RS13204A

RS13204A - Kombinovana terapija za tretman kancera

Info

Publication number: RS13204A
Application number: YUP-132/04A
Authority: RS
Inventors: Parul Doshi; Julie Cherrington; Jaime Masferrer
Original assignee: Sugen Inc.,; Pharmacia Corporation,
Priority date: 2001-08-15
Filing date: 2002-08-15
Publication date: 2007-02-05
Also published as: EP1427326A4; IL159887A0; GEP20063868B; CA2457745A1; OA12651A; ZA200400849B; KR100656004B1; US20030216410A1; EA200400235A1; AU2002329744B2; AP2004002995A0; NZ530792A; TWI230609B; DE60229959D1; AR038957A1; ECSP045021A; WO2003015608A2; SK1412004A3; KR20040043193A; MA27060A1

Abstract

Ovaj pronalazak se odnosi na postupke za tretman ili prevenciju poremećaja neoplazma, upotrebom inhibitora protein tirozin kinaze u kombinaciji sa inhibitorima ciklooksigenaze, a naročito sa selektivnim inhibitorima ciklooksigenaze-2.

Description

KOMBINOVANA TERAPIJA ZA TRETMAN KAN CERA

Ovaj pronalazak se odnosi na postupke za tretman ili prevenciju poremećaja neoplazme, koji koriste inhibitore tirozin kinaze u kombinaciji sa inhibitorima ciklooksigenaze, a naročito sa selektivnim inhibitorima ciklooksigenaze-2.

Neoplazma ili tumor, je abnormalna, neregulisana i dezorganizovana proliferacija ćelijskog rasta. Neoplazma je maligna, ili kancerogena ukoliko ima svojstva destruktivnog rasta, invazivnosti i metastaze. Invazivnost se odnosi na lokalno širenje neoplazma infiltracijom ili destrukcijom okolnog tkiva, tipično probijanjem bazalne lamine koja definiše granice tkiva, usled čega obično ulazi u cirkulacioni sistem tela. Metastaza se tipično odnosi na rasejavanje ćelija tumora putem limfnih ili krvnih sudova. Metastaza se takođe odnosi na migraciju ćelija tumora direktnim širenjem kroz serozne šupljine, ili subarahnoidalne ili druge prostore. Procesom metastaze ćelije tumora, migracijom u druge delove tela, stvaraju neoplazme na mestima koja su udaljena od mesta primarne pojave.

kancer je činio 23,3% svih smrti u SAD (videti U.S. Dept. of Health and Human Services, National Centerfor Health Statistics, Health United States 1996-97, i lnjury Chartbook 117 (1997)).

Kancer se ne razume u potpunosti na molekulskom nivou. Poznato je da izlaganje ćelija karcinogenu, kao što su neki virusi, neke hemikalije, ili radijacija, dovodi do izmene DNA, koja inaktivira supresivne gene ili alktivira "onkogene". Supresivni geni su geni regulatori rasta, koji nakon mutacije više ne mogu da kontrolišu ćelijski rast. Onkogeni su prvobitno normalni geni (zovu se proonkogeni), koji mutacijom ili u izmenjenom kontekstu izlučivanja postaju geni transformacije. Proizvodi ovih gena transformacije izazivaju neodgovarajući ćelijski rast. Više od dvadeset normalnih ćelijskih gena mogu genetskom alteracijom postati onkogeni. Transformisane ćelije se razlikuju od normalnih ćelija na mnogo načina, ukljuučujući morfologiju ćelije, interakcije ćelija-ćelija, sadržaj membrane, citoskeletnu strukturu, izlučivanje proteina, izlučivanje gena i smrtnost (transformisane ćelije mogu neograničeno da rastu).

Danas se kancer prvenstveno tretira sa jednom ili sa kombinacijom tri vrste terapije: hirurgija, zračenje i hemoterapija. Hirurgija uklanja masu obolelog tkiva, lako je ponekad efikasna u uklanjanju tumora lociranih na nekim mestima, na primer u dojci, debelom crevu i koži, ona se ne može koristiti za tretiranje tumora lociranih na drugim mestima, kao što je kičma, niti za tretman rasejanih stanja neoplazma, kao što je leukemija.

Hemoterapiju čini prekid replikacije ćelija ili metabolizma ćelije. Najčešće se koristi u tretmanu kancera dojke, pluća i testisa.

Štetnih efekata sistemske hemoterapije, koji se koriste u tretmanu bolesti neoplazme, najviše se plaše pacijenti koji se podvrgavaju tretmanu kancera. Od ovih štetnih efekata, najčeša su mučnina i povraćanje i ozbiljni sporedni efekti. Drugi štetni efekti kod pacijenata koji primaju visoke doze hemoterapije su

citopenija, infekcije, kaheksija, mukozitis, uz opasnost po koštanu srž ili od radijacine terapije; alopecija (gubitak kose); kožne komplikacije (videti M.D. Abeloff et al., "Alopecia and Cutaneous Cimplications", str. 755-56, u Abeloff, M.D., Armitage, J.O., Lichter, A.S. i Niederhuber, J.E. (urednici), "Clinical Oncologv", Churchill Livingston, New York, 1992 za kožne reakcije na hemoterapijske agense), kao što su svrab, urtikarija i angioedem; neurološke komplikacije; plućne i srčane komplikacije kod pacijena takoji primaju radijacionu i hemoterapiju; i reproduktivne i endokrine komplikacije.

Sporedni efekti izazvani hemoterapijom značajno deluju na kvaliteta života pacijenta i mogu dramatično da utiču na pristanak pacijenta na tretman.

Pored toga, štetni sporedni efekti, koji su povezani sa hemoterapijskim agensim, obično su ograničeni dozom na gornjoj granici toksičnosti kod ordiniranja tih lekova. Na primer, mukozitis je jedan od glavnih faktora toksičnosti koji ograničava dozu kod nekoliko antikancer agenasa, uključujući antimetaboličke citotoksične agense 5-FU, metotreksat i antitumorne antibiotike, kao što je dokorubicin. Mnogi od ovih sporednih efekata izazvanih hemoterapijom, ako su ozbiljni, mogu dovesti do hospitalizacije, ili zathevaju tretman sa analgeticima za tretiranje bola.

Štetni efekti izazvani hemoterapijskim agensima i radijacionom terapijom dobili su primarnu važnost u kliničkom tretmanu pacijenata sa kancerom.

Danas su naučnici u potrazi za tretmanom kancera preko upotrebe antiangiogenih agenasa. Angiogeneza se smatra mehanizmom preko koga tumori dobijaju potrebnu hranu da bi rasli i metastazirali na druge lokacije u telu. Antiangiogeni agensi interferiraju sa ovih procesima i uništavaju ili kontrolišu tumore.

Na primer, u U.S. Patent No. 5,854,205 opisan je i izolovan endostatinski protein koji je inhibitor proliferacije i angiogenze endotelijuma ćelije; u U.S. Patent No. 5,843,925 opisan je postupak za inhibiciju angiogeneze i proliferaciju endotelijuma ćelije korišćenjem 7-[supstituisani amino]-9-[(supstituisani gliciloamido]-6-demetilksitetraciklin; u U.S. Patent No. 5,861,372 opisana je upotreba inhibitora agregacije endotelijuma, angiostatina i njegovo korišćenje za inhibiranje angiogenze; PCT/GB97/00650 opisuje upotrebu derivata hinolina koji se koristi za stvaranje antiangiogenog i/ili snižavajućeg efekta vaskularne permeabilnosti; Tai-Ping, D. opisuje potencijalne anti-angiogene terapije, videtiTrends Pharmacol. Sci.1995, 16(2), 57-66; Lode, H. et al. opisuju sinergiju između antiangiogenog integrina alfa v antagonista i proteina fuzije antitela-citokina koji iskorenjuje spontanu metastazu tumora, videtiProc. Natl. Acad. Sci. USA,1999, 96(4), 1591-1596; Giannis, A. et al. opisuju antagoniste integrina i druga jedinjenja niske molarne mase kao inhibitore angiogeneze, videti "New Drugs in Cancer Therapv" uAngevv. Chem. Int. Ed. Engl.,1997, 36(6), 588-590; u WO 97/41,844 se opisuje postupak korišćenja kombinacija angiostatskih jedinjenja u prevenciji i/ili tretmanu neovaskularizacije kod humanih pacijenata; u WO 98/22,101 se opisuje postupak za korišćenje [pirazil-1-il]benzensulfonamida kao anti-angiogenih agenasa; i u U.S. Patent No. 5,792,783 se opisuje upotreba 3-heteroaril-2-indolinona, koji su inhibitori protein kinaze i antiangiogeni agensi za tretman različitih kancera.

Nedavno je objavljeno da je tretman kolorektalnih kancera sa selektivnim inhibitorom ciklooksigenze-2, specifično to je Herceptin<®>, efikasniji nego kada se bilo koji od ovih agenasa koristi sam. U skladu sa tim, postoji potreba za otkrivanjem novih kombinacija hemoterapijskih agenasa, koji su, kada se koriste zajedno, efikasniji nego kada se koriste pojedinačno. Ovaj pronalazak ispunjava potrebu za ovim.

U jednom aspektu, ovaj pronalazak je usmeren na postupak za tretman ili prevenciju kancera koji se sastoji u ordiniranju sisaru kome je potreban takav tretman terapijski efikasne količine:

inhibitora protein kinaze formule (I):

gde su

R se bira iz grupe koju čine vodonik, piperazin-1-ilmetil, 4-metilpiperazin-1 - ilmetil, piperidin-1-ilmetil, 2-hidroksimetilpirolidin-1-ilmetil, 2-karboksipirolidin-1-ilmetil i pirolidin-1-ilmetil;

R<1>se bira iz grupe koju čine vodonik, halo, alkil, supstituisani alkil, cikloalkil, supstituisani cikloalkil, aril, heteroaril, heteroaliciklil, hidroksi, alkoksi, -C(0)NR<8>R<9>,-NR<13>R<14>, -(CO)R<15>i -(CH2)rR<16>;

R<2>se bira iz grupe koju čine vodonik, halo, alkil, supstituisani alkil, trihalometil, hidroksi, alkoksi, cijano, -NR13R1<4>, -NR<13>(CO)R<14>, -C(0)R<15>, aril, heteroaril i -S(0)2NR13R14;

R<3>se bira iz grupe koju čine vodonik, halogen, alkil, supstituisani alkil, trihalometil, hidroksi, alkoksi, aril, heteroaril, -NR13R<14>, -NR<13>S(0)2R<14>, -S(0)2NR<13>R<14>, -NR<13>C(0)R14, -NR<13>C(0)OR<14>, -C(0)R<15>i -S02R<19>;

R<4>se bira iz grupe koju čine vodonik, halogen, alkil, supstituisani alkil, hidroksi, alkoksi i -NR13R<14>;

R<5>se bira iz grupe koju čine vodonik, alkil, supstituisani alkil i -C(0)R<10>;

R<6>se bira iz grupe koju čine vodonik, alkil, supstituisani alkil i -C(0)R<10>;

R<7>se bira iz grupe koju čine vodonik, alkil, supstituisani alkil, aril, heteroaril,

-C(0)R17 i -C(0)R<10>, pod uslovom kada R predstavlja vodonik da tada najmanje jedan odR5,R<6>iR<7>predstavlja -C(0)R<10>; ili

R<6>i R<7>mogu da se kombinuju i da formiraju grupu koja se bira iz grupe koju čine -(CH2)4-, -(CH2)5- i -(CH2)6-;

R<8>i R<9>se nezavisno biraju iz grupe koju čine vodonik, alkil, supstituisani alkil i aril;

R<10>se bira iz grupe koju čine hidroksi, alkoksi, ariloksi, -N(R<11>)(alkilen)nR<12>, gde je alkilenska grupa opciono susptituisana sa hidroksi grupom, i -NR<13>R<14>; R11 se bira izgrupe koju čine vodonik, alkil i supstituisani alkil;

R<12>se bira iz grupe koju čine -NR<13>R<14>, hidroksi, -C(0)R<15>, aril, heteroaril, -N<+>(0-)R13R<14>, -N(OH)R<13>i -NHC(0)R<18>(gde je R<18>alkil, supstituisani alkil, haloalkil ili aralkil);

R<13>i R<14>se nezavisno biraju iz grupe koju čine vodonik, alkil, supstituisani alkil, niži alkil supstituisan sa hidroksifamino, cijanoalkil, cikloalkil, supstituisani cikloalkil, aril i heteroaril; ili

R<13>i R<14>se mogu kombinovati da formiraju heterociklo grupu;

R15 se bira iz grupe koju čine vodonik, hidroksi, alkoksi i ariloksi;

R<16>se bira iz grupe koju ane hidroksi, -NR<13>R<14>, -C(0)R<15>i -C(0)NR<13>R<14>; R<17>se bira iz grupe koju čine alkil, supstituisani alkil, cikloalkil, aril i heteroaril; R<19>se bira iz grupe koju čine alkil, supstituisani alkil, aril, aralkil, heteroaril ili heteroaralkil; i

n i r su nezavisno, 1, 2, 3 ili 4;

u kombinaciji sa inhibitorom ciklooksigenaze;

ili njegova farmaceutski prihvatljiva so.

Poželjno je da se inhibitor protein kinaze formule (I), koristi u kombinaciji sa selektivnim inhibitorom ciklooksigenaze-2, koji se bira iz grupe koju čine:

(i) jedinjenje formule (II)

gde su:

G se bira iz grupe koju čine 0, S i -NR<a->, gde je R<a>vodonik ili alkil;

R10a se bira iz grupe koju čine vodonik i aril;

R11a se bira iz grupe koju čine karboksil, alkil, aralkil, aminokarbonil, alkilsulfonilaminokarbonil i alkoksikarbonil;

R12a se bira iz grupe koju čine haloalkil, alkil, aralkil, cikloalkil i aril, opciono supstituisan sa jednim ili više radikala koji se biraju između alkiltio, nitro i alkilsulfonil; i

R<13a>je jedan ili više radikala koji se nezavisno biraju iz grupe koju čine vodonik, halo, alkil, aralkil, alkoksi, ariloksi, heteroariloksi, aralkoksi, heteroaralkiloksi, haloalkil, haloalkoksi, alkilamino, arilamino, aralkilamino, heteroarilamino, heteroarilalkilamino, nitro, amino, aminosulfonil, alkilaminosulfonil, arilaminosulfonil, heteroarilaminosulfonil, aralkilaminosulfonil, heteroaralkilaminosulfonil, heterociklosulfonil, alkilsulfonil, hidroksialkilkarbonil, nitroaril, opciono supstituisani aril, opciono supstituisani heteroaril, aralkilkarbonil, heteroaril-karbonil, arilkarbonil, aminokarbonil i alkilkarbonil; ili

R<13a>zajedno sa prestenom E formira naftil prsten;

ili

(ii) jedinjenje formule (III):

gde su

A se bira iz grupe koju čine delimično nezasićeni ili nezasićeni heterociklil i delimično nezasićeni ili nezasićeni karbokciklični prstenovi;

R<1b>se bira iz grupe koju čine heterociklil, cikloalkil, cikloalkenil i aril, gde je R<1b>opciono supstituisan u pogodnom položaju sa jednim ili više radikala koji se nezavisno biraju između alkil, haloalkil, cijano, karboksi, alkoksikarbonil, hidroksil, hidroksialkil, haloalkoksi, amino, alkilamino, arilamino, nitro, alkoksilakil, alkilsulfinil, halo, alkoksi i alkiltio;

R2b se bira iz grupe koju čine metil i amino; i

R<3b>se bira iz grupe koju čini radikal koji se bira između: vodonik, halo alkil, alkenil, alkinil, okso, cijano, karboksil, cijanoalkil, heterocikliloksi, alkiloksi, alkiltio, alkilkarbonil, cikloalkil, aril, haloalkil, heterociklil, cikloalkenil, aralkil, hetrocikiilaikil, adi, alkiltioalkil, hidroksialkil, alkoksikarbonil, arilkarbonil, aralkilkarbonil, aralkenil, alkoksialkil, ariltioalkil, ariloksialkil, aralkiltioalkil, aralkoksialkil, alkoksiaralkoksialkil, alkoksikarbonilalkil, aminokarbonil, aminokarbonilalkil, alkilaminokarbonil, N-arilaminokarbonil, N-alkil-N-arilaminokarbonil, alkilaminokarbonilalkil, karboksi alki I, alkilamino, N-arilamino, N-aralkilamino, N-alkil-N-aralkilamino, N-alkil-N-arilamino, aminoalkil, alkilaminoalkil, N-arilaminoalkil, N-aralkilaminoalkil, N-alkil-N-aralkilaminoalkil, N-alkil-N-arilaminoalkil, ariloksi, aralkoksi, ariltio, aralkiltio, alkilsulfinil, alkilsulfonil, aminosulfonil, alkilaminosulfonil, N-arilaminosulfonil, arilsulfonil i N-al ki l-N-aril ami nosulfonil;

i njegova farmaceutski prihvatljiva so.

Poželjno je da se gornja jedinjenja ordiniraju kao farmaceutski preparat koji sadrži jedno ili više od gornjih jedinjenja i farmaceutski prihvatljiv dodatak. Specifično, terapeutski agensi iz ovog pronalaska se mogu formulisati kao odvojeni preparati koji se daju u isto vreme ili u različita vremena, ili se ovaj terapeutski agens može davati kao jedan preparat.

Postupci iz ovog pronalaska su korisni za tretman ili prevenciju poremećaja neoplazma, uključujući akralni lentiginozni melanom, aktiničke keratoze, adenokarcinom, adenoidni cistični karcionom, adenome, adenosarkom, adenoskvamozni karcinom, astrocitičke tumore, karcinom Bartolinove žlezde, karcinom bazalnih ćelija, karcinome bronhijalne žlezde, kapilarni karcinoidis, karcinom, karcinosarkom, kaverne, holangiokarcinom, hondosarkom, karcinom horiodne papilome pleksusa, karcinom bistrih ćelija, cistadenom, endodermalni tumor sinusa, endometrijalna hipeprlazija, sarkom endometrijsalne strome, endometriodinalni adenokarcinom, ependimalni, epiteloidni Ewing-ov sarkom, fibrolamelama, fokalna hiperplazija čvorova, gastrinom, tumori ćelija kvasaca, glioblastom, glukagonom, hemangioblastomi, hemangioendotelijum, hemangiome, hepatični adenom, hepatična adenomatoza, hepatocelularni karcinom, insulinom, intraepitelijumska neoplazija, intraepitelijumska neoplazija skvamoznih ćelija, invazivni sarkom skvamoznih ćelija, karcinom velikih ćelija, leiomiosarkom, lentigo maligni melanomi, maligni melanomi, maligni tumori mezotelijuma, meduloblastom, meduloepiteliom, melanom, meningialni, metastatički karcinom, mukoepidermoidni karcinom, neuroblastom, neuroepitelijalni adenokarcinom čvornih melanoma, karcinom malih ćelija, oligodendroglialni, osteosarkom, pankreasni polipeptid, serozni papilami adenokarcinom, ćelije epifize, tumori hipofize, plazmacitomi, pseudosarkom, pulmonarni blastom, karcinom bubrženih ćelija, retinoblastom, rabdomiosarkom, sarkom, serozni karcinom, karcniom malih ćelija, karcinomi mekog tkiva, tumor izlučivanja somatostatina, skvamozni karcinom, karcinom skvamoznih ćelija, submezotelijumni melanom koji se širi po površini, nediferencirani karcinom, uvealni melanom, verukozni karcinom, vipom, dobro izdiferencirani karcinom i Wilm-ov tumor.

Postupci iz ovog pronalaska pružaju još jednu korist. Jedna od koristi je da se preparati, agensi i terapije iz ovog pronalaska ordiniraju u kombinaciji sa niskom dozom, tj. sa sadržajem doze koji je niži nego što se konvencionalno koristi u kliničkim situacijama za svaku od pojedinačnih komponenata kada se ordiniraju same.

Korist od smanjivanja doze jedinjenja, preparata, agenasa i terapija iz ovog pronalaska, kada se ordiniraju sisarima, sastoji se u smanjenju pojave štetnih efekata, koji su povezani sa višim dozama. Na primer, snižavanjem doze hemoterapiskog agensa, kao što je metotreksat, dovodi do smanjenja u učestanosti i ozbiljnosti mučnine i povraćanja, u poređenju sa istim koje se opaža pri višim dozama. Slične koristi se dešavaju kada se koristi inhibitor protein kinaze iz ovog pronalaska u kombinaciji sa inhibitorom ciklooksigenaze, a naročito sa selektivnim inhibitorom ciklooksigenaze-2.

Namera je smanjenje pojave štetnih efekata i poboljšanje kvaliteta života pacijenta podvrgnutog tretmanu kancera. Sledeća korist od snižavanja pojave štetnih efekata je povećanje pristajanja pacijenta, smanjenje broja neophodnih hospitalizacija zbog tretmana štetnih efekata i smanjenje ordiniranja analgetičkih agenasa za tertiranje bola, koje je povezano sa štetnim efektima.

Sledeća korist je u nameri da inhibicija tumora bude veća kada se inhibitor protein kinaze ordinira u kombinaciji sa inhibitorom ciklooksigenaze, poželjno specifičnim inhibitorom ciklooksigenaze-2-, nego kada se bilo koji od ovih agenasa ordinira sam.

Ovaj pronalazak obuhvata još i komplete koji sadrže inhibitor COX-2 i inhibitor protein kinaze formule (I).

Definicije

Ukoliko se drugačije ne naglasi, nazivi koji slede u ovoj prijavi i zahtevima imaju značenja koja se diskutuju niže: "Alkil" se odnosi na zasićeni alifatični ugljovodonični radikal, uključujući grupe ravnog lanca i račvastog lanca, sa 1 do 20 atoma ugljenika (bilo kojim brojem unutar opsega; npr. kada se navede "1-20" to označava da grupa, u ovom slučaju je to alkil grupa, može da sadrži 1 atom ugljenika, 2 atoma ugljenika, 3 atoma ugljenika itd. sve do zaključno 20 atoma ugljenika). Alkil grupe koje sadrže od 1 do 4 atoma ugljenika se označavaju kao niže alkil grupe. Ako pomenutim nižim alkil grupama nedostaju supstituenti, onda se one odnose na niže alkil grupe. Poželjno je da je alkil grupa srednje veličine, koja ima 1 do 10 atoma ugljenika, npr. metil, etil, propil, 2-propil, n-butil, /zo-butil, ferc-butil, pentil i slično. Najpoželjnije je da je to niža alkil grupa sa 1 do 4 atoma ugljenika, npr. metil, etil, propil, 2-propil, n-butil, /zo-butil, ferc-butil i slično.

"Supstituisani alkil" označava alkil grupu definisanu gore, supstituisanu sa jednim ili više, poželjno jednim do tri, poželjnije sa jednim do dva supstituenta, koji se nezavisno biraju iz grupe koju čine: halo, hidroksi, niži alkoksi, aril opciono supstituisan sa jednom ili više grupa, poželjno jednom, dve ili tri grupe, koje su svaka nezavisno, halo, hidroksi, alkil ili niža alkoksi grupa, ariloksi opciono supstituisan sa jednom ili više grupa, poželjno sa jednom dve ili tri grupe, koje su svaka nezavisno halo, hidroksi, niži alkil ili niža alkoksi grupa, 6-člani heteroaril, koji ima 1 do 3 atoma azota u prstenu, a ugljenici u prstenu su opciono supstituisani sa jednom ili više grupa, poželjno sa jednom, dve ili tri grupe, koje se svaka nezavisno, biraju između halo, hidroksi, niži alkil ili niža alkoksi-grupa, 5-člani heteroaril koji ima 1 do 3 heteroatoma, koji se biraju iz grupe koju čine azot, kiseonik i sumpor, a ugljenikovi i azotovi atom u toj grupi sa opciono supstituisani sa jednom ili više grupa, poželjno jednom, dve ili tri grupe, koje se svaka nezavisno, biraju između halo, hidroksi, niža alkil ili niža alkoksi grupa, 5-ili 6-člana heterociklična grupa koja ima 1 do 3 heteroatoma, koji se biraju iz grupe koju čine azot, kiseonik i sumpor, dok su atomi azota (ukoliko je prisutan) i ugljenika u grupi opciono supstituisani sa jednom ili više grupa, poželjno sa jednom, dve ili tri grupe, merkapto (niži alkil)tio, ariltio opciono supstituisan sa jednom ili više grupa, poželjno jednom, dve ili tri grupe, koje se svaka nezavisno

biraju između halo, hidroksi, niži alkil ili niža alkoksi grupa, cijano, acil, tioacil, O-karbamil, N-karbamil, O-tiokarbamil, N-tiokarbamil, C-amido, N-amido, nitro, N-sulfonamido, S-sulfonamido, R<18>S(0)-, R<18>S(0)2-, -C(0)OR18,R1<8>C(0)0- i -NR<18>R<19>, gde se R<18>i R<19>, svaki nezavisno, biraju iz grupe koju čine vodonik, niži alkil, trihalometil, (C3-C6)cikloalkil, niži alkenil, niži alkinil i aril opciono supstituisan sa jednom ili više grupa, poželjno jednom, dve ili tri grupe, koje se nezavisno biraju između halo, hidroksi, niže alkil ili niže alkoksi grupe.

Poželjno je da je alkil grupa susptituisana se jednim ili dva supstituenta koji se nezavisno biraju iz grupe koju čine hidroksi, 5- ili 6-člana heterociklična grupa koja ima 1 do 3 heteroatoma, koji se biraju iz grupe koju čine azot, kiseonik i sumpor, a ugljenikovi i azotovi (ako su prisutni) atomi u ovoj grupi su opciono supstituisani sa jednom ili više grupa, poželjno jednom dve ili tri grupe, koje su svaka nezavisno, halo, hidroksi, niža alkil ili niža alkoksi grupa, 5-člani heteroaril koji ima od 1 do 3 heteroatoma koji se biraju iz grupe koju čine azot, kiseonik i sumpor, a ugljenikovi i azotovi atomi u tim grupama su opciono supstituisani sa jednom ili više grupa, poželjno jednom, dve ili tri grupe koje su svaka nezavisno halo, hidroksi, niža alkil ili niža alkoksi grupa, 6-to člani heteroaril koji ima od 1 do 3 heteroatoma u prstenu, opciono supstituisan sa jednom ili više grupa, poželjno jednom, dve ili tri grupe koje su svaka nezavisno halo, hidroksi, niža alkil ili niža alkoksi grupa, ili -NR<18>R19, gde se R<18>i R19nezavisno biraju iz grupe koju čine vodonik i niži alkil. Još je poželjnije da je alkil grupa supstituisana sa jednim ili dva supstituenta koji su, svaki nezavisno, hidroksi, dimetilamino, etilamino, dietilamino, dipropilamino, pirolidino, piperidino, morfolino, piperazino, 4-niži alkil-piperazino, fenil, imidazolil, piridinil, piridazinil, pirimidinil, oksazolil, triazinil i slično.

"Cikloalkil" se odnosi na 3- do 8-člani monociklični prsten, sav ugljeničan, 5-člani/6-člani ili 6-člani/6-člani spojeni biciklični prsten il multiciklična spojena prstenasta ("spojeni" prstenasti sistem znači da svaki prsten u sistemu deli susedni par atoma ugljenika sa svakim drugim prstenom u sistemu) grupa u kojoj

jedan ili više od ovih prstenova može da sadrži jednu ili više dvogubih veza, ali ni jedan prsten nema potpuno konjugovan sistem pi-elektrona.

Primeri, ali bez ograničavanja, cikloalkil grupa su ciklopropan, ciklobutan, ciklopentan, ciklopenten, cikloheksan, cikloheksadien, adamantan, cikloheptan, cikloheptatrien i slično.

"Supstituisani cikloalkil" označava cikloalkil grupu, definisanu gore, koja je supstituisana sa jednim ili više, poželjno sa jedan ili dva supstituenta, koji se nezavisno biraju iz grupe koju čine niži alkil, trihaloalkil, halo, hidroksi, niži alkoksi, aril opciono supstituisan sa jednom ili više, poželjno jednom ili dve grupe koje su, svaka nezavisno, halo, hidroksi, niža alkil ili niža alkoksi grupa, ariloksi opciono supstituisan sa jednom ili više, poželjno jednom ili dve grupe koje su, svaka nezavisno, halo, hidroksi, niža alkil ili niža alkoksi grupa, 6-to člani heteroaril koji ima 1 do 3 atoma azota u prstenu, a ugljenici u prstenu su opciono supstituisan sa jednom ili više, poželjno jednom ili dve grupe koje su, svaka nezavisno, halo, hidroksi, niža alkil ili niža alkoksi grupa, 5-to člani heteroaril koji ima 1 do 3 heteroatoma koji se biraju iz grupe koju čine azot, kiseonik i sumpor, a atomi ugljenika i azota u ovoj grupi su opciono supstituisani sa jednom ili više, poželjno jednom ili dve grupe koje su, svaka nezavisno, halo, hidroksi, niža alkil ili niža alkoksi grupa, 5-to ili 6-to člana heteroaliciklična grupa koja ima 1 do 3 heteroatoma koji se biraju iz grupe koju čine azot, kiseonik i sumpor, a atomi ugljenika i azota (ako su prisutni) u ovoj grupi su opciono supstituisani sa jednom ili više, poželjno jednom ili dve grupe koje su, svaka nezavisno, halo, hidroksi, niža alkil ili niža alkoksi grupa, merkapto, (niži alkil)tio, ariltio opciono supstituisan sa jednom ili više, poželjno jednom ili dve grupe koje su, svaka nezavisno, halo, hidroksi, niža alkil ili niža alkoksi grupa, cijano, acil, tioacil, O-karbamil, N-karbamil, O-tiokarbamil, N-tiokarbamii, C-amido, N-amido, nitro, N-sulfonamido, S-sulfonamido, R<18>S(0)-, R<18>S(0)2-, -C(0)OR18, R<18>C(0)0-, a -NR<1>8R1<9>su definisani gore.

"Alkenil" se odnosi na nižu alkil grupu, defmisanu gore, koja se sastoji od najmanje dva atoma ugljenika i najmanje jedne dvogube veze ugljenik-ugljenik. Reprezentativni primeri su, ali ne i ograničeni njima, etenil, 1-propenil, 2-propenil, 1-, 2- ili 3-butenil i slično.

"Alkinil" se odnosi na nižu alkil grupu, definisanu gore, koja se sastoji od najmanje dva atoma ugljenika i najmanje jedne trogube veze ugljenik-ugljenik. Reprezentativni primeri su, ali ne i ograničeni njima, etinil, 1-propinil, 2-propinil, 1-, 2- ili 3-butinil i slično.

"Aril" se odnosi na potpuno ugljeničnu monocikličnu, ili policikličnu grupu, sa pripojenim prstenom (tj. prstenovi koji dele susedne parove atoma ugljenika), sa 1 do 12 atoma ugljenika, koja ima potpuno konjugovan sistem pi-elektrona. Primeri, bez ograničavanja, aril grupa su fenil, naftalini I i antracenil. Aril grupa može biti supstituisana i nesupstituisana. Kada je supstituisana, poželjno je da bude jedna ili više grupa supstituenata, poželjnije jedna, dve ili tri , još poželjnije jedna ili dve, koje se nezavisno biraju iz grupe koju čine niži alkil, tioalkil, halo, hidroksi, niži alkoksi, merkapto, (niži alkil)tio, cijano, acil, tioacil, O-karbamil, N-karbamil, O-tiokarbamil, N-tiokarbamil, C-amido, N-amido, nitro, N-sulfonamido, S-suIfnamido, R<18>S(0)-, R<18>S(0)2-, -C(0)OR18, R<18>C(0)0- i -NR<18>R<19>, a R<1>81<9>su definisani gore. Poželjno je da je aril grupa opciono supstituisana sa jednim ili dva supstituenta koji se nezavisno biraju između halo, niži alkil, trihaloalkii, hidroksi, merkapto, cijano, N-amido, mono- ili dialkilamino, karboksi ili N-sulfonamido.

"Heteroaril" se odnosi na monocikličnu ili spojenu prstenastu (tj. prstenovi koji dele susedni par atoma ugljenika) grupu sa 5 do 12 atoma ugljenika, koja sadrži jedan, dva ili tri heteroatoma u prstenu, koji se biraju između N, 0 ili S, a preostali atomi u prstenu su C, a pored toga ima kompletno konjugovan sistem pi-elektrona. Primeri, bez ograničavanja, nesupstituisanih heteroaril grupa su pirol, furan, tiofen, imidazol, oksazol, tiazol, pirazol, piridin, pirimidin, hinolin,

izohinolin, purin i karbazol. Heteroaril grupa može biti supstituisana ili nesupstituisana. Kada je supstituisana, poželjno je da je supstituisana sa jednom ili više grupa, poželjnije sa jednom, dve ili tri, još poželjnije sa jednom ili dve, koje se nezavisno biraju iz grupe koju čine niži alkil, trihaloalkil, halo, hidroksi, niži alkoksi, merkapto, (niži alkil)tio, cijano, acil, tioacil, O-karbamil, N-karbamil, 0-tiokarbamil, N-tiokarbamil, C-amido, N-amido, nitro, N-sulfonamido, S-sulfonamido, R<18>S(0)-, R<18>S(0)2-, -C(0)OR18, R<18>C(0)0- i NR18R1<9>, gde su R<18>i R<19>definisani gore. Poželjno je da je heteroaril grupa opciono supstituisana sa jednim ili dva supstituenta koji se nezavinso biraju između halo, niži alkil, trihaloalkil, hidroksi, merkapto, cijano, N-amido, mono ili dialkilamino, karboksi ili N-sulfonamido.

"Heteroaliciklični" se odnosi na monocikličnu ili spojenu prstenastu grupu koja ima u prstenu ili prstenovima 5 do 9 atoma prstena, među kojima su jedan ili dva atoma u prstenu heteroatomi koji se biraju između N, O ili S(0)n(gde je n ceo broj od 0 do 2), a preostali atomi u prstenu su C. Ovi prstenovi mogu da imaju jednu ili više dvogubih veza. Međutim, ovi prstenovi nemaju kompletno konjugovan sistem pi-elektrona. Primeri, bez ograničavanja, nesupstituisanih heterocikličnih grupa su pirolidino, piperidino, piperazino, morflolino, tiomorfolino, homopiperazino i slično. Heterociklični prsten može biti supstituisan ili nesupstituisan. Kada je supstituisan, poželno je da je jedna ili više supstituisanih grupa, poželjnije jedna, dve ili tri, još poželjnije jedna ili dve, koje se nezavisno biraju iz grupe koju čine niži alkil, trihaloalkil, halo, hidroksi, niži alkoksi, merkapto, (niži alkil)tio, cijano, acil, tioacil, O-karbamil, N-karbamil, O-tiokarbamil, N-tiokarbamil, C-amido, N-amido, N-sulfonamido, S-sulfonamido, R<18>S(0)-, R<18>S(0)2-, -C(0)OR18,R18C(0)0- i NR<18>R<19>, gde su R<18>i R<19>definisani gore. Poželjno je da je heterociklična grupa opciono supstituisana sa jednim ili dva supstituenta koji se nezavisno biraju između halo, niži alkil, trihaloalkil, hidroksi, merkapto, cijano, N-amido, mono ili dialkilamino, karboksi ili N-sulfonamido.

Poželjno je da je heteroaliciklična grupa opciono supstituisana sa jednim ili dva supstituenta koji se nezavisno biraju između halo, niži alkil, trihaloalkil, hidroksi, merkapto, cijano, N-amido, mono ili dialkilamino, karboksi ili N-sulfonamido.

"Heterocikl" označava zasićeni ciklični radikal sa 3 do 8 atoma u prstenu, gde su 1 ili 2 atoma u prstenu heteroatomi, koji se biraju između N, 0 ili S(0)n(gde je n ceo broj od 0 do 2), a preostali atomi u prstenu su C, gde su jedan ili dva C atoma opciono zamenjeni sa karbonil grupom. Heterociklil prsten može opciono biti supstituisan sa jednim, dva ili tri supstituenta koji se biraju između opciono supstituisanog nižeg alkila (supstituisan sa 1 ili2 supstituenta koji se nezavisno biraju između karboksi i estar), haloalakil, cijanoalkil, halo, nitro, cijano, hidroksi, alkoksi, amino, monoalkilamino, dialkilamino, aralkil, heteroaralkil, -COR (gde je R alkil) ili -COOR (gde je R vodonik ili alkil). Određenije, naziv heterociklil obuhvata, ali bez ograničavanja, tetrahidropiranil, 2,2-dimetil-1,3-dioksolan, piperidino, N-metilpiperidin-3-il, piperazino, N-metilpirolidin-3-il, 3-pirolidino, morfolino, tiomorfolino, tiomorfolino-1 -oksid, tiomorfolino-1,1-dioksid, 4-etiloksikarbonilpiperazino, 3-oksopiperazino, 2-imidazolidon, 2-pirolidinon, 2-oksohomopiperazino, tetrahidropirimidin-2-on, i njihove derivate. Poželjno je da je heterociklična grupa opciono supstituisana sa jednim ili dva supstituenta koji se nezavisno biraju između halo, niži alkil, niži alkil supstituisan sa karboksi, estar, hidroksi, mono ili dialkilamino.

"Hidroksi" se odnosi na -OH grupu.

"Alkoksi" se odnosi i na -O-(alkil) i na -O-(cikloalkil) grupu. Reprezentativni primeri su, ali bez ograničavanja, npr. metoksi, etoksi, propoksi, butoksi, ciklopropiloksi, ciklobutiloksi, ciklopentiloksi, cikloheksiloksi i slično.

"Ariloksi" se odnosi i na —O-aril i na -O-heteroaril grupu, kako je definisano ovde. Reprezentativni primeri su, ali bez ograničavanja, fenoksi, piridiniloksi, furaniloksi, tieniloksi, pirimidiniloksi, piraziniloksi i slično, i njihovi derivati.

"Merkapto" se odnosi na -SH grupu.

"Alkiltio" se odnosi i na -S-alkil i na -S-cikloalkil grupu. Reprezentativni primeri su, ali bez ograničavanja, npr. metiltio, etiltio, propiltio, butiltio, ciklopropiltio, ciklobutiltio, cikloheksiltio i slično.

"Ariltio" se odnosi i na -S-aril i na -S-heteroaril grupu, kako je ovde definisano. Reprezentativni primeri su, ali bez ograničavanja, feniltio, piridiniltio, furaniltio, tieniltio, piirimidiniltio i slično i njihovi derivati.

"Acil" se odnosi na -C(0)-R" grupu, gde se R" bira iz grupe koju čine vodonik, niži alkil, trihalometil, cikloalkil, aril opciono supstituisan sa jednim ili više, poželjno jedan, dva ili tri supstituenta koji se biraju iz grupe koju čine niži alkil, trihalometil, niži alkoksi, halo i -NR<18>R19grupe, heteroaril (vezan preko atoma ugljenika u prstenu) opciono supstituisan sa jednim ili više, poželjno jednim, dva ili tri supstituenta koji se biraju iz grupe koju čine niži alkil, trihaloalkil, niži alkoksi, halo i -NR18R<19>grupe, i heteroaliciklični (vezan preko atoma ugljenika u prstenu), opciono supstituisan sa jednim ili više, poželjno jednim, dva ili tri supstituenta koji se biraju iz grupe koju čine niži alkil, trihaloalkil, niži alkoksi, halo i -NR18R19grupe. Reprezentativne acil grupe su, ali bez ograničavanja, acetil, trifluoroacetil, benzoil i slično.

"Aldehid" se odnosi na acil grupu u kojoj je R" vodonik.

TioacH" se odnosi na -C(S)-R" grupu, gde je R" definisano gore.

"Estar" se odnosi na -C(0)0-R" grupu, gde je R" definisano gore, izuzev što R" ne može biti vodonik.

"Acetil" grupa se odnosi na -C(0)CH3grupu.

"Halo" grupa se odnosi na fluor, hlor, brom ili jod, poželjno fluor ili hlor.

"Trihalometil" grupa se odnosi na -CXa grupu, gde je X halo grupa definisana gore.

"Trihalometansulfonil" grupa se odnosi na X3CS(=0)2-grupu, gde je X definisano gore.

"Cijano" se odnosi na - C=N grupu.

"Metilendioksi" se odnosi na -OChbO-grupu, gde su atomi kiseonika vezani za susedne atome ugljenika.

"Etilendioksi" se odnosi na -OCHkChbO-grupu, gde su atomi kiseonika vezani za susedne atome ugljenika.

"S-sulfonamido" se odnosi na -S(0)2NR<18>R<19>grupu, gde su R<18>i R19definisani gore.

"N-sulfonamido" se odnosi na -NR<18>S(0)2R<19>grupu, gde su R<18>i R19definisani gore.

"O-karbamil" se odnosi na -OC(0)NR<18>R<19>grupu, gde su R18iR19definisani gore.

"N-karbamil" se odnosi na -R<18>OC(0)NR<19>grupu, gde su R<18>i R19definisani gore.

"O-tiokarbamil" se odnosi na -OC(S)NR<18>R<19>grupu, gde su R18iR19definisani gore.

"N-tiokarbamil" se odnosi na -R<18>OC(S)NR<19>grupu, gde su R<18>i R19definisani gore.

"Amino" se odnosi na-NR18R<19>grupu,<g>de suR18i R<19>oba vodonik.

"C-amido" se odnosi na -C(0)NR18R<19>grupu, gde suR18i R<19>definisani gore.

"N-amido" se odnosi na -R<18>C(0)NR<19>grupu,<g>de suR18i R<19>definisani gore.

"Nitro" se odnosi na -NO2grupu.

"Haloalkil" označava alkil, poželjno niži alkil definisan gore, koji je supstituisan sa jednim ili više istih ili različitih halo atoma, npr. -CH2CI, -CF3, -CH2CF3, -CH2CCI3i slično.

"Aralkil" označava alkil, poželjno niži alkil, definisan gore, koji je supstituisan sa aril grupom, dfinisanom gore, npr. -CH2fenil, -(CH2)2fenil, -(CH2)3fenil, CH3CH(CH3)CH2fenil i slično, i njihovi derivati.

"Heteroaralkil" grupa označava alkil, poželjno niži alkil kako je definisan gore, supstituisan sa heteroaril grupom, npr. -CH2piridinil, -(CH2)2pirimidinil,

-(CH2)3imidazolil i slično, i njihove derivate.

"Monoalkilamino" označava radikal -NHR, gde je R nesupstituisana alkil ili cikloalkil grupa, definisana gore, npr. metilamino, (l-metiletil)amino, cikloheksilamino i slično.

"Dialkilamino" označava radikal -NRR, gde je svaki R nezavisno, nesupstituisana alkil ili cikloalkil grupa, definisana gore, npr. dimetilamino, dietilamino, (1-metiletil)-etilamino, cikloheksilmetilamino, ciklopentilmetilamino i slično.

"Cijanoalkil" označava alkil, poželjno niži alkil, kao što je definisan gore, koji je supstituisan sa 1 ili 2 cijano grupe.

"Opcioni" ili "opciono" označava da se naknadno opisani događaj ili situacija može, ali ne mora da odigra, i da opis obuhvata primere u kojima se taj događaj ili situacija odigrava i primere u kojima se ne odigrava. Na primer, "heterociklična grupa opciono supstituisana sa alkil grupom" znači da alkil može, ali da ne mora biti prisutan, a taj opis obuhvata i situacije u kojima je heterociklična grupa supstituisana sa alkil grupom i situacije u kojima heterociklo grupa nije supstituisana sa alkil grupom.

Nazivi "2-indolinon", "indolin-2-on" i "2-oksindol" se koriste smenjujući se da označe ovde molekul koji ima hemijsku strukturu:

Naziv pirol se odnosi na molekul koji ima hemijsku strukturu:

Naziv "pirolom supstituisan 2-indolinon" i "3-pirolidenil-2-indolion" se koriste smenjujući se, da označe hemijsko jedinjenje koje ima opštu strukturu pokazanu formulom (I).

Jedinjenja koja imaju istu molekulsku formulu, ali se razlikuju po prirodi ili sekvenciji vezivanja njihovih atoma, ili rasporedu atoma u prostoru, se nazivaju "izomerima". Izomeri koji se razlikuju po rasporedu njihovih atoma u prostoru nazivaju se "stereoizomerima".

Stereoizomeri koji nisu jedan prema drugom kao predmet i lik u ogledalu, nazivaju se "dijasteromerima", a oni čiji se likovi u ogledalu ne mogu preklopiti jedan sa drugim, nazivaju se "enantiomerima". Kada jedinjenja imaju asimetrični centar, na primer, koji je vezan za četiri različite grupe, moguć je par enantiomera. Enantiomer može da karakteriše apsolutna konfiguracija njegovog asimetričnog centra, a opisuje se pravilima R- i S-sekvencioniranja, koja su dali Cahn i Prelog, ili načinom kako kako molekul rotira ravan polarizovanog svetla, pa se opisuju kao desnogire ili levogire (tj. kao (+)- ili (-)-izomeri, respektivno). Hiralno jedinjenje može da postoji ili kao pojedinačni enantiomer ili kao njihova smeša. Smeša koja sadrži iste proporcije enantiomera naziva se "racemska smeša".

Jedinjenja iz ovog pronalaska mogu da poseduju jedan ili više asimetričnih centara, pa takva jedinjenja mogu da se dobiju kao pojedinačni (R)- ili (S)-stereoizomeri, ili kao njihove smeše. Na primer, ako je suptituent R<6>u jedinjenju formule (I) 2-hidroksietil, tada je ugljenik za koji je vezana hidroksilna grupa asimetrični centar, pa stoga jedinjenje formule (I) može postojati kao (R)- ili (S)-stereoizomer. Ukoliko se drugačije ne naznači, opis ili naziv pojedinog jedinjenja u ovoj prijavi i zahtevima obuhvata i pojedinačne enantiomere i njihove smeše, racemske ili druge. Postupci određivanja stereohemije i razdvajanje stereoizomera su dobro poznati u stanju tehnike (videti, diskusiju u 4. glavi publikacije "Advanced Organic Chemistrv", 4. izdanje, J. March, John Wiley, New York, 1992).

Jedinjenja iz ovog pronalaska mogu da pokazuju fenomen tautomerije i strukturne izomerije. Na primer, jedinjenja formule (I), koja su ovde opisana, mogu biti E ili Z konfiguracije u odnosu na dvogubu vezu koja spaja 2-indolinonska ostatka u pirolovom ostatku, ili oni mogu biti smeša E i Z. Ovaj pronalazak obuhvata bilo koji tautomerni ili strukturno izomerni oblik ili njegovu smešu, koji poseduje sposobnost da modulira aktivnost RTK, CTK i/ili STK, i nije ograničen bilo kojim tautomernim ili strukturno izomemim oblikom.

"Farmaceutski preparat" se odnosi na smešu jednog ili više jedinjenja koja su ovde opisana, ili njihovih fiziološki/farmaceutski prihvatljivih soli ili prolekova, sa drugim hemijskim jedinjenjima, kao što su fiziološki/farmaceutski prihvatljivi nosači i dodaci. Svrha farmaceutskog preparata je olakšavanje ordiniranja nekog jedinjenja u organizam.

Jedinjenja iz ovog pronalaska mogu takođe da dejstvuju kao prolek. "Prolek" se odnosi na agens koji se konvertuje u polazno jedinjenjain vivo.Prolekovi se često koriste, zato što u nekim situacijama, može biti lakše da se ordiniraju oni umesto polaznog leka. Na primer, oni mogu da da budu bioupotrebljivi za oralno ordiniranje, dok to polazni lek nije. Prolek može takođe da ima poboljšanu rastvorljivost u farmaceutskim preparatima, u odnosu na polazni lek. Primer proleka, bez ograničenja, bilo bi jedinjenje iz ovog pronalaska koje se ordinira kao estar ("prolek"), kako bi se olakšao prolaz kroz ćelijsku membranu, gde je rastvorljivost u vodi štetna po pokretljivost, ali kada se jedanput nađe unutar ćelije, tada metabolički hidrolizuje u karboksilnu kiselinu i aktivni ostatak; rastvorljivost u vodi je korisna.

Sledeći primer proleka može biti kratki polipeptid, na primer, ali bez ograničavanja, polipeptid sa 2-10 aminokiselina, povezan preko krajnje amino grupe za karboksi grupu jedinjenja iz ovog pronalaska, a kada polipeptid hidrolizuje ili se metabolišein vivo,oslobađa aktivni molekul. Prolekovi jedinjenja formule (I) su unutar obima ovog pronalaska.

Pored toga, podrazumeva se da će jedinjenje formule (I) biti metabolisano enzimima u telu organizma, kao što je humano biće, generišući metabolit koji može da moduliše aktivnost protein kinaze. Ovakvi metaboliti su unutar obima ovog pronalaska.

Naziv "fiziološki/farmaceutski prihvatljiv nosač" se odnosi na nosač ili razblaživač koji ne izaziva značajnu iritaciju organizma i ne poništava biološku aktivnost i svojstva ordiniranog jedinjenja.

"Farmaceutski prihvatljiv dodatak" se odnosi na inertnu supstancu dodatu farmaceutskom preparatu da olakša ordiniranje jedinjenja. Primeri dodataka, ali bez ograničavanja, su kalcijum-karbonat, kalcijum-fosfat, razni šećeri i vrste škroba, derivati celuloze, biljna ulja i polietilenglikoli.

Naziv "farmaceutski prihvatljiva so", kako se ovde koristi, odnosi se na one soli koje zadržavaju biološku efikasnost i svojstva polaznog jedinjenja. Takve soli su: (i) kisela adiciona so, dobijena reakcijom slobodne baze polaznog jedinjenja sa neorganskim kiselinama, kao što su hlorovodonična kiselina, bromovodonična kiselina, azotna kiselina, fosforna kiselina, sumporna kiselina i perhlorna kiselina, i slično, ili sa organskim kiselinama, kao što su oksalna kiselina, (D) ili (L)-jabučna kiselina, maleinska kiselina, metansulfonska kiselina, etansulfonska kiselina, p-toluensulfonska kiselina, salicilna kiselina, vinska kiselina, limunska kiselina, ćilibarna kiselina ili malonska kiselina i slično, poželjno hlorovodonična kiselina ili (L)-jabučna kiselina, kao što je L-malatna so 5-(5-fluoro-2-okso-1,2-dihidroinfol-3-ilidenmetil)-2,4-dimetil-1 H-pirol-3-karboksilna kiselina (2-dietilaminoetil)amid; ili (ii) soli formirane kada se kiseli deo prisutan u polaznom jedinjenju ili zameni sa jonom metala, npr. jonom alkalnog metala, ili jonom zemnoalkalnog metala; ili se koordinira sa organskom bazom. Primeri jona su aluminijum, kalcijum, litijum, magnezijum, kalijum, natrijum i cink, u njihovim uobičajenim valencama. Poželjne organske baze su protonizovani tercijarni amini i kvatemerni amonijumovi katjoni, uključujući delom, trimetilamin, dietilamin, N,N'-dibenziletilendiamin, hloroprokain, holin, dietanolamin, etilendiamin, meglumin (N-metilglukamin) i prokain.

"Postupak" se odnosi na načine, sredstva, tehnike i procedure za ostvarivanje datog zadatka, ali nisu ograničeni načinima, sredstvima, tehnikama i

procedurama koje su ili poznate ili se lako razvijaju iz poznatih načina, sredstava, tehnika i procedura, od strane onih koji ih upražnjavaju u hemijskom, farmaceutskom, biološkom, biohemijskom i medicinskom stanju tehnike.

"Tretirati", "tretiranje" i "tretman" se odnose na postupak, dejstvo, primenu, terapiju i slično, gde je sisar, uključujući humano biće, predmet medicinske pomoći sa ciljem poboljšanja stanja tog sisara, direktno ili indirektno. Naročito u pogledu kancera, ovi nazivi jednostavno znače da očekivanje trajanja života pojedinca zahvaćenog kancerom može da se poveća, ili da se umanji jedan ili više simptoma bolesti. Ovo se može pratiti preko odlaganja pojave primarnih ili sekundarnih tumora, usporenom ili umanjenom oštrinom sekundarnih efekata bolesti, zaustavljanjem rasta tumora i regresije tumora, između ostalog.

Naziv "prevencija" obuhvata ili sprečavanje pojave klinički evidentnog neoplazma, zajedno sa sprečavanjem pojave predklinički očiglednog stupnja neoplazije kod pojedinaca. Namera je takođe, da se ovom definicijom obuhvati i prevencija začinjanja malignih ćelija i da se zaustavi ili povrati napredovanje premalignih ćelija u maligne ćelije. Ovo obuhvata profilaktički tretman onih koji su ugroženi razvijanjem neoplazma.

Fraza "terapeutski efikasan", namera je da kvalifikuje količinu svakog agensa kojom se kao cilj postiže poboljšanje u ozbiljnosti bolesti neoplazma i u učestanosti bolesti neoplazma u odnosu na tretman samostalno sa svakim agensom, izbegavajući pri tome štetne efekte, koji su tipično povezani sa alternativnim terapijama.

"Terapeutski efekaf ili "terapeutski efikasna količina", namera je da kvalifikuje količinu agensa protiv kancera potrebnu da u nekoj meri ublaži jedan ili više simptoma neoplazma kao poremećaja, uključujući, ali bez ograničavanja: 1) smanjenje broja ćelija kancera; 2) smanjenje veličine tumora; 3) inhibiciju (tj. usporavanje do izvesne mere, poželjno zaustavljanje) metastaze tumora; 4)

inhibiciju do izvesne mere rasta tumora; 5) ublažavanje ili smanjenje do izvesne mere jednog ili više simptoma povezanih sa tim poremećajem; i/ili 6) ublažavanje ili umanjenje sporednih efekata povezanih sa ordiniranjem agenasa protiv kancera.

Fraza "kombinovana terapija" (ili "ko-terapija")obuhvata ordiniranje inhibitora protein kinaze i inhibitora ciklooksigenaze-2, kao deo specifičnog režima tretmana namenjenog obezbeđivanju blagotvornih efekata usled sadejstva ovih terapeutskih agenasa. Blagotvorni efekat ove kombinacije obuhvata, ali bez ograničavanja, farmakokinetičko ili farmakodinamičko sadejstvo koje proističe iz kombinacije terapeutskih agenasa. Ordiniranje ovih terapeutskih agenasa u kombinaciji tipično se obavlja tokom defmisanog perioda vremena (obično, minuti, sati, dani ili nedelje, zavisno od odabrane kombinacije). Obično nije namera da "kombinovana terapija" obuhvati ordiniranje dva ili više ovih terapeutskih agenasa kao deo posebnog režima monoterapije koji slučajno ili arbitrarno dovodi do kombinacija iz ovog pronalaska. Namera je da "kombinovana terapija" obuhvati ordiniranje ovih terapeutskih agenasa na sekvencijalni način, tj. da se svaki terapeutski agens ordinira u različito vreme, kao i ordiniranje ovih terapeutskih agenasa, ili najmanje dva od ovih terapeutskih agenasa, suštinski paralelnim načinom. Suštinski paralelno ordiniranje se može sprovesti, na primer, ordiniranjem osobi jedne kapsule koja ima fiksiran odnos svakog od terapeutskih agenasa ili u više pojedinačnih kapsula, svaka kapsula za jedan od terapeutskih agenasa. Sekvencijalno ili suštinski paralelno ordiniranje svakog od terapeutskih agenasa se može ostvariti bilo kojim od odgovarajućih puteva, uključujući, ali bez ograničavanja, oralne puteve, intravenozne puteve, intramuskularne puteve i direktnu absorpciju kroz sluzokožu membranskog tkiva. Ovi terapeutski agensi se mogu ordinirati istim ili različitim putevima. Na primer, prvi terapeutski agens odabrane kombinacije može se ordinirati intravenoznom injekcijom, dok se drugi terapeutski agens ove kombinacije može ordinirati oralno. Alternativno, oba terapeutska gensa se mogu ordinirati na primer oralno, ili se oba terapeutska agensa mogu ordinirati intravenoznom injekcijom. Redosled po kome će se ordinirati ovi terapeutski agensi nije naročito kritičan. "Kombinovana terapija" može takođe da obuhvati ordiniranje terapeutskih agenasa opisanih gore, u dodatnoj kombinaciji sa drugim biološki aktivnim sastojcima (kao što su, ali bez ograničavanja, drugi i različiti agensi protiv neoplazme) i terapije koje pre predstavljaju lekovitu supstancu (kao što je hidrurški ili radijacioni tretman). Ukoliko kombinovana terapija obuhvata još i i radijacioni tretman, ovaj radijacioni tretman se može voditi u bilo koje pogodno vreme, sve dok se postiže blagotvoran efekat sadejstva kombinacije terapeutskih agenasa i radijadonog tretmana. Na primer, u odgovaraju«m slučajevima se blagotvorni efekat postiže kada se radijadoni tretman privremeno odvoji od ordiniranja ovih terapeutskih agenasa, možda za nekoliko dana ili čak nedelja.

"Adjunktivna terapija" obuhvata tretman osobe sa agensima koji umanjuju ili izbegavaju sporedne efekte povezane sa kombinovanom terapijom iz ovog pronalaska, uključujući, ali bez ograničavanja, one agense koji, na primer, smanjuju toksične efekte lekova protiv kancera, npr. inhibitore resorpdje kosti, agensi koji štite srce; sprečavaju ili umanjuju pojavu mučnine i povraćanja, koji su povezani sa hemoterapijom, radioterapijom ili operadjom; ili umanjuju pojavu infekcije, povezane sa ordiniranjem mijelosupresivnih lekova protiv kancera.

lako je u prethodnom odeljku data najšira definidja ovog Pronalaska, neka jedinjenja formule (I), (II) i (III), koja se daju niže, su poželjna u ovom pronalasku.

A. Inhibitor protein tirozin kinaze - iedinienia formule(\ Y .

(1) Poželjna je grupa jedinjenja formule (I) u kojima suR<1>,R<3>iR<4>vodonik. (2) Sledeća poželjna grupa jedinjenja formule (I) je ona u kojoj su R1,R2i R<4>vodonik. (3) Sledeća poželjna grupa jedinjenja formule (I) je ona u kojoj suR<1>, R<2>iR<3>vodonik. (4) Sledeća poželjna grupa jedinjenja formule (I) je ona u kojoj suR<2>, R<3>iR<4>vodonik. (5) Sledeća poželjna grupa jedinjenja formule (I) je ona u kojoj su R1, R<2>,R<3>i R4 vodonik. (6) Još jedna poželjna grupa jedinjenja formule (I) je ona u kojoj R<5>,R<6>iR7, poželjnoR<5>iliR6, poželjnije R<6>, predstavlja -COR<10>, gde jeR10-NR<11>(CH2)nR<12>, gde su: R<11>je vodonik ili niži alkil, poželjno vodonik ili metil;

n je 2, 3 ili 4, poželjno 2 ili 3; i

R<12>je -NR<13>R<14>, gde su R13 i R14 svaki nezavisno, alkil, poželjnije niži alkil, ili se R<13>iR14kombinuju formirajući grupu koja se bira između: -(CH2)4-, -(CH2)5-, -(CH2)2-0-(CH2)2- ili -(CH2)2N(CH3)(CH2)2-, poželjno je da suR13i R<14>, nezavisno, vodonik, metil, etil, ili da se kombinuju formirajući morfolin-4-il, pirolidin-1-il, piperazin-1-il ili 4-metilpiperazin-1-il. Poželjnije je da su R<5>i R<6>u (6) gore, N-(2-dimetilaminoetil)aminokarbonil, N-(2-etilaminoetil)-N-metilaminokarbonil, N-(3-dimetilaminopropil)-aminokarbonil, N-(2-dietilaminoetil)aminokarbonil, N-(3-etilaminopropil)aminokarbonil, N-(3-dietilaminopropil)aminokarbonil, 3-pirolidin-1-il-propilaminokarbonil, 3-morfolin-4-ilpropilaminokarbonil, 2-pirolidin-1-iletilaminokarbonil, 2-morfolin-4-iletilaminokarbonil, 2-(4-metilpiperazin-1 -l)etilaminokarbonil, 2-(4-metilpiperazin-1 -il)propil-aminokarbonil, 2-(3,5-dimetilpiperazin-1-il)etilaminokarbonil ili 2-(3,5-dimetil-piperazin-1-il)propilaminokarbonil, a još poželjnije N-(2-dietilaminoetil)aminokarbonil ili N-(2-etilaminoetil)aminokarbonil. (7) Još jedna poželjna grupa jedinjenja formule (I) su ona u kojima R<5>, R<6>iliR<7>, poželjno R<5>iliR6, poželjnijeR6, predstavlja -COR<10>, gde j<e>R<10>-NR<13>R<14>, gde su R<13>je vodonik, a R14 je alkil, poželjno niži alkil, supstituisan sa hidroksi, aril, heteroaril, heterociklil ili karboksi, poželjnije metil, etil, propil ili butil, supstituisan sa hidroksi, aril, heterociklil, kao što je piperidin piperazin, morfolin i slično, heteroaril ili karboksi. Još je poželjnije da unutar ove grupe (7), R<5>ili R<6>predstavljaju 2-etoksikarbonilmetil-aminokarbonil, karboksimetilaminokarbonil, 3-hidroksipropil-aminokarbonil, 2-hidroksietilaminokarbonil, 3-triazin-1-ilpropil-aminokarbonil, triazin-1-iletilaminokarbonil, 4-hidroksi-feniletilaminokarbonil, 3-imidazol-1-ilpropilaminokarbonil, piridin-4-ilmetilaminokarbonil, 2-piridin-2-iletilaminokarbonil ili 2-imidazol-1-iletilaminokarbonil.

(8) Još jedna poželjna grupa jedinjenja formule (I) su ona ukojima R<5>, R<6>iliR<7>, poželjno R<5>iliR<6>, poželjnijeR6, predstavlja -COR10, gde je R<10>

-NR<11>(CH2)nR<12>, gde su:

R<11>je vodonik ili niži alkil, poželjno vodonik ili metil;

n je 2, 3 ili 4, poželjno 2 ili 3; i

R<12>je -NR13R<14>, gde seR13i R<14>kombinuju formirajući heterocikl, poželjno 5-, 6- ili 7-člani heterocikl koji sadrži karbonilnu grupu i 1 ili 2 atoma azota. Poželjno je da R<5>ili R<6>predstavlja 2-(3-etoksikarbonilmetil-piperazin-1 -il)etilaminokarbonil, 2-(3-oksopiperazin-1 -il)etilaminokarbonil, 2-(imidazolidin-1 -il-2-on)eilaminokarbonil, 2-(tetrahidropiirmidin-1 -il-2-on)etilaminokarbonil, 2-(2-oksopirolidin-1 -il)-etilaminokarbonil, 3-(4-metilpiperazin-1-il)-propilaminokarbonil, 3-(3-etoksikarbonilmetilpiperazin-1 -il)-propilaminokarbonil, 3-(3-oksipiperazin-1 -il)propilaminokarbonil, 3-(imidazolidin-1-il-2-on)propilaminokarbonil, 3-(tetrahidropirimidin-1-il-2-on)propilaminokarbonil, 3-(2-oksopirolidin-1 -il)propilaminokarbonil, 2-(2-oksohomopiperidin-1 -il)etilaminokarbonil ili 3-(2-oksohomopiperidin-1-il)propilaminokarbonil.

(9) Još jedna poželjna grupa jedinjenja formule (I) je ona u kojoj R<5>,R<6>ili R7 poželjnoR<5>iliR6, poželjnijeR6, predstavlja -COR<10>, gde

(a)R1<0>predstavlja-NR<11>(CH2)nR12, gde su:

R<11>je vodonik ili niži alkil, poželjno vodonik ili metil;

n je 2, 3 ili 4, poželjno 2 ili 3; i

R<12>je -NR13R<14>, gde je R<13>vodonik, a R<14>je cijanoalkil ili -NHC0R<3>,

gde je Ra alkil; ili

(b)R1<0>predstavlja -NR13R14, gde se R<13>i R<14>zajedno kombinuju formirajući heterocikl koji ne sadrži karbonilnu grupu unutar prstena. Poželjno je da R<5>ili R<6>predstavljaju 2-(2-cijanoetilami no)etilami nokarboni 1, 2-(acetilami no)etilami no-karbonil, morflolinokarbonil, piperidin-1-il-karbonil, 2-tijanometilaminoetilamino-karbonil ili piridin-1-ilkarbonil. (10) Još jedna poželjna grupa jedinjenja formule (I) je ona u kojoj R<5>predstavlja -COR<10>, gde je R<10>-NR<13>R<14>, gde je R13 vodonik, a R<14>je niži alkil, supstituisan sa hidroksi, niži alkil supstituisan sa hidroksilamino, karboksi ili -NR<18>R<19>, gde su R<18>i R<19>, svaki nezavisno, vodonik ili niži alkil, poželjnije je da R<5>predstavlja 2-[(dietilamino)-2-hidroksietil]aminokarbonil, 2-(N-etil-N-2-hidroksietilamino)etilaminokarbonil, karboksimetilaminokarbonil ili 2-(2-hidroksi-etilamino)etilaminokarbonil. (11) Još jedna poželjna grupa jedinjenja formule (I) je ona u kojoj R<6>predstavlja -COR<10>, gde je R<10>-NR<13>R<14>, gde je R<13>vodonik, a R<14>je niži alkil, supstituisan sa hidroksi, niži alkil supstituisan sa hidroksilamino, karboksi ili -NR18R19 gde su R<18>i R<19>, svaki nezavisno, vodonik ili niži alkil, poželjnije je da R<s>predstavlja 2-[(dietilamino)-2-hidroksietil]aminokarbonil, 2-(N-etil-N-2-hidroksietilamino)etilaminokarbonil, karboksimetilaminokarbonil ili 2-(2-hidroksi-etilamino)etilaminokarbonil. (12) Još jedna poželjna grupa jedinjenja formule (I) je ona u kojoj R<5>predstavlja -COR<10>, gde je R<10>-NR<11>(CH2)nR<12>, gde je R<12>-N<+>(0")NR<13>R<14>ili -N(OH)R<13>, gde seR13i R<14>, nezavisno, biraju iz grupe koju čine vodonik i niži alkil, poželjno je da R5 predstavlja 2-(N-hidroksi-N-etilamino)-etilaminokarbonil ili 2-[N<+>(0<->)(C2H5)2]etilaminokarbonil. (13) Još jedna poželjna grupa jedinjenja formule (I) je ona u kojoj R<6>predstavlja -COR<10>, gde j<e>R<10>-NR<11>(CH2)nR<12>, gde je R<12>-N+(0)NR13R14 ili -N(OH)R1<3>, gde se R<13>i R<14>, ne<z>avisno, biraju iz grupe koju čine vodonik i niži alkil, poželjno je da R6 predstavlja 2-(N-hidroksi-N-etilamino)-etilaminokarbonil ili 2-[N<+>(0<->)(C2H5)2]etilaminokarbonil. (14) U gornjim poželjnim grupama (6)-(13), kadaR<5>predstavlja -COR<10>, tada je poželjnija grupa jedinjenja ona u kojoj se: R<6>bira iz grupe koju čine vodonik i alkil, poželjno vodonik, metil, etil, izopropil, terc-butil, izobutil ili n-butil, poželjnije vodonik ili metil; i

R<7>se bira iz grupe koju čine vodonik, alkil, aril, heteroaril i -C(0)R<17>, gde je R<17>hidroksi, alkil ili aril, poželjnije vodonik, metil, etil, izopropil, n-izo- ili terc-butil, benzoil, acetil ili karboksi, a još požejnije metil, vodonik ili fenil.

(15) U gornjim poželjnim grupama (6)-(13), kada R<5>predstavlja -COR<10>, tada je sledeća poželjnija grupa jedinjenja ona u kojoj se R<6>i R<7>kombinuju formirajući

-(CH2)4-.

(16) U gornjim poželjnim grupama (6)-(13), kada R<5>predstavlja -COR10,tada je poželjnija grupa jedinjenja ona u kojoj su: R<5>se bira iz grupe koju čine vodonik i alkil, poželjno vodonik, metil, etil, izopropil, terc-butil, izobutil ili n-butil, poželjnije vodonik ili metil; i

R<6>se bira iz grupe koju čine vodonik, alkil, aril, heteroaril i -C(0)R17 gde je R<17>hidroksi, alkil ili aril, poželjnije vodonik, metil, etil, izopropil, n-, izo- ili terc-butil, fenil, benzoil, acetil ili karboksi, a još poželjnije metil, vodonik ili fenil. (17) Unutar gornjih poželjnih i poželjnijih grupa (6)-(16), još poželjnija grupa jedinjenja je ona u kojoj su: R<1>je vodonik, alkil, -C(0)NR<8>R<9>, cikloalkil ili aril, poželjno vodonik, fenil, 3,4-dimetoksifenilaminokarbonil, 4-metoksi-3-hlorofenilaminokarbonil, a još poželjnije vodonik ili metil, i najpoželjniji vodonik;

R<2>je cijano, vodonik, halo, niži alkoksi, aril ili -S(0)2NR<1>3R14, gdej<e>R<13>vodonik, a R<14>je vodonik, aril ili alkil, poželjno je da je R<2>vodonik, hloro, bromo, fluoro, metoksi, etoksi, fenil, dimetilaminosulfonil, 3-hlorofenilaminosulfonil, karboksi, metoksi, aminosulfonil, metilaminosulfonil, fenilaminosulfonil, piridn-3-il-aminosulfonil, dimetilaminosulfonil, izopropilaminosulfonil, poželjnije vodonik, fluoro ili bromo;

R<3>se bira iz grupe koju čine vodonik, niži alkoksi, -C(0)R<15>, -NR<13>C(0)R<14>, aril, poželjno aril opciono supstituisan sa jednim ili dva supstituenta koji se biraju iz grupe koju čine niži alkil, halo ili niži alkoksi i heteroaril, poželjno heteroaril opciono supstituisan sa jednim ili dva supstituenta koji se biraju iz grupe koju čine niži alkil, halo ili niži alkoksi; poželjno vodonik, metoksi, karboksi, fenil, piridin-3-il, 3,4-dihlorofenil, 2-metoksi-5-izopropilfenil, 4-n-butilfenil, 3-izopropilfenil, poželjnije vodonik ili fenil; i

R<4>je vodonik.

(18) Sledeća poželjnija grupa jedinjenja formule (I) je ona u kojoj su:

R<1>je vodonik, alkil, -C(0)NR<8>R<9>, cikloalkil ili aril, poželjno vodonik, 3,4-dimetoksi-fenilaminokarbonil, 4-metoksi-3-hlorofenilaminokarbonil, još poželjnije vodonik ili metil, a naročito vodonik;

R<2>je cijano, vodonik, halo, niži alkoksi, aril ili -S(0)2NR<13>R<14>, gde je R<13>vodonik, a R<14>je vodonik, aril, poželjno je da je R<2>vodonik, hloro, bromo, fluoro, metoksi, etoksi, fenil, dimetilaminosulfonil, 3-hlorofenilaminosulfonil, karboksi, metoksi, aminosulfonil, metilaminosulfonil, fenilaminosulfonil, piridin-3-il-aminosulfonil, dimetilaminosulfonil, izopropilaminosulfonil, poželjnije vodonik, fluoro ili bromo;

R<3>se bira iz grupe koju čine vodonik, niži alkoksi, -C(0)R<15>, -NR<13>C(0)R<14>, aril, poželjno je daje aril supstituisan sa jedan ili dva supstituenta koji se biraju iz grupe koju čine, niži alkil, halo ili niži alkoksi, i heteroaril, poželjno heteroaril opciono supstituisan sa jedan ili dva supstituenta koji se biraju iz grupe koju čine niži alkil, halo ili niži alkoksi; poželjno vodonik, metoksi, karboksi, fenil, piridin-3-il, 3,4-dihlorofenil, 2-metoksi-5-izopropilfenil, 4-n-butilfenil, poželjnije vodonik i fenil; i

R<4>je vodonik.

Unutar gornje, poželjne grupe (18) poželjnija je grupa jedinjenja, gde su:

R<5>je -COR<10>, gde je R<10>definisano ranije, poželjno -NR<11>(CH2)nR<12>ili

-NR13R1<4>, koji su definiusani ranije.

R<6>se bira iz grupe koju čine vodonik i alkil, poželjno vodonik, metil, etil, izopropil, terc-butil, izobutil ili n-butil, poželjnije vodonik ili metil; i R<7>se bira iz grupe koju čine vodonik, alkil, aril, heteroaril i -C(0)R<17>, gde je R17 hidroksi, alkil ili aril, poželjnije vodonik, metil, etil, izopropil, n-, izo- ili terc-butil, fenil, benzoil, acetil ili karboksi, a još poželjnije metil, vodonik ili fenil.

U gornjoj poželjnoj grupi (18) poželjnija je grupa jedinjenja u kojoj su:

R<6>je -COR<10>, gde je R<10>definisano ranije, poželjno -NR<11>(CH2)nR<12>ili

-NR13R<14>, kao što su definisani ranije.

R<5>se bira iz grupe koju čine vodonik i alkil, poželjno vodonik, metil, etil, izopropil, terc-butil, izobutil ili n-butil, poželjnije vodonik ili metil; i

R<7>se bira iz grupe koju čine vodonik, alkil, aril, heteroaril i -C(0)R17, gde je R<17>hidroksi, alkil ili aril, poželjnije vodonik, metil, etil, izopropil, n-, izo- ili terc-butil, fenil, benzoil, acetil ili karboksi, a još poželjnije metil, vodonik ili fenil.

(19) Sledeća poželjnija grupa jedinjenja formule (I) su ona gde su:

R<1>iR<4>su vodonik;R<2>se bira iz grupe koju čine vodonik, halo, niži alkoksi, -C(0)R15i-S(0)2NR<13>R<14>;

R<3>se bira iz grupe koju čine vodonik, niži alkoksi, -C(0)R<15>, -S(0)2NR<13>R14, aril i heteroaril;

R<5>je -C(0)R<19>;

R<6>se bira iz grupe koju čine vodonik i niži alkil; i

R<7>se bira iz grupe koju čine vodonik, niži alkil i -C(0)R<17.>

Sledeća ovde poželjna realizacija ovog pronalaska je jedinjenje koje ima strukturu opisanu u (15):

R10 se bira iz grupe koju čine hidroksi, niži alkoksi i -NR<11>(CH2)nR<12>, gde su

n je 2 ili 3;

R<11>se bira iz grupe koju čine vodonik i niži alkil; i

R12se bira iz grupe koju čine aril i -NR13R14.

Dalje, ovde poželjna realizacija ovog pronalaska je jedinjenje koje ima strukturu opisanu u prethodna dva pasusa, gde se R<13>i R14nezavisno biraju iz grupe koju čine vodonik, niži alkil, a kombinovano -(CH2)4-, -(CH2)5-, -(CH2)20(CH2)2- ili

-(CH2)2N(CH3)(CH2)2-.

(20) sledeća ovde poželjna realizacija ovog pronalaska je jedinjenje gde su: R<1>se bira iz grupe koju čine vodonik, niži alkil, -(CH2)rR16 i -C(0)NR<8>R<9>; R<2>se bira iz grupe koju čine vodonik, halogen, aril i -S(0)2NR<13>R<14>; R<3>se bira iz grupe koju čine vodonik, niži alkil, niži alkoksi, aril, heteroaril i -C(0)R<15>;

R<4>je vodonik;

R<5>se bira iz grupe koju čine vodonik i niži alkil;

R<6>je -C(0)R<10>;

R 7 s/e bira iz grupe koju čine vodonik, niži alkil i aril;

R1<6>se bira iz grupe koju čine hidroksi i -C(0)R15;i

r je 2 ili 3.

Ovde poželjna realizacija ovog pronalaska je jedinjenjekoje ima strukturu opisanu u gornjem pasusu, gde je R<3>aril, opciono supstituisan sa jednom ili više grupa koje se biraju iz grupe koju čine niži alkil, niži alkoksi i halo.

(21) Slično, ovde poželjna realizacija ovog pronalaska je jedinjenje gde su:

R<1>se bira iz grupe koju čine vodonik, niži alkil, -(CH2)rR16 i-C(0)NR<8>R9;R<2>se bira iz grupe koju čine vodonik, halogen, aril i -S(0)2NR13R1<4>; R<3>se bira iz grupe koju čine vodonik, niži alkil, niži alkoksi, aril, heteroaril i -C(0)R<15>;

R<4>je vodonik;

R<5>se bira iz grupe koju čine vodonik i niži alkil;

R<6>je -C(0)R<10>;

R<7>se bira iz grupe koju čine vodonik, niži alkil i aril;

R1<6>se bira iz grupe koju čine hidroksi i -C(0)R15,i

r je 2 ili 3,

R1<0>se bira iz grupe koju čine hidroksi, niži alkoksi, -NR<13>R14i-NR<11>(CH2)nR<12>, gde je n 1,2 ili 3, R11 je vodonik, a R12 se bira iz grupe koju čine hidroksi, niži alkoksi, -C(0)R<15>, heteroaril i -NR13R14. (22) Sledeća ovde poželjna realizacija ovog pronalaska je jedinjenje koje ima strukturu opisanu u gornjem pasusu, gde seR13i R<14>nezavisno biraju iz grupe koju čine vodonik, niži alkil, heteroaril, a kombinovano -(CH2)4-, -(CH2)s-,

-(CH2)20(CH2)2- ili -(CH2)N(CH3)(CH2)2-.

(23) Sledeća ovde poželjna realizacija ovog pronalaska je jedinjenje gde su: R<1>je -C(0)NR8R<9>, gde je R<8>vodonik, a R<9>je aril opciono supstituisan sa jednom ili više grupa koje se biraju iz grupe koju čine halo, hidroksi i niži alkoksi;R<2>se bira iz grupe koju čine vodonik, halogen, aril i -S(0)2NR13R1<4>; R<3>se bira iz grupe koju čine vodonik, niži alkil, niži alkoksi, aril, heteroaril i -C(0)R<15>;

R<4>je vodonik;

R<5>se bira iz grupe koju čine vodonik i niži alkil;

R<6>je -C(0)R<10>;

R<7>se bira iz grupe koju čine vodonik, niži alkil i aril;

R<16>se bira iz grupe koju čine hidroksi i -C(0)R<15>; i

r je 2 ili 3.

(24) Još jedna ovde poželjna realizacija ovog pronalska je jedinjenje gde su: R<1>se bira iz grupe koju čine vodonik i niži alkil; R<2>se bira iz grupe koju one vodonik, halo, niži alkoksi, aril, -C(0)R<15>i -S(0)2NR<13>R14;

R<3>se bira iz grupe koju čine vodonik, halo, aril, heteroaril i -C(0)R<15>;

R<4>je vodonik;

R<5>je-C(0)R10;i

R<6>i R<7>kombinovano formiraju -(CH2)4- grupu.

U jedinjenjima koja imaju strukturu opisanu u gornjem pasusu, ovde poželjna je realizacija u kojoj se R<10>bira iz grupe koju čine hidroksi, alkoksi, -NR13R<14>i

-NH(CH2)nNR13R1<4>,gdej<e>n 2 ili 3.

Ovde je poželjna realizacija ovog pronalaska u kojoj jedinjenje ima strukturu opisanu u prethodna dva pasusa, gde se R<13>i R1<4>nezavisno biraju iz grupe koju čine vodonik, niži alkil, a kombinovano -(CH2)4-, -(CH2)5-, -(CH2)20(CH2)2- ili

-(CH2)N(CH3)(CH2)2-.

Reprezentaivna jedinjenja formule (I) su pokazana u Tabeli I, u nastavku.

Brojevi ovih jedinjenja odgovaraju brojevima primera u odeljku Primeri. To znači, sinteza Jedinjenja 1 u Tabeli 1 je opisana u Primeru 1. Jedinjenja prikazana u Tabeli 1 služe samo kao primeri i ne treba da se shvate da na bilo koji način ograničavaju obim ovog pronalaska. Dodatni inhibitori protein kinaze koji se mogu koristiti u ovom postupku su 3-(3,5-dimetilpirol-2-ilmetiliden)-2-indolinon (su 5416); 3-[3,5-dimetil-4-(2-karboksietil)pirol-2-ilmetiliden]-2-indolinon (su 6668) i 3-[3-(2-karboksietil)-5-metilpirol-2-ilmetiliden)-2-indolinon.

B. Selektivni inhibitori ciklooksiqenaze- 2 - iedinienia sa formulama ( II) i ( III)

Primeri bez ograničavanja inhibitora COX-2, koji se mogu koristiti u ovom pronalasku, identifikovani su u Tabelama II i III niže. Pirazoli se mogu dobiti postupcima koji su opisani u WO 95/15316. Pirazoli se mogu dobiti još i metodama koje su opisane u WO 95/15315. Pirazoli se mogu dobiti takođe i metodama koje su opisane u WO 95/00501. Pirazoli se mogu dobiti metodama koje su opisane u WO 96/03385. Analozi tiofena se mogu dobiti metodama koje su opisane u WO 95/00501. Dobijanje analoga tiofena opisano je takođe u WO 94/15932. Oksazoli se mogu dobiti po metodama koje se opisane u WO 95/00501. Dobijanje oksazola je opisano takođe u WO 94/27980. Izoksazoli se mogu dobiti metodama koje su opisane u WO 96/25405. Imidazoli se mogu dobiti po postupcima koji su opisani u WO 96/03388. Dobijanje imidazola je opisano takođe u WO 96/03387. Ciklopentenski inhibitori cklooksigenaze-2 se mogu dobiti postupcima koji su opisani u U.S. Patent No. 5,344,991. Dobijanje ciklopentanskih inhibitora Cox-2 opisano je takođe u WO 95/00501. Trifenilna jedinjenja se mogu dobiti po metodama koje su opisane u WO 96/16934. Tiazolska jedinjenja se mogu dobiti po metodama koje su opisane u WO 96/03392. Piridinska jedinjenja se mogu dobiti po metodama koje su opisane u WO 96/03392. Dobijanje piridinskih jedinjenja je opisano takođe u WO 96/24585.

Celecoxib koji se koristi u terapijskim kombinacijama iz sadašnjeg pronalaska, može se dobiti na način koji je opisan u U.S. Patent No. 5,466,823.

Valdecoxib, koji se koristi u terapijskim kombinacijama iz ovog pronalaska, može se dobiti na način opisan u U.S. Patent No. 5,633,272.

Parecoxib, koji se koristi u terapijskim kombinacijama iz ovog pronalaska, može se dobiti na način opisan u U.S. Patent No. 5,932,598.

Rofecoxib, koji se koristi u terapijskim kombinacijama iz ovog pronalaska, može se dobiti na način opisan u U.S. Patent No. 5,968,974.

JTE-522 iz Japan Tobako, koji se koristi u terapijskim kombinacijama iz ovog pronalaska, može se dobiti na način opisan u JP 90/52,882.

Lumiracoxib (Cox-189), koji se koristi u terapijskim kombinacijama iz ovog pronalaska, može se dobiti na način opisan u WO 99/11605.

Etoricoxib (MK 663), koji se koristi u terapijskim kombinacijama iz ovog pronalaska, može se dobiti na način opisan u WO 98/03484.

BMS 34070 iz Bristol Mevers Squibb-a, koji se koristi u terapijskim kombinacijama iz ovog pronalaska, može se dobiti na način opisan u U.S. Patent No. 6,180,651.

Citati navedeni u gornjim Tablicama II i III opisuju razne inhibitore COX-2, koji su pogodni za korišćenje u ovom pronalasku, i postupke za njihovu proizvodnju, pa su, svaki pojedinačno, ovde priključeni kroz citat.

Poželjni inhibitori COX-2 koji se mogu koristiti u ovom pronalasku su, ali bez ograničavanja:

C1)

JTE-522, 4-(4-cikloheksil-2-metiloksazol-5-il)-2-fluorobenzensulfonamid;

C2) 5-hloro-3-(4-(metilsultnil)fenil)-2-(metil-5-piridinil)piridin;

C3) 2-(3,5-difluorofenil)-3,4-(metilsulfonil)fenil-2-ciklopenten-1-on;

C4)

4-[5-(4-metilfenil)-3-(trifluorometil)-1H-pirazol-1-il]-benzensulfonamid; C5) Recoxib, 4-(4-metilsulfonil)fenil]-3-fenil-2(5H)-furanon; C6)

4-(5-metil-3-fenilizoksazol-4-il)benzensulfonamid;

C7)

N-[[4-(5-metil-3-fenilizoksazol-4-il)fenil]sulfonil]propanamid;

C8)

4-[5-(4-hlorofenil)-3-(trifluorometil)-1 H-pirazol-1-il]benzensulfonamid; C9) C10) C11)

6-[[5-(4-hlorobenzoil)-1,4-dimetil-1 H-2-il]metil]-3(2H)-piridazinon;

C12)

N-(4-nitro-2-fenoksifeni!)metansulfonamid; C13) C14) 3-(3,4-difluorofenoksi)-5,5<limetil-4-[4-(metilsulfonil)-2(5H)-furanon; C15) N-[6-(2,4-difluorofenil)tjo]-2,3-dihidro-1 -okso-1 H-indn-5-il]metansulfonamid; C16) 3-(4-hlorofenil)-4-[4-(metilsulfonil)fenil]-2(3H)-oksazolon; C17) 4-[3-(4-fIuorofenil)-2,3-dihidro-2-okso-4-oksazolil]benzensulfonamid; C18) 3-[4-(metansulfonil)fenil]-2-fenil-2-ciklopenten-1-on; C19) 4-(2-metil-4-fenil)-5-oksazolil)benzensulfonamid; C20) 3-(4-fluorofenil)-4-[4-(metilsulfonil)fenil]-2(3H)-oksazolon; C21) 5-(4-fluorofenil)-1-[4-(metilsulfonil)fenil]-3-(trifluorometil)-1 H-pirazol; C22) 4-[5-fenil)-3-(tirfluorometil)-1H-pirazol-1-il)benzensulfonamid; C23)

4-[1-fenil-3-(trifluorometil)-1H-pirazol-5-il]benzensulfonamid;

C24)

4-[5-(4-fluorofenil)-3-(tirfluorometil)-1H-pirazol-1-il]benzensulfonam C25) N-[2-(sikloheksiloksi)-4-nitrofenil]metansulfonamid; C26) N-[6-(2,4-difluorofenoksi)-2,3-dihidro-1-okso-1H-inden-5-i l]metzansulfonami d; C27) 3-(4-hlorofenoksi)-4-[(metilsulfonil)amino]benzensulfonamid; C28) 3-(4-fluorofenoksi)-4-[(metilsulfonil)amino]benzensulfonamid; C29) 3-[(1-metil-1H-imidazol-2-il)tio]-4-{(metilsulfonil)amino]benzensulfonamid; C30) 5,5-dimetil-4-[4-(metilsulfonil)fenil]-3-fenoksi-2(5H)-furanon; C31)

N-[6-[(4-etil-2-tiazolil)tio]-1,3-dihidro-1-okso-5-izobenzofuranil]-metansulfonamid;

C32)

3-[(2,4-dihlorofenil)tio]-4-[(metilsulfonil)amino]benzensulfonamid; C33) 1 -fluoro-4-[2-[4-(metilsulfonil)feniI]ciklopenten-1 -il]benzen; C34) 4-[5-(4-hlorofenil)-3-(diflurometil)-1H-pirazol-1-il]benzensulfonamid; C35) 3-[1-[4-(metilsulfonil)fenil]^-(trifluorometil)-1H-imidazol-2-il]piridin; C36) 4-[2-(3-piridinil)-4-(trifluorometil)-1H-imidazol-1-il]benzensulfonamid; C37) 4-[5-(hidroksimetil)-3-fenilizoksazol-4-il]benzensulfonamid; C38) 4-[3-(4-hlorofenil)-2,3-dihidro-2-okso-4-oksazolil]benzensulfonamid; C39) 4-[5-(difluorometil)-3-fenilizoksazol-4-il]benzensulfonamid; C40) [1,1 ',2', 1 "-terfenilH-sulfonamid; C41) 4-(metilsulfonil)-1,1,,2',1"-terfenil; C42) 4-(2-fenil-3-piridinil)benzensulfonamid; C43)

N-(2,3-dihidro-1,1-diokso-6-fenoksi-1,2-benzizotiazol-5-il)metansulfonamid; i

N-(3-formilamino)4-okso-6-fenoksMH-1-benzopiran-7-il]metansulfonamid; C45) C46)

C47)

C48) C49) Lumiracoxib(COX-189)

2-[(2-hloro-6-lfuorofenil)amino]-5-metilbenzensirćetna kiselina;

Me

C50) Etoricoxib(MK663)

S-hloro-e'-metil-a-^metilsulfoniOfenill^.S'-bipiridin;

C51) BMS 34070

Poželjniji inhibitori COX-2, koji se mogu koristiti u ovom pronalasku, biraju se iz grupe koju čine:

JTE-522,4-(4-cikloheksil-2-metiloksazol-5-il)-2-fluorobenzensulfonamid;

U)

5-hloro-3-(4-(metilsulfonil)fenil)-2-(metil-5-piridinil)piridin;

III)

2-(3,5-difluorofenil)-3,4-(metilsulfonil)fenil)-2-ciklopenten-1-on;

IV)

4-[5-(4-metilfenil)-3-(trifluorometil)-1H-pirazol-1-il]-benzensulfonamid; V)

Rofecoxib, 4-(4-(metilsulfonil)fenil]-3-fenil-2(5H)-furanon;

VI)

4-(5-metil-3-fenilizoksazol-4-il)benzensulfonamid;

VII)

N-[[4-(5-metil-3-fenilizokazol-4-il]fenil]sulfonil]propanamid;

VIII)

4-[5-(4-hlorofenil)-3-(trifluorometil)-1 H-pirazol-1 -il]benzensulfonamid; i IX) Lumiracoxib(COX-189)

2-[(2-hloro-6-lfuorofenil)amino]-5-metilbenzensirćetna kiselina.

Još poželjniji inhibitori COX-2, koji se mogu koristitiu ovom pronalasku su, ali bez ograničavanja, Celocoxib, Valdecoxib, Parecoxib, Rofecoxib, Lumiracoxib i Japan Tobacco JTE-522.

U kombinaciju iz ovog pronalaska uključeni su takođe i izomerni oblici, prolekovi i tautomeri opisanih jedinjenja i njihove farmaceutski prihvatljive soli. Ilustrativne farmaceutski prihvatljive soli se dobijaju iz mravlje, sirćetne, propionske, ćilibarne, glikolne, glukonske, mlečne, jabučne, vinske, limunske, askorbinske, glukuronske, maleinske, fumarne, piruvinske, aspartanske, glutaminske, benzoeve, antranilne, mezilinske, stearinske, salicilne, p-hidroksibenzoeve, fenilsirćetne, bademove, embonske (pamoinske), metansulfonske, etansulfonske, benzensulfonske, pantotenske, toluensulfonske, 2-hidroksietansulfonske, sulfanilne, cikloheksilaminosulfonske, algenske, b-hidroksibuteme, galaktarinske i galaktouronske kiseline.

Upotrebljivost

Jedinjenja iz ovog pronalaska su inhibitori protein kinaza (PK) i enzima ciklooksigenaze, a naročito enzima ciklooksigenaze-2, pa su stoga korisna za tretman kancera.

PK, čija se katalitaička aktivnost moduliše jedinjenjima formule (I) iz ovog pronalaska, su protein tirozin kinaze, kao što su receptorske tirozin kinaze (RTK), ćelijske tirozin kinaze (CTK) i serin-treonin kinaze (STK). Signal transdukcije koji je posredovan sa RTK inicira vanćelijska interakcija sa specifičnim faktorom rasta (ligandom), posle čega sledi dimerizacija receptora, prolazna stimulacija aktivnosti svojstvene protein tirozin kinaze i fosforilovanje. Tako se stvaraju mesta vezivanja sa molekulima za unutarćelijsku transdukciju signala i to dovodi do stvaranja kompleksa sa spektrom molekula za citoplazmičku signalizaciju, što olakšava odgovarajući ćelijski odgovor (npr. deljenje ćelije, metaboličke efekte na vanćelijsku sredinu, itd.). Videti Schlessinger i Ullrich,Neuron,1992, 9, 303-391.

Pokazano je da mesta fosforilovanja tirozina na receptorima faktora rasta funkcionišu kao mesta vezivanja visokog afiniteta za domene SH2 (src homologija) na molekulima za signalizaciju. Fant et al.,Cell,1992, 69, 413-423;Rnnm/ann otniMn/t~* nll Dini1 QQA" l A077"7_OTOR Cnnm;onnat ni r* nll1993, 72, 767-778 i Koch et al.,Science,1991, 252, 668-678. Identifikovano je nekoliko proteina unutarćelijskih substrata koji se povezuju sa RTK. Oni se mogu podeliti u dve glavne grupe: (1) substrati koji imaju katalitički domen, i (2) substrati kojima nedostaje katalitički domen, ali koji služe kao adapteri i povezuju se sa katalitički aktivnim molekulima. Songvang et al.,Cell,1993, 72, 767-778. Specifičnost interakcija između receptora i domena SH2 njihovih substrata određena je ostacima aminokiselina koje neposredno okružuju fosforilovani tirozinski ostatak. Razlike u afinitetima vezivanja između domena SH2 i sekvencija aminokiselina koje okružuju fosforilovane ostatke na određenim receptorima su konzistentne sa opaženim razlikama u profilima fosforilovanja njihovih substrata. Songvang et al,Cell,1993, 72, 767-778. Oba opažanja ukazuju da je funkcija svake RTK određena ne samo shemom njene ekspresije i pristupačnosti liganda, već takođe i skupom puteva silaznih signala transdukcije koje aktivira određeni receptor. Dakle, fosforilovanje obezbeđuje korak regulisanja koji određuje selektivnost puteva signalizacije angažovanih preko specifičnih receptora faktora rasta, kao i faktora diferencijacije receptora.

STK, koje su prvenstveno citosolne, deluju na unutrašnju biohemiju ćelije, često kao silazni odgovor na događanje sa PTK. STK su uključene u proces signalizacije koji inicira sintezu DNK i naknadnu mitozu, koja vodi proliferaciji ćelije.

Dakle, transdukcija signala PK dovodi, između ostalih odgovora, do proliferacije ćelije, diferencijacije, rasta i metabolizma. Abnormalna proliferacija ćelije može da dovede do širokog skupa poremećaja i bolesti, uključujući razvoj neoplazma, kao što je karcinom, sarkom, glioblastom i hemangiom, poremećaja kao što su leukemija, psorijaza, arterioskleroza, artritis i dijabetska retinopatija, kao i drugih poremećaja koji su povezani sa nekontrolisanom angiogenezom i/ili vaskulogenezom.

Precizno razumevanje mehanizma po kome jedinjenja iz ovog pronalaska inhibiraju PK nije potrebno da bi se primenjivao ovaj pronalazak. Međutim, iako se ovde ne vezuje za neki određeni mehanizam ili teoriju, smatra se da jedinjenja formule (I) stupaju u interakciju sa aminokiselinama u katalitičkoj oblsti PK. Tipično, PK poseduju dvokrilnu strukturu, gde izgleda da se ATP vezuje u procep između ova dva krila, u oblasti gde se aminokiseline zadržavaju između PK Smatra se da se inhibitori PK vezuju ne-kovalentnim interakcijama, kao što su vodonična veza, Vander Valsove sile i jonske interakcije, u istoj opštoj oblasti gde se ranije pomenuti ATP vezuje sa PK. Specifičnije, misli se da se 2-indolinonska komponenta jedinjenja formule (I) vezuje u opštem prostoru koji je normalno zauzet adeninskim prstenom ATP. Specifičnost određenog molekula prema određenoj PK može da proistekne kao rezultat dodatnih interakcija između raznih supstituenata na 2-indolinonskom jezgru i domena aminokiselina koji su specifični za određenu PK Dakle, različiti indolinonski supstituenti mogu da doprinesu preferenajalnom vezivanju za dređene PK. Svojstvo da se odabere jedinjenje koje je aktivno prema različitim mestima vezivanja ATP (ili drugog nukelotida), čini jedinjenja formule (I) korisnim za ciljano vezivanje bilo kog proteina na takvom mestu. Jedinjenja formule (I), koja su ovde opisana, pokazala su se korisnim u testovimain vitroprema takvim proteinima, kao i ispoljavanjem terapeutskih efekatain vivo,preko interakcija sa takvim proteinima.

Pored toga, jedinjenja formule (I) pružaju terapeutski pristup tretmanu mnogih vsrta čvrstih tumora, uključujući, ali bez ograničavanja, karcinome, sarkome, uključujući Kaposi-ev sarkom, eritroblastom, glioblastom, meningiom, astocitom, melanom i mioblastom. Tretman ili prevencija kancera tumora koji nisu čvrsti, kao što je leukemija, takođe se podrazumevaju ovim pronalaskom. Indikacijom mogu da se obuhvate, ali bez ograničavanja, kanceri mozga, kanceri bešike, kanceri jajnika, kanceri stomaka, kanceri pankreasa, kanceri debelog creva, kanceri krvi, kanceri pluća i kanceri kosti.

Sledeći primeri, bez ograničavanja, vrsta poremećaja povezanih sa neodgovarajućom aktivnosti PK, gde mogu biti od koristi jedinjenja iz ovog pronalaska su u prevenciji, tretiranju i izučavanju ćelijskih proliferativnih poremećaja, fibrotičkih poremećaja i metaboličkih poremećaja.

Ćelijski proliterativni poremećaji, koji se mogu sprečiti, tretirati ili dalje izučavati pomoću ovog pronalaska su kancer, proliferativni poremećaji krvnih sudova i proliferativni poremećaji mezangijalnih ćelija.

Proliferativni poremećaji krvnih sudova se odnose na poremećaje povezane sa abnormalnom vaskulogenezom (stvaranjem krvnih sudova) i angiogenezom (širenjem krvnih sudova), lako vaskulogeneza i angiogeneza igraju značajne uloge u mnogim normalnim fiziološkim procesima, kao što je embrionalni razvoj, svaranje korpus luteuma, zarastanje rana i regeneracija organa, oni takođe igraju ključnu ulogu u razvoju kancera, gde dovode do stvaranja novih kapilara, potrebnih za održavanje tumora u životu. Drugi primeri poremećaja proliferacije krvnih sudova su artritis, gde novi krvni sudovi preplavljuju zglob i uništavaju hrskavicu, i okulame bolesti, kao što je dijabetska retinopatija, gde nove kapilare u mrežnjači preplavljuju staklasto telo, krvare i izazivaju slepilo.

Identifikovano je da dve strukturno povezane RTK vezuju sa visokim afinitetom VEGF: receptor tirozina 1 nalik fms (fit-1) (Shibuva et al.,Oncogene,1990, U5U, 519-524; de Vries et al.,Science,1992, 255, 989-991) i receptor KDR/FLK-1, poznat takođe kao VEGF-R2. Objavljeno je da je faktor rasta vaskularnog endotelijuma (VEGF) jedan specifičan endotelijumski mitogen ćelije, sa aktivnošću kojain vitropromoviše endotelijumski rast ćelije. Ferara i Henzel,Biochem. Biophys. Res. Comm. 1989,161,851-858; Vaisman et al.,J. Biol. Chem.1990, 265, 19461-19566. Informacija, koja je izneta u američkoj patentnoj prijavi U.S. Ser. No. 08/193,829, 08/038,596 i 07/975,750, veoma sugeriše daje VEGF ne samo odgovoran sa proliferaciju endotelijuma ćelije, nego je takođe primarni regulator normalne i patološke angiogeneze. Videti uopšteno, Klagsburn i Soker,Current Biologv,1993, 3(10), 699-702; Houck et al.,J. Biol. Chem.1992,

267, 26031-26037.

Normalna vaskulogeneza i angiogeneza igra značajnu ulogu u raznim fiziološkim procesima, kao što su embrionalni razvoj, zarastanje rana, regeneracija organa i reproduktivni proces kod žena, kao što je razvoj folikula u korpusu luteumu za vreme ovulacije i rast placente u trudnoći. Folkman i Shing,J. Biolog. Chem.1992, 267(16). 10931-34. Nekontrolisana vaskulogeneza i/ili angiogeneza je povezana sa bolestima, kao što su dijabetes, kao i sa malignim čvrstim tumorima, čiji se rast oslanja na vaskularizaciju. Klagsbum i Soker,Curent Biology,1993, 3(10), 699-702; Folkham,J. Natl. Cancer Inst.1991, 82, 4-6; VVeidneretal.,NewEng. J. Med.1991, 324, 1-5.

Naslućena uloga VEGF u proliferaciji endotelijuma ćelije i migracija tokom angiogeneze i vaskulogeneze ukazuje na značajnu ulogu receptora KDR/FLK-1 u ovim procesima. Iz nekontrolisane angiogeneze mogu proizad bolesti, kao što je dijabetes melitus (Folkman, 198, uXlth Congress of Thrombosis and Haemostasis(urdn. Verstraeta et al.), str. 583-596, Leuven Universitv Press, Leuven) i artritis, kao i rast malignog tumora. Videti npr. Folkman,N. Eng. J. Med.1971, 285, 1182-1186. Receptori za koje se spedfično veže VEGF značajan su i snažan terapeutski dlj za regulisanje i modulisanje vaskulogeneze i/ili angiogeneze i niza ozbiljnih bolesti u koje je uključen ćelijski rast izazvan ovim procesima. Plovvman et al.,DN& P,1994, 7(6), 334-339. Određenije, visoko spedfična uloga receptora KDR/FLK-1 u neovaskularizadji, dni ga metom za terapeutski pristup u tretmanu kancera i drugih bolesti u koje je uključeno nekontrolisano formiranje krvnih sudova.

Tako, ovaj pronalazak daje jedinjenja koja su u stanju da regulišu i/ili modulišu transdukdju signala tirozin kinaze, uključujući transdukdju signala receptora KDR/FLK-1, kako bi se inhibirala ili unapredila angiogeneza i/ili vaskulogeneza, tj. jedinjenja koja inhibiraju, sprečavaju ili interferiraju sa signalom transdukovanim pomoću KDR/FLK-1, kada je aktiviran ligandima, kao što je VEGF. Mada se smatra da jedinjenja iz ovog pronalaska deluju na receptor ili drugu komponentu duž putanje transdukcije signala tirozin kinaze, oni takođe mogu da deluju direktno na ćelije tumora koje su rezultat nekontrolisane angiogeneze.

Mada se nomenklatura humanih i mišjih kopija generičkog receptora "flk-1" razlikuje, u mnogim pogledima one su uzajamno zamenjive. Mišji receptor, FLK-1 i njegova humana kpija KDR, dele homologiju sekvencije od 93,4% unutar ćelijskog domena. Slično, mišji FLK-1 vezuje humani VEGF sa istim afinitetom kao mišji VEGF, pa se prema tome aktivira ligandom koji se izvodi iz bilo koje od ovih vrsta. Millauer et al.,Cell,1993, 72, 835-846; Quinn et al.,Proc. Natl. Acad. Sci. USA,1993, 90, 7533-7537. FLK-1 se povezuje takođe sa naknadnim tirozinskim fosforilatima substrata humane RTK (npr. PLC-y ili p85), kada se istovremeno izlučuju u ćelijama 293 (fibroplasti humanog embrionalnog bubrega).

Prema tome, modeli koji se zasnivaju na receptoru FLK-1 direktno su primenljivi na razumevanje receptora KDR. Na primer, upotreba mišjeg receptora FLK-1 u metodama kojima se identifikuju jedinjenja koja regulišu putanju transdukcije mišjeg signala, direktno su primenljivi na identifikaciju jedinjenja koja se mogu koristiti za regulisanje putanje transdukcije humanog signala, tj. regulišu aktivnost povezanu sa receptorom KDR. Dakle, hemijska jedinjenja koja su identifikovana kao inhibitori KGR/FLK-1in vitro,mogu se potvrditi na podesnim modelimain vivo.Na modelima miša i pacovain vivobilo je pokazano da imaju odličnu vrednost za ispitivanje kliničkog potencijala agenasa koji deluju na putanju indukovanog signala transdukcije KDR/FLK-1.

Tako, ovaj pronalazak daje jedinjenja koja regulišu, modulišu i/ili inhibiraju vaskulogenezu i/ili angiogenezu preko uticanja na enzimsku aktivnost KDR/FLK-1 receptora, pa interferiraju sa signalom koji transdukuje KDR/FLK-1. Stoga, ovaj pronalazak pruža terapeutski pristup tretmanu mngih vrsta čvrstih tumora, uključujući, ali bez ograničavanja, glioblastom, melanom, Kaposi-je sarkom i karcinome jajnika, pluća, dojke, prostate, pankreasa, debelog creva i epiderma. Pored toga, podaci ukazuju da se ordiniranjem jedinjenja koja inhibiraju putanju signala transdukcije posredovanu sa KDR/FLK-1, mogu takođe da koriste za tretman hemangioma, restenoze i dijabetske retinopatije.

Pored toga, ovaj pronalazak se odnosi na inhibiciju vaskulogeneze i angiogeneze preko putanja posredovanih drugim receptorima, uključujua putanju koja sadrži receptor flt-1.

Signal transdukcije posredovan receptorom tirozin kinaze inicira se vanćelijskom interakcijom sa specifičnim faktorom rasta (ligand), posle čega sledi dimerizacja receptora, prolazna stimulacija aktivnosti svojstvenog proteina tirozin kinaze i autofosfoirlovanje. Na taj način se stvaraju mesta za vezivanje kod molekula unutarćelijske transdukcije signala, što dovodi do stvaranja kompleksa sa spektrom molekula citoplazmičkih signalizacija, što olakšava odgovarajući ćelijski odgovor, npr. deobu ćelije i metaboličke efekte na vanćelijsko mikrookruženje. Videti Schlessinger i Ullrich,Neuron,1992, 9, 1-20.

Bliska homologija unutarćelijskih regiona KDR/FLK-1 sa istom receptora PDGF-p (50,3% homologije) i/ili srodnog receptora flt-1, ukazuje na indukciju preklapanja putanja transdukcije signala. Na primer, za receptor PDGF-p članovi src familije (Twamley et al.,Proc. Natl. Acad. Sci USA,1993, 90, 7696-7700), fosfatidilinozitol-3'-kinaze (Hu et al,Mol. Cell. Biol.1992, 12, 981-990), fosfolipaze cy (Kashishian i Cooper,Mol. Cell. Biol.1993, 4, 49-51), aktivirajući protein ras-GTPaze (Kashishian et al.,EMBO J,1992, U, 1373-1382), PTP-ID/syp (Kazlauskas et al.,Proc. Natl. Acad. Sci. USA1993, 90(10), 6939-6943), Grb2 (Arvidsson et al.,Mol. Cell. Bbl.1994,14,6715-6726) i adapterski molekuli Shc i Nck (Nishimura et al.,Mol. Cell. Biol.1993,13, 6889-6896), pokazano je da se vezuju u regionima koji obuhvataju različita mesta za autofosforilaciju. Videti generalno, Claesson-VVelsh,Prog. Growth FactorRes.,1994, 5, 37-54. Dakle, verovatno je da putanje transdukcije signala aktiviranih sa KDR/FLK-1 obuhvataju putanju ras PI-3'-kinaze (Rozakis et al.,Nature,1992,36.0,689-692) i putanje posredovane sa src i posredovane sa plcy. Svaka od ovih putanja može igrati kritičnu ulogu u angiogenom i/ili vaskulogenom efektu KDR/FLK-1 ćelija endotelijuma. Prema tome, još jedan aspekt ovog pronalaska odnosi se na upotrebu organskih jedinjenja koja su ovde opisana za modulisanje angiogeneze i vaskulogeneze, pošto su ti procesi kontrolisani ovim putanjama.

Obrnuto, poremećaji povezani sa širenjem, kontrakcijom ili zatvaranjem krvnih sudova, kao što su restenoza, takođe su implicirani i mogu se tretirati ili sprečiti postupcima iz ovog pronalaska.

Fibrotički poremećaji se odnose na abnormanlo stvaranje vanćelijskih matrica. Primeri fibrotičkih poremećaja su ciroza jetre i proliferativni poremećaji mezangijalnih ćelija. Cirozu jetre karakteriše porast konstituenata vanćelijske matrice, što vodi stvaranju ožiljka u jetri. Porast vanćelijske matrice koji vodi ožiljku na jetri može takođe biti prouzrokovan virusnom infekcijom, kao što je hepatitis. Izgleda da lipociti igraju glavnu ulogu u cirozi jetre. Drugi implicirani fibrotički poremećaji su ateroskleroza.

Proliferativni poremećaji mezangijalnih ćelija odnose se na poremećaje koji vode abnormalnoj proliferaciji mezangijalnih ćelija. Mezangijalni proliferativni poremećaji su razne humane bubrežne bolesti, kao što su glomerulonefritis, dijabetska nefropatija i maligna nefroskleroza, kao i poremećaji kao što je sindrom trombotičke mikroangiopatije, odbacivanje transplantata i glomerulopatije. U održavanju proliferacije mezangijalne ćelije impiciran je RTK PDGFR. Floege et al.,Kidney International,1993, 43, 47S-54S.

Mnogi kanceri su proliferativni poremećaji ćelije, kao što je ranije registrovano, PK su povezane sa ćelijskim proliferativnim poremećajima. Stoga, ne iznenađuje da PK, kao što su na primer, članovi familije RTK, povezani sa razvojem kancera. Neki od ovih receptora, kao što je EGFR (Tuzi et aL,Br. J. Cancer,1991, 63, 227-233, Torp et al.,APMIS,1992, 100, 713-719), HER2/neu (Slamon et al.,Science,1989, 244, 707-712) i PDGF-R (Kumabe et al.,Oncogene,1992, 7, 627-633) se prekomemo izlučuju u mnogim tumorima i/ili su neprestano aktivirani preko autokrine petlje. Ustvari, kod najčešćih i najtežh kancera pokazana su prekomerna izlučivanja ovih receptora (Akbasak i Suner-Akbasak et al.,J. Neurol. Sci.1992, Vh, 119-133, Dickson et al.,Cancer Treatment Res.1992, 61, 249-273; Kore et al.,J. Clin. Invest.1992, 90, 1352-1360) i autokrine petlje (Lee i Donoghue,J. Cell. Biol.1992, 118, 1057-1070, Korcet al., vidi gore. Akbasak i Suner-Akbasak et al., vidi<g>ore). Na primer, EGFR je povezan sa karcinomom skvamoznih ćelija, astrocitomom, glioblastomom, kancerom glave i vrata, kancerom pluća i kancerom bešike. HER2 je povezan sa kancerom dojke, jajnika, stomaka, pluća, pankreasa i bešike. PDGFR je povezan sa ? glioblastomom i melanomom, kao i sa kancerom pluća, jajnika i prostate. RTK c-met je povezan takođe sa stvaranjem malignog tumora. Na primer, c-met je povezan sa, između ostalih kancera, sa kancerom debelog creva i rektuma, tiroide, pankreasa, želuca i hepatocelularnim karcinomima i limfomima. Pored toga, c-met je povezan sa leukemijom. Prekomemo izlučivanje gena c-met detektovano je takođe kod pacijenata sa Hodgkins-ovom bolešću i Burkitts-ovom bolešću.

Pored toga, IGF-IR je impliciran u podršci ishrane i kod tipa II dijabetesa, a povezan je takođe i sa nekoliko vrsta kancera. Na primer, IGF-I je imliiciran kao stimulator autokrinog faktora rasta kod nekoliko vrsta tumora, npr. u ćelijama karcinoma humanog kancera dojke (Artega et al.,J. Cin. Invest.1989, 84,1418-1423) i u ćelijama tumora malih ćelija pluća (Macaulev et al.,Cancer Res.,1990, 50, 2511-2517). Pored toga, IGF-I, iako je integralno uključen u normalni rast i diferencijaciju nervnog sistema, izgleda daje takođe autokrini stimulator humanih glioma. Sandberg-Nordquist et al.,Cancer Res.1993, 53, 2475-2478. Značaj IGF-IR i njegovih liganada u proliferaciji ćelije potvrđuje još i činjenica da su mnoge vrste ćelija u kulturi (fibroplasti, ćelije epitela, ćelije glatkih mišića, T-limfociti, mijeloidne ćelije, hodrociti i osteoblasti (stem ćelje koštane srži)) stimulisane sa IGF-I i da rastu. Goldring i Goldring,Eukaryotic Gene Expression,1991,1, 301-326. Baserga i Coppola predlažu da IGF-IR igra centralnu ulogu u mehanizmu transformacije i da kao takvi treba da su prevashodni cilj u terapeutskim intervencijama kod širokog spektra humanih maligniteta. Baserga,Cancer Res.1995, 55, 249-252; Baserga,Cell,1994, 79, 927-930; Copolla et al.,Mol. Cell. Biol.1994, 14, 4588-4595.

STK su implicirane u mnogim vrstama kancera, uključujući kancer dojke (Cance et al.Int. J. Cancer,1993, 54,571-577).

Povezanost između abnormalne aktivnosti PK i bolesti nije ograničena samo na kancer. Na primer, RTK su povezane sa bolestima kao što su psorijaza, dijabetes melitus, endometrioza, angiogeneza, razvoj ateromatoznog plaka, Alzheimer-ova bolest, restenoza, von Hippel-Lindau-ova bolest, epidermalna hiperproliferacija, neurodegenrativne bolesti, makularna degeneracija povezana sa starenjem i hemangiomi. Na primer, EGFR je indikovan kod zarastanja rana rožnjače i kože. Defekti u insulinu-R i IGF-IR su indikovani kod dijabetes melitusa tipa II. Potpunija korelacija između specifičnih RTK i njihovih terapeutskih indikacija je izneta u radu Plovvman et al.,DN& P,1994, 7, 334-339.

Kao što je ranije pomenuto, u putanji proliferativne i metaboličke transdukcije signala učestvuju ne samo RTK, nego i CTK, uključujući, ali bez ograničavanja, src, abl, fps, yes, fyn, lyn, lek, bik, fgr i yrk (pregled dali Bolen et al.,FASEB J.1992, 6, 3403-3409), pa se stoga može očekivati, a bilo je i pokazano, da su uključeni u mnoge poremećaje posredovane sa PTK, na koje je usmeren ovaj pronalazak. Na primer, pokazano je da je mutirana src (v-src) onkoprotein (ppeo^"5) kod pilića. Pored toga, njen ćelijski homolog, proto-onkogen pp60<c>'€<rc>prenosi onkogene signale mnogih receptora. Prekomemo izlučivanje EGFR ili HER2/neu u tumorima dovodi do konstituivnog aktiviranja ppeo<0>^<0>, koje je karakteristično za maligne ćelije, a odsustvuje kod normalnih ćelija. S druge strane, miševi kojima nedostaje izlučivanje c-src pokazuju osteopetrotički fenotip, što ukazuje na ključnu participaciju c-src u funkciji osteoklasta i moguće učešće u srodnim poremećajima.

Slično, Zap70 je impliciran u singalizaciji T-ćelija, što se može povezati sa autoimunim poremećajima.

STK su povezane sa inflamacijom, autoimunim bolestima, imuno odgovorima i hiperproliferativnim poremećajima, kao što su restenoza, fibroza, psorijaza, osteoartitis i reumatoidni artritis.

PK su takođe imlicirane u implantaciji embriona. Dakle, jedinjenja iz ovog pronalaska mogu pružiti efikasan metod za prevenciju takve implantacije embriona i tako biti korisni kao agens kontrole rađanja. Drugi poremećaji koji se mogu tretirati ili sprečiti korišćenjem jedinjenja iz ovog pronalaska su imunološki poremećaji, kao što su autoimune bolesti, AIDS i kardiovaskularni poremećaji, kao što je ateroskleroza.

Konačno, i RTK i CTK su danas pod sumnjom da učestvuju u hiperimunim poremećajima.

Primeri efekta brojnih primera jedinjenja iz ovog pronalaska na nekoliko PTK, pokazano je u Tabeli 2 niže. Ova jedinjenja i podaci koji su prikazani, ne treba da se shvate na bilo koji način kao ograničenje obima ovog pronalaska.

B. Inhibitor Ciklooksigenaze-2 ili inhibitor COX-2 obuhvata agense koji specifično inhibiraju klasu enzima ciklooksigenaze-2, uz manje značajnu inhibiciju ciklooksigenaze-1. Poželjno je da obuhvata jedinjenja koja imaju ICsoza cikooksigenazu-2 koja je manja od oko 0,2 uM, a takođe imaju odnos selektivnosti za inhibiciju ciklooksigenaze-2 prema inhibicije ciklooksigenaze-1 od najmanje 50, poželjnije od najmanje 100. Još je poželjnije da ova jedinjenja imaju ICsoza ciklooksigenazu-1 koja je veća od 1 uM, poželjnije veću od 10 uM.

Ispitivanja pokazuju da prostaglandini, koji su sintetizovani sa ciklooksigenazama, igraju kritičnu ulogu u iniciranju i promociji kancera. Pored toga, COX-2 se prekomemo izlučuje u lezijama neoplazmi debelog creva, dojke, pluća, prostate, jednjaka, pankreasa, intestinuma, cerviksa, jajnika, urinarne bešike i glave i vrata. Kod nekoliko modelain vitroi na životinjama, inhibitori COX-2 su inhibirali rast i metastazu tumora.

Pored kancera kao takvih, COX-2 se takođe izlučuje u angiogenoj vaskulaturi unutar i okolo lezija hiperplazmi i neoplazmi, što ukazuje da COX-2 igra ulogu u angiogenezi. I kod miševa i kod pacova inhibitori COX-2 primetno inhibiraju bFGF-indukovanu neovaskularizaciju. Korist inhibitora COX-2 kao hemopreventiva, antiangiogenih i hemoterapeutskih agenasa je opisana u literaturi (Koki et al., "Potential utilitv of COX-2 inhibitors in chemoprevention and chemotherapv",Exp. Opin. Invest. Dmgs1999, 8(10), 1623-1638, koji je ovde priključen kroz citat). Pojačanje i/ili prekomemo izlučivanje HER-2/nue (ErbB2) dešava se kod 20-30% humanih kancera dojke i jajnika, kao i kod 5-15% kancera želuca i jednjaka, a povezani su sa slabom prognozom. Pored toga, nedavno je otkrivenoin viroda je izlučivanje COX-2 nadregulisano u ćelijama koje prekomemo izlučuju onkogen HER-2/neu (Subbaramaiah et al., "Increased expression of cyclooxygenase-2 in HER-2/neu-overexpressing breast cancer", uCancer Research(podneto za štampu 1999), koji je ovde priključen kroz citat). U ovom ispitivanju primetan porast nivoa stvaranja PGE2, detektovan je COX-2 protein i mRNA u HER-2/neu, u transformisanim ćelijama epiteta dojke, u poređenju sa ne-transformisanim ćelijama soja partnera. Proizvodi aktivnost COX-2, tj. prostaglandini, stimulišu proliferaciju, povećavaju invazivnost malignih ćelija i pojačavaju stvaranje faktora rasta vaskulamog endotelijuma, koji promoviše angiogenezu. Dalje, HER-2/neu indukuje stvaranje angiogenih faktora, kao što je faktor rasta vaskulamog endotelijuma.

Prema tome, ordiniranje inhibitora COX-2 u kombinaciji sa anti-HER-2/neu antitelima, kao što je Trastuzumab (Herceptin<®>) i druge terapije usmerene na inhibiranje HER-2/neu, podrazumeva se da tretiraju kancere u kojima se HER-2/neu prekomemo izlučuje.

Takođe, podrazumeva se da su sadržaji COX-2 u tumorima povišeni sa pojačavanjem i/ili prekomernim izlučivanjem drugih onkogena, uključujući, ali bez ograničavanja,c-myc, H- myc, L- myc,K- ras,H- ras,N-ras. Proizvodi aktivnosti COX-2 stimulišu proliferaciju ćelije, inhibiraju imuni nadzor, povećavaju invazivnost malignih ćelija i promovišu angiogenezu. Prema tome, ordiniranje inhibitora protein kinaze u kombinaciji sa inhibitorom COX-2 iz ovog pronalaska, korisno je za sprečavanje ili tretiranje kancera u kome se onkogeni prekomemo izlučuju.

Specifični inhibitori COX-2 su korisni za tretman kancera (WO 98/16227) i na nekoliko modela na životinjama smanjuju angiogenezu izazvanu raznim faktorima rasta (WO 98/22101). Anti-angiogeneza je postignuta sa inhibitorom COX-2 kod pacova implantiranih sa bFGF, faktorom rasta vaskulamog endotelijuma (VEGF) ili karaginanom, proteinima sa dobro poznatim angiogenim svojstvima. (Masferrer et al., 89-th Annual Meeting of the American Association for Cancer Research, mart, 1998).

Farmaceutski preparati i ordiniranje

Jedinjenje iz ovog pronalaska, ili njegova farmaceutski prihvatljiva so, može se ordinirati kao takvo humanom pacijentu, ili se može ordinirati kao farmaceutski preparat u kome su prethodni materijali pomešani sa pogodnim nosačima ili dodacima. Tehnike formulacije i ordiniranja lekova se mogu nad u "Remington's Pharmacological Sdences", Mack Publishing Co., Easton, PA, poslednje izdanje.

"Ordinirati" ili "ordiniranje" ovde se odnosi na oslobađanje jedinjenja formule (I) ili njegove farmaceutski prihvatljive soli, ili farmaceutskog preparata koji sadrži

jedinjenje formule (I) ili njegovu farmaceutski prihvatljivu so iz ovog pronalaska, u nekom organizmu, sa svrhom prevencije ili tretmana pormećaja povezanog sa

PK.

Pogodni putevi ordiniranja mogu biti, bez ograničavanja, oralni, rektalni, površinski, transmukozalni ili intestinalni, ili intramuskulami, potkožni, intramedularni, intratekalni, direktno intraventikularni, intravenozni, intravitrealni, intraperitonealni, intranazalni ili intraokularni, pomoću injekcija. Poželjni putevi ordiniranja su oralni i parenteralni.

Alternativno, ovo jedinjenje se može ordinirati lokalnim, radije nego sistemskim načinom, na primer, preko injekcije ovog jedinjenja direktno u čvrsti tumor, često kao depo-formulacija ili formulacija sa uzdržanim oslobađanjem.

Pored toga, lek se može ordinirati sistemom ciljanog oslobađanja leka, na primer, u lipozomu obloženom sa antitelom specifičnim prema tumoru. Ovi lipozomi se usmeravaju i resorbuju selektivno u tumoru.

Farmaceutski preparati iz ovog pronalaska se mogu proizvoditi u procesima koji su dobro poznati u stanju tehnike, npr. konvencionalnim mešanjem, rastvaranjem, granulacijom, pravljenjem dražeja, emulgovanjem, kapsuliranjem, procesom zahvatanja ili liofilizacijom.

Farmaceutski preparati koji se koriste u skladu sa ovim pronalaskom mogu se formulisati na konvencionalan način, koristeći jedan ili više fiziološki prihvatljivih nosača, koji sadrže dodatke i pomoćna sredstva, koji olakšavaju preradu aktivnog jedinjenja u preparate koji se mogu farmaceutski upotrebljavati. Ispravna formulacija zavisi od puta koji se izabere za ordiniranje.

Za injekcije, jedinjenja iz ovog pronalaska se mogu formulisati u rastvore u vodi, poželjno u fiziološki kompatibilnim puferima, kao što je Hanks-ov rastvor, Ringer-ov rastvor ili fiziološki pufer rastvora soli. Za transmukozalno ordiniranje, u formulaciji se koriste penetranti koji odgovaraju barijeri kroz koju treba da prođu. Ovi penetranti su obično poznati u stanju tehnike.

Za oralno ordiniranje ova jedinjenja se mogu formulisati kombinovanjem aktivnih jedinjenja sa farmaceutski prihvatljvim nosačima, koji su dobro poznati u stanju tehnike. Ovi nosači omogućavaju da se jedinjenja iz ovog pronalaska formulišu kao tablete, pilule, pastile, dražeje, kapsule, tečnosti, gelovi, sirupi, guste suspenzije, suspenzije i slično, za oralno uzimanje od strane pacijenta. Farmaceutski preparati za oralnu upotrebu se mogu napraviti korišćenjem čvrstog dodatka, opciono usitnjavanjem dobijene smeše, pa preradom ove smeše u granule, nakon dodavanja drugih pogodnih pomoćnih sredstava, da bi se dobile tablete ili jezgra dražeja. Naročito korisni dodaci su punioci, kao što su šećeri, uključujući laktozu, saharozu, manitol ili sorbitol, preparati celuloze, kao što je na primer, kukuruzni škrob, pšenični škrob, pirinčani škrob i škrob iz krompira, zatim drugi materijali, kao što su želatin, tragant guma, metilceluloza, hidroksipropilmetilceluloza, natrijum-karboksimetilceluloza i/ili polivinilpirolidon (PVP). Ukoliko se želi, mogu se dodati dezintegracioni agensi, kao što su umreženi polivinilpirolidon, agar ili alginska kiselina. Može se takođe koristiti i so, kao što je natrijum-alginat.

Jezgra dražeja se daju sa pogodnim oblogama. U tu svrhu mogu se koristiti koncentrovani rastvori šećera, koji opciono mogu da sadrže gumiarabiku, talk, polivinilpirolidon, karbopol gel, polietilenglikol i/ili titanijum-dioksid, rastvore za lakiranje i pogodne organske rastvarače ili smeše rastvarača. Bojene supstance ili pigmenti se mogu dodavati oblogama za tablete ili dražeje, za identifikaciju ili karakterisanje različitih kombinacija doziranja aktivnog jedinjenja.

Farmaceutski preparati koji se mogu koristiti oralno su dvodelne zatvorene kapsule napravljene od želatina, kao i meke zaptivene kapsule od želatina i plastifikatora, kao što je glicerin ili sorbitol. Dvodelne zatvorene kapsule mogu sadržati aktivno jedinjenje umešano sa puniocem, kao što je laktoza, vezivom, kao što je škrob i/ili lubrikantom, kao što je talk ili magnezijum-stearat, i opciono sa stabilizatorima. U mekim kapsulama aktivno jedinjenje može biti rastvoreno ili suspendovano u pogodnim tečnostima, kao što su masna ulja, tečni parafin ili tečni polietilenglikoli. Ovim formulacijama mogu se takođe dodati i stabilizatori.

Kapsule se mogu pakovati u boce od mrkog stakla ili plastike, da bi se zaštitilo aktivno jedinjenje od svetla. Sudovi, koji sadrže kapsule kao formulaciju aktivnog jedinjenja, moraju se čuvati na konrolisanoj sobnoj temperaturi (15-30°C).

Za ordiniranje inhalacijom, jedinjenja koja se koriste u skladu sa ovim pronalaskom, konvencionalno se oslobađaju u obliku rasprišivanja aerosola, koristeći pakovanje pod pritiskom ili nebulizatori pogodni propelant, npr., ali bez ograničavanja, dihlorodifluorometan, trihlorofluorometan, dihlorotetrafluoroetan ili ugljen-dioksid. U slučaju aerosola pod pritiskom, jedinična doza se može kontrolisati preko oslobađanja odmerene količine kroz ventil. Kapsule i kartridži, na primer, od želatina, koji se koriste u inhalatroima ili insuflatorima, mogu se formulisati kao smeša praha ovog jedinjenja i pogodne praškaste baze, kao što je laktoza ili škrob.

Ova jedinjenja se mogu takođe formulisati za parenteralno ordiniranje, npr. kao bolus injekcija ili kontinualna infuzija. Formulacije za injekcije se mogu pripremiti u obliku jedinične doze, npr. u ampulama, ili u kontejnerima za višestruko doziranje, uz dodatak prezervativa. Ovi preparati mogu biti u obliku suspenzija, rastvora ili emulzija u ulju ili vodi kao nosaču, a mogu da sadrže i materijale za formulisanje, kao što su agensi za suspendovanje i/ili dispergovanje.

Farmaceutski preparati za parenteralno ordiniranje su rastvori u vodi oblika koji je rastvoran u vodi, kao što je, ali bez ograničavanja, so aktivnog jedinjenja. Pored toga, suspenzije aktivnih jedinjenja se mogu dobiti u lipofilnom tečnom nosaču. Pogodni lipofilni tečni nosači su masna ulja, kao što je susamovo ulje, sintetski estri masnih kiselina, kao što je etiloleat, i trigliceridi, ili materijali kao što su lipozomi. Injekcije suspenzija u vodi mogu da sadrže supstance koje povećavaju viskoznost suspenzije, kao što su natrijum-karboksimetilceluloza, sorbitol ili dekstran. Opciono, ove suspenzije mogu da sadrže takođe i pogodne stabilizatore i/ili agense koji povećavaju rastvorljivost ovih jedinjenja, kako bi se omogućilo pripremanje veoma koncentrovanih rastvora.

Alternativno, aktivni sastojak može biti u obliku praha, za konstituisanje pred upotrebu sa pogodnim tečnim nosačem, npr. sterilnom, apirogenom vodom.

Ova jedinjenja se mogu takođe formulisati u rektalne preparate, kao što su supozitorije ili retencione klizme, korišćenjem npr. konvencionalnih baza za supozitorije, kao što je kakaobuter ili drugi gliceridi.

Pored formulacija koje su prethodno opisane, ova jedinjenja se mogu takođe formulisati kao depo preparati. Ove formulacije dugog trajanja se mogu ordinirati implantacijom (na primer, potkožno ili intramuskulamo) ili intramuskularnom injekcijom. Jedinjenje iz ovog pronalaska se može formulisati za ovaj put ordiniranja sa pogodnim polimemim ili hidrofobnim materijalima (na primer, u emulziji sa farmakološki prihvatljivim uljem), sa jono-izmenjivačkim smolama, ili kao teško rastvoran derivat, kao što je, ali bez ograničavanja, teško rastvoma so.

Primer farmaceutskog nosača, ali bez ograničavanja, za hidrofobna jedinjenja iz ovog pronalaska je ko-rastvarač koji sadrži benzilalkohol, nepolami surfaktant, organski polimer mešljiv sa vodom i vodenu fazu, kao što je VPD sistem ko-rastvarača. VPD je rastvor 3 % ( m/ V) benzilalkohola, 8 % (m/V) nepolamog surfaktanta Polvsorbate 80, i 65% (m/V) polietilenglikola 300, dopunjen sa apsolutnim etanolom. VPD sistem ko-rastvarača (VPD:D5W) sastoji se od VPD razblaženog 1:1 sa 5% dekstrozom u vodenom rastvoru. Ovaj sistem ko-rastvarača dobro rastvara hidrofobna jedinjenja, a sam izaziva nisku toksičnost kod sistemskog ordiniranja. Prirodno, proporcije ovog sistema ko-rastvarača se mogu znatno varirati, bez poništavanja njegovih karakteristika rastvorljivosti i toksičnosti. Pored toga, i identitet komponenata ko-rastvarača se može varirati: na primer, umesto Polysorbate 80 mogu se koristiti drugi nisko-toksični nepolami surfaktanti, frakcija veličine polietilenglikola se može varirati, polietilenglikol mogu da zamene drugi biokompatibilni polimeri, npr. polivinilpiroidon, a drugi šećeri ili polisaharidi mogu da zamene dekstrozu.

Alternativno, mogu se koristiti i drugi sistemi oslobađanja hidrofobnih farmaceutskih jedinjenja. Dobro poznati primeri oslobađanja tečnih nosača ili nosača hidrofobnih lekova su lipozomi i emulzije. Pored toga, mogu se koristiti i neki organski rastvarači, kao što je dimetilsulfoksid, mada često po cenu veće toksičnosti.

Pored toga, ova jedinjenja se mogu oslobađati korišćenjem sistema za uzdržano oslobađanje, kao što su polupropustljive matrice čvrstih hidrofobnih polimera koje sadrže terapeutski agens. Postoje razni materijali za uzdržano oslobađanje i dorbo su poznati onima koji su verzirani u stanje tehnike. Kapsule za uzdržano oslobađanje mogu, zavisno od njihove hemijske prirode, oslobađati ova jedinjenja, od nekoliko nedelja do preko 100 dana. Zavisno od hemijske prirode i biološke stabilnosti terapeutskog reagensa, mogu se koristiti i druge strategije za stabilizaciju proteina.

Ovi farmaceutski preparati mogu da sadrže pogodne nosače ili dodatke u čvrstoj fazi ili u obliku gela. Primeri takvih nosača ili dodataka su, ali bez ograničavanja, kalcijum-karbonat, kalcijum-fosfat, razni šećeri, škrobovi, derivati celuloze, želatin i polimeri, kao što su polietilenglikoli.

Mnoga od jedinjenja iz ovog pronalaska koja modulišu PK mogu se dati kao fiziološki prihvatljive soli u kojima ovo jedinjenje može da formira negativno ili pozitivno naelektrisane vrste. Primeri soli u kojima ovo jedinjenje formira pozitivno naelektrisan ostatak su, ali bez ograničavanja, kvaterneme amonijum soli (definisane i na drugom mestu), kao što su hidrohlorid, sulfat, karbonat, laktat, tartarat, malat, maleat, sukcinat, gde je atom azota u kvaternernoj amonijumovoj grupi azot izabranog jedinjenja iz ovog pronalska, koji je reagovao sa odgovarajućom kiselinom. Soli u kojima jedinjenje iz ovog pronalaska formira negativno naelektrisane vrste su, ali bez ograničavanja, soli natrijuma, kalijuma, kalcijuma i magnezijuma, formirane reakcijom grupe karboksilne kiseline u ovom jedinjenju sa odgovarajućom bazom (npr. natrijum-hidroksidom (NaOH), kalijum-hidroksidom (KOH), kalcijum-hidroksidom (Ca(OH)2itd.).

Farmaceutski preparati koji su pogodni za upotrebu u ovom pronalasku su preparati u kojima se aktivni sastojci nalaze u količini dodvoljnoj da se postigne nameravana svrha, npr. modulacija aktivnosti PK ili tretman ili prevencija poremećaja povezanog sa PK.

Određenije, terapeutski efikasna je količina jedinjenja koja efikasno sprečava, ublažava ili olakšava simptome bolesti ili produžava život subjektu koji se tretira.

Određivanje terapeutski efikasne količine je sasvim unutar ingerencija onog ko je verziran u stanje stehnike, naročito u svetlu detaljnog opisa koji je priložen.

Za svako jedinjenje koje se koristi u postupcima iz ovog pronalaska, terapeutski efikasna količina, ili doza, može se proceniti pre svega iz testova ćelijske kulture. Zatim, doziranje se može formulisati korišćenjem modela na životinjama, kako bi se postiglo da koncentracija u cirkulacionom sistemu bude u opsegu koji obuhvata IC50, koja je određena u testu na kulturi (tj. koncentracija testiranog jedinjenja koja postiže polovinu maksimalne inhibicije aktivnosti PK). Ova informacija se zatim može koristiti za tačno određivanje korisnih doza kod humanih bića.

Toksičnost i terapeutska efikasnost jedinjenja koja su ovde opisana, može se odrediti standardnim farmaceutskim procedurama na kulturama ćelija ili na eksperimentalnim životinjama, npr. određivanjem IC50i LD50(obe se ovde diskutuju i na drugom mestu) za posmatrano jedinjenje. Podaci koji se dobiju iz ovih testova na kulturi i ispitivanja na životinjama, mogu se koristiti za formulisanje opsega doziranja kod humanih bića. Ove doze mogu da variraju zavisno od oblika za doziranje koji se koristi i od puta ordiniranja koji se koristi. Tačnu formulaciju, put ordiniranja i doziranje može odabrati lekar, imajući u vidu stanje pacijenta, (videti, npr. Fingl et al., "The Pharmacological Basis of Therapeutics", glava 1, str. 1,1975.

Količina i interval doziranja se mogu podešavati individualno, kako bi se obezbedili sadržaji aktivnih vrsta u plazmi koji su dovoljni da održavaju efekte modulacije kinaze. Ovi sadržaji u plazmi se referišu kao minimalne efikasne koncentracije (MEC). MEC varira za svako jedinjenje, ali se procenjuje iz podatakain vitro,npr. koncentracija potrebna da se postigne 50-90% inhibicija kinaze, može se utvrditi korišćenjem testova koji su ovde opisani. Doze potrebne da se postigne MEC zavisiće od individualnih karakteristika i puta ordiniranja. Testovi HPLC ili biotestovi se mogu koristiti za određivanje koncentracija u plazmi.

Intervali doziranja se mogu takođe odrediti korišćenjem vrednosti MEC. Jedinjenja treba da se ordiniraju koristeći režime koji obezbeđuju saržaje u plazmi iznad MEC u 10-90% vremena, poželjno između 30-90%, a najpoželjnije između 50-90%.

Za sada, terapeutski efikasne količine jedinjenja Formule (I) mogu da se kreću od približno 0,25 mg/m<2>do 1500 mg/m<2>na dan; poželjno od oko 3 mg/rrrVdan. Još poželjnije 50 mg/m<2>/dan do 400 mg/dan.

Terapeutski efikasne količine inhibitora ciklooksigenaze su od oko 0,1 mg do oko 10.000 mg, pri tretiranju gornjih stanja, sa poželjnim sadržajim od oko 1,0 mg do oko 1.000 mg.

Količina aktivnog sastojka, koji se može kombinovati sa drugim agensima protiv kancera, za proizvodnju oblika jedinične doze, variraće zavisno od domaćina koji se tretirai, a naročito od načina ordiniranja.

U slučajevima lokalnog ordiniranja ili selektivne resorpcije, efikasna lokalna koncentracija leka ne mora biti povezana sa koncentracijom u plazmi, a mogu se koristiti druge procedue, koje su poznate u stanju tehnike, za određivanje ispravne količine i intervala doze.

Količina jedinjenja koja se ordinira zavisiće, naravno, od subjekta koji se tretira, ozbiljnosti ispada, načina ordiniranja, ocene ordinirajućeg lekara itd.

Ovi preparati mogu, ukoliko se želi, da se daju kao pakovanje ili uređaj za doziranje, kao što je preporučeni komplet od strane FDA, koji može da sadrži jedan ili više oblika jedinične doze koja sadrži aktivni sastojak. Ovo pakovanje može, na primer, da sadrži prateće uputstvo za ordiniranje. Ovo pakovanje ili uređaj za doziranje mogu da budu takođe zajedno sa upozorenjem koje je u tom kontejneru, u obliku preporuke od strane vladine agencije koja reguliše proizvodnju, upotrebu i prodaju farmaceutskih proizvoda, upozorenje koje sadrži dozvolu te agencije da je oblik tog preparata za humano ili veterinarsko ordiniranje. Ovo upozorenje može, na primer, biti etiketa od strane U.S. Food and Drug Administration za prepisivanje lekova ili za dozvolu korišćenja tog proizvoda. Preparati koji sadrže jedinjenje iz ovog pronalaska, formulisani u kompatibilnom farmaceutskom nosaču, mogu se takođe dobiti tako što su stavljeni u odgovarajući kontejner i etiketom označeni za tretman naznačenog stanja. Pogodni uslovi, koji su naznačeni na etiketi, mogu da sadrže tretman tumora, inhibiciju angiogeneze, tretman fibroze, dijabetesa i slično.

Aspket ovog pronalaska je takođe da jedinjenje koje se ovde opisuje, ili njegova so ili prolek, mogu biti kombinovani sa drugim hemoterapijskim agensima za tretman bolesti ili stanja koji su diskutovani gore. Na primer, jedinjenje, so ili prolek iz ovog pronalaska se može kombinovati sa agensima za alkilovanje, kao što je fluorouracil (5-FU), samim ili u dodatnim kombinacijama sa leukovorin-om; ili drugim agensima za alkilovanje, kao što su, ali bez ograničavanja, drugi pirimidinski analozi, kao što je UFT, capecitabine, gemcitabine i cvtarabine; alkil sulfonatima, npr. bisulfan (koji se koristi za tretman hronične granulocitne leukemije), improsulfan i piposulfan; aziridini, npr. benzodepa, carboquone, meturedepa i uredepa; etiliminima i metilmelaminima, npr. altretamine, trietilenmelamin, trietilenfosforamid, trietilentiofosforamid i trimetilolmelamin; i azotovim slačicama, npr. chlorambucil (koji se koristi za tretman hronične limfocitne leukemije, primarne makroglobulinemije i ne-Hodgkin-ovog limfoma), ciklofosfamid (koji se koristi za tretman Hodgkin-ove bolesti, multiplog mijeloma, neuroblastoma, kancera dojke, kancera jajnika, kancera pluća, VVilm-ovog tumora i rabdomiosarkoma), estramustirie, ifosfamide, novembrichin, prednimustine i uracilna slaćica (koja se koristi u tretmanu primarne trombocitoze, ne-Hodgkin-ovog limfoma, Hodgkin-ove bolesti i kancera jajnika); i triazini, npr. dacarbazine (koji se koristi u tretmanu sarkoma mekog tkiva).

Jedinjenje, so ili prolek iz ovog pronalaska može se takođe koristiti u kombinaciji sa drugim antimetaboličkim hemoterapeutskim agensima, kao što su, ali bez ograničavanja, analozi folne kiseline, npr. methotrexate (koji se koristi u tretmanu akutne limfocitne leukemije, horiokarcinoma, kancera dojke mvcosis fungiodes, kancera glave i vrata i osteogenog sarkoma) i pteropterin; i analozi purina, kao što je merkaptopurin i tiogvanin, koji su našli upotrebu u tretmanu akutne granulocitne, akutne limfocitne i hronične granulocitne leukemije.

Podrazumeva se da jedinjenje, so ili prolek iz ovog pronalaska može takođe da se koristi u kombinaciji sa terapeutskim agensima zasnovanim na prirodnom proizvodu, kao što su, ali bez ograničavanja, vinka alkaloidi, npr. vinblastin (koji se koristi u tretmanu kancera dojke i testisa), vincristine i vindesine; epipodofilotoksinima, npr. etoposide i teniposide, oba se koriste za tretiranje kancera testisa i Kaposi-evog sarkoma; antibiotičkim hemoterapeutskim agensima, npr. daunrubicin, doxorubicin, epirubicin, mitomvcin (koji sekoristi za tretiranje kancera stomaka, cerviksa, debelog creva, dojke, bešike i pankreasa), dactinomycin, temozolomide, plicamycin, bleomycin (koji se koristi u tretmanu kancera kože, jednjaka i genito-urinarnog trakta); i enzimatskim hemoterapeutskim agensima, kao što je L-asparaginaza.

Pored gornjeg, jedinjenje, so ili prolek iz ovog pronalaska se može takođe koristiti u kombinaciji sa koordinacionim kompleksima platine (cisplatin, itd.); supstituisanim ureama, kao što je hidroksiurea; derivatima metilhidrazina, npr. procarbazine; adrenokortiko supresantima, npr. mitotane, aminoglutetimid; i hormonima i antagonistima hormona, kao što su adenokortikosteroidi (npr. prenisone), progestini (npr. hidroksiprogesteron kaproat); estrogenima (npr. dietilstilbestrol); antiestrogenima, kao što je tamoxifen; androgenima, npr. testosteron propionat; i inhibitorima aromataze, kao što je anastrozole.

Zajedno sa kombinovanom terapijom iz ovog pronalaska mogu se koristiti drugi agensi protiv neoplazme koji su poznati u stanju tehnike. Primeri ovih i drugih agenasa protiv neoplazme su dati u United States Patent Application Serial No. 60/113,786 podnosilaca ove prijave, koja je podneta 23 decembra 1998, i u PCT Application Publication No. WO 00/38716, čiji je opis ovde priključen kroz citat.

Najzad, podrazumeva se takođe da će kombinacija jedinjenja iz ovog pronalaska biti efikasna u kombinaciji sa mitoxantrone-om ili paclitaxel-om u tretmanu čvrstih tumora kancera ili u leukemijama, kao što su, ali bez ograničavanja, akutna mielogenozna (ne-limfocitna) leukemija.

PRIMERI

Primeri sinteze

Sledeći preparati i primeri su dati da se onima koji su verzirani u stanje tehnike olakša jasnije razumevanje i praksa ovog pronalaska. Oni ne treba da se posmatraju tako da ograničavaju obim ovog pronalaska, već samo su njihova ilustracija i predstavljanje.

SINTEZA INHIBITORA PROTEIN KINAZE - JEDINJENJA FORMULE (\) IZ

OVOG PRONALASKA

Opšta procedura sinteze:

Za dobijanje jedinjenja iz ovog pronalaska može se primeniti opšta metodologija koja sledi: Odgovarajuće supstituisan 2-oksiindol (1 ekviv.), odgovarajuće supstituisan aldehid (1,2 ekviv.) i baza (0,1 ekviv.) se pomešaju u rastvaraču (1-2 mL/mmol 2-oksiindola), pa se ta smeša zatim zagreva od oko 2 do oko 12 h. Posle hlađenja filtrira se talog koji nastane, opere hladnim etanolom ili etrom, pa suši pod vakuumom, dajući čvrst proizvod. Ukoliko se talog ne formira, reakciona smeša se koncentriše, a ostatak triturira sa dihlorometan/etrom, dobijena čvrsta supstanca se sakupi filtriranjem i zatim osuši. Ovaj proizvod se može opciono dalje prečišćavati hromatogafijom.

Baza može biti organska ili neorganska baza. Ukoliko se koristi organska baza, poželjno je da to bude azotna baza. Primeri organskih azotnih baza su, ali bez ograničavanja, diizopropilamin, trimetilamin, trietilamin, anilin, piridin, 1,8-diazabiciklo[5.4.1]undec-7-en, pirilidin i piperidin.

Primeri neorganskih baza su, ali bez ograničavanja, amonijak, hidroksidi, fosfati, karbonati, bikarbonati, bisulfati i amidi alkalnih metala ili zemnoalkalnih metala. Alkalni metali su litijum, natrijum i kalijum, a zemnoalkalni metali sa kalcijum, magnezijum i barijum.

U ovde poželjnoj realizaciji ovog pronalska, kada je rastvarač protonski rastvarač, kao što je voda ili alkohol, baza je neorganska baza alkalnog metala ili zemnoalkalnog metala, poželjno hidroksid alkalnog metala ili zemnoalkalnog metala.

Onima koji su verzirani u stanje tehnike je jasno, na bazi poznatih opštih principa organske sinteze i opisa koji su dati ovde, koja baza je najpodesnija za posmatranu reakciju.

Rastvarač u kome se ova reakcija obavlja može biti protonski i aprotonski rastvarač, poželjno je da je to protonski rastvarač. "Protonski rastvarač" je rastvarač koji ima atom ili atome vodonika koji su kovalentno vezani za atome kiseonika ili azota, što čini ove atome vodonika značajno kiselim i na taj način u stanju da se "dele" sa rastvaračem preko vodonične veze. Primeri protonskih rastvarača su, ali bez ograničavanja, voda i alkoholi.

"Aprotonski rastvarač" može biti polaran i nepolaran, ali u svakom slučaju ne sadrži kiselinske vodonike, pa stoga nije u stanju da vodonik veže sa rastvaračem. Primeri, ali bez ograničavanja, nepolarnih organskih rastvarača su pentan, heksan, benzen, toluen, metilenhlorid i ugljentetrahlorid. Primeri polarnih rastvarača su hloroform, tetrahidrofuran, dimetilsulfoksid i dimetilfromamid.

U ovde poželjnoj realizaciji ovog pronalaska rastvarač je protonski rastvarač, poželjno voda ili alkohol, kao što je etanol.

Ova reakcija se obavlja na temperaturi višoj od sobne temperature. Temperatura je obično od oko 30°C do oko 150°C, poželjno od oko 80°C do oko 100°C, a najpoželjnije od oko 75°C do oko 85°C, što je oko temperature ključanja etanola. Pod "oko" podrazumeva se da je temperatura u opsegu od poželjno 10°C u odnosu na naznačenu temperaturu, poželjnije unutar 5°C od naznačene temperature, a najpoželjnije unutar 2°C od naznačene temperature. Tako, na primer, "oko 75°C" znači 75±10°C, poželjno 75±5°C, a najpoželjnije 75±2°C. Korišćenjem tehnika koje su dobro poznate u stanju tehnike u herniji lako se mogu sintetizovati 2-oksiindoli i aldehidi. Oni koji su verzirani u stanje tehnike znaju da postoje i drugi putevi sinteze za formiranje jedinjenja iz ovog pronalaska, i da se ovaj što sledi nudi samo u svrhu primera, a ne ograničenja.

Postupak A: formilovanie pirola

U kapima se dodaje POCb (1,1 ekv.) u dimetilformamid (3 ekviv.) na -10°C, posle čega sledi dodavanje odgovarajućeg pirola, rastvorenog u dimetilformamidu. Posle 2 h mešanja smeša se razblaži vodom, pa učini baznom do pH 11, sa 10 M KOH. Nastali talog se sakupi filtriranjem, opere vodom i osuši u vakuum sušnici, dajući željeni aidehid.

Postupak B: saponifikacija estara pirolkarboksilne kiseline

Smeša estra pirolkarboksilne kiseline i KOH { 2- 4 ekviv.) u EtOH se refluksuje dok se reakcija ne završi, na šta ukazuje tankoslojna hromatografija (TLC). Ohlađena reakciona smeša se zakiseli do pH 3 sa 1 M HCI. Nastali talog se sakupi filtriranjem, opere vodom i suši u vakuum sušici, dajući željenu pirolkarboksilnu kiselinu.

Postupak C: amidovanje

U mešani rastvor pirolkarboksilne kiseline, rastvorene u dimetilformamidu (0,3 M), doda se 1-etil-3-(3-dimetilamino-propil)karbodiimid (1,2 ekviv.), 1-hidroksibenzo-triazol (1,2 ekviv.) i trietilamin (2 ekviv.). Doda se odgovarajući amin (1 ekviv.), pa se reakcija meša dok se ne završi, na šta ukazuje TLC. Zatim se u reakcionu smešu doda etilacetat, pa se taj rastvor opere zasićenim NaHCOsi rastvorom soli (sa ekstra dodatkom soli), osuši iznad anhidrovanog MgS04i koncentriše, dajući željeni amid.

Postupak D: kondenzovanie aldehida ioksiindola koii sadrže supstituente

karboksilne kiseline

Smeša oksiindola (1 ekviv.), 1 ekvivalenta aldehida i 1.3 ekvivalenta piperidina (ili pirolidina) u etanolu (0,4 M), meša se na 90-100°C, sve do završetka reakcije, na šta ukazuje TLC. Ova smeša se ohladi na sobnu temperaturu, a formirani talog se sakupi filtriranjem pod vakuumom, opere etanolom i osuši, dajući proizvod. Ukoliko se prilikom hlađenja reakcione smeše ne formira talog, smeša se koncentriše i prečisti hromatografijom na koloni.

C. Primeri sinteze indola

Sledeći primeri sinteze reprezentativnih oksiindola ne treba da se shvate kao ograničavanje obima ovog pronalaska na bilo koji način. Na bazi sledećih opisa, onima koji su verzirani u stanje tehnike poznati su alternativni putevi do pokazanih oksiindola, kao i drugi oksiindoli koji se mogu koristiti za dobijanje jedinjenja iz ovog pronalaska. Te sinteze i oksiindoli su unutar obima i duha ovog pronalaska.

5- amino- 2- oksiindol

Hidrogenuje se 5-nitro-2-oksiindol (6,3 g) u metanolu, iznad 10% paladijuma na uglju, dajući 3,0 g (60% prinos) naslovljenog jedinjenja, kao belu čvrstu supstancu.

5- bromo- 2- oksiindot

Ohladi se 2-oksiindol (1,3 g) u 20 mL acetonitrila, na -10°C, pa se uz mešanje, lagano dodaje 2,0 g N-bromosukcinimida. Reakcija se 1 h meša na -10°C i 2 h na 0°C. Sakupi se talog, opere vodom i osuši, dajući 1,9 g (90% prinos) naslovljenog jedinjenja.

4- metil- 2- oksiindol

Uz mešanje, dodaje se dietiloksalat (30 mL) u 20 L suvog etra u 19 g kalijum-etoksida, suspendovanog u 60 mL suvog etra. Ova smeša se ohladi u kupatilu sa ledom, pa se lagano dodaje 20 mL 3-nitro-oksilena u 20 mL suvog etra. Gusta, tamnocrvena smeša se zagreva 0,5 h pod refluksom, koncentriše do tamno-crvene čvrste supstance, tretira sa 10% natrijum-hidroksidom, sve dok se skoro sav talog ne rastvori. Tamnocrvena smeša se tretira sa 30% vodonik-peroksidom sve dok se crvena boja ne promeni u žutu. Smeša se tretira redom, sa 10% natrijum-hidroksidom i 30% vodonik-peroksidom, sve dok više ne opstaje crvena boja. Talog se odvoji filtriranjem, a filtrat zakiseli sa 6M HCI. Nastali talog se sakupi vakuum-filtriranjem.opere vodom i suši pod vakuumom, dajući 9,8 g (45% prinos) 2-metil-6-nitrofenilsirćetne kiseline kao beličastu čvrstu supstancu. Ova supstanca se hidrogenuje u metanulu, iznad 10% paladijuma na uglju, dajući 9,04 g naslovljenog jedinjenja, kao belu čvrstu supstancu.

7- bromo- 5- hloro- 2- oksiindol

Suspenduje se 5-hloro-2-oksiindol (16,8 g) i 19,6 g N-bromosukcinimida u 140 mL acetonitrila, pa se refluksuje 3 h. Tankoslojna hromatografija (silicijum-dioksid, etilacetat) u 2. satu refluksovanja pokazuje 5-hloro-2-oksiindol ili N-bromosukcinimid (Rf 0,8), proizvod (Rf 0,85) i drugi proizvod (Rf 0,9), čiji se odnosi nisu menjali nakon sledećeg sata refluksovanja. Ova smeša se ohladi na 10°C, talog sakupi vakuum-filtriranjem, opere sa 25 mL etanola i suši usisavanjem 20 min u nuču, dajući 14,1 g vlažnog proizvoda (56% prinos). Ovaj talog se suspenduje u 200 mL denaturisanog alkohola, a gusta suspenzija opere uz mešanje, pa refluksuje 10 min. Smeša se ohladi u kupatilu sa ledom na 120°C. Čvrst proizvod se sakupi vakuum-filtriranjem, opere sa 25 mL etanola i suši pod vakuumom na 40°, dajući 12,7 g (51% prinos) 7-bromo-5-hloro-2-oksiindola.

5- fluoro- 2- oksiindol

Rastvori se 5-fluoroizatin (8,2 g) u 50 mL hidrazin hidrata, pa se refluksuje 1,0 h. Reakciina smeša se prespe u led i vodu. Talog se odvoji filtriranjem, opere vodom i suši u vakuum sušnici, dajući naslovljeno jedinjenje.

5- nitro- 2- oksiindol

Rastvori se 2-oksiindol (6,5 g) u 25 mL koncentrovane sumporne kiseline, pa se smeša drži na -10° do -15°C sve dok se u kapima dodaje 2,1 mL pušeće azotne kiseline. Posle dodavanja azotne kiseline reakciona smeša se 0,5 h meša na 0°C, pa prespe u led-vodu. Talog se skupi filtriranjem opere vodom, pa kristališe iz 50% sirćetne kiseline. Kristalni proizvod se zatim filtrira, opere vodom i suši pod vakuumom, dajući 6,3 g (89%) 5-nitro-2-oksiindola.

5- aminosulfonil- 2- oksiindol

U balon od 100 mL uspe se 27 mL hlorosulfonske kiseline, pa se lagano dodaje 13,3 g 2-oksiindola. Temperatura reakcije se održava ispod 30°C tokom ovog dodavanja. Posle dodavanja reakciona smeša se 1,5 h meša na sobnoj temperaturi, zagreva 1 h na 68°C, ohladi i prespe u vodu. Talog se opere vodom i osuši u vakuum sušnici, dajući 11,0 g 5-hlorosulfonil-2-oksiindola (50% prinos), koji se koristi bez daljeg prečišćavanja.

Doda se 5-hlorosulfonil-2-oksiindol (2,1 g) u 10 mL amonijum-hidroksida u 10 mL etanola, pa se preko noći meša na sobnoj temperaturi. Smeša se koncentriše, a talog sakupi vakuum-filtriranjem, dajući 0,4 g (20% prinos) naslovljenog jedinjenja, kao beličastu čvrstu supstancu.

5- izopropilaminosulfonil- 2- oksiindol

U balon od 100 mL, napunjen sa 27 mL hlorosulfonske kiseline, lagano se dodaje 1,13 g 2-oksiindola. Tokom ovog dodavanja temperatura reakcije se održava ispod 30°C. Reakciona smeša se 1,5 h meša na sobnoj temperaturi, zagreva 1 h na 68°C, ohladi i prespe u vodu. Nastali talog se filtrira, opere vodom i suši u vakuum sušnici, dajući 11,0 g (50%) 5-hlorosulfonil-2-oksiindola, koji se koristi bez daljeg prečišćavanja.

Suspenzija 3 g 5-hlorosulfonil-2-oksiindola, 1,15 g izopropilamina i 1,2 mL piridina u 50 mL dihlorometana, meša se 4 h na sobnoj temperaturi, za koje vreme nastane beli talog. Ovaj talog se sakupi vakuum-filtriranjem, gusta suspenzija opere vrućim etanolom, ohladi, sakupi vakuum-filtriranjem i preko noći suši pod vakuumom na 40°C, dajući 1,5 g (45%) 5-izopropilaminosulfonil-2-oksiindola.

<1>H NMR (360 MHz, DMSO-d6) 5: 10,69 (s, br, 1H, NH), 7,63 (dd, J=2 i 8Hz, 1H), 7,59 (d, J=2Hz, 1H), 7,32 (d, J=7Hz, 1H, NH-S02-), 6,93 (d, J=8Hz, 1H), 3,57 (s, 2H), 3,14-3,23 (m, 1H, CH-(CH3)2), 0,94 (d, J=7Hz, 6H, 2*CH3).

5- fenilaminosulfonil- 2- oksiindol

Suspenzija 5-hlorosulfonil-2-oksiindola (1,62 g, 7 mmol), anilina (0,782 mL, 8,4 mmol) i piridina (1 mL) u dihlorometanu (20 mL), meša se 4 h na sobnoj temperaturi. Reakciona smeša se razblaži etilacetatom (300 mL), pa zakiseli sa 1M hlorovodoničnom kiselinom (16 mL). Organski sloj se opere natrijum-bikarbonatom i rastvorom soli, osuši i koncentriše. Ostatak se opere etanolom (3 mL), a zatim hromatografira na silikagelu i eluira sa metanol/dihlorometanom 1:9, dajući 5-fenilaminosulfonil-2-oksiindol.

<1>H NMR (360 MHz, DMSO-d6) 6: 10,71 (s, br, 1H, NH), 10,10 (s, br, 1H, NH), 7,57-7,61 (m, 2H), 7,17-7,22 (m, 2H), 7,06-7,09 (m, 2H), 6,97-7,0 (m, 1H), 6,88 (d, J=8,4Hz, 1H), 3,52 (s, 2H).

2- okso- 2, 3- dihidro- 1H- indol- 5- sulfonska kiselina piridin- 3- ilamid

Rastvor 5-hlorosulfonil-2-oksiindola (3 g) i 3-aminopiridina (1,46 g) u piridinu (15 mL) meša se preko nod na sobnoj temperaturi, opere etanolom i osuši pod vakuumom, dajući 1,4 g (38%) 2-okso-2,3-dihidro-1H-indol-5-sulfonska kiselina piridin-3-ilamida.

<1>H NMR (360 MHz, DMSO-d6) 5: 10,74 (s, 1H, NH), 10,39 (s, 1H, SO2NH), 8,27-8,28 (d, 1H), 8,21-8,23 (m, 1H), 7,59-7,62 (m, 2H), 7,44-7,68 (m, 1H), 7,24-7,28 (m, 1H), 6,69-6,71 (d, 1H), 3,54 (s, 2H).

MSm/ z(APCI<+>) 290,2.

5- feniloksiindol

Rastvori se 5-bromo-2-oksiindol (5 g, 23,5 mmol) u 110 mL toluena i 110 mL etanola, uz mešanje i malo zagrevanja. Doda se tetrakis(trifenilfosfin)-paladijum(O) (1,9 g, 1,6 mmol), a zatim 40 mL (80 mmol) 2M natrijum-karbonata u vodi. Ovoj smeši se doda benzenborna kiselina (3,7 g, 30,6 mmol), pa se smeša 12 h zagreva na 100°C u uljanom kupatilu. Reakcija se ohladi, razblaži etilacetatom (500 mL), opere zasićenim natrijum-bikarbonatom (200 mL), vodom (200mL), 1M HCI (200 mL) i rastvorom soli (200 mL). Organski sloj se osuši iznad magnezijum-sulfata, pa koncentriše dajući mrku čvrstu supstancu. Trituriranje sa dihlorometanom daje 3,8 g (77%) 5-fenil-2-oksiindola, kao tamno smeđu čvrstu supstancu.

<1>H NMR (360 MHz, DMSO-d6) 6:10,4 (br s, 1H, NH), 7,57 (dd, J=1,8 i 7,2Hz, 1H), 7,5-7,35 (m, 5H), 7,29 (m, 1H), 6,89 (d, J=8,2Hz, 1H), 3,51 (s, 2H, CH2CO).

MS m/z 209 [M<+>J.

Na sličan način mogu se dobiti sledeći oksiindoli:

6-( 3, 5- dihlorofenil)- 1, 3- dihidroindol- 2- on

<1>H NMR (360 MHz, DMSO-d6) 8: 10,46 (br, 1H, NH), 7,64 (d, J=1,8Hz, 2H), 7,57 (m, 1H), 7,27 (m, 2H), 7,05 (d, J=1,1Hz, 1H), 3,5 (s, 2H).

MS-Ei m/z 277/279 [M<+>J.

6-( 4- butilfenil)- 1, 3- dihidroindol- 2- cn

<1>H NMR (360 MHz, DMSO-d6) 8: 10,39 (s, 1H, NH), 7,49 (d, J=8,0Hz, 2H), 7,25 (d, J=8Hz, 3H), 7,17 (dd, J=1,5i 7,8Hz, 1H), 6,99 (d, J=1,5Hz, 1H), 3,48 (s, 2H), CH2CO), 2,60 (t, J=7,5Hz, 2H, CH2CH3), 1,57 (m, 2H,CH2),1,32 (m, 2H,CH2),0,9 (t, J=7,Hz, 3H, CH3).

6-( 5- izopropil- 2- metoksifenil)- 1, 3- dihidroindol- 2- on

<1>H NMR (360 MHz, DMSO-d6) 8: 10,29 (br s, 1H, NH), 7,16-7,21 (m, 2H), 7,08 (d, J=2,4Hz, 1H), 6,97-7,01 (m, 2H), 6,89 (d, J=0,8Hz, 1H), 3,71 (s, 3H, 0CH3), 3,47 (s, 2H, CH2CO), 2,86 (m, 1H, CH(CH3)2), 1,19 (d, J=6,8Hz, 6H, CH(CH3)2).

MS-EI m/ z 281 [M]<+.>

6-( 4- etilfenil)- 1, 3- dihidroindol- 2- on

<1>H NMR (360 MHz, DMSO-d6) 6: 10,39 (br s, 1H, NH), 7,50 (d, J=8,2Hz, 2H), 7,28 (d, J=8,2Hz, 2H), 7,25 (d, J=7,5Hz, 1H), 7,17 (dd, J=1,6 i 7,5Hz, 1H), 6,99 (d, J=1,6Hz, 1H), 3,48 (s, 2H, CH2CO), 2,63 (q, J=7,6Hz, 2H, CH2CH3), 1,20 (t, J=7,6Hz, 3H, CH2CH3).

MS-EI m/ z 237 [M]+.

6-( 3- izopropilfenil)- 1, 3- dihidroindol- 2- on

<1>H NMR (360 MHz, DMSO-d6) 6: 10,37 (br s, 1H, NH), 7,43 (m, 1H), 7,35-7,39 (m, 1H), 7,17-7,27 (m, 3H), 7,01 (d, J=1,8Hz, 1H), 3,49 (s, 2H, CH2CO), 2,95 (m, 1H, CH(CH3)2), 1,24 (d, J=6,8Hz, CH(CH3)2).

MS-Ei m/ z 251 [Mf.

6-( 2, 4- dimetoksifenil)- 1, 3- dihidroindol- 2- on

<1>H NMR (360 MHz, DMSO-d6) 8: 10,28 (br s, 1H, NH), 7,17 (m, 2H), 6,93 (dd, J=1,6 i 7,6Hz, 1H), 6,86 (d, J=1,6Hz, 1H), 6,63 (d, J=2,4Hz, 1H), 6,58 (dd, J=2,4 i 8,5Hz, 1H), 3,79 (s, 3H, OCH3), 3,74 (s, 3H, OCH3), 3,45 (s, 2H, CH2CO).

MS-Ei m/ z 269 [Mf.

6- piridin- 3- il- 1, 3- dihidroindol- 2- on

<1>H NMR (360 MHz, DMSO-d6) 8: 10,51 (s, 1H, NH), 8,81 (d, J=2,5Hz, 1H), 8,55 (ss, J=1,8 i 5,7Hz, 1H), 8 (m, 1H), 7,45 (dd, J=5,7 i 9,3Hz, 1H), 7,3 (m, 2H), 7,05 (s, 1H), 3,51 (s, 2H, CH2CO).

MS-EI m/z210[M]+

2<>kso- 2, 3HJihidro- 1H- indol- 4- karboksilna kiselina ( 3- hloro- 4- etoksifenil)- amid

U rastvor 4-karboksi-2-oksiindola (200 mg, 1,13 mmol) i 3-hloro-4-metoksifenilamina (178 mg, 1,13 mmol) u dimetilformamidu (15 mL), na sobnoj temperaturi, doda se benzotriazol-1-iloksitri(dimetilamino)fosfonijum heksafluorofosfat (BOP reagens, 997 mg, 2,26 mmol), a zatim 4-dimetilaminopiridin (206 mg, 1,69 mmol). Ova smeša se 72 h meša na sobno] temperaturi. Reakcija se zatim razblaži etilacetatom (300 mL), opere zasićenim natrijum-bikarbonatom (100 mL), vodom, 2M hlorovodoničnom kiselinom (100 mL), vodom (3x200mL) i rastvorom soli. Zatim se osuši iznad magnezijum-sulfata i koncentriše. Ostatak se triturira etilacetatom, dajući 2-okso-2,3-dihidro-1H-indol-4-karboksilna kiselina (3-hloro-4-metoksifenil)-amid, kao ružičastu čvrstu supstancu.

<1>H NMR (360 MHz, DMSO-d6) 5: 10,50 (d, br, 1H, NH), 10,12 (s, br, 1H, NH), 7,9 (s, J=2,5Hz, 1H), 7,62 (dd, J=2,5 i Hz, 1H), 7,38 (d, J=7,6Hz), 7,32 (t, J=7,6Hz, 1H), 7,13 (d, J=9Hz, 1H), 6,98 (d, J=7,6Hz, 1H), 3,83 (s, 3H, OCH3), 3,69 (S, 2H,

CH2).

MS_EI m/ z 316 [Mf.

4- karboksi- 2- oksiindol

Rastvor trimetilsilildiazometana u heksanu (2 M) u kapima se dodaje u rastvor 2,01 g 2-hloro-3-karboksi-nitrobenzena u 20 mL metanola, na sobnoj temperaturi, sve dok ne prestane izdvajanje gasa. Zatim se doda sirćetna kiselina da se razori višak trimetilsilildiazometana. Reakciona smeša se ispari pod vakuumom, a ostatak se preko noći suši u sušnici. Dobijeni 2-hloro-3-metoksikarbonilnitrobenzen je dovoljno dst za sledeću reakciju.

Doda se dimetilmalonat (6,0 mL) u ledom ohlađenu suspenziju 2,1 g natrijum-hidrida u 15 mL DMSO. Ova reakciona smeša se 1 h meša na 100°C, a zatim ohladi na sobnu temperaturu. U jednoj porciji se doda 2-hloro-3-metoksikarbonilnitrobenzen (2,15 g), pa se smeša 1,5 h zagreva na 100°C. Reakciona smeša se zatim ohladi na sobnu temperaturu, prespe u led i vodu, zakiseli do pH 5 i ekstrahuje etilacetatom. Organski sloj se opere rastvorom soli, osuši iznad anhidrovanog natrijum-sulfata i koncentriše, dajući 3,0 g dimetil 2-metoksikabronil-6-nitrofenil-malonata.

Refluksuje se preko noći dimetil 2-metoksikarbonil-6-nitrofenilmalonat (3,0 g) u 50 mL 6M hlorovodonične kiseline. Ova smeša se koncentriše do suva, dodaju 20 mL etanola i 1,1 g kalaj(ll)hlorida, pa se smeša 2 h refluksuje. Smeša se filtrira kroz Celite, koncentriše i hromatografira na silikagelu, koristeći etilacetat.heksan.sirćetnu kiselinu kao eluent, što daje 0,65 g (37%) 4-karboksi-2-oksiindola, kao belu čvrstu supstancu.

<1>H NMR (360 MHz, DMS0-d6) 8: 12,96 (s, br, 1H, COOH), 10,74 (s, br, 1H, NH), 7,53 (d, J=8Hz, 1H), 7,39 (t, J=8Hz, 1H), 7,12 (d, J=8Hz, 1H), 3,67 (s, 2H).

D. Sinteza 2- indolinona supstituisanih pirolom

Primer 1

4 - metil - 5 -( 2<>kso - 1 . 2<iihidroindol - 3 - ildenmetil )- 1H ^ kiselina

Korišćenjem Postupka A, formiluje se 4-metil-2-pirolkarboksilna kiselina etilestar (komercijalno dostupan), dajući (73%) 5-formil-4-metil-2-pirolkarboksilna kiselina etilestar. Ovaj se hidrolizuje, koristeći Postupak B, dajući 5-formil-4-metil-1H-pirol-2-karboksilnu kiselinu (58%).

Kondenzuje se oksiindol (133 mg) sa 5-formil-4-metil-1H-pirol-2-karboksilnom kiselinom (153 mg) koristeći Postupak D, dajući 268 g (100%) naslovljenog jedinjenja, kao oranž-crvenu čvrstu supstancu.

<1>H NMR (360 MHz, DMSO-d6) 8: 13,84 (s, br, 1H, NH), 12,84 (s, br, 1H, COOH), 10,98 (s, br, 1H, NH), 7,82 (d, J=7,5Hz, 1H), 7,67 (s, 1H, N-vinil), 7,18 (t, J=7,5Hz, 1H), 7,01 (t, J=7,5Hz, 1H), 6,88 (d, J=7,5Hz, 1H), 6,71 (d, J=2,2Hz, 1H),2,32(s, 3H, CH3).

MS (negativni način) 266,8 [M-1]+

Primer 2

4 - metil - 5 -( 1 - metil - 1 . 2<iihidmindol - 3 - ilidenmetil )- 1H - DM ^ kiselina

Kondenzuje se 1-metil-1,3-dihidroindol-2-on (147 mg, 1 mmol) sa 5-formil-4-metil-1H-pirol-2-karboksilnom kiselinom (153 mg), koristeći Postupak D, što daje 250 mg (86%) naslovljenog jedinjenja.

<1>H NMR (360 MHz, DMSO-d6) 6: 13,82 (s, br, 1H, NH), 12,88 (s, br, 1H), 7,83 (d, J=7,5Hz, 1H), 7,65 (s, 1H, H-vinil), 7,26 (t, J=7,5Hz, 1H), 7,02-7,09 (m, 2H), 6,70 (d, J=2,2Hz, 1H), 2,32 (s, 3H, CH3).

MSm/z283,0[M+1]+

Primer 3

4 - metil - 5 -( 2<>kso - 1 . 2<iihidir ) indol - 3 - ilidenm

metilestar

Kondenzuje se oksiindol (105 mg, 0,79 mmol) sa 5-formil-4-metil-1H-pirol-2-karboksilna kiselina metilestrom (110 mg, 0,67 mmol), koristeći Potsupak E, što daje 153,2 mg (81%) naslovljenog jedinjenja.

<1>H NMR (360 MHz, DMSO-de) 6:13,98 (s, br, 1H, NH), 10,97 (s, br, 1H, NH), 7,82 (d, J=7,6Hz, 1H), 7,67 (s, 1H, H-vinil), 7,2 (dt, J=1,2 i 7,7Hz, 1H), 7,01 (dt, J=1,2 i 7,7Hz, 1H), 6,90 (d, J=7,6Hz, 1H), 6,77 (d, J=2Hz, 1H).

MS-EI m/ z 283 [M++1].

Primer 4

5 - ( 5 - hloro - 2 - okso - 1 . 2<lihidmindol - 3 - ilidenmetil )- 4 - metil - 1H - Dirol - 2 - karboksilna

kiselina etilestar

Kondenzuje se 5-hloro-1,3-dihidroindol-2-on (2,22 g, 13,2 mmol) sa 5-formil-4-metil-1H-pirol-2-karboksilna kiselina etilestrom (2,43 g), koristed Postupak E, što daje 4,1 g (94%) naslovljenog jedinjenja, kao oranž čvrstu supstancu.

<1>H NMR (360 MHz, DMSO-d6) 6: 13,95 (s, br, 1H, NH), 7,98 (d, J=2,2 Hz, 1H, H-4), 7,78 (s, 1H, H-vinil), 7,18 (dd, J=2,2 i 8,3Hz, 1H, H-6), 6,87 (d, J=8,3Hz, H-7), 7,34 (d, J=1,8Hz, 1H, H-3'), 4,27 (q, J=7,2Hz, 2H, OCH2CH3), 2,33 (s, 3H, CH3), 1,29 (t, J=7,2Hz, 3H, OCH2CH3).

MS-EIm/ z330 [M<+>].

Primer 5

5 -( 5 - hloro - 2 ^ kso - 1 . 2<iihidroindol - 34idenm

kiselina

Smeša 5-(5-hloro-2-okso-1,2-dihidroindol-3-ilidenmetil)-4-metil-1 H-pirol-2-karboksilna kiselina etilestra (1,3 g, 4 mmol) i kalijum-hidroksida u metanolu (25 mL) i etanolu (25 mL) zagreva se preko noći pod refluksom. Nerastvorni materijal se odvoji filtriranjem, a smeša neutrališe sa 6M hlorovodoničnom kiselinom, dajući 0,876 g (70%) naslovljenog jedinjenja.

<1>H NMR (360 MHz, DMSO-d6) 6: 13,80 (s, br, 1H, NH), 12,90 (s, br, 1H, COOH), 11,06 (s, br, 1H, NH), 8,02 (d, J=1,8Hz, 1H, H-4), 7,81 (s, 1H, H-vinil), 7,20 (dd, J=1,8 i 8,3Hz, 1H, H-6), 6,89 (d, J=8,3Hz, 1H, H-7), 6,72 (d, J=1,8Hz, 1H, H-3'), 2,35 (s, 3H, CH3).

MS-EIm/ z302 [M<+>].

Primer 6

5 -( 5 - bmmo - 2<>kso - 1 . 2<lihidmindol - 3 - iliden

kiselina ( 3 - Dirolidin - 1 - il - oroDil ) amid

Kondenzjuje se 5-bromo-1,3-dihidroindol-2-on (0,16 g, 0,76 mmol) sa 5-formil-4-metil-1H-pirol-2-karboksilna kiselina (3-pirolidin-1-ilpropil)amidom (0,2 g, dobijen po Postupku C), dajući 60 mg (17%) naslovljenog jedinjenja kao oranž čvrstu supstancu.

<1>H NMR (300 MHz, DMSO-d6) 6: 13,61 (s, br, 1H, NH), 11,02 (s, br, 1H, NH), 8,42 (t, J=5,8Hz, 1H, CONHCH2), 8,12 (d, J=1,8Hz, 1H, H-4), 7,78 (s, 1H, H-vinil), 7,30 (dd, J=1,8i 5,8Hz, 1H, H-6), 6,82 (d, J=8,4Hz, 1H, H-7), 6,77 (d, J=2,4Hz, 1H, H-3'), 3,22-3,31 (m, 2H, CH2), 2,38-2,43 (m, 6H, 3*CH2), 2,35 (s, 3H, CH3), 1,62-1,71 (m, 6H, 3xCH2).

MS-EIm/ z456 i 458 [M<+->1 i M<+>+2].

Primer 7

5 -( 5 - bromo - 2 - okso - 1 . 2<lihidroindol - 3 - ilidenmetil )- 4 - metil - 1H - Dirol - 2 - karboksilna

kiselina ( 3 - dietilamino - DroDil ) amid

Kondenzuje se 5-bromo-1,3-dihidroindol-2-on (0,16 g, 0,75 mmol) sa 5-formil-4-metil-1H-pirol-2-karboksilna kiselina (3-dietilaminopropil)amidom (0,2 g, dobijen po Postupku C), dajući 30 mg (8%) naslovljenog jedinjenja kao oranž čvrstu supstancu.

<1>H NMR (300 MHz, DMSO-d6) 8: 13,61 (s, br, 1H, NH), 11,02 (s, br, 1H, NH), 8,40 (m, 1H, CONHCH2), 8,12 (d, J=1,5Hz, 1H, H-4), 7,78 (s, 1H, H-vinil), 7,30 (dd, J=1,5 i 8,2Hz, 1H, H-6), 6,82 (d, J=8,2Hz, 1H, H-7), 6,78 (d, J=2,4Hz, 1H, H-3'), 3,23 (m, 2H,CH2),2,38-2,45 (m, 6H, CH2i N(CH2CH3)2), 2,35 (s, 3H, CH3), 1,61 (m, 2H, CH2), 0,93 (t, J=7,1Hz, 6H, N(CH2CH3)2).

MS-EIm/ z458 i 469 [M<+->1 i M<+>+2].

Primer 8

5 -( 5 - bmmo - 2<>ks ( >1 . 2<lihidmindol - 3 - ilidenmetil )- 4 - me

kiselina ( 2 - dietHaminoetiliamid

Kondenzuje se 5-bromo-1,3-dihidroindol-2-on (212 mg, 1 mmol) sa 5-formil-1H-pirol-2-karboksilna kiselina (2-dietilaminoetil)amidom (dobijen iz etil pirol-2-karboksilata po Postupku A, B i zatim C), dajući 162 mg (38%) naslovljenog jedinjenja.

<1>H NMR (300 MHz, DMSO-d6) 6: 13,53 (s, br, 1H, NH), 11,06 (s, br, 1H, NH), 8,37 (t, 1H, CONHCH2), 7,89 (m, 2H), 7,32 (dd, J=2,0Hz, 1H), 6,96 (s, 1H), 6,80-6,84 (m, 2H), 3,3 (m, 2H, CH2), 2,45-2,55 (m, 6H, N(CH2CH3)2i CH2), 0,95 (t, J=7,2Hz, N(CH2CH3)2).

MS-EIm/ z430 i 432 [M<+->1 i M<+>+1].

Primer 9

5- f2- ofrso- 6- fenil- 1 . 2<lihidroindol - 3 - ilidenmetil )- 1H - Dirol - 2 - kamoksilna kiselina ( 2 -

dietilaminoetiDamid

Kondenzuje se 6-fenil-1,3-dihidroindol-2-on (209 mg, 1 mmol) sa 5-formil-1H-pirol-2-karboksilna kiselina (2-dietilaminoetil)amidom, dajući 182 mg (42%) naslovljenog jedinjenja.

<1>H NMR (300 MHz, DMSO-d6) 8: 13,56 (s, br, 1H, NH), 11,06 (s, br, 1H, NH), 8,36 (t, 1H, CONHCH2), 7,77 (s, 1H, H-vinil), 7,73 (d, J=7,8Hz, 1H), 7,64 (d, J=7,2Hz, 2H), 7,46 (m, 2H), 7,32 (m, 2H), 7,11 (s, 1H), 6,96 (m, 1H), 6,80 (m,

1H), 3,31-3,32 (m, 2H, CH2), 2,46-2,53 (m, 6H, N(CH2CH3)2i CH2), 0,96 (t, J=6,9Hz, 6H, N(CH2CH3)2).

MS-EIm/ z428 [M<+>].

Primer 10

5 -( 5 - bmmo - 2 - okso - 1 . 2<lihidmindol - 3 - iliden kiselina

( 2 - dietilaminoetil )- metil - amid

Kondenzuje se 5-bromo-1,3-dihidroindol-2-on (212 mg, 1 mmol) sa 5-formil-1H-pirol-2-karboksilna kiselina (2-dietilaminoetil)metilamidom, dajući 246 mg (55%) naslovljenog jedinjenja.

<1>H NMR (360 MHz, DMSO-d6) 8: 13,54 (s, br, 1H, NH), 11,06 (s, br, 1H, NH), 7,90 (m, 2H), 7,33 (dd, J=1,8 i 8,4Hz, 1H), 6,82-6,85 (m, 3H), 3,55 (s, br, 2H, CH2), 3,25 (s, br, 3H, NCH3), 2,57 (t, J=6,5Hz, 2H, CH2), 2,45 (m, 4H, N(CH2CH3)2), 0,91 (m, 6H, N(CH2CH3)2).

MS-EIm/ z 444i 446 [M<+->1 i M<+>+1].

Primer 11

5-( 2- o/ cso- 6- fenil- 1 . 2<lihidmindol - 3 - ilidenmetil )- 1H - Dirol - 2 - karboksilna kiselina ( 2 -

dietilaminoetiDmetilamid

Kondenzuje se 6-fenil-1,3-dihidroindol-2-on (209 mg, 1 mmol) sa 5-formil-1H-pirol-2-karboksilna kiselina (2-dietilaminoetil)metilamidom, dajući 277 mg (63%) naslovljenog jedinjenja.

<1>H NMR (360 MHz, DMSO-d6) 8: 13,58 (s, br, 1H, NH), 11,04 (s, br, 1H, NH), 7,78 (s, 1H, H-vinil), 7,73 (d, J=7,8Hz, 1H), 7,64 (d, J=7,5Hz, 2H), 7,46 (m, 2H), 7,33-7,36 (m, 2H), 7,11 (s, 1H), 6,84 (m, 1H), 6,78 (m, 1H), 3,55 (s, br, 2H, CH2), 3,25 (s, br, 3H, NCH3), 2,58 (t, 2H, CH2), 2,44 (m, 4H, N(CH2CH3)2), 0,92 (m, 6H, N(CH2CH3)2).

Primer 12

3 - metil - 5 -( 2< ) kso - 1 . 2<lihidmindol - 3 - ilidenmetil )- 1H - Diml - 2 - kam ^ kiselina ( 3 -

dietilaminoproDiDamid

Kondenzuje se oksiindol (66,5 mg, 0,5 mmol) sa 5-formil-3-metil-1H-pirol-2-karboksilna kiselina (3-dietilaminopropil)amidom (dobijen iz 3-formil-3-metil-1 H-pirol-2-karboksilna kiselina etilestra po postupku B, a zatim C), dajući 39 mg (21%) naslovljenog jedinjenja.

<1>H NMR (300 MHz, DMSO-d6) 6: 13,34 (s, br, 1H, NH), 10,88 (s, br, 1H, NH), 7,62-7,67 (m, 3H), 7,17 (m, 1H), 6,99 (m, 1H), 6,87 (d, J=7,6Hz, 1H), 6,63 (d, J=1Hz, 1H), 3,26-3,32 (m, 2H, CH2), 2,41-2,48 (m, 6H, CH2i N(CH2CH3)2), 2,29 (s, 3H, CH3), 1,63 (m, 2H, CH2), 0,93 (t, J=7,2Hz, 6H, N(CH2CH3).

MS-EIm/ z380 [M<*>].

Primer 13

5 -( 5 - bmmo - 2 - okso - 1 . 2< / ihidmindol - 3 - ilidenmetil )- 3 - metil - 1H ^

kiselina ( 3 - dietilamino - DroDil ) amid

Kondenzuje se 5-bromo-1,3-dihidroindol-2-on (106 mg, 0,5 mmol) sa 5-formil-3-metil-1H-pirol-2-karboksilna kiselina (3-dietilaminopropil)amidom, dajući 35 mg (15%) naslovljenog jedinjenja

<1>H NMR (300 MHz, DMSO-d6) 5: 13,35 (s, br, 1H, NH), 11,00 (s, br, 1H, NH), 7,89 (d, J=1,9Hz, 1H, H-4), 7,80 (s, 1H, H-vinil), 7,74 (t, J=5,3Hz, 1H, CONHCH2), 7,31 (dd, J=1,9i 8,4Hz, 1H, H-6), 6,83 (d, J=8,4Hz, 1H, H-7), 6,63 (S, 1H, H-3'), 3,26 (m, 2H, CH2), 2,41-2,48 (m, 6H,CH2i N(CH2CH3)2), 2,29 (s, 3H, CH3), 1,63 (m, 2H, CH2), 0,93 (t, J=7,1H, 6H, N(CH2CH3)2).

MS-EIm/ z458 i 460 [M<+->1 i M<+>+1].

Primer 14

3 - metil - 5 -( 2<>kso - 6 - feri \ l - 1 . 2<lihidmindol - 3 - ilidenmetil )-^

kiselina ( 3 - dietilaminopropil ) amid

Kondenzuje se 6-fenil-1,3-dihidroindol-2-on (105 mg, 0,5 mmol) sa 5-formil-3-metil-1H-pirol-2-karboksilna kiselina (3-dietilaminopropil)amidom dajući 67,8 mg (30%) naslovljenog jedinjenja<1>H NMR (300 MHz, DMSO-d6) 8: 13,37 (s, br, 1H, NH), 11,02 (s, br, 1H, NH), 7,23-7,73 (m, 1H), 3,29 (m, 2H,CH2),2,41-2,48 (m, 6H, CH2i N(CH2CH3)2), 2,29 (s, 3H, CH3), 1,64 (m, 2H, CH2), 0,94 (t, J=7,0Hz, 6H, N(CH2CH3)2).

MS-EIm/ z456 [M<+>].

Primer 15

5-^ 5-/ T7eot/ cs/- 2- okso- 1 . 2 - dihidroindol - 3 - ilidenmetil )- 3 - metil - 1H - pirol - 2 - karboksilna

kiselina ( 3 - dietilamino ) amid

Kondenzuje se 5-metoksi-1,3-dihidroindol-2-on (82,5 mg, 0, 5 mmol) sa 5-formil-3-metil-1H-pirol-2-karboksilna kiselina (3-dietilaminopropil)amidom dajući 80 mg (39%) naslovljenog jedinjenja.

<1>H NMR (300 MHz, DMSO-d6) 8: 13,45 (s, br, 1H, NH), 10,70 (s, br, 1H, NH), 7,68-7,70 (m, 2H), 7,32 (d, J=1,8Hz, 1H), 6,72-6,79 (m, 2H), 6,60 (s, 1H), 3,73 (s, 3H, OCH3), 3,28 (m, 2H, CH2), 2,41-2,48 (m, 6H, CH2i N(CH2CH3)2), 2,29 (s, 3H, CH3), 1,63 (m, 2H, CH2), 0,93 (t, J=7,0Hz, 6H, N(CH2CH3)2).

MS-EI m/z410[M+].

Primer 16

5 -( 6 - metoksi - 2okso - 1 . 2 - dihidroindol - 3 - ilidenmetil )- 3 - metil - 1H - Dirol - 2 - karboksilna

kiselina ( 3 - dietilaminoDroDil ) amid

Kondenzuje se 6-metoksi-1,3-dihidroindol-2-on (82,5 mg, 0,5 mmol) sa 5-formil-3-metil-1H-pirol-2-karboksilna kiselina (3-dietilaminopropil)amidom dajući 63 mg (31%) naslovljenog jedinjenja.

<1>H NMR (300 MHz, DMSO-d6) 8: 13,22 (s, br, 1H, NH), 10,86 (s, br, 1H, NH), 7,39-7,63 i 7,37-6,55 (m, 6H), 3,73 (s, 3H, OCH3), 3,3 (m, 2H, CH2), 2,45 (m, 6H, CH2i N(CH2CH3)2), 2,28 (s, 3H, CH3), 1,63 (m, 2H, CH2), 0,93 (m, 6H, N(CH2CH3)2).

MS-EI m/ z 410 [Ml

Primer 17

3 -( 5 - bromo - 2 - okso - 1 . 2 - dihidroindol - 3 - ilidenmetil )- 4 . 5 . 6 . 7 - tetrahidro - 2H - izoindol - 1 -

karboksilna kiselina ( 2 - dietilamino - etil ) amid

Formiluje se 4,5,6,7-tetrahidro-2/-/-izoindol-1-karboksilna kiselina etilestar (May, Donald A.; Lash, Timothy D.,J. Org. Chem.1992, 57(18), 4820-4828), koristeći Postupak A, zatim B, dajući 3-formil-4,5,6,7-tetrahidro-2H-izoindol-1-karboksilnu kiselinu.

Kondenzuje se 5-bromo-1,3-dihidroindol-2-on (1,43 g, 6,8 mmol) sa 3-formil-4,5,6,7-tetrahidro-2H-izoindol-1 -karboksilna kiselina 2-dietilaminoetil)amidom (1,97), dajući 2,2 g (67%) naslovljenog jedinjenja, kao žuto-oranž čvrstu supstancu.

<1>H NMR (360 MHz, DMSO-d6) 5: 13,47 (s, 1H, NH), 11,0 (s, 1H, NH), 8,0 (d, 1H, NH), 7,70 (s, 1H, CH), 7,28 (dd, J=2,1 i 8,2Hz, 1H, ArH), 7,16 (m, 1H, ArH), 6,8 (d, J=8,3Hz, 1H, ArH), 3,3 (s, 2H, CONH), 2,5 (m, 6H, 3xNCH2), 2,78 (br m, 2H, pirolskiCH2),2,72 (br, m, 2H, pirolskiCH2),1,7 (br m, 4H, N(CH2CH3)2), 1,74 (br s, 4H, CH2CH2CH2CH2), 0,96 (t, J=7,4Hz, 6H, N(CH2CH3)2.

MS-EIm/z484 i 486 [M<+->1 i M<+>+1].

Primer 18

kartioksilna kiselina ( 3 - dietilamino - Dropil ) amid

Kondenzuje se 5-bromo-1,3-dihidroindol-2-on (20 mg, 0,1 mmol) sa 3-formil-4,5,6,7-tetrahidro-2H-izoindol-1 -karboksilna kiselina (3-dietilaminopropil)amidom (30 mg), dajući 33 mg (46%) naslovljenioog jeinjenja kao čvrstu supstancu oranž boje.

<1>H NMR (360 MHz, DMSO-de) 8: 10,9 (s, 1H, NH), 8,0 (m, 1H, NH), 7,68 (m, 1H, ArH), 7,4 (m, 1H, ArH), 7,29 (d, J=1,9i 8,5Hz, 1H, ArH), 6,8 (d, J=8Hz, 1H, Ar-H), 2,7 (br m, 4H, 2xNCH2), 2,4 (m, 8H, 4xNCH2), 1,7 (br m, 4H, N(CH2CH3)2), 1,6 (br m 2H, CH2CH2CH2), 0,93 (t, J=7,4H, 6H, N(CH2CH3)2).

MS-EIm/ z 499i 501 [M<+>i M<+>+2].

Primer 19

3 -( 5 - bromo - 2 - okso - 1 . 2 - dihidroindol - 3 - ilidenmetil )- 4 , 5 . 6 . 7 - tetrahidro - 2H - izoindol - 1 -

karboksilna kiselina ( 3 - Dirolidin - 1 - ilDroDil ) amid

Kondenzuje se 5-bromo-1,3-dihidroindol-2-on (80 mg, 0,4 mmol) sa 3-formil-4,5,6,7-tetrahidro-2H-izoindol-1 -karboksilna kiselina (3-pirolidin-1 -ilpropil)amidom (120 mg), dajući 43 mg (22%) naslovljenog jedinjenja, kao tamnosmeđe-oranž čvrstu supstancu.

<1>H NMR (360 MHz, DMSO-d6) 8: 13,4 (s, 1H, NH), 10,9 (s, 1H, NH), 8,0 (m, 1H, NH), 7,69 (m, 1H, ArH), 7,28 (d, J=1,7i 7,8Hz, 1H, ArH), 6,8 (d, J=8Hz, 1H, ArH), 3,3 (br m, 2H, 2*NCH2), 2,8 (m, 4H, 2xpirolCH2), 2,5 (br m, 4H, N(CH2CH3)2), 1,6 (br m, 8H, 2xpirolCH2CH2, CH2CH2CH2i CONHCH2).

MS-EIm/ z497 i 499 [M<+>i M<+>+2].

Primer 20

3 - ( 2 - okso - 6 - Diridin - 3 - il - 1 . 2 - dihidroindol - 3 - ilidenmetil )- 4 . 5 . 6 . 7 - tetrahidro - 2H -

izoindol - 1 - kamoksilna kiselina ( 2 - dietilaminoetil ) amid

Kondenzuje se 6-piridin-3-il-1,3-dihidroindol-2-on (60 mg, 0,4 mmol) sa 3-formil-4,5,6,7-tetrahidro-2H-izoindol-karboksilna kiselina (2-dietilaminoetil)amidom (80 mg), dajući 50 mg (38%) naslovljenog jedinjenja, kao crvenkastu čvrstu supstancu.

<1>H NMR (360 MHz, DMSO-d6) 8: 13,4 (s, 1H, NH), 11 (s, 1H, NH), 8,9 (d, 1H, NH), 8,7 (dd, 1H, ArH), 8,1 (dd, 1H, ArH), 7,9 (d, 1H, ArH), 7,6 (s, 1H, CH), 7,5 (dd, 1H, ArH), 7,3 (dd, 1H, ArH), 7,1 (m, 2H, ArH), 3,35 (m, 2H, CONCH2), 2,8 (m, 4H, 2xpirolCH2), 2,5 (br m, 6H, N(CH2CH3)2i NCH2), 1,75 (br s, 4H, 2xpirolCH2CH2), 0,9 (t, 6H), N(CH2CH3)2).

MS-EIm/ z484 [M<+>].

Primer 21

4 - benzoil - 5 -( 5 - bromo - 2 - okso - 1 . 2 - dihidroindol - 3 - ilidenmetil )- 3 - metil - 1H - pirol - 2 -

karboksilna kiselina ( 3 - dietilaminoDroDil ) amid

U smešu benzoilhlorida (1 ekviv.) i aluminijum-hlorida (1 ekviv.) u dihloroetanu, na 0°C, doda se etil 3,5-dimetil-2-pirolkarboksilat (1 ekviv.). Ova smeša se 4 h meša na 80°C. Smeša se zatim ekstrahuje etilacetatom (EtOAc) i vodom. Sjedinjeni organski ekstrakti se operu zasićenim natrijum-bikarbonatom i rastvorom soli, osuše i koncentrišu, dajući (51%) 4-benzoil-3,5-dimetil-1H-pirol-2-karboksilnu kiselinu.

Smeša 4-benzoil-3,5-dimetil-1H-pirol-2-karbiksilna kiselina etilestra (4,13 g, 15,2 mmol) i cerijum-amonijum-nitrata (33 g, 4 ekviv.) u 50 mL smeše tetrahidrofuran (THF):sirćetna kiselina (HOAc):H20 1:1:1, refluksuje se preko noći. Reakciona smeša se zatim ohladi, ekstrahuje sa EtOAc i zatim učini baznom do pH 9 sa natrijum-karbonatom. Organski sloj se zatim opere rastvorom soli, osuši (MgS04) i koncentriše, pa hromatografira na koloni, dajući 3,5 g (75%) 4-benzoil-5-formil-3- metil-1H-pirol-2-karboksilna kiselina etilestra, kao žutu čvrstu supstancu. Kondenzuje se 5-bromo-1,3-dihidroindol-2-on sa 4-benzoil-5-formil-3-metil-1H-pirol-2-karboksilnom kiselinom, koristeći Postupak D, dajući 4-benzoil-5-(5-bromo-2-okso-1,2-dihdiroindol-3-ilidenmetil)-3-metil-1H-pirol-2-karboksilnu kiselinu.

Gornja karboksilna kiselina se zatim kupluje sa N,N-dietil-1,3-propandiaminom, koristeći Postupak C, dajući naslovljeno jedinjenje.

<1>H NMR (360 MHz, DMS0-d6) 5: 7,96 (m, 1H, CONHCH2), 7,76 (d, J=7,0Hz, 2H), 7,68 (t, 1H), 7,56 (m, 2H), 7,40 (s, 2H), 7,33 (dd, J=1,6 i 8,3Hz, 1H, H-6), 6,84 (d, J=8,3Hz, 1H, H-7), 3,33 (m, 2H, CH2), 2,42-2,46 (m, 6H, 3xCH2), 2,10 (s, 3H, CH3), 1,65 (m, 2H, CH2), 0,94 (t, J=7,0Hz, 6H, N(CH2CH3)2).

MS-EI m/ z 564 [M++1].

Primer 22

4 - benzoil - 5 -( 5 - bromo - 2< ) kso - 1 . 2<iihidmindo ^

karboksilna kiselina ( 3 - morfolin - 4 - ilpropil ) amid

<1>H NMR (360 MHz, DMSO-d6) 6: 14,10 (s, 1H, NH), 11,14 (br s, 1H, NH), 7,92 (m, 1H, CONHCH2), 7,75 (m, 2H), 7,69 (t, 1H), 7,56 (m, 2H), 7,42 (m, 2H), 7,33 (dd, J=1,9i 8,3Hz, 1H, H-6), 6,85 (d, J=8,3Hz, 1H, H-7), 3,56 (m, 4H, 2*CH2), 3,33 (m, 2H,CH2),2,35 (m, 6H, 3*CH2), 2,10 (s, 3H, CH3), 1,70 (m, 2H, CH2).

Primer 23

4 - benzoil - 3 - metil - 5 -( 2 - okso - 1 . 2 - dihidroindol - 3 - Hidenmetil )- 4 - mei \ l - 1H - oirol - 2 -

karboksilna kiselina ( 3 - oirolidin - 1 - ilorooil ) amid

<1>H NMR (360 MHz, DMSO-d6) 8: 14,18 (s, 1H, NH), 11,14 (br s, 1H, NH), 8,01 (m, 1H, CONHCH2), 7,74 (m, 1H), 7,67 (m, 1H), 7,55 (m, 1H), 7,32 (s, 1H, H-vinil), 7,17 (m, 1H), 6,92 (m, 1H), 3,36 (m, 2H,CH2),2,44 (m, 6H, 3xCH2), 2,11 (s, 3H, CH3), 1,65-1,75 (m, 6H, 3*CH2).

MS-EI m/ z 482 [M+].

Primer 24

4 - benzoil - 5 -( 5 - bromo - 2<>kso - 1 , 2<lihidmindol - 3 - ilidenmetil )-^^

karboksilna kiselina ( 3 - oirolidin - 1 - iloropil ) amid

<1>H NMR (360 MHz, DMSO-d6) 6: 14,01 (s, H, NH), 11,18 (br s, 1H, NH), 7,98 (m, 1H, CONHCH2), 7,75 (m, 2H), 7,68 (m, 1H), 7,55 (m, 2H), 7,40 (m, 2H), 7,33 (dd, J=2,0 i 8,2Hz, 1H, H-6), 6,84 (d, J=8,2Hz, 1H, H-7), 3,34 (m, 2H, CH2), 2,42-2,47 (m, 6H, 3xCH2), 2,09 (s, 3H, CH3), 1,70 (m, 2H, CH2), 1,64 (m, 4H, 2xCH2).

Primer 25

4 - benzoil - 3 - metil - 5 -( 2<>kso - 1 . 2 - dihidroindol - 3jlidenmetil )-^

kiselina ( 3 - oirolidin - 1 - ilorooil ) amid

<1>H NMR (300 MHz, DMSO-d6) 8: 14,15 (s, 1H, NH), 11,16 (br s, 1H, NH), 7,98 (m, 1H, CONHCH2), 7,77 (d, J=7,7Hz, 2H), 7,69 (m, 1H), 7,53-7,63 (m, 4H), 7,44 (m, 2H), 7,33-7,37 (m, 2H), 7,24 (s, 2H), 7,12 (s, 1H), 3,36 (m, 2H, CH2), 2,43-2,8 (m, 6H, 3xCH2), 2,12 (s, 3H, CH3), 1,74 (m, 2H, CH2), 1,69 (m, 4H, 2xCH2).

MS-EIm/ z558 [M<+>].

Primer 26

4 - benzoil - 5 -( 6 - rrietoksi - 2 - okso - 1 . 2<lihidroindol - 3 - ilidenmetil )- 3 - m ^

karboksilna kiselina ( 3 - oirolidin - 1 - ilpropil ) amid

<1>H NMR (300 MHz, DMSO-d6) 8: 13,99 (s, 1H, NH), 11,05 (br s, 1H, NH), 7,93 (m, 1H, CONHCH2), 7,72 (m, 2H), 7,65 (m, 1H), 7,54 (m, 2H), 7,15 (s, 1H, H-

vinil), 7,04 (d, J=8,4Hz, 1H, H-4), 6,51 (dd, J=2,3 i 8,4Hz, 1H, H-5), 6,44 (d, J=2,3Hz, 1H, H-7), 3,74 (s, 3H, OCH3), 3,35 (m, 2H, CH2), 2,42-2,46 (m, 6H, 3xCH2), 2,10 (s, 3H, CH3), 1,72 (m, 2H,CH2),1,65 (m, 4H, 2xCH2). MS-EI m/ z 512 [M+].

Primer 27

4 - benzoi \- 5 -( 5 - metoksi - 2< ) kso - 1 . 2 - dihidroindol - 3 - ilide

karboksilna kiselina ( 3 - oirolidin - 1 - ilorooil ) amid

<1>H NMR (360 MHz, DMSO-d6) 8: 14,24 (s, 1H, NH), 10,90 (brs, 1H, NH), 7,97 (m, 1H, CONHCH2), 7,75 (d, J=7,2Hz, 2H), 7,69 (m, 1H), 7,56 (m, 2H), 7,24 (s, 1H, H-vinil), 6,79 (m, 2H), 6,66 (m, 1H), 3,67 (s, 3H, OCH3), 3,34 (m, 2H, CH2), 2,43-2,48 (m, 6H, 3xCH2), 2,14 (s, 3H, CH3), 1,71 (m, 2H, CH2), 1,66 (m, 4H, 2*CH2).

MS-EI m/z 512 [M*].

Primer 28

4 - benzoil - 5 -( 5 - fluom - 2 - okso - 1 . 2<lihidmindol - 3 - ilidenmetil )- 3 - metM

karboksilna kiselina ( 3 - pirolidin - 1 - ilDropil ) amid

<1>H NMR (300 MHz, DMSO-d6) 8: 14,20 (s, 1H, NH), 11,14 (br s, 1H, NH), 8,03 (m, 1H, CONHCH2), 7,75 (m, 2H), 7,68 (m, 1H), 7,55 (m, 2H), 7,38 (s, 1H, H-vinil), 7,08 (m, 1H), 7,01 (m, 1H), 6,87 (m, 1H), 3,34 (m, 2H, CH2), 2,42-2,48 (m, 6H, 3xCH2), 2,09 (s, 3H, CH3), 1,70 (m, 2H,CH2),1,65 (m, 4H, 2xCH2).

MS-EIm/ z500 [M<+>].

Primer 29

4 - acetil - 5 -( 5 - bromo - 2<>kso - 1 . 2 - dihidroindol - 3 - ilidenmet ^

karboksilna kiselina ( 3 - dietilaminoprooil ) amid

Kondenzuje se 5-bromo-1,3-dihidroindol-2-on sa 4-acetil-5-formil-3-metil-1 H-pirol-2-karboksilna kiselina etilestrom po Postupku B, a zatim C, dajući naslovljeno jedinjenje.

<1>H NMR (300 MHz, DMSO-d6) 5: 14,19 (s, 1H, NH), 11,19 (br s, 1H, NH), 8,15 (m, 1H, CONHCH2), 8,11 (s, 1H, H-vinil), 7,72 (d, J=1,8Hz, 1H, H-4), 7,38 (dd, J=1,8i 8,2Hz, 1H, H-6), 6,87 (d, J=8,2Hz, 1H, H-7), 3,27 (m, 2H,CH2),2,57 (s, 3H, CH3CO), 2,46 (m, 9H, CH3i 3*CH2), 0,93 (t, J=7,1Hz, 6H, N(CH2CH3)2).

Primer 30

4 - acetil - 5 -( 5 - bmmo - 2< ) kso - 1 . 2<Jihidmindol - 3 - ilide

karboksilna kiselina ( 3 - pirolidin - 1 - ilpropil ) amid

<1>H NMR (300 MHz, DMSO-d6) 5: 8,14 (m, 1H, CONHCH2), 8,10 (s, 1H, H-vinil), 7,70 (d, 1H, H-4), 7,36 (dd, J=1,6 i 8,1Hz, 1H, H-6), 6,85 (d, J=8,1Hz, 1H, H-7), 3,32 (m, 2H,CH2),2,57 (S, 3H, CH3CO), 2,44 (s, 3H,CH3),2,35-2,48 (m, 6H, 3xCH3), 1,65-1,71 (m, 6H, 3xCH2).

MS m/z 499 i 501 [M<+>]i[M<+>+2].

Primer 31

4 - acetil - 5 -( 5 - bmmo - 2 - okso - 1 . 2<iihidmindol - 3 - ilidenmetil )- 3 - metM

karboksilna kiselina ( 3 - morfolin - 4 - ilproDil ) amid

<1>H NMR (300 MHz, DMSO-d6) 8: 14,20 (s, 1H, NH), 11,26 (br s, 1H, NH), 8,09 (m, 2H, Hvinil i CONHCH2), 7,73 (d, J=1,5Hz, 1H, H-4), 7,38 (dd, J=1,5 i 8,3Hz, 1H, H-6), 6,87 (d, J=8,3Hz, 1H, H-7), 3,55 (m, 4H, 2xCH2), 3,26 (m, 2H, CH2), 2,57 (s, 3H, CH30), 2,44 (s, 3H, CH3), 2,35 (m, 6H, 3xCH3), 1,68 (m, 2H, CH2).

MS-EI m/z 514 i 516 [M-1] i [M<+>+1].

Primer 32

4 - acetil - 5 - f5 - bromo - 2<>kso - 1 . 2<lihidmindol - 3 - ilidenmetil )- 3 - metil - 1H ^

karboksilna kiselina ( 3 - hidroksioropil ) amid

<1>H NMR (360 MHz, DMSO-d6) 8: 14,17 (s, 1H, NH), 11,25 (brs, 1H, NH), 8,10 (s, 1H, H-vinil), 8,03 (m, 1H, CONHCH2), 7,71 (br s, 1H, H-4), 7,37 (br d, J=8,4Hz, 1H, H-6), 6,87 (d, J=8,4Hz, 1H, H-7), 4,51 (br s, 1H, OH), 3,51 (br s, 2H, CH2), 3,36 (m, 2H, CH2), 2,57 (s, 3H, CH3CO), 2,43 (s, 3H, CH3), 1,70 (m, 2H, CH2).

MS-EIm/ z445 i 447 [M<+->1] i [M<+>+1].

Primer 34

4 - acetil - 5 -( 5 - bmmo - 2< ) kso - 1 . 2<lihidmindol - 3 - ilidenmetil )- 3 - m ^

karboksilna kiselina ( 3 - morfolin - 4 - iletil ) amid

<1>H NMR (360 MHz, DMSO-d6) 5: 14,19 (s, 1H, NH), 11,14 (br s, 1H, NH), 8,10 (s, 1H, H-vinil), 7,84 (m, 1H, CONHCH2), 7,71 (d, J=1,8Hz, 1H, H-4), 7,38 (dd, J=1,8 i 8,2Hz, 1H, H-6), 6,87 (d, J=8,2Hz, 1H, H-7), 3,58 (m, 4H, 2xCH2), 3,40 (m, 2H, CH2), 2,57 (s, 3H, CH3CO), 2,49 (m, 4H, 2xCH2), 2,45 (m, CH3 i CH2).

MS-EI m/z 500 i 502 [M<+->1] i [M<+>+1].

Primer 35

4 - acetil - 5 -( 5 - bromo - 2 ^ kso - 1 . 2<lihidmindol - 3 - ilidenmetil )- 3 - meM

karboksilna kiselina ( 3 - Dirolidin - 1 - iletil ) amid

<1>H NMR (360 MHz, DMSO-d6) 5: 14,17 (s, 1H, NH), 11,23 (s, 1H, NH), 8,11 (s, 1H, H-vinil), 7,91 (m, 1H, CONHCH2), 7,73 (d, J=1,9Hz, 1H, H-4), 7,39 (dd, J=1,9 i 8,3Hz, 1H, H-6), 6,88 (d, J=8,3Hz, 1H, H-7), 3,40 (m, 2H, CH2), 2,62 (m, 2H,CH2),2,57 (s, 2H, CH3CO), 2,49 (m, 4H, 2xCH2), 2,4 (s, 3H, CH3), 1,69 (m, 4H, 2<x>CH2)

Primer 36

4 - acetil - 5 -( 5 - bromo - 2 ~ okso - 1 . 2 - dihidroindol - 3 - ilidenmetil )- 3 - metil - 1H - pirol - 2 -

karboksilna kiselina [ 2 -( 4 - hidroksifenil ) etil1amid

<1>H NMR (300 MHz, DMSO-d6) 6: 14,21 (s, 1H, NH), 11,18 (s, 1H, OH), 9,09 (s, 1H, NH), 8,06-8,10 (m, 2H), 7,73 (s, 1H), 7,38 (d, J=7,8Hz, 1H), 7,04 (d, J=7,1Hz, 2H), 6,88 d, J=7,8Hz, 1H), 6,67 (d, J=7,1Hz, 2H), 3,42 (m, 2H, CH2), 2,72 (m, 2H, CH2), 2,56 (s, 3H, CH3CO), 2,37 (s, 3H, CH3).

MS-EInVz507 i 509 [M<+->1] i [M<+>+1].

Primer 37

I

5 -( 5 - bromo - 2 - okso - 1 . 2<lihidroindol - 3 - ilid ^

karboksilna kiselina O - dietilaminoproDiDamid

Smeša 2-aminoacetofenon hidrohlorida (1 ekviv.), etil-izobutirilacetata (1,2 ekviv.) i natrijum-acetata (2,4 ekviv.) u vodi meša se 18 h na 100°C, a zatim ohladi na sobnu temperaturu. Vodeni sloj se dekantira, a ulje rastvori u etilacetatu. Zatim se opere vodom i rastvorom soli, pa osuši, dajući (93%) 2-izopropil-4-fenil-1H-pirol-3-karboksilna kiselina etilestar, kao crveno-mrko uje.

<1>H NMR (300 MHz, DMS0-d6) 5: 11,21 (s, br, 1H, NH), 7,14-7,27 (m, 5H), 6,70 (d, J=2,7Hz, 1H), 4,02 (d, J=7,1H, 2H, OCH2CH3), 3,65 (m, 1H, CH(CH3)2), 1,22 (d, J=7,5Hz, 6H, CH(CH3)2), 1,04 (t, J=7,1Hz, 3H, OCH2CH3). MS-EI m/ z 257 [M+].

Gornji pirol se formiluje korišćenjem Postupka A, dajući (41%) 5-formil-1-izopropil-4-fenil-1H-pirol-3-karboksilna kiselina etilestar, kao crvenkastu čvrstu supstancu.

<1>H NMR (300 MHz, DMSO-d6) 6: 12,35 (s, br, 1H, NH), 9,14 (s, 1H, CHO), 7,36 (s, 5H), 3,96 (q, J=7,1Hz, 2H, OCH2CH3), 3,74 (m, 1H, CH(CH3)2), 1,29 (d, J=6,9Hz, 6H, CH(CH)3)2), 0,90 (t, J=7,1Hz, 3H, OCH2CH3).

MS-EIm/ z285 [M<*>].

Hidrolizuje se estar pirolkarboksilne kiseline korišćenjem Postupka B, dajući (57%) 5-formil-2-izopropil-4-fenil-1H-pirol-3-karboksilnu kiselinu kao čvrstu supstancu bež boje.

<1>H NMR (300 MHz, DMSO-d6) 8: 12,28 (s, br, 1H, COOH), 12,02 (s, br, 1H, NH), 9,10 (s, 1H, CHO), 7,35 (s, 5H), 3,81 (m, 1H, CH(CH3)2), 1,28 (d, J=6,9Hz, 6H, CH(CH)3)2).

MS-EI m/ z 257 [M+].

Kondenzuje se 5-bromo-1,3-dihidroindol-2-on (120 mg, 0,31 mmol) sa 5-formil-2-izop ropil-4-fen il-1 H-pirol-3-karboksilna kiselina (3-dietilaminopropil)amidom (dobijen po Postupku C), dajući 120 mg (71%) naslovljenog jedinjenja<1>H NMR (300 MHz, DMSO-d6) 8: 14,23 (s, br, 1H, NH), 11,08 (s, br, 1H, NH), 7,38-7,55 (m, 7H, Ar-H i CONHCH2), 7,30 (s, 1H, H-vinil), 7,26 (dd, J=1,8 i 7,8Hz, 1H), 6,85 (d, J=8,7Hz, 1H), 3,36 (m, 1H, CH(CH3)2), 3,07 (m, 2H, CH2), 2,34 (q, J=7,1Hz, 4H, N(CH2CH3)2), 2,22 (t, J=6,9Hz, 2H, CH2), 1,40 (m, 2H, CH2), 1,31 (d, J=6,9Hz, 6H, CH(CH3)2), 0,86 (t, J=7,1Hz, 6H, N(CH2CH3)2).

MS-EI m/z 565,1 [M<+>+1].

Primer 38

5 -( 5 - bromo - 2 - okso - 1 . 2 - dihidroind

karboksilna kiselina ( 3 - pirolidin - 1 - ilpropil ) amid

Kondenzuje se 5-(5-bromo-2-okso-1,2-dihidroindol-3-ilidenmetil)-2-izopropil-4-fenil-1H-pirol-3-karboksilna kiselina (127 mg, 0,28 mmol) sa 3-pirolidin-1-il-propilaminom (43 mg, 0,336 mmol), dajući 140 mg (66%) naslovljenog jedinjenja.<1>H NMR (300 MHz, DMSO-d6) 8: 14,40 (s, br, 1H, NH), 7,38-7,47 (m, 7H), 7,23-7,27 (m, 2H), 6,84 (d, J=8,1Hz, 1H), 3,36 (m, 1H, CH(CH3)2), 3,08 (m, 2H, CH2), 2,30 (m, 4H, 2xCH2), 2,20 (t, J=7,0Hz, 2H, CH2), 1,62 (m, 4H, 2xCH2), 1,42 (t, J=7,0Hz, 2H, CH2), 1,31 (d, J=7,2Hz, 6H, CH(CH3)2).

MS-EIm/z560 i 562 [M<+->1] i [M<+>+1].

Primer 39

5 -( 5 - bromo - 2 - okso - 1 . 2<iihidmindol - 3 - ilidenmetil )- 2 - izoDroDil - 4 - fenil - 1H - Diml - 3 -

karboksilna kiselina ( 2 - dietilaminoetil ) amid

Kondenzuje se 5-bromo-1,3-dihidroindol-2-on (57 mg, 0,27 mmol) sa 5-formil-2-izopropil-4-fenil-1H-pirol-3-karboksilna kiselina (2-dietilaminoetil)amidom (120 mg), dajući 78 mg (53%) naslovljenog jedinjenja kao žutu čvrstu supstancu.

<1>H NMR (300 MHz, DMSO-d6) 8: 14,23 (s, br, 1H, NH), 11,09 (s, br, 1H, NH), 7,38-7,51 (m, 6H), 7,25-7,28 (m, 2H), 7,19 (t, 1H, CONHCH2), 6,85 (d, J=7,8Hz, 1H), 3,43 (m, 1H, CH(CH3)2), 3,11 (m, 2H, CH2), 2,28-2,39 (m, 6H, N(CH2CH3)2i CH2), 1,31 (d, J=6,9Hz, CH(CH3)2), 0,85 (t, J=7,0, 6H, N(CH2CH3)2).

MS-EIm/ z548 i 550 [M<+->1] i [M<+>+1].

Primer 40

5 -( 5 - bmmo - 2 - okso - 1 . 2<lihidmindol - 3 - iliden

karboksilna kiselina f3 -( 4 - metilDiDerazin - 1 - il ) DroDillamid

Kondenzuje se 5-bromo-1,3-dihidroindol-2-on (53 mg, 0,25 mmol) sa 5-formil-2-izopropil-4-fenil-1 H-pirol-3-karboksilna kiselina [3-(4-metilpiperazin-1 -il)propil]-amidom (300 mg), dajući 65 mg naslovljenog jedinjenja.

<1>H NMR (300 MHz, DMSO-d6) 6: 14,22 (s, br, 1H, NH), 11,08 (s, br, 1H, NH), 7,23-7,50 (m, 9H), 6,85 (d, J=8,7Hz, 1H), 3,37 (m, 1H, CH(CH3)2), 3,05 (m, 2H,CH2),2,24 (m, 8H, 4xCH2), 2,11 (m, 5H, CH2i CH3), 1,42 (m, 2H, CH2), 1,31 (d, J=7,2Hz, 6H, CH(CH3)2).

MS-EIm/ z589 i 591 [M<+->1] i [M<+>+1].

Primer 41

b ^( 5 ^ romo - 2 - okso - 1 . 2 ^ ihidroindol - 3 - ilidenmetil )- 2 ^

karboksilna kiselina

Kondenzuje se 5-bromo-1,3-dihidroindol-2-on (170 mg, 0,8 mmol) sa 5-formil-2-izopropil-4-fenil-1H-pirol-3-karboksilnom kiselinm (205 mg), koristeći Postupak D, dajući 210 mg (58%) naslovljenog jedinjenja kao žutu čvrstu supstancu.

<1>H NMR (300 MHz, DMSO-d6) 8: 14,31 (s, br, 1H, NH), 11,16 (s, br, 1H, NH), 7,26-7,44 (m, 7H), 7,11 (s, 1H, H-vinil), 6,85 (d, J=7,8Hz, 1H), 3,78 (m, 1H, CH(CH3)2), 1,34 (d, J=6,9Hz, 6H, CH(CH3)2).

MS-EI m/ z 452 [M++1].

Primer 42

5 -( 5 - bromo - 2 - okso - 1 . 2<lihidmindol - 3 - ilidenmetil )- 2 - metil - 4 - fenM

karboksilna kiselina ( 2 - pirolidin - 1 - iletil ) amid

Kondenzuje se 5-bromo-1,3-dihidroindol-2-on (44 mg, 0,21 mmol) sa 5-formil-2-metil-4-fenil-1H-pirol-3-karboksilna kiselina (2-pirolidin-1-iletil)amidom (70 mg, dobijen na isti način kao gornji izopropil-analog), dajući 0,03 g (27%) naslovljenog jedinjenja kao žutu čvrstu supstancu.

<1>H NMR (300 MHz, DMSO-d6) 6: 13,87 (s, br, 1H, NH), 11,11 (s, br, 1H, NH), 7,36-7,51 (m, 6H), 7,26 (dd, J=1,8 i 8,1 Hz, 1H), 7,2 (s, 1H, H-vinil), 7,09 (m, 1H, CONHCH2), 6,83 (d, J=8,1Hz, 1H), 3,17 (m, 2H, NCH2), 2,48 (m, CH3), 2,29-2,35 (m, 6H, 3xNCH2), 1,59 (m, 4H, 2xCH2).

MS-EI m/z 518 i 520 [M<+->1] i [M<+>+1].

Primer 435 - f6 -( 2 - metoksifenil )- 2<>kso ~ 1 . 2<iihidmindol - 3 - iliden

3 - karboksilna kiselina ( 2 - Dirolidin - 1 - iletil ) amid

Kondenzuje se 6-(2-metoksifenil)-1,3-dihidroindol-2-on (50 mg, 0,21 mmol) sa 5-formil-2-metil-4-fenil-1 H-pirol-3-karboksilna kiselina (2-pirolidin-1 -iletil)amidom (70 mg), dajući 0,04 g (35%) naslovljenog jedinjenja kao žuto-oranž čvrstu supstancu.

<1>H NMR (300 MHz, DMSO-d6) 5: 13,82 (s, br, 1H, NH), 11,02 (s, br, 1H, NH), 7,48 (m, 2H), 7,43 (m, 1H), 7,38 (m, 2H), 7,32 (m, 1H), 7,24 (m, 2H), 7,16 (s, 1H, H-vinil), 7,08 (m, 2H), 7,03 (m, 1H), 7,0 (m, 2H), 3,74 (s, 3H, OCH3), 3,19 (m, 2H), NCH2), 2,49 (m, CH3), 2,32-2,38 (m, 6H, 3<x>NCH2), 1,59 (m, 4H, 2xCH2).

MS-EI m/z 546 [M<+>].

Primer 44

5 -( 5 - bromo - 2 - okso - 1 . 2<lihidmindol - 3 - ilidenmetil )- 2 - met ^

karboksilna kiselina ( 2 - dimetilaminoetil ) amid

Kondenzuje se 5-bromo-1,3-dihidroindol-2-on (46 mg, 0,22 mmol) sa 5-formil-2-metil-4-fenil-1H-pirol-3-karboksilna kiselina (2-dimetilaminoetil)amidom (65 mg), dajući 60 mg (55%) naslovljenog jedinjenja kao žutu čvrstu supstancu.

<1>H NMR (360 MHz, DMSO-d6) 8: 13,86 (s, br, 1H, NH), 11,09 (s, br, 1H, NH), 7,47-7,49 (m, 2H), 7,38-7,41 (m, 4H), 7,26 (dd, J=2,2 i 8,3Hz, 1H), 7,21 (s, 1H, H-vinil), 7,04 (m, 1H, CONHCH2), 6,77 (d, J=8,3Hz, 1H), 3,15 (m, 2H, NCH2), 2,48 (m, CH3), 2,16 (t, J=6,8Hz, 2H, 3xNCH2), 2,02 (s, 6H, 2xNCH3).

MS-EI m/z 493 i 498 [M<+>i M<+>+2].

Primer 455 - f6 -( 2 - metoksifenil )- 2 - okso - 1 . 2 - dihidroindol - 3 - ilidenmetill - 2 - metil - 4 - fenil - 1H - pirol -

3 - karboksilna kiselina ( 2 - dimetilaminoetil ) amid

Kondenzuje se 2-(2-metoksifenil)-1,3-dihidroindol-2-on (53 mg, 0,22 mmol) sa 5-formil-2-metil-4-fenil-1 H-pirol-3-karboksilna kiselina (2-dimetilaminoetil)amidom (65 mg), dajući 0,05 g (44%) naslovljenog jedinjenja kao oranž gumu.

<1>H NMR (300 MHz, DMSO-d6) 8: 13,82 (s, br, 1H, NH), 11,02 (s, br, 1H, NH), 7,37-7,52 (m, 5H), 7,32 (m, 1H), 7,22-7,27 (m, 2H), 7,16 (s, 1H), 7,08 (m, 2H), 7,03 (m, 1H), 7,0 (m, 2H), 3,74 (s, 3H, OCH3), 3,15 (m, 2H, NCH2), 2,49 (m, CH3),2,16 (t, J=6,5Hz, 2H, NCH2), 2,02 (s, 6H, 2*NCH3).

MS-EIm/ z521 [M<+>].

Primer 46

5 -( 5 - bmmo - 2<>kso - 1 . 2<lihidmindol - 3 - ilidenmetil )- 2 - metil - 4 - fenM

karboksilna kiselina etilestar

Kondenzuje se 5-bromo-1,3-dihidroindol-2-on (60 mg, 0,29 mmol) sa 5-formil-2-metil-4-fenil-1H-pirol-3-karboksilna kiselina etilestrom (75 mg), dajući 78 mg (60%) naslovljenog jedinjenja kao oranž čvrstu supstancu.

<1>H NMR (360 MHz, DMSO-d6) 8: 14,01 (s, br, 1H, NH), 11,13 (s, br, 1H, NH), 7,42-7,46 (m, 3H), 7,27-7,34 (m, 4H), 7,12 (s, 1H), 6,84 (dd, J=2,2 i 8,3Hz, 1H), 3,99-4,03 (m, 2H, OCH2CH3), 2,61 (s, 3H, CH3), 0,98-1,03 (m, 3H, OCH2CH3). MS-EIm/ z450 i 452 [M<+->1] i [M<+>+1].

Primer 47

5 -( 5 - bmmo - 2<>kso - 1 . 2<lihidn3indol - 3 - ilidenmetil )- 2 - metil - 4 -^

karboksilna kiselina ( 3 - dietilaminoproDit ) amid

Kondenzuje se 5-bromo-1,3-dihidroindol-2-on (0,47 g, 2,2 mmol) sa 5-formil-2-metil-4-fenil-1H-pirol-3-karboksilna kiselina (3-dietilaminopropil)amidom (0,75 g), dajući 0,11 g (42%) naslovljenog jedinjenja kao oranž čvrstu supstancu.

<1>H NMR (30 MHz, DMS0-d6) 8: 13,86 (s, br, 1H, NH), 7,42-7,46 (m, 3H), 7,37-7,50 (m, 7H), 7,24-7,28 (m, 2H), 6,83 (d, J=8,1Hz, 1H), 3,09 (m, 2H, NCH2), 2,45

(s, 3H, CH3), 2,38 (q, J=7,1Hz, 4H, 2xNCH2CH3), 2,26 (t, J=6,9Hz, 2H, NCH2), 1,42 (m, 2H, NCH2), 0,87 (t, J=7,1Hz, 6H, 2xNCH2CH3).

MS-EIm/ z535,0 i 537 [M<+>i [M<+>+2].

Primer 48

5 -( 5 - bromo - 2 - okso - 1 . 2 - dihidroindol - 3 - ilidenmetil )- 2 . 4 - dimetil - 1 H - pirol - 3 -

karboksilna kiselina ( 2 - dimetilamino - etil ) amid

Smeša ferc-butil 3-oksibutirata i natrijum-nitrita (1 ekviv.) u sirćetnoj kiselini meša se na sobnoj temperaturi, dajući ferc-butil-2-hidroksiimino-3-oksibutirat. Mešaju se 1 h na 60°C, u sirćetnoj kiselini, etil-3-oksibutirat (1 ekviv.), cink u prahu (3,8 ekviv.) i sirovi ferc-butil-2-hidroksiimino-3-oksibutirat. Reakciona smeša se prespe u vodu, a filtrat sakupi, dajući (65%) 2-ferc-butiloksikarbonil-3,5-dimetil-4-etoksikarbonilpirol.

Smeša 2-fe/c-butiloksikarbonil-3,5-dimetil-4-etoksikarbonilpirola i trietil-orto-formijata (1,5 ekviv.) u trifluorosirćetnoj kiselini meša se 1 h na 15°C. Reakcija se koncentriše, a ostatak prečisti, dajući (64%) 2,4-dimetil-3-etoksikarbonil-5-formilpirol, kao žute iglice.

Hidrolizuje se 2,4-dimetil-3-etoksikarbonil-5-formilpirol, uz korišćenje Postupka B, dajući (90%) 5-formil-2,4-dimetil-1H-pirol-3-karboksilnu kiselinu.

<1>H NMR (360 MHz, DMSO-d6) 8: 12 (br s, 2H, NH i C02H), 9,58 (s, 1H, CHO), 2,44 (s, 3H, CH3), 2,40 (s, 3H, CH3).

MS-EI m/ z 267 [M+].

Kondenzuje se 5-bromo-1,3-dihidroindol-2-on (170 mg, 0,8 mmol) sa 5-formil-2,4-dimetil-1H-pirol-3-karboksilna kiselina (2-dimetilaminoetil)amidom (0,2 g, dobijen po Postupku C) koristeći Postupak B, dajući 0,3 g (83%) naslovljenog jedinjenja kao žutu čvrstu supstancu.

<1>H NMR (360 MHz, DMSO-d6) 8: 13,60 (s, br, 1H, NH), 10,94 (s, br, 1H, NH), 8,07 (d, J=1,8Hz, 1H, H- 4), 7,75 (s, 1H, H-vinil), 7,44 (t, J=5,2Hz, 1H, CONHCH2), 7,24 (dd, J=1,8 i 8,4Hz, 1H, H-6), 6,82 (d, J=8,4Hz, 1H, H-7), 3,26-3,33 (m, 2H, NCH2), 2,42 (s, 3H, CH3), 2,41 (s, 3H, CH3), 2,38 (t, J=6,7Hz, 2H, NCH2), 2,18 (s, 6H, N(CH3)2).

MS-EI m/z 430 i 432 [M<+->1] i [M<+>+1].

Primer 49

2A<limetil - 5 -( 2 - okso - 6 - fenil - 1 . 2<Jihidmindol - 3 - ilidenmetil )- lH ^

kiselina ( 2 - dimetilaminoetil ) amid

Kondenzuje se 6-fenil-1,3-dihidroindol-2-on (0,17 g, 0,8 mmol) sa 5-formil-2,4-dimetil-1H-pirol-3-karboksilna kiselina (2-dimetilaminoetil)amidom (0,2 g), dajući 0,13 g (36%) naslovljenog jedinjenja kao žuto-oranž čvrstu supstancu.

<1>H NMR (360 MHz, DMSO-d6) 6: 13,59 (s, br, 1H, NH), 10,93 (s, br, 1H, NH), 7,85 (d, J=7,92Hz, 1H, H-4), 7,63-7,65 (m, 3H), 7,40-7,47 (m, 3H), 7,32-7,36 (m, 1H, Ar-H), 7,30 (dd, J=1,6 i 7,9Hz, 1H, H-5), 7,11 (d, J=1,6Hz, 1H, H-7), 3,28-3,34 (m, 2H, NCH2), 2,43 (s, 3H, CH3), 2,41 (s, 3H, CH3), 2,38 (t, J=6,8Hz, 2H, NCH2), 2,18 (s, 6H, N(CH3)2).

MS-EIm/ z428 [M<*>].

Primer 50

5 -( 5 - hlom - 2 - okso - 1 . 2<lihidmindol - 3 - ilidenmetil )- 2A<l ^

kiselina ( 2 - dimetilamino - etil ) amid

Kondenzuje se 5-hloro-1,3-dihidroindol-2-on (0,1 g, 0,6 mmol) sa 5-formil-2,4-dimetil-1H-pirol-3-karboksilna kiselina (2-dimetilaminoetil)amidom (0,15 g), dajući 0,22 g (90%) naslovljenog jedinjenja kao žutu čvrstu supstancu.

<1>H NMR (300 MHz, DMSO-d6) 6: 12,61 (s, br, 1H, NH), 10,98 (s, br, 1H, NH), 7,96 (d, J=2,0Hz, 1H, H-4), 7,75-(s, 1H, H-vinil), 7,50 (t, J=5,5Hz, 1H, CONHCH2), 7,12 (dd, J=2,0i 8,3Hz, 1H, H-6), 6,86 (d, J=8,3Hz, 1H, H-7), 3,26-3,31 (m, 2H, NCH2), 2,42 (s, 3H, CH3), 2,40 (s, 3H, CH3), 2,36 (t, J=6,6Hz, 2H, NCH2), 2,17 (s, 6H, N(CH3)2).

MS-EIm/ z386 [M<+>].

Primer 51

5 -( 5 - bromo - 2 - okso - 1 . 2 - dihidroindol - 3 - ilidenmetil )- 2 . 4 - dimetil - 1H - pirol - 3 -

karboksilna kiselina ( 2 - dietilamino - etil ) amid

Kondenzuje se 5-bromo-1,3-dihidroindol-2-on (0,17 g, 0,8 mmol) sa 5-formil-2,4-dimetil-1H-pirol-3-karboksilna kiselina (2-dietilaminoetil)amidom (0,2 g), dajući 0,09 g (26%) naslovljenog jedinjenja kao žutu čvrstu supstancu.

<1>H NMR (360 MHz, DMSO-d6) 5: 13,61 (s, br, 1H, NH), 10,98 (s, br, 1H, NH), 8,09 (d, J=1,7Hz, 1H, H-4), 7,76 (s, 1H, H-vinil), 7,42 (, J=5,5Hz, 1H, CONHCH2), 7,24 (dd, J=1,7 i 8,0Hz, 1H, H-6), 6,82 (d, J=8,0Hz, 1H, H-7), 3,23-3,32 (m, 2H, NCH2), 2,46-2,55 (m, 6H, 3xNCH2), 2,43 (s, 3H, CH3), 2,42 (s, 3H, CH3), 0,96 (t, J=7,2Hz, 6H, 2xNCH2CH3).

MS-EIm/z 458i 460 [M<+->1] i [M<+>+1].

Primer 52

karboksilna kiselina ( 3 - Dirolidin - 1 - iletil ) amid

Kondenzuje se 5-bromo-1,3-dihidroindol-2-on (0,09 g mg, 0,4 mmol) sa 5-formil-2,4-dimetil-1H-pirol-3-karboksilna kiselina (2-pirolidin-1-iletil)amidom (0,1 g), dajući 0,14 g (81%) naslovljenog jedinjenja kao žuto-oranž čvrstu supstancu.

<1>H NMR (300 MHz, DMSO-d6) 6: 13,61 (s, br, 1H, NH), 10,98 (s, br, 1H, NH), 8,09 (d, J=1,9Hz, 1H, H-4), 7,76 (s, 1H, H-vinil), 7,53 (t, J=5,5Hz, 1H, CONHCH2), 7,24 (dd, J=1,9 i 8,5Hz, 1H, H-6), 6,81 (d, J=8,5Hz, 1H, H-7), 3,29-3,35 (m, 2H, NCH2), 2,54 (t, J=6,9Hz, 2H, NCH2), 2,47 (m, ispid DMSO), 2,42 (s, 3H, CH3), 2,40 (s, 3H, CH3), 1,55-1,69 (m, 4H, 2xCH2).

MS-EIm/z456 i 458 [M<+->1] i [M<+>+1].

Primer 53

karboksilna kiselina ( 3 - imidazol - 1 - ilpropil ) amid

Kondenzuje se 5-bromo-1,3-dihidroindol-2-on (0,09 g, 0,4 mmol) sa 5-formil-2,4-dimetil-1H-pirol-3-karboksilna kiselina (3-imidazol-1-ilpropil)amidom (0,1 g), dajući 0,1 g (59%) naslovljenog jedinjenja kao oranž čvrstu supstancu.

<1>H NMR (300 MHz, DMSO-d6) 6: 13,63 (s, br, 1H, NH), 10,99 (s, br, 1H, NH), 8,09 (d, J=2,2Hz, 1H, H-4), 7,77 (s, 1H, H-vinil), 7,71 (t, J=5,7Hz, 1H,

CONHCH2), 7,65 (s, 1H, Ar-H), 7,25 (dd, J=2,2 i 8,4Hz, 1H, H-6), 7,20 (s, 1H, Ar-H), 6,89 (s, 1H, Ar-H), 6,81 (d, J=8,4Hz, 1H, H-7), 4,02 (t, J=6,7Hz, 2H, NCH2), 3,18 (q, J=6,7Hz, NCH2), 2,43 (s, 3H, CH3), 2,41 (s, 3H, CH3), 1,93 (m, 2H, CH2). MS-EIm/ z 467i 469 [M<+->1] i [M<+>+1].

Primer 54

5 - f6 -( 2 - metoksifenin - 2 - okso - 1 . 2<lihidmindo

karboksilna kiselina ( 2 - dimetilaminoetil ) amid

Kondenzuje se 6-(2-metoksifenil)-1,3-dihidroindol-2-on (30 mg, 0,13 mmol) sa 5-formil-2,4-dimetil-1H-pirol-3-karboksilna kiselina (2-dimetilaminoetil)amidom (30 mg), dajući 0,06 g (100%) naslovljenog jedinjenja kao žuto-oranž gumu.

<1>H NMR (300 MHz, DMSO-d6) 5: 13,60 (s, br, 1H, NH), 10,89 (s, br, 1H, NH), 7,79 (d, J=8,4Hz, 1H), 7,63 (s, 1H, H-vinil), 7,46 (t, J=5,5Hz, 1H, CONHCH2), 7,28-7,35 (m, 2H), 6,99-7,11 (m, 4H), 3,76 (s, 3H, OCH3), 3,27-3,31 (m, 2H, NCH2), 2,43 (s, 3H, CH3), 2,39 (s, 3H, CH3), 2,37 (m, 2H, NCH2), 2,18 (s, 6H, N(CH3)2).

MS-Ei m/ z 458 [M+].

Primer 55

5 - f6 -( 3 - metoksifenil )- 2 - okso - 1 . 2 - dihidroindol - 3 - ilidenmetill - 2 . 4 - dimetil - 1H - pirol - 3 -

karboksilna kiselina ( 2 - dimetilaminoetil ) amid

Kondenzuje se 6-(3-metoksifenil)-1,3-dihidroindol-2-on (30 mg, 0,13 mmol) sa 5-formil-2,4-dimetil-1H-pirol-3-karboksilna kiselina (2-dimetilaminoetil)amidom (30 mg), dajući 8 mg (14%) naslovljenog jedinjenja kao žuto-oranž čvrstu supstancu.<1>H NMR (360 MHz, DMSO-d6) 5: 13,59 (s, br, 1H, NH), 10,92 (s, br, 1H, NH), 7,84 (d, J=7,6Hz, 1H), 7,65 (s, 1H, H-vinil), 7,42 (m, 1H, CONH2CH2), 7,36 (d, J=7,8Hz, 1H), 7,29 (dd, J=1,6 i 7,6Hz, 1H), 7,20 (d, J=7,8Hz, 1H), 7,14 (d, J=2,8Hz, 1H), 7,11 (d, J=1,6Hz, 1H), 6,91 (dd, J=2,8 i 7,8Hz, 1H), 3,82 (s, 3H, OCH3), 3,21-3,33 (m, 2H, NCH2), 2,43 (s, 3H, CH3), 2,40 (s, 3H, CH3), 2,36-2,40 (m, 2H, NCH2), 2,18 (s, 6H, N(CH3)2).

MS-EIm/ z458 [M<+>].

Primer 56

2A<limetil - 5 -( 2 - okso - 5 - 1eni \- 1 . 2<lihidroind

kiselina ( 2 - dietilaminoetil ) amid

Kondenzuje se 5-fenil-1,3-dihidroindol-2-on (80 mg, 0,4 mmol) sa 5-formil-2,4-dimetil-1 H-pirol-3-karboksilna kiselina (2-dietilaminoetil)amidom (0,1 g, koristeći postupak B, dajući 79 mg (46%) naslovljenog jedinjenja.

<1>H NMR (300 MHz, DMSO-d6) 8: 13,66 (s, br, 1H, NH), 10,95 (s, br, 1H, NH), 8,15 (d, J=1,2Hz, 1H), 7,81 (s, 1H, H-vinil), 7,71 (d, J=7,5Hz, 1H), 7,40-7,47 (m, 4H), 7,31 (m, 1H), 6,95 (d, J=8,1Hz, 1H), 3,2-3,31 (m, 2H, NCH2), 2,46-2,55 (m, 6H, 3*NCH2), 2,44 (s, 6H, 2xCH3), 0,096 (t, J=7,4Hz, 6H, NCH2CH3).

MS-EI m/ z 456 [M+].

Primer 57

2A<limetil - 5 -( 2<>kso - 5 - fer \\\- 1 . 2<lihidmindol - 3 - ilide

kiselina ( 3 - Dirolidin - 1AM \\) amid

Kondenzuje se 5-fenil-1,3-dihidroindol-2-on (0,04 g, 0,2 mmol) sa 5-formil-2,4-dimetil-1H-pirol-3-karboksilna kiselina (2-pirolidin-1-iletil)amidom (0,04 g), dajući naslovljeno jedinjenje kao žuto-oranž čvrstu supstancu.

<1>H NMR (300 MHz, DMSO-d6) 8: 13,65 (s, br, 1H, NH), 10,96 (s, br, 1H, NH), 8,15 (d, J=1,0Hz, 1H), 7,80 (s, 1H, H-vinil), 7,71 (d, J=7,2Hz, 2H), 7,49 (t, J=6,3Hz, 1H, CONHCH2), 7,41-7,46 (m, 3H), 7,31 (m, 1H), 6,95 (d, J=7,8Hz, 1H), 4,08 (m, 4H, 2xNCH2), 3,32 (m, 2H, NCH2), 2,55 (t, J=7,1Hz, 2H, NCH2), 2,47 (m, ispod DMSO), 2,43 (s, 6H, 2xCH3), 1,66 (m, 4H, 2xCH2).

MS-EIm/ z454 [M<*>].

Primer 58

2A<limetil - 5 -( 2<>kso - 5 - ien \\- 1 . 2<lihidroindol - 3 - ilidenmetil )- 1H ^

kiselina ( 3 - imidazol - 1 - ilprooiDamid

Kondenzuje se 5-fenil-1,3-dihidroindol-2-on (8 mg, 0,04 mmol) sa 5-formil-2,4-dimetil-1H-pirol-3-karboksilna kiselina (3-imidazol-1-ilpropil)amidom (10 mg), dajući 10 mg (59%) naslovljenog jedinjenja kao oranž čvrstu supstancu.

<1>H NMR (300 MHz, DMSO-d6) 8: 13,67 (s, br, 1H, NH), 10,96 (s, br, 1H, NH), 8,16 (d, J=1,2Hz, 1H), 7,81 (s, 1H, H-vinil), 7,65-7,72 (m, 4H), 7,44 (m, 3H), 7,31 (m, 1H, CONHCH2), 2,44 (s, 6H, 2xCH3), 1,93 (m, 2H, CH2CH2CH2).

MS-EI m/ z 465 [M+].

Primer 59

2A - dimetil - 5 -( 2 - okso ^. fen \\- 1 . 2<lihidroindo

kiselina ( 2 - dietilaminoetil ) amid

Kondenzuje se 6-fenil-1,3-dihidroindol-2-on (0,08 g, 0,4 mmol) sa 5-formil-2,4-dimetil-1H-pirol-3-karboksilna kiselina (2-dietilaminoetil)amidom (0,1 g), dajući 65 mg (38%) naslovljenog jedinjenja kao žutu čvrstu supstancu.

<1>H NMR (300 MHz, DMSO-d6) 8: 13,61 (s, br, 1H, NH), 10,99 (s, br, 1H, NH), 7,86 (d, J=7,8Hz, 1H), 7,62-7,66 (m, 3H), 7,40-7,47 (m, 3H), 7,28-7,36 (m, 2H), 7,10 (d, J=1,2Hz, 1H), 3,26 (m, 2H, NCH2), 2,46-2,55 (m, 6H, 3xNCH2), 2,44 (s, 3H, CH3), 2,41 (s, 3H, CH3), 0,97 (t, J=7,2Hz, 6H, 2xNCH2CH3).

MS-EInVz456 [M<+>].

Primer 60

2A<iimetil - 5 -( 2<>kso ^ Aen \\- 12 - dihidroindol - 3 - ilide

kiselina ( 2 - pirolidin - 1 - iletil ) amid

Kondenzuje se 6-fenil-1,3-dihidroindol-2-on (30 mg, 0,15 mmol) sa 5-formil-2,4-dimetil-1H-pirol-3-karboksilna kiselina (2-pirolidin-1-iletil)amidom (40 mg), dajući 5,9 mg (8,5%) naslovljenog jedinjenja kao žuto-oranž čvrstu supstancu.

<1>H NMR (300 MHz, DMSO-d6) 8: 13,60 (s, br, 1H, NH), 10,99 (s, br, 1H, NH), 7,86 (d, J=7,8Hz, 1H), 7,63-7,66 (m, 3H), 7,51 (m, 1H, CONHCH2), 7,45 (m, 2H), 7,28-7,36 (m, 2H), 7,10 (d, J=1,5Hz, 1H), 3,31 (m, 6H, 3xNCH2), 2,55 (t, J=6,6Hz, 2H, NCH2), 2,43 (s, 3H, CH3), 2,40 (s, 3H, CH3), 1,67 (m, 4H, 2xCH2).

MS-EI m/ z 454 [M+].

Primer 612A<limetil - 5 -( 2 ^ ksoS - fen \\- 1 . 2<Jihidmind

kiselina ( 3 - imidazol - 1 - ilDrDDil ) amid

Kondenzuje se 6-fenil-1,3-dihidroindol-2-on (8 mg, 0,04 mmol) sa 5-formil-2,4-dimetil-1H-pirol-3-karboksilna kiselina (3-imidazol-1-ilpropil)amidom (10 mg), dajući 7,3 mg (43%) naslovljenog jedinjenja kao oranž čvrstu supstancu.

<1>H NMR (300 MHz, DMSO-d6) 6: 13,62 (s, br, 1H, NH), 10,99 (s, br, 1H, NH), 7,86 (d, J=8,2Hz, 1H), 7,62-7,70 (m, 5H), 7,45 (m, 2H), 7,35 (m, 1H), 7,30 (dd, J=1,4i 8,2Hz, 1H), 7,21 (s, 1H), 7,10 (d, J=1,4Hz, 1H), 6,89 (s, 1H), 4,02 (t, J=6,9Hz, 2H, CH2), 3,19 (m, 2H, NH2CH3), 2,43 (s, 3H, CH3), 2,41 (s, 3H, CH3), 1,93 (t, J=6,9Hz, 2H, NCH2).

MS-EI m/z 465 [M+].

Primer 62

5 -[ 6 -( 3 . 5 - dihlorofenil )- 2 - okso - 1 . 2 - dihidroindol - 3 - ilidenmetil1 - 2 , 4 - dimetil - 1H - pirol - 3 -

karboksilna kiselina ( 2 - dietilaminoetil ) amid

Kondenzuje se 6-(3,5-dihlorofenil)-1,3-dihidroindol-2-on (64 mg, 0,23 mmol) sa 5-formil-2,4-dimetil-1H-pirol-3-karboksilna kiselina (2-dietilaminoetil)amidom (60 mg), dajući 53 mg (44%) naslovljenog jedinjenja kao svetlomrku supstancu.

<1>H NMR (360 MHz, DMSO-d6) 5: 13,62 (s, br, 1H, NH), 10,99 (s, 1H, NH), 7,89 (d, J=7,9Hz, 1H, H^), 7,69-7,71 (m, 3H), 7,55 (m, 1H, CONHCH2), 7,37 (m, 2H), 7,14 (d, J=1,4Hz, 1H, H-7), 3,27 (m, 2H, NCH2), 2,48-2,58 (m, 6H, 3*NCH2), 2,45 (s, 3H, CH3), 2,42 (s, 3H, CH3), 0,97 (t, J=6,8Hz, 6H, 3xNHCH2CH3).

MS-EIm/ z526,9 [M<+>].

Primer 63

2A<limetil - 5 -( 2<>kso - 6 - o \ rić \ n - 3A \- 1 . 2<lihidmindo

karboksilna kiselina ( 2 - dietilaminoetil ) amid

Kondenzuje se 6-piridin-3Hl-1,3-dihidroindol-2-on (40 mg, 0,19 mmol) sa 5-formil-2,4-dimetil-1H-pirol-3-karboksilna kiselina (2-dietilaminoetil)amidom (50 mg), dajući 29 mg (33%) naslovljenog jedinjenja kao svetlooranž čvrstu supstancu.

<1>H NMR (300 MHz, DMSO-d6) 8: 13,62 (s, br, 1H, NH), 11,05 (s, br, 1H, NH), 8,86 (s, br, 1H), 8,53 (d, J=5,8Hz, 1H), 8,04 (m, 1H), 7,91 (d, J=8,1Hz, 1H), 7,70 (s, 1H, H-vinil), 7,40-7,48 (m, 2H), 7,35 (d, J=7,5Hz, 1H), 7,14 (s, 1H), 3,26 (m, 2H, NCH2), 2,48-2,55 (m, 3xNCH2), 2,42 (s, 3H, CH3), 2,38 (S, 3H, CH3), 0,96 (t, J=6,9Hz, 6H, 2xNCH2CH3).

MS-EIm/ z457 [M<+>].

Primer 64

2, 4- d/ roef//- 5- f2- o/ cso- 6- Piridin- 3- il- 12- d/^^^

karboksilna kiselina ( 2 - pirolidin - 1 - iletil ) amid

Kondenzuje se 6-piridin-3-il-1,3-dihidroindol-2-on (60 mg, 0,28 mmol) sa 5-formil-2,4-dimetil-1H-pirol-3-karboksilna kiselina (2-pirolidin-1-iletil)amidom (75 mg), dajući 90 mg (71%) naslovljenog jedinjenja kao svetlooranž čvrstu supstancu.

<1>H NMR (300 MHz, DMSO-d6) 8: 13,61 (s, br, 1H, NH), 11,05 (s, br, 1H, NH), 8,86 (d, J=1,5Hz, 1H), 8,54 (dd, J=1,5i 4,8Hz, 1H), 8,05 (m, 1H), 7,91 (d, J=7,8Hz, 1H), 7,70 (s, 1H, H-vinil), 7,44-7,53 (m, 2H), 7,36 (dd, J=1,5 i 8,1 Hz, 1H), 7,15 (d, J=1,2Hz, 1H), 3,33 (m, 2H, NCH2), 2,47-2,57 (m, 6H, 3xNCH2), 2,43 (s, 3H, CH3), 2,41 (s, 3H, CH3), 1,67 (m, 4H, 2xCH2).

MS-EI m/ z 455 [M*].

Primer 65

2. 4- d/ mef//- 6W2- ofrso- 6- piridin- 3- il- 1 . 2 - dihidroindol - 3 - ilidenmetil )- 1H - Dirol - 3 -

karboksilna kiselina ( 3 - dimetilaminoDroDil ) amid

Kondenzuje se 6-piridin-3-il-1,3-dihidroindol-2-on (42 mg, 0,2 mmol) sa 5-formil-2,4-dimetil-1H-pirol-3-karboksilna kiselina (3-dimetilaminopropil)amidom (50 mg), dajući 67 mg (75%) naslovljenog jedinjenja kao žuto-mrku čvrstu supstancu.

<1>H NMR (360 MHz, DMSO-d6) 8: 13,61 (s, br, 1H, NH), 11,00 (S, br, 1H, NH), 8,86 (s, br, 1H), 8,54 (s, br, 1H), 8,04 (m, 1H), 7,90 (d, J=8,0Hz, 1H), 7,69 (s, 1H, H-vinil), 7,63 (m, 1H), 7,45-7,48 (m, 1H), 7,35 (dd, J=1,7i 8,0Hz, 1H), 7,15 (d, J=1,7Hz, 1H), 3,21-3,27 (m, 2H, NCH2), 2,43 (s, 3H, CH3), 2,41 (s, 3H, CH3), 2,28 (m, 2H, NCH2), 2,14 (s, 6H, 2xNCH3), 1,64 (m, 2H, CH2).

MS-EI m/ z 443 [M+].

Primer 66

2A< ] imetil - 5 -( 2< ) kso - 5 - 1en \\- 12<lihidmindol - 3 - iliden

kiselina ( 3 - dimetilaminoDroDil ) amid

Kondenzuje se 5-fenil-1,3-dihidroindol-2-on (67 mg, 0,32 mmol) sa 5-formil-2,4-dimetil-1H-pirol-3-karboksilna kiselina (3-dimetilaminopropil)amidom (81 mg), dajući 40 mg (28%) naslovljenog jedinjenja kao oranž čvrstu supstancu.

<1>H NMR (360 MHz, DMSO-d6) 6: 13,66 (s, br, 1H, NH), 10,92 (s, br, 1H, NH), 8,14 (s, 1H), 7,79 (s, 1H), 7,71 (m, 2H), 7,62 (m, 1H), 7,44 (m, 3H), 7,32 (m, 1H), 6,95 (m, 1H), 3,33 (m, 2H, NCH2), 2,43 (s, 6H, 2xCH3), 2,27 (m, 2H, NCH2), 2,13 (s, 6H, 2xNCH3), 1,63 (m, 2H,CH2).

MS-EIm/ z442 [M<+>].

Primer 67

2A<limetil - 5 -( 2 - okso - 5 - 1er \\\- 12<lihidmindol - 3 - ilM ^

kiselina ( 3 - dietilaminoproDil ) amid

Kondenzuje se 5-fenil-1,3-dihidroindol-2-on (1,5 g, 7,16 mmol) sa 5-formil-2,4-dimetil-1H-pirol-3-karboksilna kiselina (3-dietilaminopropil)amidom (2 g), dajući 1,3 g (40%) naslovljenog jedinjenja kao žuto-oranž čvrstu supstancu.

<1>H NMR (360 MHz, DMSO-d6) 8: 13,64 (s, 1H, NH), 10,91 (s, 1H, NH), 8,14 (d, J=1,4Hz, 1H, Ar-H), 7,8 (s, 1H, Ar-H), 7,7 (dd, J=1,2 i 8,5Hz, 2H, Ar-H), 7,6 (t, J=5,3Hz, 1H, CONHCH2), 7,4 (m, 3H, Ar-H), 7,3 (t, J=7,4Hz, 1H, Ar-H), 6,9 (d, J=8,0Hz, 1H, Ar-H), 3,2 (m, 2H, CONHCH2), 2,5 (m, 12H, 3xNCH2), 1,61 (m, 2H, CH2CH2CH2), 0,93 (t, J=6,7Hz, 6H, NCH2CH3).

MS-EIm/ z470 [M<+>].

Primer 68

2A<limetil - 5 -( 2<>kso - 6 ^ en \\- 12<lihidmindol - 3 - ilidenmetil )- 1H ^

kiselina ( 3 - dietilaminoDroDil ) amid

Kondenzuje se 2-okso-2,3-dihidro-1H-indW-karboksilna kiselina (3-hloro-4-metoksifenil)amid (1 g, 3,16 mmol) sa 5-formil-2,4-dimetil-1/-/-pirol-3-karboksilna kiselina (3-dietilaminopropil)amidom (1 g), dajući 1,7 g (85%) naslovljenog jedinjenja žuto-oranž čvrstu supstancu.

MS-EI m/ z578,2 [M<+>].

Primer 70

karboksilna kiselina ( 3 - dietilaminoprooil ) amid

Kondenzuje se 5-bromo-1,3-dihidroindol-2-on (0,5 g, 2,36 mmol) sa 5-formil-2,4-dimetil-1H-pirol-3-karboksilna kiselina (3-dietilaminopropil)amidom (0,51 g), dajući 0,84 g naslovljenog jedinjenja kao crveno-oranž čvrstu supstancu.

<1>H NMR (360 MHz, DMSO-d6) 5: 13,61 (s, 1H, NH), 10,99 (s, 1H, NH), 8,09 (d, J=1,8Hz, 1H, Ar-H), 7,7 (m, 4H), 7,2 (dd, .7=1,8 i 8,3Hz, 2H, Ar-H), 6,8 (d, J=7,8Hz, 1H, Ar-H), 3,3 (br s, 4H, 2*NCH2), 3,2 (m, 2H, CONHCH2), 2,6 (br s, 2H, NCH2i 2xCH3), 2,4 (s, 6H, 2*CH3), 1,66 (m, 2H, CH2CH2CH2), 0,98 (t, J=7,1Hz, 6H, NCH2CH3).

MS-EIm/ z472 i 474 [M<+->1] i [M<+>+1].

Primer 71

5 -( 5 - bromo - 2<>kso - 12<lihidmindol - 3 - ilidenmetil )- 2A<lte ^

karboksilna kiselina ( 2 - dietilaminoetil ) amid

Kondenzuje se 5-bromo-1,3-dihidroindol-2-on (100 mg, 0,47 mmol) sa 5-formil-2,2-diizopropil-1H-pirol-3-karboksilna kiselina (2-dietilaminoetil)amidom (150 mg), dajući 0,15 g (62%) naslovljenog jedinjenja kao žuto-oranž čvrstu supstancu.

<1>H NMR (300 MHz, DMSO-d6) 5: 13,97 (s, 1H, NH), 10,95 (s, 1H, NH), 8,09 (d, J=1,2Hz, 1H, Ar-H), 7,84 (m, 1H), 7,79 (s, 1H), 7,23 (dd, J=1,3 i 8,1 Hz, 1H, Ar-H), 6,8 (d, J=8,1Hz, 1H, Ar-H), 3,5 (m, 1H, CH), 3,3 (m, 3H, CH i NHCH2), 2,5 (br m, 6H, 3xNCH2), 1,28 (d, J=6,9Hz, 6H, 2xCH3), 1,23 (d, J=6,6Hz, 6H, 2xCH3), 0,96 (m, 6H, 2xCH2CH3).

MS-EIm/ z514 i 516 [M<+->1] i [M<+>+1].

Primer 72

5 -( 5 - bmmo - 2 - okso - 12<lihidmindol - 3 - iM ^

karboksilna kiselina ( 3 - dietilaminoDroDil ) amid

Kondenzuje se 5-bromo-1,3-dihidroindol-2-on (90 mg, 0,42 mmol) sa 5-formil-2,4-diizopropil-1H-pirol-3-karboksilna kiselina (3-dietilaminopropil)amidom (140 mg), dajući 54 mg (25%) naslovljenog jedinjenja kao crveno-mrku čvrstu supstancu.

<1>H NMR (300 MHz, DMSO-d6) 6: 13,98 (s, 1H, NH) 10,96 (s, 1H, NH), 8,09 (d, J=1,7Hz, 2H), 7,78 (s, 1H, H-vinil), 7,23 (dd, J=1,7 i 8,1 Hz, 1H, Ar-H), 6,82 (d, J=8,1Hz, 1H, Ar-H), 3,5 (m, 1H, CH), 3,25 (m, 2H, NHCH2), 3,15 (m, 1H, CH), 2,7 (br s, 6H, 3xNCH2), 1,7 (br m, 2H, CH2CH2CH2), 1,28 (d, J=6,9Hz, 6H, 2xCH3), 1,24 (d, J=5,9Hz, 6H, 2xCH3), 1,06 (m, 6H, 2xCH2CH3).

MS-EIm/ z528 i 530 [M<+->1] i [M<+>+1].

Primer 73

5 -( 5 - bmmo - 2 - okso - 12<lihidmindol - 3 - ilidenmetil )- 2A<liizoDix } pM

karboksilna kiselina ( 3 - DiroHdin - 1 - ilDroDil ) amid

Kondenzuje se 5-bromo-1,3-dihidroindol-2-on (130 mg, 0,6 mmol) sa 5-formil-2,4-diizopropil-1H-pirol-3-karboksilna kiselina (3-pirolidin-1-ilpropil)amidom (150 mg, 0,45 mmol), dajući 36 mg (15%) naslovljenog jedinjenja kao smeđe-oranž čvrstu supstancu.

<1>H NMR (300 MHz, DMSO-d6) 8: 13,98 (s, 1H, NH), 10,97 (s, 1H, NH), 8,10 (d, J=1,6Hz, 2H), 7,78 (s, 1H, H-vinil), 7,23 (dd, J=1,6 i 7,6Hz, 1H, Ar-H), 6,82 (d, J=7,6Hz, 1H, Ar-H), 3,5 (m, 1H, CH), 3,25 (m, 2H, NHCH2), 3,15 (m, 1H, CH), 2,7 (br s, 6H, 3xNCH2), 1,7 (br m, 6H, 3xNCH2CH2), 1,28 (d, J=5,6Hz, 6H, 2xCH3), 1,24 (d, J=5,7Hz, 6H, 2xCH3).

MS-EIm/ z526 i 528 [M<+->1] i [M<+>+1].

Primer 74

karboksilna kiselina ( Diridin - 4 - ilmetil ) amid

Kondenzuje se 5-bromo-1,3-dihidroindol-2-on (170 mg, 0,8 mmol) sa 5-formil-2,4-dimetil-1H-pirol-3-karboksilna kiselina (piridin-4-ilmetil)amidom (200 mg), dajući 14 mg (4%) naslovljenog jedinjenja kao žutu čvrstu supstancu.

<1>H NMR (300 MHz, DMSO-d6) 6: 13,67 (s, 1H, NH), 11,01 (s, br, 1H, NH), 8,51 (dd, J=1,6i 4,3, 2H), 8,23 (t, J=6,0Hz, 1H, CONHCH2), 8,11 (d, J=1,9Hz, 1H), 7,78 (s, 1H, H-vinil), 7,31 (d, J=6,0Hz, 2H), 7,25 (dd, J=1,9 i 8,1 Hz, 1H), 6,82 (d, J=8,1Hz, 1H), 4,45 (d, J=6,0Hz, 2H, NCH2), 2,46 (s, 6H, 2*CH3).

MS-EIm/ z 450i 452 [M<+->1] i [M<+>+1].

Primer 75

5 - r6 -( 4 - butilfenil )- 2 - okso - 1 . 2 - dihidroindol - 3 - ilidenmetill - 2 . 4 - dimetil - 1H - pirol - 3 -

karboksilna kiselina ( 2 - Dirolidin - 1 - iletil ) amid

Kondenzuje se 5-[6-(4-butilfenil)]-1,3-dihidroindol-2-on (50 mg, 0,19 mmol) sa 5-formil-2,4-dimetil-1H-pirol-3-karboksilna kiselina (2-pirolidin-1 -iletil)amidom (50 mg), dajući 74 mg (76%) naslovljenog jedinjenja kao oranž čvrstu supstancu.

<1>H NMR (360 MHz, DMSO-d6) 5: 13,58 (s, 1H, NH), 10,93 (s, br, 1H, NH), 7,82 (d, J=7,9Hz, 1H), 7,63 (s, 1H, H-vinil), 7,54 (d, J=7,9Hz, 2H), 7,46 (m, 1H, CONH), 7,26 (m, 3H), 7,09 (s, 1H), 3,30 (m, 2H, CH2), 2,52-2,63 (m, 4H, 2*CH2), 2,49 (m, 4H, 2xCH2), 2,43 (s, 3H, CH3), 2,40 (s, 3H,CH3),1,68 (m, 4H,2xCH20,1,58 (m, 2H,CH2),1,34 (m, 2H,CH2),0,91 (tm, J=7,2Hz, 3H, CH2CH3).

MS-EI m/ z 510[M+].

Primer 76

5 -{ 6 -( 5 - izoDomDil - 2 - metoksifenil )- 2<fkso - 12 ^ ihidroin ^

dimetil - 1H - pirol - 3 - kart ) oksilna kiselina ( 2 - pirolidin - 1 - iletil ) amid

Kondenzuje se 6-(5-izopropil-2-metoksifenil)-1,3-dihidroindol-2-on (50 mg, 0,17 mmol) sa 5-formil-2,4-dimetil-1H-pirol-3-karboksilna kiselina (2-pirolidin-1-iletil)amidom (45 mg), dajući 67 mg (75%) naslovljenog jedinjenja kao oranž čvrstu supstancu.

<1>H NMR (360 MHz, DMSO-d6) 8: 13,60 (s, 1H, NH), 10,82 (s, br, 1H, NH), 7,77 (d, J=7,9Hz, 1H), 7,61 (s, 1H, H-vinil), 7,45 (m, 1H, CONH), 7,0-7,19 (m, 5H),

3,73 (s, 3H, OCH3), 3,32 (m, 2H,CH2),2,87 (m, 1H, CH(CH3)2), 2,56 (m, 2H,CH2),2,48 (m, 4H, 2xCH2), 2,43 (s, 3H, CH3), 2,40 (s, 3H, CH3), 1,68 (m, 4H, 2*CH2), 1,21 (d, J=6,8Hz, 6H, CH(CH3)2).

MS-EI m/ z527,2 [M<+>].

Primer 77

5 - r6 -( 4 - etilfenil )- 2 - okso - 1 . 2 - dihidroindol - 3 - ilidenmetil1 - 2 . 4 - dimetil - 1 H - pirol - 3 -

karboksilna kiselina ( 2 - Dirolidin - 1 - iletil ) amid

Kondenzuje se 6-(2,4-dimetoksifenil)-1,3-dihidroindol-2-on (51 mg, 0,19 mmol) sa 5-formil-2,4-dimetil-1 H-pirol-3-karboksilna kiselina (2-pirolidin-1 -iletil)amidom (50 mg), dajući 30 mg (31%) naslovljenog jedinjenja kao oranž čvrstu supstancu.<1>H NMR (300 MHz, DMSO-d6) 5: 13,59 (s, 1H, NH), 10,86 (s, br, 1H, NH), 7,75 (d, J=7,8Hz, 1H), 7,60 (s, 1H, H-vinil), 7,49 (m, 1H, CONH), 7,22 (d, J=8,4Hz, 1H), 7,03 (m 1H), 6,97 (s, 1H), 6,58-6,65 (m, 2H), 3,79 (s, 3H, OCH3), 3,76 (s, 3H, OCH3), 3,33 (m, 2H, CH2), 2,55 (m, 2H,CH2),2,50 (m, 4H, 2xCH2), 2,42 (s, 3H, CH3), 2,39 (s, 3H, CH3), 1,67 (m, 4H, 2xCH2).

MS-EI m/ z 514 [M*].

Primer 79

5 - r6 -( 3 - izoDroDilfenil )- 2 - okso - 1 . 2 - dihidroindol - 3 - ilidenmetill - 2 . 4 - dimetil - 1H - pirol - 3 -

karboksilna kiselina ( 2 - pirolidin - 1 - iletil ) amid

Kondenzuje se 6-(3-izopropilfenil)-1,3-dihidroindol-2-on (48 mg, 0,19 mmol) sa 5-formil-2,4-dimetil-1H-pirol-3-karboksilna kiselina (2-pirolidin-1-iletil)amidom (50 mg), dajući 59 mg (63%) naslovljenog jedinjenja kao oranž čvrstu supstancu.

<1>H NMR (300 MHz, DMSO-d6) 5: 13,63 (s, 1H, NH), 10,97 (s, br, 1H, NH), 7,87 (d, J=7,8Hz, 1H), 7,68 (s, 1H, H-vinil), 7,24-7,55 (m, H), 7,13 (m, 2H, CH2), 3,30 (m, 1H, CH(CH3)2), 2,60 (m, 2H, CH2), 2,50 (m, 4H, 2xCH2), 2,45 (s, 3H, CH3), 2,43 (s, 3H, CH3), 1,70 (m, 4H, 2xCH2), 1,27 (d, J=6,9Hz, 6H, CH(CH3)2).

MS-EI m/ z 496 [M+j.

Primer 80

5 -( 5 - fluoro - 2<tkso - 12 ^ ihidroindol - 3 - ilidenmetil ) 2

karboksilna kiselina ( 2 - dietilaminoetil ) amid

Kondenzuje se 5-fluoro-1,3-dihidroindol-2-on (0,54 g, 3,8 mmol) sa 5-formil-2,4-dimetil-1H-pirol-3-karboksilna kiselina (2-dietilaminoetil)amidom, dajući 0,83 g (55%) naslovljenog jedinjenja kao žuto-zelenu čvrstu supstancu.

<1>H NMR (360 MHz, DMSO-d6) 5: 13,66 (s, 1H, NH), 10,83 (s, br, 1H, NH), 7,73 (dd, J=2,5 i 9,4Hz, 1H), 7,69 (s, 1H, H-vinil), 7,37 (t, 1H, CONHCH2CH2), 6,91 (m, 1H), 6,81-6,85 (m, 1H), 3,27 (m, 2H, CH2), 2,51 (m, 6H, 3*CH2), 2,43 (s, 3H, CH3), 2,41 (s, 3H, CH3), 0,96 (t, J=6,9Hz, 6H, N(CH2CH3)2).

MS-EIm/ z398 [M<*>].

Primer 80 ( alternativna sinteza)

5 -[ 5 - fluom - 2 ^ kso - 1 . 2 - dihidro - indol -( 3Z )- ilidenmetill - 2 . 4 - dimetil - 1H - pirol - 3 -

karboksilna kiselina ( 2 - dietilaminoetil ) amid

Zagreju se na 100°C hidrazin hidrat (55%, 3000 mL) i 5-fluoroizatin (300 g). Tokom 120 min, uz mešanje, dodaje se još 5-fluoroizatina (500 g) u porcijama (od po 100 g). Smeša se zagreje na 100°C i meša 4 h. Smeša se ohladi na sobnu temperaturu, a talog se sakupi vakuum-filtriranjem, dajući sirovi (2-amino-5-fluoro-fenil)-sirćena kiselina hidrazid (748 g). Ovaj hidrazid se suspenduje u vodi (700 mL), a pH smeše se podesi na <pH 3, sa 12 M hlorovodoničnom kiselinom. Smeša se 12 h meša na sobnoj temperaturi. Talog se sakupi vakuum-filtriranjem, pa dva puta opere vodom. Proizvod se suši pod vakuumom, dajući 5-fluoro-1,3-dihidroindol-2-on (600 g, 73% prinos), kao mrki prah.<1>H NMR (dimetilsulfoksid-d6) 8: 3,46 (s, 2H, CH2), 6,75, 6,95, 7,05 (3xm, 3H, aromatični), 10,35(s, 1H, NH). MS m/ z152 [M+1].

Snažno se mešaju 3,5-dimetil-1H-pirol-2,4-dikarboksilna kiselina 2-terc-butiestar 4-etilestar (2600 g) i etanol (7800 mL), dok se lagano dodaje 10 M hlorovodonična kiselina (3650 mL). Temperatura poraste sa 25°C na 35°C i počne izdvajanje gasa. Smeša se zagreje na 54°C pa meša uz zagrevanje još 1 h, kada temperatura dostigne 67°C. Smeša se ohladi na 5°C, pa se uz mešanje lagano dodaje 32 L vode. Talog se sakupi vakuum-filtriranjem i tri puta opere vodom. Talog se suši na vazduhu do konstantne mase, dajući 2,4-dimetil-1H-pirol-3-karboksilna kiselina etilestar (1418 g, 87% prinos), kao ružičastu čvrstu supstancu. 1H NMR (dimetilsulfoksid-d6) 8: 2,10, 2,35 (2xs, 2*3H, 2xCH3), 4,13 (q, 2H, CH2), 6,37 (s, 1H, CH), 10,85 (s, 1H, NH). MSm/ z167 [M+1J.

Ohlade se na 4°C dimetilformamid (322 g) i dihlorometan (3700 mL) u kupatilu sa ledom, pa se uz mešanje doda fosfor-oksihlorid (684 g). Lagano, tokom 15 min, u alikvotima se dodaje čvrst 2,4-dimetil-1H-pirol-3-karboksilan kiselina etilestar (670 g). Maksimalna temperatura dostigne 18°C. Smeša se zagreva 1 h pod reluksom, ohladi na 10°C u kupatilu sa ledom, pa se brzo doda, uz snažno mešanje, 1,6 L vode. Temperatura poraste na 15°C. Uz snažno mešanje doda se 10 M hlorovodonična kiselina (1,6 L). Temperatura poraste na 22°C. Smeša se ostavi da stoji 30 min da se dozvoli slojevima da se razdvoje. Temperatura dostigne maksimalno 40°C. Vodenom sloju se podesi pH na 12-13 sa 10 M kalijum-hidroksidom (3,8 L), koji se dodaje takvom brzinom da se dozvoli da temperatura dostigne 55°C i tu se održava tokom dodavanja. Po završetku dodavanja smeša se ohladi na 10°C i meša 1 h. Talog se sakupi vakuum-filtriranjem i četiri puta opere vodom, dajući 5-formil-2,4-dimetil-1H-pirol-3-karboksilna kiselina etilestar (778 g, 100% prinos), kao žutu čvrstu supstancu.<1>H NMR (DMSO-de) 8: 1,25 (t, 3H, CH3), 2,44, 2,48 (2xS, 2x3H, 2xCH3), 4,16 (q, 2H, CH2), 9,59 (s, 1H, CHO), 12,15 (brs,1H, NH). MS m/ z 195 [M+1].

Refluksuju se 2 h uz mešanje 5-formil-2,4-dimetil-1H-pirol-3-karboksilna kiselina etilestar (806 g), kalijum-hidroksid (548 g), voda (2400 mL) i metanol (300 mL), pa se zatim ohlade na 8°C. Smeša se dva puta ekstrahuje dihlorometanom. Vodenom sloju se podesi pH na 4 sa 1000 mL 10 M hlorovodonične kiseline, držeći temperaturu ispod 15°C. Doda se voda da se olakša mešanje. Talog se sakupi vakuum-filtriranjem, tri puta opere vodom i suši pod vakuumom na 50°C, dajući 5-formil-2,4-dimetil-1H-pirol-3-karboksilnu kiselinu (645 g, 93,5% prinos) kao žutu čvrstu supstancu.<1>H NMR (DMSO-d6) 6: 2,40, 2,43 (2*s, 2*3H, 2xCH3), 9,57 (s, 1H, CHO), 12,07 (brs, 2H, NH+COOH). MS m/ z 168 [M+1].

Mešaju se na sobnoj temperaturi 5-formil-2,4-dimetil-1/-/-pirol-3-karboksilna kiselina (1204 g) i 6020 mL dimetilformamida, dok se dodaju 1 -(3-dimetil-aminopropil-3-etilkarbodiimid hidrohlorid (2071 g), hidroksibenzotriazol (1460 g), trietilamin (2016 mL) i dietiletilendiamin (1215 mL). Ova smeša se 20 h meša na sobnoj temperaturi. Smeša se razblaži sa 3000 mL vode, 2000 mL rastvora soli i 3000 mL zasićenog rastvora natrijum-bikarbonata, pa se pH podesi na više od 10, sa 10M natrijum-hidroksidom. Smeša se dva puta ekstrahuje, svaki put sa 5000 mL 10% metanola u dihlorometanu, ekstrakti se kombinuju, osuše iznad anhidrovanog magnezijum-sulfata i ispare do suva na rotacionom uparivaču. Smeša se razblaži sa 1950 mL toluena, pa ponovo ispari do suva na rotacionom uparivaču. Ostatak se triturira sa 3:1 heksan:dietiletrom (4000 mL). Taloži se sakupe vakuum-filtriranjem, dva puta operu sa 400 mL etilacetata i suše 21 h pod vakuumom na 34°C, dajući 5-formil-2,4-dimetil-1H-pirol-3-karboksilna kiselina (2-dietilaminoetil)amid (819 g, 43% prinos), kao svetlomrku čvrstu supstancu. 1H NMR (dimetilsulfoksid-d6) 6: 0,96 (t, 6H, 2xCH3), 2,31, 2,38 (2xS, 2xCH3), 2,51 (m, 6H, 3xCH2), 3,28 (2H, CH3), 7,34 (m, 1H, amidni NH), 9,56 (s, 1H, CHO), 11,86 (s, 1H pirolski NH). MSm/ z 266[M+1].

Zagrevaju se 3 h na 78°C 5-formil-2,4-dimetil-1/-/-pirol-3-karboksilna kiselina (2-dietilaminoetil)amid (809 g), 5-fluoro-1,3-dihidro-indol-2-on (438 g), etanol (8000 mL) i pirolidin (13 mL). Smeša se ohladi na sobnu temperaturu, a talog se sakupi vakuum-filtriranjem i opere etanolom. Ovaj talog se 30 min meša sa etanolom (5900 mL), na 72°C. Smeša se ohladi na sobnu temperaturu. Talog se sakupi vakuum-filtriranjem, opere etanolom i 130 h suši pod vakuumom na 54°C, dajući 5-[5-fluoro-2-okso-1,2-dihidro-indol-(3Z)-ilidenmetil]-2,4-dimetil-1H-pirol-3-karboksilna kiselina (2-dietilaminoetil)amid (1013 g, 88% prinos), kao oranž čvrstu supstancu. 1H NMR (dimetilsulfoksid-d6) 8: 0,98 (t, &H, 2xCH3), 2,43, 2,44 (2xs, 6H, 2xCH3), 2,50 (m, 6H, 3xCH2), 3,28 (q, 2H, CH2), 6,84, 6,92, 7,42, 7,71, 7,50 (5xm, 5H, aromatiči, vinil CONH), 10,88 (s, 1H, CONH), 13,68 (s, 1H, pirolski NH). MSm/ z397 [M-1].

Primer 81

3 - f4 -( 2<lietilaminoetilkarbamoil )- 3 . 5<1imetil - 1H - D ^

dihdro - 1H - indol - 6 - karboksilna kiselina

Kondenzuje se 2-okso-2,3-dihidro-1H-indol-6-karboksilna kiselina (80 mg, 0,45 mmol) sa 5-formil-2,4-dimetil-1H-pirol-3-karboksilna kiselina (2-dietilaminoetil)-amidom, dajući 210 mg (92%) naslovljenog jedinjenja kao žuto-oranž čvrstu supstancu.

<1>H NMR (360 MHz, DMSO-d6) 8: 13,6 (s, 1H, NH), 7,76 (d, J=8,0Hz, 1H), 7,66 (s, 1H, H-vinil), 7,57 (dd, J=1,5 i 8,0Hz, 1H), 7,40-7,42 (m, 2H), 3,28 (m, 2H, CH2), 2,88 (m, H-piperidin), 2,54 (m, 6H, 3xCH2), 2,44 (s, 3H, CH3), 2,40 (s, 3H, CH3), 1,56 (m, H-piperidin), 0,97 (t, J=6,98Hz, 6H, N(CH2CH3)2).

MSm/ z424 [M<+>].

Primer 82

5 -( 5<limetilsulfamoil - 2 - okso - 12 - dihidmindol - 3 - ilidenmetil )- 2A ^

karboksilna kiselina ( 2 - Dirolidin - 1 - iletil ) amid

Kondenzuje se 2-okso-2,3-dihidro-1H-indol-5-sulfonska kiselina dimetilamid (90 mg, 0,38 mmol) sa 5-formil-2,4-dimetil-1H-pirol-3-karboksilna kiselina (2-pirolidin-1-iletil)amidom (100 mg), dajući 100 mg (54%) naslovljenog jedinjenja kao žutu čvrstu supstancu.

<1>H NMR (360 MHz, DMSO-d6) 8: 13,65 (s, 1H, NH), 11,30 (s, br, 1H, NH), 8,25 (d, 1H), 7,92 (s, 1H, H-vinil), 7,48-7,53 (m, 2H), 7,07 (d, J=8,2Hz, 1H), 3,33 (m, 2H, CH2), 2,61 (s, 6H), N(CH3)2), 2,56 (t, 2H, CH2), 2,49 (m, 4H, 2xCH2), 2,45 (s, 3H, CH3), 2,44 (s, 3H, CH3), 1,67 (m, 4H, 2xCH2).

MS-EI m/ z 485 [M+J.

Primer 83

5 - f5 -( 3 - hlorofenilsulfamoil )- 2 - okso - 1 . 2 - dihidroindol - 3 - ilidenmetill - 2 . 4 - dimetil - 1H -

pirol - 3 - karboksilna kiselina ( 2 - Dirolidin - 1 - iletil ) amid

Kondenzuje se 2-okso-2,3-dihidro-1H-indol-5-sulfonska kiselina (3-hlorofenil)amid (120 mg, 0,38 mmol) sa 5-formil-2,4-dimetil-1H-pirol-3-karboksilna kiselina (2-pirolidin-1 -iletil)amidom (100 mg), dajući 150 mg (69%) naslovljenog jedinjenja, kao žuto-oranž čvrstu supstancu.

<1>H NMR (360 MHz, DMS0-d6) 5: 13,55 (s, 1H, NH), 11,26 (br s, 1H, NH), 10,30 (br s, 1H, NH), 8,26 (d, 1H), 7,79 (s, 1H, H-vinil), 7,51-7,57 (m, 2H), 7,22 (t, J=8,1Hz, 1H), 7,15 (m, 1H), 7,07 (m, 1H), 7,0 (m, 2H), 3,44 (m, 2H, CH2), 2,57 (t, J=7,0Hz, 2H, CH2), 2,49 (m, 4H, 2*CH2), 2,44 (s, 3H, CH3), 2,43 (s, 3H, CH3), 1,68 (m, 4H, 2xCH2).

MSm/ z568 [M<+>].

Primer 84

2A - dimetil - 5 -[ 2 - okso - 5 -( D \ nd \ n - 2 -\\ su \ famo ^

pirol - 3 - karboksilna kiselina ( 2 - Dirolidin - 1 - iletil ) amid

Kondenzuje se 2-okso-2,3-dihidro-1H-indol-5-sulfonska kiselina piridin-3-ilamid (110 mg, 0,38 mmol) sa 5-formil-2,4-dimetil-1H-pirol-3-karboksilna kiselina (2-pirolidin-1 -iletil)amidom (100 mg), dajući 150 mg (74%) naslovljenog jedinjenja, kao oranž čvrstu supstancu.

<1>H NMR (360 MHz, DMSO-d6) 5: 13,58 (s, 1H, NH), 8,21 (d, J=2,0Hz, 2H), 8,04 (m, 1H), 7,76 (s, 1H, H-vinil), 7,49-7,54 (m, 2H), 7,41 (m, 1H), 6,94 (d, J=8,5Hz, 1H), 3,33 (m, 2H, CH2), 2,56 (t, J=7,06 Hz, 2H, CH2), 2,49 (m, 4H, 2xCH2), 2,43 (s, 6H, 2xCH3), 1,68 (m, 4H, 2xCH2).

MSm/ z535 [M<+>].

Primer 85

3 - f3 . 5 - dimetil - 4 -( 4 - metilDiDemzin - 1 - karbonil )- 1H - piml - 3 - ilmetn ^^

hidroksietil )- 1 . 3 - dihidroindol - 2 - on

Kondenzuje se 4-(2-hidroksietil)-1,3-dihidroindol-2-on (71 mg, 0,4 mmol) sa 3,5-dimetil-4-(4-metil-piperazin-1-karbonil)-1/-/-pirol-2-karbaldehidom dajući 90 mg (55%) naslovljenog jedinjenja, kao oranž čvrstu supstancu.

<1>H NMR (360 MHz, DMSO-d6) 6: 14,25 (s, 1H, NH), 10,88 (s, 1H, NH), 7,57 (s, 1H, H-vinil), 7,03 (m, 1H), 6,75-6,82 (m, 2H), 4,86 (m, 1H, OH), 3,70 (m, 2H,CH2),3,04 (m, 2H, CH2), 2,48 (m, 4H, 2xCH2), 2,28 (br s, 7H), 2,29 (s, 3H, CH3), 2.18 (s, 3H,CH3).

MSm/ z(+van) 409,3 [M<+>].

Primer 86

3 -[ 3 . 5<limetil - 4 -( 4 - metilDiDemzin - 1 - karbonil )- 1H - Dim ^^

dihidro - 1H - indol - 5 - sulfonska kiselina fenilamid

Kondenzuje se 2-okso-2,3-dihdiro-1H-indol-5-sulfonska kiselina fenilamid (110 mg, 0,4 mmol) sa 3,5-dimetil-4-(4-metilpiperazin-1-karbonil)-1H-pirol-2-karbaldehidom (100 mg), dajući 50 mg (24%) naslovljenog jedinjenja, kao žutu čvrstu supstancu.

<1>H NMR (300 MHz, DMS0-d6) 8: 13,52 (s, 1H, NH), 11,26 (s, 1H, NH), 10,08 (s, 1H, NH), 8,21 (d, J=1,6Hz, 1H), 7,75 (s, 1H, H-vinil), 7,50 (dd, J=1,6 i 8,3Hz, 1H), 7.19 (m, 2H), 7,10 (m, 2H), 6,97 (m, 2H), 2,49 (m, 4H,2*CH2),2,28 (m, 10H, 2xCH3i 2xCH2), 2,18 (s, 3H, CH3).

MS-EI m/ z 519 [M+].

Primer 87

5 -( 5 - dimetilsulfonil - 2<>kso - 12<1ihidmindol - 3 - ilidenme

karboksilna kiselina ( 2 - deietilaminoetil ) amid

Kondenzuje se 2-okso-2,3-dihidro-1H-indol-5-sulfonska kiselina (3-hlorofenil)amid (120 mg, 0,38 mmol) sa 5-formil-2,4-dimetil-1H-pirol-3-karboksilna kiselina (2-dietilaminoetil)amidom (100 mg), dajući 80 mg (43%) naslovljenog jedinjenja, kao žutu čvrstu supstancu.

<1>H NMR (300 MHz, DMSO-d6) 8: 11,30 (s, 1H, NH), 8,27 (d, J=1,7Hz, 1H), 7,94 (s, 1H, H-vinil), 7,49 (dd, J=1,7 i 8,0Hz, 1H), 7,44 (m, 1H, CONHCH2CH2), 7,07

(d, J=8,0Hz, 1H), 3,26 (m, 2H, CH2), 2,60 (s, 6H, NCH3)2), 2,63 (m, CH2), 2,45-2,50 (m, 10H, 2xCH3i N(CH2CH3)2), 0,96 (t, J=7,2Hz, 6H, N(CH2CH3)2). MS-EI m/ z 487[M+].

Primer 88

5 - f5 -( 3 - hlorofenilsulfamoil )- 2 - oksc ~ 1 . 2 - dihidroindol - 3 - ilidenmetill - 2 . 4 - dimetil - 1H -

pirol - 3 - karboksilna kiselina ( 2 - dietilaminoetil ) amid

Kondenzuje se 2-okso-2,3-dihidro-1H-indol-5-sulfonska kiselina (3-hlorofenil)amid (120 mg, 3,8 mmol) sa 5-formil-2,4-dimetil-1/-/-pirol-3-karboksilna kiselina (2-dietilaminoetil)amidom (100 mg), dajući 80 mg (37%) naslovljenog jedinjenja, kao žutu čvrstu supstancu.

<1>H NMR (360 MHz, DMSO-d6) 8: 13,55 (s, 1H, NH), 11,24 (s, 1H, NH), 10,29 (s, 1H, NH), 8,25 (d, J=1,87Hz, 1H), 7,79 (s, 1H, H-vinil), 7,52 (dd, J=1,87 i 8,3Hz, 1H), 7,42 (m, 1H, CONHCH2CH2), 7,22 (t, J=8,02Hz, 1H), 7,15 (t, J=2Hz, 1H), 7,08 (m, 1H), 7,0 (m, 2H), 3,27 (m, 2H, CH2), 2,48-2,57 (m, 6H, 3xCH2), 2,45 (s, 3H, CH3), 2,44 (s, 3H, CH3), 0,97 (t, J=7,0Hz, 6H, N(CH2CH3)2).

MS m/ z 579,1 [M<+>].

Primer 95

3 -( 2 - okso - 5 - fen \\- 1 . 2 - dihidmindol - 3 - ilidenmetil )- 4 . 5 . 6J - tetmhi ^

karboksilna kiselina etilestar

<1>H NMR (360 MHz, DMSO-d6) 8: 13,74 (s, 1H, NH), 11,00 (s, 1H, NH), 8,13 (d, J=1,7Hz, 1H), 7,74 (s, 1H, H-vinil), 7,70 (d, J=7,7Hz, 2H), 7,49 (dd, J=1,7i 8,0Hz, 1H), 7,44 (t, J=7,7Hz, 2H), 7,32 (m, 1H), 6,96 (d, J=8,0Hz, 1H), 4,26 (q, J=7,0Hz, 2H, OCH2CH3), 2,79 (m, 2H, CH2), 2,72 (m, 2H, CH2), 1,73 (m, 4H, 2xCH2), 1,30 (t, J=7,0Hz, 3H, OCH2CH3).

MS-EI m/ z 412 [M+].

Primer 99

3- r2- o/ cso- 5- fenilsulfamoil- /. 2 - dihidroindol - 3 - ilidenmetil )- 4 . 5 , 6 . 7 - tetrahidro - 2H -

indol - 1 - karboksilna kiselina etilestar

<1>H NMR (360 MHz, DMSO-d6) 6: 13,64 (s, 1H, NH), 11,33 (s, 1H, NH), 10,07 (s, IH, NH), 8,24 (d, J=1,8Hz, 1H), 7,74 (s, 1H, H-vinil), 7,57 (dd, J=1,8 i 8,0Hz, 1H), 7,21 (t, J=7,6Hz, 2H), 7,11 (d, J=7,6Hz, 2H), 6,99 (d, J=8,0Hz, 1H), 6,98 (d, J=7,6Hz, 1H), 4,27 (q, J=7,0Hz, 2H, OCH2CH3), 2,80 (m, 2H, CH2), 2,73 (m, 2H, CH2), 1,73 (m, 4H, 2xCH2), 1,30 (t, J=7,0Hz, 3H, OCH2CH3).

MS-EI m/ z 491 [M+].

Primer 109

3 - f3 - morfolin - 4 - kamonil )- 4 . 5 . 6J - tetmhidro - 2H - izoin ^

dihidro - 1H - indol - 6 - karboksilna kiselina

<1>H NMR (360 MHz, DMSO-d6) 6: 13,60 (s, 1H, NH), 12,75 (br s, 1H, COOH), II, 08 (s, 1H, NH), 7,85 (d, J=7,8Hz, 1H), 7,71 (s, 1H, H-vinil), 7,62 (dd, J=1,4i 7,8Hz, 1H), 7,41 (d, J=1,4Hz, 1H), 3,65 (m, 4H, 2xCH2), 3,55 (m, 4H, 2xCH2), 2,81 (m, 2H, CH2), 2,54 (m, 2H, CH2), 1,73 (m, 4H, 2xCH2).

MS-EI m/ z 421 [M+].

Primer 112

5 - bromo - 3 - f3 -( Dirolidin - 1 - karbonil )- 4 , 5 . 6 . 7 - tetrahidro - 2H - izoindol - 1 - ilmetilenl - 1 . 3 -

dihidro - indol - 2 - on

<1>H NMR (360 MHz, DMSO-d6) 6. 13,56 (s, 1H, NH), 11,00 (s, 1H, NH), 8,05 (d, J=1,8Hz, 1H), 7,74 (s, 1H, H-vinil), 7,28 (dd, J=1,3 i 8,3Hz, 1H), 6,83 (d, J=8,3Hz, 1H), 3,57 (m, 4H, 2xCH2), 2,79 (m, 2H, CH2), 2,65 (m, 2H,CH2),1,88 (m, 4H, 2xCH2), 1,71 (m, 4, 2xCH2).

MS-EIm/ z 439i 441 [M<+->1] i [M<+>+1].

Primer 114

3 -( 3 - dimetilkarbamoil - 4 . 5 . 6 . 7 - tetrahidro - 2H - izoindol - 1 - ilmetilen )- 2 - okso - 2 . 3 -

dihidro - 1H - indol - 6 - karboksilna kiselina

<1>H NMR (360 MHz, DMSO-d6) 8: 13,60 (s, 1H, NH), 12,72 (br s, 1H, COOH), 11,05 (s, 1H, NH), 7,85 (d, J=7,9Hz, 1H), 7,72 (s, 1H, H-vinil), 7,62 (dd, J=1,3i

7,9Hz, 1H), 7,42 (d, J=1,3Hz, 1H), 3,03 (s, 6H, N(CH3)2), 2,81 (m, 2H, CH2), 1,73 (m, 4H, 2xCH2).

MS-EIm/ z379 [M<+>].

Primer 115

4 - metil - 5 -( 5 - metilsulfamoil - 2<>kso - 1 . 2<lihidm - indol - 3 - iliden

karboksilna kiselina

<1>H NMR (360 MHz, DMSO-d6) 8: 13,56 (br s, 1H, NH), 8,24 (d, J=1,5Hz, 1H), 7,86 (s, 1H, H-vinil), 7,74 (d, J=2,96Hz, 1H), 7,56 (dd, J=1,5i 8,1 Hz, 1H), 7,20 (brm, 1H, NHCH3), 7,03 (d, J=8,1Hz, 1H), 2,57 (s, 3H, CH3), 2,41 (s, 3H, CH3). MS-EIm/ z361 [M<*>].

Primer 116

M - metil - 5 -( 4 - metil - 5 - metilsulfamoil - 2< ) kso - 1 . 2 - dihidro ^ ndol - 3 - men 1H -

Dirol - 3 - karbonillaminoisirćetna kiselina etilestar

Formiluje se 4-metil-1H-pirol-3-karboksilna kiselina etilestar (literatura: D.O. Cheng, T.LBowman i E. leGoff,J. Heterocycli Chem.1976, 13, 1145-1147), koristeći Postupak A, pa se hidrolizuje, koristeći Postupak B, a zatim amiduje (Postupak C), dajući [(formil-4-metil-1H-pirol-3-karbonil)amino]sirćetna kiselina etilestar.

Kondenzuje se 4-metil-5-metilaminosulfonil-2-oksiindol (50 mg, 0,21 mmol) sa [(5-formil-4-metil-1H-pirol-3-karbonil)amino]sirćetna kiselina etilestrom (100 mg, 0,42 mmol) i piperidinom (0,1 mL) u etanolu (2 mL), dajući 50 mg (52%) naslovljenog jedinjenja.

<1>H NMR (360 MHz, DMSO-d6) 8: 13,59 (s, 1H, NH), 11,29 (v.br, s, 1H, NH-CO), 8,33 (t, J=5,8Hz, 1H, CONHCH2), 7,83 (d, J=3,1Hz, 1H), 7,80 (s, 1H, H-vinil), 7,71 (d, J=8,5Hz, 1H), 7,34 (br m, 1H, NHCH3), 6,89 (d, J=8,5Hz, 1H), 4,11 (q, J=7,1Hz, 2H, OCH2CH3), 3,92 (d, J=5,8Hz, 2H, GlyCH2), 2,86 (s, 3H, CH3), 2,48 (s, 3H, CH3), 2,42 (d, J=4,71Hz, 3H, HNCH3), 1,20 (t, J=7,1Hz, 3H, OCH2CH3).

MS-EI m/ z 460 [M+].

Primer 117

M - metil - 5 -( 5 - metilsulfamoil - 2 ^ kso - 12 ^ ihidm - indo

karbonillaminoJsirćetna kiselina etilestar

Smeša 5-metilaminosulfonil-2-oksiindola (0,06 g, 0,22 mmol), [(5-formil-4-metil-1H-pirol-3-karbonil)amino]sirćetna kiselina etilestra (0,075 g, 0,27 mmol) i piperidina (2 kapi) u etanolu (5 mL) zagreva se 12 h u zatopljenoj epruveti na 95°C. Posle hlađenja talog se sakupi vakuum-filtriranjem, opere etanolom, triturira dihlorometan/etrom i osuši, dajući 0,35 g (36%) naslovljenog jedinjenja, kao žućkasto-mrku čvrstu supstancu.

<1>H NMR (360 MHz, DMSO-d6) 8: 13,6 (s, 1H, NH), 11 (v.br, s, 1H, NH-CO), 8,30 (t, J=5,7Hz, 1H, CONHCH2), 8,25 (d, J=1,2Hz, 1H), 7,88 (s, 1H, H-vinil), 7,84 (d, J=3,3Hz, 1H), 7,57 (dd, J=1,9 i 8,5Hz, 1H), 7,14 (br m, 1H, NHCH3), 7,04 (d, J=8,5Hz, 1H), 4,11 (q, J=6,7Hz, 2H, OCH2CH3), 3,92 (d, J=5,7Hz, 2H, GlyCH2), 2,55 (s, 3H, CH3), 2,41 (m, 3H, NCH3), 1,20 (t, J=6,7Hz, 3H, OCH2CH3).

MS m/ z 446 [M+J.

Primer 118

{ f4 - metil - 5 -( 5 - metilsulfamoil - 2< ) kso - 12<lihidrc ^ ndol - 3 - ilidenme

karbonillaminoJsirčetna kiselina

Smeša [(5-formil-4-metil-1 /-/-pirol-3-karbonil)amino]sirćetna kiselina etilestra (0,142 g, 0,59 mmol) i 1M NaOH (1,2 mL) u metanolu (10 mL) meša se 1 h na sobnoj temperaturi. Reakcija se koncentriše, a ostatak kondenzuje sa 5 metilaminosulfonil-2-oksiindolom (0,13 g, 0,48 mmol) i piperidinom (0,12 mL) u etanolu (12 mL), dajući 0,11 g (52%) naslovljenog jedinjenja.

<1>H NMR (300 MHz, DMSO-d6)8: 13,98 (brs, 1H, NH), 8,17 (s, 1H), 7,80 (s, 1H), 7,75 (d, J=3,1Hz, 1H), 7,51 (dd,J=2i 8,2Hz, 1H), 7,21 (m preko brs, 2H), 6,97 (d, ,7=8,1 Hz, 1H), 3,41 (d, J=4,2Hz, 2H, CH2NH), 2,54 (s, 3H, pirol-CH3), 2,39 (s, 3H, Ar-CW3).

MS m/z 418 [Ml

Primer 120

5 - metil - 2 -( 2 - okso - 12<lihidro - indol - 3 - ilid ^ kiselina

<1>H NMR (300 MHz, DMSO-d6) 5: 13,77 (br s, 1H, NH), 12,49 (s, 1H, COOH), 11,07 (s, 1H, NH), 8,39 (s, 1H, H-vinil), 7,43 (d, J=7,47 Hz, 1H), 7,20 (t, J=7,47Hz, 1H), 7,03 (t, J=7,47Hz, 1H), 6,91 (d, J=7,47Hz, 1H), 6,49 (d, J=1,53Hz, 1H), 2,34 (s, 3H, CH3).

MS m/ z 269 [M+H]+.

Primer 121

5- metil- 2-( 2- okso- 1 2- dihidro- indol- 3- ilidenmetilY- 1 H- pirol- 3- karboksilna kiselina

etilestar

<1>H NMR (300 MHz, DMSO-d6) 5: 13,79 (s, 1H, NH), 11,08 (s, 1H, NH), 8,31 (s, 1H, H-vinil), 7,45 (d, J=7,52Hz, 1H), 7,20(t, J=7,52Hz, 1H), 7,03 (t, J=7,52Hz, 1H), 6,91 (d, J=7,52Hz, 1H), 6,50 (d, J=2,1Hz, 1H), 4,26 (q, J=7,2Hz, 2H, OCH2CH3), 2,33 (s, 3H, CH3), 1,32 (t, J=7,2Hz, 3H, OCH2CH3).

MS m/ z 297,1 [M+H]+.

Primer 122

2 -( 5 - bromo - 2 - okso - 12<lihidmindol - 3 - ilidenmetil )- 5 - metil - 1H - Di ^

kiselina etilestar

<1>H NMR (360 MHz, DMSO-d6) 8. 13,72 (s, 1H, NH), 11,16 (s, 1H, NH), 8,29 (s, 1H, H-vinil), 7,53 (d, J=2,0Hz, 1H), 7,35 (dd, J=2,0i 8,05Hz, 1H), 6,87 (t, J=8,05Hz, 1H), 6,53 (d, J=2,4Hz, 1H), 4,28 (q, J=7,03Hz, 2H, OCH2CH3), 2,35 (s, 3H, CH3), 1,33 (t, J=7,03Hz, 3H, OCH2CH3).

MS/rvz375i377 [M+H]+.

Primer 123

2 -( 5 - bromo - 2 - okso - 12<lihidmindol - 3 - ilidenmetil )- 5 - metil - 1H - piivl - 3 - kafa ^

kiselina

<1>H NMR (300 MHz, DMSO-d6) 8: 13,72 (s, 1H, NH), 12,57 (s, 1H, COOH), 11,19 (s, 1H, NH), 8,36 (s, 1H, H-vinil), 7,51 (d, J=1,4Hz, 1H), 7,34 (dd, J=1,4 i 8,17Hz, 1H), 6,87 (t, J=8,17Hz, 1H), 6,52 (d, J=2,5Hz, 1H), 2,35 (s, 3H, CH3).

MSm/ z347 i 349 [M+H]<+>.

Primer 124

2 -( 5 - bmmo - 2< ) kso - 12<lihidroindol - 3 - ilidenme

kiselina ( 2 - pirolidin - 1 - iletil ) amid

U rastvor 2-formil-5-metil-1/-/-pirol-3-karboksilne kiseline (250 mg, 1,63 mmol) u dimetilfromamidu (3 mL) doda se 1-etil-3-(3-dimetilaminopropil)karbodiimid (376 mg, 1,2 ekviv.), 1 -hidroksibenzotriazol (265 mg, 1,2 ekviv.), trietilamin (0,45 mL, 2 ekviv.) i 1-(2-aminoetil)pirolidin (023 mL, 1,1 ekvid). Posle mešanja preko noći na sobnoj temperaturi, reakcija se razblaži zasićenim natrijum-bikarbonatom i rastvorom soli (sa dodatnom solju), pa ekstrahuje sa 10% metanolom u dihlorometanu. Sjedinjeni organski slojevi se operu rastvorom soli, osuše iznad anhidrovanog natrijum-sulfata i koncentrišu, dajući 130 mg 2-formil-5-metil-1H-pirol-3-karboksilna kiselina (2-pirolidin-1-iletil)amida.

Smeša 5-bromo-2-oksiindola (106 mg, 0,5 mmol), 2-formil-5-metil-1 H-pirol-3-karboksilna kiselina (2-pirolidin-1-iletil)amida (125 mg, 1 ekviv.) i piperidina (0,2 mL) u etanolu (2 mL), zagreva se 1 h u zatopljenoj epruveti na 80°C, pa se zatim ohladi. Nastali talog se sakupi vakuum-filtriranjem, opere etanolom i etilacetatom i osuši, dajući naslovljeno jedinjenje kao oranž čvrstu supstancu.

<1>H NMR (300 MHz, DMSO-d6) 5: 13,62 (s, 1H, NH), 11,06 (brs, 1H, NH), 8,56 (s, 1H, H-vinil), 8,15 (m, 1H, CONHCH2), 7,48 (d, J=1,8Hz, 1H), 7,31 (dd, J=1,8 i 7,9Hz, 1H), 6,86 (d, J=7,9Hz, 1H), 6,60 (d, J=2,3Hz, 1H), 3,35 (m, 2H, HNCH2CH2), 2,56 (t, J=6,91Hz, 2H, HNCH2CH2), 2,35 (s, 3H, CH3), 1,67 (m, 4H, 2<x>CH2).

MSm/ z443/445 [M<+>i M<+>+2].

Primer 125

2 -( 5 - bivmo - 2<>kso - 124ihidmindol - 3 - ilidenmetil )- 5 - metil - 1H ^

kiselina ( 2 - dietilaminoetil ) amid

U rastvor 2-formil-5-metil-1H-pirol-3-karboksilne kiseline (3290 mg, 2,1 mmol) u dimetilformamidu (3 mL) doda se 1-etil-3-(3-dimetilaminopropil)karbodiimid (483 mg, 1,2 ekviv.), 1-hidroksibenzotriazol (340 mg, 1,2 ekviv.), trietilamin (0,59 mL, 2 ekviv.) i N,N-dietiletilendiamin (0,32 mL, 1,1 ekviv.). Pošto se preko noći meša na sobnoj temperaturi, reakcija se razblaži zasićenim natrijum-bikarbonatom i rastvorom soli (sa dodatnom solju), pa ekstrahuje sa 10% metanolom u dihlorometanu. Sjedinjeni organski slojevi se operu rastvorom soli, osuše iznad anhidrovanog natrijum-sulfata i koncentrišu, dajući 5-formil-5-metil-1 H-pirol-3-karboksilna kiselina (2-dietilaminoetil)amid.

Smeša 5-bromo-2-oksiindola (106 mg, 0,5 mmol), 2-formil-5-metil-1H-pirol-3-karboksilna kiselina (2-dietilaminoetil)amid (126 mg, 1 ekviv.) i piperidin (0,2 mL) u etanolu (2 mL), zagrevaju se 1 h u zatvorenoj epruveti na 80°C, a zatim ohlade. Talog se sakupi vakuum-filtriranjem, opere etanolom i etilacetatom, pa osuši, dajući naslovljeno jedinjenje kao oranž čvrstu supstancu.

<1>H NMR (360 MHz, DMSO-d6) 6: 13,62 (s, 1H, NH), 11,11 (brs, 1H, NH), 8,54 (s, 1H, H-vinil), 8,1 (m, 1H, CONH2CH2), 7,49 (d, J=2,2Hz, 1H), 7,31 (dd, J=2,2 i 8,3Hz, 1H), 6,86 (d, J=8,3Hz, 1H), 6,58 (d, J=2,24Hz, 1H), 3,31 (m, 2H, HNCH2CH2), 2,59 (m, 6H, 3xCH2), 2,36 (s, 3H, CH3), 0,99 (t, J=6,8Hz, 6H, N(CH2CH3)2).

MSm/ z 445/447[M<+>i M<+>+2].

Primer 126

2A - dimetil - 5 -( 2<>kso - 12<lihidro - indol - 3 - ilidenm

kiselina ( 2 - dietilaminoetil ) amid

Smeša 1,3-dihidro-indol-2-ona (266 mg, 2 mmol), 5-formil-2,4-dimetil-1H-pirol-3-karboksilna kiselina (2-dietilaminoetil)amida (530 mg, 2 mmol) i piperidina (1 kap) u etanolu, zagreva se 2 h na 90°C. Reakcija se ohladi na sobnu temperaturu, a nastali talog se sakupi vakuum-filtriranjem, opere etanolom i osuši, dajući 422 mg (55%) naslovljenog jedinjenja, kao svetložutu čvrstu supstancu.

<1>H NMR (400 MHz, DMSO-d6) 6: 13,7 (s, 1H, NH), 10,9 (s, 1H, NH), 7,88 (d, J=7,6Hz, 1H), 7,64 (s, 1H, H-vinil), 7,41 (t, J=5,4Hz, 1H NH), 7,13 (dt, J=1,2i 7,6Hz, 1H), 6,99 (dt, J=1,2 i 7,6Hz, 1H), 6,88 (d, J=7,6Hz, 1H), 3,28 (m, 2H),

2,48-2,55 (m, 6H), 2,44 (s, 3H, CH3), 2,41 (s, 3H, CH3), 0,97 (t, J=7,2Hz, 6H, N(CH2CH3)2).

MS +van APCI381 [M<+>+1].

Primer 127

5 -( 5 - hloro - 2<>kso - 12<lihidmindol - 3 - ilid ^

kiselina ( 2 - dietilaminoetill ) amid

Smeša 5-hloro-1,3-dihidro-indol-2-ona (335 mg, 2 mmol), 5-formil-2,4-dimetil-1 H-pirol-3-karboksilna kiselina (2-dietilaminoetil)amida (530 mg, 2 mmol) i piperidina (1 kap) u etanolu, meša se 2 h na 90°C. Reakcija se ohladi na sobnu temperaturu, a nastali talog se sakupi vakuum-fitlriranjem, opere etanolom i osuši, dajući 565 mg (68%) naslovljenog jedinjenja kao oranž čvrstu supstancu.

<1>H NMR (400 MHz, DMSO-d6) 8: 13,65 (s, 1H, NH), 11,0 (s, 1H, NH), 7,98 (d, J=2,1Hz, 1H), 7,77 (s, 1H, H-vinil), 7,44 (t, NH), 7,13 (dd, J=2,1 i 8,4Hz, 1H), 6,87 (d, J=8,4Hz, 1H), 3,28 (g, 2H), 2,48-2,53 (m, 6H), 2,44 (s, 3H, CH3), 2,43 (s, 3H, CH3), 0,97 (t, J=7,0Hz, 6H, N(CH2CH3)2).

MS +van APCI 415 [M++1].

Primer 128

2A<limetil - 5 -( 2 - okso - 1 . 2<lihidroindol - 3 - ilidenmetil )- 1H ^

kiselina { 2 - pirolidin - 1 - iletil ) amid

Kondenzuje se 1,3-dihidro-indol-2-on sa 5-formil-2,4-dimetil-1H-pirol-3-karboksilna kiselina (2-pirolidin-1-iletil)amidom, dajući 78 mg naslovljenog jedinjenja.

MS +van APCI 379 [M++1].

Primer 129

5 -( 5 - fluoro - 2 - okso - 12 - dihidm - indol - 3 - ilidenmetil )-^

kiselina ( 2 - pirolidin - 1 - iletil ) amid

Kondenzuje se 5-fluoro-1,3-dihidroindol-2-on sa 5-formil-2,4-dimetil-1H-pirol-3-karboksilna kiselina (2-pirolidin-1-iletil)amidom dajući naslovljeno jedinjenje.

MS +van APCI 397 [M++1].

Procedura uvećano<g>dobijania

Refluksuju se 4,5 h 5-formil-2,4-dimetil-1H-pirol-3-karboksilna kiselina (61 g), 5-fluoro-1,3-dihidro-indol-2-on (79 g), etanol (300 mL) i pirolidin (32 mL). U smešu se doda sirćetna kiselina (24 mL), pa se sa refluksovanjem nastavi još 30 min. Smeša se ohladi na sobnu temperaturu, a talog sakupi vakuum-filtriranjem i dva puta opere etanolom. Ovaj talog se 30 min mšea u 40% acetonu u vodi (400 mL), koji sadrži 12 M hlorovodoničnu kiselinu (6,5 mL). Talog se sakupi vakuum-filtriranjem i dva puta opere 40% acetonom u vodi. Talog se suši pod vakuumom, dajući 5-[5-fluoro-2-okso-1,2-dihidro-indol-(3Z)-ilidenmetil]-2,4-dimetil-1 H-pirol-3-karboksilnu kiselinu 886 g, 79% prinos), kao oranž čvrstu supstaricu.<1>H NMR (dimetilsulfoksid-de) 6: 2,48 , 2,50 (2*S, 6H, 2xCH3), 6,80, 6,88, 7,68, 7,72 (4xn, 4H, aromatični i vinil), 10,88 (s, 1H, CONH), 12,12 (s, 1H, COOH), 13,82 (s, 1H, pirolski NH). MSm/ z299 [M-1].

Mešaju se 5-[5-fluoro2-okso-1,2-dihidro-indol-(3Z)-ilidenmetil]-2,4-dimetil-1 H-pirol-3-karboksilna kiselina (100 g) i dimetilfromamid (500 mL), pa se dodaju benzotriazol-1-iloksi-tris(dimetilamino)fosfonijum heksafluorofosfat (221 g), 1-(2-aminoetil)pirolidin (45,6 g) i trietilamin (93 mL). Smeša se 2 h meša na temperaturi okoline. Čvrst proizvod se sakupi vakuum-filtriranjem i opere etanolom. Talog u gustoj suspenziji se, uz mešanje, pere u etanolu (500m L) 1 h na 64°C. Talog se sakupi vakuum-filtriranjem, opere etanolom i suši pod vakuumom, dajući 5-[5-fluoro-2-okso-1,2-dihidro-indol-(3Z)-ilidenmetil]-2,4-dimetil-1H-pirol-3-karboksilna kiselina (2-pirolidin-1-il-etil)amid (101,5 g, 77% prinos).<1>H NMR (dimetilsulfoksid-de) 8: 1,60 (m, 4H, 2xCH2), 2,40, 2,44 (2xs, 6H, 2xCH3), 2,50 (m, 4H, 2xCH2), 2,57, 3,35 (2xm, 4H, 2XCH2), 7,53, 7,70, 7,73, 7,76 (4xm, 4H, aromatični i vinil), 10,88 (s, 1H, CONH), 13,67 (s, 1H, pirolski NH). MS m/ z 396 [M+1].

Primer 130

5 -( 5 - hloro - 2 - okso - 12<iihidro - indol - 3 - ilidenmetil )- 2A<JimetM

karboksilna kiselina ( 2 - Dirolidin - 1 - iletil ) amid

Kondenzuje se 5-hloro-1,3-dihidro-indol-2-on sa 5-formil-2,4-dimetil-1H-pirol-3-karboksilna kiselina (2-pirolidin-1-iletil)amidom, dajući 78 mg naslovljenog jedinjenja.

MS +van APCI 413 [M++1].

Primer 131

2A<limetil - 5 -( 2< ) kso - 12<lihidm - indol - 3 - ilidenmetil )- 1H - D ^

kiselina ( 2 - dimetilaminoetil ) amid

Kondenzuje se 1,3-dihidro-indol-2-on sa 5-formil-2,4-dimetil-1H-pirol-3-karboksilna kiselina (2-dimetilaminoetil)amidom, dajući naslovljeno jedinjenje.

<1>H NMR (400 MHz, DMSO-d6) 5: 13,63 (s, 1H, NH), 10,90 (s, 1H, NH), 7,78 (d, J=7,8Hz, 1H), 7,63 (s, 1H, H-vinil), 7,48 (t, 1H, NH), 7,13 (dt, 1H), 6,98 (dt, 1H), 6,88 (d, J=7,7Hz, 1H), 3,31 (q, J=6,6Hz, 2H), 2,43 (s, 3H, CH3), 2,40 (s, 3H, CH3), 2,38 (t, J=6,6Hz, 2H), 2,19 (s, 6H, N(CH2CH3)2).

MS +van APCI 353 [M++1].

Primer 132

5 -( 5 - fluoro - 2< ) kso - 1 . 2<lihidm - indol - 3 - ilidenmetil )- 2A ^

karboksilna kiselina ( 2 - dimetilaminoetil ) amid

Kondenzuje se 5-fluoro-1,3-dihidroindol-2-on sa 5-formil-2,4-dimetil-1H-pirol-3-karboksilna kiselina (2-dimetilaminoetil)amidom, dajući naslovljeno jedinjenje.

<1>H NMR (400 MHz, DMSO-d6) 5: 13,68 (s, 1H, NH), 10,90 (s, 1H, NH), 7,76 (dd, J=2,4i 9,4Hz, 1H), 7,71 (s, 1H, H-vinil), 7,51 (t, 1H, NH), 6,93 (m, 1H), 6,84 (dd, J=4,6i 8,4Hz, 1H), 3,31 (q, J=6,6Hz, 2H), 2,43 (s, 3H, CH3), 2,41 (s, 3H, CH3), 2,38 (t, J=6,6Hz, 2H), 2,19 (s, 6H, N(CH2CH3)2).

MS +van APCI 371 [M<+>+1].

Primer 193

5 -[ 5 - fluom - 2<>kso - 1 . 2 - dihidm - indol -( 3Z )- ilidenmetill - 2A<limetM

karboksilna kiselina ( 2 - etilaminoetil ) amid

Refluksuju se 3 h, uz mešanje, 5-formil-2,4-dimetil-1/-/-pirol-3-karboksilna kiselina (2-etileaminoetil)amid (99 g), etanol (400 mL), 5-fluoro-2-oksiindol (32 g) i pirolidin (1,5 g). Smeša se ohladi na sobnu temperaturu, a talog sakupi vakuum-filtriranjem. Talog se meša u etanolu na 60°C, ohladi na sobnu temperaturu, pa sakupi vakuum-filtriranjem. Proizvod se osuši pod vakuumom, dajući 5-[5-fluoro-2-okso-1,2-dihidro-indol-(3Z)-ilidenmetil]-2,4-dimetil-1H-pirol-3-karboksilna kiselina (2-etilaminoetil)amid (75 g, 96% prinos).<1>H NMR (dimetilsulfoksid-de) 8: 1,03 (t, 3H, CH3), 2,42, 2,44 (2*s, 6H, 2*CH3), 2,56 (q, 2H, CH2), 2,70, 3,30 (2<*>t, 4H, 2xCH2), 6,85, 6,92, 7,58, 7,72, 7,76 (5xm, 5H, aromatični, vinil i CONH), 10,90 (brs, 1H, CONH), 13,65 (brs, 1H, pirol NH). MS m/ z369[M-1].

Primer 195

5 - f5 - fluoro - 2<>kso - 12<lihidm - indol - f3Z )- ilidenmetin - 2A ^

karboksilna kiselina ( 2 - dietil - N - oksoamino - etil ) amid

Postupak A:

Tretiraju se 5-[5-fluoro-2-okso-1,2-dihidro-indol-(3Z)-ilidenmetil]-2,4-dimetil-1H-pirol-3-karboksilna kiselina (2-dietilaminoetil)amid (598 mg) i dihlorometan (60 mL), u kupatilu sa ledom, sa 3-hloroperbenzoevom kiselinom (336 mg), pa se smeša preko noći meša na sobnoj temperaturi. Rastvarač se ispari na rotacionom uparivaču, a ostatak suspenduje u metanolu (20 mL). Doda se voda (20 mL), koja sadrži natrijum-hidroksid (240 mg), pa se smeša 1 h meša. Talog se sakupi vakuum-filtriranjem, opere sa 5 mL vode i suši pod vakuumom, dajući 5-[5-fluro-2-okso-1,2-dihidro-indol-(3Z)-ilidenmetil]-2,4-dimetil-1H-pirol-3-karboksilna kiselina (2-dietil-N-oksoamino-etil)amid (510 mg, 82% prinos), kao oranž čvrstu supstancu.

<1>H NMR (DMSO-de) 8: 13,72 (dd, 1H, aromatični), 7,70 (s, 1H, aromatični), 6,93 (td, 1H, CONH), 9,81 (br s, CONH), 7,75 (dd, 1H, aromatični), 7,70 (s, 1H, aromatični), 6,93 (td, 1H, aromatični), 6,84 (m, 1H, aromatični), 3,63 (m, 2H,

CH2), 3,29 (m, 2H, CH2), 3,14 (m, 4H, 2xCH2), 2,47 (s, 1H, CH3), 2,45 (s, 3H, CH3), 1,64 (t, 6H, 2<*>CH3), 1,64 (t, 6H, 2xCH3).

MS m/ z 415 [M+1].

Postupak B:

Suspenduje se 5-formil-2,4-dimetil-1H-pirol-3-karboksilna kiselina (2-dietilaminoetil)amid (10 g) u dihlorometanu (100 mL) i ohladi u kupatilu sa ledom. Uz mešanje se doda 3-hloroperbenzoeva kiselina (13,1 g), pa se smeša ostavi da se zagreje na sobnu temperaturu i onda preko noći meša. Smeša se ispari do suva na rotacionom uparivaču, pa hromatografira na koloni sa silikagelom, uz eluiranje sa 20% metanolom u dihlorometanu. Sjedine se frakcije koje sadrže proizvod, ispare do suva na rotacionom uparivaču, dajući 5-formil-2,4-dimetil-1H-pirol-3-karboksilna kiselina (2-dietil-N-oksoamino-etil)amid (9 g, 83% prinos).

Refluksuju se 4 h u etanolu (30 mL) 5-formil-2,4-dimetil-1H-pirol-3-karboksilna kiselina (2-dietil-N-oksoamino-etil)amid (9 g), 5-fluoro-1,3-dihidro-indol-2-on (9 g, 83% prinos) i pirolidin (9 g, 83% prinos 0,1g). Smeša se ohladi u kupatilu sa ledom, a talog sakupi vakuum-filtriranjem i opere etilacetatom, pa osuši pod vakuumom, dajući 5-[5-fluoro-2-okso-1,2-dihidro-indol-(3Z)-ilidenmetil]-2,4-dimetil-1/-/-širol-3-karboksilna kiselina (2-dietil-N-oksoamino-etil)amid (10,3 g, 80% prinos) kao oranž čvrstu supstancu.

<1>H NMR (DMSO-de) 8: 13,72 (brs, 1H, NH), 11,02 (brs, 1H, CONH), 9,81 (brs, 1H, CONH), 7,75 (dd, 1H, aromatični), 7,70 (s, 1H, aromatični), 6,93 (td, 1H, aromatični), 6,84 (m, 1H, aromatični), 3,63 (m, 2H, CH3), 3,29 (m, 2H, CH2), 3,14 (m, 4H, 2xCH2), 2,47 (s, 1H, CH3), 2,45 (s, 3H, CH3), 1,64 (t, 6H, 2xCH3).

MS m/ z 415 [M+1].

Primer 190

5 - r5 - fluom - 2< ) kso - 1 . 2 - dihidm - indol -( 3Z ) Hlidenm

karboksilna kiselina [ 2 - Diridin - 1 - il ) etil1amid

Mućka se 2-3 dana, na sobnoj temperaturi, 5-[5-fluoro-2-okso-1,2-dihidro-indol-(3Z)-ilidenmetil]-2,4-dimetil-1/-/-pirol-3-karboksilna kiselina (120 mg, 0,4 mmol) sa EDC, HCI (96 mg, 0,5 mmol), anhidrovanim 1-hidroksi-benztriazolom (68 mg, 0,5 mmol) i 2-(2-aminoetilpiridinom), dobijenim iz firme Aldrich u anhidrovanom DMF (3 mL). Reakciona smeša se razblaži sa 1M NaHC03(1,5 mL), a zatim sa 8 mL vode. Istaloženi sirovi proizvod se sakupi filtriranjem, opere vodom, osuši i prečisti kristalizacijom ili hromatografijom, dajući 5-[5-fluoro-2-okso-1,2-dihidroindol-(3Z)-ilidenmetil]-2,4-dimetil-1H-pirol-3-karboksilna kiselina [2-(piridin-1 - il)etil]-amid.

Primer 189

5 - r5 - hloro - 2 - okso - 12<lihidr - oindol -( 3Z )- ilidenmeW1 - 2A - dimetiM

karboksilna kiselinaf2 -( piridin - 1 - il ) etiljamid

Postupajući kao što je opisano u prethodnom Primeru, ali zamenjujući 5-[5-fluoro-2-okso-1,2-dihidro-indol-(3Z)-ilidenmetil]-2,4-dimetil-1H-pirol-3-karboksilnu kiselinu sa 5-[5-hloro-2-okso-1,2-dihidro-indol-(3Z)-ilidenmetil]-2,4-dimetil-1/-/- pirol-3-karboksilnom kiselinom (127 mg), dobije se 5-[5-hloro-2-okso-1,2-dihidroindol-(3Z)-ilidenmetil]-2,4-dimetil-1 H-pirol-3-karboksilna kiselina [2-(piridin-1 - il)etil]amid.

Primer 192

5 - 12 - okso - 1 . 2 - dihidro - indol -( 3Z )- ilidenmetil )- 2 . 4 - dimetil - 1H - pirol - 3 - karboksilna

kiselina f2 -( piridin - 1 - il ) etinamid

Postupajući kao što je opisano u Primeru 190, ali zamenjujući 5-[5-fluoro-2-okso-1,2-dihidro-indol-(3Z)-ilidenmetil]-2,4-dimetil-1H-pirol-3-karboksilnu kiselinu sa 5-[5-2-okso-1,2-dihidro-indol-(3Z)-ilidenmetil]-2,4-dimetil-1H-pirol-<3-karboksilnom kiselinom (113 mg), dobije se 5-[2-okso-1,2-dihidro-indol-(3Z)-ilidenmetil]-2,4-dimetil-1 H-pirol-3-karboksilna kiselina [2-(piridin-1 -il)etil]amid.

Primer 2035-/ 5- c// ano- 2- o/ cso- 12- d// 7/ d^

karboksilna kiselina [ 2 -( Diridin - 1 - il ) etill ) amid

Postupajući kao što je opisano u Primeru 190, ali zamenjujući 5-[5-fluoro-2-okso-1,2-dihidro-indol-(3Z)-ilidenmetil]-2,4-dimetil-1 H-pirol-3-karboksilnu kiselinu sa 5-[5-cijano-2-okso-1,2-dihidro-indol-(3Z)-ilidenmetil]-2,4-dimetil-1H-pirol-3-karboksilnom kiselinom (123 mg), dobije se 5-[5-cijano-2-okso-1,2-dihidro-indol-(3Z)-ilidenmetil]-2,4-dimetil-1 H-pirol-3-karboksilna kiselina [2-(piridin-1 -il)etil]-amid.

Primeri 142. 186. 187. 188 i 204

Postupajući kao što je opisano u Primerima 190, 189, 191, 192 i 203, ali zamenjujući 2-(2-aminoetil)piridn sa 1 -(2-aminoetil)pirolidinom, dobijenim iz firme Aldrich Companv Inc., dobiju se željena jedinjenja.

Primeri 143- 147

Postupa se kao što je opisano u Primerima 190, 189, 191, 192 i 203, ali se zamenjuje 2-(2-aminoetil)piridin sa 1-(2-aminoetil)aminom (2 ekvivalenta), u zatvorenom balonu, 30 min na 150°C, a sledi se procedura koja je opisana u U.S. Patent 2,613,212 (1960), firme Rohm & Haas Co. Sirovi proizvod se prečisti na silikagelu, a eluent je smeša hloroform-metanol-amonijak u vodi 80:25:2), dajući željeno jedinjenje.

Primeri 148- 151 i 184

Postupajući kao što je opisano u Primerima 190, 189, 191, 192 i 203, ali zamenjujući 2-(2-aminoetil)piridin sa 4-(2-aminoetil)piperazin-1-sirćetna kiselina etilestrom (dobijenim kao što sledi: piperazin-1-sirćetna kiselina etilestar (11,22

g) se tretira sa jodoacetonitrilom (5,o mL), u prisustvu kalijum-karbonata (6,9 g) u etilacetatu (260 mL), na 0°C. Posle završetka dodavanja svog jodoacetonitrila

(45 min), reakciona smeša se zatim 11 h meša na sobnoj temperaturi. Reakciona smeša se filtrira, a filtrat ispari. Ostatak se 2 dana hidrogenuje, u prisustvu kobalt-borida (dobijenog iz C0CI2i natrijum-borhidrida), na sobnoj temperaturi,

pod 3,4 bar, u etanolu. Filtriranje, isparavanje i hromatografsko prečišćavanje, koristeći kao eluent smešu hloroform-metanol-amonijak u vodi, 80:25:2, daje željeni amin (3,306 g) kao svetložuto ulje), dajući željena jedinjenja.

Primeri 152- 153

Postupajući kao što je opisano u Primerima 190, 189, 191, 192 i 203, ali zamenjujući 2-(2-aminoetil)piridin sa 2-[(2-aminoetilamino)]acetonitrilom (dobijenim kao što sledi: rastvor jodoacetonitrila (50 mmol) u etilalkoholu (80 mL) dodaje se 30 min rastvoru etilendiamina (150 mL) u etilalkoholu (60 mL), na 0°C. Sa mešanjem se nastavi još 1 h na 0°C, a zatim 14 h na sobnoj temperaturi. Doda se 55 mmol kalijum-karbonata, meša 30 min, filtrira i filtrat koncentriše na sobnoj temperaturi. Ostatak se prečisti na siiicijum-dioksidu, koristeći kao eluent smešu hloroform-metanol-amonijak u vodi 80:15:1,5), dajući 2-[(2-aminoetilaino)]acetonitril (3,550 g) koji se odmah koristi), dajući željena jedinjenja.

Primeri 154- 158

Postupajući kao što je opisano u Primerima 190, 189, 191, 192 i 203, ali zamenjujući 2-(2-aminoetil)piridin sa 1-(3-aminopropil)-azepin-2-onom (dobijenim prema proceduri koju je dao Kraft A.,J. Chem. Soc. Perkin Trans.1999,1,(6), 705-14, izuzev što je hidroliza čistog DBU obavljena na 145°C u prisustvu litijum-hidroksida (1 h, 5 mL DBU, 2 mL vode, 420 mg litijum-hidroksid hidrata). Prečišćavanje čistog proizvoda na siiicijum-dioksidu, koristeći kao eluent smešu hloroform-metanol-amonijak u vodi 80:40:4, daje1-(3-aminopropil)azepin-2-on (4,973 g, 87% prinos)), daje željena jedinjenja.

Primeri 133- 135. 159 i 200

Postupajući kao što je opisano u Primerima 190, 189, 191, 192 i 203, ali zamenjujući 2-(2-aminoetil)piridin sa N-acetil-etilendiaminom (dobijenim zagrevanjem smeše etilacetata sa etilendiaminom (1,5 ekviv.) na 160°C, tokom 1 h, u zatvorenom sudu. Vakuum destilacija daje željeni proizvod u 56% prinosu. N-acetildiamin je dostupan takođe iz firme Aldrich), daje željena jedinjenja.

Primeri 146- 140

Postupajući kao što je opisano u Primerima 190, 189, 191, 192 i 203, ali zamenjujući 2-(2-aminoetil)piridin sa 1-(3-aminopropil)-tetrahidro-pirimidin-2-onom (dobijenim na isti način kao i 1-(3-aminopropil)azepin-2-on, prema proceduri koju je dao Kraft A., uJ. Chem. Soc. Perkin Trans,1999,1(6), 705-14. Ukratko, zagrevaju se 1,3,4,6,7,8-heksahidro-2H-pirimido[1,2-a]pirimidin (4,939 g), litijum-hidroksid hidrat (918 mg) i 2 mL vode, bez rastvarača, u zatvorenom sudu, na 145°C, tokom 1 h. Sirovi proizvod se prečisti na koloni sa silicijum-dioksidom u hloroform-metanol-amonijaku u vodi, 80:40:4, dajući čist amin (5,265 g, 94% prinos).

Primeri 141. 160- 162 i 185

Postupajući kao što je opisano u Primerima 190, 189, 191, 192 i 203, ali zamenjujući 2-(2-aminoetil)piridin sa 1-(2-aminoetil)-piperazin-2-onom (dobijenim kao što sledi: čist butildifenilsililhlorid (25 mL, 97,7 mmol) se u kapima dodaje u rastvor DBU (19,5 mL, 130 mmol) i bis(2-aminoetil)amina (4,32 mL, 40 mmol) u anhidrovanom dimetilacetamidu (80 mL), na sobnoj temperaturi, nakon 5 min hlađenja u vodenom kupatilu. Smeša se 5 h meša. Posle hlađenja na sobnu temperaturu doda se čist bromosirćena kiselina etilestar (6,70 mL, 60 mmol). Reakcija se 25 min meša, a zatim ispari pod vakuumom. Ostatak se rastvori u metanolu (200 mL), dodaju KHC03(10 g) i KF (12 g, 200 mmol), pa se smeša 5 h meša na 60°C. Doda se 10 g Na2C03, meša 10 min, ohladi i filtrira. Filtrat se ispari. Ostatak se ekstrahuje heksanima (2x250 mL). Materijal koji je nerastvoran u heksanu rastvori se u etanolu (60 mL), filtrira i ispari. Ostatak se prečisti na koloni sa silicijum-dioksidom, u hloroform-metanol-amonijaku u vodi 80:40:4, dajući čisti amin (2,245 g, 74% prinos)) dobiju se željena jedinjenja.

Primeri 163- 167

Postupajući kao što je opisano u Primerima 190, 189, 191, 192 i 203, ali zamenjujući 2-(2-aminoetil)piridin sa 3-[(aminoetil)amino]propionitrilom (dobijenim iz etilendiamina (150 mL) i akrilonitrila (50 mmol) u THF, na sobnoj temperaturi, kao što su opisali Israel, M. et al., uJ. Med. Chem.1964, 7, 710-16, dajući željeni amin (4,294 g)) dobiju se željena jedinjenja.

Primer 168

5 -( 5 - fluoro - 2 - okso - 1 . 2 - dihidro - indol - 3 - ilidenmetil )- 2 . 4 - dimetil - 1H - pirol - 3 -

karboksilna kiselina [ 2 -( 4 - metilDiDerazin - 1 - il ) etillamid

U mešanu, blatnjavo-žutu smešu 5-[5-fluoro-2-okso-1,2-dihidro-indol-(3Z)-ilidenmetil]-2,4-dimetil-1H-pirol-3-karboksilne kiseline (90 mg), DMF (0,8 mL) i TEA (0,084 mL) u reaktoru u obliku epruvete od 20 mL, doda se reagens BOP (199 mg). Ova smeša za 5 min postane bistra. Bistroj smeši se doda 2-(4-metilpiperazin-1-iL)etilamin<1>(51 mg). Dobijeni rastvor se preko noći meša na sobnoj temperaturi. U reakcionom sistemu istaloži se žuti talog. Tankoslojna hromatografija (10% metanol u metilenhloridu) pokazuje da je sav polazni materijal konvertovan u proizvod. Talog se odvoji vakuum-filtriranjem i opere jedan put etanolom (1 mL). Talog se 20 min sonikuje u dietiletru (2 mL), pa sakupi vakuum-filtriranjem. Posle sušenja pod vakuumom dobije se 5-(5-fluoro-2-okso-1,2-dihidro-indol-3-ilidenmetil)-2,4-dimetil-1H-pirol-3-karboksilna kiselina (4-metilpiperazin-1-il-etil)-amid (79 mg, 62% prinos).

<1>H NMR (360 MHz, DMSO-d6) 6: 2,13 (s, 3H, CH3), 2,40, 2,42 (2*s, 6H, 2xCH3), 2,41 (m, 2H, CH2), 2,47 (m, 8H, 4xCH2), 3,30 (m, 2H, CH2), 6,82 (dd, J=4,5 i 8,7 Hz, 1H), 6,91 (td,<2>J=2,4Hz,<3>J=8,8Hz, 1H), 7,43 (t, J=5,6Hz, 1H), 7,70 (s, 1H), 7,75 (dd, J=2,8 i 9,6Hz, 1 H)(aromatični i vinil), 10,88 (s, 1H, CONH), 13,67 (s, 1H, NH). LC-MS (m/z) 424,4 (M-1).

Primer 169

5 -( 5 - hlom - 2< ) kso - 1 . 2<lihidro - indol - 3 - ilidenmetil )- 2 . 4<limetiM

karboksilna kiselina ( 4 - metilDiDerazin - 1 - iletil ) amid

Kada se sledi procedura iz Primera 168, ali se zameni 5-[5-fluoro-2-okso-1,2-dihidro-indol-(3Z)-ilidenmetil]-2,4-dimetil-1/-/-pirol-3-karboksilna kiselina sa 5-[5-hloro-2-okso-1,2-dihidro-indol-(3Z)-ilidenmetil]-2,4-dimetil-1H-pirol-3-karboksilnom kiselinom (95 mg, 0,3 mmol), dobije se 5-[5-hloro-2-okso-1,2-dihidro-indol-3-ilidenmetil]-2,4-dimetil-1 H-pirol-3-karboksilna kiselina (4-metilpiperazin-1 -il-etil)-amid (76 mg, 58%).

<1>H NMR (DMSO-de) 6: 2,13 (s, 3H, CH3), 2,41, 2,42 (2*s, 6H, 2xCH3), 2,42 (m, 2H, CH2), 2,48 (m, 8H, 4xCH2), 3,30 (m, 2H, CH2), 6,84 (d, J=8,0Hz, 1H), 7,11 (dd, J=2,0i 8,0Hz, 1H), 7,44 (t, J=5,6Hz, 1H), 7,76 (s, 1H), 7,97 (d, J=2,0Hz, 1H)(aromatični i vinil), 10,98 (s, 1H, CONH), 13,62 (s, 1H, NH). LC-MS (m/z) 440,2 (M-1).

Primer 170

5 -( 5 - bromo - 2 - okso - 12<iihidro - indol - 3 - ilidenmetil )- 2A ^

karboksilna kiselina ( 4 - metilDiDerazin - 1 - il - etil ) amid

Kada se sledi procedura opisana u Primeru 168, ali zamenjujući 5-[5-hloro-2-okso-1,2-dihidro-indol-3-ilidenmetil]-2,4-dimetil-1 H-pirol-3-karboksilnu kiselinu sa 5-[5-bromo-2-okso-1,2-dihidro-indol-3-ilidenmetil]-2,4-dimetil-1 H-pirol-3-karboksilnom kiselinom, dobije se 5-{5-bromo-2-okso-1,2-dihidro-indol-3-ilidenmetil]-2,4-dimetil-1 H-pirol-3-karboksilna kiselina (4-metilpiperazin-1 -iletil)amid (39 mg, 54%), iz SU 011670 (54 mg, 0,15 mmol).

<1>H NMR (DMSO-d6) 8: 2,14 (s, 3H, CH3), 2,41, 2,42 (2xS, 6H, 2xCH3), 2,42 (m, 2H, CH2), 2,48 (m, 8H, 4xCH2), 3,31 (m, 2H, CH2), 6,80 (d, J=8,0Hz, 1H), 7,23 (dd,J=2, 0i 8,0Hz, 1H), 7,44 (t, J=5,6Hz, 1H), 7,76 (s, 1H), 8,09 (d, J=2,0Hz, 1H)(aromatični i vinil), 10,99 (s, 1H, CONH), 13,61 (s, 1H, NH). LC-MS (m/z) 486,6 (M).

Primer 172

5 -( 2< ) kso - 1 . 2<lihidm - indol - 3 - ilidenmetil )- 2A<Jimetil - 1H - D ^

kiselina ( 4 - metilDiDerazin - 1 - il - etilamid

Postupajući po proceduri opisanoj u Primeru 168, ali zamenjujući 5-[5-fluoro-2-okso-1,2-dihidro-indol-3-ilidenmetil]-2,4-dimetil-1H-pirol-3-karboksilnu kiselinu SU 014900 sa 5-(2-okso-1,2-dihidro-indol-3-ilidenmetil)-2,4-dimetil-1H-pirol-3-karboksilnom kiselinom, dobije se 5-(2-okso-1,2-dihidro-indol-3-ilidenmetil]-2,4-dimetil-1H-pirol-3-karboksilna kiselina (4-metilpiperazin-1-il-etil)amid (136 mg, 84%) (112,8 mg, 0,4 mmol).

<1>H NMR (DMSO-de) 5: 2,13 (s, 3H, CH3), 2,39, 2,42 (2xs, 6H, 2xCH3), 2,42 (m, 2H, CH2), 2,48 (m, 8H, 4xCH2), 3,30 (t, 2H, CH2), 6,86 (d, J=8,0Hz, 1H), 6,96 (t, J=7,4Hz, 1H), 7,10 (t, J=7,8Hz, 1H), 7,41 (t, J=5,4Hz, 1H), 7,62 (s, 1H), 7,76 (d, J=7,6Hz, 1H)(aromatični i vinil), 10,88 (s, 1H, CONH), 13,61 (s, 1H, NH). LC-MS (m/z) 406,6 (M-1).

Primer 171

5 - r2 - okso - 1 . 2<lihidm - indol -( 3Z )- ilidenmetill - 2A<1imetil - 1H ^

karboksilna kiselina [ 2 -( 3 . 5 - dimetiloiDerazin - 1 - il ) etillamid

U mešanu, blatnjavo-žutu smešu 5-[2-okso-1,2-dihidro-indol-(3Z)-ilidenmetil]-2,4-dimetil-1H-pirol-3-karboksilne kiseline (112,8 mg, 0,4 mmol), DMF (0,5 mL) i trietilaimna (0,111 mL) u reaktoru u obliku epruvete od 20 mL, doda se reagens BOP (265 mg). Posle 5 min smeša postane bistra. U bistru smešu se doda 2-(2,6-dimetilpiperazin-1-il)etilamin (68,6 mg) (videti Tapia , L. Alonso-Cires, P. Lopez-Tudanca, R. Mosquera, L. Labeaga, A-lnnerarity, A. Orjales, uJ. Med. Chem.1999, 42, 2870-2880). Dobijeni rastvor se preko noći meša na sobnoj temperaturi. Tankoslojna hormatografija (10% metanol u metilenhloridu) pokazuje da je sav polazni materijal konvertovan u proizvod. Reakciona smeša se ispari do suva, a zatim prečisti fleš hromatografijom (CH2CI2/CH3OH, 20:1 do 15:1), posle čega sledi rekristalizacija, dajući 5-[2-okso-1,2-dihidro-indol-(3Z)-ilidenmetil]-2,4-dimetil-1 /-/-pirol-3-karboksilna kiselina [2-(3,5-dimetilpiperazin-1 - il)etil]amid (83 mg, 50% prinos).

<1>H NMR (DMSO-de) 6. 1,15, 1,16 (2xS, 6H, 2xCH3), 1,95 (t, J=11,6Hz, 2H, CH2), 2,41, 2,47 (2xs, &H, 2xCH3), 2,50 (m, 2H, CH2), 3,03 (d, J=10Hz, 2H), 3,19 (m, 2H), 3,30 (m, 2H, CH2), 6,86 (d, J=8,0Hz, 1H), 6,97 (t, J=7,2Hz, 1H), 7,11 (t,

J=7,8Hz, 1H), 7,48 (t, J=5,6Hz, 1H), 7,61 (s, 1H), 7,75 (d, J=7,6Hz, 1H)(aromatični i vinil), 10,88 (s, 1H, CONH), 13,62 (s, 1H, NH). LC-MS (m/z) 422,2 (M+1).

Primer 173

5 -[ 5 - fluoiv - 2<>kso - 12<lihidro - indol -( 3Z )^

karboksilna kiselina [ 2 -( 3 . 5 - dimetilDiDerazin - 1 - il ) etillamid

Kada se sledi procedura opisana u Primeru 168, dobije se željeno jedinjenje (60 mg, 0,2 mmol).

<1>H NMR (DMSO-de) 8: 0,891, 0,907 (2xS, 6H, 2xCH3), 1,49 (t, J=10,4Hz, 2H), 2,40, 2,42 (2xS, 6H, 2xCH3), 2,41 (m, 2H, CH2), 2,74 (m, 4H), 3,30 (m, 2H), 6,82 (dd, J=4,5i 8,7Hz, 1H), 6,90 )td,<2>J=2,4i<3>J=8,4Hz, 1H), 7,42 (t, J=5,6Hz, 1H), 7,70 (s, 1H), 7,74 (dd, J=4,6 i 8,4Hz, 1 H)(aromatični i vinil), 10,88 (s, 1H, CONH), 13,65 (s, 1H, NH). LC-MS (m/z) 438,4 (M).

Primer 174

5 - r5 - hlom - 2 - okso - 12 - dihidm - indol -( 3Z )- ilidenmeWl - 2A<lm ^

karboksilna kiselina [ 2 -( 3 , 5 - dimetilDioerazin - 1 - ii ) etillamid

Kada se sledi procedura opisana u Primeru 171, dobije se željeno jedinjenje (31,2 mg, 34%) iz 5-[5-hloro-2-okso-1,2-dihidro-indol-(3Z)-ilidenmetil]-2,4-dimetil-1H-pirol-3-karboksilne kiseline (63 mg, 0,2 mmol).

<1>H NMR (DMSO-de) 8: 1,15, 1,16 (2xs, 6H, 2xCH3), 1,95 (t, J=11,6Hz, 2H, CH2), 2,40, 2,42 (2xS, 6H, 2xCH3), 2,50 (m, 2H, CH2), 3,03 (d, J=11,2Hz, 2H), 3,19 (m, 2H), 3,30 (m, 2H, CH2), 6,85 (d, J=8,4Hz, 1H), 7,11 (dd, J=2,0i 8,0Hz, 1H), 7,11 (dd, J=2,0i 8,0Hz, 1H), 7,52 (t, J=5,6Hz, 1H), 7,76 (s, 1H), 7,97 (d, J=2,0Hz, 1H)(aromatični i vinil), 10,99 (s, 1H, CONH), 13,63 (s, 1H, NH). LC-MS (m/z) 456,2 (M+1).

Primer 175

5 - I5 - bromo - 2< ) kso - 12<lihidro - indol -( 3Z )- ilidenmetil )- 2 ^

karboksilna kiselina [ 2 -( 3 . 5 - dimetilDiDerazin - 1 - il ) etillamid

Kada se sledi procedura opisana u Primeru 171, dobije se željeno jedinjenje (40 mg, 40%) iz 5-[5-bromo-2-okso-1,2-dihidro-indol-(3Z)-ilidenmetil]-2,4-dimetil-1H-pirol-3-karboksilne kiseline (74 mg, 0,2 mmol).

1H NMR (DMSO-d6) 6: 1,15 i 1,16 (2xs, 6H, 2xCH3), 1,95 (t, J=11,6Hz, 2H, CH2), 2,40, 2,42 (2xs, 6H, 2xCH3), 2,50 (m, 2H, CH2), 3,03 (d, J=10,4Hz, 2H), 3,19 (m, 2H), 3,30 (m, 2H, CH2), 6,81 (d, J=8,4Hz, 1H), 7,24 (dd, J=2,0 i 8,4Hz, 1H), 7,24 (dd, J=2,0 i 8,4Hz, 1H), 7,51 (t, J=5,6Hz, 1H), 7,76 (s, 1H), 8,1 (d, J=2,0Hz, 1H)(aromatični i vinil), 10,99 (s, 1H, CONH), 13,62 (s, 1H, NH). LC-MS (m/z) 498,4 (M-1).

Primer 205

( 3Z )- 3 - f ( 3 . 5 - dimetil - 1H - Dirol - 2 - il )- metilidenh 1 -[ 1 -( 4 - metilDiperazinil ) rnetill - 1 . 3 -

dihidro - 2H - indol - 2 - on

Doda se A/-metilpiperazin (10 g, 100 mmol) u mešani rastvor formaldehida u vodi (10 g, 38% rastvora, 100 mL) i 3-(3,5-dimetil-1H-pirol-2-ilmetiliden)-1,3-dihidroindol-2-ona (2,38 g, 10 mmol) u metanolu (100 mL). Rastvor se 1 h zagreva na 60°C, koncentriše na malu zapreminu, talog odvoji filtriranjem, opere metanolom i osuši, dajući 2,38 g naslovljenog jedinjenja, temp. toplj. 160-164°C. HPLC Rt 4,72 min.<1>H NMR (CDCI3) 5: 2,26 (s, 3H), 2,33 (s, 3H), 2,38 (s, 3H), 2,43 (br s, 4H), 2,70 (br s, 4H), 4,59 (s, 2H), 5,96 (d, 1H), 7,02-7,08 (m, 2H), 7,15 (dd, 1H), 7,38 (s, 1H), 7,38 (s, 1H), 7,48 (dd, 1H) i 13,0 (brs, 1H). Analiza, izračunato za C21H26N40: C, 71,97; H, 7,48; H, 15,99. Nađeno: C71,75; H, 7,46; N, 15,87.

(3Z)-3-[(3,5-dimetil-1H-pirol-2-il)-metiliden]-1-[1-(4-metilpiperazinil)metil]-1,3-dihidro-2H-indol-2-on se konvertuje u dihidrohloridnu so.

Primer 207

Sinteza ( 3Z )- 34 ( 3 . 5<limetil - 1H - Dirol - 2 - il - metilidenl - U ^

dihidro - 2H - indol - 2 - ona

Doda se pirolidin (450 mg, 6,3 mmol) u mešani rastvor formaldehida u vodi (500 mg, 38% rastvor, 6,0 mmol) i 3-(3,5-dimetil-1H-pirol-2-ilmetiliden)-1,3-dihidroindol-2-ona (900 mg, 3,8 mmol) u metanolu (50 mL). Posle 15 min rastvor se ohladi na 0°C, talog odvoji filtriranjem, opere vodom i osuši, dajući 1,08 g naslovljenog jedinjenja, temp. toplj. 129-132°C. HPLC Rt 4,87 min.<1>HNMR [(CD3)2SO] 8: 1,65 (m, 2H), 7,61 (s, 1H), 7,76 (d, 2H) i 13,1 (br s, 1H). Izračunato za: C2oH23N30: C, 74,74; H, 7,21; N, 13,07. Nađeno: C, 74,61; H, 7,25; N, 13,03.

Biološki primeri

Inhibitori proteinkinaze Formule ( l )

Sledeći testovi se mogu koristiti za određivanje nivoa aktivnosti i efekta jedinjenja formule (I) na jednu ili više protein kinaza (u nastavku PK). Slični testovi se mogu načiniti, po istom principu, za bilo koju PK, koristeći se tehnikama koje su poznate u stanju tehnike.

A. Procedure testova

Nekoliko testova, koji su ovde opisani, obavljaju se pomoću ELISA (imunosorbentski sendvič test povezan sa enzimom) formata (Voller et al, "Enzvme-Linked Immunosorbent Assay" u Manual of Clinical Immunologv, 2. izdanje, Rose and Frieman, Am. Soc. of Microbiologv, VVashington, D.C., str. 359-371). Opšta procedura je kao što sledi: jedinjenje formule (I) se tokom odabranog vremena unese u ćelije koje izlučuju testiranu kinazu, bilo prirodnu ili rekombinantnu, a zatim se, ukoliko je tetsirana kinaza receptor, doda poznati ligand da aktivira receptor. Ćelije se lizuju, a lizat se prebaci u bazenčiće na ELISA ploči, koja je prethodno obložena specifičnim antitelom koje prepozanje substrat enzimatski fosforilovane reakcije. Komponente koje ne predstavljaju substrat u ćelijskom lizatu se isperu, a količina fosforilovanja substrata se određuje sa antitelom, koje specifično prepoznaje fosfotirozin, u poređenju sa kontrolnim ćelijama koje nisu bile u kontaktu sa testiranim jedinjenjem.

Ovde poželjan protokol obavljanja ELISA eksperimenata za specifične PK dat je niže. Međutim, prilagođavanje ovih protokola za određivanje aktivnosti jedinjenja prema drugim receptorima tirozin kinaze (RTK), kao i za tirozin kinaze citoplazme

(CTK) i serin treonin tirozin kinaze (STK), sasvim je u okviru znanja onih koji su verzirani u stanje tehnike. Drugi testovi, koji se ovde opisuju, mere količinu DNK nastalu kao odgovor na aktivaciju testirane kinaze, što je opšta mera proliferativnog odgovora. Opšta procedura ovog testa je kao što sledi: jedinjenje se uvede u ćelije koje izlučuju testiranu kinazu, prirodnu ili rekombinantnu, drži odabran period vremena, posle koga se, ukoliko je testirana kinaza receptor, dodaje ligand za koga se zna da aktivira receptor. Posle inkubacije preko noći, doda se reagens koji obeležava DNK, kao što je 5-bromodeoksiuridin (BrdU) ili H<3->timidin. Količina obeležene DNK se određuje ili sa anti-BrdU antitelom ili merenjem radioaktivnosti, pa se poredi sa kontrolnim ćelijama koje nisu bile u kontaktu sa testiranim jedinjenjem

BiotestGST FLK- 1

Ovaj test analizira aktivnost tirozin kinaze na GST-FLK-1 u poli(glu,tir)peptidima.

Materijali i rea<g>ensi:

1. ELISA ploče sa 96 bazenčića Corning-96 (katalog Corning No. 5805-96).

2. poli(glu,tir) 4:1 liofilizat (Sigma, Catalog No. P0275).

3. dobijanje ploča za testiranje obloženih sa poli(glu,tir)(pEY): obloži se sa 2 ug/bazenčić poli(glu.tir)(pEY) u 100 uL PBS, drži na sobnoj temperaturi 2 h,

ili preko noći na 4°C. Bazenčići u ploči se pokriju da se spreči isparavanje.

4. Pufer PBS: za 1 L pomešati 0,2 g KH2P04, 1,15 g Na2HP04, 0,2 g KCI i 8 g NaCI u približno 900 mL vode. Kada se svi reagensi rastvore, podesi se pH na 7,2 sa HCI. Dovesti ukupnu zapreminu na 1L sa H20.

5. Pufer PBST: u 1 L pufera PBS dodati 1,0 mL Tween-20.

6. Pufer za blokiranje TBB: za 1 L, pomešati 1,21 g TRIS, 8,77 g, NaC11 mL Tween-20 u približno 900 mL vode. Podesiti pH na 7,2 sa HCI. Dodati 10 g BSA i mešati do rastvaranja. Dovesti ukupnu zapreminu na 1L sa H20.

Profiltrirati da se ukloni zrnasti materijal.

7. 1% BSA u PBS: da se pripremi 1 * radni rastvor, doda se 10 g BSA u približno 990 mL pufera PBS i meša dok se ne rastvori. Podesi se ukupna

zapermina na 1 L sa puferom PBS i filtrira da se ukloni zrnasti materijal.

8. 50 mM Hepes pH 7,5.

9. GST-FIk 1 cd prečišćen iz sf9 transformacije rekombinantnog bakulovirusa (SUGEN, Inc.).

10. 4% DMSO u H20.

11. 10mMATPuH2O.

12. 40mMMnCI2

13. Pufer za razblaživanje kinaze (KDB): pomešati 10 mL Hepes (pH 7,5), 1 mL 5M NaCI, 40 uL 100 mM natrijum-ortovanadata i 0,4 mL 5% BSA u H20 sa

88,56 mL H20.

14. polipropilenske ploče sa 96 bazenčića i dnom oblika V, NUNC, Applied

Science Catalog No. AS-72092

15. EDTA: pomešati 14,12 g etilendiamintetrasrćetne kiseline (EDTA) sa približno 70 mL dejonizovane vode. Dodavati 10M NaOH dok se EDTA ne rastvori. Podesiti pH na 8,0. Podesti ukupnu zapreminu na 100 mL sa

dejonizovanom vodom.

16. Pufer zarazblaživanje 1° antitela. pomešati 10 mL 5% BSA u PBS sa 89,5 mL TBST 17. anti-fosfotirozin monoklonalno antitelo, konjugovano sa peroksidazom rena (PY99 HRP, Santa Cruz Biotech). 18. 2,2'-azinobis(3-etilbenztiazolin-6-sulfonska kiselina (ABTS, Moss, broj kataloga ABST) 19. 10%SDS.

Procedura:

1. Oblože se ELISA ploče Corning sa 96 bazenčića sa 2 ug poliEY peptida u sterilnom PBS, koji je opisan u koraku 3 odeljka Materijali i reagensi 2. Ukloni se nevezana tečnost iz bazenčića okretanjem ploče. Opere se sa

TBST.

3. U svaki bazenčić se doda 100 uL 1% BSA u PBS. Uz mućkanje inkubira

se 1 h na sobnoj temperaturi.

4. Ponovi se korak 2.

5. Natope se bazenčići sa 50 mM HEPES (pH 7,5) (150 uL/benzenčić)

6. Razblaži se testirano jedinjenje sa dejon. H20 / 4% DMSO do 4-struke željene konačne koncentracije testa u polipropilenskim pločama sa 96

bazenčića.

7. Doda se 25 uL razblaženg testiranog jedinjenja na ELISA ploču. U kontrolne bazenčiće stavi se 25 uL dejon. H2074% DMSO.

8. U svaki bazenčić se doda 25 uL 40 mM MnCI2sa 4x ATP (2 uM)

9. U bazenčiće sa negativnom kontrolom doda se 25uL 0,5 M EDTA.

10. Razblaži se GST-Flk1 sa KDB do 0,005 ug(5 ngVbazenčić.

11. Doda se 50 uL enzima u svaki bazenčić.

12. Uz mućkanje, inkubira se 15 min, na sobnoj temperaturi.

13. Zaustavi se reakcija dodavanjem 50 uL 250 mM EDTA (pH 8,0).

14. Opere se 3* sa TBST, a ploča tapka na papirnom ubrusu da se ukloni višak tečnosti. 15. Doda se 100 uL po bazenčiću konjugata anti-fosfotirozin HRP, razblaženje 1:5000, u puferu za razblaživanje antitela. Uz mućkanje, inkubira se 90

min na sobnoj temperaturi.

16. Pranje, kao u koraku 14.

17. Na sobnoj temperaturi, doda se u svaki bazenčić 100 uL rastvora ABTS.

18. Uz mućkanje, inkubira se 10 do 15 min. Uklone se mehurići.

19. Zaustavi se reakcija dodavanjem 20 uL 10% SDS u svaki bazenčić.

20. Očitaju se rezultati na čitaču Dvnatech MR 7000 ELISA reader, sa test filterom na 410 nm i referentnim filtrom na 630 nm.

PYK2 Biotest

Ovaj test se koristi za merenjein vitroaktivnosti kinaze na HA-epitop prikačen ćelom dužinom na pyk2 (FL-pyk2-HA), u testu ELISA.

Matehiali i rea<g>ensi

1. ELISA ploče sa 96 bazenčića, Corning.

2. Monoklonalno antitelo anti-HA 12CA5 (SUGEN, Inc.)

3. PBS (Dubelcco-ov slani fosfatni pufer) (Gibco, katalog No. 450-1300EB) 4. Pufer TBST: za 1 L pomešati 8,766 g NaCI, 6,057 g TRIS i 1 mL 0,1% Triton X-100, u pribl. 900 mL dejon. vode. Podesiti pH na 7,2 i zapreminu

dovesti na 1 L.

5. Pufer za blokiranje: za 1 L pomešati 100 g 10% BSA, 12,1 g 100 mM

TRIS, 58,44 g 1 M NaCI i 10 mL 1% TvVEEN-20.

6. FL-pyk2-HA iz lizata ćelija sf9 (SUGEN, Inc.)

7. 4% DMSO u MilliOue H20.

8. 10 mM ATP u dejon. vodi.

9. 1M MnCI2-

10. 1MMgCI2.

11. IMditiotreitol(DTT).

12. 10* pufer za fosforilovanje kinaze: pomešati 5,0 mL 1M Hepes (pH 7,5), 0,2 mL 1M MnCI2, 1,0 mL 1M MgCI2, 1,0 mL 10% Triton X-100 u 2,8 mL

dejon. vode. Neposredno pred upotrebu dodati 0,1 mL DTT.

13. Polipropilenske ploče sa 96 bazenčića i dnom oblika V, NUNC.

14. 500 mM EDTA u dejon. vodi.

15. Pufer za razblaživanje antitela: za 100 mL, uzeti 1 mL 5% BSA/PBS i 1 mL 10% Tween-20 u 88 mL TBS. 16. HRP-konjugovani anti-Ptyr PY99, Santa Cruz Biotech Cat. No. SC-7020.

17. ABTS, Moss katalog No. ABST-2000.

18. 10%SDS.

Procedura:

1. Oblože se ELISA ploče sa 96 bazenčića sa 0,5 ug po bazenčiću sa 12CA5 anti-HA antitelom u 100 uL PBS. Čuvaju se preko noći na 40°C. 2. Okretanjem ploče uklone se nevezana HA antitela iz bazenčića. Ploča se opere sa dejon. vodom. Tapka se ploča po papirnom ubrusu da se ukloni višak tečnosti. 3. U svaki bazenčić se doda 150 uL bufera za blokiranje. Uz mućkanje, inkubira se 30 min na sobnoj temperaturi.

4. Ploča se 4* opere sa TBS-T.

5. Lizat se razblaži u PBS (1,5 ug lizata/100 uL PBS).

6. U svaki bazenčić se doda 100 uL razblaženog lizata. Mućka se 1 h na sobnoj temperaturi.

7. Pranje, kao u 4- koraku.

8. Na ELISA ploče se doda 50 uL 2* pufer kinaze, koji sadrži pyk2-HA.

9. U svaki bazenčić se doda 25 uL 400 mM testiranog jedinjenja u 4%

DMSO. U kontrolne bazenčiće se stavi samo 4% DMSO.

10. U bazenčiće za negativnu kontrolu doda se 25 uL 0,5 M EDTA.

11. U sve bazenčiće se doda 25 uL 20 uM STP. Uz mućkanje, inkubira se 10 min. 12. Reakcija se zaustavi dodavanjem u sve bazenčiće 25 uL 500 mM EDTA (pH 8,0).

13. Pranje, kao u 4. koraku.

14. U svaki bazenčić se doda 100 uL HRP konjugovanog anti-Ptyr, razblaženog 1:6000 u puferu za razblaživanje antitela. Uz mućkanje,

inkubira se 1 h na sobnoj temperaturi.

15. Ploča se 3* opere sa TBST i 1 * sa PBS.

16. U svaki bazenčić se doda 100 uL ABST.

17. Ako je potrebno, zaustavi se razvoj reakcije dodavanjem u svaki bazenčić

20 uL10%SDS.

18. Očitava se na ELISA čitaču, sa filterom na 410 nm, a referentnim filterom na 630 nm.

FGFR1 biotest

Ovaj test se koristi za merenjein vitroaktivnosti kinaze na FGFR1-R u testu

ELISA.

Materijali i rea<g>ensi:

1. ELISA ploče sa 96 bazenčića Costar (Corning, katalog No. 3369).

2. Polv(Glu-Tir) (Sigma, katalog No. P0275).

3. PBS (Gibco, katalog No. 450-1300 EB).

4. Pufer Hepes, 50 mM rastvor.

5. Pufer za blokiranje (5% PSA/PBS).

6. Perčišćeni GST-FGFR1 (SUGEN Inc.).

7. Pufer za razblaživanje kinaze. Pomeša se 500 uL 1M Hepes (Gibco), 20 uL 5% BSA/PBS, 10 uL 100 mM natrijum-otrovanadata i 50 uL 5M NaCI.

8. 10 mM ATP

9. Mešavina za fosfroilovanje ATP/MnCI2: pomeša se 20 uL ATP, 400 uL 1M

MnCI2i 9,56 mL dejon. vode.

10. Polipropilenske ploče sa 96 bazenčića i dnom V-oblika NUNC (Applied

Scientific, katalog No. AS-72092).

11. 0,5 M EDTA.

12. 0,05% TBST. Dodati 500 uL TVVEEN u 1 L TBS.

13. Zečji poliklonalni anti-fosfotirozinski serum (SUGEN, Inc.).

14. Kozji anti-zečji konjugat EgG peroksidaze (Biosource, katalog No.

ALI0404).

15. Rastvor ABTS.

16. Rastvor ABTS/H2O2.

Procedura:

1. Oblože se RLISA ploče sa 96 bazenčića Costar sa 1 ug po bazenčiću sa

Polv(Glu-Tir) u 100 muL PBS. Drže se preko noći na 4°C.

2. Operu se obložene ploče 1 x sa PBS.

3. U svaki bazenčić se doda 150 uL 5% BSA/PBS pufera za blokiranje. Uz mešanje, inkubira se 1 h na sobnoj temperaturi. 4. Ploča se 2* opere sa PBS, zatim 1 * sa 50 mM Hepes. Tapkaju se ploče na ubrusu od hartije da se ukloni višak tečnosti i mehurići. 5. Ploči se dodaje 25 uL 0,4 mM testiranog jedinjenja u 4% DMSO, ili samo 4% DMSO (kontrole). 6. Razblaži se GST-FGFR1 u puferu za razlaživanje kinaze (5 ng kinaze/50 uL KDB/bazenčić).

7. U svaki bazenčić se doda 50 uL razblažene kinaze.

8. Startuje se rekacija kinaze dodavanjem 25 uL/bazenčić sveže pripremljenog ATP/Mn<2+>(0,4 mL 1M MnCI2, 40 uL 10 mM ATP, 9,56 mL

dejon. vode), sveže se priprema.

9. Ovo je brza reakcija kinaze i mora se zaustaviti sa 25 uL 0,5M EDTA, na sličan način dodavanju ATP.

10. Ploča se opere 4* svežim PBS.

11. Pripremi se pufer za razblaživanje antitela: za 50 mL: pomeša se 5 mL 5% BSA, 250 uL 5% mleka i 50 uL 100 mM natrijum-vanadata, pa se dopuni

do tražene zapremine sa 0,05% TBST.

12. Doda se 100 uL po bazenčiću anti-fosfotirozina (razblaženje 1:10.000 u

ADB). Uz mućkanje inkubira se 1 h na sobnoj temperaturi.

13. Pranje, kao u 10. koraku.

14. Doda se 100 uL po bazenčiću konjugata kozje anti-zečje IgG peroksidaze (razblaženje 1:6000 u ADB). Uz mućkanje, inkubira se 1 h na sobnoj

temperaturi.

15. Opere se kao u 10. koraku, a zatim sa PBS da se uklone mehurići i višak

TVVEEN.

16. U svaki bazenčić se doda 100 uL ABTS/H202.

17. Uz mućkanje, inkubira se 10 do 20 min. Uklone se mehurići.

18. Test se očitava na čitaču Dvnatech MR700 ELISA reader test filter na 410 nm, referentni filter na 630 nm.

EGFR biotest

Ovaj test se koristi za akitvnost kinazein vitrona FGFR1-R, u testu ELISA.

Materijal i rea<g>ensi:

1. ELISA ploče sa 96 bazenčića Corning

2. SUMO 1 monoklonalno anti-EGFR antitelo (SUGEN iNc).

3. PBS

4. Pufer TBST.

5. Pufer za blokiranje: za 100 mL, pomešati 5,0 g mleka (Carnatiom Instant

Non-fat Milk<®>) sa 100 mL PBS.

6. Lizat ćelija A431 (SUGEN, Inc.).

7. TBS pufer:

8. TBS + 10% DMSO: za 1L pomešati: 1,514 g TRIS, 2,192 g, NaCI i 25 mL

DMSO; dovesti do ukupne zapemine 1 L sa dejon. vodom.

9. ATP (adenozin-5'-trifosfat, iz konjskog mišića, Sigma katalog No. A-5394), 1,0 mM rastvor u dejon. vodi. Ovaj reagens treba da se pripremi

neposredno pred upotrebu i da se drži na ledu.

10. 1,0mMMnCI2

11. Mešavina ATP/MnCb za fosforilovanje: za pravljenje 10 mL, pomešati 300 uL 1 mM ATP, 500 uL MnCI2 i 9,2 mL dejon. vode. Pripremiti neposredno

pred upotrebu, držati na ledu.

12. Polipropilenske ploče sa 96 bazenčića i dnom V-oblika, NUNC.

13. EDTA.

14. Zečji poliklonalni anti-fosfotirozinski serum (SUGEN, Inc.).

15. Konjugat kozje anti-zečje IgG peroksidaze (Biosource, katalog No.

ALI0404).

16. ABTS.

17. 30% vodonik-peroksid.

18. ABTS/H2O2.

19. 0,2 M HCI.

Procedura:

1. Oblaganje ELISA ploča sa 96 bezenčića, Corning, sa 0,5 ug 28D4C10 u 100 uL PBS po bazenčiću, držati preko noći na 4°C. 2. Uklanjanje nevezanog 28D4C10 iz bazenčića okretanjem ploče i uklanjanjem tečnosti. Oprati 1x sa dejon. vodom. Tapkati ploču po papirnom ubrusu da se ukloni višak tečnosti. 3. Dodati 150 uL pufera za blokiranje u svaki bazenčić. Inkubirati, uz mućkanje, 30 min, na sobnoj temperaturi. 4. Oprati ploču 3* sa dejonizovanom vodom, zatim 1x sa TBST. Tapkati ploču po papirnom ubrusu da se ukloni višak tečnosti i mehurići.

5. Razblažiti lizat u HNTG (10 ug lizata/100 uL HNTG).

6. Dodati 100 ul_ razblaženog lizata u svaki bazenčić. Mućkati 60 min na sobnoj temperaturi.

7. Pranje ploča kao u 4. koraku.

8. Dodati 80 uL mešavine radnog pufera kinaze po ploči ELISA, koja sadrži vezani PDGFR. 9. Razblažiti testirano jedinjenje 1:10 u TBS, u polipropilenskim pločama sa

96 bazenčića.

10. Dodati 10 uL razblaženog testiranog jedinjenja na ploču ELISA. U kontrolne bazenčiće dodati 10 uL TBS + 10% DMSO. Inkubirati,uz

mućkanje, 30 min, na sobnoj temperaturi.

11. Dodati 10 uL ATP u sve bazenčiće, izuzev bazenčića negativne kontrole. (Konačna zapremina u bazenčiću treba daje približno 100 uL, a 20 uM po

ATP u svakom bazenčiću. Inkubirati, uz mućkanje, 30 min.

12. Prekinuti reakciju dodavanjem 10 uL rastvora EDTA u svaki bazenčić.

13. Oprati 4* dejonizovanom vodom, 2* sa TBST.

14. Dodati 100 uL anti-fosfotirozina (razblaženje 1:3000 u TBST) po bazenčiću. Inkubirati, uz mućkanje, 30-45 min, na sobnoj temperaturi.

15. Pranje, kao u 4. koraku.

16. Dodati u svaki bazenčić 100 uL konjugata kozje anti-zečje IgG peroksidaze iz firme Biosource (razblaženje 1:2000 u TBST). Inkubirati, uz

mućkanje, 30 min, na sobnoj temperaturi.

17. Pranje, kao u 4. koraku.

18. U svaki bazenčić dodati 100 uL rastvora ABTS/H202.

19. Inkubirati 10 do 30 min, uz mućkanje. Ukloniti mehuriće.

20. Ukoliko je potrebno, prekinuti reakciju dodavanjem 100 uL 0,2M HCI po bazenčiću. 21. Očitati test na čitaču Dvnatech MR7000 ELISA reader: test filter na 410 nm, a referentni filter na 630 nm.

Test na ćeliisku HER- 2 kinazu

Ovaj test se koristi da se meri aktivnost HER-2 kinaze u celim ćelijama, pomoću formata ELISA.

Materijal i rea<g>ensi:

1. DMEM (GIBCO, katalog No. 11965-092).

2. Serum goveđeg fetusa (FBS, GIBCO, katalog No. 16000-044), inaktiviran toplotom u vodenim kupatilu, 30 min na 56°C.

3. Tripsin (GIBCO, katalog No. 25200-0,56).

4. L-glutamin (GIBCO, katalog No. 25030-081).

5. HHEPES (GIBCO katalog No. 15630-080).

6. Medijum za rast. Mešavina 500 mL DMEM, 55 mL FBS inaktiviranog toplotom, 10 mL HEPES i 5,5 mL L-glutamina. 7. Medijum za izgladnjivanje. Mešavina 500 mL DMEM, 2,5 mL FBS inaktiviranog toplotom, 10 mL HEPES i 5,5 mL L-glutamina.

8. PBS.

9. Mikro-titarske ploče za kulturu tkiva, sa 96 bazenčića, ravnog dna (Corning katalog No. 25860). 10. Petrijeve šolje za kulturu tkiva od 15 cm (Corning, katalog No. 08757148).

11. Elisa ploče sa 96 bazenčića, Corning.

12. Polipropilenske ploče sa 96 bazenčića i dnom oblika V, NUNC.

13. Costar-ovi kartidži za prenos, za Transtar 96 (Costar katalog No. 7610).

14. SUMO 1: monoklonalno anti-EGFR antitelo (SUGEN, Inc.).

15. Pufer TBST.

16. Pufer za blokiranje: 5% mleko (Carnation Instant Milk<®>) u PBS.

17. EGF ligand: EGF-201, Shinko Amerikan, Japan. Prah suspendovana u 10 uL 10 nM HCI. Dodati 100 uL 10 mM NaOH. Dodati 800 uL PBS, prebaciti u Eppendorf-ovu epruvetu i držati na -20°C, spremnog za upotrebu. 18. Pufer za lizu HNTG. Za polazni rastvor 5* HNTG, pomešati 23,83 g Hepes, 43,83 g NaCI, 500 mL glicerina i 100 mL Triton X-100 i dovoljno dejon. vode da se dobije ukupno 1 L rastvora. Za 1x HNTG<*>, pomešati 2

mL HNTG, 100 uL 0,1 M Na3V04, 250 uL 0,2 M Na4P207i 100 mL EDTA.

19. EDTA.

20. Na3V04. Da bi se napravio polazni rastvor, pomeša se 1,84 g Na3V04sa 90 mL dejon. vode. Podesi se pH na 10. Kljuca se 1 min u mikrotalasnoj

pećnici (rastvor postane bistar). Ohladi se na sobnu temperaturu. Podesi se pH na 10. Ponavlja se ciklus zagrevanje/hlađenje sve dok pH ne

ostane na 10.

21. 200 mM Na4P207. 22. Zečji poliklonalni antiserum, specifičan za fosfotirozin (antitelo anti-Ptyr,

SUGEN, Inc.).

23. Antiserum prečišćenog afiniteta, kozje anti-zečje IgG antitelo, konjugat peroksidaze (Biosource, katalog No. ALI0404).

24. Rastvor ABTS.

25. Rastvor 30% vodonik-peroksida.

26. ABTS/H202.

27. 0,2 M HCI.

Procedura:

1. Oblaganje ELISA ploča sa 96 bazenčića, Corning, sa SUMO 1, 1,0 ug po bazenčiću, u PBS, tako da je konačna zapremina 100 uL/baznečić. Držati

preko noći na 4°C.

2. Na dan upotrebe ukloniti pufer za oblaganje i ploču oprati 3* sa dejon. vodom i 1* sa puferm TNST. Sva pranja u ovom testu treba da se

obavljaju na ovaj način, ukoliko se drugačije ne naglasi.

3. Doda se u svaki bazenčić po 100 uL pufera za blokiranje. Ploča se inkubira, uz mućkanje, 30 min, na sobnoj temperaturi. Pred upotrebu,

ploča se opere.

4. U ovom testu se koristi soj ćelija himera/3Te-C7 EGFr/HER-2

5. Odaberu se Petrijeve šolje u kojima je došlo do spajanja 80-90%. Ćelije se sakupe tripsinizacijom, pa se se centrifugiraju 5 min sa 1000 o/min, na

sobnoj temperaturi.

6. Ćelije se resuspenduju u medijumu za izgladnjivanje i broje pomoću tripan-plavog. Traži se vitalnost preko 90%. Ćelije se zaseju u medijum za izgladnjivanje sa gustinom 2500 ćelija po bazenčiću, 90 uL po bazenčiću, na mikrotitarskoj ploči sa 96 bazenčića. Zasejane ćelije se inkubiraju

preko noći na 37°C, u 5% C02.

7. Dva dana posle zasejavanja počinje test.

8. Rastvore se testiranja jedinjenja u 4% DMSO. Uzorci se zatim još razblažuju, direktno na pločama, sa DMEM za izgladnjivanje. Tipično, ovo razblaženje je 1:10 ili veće. Svi bazenčići se zatim prebace na ploču za ćelije i još razblaže 1:10 (10 jjL uzorka i medijuma u 90 uL medijuma za izgladnjivanje). Konačna koncentracija DMSO treba da je 1% ili niža.

Može se takođe koristiti standamo serijsko razblaživanje.

9. Inkubiranje 2 h, na 37°C, u 5% C02.

10. Pripremi se EGF ligand razblaživanjem polaznog EGF (16,5 uM) u toplom

DMEM, do 150 nM.

11. Pripremanje svežeg HNTG<*>, doovoljno za po 100 uL po bazenčiću; drži se na ledu. 12. Posle 2 h inkubiranja sa testiranim jedinjenjem, dodati pripremljeni EGF ligand ćelijama, 50 uL po bazenčiću, tako da je konačna koncentracija 50 nM. Bazenčići pozitivne kontrole dobiju istu zapreminu EGF. Negativne

kontrole ne dobijaju EGF. Inkubiranje 10 min na 37°C.

13. Uklanjanje testiranog jedinjenja, EGF i DMEM. Ćelije oprati 1 * sa PBS. 14. Prebacivanje HNTG<*>u ćelije, 100 uL po bazenčiću. Držati na ledu 5 min.

U međuvremenu ukloniti pufer za blokiranje sa ELISA ploče i oprati je.

15. Ostrugati ćelije sa ploče sa mikropipetorom, pa homogenizovati ćelijski materijal ponovljenim usisavanjem i dispergovanjem u puferu za lizu HNTG<*>. Prebaciti lizat u obložene, blokiane ELISA ploče. Ili, korišćenjem Costar-ovog transfer kartridža za prebacivanje lizata na ploču.

16. Inkubiranje, uz mućkanje, 1 h, na sobnoj temperaturi.

17. Uklanjanje lizata, pranje. Prebacivanje sveže razblaženog antitela anti-Ptyr (1:3000 u TBST) na ELISA ploče, 100 uL po bazenčiću.

18. Inkubiranje, uz mućkanje, 30 min, na sobnoj temperaturi.

19. Uklanjanje antitela anti-Ptyr, pranje. Prebacivanje sveže razblaženog antitela (Biosource) na ELISA ploču (1:8000 u TBST, 100 uL po

bazenčiću).

20. Inkubiranje, uz mućkanje, 30 min, na sobnoj temperaturi.

21. Uklanjanje Biosource-ovog antitela, pranje. Prepbacivanje sveže pripremljenog rastvora ABTS/H2O2na ELISA ploču, 100 uL po bazenčiću.

22. Inkubiranje, uz mućkanje, 5-10 min. Uklanjanje mehurića.

23. Prekidanje reakcije dodavanjem 100 uL 0,2 M HCI po bazenčiću.

24. Očitavanje testa na čitaču Dynatch MR7000 reader, sa filterom za testiranje na 410 nm, a referentnim filterom na 630 nm.

Test CDK2/ CYCLIN A

Ovaj test se koristi za merenjein vitroaktivnosti serin-treonin kinaze humanog cdk2/ciklina A, u testu bliske scintilacije (Scintilation Proximity Assay, SPA).

Matehiali i rea<g>ensi:

1. Polietilen-tereftalatne (flekisbilne) ploče sa 96 bazenčića VVallac (VVallac, katalog No. 1450-401).

2. Amersham Redivue[ j^ P](Amersham, katalog No. AH 9968).

3. SPA poliviniltoluenske perlice obložene sa streptavidinom, Amersham (Amersham, katalog No. RPNQ 0007). Ove perlice treba da se

rekonstituišu u PBS, bez magnezijuma ili kalcijuma, sa 20 mg/mL.

4. Aktivirani kompleks enzima cdk2/ciklina A, prečišćen od Sf9 ćelija (SUGEN, Inc.). 5. Biotinilovani peptidni substrat (Debtide). Peptin biotin-X-PKTPKKAKKL se rastvori u vodi sa koncentracijom 5 mg/mL. 6. Smeša peptid/ATP: za 10 mL se pomeša 9,979 mL vode, 0,00125 mL "hladnog" ATP, 0,010 mL Debtide-a i 0,010 mL v^P ATP. Krajnja koncentracija po bazenčiću je 0,5 uM za "hladni" ATP, 0,1 ug Debtide-a i

0,2 uCi y33P ATP.

7. Pufer kinaze: za 10 mL se pomeša 8,85 mL vode, 0,625 mL TRIS (pH 7,4), 0,25 mL 1M MgCfe, 0,25 mL 10% NP40 i 0,025 mL 1M DTT, koji se

dodaje svež, pred upotrebu.

8. 10 mM ATP u dejon. vodi.

9. 1M Tris, pH podešeno na 7,4 sa HCI

10. 1MMgCI2.

11. 1MDTT.

12. OBS (Gibco, katalog No. 14190-144).

13. 0,5 M EDTA.

14. Rastvor za prekidanje reakcije: za 10 mL pomešati 9,25 mL PBS, 0,005 mL 100 mM ATP, 0,1 mL 0,5 M EDTA, 0,1 mL 10% Triton X-100 i 1,25 mL

20 mg/mL perlica SPA.

Procedura:

1. Pripremanje rastvora testiranog jedinjena u 5% DMSO, sa 5-strukom koncentracijom od konačne. Doda se 10 uL u svaki bazenčić. Za

negativne kontrole koristi se samo 10 uL 5% DMSO u svim bazenčićima.

2. Razblaži se 5 uL rastvora cdk2/ciklin A sa 2,1 mL pufera kinaze.

3. Doda se 20 uL enzima u svaki bazenčić.

4. Doda se 10 uL 0,5 M EDTA u bazenčiće negativne kontrole.

5. Da bi počela reakcija kinaze, doda se 20 uL smeše peptid/ATP u svaki bazenčić. Inkubira se 1 h, bez mućkanja.

6. Doda se u svaki bazenčić 200 uL rastvora za prekidanje reakcije.

7. Drži se najmanje 10 min.

8. Vrti se ploča sa približno 2300 o/min, 2-3 min.

9. Očitavaju se impulsi sa ploče, koristeći čitač Trilux ili sličan.

Test transfosforilovania MET

Ovaj test se koristi za merenje sadržaja fosfotirozina u poli(glutaminska kiselina:tirozin, 4:1) substratu, kao način za identifikaciju agonista/antagonista transfosforilovanja met substrata.

Materijali i rea<g>ensi:

1. ELISA ploče sa 96 bazenčića Corning, Corning, katalog No. 25805-96.

2. Poli(glu:tir) 4:1, Sigma, katalog No. P 0275.

3. PBS, Gibco, katalog No. 450-1300EB.

4. 50 mM HEPES.

5. Pufer za blokiranje: rastvori se 25 g seruma goveđeg albumina, Sigma, katalog No. A-7888, u 500 mL PBS i filtrira kroz filter od 4 pm.

6. Prečišćeni fuzioni protein koji sadrži domen Met kinaze, Sugen, Inc.

7. Pufer TBST.

8. 10% DMSO u vodi (MilliOue H20).

9. 10 mM adenozin-5'-trifosfat u vodi (dejon. H20), Sigma, katalog No. A-5394. 10. Pufer za 2x razblaživanje kinaze: za 100 mL pomešati 10 mL 1M HEPES sa pH 7,5 sa 0,4 mL 5% BSA/PBS, 0,2 mL 0,1 M natrijum-ortovanadata i 1

mL 5M natrijum-hlorida u 88,4 mL dejon. vode.

11. Reakciona smeša 4*ATP: za 10 mL pomešati 0,4 mL 1M mangan-hlorida i 0,02 mL 0,1 M ATP u 9,56 mL dejon. vode. 12. Smeša 4* za negativne kontrole: za 10 mL pomešati 0,4 mL 1M mangan-hlorida u 9,6 mL dejon. vode. 13. Polipropilenske ploče sa 96 bazenčića sa dnom oblika V, NUNC, Applied

Scientific, katalog No. S-72092.

14. 500 mM EDTA.

15. Pufer za razblaživanje antitela: za 100 mL pomešati 10 mL 5% BSA/PBS, 0,5 mL 5% mleka (Carnation Instant Milk<®>) u PBS i 0,1 mL 0,1 M natrijum-ortovanadata u 88,4 mL TBST.

16. Zečje poliklonalno antifosfotirozinsko antitelo, Sugen, Inc.

17. Konjugovano antitelo kozje anti-zečje peroksidaze rena, Biosource, Inc. 18. Rastvor ABTS: za 1 L pomešati 19,21 g limunske kiseline, 35,49 g

Na2HP04i 500 mg ABTS, sa dovoljno dejon. vode da se dobije 1 L.

19. ABTS/H202: pomešati 15 mL rastvora ABTS sa 2 uL H202, pet minuta pred upotrebu.

20. 0,2 M HCI.

Procedura:

1. Oblože se ELISA ploče sa 2 ug poli(glu-tir) u 100 uL PBS, pa se drže na 4°C.

2. Blokira se 60 min ploča sa 150 uL BSA/PBS.

3. Opere se ploča 2* sa PBS, 1 * sa 50 mM puferom Hepes, pH 7,4.

4. Doda se u sve bazenčiće 50 uL razblažene kinaze. (Prečišćena kinaza se razblaži sa puferom za razblaživanje kinaze. Konačna koncentracija treba

da je 10 ng/bazenčić).

5. Doda se 25 uL testiranog jedinjenja (u 4% DMSO) ili samo DMSO (4% u dejon. vodi) u ploče sa kontrolom.

6. Inkubira se smeša kinaza/jedinjenje 15 min.

7. Doda se 25 uL 40 mM MnCI2u bazenčiće sa negativnom kontrolom.

8. Doda se u sve ostale bazenčiće 25 uL smeše ATP/MnCI2(izuzimaju se nagativne kontrole). Inkubira se 5 min.

9. Doda se 25 uL 500 mM EDTA da se prekine reakcija.

10. Opere se ploča 3x sa TBST.

11. Doda se u svaki bazenčić 100 uL zečjeg poliklonalnog anti-Ptyr razblaženog 1:10.000 sa puferom za razblaživanje antitela. Inkubira se 1

h, uz mućkanje, na sobnoj temperaturi.

12. Opere se ploča 3* sa TBST.

13. Razblaži se HRP konjugovano anti-zečje antitelo iz firme Biosource 1:6000 u puferu za antitelo. Doda se 100 uL po bazenčiću, pa se inkubira

1 h, uz mućkanje, na sobnoj temperaturi.

14. Opere se ploča 1 * sa PBS.

15. Doda se u svaki bazenčić 100 uL rastvora ABTS/H2O2.

16. Ukoliko je potrebno, zaustavi se napredovanje reakcije dodavanjem 100 uL 0,2 M HCI po bazenčiću. 17. Očitava se ploča na čitaču Dvnatech MR7000 ELISA reader, sa filterom za testiranje na 410 nm, a referentnim filterom na 630 nm.

Test transfosforilovania IGF- 1

Ovaj test se koristi za merenje sadržaja fosfotirozina u poli(glutaminska kiselina:tirozin, 4:1) za identifikaciju agonista/antagonista za transfosforilovanje gst-IGF-1 substrata.

Materijali i rea<g>ensi:

1. ELISA ploče sa 96 bazenčića, Corning.

2. Poli(glu:tir, 4:1), Sigma, katalog No P 0275.

3. PBS, Gibco, katalog No. 450-1300EB.

4. 50 mM HEPES.

5. Pufer za blokiranje TBB: sa 1L pomešati 100 g BSA, 12,1 g TRIS (pH 7,5), 58,44 g natrijum-hlorida i 10 mL 1% TVVEEN-20. 6. Prečišćeni fuzioni protein GST koji sadrži domen kinaze IGF-1 (Sugen,

Inc.).

7. Pufer TBST. za 1 L pomešati 6,057 g Tris, 8,766 g natrijum-hlorida i 0,5 mL TVVEEN-20, sa dovoljno vode da se dobije 1 L.

8. 4% DMSO u Mili-Q H20.

9. 10 mM ATP u dejon. vodi.

10. Pufer za razblaživanje 2* kinaze: za 100 mL pomešati 10 mL 1M HEPES (pH 7,5), 0,4 mL 5% BSA u dejon. vodi, 0,2 mL 0,1 M natrijum-ortovanadata i 1 mL 5 M natrijum-hlorida, sa dovoljno dejon. vode da se

dobije 100 mL.

11. Reakciona smeša 4* ATP: za 10 mL pomešati 0,4 mL 1M MnCI2i 0,008 mL 0,01 M ATP i 9,56 mL dejon. vode. 12. Smeša 4* za negative kontrole: pomešati 0,4 mL 1M mangan-hlorida u 9,60 mL dejon. vode.

13. Polipropilenske ploče sa 96 bazenčića i dnom oblika V, NUNC.

14. 500 mM EDTA u dejon. vodi.

15. Pufer za razblaživanje antitela: za 100 mL pomešati 10 mL 5% BSA u PBS, 0,5 mL 5% mleka (Camation Instant Non-fat Milk<®>) u PBS i 0,1 mL

0,1 M natrijum-otrovanadata u 88,4 mL TBST.

16. Zečje poliklonalno antifosfotirozinsko antitelo, Sugen, Inc.

17. Kozje anti-zečje HRP konjugovano antitelo, Biosource.

18. Rastvor ABTS.

20. ABTS/H202: pomešati 15 mL ABTS sa 2 uL H202, 5 min pre upotrebe.

21. 0,2 M HCI u dejon. vodi.

Procedura:

1. Oblaganje ELISA ploče sa 2,0 ug/bazenčić sa poli(glu:tir, 4:1) (Sigma,

P0275) u 100 uL PBS. Preko noa držati na 4°C.

2. Opere se ploča 1 * sa PBS.

3. Doda se u svaki bazenčić 100 uL pufera za blokiranje TBB. Inkubira se ploča 1 h, uz mućkanje, na sobnoj temperaturi. 4. Opere se ploča 1 * sa PBS, zatim 2x sa 50 mM puferom Hepes, pH 7,5. 5. Doda se na ploču 25 uL testiranog jedinjenja u 4% DMSO (dobijenog razblaživanjem polaznog rastvora 10 mM testiranog jedinjenja u 100%

DMSO, sa dejon. vodom).

6. Doda se u sve bazenčiće 10,0 ng kinaze gst-IGF-1 u 50 uL pufera za razblaživanje kinaze. 7. Reakcija kinaze počinje sa dodavanjem 25 uL 4* reakcione smeše ATP u sve bazenčiće sa testiranim jedinjenjem i u sve bazenčiće pozitivne kontrole. Doda se 25 uL smeše 4* negativna kontrola u sve bazenčiće negativne kontrole. Inkubira se 10 min, uz mućkanje, na sobnoj

temperaturi.

8. Doda se u sve bazenčiće 25 uL 0,5 M EDTA (pH 8,0).

9. Ploča se opere 4* sa puferom TBST.

10. Doda se u sve bazenčiće zečji poliklonalni anti-fosfotirozinski antiserum, razblažen 1:10.000, u 100 uL pufera za rablaživanje antitela. Inkubira se

uz mućkanje, 1 h na sobnoj temperaturi.

11. Ploča se opere kao u koraku 9.

12. Doda se u sve bazenčiće 100 uL anti-zečjeg HRP iz firme Biosource, razlaženog 1:10.000 u puferu za razblaživanje antitela. Inkubira se uz

mućkanje, 1 h na sobnoj temperaturi.

13. Poloča se opere kao u koraku 9, a zatim 1x sa PBS, da se uklone mehurići i višak Tween-20. 14. Razvijanje, dodavanjem u svaki bazenčić 100 uL/bazenčić ABTS/H2O2. 15. Posle oko 5 min očitavanje na ELISA čitaču, sa filterom za testiranje na 410 nm, a referentnim filterom na 630 nm.

Testovi ugradnje BRDU

Sledeći testovi koriste ćelije koje su skrojene tako da izlučuju odabrani receptor, a zatim se vrednuje efekat posmatranog jedinjenja u pogledu aktivnosti sinteze DNK indukovane ligandom, tako što se određuje ugradnja BrdU u DNK.

Sledeći materijali, reagensi i procedure su opšti za svaki od sledećih testova ugradnje BrdU. Varijacije u određenim testovima su naznačene.

Materijali i rea<g>ensi:

1. Odgovarajući ligand.

2. Odgovarajuće skrojene ćelije.

3. Reagens za obeležavanje BrdU: 10 mM u PBS (pH 7,4) (Boehringer

Mannheim, Nemačka).

4. FixDenat: rastvor za fiksiranje (spreman za upotrebu) (Boehringer

Mannheim, Nemačka).

5. Anti-BrdU-POD: mišje monoklonalno antitelo konjugovano sa peroksidazom. (Boehringer Mannheim, Nemačka). 6. Rastvor TMB substrata: tetrametilbenzidin (TMB, Boehringer Mannheim,

Nemačka).

7. Rastvor PBS za pranje: 1 x PBS, pH 7,4.

8. Albumin, goveđi (BSA), frakcija V praha (Sigma Chemical Co., USA).

Opšta procedura:

1. Zaseju se ćelije, 8000 ćelija/bazenčić, u 10% CS, 2 mM Gln u DMEM, na ploču sa 96 bazenčića. Ćelije se preko noći inkubiraju na 37°C, u 5% CO2. 2. Posle 24 h ćelije se operu sa PBS, a zatim se 24 h izgladnjuju od seruma u medijumu bez seruma (0% CS DMEM sa 0,1% BSA). 3. Trećeg dana, istovremeno se ćelijama dodaju odgovarajući ligand i testirano jedinjenje. Bazenčići sa negativnom kontrolom dobiju samo DMEM bez seruma, sa 0,1% BSA; ćelije za pozitivnu kontrolu dobiju ligand, ali bez testiranog jedinjenja. Testirana jedinjenja se dobijaju u DMEM bez seruma, sa ligandom, na ploči sa 96 bazenčića, pa se serijski

razblažuju u 7 koncentracija za testiranje.

4. Posle 18 h aktiviranja liganda, doda se razblaženi reagens za obeležavanje BrdU (1:100 u DMEM, 0,1% BSA), pa se ćelije 1,5 h

inkubiraju sa BrdU (konačna koncentracija 10 uM).

5. Posle inkubiranja sa obeleženim reagensom, medijum se uklanja dekantovanjem i tapkanjem okrenute ploče po ubrusu od hartije. Doda se rastvor FixDenat (50 uL/bazenčić), pa se ploče 45 min inkubiraju na

sobnoj temperaturi, na mućkalici za ploče.

6. Rastvor FixDenat se potpuno ukloni dekantovanjem i tapkanjem okrenute ploče po ubrusu od hartije. Kao rastvor za blokiranje doda se mleko (5% dehidrirano mleko u PBS, 200 uL/bazenčić), pa se ploča inkubira 30 min

na sobnoj temperaturi, na mućkalici za ploče.

7. Ukloni se rastvor za blokiranje dekantovanjem, a bazenčići se operu 1 x sa PBS. Doda se anti-BrdU-POD rastvor (razblaženje 1:200 u PBS, 1% BSA)

(50 uL/bazenčić), pa se ploča 90 min inkubira na sobnoj temperaturi, na mućkalici za ploče. 8. Konjugat antitela se potpuno ukloni dekantovanjem i ispiranjem bazenčića 5* sa PBS, pa se ploča suši okretanjem i tapkanjem po ubrusu od hartije. 9. Doda se rastvor substrata TMB (100 ul/bazenčić), pa se inkubira 20 min a sobnoj temperaturi, na mućkalici za ploče, sve dok se boja ne razvije

dovoljno za fotometrijsku detekciju.

10. Meri se absorbancija uzoraka na 410 nm (načinom "dvojne talasne dužine" sa filterom za očitavanje na 490 nm, kao referentnim filtrom), na čitaču Dvnatech ELISA reader.

Test ugradnje BrdU indukovan sa EGF

Materijali i rea<g>ensi:

1. Mišji EGF, 201 (Toyobo Co., Ltd., Japan).

2. 3T3/EGFRc7.

Test ugradnje Brdu pomoću Her- 2 indukovan sa EGF

Materijali i rea<g>ensi:

1. Mišji EGF, 201 (Toyobo Co., Ltd., Japan).

2. 3T3/EGFr/HER2/EGFr (EGFr sa domenom Her-2-kinaze).

Test uoradnie Brdu pomoću Her- 4 indukovan sa EGF

Materijali i rea<g>ensi:

1. Mišji EGF, 201 (Toyobo Co., Ltd., Japan).

2. 3T3/EGFr/HER4/EGFr (EGFr sa domenom Her-4-kinaze).

Test ugradnje BrdU indukovan sa PDGF

Materijali i rea<g>ensi:

1. Humani PDGF B/B (Boehringer, Mannheim, Nemačka).

2. 3T3/EGFRC7.

1. Humani FGF2(bFGF (Gibco BRL, USA).

2. 3T3c7/EGFr.

Test u<g>radnje BrdU indukovan sa IGF1

Materijali i rea<g>ensi:

1. Humani rekombinantni (G511, Promega Corp. USA).

2. 3T3/IGF1r.

Test ugradnje BrdU indukovan insulinom

Materijali i rea<g>ensi:

1. Insulin, kristalni, goveđi, cink (13007, Gibco BRL, USA)

2. 3T3/H25.

Test ugradnje BrdU indukovan sa HGF

Materijali i rea<g>ensi:

1. Rekombinantni humani HGF (katalog No. 249-HG, R&D Systems, Inc.

USA)

2. BxPC-3 ćelije (ATCC CRL-1687).

Procedura:

1. Zasejavanje ćelija, 9000 ćelija/bazenčić, u RPM110% FBS, na ploči sa 96 bazenčića. Ćelije se preko noći inkubiraju na 37°C, u 5% CO2. 2. Posle 24 h ćelije se operu sa PBS, a zatim se 24 h izgladnjuju bez seruma u 100 uL medijuma bez seruma (RPMI sa 0,1% BSA). 3. Trećeg dana doda se ćelijama 25 uL gde se sadrži ligand (dobija se iz 1 ug/mL RPMI sa 0,1% BSA; konačna koncentracija HGF je 200 ng/mL) i test jedinjenje. Bazenčići sa negativnom kontrolom dobiju 25 uL RPMI bez seruma, samo sa 0,1% BSA. Ćelije za pozitivnu kontrolu dobiju ligand (HGF), ali bez testiranog jedinjenja. Testirana jedinjenja se pripremaju u 5-strukoj koncentraciji od konačne, u RPMI bez seruma, sa ligandom, u ploči sa 96 bazenčića, pa se serijski razblažuju, dajući 7 testiranih koncentracija. Tipično, najveća koncentracija testiranog jedinjenja je 100 uM, a koriste se razblaženja 1:3 (tj. konačna koncentracija testiranog

jedinjenja je u opsegu 0,137-100 uM).

4. Posle 18 h aktivacije liganda, u svaki bazenčić se doda 12,5 uL razblaženog reagensa BrdU (1:100 u RPMI , 0,1% BSA), pa se ćelije

inkubiraju 1 h sa BrdU (konačna koncentracija 10 uM).

5. Isto kao u Opštoj proceduri.

6. Isto kao u Opštoj proceduri.

7. Ukloni se rastvor za blokiranje dekantovanjem bazenčića i pranjem 1 * sa OBS. Doda se rastvor anti-BrdU-POD (razblaženje 1:100 u PBS, 1% BSA)

(100 uL/bazenčić), pa se ploča 90 min inkubira na sobnoj temperaturi, na

mućkalici za ploče.

8. Isto kao u Opštoj proceduri.

9. Isto kao u Opštoj proceduri.

10. Isto kao u Opštoj proceduri.

Test HUV- EC- C

Ovaj test se koristi za merenje aktivnosti jedinjenja protiv PDGF-R, FGF-R, VEGF, aFGF ili Flk-1/KDR, svih koje prirodno izlučuju ćelije HUV-EC.

Nulti dan.

1. Operu se 2* i tripsinizuju ćelije HUV-EC-C (humane ćelijuma endotelijuma pupčane vene, American Type Culture Collection, katalog No. 1730 CRL). Operu se slanim fosfatnim puferom Dulbecco (D-PBS, dobijen iz firme Gibco BRL, katalog No. 14190-029), sa oko 1 mL/1 Ocm2 tkiva, u balonu za kultivisanje. Tripsinizuje se sa 0,05% tripsin-EDTA, u rastvoru za ne-enzimatsku disocijaciju ćelija (Sigma Chemical Company, katalog No. C-1544). Priprema se 0,05% tripsin razblaživanjem 0,25% tripsin / 1 mM EDTA (Gibco, katalog No. 25200-049) u rastvoru za disocijaciju ćelija. Tripsinizuje se sa oko 1 mL/25-30 cm<2>tkiva u balonu za kultivisanje, oko 5 min na 37°C. Pošto se ćelije odvoje od balona, doda se jednaka zapremina medijuma za testiranje, pa se prebaci u sterilnu kivetu za

centrifugiranje od 50 mL (Fisher Scientific, katalog No. 05-539-6).

2. Operu se ćelije sa oko 35 mL medijuma za testiranje, u sterilnoj kiveti za centrifugiranje od 50 mL, dodavanjem medijuma za testiranje i centrifugiranjem 10 min na približno 200xg, gornji bistri sloj se usisa, pa se resuspenduje u 35 mL D-PBS. Ponovi se ovo pranje sa D-PBS još dva puta, ćelije resuspenduju u oko 1 mL medijuma za testiranje/15 cm<2>tkiva, u balonu za kultivisanje. Medijum za testiranje se sastoji od medijuma F12K (Gibco BRL, katalog No. 21127-014) i 0,5% toplotno inaktiviranog seruma goveđeg fetusa. Ćelije se broje pomoću uređaja Coulter Counter<®>

(Coulter Electronics, Inc.), pa se ćelijama doda medijum za testiranje, tako

da se dobije koncentracija (0,8-1,0)*10<5>ćelija/mL

3. Doda se 100 uL/bazenčić ćelija na ploču sa 96 bazenčića ravnog dna, pa se inkubira -24 h na 37°C, u 5% C02.

Prvi dan

1. Naprave se dvostruke titracije testiranog jedinjenja na odvojenim pločama sa 96 bazenčića, obično od 50 uM, pa do 0 uM. Koristi se isti medijum za testiranje koji je pomenut u Nultom danu, u gornjem 2. koraku. Titracije se obavljaju dodavanjem 90 uL/bazenčić 200 uM testiranog jedinjenja (40* od konačne koncentracije u bazenčiću) u bazenčić na vrhu kolone odabrane ploče. Pošto je početna koncentracija testiranog jedinjenja obično 20 uM koncentracija leka sadrži 2% DMSO.

Razblaživač se dopuni sa 2% DMSO u medijumu za testiranje (F12K + 0,5% seruma goveđeg fetusa), pa se koristi kao razblaživač za titraciju testiranog jedinjenja, kako bi se razblažilo testirano jedinjenje, a održala koncentracija DMSO konstantnom. Doda se 60 uL/bazenčić ovog razblaživača u preostale bazenčiće u koloni. Uzme se 60 uL iz 120 uL 200 uM testiranog jedinjenja u bazenčići na vrhu kolone, pa se pomeša sa 60 uL u drugom bazenčiću te kolone. Uzme se 60 uL iz ovog bazenčića, pa se pomeša sa 60 uL u trećem bazenčiću iste kolone, i tako dalje, dok se ne kompletira dvostruka titracija. Kada se pomeša predposlednji bazenčić, uzme se 60 uL iz 120 uL u tom bazenčiću i odbaci se. Posledni bazenčić se ostavi sa 60 uL razblaživač medijuma/DMSO, kao kontrola koja ne sadrži testirano jedinjenje. Pripremi se 9 kolona titrisanog testiranog jedinjenja, dovoljno da se ima triplikat bazenčića od kojih je svaki za: (1) VEGF (dobijen iz firme Pepro Tech Inc., katalog No. 100-200; (2) faktor rasta ćelija endotelijuma (ECGF) (poznat takođe kao faktor rasta kiselog fibroplasta, ili FGF) (dobijen iz firme Boehringer Mannheim Biochemica, katalog No. 1439 600); ili (3) humani PDGF B/B (1276-956, Boehringer Mannheim, Nemačka) i medijum za testiranje kao kontrola. ECGF dolazi

kao preparat sa natrijum-heparinom.

2. Prebaci se 50 uL/bazenčić rablaženja testiranog jedinjenja na ploče za testiranje sa 96 bazenčića, koje sadrže (0,8-1,0)*10<4>ćelija(100 uL/bazenčić ćelija HUV-Ec C iz Nultog dana, pa se inkubira~2 h na 37°C,

u 5% C02.

3. U triplikatu, dodaje se svakom testiranom jedinjenju 50 uL/bazenčić 80 ug/mL VEGF, 20 ng/mL ECGF ili kontrolni medijum. Koristi se medijum za testiranje iz Nultog dana, korak 2, za pripremanje koncentracija faktora rasta. Inkubira se približno 24 h na 37°C, u 5% C02. Svaki bazenčić ima 50 uL razblaženog testiranog jedinjenja, 50 uL faktora rasta ili medijuma i

100 uL ćelija, što ukupno čini 200 uL/bazenčić. Dakle 4-struke koncentracije testiranog jedinjenja i faktora rasta postaju jednostruke, kada se sve ovo doda u bazenčiće.

Drugi dan

1. Doda se 1 uCi/bazenčić<3>H-timidina (Amersham, katalog No. TRK-686) (10 uL/bazenčić rastvora 100 uCi/mL, pripremljenog u medijumu RPMI + 10% toplotom inaktiviranog sruma goveđeg fetusa), pa se inkubira -24 h na 37°C, u 5% C02. RPMI je dobijen iz firme Gibco BRL, katalog No. 11875-051.

Treći dan

1. Ploče se preko noći mrznu na -20°C.

Četvrti dan

Otkrave se ploče i pokupe ćelije sa sakupljačem, iz ploča sa 96 bazenčića (Tomtec Harvester 96<®>) na filter papire (VVallac, katalog No. 1205-401), očitaju se impulsi na VVallac Betaplate™ brojaču tečne scintilacije.

Tabela 2 pokazuje rezultate biološkog testiranja nekih jedinjenja formule (I) uzetih za primer. Rezultati su dati kao vrednost IC50, mikromolarna koncentracija (uM) jedinjenja koje se testira, koja izaziva 50% pramenu u aktivnosti ciljane PKT, u poređenju sa aktivnošću PKT kontrole kojoj nije dodato testirano jedinjenje. Specifično, ovi rezultati pokazuju koncentraciju testiranog jedinjenja koja je potrebna sa izazove 50% smanjenje aktivnosti ciljane PTK. Biotestovi koji su, ili koji se mogu korisitit za vrednovanje jedinjenja, opisani su detaljnije u nastavku.

Modeli životinjain vivo

Model životinjskog ksenoarafta ( heterokalemlienia )

Svojstvo humanih tumora da rastu kao ksenografti kod atimičnih miševa (npr. Balb/v, nu/nu) predstavlja koristan model za ispitivanjein vivobiološkog odgovora na terapiju humanih tumora. Od prve uspešne kseno-transplantacije humanih tumora na atimične miševe (Rvgard i Povišen,Acta Pathol. Microbial. Scand,1969, 77, 758-760), mnogi različiti sojevi ćelija humanog tumora (npr. dojke, pluća, genitourinarni, gastrointestinalni, glave i vrata, glioblastom, kosti i maligni melanomi) su transplantirani i uspešno razvijani u golim miševima. Za određivanje nivoa aktivnosti, specifičnosti i efekta raznih jedinjenja formule (I), mogu se koristiti sledeći testovi.

Za ocenjivanje jedinjenja formule (I) korisne su tri opšte vrste testova: ćelijsko/katalitički, ćelijsko/biološki iin vivo.Predmet ćelijsko/katalitičkih testova je određivanje efekta jedinjenja formule (I) na svojstvo TK da fosforiluje tirozine na poznatom substratu u ćeliji. Predmet ćelijsko/bioloških testova je određivanje efekta jedinjenja formule (I) na biološki odgovor stimulisan sa TK u ćeliji. Predmetin vivotestova je određivanje efekta jedinjenja formule (I) na određeni poremećaj, kao što je kancer, na modelu životinja.

Pogodni sojevi ćelija za eksperimente sa potkožnim ksenograftom su ćelije C6 (gliom, ATCC#CCI 107), ćelije A375 Melanom, ATCC#CRL 1619), ćelije A431 (karcinom epiderma, ATCC#CRL 1555), ćelije Calu 6 (pluća, ATCC#56), ćelije PC3 (prostata, ATCC#CRL 1435), ćelije SKOV3TP5 i fibroplasti NIH 3T3 genetski skrojeni da pojačano izlučuju EGFR, PDGFR, IGF-1 R ili mnoge druge kinaze. Za obavljanje eksperimenata sa ksenograftom može se koristiti sledeći protokol: Ženke atimičkih miševa (BALB/c, nu/nu) se dobijaju iz firme Simonsen Laboratories (Gilrov, CA). Sve životinje se drže u uslovima čistih prostorija u mikro-izolacionim kavezima, sa Alfa-suvom prostirkom. Oni primaju sterilnu hranu za glodare i vodu po volji.

Sojevi ćelija se rastu u odgovarajućem medijumu (na primer, MEM, DMEM, Ham-ov F10 ili Ham-ov F12 plus 5%-10% seruma goveđeg fetusa (FBS) i 2 mM glutamin (GLN)). Sve, medijum kulture ćelija, glutamin i serum goveđeg fetusa se poručuju iz firme Gibco Life Technologies (Grand Island, NY), ukoliko se drugačije ne naglasi. Sve ćelije rastu u vlažnoj atmosferi 90-95% vazduha i 5-10% C02, na 37°C. Svi sojevi ćelija se rutinski sub-kultivišu dva puta nedeljno i negativni su na mikoplazmu, što se određuje metodom Mvcotect (Gibco).

Ćelije se sakupe kada su ili kada su bliske potpunoj konfluenciji, sa 0,05% tripsin-EDTA, pa se peletiraju 10 min sa 450*g. Ove pelete se resuspenduju u sterilnom PBS ili medijumu (bez FBS) do određene koncentracije, pa se ćelije implantiraju u zadnji deo slabine miševa (8-10 miševa u grupi, (2-10)x10<6>ćelija/životinja). Rast tumora se meri tokom 3 do 6 nedelja, koristeći šestar nonijusa. Zapremine tumora se izračunavaju kao proizvod dužinaxšiirnaxvisina, ukoliko se drugačije ne naglasi. Vrednosti P se izračunavaju korišćenjem Student-ovog t-testa. Testirana jedinjenja formule (I) u 50-100 uL dodatka (DMSO ili VPD.D5VV) mogu se dozirati IP injekcijom pri različitim koncentracijama, obično polazeći dan posle implantacije.

Model invazije tumora

Razvijen je sledeći model invazije tumora, koji se može koristiti za ocenjivanje terapeutske vrednosti i efikasnosti jedinjenja formule (I), a identifikovan je po selektivnoj inhibiciji receptora KDR/FLK-1.

Procedura

Kao eksperimentalne životinje koriste se goli miševi (ženke), stari 8 nedelja (Simonsen Inc.). Implantacija ćelija tumora se može obaviti u kapeli sa laminamim protokom. Za anesteziju, ordinira se intrapeirtonealno koktel ksilazin/ketamin (100 mg/kg ketamina i 5 mg/kg ksilazina). Napravi se središni rez da se izloži abdominalna šupljina (dužine, približno 1,5 cm), da bi se injektiralo 10<7>ćelija tumora, u zapremini 100 uL medijuma. Ćelije se injektiraju, ili u duodenalno krilo pankreasa ili pod serozu debelog creva. Peritoneum i mišići se zatvore sa kontinualnim svilenim koncem 6-0, a koža se zatvori korišćenjem klema za rane. Životinje se svakodnevno posmatraju.

Analiza

Posle 2-6 nedelja, zavisno od veličine opažanja na životinjama, miševi se žrtvuju, a lokalne metastaze tumora na raznim organima (pluća, jetra, mozak, stomak, slezina, srce, mišići) se iseku i analiziraju (merenje veličine tumora, stepena invazije, imunohemije, određivanje hibridizacijein situ,itd.).

Test C- KIT

Ovaj test se koristi za detekciju nivoa fosforilovanja c-kit tirozina.

Ćelije M07E (humana akutna mieloidna leukemija) se izgladnjuju od seruma u 0,1% serumu. Ćelije se prethodno tretiraju sa jedinjenjem formule (I) (paralelno sa izgladnjivanjem od seruma), pre stimulacije ligandom. Ćelije se stimulišu 15 min sa 250 ng/mL rh-SCF. Posle stimulacije, ćelije se lizuju i imunotalože sa anti-c-kit antitelom. Sadržaji fosfotirozina i proteina se određuju metodom VVestern blotting.

Test proliferacije MTT

Ćelije M07E se izgladnjuju od seruma i prethodno tretiraju sa jedinjenjem formule (I), kao što je opisano u eksperimentima fosforilovanja. Ćelije se nanose na ploče sa 4*10<5>ćelija/bazenčić, u Petrijevoj šolji sa 96 bazenčića, u 100 uL RPMI + 10% seruma. Doda se rh-SCF (100 ng/mL), pa se ploča inkubira 48 h. Posle 48 h doda se 10 uL MTT sa 5 mg/mL [3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difenil tetrazol-bromid)] , pa se ostavi da se 4 h inkubira. Doda se kiseli izopropanol (100 uL 0,04 M HCI u izopropanolu), pa se meri optička gustina na talasoj dužini 550 nm.

Test apoptoze

Ćelije M07E se inkubiraju, ±SCF i ± jedinjenje formule (I), u 10% FBS, sa rh-GM-CSF (10 ng/mL) i rh-IL-3 (10 ng/mL). Uzorci se testiraju posle 24 i 48 h. Da bi se merila aktivirana kaspaza-3, uzorci se operu sa PBS, pa permeabilizuju sa 70% atenaolom ohlađenim u ledu. Ćelije se zatim boje sa PE-konjugovanom poliklonalnom zečjom anti-aktivnom kaspazom-3, pa analiziraju pomoću FACS. Da se mere otcepljeni PARP, uzorci se lizuju i analiziraju metodom VVestem blotting, sa anti-PARP antitelom.

Drugi testovi

Drugi testovi, koji se mogu koristi za ocenjivanje jedinjenja Formule (I) su, bez ograničavanja, bilo-flk-1 test, test EGF-receptor-HER2 himernog receptora na celim ćelijama, bio-src test, bio-lck test i test merenja funkcije fosforilovanja raf. Protokoli za svaki od ovih testova se mogu naći u U.S. Application Ser. No. 09/099,842, koji je ovde priključen, uključujući crteže, kroz citat.

Merenie toksičnosti ćelija

Terapeutska jedinjenja treba da su snažnija u inhibiranju aktivnosti receptora tirozin kinaze, nego u ispoljavanju citotoksičnog efekta. Mera efikasnosti i ćelijske toksičnosti nekog jedinjenja se može dobiti određivanjem terapeutskog indeksa, tj. IC50/LD50. Vrednost IC50, je doza koja je potrebna da se postigne 50% inhibicija, može se meriti korišćenjem standardnih tehnika, kao što su one koje se ovde opisuju. Vrednost LD50, je doza koja dovodi do 50% toksičnosti, može se takođe meriti isto tako standardnim tehnikama (Mossman,J. Immunol. Methods1983, 65, 55-63), merenjem količine oslobođenog LDH (Korzeniewski i Callewaert,J. Immunol. Methods,1983, 64, 313; Decker i Lohman-Matthes,J. Immunol. Methods,1988,115, 61), ili merenjem letalne doze na modelu životinja. Poželjna su jedinjenja sa visokim terapeutskim indeksom. Terapeutski indeks treba da je veći od 2, poželjno najmanje 10, poželjnije najmanje 50.

B . Primer rezultata ćeliiskoa testiranja , korišćenjem 5 -( 5 - fluoro - 2 - okso - 1 . 2 -

dihidroindol - 3 - ilidenmetil )- 2 . 4 - dimetil - 1 H - pirol - 3 - karboksilnakiselina ( 2 -

dietilamino - etiDamida ( Jedinjenje 80 )

Da bi se potvrdila snaga 5-(5-fluoro-2-okso-1,2-dihidroindol-3-ilidenmetil)-2,4-dimetil-1H-pirol-3-karboksilna kiselina (2-dietilamino-etil)amida (Jedinjenje 80), koja je detektovana u biohemijskim testovima (vidi niže), ocenjuje se svojstvo pomenutog jedinjenja da inhibira fosforilovanje RTK zavisno od liganda, u testovima na bazi ćelija, koristeći mišje ćelije MIH-3T3, skrojene tako da pojačano izlučuju Flk-1 ili humani PDGFRp. Pokazalo se da 5-(5-fluoro-2-okso-1,2-dihidroindol-3-ilidenmetil)-2,4-dimetil-1 /-/-pirol-3-karboksilna kiselina (2-dietilamino-etil)amid (Jedinjenje 80) inhibira fosforilovanje tirozina zavisno od VEGF, sa vrednošću IC50od približno 0,03 uM. Ova vrednost je slična 0,009 uM K vrednosti za inhibiciju Flk-1 pomoću 5-(5-fluoro-2-okso-1,2-dihidroindol-3-ilidenmetil)-2,4-dimetil-1H-pirol-3-karboksilna kiselina (2-dietilamino-etil)amida (Jedinjenje 80), koja je određena u biohemijskim testovima. Ovo pokazuje sa 5-(5-fluoro-2-okso-1,2-dihidroindol-3-ilidenmetil)-2,4-dimetil-1H-pirol-3-karboksilna kiselina (2-dietilamino-etil)amid (Jedinjenje 80) lako penetrira u ćelije. Saglasno sa ovim biohemijskim podacima (vidi niže), koji pokazuju da 5-(5-fluoro-2-okso-1,2-dihidroindol-3-ilidenmetil)-2,4-dimetil-1 H-pirol-3-karboksilna kiselina (2-dietilamino-etil)amid (Jedinjenje 80) ima uporedivu aktivnost protiv Flk-1 i PDGFRp, nađeno je takođe da isto jedinjenje inhibira receptor za fosforilovanje koji zavisi od PDGF u ćelijama, sa vrednošću IC50od približno 0,03 uM. Svojstvo

5-(5-fluoro-2<>kso-1,2-dihidro^ karboksilna kiselina (2-dietilamino-etil)amida (Jedinjenje 80) da inhibira c-kit, blisko srodnu RTK, koja vezuje faktor stem-ćelija (SCF), se određuje korišćenjem ćelija M07E koje izlučuju ovaj receptor. U ovim ćelijama 5-(5-fluoro-2-okso-1,2-dihidroindol-3-ilidenmetil)-2,4-dimetil-1 /-/-pirol-3-karboksilna kiselina (2-dietilamino-etil)amid (Jedinjenje 80) inhibira fosforilovanje c-kit, zavisno od SCF, sa vrednošću IC50od 0,01-0,1 uM. Ovo jedinjenje inhibira takođe fosforilovanje c-kit, stimulisano sa SCF, kod napada akutne mieloidne leukemije (AML), izolovanih iz periferne krvi pacijenta.

Pored toga, da bi se testiralo svojstvo 5-(5-fluoro-2-okso-1,2-dihidroindol-3-ilidenmetil)-2,4-dimetil-1 /-/-pirol-3-karboksilna kiselina (2-dietilamino-etil)amida (Jedinjenje 80) da inhibira fosforilovanje receptora zavisno od liganda, u ćelijama, ispitivan je takođein vitroefekat na proliferativni odgovor ćelija, zavisan od liganda (videti Tabelu 4). U ovim ispitivanjima, ćelije su mirovale izgladnjavanjem od seruma preko noći, pa su izazvane da podlegnu sintezi DNK, nakon dodavanja odgovarajućeg mitogenog liganda. Kao što je pokazano u Tabeli 3, 5-(5-fluoro-2-okso-1,2-dihidroindol-3-ilidenmetil)-2,4-dimetil-1 H-pirol-3-karboksilna kiselina (2-dietilamino-etil)amid (Jedinjenje 80) inhibira proliferaciju NIH-3T3 ćelija, indukovanu sa PDGF, pojačanim izlučivanjem PDGFRB ili PDGFRa, sa vrednostima IC500,031 i 0,069 uM, respektivno, i proliferaciju ćelija M07E, indukovanu sa SCF, sa vrednošću IC50od 0,007 uM.

Kao što je pokazano u Tabeli 3, postoji opšta saglasnost između biohemijskih i ćelijskih aktivnosti 5-(5-fluoro-2-okso-1,2-dihidroindol-3-ilidenmetil)-2,4-dimetil-1H-pirol-3-karboksilna kiselina (2-dietilamino-etil)amida (Jedinjenje 80), podržavajući zaključak da ovo jedinjenje prolazi kroz ćelijske membrane. Dalje, može se zaključiti da su ćelijski odgovori rezultat aktivnosti Jedinjenja 80 prema naznačenom cilju. Nasuprot, kada se testiraju u prisustvu medijuma za kompletan rastin vitro,potrebne su značajno više koncentracije 5-(5-fluoro-2-okso-1,2-dihidroindol-3-ilidenmetil)-2,4-dimetil-1H-pirol-3-karboksilna kiselina (2-dietilamino-etil)amida (Jedinjenje 80) (>10 uM), za inhibiranje rasta raznih ćelija humanih tumora (videti tabelu 4). Ovo pokazuje da ovo jedinjenje ne inhibira rast ovih ćelija direktno, sa koncentracijama potrebnim sa se inhibira fosforilovanje receptora zavisno od liganda i proleferacija ćelija.

Ukratko, rezultati u Tabeli 4 su dobijeni inkubiranjem ćelija 48 h u medijumu za kompletan rast, u prisustvu serijskih razblaženja 5-(5-fluoro-2-okso-1,2-dihidroindol-3-ilidenmetil)-2,4-dimetil-1 H-pirol-3-karboksilna kiselina (2-dietilamino-etil)amida. Na kraju perioda rasta određuje se relativni broj ćelija. Vrednosti IC50se izračunavaju kao koncentracija jedinjenja koje inhibira rast ćelija za 50% relativno prema netretiranim ćelijama. Vrednosti LD50se izračunavaju kao koncentracija jedinjenja koja izaziva 50% smanjenje u broju ćelija, relativno prema onome na početku eksperimenta.

Relevenatniji test na bazi ćelija, u kome se vrednuje anti-angiogeni potencijal 5-(5-fluoro-2-okso-1,2-dihidroindol-3-ilidenmetil)-2,4-dimetil-1H-pirol-3-karboksilna

kiselina (2-dietilamino-etil)amida (Jedinjenje 80) je test mitogenezein vitro,koji koristi humane ćelije endotelijuma iz pupčane vene (HUVEC), kao model sistem za proliferaciju ćelija endotelijuma, kritičan za angiogeni proces. U ovom testu, mitogeni odgovor, meren kao porast sinteze DNK, je izazvan u HUVEC izgladnjivanim serumom, nakon dodavanja VEGF ili FGF. U ovim ćelijama 5-(5-fluoro-2HDkso-1,2-dihidroindol-3-ilidenmetil)-2,4-dimetil-1/-/-pirol-3-karboksilna

kiselina (2-dietilamino-etil)amid (Jedinjenje 80) inhibira mitogeni odgovor indukovan sa VEGF ili FGF, na način zavisan od doze, sa vrednostim IC500,004 uM i 0,7 uM, respektivno, kada je jedinjenje bilo prisutno tokom 48 h trajanja testa.

Ukratko, gore pomenuti rezultati su dobijeni korišćenjem serumom izgladnjivanih HUVEC, koje su inkubirane sa mitogenim koncentracijama VEGF (100 ng/mL) ili FGF (30 ng/mL), u prisustvu serijskih razblaženja 5-(5-fluoro-2-okso-1,2-dihidroindol-3-ilidenmetil)-2,4-dimetil-1 H-pirol-3-karboksilna kiselina (2-dietilamino-etil)amida (Jedinjenje 80), u toku 24 h. Mitogeni odgovor tokom sledećih 24 h, u prisustvu liganda i inhibitora je kvantitativno određen merenjem sinteze DNK, zasnovane na ugradnji bromodeoksiuridina u ćelijsku DNK.

U odvojenim eksperimentima, jedinjenje 80 inhibira fosforilovanje ERKV2(p42/44MAP kinaze) zavisno od VEGF, na bliskom silaznom cilju Flk-1/KDR, na način koji zavisi od doze. Inhibitorska aktivnost jedinjenja 80, pokazalo se da je takođe dugotrajna u ovom sistemu; inhibiranje fosforilovanja ERK V2 zavisnog od VEGF, tokom čitavih 48 h, posle uklanjanja 5-(5-fluoro-2-okso-1,2-dihidroindol-3-ilidenmetil)-2,4-dimetil-1H-pirol-3-karboksilna kiselina (2-dietilamino-etil)amida (Jedinjenje 80) iz medijuma, posle koga sledi kratkotrajno izlaganje (2 h) mikromolarnim koncentracijama jedinjenja.

VEGF je značajan faktor za preživljavanje ćelija endotelijuma. Pošto 5-(5-fluoro-2- okso-1,2-dihidroindol-3-ilidenmetil)-2,4-dimetil-1 /-/-pirol-3-karboksilna kiselina (2-dietilamino-etil)amid (Jedinjenje 80) inhibira mitogeni odgovor HUVEC zavisan od VEGF, ispitivan je efekat ovog jedinjenja na preživljavanje HUVEC . U ovim eksperimentima kao iznos apoptoze koristi se cepanje kaspaze 3 od substrata poli-ADP-ribozil-polimeraze (PARP). HUVEC kultivisane 24 h pod uslovima bez seruma, pokazuju značajne sadržaje cepanja PARP, što se detektuje akumuliranjem fragmenta cepanja od 23 kDa PARP. Ovo se većinom sprečava dodavanjem VEGF u medijum ćelije, što ukazuje da VEGF deluje kao faktor za preživljavanje u ovom testu. Pokazano je da 5-(5-fluoro-2-okso-1,2-dihidroindol-3- ilidenmetil)-2,4-dimetil-1 H-pirol-3-karboksilna kiselina (2-dietilamino-etil)amid (Jedinjenje 80) inhibira signalizaciju KDR. U skladu sa tim, 5-(5-fluoro-2-okso-1,2-dihidroindol-3-ilidenmetil)-2,4-dimetil-1 H-pirol-3-karboksilna kiselina (2-dietilamino-etil)amid (Jedinjenje 80) inhibira preživljavanje HUVEC posredovano sa VEGF, na način koji zavisi od doze. Dakle, ovi podaci pokazuju da jedinjenje 80 indukuje apoptozu ćelija endotelijuma u kulturi, u prisustvu VEGF.

C. Ispitivanje efikasnosti in vivo

i. Efikasnost protiv javljanja tumora ksenografta

Efikasnostin vivo5-(5-fluoro-2-okso-1,2-dihidroindol-3-ilidenmetil)-2,4-dimetil-1H-pirol-3-karboksilna kiselina (2-dietilamino-etil)amida (Jedinjenje 80) ispitivana je na modelima potkožnog ksenografta (SC), korišćenjem humanih ćelija tumora, implantiranih u oblast zadnjeg dela slabine atimičkih miševa. Nakon implantacije, tumori su ostavljeni da se stabilizuju po veličini na 100-550 mm<3>, pre početka oralnog tretmana sa ovim jedinjenjem.

Dnevno oralno ordiniranje jedinjenja 80 izaziva inhibiciju rasta tumora A431 na način zavisan od doze, kada se tretman počne nakon što je tumor narastao do veličine 400 mm<3>. Statistički značajna (P<0,05) inhibicija rasta tumora je opažena pri dozama od 40 mg/kg/dan (74% inhibicija) i 80 mg/kg/dan (84% inhibicija) (videti tabelu 6). U preliminarnim eksperimentima, veća doza ovog jedinjenja (160 mg/kg/dan) nije bila efikasnija protiv ustanovljenog tumora A431 od doze 80 mg/kg/dan. Pored toga, miševi tretirani sa dozom od 160 mg/kg/dan ovog jedinjenja, gubili su telesnu masu, što ukazuje sa se veća doza nije dobro podnosila. Slični rezultati su dobijeni u eksperimentu u kome je dopušteno da tumori A431 dostignu veličinu od 100 mm<3>(videti Tabelu 4). U ovom drugom eksperimentu, potpuno povlačenje tumora se desilo kod šest od osam životinja, koje su tretirane 21 dan sa 80 mg/kg/dan. Kod ovih šest životinja, tumori nisu ponovo rasli, tokom perioda posmatranja od 100 dana, nakon kraja eksperimenta. Kod dve životinje, kod koji su tumori ponovo rasli do velikih razmera (2000-3000 mm<3>), tumori su se povukli, kao odgovor na drugu rundu tretmana sa jedinjenjem 80. Značajno je da se u svim eksperimentima efikasnosti 5-(5-fluoro-2-okso-1,2-dihidroindol-3-ilidenmetil)-2,4-dimetil-1H-pirol-3-karboksilna kiselina (2-dietilamino-etil)amid (Jedinjenje 80), pri 80 mg/kg/dan, dobro podnosi, čak i kada je kontinualno dozirano duže od 100 dana.

Ukratko, rezultati, koji su pokazani u Tabeli 5, dobijeni su korišćenjem ćelija A431 (0,5x1 o6 ćelija/miš), koje su implantirane SC u oblast zadnje slabine atimičkog miša. Dnevno oralno ordiniranje 5-(5-fluoro-2-okso-1,2-dihidroindol-3-ilidenmetil)-2,4-dimetil-1H-pirol-3-karboksilna kiselina (2-dietilamino-etil)amida (Jedinjenje 80) u tečnom nosaču na bazi Cremophore-a ili u tečnom nosaču kontrole, početo je kada su tumori dostigli naznačenu prosečnu zapreminu. Tumori su mereni korišćenjem nonijus-šestara, a zapremina tumora je izračunavana kao proizvod dužina*šiirnaxvisina. Vrednosti P su izračunavanje poređenjem veličine tumora kod životinja koje su tretirane sa jedinjenjem 80 (n=8) sa onim životinjama koje su tretirane samo tečnim nosačem (n=16), i to poslednjeg dana eksperimenta, koristeći dvodelni Student-ov t-test.

Efikasnost jedinjenja 80 protiv utvrđenih humanih tumora različitog porekla određivana je korišćenjem ksenografta Colo205 (karcinom debelog creva), SF763T (gliom) i NCI-H460 (karcinom pluća, ali ne malih ćelija) (videti Tabelu 6). Ovi eksperimenti su obavljeni korišćenjem 5-(5-fluoro-2-okso-1,2-dihidroindol-3-ilidenmetil)-2,4-dimetil-1 H-pirol-3-karboksilna kiselina (2-dietilamino-etil)amida (Jedinjenje 80), ordiniranog oralno sa 80 mg/kg/dan, dozom koja je bila efikasna i dobro se podnosila.

U gore pomenutim eksperimentima, jedinjenje 80 se ordinira jedan put na dan sa 80 mg/kg u tečnom nosaču na bazi Cremophore-a, tek kada je tumor dostigao naznačenu veličinu. Procenat inhibicije se poredi sa kontrolnom grupom koja je tretirana tečnim nosačem, a izračunat je na završetku eskperimenata. Vrednosti P se izračunavaju poređenjem veličine tumora životinja koje su tretirane sa ovim jedinjenjem prema veličini tumora onih životinja koje su tretirane samo sa tečnim nosačem, koristeći dvodelni Student-ov t-test.

Mada 5-(5-fluoro-2-okso-1,2-dihidroindol-3-ilidenmetil)-2,4-dimetil-1 H-pirol-3-karboksilna kiselina (2-dietilamino-etil)amid (Jedinjenje 80) inhibira rast svih vrsta tumora prikazanih u Tabeli 7, postojala je razlika u odgovoru na različite modele ksenografta. Specifično, rast tumora NCI-H460 i SF763T bio je zaustavljen ili veoma usporen, dok su se tumori Colo205, kao što su tumori A431, povukli kada su tretirani sa 5-(5-fluoro-2-okso-1,2-dihidroindol-3-ilidenmetil)-2,4-dimetil-1H-pirol-3-karboksilna kiselina (2-dietilamino-etil)amidom.

Da bi se odredila molekulska baza razlika u odgovoru između modela ksenografta, ispitivani su tumori SF763T. Dakle, tumori SF763T, sa manjim odgovorom na tretman sa 5-(5-fluoro-2-okso-1,2-dihidroindol-3-ilidenmetil)-2,4-dimetil-1 H-pirol-3-karboksilna kiselina (2-dietilamino-etil)amidom, bili su ocenjivani na molekulskom nivou korišćenjem imunohistoloških tehnika, da bi se odredio efekat tretmana sa ovim jedinjenjem. Ova ispitivanja su na početku obavljana na ovoj vrsti tumora, zato što su ovi tumori veoma vaskularizovani sa mikro-krvnim sudovima, koji jako izlučuju marker ćelije endotelijuma CD31, pa su stoga vrlo pogodni za ispitivanje gustine mikro-krvnih sudova tumora (MVD). Imunohistološko ocenjivanje tumora SF763T pokazuje da su tumori tretiranih životinja imali smanjenje MVD, relativno prema kontrolama tretiranim sa tečnim nosačem, što je saglasno sa anti-angiogenim mehanizmom delovanja jedinjenja 80: MVD je bilo 24,2±4,1 kod životinja tretiranih sa jedinjenjem 80, u poređenju sa 39,3±5,7, kod onih koje su tretirane samo sa tečnim nosačem. Kao što se može zaključiti iz, sa time povezanog zaustavljanja rasta tumora, izraženo inhibiranje proliferacije ćelija tumora je očigledno kod tumora koji su tretirani sa jedinjenjem 80. Ovi tumori su imali polovinu mitotičkog indeksa u poređenju sa tumorom tretiranim tečnim nosačem (podaci nisu prikazani). Efekat jedinjenja 80 na MVD i proliferaicju ćelija tumora pokazuje da ovo jedinjenje ima jake anti-angiogene i anti-tumorske efekte, čak i pod uslovima pod kojima se tumori ne povlače.

Svojstvo jedinjenja 80 da inhibira fosforilovanje PDGFR i zatim signalizacijuin vivo,ocenjivano je takođe i kod tumora SF763T, koji izlučuju visoke sadržaje PDGFRp. Tretman tumora SF763T sa jedinjenjem 80 jako inhibira fosforilovanje tirozina sa PDGFRp kod utvrđenih tumora SF763T. Jedinjenje 80 je takođe smanjilo sadržaje fosforilovane (aktivirane) fosfolipaze C gama (PLC-y) , neposredni silazni indikator aktiviranja PDGFR. Ovi podaci pokazuju da oralno ordiniranje jedinjenja 80 izaziva direktan efekat na cilj, aktivnost (PDGFR) u tumorima,in vivo.

Na bazi toga što je pokazanoin vitroda je svojstvo jedinjenja 80 da inhibira signalizaciju zavisnu od VEGF kod HUVEC da traje dugo (vidi gore), efikasnost ovog jedinjenja je ocenjivana i kada se jedinjenje rede ordinira, na modelu tumora Colo205. Kao što je pokazano u Tabeli 7, 80 mg/kg (91% inhibicija) i 40 mg/kg (84% inhibicija) su bili efikasni kada se ordiniraju svaki dan, ali ne i kada se ordiniraju dva puta nedeljno. Nasuprot, viša doza jedinjenja 80 (160 mg/kg) inhibira (52% inhibicija) rast utvrđenog tumora Colo205, kada se ordinira dva puta nedeljno, što ukazuje da ovo jedinjenje može da pokaže efikasnost i kada se rede ordinira, ali sa višom dozom. Treba napomenuti da režime doziranja mogu da odrede oni koji su uobičajeno verzirani u stanje tehnike, bez nekorisnog eksperimentisanja.

Ukratko, rezultati pokazani u Tabeli 7 su dobijeni korišćenjem ćelija Colo205 (0,5x1 o6 ćelija/miš) koje su implantirane SC u oblast zadnjeg dela slabine atimičkih miševa. Oralno ordiniranje jedinjenja 80, u skladu sa naznačenim planom, počelo je kada su tumori dostigli 400 mm3 Tumori su mereni korišćenjem nonijus-šestara, a zapremina tumora izračunavana kao proizvod dužinaxširinaxvisina. Vrednosti P su izračunavane poređenjem veličine tumora kod životinja koje su tretirane sa jedinjenjem 80, prema onim životinjama koje su tretirane samo sa tečnim nosačem, poslednjeg dana eskperimenta, koristeći dvodelni Student-ov t-test.

ii. Efikasnost jedinjenja 80 na modelu rasejavanja bolesti

Pored toga što pomaže uzdržan rast čvrstih primarnih tumora, angiogeneza je takođe bitna komponenta u podršci razvoja rasejavanja bolesti, usled metastaze primarnog tumora. Efekat jedinjenja 80 na razvoj rasejavanja bolesti bio je ispitivan na melanomu mišjeg B16-F1, na modelu kolonizacije pluća. U ovom modelu ćelije B16-F1 inokuliraju se intravenozno kroz repnu venu atimičkog miša, da se kolonizuju u pluća i formiraju tumore. Kao što pokazuje Tabela 7, oralno ordiniranje jedinjenja 80 sa 80 mg/kg/dan efikasno smanjuje unošenje B16-F1 ćelija u pluća, što se vrednuje merenjem ukupne mase pluća. Ovi podaci ukazuju da jedinjeje 80 može dain vivoinhibira rasejavanje bolesti.

Ukratko, rezultati pokazani u Tabeli 8, dobijeni su korišćenjem atimičkih miševa koji su bili inokulirani sa ćelijama tumora B16-F1 (5*10<5>ćelija/miš), kroz repnu venu. Miševi su svakodnevno tretirani oralno sa jedinjenjem 80 sa 80 mg/kg/dan (n=10) ili sa tečnim nosačem (n=18), tokom 24 dana posle inokulacije ćelijama tumora. Na kraju perioda tretmana miševi su žrtvovani, a njihova pluća izvađena i merena im je masa. Procenat inhibicije je izračunavan poređenjem mase pluća onih životinja koje su bile tretirane sa jedinjenjem 80, sa masom pluća životinja koje su bile tretirane samo sa tečnim nosačem. Vrednosti P su određivane korišćenjem dvodelnog Student-ovog t-testa.

//. Inhibitori Cox - 2

Svojstvo inhibitora COX-2 da uspore rast tumora, testirano je korišćenjem Lewis-ovog modela pluća, koji je opisan niže.

Miševima se potkožno ubrizga u levu šapu (1*10<6>ćelija tumora, suspendovanih u 30% Matrigel-u), pa se ocenjuje veličina tumora, korišćenjem pletizmometra, dvaput nedeljno, tokom 30-60 dana. Krv se vadi dva puta tokom eksperimenta u 24 satnom protokolu, da se dostigne koncentracija u plazmi i ukupno izlaganje analizi AUC. Podaci se iskazuju kao srednja vrednost ± SEM. Koriste se Student-ov i Mann-Whitney-ev test, da se dobiju razlike između srednjih vrednosti, korišćenjem softverskog paketa InStat. U dijeti se daje Celecoxib, sa dozom između 160-3200 ppm, tako da zaustavlja rast ovih tumora. Inhibitorski efekat Celecoxib-a je zavisio od doze i kretao se od 48% do 85%, u poređenju sa kontrolnim tumorima. Analiza metastaza u plućima obavljena je kod svih životinja, brojanjem metastaza pod stereomikroskopom i histohemijskom analizom uzastopnih isečaka pluća. Celecoxib nije uticao na metastazu u smanjene za više od 50%, kada je davan u dozama između 480-3200 ppm. Pored toga, histopatološka analiza je otkrila da Celecoxib smanjuje veličinu lezija metastaze u plućima na način koji zavisi od doze.

2. Model HT-29:

Miševima se poktožno ubrizga, u levu šapu, (1 *10<6>ćelija tumora, suspendovanih u 30% Matrigel-u), pa se veličina tumora ocenjuje korišćenjem pletizmometra, dva puta nedeljno, tokom 30-60 dana. Implantacija ćelija humanog kancera debelog creva (HT-29) u gole miševe, stvara tumore koji će dostići 0,6-2 mL, između 30-50 dana. Krv se vadi dva puta tokom eksperimenta, po protokolu od 24 h, kako bi se dobile koncentracije u plazmi i ukupno izlaganje analizi AUC. Podaci se iskazuju kao srednja vrednost ± SEM. Koriste se Student-ov i Mann-Whitney-ev test da se dođe do razlika u srednjim vrednostima, korišćenjem softverskog paketa InStat.

A. Miševima se ubrizgaju ćelije tumora H-29, pa se tretiraju sa Cytoxin-o, Lp., sa dozom od 50 mg/kg, u dane 5, 7 i 9, u prisustvu ili u odsustvu Celecoxib-a u dijeti. Efikasnost oba agensa se određuje merenjem zapremine tumora. Tretman koji koristi inhibitor CIX-2 srodan Celecoxib-u (SC-58236) smanjuje zapreminu tumora za 89%. U istom testu, Indomethacin, davan sa skoro maksimalno tolerantnom dozom od 2 mg/kg/dan, u pijaćoj vodi, inhibira stvaranje tumora za 77%. Pored toga, ovaj selektivni inhibitor COX-2 potpuno inhibira stvaranje metastaza u plućima, dok je ne-selektivni NSAID Indomethacin bio neefikasan. Rezultati iz ovih ispitivanja pokazuju da Celecoxib, koji se ordinira u dijeti miševima koji imaju tumor, može da odloži rast tumora i metastaze, kada se ordinira kao jedina terapija. Pored toga, opažen je pozitivan efekat kada se Celecoxib ordinira u kombinaciji sa citotoksičkim agensom, kao što je ciklofosfamid.

B. U drugom testu, miševi su injektirani sa ćelijama kancera debelog creva HT-29, pa tretirani sa Celecoxib-om (10, 40 ili 160 ppm) u dijeti, koja je počela 10. dana. Opažen je efekat približno zavisan od doze (Tabela 9).

III. Testoviin vivo,koristeći protein kinaze u kombinaciji sa selektivnim inhibitorom Ciklooksigenaze-2, za tretiranje kancera

Svojstvo inhibitora protein kinaze da uspori rast tumora u kombinaciji sa selektivnim inhibitorom COX-2, može se testirati na modelu ksenografta 1483, koji je opisan niže.

Ksenograft 1483 je životinjski ksenograft koji modeluje kancere humanog epitelijuma, izlučujući ciklooksigenazu-2 (COX-2) u ćelijama tumora i u vaskulaturi.

Model golog miša humanog ksenografta tumora karcinoma skvamoznih ćelija glave i vrata (ćelijski soj 1483), koji izlučuje COX-2 u ćelijama tumora i u vaskulaturi, slično kancerima humanog epitela. Mi smatramo da ovaj model predstavlja humane kancere epitela i mogao bi biti dobar model za korelaciju efikasnosti anti-kancer lekova, uključujući inhibitore COX-2, na efikasnost kod humanih bića.

Materijali i metode:

Kultura ćelije:

Ćelije 1483, skvamoznih ćelija humanog karcionoma glave i vrata (HNSCC) se drže smrznute u fiolama koje sadrže 3x1 o6 ćelija, 90% serum goveđeg fetusa (FBS) i 10% dimetilsulfoksid(DMSO). Uzme se smrznuta fiola i brzo se otopi na 37°C, pa se stavi u balon T-162 cm<2>(Corning) koji sadrži medijum D-MEM/F12 (Gibco NRL) sa 15 mM Hepes puferom, L-glutaminom, piridoksin hidrohloridom i 10% FBS. Ćelije rastu u inkubatoru, u 5% CO2 i na temperaturi 37°C. Medijum se menja svakog drugog dana, a ćelije se prebace kada se dostigne slivanja 80-90%. Za oslobađanje od ćelija, opere se balon sa 10 mL slanog fosfatnog pufera (PBS), usisa i doda 2 mL tripsin-EDTA (0,25% 1 mM Gibco BRL), stave nazad u inkubator, posle 5 min, ćelije će se odvojiti. Doda se 8 mL gornjeg medijuma u balon, opere se i prebaci u sterilanu kivetu za centrifugu od 50 mL. Doda se još 30 mL medijuma, pa se pomeša, a ćelije se broje, korišćenjem hemacitometra, koji daje ćelije na T-162 cm<2>, koje sadrže (3-4)x10<6>ćelija.

Model 1483 na životinji:

Promeni se medijum 24 h pre sakupljanja ćelija 1483 i pre injektiranja u gole miševe. Ćelije 1483 se tripsinizuju kao što je opisano gore, u odeljku kulture ćelija. Broje se ćelije i odredi broj ćelija. Centrifugiraju se ćelije 5 min sa 1000 o/min, na sobnoj temperaturi. Pelete ćelija se resuspenduju, pa se sakupe (ako ima više kiveta za centrifugu od 50 mL) u jednu kivetu za centrifugu od 50 mL, sa Hank-ovim puferovanim slanim rastvorom (HBSS; Gibco BRL), pa se centrifugiraju kao ranije. Za injektiranje treba da ima oko 25% više ćelija nego što je stvarno potrebno. Ako se injektiraju 72 miša, a ima se 100xio<6>ćelija, za injektiranje miševima pripreme se sve ćelije. Injektiraju se ćelije 1483 sa lxio<6>ćelija u 0,03 mL/miš.

Ćelije se injektiraju sa 30% Matrigel-a (Collaborative Biomedical Products) i 70% HBSS. Sakupljene pelete se resuspenduju sa 2,1 mL (70%) hladnog HBSS, a zatim se doda 0,9 mL (30%) otkravljenog tečnog, hladnog Matrigel-a i dobro izmešaju na ledu. Ovaj preparat ćelija se drži na ledu sve vreme do injektiranja miševima. U ovim ispitivanjima se koriste mužjaci golih miševa, stari 4-6 nedelja

(Harlen). Miševi se anesteziraju korišćenjem CO2/O2gasa, a zatim se injektiraju u sredinu zadnje desne šape, korišćenjem tuberkulin šprica 0,5 cm<3>(Beckerson & Dickerson). Na dan injektiranja izmeri se telesna masa miševa (Nulti dan), za osnovnu težinu na početku ispitivanja. Meri se masa miševa 7. dana i meri se zapremina tumora na zadnjoj desnoj šapi, korišćenjem pletismometra (Stoelting Co.). Pletizmometar je mašina koja meri zapreminu šape istiskivanjem vode. Meri se nekoliko levih šapa, koje nisu injektirane, zbog prošeka za merenja osnovnog podatka, radi oduzimanja od desne šape u kojoj je tumor.

Životinjama se daju testirana jedinjenja kroz hranu kada tumori dostignu veličinu 100-200 uL, pa se nastavi sa jedinjenjima u hrani kroz čitavo ispitivanje. Nekim miševima se daje samo inhibitor protein kinaze ili selektivni inhibitor ciklooksigenaze-2. Nekim miševima se svakodnevno daju i inhibitor protein kinaze i selektivni inhibitor ciklooksigenaze-2, u pogodnoj dozi, koja je određena na osnovu resultata ispitivanjain vitro.

Mere se masa i miševi za vreme ispitivanja, u dane: 7, 10, 14, 17, 21, 24 i 28. Životinjama se može početi tretman sa jedinjenjem Nultog dana (profilaktički), ili onda kada se ustanovi tumor, oko 7. dana (terapeutski). Oko 30. dana miševi koji su dobijali tečni nosač (kontrola) imaju velike tumore (~1,0-1,5 mL) i počnu da gube telesnu masu, pa se u to vreme završava sa životinjama koje primaju tečni nosač. Ukoliko se u tretiranim grupama primeti inhibicija tumora i one su dobrog zdravlja, eutanizuje se polovina tretiranih grpa, a polovina tretiranih grupa se zadrži u životu, da bi se odredilo odlaganje rasta tumora.

Onaj ko je verziran u stanje tehnike, takođe će lako shvatiti da je ovaj pronalazak prilagođen za sprovođenje ovih ciljeva i pomenutih pogodnosti, kao i onih koje su im svojstvene. Molekulski kompleksi i metode, procedure, tretmani, molekuli, specifična jedinjenja koji su ovde opisani, su predstavnici i primeri poželjnih realizacija, a nije namera da predstavljaju ograničenje obima ovog pronalska. Oni koji su verziraniu stanje tehnike shvataju da se mogu obaviti izmene i drugačije upotrebe, koje su unutar duha ovog pronalaska, koji je definisan obimom patentnih zahteva.

Onome ko je verziran u stanje tehnike je jasno da može da se obavi variranje supstitucija i modifikacija pronalaska, koji je ovde opisan, a bez odstupanja od obima i duha ovog pronalaska.

Svi patenti i publikacije koje se pominju u ovoj prijavi su indikacija nivoa onih koji su verzirai u stanje tehnike i na koje se odnosi ovaj pronalazak. Svi patenti i publikacije su ovde priključeni kroz citate u istom obimu u kome je i svaka pojedinačna publikacija, specifično i individualno naznačena i obuhvaćena citatom.

Claims

1. Postupak za tretman ili prevenciju kancera, naznačen time, što se sisaru kome je takav tretman potreban ordinira efikasna količina: inhibitora protein kinaze formule (I): gde su: R se bira iz grupe koju čine vodonik, piperazin-1-ilmetil, 4-metilpiperazin-1-ilmetil, piperidin-1-ilmetil, 2-hidroksimetilpirolidin-1-ilmetil, 2-karboksipirolidin-1-ilmetil i pirolidin-1 -ilmetil; R<1>se bira iz grupe koju čine vodonik, halo, alkil, supstituisani alkil, cikloalkil, supstituisani cikloalkil, aril, heteroaril, heteroaliciklil, hidroksi, alkoksi, -C(0)NR<8>R<9>,-NR13R<14>, -(CO)R<15>i -(CH2)rR<16>; R<2>se bira iz grupe koju čine vodonik, halo, alkil, supstituisani alkil, trihalometil, hidroksi, alkoksi, cijano, -NR<13>R<U>, -NR<13>(CO)R<14>, -C(0)R<15>, aril, heteroaril i -S(0)2NR<13>R<14>; R<3>se bira iz grupe koju čine vodonik, halogen, alkil, supstituisani alkil, trihalometil, hidroksi, alkoksi, aril, heteroaril, -NR<13>R<14>, -NR<13>S(0)2R<14>, -S(0)2NR<13>R1<4>, -NR<13>C(0)R<14>, -NR<13>C(0)OR<14>, -C(0)R<15>i -S02R<19>; R<4>se bira iz grupe koju čine vodonik, halogen, alkil, supstituisani alkil, hidroksi, alkoksi i -NR13R14;R<5>se bira iz grupe koju čine vodonik, alkil, supstituisani alkil i -C(0)R<10>; R<6>se bira iz grupe koju čine vodonik, alkil, supstituisani alkil i -C(0)R<10>; R<7>se bira iz grupe koju čine vodonik, alkil, supstituisani alkil, aril, heteroaril, -C(0)R<17>i -C(0)R<10>, pod uslovom kada R predstavlja vodonik da tada najmanje jedan odR<5>,R<6>iR<7>predstavlja -C(0)R<10>; ili R<6>i R<7>mogu da se kombinuju i da formiraju grupu koja se bira iz grupe koju čine -(CH2)4-, -(CH2)5- i -(CH2)6-; R<8>i R<9>se nezavisno biraju iz grupe koju čine vodonik, alkil, supstituisani alkil i aril;R10 se bira iz grupe koju čine hidroksi, alkoksi, ariloksi, -N(R<11>)(alkilen)nR<12>, gde je alkilenska grupa opciono susptituisana sa hidroksi grupom, i -NR13R1<4>; R<11>se bira iz grupe koju čine vodonik, alkil i supstituisani alkil;R12 se bira iz grupe koju čine -NR<13>R14,hidroksi, -C(0)R<15>, aril, heteroaril, -N<+>(0")R<13>R<14>, -N(OH)R<13>i -NHC(0)R<18>(gde je R<18>alkil, supstituisani alkil, haloalkil ili aralkil); R<13>i R<14>se nezavisno biraju iz grupe koju čine vodonik, alkil, supstituisani alkil, niži alkil supstituisan sa hidroksilamino, cijanoalkil, cikloalkil, supstituisani cikloalkil, aril i heteroaril; ili R<13>i R<14>se mogu kombinovati da formiraju heterociklo grupu;R<15>se bira iz grupe koju čine vodonik, hidroksi, alkoksi i ariloksi;R16 se bira iz grupe koju čine hidroksi, -NR<13>R<14>, -C(0)R<15>i -C(0)NR13R14;R<17>se bira iz grupe koju čine alkil, supstituisani alkil, cikloalkil, aril i heteroaril; R<19>se bira iz grupe koju čine alkil, supstituisani alkil, aril, aralkil, heteroaril ili heteroaralkil; i n i r su nezavisno, 1, 2, 3 ili 4; u kombinaciji sa inhibitorom ciklooksigenaze; ili njegova farmaceutski prihvatljiva so.

2. Postupak za tretman ili prevenciju kancera, naznačen time, što se sisaru kome je takav tretman potreban ordinira terapeutski efikasna količina inhibitora protein kinaze formule (I): gde su: R se bira iz grupe koju čine vodonik, piperazin-1-ilmetil, 4-metilpiperazin-1 - ilmetil, piperidin-1-ilmetil, 2-hidroksimetilpirolidin-1 -ilmetil, 2-karboksipirolidin-1-ilmetil i pirolidin-1-ilmetil; R<1>se bira iz grupe koju čine vodonik, halo, alkil, supstituisani alkil, cikloalkil, supstituisani cikloalkil, aril, heteroaril, heteroaliciklil, hidroksi, alkoksi, -C(0)NR<8>R<9>,-NR13R<14>, -(CO)R<15>i -(CH2)r<R16>; R<2>se bira iz grupe koju čine vodonik, halo, alkil, supstituisani alkil, trihalometil, hidroksi, alkoksi, cijano, -NR<13>R<14>, -NR<13>(CO)R<14>, -C(0)R15,aril, heteroaril i -S(0)2NR<13>R<14>; R<3>se bira iz grupe koju čine vodonik, halogen, alkil, supstituisani alkil, trihalometil, hidroksi, alkoksi, aril, heteroaril, -NR<1>3R1<4>, -NR<13>S(0)2R<14>, -S(0)2NR<13>R<14>, -NR<13>C(0)R<14>, -NR<13>C(0)OR<14>, -C(0)R<15>i -S02R<19>; R<4>se bira iz grupe koju čine vodonik, halogen, alkil, supstituisani alkil, hidroksi, alkoksi i -NR13R14;R<5>se bira iz grupe koju čine vodonik, alkil, supstituisani alkil i -C(0)R<10>; R<6>se bira iz grupe koju čine vodonik, alkil, supstituisani alkil i -C(0)R<10>; R<7>se bira iz grupe koju čine vodonik, alkil, supstituisani alkil, aril, heteroaril, -C(0)R<17>i -C(0)R<10>, pod uslovom kada R predstavlja vodonik da tada najmanje jedan odR<5>,R6iR7predstavlja -C(0)R<10>; ili R<6>i R<7>mogu da se kombinuju i da formiraju grupu koja se bira iz grupe koju čine -(CH2)4-, -(CH2)5- i -(CH2)6-; R<8>i R<9>se nezavisno biraju iz grupe koju čine vodonik, alkil, supstituisani alkil i aril;R10se bira iz grupe koju čine hidroksi, alkoksi, ariloksi, -N(R<11>)(alkilen)nR<12>, gde je alkilenska grupa opciono susptituisana sa hidroksi grupom, i -NR13R14;R<11>se bira iz grupe koju čine vodonik, alkil i supstituisani alkil; R<12>se bira iz grupe koju čine -NR13R<14>, hidroksi, -C(0)R<15>, aril, heteroaril, -N<+>(0-)R13R<14>, -N(OH)R<13>i -NHC(0)R18(gde je R<18>alkil, supstituisani alkil, haloalkil ili aralkil);R13i R<14>se nezavisno biraju iz grupe koju čine vodonik, alkil, supstituisani alkil, niži alkil supstituisan sa hidroksilamino, cijanoalkil, cikloalkil, supstituisani cikloalkil, aril i heteroaril; ili R<13>i R<14>se mogu kombinovati da formiraju heterociklo grupu;R1<5>se bira iz grupe koju čine vodonik, hidroksi, alkoksi i ariloksi;R1<6>se bira iz grupe koju čine hidroksi, -NR<13>R<14>, -C(0)R<15>i -C(0)NR13R14;R<17>se bira iz grupe koju čine alkil, supstituisani alkil, cikloalkil, aril i heteroaril; R<19>se bira iz grupe koju čine alkil, supstituisani alkil, aril, aralkil, heteroaril ili heteroaralkil; i n i r su nezavisno, 1,2,3 ili 4; u kombinaciji sa selektivnim inhibitorom ciklooksigenaze-2, koji se bira iz grupe koju čine: (i) jedinjenje formule (II): gde su: G se bira iz grupe koju čine 0, S i -NR<a->, gde je R<a>vodonik ili alkil; R<10a>se bira iz grupe koju čine vodonik i aril; R11a se bira iz grupe koju čine karboksil, alkil, aralkil, aminokarbonil, alkilsulfonilaminokarbonil i alkoksikarbonil; R12<a>se bira iz grupe koju čine haloalkil, alkil, aralkil, cikloalkil i aril, opciono supstituisan sa jednim ili više radikala koji se biraju između alkiltio, nitro i alkilsulfonil; i R<13a>je jedan ili više radikala koji se nezavisno biraju iz grupe koju čine vodonik, halo, alkil, aralkil, alkoksi, ariloksi, heteroariloksi, aralkoksi, heteroaralkiloksi, haloalkil, haloalkoksi, alkilamino, arilamino, aralkilamino, heteroarilamino, heteroarilalkilamino, nitro, amino, aminosulfonil, alkilaminosulfonil, arilaminosulfonil, heteroarilaminosulfonil, aralkilaminosulfonil, heteroaralkilaminosulfonil, heterociklosulfonil, alkilsulfonil, hidroksialkilkarbonil, nitroaril, opciono supstituisani aril, opciono supstituisani heteroaril, aralkilkarbonil, heteroaril-karbonil, arilkarbonil, aminokarbonil i alkilkarbonii; ili R<13a>zajedno sa prestenom E formira naftil prsten; ili (ii) jedinjenje formule (III): gde su A se bira iz grupe koju čine delimično nezasićeni ili nezasićeni heterociklil i delimično nezasićeni ili nezasićeni karbokciklični prstenovi; R<1b>se bira iz grupe koju čine heterociklil, cikloalkil, cikloalkenil i aril, gde je R<1b>opciono supstituisan u pogodnom položaju sa jednim ili više radikala koji se nezavisno biraju između alkil, haloalkil, cijano, karboksi, alkoksikarbonil, hidroksil, hidroksialkil, haloalkoksi, amino, alkilamino, arilamino, nitro, alkoksilakil, alkilsulfinil, halo, alkoksi i alkiltio; R<2b>se bira iz grupe koju čine metil i amino; i R3bse bira iz grupe koju čini radikal koji se bira između: vodonik, halo alkil, alkenil, alkinil, okso, cijano, karboksil, cijanoalkil, heterocikliloksi, alkiloksi, alkiltio, alkilkarbonil, cikloalkil, aril, haloalkil, heterociklil, cikloalkenil, aralkil, hetrociklilalkil, acil, alkiltioalkil, hidroksialkil, alkoksikarbonil, arilkarbonil, aralkilkarbonil, aralkenil, alkoksialkil, ariltioalkil, ariloksialkil, aralkiltioalkil, aralkoksialkil, alkoksiaralkoksialkil, alkoksikarbonilalkil, aminokarbonil, aminokarbonilalkil, alkilaminokarbonil, N-arilaminokarbonil, N-alkil-N-arilaminokarbonil, alkilaminokarbonilalkil, karboksialkil, alkilamino, N-arilamino, N-aralkilamino, N-alkil-N-aralkilamino, N-alkil-N-arilamino, aminoalkil, alkilaminoalkil, N-arilaminoalkil, N-aralkilaminoalkil, N-alkil-N-aralkilaminoalkil, N-alkil-N-airlaminoalkil, ariloksi, aralkoksi, ariltio, aralkiltio, alkilsulfinil, alkilsulfonil, aminosurfonil, alkilaminosulfonil, N-arilaminosulfonil, arilsulfonil i N-alkil-N-arilaminosulfonil; i njegova farmaceutski prihvatljiva so.

3. Postupak prema Zahtevu 2, naznačen time, što je selektivni inhibitor ciklooksigenaze-2-jedinjenje formule (II) gde su: G se bira iz grupekoju čine kiseonik i sumpor;R11a se bira iz grupe koju čine karboksil, niži alkil, niži aralkil i niži alkoksikarbonil; R<12a>se bira iz grupekoju čine niži haloalkil, niži cikloalkil i fenil; i R<13a>je jedan ili više radikala koji se birajuiz grupe koju čine: H, halo, niži alkil, niži alkoksi, niži haloalkil, niži haloalkoksi, niži alkilamino, nitro, amino, aminosulfonil, niži alkilaminosulfonil, 5-člani heteroarilalkilaminosulfonil, 6-člani heteroarilalkilaminosulfonil, niži aralkilaminosulfonil, 5-člani heterociklosulfonil koji sadrži azot, 6-člani heterociklosulfonil koji sadrži azot, niži alkilsulfonil, opciono supstituisani fenil, niži aralkilkarbonil i niži alkilkarbonil; iliR13<a>zajedno sa prstenom E formira naftil radikal.

4. Postupak prema Zahtevu 3, naznačen time, što su R<11a>je karboksil; R<12a>je niži haloalkil; i R<13a>je jedan od radikalakoji se bira iz grupe koju čine: H, halo, niži alkil, niži haloalkil, niži haloalkoksi, niži alkilamino, amino, aminosulfonil, niži alkilaminosulfonil, 5-člani heteroarilalkilaminosulfonil, 6-člani heteroarilalkilaminosulfonil, niži aralkilaminosulfonil, niži alkilsulfonil, 6-člani heterociklosulfonil koji sadrži azot, opciono supstituisani fenil, niži aralkilkarbonil i niži alkilkarbonil; ili R<1>3a zajedno sa prstenom E formira naftil radikal.

5. Postupak prema Zahtevu 4, naznačen time, što se R12a bira iz grupe koju čine: fluorometil, hlorometil, dihlorometil, trihlorometil, pentafluoroetil, heptafluoropropil, difluoroetil, difluoropropil, dihloroetil, dihloropropil, difluorometil i trifluorometil; i R<13a>je jedan ili više radikala koji se biraju iz grupe koju čine: hidrido, hloro, fluoro, bromo, jodo, metil, etil, izopropil, ferc-butil, butil, izobutil, pentil, heksil, metoksi, etoksi, izopropoksi, tributiloksi, trifluorometil, difluorometil, trifluorometoksi, amino, N,N-dimetilamino, N,N-dietilamino, N-fenilmetilaminosulfonil, N-feniletilaminosulfonil, N-(2-furilmetil)aminosulfonil, nitro, N,N-dimetilaminosulfonil, N-metilaminosulfonil, N-etilsulfonil, 2,2-dimetiletilaminosulfonil, N,N-dimetilaminosulfonil, N-(2-metilpropil)aminosulfonil, N-morfolinosulfonil, metilsulfonil, benzilkarbonil, 2,2-dimetilpropilkarbonil, fenilacetil i fenil; ili R<1>3a zajedno sa prstenom E formira naftil radikal.

6. Postupak prema Zahtevu 5, naznačen time, što seR12a bira iz grupe koju čine trifluorometil i pentafluoroetil; a R<13a>je jedan ili više radikala koji se biraju iz grupe koju čine: hidrido, hloro, fluoro, bromo, jodo, metil, etil, izopropil, ferc-butil, metoksi, trifluorometil, trifluorometoksi, N-fenilmetilaminosulfonil, N-feniletilaminosulfonil, N-(2-furilmetil)aminosulfonil, N,N-dimetilaminosulfonil, N-metilaminosulfonil, N-(2,2-dimetiletil)aminosulfonil, dimetilaminosulfonil, 2-metilpropilaminosulfonil, N-morfolinosulfonil, metilsulfonil, benzilkarbonil, i fenil; ili R<1>3a zajedno sa prstenom E formira naftil radikal.

7. Postupak prema Zahtevu 2, naznačen time, što se selektivni inhibitor ciklooksigenaze-2 bira iz grupe koju čine: 6-hloro-2-trifluorometil-2H-1 -benzopiran-3-karboksilna kiselina; 6-hloro-7-metil-2-trifluorometil-2H-1-benzopiran-3-karboksilna kiselina;

8-(1 -metiletil)-2-trifluorometil-2H-1 -benzopiran-3-karboksilna kiselina; 6-hloro-7-(1,1 -dimetiletil)-2-trifluorometil-2H-1 -benzopiran-3-karboksilna kiselina;

6- hloro-8-(1 -metiletil)-2-trifluorometil-2H-1 -benzopiran-3-karboksilna kiselina; 2-trifluorometil-3H-naftopiran-3-karboksilna kiselina;

7- (1,1 -dimetiletil)-2-tirfluorometil-2H-1 -benzopiran-3-karboksilna kiselina; 6-bromo-2-trifluorometil-2H-1 -benzopiran-3-karboksilna kiselina;

8- hloro-2-trifluorometil-2H-1 -benzopiran-3-karboksilna kiselina;

6- trifluorometoksi-2-trifluorometil-2H-1-benzopiran-3-karboksilna kiselina;

5.7- dihloro-2-tirfluorometil-2H-1-benzopiran-3-karboksilna kiselina; 8-fenil-2-trifluorometil-2H-1-benzopiran-3-karboksilna kiselina;

7.8- dimetil-2-trifluorometil-2H-1-benzopiran-3-karboksilna kiselina; 6,8-bis(dimetiletil)-2-trifluorometil-2H-1-benzopiran-3-karboksilna kiselina;

7- (1 -metiletil)-2-trifluorometil-2H-1 -benzopiran-3-karboksilna kiselina; 7-fenil-2-trifluorometil-2H-1 -benzopiran-3-karboksilna kiselina; 6-hloro-7-etil-2-trifluorometil-2H-1-benzopiran-3-karboksilna kiselina; 6-hloro-8-etil-2-trifluorometil-2H-1-benzopiran-3-karboksilna kiselina; 6-hloro-7-fenil-2-trifluorometil-2H-1-benzopiran-3-karboksilna kiselina; 6J-dihloro-2-trifluorometil-2H-1-benzopiran-3-karboksilna kiselina; 6,8-dihloro-2-tirfluorometil-2H-1-benzopiran-3-karboksilna kiselina; 2-trifluorometil-3H-nafto[2,1 -b]piran-3-karboksilna kiselina; 6-hloro-8-metil-2-trifluorometil-2H-1-benzopiran-3-karboksilna kiselina; 8-hloro-6-metil-2-trifluorometil-2H-1-benzopiran-3-karboksilna kiselina; 8-hloro-6-metoksi-2-trifluorometil-2H-1-benzopiran-3-karboksilna kiselina; 6-bromo-8-hloro-2-trifluorometil-2H-1-benzopiran-3-karboksilna kiselina; 8-bromo-6-fluoro-2-trifluorometil-2H-1-benzopiran-3-karboksilna kiselina; 8-bromo-6-metil-2-trifluorometil-2H-1-benzopiran-3-karboksilna kiselina; 8-bromo-5-fluoro-2-trifluorometil-2H-1-benzopiran-3-karboksilna kiselina; 6-hloro-8-fluoro-2-trifluorometil-2H-1-benzopiran-3-karboksilna kiselina; 6-bromo-8-metoksi-2-trrfluorometil-2H-1-benzopiran-3-karboksilna kiselina; 6-[[(fenilmetil)amino]sulfonil]-2-trifluorometil-2H-1-benzopiran-3-karboksilna kiselina; 6-[(dimetilamino)sulfonil]-2-tirfluorometil-2H-1-benzopiran-3-karboksilna kiselina; 6-[(metilamino)sulfonil]-2-tritluorometil-2H-1-benzopiran-3-karboksilna kiselina; 6-[(4-morfolino)sulfonil]-2-tirfluorometil-2H-1-benzopiran-3-karboksilna kiselina;

6-[(1,1 -dimetiletil)aminosulfonil]-2-trifluorometil-2H-1 -benzopiran-3-karboksilna kiselina; 6-[(2-metilpropil)aminosulfonil]-2-trifluorometil-2H-1-benzopiran-3-karboksilna kiselina; 6-metilsulfonil-24nTluorometil-2H-1-benzopiran-3-karboksilna kiselina; 8-hloro-6-[[(fenilmetil)amino]sulfonil]-2-trifluorometil-2H-1-benzopiran-^^ karboksilna kiselina; 6-fenilacetil-2-trifluorometil-2H-1-benzopiran-3-karboksilna kiselina; 6,8-dibromo-2-trrnuorometil-2H-1-benzopiran-3-karboksilna kiselina; 8-hloro-5,6-dimetil-2-trifluorometil-2H-1-benzopiran-3-karboksilna kiselina; 6,8-dihloro-(S)-2-trifluorometil-2H-1-benzopiran-3-karboksilna kiselina; 6-benzilsulfonil-2-trifluorometil-2H-1-benzopiran-3-karboksilna kiselina; 6-[[N-(2-furilmetil)amino]sulfonil]-2-trifluorometil-2H-1-benzopiran-3-karboksilna kiselina; 6-[[N-(2-feniletil)amino]sulfonil]-2-tirtluorometil-2H-1-benzopiran-3-kartok^ kiselina; 6-jodo-2-trifluorometil-2H-1 -benzopiran-3-karboksilna kiselina;

7- (1,1 -dimetiletil)-2-tirfluorometil-2H-1 -benzopiran-3-karboksilna kiselina; i 6-hloro-2-trifluorometil-2H-1-benzotiopiran-3-karboksilna kiselina; ili njegova farmaceutski prihvatljiva so.

8. Postupak prema Zahtevu 2, naznačen time, što je selektivni inhibitor ciklooksigenaze-2 jedinjenje koje se bira iz grupe koju čine: 6-nitro-2-trifluorometil-2H-1 -benzopiran-3-karboksilna kiselina; 6-hloro-8-metil-2-trifluorometil-2H-1-benzopiran-3-karboksilna kiselina; ((S)-6-hloro-7-(1,1 -dimetiletil)-2-trifluorometil-2H-1 -benzopiran-3-karboksilna kiselina; 2-trifluorometil-2H-nafto[2,3-b]piran-3-karboksilna kiselina; 6-hloro-7-(4-nitrofenoksi)-2-tritluorometil-2H-1-benzopiran-3-karboksilna kiselina; (S)-6,8-dihloro-2-(trifluorometil)-2H-1-benzopiran-3-karboksilna kiselina; 6-hloro-2-(trifluorometj|)-4-fenil-2H-1-benzopiran-3-karboksilna kiselina; 6-(4-hidroksibenzoil)-2-(trifluorometil)-2H-1-benzopiran-3-karboksilna kiselina; 2-(trrfluorometil)-64(trrfluorometil)tio]-2H-1-benzotiopiran-3-karooks kiselina; 6,8-dihloro-2-trifluorometil-2H-1-benzotiopiran-3-karboksilna kiselina; 6-(1,1-dimetiletil)-2-(trifluorometil)-2H-1-benzotiopiran-3-karboksilna kiselina; 6J-difluoro-1,2-dihidro-2-(trilfuorometil)-3-hinolinkartooksi kiselina; 6-hloro-1,2-dihidro-1-metil-2-(trifluorometil)-3-hinolinkarboksilna kiselina; 6-hloro-2-(trifluorometil)-1,2-dihidro-[1,8]nafthiirdin-3-karboksilna kiselina; (S)-6-hloro-1,2-dihidro-2-(trifluorometil)-3-hinolinkarboksilna kiselina; ili njegova farmaceutski prihvatljiva so, i bilo koja njihova kombinacija.

9. Postupak prema Zahtevu 2, naznačen time, što je selektivni inhibitor ciklooksigenaze-2 jedinjenje formule (III), koje se bira iz grupe koju čine: ili njegova farmaceutski prihvatljiva so, ili bilo koja njihova kombinacija.

10. Postupak prema Zahtevu 3, naznačen time, što se selektivni inhibitor ciklooksigenaze-2 bira iz grupe koju čine: ili njihova farmaceutski prihvatljiva so i bilo koja njihova kombinacija.

11. Postupak prema Zahtevu 2, naznačen time, što je pomenuti selektivni inhibitor ciklooksigenaze-2: ili njegova farmaceutski prihvatljiva so.

12. Postupak prema Zahtevu 2, naznačen time, što je pomenuti selektivni inhibitor ciklooksigenaze-2: ili njegova farmaceutski prihvatljiva so.

13. Postupak prema Zahtevu 1, naznačen time, što selektivni inhibitor ciklooksigenaze-2 predstavlja 4-[4-(metil)-sulfonil)fenil]-3-feni-2(5H)-furanon, ili njegova farmaceutski prihvatljiva so.

14. Postupak prema Zahtevu 2, naznačen time, što selektivni inhibitor ciklooksigenaze-2 predstavlja 4-{(5-metil-3-fenil)-4-izoksazolil]fenilsulfonamid, ili njegova farmaceutski prihvatljiva so.

15. Postupak prema Zahtevu 1, naznačen time, što selektivni inhibitor ciklooksigenaze-2 predstavlja 2-(6-metilpirid-3-il)-3-(4-metilsulfonilfenil)-5-hloropiridin, ili farmaceutski prihvatljiva so.

16. Postupak prema Zahtevu 2, naznačen time, što selektivni inhibitor ciklooksigenaze-2 predstavlja 4-[5-(4-metilfenil)-3-(trifluorometil)-1 H-pirazol-1 - iljfenilsulfonamid, ili farmaceutski prihvatljiva so.

17. Postupak prema Zahtevu 2, naznačen time, što selektivni inhibitor ciklooksigenaze-2 predstavlja 4-[(2-metil-4-cikloheksil)-5-okaszolil]fenilsulfon-amid, ili farmaceutski prihvatljiva so.

18. Postupak prema Zahtevu 2, naznačen time, što selektivni inhibitor ciklooksigenaze-2 predstavlja 4-[5-(3-fluoro-4-metoksifenil)-3-(difluorometil)-1 H-pirazol-1-il]-benzensulfonamid, ili farmaceutski prihvatljiva so.

19. Postupak prema Zahtevu 2, naznačen time, što selektivni inhibitor ciklooksigenaze-2 predstavlja (S)-6,8-dihloro-2-(trifluorometil)-2H-1 -benzopiran-3-karboksilna kiselina, ili farmaceutski prihvatljiva so.

20. Postupak prema Zahtevu 1, naznačen time, što je selektivni inhibitor ciklooksigenaze-2 jedinjenje formule: gde su: X je O ili S; R<12b>je niži haloalkil;R13b se bira iz grupe koju čine hidrido i halo;R13b' se bira iz grupe koju čine hidrido, halo, niži alkil, niži haloalkoksi, niži alkoksi, niži aralkilkarbonil, niži dialkilaminosulfonil, niži alkilaminosulfonil, niži aralkilaminosulfonil, niži heteroaralkilaminosulfonil, 5-člani heterociklosulfonil koji sadrži azot, i 6-člani heterociklosulfonil koji sadrži azot;R13<b>" se bira iz grupe koju čine: hidrido, niži alkil, halo, niži alkoksi i aril; iR13b" se bira iz grupe koju čine hidrido, halo, niži alkil, niži alkoksi i aril; ili njegova farmaceutski prihvatljiva so.

21. Postupak prema Zahtevu 20, naznačen time, što se R<1>2<b>bira iz grupe koju čine trifluorometil i pentafluoroetil; R13<b>bira iz grupe koju čine hidrido, hloro i fluoro; R<1>3b' bira iz grupe koju čine hidrido, hloro, bromo, fluoro, jodo, metil, terc-butil, trifluorometoksi, metoksi, benzilkarbonil, dimetilaminosulfonil, izopropilaminosulfonil, metilaminosulfonil, benzilaminosulfonil, feniletilaminosulfonil, metilpropilaminosulfonil i morfolinosulfonil; R13b bira iz grupe koju čine hidrido, metil, etil, izopropil, terc-butil, hloro, metoksi, dietilamino i fenil; i R13b" bira iz grupe koju čine hidrido, hloro, bromo, fluoro, metil, etil, ferc-butil, metoksi i fenil.

22. Postupak prema Zahtevu 2, naznačen time, što je inhibitor protein kinaze jedinjenje formule (I), gde su: R<1>se bira iz grupe koju čine vodonik, halo, alkil, cikloalkil, aril, heteroaril, heteroaliciklil, hidroksi, alkoksi, -(CO)R<15>, -NR13R<14>, -(CH2)rR<16>i -C(0)NR<8>R9;R<2>se bira iz grupe koju čine vodonik, halo, alkil, trihalometil, hidroksi, alkoksi, -NR13R<14>, -NR<13>(CO)R<14>, -C(0)R15, aril, heteroaril i -S(0)2NR<13>R14;R<3>se bira iz grupe koju čine vodonik, halogen, alkil, trihalometil, hidroksi, alkoksi, -C(0)R15, -NR13R1<4>, aril, heteroaril, -NR<13>S(0)2R<14>, -S(0)2NR<13>R<14>, -NR<13>C(0)R<14>i -NR<13>C(0)OR<14>; R<4>se bira iz grupe koju čine vodonik, halogen, alkil, hidroksi, alkoksi i-NR13R14;R<5>se bira iz grupe koju čine vodonik, alkil, i -C(0)R<10>; R<6>se bira iz grupe koju čine vodonik, alkil, i -C(0)R<10>; R<7>se bira iz grupe koju čine vodonik, alkil, aril, 3-karboksipropil, heteroaril, -C(0)R17 i -C(0)R10; ili R<6>i R<7>mogu da se kombinuju i da formiraju grupu koja se bira iz grupe koju čine -(CH2)4-, -(CH2)5- i -(CH2)6-; R<8>i R<9>se nezavisno biraju iz grupe koju čine vodonik, alkil, i aril; R<10>se bira iz grupe koju čine hidroksi, alkoksi, ariloksi, -N(R11)(CH2)nR12 i-NR13R14;R<11>se bira iz grupe koju čine vodonik i alkil;R12 se bira iz grupe koju čine -NR<13>R14,hidroksi, -C(0)R<15>, aril i heteroaril; R<13>i R<14>se nezavisno biraju iz grupe koju čine vodonik, alkil, cikloalkil, aril i heteroaril; ili R<13>i R<14>se mogu kombinovati da formiraju grupu koja se bira iz grupe koju čine: -(CH2)4-, -(CH2)5-, -(CH2)0(CH2)2-i-(CH2)2N(CH3)(CH2)2-; R<15>se bira iz grupe koju čine vodonik, hidroksi, alkoksi i ariloksi;R1<6>se bira iz grupe koju čine hidroksi, -NR13R1<4>, -C(0)R<15>i -C(0)NR<1>3R14;R<17>se bira izgrupe koju čine alkil, cikloalkil, aril i heteroaril; i n i r su nezavisno, 1, 2, 3 ili 4; ili njegova farmaceutski prihvatljiva so.

23. Postupak prema Zahtevu 2, naznačen time, što je inhibitor protein kinaze jedinjenje formule (I), gde su: R<6>je -COR<10>, gde R<10>predstavlja -NR<11>(CH2)nR<12>, gde su R<11>je vodonik ili niži alkil; n je 2 ili 3; i R<12>je -NR13R<14>, gde suR13i R<14>nezavisno, niži alkil.

24. Postupak prema Zahtevu 2, naznačen time, što je inhibitor protein kinaze jedinjenje formule (I), gde su: R<6>je -COR<10>, gdeR10predstavlja -NR<11>(CH2)nR<12>, gde su R<11>je vodonik ili niži alkil; n je 2 ili 3; i R<12>je -NR13R<14>, gde se R<13>i R<14>kombinuju formirajući grupu koja se bira između: -(CH2)4-, -(CH2)5- -(CH2)2-0-(CH2)2- ili -(CH2)2N(CH3)(CH2)2-.

25. Postupak prema Zahtevu 2, naznačen time, što je inhibitor protein kinaze jedinjenje formule (I), gde R<6>predstavlja N-(2-dimetilamino-etil)aminokarbonil, N-(2-dietil-aminoetil)-N-metilaminokarbonil, N-(3-dimetilamino-propil)-aminokarbonil, N-(2-dietilaminoetil)-aminokarbonil, N-(2-etilaminoetil)-aminokarbonil, N-(3-etilaminopropil)-aminokarbonil ili N-(3-dietilamino-propil)aminokarbonil.

26. Postupak prema Zahtevu 2, naznačen time, što je inhibitor protein kinaze jedinjenje formule (I) gde je R<6>N-(2-dietilaminoetil)aminokarbonil ili N-(2-etilaminoetil)aminokarbonil.

27. Postupak prema Zahtevu 2, naznačen time, što je inhibitor protein kinaze jedinjenje formule (I) gde je R<6>3-pirolidin-1-ilpropilaminokarbonil, 3-morfolin-4-ilpropilaminokarbonil, 2-pirolidin-1 -iletilaminokarbonil, 2-morfolin-4-iletilaminokarbonil, 2-(4-metilpiperazin-1-il)etilaminokarbonil, 2-(3,5-dimetilpiperazin-1-il)etilaminokarbonil, 3-(4-metilpiperazin-1-il)propilaminokarbonil ili 3-(3,5-dimetilpiperazin-1-il)propilaminokarbonil.

28. Postupak prema Zahtevu 2, naznačen time, što je inhibitor protein kinaze jedinjenje formule (I) gde je R<6->COR10, gde R<10>predstavlja-NR13R14, gde je R<13>vodonik, a R<14>niži alkil, supstituisan sa hidroksi, aril, heteroaliciklil, heteroaril ili karboksi.

29. Postupak prema Zahtevu 2, naznačen time, što je inhibitor protein kinaze jedinjenje formule (I) gde je R<6>2-triazin-1-ilpropilaminokarbonil, 2-triazin-1-iletilaminokarbonil, 3-imidazol-1-ilpropilaminokarbonil, piridin-4-ilmetil-aminokarbonil, 2-piridin-2-iletilaminokarbonil ili 2-imidazol-1-il-etilaminokarbonil.

30. Postupak prema Zahtevu 2, naznačen time, što je inhibitor protein kinaze jedinjenje formule (I), gde su R<6>je -COR<10>, gde je R<10>-NR<11>(CH2)nR<12>, gde su: R<11>je vodonik ili niži alkil; n je 2 ili 3; i R<12>je -NR13R<14>, gde se R<13>i R<14>zajedno kombinuju formirajući heterocikl.

31. Postupak prema Zahtevu 2, naznačen time, što je inhibitor protein kinaze jedinjenje formule (I), gde su: R<6>je -COR<10>, gde je R10 -NR11(CH2)nR12, gde su: R<11>je vodonik ili niži alkil; n je 2 ili 3; i R<12>je -NR13R14, gde seR13i R<14>zajedno kombinuju formirajući heterocikl od 5, 6 ili 7 atoma koji sadrži karbonilnu grupu i unutar prstena jedan ili dva atoma azota.

32. Postupak prema Zahtevu 2, naznačen time, što je inhibitor protein kinaze jedinjenje formule (I) gde je R<6>2-(3-oksopiperazin-1-il)etilaminokarbonil, 2-(imidazolidin-1 -il-2-on)etilaminokarbonil, 2-(tetrahidropirimidin-1 -il-2-on)etilamino-karbonil, 2-(2-oksopirolidin-1 -il)etilaminokarbonil, 3-(3-oksopiperazin-1 -il)propil-aminokarbonil, 3-(imidazolidin-1 -il-2nDn)propilaminokarbonil, 3-(tetrahidro-pirimidin-1-il-2-on)propilaminokarbonil ili 3-(2-oksopirolidin-1 -il)propilamino-karbonil.

33. Postupak prema bilo kome od Zahteva 22 do 32, naznačen time, što je inhibitor protein kinaze jedinjenje formule (I) gde su: R<5>se bira iz grupe koju čine vodonik i niži alkil, iR<7>se bira iz grupe koju čine vodonik, alkil, aril, heteroaril i -C(0)R17, gdeje R<17>hidroksi, niži alkil ili aril.

34. Postupak prema Zahtevu 33, naznačen time, što su R<1>je vodonik, niži alkil, -C(0)NR<8>R<9>, cikloalkil ili aril; R<2>je vodonik, halo, niži alkoksi, cijano, aril, -S02R<20>ili -S(0)2NR<13>R<14>, gde j<e>R<13>vodonik, a R<14>vodonik, aril ili alkil; R<3>se bira iz grupe koju čine vodonik, niži alkoksi, -C(0)R<15>, -NR<13>C(0)R<14>, aril i heteroaril; i R<4>je vodonik.

35. Postupak prema Zahtevu 34, naznačen time, što su R<1>je vodonik ili fenil; R<2>je vodonik, hloro, bromo, fluoro, metoksi, etoksi, fenil, dimetilaminosulfonil, cijano, metilsulfonil, etilsulfonil, benzilsulfonil, 3-hlorofenil-aminosulfonil, karboksi, metoksi, aminosulfonil, metilaminosulfonil, fenilaminosulfonil, piridin-3-il-aminosulfonil, dimetilaminosulfonil ili izopropilaminosulfonil; R<3>je vodonik, metoksi, karboksi, fenil, piridin-3-il, 3,4-dihlorofenil, 2-metoksi-5-izopropilfenil, 4-n-butilfenil, 3-izopropilfenil; i R<4>je vodonik.

36. Postupak prema Zahtevu 35, naznačen time, što su R<1>je vodonik; R<2>je vodonik, cijano, fluoro, hloro ili bromo; R<3>je fenil; i R<4>je vodonik.

37. Postupak prema Zahtevu 2, naznačen time, što su R<1>je vodonik, niži alkil, -C(0)NR<8>R<9>, cikloalkil ili aril; R<2>je vodonik, halo, niži alkoksi, cijano, aril ili -S(0)2NR<13>R<14>, gde j<e>R<13>vodonik, a R<14>vodonik, aril ili alkil; R<3>se bira iz grupe koju čine vodonik, niži alkoksi, -C(0)R<15>, -NR13C(0)R14 aril i heteroaril; i R<4>je vodonik.

38. Postupak prema Zahtevu 2, naznačen time, što su R<1>je vodonik, ili metil; R<2>je vodonik, cijano, hloro, fluoro ili bromio; R<3>se bira iz grupe koju čine vodonik ili fenil; i R<4>je vodonik.

39. Postupak prema Zahtevu 2, naznačen time, što R<6>predstavlja -COR<10>, gde je R<10>-NR<13>R<14>, gde je R<13>vodonik, a R<14>je niži alkil, supstituisan sa hidroksi, niži alkil supstituisan sa hidroksilamino, karboksi ili -NR<1>8R19, gdesu R<18>i R<19>nezavisno, vodonik ili niži alkil.

40. Postupak prema Zahtevu 2, naznačen time, što R<6>predstavlja [2-(dietilamino)-2-hidroksi]etilaminokarbonil, 2-(N-etil-N-2-hidroksietilamino)etil-aminokarbonil, karboksimetilaminokarbonil ili 2-hidroksietil-aminokarbonil.

41. Postupak prema Zahtevu 2, naznačen time, što R<6>predstavlja -COR<10>, gde jeR10-NR<11>(CH2)nR<12>, gde je R<12>-N<+>(0<_>)NR<13>R<14>ili -N(OH)R<13>, gde se R<13>i R<14>nezavisno biraju iz grupe koju čini niži alkil.

42. Postupak prema Zahtevu 2, naznačen time, što R<6>predstavlja 2-(N-hidroksi-N-etilamino)-etilaminokarbonil ili 2-[N+(0")(C2H5)2]etil-aminokarbonil.

43. Postupak prema Zahtevu 41 ili 42, naznačen time, što su: R<5>se bira iz grupe koju čine vodonik ili metil; i R<7>se bira iz grupe koju čine metil, vodonik ili fenil.

44. Postupak prema Zahtevu 2, naznačen time, što su: R<1>je vodonik; R<2>je vodonik, cijano, hloro, fluoro ili bromo; R<3>je vodonik; i R<4>jevodonik.

45. Postupak prema Zahtevu 2, naznačen time, što se inhibitor protein kinaze bira iz grupe koju čine: ili njegova L-malatna so.

46. Postupak prema Zahtevu 2, naznačen time, što je inhibitor protein kinaze jedinjenje formule:

47. Postupak za tretman ili prevenciju kancera, naznačen time, što se sisaru kome je takav tretman potreban ordinira terapeutski efikasna količina: inhibitora protein kinaze formule (I): u kombinaciji sa selektivnim inhibitorom ciklooksigenaze-2 formule: ili njegove farmaceutski prihvatljive soli.

48. Postupak za tretman ili prevenciju kancera, naznačen time, što se sisaru kome je takav tretman potreban ordinira terapeutski efikasna količina: inhibitora protein kinaze formule (l>: u kombinaciji sa selektivnim inhibitorom ciklooksigenaze-2 formule: ili njegove farmaceutski prihvatljive soli.

49. Postupak za tretman ili prevenciju kancera, naznačen time, što se sisaru kome je takav tretman potreban ordinira terapeutski efikasna količina: inhibitora protein kinaze formule (I): u kombinaciji sa selektivnim inhibitorom ciklooksigenaze-2 formule: ili njegove farmaceutski prihvatljive soli.

50. Postupak za tretman ili prevenciju kancera, naznačen time, što se sisaru kome je takav tretman potreban ordinira terapeutski efikasna količina: inhibitora protein kinaze formule (I): u kombinaciji sa selektivnim inhibitorom ciklooksigenaze-2 formule: ili njegove farmaceutski prihvatljive soli.