CZ2006291A3 - Čištěná protilátka, která specificky váže TRAIL receptor pro DR5 - Google Patents

Čištěná protilátka, která specificky váže TRAIL receptor pro DR5 Download PDF

Info

Publication number
CZ2006291A3
CZ2006291A3 CZ2006-291A CZ2006291A CZ2006291A3 CZ 2006291 A3 CZ2006291 A3 CZ 2006291A3 CZ 2006291 A CZ2006291 A CZ 2006291A CZ 2006291 A3 CZ2006291 A3 CZ 2006291A3
Authority
CZ
Czechia
Prior art keywords
tra
cells
antibody
trail
cell
Prior art date
Application number
CZ2006-291A
Other languages
English (en)
Other versions
CZ306996B6 (cs
Inventor
Tong Zhou
Kimihisa Ichikawa
Robert P. Kimberly
William J. Koopman
Original Assignee
Uab Research Foundation
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Uab Research Foundation filed Critical Uab Research Foundation
Publication of CZ2006291A3 publication Critical patent/CZ2006291A3/cs
Publication of CZ306996B6 publication Critical patent/CZ306996B6/cs

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A61K39/39533—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals
    • A61K39/39558—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals against tumor tissues, cells, antigens
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2866—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against receptors for cytokines, lymphokines, interferons
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/04—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for ulcers, gastritis or reflux esophagitis, e.g. antacids, inhibitors of acid secretion, mucosal protectants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P13/00—Drugs for disorders of the urinary system
    • A61P13/12—Drugs for disorders of the urinary system of the kidneys
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P15/00—Drugs for genital or sexual disorders; Contraceptives
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P21/00—Drugs for disorders of the muscular or neuromuscular system
    • A61P21/04—Drugs for disorders of the muscular or neuromuscular system for myasthenia gravis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/08—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis
    • A61P3/10—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis for hyperglycaemia, e.g. antidiabetics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
    • A61P31/18—Antivirals for RNA viruses for HIV
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/04—Immunostimulants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/06—Immunosuppressants, e.g. drugs for graft rejection
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/08—Antiallergic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P5/00—Drugs for disorders of the endocrine system
    • A61P5/18—Drugs for disorders of the endocrine system of the parathyroid hormones
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A61P7/06—Antianaemics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A61P9/10—Drugs for disorders of the cardiovascular system for treating ischaemic or atherosclerotic diseases, e.g. antianginal drugs, coronary vasodilators, drugs for myocardial infarction, retinopathy, cerebrovascula insufficiency, renal arteriosclerosis
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2878—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the NGF-receptor/TNF-receptor superfamily, e.g. CD27, CD30, CD40, CD95
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/30—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6863—Cytokines, i.e. immune system proteins modifying a biological response such as cell growth proliferation or differentiation, e.g. TNF, CNF, GM-CSF, lymphotoxin, MIF or their receptors
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/10—Immunoglobulins specific features characterized by their source of isolation or production
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/24—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin containing regions, domains or residues from different species, e.g. chimeric, humanized or veneered
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/73—Inducing cell death, e.g. apoptosis, necrosis or inhibition of cell proliferation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/30—Non-immunoglobulin-derived peptide or protein having an immunoglobulin constant or Fc region, or a fragment thereof, attached thereto

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)

Description

Oblast techniky
Tento vynález se týká protilátky schopné specifické vazby na jeden receptor faktoru nekrosy nádorů (dále TNF) indukující apoptosu (zde dále TRAIL), přesněji, čištěné protilátky, která specificky váže TRAIL receptor pro DR5.
Dosavadní stav techniky
TRAIL je členem TNF rodiny proteinů, kam též patří TNF-alfa a Fas ligand (1). Tyto proteiny jsou silnými induktory apoptosy. Dosud bylo identifikováno pět receptorů pro TRAIL, z nichž dva, DR4 (TRAIL-R1) a DR5 (TRAIL-R2) (2-7), jsou schopné přenášet signál pro apoptosu, zatímco další tři DcRl (TRAIL-R3), DcR2 (TRAIL-R4), a osteoprotegerin (OPG) nepřenášejí signál pro apoptosu (8-12). Všech pět receptorů pro TRAIL vykazuje značnou homologii v extracelulárních doménách pro vazbu ligandu. Podobně jako Fas a TNF receptor I (dále TNFRI) obsahují intracelulární segmenty DR4 a DR5 death doménu a přenášejí signál pro apoptosu prostřednictvím drah, na kterých se podílejí Fas-asociované proteiny s death doménou (dále FADD) a caspasa 8 (6,7). Kromě přenosu signálu pro apoptosu mohou DR4 a DR5 receptory také aktivovat dráhy zahrnuj ící NFkappab (6,7).
Biologické funkce TRAIL, které byly prokázány, zahrnují schopnost TRAIL selektivně indukovat apoptosu transformovaných nádorových buněk, kde normální buňky jsou relativně rezistentní na apoptosu zprostředkovanou TRAIL (13-15). Tato selektivita
- 2 naznačuje, že oproti Fas ligandu je podání TRAIL asociované s velmi slabou toxicitou, jak bylo prokázáno při systémovém podání TRAIL na zvířecím modelu bez indukce významnější toxicity (13). Proto byl TRAIL navržen jako účinné činidlo indukující apoptosu, které by mohlo být vhodným terapeutickým činidlem pro léčbu nádorů a jiných onemocnění spojených s abnormální buněčnou proliferací. TRAIL byl také navržen jako účinné činidlo indukující apoptosu, které by mohlo být vhodným terapeutickým činidlem pro léčbu autoimunních a zánětlivých onemocnění. Bylo prokázáno, že apoptosa zprostředkovaná TRAIL se podílí na aktivací indukované smrti T-lymfocytů, čímž účinkuje jako alternativní mechanismus k Fas ligandu (16,17). TRAIL-zprostředkovaná apoptosa se také může podílet na indukci apoptosy T-lymfocytů a jiných zánětlivých buněk (18), a má roli v zabíjecí aktivitě NK buněk (19-2 1), a v imunomodulační funci dendritických buněk (22,23). Tak může apoptosa zprostředkovaná TRAIL mít roli také v imunotoleranci a imunitním dohledu.
TRAIL receptorový systém je komplexní a zahrnuje alespoň dva death receptory, DR4 a DR5, a alespoň dva non-apoptogenní receptory, DcRl a DcR2. Všechny tyto receptory nejen sdílejí vysokou homologii aminokyselinové sekvence, ale také vykazují podobnou vazebnou afinitu k TRAIL (2-12). Schopnost DcRl a DcR2 receptorů soutěžit o vazbu TRAIL bez indukce apoptosy naznačuje, že mohou účinkovat jako vychytávací receptory, které blokují nebo modulují aktivitu TRAIL ligandu. Dále bylo popsáno, že netransformované buňky exprimují vyšší koncentrace těchto vychytávacích receptorů než transformované buňky. Tak bylo navrženo, že rozdílná modulace exprese death a vychytávacích receptorů může představovat klíčový regulační mechanismus, který určuje citlivost buněk na apoptosu zprostředkovanou TRAIL, v důsledku chybění protilátek specifických pro receptor (2). Ačkoliv byla exprese a funkce DR4 a DR5 studována podrobně, byl • · · · i · ·
- 3 pokrok omezen chyběním monoklonálních protilátek specifických pro receptor. Exprese DR5 na povrchu buněk nebyla popsána. Bylo popsáno, že byl připraven panel protilátek proti TRAIL receptoru, které jsou schopné indukovat apoptosu melanomových buněk in vitro, ale pouze po imobilizaci protilátek, podpořeni zesítění a, v některých případech, po kultivaci buněk s actinomycinem D (24). Bylo připraveno několik anti-DR5 protilátek (24). Nicméně, tyto dříve připravené anti-DR5 monoklonální protilátky mají in vitro nízkou aktivitu v indukci apoptosy, i za podmínek zesítění. Nebyla popsána žádná aktivita in vivo. Tyto protilátky nebyly použity pro testování exprese TRAIL receptorů na povrchu buněk (24). Proto existuje potřeba pro monoklonální protilátky selektivní pro každý specifický TRAIL receptor, které se nejen váží na receptory na povrchu buněk, ale také silně indukují apoptosu v různých typech abnormálních buněk, včetně nádorových buněk, jak in vivo, tak in vitro, bez nutnosti zesítění nebo imobilizace. Takové protilátky nebudou pouze potenciálními terapeutickými činidly, ale též diagnostickými prostředky pro funkční analýzu TRAIL receptoru. Existuje zejména potřeba protilátek specifických pro každý z apoptosu indukujících receptorů DR4 a DR5.
Při vývoji nebo progresi mnoha onemocnění se často stává, že nedochází k depleci buněk. Při mnoha autoimunitních onemocněních a zánětlivých onemocněních ohrožuje přežívání aktivovaných buněk normální tkáně nebo buňky. Dále, progrese nádorů a proliferace s tvorbou panu při revmatoidní arthritidě jsou charakterizovány nekontrolovanou proliferací buněk. Tak vede nedostatečná apoptosa k vzniku onemocnění a použití apoptosu-indukujícího ligandu nebo agonistické monoklonální protilátky pro zesílení apoptosy se považuje za potenciální terapeutickou strategii pro eliminaci nežádoucích buněk.
Například, revmatoidní arthritida (dále RA) je běžným lidským
- 4 autoimunitním onemocněním. Současné znalosti o patofyziologii RA jsou takové, že autoimunní T-lymfocyty a B lymfocyty iniciují zánětlivou reakci v kloubech, která způsobí hyperproliferaci synoviocytů. V důsledku hyperproliferace synoviálních buněk jsou nadprodukovány metaloproteinasy (dále MMP), které potom způsobují erosivní destrukci chrupavek a kostí, která je charakteristická pro RA (25). Proto je kontrola hyperproliferace zánětlivých synoviálních buněk klíčovým krokem v léčbě RA. Molekulární mechanismy vedoucí k hyperproliferaci synoviálních buněk jsou dosud neznámé. Ačkoliv jsou hyperproliferující synoviální buňky nemaligní a netransformované, mnohé práci ukazují, že vykazuji společné charakteristiky s transformovanými buňkami (46). Tyto buňky, takzvané transformované synoviocyty, jsou charakterizované densním hrubým endoplasmatickým retikulem, množstvím nepravidelných jader, a změnami cytoskeletu. Bylo navrženo, že inkorporace onkogenů a virových genů může být primárním spouštěcím mechanismem pro transformaci RA synoviálních buněk (46).
Alespoň dva aspekty RA naznačují, že dysregulovaná apoptosa může přispívat k onemocnění a že terapeutická indukce apoptosy může být účinnou léčbou: selhání deplece aktivovaných T-lymfocytů naznačuje, že došlo k selháni aktivací indukované smrti těchto T-lymfocytů, což je proces, na kterém se podílí Fas-zprostředkovaná apoptosa a TRAIL-zprostředkovaná apoptosa, a hyperproliferativní charakteristiky těchto RA synoviálních buněk jsou přispívající faktory v pozdějších stadiích patofyziologie RA. Dále bylo prokázáno, že podání anti-Fas protilátky do zánětem postižených kloubů inhibuje vznik chronické artritidy u tax transgenních myší, které jsou zvířecím modelem lidské RA (26).Nicméně, lokalizovaná transdukce genem pro fas ligand pomocí adenovirového vektoru je účinná v prevenci arthritidy indukované kolagenem (27). Inhibice proliferace zánětlivých synoviálních • · • · · a ♦ · • ·· • ·· 9 ♦ • ·· » • ♦» • »· · · buněk zesílením Fas-zprostředkované apoptosy je pozorováno v oboru případech. Ačkoliv je Fas ligand silným induktorem apoptosy u RA synoviálních buněk, je použití Fas ligandem-zprostředkované apoptosy jako terapie u člověka limitováno letální jaterní toxicitou. Tak představuje TRAIL receptorem indukovaná apoptosa bezpečnější a účinnější terapii RA než Fas-ligandem indukovaná apoptosa.
TRAIL receptorem indukovaná apoptosa také představuje bezpečnější a účinnější terapii pro léčbu nádorů než Fas-ligandem indukovaná apoptosa. TRAIL-zprostředkovaná apoptosa specificky indukuje apoptosu transformovaných nádorových buněk bez postižení normálních buněk. Bylo prokázáno, že systémové podání trimerizovaného solubilního TRAIL není toxické u experimentálních zvířat a zároveň umožňuje indukci regrese implantovaných nádorů (13,28). Její potenciál jako pomocné léčby k tradičním způsobům léčby byl snížen nedávnými zjištěními, že exprese DR5 a citlivost na TRAIL-indukovanou apoptosu buněk karcinomu prsu je zesílena radiací, což naznačuje, kombinací s radiací bude účinnost TRAIL v protinádorové léčbě zvýšena (29).
Dále, gen kódující TRAIL receptor DR5 byl lokalizován na chromosom 8p21-22, lokus s vysokou frekvencí mutací v některých nádorových buňkách (30). Bylo popsáno, že alespoň dva druhy nádorových buněk, buňky malobuněčného karcinomu plic (31) a nádorů hlavy a krku (32), mají mutace v death doméně DR5 genu. Proto existuje potřeba anti-DR5 protilátky ve výzkumu nádorů pro určení efektu variací epitopu receptoru na vývoj a progresi nádorů. Dále, funkce mutací TRAIL receptoru poskytují použitelný klinický diagnostický nástroj při použití s dalšími biomarkery pro časnou detekci nádorů a v predikci agresivity nádorů.
t « < * *
Nyní byla nalezena protilátka, která rozpoznává TRAIL receptor DR5 a která indukuje apoptosu v buňkách exprimujícich DR5 in vivo. Tato protilátka rozpoznává DR5, ale nikoli DR4, DcRl či DCR2.
Podstata vynálezu
Předmětem tohoto vynálezu je čištěná protilátka, která specificky váže TRAIL receptor pro DR5, ve které uvedená i
(a) pxotiiát-M má aktivitu indukující buněčnou smrt cílových buněk exprimujícich DR5 in vitro ve své rozpustné formě při koncentraci 1 pg/ml nebo méně, (b) má tumoricidní aktivitu proti nádorovým buňkám exprimujícím DR5 in vivo, a (c) neváže TRAIL receptory pro DR4, DcRl nebo DcR2.
Výhodným provedením předmětu tohoto vynálezu je čištěná protilátka uvedená svrchu, kde protilátka neindukuje významně buněčnou smrt netransformovaných buněčných fibroblastů.
Výhodným provedením předmětu tohoto vynálezu je čištěná protilátka uvedená svrchu, ve které aktivita indukující buněčnou smrt je charakterizována 70% nebo menší životaschopností cílových buněk při koncentraci protilátky 2,5 pg/ml.
Výhodným provedením předmětu tohoto vynálezu je čištěná protilátka uvedená svrchu, kde uvedená protilátka neváže TRAIL receptory pro DR4, DcRl nebo DcR2 po obvyklé analýze westernového přenosu.
Výhodným provedením předmětu tohoto vynálezu je čištěná protilátka uvedená svrchu, kde uvedená protilátka je monoklonální.
Výhodným provedením předmětu tohoto vynálezu je čištěná protilátka uvedená svrchu, kde DR5 je lidský DR5.
• · · · • · · • · · · • · • · • · · · · · · • · · · · · • · · • · · ·
Výhodným provedením předmětu tohoto vynálezu je čištěná protilátka uvedená svrchu, kde uvedenou cílovou buňkou je zánětlivá synoviální buňka.
Výhodným provedením předmětu tohoto vynálezu je čištěná protilátka uvedená svrchu, kde uvedenou cílovou buňkou je rakovinná buňka.
Výhodným provedením předmětu tohoto vynálezu je čištěná protilátka uvedená svrchu, kde uvedenými cílovými buňkami jsou aktivované T lymfocyty a B lymfocyty.
Výhodným provedením předmětu tohoto vynálezu je čištěná protilátka uvedená svrchu, kde uvedenou imunitní buňkou je aktivovaný lymfocyt. Jejím výhodným provedením je čištěná protilátka, kde imunitní buňkou je aktivovaná NK buňka nebo aktivovaná dendritická buňka. Ještě dalším výhodným provedením je čištěná protilátka, kde protilátka má stejný specifický epitop jako protilátka produkovaná myším-myším hybridomem, označovaná jaKO TRA-8, s ATCC přírůstkovým číslem PTA-1428.
Výhodným provedením předmětu tohoto vynálezu je čištěná protilátka uvedená svrchu, kde uvedená protilátka je humanizovaná.
Dále se uvádějí podrobnější údaje související s předmětným vynálezem, jakož i údaje, které osvětlují v širších souvislostech nalezené řešení a možné aplikace.
Způsob podle předmětu tohoto vynálezu umožňuje inhibici proliferace buněk tím, že buňky vystaví terapeutickému množství protilátky schopné vazby na DR5. Předmět tohoto vynálezu umožňuje získat farmakologický prostředek, který obsahuje terapeutické množství monoklonální protilátky aktivní proti DR5, farmaceuticky přijatelný nosič a zásobník na protilátku a nosič. Předmět tohoto vynálezu také umožňuje získat protilátku rozpoznávající DR5 použitelnou pro přípravu terapeutického činidla pro selektivní · · « 9 » « * · * · 4 · • · • · • · · · · · ·
* » « í · »
apoptosu abnormálních nebo dysregulovaných buněk.
Protilátka interaguje s ligandem receptoru faktoru nekrosy nádorů, jako je DR4, DR5, DcRl, DcR2 a OPG, a indukuje apoptosu v buňkách exprimujících takový receptor. Tato protilátka je schopná selektivně se vázat na agonistický nebo antagonistický epitop ligandu receptoru faktoru nekrosy nádorů.
Předmět tohoto vynálezu umožňuje léčbu onemocnění spojených s apoptosou způsobem, který zahrnuje exponování cílových tkání s onemocněním spojeným s apoptosou terapeutickému množství protilátky.
Fúzní protein obsahuje antigenní aminokyselinovou sekvenci TRAIL receptoru tvořenou alespoň deseti bázemi, navázanou na imunoglobulinový protein nebo jeho fragment schopný vyvolat imunitní reakci u jedince.
Předmět tohoto vynálezu umožňuje provádět způsob pro genovou terapii, při kterém je cílová buňka transfektována sekvencí nukleové kyseliny TRAIL receptoru v expresním vektoru tak, že TRAIL receptor je exprimován na cílové buňce. Cílová buňka je potom vystavena působení protilátky, která se selektivně váže na TRAIL receptor.
Nalezené řešení poskytuje sekvence nukleové kyseliny a aminokyselinové sekvence kódující těžké a lehké řetězce imunoglobulinů protilátky selektivní pro DR5 a také vektory, které obsahují sekvence nukleové kyseliny a hostitelské buňky transformované uvedeným vektorem.
Předmětný vynález využívá hostitelské buňky produkující humanizované TRA-8.
Způsob pro produkci humanizované DR5 protilátky spočívá v tom, že hostitelská buňka je transformována sekvencí nukleové kyseliny kódující humanizované lehké řetězce imunoglobulinu a ·>»· humanizované těžké řetězce imunoglobulinu a potom je inkubována po předem určenou dobu.
Způsob pro inhibici buněčné proliferace zahrnuje kontaktováni cilové buňky s farmaceuticky účinným množstvím humanizované DR5 protilátky.
Předmět tohoto vynálezu umožňuje vyrobit komerční kit pro indukci smrti buněk, který obsahuje humanizované TRA-8 protilátky selektivní pro DR5, balený ve vhodném zásobníku společně s návodem k použití.
Popis obrázků na připojených výkresech
Obr. 1. Charakterizace TRA-8. (a) Vazebná specificita TRA-8:
Westernová hybridizace (horní panel): Rekombinantní fúzní proteiny TNFR rodiny sondované TRA-8 nebo anti-lidským IgG. Dráha 1: DR5/hIgGl fúzní protein (imunogen); Dráha 2: DR4/hIgGl (TRAIL-R1); Dráha 3: DR5/hIgGl; Dráha 4: TRAIL-R3 (DcR-1)/hlgGl; Dráha 5: TRAIL-R4 (DcR-2)/hlgGl; Dráha 6, CD95/hIgGl; Dráha 7:
• · « « · ·
-10 — solubilní TNFRI. ELISA analýza (dolní panel): Čísla jamek odpovídají číslům v Westernové hybridizaci s výjimkou jamky 8, která je myší DR5/hIgGl fúzní protein, (b.) Vazebná aktivita solubilních TRAIL a TRA-8 k DR5 a DR4: ELISA plotny se potáhly DR5/hIgGl (levý panel) nebo DR4IhIgGl (střední panel) a potom se inkubovaly s TRAIL nebo TRA-8. (c.) Analýza průtokovou cytometrií povrchové exprese DR5. Cos-7 buňky transfektováné pcDNA3 expresním vektorem obsahujícím kompletní DR5 cDNA (plný histogram), DR4 cDNA (prázdný histogram, plná čára) nebo prázdným vektorem (prázdný histogram, čárkovaná čára). 48 hodin po transfekci se buňky barvily TRA-8 a potom PE-konjugovaným anti-myším IgGl. (d.) Imunohistochemická reaktivita pro DR5 in šitu. Cytospin řezy Cos-7 buněk transfektovaných DR5 expresním nebo kontrolním vektor se barvily TRA-8 ve 48 hodině po transfekci. (e.) Smrtící aktivita TRA-8: Jurkat buňky se inkubovaly s uvedenými koncentracemi TRA-8. Životaschopnost buněk se stanovila ATPLite, MIT a Pl testy po kultivaci přes noc. Výsledky ATPLite a MIT testů jsou prezentovány v procentech vzhledem ke kontrolnímu mediu, a výsledky PT testu jsou prezentovány jako procento Pl negativních buněk (f.) Westernová hybridizace aktivace caspas: Jurkat buňky se inkubovaly s 500 ng/ml TRA-8 po uvedenou dobu. Buněčné lyzáty se separovaly 15% SDS-PAGE, přenesly se na membránu a sondovaly se protilátkami proti caspase. Šipky ukazují odštěpené podjednotky každé caspasy. (g.) Test inhibice caspas: Jurkat buňky se inkubovaly přes noc s 50 ng/ml TRA-8 za přítomnosti různých koncentrací uvedených inhibitorů caspas. Životaschopnost buněk se určila ATPLite testem.
Obr. 2. Exprese DR5 na povrchu buněk a citlivost na
DR5-zprostředkovanou apoptosu. Normální T a B lymfocyty, čerstvě izolované z periferní krve, T lymfocyty (a a a'), gliomové buňky (b a b'), buňky karcinomu prostaty (c) a B lymfocyty (d) se inkubovaly s TRA-8 nebo myší IgGl kontrolní protilátkou a potom
J 4 ♦ · ·» · » · „11 s anti-mysím IgGl konjugovaným s PE. Prázdné histogramy , Z reprezentuji kontrolní i^otypové protilátky a plné histogramy reprezentují TRA-8 barvení. Apoptosa byla stanovena ATPLite testem po inkubaci přes noc se solubilním TRAIL (prázdná kolečka) nebo TRA-8 (plná kolečka), jak je uvedeno na a, b' a d.
Obr. 3a': T lymfocytární linie U937 se inkubovala s TRA-8 nebo myší IgGl kontrolní protilátkou. Apoptosa se stanovila ATPLite testem po inkubaci přes noc se solubilním TRAIL (prázdná kolečka) nebo TRA-8 (plná kolečka).
Obr. 3: Gliomová buněčná linie (b) a buněčná linie karcinomu prostaty (c) se inkubovaly s TRA-8 nebo myší IgGl kontrolní protilátkou. Apoptosa se stanovila ATPLite testem po inkubaci přes noc se solubilním TRAIL (prázdná kolečka) nebo TRA-8 (plná kolečka).
Obr. 4 je série grafů ukazující životaschopnost buněk pro lidské Jurkat-buňky po expozici uvedeným koncentracím (A) protilátkám TRA-1, -8 a -10 a (B) TRAIL za přítomnosti fixních koncentrací protilátek podle předkládaného vynálezu dle obr. 4A;
Obr. 5. Exprese DR5 v normální a nádorové tkáni: Homogenizáty normálních a nádorových tkání se sondovaly TRA-8 a vyvíjely se pomocí chemiluminiscence, (a.) Westernová hybridizace DR5 proteinu v normálních tkáních: dráha 1: játra, dráha 2: mozek, dráha 3: plíce, dráha 4: ledviny, dráha 5: slezina, dráha 6: varlat; dráha 7: vaječníky; dráha 8: srdce, dráha 9: pankreas. b. Westernová hybridizace DR5 proteinu v nádorových tkáních. Membrány pro nádorové tkáně obsahovaly nádory vaječníků (dráha 1), plic (dráha 2), jater (dráha 3), rekta (dráha 4), čípku děložního (dráha 5), kůže (dráha 6), varlat (dráha 7), štítné žlázy (dráha 8), dělohy (dráha 10), žaludku (dráha 11), laryngofaryngu (dráha 12) ♦ · · · · · · • ··· · · ·»· · • ··»»»·· · · · · • · · · · · · • · · ·····
-12 a pankreasu (dráha 13). In šitu imunohistochemické vyšetření normálních lidských tkání (c) a nádorových tkání (d.). Zmrazené řezy byly imuno-barveny TRA-8.
Obr. 6. Tumoricidní aktivita TRA-8. SCID myším se podkožně inokulovaly 1321N1 buňky. Myším se intravenosně podala jedna dávka 100 ug TRA-8 druhý den po naočkování nádoru (a.), nebo se jim podaly tři dávky 100 ug TRA-8 od 7 dne po naočkování nádoru (b). Růst nádoru se stanovil zvážením a histologickým vyšetřením za použití H&E barvení. Fotografie ukazují růst nádorů u kontrolních myší, ale ne u myší léčených TRA-8 (c., horní panel), a H&E barvení nádoru (c., dolní panel). SCID myši se injekčně intravenosně podalo 106 Jurkat-buněk a léčily se jednou dávkou TRA-8 v den 2 po injekci. O sedm dnů později se odebraly buňky sleziny, nabarvily se protilátkou proti lidskému CD3 a analyzovaly se průtokovou cytometrií (d.), nebo imunohistochemicky (e).
Obr. 7 ukazuje povrchovou expresi DR5 u RA (A) a OA (B) synoviálních buněk. 1 X 106 primárně kultivovaných synoviálních buněk se barvilo afinitně-přečistěným TRA-8 a potom kozí anti-myší IgGl protilátkou konjugovanou na PE. 10000 živých buněk se analyzovalo FACSvantage.
Obr. 8 je série fotografií ukazujících životaschopnost buněk jako funkci TRAIL a TRA-8 indukované apoptosy reprezentativních kmenů RA (A) a OA (B) synoviálních buněk s různými koncentracemi rekombinantního solubilního TRAIL (prázdná kolečka) nebo afinitně-přečistěným TRA-8 (plná kolečka). Životaschopnost buněk je procento cpm ošetřených buněk versus cpm něošetřených buněk.
Obr. 9 je série grafů ukazujících závislost DR5-zprostředkované apoptosy RA synoviálních buněk na caspase. RA synoviální buňky (RA5 12) se inkubovaly s 50 ng/ml solubilního Fas ligandů (prázdné » 9
- 13 čtverečky), anti-Fas protilátky (CH-11) (plné čtverečky), solubilního TRAIL (prázdná kolečka), nebo anti-DR5 protilátky (TRA-8) (plná kolečka) za přítomnosti různých koncentrací inhibitorů caspas. Po kultivaci přes noc se životaschopnost buněk stanovila pomocí ATPLite.
Obr. 10A je test posunu v elektroforetickém gelu ukazující aktivaci Nfkappa-b. RA1016 buňky se inkubovaly s 20 ng/ml TNF-a, 50 ng/ml solubilního TRAIL nebo 50 ng/ml TRA-8 po uvedenou dobu před tím, než se zpracovaly elektroforesou. Obr. 1OB a C jsou grafy ukazující produkci MMP-1 a MMP-3. 1 X 106/ml uvedených RA synoviálních buněk se inkubovalo uvedenými koncentracemi TNF-a (prázdná kolečka), TRAIL (prázdné trojúhelníčky) nebo TRA-8 (plná kolečka). Po kultivaci přes noc se odebraly supernatanty kultur. Koncentrace MMP v supernatantech kultur se určily ELISA.
Obr. 11. TRA-8 neindukuje hepatocelulární toxicitu, (a.) Normální jaterní tkáně neexprimují DR5. Parafínové řezy dvou normálních jaterních tkání, jednoho hepatocelulárního karcinomu a cytospinový přípravek HepG2 buněk se připravily pro H&E barvení, a příslušné zmrazené řezy se barvily TRA-8. (b.) analýza průtokovou cytometrií povrchové exprese DR5. Hepatocyty, izolované ze dvou normálních jaterních tkání a z tkáně hepatocelulýárního karcinomu a HepG2 'a buňky se barvily TRA-8, anti-Fas protilátkou (DX2) nebo igíotypovou kontrolní protilátkou. Plné histogramy ukazují TRA-8 nebo DX2 , , z.
barveni, a prázdné histogramy jsou příslušné i^otypove kontroly.
Obr. 12. TRAIL, ale ne TRA-8, indukuje hepatocelulární toxicitu. Čerstvé normální lidské hepatocyty se kultivovaly v Hepatocyte Kultury Medium, (a.) Apoptosa hepatocytů se indukovala 1 ug/ml solubilního TRAIL plus zesítovací činidlo nebo TRA-8 po uvedenou dobu, životaschopnost buněk se stanovila pomocí ATPLite. Výsledky jsou uvedeny jako procento životaschopných buněk ve srovnání » · ♦ « » · * t • · · · ·· • · · · · · ·· · • ·**»»·· · · · • · · · · · • · · 4 ·· · ·
- 14 kontrolním mediem. Šrafováné sloupce ukazují TRAIL a plné sloupce ukazují TRA-8. (b.) Kondenzovaná jádra hepatocytů se barvila Hoechst 33352 a analyzovala se průtokovou cytometrií. (c.) Efekt cykloheximidu na apoptosu hepatocytů. Hepatocyty se kultivovaly v kontrolním mediu nebo s 1 ug/ml TRAIL nebo TRA-8 za přítomnosti (plné sloupce) nebo nepřítomnosti (prázdné sloupce) 1 ug/ml cykloheximidu po dobu 8 hodin. Životaschopnost buněk se stanovila pomocí ATPLite. Výsledky jsou uvedeny jako průměr + SEM pro tři kultury ve dvou pokusech, (d.) Srovnání citlivosti normálních hepatocytů na DR5 a Fas-zprostředkovanou apoptosu. Čerstvě izolované hepatocyty se inkubovaly s uvedenými koncentracemi solubilního TRAIL, TRA-8, solubilního FasL nebo s anti-Fas mAb CH11 po dobu 6 hodin. Životaschopnost buněk se stanovila pomocí ATPLite testu. Výsledky jsou uvedeny jako procento životaschopných buněk ve srovnání s kontrolním mediem. Pro normální hepatocyty jsou uvedeny průměr + SEM pro čtyři normální jedince. Výsledky pro buňky hepatocelulámího karcinomu od jednoho jedince a pro HepG2 buňky jsou uvedeny jako průměr pro tři kultury.
Obr. 13. TRAIL indukuje hepatitidu. B6 myši se intravenosně naočkovaly 109 pfu adenovirového vektoru kódujícího kompletní lidský TRAIL pod kontrolou”Tet-on transkripčního elementu. TRAIL exprese se indukovala uvedenými dávkami tetracyklinu. (a.) Northernova hybridizace lidské TRAIL exprese v játrech. 24 hodin po naočkování vektoru a indukci tetracyklinem se celková RNA izolovala z jater a sondovala se lidskou TRAIL cDNA nebo 3-aktinem. (b.) Sérové koncentrace AST. 24 hodin po transdukci TRAIL se určily sérové koncentrace AST. (c.)
TRAIL-zprostředkovaná smrt hepatocytů infikovaných adenovirovým vektorem: B6 myši se intravenosně naočkovaly tetracyklinem-indukovatelným adenovirovým vektorem. 48 hodin po naočkování se hepatocyty od naočkovaných a nenaočkovaných kontrolních myší izolovaly a inkubovaly se s uvedenými koncentracemi TRAIL po dobu 8 hodin (levý panel). Životaschopnost hepatocytů se stanovila pomoci ATPLite testu. Myším, naočkovaným adenovirovým vektorem stejně jako výše, se o 48 později intravenosně podalo 10 ug solubilního lidského TRAIL 48 hodin. Sérové koncentrace AST se měřily za 24 hodin po injekci TRAIL (pravý panel), (d. a e.) Histologická analýza jaterního poškození indukovaného TRAIL. Játra se odebrala za 24 hodin (d.) nebo 7 dnů (e.) po transdukci TRAIL. Parafínové řezy se barvily H&E a fotografovaly se při 100X (horní panel) a 400X (dolní panel) zvětšení.
Obr. 14 je série grafů ukazujících, že aktivované T lymfocyty a B lymfocyty přečištěné z lidských PBMC exprimují zvýšené koncentrace DR5, jak bylo zjištěno průtokovou cytometrií pro klidové (prázdné) a aktivované (šrafováné) buňky.
Obr. 15 je graf životaschopnosti v závislosti na koncentraci TRA-8 pro přečištěné T lymfocyty a B lymfocyty z obr. 14, které byly stimulovány po dobu 48 hodin s anti-CD3 nebo anti-u, s aktivovanými buňkami a blasty odebranými podle různé density v Ficoll-Paque. Životaschopnost se určila pomocí ATPLite testu.
Obr. 16 je histogram a graf průtokové cytometrie ukazující CD3 expresi v lymfocytární populaci pro NOD/SCID myši bez NK buněk, kterým byly injekčně podány lidské PBMC a TRA-8 nebo IgG (kontrola).
Obr. 17 ukazuje CD3 a TUNEL barvené buněčné mikrofotografie pro tkáně myší sleziny z příkladu 13.
Obr. 18 ukazuje grafy cytotoxicity pro buňky chronické lymfolytické leukemie (CCL) a normální lidské B lymfocyty za přítomnosti TRA-8, BIS VIII, a ejjich kombinace.
» 9
Podrobný popis vynálezu
Selhávání deplece buněk je způsobeno defekty systémů indukujících apoptosu, například defekty v expresi nebo funkci ligandu, receptoru nebo intracelulárních regulačních nebo efektorových molekul. Předkládaný vynález poskytuje způsob pro korekci defektních systémů indukce apoptosy, stejně jako způsob pro hodnocení specifických defektů v daných defektních systémech indukce apoptosy.
Předkládaný vynález se týká nové třídy monoklonálních protilátek, které mají selektivní in vivo a in vitro aktivitu indukující apoptosu proti specifickým TRAIL receptorům, včetně DR5, DR4, DcRl a DcR2. Předkládaný vynález je použitelný jako činidlo pro výzkum signalizace při apoptose, stejně jako v terapii při ovlivnění buněk exprimujících TRAIL receptory, mezi které patři například různé nádorové buňky a synoviální buňky při autoimunitních onemocněních s dysregulací systémů apoptosy a abnormální proliferací. Protilátky podle předkládaného vynálezu jsou specifické ve vazbě na určité typy TRAIL receptorů navzdory homologii mezi těmito protilátkami. Protilátky podle předkládaného vynálezu by měly indukovat apoptosu pouze buněk exprimujících cílový TRAIL receptor, nebo alternativně, měly by blokovat TRAIL apoptosu buněk exprimujících cílový receptor.
Anti-DR5 monoklonální protilátky podle předkládaného vynálezu slouží jako účinný induktor apoptosy buněk exprimujících DR5 in vitro a jako účinný induktor apoptosy in vivo. Humanizované fragmentární CDR sekvence přenesené na humanizované protilátkové skelety a fúzní protein anti-DR5 protilátek podle předkládaného vynálezu vykazují podobné apoptotické vlastnosti.
Dosud nejsou dostupné žádné monoklonální protilátky, které by • »*« se vázaly na povrchové DR5 a indukovaly apoptosu buněk exprimujících DR5 in vitro a in vivo za nepřítomnosti zesilovacího činidla. Předkládaný vynález zahrnuje anti-DR5 protilátky účinné jako terapeutické činidlo ve zvířecích modelech onemocnění, jako jsou zvířata s xenotransplantáty, nebo in vivo. Ačkoliv byl solubilní TRAIL prokázán jako účinný v indukci apoptosy nádorových buněk in vivo, byla apoptotická aktivita velmi nízká a bylo nutné opakované podání vysokých dávek (13). TRA-8, jedna ze série anti~DR5 protilátek podle předkládaného vynálezu, je farmaceuticky účinná u zvířat nesoucích lidský DR5 transgen a také je použitelná při přípravě modelu pro výzkum úlohy DR5 a TRAIL.
Protilátka podle předkládaného vynálezu namířená proti TRAIL receptoru je v předkládaném vynálezu získána z pokusného zvířete. Humanizací protilátky podle předkládaného vynálezu s cílem zachování vazebné aktivity pro receptor za snížení imunitní reakce u člověka se získá humanizovaná protilátka proti TRAIL receptoru použitelná jako terapeutické agonistické nebo antagonistické činidlo pro daný TRAIL receptor. Protilátka podle předkládaného vynálezu je použitelná jako in vivo terapeutické činidlo, protože není nutné sekundární zesítění anti-TRAIL receptorové protilátky.
Předkládaný vynález není omezen na jedinou anti-TRAIL receptorovou protilátku mající agonistický nebo antagonistický apoptotický účinek. Místo toho se použijí dvě nebo více anti-TRAIL receptorových protilátek, které se aplikují do buněčné kultury in vitro nebo do jedince in vivo pro dosažení synergního účinku. Například, gliomová buněčná linie U87 a hematopoetické buněčné linie U937 a Molt-4 reagují na synergní aplikaci agonistických anti-DR4 a anti-DR5 protilátek, zatímco agonistická anti-DR5 protilátka samostatně má pouze omezený efekt v indukci apoptosy.
í t
-18 1'íX
Dále, antagonistické anti-TRAIL receptorové protilátky/fílavní význam v předkládaném vynálezu tehdy, když se protilátka specificky váže na falešné receptory DcRl, DcR2 nebo OPG. Selektivní blokování falešných receptorů protilátkou podle předkládaného vynálezu má vliv na buňky exprimující falešné receptory tím, že posouvá vazebnou rovnováhu TRAIL směrem ke TRAIL receptorům schopným přenosu apoptotického signálu. Tak v jiné kombinované teg^rpii podle předkládaného vynálezu protilátky vážící se na falešné receptory sensitizují exprimující buňky na agonistický apoptotický signál vzešlý z vazby na TRAIL receptor.
V jiném provedení poskytuje předkládaný vynález způsob pro hodnocení agonistických a antagonistických epitopů daného TRAIL receptorů. Dále, polymorfismy mezi jedinci asociované s daným TRAIL receptorem mohou být hodnoceny podle předkládaného vynálezu za použití panelu monoklonálních protilátek majících různý variabilní nebo CDR region. Charakteristický panel monoklonálních protilátek poskytuje možnost definování agonistických a antagonistických epitopů a polymorfismů. Proto je panel monoklonálních protilátek podle předkládaného vynálezu použitelný při vyhledávání léků a/nebo při testování jedinců na rizikovost vzniku onemocnění.
Ještě další provedení předkládaného vynálezu zahrnuje fúzní proteiny obsahující antigenní fragment TRAIL receptorů navázaný na imunoglobulinový protein, polypeptid nebo jeho fragment. Fragment TRAIL receptorů je definován jako fragment obsahující dostatečný počet baží pro vyvolání imunogenní reakce k přirozenému TRAIL receptorů exprimovanému na povrchu buněk jedince. Fragment TRAIL receptorů obsahuje alespoň deset aminokyselin. Imunoglobulinový fúzní protein nebo jeho fragment je zde definován jako fragment obsahující přirozený nebo syntetický proteinový nebo polypeptidový segment obsahující dostatečný počet aminokyselinových baží pro » ·
-19 aktivaci imunogenní kaskády u jedince. Imunogen podle předkládaného vynálezu obsahující fúzi fragmentu TRAIL receptoru a imunoglobulinového fragmentu je použitelný při terapii in vivo pro indukci protilátek proti TRAIL receptoru u jedince in šitu.
V ještě dalším provedení je předkládaný vynález použitelný jako genová terapie. V genové terapii podle předkládaného vynálezu jsou cílové buňky transfektované vektorem s expresibilní sekvencí odpovídající TRAIL receptoru. Vektorem je běžný vektor a je vybrán podle citlivosti cílových buněk na vektor. Mezi příklady vektorů pro genovou terapii patří adenovirový vektor, pAdCMVS. Po cíleném podání do buněk nebo tkání exprimujících transfektováný TRAIL receptor jsou buňky vystaveny protilátce podle předkládaného vynálezu specifické pro vazbu na transfektováný TRAIL receptor. Předpokládá se, že anti-TRAIL receptorové protilátky jsou bud agonistické, nebo antagonistické, podle požadovaného terapeutického efektu.
Protilátky podle předkládaného vynálezu jsou také použitelné společně se senzibilizačním činidlem. Senzibilizátor je zde definován jako jakýkoliv stimul, který indukuje apoptosu, včetně ultrafialového záření, organických molekul, specificky ze třídy bisindolmaleimidů, těžkých kovů a volných radikálů.
V kontextu s terapií malignit je TRA-8 schopna indukovat apoptosu většiny TRAIL-sensitivních nádorových buněk cestou závislou na caspasách za nepřítomnosti sekundárního zesíténí. TRA-8 vykazuje silnou tumoricidní aktivitu in vivo. Schopnost TRA-8 indukovat apoptosu většiny TRAIL-sensitivních buněk potvrzuje, že DR5 samostatně je dostatečný pro spuštění apoptosy. Většina zde popsaných nádorových buněk exprimuje na svém povrchu DR5 a jejich citlivost na TRA-8 indukovanou apoptosu je paralelní s jejich citlivostí na TRAIL, což naznačuje, že DR5 je primární death receptor pro TRAIL-zprostředkovanou apoptosu ve většině nádorových buněk. Proto odlišná exprese DR5 v normálních a nádorových buňkách způsobuje selektivitu TRAIL-zprostředkované apoptosy. TRA-8 obchází falešné receptory za indukce TRAIL-zprostředkované apoptosy. Pouze menšina TRAIL resistentních nádorových buněk je sensitivní na TRA-8, což naznačuje, že falešné receptory nemají hlavní úlohu v rezistenci nádorových buněk na TRAIL-zprostředkovanou apoptosu.
Ačkoliv dřívější pokusy ukázaly, že systémové podání solubilní formy TRAIL u zvířat indukuje regresi nádorů bez toxicity (3,4,22), membránová forma lidského TRAIL indukuje jaterní toxicitu u myší, jak je zde dokázáno. Nicméně, hepatální toxicita TRAIL je mnohem nižší než hepatální toxicita Fas ligandu, jak je demonstrováno nižší citlivostí normálních hepatocytů na TRAIL-indukované poškození ve srovnání s Fas ligandem a chyběním letality TRAIL in vivo. Proto je titrace TRAIL použitelná v protinádorové terapii.
Jak je zde popsáno, nepřítomnost významnější úrovně exprese DR5 proteinu v normálních hepatocytech je asociovaná s rezistencí hepatocytů na TRA-8 indukovanou apoptosu. Zesítění DR5 pomocí monoklonální protilátky je nedostačující pro organizování homopolymerních forem death receptorů schopných spouštět apoptosu. Experimenty na kosmanech neukázaly žádnou hepatální toxicitu po podání TRA-8. Proto je agonistická monoklonální anti-DR5 protilátka pravděpodobně více selektivní a bezpečnější jako terapeutické činidlo než solubilní TRAIL.
Jako skríningový test je předkládaný vynález vhodný pro detekci malých ložisek maligních buněk, které mohou stále ještě mít normální morfologii. Barvení řezů lidských nádorových buněk, včetně karcinomu plic, prostaty a jater, značenou protilátkou • ·
3 » · » ·
- 21 podle předkládaného vynálezu, snadno identifikuje nádorové buňky. Bylo zjištěno, že tyto nádorové buňky exprimují velmi vysoké množství DR5 ve srovnání s normálními buňkami stejného typu. Tak je předkládaný vynález použitelný jako citlivá vyšetřovací metoda pro vyhledávání časných stadií maligních nádorů ve tkáních, včetně alespoň plic, prostaty a jater. Vynález popisuje terapeutický způsob pro inhibici abnormální buněčné proliferace spojené s nemocemi, jako jsou některé nádory a lymfatické leukemie.
Předkládaný vynález je popsán podrobně zejména na anti-lidské DR5 monoklonální protilátce označené jako TRA-8, mající ATCC přírůstkové č. PTA-1428. Předpokládá se, že techniky a výsledky popsané pro agonistickou monoklonální protilátku proti lidskému DR5 označenou jako TRA-8 jsou aplikovatelné antagonistické DR5 protilátky, stejně jako na protilátky namířené proti DR4, DcRl a DcR2, působící agonisticky a antagonisticky.
Úroveň exprese apoptotických receptorů, jako je Fas, nekoreluje nutně s citlivostí buněk na apoptosu. Pro TRAIL-zprostředkovanou apoptosu se předpokládá, že exprese falešných receptorů pro TRAIL ovlivňuje citlivost buněk. Dále, předpokládá se, že DR5 musí být -pre- asociován s DR4 pro účinný přenos apoptotického signálu přes FADD a caspasu 8. Dostupnost agonistické monoklonální anti-DR5 protilátky umožňuje hodnocení regulace DR5 signalizace a její relativní úlohy v TRAIL-zprostředkované apoptose. Srovnání citlivosti buněk na TRA-8-zprostředkovanou apoptosu s jejich citlivostí na TRAIL-zprostředkovanou apoptosu umožňuje výzkum úlohy DR5 ve TRAIL-zprostředkované apoptose a mechanismů, které mohou ovlivňovat citlivost buněk.
Tato výhoda obecně platí pro humanizované anti-DR5 protilátky podle předkládaného vynálezu. Molekulární klon protilátka k DR-5 se připravil známými technikami, jak je podrobně popsáno • · » • ·
- 22 v následujících příkladech. Rekombinantní DNA techniky (33) se použily pro přípravu konstruktu sekvence nukleové kyseliny kódující molekulu monoklonální protilátky nebo jejího regionu pro vazbu antigenu.
Předkládaný vynález umožňuje konstrukci humanizovaných anti-TRAIL receptorových protilátek, u kterých je nepravděpodobné, že by indukovaly lidské anti-myší protilátky (zde dále označované jako HAMA) (34), za zachování efektorových funkcí protilátky. Termíny lidské a humanizované, v souvislosti s protilátkami, označují jakékoliv protilátky, u kterých se předpokládá, že budou indukovat terapeuticky tolerovatelnou slabou imunogenní reakci u člověka.
Předkládaný vynález poskytuje anti-DR5 protilátky, humanizované anti-DR5 protilátky, těžké a lehké řetězce TRA-8 imunoglobulinů a humanizované těžké a lehké řetězce imunoglobulinů. Některé zkrácení těchto proteinů nebo genů je provedeno za účelem získání regulačních nebo enzymatických funkcí pro kompletní sekvenci proteinu nebo genu. Například, kódující sekvence nukleové kyseliny může být pozměněna substitucemi, adicemi, delecemi nebo multimerní expresí, za zisku funkčně ekvivalentních proteinů nebo genů. V důsledku degenerace kódujících sekvencí nukleové kyseliny mohou být v předkládaném vynálezu použity jiné sekvence, které kódují v podstatě stejné aminokyselinové sekvence, jako jsou sekvence přirozených proteinů. Sem patří, například, sekvence nukleové kyseliny obsahující celou nebo část sekvence nukleové kyseliny kódující výše uvedené polypeptidy, které jsou pozměněny substitucemi různých kodonů, které kódují funkčně ekvivalentní aminokyselinové zbytky v sekvenci, čímž je dosaženo silentní změny. Předpokládá se, že nukleotidová sekvence imunoglobulinů podle předkládaného vynálezu toleruje variace v homologii sekvence až do 2sj%, jak se vypočte za použití standardních způsobů • · « · · · • ·
- 23 • · · • · • ··· · ·«·· *£.’···· «·· • » 9 9 99
9 9 9 99 9 9 (Current Methods in Sequence Comparison and Analysis” Macromolecule Sekvenováním and Syntézy, Selected Methods and Applications, str. 127-149, 1998, Alan R. Liss, lne.), pokud atková varianta vytváří protilátky, které rozpoznávají TRAIL receptor DR5. Například, jeden nebo více aminokyselinových zbytků v polypeptidové sekvenci může být substituován jiným aminokyselinovým zbytkem s podobnou polaritou, který účinkuje jako funkční ekvivalent, což vede k silentní alteraci. Substituce v aminokyselinách v sekvenci mohou být vybrány z jiných členů ve skupinách, kam daná aminokyselina náleží. Například, mezi nepolární (hydrofobní) aminokyseliny patří alanin, leucin, isoleucin, valin, prolin, fenylalanin, tryptofan a methionin. Mezi polární neutrální aminokyseliny patří glycin, serin, threonin, cystein, tyrosin, asparagin a glutamin. Mezi aminokyseliny s pozitivním nábojem (bazické) patří arginin, lysin a histidin. Mezi aminokyseliny s negativním nábojem (acidické) patří kyselina asparagová a kyselina glutamová. Předkládaný vynález také zahrnuje proteiny nebo jejich fragmenty nebo deriváty, které jsou odlišně modifikovány během nebo po translaci, například glykosylací, proteolytickým štěpením, vazbou na protilátkovou molekulu nebo jiné buněčné ligandy, atd. Dále, rekombinantní vektor kódující sekvenci nukleové kyseliny anti-DR5 protilátky podle předkládaného vynálezu může být upraven tak, aby bylo modifikováno zpracování nebo exprese vektoru.
Dále, sekvence nukleové kyseliny kódující inhibitor může být mutována in vitro nebo in vivo pro vytvoření a/nebo narušení translace, iniciace, a/nebo terminace sekvence nebo pro vytvoření variací v kódujících regionech a/nebo pro vytvoření nových míst pro restrikční endonukleasy nebo pro zničení existujících míst, pro usnadnění dalších modifikací in vitro. Mohou být použity techniky pro mutagenesi známé v oboru, včetně in vitro místně cílené mutagenese, J. Biol. Chem. 253:6551, za použití Tab linkerů
- 24 (Pharmacia), a podobně.
Data z rentgenové krystalografie ukazují, že protilátky se skládají do forem s dlouhou cylindrickou strukturou složenou ze dvou vrstev antiparalelních b-listů, který se každý skládá ze tří nebo čtyř b-řetezců. Ve variabilních regionech tvoří tři smyčky z každé V domény H a L řetězce dohromady vazebné místo pro antigen. Každá z těchto smyček se označuje jako region určující komplementaritu (CDR). CDR mají nejvyšší variabilitu v aminokyselinové sekvenci z protilátky. Části variabilního regionu, které nejsou částí CDR, se označují jako pracovní regiony (FR regiony) a podílí se na zachování struktury CDR. Výhodně jsou všechny CDR z dané protilátky přeneseny na akceptorovou protilátku, pro zachování vazebného regionu pro epitop TRAIL receptoru. Předpokládá se, že přenesení části celkového počtu CDR do donoru je účinné. Je třeba si uvědomit, že přenesení znamená nahrazení, zbytku za zbytek, jedné aminokyseliny nebo regionu za jiný. Nicméně, příležitostně, zejména při přenášení regionu, může být jeden nebo více zbytků přidáno nebo vynecháno nebo substituováno, a takové delece a inserce, stejně jako vhodná náhrady a inverze, jsou v oboru známé.
Protilátka podle předkládaného vynálezu se získá, například, přenesením každého CDR L řetězce a H řetězce monoklonální protilátky proti TRAIL receptoru na příslušný CDR region lidské protilátky, čím se dosáhne humanizace myší monoklonální protilátky účinné proti TRAIL-receptoru.
Protilátkové fragmenty, které obsahují idiotyp molekuly, se také získají a použijí za použití známých technik. Například takové fragmenty obsahují anti-TRAIL receptorový (AB)2 fragment, který může být získán trávením molekuly protilátky pepsinem, AB' fragmenty protilátky proti TRAIL receptoru připravené redukcí •· •· •· d » « «· , > · ·· e ·9 •3 » bit »
b 9 > 9
9« •· •« •C » · disulfidových můstků fragmentu (AB')2 proti TRAIL receptor, a protilátkové fragmenty získané zpracováním protilátky papainem a redukčním činidlem.
Konkrétně, anti-DR5 monoklonální protilátka TRA-8 může být získána kultivací hybridomu, který může být získán imunizací myši lidským DR5 a následným fúzováním buněk sleziny nebo buněk lymfatické uzliny myši s myšími myelomovými buňkami.
Příprava monoklonální protilátky ilustrativně zahrnuje následující kroky:
a) přečištění biomakromolekuly pro použití jako antigen;
b) přípravu buněk produkujících protilátky, nejprve imunizací zvířat injekcí antigenu, potom odběrem krve od zvířete a testováním titru protilátek, pro určení doby odběru sleziny;
c) přípravu myelomových buněk;
d) fúzováním buněk produkujících protilátky a myelomových buněk;
e) selekci hybridomu produkujícího požadované protilátky;
f) přípravu j ediného buněčného klonu (klonování);
g) volitelně kultivaci hybridomových buněk, nebo chov zvířat, kterým byly hybridomové buňky transplantovány, pro velkoobjemovou přípravu monoklonální protilátky; a
h) testování biologických aktivit a specificity, nebo testování vlastností jako markerového činidla, pro takto získanou monoklonální protilátku.
Postup přípravy anti-DR5 monoklonální protilátky je podrobně popsán dále s odkazem na výše uvedené kroky. Způsob přípravy protilátky podle předkládaného vynálezu je pouze ilustrativní a není limitující pro předkládaný vynález. Mohou být použity jiné postupy nebo modifikace způsobu, například za použití buněk produkujících protilátky jiných než jsou buňky sleziny a myelomu.
« · * > 3 · • · • ’* • « · 9 »9 • ··· · ·9 9 9
9 9 9 9 9 9 9 · 99 • « « t ·9
9 9 » 99 9 9 (a) Příprava antigenu
Rekombinantní protein (dále rekombinantní lidský DR5), účinný jako antigen se získá transfekcí QBI-293A buněk expresním vektorem pAdDR5-IgG pro fúzní protein obsahující extracelulární doménu lidského DR5 a Fc region lidské IgGl protilátky (dále IgG), (cf. PTA-1428) a tento se exprimuje za použití ADENO-Quest kitu (Quantum Biotecbnologies lne., Canada), a odběrem částečně rf* X přečištěného produktu exprese!. Pla$mid pAdDR5-IgG se konstruuje insercí DNA kódující lidský DR5 a lidský IgG fúzní protein do pAdCMV5,což je expresní vektor pro zvířecí buňky. Jiné materiály, jako je DNA kódující DR5, vektor, a hostitel, mohou být také použity.
Lidský DR5 a IgG fúzní protein produkovaný v supernatantu kultury QBI-293A buněk transfektovaných vektorem pAdDR5-IgG může být částečně přečištěn ProteinA-Sepharosovou afinitní chromatografíí nebo ProteinG-Sepharosovou afinitní chromatografíí, nebo iontoměničovou chromatografíí za použití Resource Q kolony (obchodní název; Pharmacia).
Alternativně se jako antigen použije přečištěný DR5 získaný z buněčných membrán lidské buněčné linie. Dále, protože primární struktura DR5 je známá (Sřvv.. PTA-1428), může být peptid obsahující aminokyselinovou sekvenci SEQ ID No. 1 syntetizován chemicky za použití známých způsobů, jako je Sangerúv způsob, a může být potom použit jako antigen.
(b) Příprava buněk produkujících protilátky
Myš se imunizuje imunogenem získaným v kroku (a), ve směsi s adjuvans, jako je Freundovo kompletní nebo nekompletní adjuvans > » * i » « ' · »
* * · • ♦· • ·· • ··
- 27 nebo kamenec. Mezi vhodná pokusná zvířata patří, například, krysy, morčata, králíci, psi, kuřata, koně, prasata, krávy a ovce.
Mezi vhodné způsoby podání pro imunizaci pokusných zvířat patří subkutánní, intraperitoneální, intravenosní, intradermální a intramuskulární injekce, kdy výhodné jsou subkutánní a intraperitoneální injekce.
Imunizace jsou výhodně provedeny podáním jedné dávky, nebo se podá několik dávek ve vhodných intervalech (výhodně 1 až 5 týdnů). Imunizovaná zvířata se sledují na titry protilátky v séru a zvíře s dostatečně vysokým titrem protilátek se vybere jako zdroj buněk produkujících protilátky. Výběr zvířete se vysokým titrem vede ke zvýšení účinnosti dalšího procesu. Buňky pro následnou fúzi se obvykle odeberou od zvířete 3 až 5 dnů po poslední imunizaci.
Způsoby pro testování protilátkových titrů zahrnují různé známé techniky, jako je radioimunotest (dále RIA), enzymový imunotest na pevné fázi (zde dále ELISA), fluorescentní protilátkový test a pasivní hemaglutinační test, kde RIA a ELISA jsou výhodné z důvodu sensitivity detekce, rychlosti a možnosti automatizace.
Stanovení protilátkových titrů může být provedeno, například ELISA, následujícím způsobem. Nejprve se přečištěná nebo částečně přečištěná DR5 adsorbuje na povrch pevné fáze, jako je 96|-jamková
ELISA plotna, potom se provede blokování jakéhokoliv zbývajícího povrchu, na který se DR5 nenavázal, proteinem nepříbuzným s antigenem, jako je hovězí sérový albumin (BSA). Po promytí se povrchy buněk kontaktují se sériové ředěnými vzorky myšího séra pro umožnění vazby anti-DRS protilátky ve vzorcích na antigen. Enzymem značená, anti-myší protilátka, jako sekundární protilátka, se přidá pro navázání na myší protilátku. Po promytí se přidá substrát pro enzym a titr protilátky se hodnotí stanovením změny * · · • « « • · 9 ·
• · ♦ » * · » • ♦ · · « t absorbance v důsledku vývoje barvy způsobeného alterací substrátu.
(c) Příprava myelomových buněk
Buňky ze zavedených myších buněčných linií slouží jako zdroj myelomových buněk, včetně například myší rezistentních na 8-azaguanin, odvozených od BALB/c myelomových kmenů P3X63Ag8U.l (P3-U1) (35), P3/NSI/l-Ag4-l(NS-1) (36), Sp2/0-Agl4 (SP-2) (37), P3X63Ag8.653 (653) (38) a P3X63Ag8 (X63) (39). Vybraná buněčná linie se sériově přenese do vhodného media, jako je 8-azaguaninové medium. 8-azaguaninové medium obsahuje Iscovem modifikované Dulbeccovo medium (zde dále označované jako IMDM) nebo Dulbeccovo modifikované Eagle medium (zde dále označované jako DMEM), RPMI-1640 medium doplněné glutaminem, 2-merkaptoethanolem, gentamicinem, fetálním telecím sérem (zde dále označované jako FCS), a 8-azaguaninem. Buňky se potom přenesou do normálního media, jako je ASF 104 medium (Ajinomoto, K. K.) obsahující 10% FCS, 3 až 4 dnů před fúzí, pro zajištění toho, aby v den fúze bylo přítomno alespoň 2 x 107 buněk.
(d) Fúze buněk
z.
Lymfocyty a pla^matické buňky získané z jakékoliv vhodné části
2.
zvířat jsou prekur^orové buňky pro produkci protilátky. Mezi ilustrativní zdroje lymfocytů nebo buněk patří slezina, lymfatické uzliny, periferní krev nebo jakákoliv vhodná kombinace těchto zdrojů, kde buňky sleziny jsou nejběžnějším zdrojem.
Po poslední dosycovací injekci se tkáň, ve které jsou přítomny buňky produkující protilátky, odstraní od myši majících předem určený titr protilátek. V současnosti doporučovaná technika pro fúzi buněk sleziny a myelomových buněk připravených v kroku c)
- 29 — využívá polyethylenglykol.
Technika fúze zahrnuje promytí slezinných a myelomových buněk bezsérovým mediem (jako je RPMI 1640) nebo fosfátem pufrovaným salinickým roztokem (zde dále označovaným jako PBS) tak, že poměr počtu buněk sleziny k myelomovým buňkám je přibližně mezi 5:1 a 10:1, a potom odstředění. Po odstranění supernatantu a dostatečném rozvolnění peletovaných buněk se po kapkách za míšení přidá 1 ml bezsérového media obsahujícího 50j% (hmot./obj.) polyethylenglykolu (molekulová hmotnost 1000 až 4000). Potom se pomalu přidá 10 ml bezsérového media a provede se odstředění. Supernatant se opět odstraní a peletované buňky se suspendují ve vhodném množství HAT media obsahujícího roztok hypoxantinu, aminopterinu a thymidinu (zde dále označované jako HAT) a myší interleukin-2 (zde dále označovaný jako IL-2). Suspenze se potom rozdělí do jamek kultivačních ploten (též jednoduše ploten) a provede se inkubace za přítomnosti 5% obj./obj. CO2 při 37 °C po dobu přibližně 2 týdnů, s přidáváním HAT media podle potřeby.
(e) Selekce hybridomů ·?.
Když je použitý myelomový kmen rezistentní na 8-azaguanin, tj., je deficitní v enzymu hypoxanthin-guanin- fosforibosyltransferase (HGPRT), jsou jakékoliv nefúzované myelomové buňky a jakékoliv myelom-myelom fúze nemohou přežívat v HAT mediu. Na druhé straně, vzájemné fúze buněk produkujících protilátky, stejně jako hybridomy buněk produkujících protilátky s myelomovými buňkami přežívat mohou, s tím, že poslední uvedené mají pouze omezenou dobu života. Proto pokračující inkubace v HAT mediu vede k selekci pouze požadovaných hybridomů.
Získané hybridomy se kultivují do kolonií, které se potom přenesou do HAT media bez aminopterinu (HI medium). Potom se
9 «9 * • · ··· « · <
* · · · 9 ·«!« « ·« ♦ · » Μ » · · » ··· · •·· ·» 9 ·· « * ♦ · 9 9 9 9 99 9
- 30 odeberou podíly supematantu kultury pro určení titru anti-Fas protilátky, například pomocí ELISA. Když se výše uvedený fúzní protein použije jako ELISA antigen, je také nutné eliminovat klony produkující protilátku, která se specificky váže na Fc region lidského IgGl. Přítomnost nebo nepřítomnost takového klonu může být potvrzena například ELISA za použití Fas-IgGl nebo IgGl jako antigenu.
(f) Klonování
Hybridomy, u kterých byla prokázána produkce specifických protilátek, za použití způsobu podobného způsobu použitému v kroku b) pro stanovení titru protilátek, se potom přenesou na jinou plotnu pro klonování. Vhodné způsoby klonování zahrnují: techniku limitního ředění, ve které jsou hybridomy naředěny na jednu buňku na jamku plotny a potom se provede kultivace; techniku měkkého agaru, ve které jsou kolonie získány po kultivaci v měkkém agaru; a způsob využívající mikromanipulátoru pro separaci jednotlivých buněk pro kultivaci; a techniku roztřiď a klonuj, ve které jsou jednotlivé buňky separovány třídičem buněk.
J Postup klonování pro, například, limitní ředění se opakuje
Aty .A
2f4^krát pro každou jamku za určování titru protilátky a klony mající stabilní protilátkové titry se selektují jako hybridomy produkující anti-DR5 monoklonální protilátky. Hybridomy produkující anti-myší DR5 protilátky se selektují podobným způsobem za zisku buněčné linie produkující anti-DR5 monoklonální protilátky.
Myší-myší hybridom TRA-8, který je základem pro protilátky podle předkládaného vynálezu, byl uložen v Američan Type Culture Collection 1.3.2000, a má přírůstkové č. PTA-1428. Proto při přípravě protilátky za použití myšího-myšího hybridomů TRA-8 nebo i » Λ I i i
9
- 31 — jakéhokoliv již připraveného hybridomu lze použit postupu začínajícího od kroku (g), s vynecháním kroků (a) až (f).
(g) Kultivace hybridomu pro přípravu monoklonální protilátky
Hybridom získaný klonováním se potom kultivuje v normálním mediu, ne v HT mediu. Velkoobjemová kultura se připraví v kultivací v otočném válci, za použití velkoobjemových nádob, nebo kultivací za odstřelování. Potom se získá supematant z velkoobjemové kultury a ten se přečistí vhodným způsobem, jako je gelová filtrace, která je dobře známá odborníkům v oboru, za zisku anti-DR5 monoklonální protilátky, která je základem pro protilátky podle předkládaného vynálezu. Hybridom může být také kultivován intraperitoneálně v syngenních myších, jako jsou BALB/c myši nebo flu/flu myši, pro získání ascitu obsahujícího anti-DR5 monoklonální protilátky ve velkých množstvích. Komerčně dostupné kity pro přečištění monoklonálních protilátek (například, MAbTrap GII Kit; Pharmacia) se použijí pro přečištění získaných protilátek.
Monoklonální protilátky připravené výše uvedeným způsobem mají vysokou specificitu pro lidské DR5.
(h) Test pro monoklonální protilátky
Vhodné způsoby identifikace isotypu a podtřídy monoklonální protilátky zahrnují Ouchterlonyho metodu, ELISA a RIA. Výhodně se pro identifikaci použije komerční kit, jako je Mouše Typer Kit (obchodní název; BioRad).
Kvantifikace proteinu může být provedena za použití Folin-Lowryho způsobu, nebo výpočtem podle absorbance při 280 nm (1,4 (OD280) = imunoglobulin 1 mg/ml).
• · · · » · • · • · · • · .» · » • · · · ♦ ·» · β < '
- 32 —
Identifikace epitopu rozpoznávaného monoklonální protilátkou se provede následujícím způsobem. Nejprve se připraví různé částečné struktury molekuly, kterou monoklonální protilátka rozpoznává. Částečné struktury se připraví způsobem, při kterém jsou různé částečné peptidy molekuly připraveny synteticky technikou oligopeptidové syntézy, nebo způsobem, ve kterém je DNA kódující požadovaný částečný polypeptid inkorporována do vhodného expresního plasmidu a je exprimována ve vhodném hostiteli, jako je E. coli, za produkce peptidů. Oba způsoby mohou být použity v kombinaci. Například mohou být známými technikami genového inženýrství připraveny série polypeptidů s vhodně redukovanou délkou, od C- nebo N-konce antigenního proteinu. Stanovením toho, které fragmenty reagují s protilátkou se získá přibližná představa o místě epitopu.
Epitop se přesněji identifikuje syntézou různých menších oligopeptidů nebo mutantních peptidů za použití techniky oligopeptidové syntézy pro určení vazebných vlastností peptidů vzhledem k anti-DR5 monoklonální protilátce, která je základem pro přípravu protilátek podle předkládaného vynálezu a kompetitivní inhibice vazby peptidů na antigen monoklonální protilátkou. Komerčně dostupné kity, jako je SPOTs Kit (Genosys Biotechnologies, lne.) a série multihrotových kitů pro peptidovou syntézu založenou na technice multihrotové syntézy (Chiron Corp.) mohou být použity pro získání větších množství oligopeptidů.
Protilátka podle předkládaného vynálezu má různé funkční vlastnosti a) až f) popsané dále, které byly potvrzeny způsoby popsanými dále.
a) Specifická vazba TRA-8 na buňky exprimující lidské DR5.
» · « a ·
Jedinečným rysem protilátek podle předkládaného vynálezu je schopnost vazby na buněčné povrchové DR5. Tato vlastnost je prokázána analýzou buněk exprimujících DR5 pomocí průtokové cytometrie. Nejprve se specifická vazba na DR5 na povrchu buněk potvrdí pomocí COS-7 buněk transfektovaných kompletní cDNA kódující lidské DR5. Přesněji, TRA-8 pouze rozpoznává COS-7 buňky transfektované DR5, ale ne prázdným kontrolním vektorem nebo vektorem kódujícím DR4. Za druhé se testují tři různé druhy lidských maligních nádorových buněk: hematopoetické, gliomové a karcinomu prostaty. Většina těchto transformovaných nádorových buněk exprimuje významné koncentrace DR5 na svém povrchu, ačkoliv se exprese značně liší. Za třetí se testují dva panely lidských primárních synoviálních fibroblastů od pacientů s RA a OA. Všechny RA synoviální buňky exprimují významně vyšší množství DR5 ve srovnání s OA buňkami.
b) Indukce apoptosy lidských maligních nádorových buněk in vitro za nepřítomnosti zesítění.
Schopnost protilátek podle předkládaného vynálezu rozpoznávat TRAIL receptor a přímo indukovat apoptosu maligních lidských nádorových buněk se určí testem životaschopnosti buněk (ATPLite) během in vitro kultivaci buněk s různými koncentracemi protilátky, zejména TRA-8. Většina nádorových buněk je citlivá na TRA-8 indukovanou apoptosu. Pro některé buňky vykazuje TRA-8 silnou proapoptotickou aktivitu, například je TRA-8 schopen indukovat apoptosu lidských Jurkat buněk v koncentracích v řádu pg/ml. Významné je to, že TRA-8 indukovaná apoptosa nevyžaduje zesítění, a u většiny buněk má TRA-8 silnější proapoptotickou aktivitu než rekombinantní solubilní TRAIL za přítomnosti zesilovače.
c) Tumoricidní aktivita TRA-8 in vivo.
»
- 34 Tumoricidní aktivita TRA-8 se hodnotí ve dvou modelech SCID/lidské nádorové buňky. Za prvé, SCID myším se intravenosně naočkovaly lidské leukemické Jurkat buňky a aplikovala se jediná dávka (100 ug) TRA-8. Výsledky ukazují, že většina implantovaných Jurkat buněk byla eliminována z periferní krve a sleziny díky aplikaci TRA-8, jak bylo určeno analýzou průtokovou cytometrií a in šitu imunohistochemickým barvením Jurkat buněk. Za druhé, lidské astrocytomové buňky 1321N1 se podkožně naočkovaly SCID myši a myši s nádory se léčily jednou dávkou TRA-8. Růst implantovaných 1321N1 buněk je významně inhibován u myší léčených TRA-8, jak bylo určeno podle velikosti nádorů histologickou analýzou.
d) Identifikace RA synoviálních buněk pomocí TRA-8
Primární synoviální buňky izolované od 8 pacientů s RA a 4 s OA se testovaly na povrchovou expresi DR5. TRA-8 je schopna pozitivně barvit všechny RA buňky, ale nebarví OA buňky. Tak se RA odliší od OA podle povrchové exprese DR5, která se detekuje TRA-8.
e) Indukce apoptosy u RA synoviálních fibroblastů pomocí TRA-8
Schopnost TRA-8 indukovat apoptosu RA synoviálních buněk se určí testem životaschopnosti buněk během in vitro kultivace kultury za přítomnosti různých koncentrací TRA-8. Všechny RA buňky mají vysokou až střední úroveň citlivosti na 100 ng/ml TRA-8. Naopak, všechny OA buňky jsou v podstatě resistentní na apoptosu indukovanou TRA-8. Významné je, že TRA-8 vykazuje lepší proapoptotickou aktivita u RA synoviálních buněk něž solubilní TRAIL se zesilovacím činidlem. Dále, ve srovnání s anti-Fas protilátkou (CH-11) vykazuje TRA-8 lepší selektivitu pro RA synoviální buňky.
f) TRA-8 neindukuje produkci MMP v RA synoviálních buňkách « i i *
- 35Protože je TRA-8 schopen indukovat aktivaci NF-kappab v RA synoviálních buňkách, stejně jako TNF-alfa, určil se vliv TRA-8 na produkci MMP1 a MMP3 synoviálními buňkami. Zatímco TNF-alfa indukuje zvýšení MMP závislé na dávce, je TRA-8 neschopen indukovat jakoukoliv produkci MMP, a v určitých koncentracích TRA-8 mírně snižuje produkci MMP v RA synoviálních buňkách.
g) TRA-8 indukuje aktivaci více caspas
Protože mají caspasy zásadní roli v indukci apoptosy, určovala se schopnost TRA-8 indukovat aktivaci caspas na lidských Jurkat buňkách. Když se Jurkat buňky inkubovaly s nízkou dávkou (50 ng/ml) TRA-8, tak se aktivace caspasy 8, caspasy 9 a caspasy 3 pozorovala již za 15 minut po inkubaci, jak bylo prokázáno Westernovou hybridizací a analýzou štěpení caspas. Ve smyslu doby, množství a účinnosti v aktivaci caspas mají protilátky podle předkládaného vynálezu, včetně protilátky TRA-8, mnohem lepší aktivitu než jakékoliv jiné známé proapoptotické protilátky, jako je protilátka proti lidskému Fas (CH-11).
Proto je protilátka podle předkládaného vynálezu substance mající schopnost selektivně indukovat apoptosu patogenních buněk, jak je ukázáno v efektech (a) a (g). Proto je protilátka podle předkládaného vynálezu použitelná jako profylaktické a terapeutické činidlo pro léčbu onemocnění asociovaných s neadekvátním přežíváním buněk nebo nevhodnou proliferací buněk, které souvisí s dysregulací systémů indukujících apoptosu, včetně Fas/Fas ligand systému.
Schopnost protilátky podle předkládaného vynálezu indukovat apoptosu je potvrzena kultivací buněk, jako je buněčná linie lidské leukemie Jurkat (Američan Type Culture č. TIB-152) • ·
- 36a astrocytomová buněčná linie 1321N1 v mediu, do kterého se přidá testovaný vzorek, a určením přežívání buněk, například za použití ATPLite testu.
Protilátky podle předkládaného vynálezu, zejména anti-DR5 protilátky mající téměř stejnou imunogenicitu pro člověka jako lidské protilátky, se použijí jako činidla pro profylaxi nebo léčbu onemocnění asociovaných s nevhodným přežíváním nebo proliferací buněk, včetně onemocnění spojených s dysregulací systémů indukujících apoptosu u autoimuních onemocnění, jako je systémový lupus erythematosus, Hashimotova nemoc, revmatoidní arthritis, reakce štěpu proti hostitely, Sjogrenův syndrom, perniciosní anemie, Addisonova nemoc, sclerodermie, Goodpasterův syndrom, Crohnova nemoc, autoimunitní hemolytická anemie, sterilita, myasthenia gravis, roztroušená sklerosa, Basedowa nemoc, thrombopenická purpura, insulin-dependentní diabetes mellitus, alergie; atopie; arteriosklerosa; myokarditida; kardiomyopatie; glomerulonefritida; hypoplastická anemie; rejekce po orgánové transplantaci a různé malignity plic, prostaty, jater, vaječníků, lymfatické tkáně a prsů.
Takové profylaktické nebo terapeutické činidlo může být podáno v různých formách. Mezi vhodné způsoby podáni patří orální podání, jako je podání ve formě tablet, kapslí, granulí, prášků a sirupů, nebo parenterální podání, jako je podání ve formě injekce, kapající infuse a čípků.
Protilátka nebo terapeutické činidlo může být podáno orálně, rektálně, intracisternálně, intraventrikulárně, intrakraniálně, intrathekálně, intravaginálné, parenterálně (intravenosně, intramuskulárně nebo podkožně), lokálně (ve formě zásypu, mastí nebo kapek), intraperitoneální injekci, transdermálně, inhalačně nebo jako bukální nebo nasální spray. Přesná dávka protilátky nebo
9 9 4
4
4 ·
4 4 4*
4
- 37 terapeutického činidla se ude lišit mezi jedinci, podle věku, hmotnosti a celkového zdravotního stavu jedince, závažnosti léčeného onemocnění, lokalizaci a velikosti nádoru, konkrétní použité sloučeniny, způsobu podání, a podobně. Vhodná dávka může být určena odborníkem v oboru za použití pouze běžného experimentování. Typické jednotlivé dávky protilátky jsou v rozmezí 0,1+-10,000 mikrogramů, výhodně mezi 1 a 100 mikrogramů. Obvyklé koncentrace protilátky v nosiči jsou v rozmezí od 0,2 do 2000 nanogramů na podaný mililitr.
Podle zamýšleného způsobu podání mohou být protilátky nebo terapeutického činidla ve farmaceutických prostředcích ve formě pevných, semi-solidních nebo kapalných dávkových forem, jako jsou, například, tablety, čípky, pilulky, kapsle, prášky, kapaliny nebo čípky, výhodně ve formě dávkových jednotek vhodných pro podání přesné dávky. Prostředky budou obsahovat účinné množství vybraného substrátu v kombinaci s farmaceuticky přijatelným nosičem a dále mohou obsahovat další lékařská činidla, farmaceutická činidla, nosiče nebo ředidla. Termín farmaceuticky přijatelný označuje materiál, který není biologicky nebo jinak nežádoucí, který může být podán jedinci společně s vybraným substrátem bez toho, že by způsobil nežádoucí biologické reakce nebo že by interagovat škodlivým způsobem s jakoukoliv jinou složkou farmaceutického přípravku, ve kterém je obsažen.
Prostředky vhodné pro parenterální injekční podání mohou obsahovat fyziologicky přijatelné sterilní vodné nebo nevodné roztoky, disperze, suspenze nebo emulze, a sterilní prášky pro rekonstituci na sterilní injekční roztoky nebo disperze. Příklady vhodných vodných nebo non-vodných nosičů, ředidel, rozpouštědel nebo vehikul zahrnují vodu, ethanol, polyoly (propylneglýko1, polyethyleneglykol, glycerol, a podobně), jejich vhodné směsi, rostlinné oleje (jako je olivový olej) a injekční organické » * estery, jako je ethyloleát. Správná tekutost může být udržována například pomocí potahovacích činidel, jako je lecitin, dodržením správné velikosti částic v případě disperzí a použitím surfaktantů.
Prostředky mohou také obsahovat adjuvans, jako jsou konzervační, smáčivá, emulgační a dávkovači činidla. Prevence růstu mikroorganismů může být zajištěna pomocí různých antibakteriálních a antimykotických činidel, například, parabenů, chlorobutanolu, fenolu, kyseliny sorbové, a podobně. Může být také žádoucí použít činidla upravující izotonicitu, například, sacharidy, chlorid sodný a podobně. Prodloužená absorpce injekčních farmaceutických forem může být dosažena za použití činidel prodlužujících absorpci, jako je například aluminum-monostearát a želatina.
Mezi pevné dávkové formy pro orální podání patří kapsle, tablety, pilulky, prášky a granule. V takových dávkových formách je aktivní sloučenina smísena s alespoň jednou inertní běžnou přísadou (nebo nosičem), jako je natrium-citrát nebo fosforečnan vápenatý, nebo (a) plnivy nebo činidly zvětšujícími objem, jako je například škrob, laktosa, sacharosa, glukosa, manitol a kyselina křemičitá, (b) pojivý, jako je například, karboxymethylceluloae, algináty, želatina, polyvinylpyrrolidon, sacharosa a arabská klovatina, (c) zvlhčovacími činidly, jako je například glycerol, (d) činidly podporujícími rozpadavost, jako je například agar-agar, uhličitan vápenatý, bramborový nebo tapiokový škrob, kyselina alginová, některé komplexní silikáty a uhličitan sodný, (e) činidly zpomalujícími tvorbu roztoku, jako je například paraffin, (f) akcelerátory absorpce, jako jsou například kvartem! ammoniové sloučeniny, (g) smáčivými činidly, jako je například, cetylalkohol a glycerol-monostearát, (h) adsorbenty, jako je například kaolin a bentonit, a (i) lubrikačními činidly, jako je
- 39 například talek, kalcium- stearát, síran hořečnatý, pevné polyethylenglykoly, lauryl síran sodný, nebo jejich směsi, v případě kapslí, tablet a pilulek mohou dávkové formy také obsahovat pufrovací činidla.
Pevné přípravky podobného typu mohou být také použity jako náplně do kapslí z tuhé a měkké želatiny, za použití přísad jako je laktosa nebo mléčný cukr, stejně jako polyethylenglykoly s vysokou molekulovou hmotností, a podobně.
Pevné dávkové formy, jako jsou tablety, dražé, kapsle, pilulky a granule, mohou být připraveny také s potahy, jako jsou enterální potahy a jiné potahy dobře známé v oboru. Tyto potahy mohou obsahovat činidla zabraňující průniku světla a mohou mít také takové složení, že uvolňují aktivní sloučeninu nebo sloučeniny v některých částech zažívacího traktu kontrolovaným způsobem. Příklady přípravků, které mohou být použity pro tento účel, jsou polymemí substance a vosky. Aktivní sloučeniny mohou být také v mikroenkapsulované formě, s jednou nebo více z výše uvedených přísad.
Kapalné dávkové formy pro orální podání zahrnují farmaceuticky přijatelné emulze, roztoky, suspenze, sirupy a elixíry. Kromě aktivní sloučeniny mohou kapalné dávkové formy obsahovat inertní ředidla běžně používaná v oboru, jako je voda nebo jiná rozpouštědla, solubilizační činidla a emulgační činidla, jako je například ethylalkohol, isopropylalkohol, ethylkarbonát, ethylacetát, benzylalkohol, benzylalkohol, benzylbenzoát, propylenglykol, 1,3-butyleneglykol, dimethylformamide oleje, zejména olej z bavlníkových semen, podzemnicový olej, olej z kukuřičných klíčků, olivový olej, ricinový olej a sezamový olej, glycerol, tetrahydrofurfuryl- alkohol, polyethyleneglykoly a estery sorbitanu a mastných kyselin nebo směsi těchto substancí « · • · * « · » · · « · · · • · * · • · · ♦ · a podobně.
Kromě takových inertních ředidel mohou prostředky také obsahovat adjuvans, jako jsou smáčivá činidla, emulgační a suspendační činidla, sladidla, chuťová korigens a činidla upravující vůni.
Suspenze mohou, kromě aktivní sloučeniny, obsahovat suspendační činidla, jako jsou například ethoxylované isostearylalkoholy, polyoxyethylensorbitolové a sorbitanové estery, mikrokrystalická celulosa, metahydroxid hlinitý, bentonit, agar-agar a tragant, nebo směsi takových substancí, a podobně.
Prostředky pro rektální podání jsou výhodně čípky, které mohou být připraveny smísením sloučeniny podle předkládaného vynálezu s vhodnými nedráždivými přísadami nebo nosiči, jako je kakaové máslo, polyethyleneglykol nebo vosk pro čípky, které jsou pevné při teplotě místnosti, ale kapalné při tělesné teplotě a proto tají v rektu nebo vagíně a uvolňují aktivní složku.
Dávkové formy pro lokální podání sloučeniny podle předkládaného vynálezu jsou masti, zásypy, spraye a inhalační prostředky. Aktivní složka se smísí za sterilních podmínek s fyziologicky přijatelným nosičem a jakýmkoliv konzervačním činidlem, pufrem nebo hnacím plynem. Oční přípravky, oční masti, prášky a roztoky také spadají do rozsahu předkládaného vynálezu.
Termín farmaceuticky přijatelné soli, estery, amidy a proléčiva označuje karboxylatové soli, adiční soli s aminokyselinami, estery, amidy a proléčiva sloučeniny podle předkládaného vynálezu, které jsou, podle lékařských znalostí, vhodné pro použití v kontaktu se tkáněmi pacientů bez toxicity, iritace, alergické reakce a podobně, za zajištění rozumného poměru « · ·
-41 — přínos/riziko, a které jsou účinné pro zamýšlené použiti, stejně jako obojetné formy sloučeniny podle předkládaného vynálezu, pokud jsou možné. Termín soli označuje relativně netoxické, anorganické a organické adiční soli sloučeniny podle předkládaného vynálezu s kyselinami. Soli mohou být připraveny in šitu během konečné izolace a přečištění sloučeniny nebo samostatně reakcí přečištěné sloučeniny ve formě volné baze s vhodnou organickou nebo anorganickou kyselinou a izolováním takto vzniklé soli. Reprezentativní soli jsou hydrobromid, hydrochlorid, síran, kyselý síran, nitrát, acetát, oxalát, valerát, oleát, palmitát, stearát, laurát, boritan, benzoát, laktát, fosfát, tosylát, citrát, maleát, fumarát, sukcinát, tartrát, naftylát, mesylát, glukoheptanoát, laktobionát, methansulfonát a laurylsulfonát, a podobně. Tyto soli mohou obsahovat kationty na bázi alkalických kovů nebo kovů alkalických zemin, jako je sodík, lithium, draslík, vápník, hořčík, a podobně, stejně jako netoxické ammoniové, kvarterní ammoniové a aminové kationty, včetně například ammonia, tetramethylammonia, tetraethylammonia, methylaminu, dimethylaminu, trimethylaminu, triethylaminu, ethylaminu, a podobné. (Viz, například, S.M. Barge a kol., Pharmaceutical Salts, J. Pharm. Sci., 1977, 66: 1-19; zde uvedeno jako odkaz.)
Termín proléčivo označuje sloučeniny, které jsou rychle transformované in vivo za vzniku původní sloučeniny výše uvedeného vzorce, například, hydrolýzou v krvi. Podrobný popis je uveden v I. Higuchi a V. Stella, Pro-drugs as Novel Delivery Systems, Vol. 14 of A.C.S. Symposium Series, a v Bioreversible Carriers in Drug Design, ed. Edward B. Roche, Američan Pharmaceutical Association a Pergamon Press, 1987.
Cílová buňka je buňka zvířete, jako je například člověk, primát jiný než člověk, krysa, myš, morče, králík, koza, ovce, kůň, kuře, prase, kosman a fretka.
« · «
* • · • ·
- 42“
Dále, protilátky nebo terapeutická činidla podle předkládaného vynálezu mohou existovat v nesolvatované, stejně jako v solvatované formě s farmaceuticky přijatelnými rozpouštědly, jako je voda, ethanol a podobně. Obecně jsou pro účely předkládaného vynálezu solvatované fromy považovány za ekvivalentní nesolvatovaným formám.
Protilátkové molekuly jsou přečištěny známými technikami, mezi které patří například amino-absorpce nebo amino-afinitní chromatografie, chromátografické techniky, jako je vysokotlaká kapalinová chromatografie, nebo jejich kombinace.
Jiný aspekt předkládaného vynálezu zahrnuje farmaceutický produkt určený pro podání biologicky aktivní protilátky proti TRAIL receptorů nebo humanizované protilátky proti TRAIL receptorů obratlovci. Farmaceutický produkt obsahuje farmaceuticky účinné množství protilátky proti TRAIL receptorů nebo jejího fragmentu a farmaceuticky přijatelný nosič, a sterilní zásobník pro nosič a protilátku.
Ve výhodném provedení předkládaného vynálezu inhibuje farmaceuticky účinné množství anti-DR5 protilátky proliferaci buněk po kontaktu s cílovou buňkou. Farmaceuticky účinným množstvím protilátky rozpoznávající DR5 nebo humanizované protilátky rozpoznávající DR5 je množství podané jedinci, které je dostatečné pro způsobení požadovaného účinku. Požadovanými účinky podání farmaceuticky účinného množství protilátek rozpoznávajících DR5 je smrt cílové buňky, inhibice růstu cílové buňky, stimulace DR5, vazba na DR5 a zvýšení koncentrace nebo aktivity NFkB v cílové buňce. Cílová buňka je buňka, která exprimuje DR5 a mohou jí být například abnormálně rostoucí buňky a nádory, jako jsou papillomy a bradavice; nádory prsu, střeva, hepatomy, leukemie,
- 43 nádory plic, melanom, myelom, osteosarkom, nádor vaječníku, slinivky břišní, hlavy a krku, štítné žlázy, dělohy a nádory mozku, jako jsou astrocytomy. In vivo je cílová buňka buňka jedince s patologickým onemocněním, včetně těch, při kterých je buněčná proliferace abnormální nebo dysregulovaná, jako je tomu při maligních nebo benigních nádorech a revmatoidní artritidě.
V jiném výhodném provedení je cílová buňka také kontaktována s terapeutickým činidlem.
Terapeutickým činidlem je sloučenina nebo přípravek účinný ve zmírnění patologického stavu. Ilustrativním příkladem terapeutického činidla jsou protinádorové sloučeniny.
Protinádorová sloučenina je sloučenina nebo prostředek účinný v inhibici nebo blokování růstu abnormálně rostoucích buněk. Farmaceuticky účinným množstvím protinádorové sloučeniny je množství podané jedinci dostatečné pro způsobení inhibice nebo blokády růstu abnormálně rostoucích buněk. Příklady protinádorových sloučenin jsou: bleomycin, karboplatina, chlorambucil, cisplatina, kolchicin, cyklofosfamid, daunorubicin, dactinomycin, diethylstilbestrol, doxorubicin, etoposid,
5- fluorouracil, floxuridin, melfalan, methotrexát, mitomycin,
6- merkaptopurin, teniposid, 6-thioguanin, vincristin a vinblastin. Další příklady protinádorových sloučenin a terapeutických činidel jsou uvedeny v Měrek Manual of Diagnosis and Therapy, 15th Ed., Berkow a kol., eds., 1987, Rahway, N.J. a Sládek a kol. Metabolism and Action of Anti-Cancer Drugs, 1987, Powis a kol. eds., Taylor a Francis, New York, N.Y.
Protilátky podle předkládaného vynálezu mohou být dále kombinovány s jinými terapeutickými modalitami, jako je chemoterapie a radioterapie v léčbě nádorů, a terapeutická ♦» · • ·· • · »» « · ♦ »»» · » » » ·»· · · * • ♦ · .* ♦ · • · · ♦ · · • ♦ · ♦ 9 · · » ·< *
- 44 — účinnost může být zesílena proapoptotickými sloučeninami, jako je bisindolylmaleimid VIII.
Ve srovnání s dříve publikovanou anti-DR5 protilátkou (24) je proapoptotická aktivita demonstrativni TRA-8 protilátky podle předkládaného vynálezu velmi silná a tato protilátka je schopna indukovat apoptosu Jurkat buněk v koncentracích v řádu pg/ml in vitro a vykazuje lepší in vivo tumoricidní aktivitu ve srovnání s dříve popisovaným solubilním TRAIL. Intravenosní podání jedné dávky TRA-8 je dostatečné pro inhibici růstu jak solidních nádorů, tak hernatopoetických nádorových buněk, zatímco indukce regrese nádoru in vivo za použití solubilního TRAIL vyžaduje mnohem vyšší dávky (500 ug každý den po dobu 10 dnů). Protilátky proti TRAIL receptoru podle předkládaného vynálezu se zdají být stejně bezpečné jako solubilní TRAIL, protože příkladná protilátka TRA-8 neindukuje apoptosu netransformovaných fibroblastů.
Vektory podle předkládaného vynálezu obsahují sekvence nukleové kyseliny kódující těžké nebo lehké řetězce imunoglobulinu anti-DR5 protilátky operativně navázané na regulační element, jako je promotor nebo zesilovač transkripce. Operativní vazba označuje uspořádání nukleotidových sekvencí tak, že tyto sekvence mohou provádět obvyklé funkce. Tak je regulační element operativně navázaný na nukleotidovou sekvenci kódující polypeptide schopen řídit transkripci, replikaci a/nebo translaci polypeptidu. Odborníkům v oboru bude jasné, že jediný vektor volitelné obsahuje kódující sekvence pro těžký a lehký řetězec imunoglobulinu anti-DR5 protilátky.
Následující příklady jsou uvedeny pro ilustraci metod a výsledků předkládaného vynálezu. Tyto příklady nejsou limitující pro předkládaný vynález, ale pouze ilustrují reprezentativní způsoby a výsledky. Tyto příklady nevylučují ekvivalenty « * · ♦
14«»*·· * « i · 1 * t « * * * * ·
- 45 a varianty předkládaného vynálezu, které jsou zřejmé odborníkům v oboru.
Přiklad 1. Příprava DR5 antigenu
1.1 Klonování DR5 cDNA
DNA kódující lidský DR5 protein se klonuje následující RT-PCR metodou za použití:
a) Templát
Celková RNA HeLa buněk se extrahuje za použití TRIzol Reagent (GIBCO BRL). Templátem pro PCR reakci je cDNA, která se získá za použití First-Strand kitu pro syntézu cDNA (Amersham Pharmacia Biotech) podle návodu výrobce kitu.
b) PCR primery
Následující oligonukleotidové primery se syntetizují pro PCR:
5'-gacgatgcccgatctactttaaggg-3' (DR5pl: SEQ ID No. 1); 5'- ccactgggtgatgttggatggg-3' (DR5p2: SEQ ID No. 2);
Pokud není uvedeno jinak, syntetizují se všechny oligonukleotidy v těchto příkladech za použití Lifetechnologies. Všechny oligonukleotidy se uskladní při -20 °C po rozpuštění v destilované vodě.
c) PCR reakce
Složení roztoku pro PCR reakci:
templátová cDNA, 5 ul z celkového objemu reakce 33 ul;
- 46 primer DR5pl, 10 pmol; primer DR5p2, 10 pmol;
x koncentrovaný PCR pufr (obsažený v kitu), 10 ul; dNTP (každý 2,5 mM), 4 ul; a
Taq polymerasa (Promega), 5 jednotek.
Sterilní destilovaná voda se přidá do roztoku do celkového objemu 100 ul. Pokud není uvedeno jinak, jsou dNTP ekvimolární směsí dATP, dCTP, dGTP a dTTP (2,5 mM každý).
PCR reakce se provede následujícím způsobem. Roztok se nejprve zahřívá při 94 °C po dobu 2 minut, a potom se 40^krát opakuje cyklus zahřívání při 94 °C na dobu 30 s, 52 °c po dobu 1 minuty a 72 °C po dobu 3 minut. Po dokončení tohoto postupu se reakční roztok zahřívá při 72 °C po dobu 10 minut.
Takto získané amplifikované DNA fragmenty se separují na 1% agarosovém gelu obsahujícím 0,25 ug/ml ethidiumbromidu. Proužky obsahující požadované DNA fragmenty se vyříznou z gelu a DNA se z nich získá za použití Gene Clean kitu (BIO 101). DNA fragment se klonuje za použití TA Cloning Kitu (Invitrogen, CA). Toto se provede následujícím způsobem.
DNA fragment získaný z PCR reakčního roztoku, spolu s 50 ng pCR2.1 vektoru, který je obsažen v Ta Cloning kitu, se smísí s 1 ul 10X ligasového reakčního pufru (6 mM Tris-HCl (pH 7,5), 6 mM chloridu hořečnatého, 5 mM chloridu sodného, 7 mM beta-merkaptoethanolu, 0,1 mM ATP, 2 mM DTT, 1 mM spermidinu, a 0,1 mg/ml hovězího sérového albuminu), do kterého byly přidány 4 jednotky T4 DNA ligasy (1 ul). Celkový objem směsi se upraví na 10 ul sterilní deionizovanou vodou, a získaný ligasový roztok se inkubuje při 14 °C po dobu 15 hodin. Po této době se 2 ul ligasového reakčního roztoku přidají k 50 ul kompetentních E. coli • « » ·
- 47 — kmene TOP 10F', který je obsažen v Ta Cloning kitu a který se uvede do kompetence podle návodu, a do této směsi se přidají 2 ul 0,5 M beta-merkaptoethanolu, a směs se udržuje na ledu po dobu 30 minut, potom při 42 °C po dobu 30 sekund, a opět na ledu po dobu 5 minut. Potom se do kultury přidá 500 ul media obsahujícího 2% obj./obj. tryptonu, 0,5% hmot./obj. kvasinkového extraktu, 0,05% hmot./obj. chloridu sodného, 2,5 mM chloridu draselného, 1 mM chloridu hořečnatého a 20 mM glukosy (zde dále označované jako SOC medium) a směs se inkubuje po dobu 1 hodiny při 37 °C za třepání. Po této době se kultura rozšíří na L-agarové plotně (1% obj./obj. trypton, 0,5% hmot./obj. kvasinkový extrakt, 0,5% hmot./obj. chlorid sodný, 0,1% hmot./obj. glukosa a 0,6% hmot./obj. bacto-agar (Difco)), obsahující 100 ug/ml. Kolonie resistentní na ampicilin objevivší se na plotně se selektuji a seškrábnou se platinovou kličkou a kultivují se v L-bujonovém mediu obsahujícím 100 ug/ml ampicilinu při 37 °C, přes noc, za třepání při 200 r.p.m. Po inkubaci se buňky odeberou odstředěním a alkalickým způsobem se z nich získá plasmidová DNA. EcoRI-EcoRI DR5 cDNA fragment z takto získaného plasmidu se subklonuje do
z.
pcDNA3 pla$midu (Invitrogen, CA). Kompletní DR5 gen v pcDNA3 se sekvencuje a porovná se s publikovanou sekvencí. Takto získaný plasmid se označí jako plazmid pcDNA3-DR5.
1.2 Konstrukce DR5-IgG expresního vektoru
Pro získání solubilní formy lidského DR5 bez transmembránové domény se konstruoval expresní plafmidový vektor. Tento vektor se navrhl tak, aby kódoval fúzní protein obsahující extracelulární doménu lidského DR5 fúzovanou na lidskou IgGl Fc DNA (41). DNA kódující lidský DR5 bez transmembránové domény se získal následující PCR reakcí.
a) Templát
-48 —
Templát pro PCR reakci byl pcDNA3-DR5.
b) PCR primery
Následující oligonukleotidové primery se syntetizovaly pro PCR:
5'-gacgatgcccgatctactttaaggg-3' (DR5pl: SEQ ID No. 1); 5'-ggatccgtggacacattcgatgtc-3' (DRSp3: SEQ ID No. 3);
Pokud není uvedeno jinak, syntetizují se všechny oligonukleotidy v těchto příkladech za použití Lifetechnologies. Všechny oligonukleotidy se uskladní při -20 °C po rozpuštění v destilované vodě.
c) PCR reakce
Provede se PCR reakce a amplifikované DNA se izolují způsobem podle příkladu 1.1(c).
7Takto získaný plasmid se označí jako plazmid pCR-DR5. BamlII-EcoRI fragment z lidského Fc fragmentu, který se získá z pmFas-hIgGIFc se subklonuje do BamHI a EcoRI multi-klonovacích míst pcDNA3. Takto získaný plazmid se označí jako pcDNAFc. Dále, BamHI-BamHI fragment kódující lidský solubilní DR5 region, který se získá z pCR-DR5, se subklonuje do BamHI místa pcDNAFc plazmidu. Takto získaný plasmid se označí jako plasmid pcDNADR5-Fc. EcoRI fragment kódující lidský solubilní DR5-lidský IgGFc region, který se získá z pcDNADR5-Fc plazmidu se opatří lepivými konci za použití Klenow fragmentu DNA polymerasy (GIBCO BRL) a potom se subklonuje do přenosového vektoru pAdCMVS (Quantum Biotechnologies lne., Canada), který se opatří lepivými konci po tráevní BamHI. Takto získaný pia$mid se označí pAdDR5-Fc.
> ) » •9
9 » ♦ »· * *3
1.3 Exprese a přečištění lidského DR5-IgGl fúzního proteinu
QBI-293A buňky (z ADENO-Quest Kitu) se ko-transfektují pAdDR5-Fc a QBI-virovou DNA (z ADENO-Quest Kitu) za použití ADENO-Quest kitu (Quantum Biotechnologies lne., Canada) podle návodu výrobce. Rekombinantní virové plaky se kultivují a testují se na expresi DR5-IgG fúzního proteinu ELISA analýzou supernatantu. Pozitivní plaky se amplifikují v QBI-293A buňkách a uskladní se při -80 °C jako zásoba virů. 50 disků (150 mm) QBI-293A buněk se transfektuje pAdDR5-Fc rekombinantním virem při 10 m.o.i. (Multiplicity of Infection). Kultivační medium se odebere za 48 hodin po transfekci.
Transfektované buňky mající DR5-IgG gen se kultivují do hustoty buněk 1 x 106 buněk/ml inkubací v 500 ml DMEM (GIBCO) mediu obsahujícím 10% obj./obj. FCS, při 37 °C v atmosféře 5% obj./obj. C02 po dobu 2 dnů. Kultura se potom odstředí (1000 r.p.m., 5 minut) a odebere se supernatant. Přečištění DR5-IgG ze supernatantu se provede za použití ProteinA-Sepharosové CL-4B afinitní chromátografie (Pharmacia) za následujících podmínek:
kolona: ProteinA-Sepharosová CL-4B kolona (velikost kolony 2 ml; Pharmacia);
eluční pufr: 0,1 M glycin (pH 2,4), 0,15 M NaCl; neutralizační pufr: 1M Tris-HCl (pH 8,5).
Po aplikaci veškerého supernatantu do kolony se kolona promyje třikrát 20 ml PBS a potom se lOAkrát přidá 1 ml elučního pufru.
Změří se optická hustota každé eluované frakce (1 ml). Odebere se druhá až pátá frakce (s OD280 0,1) a po přidání 100 ul neutralizačního pufru se eluáty umístí samostatně do dialyzačních zkumavek a eluát se dialyzuje proti 1 litru PBS (pH 7,5) při 4 °C.
« » « · ·
• «· « * ·» * « · · · • *· « · «
Dialyzační pufr se vymění dvakrát.
Eluáty se potom testují na expresi DR5-IgG genového produktu pomocí ELISA. nejprve se 100 ul každé frakce umístí samostatně do jamek 96$jamkové mikroplotny (Costar) a provede se inkubace při 37 °C po dobu 1 hodiny. Po této době se roztok z jamek odstraní
A a plotna se promyje 3^-krát 100 ul/jamku PBS obsahujícím 0,1% obj./obj. Tween 20 (zde dále označovaný jako PBS-Tween). Po promytí se PBS obsahující 2% hmot./obj. hovězího sérového albuminu (zde dále označovaný jako BSA”) přidá v množství 100 ul/jamku a plotna se potom inkubuje při 37 °C po dobu 1 hodiny. Po této době se jamky znovu promyjí 3-krát 100 ul/jamku PBS-Tween, potom se do každé jamky přidá 100 ul/jamku roztoku monoklonální protilátky proti lidskému IgGl ředěné 1000-krát s PBS-Tween a plotna opět inkubuje při 37 °C po dobu 1 hodiny. Jamky se potom promyjí 3-krát 100 ul/jamku PBS-Tween. Potom se přidá 3,3oo,5,5oo-tetramethyl-benzidin (zde dále označovaný jako TMB) kapalný substrát (Sigma) v množství 100 ul/jamku a plotna se nechá stát při teplotě místnosti po dobu 5 minut a potom se reakce ukončí přidáním 100 ul/jamku 0,2N H2SO4. Absorbance každé jamky se odečítá při 450 nm pro určení koncentrace navázané protilátky, za použití absorbance při 650 nm jako kontrolního měření. Absorbance se měří za použití čtečky mikroploten (Molecular Devices).
Produkce DR5-IgGl se potvrdí za použití této ELISA techniky. Molekulová hmotnost exprimovaného DR5-IgGl fúzního proteinu se určí za použití westernové hybridizace, ve které se anti-lidský IgGl mAb (Sigma) použije pro detekci protilátky na gelu.
Molekulová hmotnost exprimovaného DR5-IgGl fúzního proteinu je přibližně 50 kDa. Dosažená čistota je vyšší než 90%, jak se zjistí analýzou na SDS-PAGE a detekcí proteinu barvením Coomassie modří.
Příklad 2. Příprava monoklonálních protilátek proti lidskému
DR5
Μ £ > » * * · • · · · · ‘ « · · a ϊ * ·« e · i ♦ · · · » · ·«t • · · * ·t - • « » · » · · ·
2.1 Imunizace
Samice Balb/c myší (Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME) stáří 6¾¾ týdnů se imunizují afinitně-přečistěným lidským DR5/hIgGl fúzním proteinem. Pro první imunizaci do tlapky se fúzní protein (50 ug) emulsifikuje ve Freundově kompletním adjuvans (Difco, Detroit, MI). Myším se potom podá dosycovací imunizace čtyřmi injekcemi 50 ug fúzního proteinu bez adjuvans každý druhý den. Tři dnypo poslední injekci se lymfocyty z lokálních lymfatických uzlin fúzují s NS-1 myelomovými buňkami a hybridomy se kultivují ve F104 mediu doplněném 10% fetálním telecím sérem. Pozitivní hybridomy se selektují ELISA, při kterém se plotny potáhnou bud 1 ug/ml DR5/hIgGl nebo stejným množstvím Fas/hlgGl jako kontrolou. Isotyp hybridomů se určí ELISA za použití panelu kozích protilátek specifických pro myši Ig isotyp (Southern Biotechnology, Birmingham, AL). Monoklonální protilátky se přečistí afinitní chromatografíi za použití imobilizovaného anti-myší IgGl nebo proteinu G (Sigma).
2.2 Fúze buněk
V den tři po dosycovací injekci se od myší odeberou lokální lymfatické uzliny a umístí se do 10 ml bezsérového RPMI 1640 media (GIBCO BRL) obsahujícího 50 jednotek/ml penicilinu, 50 ug/ml streptomycinu a 300 ug/ml kyseliny L-glutamové, a uzliny se rozruší protlačením přes síto (Cell Kmeneer; Falcon) za použití lžičky. Získaná buněčná suspenze se odstředí pro peletizaci buněk lymfatických uzlin, které se potom promyjí dvakrát bezsérovým RPMI mediem. Promyté buňky se potom resuspendují v bezsérovém RPMI medium a spočítají se.
Mezitím se myelomové NS1 buňky (Američan Type Culture • ·· • * ·· « · « » · « • ·· • · ·
Collection TIB-18) kultivují do buněčné density 1 x 108 buněk/ml v ASF1O4 medium (Ajinomoto, K. K.) obsahujícím 10% obj./obj. FCS (Gibco BRL) (ASF medium se sérem) při 37 °C pod 5% obj./obj. C02, a tyto buňky se podobným způsobem rozruší, promyjí se, resuspendují se a spočítají se.
Množství suspenze NS1 buněk obsahující 3 x 107 buněk se smísí s množstvím suspenze buněk sleziny obsahující 3 x 108 buněk. Získaná směs se odstředí a odstraní se supernatant. Následující kroky fúze buněk se provedou vždy v plastové zkumavce obsahující peletu při 37 °C v lázni s teplou vodou.
ml 50%(hmot./obj.) polyethylenglykolu 1500 (Boehringer Manheim) se pomalu přidá do zkumavky, za míšení pelety za použití konce pipety. Potom se 1 ml bezsérového RPMI media, předem ohřátého na 37 °C, pomalu přidá ve dvou podílech, a potom se provede přidání dalších 7 ml bezsérového RPMI media. Získaná směs se potom odstředí, supernatant se odstraní a za mírného míšení koncem pipety se přidá 10 ml HAT media obsahujícího 10% obj./obj. FCS. Přidá se dalších 20 ml HAT media obsahujícího 10% obj./obj. FCS a suspenze se rozdělí do 96-jamkových mikroploten pro kultivaci buněk při 100 ul/jamku a provede se inkubace při 37 °C v atmosféře 5% obj./obj. C02. Po 7 nebo 8 dnech se 100 ul/jamku čerstvého HAT media použije pro nahrazení media v jamkách vykazujícího nažloutlou barvu. Fúzní buňky z těchto jamek se klonují limitním ředěním, které je popsáno dále.
2.3 Klonování limitním ředěním
Thymy od 4 až 10 týdenních samic BALB/c myší (od Japan SLC, lne.) se odeberou, rozruší se na sítu (Cell Kmeneer; Falcon) jak je popsáno výše, a rozrušené buňky se promyjí dvakrát HT mediem obsahujícím 10% obj./obj. FCS. Množství buněk thymu odpovídající • 4 * ·
4 · * 4 9
- 53 množství od jedné myši se suspenduje v 30 ml HT media obsahujícího 10% obj./obj. FCS za zisku suspenze podpůrných buněk. Fúzní buňky připravené výše v příkladu 2.2 se naředí touto suspenzí podpůrných buněk 10-( až lOO^násobně a dále se ředí sériově suspenzí podpůrných buněk za zisku suspenzí s hustotou fúzních buněk 5, 1 a 0,5 buněk/ml. Takto připravené vzorky se rozdělí do jamek 96-jamkových mikroploten pro kultivaci buněk při 100 ul/jamku a provede se inkubace po dobu 5 dnů při 37 °C v 5% obj./obj. CO2·
2.4 Skríning
Supernatanty kultur hybridomů se testují ELISA za použití ploten potažených bud 1 ug/ml DR5/hIgGl nebo stejným množstvím Fas/hlgGl (41) jako kontrolou. Navázané protilátky se detekují za použití anti-myších imunoglobulinů konjugovaných s křenovou peroxidasou (HRP) (Southern Biotechnology, Birmingham, AL) s TMB (Sigma, St Louis, MI) jako substrátem. Přečištěný DR5-IgGl při koncentraci 1 ug/ml nebo stejné množství Fas-hlgGl se přidá do jamek 96-jamkové ELISA/RIA STRIP plotny (Costar, NY). Plotna se nechá stát při 4 °C přes noc pro umožnění adsorpce proteinu na povrch jamek. Po této době se roztok v jamkách odstraní a každá jamka se promyje 3j-krát PBS-Tween. Potom se 100 ul PBS obsahujícího 1% (hmot./obj.) hovězího sérového albuminu (A3803,
Sigma Chemicals Co.) přidá do každé jamky a plotna se inkubuje při 37 °C po dobu 1 hodiny. Jamky se potom promyjí znova 3-£krát PBS-Tween, a potom se 50 ul supernatantu každé kultury hybridomů přidá do každé jamky. Plotna se potom inkubuje při 37 hodiny a jamky se znovu promyjí 4 ul křenovou imunoglobulinu °C po dobu Po promyt! se myšímu AL), ředěné
Ifkrát PBS-Tween. - - peroxidasou značené protilátky proti (Southern Biotechnology, Birmingham,
1000-krát PBS, přidá na jamku, a plotna se znovu inkubuje při °C po dobu 1 hodiny, a potom se jamky promyjí 4-krát PBS-Tween.
3,3oo,5,5oo-tetramethyl-benzidinový (TMB) kapalný substrát (Sigma) ·» »· <· · • ·· • »· • ·· » » • « · · « Η « * · · » * · ·» »«·· · ··· « i * · * · ♦ · < • ♦ » · » · · ·
- 54 — se potom přidá v množství 100 ul/jamku a plotna se nechá stát při teplotě místnosti po dobu 5 minut a potom s reakce ukončí přidáním 100 ul/jamku 0,2N H2SO4. Absorbance každé jamky při 450 nm (kontrolní při 650 nm) se měří za použití čtečky mikroploten (Molecular Devices) a fúzní buňky se selektují ze vzorku, který má absorbanci (450 nm-650 nm, OD hodnoty; > 0,5) jasně vyšší než je absorbance vzorků, které neobsahují supernatant fúzních buněk (OD hodnoty; 0,03). Dále, supernatanty kultur hybridomů se také funkčně testují měřením proapoptotické aktivity za použití Jurkat buněk. 50 ul RPMI media obsahujícího Jurkat buňky (1000 buněk na jamku) a 5 uM bisindolylmaleimidu VIII (BisVIII, Alexis, San Diego, CA) se přidá do 96-jamkových ploten za přítomnosti 50 ul supernatantů kultur hybridomů. Buňky se kultivují ve zvlhčovaném inkubátoru při 37 °C přes noc. Apoptosa se určí testem na životaschopnost buněk za použití ATPLite kitu podle návodu výrobce (Packard Instruments) a vzorky se počítají za použití TopCounter (Packard Instruments).
2.5 ELISA vazba TRAIL a TRA-8 na receptory
ELISA plotny se potáhnou 2 ug/ml DR4-Ig nebo DR5-Ig fúzním proteinem přes noc. Po blokování 3% BSA se solubilní TRAIL-FLAG nebo TRA-8 přidá při uvedených koncentracích a provede se inkubace při 37 °C po dobu jedné hodiny. Vazba TRAIL nebo TRA-8 se detekuje za použití anti-Flag protilátky konjugované s HRP (Alexis) nebo anti-myšího igGl konjugovaného s HRP (Southern Biotechnology), v příslušném pořadí. Reakce se vyvíjejí za použití TMB substrátového pufru a měří se Benchmark čtečkou mikroploten (BioRad). Kd hodnoty se určí jednocestným modelem vazby nelineární regrese za použití GraphPad Prism softwaru (GraphPad Software, San Diego, CA). Pro kompetitivní ELISA se přidá 100 ng/ml TRAIL-FLAG a provede se inkubace za přítomnosti různých koncentrací of TRA-8. Vazba TRAIL se určí způsobem uvedeným výše.
2.6 Klonování
Kroky popsané v příkladech 2.3 a 2.4 se opakují 5|krát pro buňky selektované v 2.4, což umožní selekci několika hybridomních klonů, z nichž každý produkuje jednu protilátku, která se váže na DR5-IgG, ale ne na Fas-IgG. Takto se získá myší-myší hybridom, označený TRA-8 a produkující protilátku vážící se na DR5-IgG, ale ne na Fas-IgG. Tento hybridom, TRA-8, se uložil v Američan Type Culture Collection 1.3.2000 a byl označen přírůstkovým číslem PTA-1428.
Podtřída protilátky produkované myším-myším hybridomem TRA-8 (dále TRA-8) byla určena jako IgGl, kappa, po testování za použití kitu pro izotypizaci monoklonální protilátky (Pierce).
Za použiti našeho lidského DR5-IgGl fúzního proteinu jako imunogenu se sedm hybridomních klonů získalo prvotním ELISA skríningem, z nichž všechny byly silně pozitivní na DR5-IgG ale ne na Fas-IgG fúzní protein, což ukazuje, že byly získány hybridomy produkující protilátky, které rozpoznávají extracelulární část DR5, ale ne Fc část IgGl (data nejsou uvedena).
2.7 Westernová hybridizace
Filtry pro Westernovou hybridizaci homogenizátů normální lidské a nádorové tkáně se zakoupily od Geno Technology (St Louis, MO). Do každé dráhy se aplikovalo stejné množství proteinu, jak určeno protilátkou proti beta-aktinu. Skvrny se se sondovaly 1 ug/ml TRA-8 přes noc, a potom HRP-konjugovaným kozím anti-myším IgGl (Southern Biotechnology) při teplotě místnosti po dobu 1 hodiny, a vyvíjely se chemiluminiscencí.
« * » ϊ ♦
2.8 In šitu imunohistochemické vyšetření
Lidské tkáně se získaly od Tissue Procurement Center UAB. Zmrazené řezy se fixují v 70% ethanolu, blokují se 10% koňským sérem v PBS, a potom se provede inkubace s 10 ug/ml afinitně-přečištěným TRA-8 při teplotě místnosti po dobu 60 minut. Anti-myší IgG ABC kit s diaminobenzidinem (Vektor, Burlingame, CA) jako kolorimetrickým substrátem se použije pro visualizaci reaktivity.
2.9 Analýza aktivace caspas
Jurkat buňky (lxl06/ml) se inkubují s 500 ng/ml TRA-8. Podíly (30 ug proteinu)buněčného lyzátu se separují na 15% SDS-PAGE, přenesou se na nylonovou membránu, a skvrny se sondují protilátkami proti caspase 8, 9, a 3 (BD Pharmingen, San Diego, CA) a potom HRP-konjugovanou sekundární protilátkou a provede se chemiluminiscentní visualizace štěpených produktů. Sada inhibitorů caspas se zakoupí od R&D Systems (Minneapolis, MN). Každý inhibitor caspas se přidá do kultury v uvedené koncentraci.
Příklad 3. Přečištěni TRA-8 monoklonální protilátky
Myší-myší hybridom, TRA-8, se kultivuje do hustoty buněk 1 x 106 buněk/ml inkubací v 500 ml ASF media obsahujícího 10% obj./obj. FCS, při 37 °C v 5% obj./obj. C02 po dobu 5 dnů. Kultura se potom odstředí (1000 r.p.m., 5 minut) a supernatant se odebere. Přečištění TRA-8 ze supernatantu se provede za použití ProteinG-Sepharosové CL-4B afinitní chromatografie (Pharmacia) za následujících podmínek:
kolona: ProteinG-Sepharosová CL-4B kolona (velikost kolony 2 ml; Pharmacia);
eluční pufr: 0,1 M Glycin (pH 2,4), 0,15 M NaCl;
- 57 — neutralizační: 1M Tris-HCl (pH 8,5).
Po aplikaci veškerého supematantu do kolony se 20 ml PBS promyje 3+»krát a potom se eluční pufr přidá v objemu 1 ml 10+krat. Změří se optická densita pro každou eluovanou frakci (1 ml). Frakce č.2 až č.5 (>OD2qq = 0,1) se odeberou samostatně.
Po přidáni 100 ul neutralizačního pufru se eluáty samostatně vloží do dialyzační zkumavky a eluáty se dialyzují proti 1 litru PBS (pH 7,5) při 4 °C. Dialyzační pufr se vymění dvakrát. Tento vzorek se testuje na aktivitu anti-DR5 protilátky ELISA za použití lidského DR5-IgG fúzního proteinu připraveného výše za použití techniky popsané výše.
Příklad 4. Příprava DR4 antigenu, DR4-IgG expresního vektoru a anti-DR4 monoklonální protilátky
Postupy z příkladů 1-3 se opakují s DR4 templátovou cDNA a primery místo těch, které jsou uvedeny v příkladu 1, za zisku DR4 antigen, který se použije stejně jako v příkladech 1.2-3 pro získání monoklonální protilátky specifické pro DR4.
Příklad 5. Monoklonální protilátky pro DcRl a DcR2
Monoklonální protilátky jsou namířeny proti falešným receptorům DcRl a DcR2 pomocí substituce příslušné cDNA a primerů za zisku příslušných antigenů stejné jako v příkladu 1. Expresní vektory pro DcRl nebo DcR2-fúze s imunoglobulinem G a výsledné přečištěné monoklonální protilátky se připraví stejně jako v příkladech 2 a 3.
Příklad 6. Specificita monoklonální protilátky
- 58 9 ϊ · J f « i i 9» * « Y · · ♦ · » « • « * 4 9 9 9 3» 9^ ·*
9 9 » ♦ » · · 9 9 9 9«>
• 9 » 9 9 99ti
9 9 9 9 9 t 9♦ *
Protože všechny receptory pro TRAIL a jiné proteiny TNFR rodiny vykazují významnou homologii, určí se specificita příkladné protilátky TRA-8 pro DR5 westernovou analýzou za použití dvou různých lidských DR5-IgG fúzních proteinů a solubilních, rekombinantních forem jiných příbuzných proteinů. První DR5-Ig fúzní protein se konstruuje fúzí cDNA ze zbytků 1-180 extracelulární části DR5 a cDNA kódující konstantní region lidského IgGl. Fúzovaná cDNA se klonuje do rekombinantního adenovirového vektoru (Quantum Biotechnogies, lne., Montreal, Canada). Exprimovaný DR5/hIgGl fúzní protein, který má relativní molekulovou hmotnost 50 kDa, se přečistí za použití anti-lidský IgG afinitní kolony (Sigma, St Louis, MO). Pro westernovou analýzu specificity se druhý rekombinantní lidsky DR5/IgGl fúzní protein (aa. 52-212), stejně jako TRAIL-R1, R3 a R4 fúzní proteiny, zakoupí od Alexis. Solubilní formy lidského Fas a TNFR1 se získají od Dr. Carl Edwards z Amgen, lne., Thousands Oaks, CA, USA. Použité solubilní rekombinantní lidské DR4, DcRl, DcR2, TNFR1, R4, a Fas molekuly jsou lidské IgGl fúzní proteiny. 0,5 ug každého proteinu se separuje pomocí 10% SDS-PAGE a přenese se na nitrocelulosovou membránu. Skvrny se blokují 5% sušeným mlékem v PBS při teplotě místnosti po dobu 1 hodiny a sondují se 1 ug/ml přečištěné monoklonální anti-DR5 protilátky (klon: TRA-8) nebo 0,1 ug/ml HRP-konjugované kozí anti-lidským IgG při 4 °C přes noc. Kozí anti-myší IgG konjugovaný s křenovou peroxidasou se použije jako sekundární protilátka pro detekci navázaného TRA-8. Skvrny se vyvíjejí chemiluminiscencí.
Cos-7 buňky transfektované pcDNA3 vektorem (Clontech, Palo Alto, CA) obsahujícím kompletní DR5 nebo DR4 nebo prázdným vektorem se použijí pro analýzu průtokovou cytometrií. Kompletní cDNA kódující lidský TRAIL nebo myší Fas ligand se klonuje do pTRE vektoru za tetracyklinem-řízený promotor (Clontech). Xhol-HindlII fragmenty pTRE-hTRAIL nebo pTRE-mFasL se potom klonují do • ·> 4 · • · ·· 3 · i » · · · ·· • · ·· • « ·· « 9
-59adenovirového přenosového vektoru pAdBN (Quantum Biotechnologies, lne.). 293 hostitelské buňky s ko-transfektují linearizovaným pAd-TRE-hTRAIL nebo pAd-TRE-mFasL a velkým fragmentem DNA adenoviru. Exprese funkčního lidského TRAIL nebo myšího Fas ligandu z plaků rekombinantního viru se testuje za použití a testu uvolňování 51Cr s Jurkat buňkami jako cíly.
TRA-8 reaguje silně s DR5-IgG fúzním proteinem (50 kDa), který se použije pro imunizaci, jak je uvedeno na obr. la, DR5, #1, a slabě s druhým DR5-IgG fúzním proteinem (60 kD), jak je uvedeno na obr. la, DR5, #2. Není pozorovatelná významná vazba TRA-8 na DR4, DcRl, DcR2, Fas (CD95) nebo TNFRI. Tyto výsledky naznačují, že TRA-8 rozpoznává epitopy, které jsou specifické pro DR5, ale nejsou přítomné v jiných členech rodiny.
TRA-8 nereaguje s jinými členy superrodiny TNF receptoru, jako je Fas (CD95) a TNF receptor I, ani nereaguje TRA-8 zkříženě s myším homologem DR5, jak je zřejmé z poměrů optické absorbance pro 450 nm a 650 nm, dolním panelu č<l-f7 (obr. la, sloupec 8 dolního panelu). Solubilní TRAIL a TRA-8 se váží srovnatelně na imobilizovaný DR5 (obr. Ib, levý panel). Naopak, TRAIL se váže na DR4, ale TRA-8 nevykazuje žádnou vazebnou aktivitu k DR4 (obr. Ib, střední panel). Kd hodnoty pro vazbu TRAIL a TRA-8 na DRS jsou přibližně 59 nM a 3 nM, v příslušném pořadí. Významné je to, že TRA-8 významně soutěží s TRAIL o vazbu na DR5, ale ne o vazbu na DR4, jak je zřejmé z kompetitivního ELISA testu (obr. Ib, pravý panel). Tyto výsledky ukazují na specificitu TRA-8 pro lidský DR5.
TRA-8 je schopen detekovat povrchovou buněčnou expresi DR5, a analýza průtokovou cytometrií ukazuje na specifickou vazbu na povrch Cos-7 buněk transfektovaných kompletním lidským DR5, ale ne Cos-7 buněk transfektovaných DR4 nebo prázdným vektorem (obr. Ic). Obdobně, in sítu imunohistochemické vyšetření s TRA-8 i » » · • » · -? ♦ • « · · »· « * · · · « · »» » « • ® · »9 · · · · «· f · · · » ·C
9· · * »9 9 9 demonstruje reaktivitu s Cos-7 buňkami transfektovanými kompletní DR5 DNA, ale ne transfektovanými kontrolním vektorem (obr. ld). TRA-8 neindukuje apoptosu netransfektovaných Cos-7 buněk, a RT-PCR RNA z Cos-7 buněk za použití párových primerů kódujících lidské DR5 ukazuje, že nejsou přítomny žádné specifické PCR produkty. Další funkční analýza za použití lidských Jurkat buněk jako cílů ukazuje, že - za nepřítomnosti zesítění - TRA-8 silně indukuje smrt buněk, což bylo prokázáno třemi různými testy na životaschopnost buněk včetně ATPLite, MIT a PÍ vylučování (obr.
le) . Více než 50% Jurkat buněk je usmrceno nanogramovými koncentracemi TRA-8, jak bylo zjištěno pomocí ATPLite testu. Smrtící aktivita TRA-8 je specifická pro DRS, protože může být blokována DR5-Ig, ale ne DR4-Ig fúzním proteinem (data nejsou uvedena). Štěpení caspas 8, 9, a 3 může být detekováno westernovou analýzou již za 30 minut po aplikaci TRA-8 na Jurkat buňky (obr.
lf) , a smrt Jurkat buněk je zcela inhibována obecným inhibitorem caspas (Z-VAD) (obr. lg). Jednotlivé inhibitory pro caspasy 8, 3, 9, a 10 částečně inhibují buněčnou smrt, což dále dokazuje, že TRA-8-zprostředkovaná smrt buněk je primárně způsobena apoptotickým mechanismem závislým na caspasách.
Příklad 7. Analýza exprese DR5 na povrchu buněk za použití průtokové cytometrie: Hlavní death receptor na mnoha nádorových buňkách, ale ne na normálních buňkách
Schopnost vazby TRA-8 na DR5 exprimovaném na buněčném povrchu a specificita této reakce se potom hodnotí za použití COS-7 (Američan Type Culture Collection č. CRL- 1651) buněk transfektováných expresním vektorem obsahujícím kompletní lidské DR5 nebo DR4 cDNA nebo prázdným vektorem jako kontrolou. Anti-myší IgGl konjugovaný s fykoerythrinem (PE) (Pharmingen) se použije jako sekundární protilátka pro detekci vazby TRA-8. Fluorescence 1 X 104 buněk se měří za použití průtokového
- 61 • · *» » · » 9· i » · · · ·« • »»31 · « «t t
9 ··· ř ·· • ♦ * · * « · ·· 4«· a·t« cytometru (FACSVantage) za následujících podmínek:
Excitační vlnová délka: 488 nm; Detekční vlnová délka; 600 nm.
Analýza průtokovou cytometrií ukazuje, že TRA-8 barví přibližně 30% COS-7 buněk transfektováných DR5 vektorem, jak je uvedeno v plném histogramu na obr. lc. Toto procento odpovídá účinnosti transfekce, jak je určena analýzou transfekce za použití zeleného fluorescentního proteinu (GFP) (data nejsou uvedena). TRA-8 nebarví významně buňky transfektované buď DR4 (prázdný histogram) nebo kontrolním vektorem (tečkovaný histogram), což ukazuje, že TRA-8 je specifický pro DR5 na povrchu buněk.
Ačkoliv byla exprese DR5 v nádorových buňkách důkladně studována na úrovni mRNA (Rieger J. a kol. 1: FEBS Lett 1998 May 1; 427(1):124-8), je povrchová exprese DR5 málo prozkoumána. Gibson S.B. a kol. 1: Mol buňky Biol 2000 Jan; 20(1):205-12; Kim K. a kol. 1: Clin Cancer Res 2000 Feb; 6(2):335-46. Proto umožňuje dostupnost monoklonální anti-DR5 protilátky zkoumat povrchové koncentrace DR5, a korelovat expresi s citlivostí buněk na TRAIL-zprostředkovanou apoptosu. Následující panel buněk (1 x 106) se inkuboval s 10 ug/ml afinitně přečištěné TRA-8 při teplotě místnosti po dobu 30 minut a potom se provedlo barvení PE-konjugovaným anti-myším IgGl (Pharmingen) po dalších 30 minut 30 minut. 10000 živých buněk se analyzovalo za použití FACS-vantage průtokového cytometru za následujících podmínek:
Excitační vlnová délka: 488 nm;
Detekční vlnová délka: 600 nm.
Pět testovaných hematopoetických buněčných linií jsou Jurkat, CEM-6, Molt-4, H-9 a U937 buňky. DR5 exprese je detekovatelná na • · • » 9 ·
t
- 62 povrchu Jurkat, CEM-6, H-9 a U937 buněk, ale je téměř nedeteovatelná na Molt-4 buňkách, jak je uvedeno na obr. 2a a 2a'. Ačkoliv byly dříve popsány vysoké úrovně exprese DR5 RNA (43), FACs analýza ukázala, že tyto buňky neexprimují vysoké koncentrace povrchových DR5. Tyto výsledky naznačují, že povrchová exprese DR5 nekoreluje s transkripční expresí DR5, což není neočekávané pro takový receptor. Povrchová exprese DR5 může být specifická pro buněčné linie, protože většina buněk hematopoetického původu exprimuje nízké hladiny, zatímco většina gliomových a prostatických buněk exprimuje vysoké koncentrace DR5.
TRA-8 monoklonální protilátka se použije pro určení role DR5 v indukci TRAIL-zprostředkované apoptosy testováním povrchové exprese TRAIL na panelu různých lidských nádorových buněk, stejně jako citlivosti těchto buněk na TRAIL a TRA-8-zprostředkovanou apoptosu. Primární T-lymfocyty periferní krve neexprimují významnější množství povrchových DR5 a jsou resistentní na TRAIL i TRA-8-zprostředkovanou apoptosu (obr. 2a, 2a' a 3 a'). Ačkoliv všech pět testovaných lidských T-leukemických buněčných linií exprimuje detekovatělně, i když relativně nízké koncentrace povrchových DR5, jsou dvě z nich (Jurkat a CEM-6) vysoce citlivé na TRAIL-zprostředkovanou a TRA-8-zprostředkovanou apoptosu, což naznačuje, že DR5 sám je dostačující pro indukci apoptosy těchto buněk. Molt-4 a U937 buňky jsou částečně citlivé na TRAIL-zprostředkovanou apoptosu, ale jsou relativně resistentní na TRA-8-zprostředkovanou apoptosu, což naznačuje, že jiné TRAIL receptory se mohou podílet na přenosu apoptotického signálu. H-9 buňky jsou resistentní jak na TRAIL, tak na
TRA-8-zprostředkovanou apoptosu, což ukazuje na blok v intracelulární anti-apoptotické dráze.
Panel buněk zahrnuje lidské maligním gliomové buněčné linie^Hs683, U251MG, D37MG, D54MG, U373MG, CH235MG, U87 a normální i »
-63lidské astrocyty, které jsou získány od Dr. Yancey Gillespie z Neurosurgery Department of University of Alabama v Birminghamu. Lidské buněčné linie karcinomu prostaty, Dul54, PC3 a LnCap, se získají od Dr. William Grizzle z Pathology Department of University of Alabama v Birminghamu, který má buněčné linie z Američan Type Culture Collection. Lidské leukemické T-lymfocytární linie, B-lymfocytární lymfomové buňky, HepG2 Jurkat (Američan Type Culture Collection TIB-1 52) a CCRF-CEM CEM-6 (Američan Type Culture Collection CCL-1 19); monocytární buněčné linie, U937 (Američan Type Culture Collection CRL-2367); se získají od Američan Type Culture Collection. Všechny výše uvedené buněčné linie se kultivují v RPMI 1640 doplněném 10% FCS. Lidská astrocytomová buněčná linie, 1321N1, se získá od Dr. Richard Jope z Psychiatry Department of University of Alabama v Birminghamu, a kultivuje se v DMEM doplněném 5% FCS.
Solubilní rekombinantní lidský TRAIL, zakoupený od Alexis Corporation (San Diego, CA), je fúzní protein složený z extracelulární domény lidského TRAIL (aa zbytků 95 až 281) fúzované N-koncem na FLAG-koncovku a 8 aminokyselinový spojovací peptid. Oproti dříve popsanému TRAIL s His koncovkou tento přípravek TRAIL neindukuje sám silnou apoptotickou odpověď v Jurkat buňkách a vyžaduje anti-FLAG protilátku jako zesítovací činidlo pro zesílení apoptosy. Anti-FLAG protilátky byly také zakoupeny od Alexis.
Všech 10 testovaných lidských maligních gliomových buněk exprimuje detekovatelné množství DR5 na povrchu buněk. Většina buněk exprimuje vysoká množství DR5, jak je uvedeno na obr. 2b. Tři linie, D-54MG, U373MG a CH-235MG, exprimují vysoké koncentrace DR5, zatímco šest linií, Hs-683, U251-MG, D37-MG, U87, SMK1 a 1321N1, exprimuje střední koncentrace DR5. Pouze jedna buněčná linie, H-465, exprimuje nízké koncentrace DR5. Všechny tři buněčné »
- 64 • » · « · • · · · · · • ··<>·»·· · 4· C • · « · » »t ·« · ΐ··9»4 ’ linie karcinomu prostaty exprimují vysoké koncentrace DR5, jak je uvedeno na obr. 2c.
Stejně jako normální primární T-lymfocyty primární B lymfocyty neexprimují významné koncentrace DR5 a nepodléhají apoptose po ošetření TRAIL nebo TRA-8 (obr. 2d). Tři (SKW6.4, EB-3, a Ráji) ze čtyř testovaných B lymfomových buněčných linií exprimuje relativně vysoké koncentrace DR5 a jsou velmi citlivé na TRAIL i TRA-8-zprostředkovanou apoptosu. Čtvrtá buněčná linie, Daudi, exprimuje velmi nízké koncentrace DR5 a je mnohem méně citlivá na TRAIL nebo TRA-8-zprostředkovanou apoptosu. Ačkoliv primární astrocyty neexprimují detekovatelné koncentrace povrchových DR5 (obr. 2b'), exprimují všechny čtyři testované gliomové buněčná linie vysoké koncentrace DR5. Vyšší hladina exprese DR5 na gliomových buňkách než na T a B lymfocytech není doprovázena významné vyšší citlivostí na TRAIL a DR5-zprostředkovanou apoptosu, což naznačuje, že úrověň povrchové exprese DR5 nekoreluje nutně s úrovní apoptosy nádorových buněk. RT-PCR, provedená pro určení koncentrace mRNA DR4, DR5 a DcR2, detekovala mRNA u všech testovaných buněk (Tabulka 1). Nicméně, obecně, primární normální buňky exprimují relativně nízké koncentrace DR5 ve srovnání s transformovanými nádorovými buňkami.
Tabulka 1: RT-PCR analýza exprese TRAIL receptoru* • * · 4 · ·« • 9 · 4 · * · » ♦í • 4 4 J » > 9 · · » * t
9 4 9 » 9t
U « 9 99»»
Buňky DR5 DR4 DcR2
primární T-lymfocyty <0,001 <0,001 0,015
Jurkat 0,10 <0,001 0,21
CEM-6 0,50 0,59 0,25
Molt-4 0,10 <0,001 0,05
H-9 0,73 0,61 0,07
primární B lymfocyty <0,001 <0,001 0,024
SKW6.4 0,95 0,66 0,45
EB3 0,40 <0,001 0,35
Ráji 0,55 0,11 0,45
Daudi 0,73 0,36 0,63
Normální astrocyty 0,05 <0,001 0,12
SH683 0,56 0,96 0,14
U87 0,44 0,56 0,21
D54 1,15 0,46 0,12
1321N1 0,25 0,35 0,05
* Celková RNA se izolovala z buněk a provedla se RT-PCR způsobem popsaným ve technikách. PCR produkty se separovaly na 3% agarosovém gelu a analyzovaly se pomocí Fluor-S MAX Multilmager Systém (BioRad). Hodnoty jsou uvedeny jako poměry vzhledem k beta-aktinu.
Příklad 8. Indukce apoptosy in vitro u maligních buněk
Pro stanovení toho, zda TRA-8 indukuje apoptosu transformovaných buněk in vitro, se všechny DR5-pozitivní nádorové buňky testovaly na jejich citlivost na apoptosu indukovanou TRA-8 nebo TRAIL.
Cílové buňky (1 χ 103 na jamku) se kultivují v 96-jamkových plotnách za přítomnosti uvedených koncentrací solubilního TRAIL plus zesilovacího činidla (Alexis) nebo TRA-8 při 37 °C přes noc. Životaschopnost buněk se určí za použití (1) ATPLite kit podle návodu výrobce (Packard Instruments, Meriden, Cl); (2) kitu pro hodnocení MTT lymfocytární proliferace/ životaschopnosti (Sigma); nebo (3) Pl barvení mrtvých buněk a analýzy průtokovou cytometrií. Na konci kultivace se buňky barví 10 ug/ml Pl a Pl negativní buňky se hodnotí jako živé buňky. Pro analýzu kondenzovaných jader • 9 « · « · · * · • · · · ·· « « ··« · · ·· · * * ·»>«»·· · * * «
9 9 · · ·· • 9 · * »·* ♦
- 66 hepatocytů se buňky barví 10 ng/ml Hoechst 33352 (Molecular Probes) a analyzují se průtokovou cytometrií.
TRA-8 protilátka je schopná indukovat apoptosu u většiny maligních lidských gliomových buněčných linií (9/10), u 2 ze 3 buněčných linií karcinomu prostaty, a u 2 ze 4 DR5-pozitivních hematopoetických buněčných linií. Neindukuje apoptosu u Molt-4 buněčné linie, která exprimuje téměř nedetekovatelné povrchové koncentrace DR5. Úroveň citlivosti buněk na
TRA-8-zprostředkovanou apoptosu se však významně liší mezi buněčnými liniemi.
Variabilita citlivosti buněk na TRA-8 protilátkou indukovanou apoptosu naznačuje, že ačkoliv je nutná minimální úroveň povrchové exprese DR5, není úroveň povrchové exprese DR5 nutně primární determinantou citlivosti a další faktory ovlivňují tento proces. Ačkoliv gliomové buňky obecně exprimují významně vyšší koncentrace povrchového DR5 než hematopoetické buňky, není citlivost gliomových buněk na apoptosu indukovanou TRA-8 poměrně zvýšena ve srovnání s hematopoetickými buňkami. Citlivost pěti gliomových buněčných linií, D-37MG, D54-MG, U373-MG, CH235-MG a 1321N1, na TRA-8-indukovanou apoptosu, je vysoká a je ekvivalentní jejich citlivosti na TRAIL-zprostředkovanou apoptosu, jak je uvedeno na obr. 3b. Dvě gliomové buněčné linie, H-456 a SMK1, jsou mnohem méně citlivé na apoptosu indukovanou TRA-8. V případě H-456 buněk je povrchová exprese DR5 nízká; nicméně, povrchová exprese DR5 na SMK1 je podobná jako u citlivější buněčné linie, což naznačuje, že i jiné mechanismy mohou ovlivňovat citlivost na
TRAIL-zprostředkovanou apoptosu. Aškoliv všechny tři buněčné linie karcinomu prostaty exprimují vysoké koncentrace DR5, jsou Dul45 buňky nejvíce sensitivní na TRA-8-indukovanou apoptosu, PC3 buňky jsou částečně sensitivní, zatímco LnCAP buňky jsou zcela resistentní, jak je uvedeno na obr. 3c. Z hematopoetických buněk « · » · · • · · · ♦ »4 • ··« · ··*·í • ······· · ··· a · « · ·· s • · « *·<*·»
-67jsou Jurkat a CEM-6 velmi citlivé na TRA-8- apoptosu, jak je uvedeno na obr. 2a, ačkoliv bylo zjištěno, že obě tyto buněčné linie exprimují nízké koncentrace DR5. Ačkoliv je DR5 detekovatelný na U937 buňkách, jou tyto buňky rezistentní na TRA-8-indukovanou apoptosu. Obdobně, ačkoliv H-9 buňky exprimují detekovatelné koncentrace DR5, jsou H-9 buňky rezistentní na apoptosu indukovanou TRA-8. Tyto výsledky ukazují na existenci regulačních mechanismů, které ovlivňují DR5-zprostředkovanou apoptosu.
Další vazba anti-DR5 protilátek na povrch buněk se provede postupem podle příkladů 1^3. Dvě další anti-DR5 protilátky označené TRA-1 a TRA-10 se testují společně s TRA-8 pro srovnání schopnosti indukovat apoptosu a tak působit jako agonisté nebo naopak blokovat TRAIL-zprostředkovanou apoptosu, a tak působit jako antagonisté. Lidské Jurkat buňky se použijí jako cíl pro určení agonistické a/nebo antagonistické aktivity tří anti-DR5 protilátek označených jako TRA-1, TRA-8 a TRA-10. Jak je uvedeno na obr. 4, je životaschopnost buněk přibližně 90%, 70% a 20% pro TRA-10, TRA-1 a TRA-8, v příslušném pořadí, po inkubaci přes noc s 2,5 ug na ml. TRA-8 indukuje silnou apoptotickou odpověď závislou na dávce, zatímco TRA-1 indukuje pouze středně silnou apoptotickou odpověď a TRA-10 indukuje pouze slabou odpověď.
TRA-8 je proto klasifikována jako agonistická anti-DR5 protilátka. Na obr. 4 je ukázána životaschopnost lidských Jurkat buněk jako funkce TRAIL-indukované apoptosy závislé na dávce. TRA-10 významně blokuje apoptosu lidských Jurkat buněk při testu TRAIL-indukované apoptosy za použití nízkých dávek. Proto je TRA-10 klasifikována jako antagonistická anti-DR5 protilátka. TRA-1 je uložena v Američan Type Culture Collection pod přírůstkovým číslem PTA-1741. TRA-10 je také uložena v Američan Type Culture Collection pod přírůstkovým číslem PTA-1742.
* ♦ · • · · 4 ·· • · · · · 9 ·· · • »»»»♦*» « «· • » « · · · • · » 9 ····
- 68 Citlivost pěti gliomových buněčných linií, D-37MG, D54-MG, U373-MG, CH235-MG a 1321N1, na TRA-8-indukovanou apoptosu, je ekvivalentní jejich citlivosti na TRAIL-zprostředkovanou apoptosu, jak je uvedeno na obr. 3b, což ukazuje, že TRAIL-indukovaná apoptosa těchto buněk je zprostředkovaná primárně DR5. Dále, dvě gliomové buněčné linie, Hs683 a U251-MG, jsou rezistentní na TRAIL-indukovanou apoptosu, ale jsou částečně senzitivní na TRA-8-indukovanou apoptosu, což ukazuje, že v těchto buňkách jsou účinné falešné receptory a že použití TRA-8 protilátky překonává tento regulační mechanismus. V buněčných liniích karcinomu , ε.
prostaty, pres ruznou sensitivitu na apoptosu indukovanou TRA-8, tato paralelní sensitivita buněk na apoptosu indukovanou TRAIL opět ukazuje, že DR5 má hlavní význam pro TRAIL-zprostředkovanou apoptosu v buňkách karcinomu prostaty. U hernatopoetických buněk bylo zjištěno, že Jurkat a CEM-6 jsou velmi citlivé na TRA-8 i TRAIL-zprostředkovanou apoptosu. Úroveň apoptosy indukované TRA-8 je srovnatelná s úrovní indukovanou TRAIL, jak je uvedeno na obr. 2a a 3a'. Pouze jedna z gliomových buněčných linií, U87, a dvě hematopoetické buněčné linie, U937 a Molt-4, vykazují sensitivitu na TRAIL-indukovanou apoptosu, ale jsou méně citlivé nebo rezistentní na TRA-8-indukovanou apoptosu. Jedna buněčná linie, H-9 buněčná linie, exprimuje detekovatelné koncentrace
τ.
DR5, ale je rezistentní na apoptosu indukovanou TRA-8 nebo TRAIL. Ačkoliv jsou minimální úrovně exprese DR5 nutné pro
TRA-8-indukovanou apoptosu, neurčují úrovně exprese DR5 nutně citlivost buněk na TRA-8 zprostředkovanou apoptosu; falešné receptory mají úlohu při modulování TRAIL-zprostředkované apoptosy v některých buňkách, ale nezdá se, že by měly hlavní úlohu v většiny dosud testovaných buněk; předpokládá se, že TRA-8 protilátka překonává efekt falešných receptorů; funkční mutace DRS receptoru mohou být přítomny v transformovaných buňkách; a, nakonec, intracelulární regulační mechanismy mohou být také významné, nebo významnější, než falešné receptory, v definování • · · «· • * · · · ·· • ··· · ··*·· • ··*···· ·· · · • · 9 · · ·· • · · · · · ♦ ·
- 69 — citlivosti buněk na TRAIL a DR5-zprostředkovanou apoptosu.
Předchozí pokusy ukázaly, že mRNA pro DR5 je široce distribuována v normálních tkáních (7). Pro hodnocení exprese DR5 na proteinové úrovni se panel homogenizátů normálních lidských tkání (Geno Technology, St. Louis, MO) sonduje TRA-8 protilátkou ve westernové analýze. Z devíti normálních lidských tkání je mozková tkáň slabě pozitivní (obr. 5a, dráha 2). DR5 protein není detekovatelný TRA-8 reaktivitou v játrech (dráha 1), plících (dráha 3), ledvinách (dráha 4), slezině (dráha 5), varlatech (dráha 6), vaječnících (dráha 7), srdci (dráha 8) nebo pankreasu (dráha 9). Naopak, všech třináct lidských nádorových tkání se barvilo pozitivně TRA-8 (obr. 5b), včetně karcinomů vaječníků (dráha 1), plic (dráha 2), jater (dráha 3), rekta (dráha 4), čípku děložního (dráha 5), kůže (dráha 6), varlat (dráha 7), štítné žlázy (dráha 5), dělohy (dráha 10), žaludku (dráha 11), laryngofaryngu (dráha 12) a pankreas (dráha 13). Dále, in šitu imunohistochemické barvení normální a nádorové tkáně TRA-8 potvrdilo, že kromě několika rozptýlených pozitivních buněk ve slezině není DR5 exprese v normálním prsu, plících a slezině detekovatelná (obr. 5c). Příslušné nádorové tkáně včetně infiltrujícího duktálního karcinomu prsu, malobuněčného karcinomu plic a lymfomu reagovalo pozitivně s TRA-8 (obr. 5d). Z celkem 22 vyšetřovaných nádorových tkání reagovalo 5 ze 6 nádorů prsu, 2 z 2 nádorů čípku děložního, 4 z 5 nádorů jater, 5 z 8 lymfomů, 2 z 2 karcinomů plic a 2 z 2 karcinomů prostaty pozitivně s TRA-8. Tyto výsledky jsou v souladu s výsledky analýzy průtokovou cytometrií a ukazují, že nádorové tkáně exprimují vyšší koncentrace DR5 proteinu než normální tkáně.
Příklad 9. Tumoricidní aktivita TRA-8 in vivo
Z různých důvodů nemají mnohá činidla, která mají slibné
-70 výsledky v pokusech in vitro, účinnost in vivo. Je proto důležité testovat účinnost TRA-8 v in vivo zvířecím modelu. Pro tento účel se TRA-8 anti-lidská DR5 protilátka podá myším s lidskými xenotransplantáty, které exprimují lidskou DR5 molekulu. Použité myši jsou stáří 6 až 8 týdnů, NOD/SCID myši (Jackson Laboratory), které mají podkožně naočkované lidské astrocytomové 1321N1 buňky (1x107), nebo intravenosně naočkovné lidské leukemické Jurkat buňky (lxlO6). V den 2 po naočkování nádoru se myši naočkují intravenosně TRA-8 (100 ug). Pět dnů po aplikaci TRA-8 se růst 1321N1 nádoru určí podle velikosti a hmotnosti nádoru. Růst Jurkat buněk se určí podle hmotnosti sleziny a procenta lidských CD3-pozitivních Jurkat buněk ve slezině zvířat. Provedou se biopsie nádorové tkáně a atto tkáň se vyšetří histologicky.
Časná léčba jednou intravenosní dávkou 100 ug TRA-8 v den 1 po naočkování nádoru zcela inhibuje tvorbu solidního nádoru 1321N1 buněk (obr. 6a). Pozdější léčba třemi dávkami 100 ug TRA-8 první týden po naočkování nádoru redukuje 4|krát nebo vícekrát hmotnost nádoru (obr. 6b). Vznik nádoru není viditelný u zvířat léčených časně TRA-8 (obr. 6c, horní panel). Histologická analýza ukazuje dramaticky degenerovanou nádorovou tkáň u zvířat léčených TRA-8 (obr. 6c, dolní panel). Obdobně, léčba TRA-8 inhibovala slezinnou populaci Jurkat buněk, jak se to projevilo na malém počtu CD3-pozitivních Jurkat buněk ve slezině (obr. 6d, 6e). Histologická analýza implantovaných nádorů ukázala několik nádorových buněk rozptýlených v měkkých tkáních u zvířat léčených TRA-8, zatímco u kontrol byla patrná tvorba solidních nádorů, jak je uvedeno na obr. 6c. V modelu Jurkat buněk je počet Jurkat buněk ve slezinách zvířat léčených TRA-8 menší než 2%, ve srovnání s téměř 10% ve slezinách kontrolních zvířat, jak bylo zjištěno analýzou průtokovou cytometrií uvedenou na obr. 6a a in sítu CD3 barvením na obr. 6c.
· • ? > 4
- 71 Tyto výsledky potvrzují nedávné pozorování, že systémové podání zesítěných rekombinantních TRAIL inhibuje růst nádoru in vivo (13). Tyto výsledky ukazují, že jediná dávka TRA-8 je vysoce účinná v eliminaci nádorových buněk in vivo.
Protože je anti-lidská protilátka použita na zvířecím modelu, nemůže být hodnocena toxicita podání TRA-8. Nicméně, pokusy s podáváním TRAIL in vivo ukázaly, že s touto léčbou není spojena žádná významná toxicita (13).
Příklad 10: RA synoviální buňky jsou citlivé na TRAIL a TRA-8 indukovanou apoptosu
Většina z předchozích prací týkajících se apoptosy zprostředkované TRAIL se zaměřila na maligní buňky. TRAIL-zprostředkovaná apoptosa podle předkládaného vynálezu je také terapeutická u autoimunitních a zánětlivých onemocnění, jako je RA.
10.1 Analýza povrchové exprese DR5 na RA synoviálních buňkách za použití průtokové cytometrie
Exprese DR5 na panelu 8 primárně kultivovaných synoviálních buněk od pacientů s RA se srovnávala s expresí na 8 primárně kultivovaných synoviálních buňkách od pacientů s osteoartritidou (zde dále OA). 8 kultur primárních RA synoviálních buněk RA-1014, RA-1016, RA-1021, RA-512, RA-707, RA-811, RA-716 a RA929 se získaly od Dr. M. Ohtsuki (Sankyo Co., Ltd., Tokyo, Japan) a kultivovaly se v DMEM doplněném 10% FCS, penicilinem streptomycinem a glutaminem. 7 kultur primárních OA synoviálních buněk se izolovalo ze synoviální tkáně od pacientů s OA za použití standardní kolagenásové metody a kultivovaly se za stejných podmínek. Počet pasáží všech primárních buněk je menší než 10.
- 72 Exprese DR5 se určila FACs analýzou, jak je popsána v příkladu 5.
Všechny primární kultury RA buněk exprimují vysoké hladiny povrchových DR5 a mezi těmito buňkami izolovanými od různých pacientů je přítomna pouze malá variabilita v úrovních exprese, jak je uvedeno na obr. 7a. Naopak, povrchová exprese DR5 na povrchu synoviálních buněk izolovaných od pacientů s OA je velmi nízká nebo nedetekovatelná, jak je uvedeno na obr. 7b. Bylo zjištěno, že SV-40 transformované synoviální buňky exprimují vysoké koncentrace DR5 ve srovnání s RA buňkami. Naopak, netransformované fibroblasty exprimují nízké hladiny DR5 ve srovnání s OA buňkami, jak je uvedeno na obr. 7b.
10.2 Citlivost RA buněk na apoptosu zprostředkovanou TRA-8 nebo TRAIL
Obecně, všechny synoviální buňky izolované od pacientů s RA jsou citlivé jak na TRAIL, tak na anti-DR5 protilátkami zprostředkovanou apoptosu, a všechny OA buňky jsou resistentní jak na TRAIL, tak na anti-DR5 protilátkami zprostředkovanou apoptosu, jak je uvedeno na obr. 8a, b. Tyto pokusy naznačují, že TRA-8 protilátka se přednostně váže na pozměněné buňky ve srovnání s normálními buňkami. Dále, citlivost nebo resistence na apoptosu indukovanou TRAIL koreluje s apoptosou indukovanou anti-DR5, což naznačuje, že synoviální buňky primárně využívají DR5 pro spuštění TRAIL apoptosy.
Jak bylo popsáno pro maligní buňky, liší se citlivost na paoptosu indukovanou TRAIL nebo anti-DR5 protilátkou mezi RA synoviálními buňkami, ačkoliv exprimují podobné hladiny DR5. RA512 a RA-707 jsou nejcitlivější, protože více než 80% buněk je usmrceno koncentracemi TARIL nebo TRA-8 pod 20 ng/ml. RA-1014, RA-811, RA-716 a RA-929 mají střední citlivost na TRAIL nebo » » ♦ » > ♦ — 73 TRA-8, s téměř 100% usmrcením buněk za přítomnosti vysokých koncentrací (50 ng/ml) TRAIL nebo TRA-8. U RA-1016 a RA1021 buněk - ačkoliv je většina (více než 60%) buněk usmrcena nízkou dávkou
TRAIL nebo TRA-8 - část buněk přežívá za přítomnosti vysokých koncentrací TRAIL nebo TRA-8, což ukazuje, že subpopulace buněk je resistentní na TRAIL-zprostředkovanou apoptosu. naopak, všechny OA buňky jsou mnohem méně citlivé na TRAIL a TRA-8 indukovanou apoptosu. Ne více než 6oj% buněk je usmrceno v OA52F a 0A69F, i za přítomnosti vysoké koncentrace TRAIL nebo TRA-8. OA72M buňky jsou zcela rezistentní na TRAIL nebo TRA-8 indukovanou apoptosu. SV40 transformované synoviální buňky jsou také citlivé na TRAIL a TRA-8 indukovanou apoptosu (data nejsou uvedena). Naopak, netransformované fibroblasty se zdají být rezistentní na TRAIL a TRA-8.
Již dříve bylo prokázáno, že DR5 využívá FADD/caspasa 8 dependentní dráhu pro spuštění apoptosy (44). Pro stanovení závislosti DR5-zprostředkované apoptosy na caspasách v RA-synoviálních buňkách se RA buňky kultivují s TRAIL nebo anti-DR5 protilátkou za přítomnosti specifických inhibitorů caspas. Z osmi testovaných inhibitorů caspas jsou inhibitory caspasy 6, 8 a 10 schopny inhibovat apoptosu RA synoviálních buněk indukovanou jak TRAIL, tak DR5, jak je uvedeno na obr. 9, což ukazuje, že tyto tři caspasy se podílejí na DR5-zprostředkované apoptose.
10.3 TRA-8 nebo TRAIL indukuje aktivaci NF-kappa-b v RA synoviálních buňkách bez zvýšení uvolňování MMP
Existují významné důkazy podporující předpoklad, že existuje těsná vazba mezi signalizací apoptosy a signalizací proliferace (45). Bylo zjištěno, že DR5 je schopen aktivovat NF-kappa-b dráhu, kromě přenosu signálu pro apoptosu, a že aktivace NF-kappa-b může ♦ > s » •S » • 9 99 •99 » · · » -1 • i »· • < ÍM« • β ♦ ·« • 9 ·· · i 9
- 74 přenášet anti-apoptotický signál. Proto se provede test posunu na gelu. Buňky se stimulují 50 ng/ml rekombinantního solubilního TRAIL, Pas ligandu, za přítomnosti 1 mg/ml zesilovače, nebo 50 ng/ml TRA-8, po uvedenou dobu. Připraví se jaderné extrakty a provede se inkubace s dvojitě značenou [32P]-značenou oligo-DNA sondou. Výsledky se analyzují za použití cyklon phospha-imager (TopCount NXT, Packard Instrument Company, CT). Po inkubaci RA synoviální buněk s TNF-alfa nebo TRAIL je NF-kappa-b aktivován v závislosti na čase. TRA-8 protilátka je schopena silně aktivovat NP-kappa-b. Naopak, Fas ligand je neschopen indukovat aktivaci NF-kappa-b, jak je uvedeno na obr. 10a.
Proto, ačkoliv TRAIL a TRA-8 protilátky indukují silně apoptotickou odpověď u RA synoviální buněk, mohou také aktivovat NF-kappa-b, a aktivace NF-kappab může přispívat k prozánětlivé úloze TNF-alfa u RA. Tak je možné, že TRAIL, stejně jako TNF-alfa, může účinkovat jako prozánětlivý cytokin. Pro určení toho, zda existují podobné biologické následky aktivace NF-kappab indukované TRAIL a TNF-alfa se produkce MMP určí ELISA. Synoviální buňky se kultivují v mediu samotném nebo s 50 ng/ml interleukinu lb, 10 ng/ml TNF-alfa, 50 ng/ml TRAIL, nebo 50 ng/ml TRA-8, přes noc. Koncentrace MMP-1 a MMP-3 v supernatantech kultur se určí za použití ELISA kitů.
Když se RA synoviální buňky inkubují s prozánětlivým cytokinem, TNF-alfa nebo Il-lb, ta je produkce MMP-1, 3, a 13 zvýšena ve srovnání s kontrolním mediem, jak je uvedeno na obr. 10 b,c. Naopak, aplikace TRAIL nebo anti-DR5 protilátky není spojena se zvýšením uvolňování těchto MMP.
Příklad 11A. Selhání indukce hepatocelulární toxicity
Pro test 24f-hodinové životaschopnosti buněk se čerstvé normální lidské hepatocyty v 96fjamkových plotnách získají od In Vitro v
Technology (Baltimore, MD). Hepatocyty se kultivují v Hepatocyte Kultury Medium obsahujícím 1 ug/ml bud solubilního TRAIL, nebo TRA-8. Pro test hodinové životaschopnosti se normální hepatocyty nebo buňky hepatocelulámího karcinomu izolují z čerstvých chirurgických vzorků odebraných v UAB Tissue Procurement Center. Všechna reakční činidla pro izolaci lidských hepatocytů, včetně hepatocytárního perfúzního pufru, trávícího media, promývacího media a vazebného media se získají od Gibco. Tkáňové řezy se tráví v Hepatocyte Digest Medium při 37 °C za třepání (50 rpm) po dobu jedné hodiny. Izolované hepatocyty se získají odstředěním při nízké rychlosti (50 g, 3 mm), a promyjí se 6tkrát hepatocytárním promývacím mediem. Suspenze jednotlivých hepatocytů se kultivuje v Attachment Medium obsahujícím 10% FCS v 96^jamkových Matrigel plotnách (BD) po dobu 6 hodin. Nenavázané hepatocyty se odstraní dvojím promytím předem zahřátým vazebným mediem. Navázané hepatocyty se dále inkubují s různými koncentracemi solubilního TRAIL nebo FasL za přítomnosti zesilovacího činidla, nebo TRA-8 nebo CH11 po dobu 6 hodin.
TRAIL má alespoň dva receptory (DR4 a DR5), které jsou schopné indukovat apoptosu. TRA-8 se použije pro určení toho, zda zesítění DR5 samotného $e schopné indukovat apoptosu normálních hepatocytů. DR5 exprese na proteinové úrovni se stanoví nejprve v pěti lidských jaterních tkáních a pěti tkáni nádorů jater pomocí in šitu imunohistochemického vyšetření za použití TRA-8. Řezy z normální jaterní tkáně vykazují normální architekturu a buněčnou morfologii při barvení H&E (obr. 11a, levé horní panely) za nepřítomnosti pozitivní reaktivity s TRA-8 na DR5 (obr. 11a, levé dolní panely). Naopak, tkáně lidských hepatocelulárních karcinomů reagují pozitivně s TRA-8 způsobem odpovídajícím přítomnosti DR5 na membráně a v cytoplasmě nádorových buněk. Lidské buněčná linie hepatocelulámího karcinomu HepG2 je také pozitivní na DR5. Tyto
9 9 ·
9 i > ? * 9
9 *
výsledky jsou v souladu s pěti normálními jaterními tkáněmi, a pouze jedna (jaterní adenom) z pěti jaterních nádorových tkání je DR5-negativní. Tyto výsledky jsou v souladu s daty z Westernové analýzy uvedenými na obr. 5a, to znamená, stejně jako jiné normální tkáně, normální lidské jaterní tkáně neexprimují významné koncentrace DR5 proteinu. Dále, Westernová analýza izolovaných, normálních lidských hepatocytů sondovaných TRA-8 neukazuje detekovatělně koncentrace DR5.
Povrchová exprese DR5 na lidských hepatocytech analyzovaná průtokovou cytometrií ukazuje, že čerstvě připravené normální hepatocyty neexprimují detekovatelné koncentrace povrchového DR5 (obr. 11b, horní levé panely). Tato exprese není detekována ani na normálních lidských hepatocytech, které byly kryokonzervovány nebo krátkodobě kultivovány. Naopak, čerstvě izolované buňky hepatocelulárního karcinomu, stejně jako HepG2 buňky, exprimují povrchové DR5. Za použití Fas pro srovnání normální hepatocyty, buňky hepatocelulárního karcinomu a HepG2 buňky všechny exprimují ekvivalentní koncentrace Fas (obr. 11b, dolní panely). Tyto výsledky jsou v souladu s výsledky získanými za použití in šitu imunohistochemického vyšetření a Westernové analýzy a ukaž^fí, že povrchové DR5 jsou značně exprimované v nádorových jaterních buňkách, ale ne na normálních hepatocytech. Přítomnost určitých koncentrací mRNA pro DR4, DR5, DcRl a DcR2 v lidských hepatocytech prokázaná RT-PCR (23) naznačuje, že lidské hepatocyty mohou exprimovat velmi nízké koncentrace DR5 proteinu, které jsou pod prahem detekce pomocí TRA-8.
Pro určení toho, zda TRA-8 indukuje hepatocelulární toxicitu, se testuje citlivost normálních lidských hepatocytů na apoptosu indukovanou TRA-8 a solubilním TRAIL plus zesilovacím činidlem. Když se normální hepatocyty kultivují za přítomnosti vysoké koncentrace TRAIL, tak se pozoruje snížení životaschopnosti buněk « · · · ·
- 77 — závislé na čase pomocí AIPLite (obr. 12a) a MIT testů.
TRAIL-zprostředkovaná apoptosa normálních hepatocytů může být pozorovaná již za 4 hodiny po přidání TRAIL. Na konci 24j-hodinové kultivace je více než 8oj% hepatocytů usmrceno TRAIL. Naopak, během stejného kultivačního období TRA-8 neindukují významnou apoptosu v normálních hepatocytěch. Kondenzovaná jádra barvená Hoechst, a charakteristická pro apoptosu, se zvyšují u TRAIL-ošetřených, ale ne u TRA-8-ošetřených hepatocytů (obr. 12b). Počet apoptotických hepatocytů dobře koreluje se sníženou životaschopností buněk, jak je určena AIPLite testem, což naznačuje, že TRAIL-indukovaná smrt hepatocytů je zprostředkovaná apoptosou. Toto je potvrzeno schopností Z-VAD inhibovat TRAIL-zprostředkovanou toxicitu u hepatocytů. Protože je cykloheximid účinný zesilovač apoptosy, zkoumal se efekt této sloučeniny na TRAIL a TRA-8-ošetřené hepatocyty. Během 4j-hodinové kultivace cykloheximid významně zesílil smrt hepatocytů indukovanou TRAIL, kdy bylo více než 7θ|% hepatocytů usmrceno TRAIL za přítomnosti cykloheximidu (obr. 12c). Nicméně, aplikace cykloheximidu není schopna zesílit TRA-8-zprostředkovanou smrt hepatocytů. Pro srovnání charakteristik apoptosy indukované TRA-8 s apoptosou indukovanou TRAIL v hepatocytěch se normální hepatocyty, stejně jako nádorové buňky inkubují s různými koncentracemi solubilního TRAIL se zesíťovacím činidlem nebo
Q
TRA-8. Během 6thodinové kultivace TRAIL indukuje střední apoptotickou reakci v normálních hepatocytech. Více než 2 hepatocytů je usmrceno za přítomnosti 500 ng/ml TRAIL (obr. 12d, horní levý panel). Ošetření normálních hepatocytů TRA-8 neindukuje během stejné doby žádou významnou apoptotickou odpověď. Oproti normálním hepatocytům jsou buňky primárního hepatocelulárního karcinomu (obr. 12d, horní střední) a HepG2 buňky (obr. 12d, horní pravý) vysoce citlivé na apoptosu zprostředkovanou TRAIL nebo TRA-8. Více než 80% buněk hepatocelulárního karcinomu a téměř 100% HepG2 buněk je usmrceno během 81-hodinové kultivace. Tyto
» » • · · · i « • ·· » 9 ·· • · · » 9 » • ··
9·
- 78 výsledky ukazují, že normální hepatocyty jsou zcela rezistentní na TRA-8-zprostředkovanou apoptosu, a jsou mnohem méně citlivé na TRAIL-zprostředkovanou apoptosu, než are jaterní nádorové buňky. Za použití Fas ligandu a anti-Fas protilátky (CH-11) neexistuje významný rozdíl v citlivosti na Fas-zprostředkovanou apoptosu mezi normálními hepatocyty, buňkami hepatocelulámího karcinomu a HepG2 buňkami (obr. 12d, dolní panely).
Srovnávací příklad 11B. In vivo indukce hepatitidy lidským
membránovým TRAIL
8/10 týdnů starým B6 myším se intravenosně podá 10 pfu
Ad/hTRAIL se stejným počtem Ad/Tet-on. Myším se potom podávají různé koncentrace tetracyklinu ve vodě k pití, bezprostředně po inokulaci adenovirovými vektory. Poškození jater se určí podle sérové koncentrace AST za použití AST diagnostického kitu (Sigma). Exprese TRAIL se určí by Northernovou analýzou.
Pro stanovení toho, zda membránová forma TRAIL indukuje poškození jater in vivo, se připraví rekombinantní adenovirový vektor kódující kompletní lidský TRAIL (Ad/hTRAIL), jehož exprese je řízena tetracyklinem-indukovatelným promotorem. 24 hodin po intravenosní inokulaci B6 myší Ad/hTRAIL se tetracyklinem-indukovaná exprese lidského TRAIL pozoruje v játrech v závislosti na dávce, ja se zjistí Northernovou analýzou (obr. 13a). Úroveň exprese TRAIL dobře koreluje s poškozením jater, jak je patrné na zvýšení sérové koncentrace transaminas závislém na tetracyklinu, opět v závislosti na dávce (obr. 13b). Protože inokulace adenovirovým vektorem samotným může zvyšovat citlivost hepatocytů na TRAIL-zprostředkovanou apoptosu, izolují se hepatocyty od myší naočkovaných Ad/TRAIL a testují se na TRAIL-zprostředkovanou smrt buněk. Není pozorována významně zvýšená smrt buněk u hepatocytů infikovaných Ad/TRAIL ve srovnání « *
-79 s hepatocyty od kontrolních myší (obr. 13c, levý panel). Dále, Ad/TRAIL inokulované myši nevykazují vyšší poškození jater po intravenosní injekci solubilního lidského TRAIL. Proto se předpokládá, že hepatitida indukovaná Ad/TRAIL je zprostředkovaná vysokými koncentracemi exprese TRAIL v membránové formě. Histologická analýza jaterních řezů ukázala, že poškození hepatocytů je patrné již za 24 hodin po inokulaci vektoru (obr. 13d), a perfistuje po alespoň 7 dnů (obr. 13e). Tyto patologické alterace jater jsou také závislé na tetracyklinu a na dávce. Časná fáze, během 24 hodin léčby, TRAIL-indukovaného poškození jater, je charakterizovaná ložisky nekro$y. V tomto stadiu není pozorována infiltrace zánětlivých buněk, ale jsou patrné hemorhagie, V den 7 po inokulaci je patrné difusní poškození jater s vysnačenou desintegarcí lobulů, závažnou degenerací hepatocytů s nepravidelnou cytopla$mou a velkými čirými oblastmi, a s významnou apoptosou a nekrosou. Významný infiltrát mononukleárních buněk je charakteristickým rysem tohoto stadia. Tyto výsledky ukazují, že lidský TRAIL v membránové formě je schopen indukovat jaterní poškození in vivo. I přes značnou pravděpodobnost indukce závažné hepatitidy u myší lidským TRAIL neindukuje lidský TRAIL letální reakci. Naopak, myši naočkované podobnými tetracyklinem-kontrolovanými vektory kódujícími Fas ligand vykazují fulminantní hepatitidu s masivní apoptosou a nekrosou hepatocytů doprovázenou těžkou hemorhagií a mortalitou vyskytující se v závislosti na dávce tetracyklinu během 72 hodin v* po inokulaci. Mortalita dosahuje 100]% během 48 hodin u podskupin s aplikací 3 mg/ml nebo více tetracyklinu. Naopak, všechny myši, kterým byl podán Ad/hTRAIL, bez ohledu na dávku tetracyklinu, jsou naživu za čtyři týdny po inokulaci. Proto se zdá, že in vivo je membránová forma TRAIL méně účinná v indukci hepatocelulárního poškození než Fas ligand. Dále se zdá, že TRAIL může indukovat poškození jater mechanismem, který je jiný než mechanismus odpovědný za toxicitu Fas ligandu.
• » ♦ · • ··«···· · • · ♦ · · > · · · · « · ·
- 80 Příklad 12. Aktivované lidské T a B lymfocyty exprimují zvýšené koncentrace DR5.
Pro určení toho, zda má DR5 úlohu v TRAIL-zprostředkované apoptose aktivovaných T lymfocytů a B lymfocytů, se testuje povrchová exprese DR5 na klidových a aktivovaných T a B lymfocytech za použití TRA-8. Nestimulované lidské T lymfocyty v PBMC neexprimují významné koncentrace DR5 (obr. 14). Za 48 hodin po stimulaci budí anti-CD3, nebo Con-A, se povrchová exprese DR5 významně zvýší. Obdobně, nestimulované B lymfocyty exprimují velmi nízké koncentrace DR5. Stimulace anti-u, ale ne LPS, vede ke zvýšení povrchové exprese DR5. Tyto výsledky ukazují, že aktivované T i B lymfocyty exprimují vysoké koncentrace povrchového DR5. Buňky se barví 20 ug/ml TRA-8 a PE anti-myší IgGl.
Příklad 13. Aktivované T a B lymfocyty jsou citlivé na TRA-8 zprostředkovanou apoptosu
Pro stanovení toho, zda jsou aktivované T a B lymfocyty citlivé na TRA-8-zprostředkovanou apoptosu, se T lymfocyty a B lymfocyty lidských PBMC stimulují anti-CD3 nebo anti-u in vitro po dobu 48 hodin, v příslušném pořadí. Živé buňky a proliferující blasty se získají gradientovým odstředěním a provede se inkubace s různými koncentracemi TRA-8. Nestimulované T lymfocyty a B lymfocyty nejsou citlivé na
TRA-8-zprostředkovanou apoptosu (obr. 15). Celkově vykazovaly stimulované T-lymfocyty a B lymfocyty střední citlivost na TRA-8-zprostředkovanou apoptosu, s 20% buněk usmrcenými TRA-8 po kultivaci přes noc. Vysoce proliferující blastické T lymfocyty jsou ještě citlivější na TRA-8 zprostředkovanou apoptosu. Více než 70% blastických T lymfocytů může být usmrceno TRA-8. Blastické a » · · » ·*» · »* * » * 4 - · « • ««>»>·· · · ♦ · • « · · · · 1 - ' ## « í ♦ ♦ » 4 « » » ·
- 81B lymfocyty jsou také více citlivé na TRA-8 zprostředkovanou apoptosu ve srovnání s ostatními B-lymfocyty. Tyto výsledky ukazují, že aktivované T a B lymfocyty jsou citlivé na DR5-zprostředkovanou apoptosu.
Příklad 14. TRA-8 způsobuje depleci aktivovaných T-lymfocytů u lidí/SCID myší
Pro stanovení in vivo anti-T lymfocytární účinnosti TRA-8 se NOD/SCID myším intravenosně injikovalo 1x108 lidských^ PBMC. Za normálních okolností jsou lidské T-lymfocyty u SCID myší rychle aktivované v reakci na xenogenní stimulaci. SCID myším s lidskými PBMC se intraperitoneálně podávalo 100 ug TRA-8 nebo kontrolního IgGl, od dne přenosu, jednou za tři dny. 5 dnů po přenosu se mononukleární buňky izolovaly ze sleziny a barvily se anti-lidskou CD3 protilátkou, lymfocytární populace se separovala průtokovou cytometrií, a analyzovaly se CD3 pozitivní lidské buňky. Přibližně 30^ lymfocytů sleziny jsou lidské T-lymfocyty, jak se určilo anti-lidskou CD3 protilátkou u myší léčených kontrolním přípravkem. Nicméně, pouze několik lidských T-lymfocytů (méně než 3j%) se pozorovalo v lymfocytech sleziny u myší léčených TRA-8 (obr. 16). Histologické vyšetření in šitu ukázalo, že ve slezině kontrolní myší jsou lidské T-lymfocyty repopulovány a je přítomno pouze několik apoptotických buněk, jak se určí TUNEL barvením. Naopak, repopulace živých lidských T-lymfocytů není pozorována ve slezinách myší léčených TRA-8 a místo toho jsou pozorovány apoptotické buňky (obr. 17). Tyto výsledky ukazují, že TRA-8 má anti-T-lymfocytární aktivitu in vivo, a ukazují na použitelnost protilátek podle předkládaného vynálezu pro léčbu GVH nemoci.
Příklad 15. Protinádorová terapeutická aktivita TRA-8
4* · • · · 4 » 4 4 ·* « · 4 4· *
4
4 4* ·· ·
4·
4 4 4 4· ·
15.1 Exprese a funkce DR5 v lidské nádorové tkáni a buněčných liniích
i) DR5 exprese v lidských nádorových tkáních stanovená in sítu barvením pomocí TRA-8. Pro stanovení toho, zda nádorové buňky a tkáně odlišně exprimují vyšší koncentrace DR5 se panel lidských nádorových tkání, včetně více než 20 karcinomů prsu, 6 karcinomů vaječníků, 5 karcinomů tlustého střeva a 5 karcinomů prostaty, barvil TRA-8 pro imunohistochemické vyšetření. Většina z těchto nádorových tkání exprimovala detekovatelnou expresi DR5. Úroveň exprese DRS v těchto nádorových tkáních byla různá. Obecně, nádorové tkáně exprimují vyšší koncentrace DR5 než nenádorové tkáně. Dále, DR5 exprese nekoreluje s mutacemi p53.
ii) Exprese a funkce DR5 v lidských nádorových buněčných liniích (Tabulka 2) lidských buněčných linií karcinomu prsu, 3 buněčné linie karcinomu ovaria, 3 buněčné linie karcinomu vaječníků a 3 buněčné linie karcinomu prostaty se testovaly na povrchovou expresi DR5 a citlivost na TRA-8-indukovanou apoptosu in vitro. 7 z 9 buněčných linií karcinomu prsu, 3 ze 3 buněčných linií karcinomu vaječníků, 3 ze 3 buněčných linií karcinomu tlustého střeva a 3 ze 3 buněčných linií karcinomu prostaty exprimují různé koncentrace povrchového DR5. Z 9 buněčných linií karcinomu prsu jsou tři velmi citlivé, tři středně citlivé a tři resistentní na TRA-8-zprostředkovanou apoptosu. Všechny tři buněčné linie karcinomu vaječníků jsou velmi citlivé. 1 ze 3 buněčných linií karcinomu tlustého střeva je velmi citlivá, zatímco další dvě mají různou sensitivitu. 2 ze 3 buněčných linii karcinomu prostaty mají střední sensitivitu a jedna je resistentní.
* » ♦ ·
Tabulka 2. Exprese a funkce DRS v lidských nádorových buněčných liniích
Buněčná linie Zdroj “ Exprsese 1 (CitlivostJ
2LMP prs 4- 4444-
LCC6 prs . +++ 4444-
MB468 prs +44- 444-
MB231 ors ++ 444-
ZR-75-1 prs. 444- 44-
SKBR3 prs + ' 44-
MB453 prs 44- . 4-
BT474 prs + -
DY36T2 prs - -
Caov-3 vaječník 4- 4444-
OVCAR-3 vaječník 44- 4444-
Skov-3 vaječník 4- 444-
WiDR tlusté střevo +44- 4444-
HST29 tlusté střevo 44- 444-
T84 tlusté střevo 4- 44-
PC3 prostata 444- 44-
LnCap ’ prostata 444- 4-
Du-145 prostata 444- 4-
Poznámky: (1) určeno průtokovou cytometrií, buňky barvené 20 ug/ml TRA-8 a srovnávány s kontrolní protilátkou. (2) určeno APLite testem. ++++: více než 80% usmrcení; +++ 60^0% usmrcení; ++: usmrcení mezi 40^60%; usmrcení mezi 20^0%; -: bez usmrcení.
iii) Kombinovaná cytotoxicita TRA-8 s adriamycinem. Na několika buněčných liniích karcinomu prsu se testoval efekt adriamycinu na TRAS-indukovanou apoptosu. Vysoké dávky adriamycinu vykazovaly •2» aditivní efekt. Nicméně, v některých TRA-8 rezistentních liniích nízké dávky adriamycinu synergně zesilovaly TRA-8-indukovanou apoptosu.
iv) In vitro a in vivo vazebná aktivita TRA-8 na lidské nádorové buňky. Za použití radioizotopem značené TRA-8 se vazebná aktivita TRA-8 na buněčnou linii karcinomu prsu testuje in vitro a in vivo na SCID myších s implantovanými nádory. In vitro vazebná aktivita » · na nádorové buňky je Kd hodnota = nM, což je v souladu s dřívějšími testy za použití ELISA, a alespoň SO^krát vyšší než pro solubilní TRAIL. In vivo se TRA-8 lokalizuje do implantované nádorové tkáně.
15.2 Terapie chronické lymfatické leukemia u NOD/SCID myší pomocí TRA-8
Chronická lymfatická leukemie (CLL) je běžnou formou
B lymfocytární malignity. Většina maligních B lymfocytů u CLL má zralý fenotyp a jsou rezistentní na většinu apoptotických stimulů. Testuje se exprese a funkce DR5 u B lymfocytů od pěti pacientů s CLL. Všichni pacienti mají vysoké hodnoty periferních
B lymfocytů, jak je patrné z více než 95^ CD19+ B lymfocytů v PBMC. Ve srovnání s normálními primárními B lymfocyty mají CLL
B lymfocyty od všech pacientů vyšší koncentrace povrchového DR5 a jsou více citlivé na TRA-8 indukovanou apoptosu in vitro.
Zajímavé je, že CLL B lymfocyty jsou také sensitivní na bisindolmaleimidem VIII (BisVIII) indukovanou cytotoxicitu. Po kombinované aplikaci TRA-8 a BisVIII je téměř 5oj% CLL B lymfocytů usmrceno, zatímco normální B lymfocyty zůstávají bez reakce (obr.
18). Transfer CLL B lymfocytů do NOD/SCID myši vede k repopulaci přibližně 23%ý3a% CDI9+ B lymfocytů ve slezině myši 5 dnů po transferu. Nicméně, tři dávky 100 ug TRA-8 zcela eliminují CLL B lymfocyty u 4 z 5 pacientů ve slezině SCID myší. Proto je TRA-8 samostatně nebo společně s dalšími substancemi aktivní jako terapeutické činidlo pro léčbu chronické lymfatické leukemie.
Příklad 16. Klonování cDNA (1) Určení N-koncové aminokyselinové sekvence těžkého a lehkého řetězce TRA-8
- 85 Pro získání cDNA těžkého a lehkého řetězce TRA-8 se N-koncové aminokyselinové sekvence těžkého a lehkého řetězce TRA-8 a klonované TRA-8 geny určí za použití známých technik.
ug roztoku obsahujícího protilátku TRA-8 proti lidskému DR5 se zpracuje na SDS-polyakrylamidové gelové elektroforese (SDS-PAGE) za použití koncentrace gelu 12% hmot./obj., V konstantního napětí 100 V, během 120 minut. Po elektroforese se gel ponoří do přenosového pufru 25mM Tris-HCl (pH 9,5), 20% methanol, 0,02% obj./obj. SDS, na dobu 5 minut. Po této době se protein obsažený v gelu přenese na polyvinyliden-difluoridovou membránu (PVDF membránu; velikost pórů 0,45 um; Millipore, Japan), předem namočenou v přenosovém pufru, za použití blotting přístroje (KS-S45 1; Marysol), za podmínek konstantní napětí 10 V, 4 °C, během 14 hodin.
Po této době se PVDF membrána promyje promývacím pufrem (25 mM NaCl, 10 mM pufr boritanu sodného) (pH 8,0), potom se barví v barvícím roztoku (50% obj./obj. methanol, 20% obj./obj. kyselina octová a 0,05% hmot./obj. Coomassie Brilliant Blue) po dobu 5 minut pro lokalizaci proteinových proužků. PVDF membrána se potom odbarví 90% obj./obj. vodným methanolem a proužky odpovídající těžkým řetězcům, proužky s malou mobilitou a lehké řetězce a proužky s vyšší mobilitou dříve lokalizované na PDVF membráně se vyříznou a promyjí se deionizovanou vodou.
N-koncové aminokyselinové sekvence těžkého a lehkého řetězce se určí Edmanovým automatizovaným způsobem (Edman, P., a kol., (1967), Eur. J. Biochem., 1, 80) za použití proteinového sekvenátoru s plynnou fází (PPSQ-10; Shimadzu Seisakusyo, K. K.).
N-koncová aminokyselinová sekvence proužku odpovídajícímu těžkému řetezci se určí jako:
« » a » · ·
• · » » » » · <· ♦ » * ·
- 86 Glu-Val-Met-Leu-Val-Glu-Ser-Gly-Gly-Gly-Leu-Val-Lys-Pro-Gly-Gly-Ser-Leu-Lys-Leu (SEQ ID No.4 seznamu sekvencí);
a proužek odpovídající lehkému řetězci se určí jako:
Asp-Ile-Val-Met-Thr-Gln-Ser-His-Lys-Phe-Met-Ser-Thr-Ser-Val-Gly-Asp-Arg-Val-Ser (SEQ ID No. 5 seznamu sekvencí).
Srovnání této aminokyselinové sekvence s databází aminokyselíných sekvencí protilátek podle Kabat a kol. (Kabat E.A., a kol., (1991), v Sequences of Proteins of Immunological Interest Vol.11, U.S. Department of Health and Human Services) ukázalo, že těžké řetězce (gammal řetězce) a lehké řetězce (kappa řetězce) TRA-8 patří k podtypům 3d a 1, v příslušném pořadí.
(2) cDNA klonování
Podle výše uvedených zjištění se synetizují oligonukleotidové primery, které budou hybridizovat na části 5'-netranslatovaných regionů a konce 3'-translatovaných regionů těchto genů náležících k těmto myším subtypům. Potom se cDNA kódující těžké a lehké řetězce TRA-8 klonují následující kombinací reverzní transkripce a PCR (RT-PCR):
a) Templát
Celková RNA TRA-8 hybridomů (ATCC č. PIA-1428) se extrahuje za použití TRIzol Reagent (GIBCO BRL). Jako templát pro PCR reakci se použije cDNA, která se získá za použití First-Strand cDNA Synthesis kitu (Amersham Pharmacia Biotech) podle návodu výrobce kitu.
b) PCR primery ·
• ·
Následující oligonukleotidové primery se syntetizují pro PCR:
5'-cagcactgaa sekvencí);
5'-aaaggtaatt sekvencí);
5'-cctcaccatg sekvencí);
5'-ctgttgtatg sekvencí);
5'-gaagtgatgc sekvencí);
5'-agtgtgaagt sekvencí);
5'-tttaccagga sekvencí);
cacggacccc-3' tattgagaag-3' aacttcgggc-3' cacatgagac-3' tggtggagtc-3' gatgctggtg-3' gagtgggaga g(H5NCS1: SEQ II (H5NCS2: SEQ II (H5SS1: SEQ ID (H5552: SEQ ID (H5CS1: SEQ ID (H5CS2: SEQ ID ' (H3CR: SEQ I
No.6 seznamu i No. 7 seznamu
No. 8 seznamu
No. 9 seznamu
No. 10 seznamu
No. 11 seznamu ) No. 12 seznamu
5'-tgcagagaca gtgaccagag-3' (H3VR: SEQ ID No. 13 seznamu sekvencí);
5'-tgttcaggac cagcatgggc-3' (L5NCS1: SEQ ID No. 14 seznamu
sekvencí);
5'-aagacatttt ggattctaac-3' (LSNCS2: SEQ ID NO. 15 seznamu
sekvenci);
5'-tatcatgaag tctttgtatg-3' (L5SS 1: SEQ ID No. 16 seznamu
sekvencí);
5'-gatggagaca cattctcagg-3' (L5S52: SEQ ID No. 17 seznamu sekvencí);
5’-gacattgtga tgacccagtc-3' (LSCS: SEQ ID NO. 18 seznamu
sekvencí);
5'-ttaacactca ttcctgttga-3' (L3CR: SEQ ID No. 19 seznamu
sekvencí); a
5'-gactgggtca tcacaatgtc-3’ (LCSR: SEQ ID No. 20 seznamu
sekvencí).
· · *
» 9 • *· ·· a · · ·· • a·
9» » »
- 88 —
Pokud není uvedeno jinak, tak se všechny oligonukleotidy v těchto příkladech syntetizují za použití Pharmacia Biotech.
Všechny oligonukleotidy se uskladní se při -20 °C po rozpuštění v destilované vodě.
c) PCR reakce
Složení PCR reakčního roztoku:
templátová cDNA, 5 ul celkem 33 ul reakční směsi primer 1, 10 pmol;
primer 2, 10 pmol;
lOx koncentrovaný PCR pufr (obsažený v kitu), 10 ul; dNTP (každý 2,5 mM), 4 ul; a
Taq polymerasa (Promega), 5 jednotek.
Sterilní destilovaná voda se přidá do roztoku do celkového objemu 100 ul. Pokud není uvedeno jinak, jsou dNTP ekvimolámí směs dATP, dCTP, dGTP a dTTP (2,5 mM každý).
PCR reakce se provede následujícím způsobem. Roztok se nejprve zahřívá při 94 °C po dobu 2 minut, potom se provede cyklus zahřívání na 94 °C na dobu 30 sekund, 52 °C na dobu 1 minuty a 72 °C na dobu 3 minut, který se opakuje 4o|-krát. Po dokončení tohoto postupu se reakční roztok zahřívá při 72 °C po dobu 10 minut.
Takto získané amplifikované DNA fragmenty se separují na 1% agarosovém gelu obsahujícím 0,25 ug/ml ethidiumbromidu. Proužky obsahující požadované DNA fragmenty se vyříznou za použití čepelky a DNA se získá z těchto proužků za použití Gene Clean kitu (BI0101). DNA fragment se klonuje za použití pGEM-T Easy vektoru (Promega). Toto se provede následujícím způsobem.
W · ·>·*»· • · · 9 9 9 *
9 9 9 9 9 9 99<
• 9 9 3 9 *99 9 ♦ *’
9 9 · · · *
- 89DNA fragment získaný z PCR reakčního roztoku, společně s 50 ng pGEM-I Easy vektoru (obsaženého v kitu), se smísí s 1 ul 10 X ligasového reakčního pufru (6 mM Tris-HCl (pH 7,5), 6 mM chlorid horečnatý, 5 mM chlorid sodný, 7mM beta-merkaptoethanol, 0,1 mM ATP, 2 mM DTT, 1 mM spermidinu a 0,1 mg/ml hovězího sérového albuminu), do kterého se přidaly 4 jednotky 14 DNA ligasy (1 ul). Celkový objem směsi se upraví na 10 ul sterilní deionizovanou vodou a získaný ligasový roztok se inkubuje při 14 °C po dobu 15 hodin. Po této době se 2 ul ligasového reakčního roztoku přidají k 50 ul kompetentních E. coli kmene JM1O9 (obsažené v kitu a uvedené do kompetence podle návodu výrobce), do kterých se přidaly 2 ul 0,5 M beta-merkaptoethanolu, a získaná směs se ponechá naledu po dobu 30 minut, potom při 42 °C po dobu 30 sekund a znovu na ledu po dobu 5 minut. Potom se do kultury přidá 500 ul media obsahujícího 2% obj./obj. tryptonu, 0,5% hmot./obj. kvasinkového extraktu, 0,05% hmot./obj. chloridu sodného, 2,5 mM chloridu draselného, 1 mM chloridu hořečnatého a 20 mM glukosy (zde dále označované jako SOC” medium) a směs se inkubuje po dobu 1 hodiny při 37 °C za třepání. Po této době se kultura rozšíří na L-bujonové agarové plotně (1% obj./obj. trypton, 0,5% hmot./obj. kvasinkový extrakt, 0,5% hmot./obj. chlorid sodný, 0,1% hmot./obj. glukosa a 0,6% hmot./obj. bacto-agar (Difco)), obsahující 100 pg/ml. Kolonie resistentní na ampicilin objevivší se na plotně se selektují a seškrábnou se platinovou kličkou a provede se kultivace v L-bujonovém mediu obsahujícím 100 pg/ml ampicilinu při 37 °C, přes noc, za třepání při 200 r.p.m. Po inkubaci se buňky odeberou odstředěním a alkalickou technikou se z nich připraví plasmidová DNA. Získaný plasmid se označí jako plasmid pH62 pro těžké řetězce TRA-8 nebo pL2S pro lehké řetězce TRA-8. Transformované kmeny E. coli nesoucí tento plasmid, označené jako E. coli TM109/pH62 a E. coli JMI 09/pL28, se uložily v International Patent Organism Depositary, National Institute of Advanced Industrial Science and Technology, 1-1, Higashi 1 chome »
>
-9 > » »
Tsukuba-shi, Ibaraki-ken, 305-5466, Japan, 20.4.2001, podle Budapeštské smlouvy pro ukládání mikroorganismů, a označily se přírůstkovými č. FELM BP-7560 a FERM BP-7561, v příslušném pořadí. Nukleotidové sekvence těchto DNA kódujících těžké řetězce a lehké řetězce TRA-8 se potvrdily dideoxy technikou (Sanger, F. S., et al., (1977), Proč. Nati. Acad. Sci. USA, 74:5463-5467) za použití 3700 DNA Analyzeru (ABI PRISM; Perkin Elmer Applied Biosystems, Japan).
Nukleotidové sekvence těžkého a lehkého řetězce TRA-8 jsou uvedeny jako SEQ ID No.21 a No.22 seznamu sekvencí, v příslušném pořadí. Aminokyselinové sekvence těžkého a lehkého řetězce TRA-8 jsou uvedeny jako SEQ ID No. 23 a No. 24 seznamu sekvencí, v příslušném pořadí. N-koncové aminokyselinové sekvence těžkého a lehkého řetězce TRA-8 uvedené výše přesně odpovídají. Dále, když jsou aminokyselinové sekvence těžkého a lehkého řetězce srovnávány s databází aminokyselinové sekvence protilátek, zjistí se, že pro těžké řetězce tvoří nukleotidy 58 až 414 SEQ ID No. 21 variabilní region, zatímco nukleotidy 415 až 1392 SEQ ID No. 21 tvoří konstantní region. Pro lehké řetězce tvoří nukleotidy 64 až 387 SEQ ID No. 22 variabilní region, zatímco nukleotidy 388 až 702 SEQ ID No. 22 tvoří konstantní region. Umístění a sekvence CDR se také hodnotí srovnáním homologií s databází. Aminokyselinové sekvence CDR 1, CDR2 a CDR3 těžkého řetězce TRA-8 jsou uvedeny v SEQ ID No. 25, No. 26 a No. 27, v příslušném pořadí. Aminokyselinové sekvence CDR1, CDR2, a CDR3 lehkého řetězce TRA-8 jsou uvedeny v SEQ ID No. 28, No. 29, a No. 30, v příslušném pořadí.
Příklad 17. Konstrukce humanizované verze TRA-8 protilátky (1) Molekulární modelování variabilního regionu TRA-8
Molekulární modelování variabilního regionu TRA-8 se provede • 4 · ··».·»♦9 • · 4 » ♦ · * • 444 · 4 4 4 4»
4444444 4 4 «<
4 4 » · ·« • > « >44>4«·
-91 způsobem obecně známým jako homologické modelování (Methods in Enzymology, 203, 121-153, (1991)). Primární sekvence variabilních regionů lidského imunoglobulinu registrované v Protein Data Bank (Nuc. Acid Res. 28, 235-242 (2000)), jejichž trojrozměrné struktury se určí rentgenovou krystalografií, se srovnávají s pracovními regiony TRA-8 určenými výše. Tak se selektují 1NCD a 1HIL jako sekvence mající nejvyšší homologíi sekvence s pracovními regiony pro lehké a těžké řetězce TRA-8, v příslušném pořadí. Trojrozměrné struktury pracovních regionů se získají kombinováním kordinát 1NCD a 1HIL, které odpovídají lehkým a těžkým řetězcům TRA-8, za zisku modelu pracovního rámce. Za použiti klasifikace definované Chothia a kol. se CDR TRA-8 klasifikují následujícím způsobem; CDRL1, CDRL2, CDRH1 a CDRH2 náleží ke kanonickým třídám 2,1,1,3, v příslušném pořadí, zatímco CDRL3 nenáleží do žádné specifické kanonické třídy. CDR smyčky CDRL1, CDRL2, CDRH1, CDRH2 mají konformaci fixovanou na příslušné kanonické třídy a jsou integrovány do modelu pracovního rámce. CDRL3 je zařazen do konformační skupiny SA, podle klasifikace dle Thornton a kol. (J. Mol. Biol., 263, 800-815, (1996)), a CDRH3 je klasifikován do k(8)C za použití H3 pravidla (FEBS Letter 455,188-197(1999)). Potom se reprezentativní konfromace pro CDRL3 a CDRH3 integrují do modelu pracovního rámce.
Nakonec se provede energetická kalkulace pro vyloučení nepříznivých inter-atomárních kontaktů, za zisku pravděpodobného molekulového modelu variabilního regionu TRA-8 ve smyslu energetického uspořádání. Výše uvedená procedura se provede za použití komerčně dostupného běžného systému pro molekulární modelování ABM (Oxford Molecular Limited, lne.). Pro získaný molekulový model se přesnost struktury dále hodnotí za použití softwaru PROCHECK (J. Appl. Cryst. (1993), 26, 283-291).
(2) Konstrukce aminokyselinové sekvence pro humanizovanou TRA-8.
9 » '4 Μ ♦
-92nepříznivých inter-atomárních kontaktů, za zisku pravděpodobného molekulového modelu variabilního regionu TRA-8 ve smyslu energetického uspořádání. Výše uvedená procedura se provede za použití komerčně dostupného běžného systému pro molekulární modelování ABM (Oxford Molecular Limited, lne.). Pro získaný molekulový model se přesnost struktury dále hodnotí za použití softwaru PROCHECK (J. Appl. Cryst. (1993), 26, 283-291).
(2) Konstrukce aminokyselinové sekvence pro humanizovanou TRA-8.
Konstrukce humanizovaných TRA-8 protilátek se provede způsobem obecně známým jako přenos CDR (Proč. Nati. Acad. Sci. USA 86, 10029-10033 (1989)). Akceptorová protilátka se vybere podle aminokyselinové homologie v pracovním regionu. Sekvence pracovního regionu TRA-8 se srovnávají se všemi lidskými pracovními sekvencemi v Kabat databasy aminokyselinových sekvencí protilátek (Nuc. Acid Res. 29, 205-206 (2001)). Tak se selektuje mAB58'CL protilátka jako akceptor v důsledku vysoké homologie sekvence (80%) pro pracovní region. Aminokyselinové zbytky v pracovním regionu pro mAb58'CL se seřadí se zbytky pro TRA-8 a identifikují se pozice, ve kterých jsou různé aminokyseliny. Lokalizace těchto zbytků se analyzuje za použití trojrozměrného modelu TRA-8 připraveného výše a donorové zbytky, které mají být přeneseny na akceptor, se připraví podle kriterií uvedených v Queen a kol. (Proč. Nati. Acad. Sci. USA 86, 10029-10033 (1989)). Humanizované TRA-8 sekvence se připraví způsobem popsaným v následujícím příkladu pomocí přenosu několika donorových zbytků na akceptorovou protilátku, mAb58'CL.
Příklad 18. Konstrukce expresního vektoru pro těžké řetězce humanizované protilátky (1) Konstrukce plasmidu nesoucího DNA pro variabilní region
- 93 těžkého řetězce humanizované TRA-8 •2.
Pro stanoveni aktivity humanizované TRA-8 se plazmid nesoucí těžké řetězce humanizované TRA-8 konstruuje Následujícím způsobem. Nicméně, humanizace TRA-8 není tímto příkladem omezena.
Jak je uvedeno v SEQ ID No. 31 seznamu sekvencí, humanizace aminokyselinové sekvence těžkého řetězce myší protilátky TRA-8 proti lidskému DR5 zahrnuje nahrazení 13. aminokyseliny (lysinu),
19. aminokyseliny (lysinu), 40. aminokyseliny (threoninu), 42. aminokyseliny (kyseliny glutamové), 44. aminokyseliny (argininu), 84. aminokyseliny (šeřinu), 88. aminokyseliny (šeřinu), 93. aminokyseliny (methioninu), 114. aminokyseliny (threoninu), 115. aminokyseliny (leucinu) glutaminem, argininem, alaninem, glycinem, glycinem, asparaginem, alaninem, valinem, leucinem a valinem, v příslušném pořadí.
Plasmidy nesoucí DNA kódující variabilní region těžkého řetězce humanizované TRA-8 (SEQ ID No. 31 seznamu sekvencí) se konstruují následujícím způsobem.
PCR se použije pro přípravu následujících DNA sekvencí, z nichž každá byla popsána výše:
Syntetizuje se následujících 12 oligonukleotidů:
5'-ttggataagc ttggcttgac ctcaccatgg gatggagctg tatcatcctc ttcttggtag caacagctac aggtgtccac-3' (A; SEQ ID No. 32);
5'-tctgaagtaa tgctggtgga gtctggggga ggcttagtac agcctggagg gtccctgaga ctctcctgtg cagcctctgg-3' (B; SEQ ID No. 33);
5'-attcactttc agtagttatg taatgtcttg ggttcggcag gcaccaggga í? · — 94 agggtctgga gtgggttgca accattagta-3' (C; SEQ ID No. 34);
5'-gtggtggtag ttacacctac tatccagaca gtgtgaaggg ccgattcacc atctccagag acaatgccaa gaacaccctg-3' (D; SEQ ID No. 35);
5'-tatctgeaaa tgaacagtct gagagcagag gacacggctg tttattactg tgcaagaagg ggtgactcta tgattacgac-3’ (E; SEQ ID No. 36);
5'-ggactactgg ggccaaggga ccctggtcac agtctcctca gcctc cacc aagggcccat cggtc-3' (F; SEQ ID No. 37);
5'-ctaccaagaa gaggatgata cagctccatc ccatggtgag gtcaagccaa gcttatccaa-3' (G; SEQ ID No. 38);
5'-tctcagggac cctccaggct gtactaagcc tcccccagac tccaccagca ttacttcaga gtggacacct gtagctgftg-3' (H; SEQ ID No. 39);
5'-tccagaccct tccctggtgc ctgccgaacc caagacatta cataactact gaaagtgaat ccagaggctg cacaggagag-3' (I; SEQ ID No. 40);
5'-ctctggagat ggtgaatcgg cccttcacac tgtctggata gtaggtgtaa ctaccaccac tactaatggt tgcaacccac-3' (J; SEQ ID No. 41);
5<x>- ccttcttgca cagtaataaa cagccgtgtc ctctgctcte agactgttca tttgcagata cagggtgttc ttggcattgt-3' (K; SEQ ID No. 42); a
5'- gaccgatggg cccttggtgg aggctgagga gactgtgacc agggtccctt ggccccagta gtccgtcgta atcatagagt cacc-3' (L; SEQ ID No. 43).
Následující 2 PCR primery se syntetizují způsobem popsaným výše:
5'- ttggataagc ttggcttgac-3' (Pl; SEQ ID No.44); a
-95 5'- gaccgatggg cccttggtgg a-3' (P2; SEQ ID No. 45).
Syntéza DNA kódující polypeptidový řetězec obsahující sekvenci sekrečního signálu, variabilního regionu humanizovaného TRA-8 těžkého řetězce a 8 aminokyselinových zbytků na N-konci IgG-CHl regionu se provede za použití příslušné kombinace PCR.
DNA fragment se připraví následujícím způsobem.
Složení PCR reakčního roztoku:
oligonukleotid A, 10 pmol;
oligonukleotid B, 10 pmol;
oligonukleotid C, 10 pmol;
oligonukleotid D, 10 pmol;
oligonukleotid E, 10 pmol;
oligonukleotid F, 10 pmol;
oligonukleotid G, 10 pmol;
oligonukleotid H, 10 pmol;
oligonukleotid I, 10 pmol;
oligonukleotid J, 10 pmol;
oligonukleotid K, 10 pmol;
oligonukleotid L, 10 pmol;
oligonukleotidový primer Pl, 2 uM;
oligonukleotidový primer P2, 2 uM;
10X Pyrobest pufr II, 10 ul;
dNTP směs, 8 ul;
Pyrobest DNA polymerasa, 0,5 ul; a
Redestilovaná voda do celkového objemu 50 ul.
PCR reakce se provede následujícím způsobem. Roztok se nejprve zahřívá při 94 °C po dobu 5 minut, potom se provede cyklus zahřívání při 98 °C po dobu 10 sekund, 55 °C po dobu 30 sekund • * a 72 °C po dobu 1 minuty, který se opakuje 7-krát. Po dokončení tohoto postupu se reakční roztok zahřívá při 72 °C po dobu 15 minut.
Stejný objem fenol-chloroformu (50% obj./obj. fenol nasycený vodou, 48% obj./obj. chloroform, 2% obj./obj. isoamylalkohol) se přidá k 200 ul každého PCR produkty a směs se důkladně mísí po dobu 1 minuty. Po této době se směs odstředí při 10,000 X g, a odebere se vodná vrsva a smísí se se stejným objemem chloroformu-isoamylalkoholu (96% obj./obj. chloroformu a 4% obj./obj. isoamylalkoholu), a směs se opět odstředí při 10,000 X g a odebere se vodná vrstva. Série uvedených kroků se označuje jako fenolová extrakce).
Potom se provede srážení získané vodné vrstvy ethanolem. Termín srážení ethanolem, jak je zde použit, označuje přidání, za míšení, 1/10 objemu 3M octanu sodného (pH 5,2) a 2,5 objemů 100% ethanolu do roztoku, který je zpracováván, a zmrazení směsi za použití suchého ledu. Získaná směs se potom odstředí při 10,000 X g za zisku DNA ve formě sraženiny.
Po fenolové extrakci a srážení ethanolem se získaná DNA sraženina suší ve vakuu, rozpustí se v minimálním objemu redestilované vody a separuje se elektroforesou na 3% agarosovém gelu. Po elektroforese se gel barví 1 ug/ml vodným roztokem ethidiumbromidu pro umožnění detekce DNA pomocí UV záření. DNA proužek odpovídající humanizované TRA-8 DNA se vyřízne za použití čepelky a eluuje se z gelu za použití Geneclean Spin Kitu (BIO 101, CA, USA). Po fenolové extrakci se eluovaná DNA zahustí odstředěním při 7,500 X g, potom se provede sráženi ethanolem a nakonec se DNA rozpustí v 5 ul destilované vody.
Potom se každá extrahovaná DNA klonuje za použití pGEM-T Easy » » « « · • 9 9* • 9 9 » ) » * • * ·
-97 vektoru (Promega) následujícím způsobem:
DNA fragment získaný z PCR reakce, 5 ul;
X Taq polymerasový pufr, 1 ul; dNTP směs, 1 ul;
Taq polymerasa (5 jednotek/ml), 1 ul; a redestilovaná voda do konečného objemu 10 ul.
Poté, co každý roztok reaguje při 70 °C po dobu 30 minut, se každý DNA roztok a pGEM-T Easy vektor ligují za použití DNA Ligation Kitu Verze 2.0 (Takara Shuzo Co., Ltd.) podle návodu výrobce.
Po 4 hodinové inkubaci při 15 °C se 2 ul inkubovaného reakčního roztoku smísí s 100 ul kompetentních E. coli kmene JM109 při hustotě buněk 1-2 x 109 buněk/ml (Takara Shuzo Co., Ltd.), a směs se umístí na led na dobu 30 minut, potom se ponechá při 42 °C po dobu 30 sekund a znovu se umístí na led na dobu 1 minuty. Potom se do směsi přidá 500 ul SOC medium (2% obj./obj. trypton, 0,5% hmot./obj. kvasinkový extrakt, 0,05% hmot./obj. chlorid sodný, 2,5 mM hmot./obj. chlorid draselný, 1 mM chlorid hořečnatý a 20 mM glukosa) a provede se inkubace po dobu další hodiny, za třepání.
Potom se izolují transfromované kmeny ímidová DNA se připraví z těchto kmenů způsobem popsaným v Molecular Cloning A Laboratory Manual. Nukleotidová sekvence těchto DNA kódujících těžké řetězce humanizované TRA-8 se potvrdí dideoxy způsobem (Sanger, F.S., et al., (1977), Proč. Nati. Acad. Sci. USA, 74:5463-5467) za použití 3700 DNA Analyzeru (ABI PRISM; Perkin Elmer Applied Biosystems, J apan).
Získané pla^midy se označený jako pHBI4 (plazmid nesoucí cDNA kódující těžké řetězce humanizované TRA-8). Transformované E. coli kmene nesoucího tento plasmid, označené jako E. coli JMlO9/pHB14, « « ·-9 » • · · · • ··· · · » · ·5 t • ··«*«·< ·· t • « · · ♦V « · «····«
- 98 se uložily v International Patent Organism Depositary, National Institute of Advanced Industrial Science and Technology, 1-1, Higashi 1 chome Tsukuba-shi, Ibaraki-ken, 305-5466, Japan, 20.4.2001, Podle Budapešťské smlouvy o ukládání mikroorganismů, pod přírůstkovým č. FERM BP-7556.
z.
(2) Konstrukce expresních pla$midů nesoucích DNA pro variabilní region těžkého řetězce humanizované TRA-8
Rekombinantní expresní vektory pro živočišné buňky se konstruují insercí DNA kódující těžké řetězce humanizované TRA-8 (klonované výše) následujícím způsobem.
x ug plazmidu pSRHHH3 (Evropská patentová přihláška EP 0-909-816-A1) nesoucího variabilní region těžkého řetězce humanizované anti-Fas monoklonální protilátky HFE7A a genomovou DNA pro konstantní region lidského IgGl, expresní vektor pro savčí buňky, se tráví restrikčními enzymy HindHI a Apal, a separuje se elektroforesou na 3% agarosovém gelu. Po elektroforese se gel barví 1 ug/ml vodným roztok etidium- bromidu pro umožnění detekce DNA pomocí UV světla. Proužky vektorové DNA obsahující genomovou DNA pro lidský IgGl konstantní region bez variabilního regionu těžkého řetězce humanizované HFE7A se vyříznou za použití čepelky a eluují se z gelu za použití Geneclean Spin Kitu (BIO 101, CA, USA). Po fenolové extrakci se eluovaná DNA potom zahustí odstředěním při 7,500 x g, potom se provede srážení ethanolem a nakonec se DNA rozpustí v 5 ul destilované vody a potom se defosforyluje za použití CIP. Získaný trávený, defosforylovaný plasmid (100 ng) se liguje s 1 ug pHB14 DNA fragmentu obsahujícím DNA kódující variabilní region těžkého řetězce humanizované TRA-8, který se také tráví HindHI a Apal, za použití DNA Ligation Kitu Verze 2.0 (Takara Shuzo Co., Ltd.). Ligační směs se potom použije pro transformaci E. coli JM1O9, které se potom kultivují » ··
99 •9 ·
» 1 *9 • · ·· > 9
19 9 9« • 9 99 • J «· » «
- 99 na LB agarových plotnách obsahujících 50 ug/ml ampicilinu.
Transformanty získané tímto způsobem se kultivují v 2 ml kapalného LB media obsahujícího 50 ug/ml ampicilinu při 37 °C přes z.
noc a pla^midová DNA se potom extrahuje ze získané kultury metodou alkalické činidlo-SDS.
z.
Extrahovaná pla$midová DNA se tráví HindlII a Apal a zpracuje se elektroforesou na 3% hmot./obj. agarosovém gelu pro potvrzení přítomnosti či nepřítomnosti insertu DNA kódujícího variabilní region těžkého řetězce humanizované TRA-8. Inserce a orientace požadovaného DNA fragmentu ve vektoru se potvrdí DNA sekvenováním za použití analyzátoru genové sekvence (ABI Prism 3700 DNA Analyzer; Applied Biosystems). Získaný expresní plazmid nesoucí cDNA kódující těžké řetězce humanizované TRA-8 se označí pHB14-l.
Příklad 19. Konstrukce expresního vektor pro lehké řetězce humanizované protilátky (1) Konstrukce vektorů pro lehké řetězce humanizovaných verzí TRA-8 protilátky
Jak je uvedeno v SEQ ID No. 46 seznamu sekvencí, při humanizaci aminokyselinové sekvence lehkého řetězce myší protilátky proti lidskému DR5 označené TRA-8 se 8. aminokyselina (histidin), 9. aminokyselina (lysin), 10. aminokyselina (fenylalanin), 11. aminokyselina (methionin), 13. aminokyselin (threonin), 20. aminokyselin (serin), 42. aminokyselina (glutamin), 43. (serin), 60. aminokyselina (kyselina aspaargová), 63. aminokyselina (threonin), 77. aminokyselina (asparagin), 78. aminokyselin (valin), 80. aminokyselin (serin) 83. aminokyselina (leucin), 85. aminokyselina (kyselina asparagová), 87. aminokyselina (fenylalanin) a 99. aminokyselin (glycin), 103. aminokyselina • · · > · « · • 4» » ♦ » · · • · · · • · • · 4 · • ·
Jí ·
- 100 (leucin) a 108. aminokyselina (alanin) z N-konce aminokyselinové sekvence lehkého řetězce TRA-8 nahradí prolinem, serinem, serinem, leucinem, alaninem, threoninem, lysinem, alaninem, serinem, serinem, serinem, leucinem, prolinem, fenylalaninem, threoninem, tyrosinem, glutaminem, valinem a threoninem, v příslušném pořadí. Získaná sekvence se označí LM2.
Exprese plasmidů nesoucích tento typ aminokyselinové sekvence humanizovaného lehkého řetězce protilátky TRA-8 proti lidskému DR5 se konstruuje následujícím způsobem.
1) Syntéza primerů pro přípravu variabilních a konstantních regionů lehkého řetězce humanizované TRA-8
DNA kódující LM2 polypeptidový řetězec (SEQ ID No. 46 seznamu sekvencí), která je fúzí variabilního regionu lehkého řetězce humanizované protilátky TRA-8 proti DR5 a konstantního regionu lehkého řetězce lidského Ig (K řetězce) se v příslušném pořadí syntetizují za použití kombinací PCR.
Kromě 7AL1P (SEQ ID No. 47) a 7ALCN (SEQ ID No. 48), se následující oligonukleotidové primery syntetizují pro PCR:
5'- gtcccccaca gatgcagaca aagaacttgg agattgggtc atcacaatgt caccagtgga-3' (HKSPR11; SEQ ID No. 49);
5’-ccaagttctt tgtctgcatc agtaggagac agggtcacca tcacctgc-3' (HKCDFL1; SEQ ID No. 50);
5'- agtgtgccgg gtggatgccc agtaaatcag tagtttagga gctttccctg gtttctg-3' (HKCDR12; SEQ ID No. 51);
5'-tgggcatcca cccggcacac tggggtccca agcaggttta gtggcagt-3’ i » · (HKCDF22; SEQ ID No. 52);
5'- ataactacta tattgctgac agtaataggt tgcaaaatcc tccggctgca gactagagat ggt-3' (HKCDR22; SEQ ID No. 53); a
5'- cagcaatata gcagctatcg gacgttcggt caaggcacca aggtggaaat caaacggact gtg-3' (HKCF12; SEQ ID No. 54).
t.
2) Konstrukce pla$midu pClt3.1/M2-l (klonování lehkého řetězce humanizované TRA-8)
LM2-DNA fragment definovaný v SEQ ID No. 55 seznamu sekvencí kódující aminokyselinou sekvenci definovanou v SEQ ID No. 46 se „ £připraví provedením 2-stupňové PCR, invertuje se do pla^midového vektoru a klonuje se v E. coli.
a) První stupeň PCR
LM2-F 1-DNA fragment kódující sekvenci pro sekreční signál a část FRL1 regionu s místem pro Hind III restrikční enzym přidaným na 5<»-konec se připraví za následujících podmínek. Templářové pla^midy, pHSGHMl 7 a pSRPDHH, se získají postupem podle Evropské patentové přihlášky EP 0 909 816 Al.
Složení reakčního roztoku:
z plazmidová pHSOHM17 DNA (Evropská patentová přihláška EP 0 909 816 Al), 25 ng oligonukleotidový primer 7AL1P, 50 pmol oligonukleotidový primer HKSPR11, 50 pmol dNTP koktail, 5 ul lOxPCR pufr, 5 ul ampliTag DNA polymerasa (Perkin Elmer), 2,5 jednotky · · ·
- 102 Reakční roztok výše uvedeného složení se upraví na konečný objem 50 ul přidáním redestilované vody a použije se v PCR.
PCR termální podmínky: zahřívání při 94 °C po dobu 2 minut, potom se provede termální cyklus 94 °C po dobu 1 minuty, 5^ °C po dobu 1 minuty a 72 °C po dobu 2 minut, který se opakuje 30£krát, a potom se provede zahřívání při 72 °C po dobu 10 minut.
LM2-F2-DNA fragment kódující část FRL1, CDRL1, FRL2, a CDRL2 se připraví za následujících podmínek. Složení reakčního roztoku:
plasmidová pL28 DNA, 25 ng oligonukleotidový primer HKCDF11, 50 pmol oligonukleotidový primer HKCDR12, 50 pmol dNTPs kokteil, 5 ul lOxPCR pufr, 5 ul ampliTaq DNA polymerasa, 2,5 jednotky
Reakční roztok mající výše uvedené složení se upraví na konečný objem 50 pl přidáním redestilované vody a použije se v PCR.
PCR termální podmínky: Zahřívání při 94 °C po dobu 2 minut, potom se provede termální cyklus 94 °C po dobu 1 minuty, 55 °C po dobu 1 minuty a 72 °C po dobu 2 minut, který se provede 30-^krát, a potom se provede zahřívání při 72 °C po dobu 10 minut.
LM2-F3-DNA fragment kódující CDRL2, FRL3 a část CDRL3 se připraví za následujících podmínek.
Složení reakčního roztoku:
plasmidová pSRPDHH DNA (Evropská patentová přihláška EP 0909816 • > · · • · · · · * t • ··· · · · » · í « «·*«»«.· · · « » • · · · · · « « » 4 i · a » #
- 103 —
Al), 25 ng oligonukleotidový primer HKCDF22, 50 pmol oligonukleotidový primer HKCDR22, 50 pmol dNTP kokteil, 5 ul lOxPCR pufr, 5 ul ampliTaq DNA polymerasa, 2,5 jednotky
Reakční roztok mající výše uvedené složení se upraví na konečný objem 50 ul přidáním redestilované vody a použije se v PCR.
Vkrát,
PCR termální podmínky: Zahřívání při 94 °C po dobu 2 minut, potom se provede termální cyklus 94 °C po dobu 1 minuty, 55 °C po dobu 1 minuty a 72 °C po dobu 2 minut, který se provede 30 a potom se provede zahřívání při 72 °C po dobu 10 minut.
LM2-F4-DNA fragment kódující CDRL3, FRI4 a konstantní region s místem pro EcoRI restrikční enzym na 3'-konci se připraví za následuj ících podmínek.
Složení reakčního roztoku:
plasmidová pSRPDHH DNA, 25 ng oligonukleotidový primer HKCF 12, 50 pmol oligonukleotidový primer 7ALCN, 50 pmol dNTP kokteil, 5 ul lOxPCR pufr, 5 ul ampliTaq DNA polymerasa, 2,5 jednotky
Reakční roztok mající výše uvedené složení se upraví na konečný objem 50 ul přidáním redestilované vody a použije se v PCR.
PCR termální podmínky: Zahřívání při 94 °C po dobu 2 minut, potom se provede termální cyklus 94 °C po dobu 1 minuty, 55 °C po ϊ · ·
- 104 dobu 1 minuty a 72 °C po dobu 2 minut, který se provede 30^krát, a potom se provede zahřívání při 72 °C po dobu 10 minut.
Amplifikované DNA fragmenty po PCR se separují elektroforesou na 5% polyakrylamidovém gelu. Gel po elektroforese se nabarví 1 ug/ml ethidiumbromidu pro detekci získané DNA za použití UV světla. Příslušné DNA proužky se vyříznou z gelu za použití čepelky.
b) Druhý stupeň PCR
LM2-DNA, ve které jsou fúzovány výše popsané LM2-F1-DNA, LM2-F2-DNA, LM2-F3-DNA a LM2-F4-DNA fragmenty, se připraví za následuj ících podmínek.
Složení reakčního roztoku:
Gelový fragment LM2-F 1-DNA připravený v prvním stupni PCR,
Gelový fragment LM2-F2-DNA připravený v prvním stupni PCR, Gelový fragment LM2-F3-DNA připravený v prvním stupni PCR, Gelový fragment LM2-F4-DNA připravený v prvním stupni PCR oligonukleotidový primer 7AL1P, 50 pmol oligonukleotidový primer 7AI.CN, 50 pmol dNTP kokteil, 5,0 ul lOxPCR pufr, 5,0 ul ampliTaq DNA polymerasa, 2,5 jednotky
Reakční roztok mající výše uvedené složení se upraví na konečný objem 50 ul přidáním redestilované vody a použije se v PCR.
PCR termální podmínky: Zahřívání při 94 °C po dobu 2 minut, potom se provede termální cyklus zahřívání při 94 °C po dobu 1 minuty, 55 °C po dobu 1 minuty a 72 °C po dobu 2 minut, který se
t
- 105 opakuje 30^krát, a potom se provede zahřívání při 72 °C po dobu 10 minut.
Takto připravený LM2-DNA fragment se insertuje do pla$midové pCR3.1 DNA za použití Eukaryotic TA klonovacího kitu (Invitrogen) podle návodu výrobce a vnese se do kompetentních E. Coli TOP1OF' obsažených v kitu. Nukleotidová sekvence těchto DNA kódujících lehké řetězce humanizované TRA-8 se potvrdí dideoxy způsobem (Sanger, F.S., a kol., (1977), Proč. Nati. Acad. Sci. USA, 74:5463-5467) za použití 3700 DNA Analyzeru (AN PRISM; Perkin Elmer Applied Biosystems, Japan).
, z*
Získané plaimidy se označený pCR3.1/M2-l (plazmid nesoucí cDNA kódující lehké řetězce variabilního regionu humanizované TRA-8 a konstantní region lidského Ig lehkého řetězce).
Získaný plazmid pCR3.1/M2-l obsahující LM2-DNA fragment se tráví restrikčními enzymy HindlII a EcoRI.
x ug klonovací pla$midové pHSG399 DNA se tráví restrikčními enzymy Hind III a EcoRI a potom se defosforyluje CIP. Získaná defosforylovaná pHSG399 DNA a LM2-DNA fragment, které byly natráveny restrikčními enzymy Hind III a EcoRI, se ligují za použití DNA Ligation Kitu Verze 2.0 (Takara Syuzo, Co. Ltd.). Potom se E. coli DH5alfa transformují ligovanou DNA a kultivují se na LB agarovém mediu obsahujícím 0,1 mM IPTG, 0,1% X-Gal a 50 ug/ml chloramfenikolu (konečné koncentrace). Získané bílé transformanty se kultivují kapalném LB mediu obsahujícím 50 ug/ml chloramfenikolu, a pla^midová DNA se extrahuje ze získané kultury z.
technikou alkalické činidlo-SDS. Extrahovaná pla$midová DNA se tráví Hind III a EcoRI a potom se klon nesoucí LM2-DNA fragment selektuje za použití elektroforesy na 1% agarosovém gelu.
9· •» •· •»
9 *
*
V důsledku výše uvedeného postupu se získá plazmid pHSG/M2-l-4 nesoucí fúzní fragment variabilního regionu lehkého řetězce humanizované LM2 TRA-8 a konstantní region lidského Ig-kappa řetězce. Transformovaný kmen E coli nesoucí tento plaípmid, označený jako E. coli DH5alfa/pHSG/M2-l-4, se uložil v Intemational Patent Organism Depositary, National Institute of Advanced Industrial Science and Technology, 1-1, Higashi 1 chome Isukuba-shi, Ibaraki-ken, 305-5466, Japan, 20.4.2001, v souladu s Budapešťskou smlouvou pro ukládání mikroorganismů, a označil se přírůstkovým č. FERM BP-7563.
3) Konstrukce plazmidu pSR/M2-l (expresního plasmidu pro humanizované LM2 TRA-8 lehké řetězce)
Získaný plasmid pHSG/M2-l-4 nesoucí fúzní fragment variabilního regionu humanizovaného LM2 TRA-8 lehkého řetězce a konstantního regionu lidského Ig-kappa řetězce se tráví restrikčními enzymy HindiII a EcoRI.
ug klonovaci pla^midové pSRPDHH DNA (Evropská patentová přihláška EP 0-909-816-A1) se tráví restrikčními enzymy Hind III a EcoRI a potom se defosforyluje pomocí CIP. Získaná defosforylovaná pSRPDHH DNA a HindlII-EcoRI DNA fragment získaný z pHSG/M2-l-4 se ligují za použití DNA Ligation Kit Verze 2.0 (Takara Syuzo, Co. Ltd.). Potom se E. coli DH5alfa transformují ligovanou DNA a kultivují se na LB agaru. Získané transformanty se kultivují v kapalném LB mediu obsahujícím 100 ug/ml ampicilinu z.
a plazmidová DNA se extrahuje ze získané kultury za použití techniky alkalické činidlo-SDS. Inserce a orientace požadovaného DNA fragmentu v pSRPDHH vektoru se potvrdí DNA sekvenováním za použití analyzátoru genové sekvence (AN Prism 3700 DNA Analyzer; Applied Biosystems).
• · 9 «99« • ··» · · 9 9 »» • 99.*9··· · · ♦ * • · « · · · « • · · β · 9 9 ·i ^107 — ,χ
Získaný expresní plasmid nesoucí cDNA kódující lehké řetězce humanizované TRA-8 se označí pSR/M2-l.
Přiklad 20: Produkce humanizované protilátky
Transfekce COS-7 buněk, tj. buněčné linie odvozené z opičí
2.
ledviny, expresními plapmidy pro humanizované TRA-8 těžké řetězce a humanizované TRA-8 lehké řetězce získané výše se provede FUGENE6 technikou transfekce (Boehringer Mannheim Biochemica) podle návodu výrobce kitu.
COS-7 buňky (Američan Type Culture Collection No. CRL-1651) se kultivují do semi-konfluentního stavu (3 x 106 buněk/plotnu) v kultivačních discích (plocha kultury: 57 cm2; Sumitomo Bakelite) obsahujících Dulbeccovo modifikované Eagle medium (zde dále označované jako D-MEM; Gibco BRL) doplněné 10% fetálním telecím sérem (dále FCS; Moregate).
?/Mezitim se 10 ug/disk (celkem 5 disků) expresní plazmidové DNA pro^umanizované DR5 těžké řetězce (pHA15-l) a 10 ug/disk expresní plazmidové DNA pro humanizované DR5 lehké řetězce připravených technikou alkalické činidlo-SDS a odstředěním s gradientem chloridu česného smísí a směs se vysráží ethanolem a potom se provede suspendování v 5 ul/disk dH2O.
Po smísení 15 ul/disk FUGENE6 Transfection činidla se 180 ul/disk D-MEM bez FCS se tento FUGENE roztok (185 ul/disk) smísí s 5 ul/disk DNA roztoku obsahujícího 10 ug/disk humanizovaného expresní plasmidové DNA DR5 těžkého řetězce a 10 ug/disk expresní plasmidové DNA humanizovaného DR5 lehkého řetězce. Po 15 minutové inkubaci při teplotě místnosti se získaná suspenze plaZmidů (200 ul) přidá do předem připravených COS-7 ploten. Po inkubaci v5% CO2 při 37 °C po dobu 24 hodin se kultivační medium nahradí D-MEM
4
4
-108 — bez FCS. Po inkubaci v 5% CO2 při 37 °C po dobu 72 hodin se supernatant kultury odebere pro přečištění produktů exprese v supernatantu. Způsobem popsaným výše se COS-7 buňky transfektují každou z následujících kombinací pla^midů:
(A) : žádná plasmidová DNA (B) : kotransfekce pHB14-l a pSR/M2-l
Kultura se potom se odstředí (1000 r.p.m., 5 minut) a odebere se supernatant. Supernatant se znovu odstředí (9800 r.p.m., 15 minut) a přefiltruje se přes 0,45 um filtr (ADVANTEC TOYO DISMIC-25cs, kat # 25C5045 AS). Přečištění IgG z filtrátů se provede za použití Protein G-POROS afinitní chromatografíe (Applied Biosystems) za následujících podmínek:
HPLC: BioCAD 700E (Applied Biosystems) kolona: ProteinG-ID sensorová náplň (velikost kolony : 2,1 mm LD) x 30 mm LD, objem lože: 0,1 ml; kat # 2-1002-00, Applied Biosystems) eluční pufr: O,1M Glycin-HCl (pH 2,5) neutralizační pufr: 1M Tris-HCl (pH 8,5) detekce: 280 nm průtok: 1 ml/min velikost frakce: 0,5 ml/0,5 min frakční zkumavka: 1,5 ml polypropylenová mikrozkumavka teplota:
°C
Po aplikaci veškerého filtrátu do kolony se 30 ml PBS (Sigma, kat # 1000-3) se použije pro promytí kolony. Když se aplikuje eluční pufr, tak se zahájí odběr frakcí. Každá frakční mikrozkumavka nejprve obsahuje 55 ul 1M NaCl, 110 ul neutralizačního pufru a 74 ul 2 mg/ml hovězího sérového albuminu (Sigma, kat # A-7030) v PBS. Frakce č. 5 až č. 10 se odeberou a dialyzují se proti 1 litru PBS (pH 7,5) při 4 °C po dobu 1 dne za ·
.♦ · · • · · ♦ · · *J > «’ « • » » V» > » » 9· 1 » « · · * · < « ·«< ·
- 109 použiti Slide-A lyzačního přístroje (Pierce, kat # 66450). Dialyzační pufr se vymění dvakrát.
Ověření exprese humanizované protilátky a kvantitativní test na expresní produkty v supernatantu kultur se provede ELISA s protilátkou proti lidskému IgG.
Do každé jamky 96^jamkové plotny (MaxiSorp, Nunc) se přidá 100 ul kozí specifické polyklonální protilátky proti Fc lidského IgG (Kappel) rozpuštěné v konečné koncentraci 0,5 ug/ml v adsorpčním pufru (0,05 M hydrogenuhličitan sodný, 0,02% azid sodný, pH 9,6) a provede se inkubace plotny při 37 °C po dobu 2 hodin pro dosažení adsorpce protilátky. Potom se plotna promyje 5fkrát 350 ul PBS(-) obsahujícího 0,05% Tween-20 (BioRad) (zde dále označovaný jako PBS-T). Do jamek po promytí se přidá supernatant kultury ředěný D-MEM obsahujícím 10% FCS a provede se inkubace při 37 °C po dobu 2 hodin. Po dalším promytí PBS-T se do každé jamky přidá 100 ul alkalickou fosfatasou značené kozí specifické polyklonální protilátky proti Fc lidského IgG (Jackson Imuno Research Lab.) ředěné 10000-krát PBS-T a provede se inkubace při 37 °C po dobu 2 hodin. Po dalším promytí PBS-T se podle návodu výrobce přidá roztok substrátu p-nitrofenylfosfátu z Alkaline Phosphatase Substráte kitu (Bio Rad). Po inkubaci při 37 °C po dobu 0,5 až 1 hodiny se měří absorbance při 405 nm. V našich pokusech se lidský plasmatický imunoglobulin G podtřídy 1 (IgGl) (Biopure AG) ředěný D-MEM obsahujícím 10% FCS na určitou koncentraci použije jako referenční vzorek pro humanizované DR5 protilátky obsažené v supernatantech kultury.
Nakonec se přečištěné produkty exprese v supernatantech kultur specificky detekují protilátkou proti lidskému IgG. Množství protilátky proti lidskému IgG je 8,96 ug (800 ul).
• » » ♦ » » * ·« • · «· • ··· · ··»« · • · » » 9 > · · ··«* • · » · · · « «· · ·»·=»»4
-110 Příklad 21. Proapoptotická aktivita humanizované protilátky
Jurkat buňky (AICC No. TIB-152) se použijí pro stanovení proapoptotická aktivity přečištěné humanizované TRA-8 protilátky.
Jurkat buňky kultivované v RPMI164O mediu s 10% FCS (Gibco BRL) při 37 °C po dobu 3 dnů za přítomnosti 5% CO2 se vnesou do každé jamky 96^jamkové mikroplotny (Sumitorno Bakelite) při 50 ul na jamku. Humanizovaná TRA-8 připravená v příkladu 20 se upraví na koncentraci konečného produktu 100 ng/ml za použití RPMI 1640 media obsahujícího 10% FCS, za použití stanovení jejich koncentraci v kapalině způsobem popsaným v příkladu 20. Každý z roztoků expresních produktů takto upravených na koncentraci 100 ng/ml se použije pro získání sériových ředění opakovaným 2-násobným naředěním RPMI1640 obsahujícím 10% FCS. Každá naředěný roztok humanizované TRA-8 se přidá do každé jamky při 50 pl na jamku. Po reakci při 37 °C po dobu 12 hodin se přidá 50 ul 25 pM PMS (fenazinmethosulfátu; Sigma Chemical Co.)obsahujícího lmg/ml XTT (2,3-bis[2-methoxy-4-nitro-5-sulfofenyl]-2H-tetrazolium-5-karboxyamid, vnitřní sůl; Sigma Chemical Co.) (konečné koncentrace 250 ug/ml pro XTT a 5 uM pro PMS). Po inkubaci po dobu 3 hodin se měří absorbance každé jamky při 450 nm pro výpočet životaschopnosti buněk za použití redukční schopnosti mitochondrií jako indexu.
Životaschopnost buněk v každé jamce se vypočte podle následujícího vzorce:
životaschopnost (%) = 100 x (a-b)/(c-b) kde a je měření pro testovanou jamku, b je měření pro jamku bez buněk a c je měření jamek bez přidané protilátky.
» · * · > · · • · ·· ♦ » ·» s3 • ♦· » · ·
- 111 Expresní produkt připravený v příkladu 20 (humanizovaná TRA-8) může indukovat apoptosu buněk T lymfomové buněčné linie exprimující lidský DR5 antigen.
Příklad 22. Reaktivita TRA-8 s různými DR5 molekulami
Pro stanovení reaktivity TRA-8 s různými DR5 molekulami se reaktivita TAR-8 testuje za použití aktivovaných lymfocytů následujícím způsobem.
Nejprve se vzorky periferní krve odeberou od člověka (30 ml), kosmana (3 ml) a makaka (20 ml). Do vzorků se přidá 1 ml heparinu (Novoheparin; Novo) a vzorky se potom pomalu převrství přes stejný objem Ficoll-Paque PLUS roztoku ((Amersham Pharmacia Biotech.) specifická hmotnost: 1,077 pro všechny vzorky kromě vzorků od makaka, který má specifickou hmotnost 1,072) a odstředí se při 1700 r.p.m. po dobu 30 minut pro získání frakce mononukleárních buněk periferní krve. Tato frakce mononukleárních buněk se promyje dvakrát Hankovým vyváženým solným roztokem a potom se suspenduje v RPMI 1640 mediu s 10% obj./obj. FCS na hustotu buněk 1 x 106 buněk/ml. Fytohemagglutinin-P (PHA-P, Sigma Chemicals, Co.) se přidá do získané suspenze v konečné koncentraci 5 pg/ml a provede se inkubace vzorku při 37 °C v 5% obj./obj. CO2 po dobu 24 hodin. Po této době se buňky separují odstředěním, promyjí se a resuspendují se v RPMI 1640 mediu obsahujícím 10% obj./obj. FCS. Potom se pro aktivaci získaných buněk přidá do suspenze interleukin-2 (Amersham Pharmacia Biotech.) v konečné koncentraci 10 jednotek/ml a provede se inkubace při 37 °C v 5% obj./obj. CO2 po dobu 72 hodin.
Množství aktivovaného přípravku vypočtené tak, aby obsahovalo 1 x 106 aktivovaných lymfocytů, se umístí do testovací zkumavky a suspenduje se v 50 ul 0,5, 1,5, 10 ug/ml TRA-8 v PBS nebo 50 ul
4 • 9 » »
- 112 PBS samotného. Získaná suspenze se nechá stát na ledu po dobu 1 hodiny, potom se buňky promyjí 3^krát podíly 500 ul PBS a potom se suspendují v 50 ul 20 ug/ml FITC-značené anti-myší IgG protilátky (Bioresource) v PBS. Za použití buněk suspendovaných v 500 ul PBS jako kontroly se měří intensity fluorescence, za použití průtokového cytometru (FACSCalibur; Becton Dickinson).
Získá se distribuce počtu buněk podle intenzity fluorescence a vypočtou se podíly počtu barvících se buněk k celkovému počtu buněk. Potom se vypočtou hodnoty Kd za použití koncentrace TRA-8 a podílu počtu barvících se buněk k celkovému počtu buněk. Frekvence reaktivity aktivovaných lymfocytů od člověka, kosmana a makaka je téměř stejná. Proto je TRA-8 je schopna vazby na různé primáti DR5 včetně lidských, proti kterým je TRA-8 původně připravena.
Příklad 23. Pokusy s eskalací dávky TRA-8 u kosmanů
Předběžná studie toxicity TRA-8 s eskalací dávky se provede za použití 1 samce a 1 samice kosmana. Aplikují se tři série jedné intravenosní dávky, separované 7-dny. Dávka TRA-8 je 50, 250 a 1250 ug/zvíře. 48 hodin po každé aplikaci se odebere krev z femorální žíly a připraví se plasma. Stanoví se aktivity plasmatické aspartat-aminotransferasy a alanin- aminotransferasy, za použití analyzátoru (FUJI DRJ-CHEM: Fuji Film Medical Co., Ltd.). Veškerá krev se odebere bez jakékoliv anestesie. Při biochemickém vyšetření plasmy se nepozorují žádné známky jaterního poškození.
Příklad 24. In vitro a in vivo farmakologické testy TRA-8 proti nádorovým buňkám
Pro stanovení toho, zda má TRA-8 terapeutickou účinnost « *
- 113 v protinádorové terapii, se in vitro smrtící aktivita TRA-8 testovala za použití různých nádorových buněčných linií následujícím způsobem.
Různé nádorové buňky (2-8 x 103 buněk/50 ul) kultivované v RPMI164O mediu (pro Jurkat), DMEM mediu (pro HCT-116), MEM-R (pro WiDr) nebo DMEM-F12 (pro C0L2-Jck), které se získaly od Gibco BRL, s 10% FCS (Gibco BRL), při 37 °C za přítomnosti 5% COo, se vloží do každé jamky 96 mikroplotny (Sumitorno Bakelite).
TRA-8 se upraví tak, aby měla koncentraci konečného produktu 100 ng/ml za použití media obsahujícího 10% FCS. Roztok TRA-8 (100 ng/ml) se použije pro přípravu sériových ředění opakováním 2-násobného ředění mediem obsahujícím 10% FCS. Každý naředěný roztok TRA-8 se přidá do každé jamky při 50 ul na jamku a provede se inkubace při 37 °C. Po reakci při 37 °C po dobu 72 hodin se přidá 50 ul 25 pM PMS (fenazin-methosulfát; Sigma Chemical Co.) obsahujícího 1 mg/ml XTT (konečné koncentrace 250 ug/ml pro XTT a 5 pM pro PMS). Po inkubaci po dobu 3 hodin se měří absorbance každé jamky při 450 nm pro určení životaschopnosti buněk za použití redukční schopnosti mitochondrií jako indexu.
Životaschopnost buněk v každé jamce se vypočte podle následujícího vzorce:
Životaschopnost (%) = 100 x (a-b) / (c-b) kde a je měření pro testované jamky, ”b je měření pro jamky bez buněk a c je měření pro jamky bez přidané protilátky.
Výsledky jsou uvedeny v následující tabulce 3.
9 « '»**»··· « « · · · ·i • · · 9 9 · 4 > · 4· • · 9 i 9 » · · ·»4« • 9 « · * ·<
« · · 9 « · · > < ··
-114
Tabulka 3
Buňky ED50 (ug/ml)
Jurkat 0,001-0,01
HCT-116 0,004-0,02
WiDr 0,007-0,03
C0L2-Jck 2,28
Různé nádorové buněčné linie jsou silně indukovány k apoptose prostřednictvím TRA-8 za podmínek in vitro.
Dále se určí in vivo protinádorové účinky TRA-8 u holých myší s transplantovanými WiDr buňkami, protože TRA-8 není zkříženě reaktivní g myším DR5.
TRA-8 protilátka proti lidskému DR5 se podá holým myším s lidské xenotransplantáty, které exprimují lidské DR5 molekuly. Použité myši jsou BALb/c nude/nude myši stáří 6 týdnů (samice, od Clea Japan lne.), kterým se transplantuje buněčná linie lidského karcinomu tlustého střeva WiDr (5 mm3). Od dne 1 po transplantaci nádoru se těmto myším s transplantovaným nádorem 14-j-krát podá intraartikulární injekce TRA-8 (5 ug/zvíře). Růst WiDr nádoru se denně měří podle velikosti nádorových hmot. Výsledky jsou uvedeny v následující tabulce 4.
- 115 Tabulka 4
8 dnů 11 dnů 15 dnů 18 dnů 22 dnů 25 dnů
Kontrola (PBS) 196 24 469 584 833 119
SD ±5 ±7 ±14 ±23 ±27 ±41
TRA-8 15 97 155 195 365 530
SD ±7 ±3 ±60 ±58 ±91 ±13
SD = standardní odchylka
V tomto modelu byl u všech neléčených zvířat pozorován růst nádoru, zatímco u zvířat léčených TRA-8 byl růst nádoru inhibován, jak bylo prokázáno podle velikosti nádoru. Výsledky ukazují, že TRA-8 je účinná v eliminaci nádorových buněk in vivo.
Příklad 25. Studie kombinací s TRA-8
Lidská buněčná linie karcinomu prostaty PC-3 se získá z m Američan Tissue Culture Collection (AICC) a kultivuje se v F12K Nutrient Mixture (21127-022, Gibco BRL) obsahující 10% fetální hovězí sérum (FBS, Hyklon), 1% L-glutamin-200 mM (25030-149, Gibco BRL) a 0,5% roztok penicilinu-streptomycinu (P-7539, Sigma). RPMI1640 medium (MED-008, IWAKI) doplněné 10% FBS a 0,5% roztokem penicilinu-streptomycinu se použije v následujícím pokusu. Exponenciálně kultivované PC-3 buňky se získají trypsinizací a promyjí se dvakrát čerstvým mediem. Buňky s epotom spočítají, resuspendují se v čerstvém mediu v hustotě 5 x 104 buněk/ml a distribuují se trojmo do 96^jamkových ploten s plochým dnem (3598, Coming-Coster) v celkovém objemu 100 ul/jamku jeden den před zahájením pokusu. Reprezentativní protinádorový lék,
Paclitaxel (169-18611, Wako) rozpuštěný v dimethylsulfoxidu (10 mg/ml), se naředí v čerstvém mediu a potom se přidá do » * » ♦· · • · · · »· • · · J « 9 · «· • · » ·· * · · ♦ __ 116 • »· * · » »99 1 • 9 4 • « · « < *
96^jamkových ploten obsahujících buňky při 50 ul/jamku. Konečné koncentrace dimethylsulfoxidu jsou menší než 0,1%. Po inkubaci po dobu 24 hodin při 37 °C v atmosféře 5% C02 se TRA-8 ředěná v čerstvém mediu přidá do jamek. Po inkubaci po dalších 24 hodin se do jamek přidá 50 ul Minimum Essential Media (11095-095, Gibco BRL) obsahujícího 1 mg/ml XTT a 25 mM PMS a plotny se inkubují po dobu 6 hodin. Potom se změří OD450 pomocí SPECTRA MAX 250 (Molecular Devices) a životaschopnost buněk se vypočítá následujícím způsobem.
Životaschopnost buněk (%) = (OD450 pro jamky obsahující buňky léčené Taxolem a/nebo TRA-8 - OD45O pro jamky neobsahující ani buňky, ani činidla) x 100 / (OD450 pro jamky obsahující buňky bez činidla - 0D450 pro jamky neobsahující ani buňky, ani činidla)
Výsledky výše uvedeného testu pro TRA-8 v kombinaci s reprezentativním protinádorovým lékem, Paclitaxelem, jsou následující. Paclitaxel snižuje životaschopnost PC-3 buněk, ale více než 40% signálů naznačuje, že nádorové buňky přežívají při koncentracích až 200 nM. Významné je, že přidání 0,1 ng/ml TRA-8 značně snižuje životaschopnost nádorových buněk, až na 10%, i když není žádná redukce životaschopnosti buněk pozorována po jediné aplikaci TRA-8 v této koncentraci. Tyto výsledky jasně ukazují, že TRA-8 vykazuje synergní protinádorovou aktivitu v kombinaci s protinádorovými léky.
Příklad 26. Analýza jiných typů humanizovaných protilátek TRA8 (1) Návrh humanizovaných protilátek
Konstrukce humanizované verze TRA-8 se provede způsobem obecně známým jako přenos CDR. mAB58'CL protilátka se použije jako »
* ’ » ·
- 117 akceptor, jak je popsáno v referečním příkladu 2, a CDR regiony TRA-8 protilátky se přenesou na akceptorovou protilátku.
V pracovním regionu se některé aminokyseliny přenesou na akceptor bud z TRA-8, nebo z lidské konvenční sekvence podle kriterií uvedenýchv Queen a kol. (Proč. Nati. Acad. Sci. USA 86, 10029-10033, (1989)) a humanizované TRA-8 sekvence se konstruují způsobem popsaným dále.
(2) Konstrukce plasmidu nesoucího DNA pro variabilní region těžkého řetězce jiných typů humanizované nebo myší TRA-8
Jak je uvedeno v SEQ ID No. 56 seznamu sekvenci, HI typ-humanizace aminokyselinové sekvence těžkého řetězce myší protilátky proti lidskému DR5 označené TRA-8 zahrnuje nahrazení
3.aminokyseliny (methioninu), 13. aminokyseliny (lysinu), 19. aminokyseliny (lysinu), 40. aminokyseliny (threoninu), 42. aminokyseliny (kyseliny glutamové), 44. aminokyseliny (argininu), 84. aminokyseliny (šeřinu), 88. aminokyseliny (šeřinu), 93. aminokyseliny (methioninu), 114. aminokyseliny (threoninu), 115. aminokyseliny (leucinu) glutaminem, glutaminem, argininem, alaninem, glycinem, glycinem, asparaginem, alaninem, valinem, leucinem a valinem, v příslušném pořadí.
Jak je uvedeno v SEQ ID No. 59 seznamu sekvencí, H3 typ-humanizace aminokyselinové sekvence těžkého řetězce myší protilátky proti lidskému DR5 TRA-8 zahrnuje nahrazení 13. aminokyseliny (lysinu), 19. aminokyseliny (lysinu), 40. aminokyseliny (threoninu), 42. aminokyseliny (kyseliny glutamové),
44. aminokyseliny (argininu), 88. aminokyseliny (šeřinu), 93. aminokyseliny (methioninu), 114. aminokyseliny (threoninu), 115. aminokyseliny (leucinu) glutaminem, argininem, alaninem, glycinem, glycinem, alaninem, valinem, leucinem a valinem, v příslušném pořadí.
- 118 Jak je uvedeno v SEQ ID No. 60 seznamu sekvenci, H4 typ-humanizace aminokyselinové sekvence těžkého řetězce myši protilátky proti lidskému DR5 TRA-8 zahrnuje nahrazení 13. aminokyseliny (lysinu), 19. aminokyseliny (lysinu), 88. aminokyseliny (šeřinu), 93. aminokyseliny (methioninu), 114. aminokyseliny (threoninu), 115. aminokyseliny (leucinu) glutaminem, argininem, alaninem, valinem, leucinem a valinem, v příslušném pořadí.
Jak je uvedeno v SEQ ID No. 61 seznamu sekvencí, plasmid nesoucí DNA pro variabilní region těžkého řetězce chimérickéké TRA-8 se označí jako M typ. Humanizované TRA-8 popsané v příkladech 17 a 18 se označí jako H2 typ.
ťPla^midy nesoucí DNA kódující variabilní region těžkého řetězce humanizované nebo chimérickéké TRA-8 se konstruují následujícím způsobem.
PCR se použije pro přípravu následujících DNA sekvencí, které mají výše uvedené složení:
Syntetizuje se následujících 24 oligonukleotidů:
5'- ttggataagc ttggcttgac ctcaccatgg gatggagctg tatcatcctc ttcttggtag caacagctac aggtgtccac-3' (A; SEQ ID No. 32);
5'- tctgaagtaa tgctggtgga gtctggggga ggcttagtac agcctggagg gtccctgaga ctctcctgtg cagcctctgg-3' (B; SEQ ID No. 33);
5'- tctgaagtac agctggtgga gtctggggga ggcttagtac agcctggagg gtccctgaga ctctcctgtg cagectctgg-3' (B2; SEQ ID No. 57);
5'- tctgaagtaa tgctggtgga gtctggggga ggcttagtaa agcctggagg gtccctgaaa ctctcctgtg cagcctctgg-3' (B3; SEQ ID No. 66);
5'- attcactttc agtagttatg taatgtcttg ggttcggcag gcaccaggga
- 119 — agggtctgga gtgggttgca accattagta-3' (C; SEQ ID No. 34); 5'- attcactttc agtagttatg taatgtcttg ggttcggcag actccagaga agaggctgga gtgggttgca accattagta-3' (C2; SEQ ID No. 64); 5'- gtggtggtag ttacacctac tatccagaca gtgtgaaggg ccgattcacc atctccagag acaatgccaa gaacaccctg-3' (D; SEQ ID No. 35); 5'- tatctgcaaa tgaacagtct gagagcagag gacacggctg tttattactg tgcaagaagg ggtgactcta tgattacgac-3' (E; SEQ ID No. 36); 5'- tatctgcaaa tgagcagtct gagagcagag gacacggctg tttattactg tgcaagaagg ggtgactcta tgattacgac-3' (E2; SEQ ID No. 62); 5’- tatctgcaaa tgagcagtct gagatctgag gacacggcta tgtattactg tgcaagaagg ggtgactcta tgattacgac-3' (E3; SEQ ID No. 67); 5'~ ggactactgg ggccaaggga ccctggtcac agtctcctca gcctccacc aagggcccat cggtc-3' (F; SEQ ID No. 37);
5'- ggactactgg ggccaaggga ccactctcac agtctcctca gcctccacc aagggcccat cggtc-3' (F2; SEQ ID No. 68);
5'- ctaccaagaa gaggatgata cagctccatc ccatggtgag gtcaagccaa gcttatccaa-3' (U; SEQ ID No. 38);
5'- tctcagggac cctccaggct gtactaagcc tcccccagac tccaccagca ttacttcaga gtggacacct gtagctgttg-3' (H; SEQ ID No. 39);
5'- tctcagggac cctccaggct gtactaagcc tcccccagac tccaccagct gtacttcaga gtggacacct gtagctgttg-3' (H2; SEQ ID No. 58); 5'- tttcagggac cctccaggct ttactaagcc tcccccagac tccaccagca ttacttcaga gtggacacct gtagctgttg-3' (H3; SEQ ID No. 69); 5'- tccagaccct tccctggtgc ctgccgaacc caagacatta cataactact gaaagtgaat ccagaggctg cacaggagag-3' (I; SEQ ID No.40);
5'- tccagcctct tctctggagt ctgccgaacc caagacatta cataactact gaaagtgaat ccagaggctg cacaggagag-3' (12; SEQ ID No. 65);
5'- ctctggagat ggtgaatcgg cccttcacac tgtctggata gtaggtgtaa ctaccaccac tactaatggttgcaacccac-3' (J; SEQ ID No.41);
5'- ccttcttgca cagtaataaa cagccgtgtc ctctgctctc agactgttca tttgcagata cagggtgttc ttggcattgt-3' (K; SEQ ID No. 42);
5'- ccttcttgca cagtaataaa cagccgtgtc ctctgctctc agactgttca tttgcagata cagggtgttc ttggcattgt-3' (K2; SEQ ID No. 63);
5'- ccttcttgca cagtaataca tagccgtgtc ctcagatctc agactgctca tttgcagata cagggtgttc ttggcattgt-3' (K3; SEQ ID No. 70);
5'- gaccgatggg cccttggtgg aggctgagga gactgtgacc agggtccctt ggccccagta gtccgtcgta atcatagagt cacc-3’ (L; SEQ ID No.43) a 5'- gaccgatggg cccttggtgg aggctgagga gactgtgaga gtggtccctt ggccccagta gtccgtcgta atcatagagt cacc-3’ (L2; SEQ ID No.71).
Následující 2 PCR primery se syntetizují způsobem popsaným výše:
5'- ttggataagc ttggcttgac-3' (Pl; SEQ ID No. 44); a
5'- gaccgatggg cccttggtgg a-3' (P2; SEQ ID No. 45).
Syntéza Hl typu DNA kódující polypeptidové řetězce obsahující sekvenci sekrečního signálu, variabilní region humanizovaného TRA-8 těžkého řetězce a 5 aminokyselinových zbytků na N-konci IgG-CHl regionu, se provede za použití kombinace PCR v příslušném pořadí.
Hl typ-DNA fragmentu se připraví následujícím způsobem.
Složení PCR reakčního roztoku:
oligonukleotid oligonukleotid oligonukleotid oligonukleotid oligonukleotid oligonukleotid oligonukleotid
A,
B2,
C,
D,
E,
F,
U, pmol;
pmol; pmol; pmol; pmol; pmol; pmol;
oligonukleotid H2, 10 pmol; oligonukleotid I, 10 pmol; oligonukleotid J, 10 pmol; oligonukleotid K, 10 pmol;
- 121-
oligonukleotid L, 10 pmol;
oligonukleotidový primer Pl, 2 uM;
oligonukleotidový primer P2, 2 uM;
10X Pyrobest pufr II, 10 ul;
dNTP směs, 8 ul;
Pyrobest DNA polymerasa, 0,5 pl; a
redestilovaná voda do konečného objemu 50 ul.
PCR reakce se provede následujícím způsobem. Roztok se nejprve zahřívá při 94 °C po dobu 5 minut, potom se provede cyklus zahřívání při 98 °C po dobu 10 sekund, 55 °C po dobu 30 sekund a 72 °C po dobu 1 minuty, který se provede 7^krát. Po dokončení tohoto cyklu se reakční roztok zahřívá při 72 8C po dobu 15 minut.
Po fenolové extrakci a srážení ethanolem se získaná DNA sraženina suší ve vakuu, rozpustí se v minimálním množství redestilované vody a separuje se elektroforesou na 3% agarosovém gelu. Po elektroforese se gel barví vodným roztok (1 ug/ml) ethidiumbromidu, aby se umožnila detekce DNA za použití UV světla. DNA proužky odpovídající Hl typu-DNA se vyříznou za použití čepelky a eluují se z gelu za použití Geneclean Spin Kitu (BIO 101, CA, USA). Po fenolové extrakci se eluovaná DNA zahustí odstředěním při 7500 x g, a potom se provede srážení ethanolem, a nakonec se rozpustí v 5 ul destilované vody.
Syntéza H3 typu DNA kódující polypeptidové řetězce obsahující sekvenci sekrečního signálu, variabilní region humanizovaného TRA-8 těžkého řetězce a 8 aminokyselinových zbytků na N-konci IgG-CHl regionu, se provede za použití kombinace PCR v příslušném pořadí.
H3 typ-DNA fragmentu se připraví následujícím způsobem.
* 9 · » » · « · « * • · · · · * • · · · < i ♦ · · · <
• it · 9 ·
Složení PCR reakčního roztoku:
oligonukleotid A, oligonukleotid B, oligonukleotid C, oligonukleotid D, oligonukleotid E2, oligonukleotid F, oligonukleotid 0, oligonukleotid H, oligonukleotid I, oligonukleotid J, oligonukleotid K2, oligonukleotid L, oligonukleotidový oligonukleotidový 10X Pyrobest dNTP směs, 8 Pyrobest DNA pmol;
pmol;
pmol;
pmol;
pmol;
pmol;
pmol;
pmol;
pmol;
pmol;
pmol;
pmol;
primer Pl, 2 uM; primer P2, 2 uM; II, 10 uA;
0,5 ul; a pufr ul; polymerasa,
Redestilované voda do konečného objemu 50 ul.
PCR reakce se provede následujícím způsobem. Roztok se nejprve zahřívá při 94 °C po dobu 5 minut, potom se provede cyklus zahřívání při 95 °C po dobu 10 sekund, 55 °C po dobu 30 sekund a 72 °C po dobu 1 minuty, který se provede 7-krát. Po dokončení cyklu se reakční roztok zahřívá při 72 °C po dobu 15 minut.
Po fenolové extrakci a srážení ethanolem se získaná DNA sraženina suší ve vakuu, rozpustí se v minimálním množství redestilované vody a separuje se elektroforesou na 3% agarosovém gelu. Po elektroforese se gel barví vodným roztok (1 ug/ml) ethidiumbromidu, aby se umožnila detekce DNA za použití UV světla. DNA proužky odpovídající H3 typu-DNA se vyříznou za použití čepelky a eluují se z gelu za použití Geneclean Spin Kitu. Po
fenolové extrakci se eluovaná DNA zahustí odstředěním při 7500 x g, a potom se provede srážení ethanolem, a nakonec se rozpustí v 5 ul destilované vody.
Syntéza H4 typu DNA kódující polypeptidové řetězce obsahující sekvenci sekrečního signálu, variabilní region humanizovaného TRA-8 těžkého řetězce a 8 aminokyselinových zbytků na N-konci IgG-CHl regionu, se provede za použití kombinace PCR v příslušném pořadí.
H4 typ-DNA fragmentu se připraví následujícím způsobem.
Složení PCR reakčního roztoku: oligonukleotid A, 10 pmol; oligonukleotid B, 10 pmol; oligonukleotid C2, 10 pmol; oligonukleotid D, 10 pmoi; oligonukleotid E2, 10 pmol; oligonukleotid F, 10 pmol; oligonukleotid 0,10 pmol; oligonukleotid H, 10 pmol; oligonukleotid 12, 10 pmol; oligonukleotid J, 10 pmol; oligonukleotid K2, 10 pmol; oligonukleotid L, 10 pmol; oligonukleotidový primer Pl, 2 uM; oligonukleotidový primer P2, 2 uM; 10X Pyrobest pufr II, 10 ul; dNTP směs, 8 ul;
Pyrobest DNA polymerasa, 0,5 ul; a
Redestilovaná voda do konečného objemu 50 ul.
PCR reakce se provede následujícím způsobem. Roztok se • > · · • « · · * ·« • · · ♦ · · » » »t • ··>»»·· ·«»<
• · » · ♦ «í «4 » 4« » <♦ ·
- 124 ~ nejprve zahřívá při 94 °C po dobu 5 minut, potom se provede cyklus zahřívání při 95 °C po dobu 10 sekund, 55 °C po dobu 30 sekund a 72 °C po dobu 1 minuty, který se provede 7^krát. Po dokončení cyklus se reakční roztok zahřívá při 72 °C po dobu 15 minut.
Po fenolové extrakci a srážení ethanolem se získaná DNA sraženina suší ve vakuu, rozpustí se v minimálním množství redestilované vody a separuje se elektroforesou na 3% agarosovém gelu. Po elektroforese se gel barví vodným roztok (1 ug/ml) ethidiumbromidu, aby se umožnila detekce DNA za použití UV světla. DNA proužky odpovídající H4 typu-DNA se vyříznou za použití čepelky a eluují se z gelu za použití Geneclean Spin Kitu. Po fenolové extrakci se eluovaná DNA zahustí odstředěním při 7500 x g, a potom se provede srážení ethanolem, a nakonec se rozpustí v 5 ul destilované vody.
Syntéza M typu DNA kódující polypeptidové řetězce obsahující sekvenci sekrečního signálu, variabilní region těžkého řetězce chimérické TRA-8 a 8 aminokyselinových zbytků na N-konci IgG-CHl regionu, se provede za použití kombinace PCR v příslušném pořadí.
M typ-DNA fragmentu se připraví následujícím způsobem.
Složení PCR reakčního roztoku: oligonukleotid A, 10 pmol; oligonukleotid B3, 10 pmol; oligonukleotid C2, 10 pmol; oligonukleotid D, 10 pmol; oligonukleotid E3, 10 pmol; oligonukleotid F2, 10 pmol; oligonukleotid 0, 10 pmol; oligonukleotid H3, 10 pmol; oligonukleotid 12, 10 pmol;
- 125 — oligonukleotid J, 10 pmol; oligonukleotid K3, 10 pmol; oligonukleotid L2, 10 pmol; oligonukleotidový primer Pl, 2 uM; oligonukleotidový primer P2, 2 uM; 10X Pyrobest pufr II, 10 pl; dNTP směs, 8 ul;
Pyrobest DNA polymerasa, 0,5 ul; a Redestilovaná voda do konečného objemu 50 ul.
PCR reakce se provede následujícím způsobem. Roztok se nejprve zahřívá při 94 °C po dobu 5 minut, potom se provede cyklus zahřívání při 98 °C po dobu 10 sekund, 55 °C po dobu 30 sekund π C a 72 UC po dobu 1 minuty, který se provede 7j-krát. Po dokončení cyklus se reakční roztok zahřívá při 72 °C po dobu 15 minut.
Po fenolové extrakci a srážení ethanolem se získaná DNA sraženina suší ve vakuu, rozpustí se v minimálním množství redestilované vody a separuje se elektroforesou na 3% agarosovém gelu. Po elektroforese se gel barví vodným roztok (1 ug/ml) ethidiumbromidu, aby se umožnila detekce DNA za použití UV světla. DNA proužky odpovídající M typu-DNA se vyříznou za použití čepelky a eluují se z gelu za použití Geneclean Spin Kitu. Po fenolové extrakci se eluovaná DNA zahustí odstředěním při 7500 x g, a potom se provede srážení ethanolem, a nakonec se rozpustí v 5 ul destilované vody.
Získaná extrahovaná DNA (HI type, H3 typ, H4 typ a M typ) se klonuje za použití pGEM-T Easy vektoru (Promega) následujícím způsobem:
DNA fragment získaný z PCR reakce (Hl, H3, H4 nebo M), 5 ul;
x Taq polymerasový pufr, 1 ul;
« í « c
- 126 dNTP směs, 1 ul;
Taq polymerasa (5 jednotek/ml), 1 ul; a redestilované voda do konečného objemu 10 ul.
Po reakci výše uvedeného roztoku při 70 °C po dobu 30 minut se každý DNA roztok a pGEM-T Easy vektor ligují za použití DNA Ligation Křtu Verze 2.0 (Takara Shuzo Co., Ltd.) za použití protokolu výrobce.
Po 4 hodinové inkubaci při 15 °C se 2 ul inkubovaného reakčního roztoku smísí s 100 ul kompetentních E. coli kmene JM109 při hustotě buněk 1-2 x 109 buněk/ml (Takara Shuzo Co., Ltd.), a smés se ponechá na ledu po dobu 30 minut, potom při 42 °C po dobu 30 sekund, a znovu na ledu po dobu 1 minuty. Potom se do směsi přidá 500 ul SOC media (2% obj./obj. trypton, 0,5% hmot./obj. kvasinkový extract, 0,05% hmot./obj. chlorid sodný, 2,5 mM hmot./obj. chlorid draselný, 1 mM chlorid hořečnatý a 20 mM glukosa) a provede se inkubace po dobu další hodiny, s třepáním. Transformované kmeny se potom izolují a plasmidová DNA se připraví z těchto kmenů, jak je popsáno v Molecular Cloning: A Laboratory Manual. Nukleotidové sekvence této DNA kódující těžké řetězce humanizované nebo myší TRA-8 se potvrdí dideoxy způsobem, v příslušném pořadí (Sanger, F. S., a kol., (1977), Proč. Nati. Acad. Sd. USA, 74:5463-5467) za použití 3700 DNA Analyzeru (ABI PRISM; Perkin Elmer Applied Biosystems, Japan).
Získaný plasmid se označí pHA15 (plasmid nesoucí cDNA kódující £
Hl-typ těžkého řetězce humanizované TRA-8), pHCIO (plasmid nesoucí cDNA kódující H3-typ těžkého řetězce humanizované TRA-8), pHD21 (plasmid nesoucí cDNA kódující H4-typ těžkého řetězce humanizované TRA-8), a pMll (plasmid nesoucí cDNA kódující těžké řetězce chimérické TRA-8). Transformované E coli kmeny nesoucí tyto plasmidy, označené jako E. coli JM109/pHA15, E. coli JM109/pHC10, • ·
E. coli JM109/pHD21 a E. coli JM109/pMll, se uloží v International Patent Organism Depositary, National Institute of Advanced Industrial Science and Technology, 1-1, Higashi I chome Tsukuba-shi, Ibaraki-ken, 305-5466, Japan, 20.4.2001, v souladu s Budapešťskou smlouvou o ukládání mikroorganismů, pod přírůstkovým č. FERM BP-7555, FERM EP-7557, FERM BP-7558, a FERM BP-7559, v příslušném pořadí (3) Konstrukce expresních plasmidů nesoucích DNA pro variabilní region těžkého řetězce několika typů humanizované nebo myší TRA-8
Rekombinantní expresní vektory pro živočišné buňky se konstruují insercí DNA kódující těžké řetězce HI typu, H3 typu a H4 typu humanizované nebo M typu chimérické TRA-8 (klonované výše) následujícím způsobem.
~21 ug pla^midu pSRHHH3 (Evropská patentová přihláška EP 0 909 816 Al) nesoucí DNA pro variabilní region těžkého řetězce humanizované anti-Fas monoklonální protilátky HFE7A a genomovou DNA pro konstantní region lidského IgGl, expresní vektor pro savčí buňky, se tráví restrikčními enzymy HindlII a Apal, a separuje se elektroforesou na 3% agarosovém gelu. Po elektroforese se gel barví vodným roztokem (1 ug/ml) ethidium- bromidu pro umožnění detekce DNA za použití UV světla. Proužky vektorové DNA obsahující genomovou DNA pro konstantní region lidského IgGl bez variabilního regionu těžkého řetězce humanizované HFE7A se vyříznou za použití čepelky a eluují se z gelu za použití Geneclean Spin Kitu. Po fenolové extrakci se eluovaná DNA zahustí odstředěním při 7500 x g, potom se provede srážení ethanolem, a nakonec se rozpustí v 5 ul destilované vody a potom se defosforyluje za použití CIP. Získaný trávený, defosforylovaný plasmid (100 ng) se liguje s 1 ug DNA fragmentu pHA15, pHCIO, pHD21, nebo pMll obsahujícím DNA kódující variabilní region těžkého řetězce humanizované nebo «
Μ * • 4
4 4 4 4 4*3» «»
4 4»» 4 4 4 4 444«
444 44 4 <« «4 4 4 4 4 » · τ ·'4
128 chimérické TRA-8, který se také tráví HindlII a Apal, za použití
DNA Ligation Kitu Verze 2.0 (Takara Shuzo Co., Ltd.). Ligační směs se potom použije pro transformování E. coli JM109, které se potom kultivují na LB agarových plotnách obsahujících 50 ug/ml ampicilinu.
Transformanty získané tímto způsobem se kultivují ve 2 ml kapalného LB media obsahujícího 50 ug/ml ampicilinu při 37 °C přes noc a pla|midová DNA se potom extrahuje ze získané kultury technikou alkalické činidlo-SDS.
z.
Extrahovaná pla^midová DNA se tráví HindlII a Apal zpracuje se elektroforesou na 3% (hmot./obj.) agarosovém gelu pro potvrzení nebo nepotvrzení přítonmosti insertu DNA kódující variabilní region těžkého řetězce humanizované nebo chimérické TRA-8. Inserce a orientace požadovaného DNA fragmentu ve vektoru se potvrdí DNA sekvenováním za použití analyzátoru genové sekvence (ABI Prism 3700 DNA Analyzer; Applied Biosystems). Získané expresní ple^midy nesoucí cDNA kódující těžké řetězce humanizované nebo chimérické TRA-8 se označený pHA15-l, pHC10-3, pHD21-l, a pMll-1, v příslušném pořadí.
(4) Konstrukce vektorů pro humanizované lehké řetězce (4.1) Konstrukce expresního vektoru pro lehký řetězec humanizované protilátky (LM1 typ)
Jak je uvedeno v SEQ ID No. 72 seznamu sekvencí, další humanizace (LM1 typ) aminokyselinové sekvence lehkého řetězce myší protilátky TRA-8 proti lidskému DR5 zahrnuje nahrazení 3. aminokyseliny (valinu), 8. aminokyseliny (histidinu), 9. aminokyseliny (lysinu), 10. aminokyseliny (fenylalaninu), 11. aminokyseliny (methioninu), 13. aminokyseliny (threoninu), 20.
a ·
9 » · • · · 9 * · β » »’ • · 9 » » » · · ♦ * « * • · « * * ·t « » ‘»»·»· aminokyseliny (šeřinu), 42. aminokyseliny (glutaminu), 43. (šeřinu), 60. aminokyseliny (kyseliny asparagové), 63. aminokyseliny (threoninu), 77. aminokyseliny (asparaginu), 78. aminokyseliny (valinu), 80. aminokyseliny (šeřinu), 83. aminokyseliny (leucinu), 85. aminokyseliny (kyseliny asparagové), 87. aminokyseliny (fenylalaninu) a 99. aminokyseliny (glycinu), 103. aminokyseliny (leucinu) a 108. aminokyseliny (alaninu) z N-konce aminokyselinové sekvence lehkého řetězce TRA-8 glutaminem, prolinem, serinem, serinem, leucinem, alaninem, threoninem, lysinem, alaninem, serinem, serinem, serinem, leucinem, prolinem, fenylalaninem, threoninem, tyrosinem, glutaminem, valinem a threoninem, v příslušném pořadí. Získaná sekvence se označí LM1.
Expresní plasmidy nesoucí tento typ aminokyselinové sekvence pro humanizované lehké řetězce protilátky TRA-8 proti lidskému DR5 (LML typ, SEQ ID No. 72 seznamu sekvencí) se konstruují následujícím způsobem.
1) Syntéza primerů pro přípravu variabilních a konstantních regionů lehkého řetězce humanizované TRA-8 (LM1 typ)
DNA kódující LM1 polypeptidý řetězec (SEQ ID No. 72 seznamu sekvencí), kde každá z nich je fúzí variabilního regionu lehkého řetězce humanizované protilátky TRA-8 proti DR5 (LM1 typ) a konstantního regionu lehkého řetězce lidského Ig (kappa řetězce), se v příslušném pořadí syntetizují za použití kombinací PCR.
Kromě 7AL1P (SEQ ID No. 47), 7ALCN (SEQ ID No. 48), HKCDF1 1 (SEQ ID No. 50), HKCDR12 (SEQ ID No. 51), HKCDF22 (SEQ ID No. 52), HKCDR22 (SEQ ID No. 53) a HKCEI2 (SEQ ID No. 54).
• · » · · · » · I • · · · * ·« » ··« · · · a ·« • ····»·· ··<« • · » « · ·« «· · »· *··
- 130
Následující oligonukleotidové primery se syntetizují pro PCR:
5'- gtcccccaca gatgcagaca aagaacttgg agattgggtc atetgaatgt caccagtgga-3' (HKSPR12; SEQ ID No. 77).
z.
2) Konstrukce pla|midu pCR3.1/LMl-2 (klonování humanizovaného lehkého řetězce typu LM1 TRA-8)
LM1-DNA fragment kódující aminokyselinovou sekvenci ze SEQ ID No. 72 se připraví provedením 2-stupňové PCR, insertuje se do •z. pla|midového vektoru a klonuje se v E. coli.
a) První stupeň PCR
LM1-F1-DNA fragment kódující sekvenci sekrečního signálu a a část FRL1 regionu s místem pro štěpení Hind III restrikčním enzymem přidanýmna 5<»-konci se se připraví za následujících podmínek. Templátové plasmidy, pHSGHMI7 a pSRPDHH, se získají způsobem podle Evropská patentové přihlášky EP 0 909 816 Al.
Složení reakčního roztoku:
plazmidová pHSGHM17 DNA, 25 ng oligonukleotidový primer 7AL1P, 50 pmol oligonukleotidový primer HKSPR12, 50 pmol dNTP kokteil, 5 ul
1OX PCR pufr, 5 ul ampliTaq DNA polymerasa (PerkinElmer), 2,5 jednotek
Reakční roztok mající výše uvedené složení se upraví na konečný objem 50 pl přidáním redestilované vody a použije se v PCR.
PCR termální podmínky: Zahříváni při 94 °C po dobu 2 minut, * 9 * » 9
- 131potom se provede termální cyklus 94 °C po dobu 1 minuty, 55 °C /'Ý dobu 1 minuty a 72 °C po dobu 2 minut, který se provede 30-pařát, a potom se provede zahřívání při 72 °C po dobu 10 minut.
PO
LM1-F2-DNA fragment kódující část FRL1, CDRL1, FRL2 a CDRL2 se připraví za následujících podmínek.
Složení reakčního roztoku:
plasmidová pL28 DNA, 25 ng oligonukleotidový primer HKCDF11, 50 pmol oligonukleotidový primer HKCDR12, 50 pmol dNTP kokteil, 5 ul
10X PCR pufr, 5 ul ampliTaq DNA polymerasa, 2,5 jednotky
Reakční roztok mající výše uvedené složení se upraví na konečný objem 50 ul přidáním redestilované vody a použije se v PCR.
PCR termální podmínky: Zahřívání při 94 °C po dobu 2 minut, potom se provede termální cyklus 94 °C po dobu 1 minuty, 55 °C po dobu 1 minuty a 72 °C po dobu 2 minut, který se provede 30-j-krát, a potom se provede zahřívání při 72 °C po dobu 10 minut.
LMI-F3-DNA fragment kódující CDRL2, FRL3 a část CDRL3 se připraví za následujících podmínek.
Složení reakčního roztoku:
plasmidová pSRPDHH DNA, 25 ng oligonukleotidový primer HKCDF22, 50 pmol oligonukleotidový primer HKCDR22, 50 pmol dNTP kokteil, 5 ul
10X PCR pufr, 5 Ul ampliTaq DNA polymerasa, 2,5 jednotky
- 132Reakční roztok mající výše uvedené složení se upraví na konečný objem 50 ul přidáním redestilované vody a použije se v PCR.
PCR termální podmínky: Zahřívání při 94 °C po dobu 2 minut, potom se provede termální cyklus 94 °C po dobu 1 minuty, 55 °C po dobu 1 minuty a 72 °C po dobu 2 minut, který se provede 30+krát,
- - n a potom se provede zahřívaní při 72 C po dobu 10 minut.
LM1-F4-DNA fragment kódující CDRL3, FRL4 a konstantní region a místem pro EcoRI restrikční enzym přidaným na 3<»-konci, se připraví za následujících podmínek.
Složení reakčního roztoku:
plasmidová pSRPDHH DNA, 25 ng oligonukleotidový primer HKCF12, 50 pmol oligonukleotidový primer 7ALCN, 50 pmol d
NTP kokteil, 5 ul lOxPCR pufr, 5 ul ampliTag DNA polymerasa, 2,5 jednotky
Reakční roztok mající výše uvedené složení se upraví na konečný objem 50 ul přidáním redestilované vody a použije se v pcr.
PCR termální podmínky: Zahřívání při 94 °C po dobu 2 minut, potom se provede termální cyklus 94 °C po dobu 1 minuty, 55 °c po dobu 1 minuty a 72 °C po dobu 2 minut, který se provede 30^krát, a potom se provede zahřívání při 72 °C po dobu 10 minut.
Amplifikované DNA fragmenty po PCR se separují elektroforesou na 5% polyakrylamidovém gelu. Gel po elektroforese se barví ethidiumbromidem (1 ug/ml) pro detekci produkované DNA za použití
9
9 9 9 • * · · ·· » • 9 9 9 9 9 9 9 9« • ··«»»·· ♦ 9« f • * I 9 9 »»
- 133 UV světla. Takto detekované příslušné DNA proužky se vyříznou čepelkou.
b) Druhý stupeň PCR
LM1-DNA, ve které jsou fúzované výše popsané LM1-F1-DNA, LM1-F2-DNA, LM1-F3-DNA a LM1-F4-DNA fragmenty, se připraví za následuj íc ích podmínek.
Složení reakčního roztoku:
Gelový fragment LM1-F1-DNA připravený v prvním stupni PCR,
Gelový fragment LM1-F2-DNA připravený v prvním stupni PCR,
Gelový fragment LM1-F3-DNA připravený v prvním stupni PCR, Gelový fragment LM1-F4-DNA připravený v prvním stupni PCR oligonukleotidový primer 7AL1P, 50 pmol oligonukleotidový primer 7ALCN, 50 pmol dNTP kokteil, 5,0 ul lOxPCR pufr, 5,0 ul ampliTag DNA polymerasa, 2,5 jednotky
Reakční roztok mající výše uvedené složení se upraví na konečný objem 50 ul přidáním redestilované vody a použije se v PCR.
PCR termální podmínky: Zahřívání při 94 °C po dobu 2 minut, potom se provede termální cyklus 94 °C po dobu 1 minuty, 55 °C po
Π dobu 1 minuty a 72C po dobu 2 minut, který se provede 30fkrát, n a potom se provede zahřívaní pri 72 C po dobu 10 minut.
Takto připravený LMI-DNA fragment se insertuje do pla$midové pCR3.1 DNA za použití Eukaryotic Ta Cloning Kitu (InVitrogen) podle návodu výrobce a vnese se do kompetentních E. coli TOP1OF' obsažených v kitu. Nukleotidové sekvence těchto DNA kódujících » » >» ♦
- 134lehké řetězce humanizované TRA-8 (LM1 typ) se potvrdí dideoxy způsobem (Sanger, F. S., a kol., (1977), Proč. Nati. Acad. Sei. USA, 74:5463-5467) za použití 3700 DNA Analyzeru (ABI PRISM; Perkin Elmer Applied Biosystems, Japan).
z.
Získané plasmidy se označí pCR3.1/LMl-2 (pla^mid nesoucí cDNA kódující variabilní region lehkého řetězce humanizované TRA-8 (LM1 typ) a konstantní region lehkého řetězce lidského Ig).
Získaný plafcmid pCR3.1/LM 1-2 obsahující LM1-DNA fragment se tráví restrikčními enzymy HindlII a EcoRI.
ug klonovacího plafcmidové pHSG399 DNA se tráví restrikčními enzymy Hind III a EcoRI a potom se defosforyluje pomocí CIP. Získaná defosforylovaná pHSG399 DNA a LM1-DNA fragment, který byl tráven restrikčními enzymy Hind III a EcoRI, se ligují za použití DNA Ligation Kit Verze 2.0 (Takara Syuzo, Co. Ltd.). Potom se E. coli DHSalfa transformují ligovanou DNA a kultivují se na LB agarovém mediu obsahujícím 0,1 mM IPTG, 0,1% X-Gal a 50 ug/ml chloramfenikolu (konečné koncentrace). Získané bílé transformanty se kultivují v kapalném LB mediu obsahujícím 50 ug/ml chloramfenikolu a pla^midová DNA se extrahuje ze získané kultury za použití techniky alkalické činidlo-SDS způsob. Extrahovaná pla^midová DNA se tráví Hind III a EcoRI a potom se klon nesoucí LM1-DNA fragment selektuje elektroforesou na 1% agarosovém gelu.
2.
V důsledku výše uvedeného postupu se získá pla^mid pHSG/Ml-2-2 nesoucí fůzní fragment variabilního regionu lehkého řetězce humanizované LM1 TRA-8 a konstantní region lidského Igkappa.
Transfromovaný E. coli kmen nesoucí tento mid, označený jako
E. coli DH5a/PHSG/Ml-2-2, se uloží v International Patent Organism Depositary, National Institute of Advanced Industrial Science and Technology, 1-1, Higashi 1 chome Tsukuba-shi, Ibaraki-ken,
4» «
- 135305-5466, Japan, 20.4.2001, v souladu s Budapešťskou smlouvou o ukládání mikroorganismů, pod přírůstkovým číslem FERM BP-7562.
V
3) Konstrukce pla^midu pSR/LMI-2 (expresní plazmid pro humanizované LM1 TRA-8 lehký řetězec)
Získaný plq^mid pHSG/Ml-2-2 nesoucí fúzní fragment variabilního regionu lehkého řetězce humanizované LM1 TRA-8 a konstantní region lidského Igkappa řetězce se tráví restrikčními enzymy Hind III a EcoRI.
ug klonovací plazmidové pSRIPDHH DNA (Evropská patentová přihláška EP 0 909 816 Al) se tráví restrikčními enzymy Hind III a EcoRI a potom se defosforyluje pomocí CIP. Získaná defosforylovaná pSRPDHH DNA a HindlII-EcoRI DNA fragment získaný z pHSG/Ml-2-2 se ligují za použití DNA Ligation Kit Verze 2.0 (Takara Syuzo, Co. Ltd.). Potom se E. coli DH5alfa transformují ligovanou DNA a kultivují se na LB agaru. Získané transformanty se kultivují v kapalném LB mediu obsahujícím 100 ug/ml ampicilinu, a plasmidová DNA se extrahuje ze získané kultury za použití techniky alkalické činidlo-SDS. Inserce a orientace požadovaného DNA fragmentu v pSRPDHH vektoru se potvrdí DNA sekvenováním za použití analyzátoru genové sekvence.
Získaný expresní nesoucí cDNA kódující lehké řetězce humanizované LM1 TRA-8 se označí pSR/LMl-2.
(4.2) Konstrukce expresního vektoru pro lehké řetězce humanizované protilátky (LM3 typ)
Jak je uvedeno v SEQ ID No. 73 seznamu sekvencí, další humanizace (LM3 typ) aminokyselinové sekvence lehkého řetězce myší protilátky TRA-8 proti lidskému DR5 zahrnuje nahrazení 8.
• « a » * · • 99 • · » 9 » ·i • ♦ 9 9 9 9 · » 9i • 9 9 > ·» > 9 · 9 ·« t • ♦ ♦ 9 9ti »9 · 9 99 9 9
-r 136 aminokyseliny (histidinu), 9. aminokyseliny (lysinu), 10. aminokyseliny (fenylalaninu), 11. aminokyseliny (methioninu), 13. aminokyseliny (threoninu), 20. aminokyseliny (šeřinu), 42. aminokyseliny (glutaminu), 43. aminokyseliny (šeřinu), 77. aminokyseliny (asparaginu), 78. aminokyseliny (valinu), 80. aminokyseliny (šeřinu) 83. aminokyseliny (leucinu), 85. aminokyseliny (kyseliny asparagové), 87. aminokyseliny (fenylalaninu), 99. aminokyseliny (glycinu), 103. aminokyseliny (leucinu) a 108. aminokyseliny (alaninu) na N-konci aminokyselinové sekvence lehkého řetězce TRA-8 prolinem, serinem, serinem, leucinem, alaninem, threoninem, lysinem, alaninem, serinem, leucinem, prolinem, fenylalaninem, threoninem, tyrosinem, glutaminem, valinem a threoninem, v příslušném pořadí. Získaná sekvence se označí LM3.
Expresní plazmid nesoucí tento typ aminokyselinových sekvencí humanizovaného lehkého řetězce protilátky TRA-8 proti lidskému DR5 (LM3 typ, SEQ ID No. 73 seznamu sekvencí) se konstruují následujícím způsobem.
1) Syntéza primerů pro přípravu variabilních a konstantních regionů lehkého řetězce humanizované LM3 TRA-8
DNA kódující LM3 polypeptidový řetězec (SEQ ID No. 73 seznamu sekvencí), z nichž každá je fúzí variabilního regionu lehkého řetězce humanizované protilátky TRA-8 proti DR5 a konstantního regionu lehkého řetězce lidského Ig (kappa řetězce), se v příslušném pořadí syntetizují za použití kombinací PCR.
Kromě 7ALIP (SEQ ID No. 47) a 7ALCN (SEQ ID No. 48) se následující oligonukleotidové primery syntetizují pro PCR:
5'- atctagttct cagagatgga gacagacaca atcctgctat gggtgctgct gctctgggtt ccagg-3' (MOD1F1; SEQ ID No. 78);
*
- 1375'- cagcacccat agcaggattg tgtctgtctc catctctgag aactagatga gaggatgctt cttaagctt-3' (M0D1R1; SEQ ID No. 79);
5'- ctccactggt gacattgtga tgacccaatc tccaagttct ttgtctgcat ctgtggggga cagggtc-3' (MOD1F22; SEQ ID No. 80);
5'- acttggagat tgggtcatca caatgtcacc agtggagcct ggaacccaga gcag-3'(MOD1R22; SEQ ID No. 81);
5'- accatcacct gcaaggccag tcaggatgtg ggtactgetg tagcctggta ccaacagaaa ccaggaa-3' (MOD1F3; SEQ ID No. 82);
5'- tacagcagta cccacatcct gactggcctt gcaggtgatg gtgaccctgt cccccacaga tgcagacaaaga-3' (MOD1R3; SEQ ID No. 83);
5'- aagcacccaa actcctcatc tattgggcat ccacccggca cactggggtc ccagataggt ttacaggcag t-3' (MOD1F42; SEQ ID No. 84);
5'- cccagtgtgc cgggtggatg cccaatagat gaggagtttg ggtgettttc ctggtttctg ttggtaccag gc-3' (M0D1R4; SEQ ID No. 85);
5'- gggtctggga cagacftcac cctcaccatc tctagtctgc agccggagga ttttgcaacc tat-3’(MOD1F5; SEQ ID No. 86);
5'- actagagatg gtgagggtga agtctgtccc agacccactg cctgtaaacc tatctgggac-3' (MOD1R52; SEQ ID No. 87);
5'- tactgtcagc aatatagcag ctatcggacg ttcggtcaag gcaccaaggt ggaaatc-3' (MOD1F6; SEQ ID No. 88);
5'- cgtccgatag ctgctatatt gctgacagta ataggttgca aaatcctccg gctgcac-3' (MOD1R6; SEQ ID No. 89)
5'- aaacggactg tggctgcacc atctgtcttc atcttcccgc catctgatga g-3' (M0D1F7; SEQ ID No. 90);
5'- gaagatgaag acagatggtg cagccacagt ccgtttgatt tccaccttgg tgccttgacc gaa-3' (MOD1R7; SEQ ID No. 91); a
5'- agatttcaac tgctcatcag atggcgggaa (LR17; SEQ ID No. 101).
z
2) Konstrukce pla^midu pCR3.1/LM3-3-44 (klonování lehkého řetězce typu LM3 humanizované TRA-8)
LM3-DNA fragment kódující aminokyselinovou sekvenci definovanou v SEQ ID No. 73 se připraví provedením 2-stupňové PCR, insertuje
138 —
Z se do plašmidového vektoru a klonuje se v E. coli.
a) První stupeň PCR
LM3-F31B-DNA fragment kódující sekvenci sekrečního signálu s místem pro Hind III restrikční enzym přidaným na 5'-konci, FRL1, CDRL1, FRL2 a CDRL2, FRI3, CDRL3, FRL4 a část konstantního regionu, se připraví za následujících podmínek.
Složení reakčního roztoku:
oligonukleotidový primer MOD1F1, 5 pmol oligonukleotidový primer M0D1R1, 5 pmol oligonukleotidový primer MOD1F22, 5 pmol oligonukleotidový primer MOD1R22, 5 pmol oligonukleotidový primer M0D1F3, 5 pmol oligonukleotidový primer M0D1R3, 5 pmol oligonukleotidový primer MOD1F42, 5 pmol oligonukleotidový primer M0D1R4, 5 pmol oligonukleotidový primer MOD1F5, 5 pmol oligonukleotidový primer MOD1R52, 5 pmol oligonukleotidový primer MOD1F6, 5 pmol oligonukleotidový primer MOD1R6, 5 pmol oligonukleotidový primer MOD1F7, 50 pmol oligonukleotidový primer MOD 1R7, 5 pmol oligonukleotidový primer 7AL1P, 50 pmol oligonukleotidový primer LR1 7, 50 pmol dNTP kokteil, 5 ul lOx PCR pufr, 5 ul ampliTaq DNA polymerasa, 2,5 jednotky
Reakční roztok mající výše uvedené složení se upraví na konečný objem 50 ul přidáním redestilované vody a použije se v PCR.
i τ
- 139 PCR termální podmínky: Zahřívání při 94 °C po dobu 2 minut, potom se provede termální cyklus 94 °C po dobu 1 minuty, 55 °C po dobu 1 minuty a 72 °C po dobu 2 minut, který se provede 30^krát, a potom se provede zahřívání při 72 °C po dobu 10 minut.
LM3-F31C-DNA fragment kódující část konstantního regionu s Eco Rl restrikčním místem přidaným na 3'-konci se připraví za následuj ících podmínek.
Templátový plasmid, pSRPDHH, se získá způsobem popsaným v Evropské patentové přihlášce EP 0 909 816 Al.
Složení reakčního roztoku:
plasmidová pSRPDHH DNA, 25 ng oligonukleotidový primer MOD1F7, 50 pmol oligonukleotidový primer 7ALCN, 50 pmol dNTP kokteil, 5 ul lOx PCR pufr, 5 ul ampliTaq DNA polymerasa, 2,5 jednotky
Reakční roztok mající výše uvedené složení se upraví na konečný objem 50 pl přidáním redestilované vody a použije se v PCR.
PCR termální podmínky: Zahřívání při 94 °c po dobu 2 minut, potom se provede termální cyklus 94 °C po dobu 1 minuty, 55 °C po dobu 1 minuty a 72 °C po dobu 2 minut, který se provede 30-krát, a potom se provede zahřívání při 72 °C po dobu 10 minut.
Amplifikované DNA fragmenty po PCR se separují elektroforesou na 5% polyakrylamidovém gelu. Gel se po elektroforese nabarví 1 ug/ml ethidiumbromidu pro detekci produkované DNA za použití UV světla. Příslušné DNA proužky se excidují čepelkou.
• Μ · »
- 140 b) Druhý stupeň PCR
LM3-DNA ve výše popsané LM3-F31B-DNA a LM3-F31C-DNA fragmenty se fúzují za následujících podmínek.
Složení reakčního roztoku:
Gelový fragment LM3-F31B-DNA připravený v prvním stupni PCR, Gelový fragment LM3-F31C-DNA připravený v prvním stupni PCR, oligonukleotidový primer 7AL1P, 50 pmol oligonukleotidový primer 7ALCN, 50 pmol dNTP kokteil, 5,0 ul lOx PCR pufr, 5,0 ul ampliTaq DNA polymerasa, 2,5 jednotky
Reakční roztok mající výše uvedené složení se upraví na konečný objem 50 pl přidáním redestilované vody a použije se v PCR.
PCR termální podmínky: Zahřívání při 94 °C po dobu 2 minut, potom se provede termální cyklus 94 °C po dobu 1 minuty, 55 °C po dobu 1 minuty a 72 °C po dobu 2 minut, který se provede 30^-krát, a potom se provede zahřívání při 72 °C po dobu 10 minut.
z.
Takto připravený LM3-DNA fragment se insertuje do pla^midové pCR3.1DNA za použití Eukaryotic Ta Cloning Kitu (InVitrogen) podle návodu výrobce a vnese se do kompetentních E. coli TOP1OF' obsažených v kitu. Nukleotidové sekvence těchto DNA kódujících lehké řetězce humanizované LM3 TRA-8 se potvrdí za použití dideoxy způsobu (Sanger, F. S., a kol., (1977), Proč. Nati. Acad. Sci. USA, 74:5463-5467) za použití 3700 DNA Analyzeru (ABI PRISM; Perkin Elmer Applied Biosystems, Japan).
2.
Získaný plasmid se označí pCR3.1/LM3-3-44 (plazmid nesoucí cDNA kódující variabilní region lehkého řetězce humanizované LM3 TRA-8
») 1 · «
>
- 141a konstantní region lehkého řetězce lidského Ig).
Získaný plasmid pCR3.1/LM3-3-44 obsahující LM3-DNA fragment se tráví restrikčními enzymy Hind III a EcoRI.
£ ug klonovací pla^midové pHSG399 DNA se tráví restrikčními enzymy Hind III a EcoRI a potom se defosforyluje pomocí CIP. Získaná defosforylovaná pHSG399 DNA a LM3-DNA fragment, který byl tráven restrikčními enzymy Hind III a EcoRI, se ligují za použití DNA Ligation Kitu Verze 2.0 (Takara Syuzo, Co. Ltd.). Potom se E.coli DH5alfa transformují ligovanou DNA a kultivují se na LB agarovém mediu obsahujícím 0,1 mM IPTG, 0,1% X-Gal a 50 ug/ml chloramfenikolu (konečné koncentrace). Získané bílé transformanty se kultivují v kapalném LB mediu obsahujícím 50 ug/ml chloramfenikolu a pla^midová DNA se extrahuje ze získané kultury za použití techniky alkalické činidlo-SDS. Extrahovaná pla|midová DNA se tráví Hind III a EcoRI a potom se klon nesoucí LM3-DNA fragment selektuje elektroforesou na 1% agarosovém gelu.
z.
Takto se získá plazmid pHSG/M3-3-22 nesoucí fúzní fragment variabilního regionu lehkého řetězce humanizované LM3 TRA-8 a konstantní region lidského Igkappa. Transformované E. coli kmene nesoucího tento plasmid, označené jako E. coli DH5alfa/pHSG/M3-3-22, se uložily v International Patent Organism Depositary, National Institute of Advanced Industrial Science and Technology, 1-1, Higashi 1 chome Tsukuba-shi, Ibaraki-ken, 305-5466, Japan, 20.4.2001, v souladu s Budapešťskou smlouvou o ukládání mikroorganismů, pod přírůstkovým č. FERM BP-7564.
3) Konstrukce plazmidu pSRILM3-3-44-10 (expresního plazmidu pro humanizované LM3 TRA-8 lehké řetězce) •x
Získaný plasmid pHSG/M3-3-22 nesoucí fúzní fragment
9 i » · 1 ♦ · ·
• · » » «
t« *
« «
* * ·
142 variabilního regionu lehkého řetězce humanizované LM3 TRA-8 a konstantní region lidského Igkappa řetězce se tráví restrikčními enzymy Hind III a EcoRI.
ug klonovací plazmidové pSRPDHH DNA (Evropská patentová přihláška EP 0 909 816 Al) se tráví restrikčními enzymy Hind III a EcoRI a potom se defosforyluje pomocí CIP. Získaná defosforylovaná pSRPDHH DNA a HindlII-EcoRI DNA fragment získaný z pHSG/M3-3-22 se ligují za použití DNA Ligation Kit Verze 2.0 (Takara Syuzo, Co. Ltd.). Potom se E. coli DHSalfa transformují ligovanou DNA a kultivují se na LB agaru. Získané transformanty se kultivují v kapalném LB mediu obsahujícím 100 ug/ml ampicilinu z, a pla|midova DNA se extrahuje ze získané kultury za použití techniky alkalické činidlo-SDS. Inserce a orientace požadovaného DNA fragmentu v pSRIPDHH vektoru se potvrdí DNA sekvenováním za použití analyzátoru genové sekvence (ABI Prism 3700 DNA Analyzer; Applied Biosystems).
Získaný expresní pg^šmid nesoucí cDNA kódující lehké řetězce humanizované LM3 TRA-8 se označí pSR/LM3-3-44-10.
(4.3) Konstrukce expresního vektoru pro lehké řetězce humanizované protilátky (LM4 typ)
Jak je uvedeno v SEQ ID No. 74 seznamu sekvencí, další humanizace (LM4 typ) aminokyselinové sekvence lehkého řetězce myší protilátky TRA-8 proti lidskému DR5 zahrnuje nahrazení 8. aminokyseliny (histidinu), 9. aminokyseliny (lysinu), 10. aminokyseliny (fenylalaninu), 11. aminokyseliny (methioninu), 13. aminokyseliny (threoninu), 20. aminokyseliny (šeřinu), 42. aminokyseliny (glutaminu), 43. aminokyseliny (šeřinu), 77. aminokyseliny (asparaginu), 78. aminokyseliny (valinu), 80. aminokyseliny (šeřinu) 83. aminokyseliny (leucinu), 85.
» tm
- 143 aminokyseliny (kyseliny asparagové), 99. aminokyseliny (glycinu) 103. aminokyseliny (leucinu) a 108. aminokyseliny (alaninu) z N-konce aminokyselinové sekvence lehkého řetězce TRA-8 prolinem, serinem, serinem, leucinem, alaninem, threoninem, lysinem, alaninem, serinem, leucinem, prolinem, fenylalaninem, threoninem, glutaminem, valinem a threoninem, v příslušném pořadí, získaná sekvence se označí LM4.
Expresní plasmidy nesoucí tento typ aminokyselinové sekvence lehkého řetězce humanizované protilátky TRA-8 proti lidskému DR5 (LM4 typ) (SEQ ID No. 74 seznamu sekvencí) se konstruují následujícím způsobem.
1) Syntéza primerů pro přípravu variabilních a konstantních regionů pro lehké řetězce humanizované LM4 TRA-8
DNA kódující LM4 polypeptidový řetězec (SEQ ID No. 74 seznamu sekvencí), z nichž každá je fúzí variabilního regionu lehkého řetězce humanizované protilátky TRA-8 proti DR5 a konstantního regionu lehkého řetězce lidského Ig (kappa řetězce), se v příslušném pořadí syntetizují za použití kombinací PCR.
Kromě 7AL1P (SEQ ID No. 47), 7ALCN (SEQ ID No. 48), MOD1F1 (SEQ ID No. 78), MOD1R1 (SEQ ID No. 79), MOD1F22 (SEQ ID No. 80), MOD1R22 (SEQ ID No. 81), MOD1F3 (SEQ ID No. 82), MOD1R3 (SEQ ID No. 83), MOD1F42 (SEQ ID No. 84), MOD1R4 (SEQ ID No. 85), M0D1F5 (SEQ ID NO. 86), MOD1R52 (SEQ ID No. 87), MOD1F7 (SEQ ID No. 90) a M0D1R7 (SEQ ID No. 91), LR17 (SEQ ID No. 101) se syntetizují následující oligonukleotidové primery pro PCR:
5'- ttctgtcagc aatatagcag ctatcggacg ttcggteaag gcaccaaggt ggaaatc-3' (MOD1F62; SEQ ID No. 92)
5'- cgtccgatag ctgctatatt gctgacagaa ataggttgca aaatcctccg gctgcag-3' » »
- 144 (M0D1R62; SEQ ID No. 93)
2) Konstrukce pla^midu pCR3.1ILM4-5-3 (klonování typu LM4 lehkého řetězce humanizované TRA-8)
LM4-DNA fragment kódující aminokyselinovou sekvenci definovanou v SEQ ID No. 74 se připraví provedením 2-stupňové PCR, insertuje se do pla|midového vektoru a klonuje se v E. coli.
a) První stupeň PCR
LM4-F41B-DNA fragment kódující sekvenci sekrečního signálu s Hind III restrikčním místem přidaným na 5'-konci, FRL1, CDRL1, FRL2 a CDRL2, FRL3, CDRL3, FRL4 a část konstantního regionu, se připraví za následujících podmínek.
Složeni reakčního roztoku:
oligonukleotidový oligonukleotidový o1igonukleotidový o1igonukleotidový oligonukleotidový oligonukleotidový oligonukleotidový oligonukleotidový oligonukleotidový oligonukleotidový oligonukleotidový oligonukleotidový oligonukleotidový oligonukleotidový oligonukleotidový o1igonukleotidový primer MOD1F1, 5 pmol primer MOD1R1, 5 pmol primer MOD1F22, 5 pmol primer MOD1R22, 5 pmol primer MOD1F3, 5 pmol primer M0D1R3, 5 pmol primer MOD1F42, 5 pmol primer M0D1R4, 5 pmol primer MOD1F5, 5 pmol primer MOD1R52, 5 pmol primer MOD1F62, 5 pmol primer MOD1R62, 5 pmol primer MOD1F7, 50 pmol primer MOD1R7, 5 pmol primer 7AL1P, 50 pmol primer LRI7, 50 pmol » π ·
- 145 dNTP kokteil, 5 ul lOx PCR pufr, 5 ul ampliTaq DNA polymerasa, 2,5 jednotky
Reakční roztok mající výše uvedené složení se upraví na konečný objem 50 ul přidáním redestilované vody a použije se v PCR.
PCR termální podmínky: Zahřívání při 94 °C po dobu 2 minut, potom se provede termální cyklus 94 °C po dobu 1 minuty, 55 °C po dobu 1 minuty a 72 °C po dobu 2 minut, který se provede 30^krát, a potom se provede zahřívání při 72 °C po dobu 10 minut.
LM4-F41C-DNA fragment kódující část konstantního regionu s Eco RI restrikčním místem přidaným na 3<s-konci se připraví za následujících podmínek.
Templátový plasmid, pSRPDHH, se získá způsobem popsaným v Evropské patentové přihlášce EP 0909816 Al.
Složení reakčního roztoku:
X.
plazmidová pSRPDHH DNA, 25 ng oligonukleotidový primer MOD1F7, 50 pmol oligonukleotidový primer 7ALCN, 50 pmol dNTP kokteil, 5 ul lOx PCR pufr, 5 ul ampliTag DNA polymerasa, 2,5 jednotky
Reakční roztok mající výše uvedené složení se upraví na konečný objem 50 pl přidáním redestilované vody a použije se v PCR.
PCR termální podmínky: Zahřívání při 94 °C po dobu 2 minut, potom se provede termální cyklus 94 °C po dobu 1 minuty, 55 °C po dobu 1 minuty a 72 °C po dobu 2 minut, který se provede 30fkrát, • 9
- 146 a potom se provede zahřívání při 72 °C po dobu 10 minut.
Amplifikované DNA fragmenty po PCR se separují elektroforesou na 5% polyakrylamidovém gelu. Gel po elektroforese se barví 1 ug/ml ethidiumbromidem pro detekci produkované DNA za použití UV světla. Příslušné detekované DNA proužky se vyříznou čepelkou.
b) Druhý stupeň PCR
LM4-DNA, ve které jsou fúzované výše popsané LM4-F41B-DNA a LM4-F41C-DNA fragmenty, se připraví za následujících podmínek.
Složení reakčního roztoku:
Gelový fragment LM4-F41B-DNA připravený v prvním stupni PCR, Gelový fragment LM4-F41C-DNA připravený v prvním stupni PCR, oligonukleotidový primer 7AL1P, 50 pmol oligonukleotidový primer 7ALCN, 50 pmol dNTP kokteil, 5,0 ul lOx PCR pufr, 5,0 ul ampliTaq DNA polymerasa, 2,5 jednotky
Reakční roztok mající výše uvedené složení se upraví na konečný objem 50 ul přidáním redestilované vody a použije se v PCR.
pcr termální podmínky: Zahřívání při 94 °C po dobu 2 minut, potom se provede termální cyklus 94 °C po dobu 1 minuty, 55 °C po dobu 1 minuty a 72 °C po dobu 2 minut, který se provede 30^krát, a potom se provede zahřívání při 72 °C po dobu 10 minut.
zTakto připravený LM4-DNA fragment se insertuje do plazmidové pCR3.1 DNA za použití Eukaryotic Ta Cloning Kitu (InVitrogen) podle návodu výrobce a vnese se do kompetentních E. coli T0P10F' obsažených v kitu. Nukleotidové sekvence těchto DNA kódujících
147 lehké řetězce humanizované LM4 TRA-8 se potvrdí za použití dideoxy způsobu (Sanger, F. S., a kol., (1977), Proč. Nati. Acad. Sci.
USA, 74:5463-5467) za použití 3700 DNA Analyzer (ABI PRISM; Perkin Elmer Applied Biosystems, Japan).
, 0 ZZískaný plasmid se označený pCR3.1/LM4-5-3 (plasmid nesoucí cDNA kódující variabilní region lehkého řetězce humanizované LM4 TRA-8 a konstantní region lehkého řetězce lidského Ig).
Získaný plasmid pCR3.1/LM4-5-3 obsahující LM4-DNA fragment se tráví restrikčními enzymy Hind III a EcoRI.
z ug klonovací pla^midové pHSG399 DNA se tráví restrikčními enzymy Hind III a EcoRI, a potom se defosforyluje pomocí CIP. Získaná defosforylovaná pHSG399 DNA a LM4-DNA fragment, který byl tráven restrikčními enzymy Hind III a EcoRI, se ligují za použití DNA Ligation Kitu Verze 2.0 (Takara Syuzo, Co. Ltd.). Potom se E. coli DH5alfa transformují ligovanou DNA a kultivují se na LB agarovém mediu obsahujícím 0,1 mM IPTG, 0,1% X-Gal a 50 ug/ml chloramfenikolu (konečné koncentrace). Získané bílé transformanty se kultivují v kapalném LB mediu obsahujícím 50 ug/ml chloramfenikolu a pla^midová DNA se extrahuje ze získané kultury •z.
za použiti techniky alkalické činidlo-SDS. Extrahovaná pla^midová DNA se tráví Hind III a EcoRI a potom se klon nesoucí LM4-DNA fragment selektuje elektroforesou na 1% agarosovém gelu.
tr
Takto se získá plasmid pHSG/M4-5-3-l nesoucí fúzi fragmentu variabilního regionu lehkého řetězce humanizované LM4 TRA-8 a konstantního region lidského IgK řetězce. Transformovaný E. coli kmen nesoucí tento plasmid, označený jako E. coli DH5alfa/pHSG/M4-5-3-l, se uložil v International Patent Organism Depositary, National Institute of Advanced Industrial Science and Technology, 1-1, Higashi 1 chome Isukuba-shi, Ibaraki-ken,
J i
148
305-5466, Japan, 20.4.2001, v souladu s Budapešťskou smlouvou o ukládání mikroorganismů, pod přírůstkovým č. FERM BP-7565.
3) Konstrukce pla^midu pSR/LM4-5-3-3 (expresní plasmid pro humanizované lehké řetězce LM4 TRA-8)
Získaný plasmid pHSG/M4-5-3-l nesoucí fúzi fragmentu variabilního regionu lehkého řetězce LM4 humanizované TRA-8 a konstantního regionu lidského Igkappa řetězce se tráví restrikčními enzymy Hind III a EcoRI.
Zi ug klonovací plafcmidové pSRPDHH DNA (Evropská patentová přihláška EP 0 909 816 Al) se tráví restrikčními enzymy Hind III a EcoRI a potom se defosforyluje pomocí CIP. Získaná defosforylovaná pSRPDHH DNA a HindlII-EcoRl DNA fragment získaný z pHSG/M4-5-3-l se ligují za použiti DNA Ligation Kitu Verze 2.0 (Takara Syuzo, Co. Ltd.). Potom se E. coli DHSalfa transformují ligovanou DNA a kultivují se na LB agaru. Získané transfromanty se kultivují v kapalném LB mediu obsahujícím 100 ug/ml ampicilinu, a plapmidová DNA se extrahuje ze získané kultury za použití techniky alkalické činidlo-SDS. Inserce a orientace požadovaného DNA fragmentu pSRPDHH vektoru se potvrdí DNA sekvenováním za použití analyzátoru genové sekvence (ABI Prism 3700 DNA Anályzer; Applied Biosystems).
t.
Získaný expresní plasmid nesoucí cDNA kódující lehké řetězce humanizované LM4 TRA-8 se označí pSR/DM4-5-3-3.
(4.4) Konstrukce expresního vektoru pro lehké řetězce humanizované protilátky (LM5 typu)
Jak je uvedeno v SEQ ID No. 75 seznamu sekvencí, další humanizace (LM5 typ) aminokyselinové sekvence lehkého řetězce myší • ·
J » 9 í i · ♦ * • · » » * · 9 » i * » 4 ♦
- 149 protilátky TRA-8 proti lidskému DR5 zahrnuje nahrazení 8. aminokyseliny (histidinu), 9. aminokyseliny (lysinu), 10. aminokyseliny (fenylalaninu), 11. aminokyseliny (methioninu), 13. aminokyseliny (threoninu), 20. aminokyseliny (šeřinu), 42. aminokyseliny (glutaminu), 43. aminokyseliny (šeřinu), 77. aminokyseliny (asparaginu), 78. aminokyseliny (valinu), 80. aminokyseliny (šeřinu), 83. aminokyseliny (leucinu), 103. aminokyseliny (leucinu) a 108. aminokyseliny (alaninu) z N-konce aminokyselina sekvence lehkého řetězce TRA-8 prolinem, serinem, serinem, leucinem, alaninem, threoninem, lysinem, alaninem, serinem, leucinem, prolinem, fenylalaninem, valinem a threoninem, v příslušném pořadí. Získaná sekvence se označí LM5.
z
Expresní pla^midy nesoucí tento typ aminokyselinové sekvence lehkého řetězce humanizované protilátky TRA-8 proti lidskému DR5 (LM5 typ) (SEQ ID No. 75 seznamu sekvencí) se konstruuje následujícím způsobem.
1) Syntéza primerů pro přípravu variabilních a konstantních regionů lehkého řetězce humanizované LM5 TRA-8
DNA kódující LM5 polypeptidový řetězec (SEQ ID No. 75 seznamu sekvencí), z nichž každá je fúzí variabilního regionu lehkého řetězce humanizované protilátky TRA-8 proti DR5 a konstantního regionu lehkého řetězce lidského Ig (kappa řetězce), se v příslušném pořadí syntetizují za použití kombinace PCR.
Kromě 7ALIP (SEQ ID No.47), 7ALCN (SEQ ID No.48), MOD1F1 (SEQ ID No. 78), MOD1R1 (SEQ ID No. 79), MOD1F22 (SEQ ID No. 80), MOD1R22 (SEQ ID No. 81), MOD1F3 (SEQ ID No. 82), MOD1R3 (SEQ ID NO. 83), MOD1F42 (SEQ ID No. 84), M0D1R4 (SEQ ID No. 85), MOD1R52 (SEQ ID No. 87), MOD1F7 (SEQ ID No. 90), a LR17 (SEQ ID No. 101), se syntetizují následující oligonukleotidové primery pomocí PCR:
• · »
i * · » · · ♦ »· « ·· « · • ·» · « »» « « · » ·
- 150 5'- gggtctggga cagacttcac cctcaccatc tctagtctgc agccggagga ttttgcagat tat-3' (MOD1F52; SEQ ID No. 94)
5'- ttctgtcagc aatatagcag ctatcggacg ttcggtggag gcaccaaggt ggaaatc-: (MOD1F63; SEQ ID No. 95)
5'- cgtccgatag ctgctatatt gctgacagaa ataatctgca aaatcctccg gctgcag-2 (MOD1R63; SEQ ID No. 96)
5'- gaagatgaag acagatggtg cagccacagt ccgtttgatt tccaccttgg tgcctccac gaa-3' (MOD1R72; SEQ ID No. 102)
2) Konstrukce pla$midu pCRS.l/LMS-3-42 (klonování LM5 typu lehkého řetězce humanizované TRA-8)
LM5-DNA fragment kódující aminokyselinovou sekvenci podle SEQ ID No. 75 se připraví provedením 2-stupňové PCR, insertuje se do plasmidového vektoru a klonuje se v E. coli.
a) První stupeň PCR
LMS-F51B-DNA fragment kódující sekvenci sekrečního signálu s Hind III restrikčním míszem přidaným na 5'-konci, FRL1, CDRLL, FRL2, CDRL2, FRL3, CDRL3, FRL4 a část konstantního regionu, se připraví za následujících podmínek.
Složení reakčního roztoku:
oligonukleotidový primer MOD1F1, 5 pmol oligonukleotidový primer MOD1R1, 5 pmol oligonukleotidový primer MOD1F22, 5 pmol oligonukleotidový primer MOD1R22, 5 pmol oligonukleotidový primer MOD1F3, 5 pmol oligonukleotidový primer MOD1R3, 5 pmol oligonukleotidový primer MOD1F42, 5 pmol oligonukleotidový primer MOD1R4, 5 pmol >9 « 1 i · • » * • ·· * * • ·» • · *
Λ ·· * »
- 151 oligonukleotidový primer MOD1F52, 5 pmol oligonukleotidový primer MOD1R52, 5 pmol oligonukleotidový primer MOD1F63, 5 pmol oligonukleotidový primer MOD1R63, 5 pmol oligonukleotidový primer MOD1F7, 50 pmol oligonukleotidový primer MOD1R72, 5 pmol oligonukleotidový primer 7AL1P, 50 pmol oligonukleotidový primer LR17, 50 pmol dNTP kokteil, 5 ul lOx PCR pufr, 5 ul ampliTaq DNA polymerasa, 2,5 jednotky
Reakční roztok mající výše uvedené složení se upraví na konečný objem 50 pl přidáním redestilované vody a použije se v PCR.
PCR termální podmínky: Zahřívání při 94 °C po dobu 2 minut, potom se provede termální cyklus 94 °C po dobu 1 minuty, 55 °C po dobu 1 minuty a 72 °C po dobu 2 minut, který se provede 30-krát, a potom se provede zahřívání při 72 °C po dobu 10 minut.
LMS-F51C-DNA fragment kódující část konstantního regionu s Eco RI restrikčním místem přidaným na 3<»-konci se připraví za následujících podmínek. Templátový plafcmid, pSRPDHH, se získá způsobem, který uvádí Evropská patentová přihláška EP 0 909 816 Al.
Složení reakčního roztoku:
plasmidová pSRPDHH DNA, 25 ng oligonukleotidový primer MOD1F7, 50 pmol oligonukleotidový primer 7ALCN, 50 pmol dNTP kokteil, 5 ul lOx PCR pufr, 5 ul ampliTaq DNA polymerasa, 2,5 jednotky • ·
9 9 9 «
9*9
- 152 —
Reakční roztok mající výše uvedené složení se upraví na konečný objem 50 pl přidáním redestilované vody a použije se v PCR.
PCR termální podmínky: Zahřívání při 94 °C po dobu 2 minut, potom se provede termální cyklus 94 °C po dobu 1 minuty, 55 °C po dobu 1 • η minuty a 72 C po dobu 2 minut, který se provede 30+krát, a potom se provede zahřívání při 72 °C po dobu 10 minut.
Amplifikované DNA fragmenty po PCR se separují elektroforesou na 5% polyakrylamidovém gelu. Gel po elektroforese se barví 1 ug/ml ethidiumbromidu pro detekci produkované DNA za použití UV světla. Příslušné detekované DNA proužky se vyříznou za použití čepelky.
b) Druhý stupeň PCR
LM5-DNA, ve které jsou fúzované výše popsané LM5-F51B-DNA a LM5-F51C-DNA fragmenty, se připraví za následujících podmínek.
Složení reakčního roztoku:
Gelový fragment LM5-F51B-DNA připravený v prvním stupni PCR,
Gelový fragment LM5-F51C-DNA připravený v prvním stupni PCR, oligonukleotidový primer 7AL1P, 50 pmol oligonukleotidový primer 7ALCN, 50 pmol dNTP kokteil, 5,0 ul lOx PCR pufr, 5,0 ul ampliTaq DNA polymerasa, 2,5 jednotky
Reakční roztok mající výše uvedené složení se upraví na konečný objem 50 pl přidáním redestilované vody a použije se v PCR.
PCR termální podmínky: Zahřívání při 94 °C po dobu 2 minut, • · , Μ » » » · * · • » ti»
- 153 potom se provede termální cyklus 94 °C po dobu 1 minuty, 55 °C po dobu 1 minuty a 72 °C po dobu 2 minut, který se provede 30+krát, a potom se provede zahřívání při 72 °C po dobu 10 minut.
Z
Takto připravený LM5-DNA fragment se invertuje do plazmidové pCR3.1DNA za použití Eukaryotic Ta Cloning Kitu (InVitrogen) podle protokolu výrobce a vnese se do kompetentních E. coli TOP1OF' obsažených v kitu. Nukleotidové sekvence těchto DNA kódujících lehké řetězce humanizované LM5 TRA-8 se potvrdí dideoxy způsobem (Sanger, F. S., a kol., (1977), Proč. Nati. Acad. Sci. USA, 74:5463-5467) za použití DNA analyzátoru.
Získaný plasmid se označený pCR3.1/LM5-3-42 (plazmid nesoucí cDNA kódující variabilní region lehkého řetězce humanizované LMS TRA-8 a konstantní region lehkého řetězce lidského Ig).
x.
Získaný plazmid pCR3.l/LMS-3-42 obsahující LM5-DNA fragment se tráví restrikčními enzymy Hind III a EcoRI.
ug klonovaci plazmidové pHSG399 DNA se tráví restrikčními enzymy Hind III a EcoRI a potom se defosforyluje pomocí CIP. Získaná defosforylovaná pHSG399 DNA a LM5-DNA fragment, který se trávil restrikčními enzymy Hind III a EcoRI, se ligují za použití DNA Ligation Kitu Verze 2.0 (Takara Syuzo, Co. Ltd.). Potom se E. coli DHSalfa transformují ligovanou DNA a kultivují se na LB agarovém mediu obsahujícím 0,1 mM IPTG, 0,1% X-Gal a 50 ug/ml chloramfenikolu (konečné koncentrace). Získané bílé transformanty se kultivují v kapalném LB mediu obsahujícím 50 ug/ml
Ž.
chloramfenikolu, a plazmidová DNA se extrahuje ze získané kultury za použí techniky alkalické činidlo-SDS. Extrahovaná plazmidová DNA se tráví Hind III a EcoRI a potom se klon nesoucí LM5-DNA fragment selektuje elektroforesou na 1% agarosovém gelu.
á * — 154 •2.
Takto se získá plazmid pHSG/M5-3-27 nesoucí fúzi fragmentu pro variabilní region lehkého řetězce humanizované LM5 TRA-8 a fragmentu pro konstantní region lidského Igkappa řetězce.
L
3) Konstrukce plasmidu pSR/LM5-3-27-l (expresního pla^midu pro humanizovaný LM5 TRA-8 lehký řetězec)
Získaný plazmid pHSG/M5-3-27 nesoucí fúzi fragmentu pro variabilní region lehkého řetězce humanizované LM5 TRA-8 a fragmentu pro konstantní region lidského Ig-kappa řetězce se tráví restrikčními enzym Hind III a EcoRI.
ug klonovací plasmidové pSRPDHH DNA (Evropská patentová přihláška EP 0 909 516 Al) se tráví restrikčními enzymy Hind III a EcoRI a potom se defosforyluje pomocí CIP. Získaná defosforylovaná pSRPDHH DNA a HindlII-EcoRI DNA fragment získaný z pHSG/M5-3-27 se ligují za použití DNA Ligation Kitu Verze 2.0 (Takara Syuzo, Co. Ltd.). Potom se E. coli DHSalfa transformují ligovanou DNA a kultivují se na LB agaru. Získané transformanty se kultivují v kapalném LB mediu obsahujícím 100 ug/ml ampicilinu a plazmidová DNA se extrahuje ze získané kultury technikou alkalické činidlo-SDS. Inserce a orientace požadovaného DNA fragmentu v pSRPDHH vektoru se potvrdí DNA sekvenováním za použití analyzátoru genové sekvence (ABI Prism 3700 DNA Anályzer; Applied Biosystems).
z
Získaný expresní plazmid nesoucí cDNA kódující lehké řetězce humanizované LM5 TRA-8 se označí pSR/LM5-3-27-l.
(4.5) Konstrukce expresního vektoru pro lehký řetězec humanizované protilátky (chimérický typ)
Sekvence uvedená v SEQ ID No. 76 seznamu sekvencí, * · esa*
155 aminokyselinová sekvence lehkého řetězce chimérické TRA-8, se označí LM6.
z.
Expresní pla^midy nesoucí tento typ humanizovaného lehkého řetězce aminokyselinové sekvence protilátky TRA-8 proti lidskému DR5 (LM6 typ) (SEQ ID No. 75 seznamu sekvencí) se konstruují následujícím způsobem.
1) Syntézy primerů pro přípravu variabilního a konstantního regionu lehkého řetězce humanizované LM6 TRA-8
DNA kódující LM6 polypeptidový řetězec (SEQ ID No. 75 seznamu sekvencí), z nichž každá je fúzí variabilního regionu lehkého řetězce (LM 6 typu) myší anti-DR5 protilátky TRA-8 a konstantního regionu lehkého řetězce lidského Ig (kappa řetězce), se v příslušném pořadí syntetizují za použití kombinací PCR.
Kromě 7AL1P (SEQ ID No. 47) a 7ALCN (SEQ ID No. 48), se pro PCR syntetizují následující oligonukleotidové primery:
5’- tgatgtggac atgaatttgt gagactgggt catcacaatg tcaccagtgg a-3’ (HKSPR13; SEQ ID No. 97);
5'- tgggttccag gctceactgg tgacattgtg atgacccagt ctcacaaatt c-3' (MVF11; SEQ ID No. 98);
5'- aagacagatg gtgcagccac agcccgtttg atttccagcttggtgcctc-3' (MVR11; SEQ ID No. 99); a
5'- aagctggaaa tcaaacgggc tgtggctgca ccatctgtct tcatc-3’ (MCF 11; SE ID No. 100).
z.
2) Konstrukce plazmidu pCR3.1/LM6-l-16 (klonování LM6 lehkého řetězce humanizované TRA-8
LM6-DNA fragment kódující aminokyselinovou sekvenci podle SEQ » » » · • ·
- 156
ID No. 75 se připraví provedením 2-stupňové PCR reakce, insertuje se do imidového vektoru a klonuje se do E. coli.
a) První stupeň PCR
LM6-F1-DNA fragment kódující sekvenci sekrečního signálu a a část FRL1 regionu s místem pro Hind III restrikční enzympřidaným na 5<»-konci se připraví za následujících podmínek. Templářové pla^midy, pHSGHM17 a pSRPDHH, se získají způsobem uvedeným v Evropské patentové přihlášce EP 0909816 Al.
Složení reakčního roztoku:
z.
plazmidová pHSGHM17 DNA, 25 ng oligonukleotidoový primer 7AL1P, 50 pmol oligonukleotidový primer HKSPR13, 50 pmol dNTP kokteil, 5 ul lOx PCR pufr, 5 ul ampliTaq DNA polymerasa (PerkinElmer), 2,5 jednotky
Reakční roztok mající výše uvedené složení se upraví na konečný objem 50 pl přidáním redestilované vody a použije se v PCR.
PCR termální podmínky: Zahřívání při 94 °C po dobu 2 minut, potom se provede termální cyklus 94 °C po dobu 1 minuty, 55 °C po dobu 1 minuty a 72 °C po dobu 2 minut, který se provede 3oj-krát, a potom se provede zahřívání při 72 °C po dobu 10 minut.
LM6-F2-DNA fragment kódující část FRL1, CDRLI, FRL2, CDRL2, FRL3, CDRL3, FRL4 a část konstantního regionu se připraví za následuj íc ích podmínek.
Složení reakčního roztoku:
plazmidová pL28 DNA, 25 ng » i > » a
•
Μ»
- 157 — oligonukleotidový primer MVF11, 50 pmol oligonukleotidový primer MVR12, 50 pmol dNTPs kokteil, 5 ul lOx PCR pufr, 5 pl ampliTag DNA polymerasa, 2,5 jednotky
Reakční roztok mající výše uvedené složení se upraví na konečný objem 50 pl přidáním redestilované vody a použije se v PCR.
PCR termální podmínky: Zahřívání při 94 °C po dobu 2 minut, potom se provede termální cyklus 94 °C po dobu 1 minuty, 55 °C po A dobu 1 minuty a 72 C po dobu 2 minut, který se provede 30^krát, a potom se provede zahřívání při 72 °C po dobu 10 minut.
LM6-F3-DNA fragment kódující for a část FRL4 a konstantní region s místem pro EcoRI restrikční enzym přidaným na 3'-konci se připraví za následujících podmínek.
Složení reakčního roztoku:
z pla^midová pSRPDHH DNA, 25 ng oligonukleotidový primer MCF11, 50 pmol oligonukleotidový primer 7ALCN, 50 pmol dNTP kokteil, 5 ul lOx PCR pufr, 5 ul ampliTag DNA polymerasa, 2,5 jednotky
Reakční roztok mající výše uvedené složení se upraví na konečný objem 50 pl přidáním redestilované vody a použije se v PCR.
PCR termální podmínky: Zahřívání při 94 °C po dobu 2 minut, potom se provede termální cyklus 94 °C po dobu 1 minuty, 55 °C po dobu 1 minuty a 72 °C po dobu 2 minut, který se provede 30-řkrát,
A 9 4
-, 158 a potom se provede zahřívání při 72 °C po dobu 10 minut.
Amplifikované DNA fragmenty po PCR se separuji elektroforesou na 5% polyakrylamidovém gelu. Gel po elektroforese se barví ethidiumbromidem (1 ug/ml) pro detekci produkované DNA za použití UV světla. Příslušné takto detekované DNA proužky se vyříznou čepelkou.
b) Druhý stupeň PCR
LM6-DNA, ve které jsou fúzované výše popsané LM6-F1-DNA, LM6-F2-DNA, a LM6-F3-DNA fragmenty, se připraví za následujících podmínek.
Složení reakčního roztoku:
Gelový fragment LM6-F1-DNA připravený v prvním stupni PCR;
Gelový fragment LM6-F2-DNA připravený v prvním stupni PCR;
Gelový fragment LM6-F3-DNA připravený v prvním stupni PCR; oligonukleotidový primer 7AL1P, 50 pmol;
oligonukleotidový primer 7ALCN, 50 pmol;
dNTP kokteil, 5,0 ul;
lOx PCR pufr, 5,0 ul;
ampliTaq DNA polymerasa, 2,5 jednotky;
Reakční roztok mající výše uvedené složení se upraví na konečný objem 50 pl přidáním redestilované vody a použije se v PCR.
PCR termální podmínky: Zahřívání při 94 °C po dobu 2 minut, potom se provede termální cyklus 94 °C po dobu 1 minuty, 55 °C po dobu 1 minuty a 72 °C po dobu 2 minut, který se provede 30^krát, a potom se provede zahřívání při 72 °C po dobu 10 minut.
x
Takto připravený LM6-DNA fragment se insertuje do pla^midové pCR3.1 DNA za použití Eukaryotic Ta Cloning Kitu (Invitrogen) podle protokolu výrobce a vnese se do kompetentních E. coli
TOP1OF' obsažených v kitu. Nukleotidová sekvence těchto DNA kódujících lehké řetězce humanizované TRA-8 se potvrdí dideoxy způsobem za použití DNA analyzátoru.
- 159
Získaný pla$mid se označený pCR3.1/LM6-1-16 (pla$mid nesoucí cDNA kódující variabilní region lehkého řetězce myší TRA-8 a konstantní region lehkého řetězce lidského Ig).
Získaný plasmid pCR3.1/LM6-1-16 obsahující LM6-DNA fragment se tráví restrikčními enzymy Hind III a EcoRI.
z.
ug klonovací pla$midové pHSG399 DNA se tráví restrikčními enzymy HindlII a EcoRI, a potom se defosforyluje pomocí CIP. Získaná defosforylovaná pHSG399 DNA a LM6-DNA fragment, který byl předem tráven restrikčními enzymy Hind III a EcoRI, se ligují za použití DNA Ligation Kit Verze 2.0 (Takara Syuzo, Co. Ltd.). Potom se E. coli DHSalfa transformují ligovanou DNA a kultivují se na LB agarovém mediu obsahujícím 0,1 mM IPTG, 0,1% X-Gal a 50 ug/ml chloramfenikolu (konečné koncentrace). Získané bílé transformanty se kultivují v kapalném LB mediu obsahujícím 50 ug/ml chloramfenikolu a plazmidová DNA se extrahuje ze získané kultury “Z.
technikou alkalické činidlo-SDS. Extrahovaná plazmidová DNA se tráví Hind III a EcoRI a potom se klon nesoucí LM6-DNA fragment selektuje elektroforesou na 1% agarosovém gelu.
Takto se získá mid pHSG/M6-l-4-l nesoucí fúzi fragmentu pro variabilní region lehkého řetězce myší TRA-8 a pro konstantní region lidského Igkappa řetězce. Transformovaný kmen E. coli nesoucí tento mid, označený jako E. coli
DH5alfa/pHSG/M6-l-4-l, se uložil v Intemational Patent Organism Depositary, National Institute of Advanced Industrial Science and ·«· ·>·««· « • · · · * · · • · · · « · · 9 9 · • ·»*»··· · ··· • · · · · · · « « · * · · » · «
Technology, 1-1, Higashi 1 chome Tsukuba-shi, Ibaraki-ken, 305-5466, Japan, 20.4.2001, v soualdu s Budapešťskou smlouvou o ukládání mikroorganismů, pod přírůstkovým č. FERM BP-7566.
v 2 *-
3) Konstrukce plazmidu pSR/LM6-l-4-6 (expresní plasmid pro chimérický LM6 TRA-8 lehký řetězec)
Získaný plasmid pHSG/LM6-l-4-l nesoucí fúzi fragmentu pro variabilní region lehkého řetězce myší TRA-8 a pro konstantní region lidského Igkappa řetězce se tráví restrikčními enzymy Hind III a EcoRI. 1 ug klonovací pla^midové pSR/PDHH DNA se tráví restrikčními enzymy Hind III a EcoRI a potom se defosforyluje pomocí CIP. Získaná defosforylovaná pSRPDHH DNA a HindlII-EcoRI DNA fragment získaný z pHSG/LM6-l-4-l se ligují za použití DNA Ligation Kitu Verze 2.0 (Takara Syuzo, Co. Ltd.). Potom se E. coli DH5alfa transformují ligovanou DNA a kultivují se na LB agaru. Získané transformanty se kultivují v kapalném LB mediu obsahujícím 100 ug/ml ampicilinu a pla$midová DNA se extrahuje ze získané kultury technikou alkalické činidlo-SDS. Inserce a orientace požadovaného DNA fragmentu ve vektoru se potvrdí DNA sekvenováním za použití an alyzátoru genové sekvence.
z
Získaný expresní plasmid nesoucí cDNA kódující lehké řetězce TRA-8 (chimérický typ) se označí pSR/LM6-l-4-6.
(5) Produkce několika typů humanizovaných nebo chimérických TRA-8 protilátek
Transfekce COS-7 buněk se provede technikou využívající FUGENE6 (Boehringer Mannheim Biochemica) podle návodu výrobce kitu.
COS-7 buňky (Američan Type Culture Collection č. CRL-1651) se • «
- 161 kultivují do semikonfluentního stavu (3 x 106 buněk/disk) v kultivačních discích (plocha kultury: 57 cm2; Sumitomo Bakelite) obsahujících Dulbeccovo Modifikované Eagle medium (zde dále označované jako D-MEM; Gibco BRL) doplněné 10% fetálním telecím sérem (dále FCS; Moregate).
Mezitím se smísí 10 ug/disk (celkem 5 disků) expresní
z.
pla$midové DNA pro těžký řetězec humanizované DR5 (pHA15-l) a 10 ug/disk expresní pla^midové DNA pro lehký řetězec humanizované DR5 připravené technikou alkalické činidlo-SDS a odstředěním s gradientem chloridu česného a potom se provede vysrážení ethanolem a suspendování v 5 ul/disk dH2O.
Po smísení 15 ul/disk FUGENE6 Transfection činidla se 180 ul/disk D-MEM bez FCS se tento FUGENE roztok (185 ul/disk) smísí s 5 ul/disk DNA roztoku obsahujícího 10 ug/disk expresní imidové DNA pro humanizované DR5 těžké řetězce a 10 ug/disk expresní pla^midové DNA pro humanizované DR5 lehké řetězce. Po 15 minutové inkubaci při teplotě místnosti se získaná pla^midová suspenze (200 ul) přidá na předem připravené COS-7 plotny. Po inkubaci v 5% C02 při 37 °C po dobu 24 hodin se kultivační medium nahradí D-MEM bez FCS. Po inkubaci v 5% CO2 při 37 °C po dobu 72 hodin se odebere supernatant kultury pro přečištění produktů exprese v supernatantu. Způsobem popsaným výše COS-7 buňky z
transfektují každou z následujících kombinací pla^midů:
(A) : kotransfekce pHA15-l a pSR/LMl-2 (H1L1) (B) : kotransfekce pHB14-l a pSR/M2-l (H2L2) (C) : kotransfekce pHB14-l a pSR/LM3-3-44-10 (H2L3) (D) : kotransfekce pHB14-l a pSR/LM4-5-3-3 (H2L4) (E) : kotransfekce pHC10-3 a pSR/M2-l (H3L2) (F) : kotransfekce pHC10-3 a pSR/LM3-3-44-10 (H3L3) (G) : kotransfekce pHC10-3 a pSR/LM4-5-3-3 (H3L4) (H) : kotransfekce pHD21-l a pSR/LM5-3-27-l (H4LS) «
β i » •
S c « ·
-162 - (I): kotransfekce pMll-1 a pSR/LM6-l-4-6 (Chiméra)
Kultura se potom se odstředí (3500 r.p.m., 15 minut) a odebere se supernatant. Supernatant se přefiltruje přes 0,45 um filtr (ADVANTEC TOYO DISMIC-25cs, kat # 25C5O45 AS). Přečištění IgG z filtrátu se provede za použití Protein G-POROS afinitní chromatografie (Applied Biosystems) za následujících podmínek:
HPLC systém: BioCAD 700E (Applied Biosystems) kolona: ProteinG-ID sensorová náplň (velikost kolony: 2,1 mm ID x 30 mm LD, objem lože: 0,1 ml; Applied Biosystems) eluční pufr: 0,1 M Glycin-HCl (pH 2,5) neutralizační pufr: 1 M Tris-HCl (pH 8,5) detekce: 280 nm průtok: 1 ml/min velikost frakce: 0,5 ml/0,5 mm zkumavka pro frakce: 1,5 ml polypropylenová mikrozkumavka teplota: 4 °C
Po aplikaci veškerého filtrátu do kolony se 50 ml PBS (Sigma, kat # 1000-3) použije pro promytí kolony. Když se aplikuje eluční pufr, tak se začnou odebírat frakce. Každá mikrozkumavka pro frakce na začátku obsahuje 55 ul 1 M NaCl, 110 ul neutralizačního pufru a 74 ul 2 mg/ml hovězího sérového albuminu (Sigma, kat # A-703O) v PBS. Odeberou se frakce č. 7 až č. 8.
Potvrzení exprese humanizovaných protilátek a kvantitativní test na produkty exprese v supematantu kultury se provede pomocí ELISA za použití protilátky proti lidskému IgG.
Do každé jamky 96^jamkové plotny (MaxiSorp, Nunc) se přidá 100 ul kozí protilátky specifické pro Fc lidského IgG (Kappel) «
•· *» •· «
- 163 rozpuštěné v konečné koncentraci 0,5 ug/ml v adsorpčním pufru (0,05 M hydrogenuhličitan sodný, 0,02% azid sodný, pH 9,6) a provede se inkubace při 37 °C po dobu 2 hodin pro dosažení p adsorpce protilátky. Potom se plotna promyje 5|krát 350 ul PBS-T. Do jamky se po promytí přidá supematant kultury ředěný D-MEM obsahujícím 10% FCS a provede se inkubace při 37 °C po dobu 2 hodin. Po dalším promytí PBS-T se do každé jamky přidá 100 ul alkalickou fosfatasou značené kozí polyklonální protilátky specifické pro lidský IgG Fc (Jackson Imuno Research Lab.) naředěné íooooj-krát PBS-T a provede se inkubace při 37 °C po dobu 2 hodin. Po dalším promytí PBS-T se přidá roztok substrátu (p-nitrofenylfosfát z Alkaline Phosphatase Substráte kit (Bio Rad)) podle návodu výrobce kitu. Po inkubaci při 37 °C po dobu 0,5 až 1 hodiny se měří absorbance při 405 nm. V těchto pokusech se lidský pla^matický imunoglobulin G podtřídy 1 (IgGl) (Biopure AG) naředěný D-MEM obsahujícím 10% FCS na určité koncentrace použije jako referenční vzorek pro určitou koncentraci humanizovaných DR5 protilátek obsažených v supernatantech kultury.
Takto se exprimované a přečištěné produkty v supernatantech kultury specificky detekují pomocí protilátky proti lidskému Ig. Konečná koncentrace lidské IgG protilátky je 44,03 ug/ml (H1L1), 39,8 ug/ml (H2L2), 26,7 ug/ml (H2L3), 41,0 ug/ml (H2L4), 39,3 ug/ml (H3L2), 24,7 pg/ml (H3L3), 21,5 pg/ml (H3L4), 16,7 pg/ml (H4L5) a 18,3 pg/ml (chiméra), v příslušném pořadí.
(6) Proapoptotická aktivita několika humanizovaných protilátek nebo chimérické protilátky
Jurkat buňky (ATCC č. TIB-152) se použijí pro určení proapoptotické aktivity přečištěné humanizované TRA-8 protilátky.
Jurkat buňky kultivované v RPMI164O mediu s 10% FCS (Gibco BRL) ·
• *
9 9
- 164při 37 °C po dobu 3 dnů za přítomnosti 5% C0o se rozdělí do každé zS jamky 96j jamková mikroplotny (Sumitorno Bakelite) při 50 ul na jamku. Humanizované TRA-8 připravené v příkladu 26 se upraví tak, aby měly koncentrace konečného produktu 100 ng/ml pomocí RPMI 1640 media obsahujícího 10% FCS, za hodnocení jejich koncentrací v kapalině podle způsobu popsaného v příkladu 26. Každý z takto získaných roztoků produktů exprese se upraví na koncentraci 100 ng/ml a použije se pro přípravu sériového ředění za použití opakovaného 2-násobného ředění RPMI1640 obsahujícím 10% FCS. Každý roztok ředěné humanizované TRA-8 (H1L1, H2L2, H2L3, H2L4, H3L3, H3L4 nebo H4L5) se přidá do každé jamky při 50 ul na jamku. Po reakci při 37 °C po dobu 12 hodin se přidá 50 ul 25 uM PMS obsahujícího 1 mg/ml XII á (konečná koncentrace 250 ug/ml pro XII a 5 pM pro PMS). Po inkubaci po dobu 3 hodin se měří absorbance každé jamky při 450 nm pro vypočtení životaschopnosti buněk za použití redukční schopnosti mitochondrií jako indexu.
Životaschopnost buněk v každé jamce se vypočte podle následujícího vzorce:
životaschopnost (%) = 100 x (a-b) / (c-b) kde a je měření pro testované jamky, b” je měření pro jamky bez buněk ac je měření pro jamky bez přidané protilátky.
Výsledkem pokusu bylo, že testované humanizované protilátky jsou schopné indukovat apoptosu buněk T lymfomové buněčné linie exprimujících lidský DRS antigen.
Dále se testovala proapoptotická aktivita humanizované TRA-8 pro PC-3 s přidáním taxolu podle způsobu popsaného v příkladu 25.
Lidská buněčná linie karcinomu prostaty PC-3 (ATCC č.
- 165
CRL-1435) se získá od Američan Tissue Culture Collection (ATCC) a kultivuje se v F-12K Nutrient Mixture (21127-022, Gibco BRL) obsahující 10% fetální hovězí sérum (FBS, Hyklon), 1% L-Glutaminu-200 mM (25030-149, Gibco BRL) a 0,5% roztok penicilinu-streptomycinu (P-7539, Sigma). RPMI1640 medium (MED-008, IWAKJ) doplněné 10% FBS a 0,5% roztokem penicilin-streptomycin se použije v následujícím pokusu. Exponenciálně rostoucí PC-3 buňky se odeberou trypsinizací a promyjí se dvakrát čerstvým mediem. Buňky se potom spočítají, resuspendují se v čerstvém mediu v hustotě 5 x 104 buněk/ml a rozdělí se trojmo do 96^jamkových ploten s plochým dnem (3598, Corning-Coster) v celkovém objemu 100 ul/jamku jeden den před zahájením pokusu. Reprezentativní protinádorové léčivo, Paclitaxel (169-18611, Wako), rozpuštěný v dimethylsulfoxidu (10 mg/ml), se naředí v čerstvém mediu a potom se přidá do 96-jamkových ploten obsahujících buňky při koncentraci 50 ul/jamku. Konečná koncentrace dimethylsulfoxidu je menší než 0,1%. Po inkubaci po dobu 24 hodin při 37 °C v atmosféře 5% C02 se humanizované TRA-8 protilátky (H1L1, H2L2, H2L3, H2L4, H3L2, H3L3, H3L4 nebo H4L5) ředěné v čerstvém mediu přidají do jamek. Po inkubaci po dobu dalších 24 hodin se do jamek přidá 50 ul Minimálního esenciálního media (11095-098, Gibco BRIL) obsahujícího 1 mg/ml XTT a 25 mM PMS a plotny se inkubují po dobu 6 hodin. OD450 se potom měří za použití ARVO HIS 1420 Multilabel Counter (Wallac Berthold) a životaschopnost buněk se vypočte následujícím způsobem.
Životaschopnost buněk (%) = (OD450 pro jamky obsahující buňky léčené Taxolem a humanizovanou TRA-8 (činidla) - OD45O pro jamky neobsahující ani buňky, ani činidla) x 100 / (OD450 pro jamky obsahující buňky bez činidla - 0D450 pro jamky neobsahující ani buňky, ani činidla)
Výsledkem pokusu je, že testované humanizované protilátky jsou » 4 « » »31» <
•‘ » ·I »t • * schopny indukovat apoptosu u lidských buněk karcinomu prostaty exprimujících lidský DR5 antigen.
Jakékoliv patenty nebo publikace uvedené v předkládaném vynálezu popisují stav oboru, kterého se vynález týká. Tyto patenty a publikace jsou uvedeny v celém rozsahu jako odkazy.
Předkládaný vynález není omezen v rozsahu výše uvedenými uloženými mikroorganismy nebo provedeními popsanými v příkladech, které jsou určeny pro ilustraci několika aspektů vynálezu a jakákoliv provedení, která jsou funkčně ekvivalentní, spadají do rozsahu předkládaného vynálezu. Různé modifikace vynálezu zřejmé odborníkům v oboru spadají do rozsahu předkládaného vynálezu.
Odkazy
1. Wiley SR, Schooley K, Smolak PJ, Din WS, Huang CP, Nicholl JK, Sutherland OR, Smith ID, Rauch C, Smith CA, a kol. Imunity 1995 Dec;3(6):673-52
2. Pan G, 0'Rourke K, Chinnaiyan AM, Gentz R, Ebner R, Ni J, Dixit VM Science 1997 Apr 4,-276(5309) :111-3
3. Walczak H, Degli-Esposti MA, Johnson RS, Smolak PJ, Waugh JY, Boiani N, Timour MS, Gerhart MJ, Schooley KA, Smith CA, Goodwin RG, Rauch Cl. ΕΜΒΟ J 1997 Sep 1;16(17):5386-97
4. MacFarlane M, Ahmad M, Srinivasuia SM, Fernandes-Alnemri I, Cohen GM, Alnemri ES. J Biol Chem 1997 Oct 10,-272(41):25417-20,
5. Degli-Esposti MA, Dougall WC, Smolak Pt Waugh JY, Smith CA, Goodwin RG. Imunity 1997 Dec;7(6):813-20
6. Chaudhary PM, Eby M, Jasmín A, Bookwalter A, Murray J, Hood L. Immunity 1997 Dec;7(6) -.821-30
7.Schneider P, Thome M, Bums K, Bodmer JL, Hoflnann K, Kataoka I, Holler N, Ischopp 3. Immunity 1997 Dec;7(6):831-6
8.Degli-Esposti MA, Smolak PJ, Walczak H, Waugh 3, Huang CP, « « i ♦ « *
-167
DuBose RF, Goodwin RG, Smith CA. J Exp Med 1997 Oct 6;186(7):1 165-70
9.Sheridan JP, Marsters SA, Pit RM, Gurney A, Skubatch M, Baldwin D, Ramakrishnan L, Gray CL, Baker K, Wood WI, Goddard AD, Godowski P, Ashkenazi A. Science 1997 Aug 8;277(5327):81 8-21
10. Pan G, Ni 3, Wei YE, Yu 0, Gentz R, Dixit VM. Science 1997 Aug 8,-277(5327):815-818
11. Marsters SA, Sheridan JP, Pitti RM, Huang A, Skubatch M, Baldwin D, Yuan 3, Gurney A, Goddard AD, Godowski P, Ashkenazi A. Curr Biol 1997 Dec 1,-7(12):1003-6
12. Emery JG, McDonnell P, Burke MB, Deen KC, Lyn S, Silverman C, Dul E, Appelbaum ER, Eichman C, DiPrinzio R, Dodds RA, James IE, Rosenberg M, Lee JC, Young PR. J Biol Chem 1998 Jun 5,-273(23): 14363-7
13. Walczak H, Miller RE, Ariail K, Gliniak B, Griffith IS, Kubin M, Chin W, Jones J, Woodward A, Le I, Smith C, Smolak P, Goodwin RG, Rauch Cl, Schuh JC, Lynch DH. Nat Med 1999 Feb;5(2): 157-63
14. Gazitt Y . Leukemia 1999 Nov;13(ll): 1817-24
15. Rieger 3, Naumann U, Glaser I, Ashkenazi A, Weller M. FEBS Lett. 1998 May 1,-427(1):124-8
16. Jeremiáš I, Hen I, Boehler I, Debatin KM. Eur J Immunol 1998 Jan;28(1): 143-52
17. Martinez-Lorenzo MJ, Alava MA, Gamen S, Kim KJ, Chuntharapai
A, Pineiro A, Naval J, Anei A. Eur J Immunol 1998
Sep;:28(9):2714-25 lS.Phillips IA, Ni S, Pan U, Ruben SM, Wei YE, Páce IL, Hunt JS.
J Immunol 1999 May 15,-162(10):6053-9
19. Kayagaki N, Yamaguchi N, Nakayama M, Iakeda K, Akiba H, Isutsui H, Okamura H, Nakanishi K, Okumura K, Yagita H. J Immunol 1999 Aug 15,-163(4):1906-13
20. Johnsen AC, Haux J, Steinkjer B, Nonstad U, Egeberg K, Sundán A, Ashkenazi A, Espevik I. Cytokine 1999 Sep; 11(9):664-72
21. Zamai L, Ahmad M, Bennett IM, Azzoni L, Alnemri ES, Perussia B.
• 9 »
• Μ*
- 168 J Exp Med 1998 Dec 21; 188(12):2375-80
22. Fanger NA, Maliszewski CR, Schooley K, Griffith IS. J Exp Med 1999 Oct 18,-190(8) :1155-64
23. Griffith IS, Wiley SR, Kubín MZ, Sedger LM, Maliszewski CR, Fanger NA. J Exp Med 1999 Apr 19;189(8):1343-54
24. Griffith IS, Rauch Cl, Smolak PS, Waugh JY, Boiani N, Lynch DH, Smith CA, Goodwin RG, Kubin MZ. J. Immunology 1999 162: 2597-2605
25. Albani S a Carson DA, 1997 Arthritis and allied conditions, a textbook of rheumatology, 13. edition, volume 2, 979-992.
26. Fujisawa K, Asahara H, Okamoto K, Aono H, Hasunuma I, Kobata I, Iwakura Y, Yonehara 5, Sumida I, a Nishioka K. J. Clin. Invest. 1996 98(2): 271-278
27. Zhang H, Yang Y, Horton IL, Samoilova EB, Judge IA, Iurka LA, Wilson 3M, a Chen Y. 1997 J. Chin. Invest. 100(8), 1951-1957.
28. Roth W, Isenmann 5, Naumann U, Kugler S, Bahr M, Dichgans J, Ashkenazi A, Weller M. Locoregional. Biochem Biophys Res Commun 1999 Nov 19,-265(2):479-83
29. Chinnaiyan AM, Prasad U, Shankar 5, Hamstra DA, Shanaiah M, Chenevert IL, Ross BD, Rehemtulia A. Proč. Nati. Acad. Sci. 2000 Feb 15; 97(4):1754-1759
30. Arai I, Akiyama Y, Okabe 5, Saito K, Iwai I, Yuasa Y. Cancer Lett 1998 Nov 27,-133(2):197-204
31. Lee SH, Shin MS, Kim HS, Lee HK, Park WS, Kim SY, Lee JH, Han SY, Park JY, Oh RR, Jang JJ, Han TI, Lee JY, Yoo NJ. Cancer Res 1999 NOV 15,-59(22):5683-5686
32. Pai SI, Wu GS, Ozoren N, Wu L, Jen 3, Sidransky D, El-Deiry WS. 1998 Cancer Res Aug 15,-58(16):3513-3518
33. Maniatis a kol., 1982, Molecular Cloning, a Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY
34.Schroffa kol., 1985 Cancer Res., 45, 879-885.
35. Yelton, D. E., a kol., 1978 Current Topics in Microbiology and Immunology, 81, 1-7
36. Kohler, U., a kol., 1976 European J. Immunology, 6, 511-519 » *
- 169 37.Shuhnan, M., a kol., 1978 Nátuře, 276, 269-270
38. Keamey, J. F., a kol., 1979 J. Immunology, 123, 1548-1550
39. Horibata, K. a Harris, A. W., 1975 Nátuře, 256, 495-497 4O.Sheridan JP, Marsters SA, Pitti RM, Gurney A, Škubatch M, Baldwin D, Ramakrishinan, Gray CL, Baker K, Wood WI, Goddard AD, Godowski P. a Ashkenazi A, 1997 Science, 277, 818-821.
41. Cheng J a kol., 1994 Science, 263, 1759-1762
42. Bendele AM a kol., 1999 Clin Exp Rheumatol, 17(5), 553-560 43.Sheridan JP, Marsters AS, Pitti RM, Gurney A, Skubatch M, Baldwin D, Ramakrishnan L, Gray CJ, Baker K, Wood WI, Goddard AD, Godowski P. a Ashkenazi A. 1997 Science, 277, 818-821.
44.Schneider P, Thome M, Burns K, Bodmer JL, Hofmann K, Kataoka I, Holler N, Tschopp J., 1997 Immunity Dec;7(6): 831-836.
45. Kennedy NJ, Kataoka I, Tschopp J, a Budd RC. 1999 J. Exp. Med. 1891-1896.
46. Miller-Ladner U, Gay RE, a Gay S, 1997 Arthritis and allied conditions, a textbook of rheumatology, 13th edition, Volume 1,243-254.
170
Seznam sekvencí <120> Protilátka selektivní pro receptor faktoru nekrosy nádorů indukující apoptosu a její použití <130> UAB-17552/22 <160> 102 <170> Patenln verze 3.0 <210> 1 <211> 25 <212> DNA <213> syntetický konstrukt <400> 1 gacgatgccc gatctacttt aaggg <210> 2 <211> 22 <212> DNA <213> syntetický konstrukt <400>2 ccactgggtg atgttggatg gg <210>3 <211>24 <212> DNA <213> syntetický konstrukt <400>3 ggatccgtgg acacattcga tgtc
<210> <211> <212> <213> 4 20 PRT Mus musculus
<400> 4
» · *
171 ft i 4 4 9 » 9 » a 9 « ·
Glu Val Met Leu Val Glu Ser Gly
5
Gly
Gly Leu Val Lys
Pro
Gly Gly
Ser Leu Lys Leu
<210> <211> <212> <213> 5 20 PRT Mus musculus
<400> 5
Asp 11 e Val Met Thr Gin Ser :
1 5
Asp Arg Val Ser
20
<210> 6
<211> 20
<212> DNA
<213> syntetický konstrukt
<400> 6
cagcactgaa cacggacccc
20
<210> 7
<211> 20
<212> DNA
<213> syntetický konstrukt
<400> 7
His aaaggtaatt tattgagaag
Lys
Phe Met Ser Thr
Ser
Val Gly
<210> 8
<211> 2 0
<212> DNA
<213> syntetický konstrukt
<400> 8
cctcac catg aacttcgggc
172 <210> 9 <211> 20 <212> DNA <213 > .syntetický konstrukt <400> 9 ctgttgtatg cacatgagac <210> 10 <211> 20 <212> DNA <213> syntetický konstrukt'· <400> 10 gaagtgatgc tggtggagtč <210> 11 <211> 20 <212> DNA <213 > syntetický konstrukt <400> 11 agtgtgaagt gatgctggtg <210> 12 <211> 21 <212> DNA <213> ísyntetický konstrukt <400>12 tttaccagga gagtgggaga g <-210>13 <211> 20 <212> DNA <213> syntetický konstrukt <400>13 tgcagagaca gtgaccagag
173 ' i t · « t t » ♦ *♦ « Ϊ S »· « S < í í « < ·s «
<210> <211> <212> <213> 14 20 DNA syntetický konstrukt
<400>14 tgttcaggac cagcatgggc
<210> <211> <212> <213> 15 2 0 DNA syntetický konstrukt
<400>15 aagacatttt ggattctaac
<210> <211> <212> <213> 16 20 DNA syntetický konstrukt
<40 0>16 tatcatgaag tctttgtatg
<210> <211> <212> <213> 17 20 DNA syntetický konstrukt
<400>17 gatggagaca cattctcagg
<210> <211> <212> <Z 1O 18 20 DNA <. syntetický konstrukt
<400>18 gacattgtga tgacccagtc
174
3» «
<210>19 <211> 20 <212> DNA <213> syntetický konstrukt <400>19 ttaacactca ttcctgttga
<210> 20
<211> 20
<212> DNA
<213> syntetický konstrukt
<400>20 gactgggtca tcacaatgtc <210>
<211>
<212>
<213>
. 1398
DNA
Mus muscul-us <400> atgaacttcg ggctcagctt gattttcctt gtccttgttt taaaaggtgt ccagtgtgaa gtgatgctgg
120 tggagtctgg gggaggctta gtgaagcctg gagggtccct gaaactctcc tgtgcagcct
180 ctggattcac tttcagtagc tatgtaatgt cttgggttcg ccagactccg gagaagaggc
240 tggagtgggt cgcaaccatt agtagtggtg gtagttacac ctactatcca gacagtgtga
300 aggggcgatt caccatctcc agagacaatg ccaagaacac cctgtacctg caaatgagca
360 gtctgaggtc tgaggacacg gccatgtatt actgtgcaag acggggggac tctatgatta
420 cgacggacta ctggggccaa tcacagtctc ctcagccaaa i 1 * i «
175 ? « 9< t «4 t > »♦ > i · i í 2 í *9 i S 9 9 9 *»9* i .» 1 5 9* «< 9 « 4 * » 9Ϊ *
acgacacccc 480 catctgtcta tccactggcc cctggatctg ctgcccaaac taactccatg
gtgaccctgg 540 gatgcctggt caagggctat ttccctgagc cagtgacagt gacctggaac
tctggatccc 600 tgtccagcgg tgtgcacacc ttcccagctg tcctgcagtc tgacctctac
actctgagca 660 gctcagtgac tgtcccctcc agcacctggc ccagcgagac cgtcacctgc
aacgttgccc 720 acccggccag cagcaccaag gtggacaaga aaattgtgcc cagggattgt
ggttgtaagc 780 cttgcatatg tacagtccca gaagtatcat ctgtcttcat cttcccccca
aagcccaagg 840 atgtgctcac cattactctg actcctaagg tcacgtgtgt tgtggtagac
atcagcaagg 900 atgatcccga ggtccagttc agctggtttg tagatgatgt ggaggtgcac
acagctcaga 960 cgcaaccccg ggaggagcag ttcaacagca ctttccgctc agtcagtgaa
cttcccatca 1020 tgcaccagga ctggctcaat ggcaaggagt tcaaatgcag ggtcaacagt
gcagctttcc 1080 ctgcccccat cgagaaaacc atctccaaaa ccaaaggcag accgaaggct
ccacaggtgt 1140 acaccattcc acctcccaag gagcagatgg ccaaggataa agtcagtctg
acctgcatga 1200 taacagactt cttccctgaa gacattactg tggagtggca gtggaatggg
cagccagcgg 1260 agaactacaa gaacactcag cccatcatgg acacagatgg ctcttacttc
gtctacagca 1320 agctcaatgt gcagaagagc aactgggagg caggaaatac tttcacctgc
tctgtgttac 13 80 atgagggcct gcacaaccac catactgaga agagcctctc ccactctcct
t 9 9 t t
176
S i * »
•S
ggtaaaaatc 1398 actagtga
<210> 22 <211> 705 <212> DNA <213> Mus musculus
<400> 22 atgaagtctt 60 tgtatgtgtt agtgtataca cattatctgt ttctgtttgc aggtgttgaa
ggagacattg 120 tgatgaccca gtctcacaaa ttcatgtcca catcagtagg agacagggtc
agcatcacct 180 gcaaggccag tcaggatgtg ggtactgctg tagcctggta tcaacagaaa
ccagggcaat 240 ctcctaaact actgatttac tgggcatcca cccggcacac tggagtccct
gatcgcttca 300 caggcagtgg atctgggaca gatttcactc tcaccattag caatgtgcag
tctgaagact 360 tggcagatta tttctgtcag caatatagca gctatcggac gttcggtgga
ggcaccaagc 420 tggaaatcaa acgggctgat gctgcaccaa ctgtatccat cttcccacca
tccagtgagc 480 agttaacatc tggaggtgcc tcagtcgtgt gcttcttgaa caacttctac
cccaaagaca 540 tcaatgtcaa gtggaagatt gatggcagtg aacgacaaaa tggcgtcctg
aacagttgga 600 ctgatcagga cagcaaagac agcacctaca gcatgagcag caccctcacg
ttgaccaagg 660 acgagtatga acgacataac agctatacct gtgaggccac tcacaagaca
tcaacttcac 705 ccattgtcaa gagcttcaac aggaatgagt gttaa
<210> 23 <211> 464
* » « ♦ í 4 i
« «
li *9 í♦ í « t * *
t ·
177
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 23
Met Asn Phe Gly Leu Ser Leu Ile Phe Leu Val Leu Val Leu Lys Gly
1 5 10 15
Val Gin Cys Glu Val Met Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys
20 25 30
Pro Gly Gly Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe
35 40 45
Ser Ser Tyr Val Met Ser Trp Val Arg Gin Thr Pro Glu Lys Arg Leu
50 55 60
Glu Trp Val Ala Thr Ile Ser Ser Gly Gly Ser Tyr Thr Tyr Tyr Pro
65 7 0 75 80
Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser A.rg Asp Asn Ala Lys Asn
85 90 95
Thr Leu Tyr Leu Gin Met Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Met
100 105 110
Tyr Tyr Cys Ala Arg Arg Gly Asp Ser Met Ile- Thr Thr Asp Tyr Trp
115 120 125
Gly Gin Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser Ala Lys Thr Thr Pro Pro
130 135 140
Ser Val Tyr Pro Leu Ala Pro Gly Ser Ala Ala Gin Thr Asn Ser Met
145 150 155 160
Val Thr Leu Gly Cys Leu Val Lys Gly Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr
165 170 175
Val Thr Trp Asn Ser Gly Ser Leu Ser Ser Gly Val His Thr Phe Pro
180 185 190
A.la Val Leu Gin Ser Asp Leu Tyr Thr Leu Ser Ser Ser Val Thr Val
195 200 205
Pro Ser Ser Thr Trp Pro Ser Glu Thr Val Thr Cys Asn Val Ala His
210 215 220
Pro Ala OČI Ser Thr Lys Val Asp T t rn XJJ/ O Lys Ile Val Pro Arg Asp Cys
230
235
240 η n c Z. Z. _J
178
Gly Cys Lys Pro Cys 245 Ile Cys Thr Val Pro 250 Glu Val Ser Ser Val 255 Phe
Ile Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Val Leu Thr Ile Thr Leu Thr Pro
260 265 270
Lys Val Thr Cys Val Val Val Asp Ile Ser Lys Asp Asp Pro Glu Val
275 280 285
Gin Phe Ser Trp Phe Val Asp Asp Val Glu Val His Thr Ala Gin Thr
290 295 300
Gin Pro Arg Glu Glu Gin Phe Asn Ser Thr Phe Arg Ser Val Ser Glu
305 310 315 320
Leu Pro Ile Met His Gin Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Phe Lys Cys
325 330 335
Arg Val Asn Ser Ala Ala Phe Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser
340 345 350
Lys Thr Lys Gly Arg Pro Lys Ala Pro Gin Val Tyr Thr Ile Pro Pro
355 360 365
Pro Lys Glu Gin Met Ala Lys Asp Lys Val Ser Leu Thr Cys Met Ile
370 375 380
Thr Asp Phe Phe Pro Glu Asp Ile Thr Val Glu Trp Gin Trp Asn Gly
385 390 395 400
Gin Pro Ala Glu Asn Tyr Lys Asn Thr Gin Pro Ile Met Asp Thr Asp
405 410 415
Gly Ser Tyr Phe Val Tyr Ser Lys Leu Asn Val Gin Lys Ser Asn Trp
420 425 430
Glu Ala Gly Asn Thr Phe Thr Cys Ser Val Leu His Glu Gly Leu His
435 440 445
Asn His His Thr Glu Lys Ser Leu Ser His Ser Pro Gly Lys Asn His
450 455 460
<210> 24
<211> 234
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 24
» 9 á ! J · t t
179 * 99 • · 9· • a 9 9»
9 9*999* » ·9 >99 ·9
9*99
9 99
92
9 » 9« «
Met 1 Lys Ser Leu Tyr Val 5 Leu Val Tyr Thr His Tyr Leu Phe Leu Phe
10 15
Ala Gly Val Glu Gly Asp Ile Val Met Thr Gin Ser His Lys Phe Met
20 25 30
Ser Thr Ser Val Gly Asp Arg Val Ser Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gin
35 40 45
Asp Val Gly Thr Ala Val Ala Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Gin Ser
50 55 60
Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg His Thr Gly Val Pro
65 70 75 80
Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile
85 90 95
Ser Asn Val Gin Ser Glu Asp Leu Ala Asp Tyr Phe Cys Gin Gin Tyr
100 105 110
Ser Ser Tyr Arg Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg
115 120 125
Ala Asp Ala Ala Pro Thr Val Ser Ile Phe Pro. Pro Ser Ser Glu Gin
130 135 140
Leu Thr Ser Gly Gly Ala Ser Val Val Cys Phe Leu Asn Asn Phe Tyr
145 150 155 160
Pro Lys Asp Ile Asn Val Lys Trp Lys Ile Asp Gly Ser Glu Arg Gin
165 170 175
Asn Gly Val Leu Asn Ser Trp Thr Asp Gin Asp Ser Lys Asp Ser Thr
180 185 190
Tyr Ser Met Ser Ser Thr Leu Thr Leu Thr Lys Asp Glu Tyr Glu Arg
195 200 205
His Asn Ser Tyr Thr Cys Glu Ala Thr Eis Lys Thr Ser Thr Ser Pro
210 215 220
Ile Val Lys Ser Phe Asn Arg Asn Glu Cys
225 230
<210>
<211>
< 2 ± 2 >
PRT ’ 1 * ! Μ I
180 <213> Mus musculus <400>25
Ser Tyr Val Met Ser <210> 26 <211>17 <212> PRT <213 > Mus musculus <400>26
Thr Ile Ser Ser Gly Gly Ser Tyr Thr Tyr Tyr Pro Asp Ser Val Lys
1 Gly 5 10 15
<210> 27
<211> 10
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 27
Arg Gly Asp Ser Met Ile Thr Thr Asp Tyr
1 5 10
<210> 28
<211> 11
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 28
Lys Al a Ser Gin Asp Val Gly Thr Ala Val Ala
1 5 10
<210> 29
<211> 7
<212> PRT
<213> Mus musculus
<4 00> η n z.
Trp Ala Ser Thr Arg His Thr
1 r“ □
181 <210>
<211>
<212>
<213>
PRT
Mus musculus <400>
Gin Gin Tyr Ser Ser Tyr Arg 1
Thr <210>
<211>
<212>
<213>
119
PRT syntetický konstrukt <400>
Glu 1 Val Met Leu Val Glu Ser 5 Gly Gly Gly 10 Leu Val Gin Pro Gly 15 Gly
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Val Met Ser Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Thr Ile Ser Ser Gly Gly Ser' Tyr Thr Tyr Tyr Pro Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu .Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Arg Gly Asp Ser Met Ile Thr Thr Asp Tyr Trp Gly Gin Gly
100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 <210>
<211>
<212>
<213 >
DNA syntetický konstrukt tatcatcctc ttcttggtag
182 t t caacagctac aggtgtccac <210> 33 <211> 80 <212> DNA <213>
syntetický konstrukt <400> 33 tctgaagtaa tgctggtgga gtctggggga ggcttagtac agcctggagg gtccctgaga ctctcctgtg cagcctctgg <210> 34 <211> 80 <212> DNA <213> syntetický konstrukt <400> 34 attcactttc agtagttatg taatgtcttg ggttcggcag gcaccaggga agggtctgga gtgggttgca accattagta <210> 35 <211> 80 <212> DNA <213> syntetický konstrukt <400> 35 gtggtggtag ttacacctac tatccagaca gtgtgaaggg ccgattcacc atctccagag acaatgccaa gaacaccctg <210>
<211>
<212>
<213>
DNA syntetický konstrukt » · » «
183l • í 9 « · 9 · * í i » i 1 ·
9 » «9 9
<400> 40 tccagaccct tccctggtgc ctgccgaacc caagacatta cataactact gaaagtgaat ccágaggctg cacaggagag <210> 41 <211> 80 <212> DNA <213> syntetický konstrukt <400> 41 ctctggagat ggtgaatcgg cccttcacac tgtctggata gtaggtgtaa ctaccaccac tactaatggt tgcaacccac
<210> <211> <212> <213> 42 80 DNA syntetický konstrukt
<400> 42
ccttcttgca cagtaataaa cagccgtgtc ctctgctctc agactgttca tttgcagata cagggtgttc ttggcattgt <210>43 <211>84 <212> DNA <213> syntetický konstrukt <400>43 gaccgatggg cccttggtgg aggctgagga gactgtgacc agggtccctt ggccccagta gtccgtcgta atcatagagt cacc <210>
4« » * « 43 4 4 • · 4 * »· • »44 · 4 44 4 • «444··**
4 4 · » »» · 4 4»«··
184_ .
<400>36 tatctgcaaa tgaacagtct gagagcagag gacacggctg tttattactg tgcaagaagg ggtgactcta tgattacgac <210>37 <211>64 <212> DNA <213> syntetický konstrukt <400>37 ggactactgg ggccaaggga ccctggtcac agtctcctca gcctccacca agggcccatc ggtc <210> 38 <211> 60 <212> DNA <213> syntetický konstrukt <400> 38 , ctaccaagaa gaggatgata cagctccatc ccatggtgag gtcaagccaa gcttatccaa <210>
<211>
<212>
<213>
<400>
DNA syntetický konstrukt tctcagggac cctccaggct gtactaagcc tcccccagac tccaccagca ttacttcaga gtggacacct gtagctgttg <210> 40 <211> 80 <212> DNA <213> ' syntetický konstrukt «
185 ·
» *
* * » 9 * i •
* • i <211> 20 <212> DNA <213> syntetický konstrukt <400>44 ttggataagc ttggcttgac <210>45 <211> 21 <212> DNA <213> syntetický konstrukt <400>45 gaccgatggg cccttggtgg a <210>46 <211>213 <212> PRT <213> syntetický konstrukt <400>46
Asp 1 Ile Val Met Thr Gin Ser Pro Ser· Ser Leu Ser Ala Ser Val 15 Gly
5 10
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gin Asp Val Gly Thr Ala
2 0 25 30
Val Ala Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Trp Ala Ser Thr Arg His Thr.Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gin Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gin Gin Tyr Ser Ser Tyr Arg Thr
85 90 O c
Phe Gly Gin Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro
100 105 110
Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Sei? rxop Glu Gin Leu Lys Ser Gly Thr
115 120 125 » · * ·
186 ♦ « <
«
Ala Ser Val Val 130 Cys Leu Leu Asn Asn Phe 135 Tyr Pro 140 Arg Glu Ala Lys
Val Gin Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gin Ser Gly Asn Ser Gin Glu
145 150 155 160
Ser Val Thr Glu Gin Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser
165 170 175
Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala
180 185 190
Cys Glu Val Thr His Gin Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe
195 200 ' 205
Asn Arg Gly Glu Cys
210
<210> 47
<211> 34
<212> DNA
<213> syntetický konstrukt
<400> 47
cccaagctta agaagcatcc tctcatctag ttct
<210> 48
<211> 45
<212> DNA
<213> syntetický konstrukt
<400> 48
cccgaattct tactaacact ctcccctgtt gaagctctt.t gtgac
45
<210> 49 <211> 60 <212> DNA <213> syntetický konstrukt <400> 49 gtcccccaca gatgcagaca aagaacttgg agattgggtc atcacaatgt caccagtgga ♦ β ♦
<210> 50
<211> 48
<212> DNA
<213> syntetický konstrukt
<400> 50
r ccaagttctt tgtctgcatc agtaggagac agggtcaccá tcacctgc 48 <210>51 <211>57 <212> DNA <213> syntetický konstrukt <400>51 agtgtgccsg gtggatgccc agtaaatcag tagtttagga gctttccctg gtttctg <210>52 <211>48 <212> DNA <213> syntetický konstrukt <400>52 tgggcatcca cccggcacac tggggtccca agcaggttta gtggcagt
'.
<210>53 <211>63 <212> DNA <213> syntetický konstrukt <400>53 ataactacta tattgctgac agtaataggt tgcaaaatcc tccggctgca gactagagat ggt
<210> 54
<211> 63
<212> DNA
<213> syntetický konstrukt
<400> 54 i r caaggcacca aggtggaaat caaacggact
188 ♦ »· i 94 · í · I ·
Ϊ 9f • · » * · ·» · · • 9 • · » · ♦
« · » * · cagcaatata gcagctatcg gacgttcggt gtg <210>
<211>
<212>
<213>
711
DNA syntetický konstrukt <400>
atggagacag 60 acacaatcct gctatgggtg ctgctgctct gggttccagg ctccactggt
gacattgtga 120 tgacccaatc tccaagttct ttgtctgcat ctgtggggga cagggtcacc
atcacctgca 180 aggccagtca ggatgtgggt actgctgtag cctggtatca acagaaacca
gggaaagctc 240 ctaaactact gatttactgg gcatccaccc ggcacactgg ggtcccaagc
aggtttagtg 300 gcagtgggtc tgggacagac ttcaccctca ccatctctag tctgcagccg
gaggattttg 360 caacctatta ctgtcagcaa tatagtagtt atcggacgtt cggtcaaggc
accaaggtgg 420 aaatcaaacg gactgtggct gcaccatctg tcttcatctt cccgccatct
gatgagcagt 480 tgaaatctgg aactgcctct gttgtgtgcc tgctgaataa cttctatccc
agagaggcca 540 aagtacagtg gaaggtggat aacgccctcc aatcgggtaa ctcccaggag
agtgtcacag 600 agcaggacag c.aaggacagc acctacagcc tcagcagcac cctgacgctg
agcaaagcag 660 actacgagaa acacaaagtc tacgcctgcg aagtcaccca tcagggcctg
agctcgcccg tcacaaagag cttcaacagg ggagagtgtt agtaagaatt c
711 » · ·
189 • ·9 • ·» • 4 »· • · » 9 ··
99* •· *
<210> 56
<211> 119
<212> PRT
<213> syntetický konstrukt
<400> 56
Glu 1 Val Gin Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gin Pro Gly Gly
5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Val Met Ser Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Thr Ile Ser Ser Gly Gly Ser Týr Thr Tyr Tyr Pro Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Arg Gly Asp Ser Met Ile Thr Thr 'Asp Tyr Trp Gly Gin Gly
100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 <210> 57 <211> 80 <212> DNA <213 > syntetický konstrukt <400> 57 tctgaagtac agctggtgga gtctggggga ggcttagtac agcctggagg gtccctgaga ctctcctgtg cagcctctgg
<210> <211> <212 > <213 > 58 80 DNA syntetický konstrukt
<400> 58 tctcagggac cctccaggct gtactaagcc tcccccagac. tccaccagct gtacttcaga 60· gtggacacct gtagctgttg <210>59 <211>119 <212> PRT <213> syntetický konstrukt <400> 59
Glu 1 Val Met Leu Val 5 Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gin Pro Gly Gly
10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Val Met Ser Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Thr Ile Ser Ser Gly Gly Ser Tyr Thr Tyr Tyr Pro Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gin Met Ser Ser Leu Arg Ala Glu Ašp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Arg Gly Asp Ser Met Ile Thr Thr Asp Tyr Trp Gly Gin Gly
100 105 110
Thr Leu Val Thx’ Val Ser Ser
115 <210> 60 <211>119 <212> PRT <213> syntetický konstrukt <400>60
Glu Val Met Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gin Pro
1510
Gly Gly « « * <
191 «
Ser Leu Arg Leu Ser Cys 20 Ala Ala- .Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
25 30
Val Met Ser Trp Val Arg Gin Thr Pro Glu Lys Arg Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Thr Ile Ser Ser Gly Gly Ser Tyr Thr- Tyr Tyr Pro Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gin Met Ser Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Arg Gly Asp Sér Met Ile Thr Thr Asp Tyr Trp Gly Gin Gly
100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 <210> 61 <211> 119 <212> PRT <213> syntetický konstrukt <400> 61
Glu Val Met Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly 15 Gly
1 5 10
Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Val Met Ser Trp Val Arg Gin Thr Pro Glu Lys Arg Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Thr Ile Ser Ser Gly Gly Ser Tyr Thr Tyr Tyr Pro Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gin Met Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Arg Gly Asp Ser Met Ile Thr Thr Asp Tyr Trp Gly Gin Gly
100 105 110
192
Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser
115
<210> 62
<211> 80
<212> DNA
<213> syntetický konstrukt
<400> 62
tatctgcaaa tgagcagtct gagagcagag gacacggctg tttattactg tgcaagaagg ggtgactcta tgattacgac
<210> <211> <212> <213> 63 80 DNA syntetický konstrukt '
<400> 63 ccttcttgca cagtaataaa cagccgtgtc ctctgctctc agactgttca tttgcagata cagggtgttc ttggcattgt
<210> <211> <212> <213> 64 80 DNA syntetický konstrukt
<400> 64 attcactttc agtagttatg taatgtcttg ggttcggcag actccagaga agaggctgga gtgggttgca accattagta
<210> 65
<211> 80
<212> DNA
<213> syntetický konstrukt
<400> 65
193 tccagcctct tctctggagt ctgccgaacc caagacatta cataactact gaaagtgaat ccagaggctg cacaggagag <210> 66 <211> 80 <212> DNA <213> syntetický konstrukt <400> 66 tctgaagtaa tgctggtgga gtctggggga ggcttagtaa agcctggagg gtccctgaaa ctctcctgtg cagcctctgg <210> 67 <211> 80 .
<212> DNA <213> syntetický konstrukt <400> 67 tatctgcaaa tgagcagtct gagatctgag gacacggcta tgtattactg tgcaagaagg ggtgactcta tgattacgac <210> 68 <211>64 <212> DNA <213> syntetický konstrukt <400>68 ggactactgg ggccaaggga ccactctcac agtctcctca gcctccacca agggcccatc ggtc <210>69 <211> S0 <212> DNA
194 .«* * · · · * : * i < ** t 4 « i 3 3 » w3 «<<«»·* » * · ® * * < f 81 t » < » ♦ ·i <213> syntetický konstrukt <400>69 tttcagggac cctccaggct ttactaagcc tcccccagac tccaccagca ttacttcaga gtggacacct gtagctgttg <210> 70 <211> 80 <212> DNA <213> syntetický konstrukt <400> 70 ccttcttgca cagtaataca tagccgtgtc ctcagatctc agactgctca tttgcagata cagggtgttc t.tggcattgt <210>71 <211>70 <212> DNA <213> syntetický konstrukt <400>71 gaccgatggg cccttggtgg aggctgagga gactgtgaga gtggtccctt ggccccagta gtccgtcgta
<210> <211> <212> <213> 72 212 PRT syntetický konstrukt
<400> 72
Asp Ile Gin Met Thr Gin Ser Pro Ser
5
Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
15
Asp Arg Val Thr
Ile Thr Cys Lys Ala
Ser Gin Asp Val Gly Thr Ala * * ! H i
195 «
f t i
* t
Val Ala Trp Tyr 35 Gin Gin Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
40 45
Tyr Trp Ala Ser Thr Arg His Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gin Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr’ Tyr Cys Gin Gin Tyr Ser Ser Tyr Arg Thr
85 90 95
Phe Gly Gin Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro
100 105 110
Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gin Leu Lys Ser Gly Thr
115 120 125
Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys
130 135 140
Val Gin Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gin Ser Gly Asn Ser Gin Glu
145 150 155 160
Ser Val Thr Glu Gin Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser
165 170 175
Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala
180 185 190
Cys Glu Val Thr His Gin Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe
195 200 205
Asn Arg Gly Glu
210 <210>73 <211>213 <212> PRT <213> syntetický konstrukt <400>73
Asp 1 Ile Val Met Thr Gin Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gin Asp Val Gly Thr Ala
20 25 30
i c ·
196 * « * • i * i 4 4· « » <f * » ♦« « »· * * *
Val Ala Trp Tyr 3 5 Gin Gin Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
40 45
Tyr Trp Ala Ser Thr Arg His Thr Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gin Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gin Gin Tyr Ser Ser Tyr Arg Thr
85 90 95
Phe Gly Gin Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro
100 105 110
Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gin Leu Lys Ser Gly Thr
115 120 125
Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys
130 135 140
Val Gin Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gin Ser Gly Asn Ser Gin Glu
145 150 155 160
Ser Val Thr Glu Gin Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser
165 170 175
Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala
180 185 190
Cys Glu Val Thr His Gin Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe
195 200 205
Asn Arg Gly Glu Cys
210 <210>74 <211>213 <212> PRT <213> syntetický konstrukt <400> 74
Asp 1 Ile Val Met Thr 5 Gin Ser Pro Ser Ser 10 Leu Ser Ala Ser Val 15 Gly
Asp Arg Val Thr 20 Ile Thr Cys Lys Ala 25 Ser Gin Asp Val Gly 30 Thr Ala
» ♦ ·
197 > » » » * * » ® *
· • » · * « » > » » » · · » 9 · » 9 · » » » · 9 »
Val Ala Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Trp Ala Ser Thr Arg His Thr Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly
50 55 60
Ser Gly .Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gin Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Phe Cys Gin Gin Tyr Ser Ser Tyr Arg Thr
85 90 95
Phe Gly Gin Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro
100 105 110
Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gin Leu Lys Ser Gly Thr
115 120 125
Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu A.la Lys
. 13 0 135 140
Val Gin Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gin Ser Gly Asn Ser Gin Glu
145 150 155 160
Ser Val Thr Glu Gin Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser
165 170 175
Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala
180 185 190
Cys Glu Val Thr His Gin Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe
195 200 205
Asn Arg Gly Glu Cys
210
<210> 75
<211> 213
<212> PRT
<213> syntetický konstrukt
<400> 75
Asp Ile . Val Met Thr Gin . Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg [ Val Thr Ile : Thr Cys Lys Ala . Ser Gin . Asp > Val Gly Thr • Ala
25 30 * Η I
198
Val Ala Trp Tyr 35 Gin Gin Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
40 45
Tyr Trp Ala Ser Thr Arg His Thr Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gin Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Asp Tyr Phe Cys Gin Gin Tyr Ser Ser Tyr Arg Thr
85 90 95
Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro
100 105 110
Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gin Leu Lys Šer Gly Thr
115 120 125
Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys
130 135 140
Val Gin Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gin Ser Gly Asn Ser Gin Glu
145 150 155 160
Ser Val Thr Glu Gin Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser
165 170 175
Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala
180, 185 190
Cys Glu Val Thr His Gin Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe
195 200 205
Asn Arg Gly Glu Cys
210
<210> 76
<211> 213
<212> PRT
<213 > syntetický konstrukt
<400> 76
Asp 11 e Val Met Thr Gin Ser His Lys Phe Met Ser Thr Ser Val Gly
1 5 10 15
'Asp Arg Val Ser Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gin Asp Val Gly Thr Ala
25 30 ® 4 9 « * · í í » * I 9 » ** * i -9 * » ·»>»♦ s » j í » » * ♦ » ·· « 9 · 9 · *·
199
Val Ala Trp Tyr 35 Gin Gin Lys Pro Gly Gin Ser Pro Lys Leu Leu Ile
40 45
Tyr Trp Ala Ser Thr Arg His Thr Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Asn Val Gin Ser
65 70 75 80
Glu Asp Leu Ala Asp Tyr Phe Cys Gin Gin Tyr Ser Ser Tyr Arg Thr
85 90 95
Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Ala Val Ala Ala Pro
100 105 110
Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gin Leu Lys Ser Gly Thr
115 120 125
Ala S.er Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys
130 13 5 140
Val Gin Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gin Ser Gly Asn Ser Gin Glu
145 150 155 160
Ser Val Thr Glu Gin Asp Ser Lys Asp Gly Thr Tyr Ser Leu Ser Ser
165 170 175
Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala
180 185 190
Cys Glu Val Thr His Gin Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe
195 200 205
Asn Arg Gly Glu Cys
210 <210>77 <211> 60 <212> DNA <213> syntetický konstrukt <400>77 gtcccccaca gatgcagaca aagaacttgg agattgggtc atctgaatgt caccagtgga
<210> 78
<211> 65
<212> DNA
! < * « < ΜΙ»
Ϊ i < « * ** < < < « < ? 9 ♦ ·i «*««(!« · · < « i. '· « » < « ♦*’ v a « f f * « ·
200
<213> syntetický konstrukt
<400>78 atctagttct cagagatgga gacagacaca atcctgctat gggtgctgct gctctgggtt ccagg
<210> <211> <212> <213> 79 69 DNA syntetický konstrukt
<400> 79 cagcacccat agcaggattg tgtctgtctc catctctgag aactagatga gaggatgctt cttaagctt
<210> <211> <212> <213> 80 67 DNA syntetický konstrukt
<400> 80
ctccactggt gacattgtga tgacccaatc tccaagttct ttgtctgcat ctgtggggga cagggtc
<210> <211> <212> <213> 81 54 DNA syntetický konstrukt
<400> 81 acttggagat tgggtcatca caatgtcacc agtggagcct ggaacccaga gcag
<210> <211> <212> 82 67 DNA
Η. « 9
201 <213> syntetický konstrukt <400> 82 accatcacct gcaaggccag tcaggatgtg ggtactgctg tagcctggta ccaacagaaa ccaggaa <210>83 <211>72 <212> DNA <213> syntetický konstrukt <400>83 tacagcagta cčcacatcct gactggcctt gcaggtgatg gtgaccctgt cccccacaga tgcagacaaa ga <210> 84 <211> 71 <212> DNA <213> syntetický konstrukt <400> , 84 aagcacccaa actcctcatc tattgggcat ccacccggca cactggggtc ccagataggt ttacaggcag t <210>85 <211>72 <212> DNA <213> syntetický konstrukt <400>85 cccagtgtgc cgggtggatg cccaatagat gaggagtttg ggtgcttttc ctggtttctg ttggtaccag gc
202
<210> 86
<211> 63
<212> DNA
<213> syntetický konstrukt
<400> 86
gggtctggga cagacttcac c.ctcaccatc tctagtctgc agccggagga ttttgcaacc tat
<210> 87
<211> 60
<212> DNA
<213> syntetický konstrukt
<400> 87
actagagatg gtgagggtga agtctgtccc agacccactg cctgtaaacc tatctgggac 60
<210> 88 <211>57 <212> DNA <213> syntetický konstrukt <400_>88 tactgtcagc aatatagcag ctatcggacg ttcggtcaag gcaccaaggt ggaaatc <210>89 <211> . 57 <212> DNA <213> syntetický konstrukt <400>89 cgtccgatag ctgctatatt gctgacagta ataggttgca aaatcctccg gctgcac <210>90 <211>51 <212> DNA <213> syntetický konstrukt <400>90 • · « *9 * * » 9 * « * · · · • « 4 « · 4
203 aaacggactg tggctgcacc atctgtcttc atcttcccgc catctgatga g <210>91 <211>63 <212> DNA <213> syntetický konstrukt <400>91 gaagatgaag acagatggtg cagccacagt ccgtttgatt tccaccttgg tgccttgacc gaa
<210> 92
<211>. 57
<212> DNA
<213> syntetický konstrukt
<400>92 ttctgt.cagc aatatagcag ctatcggacg ttcggtcaag gcaccaaggt ggaaatc <210>93 <211>57 <212> DNA <213> syntetický konstrukt <400>93 cgtccgatag ctgctatatt gctgacagaa ataggttgca aaatcctccg gctgcag <210>94 <211>63 <212> DNA <213 > syntetický konstrukt <400>94 gggtctggga cagacttcac cctcaccatc tctagtctgc agccggagga ttttgcagat tat !t ti
204
<210> 95
<211> 57
<212> DNA
<213> syntetický konstrukt
<400> 95
ttctgtcagc aatatagcag ctatcggacg ttcggtggag gcaccaaggt ggaaatc
<210> 96
<211> 57
<212> DNA
<213> syntetický konstrukt'
<4Ó0> 96
cgtccgatag ctgctatatt gctgacagaa ataatctgca aaatcctccg gctgcag
<210> 97
<211> 51
<212> DNA
<213> syntetický konstrukt .
<400> 97
tgatgtggac aťgaatttgt gagactgggt catcacaatg tcaccagtgg a
51
<210> 98
<211> 51
<212> DNA
<213> syntetický konstrukt
<400> 98
tgggttccag gctccactgg tgacattgtg atgacccagt ctcacaaatt c
51
<210> 99
<211> 49
<212> . DNA
<213> syntetický konstrukt
<400> 99
aagacagatg gtgcagccac agcccgtttg atttccagct tggtgcctc • ·
205 • < *♦ < < t««· « «» i ·<
* t « · ·t • · · · « *9· ··,···4 t
<210> 100
<211> 45
<212> DNA
<213> syntetický konstrukt <400>100 aagctggaaa tcaaacgggc tgtggctgca ccatctgtct tcatc
<210> 101
<211> 30
<212> DNA
<213> syntetický konstrukt
<400> 101
agatttcaac tgctcatcag atggcgggaa
0 <210> 102 <211>63 <212> DNA <213> syntetický konstrukt <400> 102 ·' gaagatgaag acagatggtg cagccacagt ccgtttgatt tccaccttgg tgcčtccacc

Claims (13)

  1. Patentové nároky
    1. Čištěná protilátka, která specificky váže TRAIL receptor pro DR5, ve které uvedená protilátka, (a) má aktivitu indukující buněčnou smrt cílových buněk exprimujících DR5 in vitro ve své rozpustné formě při koncentraci 1 pg/ml nebo méně, (b) má tumoricidní aktivitu proti nádorovým buňkám exprimujícím DR5 in vivo, a (c) neváže TRAIL receptory pro DR4, DcRl nebo DcR2.
  2. 2. Čištěná protilátka podle nároku 1, ve které protilátka neindukuje významně buněčnou smrt netransformovaných buněčných fibroblastů.
  3. 3. Čištěná protilátka podle nároku 1, ve které aktivita indukující buněčnou smrt je charakterizována 7Ó|% nebo menší životaschopností cílových buněk při koncentraci protilátky 2,5 pg/ml.
  4. 4. Čištěná protilátka podle nároku 1, kde uvedená protilátka neváže TRAIL receptory pro DR4, DcRl nebo DcR2 po obvyklé analýze westernového přenosu.
  5. 5. Čištěná protilátka podle nároku 1, kde uvedená protilátka je monoklonální.
  6. 6. Čištěná protilátka podle nároku 1, kde DR5 je lidský DR5.
  7. 7. Čištěná protilátka podle nároku 1, kde uvedenou cílovou buňkou je zánětlivá synoviální buňka.
  8. 8. Čištěná protilátka podle nároku 1, kde uvedenou cílovou buňkou je rakovinná buňka.
    •A » • ·
    Q(Y7ZU7
    Čištěná protilátka podle nároku 1, kde uvedenými cílovými buňkami jsou aktivované T lymfocyty a B lymfocyty.
  9. 10. Čištěná protilátka podle nároku 1, kde uvedenou imunitní buňkou je aktivovaný lymfocyt.
  10. 11. Čištěná protilátka podle nároku 10, kde imunitní buňka je aktivovaná NK buňka.
  11. 12. Čištěná protilátka podle nároku 10, kde imunitní buňka je aktivovaná dendritická buňka.
  12. 13. Čištěná protilátka podle nároku 10, kde protilátka má stejný specifický epitop jako protilátka produkovaná myším-myším hybridomem, označovaná jako TRA-8, s ATCC přírůstkovým číslem PTA-1428.
  13. 14. Čištěná protilátka podle nároku 1, kde uvedená protilátka je humanizovaná.
CZ2006-291A 2000-05-02 2001-05-02 Čištěná protilátka, která specificky váže TRAIL receptor pro DR5 CZ306996B6 (cs)

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US20134400P 2000-05-02 2000-05-02

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CZ2006291A3 true CZ2006291A3 (cs) 2017-11-01
CZ306996B6 CZ306996B6 (cs) 2017-11-01

Family

ID=22745456

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CZ2006-291A CZ306996B6 (cs) 2000-05-02 2001-05-02 Čištěná protilátka, která specificky váže TRAIL receptor pro DR5
CZ2002-3917A CZ304614B6 (cs) 2000-05-02 2001-05-02 Čištěná protilátka a polypeptid, prostředek selektivně indukující buněčnou smrt, neukleová kyselina, vektor s jejím obsahem, kultivovaná buňka, kit pro indukci apoptosy, transformovaná E. coli, způsob produkce a použití

Family Applications After (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CZ2002-3917A CZ304614B6 (cs) 2000-05-02 2001-05-02 Čištěná protilátka a polypeptid, prostředek selektivně indukující buněčnou smrt, neukleová kyselina, vektor s jejím obsahem, kultivovaná buňka, kit pro indukci apoptosy, transformovaná E. coli, způsob produkce a použití

Country Status (27)

Country Link
US (6) US7244429B2 (cs)
EP (4) EP2065400B1 (cs)
JP (4) JP4156238B2 (cs)
KR (2) KR100817967B1 (cs)
CN (2) CN101585881B (cs)
AT (1) ATE426615T1 (cs)
AU (2) AU2001259366B2 (cs)
BG (3) BG109275A (cs)
BR (1) BR0110547A (cs)
CA (1) CA2407965C (cs)
CY (1) CY1109179T1 (cs)
CZ (2) CZ306996B6 (cs)
DE (1) DE60138097D1 (cs)
DK (1) DK1287035T3 (cs)
EE (1) EE05548B1 (cs)
ES (1) ES2323448T3 (cs)
HU (2) HU230399B1 (cs)
IL (1) IL152605A0 (cs)
MX (1) MXPA02010823A (cs)
NO (2) NO329843B1 (cs)
NZ (1) NZ522881A (cs)
PL (1) PL211733B1 (cs)
PT (1) PT1287035E (cs)
RU (1) RU2298013C2 (cs)
TW (1) TWI318983B (cs)
WO (1) WO2001083560A1 (cs)
ZA (1) ZA200209230B (cs)

Families Citing this family (85)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7528239B1 (en) 1997-02-13 2009-05-05 Immunex Corporation Receptor that binds trail
JP4330180B2 (ja) 1997-03-17 2009-09-16 ヒューマン ジノーム サイエンシーズ， インコーポレイテッド 死ドメイン含有レセプター５
US6872568B1 (en) 1997-03-17 2005-03-29 Human Genome Sciences, Inc. Death domain containing receptor 5 antibodies
JP2002543151A (ja) * 1999-05-04 2002-12-17 ヒューマン ジノーム サイエンシーズ， インコーポレイテッド 死ドメイン含有レセプター５
TWI318983B (en) 2000-05-02 2010-01-01 Uab Research Foundation An antibody selective for a tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand receptor and uses thereof
US7279160B2 (en) 2000-05-02 2007-10-09 The Uab Research Foundation Combinations of DR5 antibodies and other therapeutic agents
US7476383B2 (en) 2000-05-02 2009-01-13 The Uab Research Foundation Antibody selective for DR4 and uses thereof
US20030228309A1 (en) * 2000-11-08 2003-12-11 Theodora Salcedo Antibodies that immunospecifically bind to TRAIL receptors
US20060062786A1 (en) * 2000-11-08 2006-03-23 Human Genome Sciences, Inc. Antibodies that immunospecifically bind to TRAIL receptors
AU2003222427B8 (en) 2000-11-17 2010-04-29 Vascular Biogenics Ltd. Promoters exhibiting endothelial cell specificity and methods of using same
US8071740B2 (en) 2000-11-17 2011-12-06 Vascular Biogenics Ltd. Promoters exhibiting endothelial cell specificity and methods of using same for regulation of angiogenesis
US7115717B2 (en) 2001-05-18 2006-10-03 Kirin Beer Kabushiki Kaisha Anti-TRAIL-R antibodies
US20050214209A1 (en) * 2001-05-25 2005-09-29 Human Genome Sciences, Inc. Antibodies that immunospecifically bind to TRAIL receptors
US20090226429A1 (en) * 2001-05-25 2009-09-10 Human Genome Sciences, Inc. Antibodies That Immunospecifically Bind to TRAIL Receptors
US20050129616A1 (en) * 2001-05-25 2005-06-16 Human Genome Sciences, Inc. Antibodies that immunospecifically bind to TRAIL receptors
US7361341B2 (en) 2001-05-25 2008-04-22 Human Genome Sciences, Inc. Methods of treating cancer using antibodies that immunospecifically bind to trail receptors
US7348003B2 (en) 2001-05-25 2008-03-25 Human Genome Sciences, Inc. Methods of treating cancer using antibodies that immunospecifically bind to TRAIL receptors
US7064189B2 (en) 2001-05-25 2006-06-20 Human Genome Sciences, Inc. Antibodies that immunospecifically bind to trail receptors
CN100506284C (zh) 2001-10-19 2009-07-01 脉管生物生长有限公司 多核苷酸构建体、药物组合物以及靶向的下调血管生成和抗癌的治疗方法
IL161686A0 (en) * 2001-11-01 2004-09-27 Uab Research Foundation Combinations of antibodies selective for a tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand receptor and other therapeutic agents
ES2357225T3 (es) * 2001-11-01 2011-04-20 Uab Research Foundation Combinaciones de anticuerpos anti-dr5 y anticuerpos anti-dr4 y otros agentes terapéuticos.
AU2002361784A1 (en) * 2001-12-20 2003-07-09 Human Genome Sciences, Inc. Antibodies that immunospecifically bind to trail receptors
US20050069549A1 (en) 2002-01-14 2005-03-31 William Herman Targeted ligands
DE10210427A1 (de) * 2002-03-09 2003-10-09 Hans Konrad Mueller-Hermelink Humaner monoklonaler Antikörper
EP1521776A2 (en) * 2002-07-04 2005-04-13 Oncomab Gmbh Neoplasm specific antibodies and uses thereof
KR20090046973A (ko) * 2002-11-27 2009-05-11 아이알엠 엘엘씨 암세포에서 세포자멸사를 유도하기 위한 방법 및 조성물
AU2008201431B2 (en) * 2002-11-27 2011-11-24 Irm, Llc Methods and compositions for inducing Apoptosis in cancer cells
DE10311248A1 (de) 2003-03-14 2004-09-30 Müller-Hermelink, Hans Konrad, Prof. Dr. Humaner monoklonaler Antikörper
EP1531162A1 (en) 2003-11-14 2005-05-18 Heinz Vollmers Adenocarcinoma specific antibody SAM-6, and uses thereof
DE10353175A1 (de) 2003-11-14 2005-06-16 Müller-Hermelink, Hans Konrad, Prof. Dr. Humaner monoklonaler Antikörper mit fettsenkender Wirkung
KR20060132006A (ko) 2004-03-23 2006-12-20 비오겐 아이덱 엠에이 아이엔씨. 수용체 커플링제 및 이의 치료적 용도
CN100427505C (zh) * 2004-08-19 2008-10-22 中国医学科学院基础医学研究所 抗人肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体的受体dr5单克隆抗体（ad5-10）及其制法与用途
BRPI0519008A2 (pt) * 2004-12-13 2008-12-23 Evogenix Ltd proteÍnas variantes de osteoprotegerina
JP5562521B2 (ja) 2005-02-02 2014-07-30 ザ ユーエービー リサーチ ファンデーション アポトーシス誘導デスレセプターアゴニストに対する抵抗性を低減することに関する薬剤及び方法
US8029783B2 (en) 2005-02-02 2011-10-04 Genentech, Inc. DR5 antibodies and articles of manufacture containing same
JP5004154B2 (ja) * 2005-04-06 2012-08-22 一般財団法人化学及血清療法研究所 組換え抗ボツリヌス神経毒素抗体
EP1907001B1 (en) 2005-06-17 2015-07-15 Merck Sharp & Dohme Corp. Ilt3 binding molecules and uses therefor
PE20071101A1 (es) * 2005-08-31 2007-12-21 Amgen Inc Polipeptidos y anticuerpos
UA97096C2 (ru) * 2005-08-31 2012-01-10 Емджен Інк. Выделенное антитело, которое специфически связывает рецептор-2 trail (tr-2)
US8168181B2 (en) 2006-02-13 2012-05-01 Alethia Biotherapeutics, Inc. Methods of impairing osteoclast differentiation using antibodies that bind siglec-15
AU2007250735A1 (en) 2006-05-16 2007-11-22 Daiichi Sankyo Company, Limited Method for high-level secretory production of protein
CA2655903A1 (en) * 2006-06-19 2008-08-07 Tolerx, Inc. Ilt3 binding molecules and uses therefor
KR100847010B1 (ko) * 2006-07-05 2008-07-17 아주대학교산학협력단 세포사멸 수용체 5 (ｄｒ5)에 특이적으로 결합하는 항체 및이를 포함하는 암 예방 또는 치료용 조성물
KR100804126B1 (ko) 2007-02-09 2008-02-19 아주대학교산학협력단 종양 괴사 인자―관련 세포사멸―유도 리간드의 수용체에특이적으로 결합하는 1가의 인간 단일클론 항체 및 그의항원결합 단편
AR066913A1 (es) * 2007-06-08 2009-09-23 Irm Llc Metodos y composiciones para inducir la apoptosis en celulas cancerosas
CA2695991A1 (en) * 2007-08-09 2009-02-12 Daiichi Sankyo Company, Limited Immunoliposome inducing apoptosis into cell expressing death domain-containing receptor
ES2537806T5 (es) 2007-10-31 2018-10-09 Daiichi Sankyo Company, Limited Método para la secreción y producción de alto nivel de proteína
WO2010047509A2 (ko) * 2008-10-24 2010-04-29 아주대학교 산학협력단 친화도와 안정성이 향상된 항 ｄｒ5 항체, 및 이를 포함하는 암 예방 또는 치료용 조성물
JP2013505944A (ja) * 2009-09-24 2013-02-21 シアトル ジェネティックス， インコーポレイテッド Ｄｒ５リガンド薬物結合体
EP2492281B1 (en) * 2009-10-19 2018-04-11 HanAll Biopharma Co., Ltd. Modified human tumor necrosis factor receptor-1 polypeptide or fragment thereof, and method for preparing same
CA2780130A1 (en) 2009-11-05 2011-05-12 The Uab Research Foundation Treating basal-like genotype cancers
US9238069B2 (en) 2009-12-16 2016-01-19 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Method of sensitizing cancer cells to the cytotoxic effects of death receptor ligands in cancer treatment
US9120855B2 (en) 2010-02-10 2015-09-01 Novartis Ag Biologic compounds directed against death receptor 5
US9284350B2 (en) 2010-02-12 2016-03-15 Pharmascience Inc. IAP BIR domain binding compounds
US8703712B2 (en) 2010-03-18 2014-04-22 The Uab Research Foundation Targeting cancer stem cells with DR5 agonists
PH12013500845A1 (en) * 2010-10-29 2013-06-24 Daiichi Sankyo Co Ltd Novel anti-dr5 antibody
CN103561771B (zh) 2011-03-17 2019-01-04 伯明翰大学 重新定向的免疫治疗
EP2704735A1 (en) * 2011-05-03 2014-03-12 Genentech, Inc. Vascular disruption agents and uses thereof
HK1210192A1 (en) 2012-07-19 2016-04-15 Alethia Biotherapeutics Inc. Anti-siglec-15 antibodies
NZ630363A (en) * 2012-07-25 2018-09-28 Celldex Therapeutics Inc Anti-kit antibodies and uses thereof
CN103074425B (zh) * 2012-12-29 2014-01-01 深圳市第三人民医院 Cd263基因的用途
WO2015051159A1 (en) * 2013-10-02 2015-04-09 The Rockefeller University Amyloid protofibril antibodies and methods of use thereof
CN104710533A (zh) * 2013-12-12 2015-06-17 中国科学院深圳先进技术研究院 sDR5-Fc融合蛋白及其用途
IL308212A (en) 2015-01-20 2024-01-01 Igm Biosciences Inc Tumor necrosis factor-α receptor binding molecules and their uses
RU2017129236A (ru) 2015-01-26 2019-03-07 Макродженикс, Инк. Мультивалентные молекулы, содержащие dr5-связывающие домены
CN105061604B (zh) * 2015-08-19 2018-03-16 河南大学 sDR5‑Fc融合蛋白突变体及其应用
CN109195626B (zh) 2015-10-30 2022-09-13 银河生物技术有限责任公司 结合死亡受体4和死亡受体5的抗体
CN109476737A (zh) 2015-12-01 2019-03-15 根马布有限公司 抗dr5抗体及其使用方法
CN106924735A (zh) * 2015-12-29 2017-07-07 上海交通大学医学院附属瑞金医院 多巴胺1类受体激动剂在制备肿瘤治疗药物中的用途
US10849912B2 (en) 2016-02-09 2020-12-01 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Method of sensitizing cancer cells to the cytotoxic effects of apoptosis inducing ligands in cancer treatment
CA3015619A1 (en) 2016-03-01 2017-09-08 Yissum Research Development Company Of The Hebrew University Of Jerusalem Ltd. Antibodies specific to human poliovirus receptor (pvr)
KR101926166B1 (ko) * 2016-05-24 2018-12-06 재단법인 아산사회복지재단 수용체 시너지 활성을 이용한 nk 세포의 활성도 검사 방법 및 이를 이용한 nk 세포의 활성도가 관련된 질환의 진단 방법
US11680101B2 (en) 2017-01-27 2023-06-20 Kymab Limited Anti-OPG antibodies
KR101926834B1 (ko) * 2017-03-21 2018-12-07 동아에스티 주식회사 항-dr5 항체 및 그의 용도
EP3635005A1 (en) 2017-06-07 2020-04-15 Genmab B.V. Therapeutic antibodies based on mutated igg hexamers
KR101951025B1 (ko) 2017-08-17 2019-02-21 서울대학교산학협력단 세포사멸 수용체 저해제를 유효성분으로 포함하는 cx3cl1 케모카인 과발현으로 인한 질환 예방 또는 치료용 조성물
EP3684409A4 (en) * 2017-09-22 2021-06-23 Immunogen, Inc. SEPARATION OF TRIPLE LIGHT CHAIN ANTIBODIES USING CATION EXCHANGE CHROMATOGRAPHY
WO2019100194A1 (zh) * 2017-11-21 2019-05-31 深圳先进技术研究院 抗dr5的抗体及其制备方法和应用
WO2019100193A1 (zh) * 2017-11-21 2019-05-31 深圳先进技术研究院 抗dr5的抗体及其制备方法和应用
CN108251443A (zh) * 2018-01-23 2018-07-06 深圳市人民医院 一种tnfrsf10c重组质粒、制备方法及其应用
US12018045B2 (en) 2018-03-06 2024-06-25 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services 17-beta-hydroxywithanolides and use thereof in treating cancer
CN117126279A (zh) 2018-03-20 2023-11-28 鸿运华宁（杭州）生物医药有限公司 Gipr抗体及其与glp-1的融合蛋白质，以及其药物组合物和应用
EP3897851A2 (en) 2018-12-17 2021-10-27 Revitope Limited Twin immune cell engager
EP4041392A1 (en) 2019-10-08 2022-08-17 Nectin Therapeutics Ltd. Antibodies against the poliovirus receptor (pvr) and uses thereof
EP4277706A1 (en) 2021-01-15 2023-11-22 Stichting Het Nederlands Kanker Instituut- Antoni van Leeuwenhoek Ziekenhuis Inducers of senescence, in combination with a selective death receptor 5 (dr5) agonist, for use in a method of treating cancer

Family Cites Families (42)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4816567A (en) * 1983-04-08 1989-03-28 Genentech, Inc. Recombinant immunoglobin preparations
IL162181A (en) 1988-12-28 2006-04-10 Pdl Biopharma Inc A method of producing humanized immunoglubulin, and polynucleotides encoding the same
GB9028123D0 (en) * 1990-12-28 1991-02-13 Erba Carlo Spa Monoclonal antibodies against human tumor necrosis factor alpha
US6812327B1 (en) 1996-10-25 2004-11-02 Human Genome Sciences, Inc. Neutrokine-alpha polypeptides
US6433147B1 (en) * 1997-01-28 2002-08-13 Human Genome Sciences, Inc. Death domain containing receptor-4
PT1012274E (pt) 1997-01-28 2007-08-14 Craig A Rosen Receptor 4 contendo um domínio de morte (dm4; receptor de morte 4), membro da super-família do ftn e ligação a liart (ap02)
US6072047A (en) * 1997-02-13 2000-06-06 Immunex Corporation Receptor that binds trail
US6313269B1 (en) * 1997-03-14 2001-11-06 Smithkline Beecham Corporation Tumor necrosis factor related receptor, TR6
JP4330180B2 (ja) 1997-03-17 2009-09-16 ヒューマン ジノーム サイエンシーズ， インコーポレイテッド 死ドメイン含有レセプター５
US6872568B1 (en) * 1997-03-17 2005-03-29 Human Genome Sciences, Inc. Death domain containing receptor 5 antibodies
IL123888A0 (en) 1997-04-01 1998-10-30 Sankyo Co Anti-fas antibodies
AU7126498A (en) 1997-04-16 1998-11-11 Millennium Pharmaceuticals, Inc. Tumor necrosis factor receptor related proteins tango-63d and tango-63e
US6342369B1 (en) * 1997-05-15 2002-01-29 Genentech, Inc. Apo-2-receptor
ES2293682T5 (es) 1997-05-15 2011-11-17 Genentech, Inc. Anticuerpo anti-apo2.
AU8400398A (en) 1997-07-11 1999-02-08 Trustees Of The University Of Pennsylvania, The Nucleic acid encoding a novel chemotherapy-induced protein, and methods of use
EP0998561A4 (en) * 1997-07-15 2004-08-18 Immunex Corp RECEPTOR DES TRAIL PROTEIN
AU3710597A (en) 1997-08-06 1999-03-01 Laboratorio Medinfar-Produtos Farmaceuticos, Lda Dna integration into "mycobacterium spp." genome by trans-complementation using a site-specific integration system
ATE233887T1 (de) * 1997-08-13 2003-03-15 Sortech Ag Sorptionsspeicher, anordnung und verfahren zur speicherung von wärme
CA2301202A1 (en) * 1997-08-15 1999-02-25 Idun Pharmaceuticals, Inc. Trail receptors, nucleic acids encoding the same, and methods of use thereof
WO1999011791A2 (en) 1997-09-05 1999-03-11 University Of Washington Tumor necrosis factor family receptors and ligands, encoding nucleic acids and related binding agents
CA2301173C (en) 1997-09-12 2015-04-14 Biogen, Inc. Cysteine rich receptors-train
US7105640B2 (en) * 1997-10-17 2006-09-12 Genentech, Inc. Anti-pro792 antibodies
AU2338299A (en) 1998-01-26 1999-08-09 Genentech Inc. Antibodies to death receptor 4 (dr4) and uses thereof
US20040120947A1 (en) 1998-01-26 2004-06-24 Genentech, Inc. DR4 antibodies and uses thereof
US6252050B1 (en) * 1998-06-12 2001-06-26 Genentech, Inc. Method for making monoclonal antibodies and cross-reactive antibodies obtainable by the method
CA2365913C (en) * 1999-04-12 2015-03-03 Genentech, Inc. Tumor necrosis factor receptor homologs and nucleic acids encoding the same
JP2002543151A (ja) 1999-05-04 2002-12-17 ヒューマン ジノーム サイエンシーズ， インコーポレイテッド 死ドメイン含有レセプター５
CA2373063A1 (en) 1999-05-06 2000-11-16 Jian Ni Death domain containing receptor 4
EP1181319B1 (en) 1999-05-28 2009-04-22 Genentech, Inc. Chimeric dr4 antibodies and uses thereof
ATE330972T1 (de) 1999-06-09 2006-07-15 Genentech Inc Apo-2l rezeptor-agonist und cpt-11 synergie- effekt
US6294546B1 (en) 1999-08-30 2001-09-25 The Broad Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Uses of diterpenoid triepoxides as an anti-proliferative agent
CA2384762A1 (en) 1999-09-15 2001-03-22 Genentech, Inc. Apo-2 receptor antibodies
JP2003531588A (ja) 2000-04-11 2003-10-28 ジェネンテック・インコーポレーテッド 多価抗体とその用途
US7476383B2 (en) * 2000-05-02 2009-01-13 The Uab Research Foundation Antibody selective for DR4 and uses thereof
TWI318983B (en) 2000-05-02 2010-01-01 Uab Research Foundation An antibody selective for a tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand receptor and uses thereof
US7279160B2 (en) * 2000-05-02 2007-10-09 The Uab Research Foundation Combinations of DR5 antibodies and other therapeutic agents
WO2002079377A2 (en) 2000-11-08 2002-10-10 Human Genome Sciences, Inc. Antibodies that immunospecifically bind to trail receptors
US20030228309A1 (en) * 2000-11-08 2003-12-11 Theodora Salcedo Antibodies that immunospecifically bind to TRAIL receptors
US6965023B2 (en) * 2000-11-17 2005-11-15 The Burnham Institute Death domain proteins
EP1409544B1 (en) 2001-07-03 2009-06-17 Genentech, Inc. Human dr4 antibodies and uses thereof
ES2357225T3 (es) 2001-11-01 2011-04-20 Uab Research Foundation Combinaciones de anticuerpos anti-dr5 y anticuerpos anti-dr4 y otros agentes terapéuticos.
IL161686A0 (en) 2001-11-01 2004-09-27 Uab Research Foundation Combinations of antibodies selective for a tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand receptor and other therapeutic agents

Also Published As

Publication number Publication date
JP2009005707A (ja) 2009-01-15
CZ304614B6 (cs) 2014-08-06
ZA200209230B (en) 2004-03-16
US7244429B2 (en) 2007-07-17
EP1287035A1 (en) 2003-03-05
PL211733B1 (pl) 2012-06-29
HU0500800D0 (en) 2005-10-28
PT1287035E (pt) 2009-06-30
RU2002132255A (ru) 2005-01-20
US20030190687A1 (en) 2003-10-09
BG109275A (en) 2006-10-31
EP2065400A2 (en) 2009-06-03
EE05548B1 (et) 2012-06-15
US8067001B2 (en) 2011-11-29
MXPA02010823A (es) 2004-05-05
BG66153B1 (bg) 2011-08-31
HU229417B1 (hu) 2013-12-30
HUP0400951A2 (hu) 2004-07-28
KR20060092292A (ko) 2006-08-22
TWI318983B (en) 2010-01-01
EP2065401A3 (en) 2009-07-22
NO20054145L (no) 2002-12-18
US20140308288A1 (en) 2014-10-16
EE200200621A (et) 2004-06-15
KR20030055177A (ko) 2003-07-02
CZ20023917A3 (cs) 2003-05-14
JP2007091749A (ja) 2007-04-12
EP2065401A2 (en) 2009-06-03
EP1287035B1 (en) 2009-03-25
EP2065400A3 (en) 2009-07-22
EP1287035A4 (en) 2004-09-29
NO338228B1 (no) 2016-08-08
EP2368910A1 (en) 2011-09-28
US7790165B2 (en) 2010-09-07
JP3892466B2 (ja) 2007-03-14
CN100497388C (zh) 2009-06-10
CN1440424A (zh) 2003-09-03
HK1162524A1 (en) 2012-08-31
KR100817967B1 (ko) 2008-03-31
PL366195A1 (en) 2005-01-24
NO20025253D0 (no) 2002-11-01
BG65929B1 (bg) 2010-05-31
US20130243780A1 (en) 2013-09-19
DE60138097D1 (de) 2009-05-07
US9700618B2 (en) 2017-07-11
CA2407965A1 (en) 2001-11-08
AU2001259366B2 (en) 2005-09-08
EP2065400B1 (en) 2014-11-05
CN101585881B (zh) 2014-11-26
EP2065401B1 (en) 2016-08-10
AU5936601A (en) 2001-11-12
JP4156238B2 (ja) 2008-09-24
JP2005232187A (ja) 2005-09-02
DK1287035T3 (da) 2009-06-15
WO2001083560A1 (en) 2001-11-08
US8329180B2 (en) 2012-12-11
CA2407965C (en) 2014-10-14
US20120076792A1 (en) 2012-03-29
CY1109179T1 (el) 2014-07-02
US8715668B2 (en) 2014-05-06
ATE426615T1 (de) 2009-04-15
CN101585881A (zh) 2009-11-25
JP4575975B2 (ja) 2010-11-04
CZ306996B6 (cs) 2017-11-01
NO329843B1 (no) 2011-01-10
HU230399B1 (hu) 2016-04-28
ES2323448T3 (es) 2009-07-16
HK1126506A1 (en) 2009-09-04
BR0110547A (pt) 2004-06-22
JP2004502409A (ja) 2004-01-29
BG107275A (bg) 2004-09-30
NZ522881A (en) 2005-05-27
HUP0400951A3 (en) 2012-09-28
EP2368910B1 (en) 2016-02-10
US20070298039A1 (en) 2007-12-27
HK1050372A1 (en) 2003-06-20
US20110008324A1 (en) 2011-01-13
IL152605A0 (en) 2003-06-24
RU2298013C2 (ru) 2007-04-27
NO20025253L (no) 2002-12-18

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN101585881B (zh) 对于肿瘤坏死因子相关细胞凋亡诱导配体受体选择性的抗体及其应用
CA2465040C (en) An antibody selective for a tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand receptor and uses thereof
AU2001259366A1 (en) An antibody selective for a tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand receptor and uses thereof
US20030198637A1 (en) Antibody selective for a tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand receptor and uses thereof
HK1050372B (en) An antibody selective for a tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand receptor and uses thereof
HK1126506B (en) An antibody selective for a tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand receptor and uses thereof
HK1162524B (en) An antibody selective for a tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand receptor and uses thereof
HK1126505A (en) An antibody selective for a tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand receptor and uses thereof

Legal Events

Date Code Title Description
MK4A Patent expired

Effective date: 20210502