CZ2004973A3

CZ2004973A3 - Inhibitory DPIV na bázi glutaminylu

Info

Publication number: CZ2004973A3
Application number: CZ2004973A
Authority: CZ
Inventors: Hans-Ulrich Demuth; Torsten Hoffmann; Ulrich Heiser
Original assignee: Prosidion Limited
Priority date: 2002-02-28
Filing date: 2002-06-27
Publication date: 2004-12-15
Also published as: DE20220238U1; MXPA04008278A; EP1480961B1; US7060719B2; EP1480961A1; ATE349435T1; ZA200406813B; US20040167191A1; HK1067120A1; SI1480961T1; EA007434B1; JP2005527504A; US6946480B2; AU2002325278A1; DE60217186T2; KR20040095241A; ES2278944T3; NO20044038L; UA76309C2; CN1622941A

Description

Předložený vynález se týká inhibice dipeptidyl peptidázy IV, konkrétněji se týká glutaminylpyrrolidinu a glutaminylthiazolidinu, farmaceutických kompozicí obsahujících uvedené sloučeniny a použití uvedených sloučenin při inhibici dipeptidyl peptidázy IV a enzymové aktivity podobné dipeptidyl peptidáze IV.

Dosavadní stav techniky

Dipeptidyl peptidáza (DPIV) je serinová proteáza, která štěpí A-koncové dipeptidy z peptidového řetězce obsahujícího, výhodně, prolinový zbytek v předposlední poloze. Ačkoliv ještě nebyla biologická role DPIV v savčích systémech plně objasněna, předpokládá se, že hraje důležitou roli v metabolizmu neuropeptidů, aktivaci T-buněk, připojení rakovinových buněk na endotel a průnik HIV do lymfoidních buněk.

Rovněž bylo zjištěno, že DPIV je odpovědná za inaktivaci peptidu-1 (GLP-1) podobného glukagonu a glukózového-dependentně inzulinotropního polypeptidů také známého jako gastroinhibiční peptid (GIP). Poněvadž GLP-1 je hlavní stimulátor sekrece inzulínu pankreatem a má přímé, výhodné účinky na metabolizaci glukózy, bylo v přihlášce WO 97/40832 a patentu US 6 303 661 prokázáno, že inhibice DPIV a enzymové aktivity podobné DPIV reprezentuje velmi zajímavý přístup k léčení např. non-inzulindependentní diabetes mellitus (NIDDM). Záměrem předloženého vynálezu je poskytnout nové inhibitory DPIV, které jsou účinné například při léčení stavů zprostředkovaných inhibici DPIV a enzymů podobných DPIV, farmaceutické kompozice účinné například při inhibici DPIV a enzymů podobných DPIV a způsob inhibice aktivity uvedeného enzymu.

Dalším záměrem předloženého vynálezu je poskytnout způsob ošetření, konkrétně způsob ošetření diabetes mellitus, zejména non-inzulin-dependentní diabetes mellitus (NIDDM) nebo diabetů 2. typu a stavů spojených s diabetes mellitus, a kompozice pro použití v tomto způsobu.

Dipeptidyl peptidáza IV (DPIV) je post-prolin (v menší míře post-alanin, post-serin nebo post-glycin) štěpící serinovou proteázu nalezenou v různých tkáních těla, včetně ledvin, jater a zažívacího traktu.

Je známo, že inhibitory DPIV mohou být použitelné k léčení porušené glukózové tolerance a diabetes mellitus (mezinárodní přihláška vynálezu č. WO 99/61431, Pederson RA et al, Diabetes. 1998 Aug; 47(8): 1253-8 a Pauly RP et al, Metabolism 1999 Mar; 48(3): 385-9). Konkrétně přihláška WO 99/61431 publikuje inhibitory DPIV obsahující aminokyselinový zbytek a thiazolidinovou nebo pyrrolidinou skupinu a jejich soli, zejména pak L-řůreo-isoleucylthiazolidin, L-a//o-isoleucylthiazolidin, L-t/zreo-isoleucylpyrrolidin, L-a//o-isoleucylthiazolidin, L-a//o-isoleucylpyrrolidin a jejich soli.

Dalšími příklady inhibitorů dipeptidyl peptidázy IV s nízkou molekulovou hmotností jsou agens, např. tetrahydroisochinolin-3-karboxamidové deriváty, Nsubstituované 2-kyanopyroly a -pyrrolidiny, //-(V-substituované glycyl)-2kyanopyrrolidiny, 7V-(substituované glycyl)-thiazolidiny, ^-(substituované glycyl)-4kyanothiazolidiny, boronylové inhibitory a cyklopropyl-kondenzované pyrrolidiny. Inhibitory dipeptidyl peptidázy IV jsou popsány v US 6 011 155; US 6 107 317; US 6 110 949; US 6 124 305; US 6 172 081; WO 99/61431, WO 99/67278, WO 99/67279, DE 198 34 591, WO 97/40832, DE 196 16 486 C 2, WO 98/19998, WO 00/07617, WO 99/38501, WO 99/46272, WO 99/38501, WO 01/68603, WO 01/40180, WO 01/81337, WO 01/81304, WO 01/55105 a WO 02/02560, informace z těchto textů týkající se inhibitorů, jejich přípravy a použití jsou zde v souhrnu uvedeny jako odkaz.

Podstata vynálezu

Předložený vynález se týká sloučeniny obecného vzorce:

kde X = CH₂ nebo S nebo její farmaceuticky přijatelné soli.

Tyto sloučeniny a jejich odpovídající farmaceuticky přijatelné adiční soli s kyselinou jsou účinné při ošetření stavů zprostředkovaných DPIV nebo enzymů podobných

DPIV, např. artritida, obezita, imunní a autoimunní choroby, transplantace aloimplantátu, rakovina, neuronové poruchy a kožní onemocnění.

Ve výhodnějším provedení zlepšují sloučeniny podle předloženého vynálezu glukózovou toleranci snižováním zvýšených hladin krevní glukózy v rámci odpovědi na perorální podání glukózy, a tudíž jsou účinné při léčení non-inzulin-dependentní diabetes mellitus.

Podrobný popis vynálezu

Předložený vynález se týká inhibice dipeptidyl peptidázy IV (DPIV), konkrétněji se týká glutaminylpyrrolidinu a glutaminylthiazolidinu, farmaceutických kompozic obsahujících uvedené sloučeniny a použití uvedených sloučenin při inhibici DPIV a enzymové aktivity podobné DPIV.

Předložený vynález poskytuje nové inhibitory DPIV, které jsou účinné např. při léčení stavů zprostředkovaných inhibici DPIV, farmaceutické kompozice účinné např. při inhibici DPIV a enzymové aktivity podobné DPIV a způsobu inhibice DPIV a enzymové aktivity podobné DPIV.

Předložený vynález poskytuje sloučeninu obecného vzorce:

a zejména pak sloučeninu obecného vzorce (I)

nebo její farmaceuticky přijatelnou sůl.

Další výhodná sloučenina podle předloženého vynálezu je sloučenina obecného vzorce (II):

nebo její farmaceuticky přijatelná sůl.

Sloučeniny podle předloženého vynálezu mohou být konvertovány na adiční soli s kyselinou, zejména pak na farmaceuticky přijatelné adiční soli s kyselinou. Farmaceuticky přijatelná sůl obecně nabývá formy, ve které boční bazický řetězec aminokyselin je protonován anorganickou nebo organickou kyselinou. Reprezentativní organické nebo anorganické kyseliny zahrnují kyselinu chlorovodíkovou, bromovodíkovou, chloristou, sírovou, dusičnou, fosforečnou, octovou, propionovou, glykolovou, mléčnou, sukcinovou, maleinovou, filmařovou, jablečnou, tartarovou, citrónovou, benzoovou, mandlovou, methansulfonovou, hydroxyethansulfonovou, benzensulfonovou, oxalovou, pamoovou, 2-naftalensulfonovou, p-toluensulfonovou, cyklohexansulfamovou, salicylovou, sacharinovou nebo trifluoroctovou. Všechny farmaceuticky přijatelné adiční soli s kyselinou a sloučeninami podle předloženého vynálezu spadají do rozsahu předloženého vynálezu.

Z hlediska velmi úzkého vztahu volných sloučenin a sloučenin ve formě svých solí, ať už sloučenina v této spojitosti je uvedena či nikoliv, vždy za těchto okolností sem bude patřit i její sůl.

Předložený vynález v rámci svého rozsahu dále zahrnuje proléčiva sloučenin podle tohoto vynálezu. Obecně budou taková proléčiva funkční deriváty sloučenin, které jsou snadno převoditelné in vivo na požadované terapeuticky aktivní látky. Tudíž v těchto případech budou způsoby ošetření podle předloženého vynálezu zahrnovat termín podání, jenž se vztahuje na ošetření různých poruch popsaných s verzí proléčiva jedné nebo více nárokovaných sloučenin, ale které se konvertují na shora specifikovanou sloučeninu in vivo po podání subjektu. Standardní postupy selekce a preparace vhodných proléčivových derivátů jsou popsány např. v Design of Prodrugs, ed. H. Bundgaard, Elsevier, 1985 a přihláškách vynálezu DE 198 28 113, DE 198 28 114, WO 99/67228 a WO 99/67279, které jsou zde plně uvedeny jako odkaz.

Tam, kde sloučeniny podle předloženého vynálezu mají alespoň jedno chirální centrum, mohou existovat ve formě enantiomerů. Tam, kde sloučeniny mají dvě nebo více chirálních center, mohou navíc existovat ve formě diastereoizomerů. Je jasné, že všechny tyto izomery a jejich směsi spadají do předloženého vynálezu. Navíc některe z krystalických forem sloučenin mohou existovat jako polymorfy, jenž rovněž spadají do předloženého vynálezu. Dále některé ze sloučenin mohou vytvářet solváty s vodou (tzn. hydráty) nebo běžnými organickými rozpouštědly, jenž rovněž spadají do předloženého vynálezu.

Sloučeniny, včetně svých solí, mohou být také připraveny ve formě svých hydrátů nebo zahrnují další rozpouštědla používaná pro jejich krystalizaci.

Jak je uvedeno výše, jsou sloučeniny podle předloženého vynálezu, zejména sloučeniny obecných vzorců I a II, a jejich odpovídající farmaceuticky přijatelné adiční soli s kyselinou účinné při inhibici DPIV a enzymové aktivity podobné DPIV. Schopnost sloučenin podle předloženého vynálezu a jejich odpovídajících farmaceuticky přijatelných adičních solí s kyselinou inhibovat DPIV a enzymovou aktivitou podobnou DPIV lze demonstrovat na DPIV testu aktivity při stanovení hodnot Kj in vitro a v lidské plazme podle způsobu popsaného v příkladech 4 a 5. Hodnoty Ki sloučenin podle předloženého vynálezu byly stanoveny pro glutaminylthiazolidin jako Ki = 3,12*10⁷ M + 5,11*10 Ma pro glutaminylpyrrolidin jako Ki = 1,30*10’⁶ M ± 8,49*10'⁸ M proti DPIV z vepřových ledvin. Hodnoty Ki sloučenin podle předloženého vynálezu byly stanoveny pro glutaminylthiazolidin jako Ki 4,03*10'⁷ M ± 2,19*10‘¹⁰ M po 5 minutách 5,13*10 ⁷ M l,26*10'⁸ M po 22 hodinách preinkubace a pro glutaminylpynolidin jako Ki = 1,30*10 M ± 4,89*10'⁸ M po 5 minutách a l,36*10’⁶ Μ ± 3,21*10’⁸ M po 22 hodinách preinkubace v lidské plazmě.

Schopnost sloučenin podle předloženého vynálezu a jejich odpovídajících farmaceuticky přijatelných adičních solí s kyselinou inhibovat DPIV in vivo může být demonstrována perorálním nebo intravazálním podáním krysám kmene Wistar, jak je popsáno v příkladu 9. Sloučeniny podle předloženého vynálezu inhibují in vivo aktivitu DPIV při perorálním i intravazálním podání krysám kmene Wistar.

DPIV lze nalézt v širokém spektru savčích orgánů a tkání, např. intestinálním kartáčovém lemu (Gutschmidt S. et al., In situ - měření obsahů proteinu v oblasti kartáčového lemu společně s krysím jejunálním villi a jejich korelace se čtyřmi enzymovými aktivitami. Histochemie 1981, 72(3) 467 - 79 exokrinní epitel, hepatocyty, renální tubuli, endotel, myofibroblasty (Feller A. C. et al., A monoclonal antibody detecting dipeptidyl peptidase IV in human tissue. Virchows Arch. A. Pathol. Anat. Histopathol. 1986; 409 (2): 263 - 73), nervové buňky, laterální membrány určitého povrchového epitelu, např. vejcovod, dělohy a vezikulámí žlázy, v luminální cytoplazmě, např. epitel vezikulámích žláz, a v mukózních buňkách brunnerovy žlázy (Hartel S. et al„ Dipeptidyl peptidase (DPP) IV v krysích orgánech. Srovnání imunohistochemie a aktivity histochemie. Histochemie 1988; 89 (2): 151 - 61), reprodukční orgány, např. cauda epididymis a ampula, semenný váček a jejich sekrece (Agrawal & Vanha-Perttula, Dipeptidyl peptidases in bovine reproductive organs and secretions. Int. J. Androl. 1986, 9 (6): 435-52). V lidském séru jsou přítomné dvě molekulové formy dipeptidyl peptidázy (Krepela E. et al., Demonstration of two molecular forms of dipeptidyl peptidase IV in normal human serum. Physio. Bohemoslov. 1983, 32 (6): 486-96). Serova vysokomolekulární forma DPIV je exprimována na povrchu aktivovaných T-buněk (DukeCohan J. S. et al., Serum high molecular weight dipeptidyl peptidase IV (CD26) is similar to a novel antigen DPPT-L released from activated T cells. J. Immunol. 1996,156 (5):

1714-21).

Sloučeniny podle předloženého vynálezu a jejich odpovídající farmaceuticky přijatelné adiční soli s kyselinou jsou schopné inhibovat DPIV in vivo. V rámci jednoho provedení podle předloženého vynálezu spadají všechny molekulové formy, homologa a epitopy DPIV ze všech savčích tkání a orgánů a také ty, které ještě nebyly objeveny, do rozsahu předloženého vynálezu.

Mezi unikátní skupinu prolin-specifických proteáz se původně předpokládalo, že patří pouze DPIV, enzym spojený s membránou, který je specifický pro prolin jako předposlední zbytek na amino-konci polypeptidového řetězce. Nicméně v současné době byly identifikovány další molekuly, i strukturně nehomogenní s DPIV, ale s odpovídající enzymovou aktivitu. Enzymy podobné DPIV, které jsou identifikované, např. aktivační protein a fibroblastů, dipeptidyl peptidáza IV β, protein podobný dipeptidyl aminopeptidáze, N-acetylovaná α-připojená kyselá dipeptidáza, inaktivní buněčná prolin dipeptidáza, dipeptidyl peptidáza II, protein odvozený od attractinu a dipeptidyl peptidázy IV (DPP 8) a jsou popsány v rešerši vypracované Sedoem a Malíkem (Sedo & Malik, Dipeptidyl peptidase IV-like molecules: homologous proteins or homologous activities? Biochimica et Biophysica Acta 2001, 36506: 1-10).

Další podobné enzymy podobné DPIV jsou popsány v mez. přihláškách WO 01/19866, WO 02/04610, WO 02/34900 a WO 02/31134. WO 01/19866 popisuje novou lidskou dipeptidyl aminopeptidázu (DPP8) se strukturními a funkčními podobnostmi s DPIV a aktivačním proteinem fibroblastů (FAP). WO 02/04610 poskytuje agens, která regulují lidský enzym podobný dipeptidyl peptidáze IV, a agens, která se vážou na genový produkt lidského enzymu podobného dipeptidyl peptidáze IV. Tato činidla mohou hrát roli při prevenci, zlepšení nebo korekci dysfunkce nebo onemocnění zahrnující, ale není to nikterak limitováno, nádory a poruchy periferního a centrálního nervového systému, včetně bolesti a neurodegenerativních poruch. Enzym podobný dipeptidyl peptidáze IV z WO 02/04610 je v dosavadním stavu techniky dobře znám. V Gene Bank databázi je tento enzym registrován jako KIAA1492 (registrace v únoru 2001, podán 4.dubna, 2000, AB040925). WO 02/34900 popisuje dipeptidyl peptidázu 9 (DPP9) se signifikantní homologií s aminokyselinovými sekvencemi enzym podobný DPIV a DPP8. WO

02/31134 popisuje tři enzymy podobné DPIV, DPRP1, DPRP2 a DPRP3. Sekvenční analýza odhalila, že DPRP1 je identická s DPP8, jak je uvedeno v WO 01/19866, dále

DPRP2 je identická s DPP9 a DPRP3 je identická s KIAA1492, jak je uvedeno v WO

02/04610.

V dalším výhodném provedení předloženého vynálezu spadají všechny molekulové formy, homologa a epitopy proteinů obsahujících enzymovou aktivitu podobnou DPIV ze všech savčích tkání a orgánů zahrnující i ty, které ještě nebyly objeveny, do rozsahu předloženého vynálezu.

Schopnost sloučenin podle předloženého vynálezu a jejich odpovídajících, farmaceuticky přijatelných adiční solí s kyselinou inhibovat enzymy podobné DPIV může být demonstrována využitím testu enzymové aktivity ke stanovení hodnot Ki in vitro, jak je popsáno v příkladu 6. Hodnoty Kj sloučenin podle předloženého vynálezu proti vepřové dipeptidyl peptidáze II byly stanoveny jako Ki = 8,52*10’⁵ M ± 6,33*10⁶ M pro glutaminylpyrrolidin a K, = 1,07*10’⁵ M ± 3,81 *10'⁷ pro glutaminylthiazolidin. Všechny sloučeniny inhibují vepřovou dipeptidyl peptidázu II.

V dalším provedení podle předloženého vynálezu mají sloučeniny podle předloženého vynálezu a jejich odpovídající, farmaceuticky přijatelné soli pouze nízkou, jestli nějakou vůbec mají, inhibiční aktivitu vůči non-DPIV a prolinovým specifickým enzymům nepodobným DPIV. Jak je popsáno v příkladu 7, nebyla zjištěna žádná inhibice dipeptidyl peptidázy I a prolyloligopeptidazy glutaminylthiazolidinem a glutaminylpyrrolidinem. Proti prolidaze vykazovaly obe sloučeniny značné nizsi účinnost v porovnání s DPIV. Hodnoty IC₅₀ proti prolidáze byly stanoveny jako IC₅₀ > 3 mM pro glutaminylthiazolidin a jako IC₅₀ = 3,4* W⁴ M ± 5,63* 10'⁵ pro glutaminylpyrrolidin.

Vzhledem k jejich stabilitě inhibovat DPIV a enzymovou aktivitu podobnou DPIV jsou sloučeniny podle předloženého vynálezu, zejména pak sloučeniny obecných vzorců I a II, a jejich odpovídající, farmaceuticky přijatelné adiční soli s kyselinou účinné při ošetření stavů zprostředkovaných uvedenými enzymovými aktivitami. Tudíž zde publikované sloučeniny jsou účinné při ošetření stavů, např. non-inzulin-dependentní diabetes mellitus, artritidy, obezity, imunních a autoimunních chorob, transplantace aloimplantátu, rakoviny, neuronových poruch jako například roztroušené sklerózy a kožních onemocnění.

Ve výhodnějším provedení tohoto vynálezu zlepšují sloučeniny podle předloženého vynálezu a jejich odpovídající, farmaceuticky přijatelné adiční soli s kyselinou glukózovou toleranci snížením zvýšených hladin krevní glukózy při reakci na perorální příjem glukózy, a tudíž jsou účinné při léčení non-inzulin-dependentní diabetes mellitus. Schopnost sloučenin podle předloženého vynálezu a jejich odpovídajících, farmaceuticky přijatelných adičních solí s kyselinou zlepšovat glukózovou toleranci při reakci na perorální příjem glukózy může být sledována na diabetických krysách kmene Zucker. Metoda je popsána v příkladech 10 a 11. Perorální podání 5 mg/kg b.w., 15 mg/kg a 50 mg/kg b.w. glutaminylthiazolidinu nebo glutaminylpyrrolidinu má za následek na dávce závislé snížení zvýšených hladin krevní glukózy, a tím i zlepšení glukózové tolerance u diabetických krysách kmene Zucker.

Sloučeniny podle předloženého vynálezu jsou podle příkladu 5 stabilní v lidské plazmě. Překvapivě a jako další výhodné provedení předloženého vynálezu mohou být sloučeniny podle předloženého vynálezu a jejich odpovídající, farmaceuticky přijatelné adiční soli s kyselinou po podání savci degradovány in vivo. Schopnost sloučenin podle předloženého vynálezu a jejich odpovídajících, farmaceuticky přijatelných adičních solí s kyselinou být degradována in vivo může být stanovena na krysím modelu (kmeti Wistar) a následně LC/MS analýzou. Bylo zjištěno, že glutaminylthiazolidin je degradován po perorálním podání krysám kmene Wistar na odpovídající pyroglutaminylthiazolidin.

Proto předložený vynález poskytuje způsob ošetření stavu zprostředkovaného modulací enzymové aktivity DPIV nebo enzymu podobného DPIV u subjektu, při potřebě takového ošetření, vyznačující se tím, že zahrnuje podání kterékoliv ze sloučenin podle předloženého vynálezu nebo její farmaceutických kompozic v množství a dávkovacím režimům, který je terapeuticky účinný při ošetření daného stavu. Navíc předložený vynález zahrnuje použití sloučenin podle předloženého vynálezu a jejich odpovídajících, farmaceuticky přijatelných adičních, solí s kyselinou k přípravě léčebného prostředku určeného k prevenci nebo ošetření stavu zprostředkovaného modulací aktivity DPIV v subjektu. Sloučenina může být podávána pacientovi jakýmkoliv standardním způsobem podání zahrnujícím, ale není to nikterak limitováno, intravenózní, perorální, subkutánní, intramuskulámí, intradermální a parenterální způsob.

V dalším provedeni poskytuje předložený vynález formulace pro sloučeniny podle předloženého vynálezu a jejich odpovídající, farmaceuticky přijatelné adiční soli ve farmaceutických kompozicích.

Termín subjekt, jak je používán v předloženém vynálezu, se vztahuje na zvíře, výhodně savce, nejvýhodněji člověka, který byl předmětem ošetření, pozorování nebo experimentu.

Termín terapeuticky účinné množství, jak je používán v předloženém vynálezu, znamená, že množství aktivní sloučeniny nebo farmaceutického agens, které vyvolá biologickou nebo medicinální reakci v tkáňovém systému, zvířecím nebo lidském, jenž je zpozorována výzkumníkem, veterinářem, lékařem nebo jiným klinickým lékařem, zahrnuje zmírnění symptomů onemocnění nebo poruchy, která je ošetřována.

Termín kompozice, jak je používán v předloženém vynálezu, zahrnuje produkt obsahující patentované sloučeniny v terapeuticky účinných množstvích, jakož i kterýkoliv produkt vyplývající přímo či nepřímo z kombinací nárokovaných sloučenin.

K připravení farmaceutických kompozicí podle předloženého vynalezu jsou jedna nebo více sloučenin podle předloženého vynálezu, zejména pak sloučeniny obecných vzorců I nebo II, a jejich odpovídající, farmaceuticky přijatelné adiční soli s kyselinou, jako aktivní složky důkladně smíchány s farmaceutickým nosičem podle standardních farmaceutických míchacích technik, kde nosič může nabývat různých forem v závislosti na formě preparátu potřebného k podání, např. perorální nebo parenterální, napr. intramuskulámí. Při přípravě kompozic v perorální dávkovači formě může být používáno kterékoliv z obvyklých farmaceutických prostředí. Tudíž pro tekuté perorální preparáty, např. suspenze, léčebné nápoje a roztoky, mohou být používány vhodné nosiče a aditiva včetně vody, glykolů, olejů, alkoholů, ochucovadel, konzervačních prostředků, barvicích prostředků, atd.; pro pevné perorální preparáty, např. prášky, kapsle, gelové kapsle a tablety, vhodné nosiče a aditiva zahrnují škroby, cukry, ředící roztoky, granulacm prostředky, lubrikans, pojivá, dezintegrační prostředky, atd. Díky svému snadnému podaní reprezentují tablety a kapsle nejvýhodnější perorální dávkovači jednotkovou formu, ve které jsou používány pevné farmaceutické nosiče. Pokud je potřeba, mohou být tablety pomocí standardních technik potaženy cukrem nebo enterickým povlakem. Pro parenterální způsoby bude nosič obvykle obsahovat sterilní vodu, kromě jiných složek, např. pro účely lepšího rozpouštění nebo konzervace.

Připraveny mohou být rovněž injikovatelné suspenze, přičemž mohou být používány vhodné tekuté nosiče, suspendační prostředky, atd. Farmaceutické kompozice uvedené v předloženém vynálezu budou obsahovat v dávkovači jednotce, např. tabletě, kapsli, prášku, injekci, kávové lžičce, atd., množství aktivní složky, které je nezbytné k dodání shora popsané účinné dávky. Farmaceutické kompozice uvedené v předloženém vynálezu budou obsahovat v dávkovači jednotce, např. tabletě, kapsli, prášku, injekci, kávové lžičce, atd., od asi 0,01 mg do asi 1000 mg (výhodně asi 5 až asi 500 mg) látky a může být podávána v dávce od asi 0,1 do asi 300 mg/kg tělesné hmotnosti denně (výhodně 1 až 50 mg/kg denně). Nicméně množství dávky může být různé v závislosti na požadavcích pacienta, závažnosti stavu, který je ošetřován, a používané sloučenině. Využito může být denního nebo postperiodického podání. Typicky bude dávka regulována lékařem podle konkrétního pacienta, jeho stavu a požadovaném terapeutickém účinku.

Výhodně jsou tyto kompozice v jednotkové dávkovači formě, např. tablety, pilulky, kapsle, prášky, granule, sterilní parenterální roztoky nebo suspenze, měřená dávka aerosolu nebo tekutého spreje, kapky, ampule, autoinjektorové přístroje nebo čípky, pro parenterální, intranazální, sublingvální nebo rektální podání nebo pro podání inhalaci nebo insuflací. Alternativně může být kompozice přítomna ve formě vhodné pro jednotýdenní nebo jednoměsíční podání, např. nerozpustná sůl aktivní sloučeniny, např. dekanoatova sůl, může být upravena k získání depotního preparátu pro intramuskulámí injekci. K připravení pevných kompozic, např. tablet, je hlavní aktivní složka idealne smichana s farmaceutickým nosičem, např. standamí tabletovací složky, např. kukuřičný škrob, laktóza, sacharóza, sorbitol, talek, kyselina stearová, stearát hořečnatý, kalciumdihydrofosfát nebo gumy a jiné farmaceutické ředící roztoky, např. voda, k vytvoření pevné preformulační kompozice obsahující homogenní směs sloučeniny podle předloženého vynálezu nebo její farmaceuticky přijatelnou sůl. Pokud se odkazuje na tyto preformulační kompozice jako na homogenní, znamená to, že aktivní složka může být snadno rozdělena na ekvivalentní účinné dávkovači formy, např. tablety, pilulky a kapsle.

Tyto pevné preformulační kompozice pak mohou být rozděleny na jednotkové dávkovači formy shora popsaného typu obsahující asi 0,1 až asi 1000 mg, výhodně od asi 5 do asi 500 mg aktivní složky podle předloženého vynálezu.

Tablety nebo pilulky nové kompozice mohou být výhodně potaženy nebo jinak obaleny k vytvoření dávkovači formy poskytující výhody ve formě prodlouženého účinku. Například tableta nebo pilulka může obsahovat vnitřní dávku a vnější dávkovači složku, která je ve formě obálky překrývající daný vnitřek. Dvě složky mohou být separovány enterickou vrstvou, která slouží k ochraně před dezintegrací v žaludku a umožňuje vnitřní složce neporušeně prostoupit do dvanáctemíku nebo zpožděné uvolňování. Pro takové enterické vrstvy mohou být používány různé materiály nebo potahy, např. materiály zahrnující velký počet polymernich kyselin s těmito materiály jako např. šelak, cetylalkohol a acetát celulózy.

Tekuté formy, ve kterých nové kompozice podle předloženého vynálezu mohou být výhodně inkorporovány k podání perorálně nebo injekcí zahrnují vodné roztoky, výhodně ochucené sirupy, vodné nebo olejovité suspenze a ochucené emulze s jedlými oleji, např. bavlníkovým olejem, sezamovým olejem, kokosovým olejem nebo olejem z podzemnice olejně, jakož i léčebné nápoje a podobné farmaceutické nosiče. Vhodné dispergační prostředky nebo suspendační prostředky pro vodné suspenze zahrnují syntetické a přírodní gumy, např. tragant, arabskou gumu, alginát, dextran, karboxymethylcelulózu sodnou, methylcelulózu, polyvinylpyrrolidon nebo želatinu.

Pokud při přípravě sloučenin podle předloženého vynálezu vzniká směs stereoizomerů, mohou být tyto izomery separovány standardními technikami, např. preparativní chromatografií. Sloučeniny mohou být připraveny v racemické formě nebo jednotlivé enantiomery mohou být připraveny buď enantiospecifickou syntézou nebo rozdělením pomocí enantiospecifických technik. Sloučeniny mohou být např. rozlišeny na své jednotlivé enantiomery standardními technikami, např. tvorba diastereoizomemích párů tvorbou solí s opticky aktivními kyselinami, např. (-)-di-p-toluoyW-vinna kyselina a/nebo (+)-di-p-toluoyl-I-vinná kyseliny, poté frakční krystalizací a regenerací volné báze.

Sloučeniny mohou být rozděleny tvorbou diastereoizomemích esterů nebo amidů, poté chromatografickou separací a odstraněním chirálních pomocných látek. Alternativně mohou být sloučeniny rozděleny HPLC na chirálním sloupci.

Během kteréhokoliv z kroků způsobu přípravy sloučenin podle předloženého vynálezu může být nezbytné a/nebo žádoucí chránit citlivé nebo reaktivní skupiny na kterékoliv molekule. Toho lze dosáhnout zaváděním standardních chrámcích skupin, napr. skupin, které jsou popsány v Protective Groups in Organic Chemistry, ed. J.F.W. McOmie, Plenum Press, 1973; a T.W. Greene & P.G.M. Wuts, Protective in Organic Synthesis, John Wiley & Sons, 1991, zde je zcela uvedeno jako odkaz. Chrámci skupiny mohou být odstraněny standardně v následujícím kroku běžnými technikami.

Způsob ošetření stavů modulovaných dipeptidyl peptidázou IV a enzymy podobnými DPIV popsanými v předloženém vynálezu může být prováděn farmaceutickou kompozicí obsahující jednu nebo více sloučenin definovaných v předloženém vynálezu a farmaceuticky přijatelný nosič. Farmaceutická kompozice může obsahovat od asi 0,01 mg do 1000 mg, výhodně asi 5 až asi 500 mg, sloučenin a může být připravena v kterékoliv formě vhodné pro vybraný způsob podání. Nosiče zahrnují potřebné a inertní farmaceutické excipienty, včetně, ale není to nikterak limitováno, pojiv, suspendačních prostředků, lubrikans, ochucovadel, sladidla, konzervačních látek, barviv a potahů. Kompozice vhodné pro perorální podání zahrnují pevné formy, např. pilulky, tablety, caplety, kapsle (přičemž každá zahrnuje formulace uvolňující se ihned, v case nebo postupně), granule a prášky a tekuté formy, např. roztoky, sirupy, léčebné nápoje, emulze a suspenze. Formy, které jsou použitelné pro parenterální podání, zahrnuji sterilní roztoky, emulze a suspenze.

Výhodně mohou být sloučeniny podle předloženého vynálezu podávány jednorázově jednou denně nebo celková denní dávka může být podávána v dělených dávkách dvakrát, třikrát nebo čtyřikrát denně. Navíc sloučeniny podle předloženého vynálezu mohou být podávány v intranazální formě pomocí místního použiti vhodných intranazálních nosičů nebo přes transdermální náplasti na kůži, které jsou odborníkům v oboru dobře známy. Aby mohla být dávka podávána ve formě transdermálního podávacího systému, bude dávkování samozřejmě spíše kontinuální než mtermitentm v průběhu celého dávkovacího režimu a síla dávky bude tudíž modifikována k získání požadovaných terapeutických účinků.

Výhodněji může být pro perorální podání ve formě tablety nebo kapsle aktivní složka léku kombinována s perorálním, netoxickým, farmaceuticky přijatelným, inertním nosičem, např. ethanolem, glycerolem, vodou, atd. Navíc, pokud je žádoucí nebo potřeba, mohou být vhodná pojivá, lubrikans, dezintegrační prostředky a obarvovací prostředky zabudovány do směsi. Vhodná pojivá zahrnují, ale není to nikterak limitováno, škrob, želatinu, přírodní cukry, např. glukózu nebo betalaktózu, kukuřičná sladidla, přirozené nebo syntetické gumy, např. arabskou gumu, tragant nebo oleát sodný, stearát sodný, stearát hořečnatý, benzoát sodný, acetát sodný, chlorid sodný, atd. Dezintegrátory zahrnují, ale není to nikterak limitováno, škrob, methylcelulózu, agar, bentonit, xanthátovou gumu, atd.

Tekuté formy jsou výhodné v ochucených suspendačních nebo dispergačních prostředcích, např. syntetické a přirozené gumy, např. tragant, arabska guma, methylcelulóza, atd. Pro parenterální podání jsou žádoucí sterilní suspenze a roztoky. Izotonické preparáty, které obecně obsahují vhodné konzervační látky jsou používány v případě, kdy je potřeba intravenózní podání.

Sloučenina podle předloženého vynálezu může být podávána ve forme lipozómových dávkovačích systémů, jako např. malé jednolamelámí nosiče, velke jednolamelámí nosiče a vícelamelámí nosiče. Lipozómy mohou být připraveny z různých fosfolipidů, např. cholesterol, stearylamin nebo fosfatidylcholiny, způsoby, které jsou popsány v dosavadním stavu techniky.

Sloučeniny podle předloženého vynálezu mohou být také kopulovány s rozpustnými polymery jako směrované lékové nosiče. Tyto polymery mohou zahrnovat polyvinylpyrrolidon, kopolymer na bázi pyranu, polyhydroxypropylmethakrylamidfenol, polyhydroxyethylaspartamidfenol nebo polyethylenoxidpolylysin substituovaný palmitoylovým zbytkem. Navíc sloučeniny podle předloženého vynálezu mohou být kopulovány se skupinou biologicky degradovatelných polymerů použitelných při vytváření kontrolovaného uvolňování léku, např. polymléčné kyseliny, polyepsilonkaprolaktonu, polyhydroxy butyerové kyseliny, polyorthoesterů, polyacetalů, polydíhydropyranu, polykyanoakrylátů a zesítěných nebo amfipatických blokových kopolymerů hydrogelů.

Sloučeniny podle předloženého vynálezu mohou být podávány v kterémkoliv ze shora uvedených kompozic a podle dávkovačích režimů vytvořených podle dosavadní techniky kdykoliv je potřeba léčit konkrétní nemoc.

Denní dávka produktů se může pohybovat v širokém rozmezí od 0,01 do 1,000 mg na člověka denně. Pro perorální podání jsou kompozice výhodně poskytovány ve forme tablet obsahujících 0,01, 0,05, 0,1, 1,0, 2,5, 5,0, 10,0, 15,0, 25,0, 50,0,100, 150, 200, 250, 500 a 1000 miligramů aktivní složky pro symptomatické upravení dávky pro pacienta, který má být ošetřován. Účinné množství léku se obvykle pohybuje v rozmezí od asi 0,1 mg/kg do asi 300 mg/kg tělesné hmotnosti denně. Výhodně v rozmezí od 1 do asi 50 mg/kg tělesné hmotnosti denně. Sloučeniny mohou být podávány jednou až čtyřikrát denně.

Optimální dávky k podání mohou být snadno určeny odborníky v oboru a budou se lišit v závislosti na konkrétní sloučenině, způsobu podání, síle preparátu, biologické dostupnosti podle způsobu podání a postupu onemocnění. Navíc by při úpravě dávek mely být brány v úvahu faktory zahrnující konkrétního pacienta, včetně jeho věku, hmotnosti, stravy a době podání.

Sloučeniny nebo kompozice podle předloženého vynálezu mohou být podávány před jídlem, během jídla nebo pojidle.

Pokud jsou sloučeniny nebo kompozice podle předloženého vynálezu podávány před jídlem, pak 1 hodinu, výhodně 30 nebo ještě výhodněji 15 nebo 5 minut před jídlem.

Pokud jsou sloučeniny nebo kompozice podle předloženého vynalezu podávány během jídla, mohou být přimíchány do jídla nebo podány v oddělené dávkovači formě, jak je popsáno výše.

Pokud jsou sloučeniny nebo kompozice podle předloženého vynálezu podávány po jídle, mohou být podávány 5,15 nebo 30 minut nebo ještě 1 hodinu po jídle.

Přehled obrázků na výkresech

Předložený vynález bude lépe pochopen v souvislosti s následujícími obrázky.

Na obrázku 1 je uvedena plazmatická aktivita DPIV v séru z krys kmene Wistar po perorálním a intravazálním podání 100 mg/kg b.w. glutaminylpyrrolidinu,

Na obrázku 2 je uvedena plazmatická aktivita DPIV v séru z krys kmene Wistar po perorálním a intravazálním podání 100 mg/kg b.w. glutaminylthiazolidinu;

Na obrázku 3 je uvedeno na dávce závislé snížení hladin krevní glukózy v diabetických krysách kmene Zucker po perorálním podání 5 mg/kg, 15 mg/kg, 50 mg/kg b.w. glutaminylpyrrolidinu, resp. placeba.

Na obrázku 4 je uvedeno na dávce závislé snížení hladin krevní glukózy v diabetických krysách kmene Zucker po perorálním podání 5 mg/kg, 15 mg/kg, 50 mg/kg b.w. glutaminylthiazolidinu, resp. placeba.

Na obrázku 5 je uvedena chemická struktura pyroglutaminylthiazolidinu, degradačního produktu, zjištěného po perorálním podání glutaminylthiazolidinu v krysách kmene Wistar; a

Na obrázku 6 je uveden chromatogram krysího plazmatického extraktu získaného po perorálním podání glutaminylthiazolidinu tlustým krysám kmene Zucker. Pík s časem 2,95 min reprezentuje glutaminylthiazolidin a pík s časem 6,57 min reprezentuje pyroglutaminylthiazolidin.

Příklady provedení vynálezu

Příklad 1

Syntéza volné báze glutaminylpyrrolidinu

Acylace:

V-Benzyl-oxykarbonylglutamin (2,02 g, 7,21 mmol) se rozpustí v 35 ml THF a ochladí se na teplotu -15 °C. Do této směsi se přidá CAIBE (isobutylchlorformiát) (0,937 ml, 7,21 mmol) a 4-methylmorfolin (0,795 ml, 7,21 mmol) a roztok se míchá po dobu 15 minut. Tvorba směsného anhydridu se kontroluje technikou TLC (eluent:

CHCl₃/MeOH:9/l). Po ohřátí na teplotu -10° C se přidá pyrrolidin (0,596 ml, 7,21 mmol).

Teplota směsi se nechá vystoupat na pokojovou teplotu a míchá přes noc.

Zpracování:

Sediment se odfiltruje a rozpouštědlo se odpaří. Výsledný olej se vytřepe v ethylacetátu (20 ml) a promyje nasyceným roztokem hydrogensíranu sodného, poté nasyceným roztokem hydrogenuhličitanu sodného, vodou a solankou. Organická vrstva se oddělí, suší a odpařuje. Čistota výsledného produktu se kontroluje technikou TLC (eluent. CHCl₃/MeOH: 9/1)

Výtěžek: 1,18 g, voskovitá pevná látka.

Štěpení:

1,18 g výsledná pevná Z-chráněná sloučenina se rozpustí v 40 ml absolutního ethanolu. Do roztoku se přidá asi 20 mg palladia na aktivním uhlí (10%, FLUKA) a suspenze se třepe pod atmosférou vodíku po dobu 3 hodin. Průběh reakce se monitoruje technikou TLC (eluent: CHCl₃:MeOH: 9/1). Po skončení reakce se rozpouštědlo odtáhne, čímž se získá volná báze.

Výtěžek: 99%

Čistota se ověří technikou TLC: w-butanol/AcOH/voda/ethylacetát: l/l/l/l, R_f = 0,4. Struktura reakčního produktu se analyzuje technikou NMR.

Příklad 2:

Syntéza glutaminylthiazolidin-hydrochloridu

Acylace:

N-/-butyl-oxykarbonylglutamin (2,0 g, 8,12 mmol) se rozpustí v 5 ml THF a ochladí se na teplotu -15 °C. Do této směsi se přidá CAIBE (isobutylchlorformiát) (1,06 ml ml, 8,12 mmol) a 4-methylmorfolin (0,895 ml, 8,12 mmol) a roztok se míchá po dobu 15 minut. Tvorba směsného anhydridu se kontroluje technikou TLC (eluent: CHCl₃/MeOH:9/l). Po ohřátí na teplotu -10° C se přidá další ekvivalent 4-methylmorfohnu (0,895 ml, 8,12 mmol) a thiazolidin-hydrochlorid (1,02 g, 8,12 mmol). Teplota směsi se nechá vystoupat na pokojovou teplotu a míchá přes noc.

Zpracování:

Sediment se odfiltruje a rozpouštědlo se odpaří. Výsledný olej se vytřepe v chloroformu (20 ml) a promyje nasyceným roztokem hydrogensíranu sodného, pote nasyceným roztokem hydrogenuhličitanu sodného, vodou a solankou. Organická vrstva se oddělí, suší a odpařuje. Čistota výsledného produktu se kontroluje technikou TLC (eluent.

CHCl₃/MeOH: 9/1)

Výtěžek: 1,64 g, pevná látka.

Štěpení:

640 mg výsledné pevné Boc-chráněné sloučeniny se rozpustí v 3,1 ml ledově studené HC1 v dioxanu (12,98 M, 20 ekvivalentů) a nechá se stát na ledu. Průběh reakce se monitoruje technikou TLC (eluent: CHCl₃:MeOH: 9/1). Po skončení reakce se rozpouštědlo odstraní a výsledný olej se promyje methanolem, znovu odpařuje a nasledne suší nad oxidem fosforečným a dvakrat trituruje s diethyletherem.

Výtěžek: 0,265 g

Čistota se analyzuje technikou HPLC.

Struktura reakčního produktu se analyzuje technikou NMR.

Příklad 3

Syntéza glutaminylpyrrolidin-hydrochloridu

Acylace:

N-t-butyl-oxykarbonylglutamin (3,0 g, 12,18 mmol) se rozpustí v 7 ml THF a ochladí se na teplotu -15 °C. Do této směsi se přidá CAIBE (isobutylchlorformiát) (1,6 ml ml, 12,18 mmol) a 4-methylmorfolin (1,3 ml, 12,18 mmol) a roztok se míchá po dobu 15 minut. Tvorba směsného anhydridu se kontroluje technikou TLC (eluent: CHCl₃/MeOH:9/l). Po ohřátí na teplotu -10° C se přidá 1 ekvivalent pyrrolidinu (1,0 ml, 12,18 mmol). Teplota směsi se nechá vystoupat na pokojovou teplotu a míchá přes noc.

Zpracování:

Vytvořený sediment se odfiltruje a rozpouštědlo se odpaří. Výsledný olej se vytrepe v chloroformu (20 ml) a promyje nasyceným roztokem hydrogensiranu sodného, poté nasyceným roztokem hydrogenuhliěitanu sodného, vodou a solankou. Organická vrstva se oddělí, suší a odpařuje. Čistota výsledného produktu se kontroluje technikou TLC (eluent: CHCl₃/MeOH: 9/1)

Výtěžek: 2,7 g, pevná látka.

Štěpení:

2,7 g výsledné pevné látky se rozpustí v 13,0 ml ledově studené HC1 v dioxanu (12,98 M, 20 ekvivalentů) a nechá se stát na ledu. Průběh reakce se monitoruje technikou TLC (eluent: CHCl₃:MeOH: 9/1). Po skončení reakce se rozpouštědlo odstraní a výsledný olej se promyje methanolem, znovu odpařuje a následně suší nad oxidem fosforečným a dvakrát trituruje s diethyletherem.

Výtěžek: 980 mg

Čistota se analyzuje technikou HPLC.

Struktura reakčního produktu se analyzuje technikou NMR.

Příklad 4

Stanovení hodnoty Ki

Pro stanovení hodnoty K, glutaminylpyrrolidinu a glutaminylthiazolidinu byla používána dipeptidyl peptidáza IV z vepřových ledvin se specifickou aktivitou proti glycylpropyl-4-nitroanilinu 37,5 U/mg a s koncentrací enzymu 1,41 mg/ml v zásobním roztoku.

Testovací směs:

100 μΐ glutaminylpyrrolidinu nebo glutaminylthiazolidinu v rozmezí koncentrací od l*10‘⁵ M - l*10’⁷M (glutaminylpyrrolidin), resp. 1*10⁶ M - 1*10 M (glutaminylthiazolidin) bylo smícháno s 50 μΐ glycylprolyl-4-mtroanilmu v různých koncentrací (0,4 mM, 0,2 mM, 0,1 mM, 0,05 mM) a 100 μΐ HEPES (40 mM, pH 7,6; iontová síla = 0,125). Testovací směs byla předem inkubována při teplotě 30 C po dobu 30 minut, poté bylo přidáno 20 μΐ DPIV (1:600 zředění) a bylo provedeno měření vývoje žluté barvy v důsledku uvolňování 4-nitroanilinu při teplotě 30° C a λ - 405 nm po dobu 10 minut na čteěce destiček (HTS7000 plus, Applied Biosystems, Weiterstadt, Germany).

Hodnoty Kj byly vypočteny v programu Graphit 4.0.15 (Erithacus Software, Ltd., UK) na bázi kompetitivní inhibice DPIV glutaminylpyrrolidinem nebo glutaminylthiazolidinem. Byly vypočteny hodnoty pro glutaminylthiazolidin jako Ki 6 *8

3,12*10'⁷ M ± 5,11*1O'¹⁰ M a pro glutaminylpyrrolidin jako Kj = 1,30*10 M ± 8,49*10

M.

Příklad 5

Stanovení hodnoty Kj v lidské plazmě

Lidská plazma zahrnuje uvolňovací aktivitu A-koncového Xaa-Pro μΐ glutaminylpyrrolidinu nebo glutaminylthiazolidinu v rozmezí koncentrací l*10‘⁵ M -1*10’⁷ M (glutaminylpyrrolidin) al*10'⁶M-l*10⁸M (glutaminylthiazolidin) respektive byly smíchány s 50 μΐ glycylprolyl-4-nitroanilinem v různých koncentracích (0,4 mM, 0,2 mM, 0,1 mM, 0,05 mM) a 100 μΐ HEPES (40 mM, pH 7,6). Testovací směs byla předem inkubována při teplotě 30° C po dobu 5 minut, resp. 22 hodin. Po premkubaci bylo přidáno 50 μΐ lidské plazmy a bylo prováděno měření vývoje žluté barvy v důsledku uvolňování 4-nitroanilinu při teplotě 30° C a λ = 405 nm po dobu 10 minut na čtečce destiček (HTS7000 plus, Applied Biosystems, Weiterstadt, Germany).

Hodnoty Ki byly vypočteny v programu Graphit 4.0.15 (Erithacus Software, Ltd., UK) na bázi kompetitivní inhibice DPIV glutaminylpyrrolidinem nebo glutaminylthiazolidinem. Byly vypočteny hodnoty pro glutaminylthiazolidin jako Kj 4,03*10'⁷ M ± 2,19*10‘¹⁰ M po 5 minutách a Kj = 5,13*10⁷ M ± 1,26*10 M po 22 hodinách preinkubace a pro glutaminylpyrrolidin jako Ki = 1,30* 10'⁶ M ± 4,89*10⁸ M po 5 minutách aKi = l,36*10’⁶ Μ± 3,21*10’⁸ M po 22 hodináchpreinkubace.

Příklad 6

Inhibice enzymu podobného DPIV- dipeptidyl peptidáza II

DP II (3.4.14.2) uvolňuje N-koncové dipeptidy z oligopeptidu v případě, kdy V-konec není protonován (McDonald, J.K., Ellis, S. & Reilly, T.J., 1966, J Biol. Chem., 241, 1494 - 1501). Pro a Ala v poloze Pi jsou preferovanými zbytky. Enzymová aktivita byla popsána jako aktivita podobné DPIV, ale DP II má kyselé pH optimum. Používaný enzym byl purifikován z vepřových ledvin.

Test:

100 μΐ glutaminylpyrrolidinu nebo glutaminylthiazolidinu v rozmezí koncentrací IMO⁴ M - 5*10’⁸ M bylo smícháno s 100 μΐ pufrovacího roztoku (40 mM HEPES, pH 7,6, 0,015% Brij, 1 mM DTT), 50 μΐ roztoku lysylalanylaminomethylkumarinu (5 mM) a 20 μΐ vepřové DP II (250-ti násobné zředění v pufrovacím roztoku). Měření fluorescence bylo prováděno při teplotě 30° C a = 380 nm, X_emiSe = 465 run po dobu 25 minut na ěteěce destiček (HTS7000plus, Applied Biosystems, Weiterstadt, Germany).

Hodnoty Kj byly vypočteny v programu Graphit 4.0.15 (Erithacus Software, Ltd., UK) a vypočteny jako K = 8,52*10’⁵ Μ ± 6,33*10'⁶ M pro glutaminylpyrrolidin a K = l,07*10'⁵ M ± 3, 81*10'⁷ M pro glutaminylthiazolidin.

Příklad 7

Enzymové zkřížené reakce

Glutaminylpyrrolidin nebo glutaminylthiazolidin byly testovány z hlediska účinnosti svých zkřížených reakcí proti dipeptidyl peptidáze I, prolyloligopeptidáze a prolidáze.

Dipeptidyl peptidáza I (DP I, katepsin C):

DP I nebo katepsin C jsou lysosomální cysteinové proteázy, které odštěpují dipeptidy z V-konce svých substrátů (Gutman, H. R. & Fruton, J. S., 1948, J. Biol. Chem., 174, 851-858) a jsou klasifikovány jako cysteinové proteázy.

ΣΣ

Používaný enzym byl zakoupen u firmy Qiagen (Qiagen GmbH, Hilden, Germany) k získání zcela aktivního enzymu. Enzym byl 1000-ti násobně zředěn v MES pufru pH 5,6 (40 mM MES, 4 mM DTT, 4 mM KC1, 2 mM EDTA, 0,015% Brij) a předem inkubován po dobu 30 minut při teplotě 30° C.

Test:

μΐ glutaminylpynolidinu nebo glutaminylthiazolidinu v rozmezí koncentrací l*10'⁵ Μ - l*10’⁷ M bylo smícháno s 110 μΐ směsi pufru a enzymu. Testovací směs byla předem inkubována při teplotě 30° C po dobu 15 minut. Po preinkubaci bylo přidáno 100 μΐ histidylseryl-Anitroanilinu (2*10’⁵M) a měření žluté barvy v důsledku uvolňování β-nitroanilinu bylo prováděno při teplotě 30° C a k_exitace = 380 nm, k_emise = 465 nm po dobu 10 minut na čtečce destiček (HTS7000plus, Applied Biosystems, Weiterstadt, Germany).

Hodnoty IC₅o byly vypočteny programem Graphit 4.0.15 (Erithacus Software, Ltd., UK). Nebyla zjištěna žádná inhibice DP I enzymové aktivity glutaminylpyrrolidinem nebo glutaminylthiazolidinem.

Prolyl oligopeptidáza (POP)

Prolyloligopeptidáza (EC 3.4.21.26) je endoproteáza serinového typu, která odštěpuje peptidy na N-konci části vazby Xaa-Pro (Walter, R., Shlank, H., Glass, J. D., Schwartz, I. L. & Kerenyi, T. D„ 1971, Science, 173, 827-829). Substráty jsou peptidy s molekulovou hmotností až 3000 Da.

Používaný enzym byl rekombinantní lidská prolyl oligopeptidáza. Rekombinantní exprese byla prováděna v E.coli za standardních podmínek podle literatury.

Test:

100 μΐ glutaminylpyrrolidinu nebo glutaminylthiazolidinu v rozmezí koncentrací PU⁴ Μ - 5*10'⁸ M bylo smícháno s 100 μΐ pufrovacího roztoku (40 mM HEPES, pH 7,6, 0,015% Brij, 1 mM DTT) a 20 μΐ POP roztoku. Testovací směs byla předem inkubována při teplotě 30 °C po dobu 15 minut. Po preinkubaci bylo přidáno 50 μΐ glycylprolylprolyl4-nitroanilinového roztoku (0,29 mM) a měření žluté barvy v důsledku uvolňování

4-nitroanilinu bylo prováděno při teplotě 30 °C a λ = 405 nm po dobu 10 minut na čtečce destiček (sunrise, Tecan, Crailsheim, Germany).

Hodnoty IC50 byly vypočteny programem Graphit 4.0.15 (Erithacus Software, Ltd., UK). Nebyla zjištěna žádná POP aktivita ovlivněná glutaminylpyrrolidinem nebo glutaminylthiazolidinem.

Prolidáza (X-Pro dipeptidáza)

Prolidáza (EC 3.4.13.9) byla poprvé popsána Bergmannem & Frutonem (Bergmann, M. & Fruton, JS, 1937, J. Biol. Chem. 189-202). Prolidáza uvolňuje N-koncovou aminokyselinu z Xaa-Pro dipeptidů a má optimální pH mezi 6 a 9.

Prolidáza z vepřových ledvin (ICN Biomedicals, Eschwege, Germany) byla rozpuštěna (1 mg/ml) v testovacím pufru (20mM NH₄(CH₃COO)₂, 3 mM MnCl₂, pH 7,6). K získání zcela aktivního enzymu byl roztok inkubován po dobu 60 minut při pokojové teplotě.

Test:

450 μΐ glutaminylpyrrolidinu nebo glutaminylthiazolidinu v rozmezí koncentrací 5*10’³ Μ - 5*10'⁷ M bylo smícháno s 500 μΐ pufrovacího roztoku (20mM NH4(CH₃COO)₂, pH 7,6) a 250 μΐ Ile-Pro-OH (0,5 mM v testovací směsi). Testovací směs byla předem inkubována při teplotě 30 °C po dobu 5 minut. Po preinkubaci bylo přidáno 75 μΐ Prolidázy (1:10 zředění v testovacím pufru) a měření bylo prováděno při teplotě 30 C a λ = 220 nm po dobu 20 minut na UV/Vis fotometru, UV1 (Thermo Spectronic, Cambridge, UK).

Hodnoty IC50 byly vypočteny programem Graphit 4.0.15 (Erithacus Software, Ltd., UK). Byly stanoveny jako IC 50 > 3 mM pro glutaminylthiazolidin a jako IC50 = 3,4*10 M ± 5,63*10’⁵ pro glutaminylpyrrolidin.

Příklad 8

Plazmatická stabilita

K určení stability glutaminylpyrrolidinu nebo glutaminylthiazolidinu v lidské plazmě byla stanovena aktivita DPIV v definovaných časech. Průměrná aktivita DPIV v lidské plazmě byla stanovena jako 43,69 U/ml. V pracovním roztoku byla plazma zředěna v 0,9% NaCl k fixaci hladiny aktivity DPIV při 25 U/ml.

Plazma a glutaminylpyrrolidin nebo glutaminylthiazolidin v různých koncentracích (5*10'⁵, 2,5*10'⁵, l,25*10‘⁵ M v plazmě) byly inkubovány při teplotě 37 °C. V definovaných časech byly vzorky odebírány robotickou pipetou (Gilson 215, Liquid handler, Gilson) a převedeny do mikrotitrační destičky obsahující 5*10⁵ M glycylprolylaminomethylkumarinu v 0,9% NaCl + 015% Brij na jamku. Po 6 minutách byla reakce zastavena přidáním izoleucylthiazolidinu (5*10⁵ M v 0,9% NaCl roztoku).

Měření fluorescence bylo provedeno proti 0,9% NaCl v plazmě (referenční standard) na čtečce destiček (HTS7000plus, Applied Biosystems, Weiterstadt, Germany). Poločas inhibiční účinnosti glutaminylpyrrolidinu nebo glutaminylthiazolidinu byl vypočten vynesením závislosti enzymové aktivity na reakčni době.

U obou sloučenin nemohl být stanoven žádný poločas. Látka byla stabilní v lidské plazmě po dobu více jak 22 hodin.

Příklad 9

Stanovení DPIV inhibiční aktivity glutaminylpyrrolidinu a glutaminylthiazolidinu po intravazálním dávkování krysám kmene Wistar

Zvířata

Samci kmene Wistar (Shoe: Wist(Sho)) s tělesnou hmotností v rozmezí od 250 do 350 g byly zakoupeny u Tierzucht Schonwalde (Schonwalde, Germany).

Podmínky chovu

Zvířata byla chována v jediné kleci za standardních podmínek s kontrolovanou teplotou (22 ± 2°C) v 12/12 hodinovém cyklu světlo/tma (světlo od 6:00 ráno). Podle potřeby byla poskytnuta standardní peletizovaná potrava (ssniff® Soest, Germany) a voda z kohoutku okyselená HCI.

Vložení katetru do karotické artérie

Po > jednom týdnu adaptace na podmínky chovu byly katetry implantovány do karotické artérie krys kmene Wistar za standardní anestézie (i.p. injekce 0,25 ml/kg b.w. Rompun® [2%], BayerVital, Germany a 0,5 ml/kg b.w. Ketaminu 10, Atarost GmbH & Co., Twistringen, Germany). Zvířata se nechala jeden týden regenerovat. Poté byly katetry propláchnuty heparinovým fyziologickým roztokem (100 lU/ml) třikrát týdně. V případě dysfunkce katetru byl do kontralaterální karotické artérie dotyčné krysy vložen druhý katetr. Po jednom týdnu regenerace po chirurgickém zákroku byla zvířata opět zapojena do studie. Bylo zapojeno nové zvíře a v experimentech bylo pokračováno podle naplánovaného postupu začínajícím alespoň 7 dnů po implantaci katetru.

Experiment

Krysám s intaktní funkcí katetru bylo perorálně a intravazalně (intraarteriálně) podáváno placebo (1 ml fyziologického roztoku, 0,154 mol/1) nebo 100 mg/kg b.w. glutaminylpyrrolidinu nebo 100 mg/kg b.w. glutaminylthiazolidinu.

Po vyhladovění přes noc byly odebrány 100 μΐ vzorky heparinizované arteriální krve v -30, -5 a 0 minutě. Testovaná látka byla čerstvě rozpuštěna v 1,0 ml fyziologického roztoku (0,154 mol/1) a podávána v 0 minutě perorálně nebo přes potravinový kanálek (75 mm; Fin Science Tools, Heidelberg, Germany) nebo intravazálně. V případě perorálního podání bylo do arteriálního katetru injikováno 1 ml fyziologického roztoku. V případě intraarteriálního podání byl katetr ihned promyt 30 μΐ fyziologického roztoku a další 1 ml fyziologického roztoku bylo podáváno perorálně přes potravinový kanálek.

Po aplikaci placeba nebo testovaných látek byly odebrány vzorky arteriální krve v časech 2,5, 5, 7,5, 10, 15, 20, 40, 60 a 120 minut z karotického katetru od volně pohybujících se krys při vědomí. Všechny vzorky krve byly odebírány do ledově studených ependorfek (Eppendorf-Netheler-Hinz, Hamburg, Germany) naplněných 10 μΐ pufru 1M citrátu sodného (pH 3,0) k měření plazmatické aktivity DPIV. Ependorfky byly ihned centrifugovány (12000 ot./min po dobu 2 minut, Hettich Zentrifuge EBA 12,

Tuttlingen; Germany): Plazmatické frakce byly skladovány na ledu do analýzy nebo byly zmrazený při teplotě -20° C do analýzy. Všechny vzorky plazmy byly opatřeny následujícími údaji:

Kódové číslo

Číslo zvířete

Datum odběru vzorku

Čas odběru vzorku

Analytické metody

Testovací směs pro stanovení plazmatické DPIV aktivity se sestávala z 80 μΐ činidla a 20 μΐ vzorku plazmy. Kinetická měření tvorby žlutého produktu 4-nitroanilinu ze substrátu glycylprolyl-4-nitroanilinu byla prováděna při 390 nm po dobu 1 minuty pn teplotě 30 °C po 2 minutové preinkubaci při stejné teplotě. DPIV aktivita byla vyjádřena v mU/ml.

Statistické metody

Statistická vyhodnocení a grafická vyjádření byla provedena programem PRISM® 3.02 (GraphPad Software, lne.). Všechny parametry byly analyzovány popisně včetně střední a standardní odchylky.

Výsledky

Sloučeniny na bázi glutaminylpyrrolidinu a glutaminylthiazolidinu v dávce 100 mg/kg b.w. při srovnání s placebem inhibovaly plazmatickou aktivitu DPIV po perorálním a intravazálním podání (viz obrázky 1 a 2).

Příklad 10

Studie zvyšování dávky provedená na tlustých krysách kmene Zucker zahrnující po perorálním podání glutaminylpyrrolidinu

Zvířata

N=30 samčí krysy kmene Zucker (fa/fa), průměrný věk 11 týdnů (5-12 týdnů), průměrná tělesná hmotnost 350 g (150-400 g), byly zakoupeny od firmy Charles River (Sulzfeld, Germany). Po dodání byly chovány po dobu více jak 12 týdnů do té doby, dokud téměř všechny tlusté krysy kmene Zucker neměly charakteristické příznaky diabetes mellitus. Skupina (N=8) zvířat byla zapojena do testu porovnávajícího tří zvyšující se dávky glutaminylpyrrolidinu s placebem (fyziologický roztok).

Podmínky chovu

Katetrizace karotické artérie

Tlusté krysy kmene Zucker 24-31 týdnů staré (průměrně 25 týdnů), které byly zadaptované na podmínky chovu, byly vhodně připravené k provedení studie.

Katetry byly implantovány do karotické artérie tlustých krys kmene Zucker za standardní anestézie (i.p. injekce 0,25 ml/kg b.w. Rompun® [2%], BayerVital, Germany a 0,5 ml/kg b.w. Ketaminu 10, Atarost GmbH & Co., Twistringen, Germany). Zvířata se nechala jeden týden regenerovat. Poté byly katetry propláchnuty heparinovým fyziologickým roztokem (100 lU/ml) třikrát týdně.

Experiment

Skupinám (N=8) tlustých krys kmene Zucker bylo podáváno placebo (1 ml fyziologický roztok, 0,154 mol/1) nebo zvyšující se dávky glutaminylpyrrolidinu (5, 15 a 50 mg/kg b.w.). 375 mg glutaminylpyrrolidinu bylo rozpuštěno v 1000 μΐ DMSO (E.Merck, Darmstadt; Germany [dimethylsulfoxid p.a.]). Bylo přidáno 10 ml fyziologického roztoku a 1 ml alikvótů, přičemž každý obsahoval 34,09 mg glutaminylpyrrolidinu, bylo skladováno při teplotě -20 °C. K přípravě testované látky byla dávka závislá na alikvótech zředěna ve fyziologickém roztoku.

9 9 99 9 9 9 9 * ^ · • - U 9 9 9 · 9 9 9 ».«···

9 9 9 9 9 9 · * ·

9 9 999 9 9 9 9 *

Tlustým krysám kmene Zucker, které se nechaly přes noc vyhladovět, bylo perorálně podáváno placebo nebo testovaná látka prostřednictvím potravinového kanalku (15 G, 75 mm; Fine Science Tools, Heidelberg, Germany) v -10 minut. Byl proveden perorální glukózový toleranční test (OGTT) s 2 g/kg b.w. glukózy (40% roztok, B. Braun Melsungen, Germany) podávané v ± 0 minutě prostřednictvím druhého potravinového kanálku. Vzorky venózní krve z ocasní žíly byly odebírány v -30 min, -15 mm, ±0 min a v 5 10, 15, 20, 30, 40, 60, 90 a 120 minutě do 20 μΐ skleněných kapilár, které byly umístněny do standardních nádob s 1 ml roztoku pro měření krevní glukózy.

Všechny vzorky plazmy byly opatřeny následujícími údaji:

Kódové číslo

Číslo zvířete

Datum odběru vzorku

Čas odběru vzorku

Analytické metody

Hladiny glukózy byly měřeny glukózoxidázovou metodou (Super G Glucose analyzer; Dr. Miiller Gerátebau, Freital, Germany).

Statistické metody

Statistická vyhodnocení a grafická vyjádření byla provedena programem PRISM® 3.02 (GraphPad Software, lne.). Všechny parametry byly analyzovány popisným způsobem včetně střední a standardní odchylky.

Účinek léčení na glukózovou toleranci

Diabetické krysy kmene Zucker ošetřované placebem vykazovaly zvýšenou odchylku v hladině krevní glukózy indikující glukózovou intoleranci, která dokazuje přítomnost diabetes mellitus. Podání 5 mg/kg b.w. glutaminylpyrrolidinu vedlo k omezenému zlepšení glukózové tolerance v diabetických krysách kmene Zucker. Signifikantní snížení zvýšených hladin krevní glukózy a zlepšení glukózové tolerance bylo dosaženo po podání 15 mg/kg a 50 mg/kg b.w. glutaminylpyrrolidinu (viz obrázek 3).

Příklad 11

Studie zvyšování dávky provedená na tlustých krysách kmene Zucker po perorálním podání glutaminylthiazolidinu

Zvířata

N=30 samčí krysy kmene Zucker (fa/fa), průměrný věk 11 týdnů (5-12 týdnů), průměrná tělesná hmotnost 350 g (150-400 g), byly zakoupeny od firmy Charles River (Sulzfeld, Germany). Po dodání byly chovány po dobu více jak 12 týdnů do té doby, dokud téměř všechny tlusté krysy kmene Zucker neměly charakteristické příznaky diabetes mellitus. Skupina (N=8) zvířat byla zapojena do testu porovnávajícího tří zvyšující se dávky glutaminylthiazolidinu s placebem (fyziologický roztok).

Podmínky chovu

Zvířata byla chována v jediné kleci za standardních podmínek s kontrolovanou teplotou (22 ± 2°C) v 12/12 hodinovém cyklu světlo/tma (světlo od 6:00 ráno). Podle potřeby byla poskytnuta standardní peletizovaná potrava (ssniff® Soest, Germany) a voda z kohoutku okyselená HC1.

Katetrizace karotické artérie

Tlusté krysy kmene Zucker 24-31 týdnů staré (průměrně 25 týdnů), které byly zadaptované na podmínky chovu, byly vhodně připravené k provedení studie. Katetry byly implantovány do karotické artérie tlustých krys kmene Zucker za standardní anestézie (i.p. injekce 0,25 ml/kg b.w. Rompun® [2%], BayerVital, Germany a 0,5 ml/kg b.w. Ketammu 10, Atarost GmbH & Co., Twistringen, Germany). Zvířata se nechala jeden týden regenerovat. Poté byly katetry proplachovány heparinovým fyziologickým roztokem (100 lU/ml) třikrát týdně.

Experiment

Skupinám (N=8) tlustých krys kmene Zucker bylo podáváno placebo (1 ml fyziologický roztok, 0,154 mol/1) nebo zvyšující se dávky glutaminylthiazolidinu (5, 15 a 50 mg/kg b.w.). Odpovídající množství glutaminylthiazolidinu bylo rozpuštěno v 1000 μΐ fyziologického roztoku. Tlustým krysám kmene Zucker, které se nechaly přes noc vyhladovět, bylo perorálně podáváno placebo nebo testovaná látka prostřednictvím potravinového kanálku (15 G, 75 mm; Fine Science Tools, Heidelberg, Germany) v -10 minut. Perorální glukózový toleranční test (OGTT) s 2 g/kg b.w. glukózy (40% roztok, B. Braun Melsungen, Germany) podávané v ± 0 minutě prostřednictvím druhého potravinového kanálku. Vzorky venózní krve z ocasní žíly byly odebírány v -30 min, -15 min, ±0 min a v 5, 10, 15, 20, 30, 40, 60, 90 a 120 minutě do 20 μΐ skleněných kapilár, které byly umístněny do standardních nádob s 1 ml roztoku pro měření hladin krevní glukózy.

Všechny vzorky plazmy byly označeny následujícími značkami:

Kódové číslo

Číslo zvířete

Datum odběru vzorku

Čas odběru vzorku

Analytické metody

Hladiny glukózy byly měřeny glukózoxidázovou metodou (Super G Glucose analyzer; Dr. Muller Geratebau, Freital, Germany).

Statistické metody

Účinek léčení na glukózovou toleranci

Diabetické krysy kmene Zucker ošetřované placebem vykazovaly zvýšenou odchylku v hladině krevní glukózy indikující glukózovou intoleranci, která dokazuje přítomnost diabetes mellitus. Podání 5 mg/kg b.w. glutaminylthiazolidinu vedlo k omezenému zlepšení glukózové tolerance v diabetických krysách kmene Zucker. Signifikantní snížení zvýšených hladin krevní glukózy a zlepšení glukózové tolerance bylo dosaženo po podání 15 mg/kg a 50 mg/kg b.w. glutaminylpyrrolidinu (viz obrázek 4).

Příklad 12

In vivo inaktivace glutaminylthiazolidinu po perorálním podání krysám kmene Wistar

Zvířata/experiment

Glutaminylthiazolidin byl podáván perorálně krysám kmene Wistar podle příkladu 9.

Analytické metody

Po aplikaci placeba nebo glutaminylthiazolidinu byly z karotického katetru od volně se pohybujících krys při vědomí odebrány vzorky krve v 2,5, 5, 7,5, 10, 15, 20, 40, 60 a 120 minutách pro stanovení tvorby degradaěních produktů glutaminylthiazolidinu.

K analýze byla provedena jednoduchá extrakce na pevné fázi na Cl8 patronách k izolaci požadovaných sloučenin z plazmy. Extrakty byly analyzovány HPLC na reverzní fázi na sloupci Lichrospher 60 RP Select B kombinovanou s hmotnostní spektrometrií v APCI pozitivním módu (HPLC s výstupem na MS). Ke kvantifikaci byla používána metoda vnitřního standardu.

Výsledky

Po perorálním podání glutaminylthiazolidinu krysám kmene Wistar byla zjištěna degradace sloučeniny. Pomocí LC/MS mohl být definován produkt degradace jako pyroglutaminylthiazolidin. Viz obrázky 5 a 6.

Claims

1. Sloučenina obecného vzorce:

kde X = CH₂ nebo S, nebo její farmaceuticky přijatelná sůl.

2-naftalensulfonové, p-toluensulfonové, cyklohexansulfamové, salicylové, sacharinové a trifluoroctové.

2. Sloučenina podle nároku 1, kde adiční sůl s kyselinou je vybrána ze skupiny se stávající z kyseliny chlorovodíkové, bromovodíkové, chloristé, sírové, dusičné, fosforečné, octové, propionové, glykolové, mléčné, sukcinové, maleinové, filmařové, jablečné, vinné, citrónové, benzoové, mandlové, methansulfonové, hydroxy ethansulfonové, benzensulfonové, oxalové, pamoové, 2-naftalensulfonové, p-toluensulfonové, cyklohexansulfamové, salicylové, sacharinové a trifluoroctové.

3. Adiční sůl sloučeniny obecného vzorce

s kyselinou, kde X = CH₂ nebo S, a kde adiční sůl s kyselinou je vybrána ze skupiny sestávající se z kyseliny chlorovodíkové, bromovodíkové, chloristé, dusičné, propionové, glykolové, mléčné, maleinové, jablečné, citrónové, benzoové, mandlové, methansulfonové, hydroxyethansulfonové, benzensulfonové, oxalové, pamoové,

4. Sloučenina podle nároku 3 vybraná z hydrochloridu glutaminylthiazohdinu a hydrochloridu glutaminylpyrrolidinu.

5.

Hydrochlorid glutaminylthiazolidinu.

6. Hydrochlorid glutaminylpyrrolidinu.

7. Polymorf sloučeniny podle kteréhokoliv z předchozích nároků.

8. Farmaceutická kompozice, vyznačující se tím, že obsahuje farmaceuticky přijatelný nosič a/nebo ředící roztok a sloučeninu podle kteréhokoliv z předchozích nároků.

9. Použití sloučeniny nebo farmaceutické kompozice podle kteréhokoliv z předchozích nároků k přípravě léčebného prostředku k inhibici dipeptidyl peptidázy IV nebo enzymové aktivity podobné dipeptidyl peptidáze IV k prevenci nebo léčení onemocnění nebo stavů souvisejících s dipeptidyl peptidázou IV nebo enzymů s podobnou dipeptidyl peptidázou IV.

10. Použití podle nároku 9 ke snížení zvýšených hladin krevní glukózy u savců vyplývajících z příjmu potravy.

11. Použití podle nároků 9 nebo 10 k prevenci nebo léčení non-inzulin dependentní diabetes mellitus, artritidy, obezity, imunních a autoimunních chorob, transplantace aloimplantátu, rakoviny, neuronových poruch a kožních onemocnění.

12. Použití podle nároku 11 k prevenci nebo ošetření non-inzulin-dependentní diabetes mellitus.

13. Způsob inhibice dipeptidyl peptidázy IV nebo enzymové aktivity podobné dipeptidyl peptidáze IV k prevenci nebo léčení onemocnění nebo stavů souvisejících s dipeptidyl peptidázou IV nebo s enzymy podobnými dipeptidyl peptidáze IV, vyznačující se tím, že zahrnuje podání, při potřebě takového ošetření, terapeuticky účinného množství sloučeniny nebo farmaceutické kompozice podle kteréhokoliv z nároků 1 až 8 savci.

14. Způsob podle nároku 13, vyznačující se tím, že vede ke snížení zvýšených hladin krevní glukózy u savců v důsledků příjmu potravy.

15. Způsob podle nároků 13 nebo 14, vyznačující se tím, že vede k prevenci nebo ošetření onemocnění nebo stavů vybraných ze skupiny sestávající se z non-inzulin dependentní diabetes mellitus, artritidy, obezity, imunních a autoimunních chorob, transplantace aloimplantátu, rakoviny, neuronových poruch a kožních onemocnění.

16. Způsob podle nároku 15 k prevenci nebo ošetření non-inzulin-dependentní diabetes mellitus.

17. Degradační produkt sloučeniny podle nároku 1, 3 nebo 5 mající vzorec: o