloučenina obecného vzorce (I), kde:

    substituent R⁶ je -COR¹⁰, kde substituent R¹⁰ je -NRⁿ(CH₂)_nR¹², kde: substituent R¹¹ je atom vodíku nebo nižší alkyl;

    266 • · • · · φ ♦··# η je 2 nebo 3; a substituent R¹² je -NR¹³R¹⁴, kde substituenty R¹³ a R¹⁴ spojeny dohromady vytvářejí heterocykl.
55. 55. Použití podle nároku 37, kde inhibitor protein kinázy je sloučenina obecného vzorce (I), kde:

    substituent R⁶ je -COR¹⁰, kde substituent R¹⁰ je -NR¹¹(CH2)_nR¹², kde: substituent R¹¹ je atom vodíku nebo nižší alkyl; n je 2 nebo 3; a substituent R¹² je -NR¹³R¹⁴, kde substituenty R¹³ a R¹⁴ spojeny dohromady vytvářejí a 5, 6 nebo 7 členný heterocykl obsahující karbonylovou skupinu a jeden nebo dva atomy dusíku v kruhu.
56. 56. Použití podle nároku 37, kde inhibitor protein kinázy je sloučenina obecného vzorce (I), kde:

    substituent R⁶ je 2-(3-oxopiperazin-l-yl)ethylaminokarbonyl,

    2-(imidazolidin-l-yl-2-on)ethylaminokarbonyl,

    2-(tetrahydropyrimidin-1 -yl-2-on)ethylaminokarbonyl,

    2- (2-oxopyrrolidin-1 -yl)-ethylaminokarbonyl,

    3- (3-oxopiperazin-l-yl)propyl-aminokarbonyl,

    3-(imidazolidin-1 -yl-2-on)propyl-aminokarbonyl,

    3-(tetrahydropyrimidin-1 -yl-2-on)-propylaminokarbonyl nebo

    3-(2-oxopyrrolidin-l-yl)propyl-aminokarbonyl.
57. 57. Použití podle kterýhokoliv z nároků 47 až 56, kde inhibitor protein kinázy je sloučenina obecného vzorce (I), kde:

    substituent R⁵ je vybrán ze skupiny sestávající z atomu vodíku a nižšího alkylu; a substituent R⁷ je vybrán ze skupiny sestávající z atomu vodíku, alkylu, arylu, heteroarylu a -C(O)R¹⁷, kde substituent R¹⁷ je hydroxyskupina, nižší alkyl nebo aryl.
58. 58. Použití podle nároku 57, kde:

    99

    9 9 9 9 9

    9 9 9 9

    9 9 9 9 9

    9 9 9 9

    9999 99 99

    267 • 99*

    9

    9 9 9

    9 9 9 9

    99 99999

    9 9 9 substituent R¹ je atom vodíku, nižší alkyl, -C(O)NR⁸R⁹, cykloalkyl nebo aryl;

    A substituent R je atom vodíku, halogen, nižší alkoxyskupina, kyanoskupina, aryl, -SO₂R²⁰ nebo -S(O)₂NR¹³R¹⁴, kde substituent R je atom vodíku a substituent R¹⁴ je atom vodíku, aryl nebo alkyl;

    substituent R³ je vybrán ze skupiny sestávající z atomu vodíku, nižší alkoxyskupiny, -C(O)R¹⁵, -NR¹³C(O)R¹⁴, arylu a heteroarylu; a substituent R⁴ je atom vodíku.
59. 59. Použití podle nároku 58, kde:

    substituent R¹ je atom vodíku nebo fenyl;

    substituent R² je atom vodíku, chlor, brom, fluor, methoxyskupina, ethoxyskupina, fenyl, dimethylaminosulfonyl, kyanoskupina, methylsulfonyl, ethylsulfonyl, benzylsulfonyl, 3-chlorfenyl-aminosulfonyl, karboxyskupina, methoxyskupina, aminosulfonyl, methylaminosulfonyl, fenylaminosulfonyl, pyridin-3-yl-aminosulfonyl, dimethylaminosulfonyl nebo izopropylaminosulfonyl;

    substituent R³ je atom vodíku, methoxyskupina, karboxyskupina, fenyl, pyridin-3-yl, 3,4-dichlorfenyl, 2-methoxy-5-izopropylfenyl, 4-n-butylfenyl, 3-izopropylfenyl; a substituent R⁴ je atom vodíku.
60. 60. Použití podle nároku 59, kde:

    substituent R¹ je atom vodíku;

    substituent R² je atom vodíku, kyanoskupina, fluor, chlor nebo brom; substituent R³ je fenyl; a substituent R⁴ je atom vodíku.
61. 61. Použití podle nároku 37, kde:

    substituent R¹ je atom vodíku, nižší alkyl, -C(O)NR⁸R⁹, cykloalkyl nebo aryl;

    9

    9 9

    9 9 9

    9 9999

    9 9

    9

    268 ·· ···· • · ···· * « · · 9 9 9 9

    9 9 9 9

    9 · 9

    9 9 substituent R² je atom vodíku, halogen, nižší alkoxyskupina, kyanoskupina, aryl nebo -S(O)₂NR¹³R¹⁴, kde substituent R¹³ je atom vodíku a substituent R¹⁴ je atom vodíku, aryl nebo alkyl;

    substituent R³ je vybrán ze skupiny sestávající z atomu vodíku, nižší alkoxyskupiny, -C(O)R¹⁵, -NR¹³C(O)R¹⁴, arylu a heteroarylu; a substituent R⁴ je atom vodíku.
62. 62. Použití podle nároku 37, kde:

    substituent R^l je atom vodíku nebo methyl;

    substituent R² je atom vodíku, kyanoskupina, chlor, fluor nebo brom; substituent R³ je vybrán ze skupiny sestávající z atomu vodíku nebo fenylu;

    a substituent R⁴ je atom vodíku.
63. 63. Použití podle nároku 37, kde substituent R⁶ je -COR¹⁰, kde substituent R¹⁰ je -NR¹³R¹⁴, kde substituent R¹³ je atom vodíku a substituent R¹⁴ je nižší alkyl substituovaný hydroxyskupinou, nižší alkyl substituovaný hydroxyalkylaminoskupinou, karboxyskupina nebo -NR¹⁸R¹⁹, kde substituenty R¹⁸ a R¹⁹ jsou nezávisle atom vodíku nebo nižší alkyl.
64. 64. Použití podle nároku 37, kde substituent R⁶ je [2-(diethylamino)-2-hydroxy]ethylaminokarbonyl, 2-(A^r-ethyl-ÍV-2-hydroxyethylamino)-ethylaminokarbonyl, karboxymethylaminokarbonyl nebo

    2-hydroxyethyl-aminokarbonyl.
65. 65. Použití podle nároku 37, kde substituent R⁶ je -COR¹⁰, kde substituent R¹⁰ je -NR^u(CH₂)_nR¹², kde substituent R¹² je -N⁺(O')NR¹³R¹⁴ nebo -N(OH)R¹³, kde substituenty R¹³ a R¹⁴ jsou nezávisle vybrány ze skupiny sestávající z nižšího alkylu.
66. 66. Použití podle nároku 37, kde • ·

    269 • * · • · · · • · ·· · • · · substituent R⁶ je 2-(A-hydroxy-A-ethylamino)ethylaminokarbonyl nebo 2-[N⁺(O‘)(C2H5)2]ethyl-aminokarbonyl.
67. 67. Použití podle nároku 65 nebo 66, kde substituent R⁵ je vybrán ze skupiny sestávající z atomu vodíku nebo methylu; a substituent R⁷ je vybrán ze skupiny sestávající z methylu, atomu vodíku nebo fenylu.
68. 68. Použití podle nároku 37, kde substituent R¹ je atom vodíku;

    substituent R² je atom vodíku, kyanoskupina, chlor, fluor nebo brom;

    substituent R³ je atom vodíku; a substituent R⁴ je atom vodíku.
69. 69. Použití podle nároku 37, kde inhibitor kinázy je vybrán ze skupiny sestávající z:

    N

    270

    4

    4 4

    4 4 4

    4 44 4

    4 4 nebo jeho L-malátová sůl.
70. 70. Použití podle nároku 37, kde inhibitor protein kinázy je sloučenina vzorce:
71. 71. Použití podle nároku 37, kde inhibitor, protein kinázy sloučenina vzorce nebo

    271 ·· ·♦ ····

    9 9 9

    9 9 9 9

    9 9 99999 nebo jejich farmaceuticky přijatelné soli.
72. 72. Použití podle nároku 70, kde selektivní inhibitor cyklooxygenázy-2 je vybrán ze sloučenin vzorce:

    nebo jejich farmaceuticky přijatelné soli.