ES2323448T3 - Anticuerpo selectivo para un receptor de un ligando inductor de apoptosis relacionado con el factor de necrosis tumoral y sus usos. - Google Patents

Anticuerpo selectivo para un receptor de un ligando inductor de apoptosis relacionado con el factor de necrosis tumoral y sus usos. Download PDF

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Abstract

Anticuerpo purificado que se une específicamente a un receptor DR5 de TRAIL, donde dicho anticuerpo tiene actividad inductora de la apoptosis en ausencia de entrecruzamiento secundario y donde el anticuerpo no se une al receptor de TRAIL DR4, DcR1 o DcR2, que comprende una cadena pesada y una cadena ligera donde a) la cadena pesada comprende una región variable que comprende las CDR de un anticuerpo monoclonal producido por el hibridoma de ratón-ratón TRA-8 que tiene el número de acceso de la ATCC PTA-1428; y b) la cadena ligera comprende una región variable que comprende las CDR del anticuerpo monoclonal producido por TRA-8; donde en las CDR puede añadirse, omitirse o sustituirse un residuo.

Description

Anticuerpo selectivo para un receptor de un ligando inductor de apoptosis relacionado con el factor de necrosis tumoral y sus usos.
Campo de la invención
La presente invención se refiere a un anticuerpo capaz de unirse específicamente a un solo tipo de receptor de ligando (denominado en lo sucesivo "TRAIL") inductor de la apoptosis relacionada con el factor de necrosis tumoral (denominado en lo sucesivo "TNF"), más particularmente, a un anticuerpo monoclonal que induce la apoptosis en células in vivo e in vitro que expresan el único tipo de receptor y a terapias basadas en dicho anticuerpo.
Antecedentes de la invención
TRAIL es un miembro de la familia de proteínas conocidas como TNF, que también incluye el TNF-\alpha y el ligando de Fas (1). Estas proteínas son potentes inductores de la apoptosis. Hasta la fecha se han identificado cinco receptores para TRAIL, dos de los cuales, DR4 (TRAIL-R1) y DR5 (TRAIL-R2) (2-7), pueden transducir la señal de apoptosis mientras que los otros tres, DcR1 (TRAIL-R3), DcR2 (TRAIL-R4) y la osteoprotegerina (OPG), no transducen la señal de apoptosis (8-12). Los cinco receptores para TRAIL comparten una homología significativa en sus dominios extracelulares de unión al ligando. De forma similar al receptor I de Fas y TNF (denominado en lo sucesivo "TNFRI"), los segmentos intracelulares de DR4 y DR5 contienen un domino de muerte y transducen una señal de apoptosis por medio de una ruta en la que está implicada la proteína del dominio de muerte asociado con Fas (denominado en lo sucesivo "FADD") y la caspasa 8 (6, 7). Además de transducir la señal de apoptosis, los receptores DR4 y DR5 también pueden activar una ruta en la que está implicado NF\kappab (6, 7).
Las funciones biológicas de TRAIL que se han demostrado incluyen la capacidad de TRAIL de inducir selectivamente la apoptosis de células tumorales transformadas, siendo las células normales relativamente resistentes a la apoptosis mediada por TRAIL (13-15). Esta selectividad sugiere que, a diferencia del ligando de Fas, la administración de TRAIL está asociada con niveles muy bajos de toxicidad como se demuestra por la administración sistémica de TRAIL en un modelo animal sin inducir una toxicidad significativa (13). De esta manera, TRAIL se ha propuesto como un potente agente inductor de apoptosis que sería un agente terapéutico adecuado para el tratamiento de cánceres y otras enfermedades asociadas con una proliferación anómala de las células. También se ha propuesto que TRAIL es un agente potente inductor de la apoptosis que sería adecuado para el tratamiento de enfermedades autoinmunes e inflamatorias. Se ha demostrado que la apoptosis mediada por TRAIL está implicada en la muerte de células T inducida por activación, sirviendo de esta manera como mecanismo alternativo al ligando de Fas (16, 17). La apoptosis mediada por TRAIL también puede funcionar en la inducción de la apoptosis de células T y otras células inflamatorias (18), y juega un papel en la actividad destructora de las células NK (19-21) y en la función inmunomoduladora de las células dendríticas (22, 23). De esta manera, la apoptosis mediada por TRAIL también puede intervenir en inmunoprivilegio e inmunovigilancia.
El sistema receptor de TRAIL es complejo e incluye al menos dos receptores de muerte, DR4 y DR5, y al menos dos receptores no apoptóticos, DcR1 y DcR2. Todos estos receptores no sólo comparten una alta homología de secuencias de aminoácidos, sino que también presentan una afinidad de unión similar a TRAIL (2-12). La capacidad de los receptores DcR1 y DcR2 de competir por la unión de TRAIL sin inducir apoptosis sugiere que pueden actuar como receptores de reclamo que bloquean o modulan la actividad del ligando TRAIL. Además, se ha notificado que células no transformadas expresan mayores niveles de receptores de reclamo que células transformadas. De esta manera, se ha propuesto que la modulación diferencial de la expresión de los receptores de muerte y de reclamo puede representar un mecanismo regulador clave que determina la susceptibilidad de las células a la apoptosis mediada por TRAIL, pero debido a la ausencia de anticuerpos con especificidad de receptor (2). Aunque se han estudiado minuciosamente la expresión y función de DR4 y DR5, el progreso se ha obstaculizado por la falta de anticuerpos monoclonales con especificidad de receptor. No se ha documentado la expresión en la superficie celular de DR5. Se ha notificado que se ha generado un panel de anticuerpos anti-receptor de TRAIL que pueden inducir la apoptosis de células de melanoma in vitro pero sólo después de la inmovilización de los anticuerpos, para promover el entrecruzamiento y, en algunos casos, las células requieren el cultivo con actinomicina D (24). Se han generado varios anticuerpos anti-DR5 (24). Sin embargo, estos anticuerpos monoclonales anti-DR5 generados previamente tienen una baja actividad inductora de la apoptosis in vitro incluso en las condiciones de entrecruzamiento. No se ha notificado ninguna actividad in vivo. Estos anticuerpos no se han usado para examinar la expresión en la superficie celular de receptores de TRAIL (24). De esta manera, existe la necesidad de un anticuerpo monoclonal selectivo para cada receptor de TRAIL específico que no sólo pueda unirse al receptor de la superficie celular, sino que también sea capaz de inducir fuertemente la apoptosis de diversos tipos de células anómalas, incluyendo células tumorales, tanto in vivo como in vitro sin necesidad de entrecruzamiento o inmovilización. Este anticuerpo no sólo proporcionaría un agente terapéutico potencial, sino también una herramienta de diagnóstico para el análisis funcional del receptor de TRAIL. Existe una necesidad particular de un anticuerpo específico contra cada uno de los receptores inductores de muerte DR4 y DR5.
En el desarrollo o progresión de muchas enfermedades, con frecuencia las células no se eliminan. En muchas enfermedades autoinmunes y estados inflamatorios, las células activadas supervivientes atacan a los tejidos o células normales. Además, la progresión de la tumorigénesis y la formación del pannus proliferativo de la artritis reumatoide se caracterizan por una proliferación no comprobada de células. De esta manera, una apoptosis insuficiente conduce al desarrollo de una enfermedad, y los usos de un ligando inductor de la apoptosis o un anticuerpo monoclonal agonista para potenciar la apoptosis se consideran una posible estrategia terapéutica para eliminar esas células indeseadas.
Por ejemplo, la artritis reumatoide (denominada en lo sucesivo "AR") es una enfermedad autoinmune humana común. La creencia actual de la patofisiología de la RA es que las células B y células T autoinmunes inician una respuesta inflamatoria en las articulaciones, que dirige la hiperproliferación de los sinoviocitos. Como consecuencia de la hiperproliferación de las células sinoviales, se produce un exceso de metaloproteinasas (denominadas en lo sucesivo "MMP"), lo cual conduce adicionalmente a la destrucción erosiva del cartílago y el hueso que es característica de la RA (25). De esta manera, el control de la hiperproliferación de las células sinoviales inflamatorias es una etapa clave del tratamiento de la RA. Aún no se conocen los mecanismos moleculares que conducen a la hiperproliferación de células sinoviales. Aunque las células sinoviales hiperproliferativas no son malignas y no están transformadas, muchos estudios han sugerido que comparten algunas características comunes con las células transformadas (46). Estas células, los denominados "sinoviocitos de aspecto transformado", se caracterizan por un retículo endoplásmico rugoso denso, numerosos núcleos irregulares y cambios en el esqueleto celular que normalmente tiene forma de huso. Se ha propuesto que la incorporación de los oncogenes y genes derivados de virus podría ser el desencadenante principal del aspecto transformado de las células sinoviales de la RA (46).
Al menos dos aspectos de la RA sugieren que una apoptosis mal regulada puede contribuir al proceso de la enfermedad y que la inducción terapéutica de la apoptosis puede ser un tratamiento eficaz: el fallo de la eliminación de las células T activadas sugiere que hay una muerte celular inducida por la activación defectuosa de estas células T, que es un proceso que implica la apoptosis mediada por Fas y la apoptosis mediada por TRAIL, y la naturaleza hiperproliferativa de las células sinoviales de la RA es un factor contribuyente en las últimas fases de la patofisiología de la RA. De hecho, se ha demostrado que la administración de anticuerpo anti-Fas en la articulación inflamatoria inhibe el desarrollo de artritis crónica en ratones transgénicos tax, que son un modelo animal de RA humana (26). Además, la transducción localizada con el gen del ligando de Fas por un vector adenoviral es eficaz en la prevención de la artritis inducida por colágeno (27). En ambos casos se observa la inhibición de la proliferación de células sinoviales inflamatorias por medio de la potenciación de una apoptosis mediada por Fas. Aunque el ligando de Fas es un fuerte inductor de la apoptosis en células sinoviales de RA, la aplicación de apoptosis mediada por el ligando de Fas como terapia para seres humanos ha estado limitada por la toxicidad hepática letal. De esta manera, la apoptosis inducida por el receptor de TRAIL representa una terapia más segura y más eficaz para el tratamiento de la RA que la apoptosis inducida por el ligando de Fas.
La apoptosis inducida por el receptor de TRAIL también representa una terapia más segura y más eficaz para el tratamiento de cánceres que la apoptosis inducida por el ligando de Fas. Se sabe que la apoptosis mediada por TRAIL induce específicamente la apoptosis de células tumorales transformadas sin afectar a las células normales. Se ha demostrado que la administración sistémica de TRAIL soluble trimerizado no produjo toxicidad en animales experimentales pero podía inducir regresión de tumores implantados (13, 28). Su potencial como terapia auxiliar para tratamientos tradicionales se recalcó por el reciente descubrimiento de que la expresión de DR5 y las susceptibilidad a la apoptosis inducida por TRAIL de células de cáncer de mama se aumenta por la radiación, lo que sugiere que junto con la radiación, la eficacia de TRAIL podía aumentarse en la terapia del cáncer (29).
Además, el gen que codifica el receptor de TRAIL DR5 se ha localizado en el cromosoma 8p21-22, un locus con alta frecuencia de mutación en algunas células cancerosas (30). Se ha notificado que al menos dos tipos de células tumorales, el cáncer pulmonar microcítico (31) y el cáncer de cabeza y cuello (32) presentan mutaciones en el dominio de muerte del gen de DR5. De esta manera, existe la necesidad de un anticuerpo anti-DR5 en la investigación del cáncer para determinar el efecto de la variación del epítopo del receptor sobre el desarrollo y progresión de cánceres. Además, la funcionalidad de mutaciones del receptor de TRAIL resultaría una herramienta de diagnóstico clínico útil cuando se usa junto con otros biomarcadores en la detección precoz de cánceres y como agente de predicción de la agresividad tumoral.
Descripción resumida de la invención
La invención se refiere a un anticuerpo como se describe en la reivindicación 1.
Se describe un anticuerpo que reconoce un receptor de TRAIL DR5 y que induce la apoptosis en una célula que expresa DR5 in vivo y reconoce DR5 pero no DR4, DcR1 ni DcR2.
El anticuerpo de la invención puede usarse para la inhibición de la proliferación celular por medio de la exposición de una célula a una cantidad terapéutica de un anticuerpo capaz de unirse a DR5. También se describe una composición farmacológica que incluye una cantidad terapéutica del anticuerpo de la invención que es activo contra DR5, un vehículo farmacéuticamente aceptable y un recipiente que encierra el anticuerpo y el vehículo. También se proporciona por la invención el uso de un anticuerpo que reconoce DR5 para preparar una terapia para la apoptosis selectiva de células anómalas o mal reguladas.
La presente invención proporciona el uso del anticuerpo en el tratamiento de una enfermedad relacionada con la apoptosis por medio de un método que incluye exponer un tejido diana que tiene una enfermedad relacionada con la apoptosis a una cantidad terapéutica de un anticuerpo de la invención.
También se describe una proteína de fusión que incluye una secuencia de aminoácidos antigénica del receptor de TRAIL que tiene al menos diez bases, acoplada a una proteína inmunoglobulina o un fragmento de la misma capaz de inducir una respuesta inmune dentro de un sujeto.
Se proporcionan secuencias de ácido nucleico y secuencias de aminoácidos que codifican las inmunoglobulinas de cadena pesada y ligera de un anticuerpo selectivo para DR5.
La presente invención proporciona una célula hospedadora que produce un TRA-8 humanizado.
Se describe un proceso para producir un anticuerpo contra DR5 humanizado en el que un hospedador se transforma con secuencias de ácido nucleico que codifican una cadena ligera de inmunoglobulina humanizada y una cadena pesada de inmunoglobulina humanizada, después de lo cual el hospedador transformado se incuba durante un período de tiempo predeterminado.
También se describe un proceso para inhibir la proliferación celular que incluye poner en contacto una célula diana con una cantidad farmacéuticamente eficaz de un anticuerpo contra DR5 humanizado.
Se proporciona un kit comercial para inducir la muerte celular que incluye un anticuerpo TRA-8 humanizado selectivo para DR5; envasado en un recipiente adecuado junto con instrucciones para el uso.
Breve descripción de los dibujos
Figura 1. Caracterización de TRA-8. (a.) Especificidad de unión de TRA-8: análisis de transferencia de Western (panel superior): Proteínas de fusión recombinantes de la familia del TNFR sondadas con TRA-8 o IgG anti-humana. Calle 1: proteína de fusión DR5/hIgG1 (inmunógeno); Calle 2: DR4/hIgG1 (TRAIL-R1); Calle 3: DR5/hIgG1; Calle 4: TRAIL-R3 (DcR-1)/hIgG1; Calle 5: TRAIL-R4 (DcR-2)/hIgG1; Calle 6, CD95/hIgG1; Calle 7: TNFRI soluble. Análisis ELISA (panel inferior): los números de los pocillos corresponden a los de la transferencia de Western excepto el pocillo 8 que es una proteína de fusión DR5/hIgG1 murina. (b.) Actividad de unión de TRAIL soluble y TRA-8 a DR5 y DR4: se recubrieron placas ELISA con DR5/hIgG1 (panel de la izquierda) o DR4/hIgG1 (panel medio) y después se incubaron con TRAIL o TRA-8. (c.) Análisis de citometría de flujo de la expresión de DR5 en la superficie. Células Cos-7 transfectadas con vector de expresión pcDNA3 que contenía el ADNc de DR5 de longitud completa (histograma negro), ADNc de DR4 (histograma blanco, línea continua) o el vector vacío (histograma blanco, línea de trazos). Cuarenta y ocho horas después de la transfección, las células se tiñeron con TRA-8 seguido de IgG1 anti-ratón conjugada con PE. (d.) Reactividad de inmunohistoquímica in situ para DR5: se tiñeron portaobjetos de citocentrifugación de células Cos-7 transfectadas con vector de expresión de DR5 o vector de control con TRA-8 48 horas después de la transfección. (e.) Actividad de destrucción de TRA-8: se incubaron células Jurkat con las concentraciones indicadas de TRA-8. La viabilidad celular se determinó por ensayos ATPLite, MTT y ensayos de exclusión de PI después del cultivo de una noche. Los resultados de los ensayos ATPLite y MTT se presentan como porcentaje de control con medio, y los del ensayo de PI se presentan como el porcentaje de células negativas para PI (f.) Análisis de transferencia de Western de activación por caspasa: se incubaron células Jurkat con 500 ng/ml de TRA-8 durante el tiempo indicado. Los lisados celulares se separaron por SDS-PAGE al 15%, se transfirieron y se sondaron con anticuerpos anti-caspasa. Las flechas indican las subunidades escindidas de cada caspasa. g. Ensayo de inhibición de caspasa: se incubaron células Jurkat con 50 ng/ml de TRA-8 durante una noche en presencia de diversas concentraciones de los inhibidores de caspasa indicados. La viabilidad celular se determinó por el ensayo ATPLite.
Figura 2. Expresión en la superficie celular de DR5 y susceptibilidad a la apoptosis mediada por DR5. Se incubaron células T y B normales, aisladas recientemente a partir de sangre periférica, células T (a y a'), células de glioma (b y b'), células de cáncer de próstata (c) y células B (d) con TRA-8 o anticuerpo de control de isotipo IgG1 murino seguido de IgG1 de cabra anti-ratón conjugada con PE. Los histogramas blancos representan el control de anticuerpo de isotipo mientras que los histogramas negros representan la tinción con TRA-8. La apoptosis se determinó por el ensayo ATPLite después de una incubación de una noche con TRAIL soluble (círculos blancos) o TRA-8 (círculos negros) como se muestra en a, b' y d.
Figura 3a'. La línea de células T U937 se incubó con TRA-8 o anticuerpo de control de isotipo IgG1 murino. La apoptosis se determinó por el ensayo ATPLite después de una incubación de una noche con TRAIL soluble (círculos blancos) o TRA-8 (círculos negros).
Figura 3. Se incubaron líneas celulares de glioma (b) y de cáncer de próstata (c) con TRA-8 o anticuerpo de control de isotipo IgG1 murino. La apoptosis se determinó por el ensayo ATPLite después de una incubación de una noche con TRAIL soluble (círculos blancos) o TRA-8 (círculos negros).
La figura 4 es una serie de gráficos que muestran la viabilidad celular para células Jurkat humanas después de la exposición a las concentraciones indicadas de (A) cepas de anticuerpo TRA-1, -8 y -10 y (B) TRAIL en presencia de una concentración fija de las cepas de anticuerpo de la invención representadas en la figura 4A.
Figura 5. Expresión de DR5 en tejidos normales y cancerosos: se sondaron homogeneizados de tejido normal y canceroso con TRA-8 y se revelaron por quimioluminiscencia. (a.) Análisis de transferencia de Western de proteína DR5 en tejidos normales: calle 1: hígado, calle 2: cerebro, calle 3: pulmón, calle 4: riñón, calle 5: bazo, calle 6: testículos. Calle 7: ovario, calle 8: corazón, calle 9: páncreas. b. Análisis de transferencia de Western de la proteína DR5 en tejidos cancerosos. Se sondó la mancha de tejido canceroso que contenía cánceres de ovario (calle 1), pulmón (calle 2), hígado (calle 3), recto (calle 4), cuello del útero (calle 5), piel (calle 6), testículos (calle 7), tiroides (calle 8), útero (calle 10), estómago (calle 11), laringofaringe (calle 12) y páncreas (calle 13). Inmunohistoquímica in situ de tejidos humanos normales (c.) y de tejidos cancerosos (d.). Las secciones congeladas se inmunotiñeron con TRA-8.
Figura 6. Actividad tumoricida de TRA-8. En ratones SCID se inocularon por vía subcutánea células 1321N1. En los ratones se inyectó por vía intravenosa una sola dosis de 100 \mug de TRA-8 el segundo día después de la inoculación del tumor (a.) o tres dosis de 100 \mug de TRA-8 empezando 7 días después de la inoculación del tumor (b.) El crecimiento tumoral se determinó por el peso y se examinó histológicamente con tinción con H y E. Las fotografías muestran el crecimiento tumoral viable en ratones de control pero no en ratones tratados con TRA-8 (c., panel superior), y la tinción con H y E del tumor (c., panel inferior). En ratones SCID se inyectaron por vía intravenosa 10^{6} células Jurkat y se trataron con una sola dosis de TRA-8 el segundo día después de la inyección. Siete días después, se recogieron células de bazo, se tiñeron con anticuerpo anti-CD3 humano y se analizaron por citometría de flujo (d.) o por inmunohistoquímica (e).
La figura 7 muestra la expresión de DR5 de la superficie celular en células sinoviales de RA (A) y OA (B). 1 x 10^{6} células sinoviales de cultivo primario se tiñeron con TRA-8 purificado por afinidad seguido de anticuerpo IgG1 de cabra anti-ratón conjugado con PE. Se analizaron 10.000 células viables por FACSvantage.
La figura 8 es una serie de gráficos que muestran la viabilidad celular en función de la apoptosis inducida por TRAIL y por la concentración de TRA-8 de cepas representativas de células sinoviales de RA (A) y OA (B) con diversas concentraciones de TRAIL soluble recombinante (los círculos blancos) o TRA-8 purificado por afinidad (los círculos negros). La viabilidad celular es el porcentaje de las cpm de células tratadas frente a las cpm de células no tratadas.
La figura 9 es una serie de gráficos que muestran la dependencia de caspasa de la apoptosis mediada por DR5 de células sinoviales de RA. Se incuban células sinoviales de RA (RA512) con 50 ng/ml de ligando de Fas soluble (cuadrados blancos), anticuerpo anti-Fas (CH-11) (cuadrados negros), TRAIL soluble (círculos blancos) o anticuerpo anti-DR5 (TRA-8) (círculos negros) en presencia de concentraciones variables de inhibidores de caspasa. Después de un cultivo de una noche, se determina la viabilidad celular por ATPLite.
La figura 10A es un ensayo de desplazamiento en gel electroforético que indica la activación de NF\kappab. Se incuban células RA1016 con 20 ng/ml de TNF-a, 50 ng/ml de TRAIL soluble o 50 ng/ml de TRA-8 en los puntos de tiempo indicados antes de someterse a electroforesis. Las figuras 10B y C son gráficos que muestran la producción de MMP-1 y MMP-3. Se incuban 1 x 10^{6}/ml de las células sinoviales de RA indicadas con las concentraciones indicadas de TNF-a (los círculos blancos), TRAIL (los triángulos blancos) o TRA-8 (el círculo negro). Después de un cultivo de una noche, se recogen los sobrenadantes de cultivo. Los niveles de MMP en los sobrenadantes de cultivo se determinan por ELISA.
Figura 11. TRA-8 no induce la toxicidad hepatocelular. (a.) Los tejidos hepáticos normales no expresan DR5. Se prepararon las secciones en parafina de dos tejidos hepáticos normales, un tejido de carcinoma hepatocelular y la preparación de citocentrifugación de células HepG2 para la tinción con H y E y se tiñeron secciones congeladas correspondientes con TRA-8. (b.) Análisis de citometría de flujo de la expresión en la superficie celular de DR5. Se tiñeron hepatocitos, aislados a partir de dos tejidos hepáticos normales y de un caso de tejido de carcinoma hepatocelular, y células HepG2 con TRA-8, anticuerpo anti-Fas (DX2) o un anticuerpo de control de isotipo. Los histogramas negros indican la tinción con TRA-8 o DX2 y los histogramas blancos son los controles de isotipo correspondientes.
Figura 12. TRAIL pero no TRA-8 induce toxicidad hepatocelular. Se mantuvieron hepatocitos humanos normales recientes en medio de cultivo de hepatocitos. (a.) Se indujo apoptosis de los hepatocitos con 1 \mug/ml de TRAIL soluble más agente de entrecruzamiento o TRA-8 en los puntos de tiempo indicados. La viabilidad celular se determinó por ATPLite. Los resultados se presentan como porcentaje de células viables en comparación con el control con medio. Las barras sombreadas indican TRAIL y las barras negras indican TRA-8. (b.) Los núcleos condensados de los hepatocitos se tiñeron con Hoechst 33352 y se analizaron por citometría de flujo. (c.) Efecto de cicloheximida sobre la apoptosis de los hepatocitos. Se cultivaron hepatocitos en medio de control o con 1 \mug/ml de TRAIL o TRA-8 en presencia (barras negras) o ausencia (barras blancas) de 1 \mug/ml de cicloheximida durante 8 horas. La viabilidad celular se determinó por ATPLite. Los resultados se presentan como media\pmSEM de cultivos por triplicado de dos experimentos. d. Una comparación de la susceptibilidad de los hepatocitos normales a la apoptosis mediada por DR5 y por Fas. Se incubaron hepatocitos aislados recientemente con las concentraciones indicadas de TRAIL soluble, TRA-8, FasL soluble o el mAb anti-Fas CH11 durante 6 horas. La viabilidad celular se determinó por el ensayo ATPLite. Los resultados se presentan como el porcentaje de células viables en comparación con el control con medio. Para los hepatocitos normales, se presenta la media\pmSEM de cuatro individuos normales. Los resultados de las células de carcinoma hepatocelular de un paciente y las células HepG2 se presentan como la media de cultivos por triplicado.
Figura 13. TRAIL induce la hepatitis. Se inocularon en ratones B6 por vía intravenosa 10^{9} pfu de vector adenoviral que codificaba el TRAIL humano de longitud completa bajo el control del elemento de la transcripción "Tet-on". La expresión de TRAIL se indujo por la dosis indicada de tetraciclina. (a.) Análisis de transferencia de Northern de la expresión de TRAIL humano en el hígado. 24 horas después de la inoculación del vector y la inducción con tetraciclina, se aisló el ARN total de los hígados y se sondó con ADNc de TRAIL humano o \beta-actina. (b.) Niveles séricos de AST. 24 horas después de la transducción de TRAIL, se determinaron los niveles séricos de AST. (c.) Muerte celular mediada por TRAIL de hepatocitos infectados con vector adenoviral: en ratones B6 se inoculó por vía intravenosa el vector adenoviral inducible por tetraciclina. 48 horas después de la inoculación, se aislaron hepatocitos de ratones de control inoculados y no inoculados y se incubaron con las concentraciones indicadas de TRAIL durante 8 horas (panel de la izquierda). La viabilidad celular de los hepatocitos se determinó por el ensayo ATPLite. En ratones, en los que se había inoculado el vector adenoviral como se ha indicado anteriormente, se inyectaron por vía intravenosa 10 \mug de TRAIL humano soluble 48 horas después. Los niveles séricos de AST se midieron 24 horas después de la inyección de TRAIL (panel de la derecha). (d. y e.) Análisis histológico de lesión hepática inducida por TRAIL. Los hígados se recogieron 24 horas (d.) o 7 días (e.) después de la transducción con TRAIL. Las secciones de parafina se tiñeron con H y E y se fotografiaron a 100 aumentos (panel superior) y 400 aumentos (panel inferior).
La figura 14 es una serie de gráficos que demuestran que las células T y células B activadas purificadas a partir de PBMC humanas expresan mayores niveles de DR5 que los determinados por citometría de flujo para células en reposo (no rellenas) y activadas (sombreadas).
La figura 15 presenta gráficos de viabilidad en función de la concentración de TRA-8 para las células T y células B purificadas representadas en la figura 14 que se han estimulado durante 48 horas con anti-CD3 o anti-\mu, con células activadas e inmaduras recogidas por diferente densidad de Ficoll-Paque. La viabilidad se determina por el ensayo ATPLite.
La figura 16 es un histograma y gráficos de citometría de flujo que muestran la expresión de CD3 en una población de linfocitos seleccionada como ventana de exploración para ratones NOD/SCID de los que se han eliminado células NK y en los que se ha inyectado PBMC humanas y TRA-8 o IgG (control).
La figura 17 muestra micrografías celulares teñidas con CD3 y TUNEL para tejido de bazo de ratón como se detalla en el ejemplo 13.
La figura 18 muestra gráficos de citotoxicidad para leucemia linfolítica crónica (CCL) y seres humanos con células B normales en presencia de TRA-8, BISVIII y las combinaciones de los mismos.
Descripción detallada de la invención
La incapacidad de eliminar células se debe a defectos en el sistema inductor de apoptosis que están asociados con defectos que incluyen ilustrativamente la expresión o función del ligando, el receptor o las moléculas efectoras y reguladoras intracelulares. La presente invención proporciona medios que pueden usarse en un método para corregir un sistema inductor de apoptosis deficiente así como esclarecer los defectos específicos intrínsecos en un sistema inductor de la apoptosis defectuoso dado.
La presente invención se refiere a anticuerpos como se definen en la reivindicación 1 que tienen actividad inductora de la apoptosis selectiva in vivo e in vitro contra DR5. La presente invención tiene utilidad como reactivo para la investigación de la señalización de la apoptosis, y como un agente terapéutico eficaz contra células que expresan receptores de TRAIL incluyendo ilustrativamente amplias clases de células cancerosas, una mala regulación del sistema de apoptosis y células sinoviales de proliferación anómala de enfermedades autoinmunes. Los anticuerpos de acuerdo con la presente invención son específicos en la unión a un receptor de TRAIL particular. Los anticuerpos de la invención producen una apoptosis dirigida de únicamente las células que expresan un receptor de TRAIL diana.
Un anticuerpo monoclonal anti-DR5 de la presente invención sirve como potente inductor de la apoptosis en células que expresan DR5 in vitro y como potente inductor de la apoptosis in vivo. Las secuencias de CDR fragmentarias humanizadas injertadas en esqueletos de anticuerpos humanizados y anticuerpos anti-DR5 de proteínas de fusión de la presente invención presentan propiedades apoptóticas similares.
Hasta la fecha no se dispone de ningún anticuerpo monoclonal que se una a DR5 de la superficie celular e induzca apoptosis de células que expresan DR5 tanto in vitro como in vivo en ausencia de un agente de entrecruzamiento. La presente invención incluye un anticuerpo anti-DR5 operativo como agente terapéutico en modelos animales de enfermedad, tales como animales con xenoinjertos, o in vivo. Aunque se ha demostrado que TRAIL soluble es eficaz en la inducción de la apoptosis de células tumorales in vivo, la actividad destructora parecía ser muy baja requiriéndose con frecuencia dosis grandes y repetidas (13). TRA-8, uno de una serie de anticuerpos anti-DR5 de acuerdo con la presente invención, es farmacéuticamente eficaz en animales que llevan un transgén de DR5 humano y también tiene utilidad para establecer un modelo para la investigación del papel de DR5 y TRAIL.
Un anticuerpo de acuerdo con la presente invención inducido contra un receptor de TRAIL se recoge de acuerdo con la presente invención a partir de un animal experimental. Por medio de la humanización del anticuerpo de acuerdo con la presente invención para mantener la actividad de unión al receptor mientras se induce una respuesta inmune disminuida y terapéuticamente tolerable dentro de un sujeto humano, se usa un anticuerpo anti-receptor de TRAIL humanizado de acuerdo con la presente invención como agonista terapéutico. La presente invención es operativa como terapia in vivo ya que no se necesita entrecruzamiento secundario del anticuerpo anti-receptor de TRAIL.
La presente invención se extiende más allá de un solo anticuerpo anti-receptor de TRAIL que tiene efectos agonistas apoptóticos. En su lugar, dos o más anticuerpos anti-receptor de TRAIL se ponen en contacto con un cultivo celular in vitro o un tejido corporal del sujeto in vivo para crear un tratamiento sinérgico. Por ejemplo, la línea celular de glioma U87 y las líneas celulares hematopoyéticas U937 y Molt-4 responden a la exposición sinérgica a anticuerpos agonistas anti-DR4 y anti-DR5 mientras que la exposición al anticuerpo agonista anti-DR5 solo muestra únicamente un éxito limitado para inducir la apoptosis.
Además, los anticuerpos antagonistas anti-receptor de TRAIL tienen utilidad particular cuando un anticuerpo es específico para la unión a uno de los receptores de reclamo DcR1, DcR2 u OPG. El bloqueo selectivo de un receptor de reclamo en tipos celulares que expresan receptores de reclamo tiene el efecto de desplazar el equilibrio de unión de TRAIL hacia los receptores de TRAIL capaces de transducir la señal de apoptosis. De esta manera, en una terapia combinada, un anticuerpo de unión a un receptor de reclamo sensibiliza a una célula de expresión hacia la unión al receptor de TRAIL que transduce señales de apoptosis agonistas.
En otra realización, el anticuerpo de la presente invención puede usarse en un método para esclarecer epítopos agonistas y antagonistas de un receptor de TRAIL dado. Además, se esclarecen polimorfismos entre individuos asociados con un receptor de TRAIL dado por medio del uso de un panel de anticuerpos monoclonales que tienen cada uno una región variable o CDR diferente. Un panel caracterizado de anticuerpos monoclonales proporciona la capacidad de definir epítopos agonistas y antagonistas y polimorfismos. De esta manera, un panel de anticuerpos monoclonales tiene utilidad en el descubrimiento de fármacos y/o la exploración en sujetos de la predisposición a ciertas enfermedades.
Se describen proteínas de fusión que incluyen un fragmento antigénico de un receptor de TRAIL acoplado a una proteína inmunoglobulina, polipéptido o fragmento de la misma. Un fragmento de receptor de TRAIL se define como un fragmento que contiene un número suficiente de bases para inducir una respuesta inmunogénica contra un receptor de TRAIL nativo expresado en la superficie de una célula del sujeto. Una proteína de fusión de inmunoglobulina o fragmento de la misma se define en este documento como una proteína que incluye una proteína nativa o sintética o un segmento polipeptídico que tiene un número de bases de aminoácidos suficiente para activar una respuesta de cascada inmunogénica dentro de un sujeto.
Los anticuerpos de la presente invención también son operativos junto con un sensibilizador. Un sensibilizador, como se usa en este documento, se define como una entidad que incluye cualquier estímulo que induce la apoptosis incluyendo luz ultravioleta, moléculas orgánicas que incluyen específicamente la clase de bisindolmaleimidas, metales pesados y especies de radicales libres.
En el contexto de una terapia para malignidades, TRA-8 puede inducir la apoptosis de la mayoría de las células tumorales sensibles a TRAIL de una forma dependiente de caspasa en ausencia del entrecruzamiento secundario. TRA-8 presenta una fuerte actividad tumoricida in vivo. La capacidad de TRA-8 de inducir la apoptosis de la mayoría de las células sensibles a TRAIL confirma que DR5 solo es suficiente para inducir la apoptosis. La mayoría de las células tumorales detalladas en este documento expresan DR5 en la superficie celular y su susceptibilidad a la muerte celular inducida por TRA-8 se corresponde con su susceptibilidad a TRAIL, lo cual indica que DR5 es un receptor de muerte importante para la apoptosis mediada por TRAIL en la mayoría de las células tumorales. De esta manera, la expresión diferencial de DR5 por células normales y cancerosas es operativa en la selectividad de la apoptosis mediada por TRAIL. TRA-8 evita los receptores de reclamo para inducir la apoptosis mediada por TRAIL. Sin embargo, sólo una pequeña cantidad de células tumorales resistentes a TRAIL son sensibles a TRA-8, lo cual indica que los receptores de reclamo no parecen desempeñar un papel importante en la resistencia de las células tumorales a la apoptosis mediada por TRAIL.
Aunque los estudios anteriores han indicado que la administración sistémica de la forma soluble de TRAIL en animales induce regresión tumoral sin producir toxicidad^{3,4,22}, la forma unida a la membrana de TRAIL humano induce lesiones hepáticas en ratones como se muestra en este documento. Sin embargo, la toxicidad hepática de TRAIL es mucho menos potente que la del ligando de Fas como se demuestra por la menor susceptibilidad de los hepatocitos normales a las lesiones inducidas por TRAIL en comparación con el ligando de Fas y por la ausencia de letalidad de TRAIL in vivo. De esta manera, la titulación de TRAIL tiene utilidad en la terapia contra el cáncer.
Como se detalla en este documento, se demuestra la ausencia de niveles significativos de expresión de la proteína DR5 por hepatocitos normales y está asociada con resistencia de los hepatocitos a la apoptosis inducida por TRA-8. El entrecruzamiento de DR5 con anticuerpo monoclonal es insuficiente para organizar las formas homopoliméricas del receptor de muerte capaz de inducir la apoptosis. Los experimentos en titíes indican la ausencia de indicios de toxicidad hepática tras la administración de TRA-8. De esta manera, probablemente un anticuerpo monoclonal agonista anti-DR5 es más selectivo y más seguro que TRAIL soluble como agente terapéutico.
En un ensayo de selección, los anticuerpos de la presente invención son adecuados para detectar pequeños grupos de células malignas que pueden presentar morfología celular normal. La tinción de secciones celulares in situ de células de cánceres humanos incluyendo cánceres de pulmón, próstata e hígado con anticuerpos marcados de acuerdo con la presente invención identifica fácilmente células cancerosas. Estas células cancerosas, según se observa, expresan niveles muy elevados de DR5 en comparación con las células normales del mismo tipo. De esta manera, la presente invención tiene utilidad como método de exploración sensible de malignidades en sus primeras fases dentro de tejidos que incluyen al menos tejido pulmonar, de próstata y hepático. En el presente documento se detalla un proceso terapéutico para la inhibición de la proliferación anómala de células asociada con enfermedades que incluyen ilustrativamente cánceres malignos y leucemias linfáticas.
La presente invención se detalla en este documento haciendo referencia particularmente a un anticuerpo monoclonal anti-DR5 humano denominado TRA-8, que tiene el número de acceso ATCC PTA-1428.
Los niveles de expresión de un receptor de apoptosis tal como Fas no se correlacionan necesariamente con la susceptibilidad de las células a la apoptosis. Para la apoptosis mediada por TRAIL se ha sugerido que la expresión de los receptores de reclamo para TRAIL influye en la susceptibilidad de las células. Además, se ha sugerido que DR5 debe asociarse con DR4 para una transducción eficaz de la señal de apoptosis a través de FADD y la ruta de la caspasa 8. La disponibilidad del anticuerpo monoclonal agonista anti-DR5 permitió la evaluación de la regulación de la señalización de DR5 y su papel relativo en la apoptosis mediada por TRAIL. La comparación de la susceptibilidad de las células a la apoptosis mediada por TRA-8 con su susceptibilidad a la apoptosis mediada por TRAIL ofrece una perspectiva del papel de DR5 en la apoptosis mediada por TRAIL y los mecanismos que pueden afectar a la susceptibilidad.
Esta ventaja se extiende generalmente a los anticuerpos anti-DR5 humanizados de la presente invención. Un clon monoclonal de un anticuerpo contra DR5 se prepara por técnicas conocidas como se detalla con respecto a los siguientes ejemplos. La metodología de ADN recombinante (33) es operativa en este documento para construir secuencias de ácido nucleico que codifican una molécula de anticuerpo monoclonal o región de unión a antígeno de la misma.
La presente invención permite la construcción de anticuerpos anti-receptor de TRAIL humanizados con poca probabilidad de inducir una respuesta de anticuerpos humanos anti-ratón (denominados en lo sucesivo "HAMA") (34), teniendo también una función efectora de anticuerpos eficaz. Como se usa en este documento, los términos "humano" y "humanizado" en relación con anticuerpos, se refieren a cualquier anticuerpo que es de esperar que induzca una respuesta inmunogénica débil terapéuticamente tolerable en un sujeto humano.
La presente invención proporciona un anticuerpo anti-DR5, un anticuerpo anti-DR5 humanizado, inmunoglobulinas de cadena pesada y ligera de TRA-8 e inmunoglobulinas de cadena pesada y ligera humanizadas. Ciertos truncamientos de estas proteínas o genes realizan las funciones reguladoras o enzimáticas de la proteína o gen de secuencia completa. Por ejemplo, las secuencias de ácido nucleico que codifican estas proteínas pueden alterarse por sustituciones, adiciones, deleciones o expresión multimérica proporcionando proteínas o genes funcionalmente equivalentes. Debido a la degeneración de las secuencias codificantes de ácidos nucleicos, en la práctica de la presente invención pueden usarse otras secuencias que codifican sustancialmente las mismas secuencias de aminoácidos que las de las proteínas naturales. Éstas incluyen, pero sin limitación, secuencias de ácido nucleico que incluyen todo o parte de las secuencias de ácido nucleico que codifican los polipéptidos anteriores, que están alteradas por la sustitución de codones diferentes que codifican un resto aminoacídico funcionalmente equivalente dentro de la secuencia, produciendo de esta manera un cambio silencioso. Se aprecia que la secuencia de nucleótidos de una inmunoglobulina de acuerdo con la presente invención tolera variaciones de homología de secuencia de hasta un 25% calculadas por métodos convencionales ("Current Methods in Sequence Comparison and Analysis", Macromolecule Sequencing and Synthesis, Selected Methods and Applications, páginas. 127-149, 1998, Alan R. Liss, Inc.) siempre que estas formas variantes proporcionen un anticuerpo operativo que reconozca un receptor de TRAIL DR5. Por ejemplo, uno o más restos aminoacídicos dentro de una secuencia polipeptídica pueden sustituirse por otro aminoácido de polaridad similar que actúa como equivalente funcional, dando como resultado una alteración silenciosa. Los sustitutos de un aminoácido dentro de la secuencia pueden seleccionarse entre otros miembros de la clase a la que pertenece el aminoácido. Por ejemplo, los aminoácidos no polares (hidrófobos) incluyen alanina, leucina, isoleucina, valina, prolina, fenilalanina, triptófano y metionina. Los aminoácidos neutros polares incluyen glicina, serina, treonina, cisteína, tirosina, asparagina y glutamina. Los aminoácidos cargados positivamente (básicos) incluyen arginina, lisina e histidina. Los aminoácidos cargados negativamente (ácidos) incluyen ácido aspártico y ácido glutámico. Dentro del alcance de la presente invención también se incluyen proteínas o fragmentos o derivados de las mismas que se modifican de forma diferente durante o después de la traducción, por ejemplo, por glicosilación, escisión proteolítica, unión a una molécula de anticuerpo u otros ligandos celulares, etc. Además, las secuencias de ácido nucleico que codifican vectores recombinantes de los anticuerpos anti-DR5 de la presente invención pueden modificarse por ingeniería genética para modificar el procesamiento o expresión de un vector.
Además, una secuencia de ácido nucleico codificante de un inhibidor puede mutarse in vitro o in vivo para crear y/o destruir secuencias de traducción, iniciación y/o terminación o para crear variaciones en regiones codificantes y/o formar nuevos sitios de endonucleasas de restricción o destruir los preexistentes, para facilitar adicionalmente la modificación in vitro. Puede usarse cualquier técnica para mutagénesis conocida en este campo incluyendo, pero sin limitación, mutagénesis dirigida in vitro, J. Biol. Chem. 253:6551, uso de enlazadores Tab (Pharmacia) y similares.
Los datos de cristalografía de rayos X indican que el plegamiento del anticuerpo inmunoglobulina generalmente forma una estructura cilíndrica larga que comprende dos capas de láminas b antiparalelas, consistiendo cada una de ellas en tres o cuatro cadenas b. En una región variable, tres bucles de cada uno de los dominios V de las cadenas H y L se agrupan entre si para formar un sitio de unión a antígeno. Cada uno de estos bucles se denomina región determinante de complementariedad (CDR). Las CDR tienen la máxima variabilidad en secuencia de aminoácidos con el anticuerpo. Las partes de la región variable que no forman parte de una CDR se denominan "regiones flanqueantes" (regiones "FR") y generalmente intervienen en el mantenimiento de la estructura de la CDR. Preferiblemente todas las CDR procedentes de un anticuerpo dado se injertan en un anticuerpo aceptor para conservar la región de unión para la región del epítopo del receptor de TRAIL. Se aprecia que en la presente invención es operativo el injerto de una parte de la cantidad total de CDR en un donante. Se entiende que el injerto generalmente incluye el reemplazo, resto por resto, de un aminoácido o región por otra. Sin embargo, ocasionalmente, especialmente con la transferencia de una región, un resto puede añadirse, omitirse o sustituirse, cuando se desee, y estas deleciones e inserciones, así como los reemplazos e inversiones apropiados, están dentro del alcance de los especialistas en la técnica.
Un anticuerpo de la presente invención se obtiene, por ejemplo, injertando cada CDR de subunidad de cadena L y cadena H de un anticuerpo monoclonal anti-receptor de TRAIL en una región CDR correspondiente de un anticuerpo humano, humanizando de esta manera un anticuerpo monoclonal de ratón eficaz contra un receptor de TRAIL.
También se generan y son operativos en la presente invención usando técnicas conocidas fragmentos de anticuerpos que contienen el idiotipo de la molécula. Por ejemplo, estos fragmentos incluyen ilustrativamente el fragmento anti-receptor de TRAIL (AB')2 que puede producirse con digestión con pepsina de la molécula de anticuerpo, los fragmentos AB' del anticuerpo del receptor de TRAIL generados por medio de reducción de los enlaces disulfuro del fragmento del receptor de TRAIL (AB')2 y el fragmento de anticuerpo que se genera tratando la molécula de anticuerpo con papaína y un agente reductor.
En particular, el anticuerpo monoclonal anti-DR5 TRA-8 puede obtenerse cultivando un hibridoma.
La preparación de un anticuerpo monoclonal implica ilustrativamente las siguientes etapas:
a)
purificación de una biomacromolécula para uso como un antígeno;
b)
preparación de células productoras de anticuerpo, después de la primera inmunización de un animal usando inyecciones del antígeno, extracción de sangre del animal y ensayo del título de anticuerpos, para determinar cuando extraer el bazo;
c)
preparación de células de mieloma;
d)
fusión de las células productoras de anticuerpo y de células de mieloma;
e)
selección de un hibridoma que produzca un anticuerpo deseado;
f)
preparación de un clon de una sola célula (clonación);
g)
opcionalmente, cultivo de las células de hibridoma, o desarrollo de animales en los que se han trasplantado las células de hibridoma, para la preparación a gran escala del anticuerpo monoclonal; y
h)
ensayo de las actividades biológicas y la especificidad o análisis de propiedades de agentes marcadores, del anticuerpo monoclonal preparado de esta manera.
El procedimiento para la preparación de un anticuerpo monoclonal anti-DR5 se detalla más adelante haciendo referencia a las etapas descritas anteriormente.
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(a) Preparación de antígeno
Se obtiene una proteína recombinante (denominada en lo sucesivo "DR5 humano recombinante"), eficaz como antígeno, transfectando células QBI-293A con el vector de expresión pAdDR5-IgG para una proteína de fusión que comprende el dominio extracelular de DR5 humano y la región Fc del anticuerpo IgG1 humano (denominado en lo sucesivo "IgG"), (véase PTA-1428) para expresarlo usando el kit ADENO-Quest (Quantum Biotechnologies Inc., Canadá) y recogiendo y purificando parcialmente el producto de expresión. El plásmido pAdDR5-IgG se construye insertando ADN que codifica una proteína de fusión de DR5 humano e IgG humana en pAdCMV5, que es un vector de expresión para células animales. En la presente invención son operativos otros materiales tales como el ADN que codifica DR5, el vector y el hospedador.
La proteína de fusión de DR5 e IgG humana producida en el sobrenadante de cultivo de las células QBI-293A transfectadas con el vector pAdDR5-IgG pueden purificarse parcialmente por cromatografía de afinidad en proteína A-Sepharose o cromatografía de afinidad en proteína G-Sepharose, o cromatografía de intercambio iónico usando una columna Resource Q (nombre comercial; Pharmacia).
Como alternativa, como antígeno se usa el DR5 purificado obtenido a partir de las membranas celulares de líneas celulares humanas. Además, como se conoce la estructura primaria de DR5 (véase PTA-1428), puede sintetizarse químicamente un péptido que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº: 1, por un método conocido tal como el método de Sanger, y usarse como antígeno.
(b) Preparación de células productoras de anticuerpo
Se inmuniza a un ratón con el inmunógeno producido en la etapa (a), mezclado con un adyuvante, tal como adyuvante completo o incompleto de Freund o alumbre. Otros animales experimentales adecuados incluyen ilustrativamente ratas, cobayas, conejos, perros, pollos, caballos, cerdos, vacas y ovejas.
Las vías de administración adecuadas para inmunizar a un animal experimental incluyen la vía subcutánea, intraperitoneal, intravenosa, intradérmica e intramuscular, siendo preferidas las inyecciones subcutáneas e intraperitoneales.
Las inmunizaciones opcionalmente se realizan por medio de una sola dosis o por varias dosis repetidas a intervalos apropiados (preferiblemente de 1 a 5 semanas). En los animales inmunizados se controla el título de anticuerpos en sus sueros, y se selecciona un animal con un título de anticuerpos suficientemente elevado como fuente de células productoras de anticuerpo. La selección de un animal con un título elevado hace que sea más eficaz el proceso posterior. Generalmente, se recogen células para la fusión posterior a partir del animal de 3 a 5 días después de la inmunización final.
Los métodos para ensayar el título de anticuerpos incluyen diversas técnicas bien conocidas tales como radioinmunoensayo (denominado en lo sucesivo "RIA"), inmunoensayo enzimático en fase sólida (denominado en lo sucesivo "ELISA"), ensayo de anticuerpos fluorescente y ensayo de hemaglutinación pasiva, siendo preferidos el RIA y el ELISA por razones de sensibilidad de detección, rapidez, precisión y posibilidad de automatización.
La determinación del título de anticuerpos puede realizarse, por ejemplo, por ELISA como se indica a continuación. En primer lugar, se adsorbe DR5 purificado o parcialmente purificado en la superficie de una fase sólida, tal como una placa ELISA de 96 pocillos, seguido de bloqueo de cualquier superficie que quede, a la que no se ha unido DR5, con una proteína no relacionada con el antígeno, tal como albúmina de suero bovino (BSA). Después del lavado, las superficies de los pocillos se ponen en contacto con muestras diluidas en serie de sueros de ratón para permitir la unión del anticuerpo anti-DR5 presente en las muestras al antígeno. Se añade un anticuerpo anti-ratón marcado con enzimas como anticuerpo secundario para unirse al anticuerpo de ratón. Después del lavado, se añade el sustrato enzimático y se estima el título de anticuerpo determinando el cambio de absorbancia debido al desarrollo de color causado por la alteración del sustrato o similar.
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(c) Preparación de células de mieloma
Células procedentes de líneas celulares de ratón establecidas sirven como fuente de células de mieloma, incluyendo por ejemplo ratón resistente a 8-azaguanina, derivado de cepas de mieloma BALB/c P3X63Ag8U.1 (P3-U1) (35), P3/NSI/1-Ag4-1 (NS-1) (36). Sp2/0-Ag14 (SP-2) (37), P3X63Ag8.653 (653) (38) y P3X63Ag8 (X63) (39). La línea celular seleccionada se transfiere en serie a un medio apropiado, tal como medio de 8-azaguanina. El medio de 8-azaguanina incluye medio de Dulbecco modificado por Iscove (denominado en lo sucesivo "IMDM") o medio de Eagle modificado por Dulbecco (denominado en lo sucesivo "DMEM"), medio RPMI-1640 suplementado con glutamina, 2-mercaptoetanol, gentamicina, suero bovino fetal (denominado en lo sucesivo "FCS") y 8-azaguanina. Después, las células se transfieren a un medio normal tal como medio ASF104 (Ajinomoto, K. K.) que contiene FCS al 10% de 3 a 4 días antes de la fusión, para asegurar que se dispone de al menos 2x10^{7} células el día de la fusión.
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(d) Fusión de células
Los linfocitos y las células plasmáticas obtenidas de cualquier parte adecuada del animal son células precursoras para producir el anticuerpo. Las fuentes de linfocitos o células plasmáticas incluyen ilustrativamente bazo, ganglios linfáticos, sangre periférica o cualquier combinación apropiada de los mismos, siendo las células del bazo la fuente más común.
Después de la última inyección de refuerzo, se retira el tejido en el que están presentes células productoras de anticuerpo de un ratón que tiene el título de anticuerpos predeterminado. La técnica preferida actualmente para la fusión de células de bazo con células de mieloma preparadas en la etapa (c) emplea polietilenglicol.
La técnica de fusión incluye lavar las células de bazo y de mieloma con medio sin suero (tal como RPMI 1640) o solución salina tamponada con fosfato (denominada en lo sucesivo "PBS") de forma que la relación en número entre células de bazo y células de mieloma esté comprendida entre aproximadamente 5:1 y 10:1, y después centrifugar. Después de haber desechado el sobrenadante y de haber soltado suficientemente las células sedimentadas, se añade gota a gota con mezcla 1 ml de medio sin suero que contiene un 50% (p/v) de polietilenglicol (p.m. de 1.000 a 4.000). Posteriormente, se añaden lentamente 10 ml de medio sin suero y después se centrifuga. El sobrenadante se desecha de nuevo y las células sedimentadas se suspenden en una cantidad apropiada de medio HAT que contiene una solución de hipoxantina, aminopterina y timidina (denominada en lo sucesivo "HAT") e interleuquina-2 de ratón (denominada en lo sucesivo "IL-2"). Después, la suspensión se distribuye en los pocillos de placas de cultivo (que también se denominan en este documento simplemente "placas") y se incuban en presencia de un 5% v/v de CO_{2} a 37ºC durante aproximadamente 2 semanas, con la adición suplementaria de medio HAT cuando sea apropiado.
(e) Selección de hibridomas
Cuando la cepa de mieloma usada es resistente a 8-azaguanina, es decir, es deficiente en la enzima hipoxantina guanina fosforribosil transferasa (HGPRT), cualquier célula de mieloma no fusionada y cualquier fusión de mieloma-mieloma no puede sobrevivir en el medio HAT. Por otra parte, pueden sobrevivir fusiones de células productoras de anticuerpo entre sí, así como hibridomas de células productoras de anticuerpo con células de mieloma, teniendo las primeras únicamente una vida limitada. Por consiguiente, una incubación continuada en medio HAT produce una selección de únicamente los hibridomas deseados.
Los hibridomas resultantes crecen en colonias que después se transfieren a medio HAT que carece de aminopterina (medio HT). Posteriormente, se extraen alícuotas del sobrenadante de cultivo para determinar el título de anticuerpo anti-Fas, por ejemplo, por ELISA. Cuando como antígeno del ELISA se usa la proteína de fusión mencionada anteriormente, también es necesario eliminar clones productores de un anticuerpo que se une específicamente a la región Fc de IgG1 humana. La presencia o ausencia de dicho clon puede verificarse, por ejemplo, por ELISA usando IgG1 o Fas-IgG1 como antígeno.
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(f) Clonación
Los hibridomas que se ha demostrado que producen anticuerpos específicos, usando un método similar al descrito en la etapa b) para determinar el título de anticuerpo, se transfieren posteriormente a otra placa para la clonación. Los métodos de clonación adecuados incluyen: el método de dilución limitante en el que se diluyen hibridomas para contener una célula por pocillo de una placa y después se cultivan; el método de agar blando en el que se recuperan colonias después del cultivo en medio de agar blando; un método para usar un micromanipulador para separar una sola célula para el cultivo; y "separación de un clon" en el que se separan células individuales por un separador de
células.
El procedimiento de clonación de acuerdo con, por ejemplo, el método de dilución limitante se repite de 2 a 4 veces para cada pocillo que demuestra un título de anticuerpo, y se seleccionan los clones que tienen títulos de anticuerpo estables como hibridomas productores de anticuerpo monoclonal anti-DR5. Los hibridomas productores de un anticuerpo anti-DR5 de ratón se seleccionan por un método similar para obtener una línea celular productora de anticuerpo monoclonal anti-DR5.
El TRA-8 de hibridoma de ratón-ratón que constituye la base de los anticuerpos de la presente invención se depositó en la colección americana de cultivos tipo el 1 de marzo de 2000 y tiene el número de acceso PTA-1428. Por consiguiente, cuando se prepara un anticuerpo usando el TRA-8 de hibridoma de ratón-ratón, la preparación puede realizarse siguiendo un procedimiento que empieza en la etapa (g) indicada a continuación, omitiéndose las etapas (a) a (f).
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(g) Cultivo de hibridoma para preparar anticuerpo monoclonal
El hibridoma obtenido por la clonación después se cultiva en medio normal, no en medio HT. Se realiza un cultivo a gran escala por cultivo en frascos rotatorios, usando frascos de cultivo grandes, o por cultivo con agitación centrífuga. El sobrenadante del cultivo a gran escala después se recoge y se purifica por un método adecuado, tal como exclusión molecular, que es bien conocido por los especialistas en la técnica, para obtener un anticuerpo monoclonal anti-DR5 que constituye la base para los anticuerpos de la presente invención. El hibridoma también puede desarrollarse por vía intraperitoneal en un ratón singénico, tal como un ratón BALB/c o un ratón nu/nu, para obtener líquido ascítico que contiene un anticuerpo monoclonal anti-DR5 en grandes cantidades. Para purificar los anticuerpos recogidos se usan convenientemente kits de purificación de anticuerpos monoclonales disponibles en el mercado (por ejemplo el kit MAbTrap GII; Pharmacia).
Los anticuerpos monoclonales preparados como se ha indicado anteriormente tienen una alta especificidad por el DR5 humano.
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(h) Ensayo de anticuerpo monoclonal
Los métodos de identificación adecuados del isotipo y las subclases del anticuerpo monoclonal incluyen el método Ouchterlony, ELISA y RIA. Preferiblemente se usa un kit comercial para la identificación, tal como el kit Mouse Typer (nombre comercial; BioRad).
La cuantificación de la proteína puede realizarse por el método de Folin-Lowry, o por cálculo basándose en la absorbancia a 280 nm (1,4 (DO280) = inmunoglobulina a 1 mg/ml).
La identificación del epítopo que reconoce el anticuerpo monoclonal se realiza como se indica a continuación. En primer lugar, se preparan diversas estructuras parciales de la molécula que reconoce el anticuerpo monoclonal. Las estructuras parciales se preparan por el método en el que se preparan de forma sintética diversos péptidos parciales de la molécula por medio de una técnica de síntesis de oligopéptidos conocida, o el método en el que un ADN que codifica el polipéptido parcial deseado se incorpora en un plásmido de expresión adecuado y se expresa en un hospedador adecuado tal como E. coli para producir los péptidos. En general, los dos métodos se usan con frecuencia en combinación para el objetivo anterior. Por ejemplo, puede prepararse una serie de polipéptidos que tienen longitudes reducidas de forma apropiada, trabajando desde el extremo C o N de la proteína antigénica, por técnicas de ingeniería genética establecidas. Al establecer los fragmentos que reaccionan con el anticuerpo, se obtiene una idea aproximada del sitio del epítopo.
El epítopo se identifica de forma más precisa sintetizando una diversidad de oligopéptidos más pequeños que corresponden al mismo o mutantes del péptido usando técnicas de síntesis de oligopéptidos establecidas para determinar una propiedad de unión de los péptidos al anticuerpo monoclonal anti-DR5 que es la base de la preparación del anticuerpo de la presente invención y una inhibición competitiva de la unión del péptido a un antígeno con el anticuerpo monoclonal. Pueden usarse convenientemente kits disponibles en el mercado tales como el kit SPOT (Genosys Biotechnologies, Inc.) y una serie de kits de síntesis de péptidos multipin basándose en el método de síntesis multipin (Chiron Corp.) para obtener una gran diversidad de oligopéptidos.
Un anticuerpo de la presente invención tiene las diversas propiedades funcionales a) a f) descritas más adelante, verificándose cada una de ellas, por ejemplo, por un método descrito más adelante.
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a) Unión específica de TRA-8 a células que expresan DR5 humano
Una característica única de la presente invención es la capacidad de unión a DR5 de la superficie celular. Esto se demuestra por un análisis de citometría de flujo de células que expresan DR5. En primer lugar, la unión específica en la superficie celular de DR5 se confirma por las células COS-7 transfectadas con el ADNc de longitud completa que codifica DR5 humano. Específicamente, TRA-8 sólo reconoce células COS-7 transfectadas con DR5, pero no con el vector de control vacío ni con el vector que codifica DR4. En segundo lugar, se ensayan tres orígenes diferentes: cáncer hematopoyético, glioma y cáncer de próstata de células tumorales malignas humanas. La mayoría de estas células tumorales transformadas expresaban niveles significativos de DR5 en la superficie celular, aunque los niveles de expresión variaban en gran medida. En tercer lugar, se examinan dos paneles de fibroblastos sinoviales primarios humanos de pacientes con RA u OA. Todas las células sinoviales de RA expresaban niveles significativamente mayores de DR5 en comparación con las células OA.
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b) Inducción de apoptosis de células tumorales malignas humanas in vitro en ausencia de agente de entrecruzamiento
La capacidad de un anticuerpo de acuerdo con la presente invención de reconocer del receptor de TRAIL y de inducir directamente la apoptosis de células tumorales malignas humanas se determina por el ensayo de viabilidad celular (ATPLite) durante el cultivo in vitro de células con diversas concentraciones de un anticuerpo, específicamente TRA-8. La mayoría de las células tumorales son susceptibles a la apoptosis inducida por TRA-8. Para algunas células, TRA-8 presentó una fuerte actividad inductora de la apoptosis, por ejemplo, TRA-8 puede inducir la apoptosis de células Jurkat humanas dentro de los niveles de pg/ml. De forma importante, la apoptosis inducida por TRA-8 no requería entrecruzamiento y, en la mayoría de las células, TRA-8 presentaba una actividad inductora de la apoptosis más fuerte que el TRAIL soluble recombinante en presencia del potenciador.
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c) Actividad tumoricida de TRA-8 in vivo
La actividad tumoricida de TRA-8 se evalúa en dos modelos de células tumorales de SCID/humano. En primer lugar, en ratones SCID se inoculan por vía intravenosa células Jurkat de leucemia humana, y los ratones se tratan con una sola dosis (100 \mug) de TRA-8. Los resultados demuestran que la mayoría de las células Jurkat implantadas se eliminan de la sangre periférica y del bazo por tratamiento con TRA-8, como se determina por análisis de citometría de flujo y tinción inmunohistoquímica in situ de las células Jurkat. En segundo lugar, se inoculan por vía subcutánea células de astrocitoma humano, 1321N1 en ratones SCID, y los ratones portadores de tumores se tratan con una sola dosis de TRA-8. El crecimiento de las células 1321N1 implantadas se inhibe significativamente en los ratones tratados con TRA-8 como se determina por los tamaños de los tumores y el análisis histológico.
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d) Identificación de células sinoviales de RA por TRA-8
Las células sinoviales primarias aisladas a partir de 8 pacientes con RA y 4 pacientes con OA se ensayan con respecto a la expresión en la superficie celular de DR5. TRA-8 puede teñir positivamente todas las células RA, pero tiñe negativamente todas las células OA. De esta manera, la RA se diferencia de la OA por la expresión en la superficie de DR5 como se detecta por TRA-8.
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e) Inducción de la apoptosis en fibroblastos sinoviales de RA por TRA-8
La capacidad de TRA-8 de inducir la apoptosis de células sinoviales de RA se determina por el ensayo de viabilidad celular durante el cultivo in vitro en presencia de diversas concentraciones de TRA-8. Todas las células de RA presentaron niveles de elevados a intermedios de susceptibilidad a 100 ng/ml de TRA-8. Por el contrario, todas las células de OA son esencialmente resistentes a la apoptosis inducida por TRA-8. De forma importante, TRA-8 presentó una actividad inductora de la apoptosis mejor para las células sinoviales de RA que TRAIL soluble con el potenciador. Además, en comparación con el anticuerpo anti-Fas (CH-11), TRA-8 presentó una selectividad mejor para las células sinoviales de RA.
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f) TRA-8 no induce la producción de MMP en células sinoviales de RA
Como TRA-8 puede inducir la activación de NF-\kappab en células sinoviales de RA como TNF-a, se determina el efecto de TRA-8 sobre la producción de MMP1 y MMP3 de células sinoviales. Aunque el TNF-a indujo un aumento dependiente de la dosis de MMP, TRA-8 no puede inducir la producción de MMP y, en algunas concentraciones, TRA-8 redujo ligeramente la producción de MMP en células sinoviales de RA.
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g) TRA-8 induce la activación de múltiples caspasas
Como las caspasas juegan un papel crucial en la inducción de la apoptosis, se determina la capacidad de TRA-8 de inducir la activación de caspasa en células Jurkat humanas. Cuando se incuban células Jurkat con una baja dosis (50 ng/ml) de TRA-8, se observa la activación de la caspasa 8, caspasa 9 y caspasa 3 ya 15 minutos después de la incubación como se demuestra por análisis de transferencia de Western y análisis de escisión de caspasa. En términos de tiempos, número e intensidad de activación de caspasa, los anticuerpos de la presente invención, incluyendo el anticuerpo demostrativo TRA-8, presentaron una actividad mucho mejor que cualquier otro anticuerpo inductor de la apoptosis conocido, tal como el anticuerpo anti-Fas humano (CH-11).
De esta manera, un anticuerpo de la presente invención es una sustancia que tiene la propiedad de inducir selectivamente la apoptosis en células patógenas como se muestra en realidad en los apartados (a) y (g). Por consiguiente, es útil como agente profiláctico y terapéutico para enfermedades asociadas con una supervivencia inapropiada de células o una proliferación inapropiada de células, tales como las que pueden atribuirse a una mala regulación de los sistemas de apoptosis incluyendo el sistema Fas/ligando de Fas.
La capacidad de un anticuerpo de la presente invención de inducir apoptosis se confirma cultivando células, tales como la línea celular de leucemia humana Jurkat (número de cultivo tipo americano TIB-152) y la línea celular de astrocitoma 1321N1, en medio en el que se ha añadido la muestra de ensayo, y determinando la tasa de supervivencia, por ejemplo, por medio de un ensayo ATPLite.
El anticuerpo anti-DR5 de la presente invención, que tiene casi la misma inmunogenicidad en seres humanos que los anticuerpos humanos, se usa como agente para la profilaxis o tratamiento de enfermedades asociadas con una supervivencia o proliferación inapropiada de células, incluyendo las atribuibles a una falta de regulación de los sistemas de apoptosis en enfermedades autoinmunes que incluyen ilustrativamente lupus eritematoso sistémico, enfermedad de Hashimoto, artritis reumatoide, enfermedad de injerto contra hospedador, síndrome de Sjögren, anemia perniciosa, enfermedad de Addison, esclerodermia, síndrome de Goodpasture, enfermedad de Crohn, anemia hemolítica autoinmune, esterilidad, miastenia grave, esclerosis múltiple, enfermedad de Basedow, púrpura trombopénica, diabetes mellitus dependiente de insulina, alergia; enfermedad atópica; arteriosclerosis; miocarditis; cardiomiopatía; nefritis glomerular; anemia hipoplástica; rechazo después de un trasplante de órganos y numerosas malignidades de tejidos de pulmón, próstata, hígado, ovario, linfático y de mama.
Dicho agente profiláctico o terapéutico puede administrarse de diversas formas. Los modos de administración adecuados incluyen la administración oral, tal como por medio de comprimidos, cápsulas, gránulos, polvos y jarabes, o la administración parenteral tal como por inyección, inyección gota a gota y supositorios.
El anticuerpo o agente terapéutico puede administrarse por vía oral, rectal, intracisternal, intraventricular, intracraneal, intratecal, intravaginal, parenteral (intravenosa, intramuscular o subcutánea), local (polvos, pomadas o gotas), por inyección intraperitoneal, transdérmica, por inhalación o como una pulverización bucal o nasal. La cantidad exacta del anticuerpo o agente terapéutico necesario variará de un sujeto a otro dependiendo de la edad, peso y estado general del sujeto, la gravedad de la enfermedad que se va a tratar, la localización y tamaño del tumor, los compuestos particulares usados, el modo de administración y similares. Una cantidad apropiada puede determinarse por un especialista habitual en la técnica usando sólo experimentación rutinaria dadas las enseñanzas de este documento. Las dosificaciones individuales típicas de anticuerpo varían de 0,1 a 10.000 microgramos, preferiblemente entre 1 y 100 microgramos. Las concentraciones típicas de anticuerpo en un vehículo varían de 0,2 a 2.000 nanogramos por mililitro suministrado.
Dependiendo del modo de administración deseado, el anticuerpo o agente terapéutico puede estar en composiciones farmacéuticas en forma de formas de dosificación sólidas, semisólidas o líquidas tales como, por ejemplo, comprimidos, supositorios, píldoras, cápsulas, polvos, líquidos o suspensiones, preferiblemente en una forma de dosificación unitaria adecuada para la administración individual de una dosificación precisa. Las composiciones incluirán una cantidad eficaz del sustrato seleccionado en combinación con un vehículo farmacéuticamente aceptable y, además, pueden incluir otros agentes medicinales, agentes farmacéuticos, vehículos o diluyentes. Por "farmacéuticamente aceptable" se entiende un material que no es indeseable desde el punto de vista biológico o desde otro punto de vista, que puede administrarse a un individuo junto con el sustrato seleccionado sin producir efectos biológicos indeseables significativos o interaccionar de una manera perjudicial con ninguno de los otros componentes de la composición farmacéutica en la que está contenido.
Las composiciones adecuadas para inyección parenteral pueden comprender soluciones, dispersiones, suspensiones o emulsiones acuosas o no acuosas y estériles farmacéuticamente aceptables, y polvos estériles para reconstitución en soluciones o dispersiones inyectables estériles. Los ejemplos de vehículos, diluyentes, disolventes o excipientes acuosos y no acuosos adecuados incluyen, agua, etanol, polioles (propilenglicol, polietilenglicol, glicerol y similares), mezclas adecuadas de los mismos, aceites vegetales (tales como aceite de oliva) y ésteres orgánicos inyectables tales como oleato de etilo. La fluidez apropiada puede mantenerse, por ejemplo, por medio del uso de un recubrimiento tal como lecitina, por el mantenimiento del tamaño de partículas requerido en el caso de dispersiones y por medio del uso de tensioactivos.
Estas composiciones también pueden contener adyuvantes tales como agentes conservantes, humectantes, emulsionantes y agentes de dispersión. La prevención de la acción de los microorganismos puede asegurarse por diversos agentes antibacterianos y antifúngicos, por ejemplo, parabenos, clorobutanol, fenol, ácido sórbico y similares. También puede ser deseable incluir agentes isotónicos, por ejemplo azúcares, cloruro sódico y similares. La absorción prolongada de la forma farmacéutica inyectable puede conseguirse por medio del uso de agentes que retrasen la absorción, por ejemplo, monoestearato de aluminio y gelatina.
Las formas de dosificación sólidas para administración oral incluyen cápsulas, comprimidos, píldoras, polvos y gránulos. En estas formas de dosificación sólidas, el compuesto activo se mezcla con al menos un excipiente (o vehículo) inerte habitual tal como citrato sódico o fosfato dicálcico o (a) cargas o diluyentes tales como, por ejemplo, almidones, lactosa, sacarosa, glucosa, manitol y ácido silícico, (b) aglutinantes tales como, por ejemplo, carboximetilcelulosa, alginatos, gelatina, polivinilpirrolidona, sacarosa y goma arábiga, (c) humectantes tales como, por ejemplo, glicerol, (d) agentes disgregantes tales como, por ejemplo, agar-agar, carbonato cálcico, almidón de patata o tapioca, ácido algínico, ciertos silicatos complejos y carbonato sódico, (e) retardadores de la solución tales como, por ejemplo, parafina, (f) aceleradores de la absorción tales como, por ejemplo, compuestos de amonio cuaternario, (g) agentes humectantes tales como, por ejemplo, alcohol cetílico y monoestearato de glicerol, (h) adsorbentes tales como, por ejemplo, caolín y bentonita y (i) lubricantes tales como, por ejemplo, talco, estearato cálcico, estearato de magnesio, polietilenglicoles sólidos, lauril sulfato sódico o mezclas de los mismos. En el caso de las cápsulas, comprimidos y píldoras, las formas de dosificación también pueden comprender agentes tamponantes.
También pueden emplearse composiciones sólidas de un tipo similar como cargas en cápsulas de gelatina rellenas blandas y duras usando excipientes tales como lactosa o azúcar de la leche así como polietilenglicoles de alto peso molecular y similares.
Pueden prepararse formas de dosificación sólidas tales como comprimidos, grageas, cápsulas, píldoras y gránulos con recubrimientos y cubiertas, tales como recubrimientos entéricos y otros bien conocidos en la técnica. Pueden contener agentes opacificadores y también pueden tener tal composición que liberen el compuesto o compuestos activos en una cierta parte del tracto intestinal de una forma retardada. Son ejemplos de composiciones de inclusión que pueden usarse sustancias poliméricas y ceras. Los compuestos activos también pueden estar en forma microencapsulada, si es apropiado, con uno o más de los excipientes mencionados anteriormente.
Las formas de dosificación líquidas para administración oral incluyen emulsiones, soluciones, suspensiones, jarabes y elixires farmacéuticamente aceptables. Además de los compuestos activos, las formas de dosificación líquidas pueden contener diluyentes inertes usados comúnmente en la técnica, tales como agua u otros disolventes, agentes solubilizantes y emulsionantes tales como, por ejemplo, alcohol etílico, alcohol isopropílico, carbonato de etilo, acetato de etilo, alcohol bencílico, alcohol bencílico, benzoato de bencilo, propilenglicol, 1,3-butilenglicol, dimetilformamida, aceites, en particular aceite de semilla de algodón, aceite de cacahuete, aceite de germen de maíz, aceite de oliva, aceite de ricino y aceite de sésamo, glicerol, alcohol tetrahidrofurfurílico, polietilenglicoles y ésteres de ácidos grasos de sorbitán o mezclas de estas sustancias y similares.
Aparte de estos diluyentes inertes, la composición también puede incluir adyuvantes tales como agentes humectantes, agentes emulsionantes y de suspensión, agentes edulcorantes, saporíferos y perfumes.
Las suspensiones, además de los compuestos activos, pueden contener agentes de suspensión tales como, por ejemplo, alcoholes isoestearílicos etoxilados, polioxietilensorbitol y ésteres de sorbitán, celulosa microcristalina, metahidróxido de aluminio, bentonita, agar-agar y tragacanto, o mezclas de estas sustancias, y similares.
Las composiciones para administración rectal preferiblemente son supositorios que pueden prepararse mezclando los compuestos de la presente invención con excipientes o vehículos no irritantes adecuados tales como manteca de cacao, polietilenglicol o una cera de supositorios, que son sólidos a temperaturas normales pero líquidos a la temperatura corporal y, por lo tanto, se funden en el recto o en la cavidad vaginal y liberan el componente activo.
Las formas de dosificación para administración tópica de un compuesto de esta invención incluyen pomadas, polvos, pulverizaciones e inhalantes. El componente activo se mezcla en condiciones estériles con un vehículo fisiológicamente aceptable y cualquier conservante, tampón o propulsor que pueda necesitarse. También se contemplan como incluidas dentro del alcance de esta invención formulaciones oftálmicas, pomadas oftálmicas, polvos y soluciones.
La expresión "sales, ésteres, amidas y profármacos farmacéuticamente aceptables", como se usa en el presente documento, se refiere a las sales carboxilato, sales de adición de aminoácidos, ésteres, amidas y profármacos de los compuestos de la presente invención que, dentro del alcance de un criterio médico razonable, son adecuados para uso en contacto con los tejidos de pacientes sin toxicidad indebida, irritación, respuestas alérgicas y similares, en proporción a una relación razonable de ventajas/riesgos, y eficaces para el uso para el que están destinados, así como las formas zwitteriónicas, cuando sea posible, de los compuestos de la invención. El término "sales" se refiere a las sales de adición de ácidos inorgánicos y orgánicos relativamente no tóxicas de compuestos de la presente invención. Estas sales pueden prepararse in situ durante el aislamiento y purificación final de los compuestos o haciendo reaccionar por separado el compuesto purificado en forma de su base libre con un ácido orgánico o inorgánico adecuado y aislando la sal formada de esta manera. Las sales representativas incluyen las sales bromhidrato, clorhidrato, sulfato, bisulfato, nitrato, acetato, oxalato, valerato, oleato, palmitato, estearato, laurato, borato, benzoato, lactato, fosfato, tosilato, citrato, maleato, fumarato, succinato, tartrato, naftilato, mesilato, glucoheptonato, lactobionato, metano sulfonato y lauril sulfonato, y similares. Éstas pueden incluir cationes basados en los metales alcalinos y alcalinotérreos, tales como sodio, litio, potasio, calcio, magnesio y similares, así como cationes de amonio, de amonio cuaternario y de amina no tóxicos incluyendo, pero sin limitación, amonio, tetrametilamonio, tetraetilamonio, metilamina, dimetilamina, trimetilamina, trietilamina, etilamina y similares. (Véase, por ejemplo, S.M. Barge et al., "Pharmaceutical Salts", J. Pharm Sci., 1977, 66:1-19 que se incorpora en este documento como referencia).
El término "profármaco" se refiere a compuestos que se transforman rápidamente in vivo para producir los compuestos parentales de la fórmula anterior, por ejemplo, por hidrólisis en la sangre. Se proporciona una discusión detallada en T. Higuchi and V. Stella, "Pro-drugs as Novel Delivery Systems", Vol. 14 of the A.C.S. Symposium Series, y en Bioreversible Carriers in Drug Design, ed. Edward B. Roche, American Pharmaceutical Association and Pergamon Press, 1987.
Una célula diana es una célula de un animal incluyendo ilustrativamente un ser humano, un primate no humano, rata, ratón, cobaya, conejo, cabra, oveja, vaca, caballo, pollo, cerdo, tití y hurón.
Además, el anticuerpo o agente terapéutico de la presente invención puede existir en formas no solvatadas así como en formas solvatadas con disolventes farmacéuticamente aceptables tales como agua, etanol y similares. En general, las formas solvatadas se consideran equivalentes a las formas no solvatadas para los fines de la presente invención.
Las moléculas de anticuerpo se purifican por técnicas conocidas que incluyen ilustrativamente cromatografía de absorción de amino o de afinidad de amino, técnicas cromatográficas tales como cromatografía líquida de alta presión, o una combinación de las mismas.
Otro aspecto de la presente invención incluye un producto farmacéutico para uso en la administración de un anticuerpo anti-receptor de TRAIL biológicamente activo o anticuerpo anti-receptor de TRAIL humanizado en un vertebrado. El producto farmacéutico incluye una cantidad farmacéuticamente eficaz de un anticuerpo anti-receptor de TRAIL o un fragmento del mismo, un vehículo farmacéuticamente aceptable y un recipiente que encierra el vehículo y el anticuerpo de una forma estéril.
En una realización preferida de la invención, una cantidad farmacéuticamente eficaz de un anticuerpo anti-DR5 inhibe la proliferación celular por contacto con una célula diana. Una cantidad farmacéuticamente eficaz de un anticuerpo que reconoce DR5 o un anticuerpo humanizado que reconoce DR5 es una cantidad administrada a un individuo suficiente para producir un efecto deseado. Los efectos deseados de la administración de una cantidad farmacéuticamente eficaz de anticuerpos que reconocen DR5 incluyen muerte de una célula diana, inhibición del crecimiento de una célula diana, estimulación de DR5, unión a DR5 y aumento de los niveles o actividad de NF\kappaB en una célula diana. Una célula diana es una célula que expresa DR5 e incluye ilustrativamente células con crecimiento anómalo y tumores tales como papilomas y verrugas; cáncer de mama, cáncer de colon, hepatomas, leucemias, cáncer de pulmón, melanoma, mielomas, osteosarcomas, cáncer de ovario, cáncer pancreático, cáncer de próstata, cáncer de cabeza y cuello, cáncer de tiroides, cáncer uterino y tumores del cerebro tales como astrocitomas. In vivo, la célula diana es una célula de un individuo con una patología, incluyendo aquellas en las que la proliferación celular es anómala o está mal regulada tal como un cáncer maligno o benigno y artritis reumatoide.
En otra realización preferida, la célula diana también entra en contacto con un agente terapéutico.
Un agente terapéutico es un compuesto o composición eficaz para mejorar una patología. Un ejemplo ilustrativo de un agente terapéutico incluye un compuesto anticanceroso.
Un compuesto anticanceroso es un compuesto o composición eficaz para inhibir o detener el crecimiento de una célula con un crecimiento anormal. Una cantidad farmacéuticamente eficaz de un compuesto anticanceroso es una cantidad administrada a un individuo suficiente para producir inhibición o detener el crecimiento de una célula con un crecimiento anómalo. Los ejemplos ilustrativos de compuestos anticancerosos incluyen: bleomicina, carboplatino, clorambucilo, cisplatino, colchicina, ciclofosfamida, daunorubicina, dactinomicina, dietilestilbestrol, doxorubicina, etopósido, 5-fluorouracilo, floxuridina, melfalán, metotrexato, mitomicina, 6-mercaptopurina, tenipósido, 6-tioguanina, vincristina y vinblastina. Pueden encontrarse otros ejemplos de compuestos y agentes terapéuticos anticancerosos en The Merck Manual of Diagnosis and Therapy, 15th Ed., Berkow et al., eds., 1987, Rahway, N.J. and Sladek et al. Metabolism and Action of Anti-Cancer Drugs, 1987, Powis et al. eds., Taylor and Francis, New York, N.Y.
El anticuerpo de la presente invención puede combinarse además con otras terapias, tales como quimioterapia y radioterapia en el tratamiento de malignidades, y la eficacia terapéutica puede mejorarse por compuestos inductores de la apoptosis tales como bisindolilmaleimida VIII.
En comparación con anticuerpos anti-DR5 publicados previamente (24), la actividad inductora de la apoptosis del anticuerpo TRA-8 demostrativo de la presente invención es muy fuerte y puede inducir la apoptosis de células Jurkat con niveles de pg/ml in vitro y demuestra una actividad tumoricida in vivo superior a la del TRAIL soluble indicado previamente. La administración intravenosa de una sola dosis de TRA-8 es suficiente para inhibir el crecimiento de tumores sólidos y de células de tumores hematopoyéticos, mientras que la inducción de la regresión tumoral in vivo con el TRAIL soluble requiere una dosis muy elevada (500 \mug al día durante 10 días). Los anticuerpos anti-receptor de TRAIL de la presente invención parecen ser tan seguros como el TRAIL soluble, ya que el anticuerpo TRA-8 ilustrativo no induce la apoptosis de fibroblastos no transformados.
Los siguientes ejemplos se presentan a continuación para ilustrar métodos y resultados. Estos ejemplos pretenden ilustrar métodos y resultados representativos. No debe considerarse que estos ejemplos excluyan equivalentes y variaciones de la presente invención que son evidentes para un especialista en la técnica.
Ejemplo 1 Preparación de antígeno DR5 1.1 Clonación de ADNc de DR5
Se clona ADN que codifica la proteína DR5 humana por medio del siguiente método RT-PCR usando:
a) Plantilla
Se extrae el ARN total de células HeLa usando TRIzol Reagent (GIBCO BRL). La plantilla para la reacción PCR usó ADNc que se obtiene usando el kit de síntesis de ADNc de primera cadena (Amersham Pharmacia Biotech) de acuerdo con el manual de instrucciones proporcionado con el kit.
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b) Cebadores de PCR
Para la PCR se sintetizan los siguientes cebadores oligonucleotídicos:
5'-gacgatgcccgatctactttaaggg-3'
(DR5p1: SEC ID Nº: 1);
5'-ccactgggtgatgttggatggg-3'
(DR5p2: SEC ID Nº: 2);
A menos que se especifique otra cosa, todos los oligonucleótidos de estos ejemplos se sintetizan por Lifetechnologies. Todos los oligonucleótidos se almacenan a -20ºC después de disolverse en agua destilada.
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c) Reacción PCR
Composición de la solución de reacción PCR:
\quad
ADNc de plantilla, 5 \mul de reacción total de 33 \mul
\quad
cebador DR5p1, 10 pmol;
\quad
cebador DR5p2, 10 pmol;
\quad
tampón de PCR concentrado 10 x (proporcionado con el kit), 10 \mul;
\quad
dNTP (cada uno 2,5 mM), 4 \mul; y
\quad
Taq polimerasa (Promega), 5 unidades.
Se añade agua destilada estéril a la solución hasta un volumen total de 100 \mul. A menos que se especifique otra cosa, los dNTP son una mezcla equimolar de dATP, dCTP, dGTP y dTTP (2,5 mM cada uno).
La reacción PCR se realiza como se indica a continuación. La solución primero se calienta a 94ºC durante 2 minutos, después de lo cual se repite un ciclo de calentamiento a 94ºC durante 30 segundos, 52ºC durante 1 minuto y 72ºC durante 3 minutos, 40 veces. Después de completar este procedimiento, la solución de reacción se calienta a 72ºC durante 10 minutos.
Los fragmentos de ADN amplificados obtenidos de esta manera se separan en un gel de agarosa al 1% que contiene 0,25 \mug/ml de bromuro de etidio. Las bandas que, según se ha determinado, contienen los fragmentos de ADN deseados se cortan usando una cuchilla de afeitar y el ADN se recupera usando el kit Gene Clean (BIO101). El fragmento de ADN se clona usando el kit de clonación TA (Invitrogen, CA). Esto se consigue como se indica a continuación.
El fragmento de ADN recuperado de la solución de reacción PCR, junto con 50 ng de vector pCR2.1 que se proporciona con el kit de clonación TA, se mezcla con 1 \mul de tampón de reacción de ligasa 10 X (Tris-HCl 6 mM (pH 7,5), cloruro de magnesio 6 mM, cloruro sódico 5 mM, \beta-mercaptoetanol 7 mM, ATP 0,1 mM, DTT 2 mM, espermidina 1 mM y 0,1 mg/ml de albúmina de suero bovino) al que se han añadido 4 unidades de ADN ligasa de T4 (1 \mul). El volumen total de la mezcla se ajusta a 10 \mul con agua desionizada estéril y la solución de ligasa resultante se incuba a 14ºC durante 15 horas. Después de este período de tiempo, se añaden 2 \mul de la solución de reacción de ligasa a 50 \mul de la cepa de E. coli competente TOP10F', que se proporciona con el kit de clonación TA y se hace competente de acuerdo con el manual de instrucciones, a la que se han añadido 2 \mul de \beta-mercaptoetanol 0,5 M, y la mezcla resultante se mantiene en hielo durante 30 minutos y después a 42ºC durante 30 segundos, y de nuevo en hielo durante 5 minutos. Posteriormente se añaden al cultivo 500 \mul de medio que contiene triptona al 2% v/v, extracto de levadura al 0,5% p/v, cloruro sódico al 0,05% p/v, cloruro potásico 2,5 mM, cloruro de magnesio 1 mM y glucosa 20 mM (denominado en lo sucesivo medio "SOC") y la mezcla se incuba durante 1 hora a 37ºC con agitación. Después de este tiempo, el cultivo se propaga en una placa de agar con caldo L (triptona al 1% v/v, extracto de levadura al 0,5% p/v, cloruro sódico al 0,5% p/v, glucosa al 0,1% p/v y bacto-agar al 0,6% p/v (Difco)), que contiene 100 \mug/ml. Se seleccionan colonias resistentes a ampicilina que aparecen en la placa, se raspan con un asa de transferencia de platino y se cultivan en medio de caldo L que contiene 10 \mug/ml de ampicilina a 37ºC, durante una noche, con agitación a 200 rpm. Después de la incubación, las células se recogen por centrifugación y a partir de ellas se prepara el ADN plasmídico por el método de álcali. El fragmento de ADNc de DR5 EcoR I-EcoR I procedente del plásmido obtenido de esta manera se subclona en el plásmido pcDNA3 (Invitrogen CA). Se secuencia la longitud completa del gen DR5 en pcDNA3 y corresponde a la secuencia publicada. El plásmido obtenido de esta manera se denomina plásmido pcDNA3-DR5.
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1.2 Construcción del vector de expresión DR5-IgG
Para obtener una forma soluble de DR5 humano que carezca del dominio transmembrana, se construye un vector de plásmido de expresión. Este vector se diseña para codificar una proteína de fusión que comprende el dominio extracelular de DR5 humano fusionado al ADN de Fc de IgG1 (41). El ADN que codifica el DR5 humano que carece del dominio transmembrana se obtiene por la siguiente reacción PCR.
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a) Plantilla
La plantilla para la reacción PCR usó pcDNA3-DR5.
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b) Cebadores de PCR
Para la PCR se sintetizan los siguientes cebadores oligonucleotídicos:
5'-gacgatgcccgatctactttaaggg-3'
(DR5p1: SEC ID Nº: 1);
5'-ggatccgtggacacattcgatgtc-3'
(DR5p2: SEC ID Nº: 3);
A menos que se especifique otra cosa, todos los oligonucleótidos de estos ejemplos se sintetizan por Lifetechnologies. Todos los oligonucleótidos se almacenan a -20ºC después de disolverse en agua destilada.
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c) Reacción PCR
La reacción PCR se realiza y el ADN amplificado se aísla según el ejemplo 1.1 (c).
El plásmido obtenido de esta manera se denomina plásmido PCR-\DeltaDR5. El fragmento Fc humano codificado por el fragmento BamHI-EcoR I que se recupera de pmFas-hIgG1Fc se subclona en sitios de multiclonación BamHI y EcoR I de pcDNA3. El plásmido obtenido de esta manera se denomina pcDNAFc. Además, el fragmento BamHI-BamHI que codifica la región de DR5 soluble humana que se recupera a partir de PCR-\DeltaDR5 se subclona en el sitio BamHI del plásmido pcDNAFc. El plásmido obtenido de esta manera se denomina plásmido pcDNA\DeltaDR5-Fc. Los extremos del fragmento EcoR I que codifica la región Fc de IgG humana-DR5 soluble humano que se recupera del plásmido pcDNA\DeltaDR5-Fc se hacen romos usando el fragmento de Klenow de la ADN polimerasa (GIBCO BRL) y después este fragmento se subclona en el vector lanzadera pAdCMV5 (Quantum Biotechnologies Inc., Canada) cuyos extremos se han hecho romos después del corte por BamHI. El plásmido obtenido de esta manera se denomina pcAd\DeltaDR5-Fc.
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1.3 Expresión y purificación de la proteína de fusión DR5-IgG1
Se cotransfectan células QBI-293A (proporcionadas con el kit ADENO-Quest) con pAd\DeltaDR5-Fc y ADN viral de QBI (proporcionado con el kit ADENO-Quest) usando el kit ADENO-Quest (Quantum Biotechnologies Inc., Canada) de acuerdo con el manual de instrucciones. Las placas de virus recombinantes se cultivan y seleccionan con respecto a la expresión de la proteína de fusión DR5-IgG por análisis ELISA del sobrenadante. Las placas positivas se amplifican en células QBI-293A y se almacena a -80ºC como solución madre de virus. Cincuenta placas (150 mm) de células QBI-293A se transfectan con virus recombinante pA\DeltaDR5-Fc a 10 m.d.i. (multiplicidad de infección). El medio de cultivo se recoge después de la transfección durante 48 horas.
Las células transfectadas que tienen el gen DR5-IgG se cultivan hasta una densidad celular de 1 x 10^{6} células/ml por incubación en 500 ml de medio DMEM (GIBCO), que contiene FCS al 10% v/v, a 37ºC en una atmósfera de 5% v/v de CO_{2} durante 2 días. El cultivo después se centrifuga (1.000 rpm, 5 minutos) y se recoge el sobrenadante. La purificación de DR5-IgG a partir del sobrenadante se consigue usando cromatografía de afinidad en Proteína A-Sepharose CL-4B (Pharmacia) en las siguientes condiciones:
columna: columna de Proteína A-Sepharose CL-4B (tamaño de la columna 2 ml; Pharmacia);
tampón de elución: glicina 0,1 M (pH 2,4), NaCl 0,15 M;
tampón de neutralización: Tris-HCl 1 M (pH 8,5).
Después de haber aplicado todo el sobrenadante a la columna, se lava tres veces con 20 ml de PBS y después se añade 1 ml de tampón de elución diez veces. Se mide la densidad óptica de cada fracción eluida (1 ml). Se recogen de la segunda fracción a la quinta fracción (con DO_{280} \geq 0,1) y después de la adición de 100 \mul de tampón de neutralización, los eluatos se ponen por separado en tubos de diálisis y los eluatos se dializan frente a 1 litro de PBS (pH 7,5) a 4ºC. El tampón de diálisis se cambia dos veces.
Después, en los eluatos se ensaya la expresión del producto génico DR5-IgG por ELISA. Primero se ponen por separado 100 \mul de cada fracción en pocillos de una microplaca de 96 pocillos (Costar) y se incuban a 37ºC durante 1 hora. Después de este tiempo, se retira la solución de los pocillos y la placa se lava 3 veces con 100 \mul/pocillo de PBS que contiene Tween 20 al 0,1% v/v (denominado en lo sucesivo "PBS-Tween"). Después del lavado, se añade PBS que contiene albúmina de suero bovino (denominada en lo sucesivo "BSA") al 2% p/v en cantidades de 100 \mul/pocillo, y la placa posteriormente se incuba a 37ºC durante 1 hora. Después de este tiempo, los pocillos se lavan 3 veces más con 100 \mul/pocillo de PBS-Tween, después de lo cual se añaden a cada pocillo 100 \mul/pocillo de una solución de anticuerpo monoclonal IgG1 anti-humano diluido 1.000 veces con PBS-Tween, y la placa se incuba una vez más a 37ºC durante 1 hora. Los pocillos después se lavan 3 veces con 100 \mul/pocillo de PBS-Tween. Posteriormente se añade 3,3',5,5'-tetrametilbencidina (denominada en lo sucesivo "TMB") como sistema de sustrato líquido (Sigma) en una cantidad de 100 \mul/pocillo y la placa se deja en reposo a temperatura ambiente durante 5 minutos y después se detiene la reacción añadiendo 100 \mul/pocillo de H_{2}SO_{4} 0,2 N. La absorbancia de cada pocillo se lee a 450 nM para estimar la concentración del anticuerpo unido usando la absorbancia a 650 nM como lectura de control. La absorbancia se mide usando un lector de microplacas (Molecular Devices). La producción de DR5-IgG1 se confirma usando este método ELISA. El peso molecular de la proteína de fusión DR5-IgG1 expresada se determina usando análisis de transferencia de Western en el que se usa mAb IgG1 anti-humano (Sigma) para detectar el anticuerpo en el gel. El peso molecular de la proteína de fusión DR5-IgG1 expresada es aproximadamente 50 kDa. La pureza conseguida es mayor del 90% como se evalúa por análisis en SDS-PAGE y detección de la proteína por tinción con azul de Coomassie.
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Ejemplo 2 Generación de anticuerpos monoclonales contra DR5 humano 2.1 Inmunización
Se inmunizan ratones Balb/c (Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME) hembra, de 6 a 8 semanas de edad, con la proteína de fusión DR5/hIgG1 humana purificada por afinidad. Para la inmunización inicial en la almohadilla de la pata, la proteína de fusión (50 \mug) se emulsiona en adyuvante completo de Freund (Difco, Detroit, MI). Después los ratones se refuerzan con cuatro inyecciones de 50 \mug de proteína de fusión administrada sin adyuvante un día sí y otro no. Tres días después de la última inyección, se fusionan linfocitos de los ganglios linfáticos locales con células de mieloma NS-1 y los hibridomas se cultivan en medio F104 suplementado con suero bovino fetal al 10%. Los hibridomas positivos se seleccionan por ELISA en el que las placas se recubren con 1 \mug/ml de DR5/hIgG1 o la misma cantidad de Fas/hIgG1 como control. El isotipo de los hibridomas se determina por ELISA usando un panel de anticuerpos de cabra específicos de isotipo de Ig de ratón (Southern Biotechnology, Birmingham, AL). Se purifican anticuerpos monoclonales por cromatografía de afinidad usando IgG1 anti-ratón o proteína G (Sigma) inmovilizadas.
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2.2 Fusión de células
El tercer día después de la inyección de refuerzo, se extraen los ganglios linfáticos locales del ratón y se ponen en 10 ml de medio RPMI 1640 sin suero (GIBCO BRL) que contiene 50 unidades/ml de penicilina, 50 \mug/ml de estreptomicina y 300 \mug/ml de ácido L-glutámico y se rompen pasando los órganos a través de una malla (Cell Strainer; Falcon) usando una espátula. La suspensión celular resultante se centrifuga para sedimentar las células de los ganglios linfáticos locales que después se lavan dos veces con medio RPMI sin suero. Las células lavadas después se resuspenden en medio RPMI sin suero y se cuentan.
Mientras tanto, se han cultivado células de mieloma NS1 (colección americana de cultivos tipo TIB-18) a una densidad celular no superior a 1 x 10^{8} células/ml en medio ASF104 (Ajinomoto, K.K.) que contenía FCS al 10% v/v (Gibco BRL) ("medio ASF con suero") a 37ºC con un 5% v/v de CO_{2}, y éstas se rompen de forma similar, se lavan, se resuspenden y se cuentan.
Una cantidad de la suspensión de células NS1 que, según se ha calculado, contiene 3 x 10^{7} células se mezcla con una cantidad de la suspensión de células de bazo que se ha calculado que contiene 3 x 10^{8} células. La mezcla resultante se centrifuga y se desecha el sobrenadante. Las siguientes etapas de la fusión celular se realizan manteniendo durante todo el tiempo el tubo de plástico que contiene el sedimento a 37ºC en un vaso de precipitados de agua caliente.
Después se añade lentamente al tubo 1 ml de polietilenglicol 1500 al 50% (p/v) (Boehringer Manheim), agitando durante todo el tiempo el sedimento usando la punta de una pipeta. Posteriormente, se añade lentamente en dos partes 1 ml de medio RPMI sin suero, precalentado a 37ºC, seguido de la adición de 7 ml más de medio RPMI sin suero. La mezcla resultante después se centrifuga, el sobrenadante se desecha y se añaden 10 ml de medio HAT que contiene FCS al 10% v/v mientras se agita suavemente con la punta de una pipeta. Se añaden 20 ml más de medio HAT que contiene FCS al 10% v/v y la suspensión se distribuye en microplacas de cultivo de células de 96 pocillos a 100 \mul/pocillo y se incuba a 37ºC en una atmósfera con un 5% v/v de CO_{2}. Después de 7 u 8 días, se usan 100 \mul/pocillo de medio HAT limpio para reemplazar el medio en cualquier pocillo que presente un color amarillento. Las células de fusión de estos pocillos se clonan por dilución limitante como se describe más adelante.
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2.3 Clonación por dilución limitante
Se extraen timos de ratones BALB/c hembra de 4 a 10 semanas de edad (de Japan SLC, Inc.), se rompen en una malla (Cell Strainer; Falcon) como se ha descrito anteriormente y las células rotas se lavan dos veces con medio HT que contiene FCS al 10% v/v. Una cantidad de células de timo correspondiente a las de un ratón se suspende en 30 ml de medio HT que contiene FCS al 10% v/v para producir una suspensión de células de alimentación. La preparación de células de fusión obtenida anteriormente en el ejemplo 2.2 se diluye con esta suspensión de células de alimentación de 10 a 100 veces y se diluye adicionalmente en serie con la suspensión de células de alimentación para obtener suspensiones con densidades de células de fusión de 5,1 y 0,5 células/ml. Las muestras preparadas de esta manera se distribuyen en pocillos de microplacas de cultivo de células de 96 pocillos a 100 \mul/pocillo y se incuban durante 5 días a 37ºC con un 5% v/v de CO_{2}.
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2.4 Exploración
Los sobrenadantes de cultivo de los hibridomas en crecimiento se exploran por ELISA usando placas recubiertas con 1 \mug/ml de DR5/hIgG1 o la misma cantidad de Fas/hIgG1 (41) como control. Los anticuerpos unidos se detectan usando inmunoglobulinas anti-ratón conjugadas con peroxidasa de rábano picante (HRP) (Southern Biotechnology. Birmingham, AL) con TMB (Sigma, St Louis, MI) como sustrato. Se introduce DR5-IgG1 purificada a una concentración de 1 \mug/ml o la misma cantidad de Fas-hIgG1 en un pocillo de una placa de 96 pocillos ELISA/RIA STRIP PLATE (Costar, NY). La placa se mantiene en reposo a 4ºC durante una noche para permitir la adsorción de la proteína en la superficie del pocillo. Después de este tiempo, la solución de los pocillos se desecha y cada pocillo se lava 3 veces con PBS-Tween. Después se añaden 100 \mul de PBS que contiene albúmina de suero bovino al 1% p/v (A3803; Sigma Chemical Co.) a cada pocillo y la placa se incuba a 37ºC durante 1 hora. Después, los pocillos se lavan 3 veces más con PBS-Tween y posteriormente se añaden 50 \mul de cada sobrenadante de cultivo de los hibridomas en crecimiento a cada pocillo. La placa después se incuba a 37ºC durante 1 hora y los pocillos se lavan de nuevo 4 veces con PBS-Tween. Después del lavado, se añaden por pocillo 50 \mul de anticuerpo inmunoglobulina de cabra anti-ratón marcado con peroxidasa de rábano picante (Southern Biotechnology. Birmingham, AL), diluido 1.000 veces con PBS, y la placa se incuba de nuevo a 37ºC durante 1 hora, después de lo cual los pocillos se lavan 4 veces con PBS-Tween. Después se añade un sistema de sustrato líquido de 3,3',5,5'-tetrametil-bencidina (TMB) (Sigma) en una cantidad de 100 \mul/pocillo, la placa se deja en reposo a temperatura ambiente durante 5 minutos y después la reacción se detiene por adición de 100 \mul/pocillo de H_{2}SO_{4} 0,2 N. La absorbancia de cada pocillo a 450 nm (control 650 nm) se mide usando un lector de microplacas (Molecular Devices) y se seleccionan células de fusión de la muestra que tenía una absorbancia (450-650 nm, valores de DO > 0,5) claramente mayor que los pocillos a los que no se había añadido sobrenadante de células de fusión (valores de DO; \approx 0,03). Además, los sobrenadantes de cultivo de los hibridomas en crecimiento también se exploran funcionalmente midiendo la actividad inductora de apoptosis usando células Jurkat. Se añaden 50 \mul de medio RPMI que contiene células Jurkat (1.000 células por pocillo) y Bisindolilmaleimida VIII 5 \muM (BisVIII, Alexis, San Diego, CA) en placas de 96 pocillos en presencia de 50 \mul de los sobrenadantes de cultivo de los hibridomas en crecimiento. Las células se cultivan en un incubador humidificado a 37ºC durante una noche. La apoptosis se determina por viabilidad celular usando el kit ATPLite como instruye el fabricante (Packard Instruments) y las muestras se cuentan usando el TopCounter (Packard Instruments).
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2.5 Unión ELISA de TRAIL y TRA-8 a los receptores
Se recubren placas ELISA con 2 \mug/ml de proteína de fusión DR4-Ig o DR5-Ig durante una noche. Después del bloqueo con BSA al 3%, se añade TRA-8 o TRAIL-FLAG soluble a las concentraciones indicadas y se incuba a 37ºC durante 1 hora. La unión de TRAIL o TRA-8 se detecta por anticuerpo anti-Flag conjugado con HRP (Alexis) o IgG1 antimurina conjugada con HRP (Southern Biotechnology), respectivamente. Las reacciones se revelan por tampón de sustrato TMB y se miden por el lector de microplacas Benchmark (BioRad). Los valores de Kd se estiman por el modelo de unión de un sitio de regresión no lineal usando el software GraphPad Prism (GraphPad Software, San Diego, CA). Para el ELISA competitivo, se añaden 100 ng/ml de TRAIL-FLAG y se incuban en presencia de diversas concentraciones de TRA-8. La unión de TRAIL se determina como se ha indicado anteriormente.
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2.6 Clonación
Las etapas descritas en los ejemplos 2.3 y 2.4 anteriores se repiten 5 veces para las células seleccionadas en 2.4, permitiendo de esta manera la selección de varios clones de hibridoma de los que cada uno de ellos producía un solo anticuerpo que se unía a DR5-IgG pero no se unía a Fas-IgG. Como resultado de este procedimiento de selección, se obtiene un hibridoma ratón-ratón, denominado TRA-8 y que produce un anticuerpo que se une a DR5-IgG, pero no a Fas-IgG. Este hibridoma, TRA-8, se depositó en la colección americana de cultivos tipo el 1 de marzo de 2000 y se le ha asignado el número de acceso PTA-1428.
La subclase del anticuerpo producido por el hibridoma de ratón-ratón TRA-8 (denominado en lo sucesivo simplemente "TRA-8"), según se demuestra, es IgG1, \kappa, después del ensayo con un kit de isotipificación de anticuerpos monoclonales (Pierce).
Usando la proteína de fusión humana DR5-IgG1 de los presentes solicitantes como inmunógeno, se obtienen siete clones de hibridoma por exploración inicial con ELISA, siendo todos ellos fuertemente positivos para DR5-IgG pero no para la proteína de fusión Fas-IgG, lo cual indica que los hibridomas obtenidos producen anticuerpos que reconocen la parte extracelular de DR5 pero no la parte Fc de IgG1 (datos no mostrados).
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2.7 Análisis de transferencia de Western
Se adquieren filtros para el análisis de transferencia de Western de homogenizados de tejido humano normal y de tejido canceroso de Geno Technology (St Louis, MO). Cada calle se carga con una cantidad igual de proteína como se determina por un anticuerpo anti-\beta-actina. Las manchas de transferencia se sondan con 1 \mug/ml de TRA-8 durante una noche seguido de IgG1 de cabra anti-ratón conjugada con HRP (Southern Biotechnology) a temperatura ambiente durante una hora y se revelan por quimioluminiscencia.
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2.8 Inmunohistoquímica in situ
Se obtienen tejidos humanos a partir del Tissue Procurement Center of UAB. Se fijan secciones congeladas en etanol al 70%, se bloquean con suero de caballo al 10% en PBS y después se incuban con 10 \mug/ml de TRA-8 purificado por afinidad a temperatura ambiente durante 60 minutos. Para visualizar la reactividad se usa el kit ABC de IgG anti-ratón con diaminobencidina (Vector, Burlingame, CA) como sustrato colorimétrico.
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2.9 Análisis de activación de caspasa
Se incuban células Jurkat (1x10^{6}/ml) con 500 ng/ml de TRA-8. Se separan alícuotas (30 \mug de proteína) del lisado celular en SDS-PAGE al 15%, se transfieren en una membrana de nylon y las manchas de transferencia se sondan con anticuerpos anti-caspasa 8, 9 y 3 (BD Pharmingen, San Diego, CA) seguido de anticuerpo secundario conjugado con HRP y visualización por quimioluminiscencia de los productos escindidos. El equipo de inhibidor de caspasa se adquiere en R&D Systems (Minneapolis, MN). Cada inhibidor de caspasa se añade al cultivo a las concentraciones indicadas.
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Ejemplo 3 Purificación de anticuerpo monoclonal TRA-8
El hibridoma de ratón-ratón, TRA-8, se cultiva hasta una densidad celular de 1 x 10^{6} células/ml por incubación en 500 ml de medio ASF, que contiene FCS al 10% v/v, a 37ºC con un 5% v/v de CO_{2} durante 5 días. El cultivo después se centrifuga (1.000 rpm, 5 minutos) y se recoge el sobrenadante. La purificación de TRA-8 a partir del sobrenadante se consigue usando cromatografía de afinidad de proteína G-Sepharose CL-4B (Pharmacia) en las siguientes condiciones:
columna: columna de Proteína G-Sepharose CL-4B (tamaño de la columna 2 ml; Pharmacia);
tampón de elución: Glicina 0,1 M (pH 2,4), NaCl 0,15 M;
tampón de neutralización: Tris-HCl 1 M (pH 8,5).
Después de aplicar todo el sobrenadante a la columna, se lava con 20 ml de PBS tres veces y después se añade el tampón de elución en volúmenes de 1 ml 10 veces. Se mide la densidad óptica de cada fracción eluida (1 ml). Las fracciones nº 2 a nº 5 (> DO_{280} = 0,1) se recogen por separado.
Después de añadir 100 \mul de tampón de neutralización, los eluatos se ponen en tubos de diálisis por separado y los eluatos se dializan frente a 1 litro de PBS (pH 7,5) a 4ºC. El tampón de diálisis se cambia dos veces. Esta muestra se ensaya con respecto a la actividad del anticuerpo anti-DR5 por ELISA usando la proteína de fusión DR5-IgG humana preparada anteriormente usando la técnica descrita previamente.
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Ejemplo 4 Preparación de antígeno DR4, vector de expresión DR4-IgG y anticuerpo monoclonal anti-DR4
Se repiten los procedimientos de los ejemplos 1-3 con cebadores y ADNc de plantilla de DR4 en lugar de los detallados en el ejemplo 1 para obtener un antígeno DR4 que se utiliza como en los ejemplos 1.2-3 para obtener un anticuerpo monoclonal específico contra DR4.
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Ejemplo 5 Anticuerpos monoclonales contra DcR1 y DcR2
Se inducen anticuerpos monoclonales contra receptores de reclamo DcR1 y DcR2 sustituyendo el ADNc y los cebadores correspondientes para crear los antígenos respectivos de acuerdo con el ejemplo 1. Los vectores de expresión para las fusiones de DcR1 o DcR2 con inmunoglobulina G y los anticuerpos monoclonales purificados resultantes se crean de acuerdo con los ejemplos 2 y 3.
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Ejemplo 6 La especificidad de un anticuerpo monoclonal
Como todos los receptores para TRAIL y otras proteínas de la familia de TNFR comparten una homología significativa, la especificidad del anticuerpo ilustrativo TRA-8 por DR5 se determina por análisis de transferencia de Western usando dos proteínas de fusión DR5-IgG humanas diferentes y formas recombinantes solubles de otras proteínas relacionadas. Una primera proteína de fusión DR5-Ig se construye fusionando ADNc desde los restos 1-180 de la parte extracelular de DR5 y ADNc que codifica la región constante de IgG1 humana. El ADNc fusionado se clona en un vector adenoviral recombinante (Quantum Biotechnogies, Inc., Montreal, Canada). La proteína de fusión DR5/hIgG1 expresada, que tenía un peso molecular relativo de 50 kDa, se purifica usando una columna de afinidad anti-IgG humana (Sigma, St Louis, MO). Para el análisis de especificidad por transferencia de Western, se adquiere una segunda proteína de fusión DR5/IgG1 humana recombinante (aa. 52-212), así como proteínas de fusión TRAIL-R1, R3 y R4, en Alexis. Las formas solubles de TNFR1 y Fas humano se proporcionan amablemente por Dr. Carl Edwards of Amgen, Inc., Thousands Oaks, CA, USA. Las moléculas de DR4, DcR1, DcR1, TNFR1, R4 y Fas humanas recombinantes solubles usadas son proteínas de fusión con IgG1 humana. Se separan 0,5 \mug de cada proteína por SDS-PAGE al 10% y se transfieren en una membrana de nitrocelulosa. Las manchas de transferencia se bloquean con leche en polvo al 5% en PBS a temperatura ambiente durante 1 hora y se sondan con 1 \mug/ml de anticuerpo anti-DR5 monoclonal purificado (clon: TRA-8) o 0,1 \mug/ml de IgG de cabra anti-humana conjugada con HRP a 4ºC durante una noche. Como anticuerpo secundario para detectar el TRA-8 unido se usa IgG de cabra anti-ratón conjugada con peroxidasa de rábano picante (HRP). Las manchas de transferencia se revelan por quimioluminiscencia.
Para el análisis de citometría de flujo se usan células Cos-7 transfectadas con el vector pcDNA3 (Clontech, Palo Alto, CA) que contiene el DR5 o DR4 de longitud completa o el vector vacío. El ADNc de longitud completa que codifica TRAIL humano o el ligando de Fas murino se clona en el vector pTRE cadena abajo del promotor controlable por tetraciclina (Clontech). Los fragmentos XhoI-Hind III de pTRE-hTRAIL o pTRE-mFasL se clonan adicionalmente en el vector lanzadera adenoviral pAdBN (Quantum Biotechnologies, Inc.). Las células hospedadoras 293 se cotransfectan con el pAd-TRE-hTRAIL o pAd-TRE-mFasL linealizado y el fragmento grande de ADN de adenovirus. La expresión de TRAIL humano funcional o ligando de Fas murino en placas de virus recombinantes se explora usando un ensayo de liberación de ^{51}Cr con Jurkat como diana.
TRA-8 reaccionó fuertemente con la proteína de fusión DR5-IgG (\sim50 kDa), que se usa para la inmunización como se muestra en la figura 1a, DR5, # 1 y débilmente con la segunda proteína de fusión DR5-IgG (\sim60 kD) como se muestra en la figura 1a, DR5, #2. No hay una unión significativa de TRA-8 a DR4, DcR1, DcR2, Fas (CD95) o TNFRI. Estos resultados indican que TRA-8 reconoce los epítopos que son específicos para DR5 pero no compartidos por los otros miembros de la familia.
TRA-8 no reacciona con otros miembros de la superfamilia de receptores de TNF tales como Fas (CD95) y el receptor de TNF I, y TRA-8 tampoco presenta reacciones cruzadas con el homólogo murino de DR5 como se muestra por relaciones de absorbancia óptica para 450 nm y 650 nm, siendo los números del panel inferior 1-7 (Fig. 1a, la columna 8 del panel inferior). TRA-8 y TRAIL soluble se unieron comparablemente a DR5 inmovilizado (Fig. 1b, panel izquierdo). Por el contrario, TRAIL se unió a DR4, pero TRA-8 no presentó ninguna actividad de unión a DR4 (Fig. 1b panel central). Se estiman unos valores de Kd para la unión de TRAIL y TRA-8 a DR5 de 59 nM y 3 nM, respectivamente. Es importante indicar que TRA-8 compite de forma eficaz con TRAIL por la unión a DR5 pero no por la unión a DR4, como se demuestra en el ELISA competitivo (Fig. 1b, panel derecho). Estos resultados establecen la especificidad de TRA-8 para DR5 humano.
TRA-8 puede detectar la expresión en la superficie celular de DR5, indicando el análisis citométrico de flujo una unión específica a la superficie celular de células Cos-7 transfectadas con DR5 humano de longitud completa, pero no de células Cos-7 transfectadas con DR4 o el vector vacío (Fig. 1c). De forma similar, la inmunohistoquímica in situ con TRA-8 demostró reactividad con células Cos-7 transfectadas con ADN de DR5 de longitud completa pero no con las transfectadas con el vector de control (Fig- 1d). TRA-8 no induce la apoptosis de células Cos-7 no transfectadas, y la RT-PCR de ARN de células Cos-7 usando cebadores emparejados que codifican DR5 humano demostró que no había productos de PCR específicos. Un análisis funcional adicional usando células Jurkat humanas como diana demostró que, en ausencia de entrecruzamiento, TRA-8 induce fuertemente la muerte celular, lo cual se demuestra por tres ensayos diferentes para la viabilidad celular incluyendo ATPLite, MTT y exclusión de PI (Fig. 1e). Más de un 50% de las células Jurkat se destruyen por niveles de nanogramos de TRA-8 como se demuestra por el ensayo ATPLite. La actividad de destrucción de TRA-8 es específica para DR5 ya que podría bloquearse por DR5-Ig pero no por la proteína de fusión DR4-Ig (datos no mostrados). La escisión de caspasas 8, 9 y 3 podría detectarse por análisis de transferencia de Western 30 minutos después del tratamiento con TRA-8 de células Jurkat (Fig. 1f), y la muerte celular de células Jurkat se inhibe completamente por el inhibidor de caspasa general (Z-VAD) (Fig. 1g). Los inhibidores de caspasa individuales para la caspasa 8, 3, 9 y 10 inhibieron parcialmente la muerte celular, indicando además que la muerte
celular mediada por TRA-8 se produce principalmente a través de un mecanismo apoptótico dependiente de caspasa.
Ejemplo 7 Análisis por citometría de flujo de la expresión de DR5 en la superficie celular: Un receptor de muerte importante en muchas células tumorales pero no en las células normales
Después se evalúa la capacidad de TRA-8 de unirse a DR5 expresado en la superficie celular y la especificidad de esta reacción usando células Cos-7 (colección americana de cultivos tipo número CRL-1651) transfectadas con el vector de expresión que contiene el ADNc de DR4 o DR5 humano de longitud completa o el vector vacío como control. Como segundo anticuerpo para detectar el TRA-8 unido se usa IgG1 anti-ratón conjugada con ficoeritrina (PE) (Pharmingen). Se mide la fluorescencia de 1 x 10^{4} células usando un citómetro de flujo (FACSVantage) en las siguientes condiciones:
Longitud de onda de excitación: 488 nm;
Longitud de onda de detección: 600 nm.
El análisis de citometría de flujo demostró que TRA-8 teñía aproximadamente el 30% de las células COS-7 transfectadas con el vector DR5 como se muestra en el histograma de línea continua de la figura 1c. Este porcentaje equivale a la eficacia de transfección determinada por análisis de transfección usando proteína fluorescente verde (GFP) (datos no mostrados). TRA-8 no teñía significativamente las células transfectadas con DR4 (el histograma blanco) o el vector de control (el histograma de trazos), lo que indica que TRA-8 es específico para la DR5 de la superficie celular.
Aunque la expresión de DR5 en células tumorales se ha estudiado extensivamente a nivel del ARNm (Rieger J. et al. 1:FEBS Lett, 1998 May 1; 427(1):124-8), no se entiende bien la expresión de DR5 en la superficie. Gibson S.B. et al. 1: Mol Cell Biol 2000 Jan; 20(1):205-12; Kim K. et al. 1:Clin Cancer Res 2000 Feb; 6(2):335-46. De esta manera, la disponibilidad del anticuerpo monoclonal anti-DR5 permite a los presentes solicitantes examinar los niveles de DR5 en la superficie y correlacionar la expresión con la susceptibilidad de las células a la apoptosis mediada por TRAIL. El siguiente panel de células (1 x 10^{6}) se incuba con 10 \mug/ml de TRA-8 purificado por afinidad a temperatura ambiente durante 30 minutos y después se tiñe con IgG1 anti-ratón conjugada con PE (Pharmingen) durante otros 30 minutos. 10.000 células viables se analizan usando el citómetro de flujo FACSvantage en las siguientes condiciones:
Longitud de onda de excitación: 488 nm;
Longitud de onda de detección: 600 nm.
Las cinco líneas celulares hematopoyéticas ensayadas son células Jurkat, CEM-6, Molt-4, H-9 y U937. La expresión de DR5 es detectable en la superficie de células Jurkat, CEM-6, H-9 y U937 pero es casi indetectable en células Molt-4 como se muestra en la figura 2a y 2a'. Aunque previamente se han descrito altos niveles de expresión de ARN de DR5 (43), el análisis FACS indicó que estas células no expresan altos niveles del DR5 en la superficie. Estos resultados indican que la expresión en la superficie celular de DR5 no se correlaciona con la expresión transcripcional de DR5, lo cual no es inesperado para dicho receptor. El nivel de expresión en la superficie celular de DR5 puede tener especificidad de linaje celular ya que la mayoría de las células de origen hematopoyético expresaban bajos niveles mientras que la mayoría de las células de glioma y de próstata expresaban altos niveles de DR5.
El anticuerpo monoclonal TRA-8 se usa para determinar el papel de DR5 en la inducción de la apoptosis mediada por TRAIL examinando su expresión en la superficie celular entre un panel de diferentes tipos de células tumorales humanas así como la susceptibilidad de estas células a la apoptosis mediada por TRAIL y TRA-8. Las células T de sangre periférica primarias no expresaban niveles significativos de DR5 en la superficie celular y son resistentes a la apoptosis mediada por TRAIL y TRA-8 (Figs. 2a, 2a' y 3a'). Aunque las cinco líneas de células de leucemia T humanas ensayadas expresaban niveles detectables aunque relativamente bajos de DR5 en la superficie celular, dos de ellas (Jurkat y CEM-6) son muy susceptibles tanto a la apoptosis mediada por TRAIL como a la apoptosis mediada por TRA-8, lo que indica que DR5 solo es suficiente para inducir la apoptosis de estas células. Las células Molt-4 y U937 son parcialmente susceptibles a la apoptosis mediada por TRAIL, pero son relativamente resistentes a la apoptosis mediada por TRA-8, lo que sugiere que otros receptores de TRAIL podrían estar implicados en la transducción de una señal de apoptosis. Las células H-9 son resistentes tanto a la apoptosis mediada por TRAIL como a la apoptosis mediada por TRA-8, lo que implica un bloqueo mediado por una ruta antiapoptosis intracelular.
El panel de células incluía las líneas celulares de glioma maligno humano Hs683, U251MG, D37MG, D54MG, U373MG, CH235MG, U87 y astrocitos humanos normales, que se proporcionaron por Dr. Yancey Gillespie del Departamento de Neurocirugía de la Universidad de Alabama en Birmingham. Las líneas de células de cáncer de próstata humano Dul54, PC3 y LnCap se proporcionaron por Dr. William Grizzle del Departamento de Patología de la Universidad de Alabama en Birmingham, que había obtenido las líneas celulares de la colección americana de cultivos tipo. Las líneas de células T de leucemia humana, linfoma de células B, HepG2 Jurkat (colección americana de cultivos tipo TIB-152) y CCRF-CEM CEM-6 (colección americana de cultivos tipo CCL-119); líneas celulares de monocitos, U937 (colección americana de cultivos tipo CRL-2367); se adquirieron en la colección americana de cultivos tipo. Todas las líneas celulares anteriores se cultivan en RPMI 1640 suplementado con FCS al 10%. La línea celular de astrocitoma humano, 1321N1, se proporcionó amablemente por Dr. Richard Jope del Departamento de Psiquiatría de la Universidad de Alabama en Birmingham, y se cultivó en DMEM suplementado con FCS al 5%.
TRAIL humano recombinante soluble, adquirido en Alexis Corporation (San Diego, CA) es una proteína de fusión compuesta por el dominio extracelular de TRAIL humano (restos aa 95 a 281) fusionado por el extremo N a un marcador FLAG y un péptido enlazador de 8 aminoácidos. A diferencia del TRAIL marcado con His indicado previamente, esta preparación de TRAIL solo no induce una respuesta apoptótica fuerte en células Jurkat y requiere un anticuerpo anti-FLAG como agente de entrecruzamiento para potenciar la apoptosis. El anticuerpo anti-FLAG también se adquirió en Alexis.
Las 10 células de glioma maligno humanas ensayadas expresaron niveles detectables de DR5 en la superficie celular. La mayoría expresó de niveles de intermedios a elevados de DR5 como se muestra en la figura 2b. Tres líneas, D-54MG, U373MG y CH-235MG expresaron altos niveles de DR5, mientras que seis líneas Hs-683, U251-MG, D37-MG, U87, SMK1 y 1321N1 expresaron niveles intermedios de DR5. Sólo una línea celular, H-465, expresó bajos niveles de DR5. Las tres líneas de células de cáncer de próstata expresaban altos niveles de DR5 como se muestra en la figura 2c.
A diferencia de las células T primarias normales, las células B primarias no expresaban niveles significativos de DR5 y no experimentaban apoptosis después del tratamiento con TRAIL o TRA-8 (Fig. 2d). Tres (SKW6.4, EB-3 y Raji) de las cuatro líneas celulares de linfoma B ensayadas expresaron niveles relativamente altos de DR5 y son muy susceptibles tanto a la apoptosis mediada por TRAIL como a la apoptosis mediada por TRA-8. La cuarta línea celular, Daudi, expresó niveles muy bajos de DR5 y es mucho menos susceptible a la apoptosis mediada por TRAIL o TRA-8. Aunque los astrocitos primarios no expresaban niveles detectables de DR5 en la superficie celular (Fig. 2b'), las cuatro líneas celulares de glioma ensayadas expresaron altos niveles de DR5. El mayor nivel de expresión de DR5 en células de glioma en comparación con las células T y B no va acompañado de una susceptibilidad significativamente mayor a la apoptosis mediada por TRAIL y DR5, lo que sugiere que el nivel de expresión en la superficie celular de DR5 no está correlacionado necesariamente con el nivel de apoptosis de células tumorales. La RT-PCR, realizada para determinar niveles de mensajero de DR4, DR5 y DCR2, detectó mensajeros en todas las células ensayadas (Tabla 1). Sin embargo, en general, las células normales primarias expresaron niveles relativamente bajos de DR5 en comparación con células tumorales transformadas.
TABLA 1 Análisis por RT-PCR de expresión del receptor de TRAIL* 
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1
\quad
\text{*} Se aisló ARN total a partir de las células y se realizó una RT-PCR como se describe en la sección de métodos. Los productos de PCR se separaron en gel de agarosa al 3% y se analizaron por el Fluor-S MAX MultiImager System (BioRad). Los valores se presentan como relación con respecto a la \beta-actina.
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Ejemplo 8 Inducción de apoptosis in vitro en células malignas
Para determinar si TRA-8 induce la apoptosis en células trasformadas in vitro, todas las células tumorales positivas para DR5 se examinan con respecto a su susceptibilidad a la apoptosis inducida por TRA-8 o TRAIL.
Se cultivan células diana (1 x 10^{3} por pocillo) en placas de 96 pocillos en presencia de las concentraciones indicadas de TRAIL soluble más agente de entrecruzamiento (Alexis) o TRA-8 a 37ºC durante una noche. La viabilidad celular se determina usando (1) el kit ATPLite de acuerdo con las instrucciones del fabricante (Packard Instruments, Meriden, CT); (2) el kit de proliferación celular/viabilidad de MTT (Sigma); o (3) tinción con PI de células muertas y analizadas por citometría de flujo. Al final del cultivo, las células se tiñen con 10 \mug/ml de PI y las células negativas para PI se seleccionan como células viables para la ventana de exploración. Para el análisis de los núcleos condensados de los hepatocitos, las células se tiñen con 10 ng/ml de Hoechst 33352 (Molecular Probes) y se analizan por citometría de flujo.
El anticuerpo TRA-8 puede inducir la apoptosis en la mayoría de las líneas celulares de glioma humano maligno (9/10), en 2 de las 3 líneas de células de cáncer de próstata y en 2 de las 4 líneas de células hematopoyéticas positivas para DR5. No indujo la apoptosis en la línea celular Molt-4, que expresaba niveles de DR5 en la superficie celular casi indetectables. Sin embargo, los niveles de susceptibilidad de las células a la apoptosis mediada por TRA-8 variaron considerablemente entre las líneas celulares.
La variabilidad de la susceptibilidad de las células a la apoptosis inducida por anticuerpo TRA-8 sugiere que aunque se requiere un nivel mínimo de expresión de DR5 en la superficie celular, el nivel de expresión de DR5 en la superficie celular no necesariamente es el determinante principal de la susceptibilidad y otros factores influyen en este proceso. Aunque todas las células de glioma generalmente expresaban niveles significativamente mayores del DR5 en la superficie que las células hematopoyéticas, la susceptibilidad de las células de glioma a la apoptosis inducida por TRA-8 no aumenta proporcionalmente en comparación con las células hematopoyéticas. La susceptibilidad de cinco de las líneas de células de glioma D-37MG, D54-MG, U373-MG, CH235-MG y 1321N1 a la apoptosis inducida por TRA-8 es elevada y es equivalente a su susceptibilidad a la apoptosis mediada por TRAIL como se muestra en la figura 3b. Dos de las líneas de células de glioma, H-456 y SMK1, son mucho menos susceptibles a la apoptosis inducida por TRA-8. En el caso de las células H-456, la expresión en la superficie de DR5 es baja; sin embargo, la expresión en la superficie de DR5 en SMK1 es similar a la observada en líneas celulares más susceptibles, lo que sugiere que otros mecanismos podrían intervenir en la determinación de la susceptibilidad a la apoptosis mediada por TRAIL. Aunque las tres líneas celulares de cáncer de próstata expresaban altos niveles de DR5, las células Du145 son las más sensibles a la apoptosis inducida por TRA-8, las células PC3 son parcialmente sensibles mientras que las células LnCAP son completamente resistentes como se muestra en la figura 3c. Entre las células hematopoyéticas, se ha descubierto que las células Jurkat y CEM-6 son muy susceptibles a la apoptosis inducida por TRA-8 como se muestra en la figura 2a, aunque se ha descubierto que estas dos líneas celulares expresan bajos niveles de DR5. Aunque DR5 es detectable en células U937, estas células son resistentes a la apoptosis inducida por TRA-8. De forma similar, aunque las células H-9 expresaban niveles detectables de DR5, las células H-9 son resistentes a la apoptosis inducida por TRA-8. Estos resultados implicaron la existencia de mecanismos reguladores que influyen en la apoptosis mediada por DR5.
Se producen anticuerpos anti-DR5 de unión a la superficie adicionales según los procedimientos de los ejemplos 1-3. Se estudian dos anticuerpos anti-DR5 adicionales denominados TRA-1 y TRA-10 junto con TRA-8 para determinar la capacidad comparativa de inducir apoptosis y por lo tanto de actuar como agonista o por el contrario bloquear la apoptosis mediada por TRAIL, actuando de esta manera como antagonista. Como diana para determinar la actividad agonista y/o antagonista de los tres anticuerpos anti-DR5 denominados TRA-1, TRA-8 y TRA-10 se usan células Jurkat humanas. Como se muestra en la figura 4, la viabilidad celular es de aproximadamente un 90%, 70% y 20% para TRA-10, TRA-1 y TRA-8 respectivamente tras una incubación durante una noche con 2,5 \mug por ml. TRA-8 indujo una fuerte respuesta apoptótica de una forma dependiente de la dosis mientras que TRA-1 indujo sólo una respuesta apoptótica moderada y TRA-10 indujo sólo una respuesta débil. Por lo tanto, TRA-8 se clasifica como anticuerpo anti-DR5 agonista. En la figura 4 se muestra la viabilidad de células Jurkat humanas como una función dependiente de la dosis de apoptosis inducida por TRAIL. TRA-10 bloqueó la apoptosis de células Jurkat humanas en una medida significativa en un estudio de apoptosis inducida por una baja dosis de TRAIL. De esta manera, TRA-10 se clasifica como un anticuerpo anti-DR5 antagonista. TRA-1 está depositado en la colección americana de cultivos tipo con el número de acceso PTA-1741. De forma similar, TRA-10 está depositado en la colección americana de cultivos tipo con el número de acceso PTA-1742.
La susceptibilidad de cinco de las líneas celulares de glioma, D-37MG, D54-MG, U373-MG, CH235-MG y 1321N1 a la apoptosis inducida por TRA-8 es equivalente a su susceptibilidad a la apoptosis mediada por TRAIL como se muestra en la figura 3b, lo que indica que la apoptosis inducida por TRAIL en estas células está mediada principalmente por DR5. Además, dos de las líneas celulares de glioma, Hs683 y U251-MG, son resistentes a la apoptosis inducida por TRAIL pero parcialmente sensibles a la apoptosis inducida por TRA-8, lo que indica que los receptores de reclamo funcionan en estas células y que el uso del anticuerpo contra TRA-8 evitaba este mecanismo regulador. En las líneas celulares de cáncer de próstata, a pesar de la variable sensibilidad a la apoptosis inducida por TRA-8, esto correspondía a la sensibilidad de las células a la apoptosis inducida por TRAIL, lo cual sugiere de nuevo que DR5 juega un papel importante de la apoptosis mediada por TRAIL en las células de cáncer de próstata. Entre las células hematopoyéticas se ha descubierto que Jurkat y CEM-6 son muy susceptibles a la apoptosis mediada por TRA-8 y TRAIL. El nivel de apoptosis inducida por TRA-8 es comparable al nivel de apoptosis inducida por TRAIL como se muestra en las figuras 2a y 3a'. Sólo una de las líneas de células de glioma, U87, y dos líneas celulares hematopoyéticas, U937 y Molt-4, presentaron sensibilidad a la apoptosis inducida por TRAIL, pero son menos sensibles o resistentes a la apoptosis inducida por TRA-8. Una línea celular, la línea celular H-9, expresó niveles detectables de DR5 pero es resistente a la apoptosis inducida por TRA-8 o TRAIL. Aunque se necesitan niveles mínimos de expresión de DR5 para la apoptosis inducida por TRA-8, el nivel de expresión de DR5 no predice necesariamente la susceptibilidad de las células a la apoptosis mediada por TRA-8; los receptores de reclamo intervienen en la modulación de la apoptosis mediada por TRAIL en algunas células, pero no parecen jugar un papel importante en la mayoría de las células ensayadas hasta la fecha; como se preveía, el anticuerpo TRA-8 evitaba los efectos de los receptores de reclamo; pueden producirse mutaciones funcionales del receptor DR5 en células transformadas; y, finalmente, los mecanismos de regulación intracelular pueden ser tan importantes o más importantes que los receptores de reclamo para definir la susceptibilidad de las células a la apoptosis mediada por TRAIL y DR5.
Ciertos estudios previos han demostrado que el ARNm para DR5 se distribuye de forma generalizada en los tejidos normales^{7}. Para evaluar la expresión de DR5 a nivel de las proteínas, se sonda un panel de homogeneizados de tejido humano normal (Geno Technology, St. Louis, MO) con el anticuerpo contra TRA-8 en un análisis de transferencia de Western. Entre nueve tejidos humanos normales, el tejido cerebral es débilmente positivo (Fig. 5a, calle 2). La proteína DR5 no es detectable por reactividad con TRA-8 en hígado (calle 1), pulmón (calle 3), riñón (calle 4), bazo (calle 5), testículos (calle 6), ovario (calle 7), corazón (calle 8) o páncreas (calle 9). Por el contrario, los trece tejidos de cáncer humano se tiñeron positivamente con TRA-8 (Fig. 5b) incluyendo cánceres de ovario (calle 1), pulmón (calle 2), hígado (calle 3), recto (calle 4), cuello del útero (calle 5), piel (calle 6), testículos (calle 7), tiroides (calle 8), útero (calle 10), estómago (calle 11), laringofaringe (calle 12) y páncreas (calle 13). Además, la inmunohistoquímica in situ de tejidos normales y cancerosos con TRA-8 confirmó que aparte de unas pocas células positivas dispersas en el bazo, no es detectable la expresión de DR5 en tejidos normales de mama, pulmón y bazo (Fig. 5c). Los tejidos cancerosos correspondientes incluyendo carcinoma ductal infiltrante de mama, cáncer microcítico de pulmón y linfoma reaccionaban positivamente con TRA-8 (Fig. 5d). Entre un total de 22 tejidos cancerosos examinados, 5 de 6 cánceres de mama, 2 de 2 cánceres del cuello del útero, 4 de 5 cánceres de hígado, 5 de 8 linfomas, 2 de 2 cánceres de pulmón y 2 de 2 cánceres de próstata reaccionaron positivamente con TRA-8. Estos resultados son coherentes con los del análisis de citometría de flujo e indican que los tejidos cancerosos expresan mayores niveles de proteína DR5 que los tejidos normales.
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Ejemplo 9 Actividad tumoricida de TRA-8 in vivo
Por diversas razones, muchos agentes que son prometedores en estudios in vitro no muestran eficacia in vivo. Por lo tanto, es importante ensayar la eficacia de TRA-8 en un modelo animal in vivo. Para conseguir esto, se administra el anticuerpo anti-DR5 humano TRA-8 a ratones que llevan xenoinjertos humanos que expresan la molécula de DR5 humana. Los ratones usados son ratones NOD/SCID de 6 a 8 semanas de edad (Jackson Laboratory) en los que se han inoculado por vía subcutánea células de astrocitoma humano 1321N1 (1x10^{7}) o en los que se han inoculado por vía intravenosa células Jurkat de leucemia humana (1x10^{6}). El día 2 después de la inoculación del tumor, en los ratones se inocula por vía intravenosa TRA-8 (100 \mug). Cinco días después del tratamiento con TRA-8, se determina el crecimiento del tumor 1321N1 por medio del tamaño y peso de la masa tumoral. El crecimiento de las células Jurkat se determina por el peso del bazo y el porcentaje de células Jurkat positivas para CD3 humano en el bazo de animales inoculados. Se toman biopsias de los tejidos tumorales y se examinan histológicamente.
El tratamiento temprano con una sola dosis intravenosa de 100 \mug de TRA-8 sólo un día después de la inoculación del tumor inhibió completamente la formación de un tumor sólido de las células 1321N1 (Fig. 6a). El tratamiento tardío con tres dosis de 100 \mug de TRA-8 una semana después de la inoculación del tumor redujo el peso del tumor cuatro veces o más (Fig. 6b). No es visible la formación de tumores en animales tratados con TRA-8 en un punto de tiempo temprano (Fig. 6c, panel superior). El análisis histológico reveló un tejido tumoral espectacularmente degenerado en animales tratados con TRA-8 (Fig. 6c, panel inferior). De forma similar, el tratamiento con TRA-8 inhibió la población del bazo por células Jurkat como se demuestra por la escasez de células Jurkat positivas para CD3 en el bazo (Fig. 6d, 6e). El análisis histológico del tumor implantado mostró unas pocas células tumorales dispersas en el tejido blando en los animales tratados con TRA-8 mientras que los controles mostraron la formación de un tumor sólido como se muestra en la figura 6c. En el modelo de células Jurkat, el número de células Jurkat en los bazos de animales tratados con TRA-8 es menor del 2% en comparación con casi el 10% en el bazo de animales de control como se demuestra por análisis de citometría de flujo como se muestra en la figura 6a y tinción de CD3 in situ de la figura 6c.
Estos resultados confirman la reciente demostración de que la administración sistémica de TRAIL recombinante entrecruzado inhibe el crecimiento del tumor in vivo (13). Estos resultados indican que una sola dosis de TRA-8 es muy eficaz en la eliminación de las células tumorales in vivo.
Como en un modelo murino se usa un anticuerpo anti-humano, no pudo evaluarse la toxicidad del tratamiento con TRA-8. Sin embargo, el estudio de la administración de TRAIL in vivo indicó que con este tratamiento no está asociada ninguna toxicidad significativa (13).
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Ejemplo 10 Las células sinoviales de RA son susceptibles a la apoptosis inducida por TRAIL y TRA-8
La mayoría de los estudios de la técnica anterior de apoptosis mediada por TRAIL se han centrado en células malignas. La apoptosis mediada por TRAIL de acuerdo con la presente invención también es terapéutica en afecciones autoinmunes e inflamatorias tales como RA.
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10.1 Análisis por citometría de flujo de la expresión de DR5 en la superficie celular de células sinoviales de RA
Se compara la expresión de DR5 en un panel de ocho células sinoviales cultivadas primarias de pacientes con RA con la expresión en ocho células sinoviales cultivadas primarias de pacientes con osteoartritis (denominada en lo sucesivo "OA"). Los ocho cultivos de células sinoviales de RA primarias humanas RA-1014, RA-1016, RA-1021, RA-512, RA-707, RA-811, RA-716 y RA-929 se proporcionan amablemente por Dr. M. Ohtsuki (Sankyo Co. Ltd., Tokyo, Japan) y se cultivan en DMEM suplementado con FCS al 10%, penicilina, estreptomicina y glutamina. Los siete cultivos de células primarias de células sinoviales de OA se aíslan a partir de los tejidos sinoviales de pacientes con OA por un método convencional de colagenasa y se cultivan en las mismas condiciones. El número de pases de todas las células primarias es inferior a 10. La expresión de DR5 se determina por análisis FACS como se describe en el ejemplo 5.
Todos los cultivos primarios de células de RA expresaron altos niveles de DR5 en la superficie y hay una pequeña variación en los niveles de expresión entre estas células sinoviales aisladas de diferentes pacientes como se muestra en la figura 7a. Por el contrario, la expresión de DR5 de superficie en la superficie de células sinoviales aisladas a partir de pacientes con OA es muy baja o indetectable según la figura 7b. Se ha descubierto que las células sinoviales transformadas con SV40 expresan altos niveles de DR5 comparables con los presentados por las células de RA. Por el contrario, los fibroblastos no transformados expresaban bajos niveles de DR5 comparables a los presentados por las células de OA en la figura 7b.
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10.2 Susceptibilidad de células sinoviales de RA a la apoptosis mediada por TRA-8 o TRAIL
En general, todas las células sinoviales aisladas de pacientes con RA son susceptibles de apoptosis inducida por TRAIL y apoptosis inducida por anticuerpos anti-DR5, y todas las células de OA son resistentes a la apoptosis inducida por anticuerpo anti-DR5 y a la apoptosis inducida por TRAIL de acuerdo con la figura 8a, b. Estos estudios indican que el anticuerpo TRA-8 se dirige a células alteradas preferiblemente a células normales. Además, el patrón de la susceptibilidad o resistencia a la apoptosis inducida por TRAIL se correlaciona con la inducida por el anticuerpo anti-DR5, indicando que las células sinoviales principalmente utilizan DR5 para desencadenar la apoptosis inducida por TRAIL.
Como se describe para las células malignas, la susceptibilidad a la apoptosis inducida por TRAIL o anticuerpo anti-DR5 variaba entre las células sinoviales de RA aunque expresando niveles similares de DR5. RA-512 y RA-707 son las más susceptibles, ya que más del 80% de las células se destruyen por concentraciones de TRAIL o TRA-8 inferiores a 20 ng/ml. RA-1014, RA-811, RA-716 y RA-929 se encuentran entre las que tienen una susceptibilidad intermedia a TRAIL o TRA-8, produciéndose una muerte celular de casi un 100% en presencia de altas concentraciones (>50 ng/ml) de TRAIL o TRA-8. En células RA-1016 y RA1021, aunque la mayoría (más del 60%) de las células se destruyen por una baja dosis de TRAIL o TRA-8, Una parte de las células sobrevivían en presencia de altas concentraciones de TRAIL o TRA-8, indicando que una subpoblación de células es resistente a la apoptosis mediada por TRAIL. Por el contrario, todas las células OA son mucho menos susceptibles a la apoptosis inducida por TRAIL y TRA-8. No más de un 60% de las células se destruyen en OA52F y OA69F incluso en presencia de una alta concentración de TRAIL o TRA-8. Las células OA72M son completamente resistentes a la apoptosis inducida por TRAIL o TRA-8. Las células sinoviales transformadas con SV40 también son susceptibles a la apoptosis inducida por TRAIL y TRA-8 (datos no mostrados). Por el contrario, los fibroblastos no transformados parecían ser resistentes a TRAIL y TRA-8.
Previamente se ha demostrado que DR5 utiliza una ruta dependiente de FADD/caspasa 8 para desencadenar la apoptosis (44). Para determinar la dependencia de caspasa de la apoptosis mediada por DR5 de las células sinoviales de RA, las células RA se cultivan con anticuerpo anti-DR5 o TRAIL en presencia de inhibidores de caspasa específicos. Entre los ocho inhibidores de caspasa ensayados, los inhibidores de caspasa 6, 8 y 10 pueden inhibir la apoptosis de células sinoviales de RA inducidas por TRAIL y DR5 como se muestra en la figura 9, lo que indica que estas tres caspasas están implicadas en la apoptosis mediada por DR5.
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10.3 TRA-8 o TRAIL inducen la activación de NF-\kappab en células sinoviales de RA sin aumentar la liberación de MMP
Hay indicios considerables que confirman el concepto de que hay asociaciones entre la señalización de la apoptosis y la señalización de la proliferación (45). Se ha establecido que DR5 puede activar una ruta de NF-\kappab además de la transducción de la señalización de la apoptosis, y que la activación de NF-\kappab puede transducir una señal anti-apoptosis. Por lo tanto, se realiza un ensayo de desplazamiento en gel. Se estimulan células con 50 ng/ml del TRAIL soluble recombinante, ligando de Fas, en presencia de 1 mg/ml de potenciador, o 50 ng/ml de TRA-8 durante el tiempo indicado. Los extractos nucleares se preparan y se incuban con la sonda de oligo-ADN marcada con [^{32}P] teñida doblemente. Los resultados se analizan usando el ciclón phosphoimager (TopCount NXT, Packard Instrument Company, CT). Después, las células sinoviales de RA se incuban con TNF-\alpha o TRAIL, NF-\kappab se activa de una forma dependiente del tiempo. El anticuerpo contra TRA-8 puede activar fuertemente NF-\kappab. Por el contrario, el ligando Fas no puede inducir la activación de NF-\kappab de acuerdo con la figura 10a.
De esta manera, aunque el anticuerpo contra TRAIL y TRA-8 induce una fuerte respuesta de apoptosis en las células sinoviales de RA, también activan NF-\kappab y se cree que la activación de NF-\kappab contribuye al papel proinflamatorio de TNF-\alpha en RA. De esta manera, es posible que TRAIL, al igual que TNF-\alpha, pueda servir como citoquina proinflamatoria. Para determinar si hay una consecuencia biológica similar de la activación de NF-\kappab inducida por TRAIL y TNF-\alpha, se determina la producción de MMP por ELISA. Se cultivan células sinoviales en medio solo o con 50 ng/ml de interleuquina 1b, 10 ng/ml de TNF-a, 50 ng/ml de TRAIL o 50 ng/ml de TRA-8 durante una noche. Los niveles del MMP-1 y MMP-3 en los sobrenadantes de cultivo se determinan por los kits ELISA.
Cuando se incuban células sinoviales de RA con una citoquina proinflamatoria, TNF-\alpha o IL-1b, la producción de MMP-1, 3 y 13 aumenta en comparación con el control con medio como se muestra en la figura 10b, c. Por el contrario, el tratamiento con TRAIL o anticuerpo anti-DR5 no está asociado con un aumento de la liberación de estas MMP.
Ejemplo 11A Incapacidad de inducir toxicidad hepatocelular
Para ensayos de viabilidad de células de 24 horas, se adquirieron hepatocitos humanos normales recientes en placas de 96 pocillos en In Vitro Technology (Baltimore, MD). Los hepatocitos se cultivan en medio de cultivo de hepatocitos que contiene 1 \mug/ml de TRAIL o TRA-8 soluble. Para los ensayos de viabilidad de 6 horas, se aíslan hepatocitos normales o células de cáncer hepatocelular a partir de muestras quirúrgicas recientes recogidas en el UAB Tissue Procurement Center. Todos los reactivos para el aislamiento de hepatocitos humanos incluyendo tampón de perfusión de hepatocitos, medio de digestión, medio de lavado y medio de unión se adquirieron en Gibco. Los portaobjetos de tejidos se digieren en el medio de digestión de hepatocitos a 37ºC con agitación (50 rpm) durante una hora. Los hepatocitos aislados se recogen por centrifugación a baja velocidad (50 g, 3 minutos) y se lavan con el medio de lavado de hepatocitos seis veces. Se cultivan suspensiones de una sola célula de hepatocitos en el medio de unión que contiene FCS al 10% en placas Matrigel de 96 pocillos (BD) durante seis horas. Los hepatocitos no unidos se retiran lavando dos veces con medio de unión precalentado. Los hepatocitos unidos se incuban adicionalmente con diversas concentraciones de TRAIL soluble o FasL en presencia de agente de entrecruzamiento, o TRA-8 o CH11 durante 6 horas.
TRAIL tiene al menos dos receptores (DR4 y DR5) que pueden inducir apoptosis. TRA-8 se usa para determinar si el entrecruzamiento de DR5 solo es suficiente para inducir la apoptosis de hepatocitos normales. La expresión de DR5 a nivel de proteína se examina inicialmente en cinco tejidos hepáticos humanos normales y cinco tejidos de cáncer hepático por inmunohistoquímica in situ usando TRA-8. Las secciones de los tejidos hepáticos normales mostraron una arquitectura y morfología celular normales tras la tinción con H y E (Fig. 11a, paneles de la parte superior izquierda) en ausencia de reactividad positiva con TRA-8 para DR5 (Fig, 11a, paneles de la parte inferior izquierda). Por el contrario, el tejido de carcinoma hepatocelular humano reaccionó positivamente con TRA-8 en un patrón coherente con la presencia tanto citoplásmica como en la membrana celular de DR5 en las células cancerosas. La línea de células de carcinoma hepatocelular humano HepG2 también es positiva para DR5. Estos resultados son coherentes entre los cinco tejidos hepáticos normales, y sólo uno (adenoma hepático) de cinco tejidos de cáncer hepático es negativo para DR5. Estos resultados son coherentes con los datos de transferencia de Western mostrados en la figura 5a, que indican que, como ocurre con otros tejidos normales, el tejido hepático humano normal no expresa niveles significativos de proteína DR5. Además, el análisis de transferencia de Western de hepatocitos humanos normales aislados sondado con TRA-8 no revela niveles detectables de DR5.
La expresión en la superficie celular de DR5 en hepatocitos humanos por análisis de citometría de flujo demostró que los hepatocitos normales preparados recientemente no expresaban niveles detectables de DR5 en la superficie de las células (Fig. 11b, paneles de la parte superior izquierda). Tampoco se detecta en hepatocitos humanos normales que se habían crioconservado o puesto en un cultivo a corto plazo. Por el contrario, las células de carcinoma hepatocelular aislado recientemente así como las células HepG2 expresan DR5 en la superficie celular. Usando Fas como comparación, los hepatocitos normales, las células de carcinoma hepatocelular y las células HepG2 expresaron niveles equivalentes de Fas (Fig. 11b, paneles inferiores). Estos resultados son coherentes con los obtenidos usando inmunohistoquímica in situ y transferencia de Western e indican que DR5 en la superficie celular está muy expresado en las células hepáticas cancerosas pero no los hepatocitos normales. La presencia de niveles de ARNm para DR4, DR5, DcR1 y DcR2 en hepatocitos humanos, demostrada por RT-PCR^{23}, sugiere que los hepatocitos humanos podrían expresar niveles muy bajos de proteína DR5 que están por debajo del umbral de detección por TRA-8.
Para determinar si TRA-8 induce la toxicidad hepatocelular, se examina la susceptibilidad de hepatocitos humanos normales a la apoptosis inducida por TRA-8 y por TRAIL soluble más agente de entrecruzamiento. Cuando se cultivan hepatocitos normales en presencia de una alta concentración de TRAIL, se observa una reducción dependiente del tiempo en la viabilidad celular por ATPLite (Fig. 12a) y ensayos de MTT. Pudo verse muerte celular mediada por TRAIL de hepatocitos normales cuatro horas después de la adición de TRAIL. Al final de un período de cultivo de 24 horas, más del 80% de los hepatocitos se destruyeron por TRAIL. Por el contrario, durante el mismo período de cultivo, TRA-8 no indujo muerte celular significativa en los hepatocitos normales. Los núcleos condensados teñidos con Hoechst, una característica de apoptosis, están aumentados en los hepatocitos tratados con TRAIL pero no en los tratados con TRA-8 (Fig. 12b). El número de hepatocitos apoptóticos se correlaciona bien con la reducción de la viabilidad celular como se determina por el ensayo ATPLite, lo que sugiere que la muerte celular inducida por TRAIL de los hepatocitos está mediada por la apoptosis. Esto se confirma por la capacidad de Z-VAD de inhibir la toxicidad de hepatocitos mediada por TRAIL. Como la cicloheximida es un potente potenciador de la apoptosis, se investiga el efecto de este compuesto sobre hepatocitos tratados con TRAIL y TRA-8. Durante un cultivo de cuatro horas, la cicloheximida aumentó significativamente la muerte celular de hepatocitos inducida por TRAIL, destruyéndose más de un 70% de los hepatocitos por TRAIL en presencia de cicloheximida (Fig. 12c). Sin embargo, el tratamiento con cicloheximida no puede aumentar la muerte celular mediada por TRA-8 en hepatocitos. Para comparar las características de la apoptosis inducida por TRA-8 con la inducida por TRAIL en hepatocitos, se incuban hepatocitos normales así como células cancerosas con concentraciones variables de TRAIL soluble con agente de entrecruzamiento o TRA-8. Durante un período de cultivo de 6 horas, TRAIL indujo una respuesta apoptótica moderada en hepatocitos normales. Más del 20% de los hepatocitos se destruyen en presencia de 500 ng/ml de TRAIL (Fig. 12d, parte superior izquierda). El tratamiento con TRA-8 de hepatocitos normales no indujo ninguna muerte celular significativa durante el mismo período de tiempo. Al contrario que los hepatocitos normales, las células de carcinoma hepatocelular primario (Fig. 12d, parte superior central) y las células HepG2 (Fig. 12d, parte superior derecha) son muy susceptibles a la apoptosis mediada por TRAIL o TRA-8. Más del 80% de las células de carcinoma hepatocelular y casi el 100% de las células HepG2 se destruyen durante el periodo de cultivo de 8 horas. Estos resultados indican que los hepatocitos normales son completamente resistentes a la apoptosis mediada por TRA-8 y son mucho menos susceptibles a la apoptosis mediada por TRAIL que las células de cáncer de hígado. Usando ligando de Fas y anticuerpo anti-Fas (CH-11), no hay ninguna diferencia significativa en la susceptibilidad a la apoptosis mediada por Fas entre los hepatocitos normales, células de carcinoma hepatocelular y células HepG2 (Fig. 12d, paneles inferiores).
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Ejemplo comparativo 11B
Inducción de hepatitis in vivo por TRAIL unido a la membrana humana
En ratones B6 hembra de 8-10 semanas de edad se inyectan por vía intravenosa 10^{9} pfu de Ad/hTRAIL con el número igual de Ad/Tet-on. Se suministran a los ratones diferentes concentraciones de tetraciclina en el agua para beber inmediatamente después de la inoculación de vectores adenovirales. La lesión hepática se determina por niveles séricos de AST usando un kit de diagnóstico AST (Sigma). La expresión de TRAIL se determina por análisis de transferencia de Northern.
Para determinar si la forma unida a la membrana de TRAIL induce lesiones hepáticas in vivo, se construye un vector adenoviral recombinante que codifica el TRAIL humano de longitud completa (Ad/hTRAIL), cuya expresión está bajo el control del promotor inducible por tetraciclina. Veinticuatro horas después de la inoculación intravenosa en ratones B6 de Ad/hTRAIL, se observa la expresión inducida por tetraciclina de TRAIL humano en el hígado de una forma dependiente de la dosis como se demuestra por análisis de transferencia de Northern (Fig. 13a). Los niveles de expresión de TRAIL se correlacionaron bien con la lesión hepática como se muestra por un aumento dependiente de tetraciclina en los niveles séricos de transaminasas, de nuevo de una forma dependiente de la dosis (Fig. 13b). Como la inoculación con vector adenoviral per se podría aumentar la susceptibilidad de los hepatocitos a la apoptosis mediada por TRAIL, se aíslan los hepatocitos de ratones inoculados con Ad/TRAIL y se ensayan con respecto a la muerte celular mediada por TRAIL. No hay un aumento significativo en la muerte celular de los hepatocitos infectados con Ad/TRAIL en comparación con los de ratones de control (Fig. 13c, panel de la izquierda). Además, los ratones inoculados con Ad/TRAIL no presentaron un aumento de lesiones hepáticas después de la inyección intravenosa de TRAIL humano soluble. De esta manera, se deduce que la hepatitis inducida por Ad/TRAIL está mediada por altos niveles de expresión de TRAIL en su forma unida a la membrana. El análisis histológico de secciones hepáticas reveló que las lesiones en los hepatocitos son evidentes ya a las 24 horas después de la inoculación del vector (Fig. 13d), y persistieron durante al menos 7 días (Fig. 13e). Estas alteraciones patológicas en el hígado también son dependientes de tetraciclina y se produjeron de una forma dependiente de la dosis. La primera fase, en las 24 horas de tratamiento, de la lesión hepática inducida por TRAIL se caracteriza por focos de necrosis. No se observa infiltración de células inflamatorias en esta fase, pero se había producido hemorragia. El día 7 después de la inoculación es evidente una lesión hepática difusa con una notable desorganización lobular, degeneración severa de hepatocitos con citoplasma con agregados irregulares y grandes espacios transparentes, y apoptosis y necrosis prominente. En esta fase un rasgo característico es un infiltrado extenso de células mononucleares. Estos resultados indican que TRAIL humano en su forma unida a la membrana puede inducir lesiones hepáticas in vivo. A pesar de la tendencia de TRAIL humano a producir hepatitis severa en ratones, no indujo una respuesta letal. Por el contrario, los ratones en los que se habían inoculado vectores controlados por tetraciclina similares que codificaban ligando de Fas desarrollaron una hepatitis fulminante con apoptosis y necrosis masiva de hepatocitos acompañada de hemorragia severa y mortalidad de una manera dependiente de la dosis de tetraciclina en las 72 horas posteriores a la inoculación. La tasa de mortalidad alcanzó un 100% en un período de 48 horas en los subgrupos que recibieron 3 mg/ml o más de tetraciclina. Por el contrario, todos los ratones que recibieron Ad/hTRAIL, independientemente de la dosis de tetraciclina, están vivos cuatro semanas después de la inoculación. De esta manera se deduce que, in vivo, la forma unida a la membrana de TRAIL es un inductor menos potente de lesiones hepatocelulares que el ligando de Fas. Además sugieren que TRAIL podría inducir la lesión hepática por medio de un mecanismo que difiere del mecanismo en el que se basa la toxicidad del ligando de Fas.
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Ejemplo 12 Las células B y T humanas activadas expresan mayores niveles de DR5
Para determinar si DR5 interviene en la apoptosis mediada por TRAIL de células B y células T activadas, se examina la expresión en la superficie de DR5 en células B y T en reposo y activadas usando TRA-8. Las células T humanas no estimuladas en PBMC no expresaban niveles significativos de DR5 (Fig. 14). 48 horas después de la estimulación con anti-CD3 o Con-A, aumentaba significativamente la expresión de DR5 en la superficie celular. De forma similar, las células B no estimuladas expresaban niveles muy bajos de DR5. La estimulación con anti-\mu pero sin LPS produjo un aumento de la expresión de DR5 en la superficie celular. Estos resultados indican que las células T y B activadas expresan mayores niveles de DR5 en la superficie celular. Las células se marcan con 20 \mug/ml de TRA-8 e IgG1 anti-ratón conjugada con PE.
Ejemplo 13 Las células B y T activadas se hacen susceptibles a la apoptosis mediada por TRA-8
Para determinar si las células B y T activadas son susceptibles a la apoptosis mediada por TRA-8, las células T y las células B de PBMC humanas se estimulan con anti-CD3 o anti-\mu in vitro durante 48 horas, respectivamente. Las células viables y los blastocitos en proliferación se recogen por centrifugación en gradiente y se incuban con diversas concentraciones de TRA-8. Las células B y las células T no estimuladas no son susceptibles a la apoptosis mediada por TRA-8 (Fig. 15). Las células B y las células T estimuladas totales mostraron una susceptibilidad moderadamente aumentada a la apoptosis mediada por TRA-8, destruyéndose el 20% de las células por TRA-8 después de un cultivo de una noche. Las células T inmaduras con una alta tasa de proliferación son incluso más susceptibles a la apoptosis mediada por TRA-8. Más de un 70% de las células T inmaduras pudieron destruirse por TRA-8. Las células B inmaduras son también más susceptibles a la apoptosis mediada por TRA-8 que otras. Estos resultados indican que las células B y T activadas son susceptibles a la apoptosis mediada por DR5.
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Ejemplo 14 TRA-8 reduce las células T activadas en humanos/ratones SCID
Para determinar la eficacia anti-células T in vivo de TRA-8, en ratones NOD/SCID se inyectan por vía intravenosa 1x10^{8} PBMC humanas. Normalmente, las células T humanas en los ratones SCID se activan rápidamente en respuesta a una estimulación xenogénica. En los ratones PBMC/SCID se inyectan por vía intraperitoneal 100 \mug de TRA-8 o IgG1 de control desde el día de la transferencia, repitiendo la inyección diariamente durante tres días. Cinco días después de la transferencia, las células mononucleares se aíslan de los bazos y se tiñen con anticuerpo anti-CD3 humano, y la población de linfocitos se selecciona como ventana de análisis por análisis de citometría de flujo, y se analizan las células T humanas positivas para CD3. Aproximadamente el 30% de los linfocitos esplénicos son células T humanas como se determina por tinción con anti-CD3 humano en ratones tratados de control. Sin embargo, sólo se observan algunas células T humanas (menos del 3%) entre los linfocitos esplénicos en los ratones tratados con TRA-8 (Fig. 16). El estudio histológico in situ reveló que en el bazo de los ratones de control, las células T humanas se repueblan en el bazo observándose sólo unas pocas células apoptóticas como se demuestra por tinción de TUNEL. Por el contrario, no se observa repoblación con células T humanas viables en el bazo de ratones tratados con TRA-8, sino que se observan muchas células apoptóticas (Fig. 17). Estos resultados demuestran que TRA-8 tiene actividad anti-células T in vivo e indican la utilidad de los anticuerpos de la invención para el tratamiento de la enfermedad GVH.
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Ejemplo 15 Actividad terapéutica anticancerosa de TRA-8 15.1 Expresión de DR5 y función en tejidos y líneas celulares de cánceres humanos
i) Expresión de DR5 en tejidos cancerosos humanos por tinción in situ con TRA-8. Para determinar si las células y tejidos cancerosos expresan diferencialmente mayores niveles de DR5, se tiñe un panel de tejidos cancerosos humanos incluyendo más de 20 cánceres de mama, 6 cánceres de ovario, 5 cánceres de colon y 5 cánceres de próstata con TRA-8 para inmunohistoquímica. La mayoría de estos tejidos cancerosos expresaban niveles detectables de DR5. Los niveles de expresión de DR5 en estos tejidos cancerosos variaban. En general, los tejidos cancerosos expresaron mayores niveles de DR5 que los tejidos no implicados. Además, la expresión de DR5 aparentemente no se correlaciona con la mutación de p53.
ii) Expresión y función de DR5 en líneas celulares de cánceres humanos (Tabla 2). En nueve líneas celulares de cáncer de mama humano, tres líneas de cáncer de ovario, tres líneas de cáncer de colon y tres líneas de cáncer de próstata se examina la expresión en la superficie celular de DR5 y la susceptibilidad a la apoptosis inducida por TRA-8 in vitro. 7 de 9 líneas de cáncer de mama, 3 de 3 líneas de cáncer de ovario, 3 de 3 líneas de cáncer de colon y 3 de 3 líneas de cáncer de próstata expresaron niveles variables de DR5 en la superficie celular. De 9 líneas de cáncer de mama, tres son muy susceptibles, tres son intermedias y tres son resistentes a la apoptosis mediada por TRA-8. Las tres líneas de cáncer de ovario son muy susceptibles. Una de tres líneas de cáncer de colon es muy susceptible, mientras que dos tienen sensibilidad intermedia. Dos de tres líneas de cáncer de próstata tienen sensibilidad intermedia y una es resistente.
TABLA 2 Expresión y función de DR5 en células cancerosas humanas
3
\quad
Nota: ^{1}determinado por citometría de flujo, las células se tiñen con 20 \mug/ml de TRA-8 y se comparan con un anticuerpo de control. ^{2}determinado por el ensayo ATPLite. ++++: destrucción mayor del 80%, +++: destrucción entre el 60 y el 80%, ++: destrucción entre el 40 y el 60%, +: destrucción entre el 20 y el 40%, - sin destrucción.
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iii) Citotoxicidad combinada de TRA-8 con adriamicina. En varias líneas de cáncer de mama se examina el efecto de la adriamicina sobre la apoptosis inducida por TRA-8. Altas dosis de adriamicina presentaron un efecto aditivo. Sin embargo, en algunas de las líneas resistentes a TRA-8, bajas dosis de adriamicina aumentan sinérgicamente la apoptosis inducida por TRA-8.
iv) Actividad de unión in vitro e in vivo de TRA-8 a células cancerosas humanas. Usando TRA-8 marcado con radioisótopos, se examina la actividad de unión de TRA-8 a una línea de cáncer de mama in vitro e in vivo en ratones SCID en los que se han implantado tumores. La actividad de unión in vitro a las células cancerosas se estima como un valor de Kd de 3 nM, que es constante con la estimación previa usando ELISA, y al menos 50 veces mayor que el TRAIL soluble. In vivo, TRA-8 se localizaba en tejidos tumorales implantados.
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15.2 Terapia de leucemia linfocítica crónica en ratones NOD/SCID con TRA-8
La leucemia linfocítica crónica (CLL) es una forma común de malignidad de células B. La mayoría de las células B malignas en CLL son de fenotipo maduro y son resistentes a muchos estímulos de apoptosis. Se examina la expresión y función de DR5 en las células B de cinco pacientes con CLL. Todos los pacientes tenían grandes cantidades de células B periféricas como se muestra por más de un 95% de células B CD19+ en PBMC. En comparación con las células B primarias normales, las células B de CLL de todos los pacientes tenían mayores niveles de DR5 en la superficie celular y eran más susceptibles a la apoptosis inducida por TRA-8 in vitro. De forma interesante, las células B de CLL también son sensibles a la citotoxicidad inducida por bisindolmaleimida VIII (BisVIII). Después del tratamiento combinado con TRA-8 y BisVIII, se destruye casi un 50% de las células B de CLL mientras que las células B normales no muestran respuesta (Fig. 18). La transferencia de células B de CLL a ratones NOD/SCID hizo que aproximadamente un 25%-30% de células B CD19+ repoblaran el bazo de ratones receptores cinco días después de la transferencia. Sin embargo, un tratamiento con tres dosis de 100 \mug de TRA-8 eliminó completamente las células B de CLL de cuatro de cinco pacientes en el bazo de los ratones SCID receptores. De esta manera, TRA-8 solo o junto con otras sustancias es activo como agente terapéutico para la leucemia linfolítica crónica.
Ejemplo 16 Clonación de ADNc (1) Determinación de las secuencias de aminoácidos N-terminales de las cadenas pesada y ligera de TRA-8
Para obtener ADNc de las cadenas pesada y ligera de TRA-8, se determinan las secuencias de aminoácidos N-terminales de las cadenas pesada y ligera de TRA-8 y los genes de TRA-8 clonados por técnicas conocidas.
Se someten diez \mug de la solución que contiene el anticuerpo anti-DR5 humano TRA-8 a electroforesis en gel de SDS-poliacrilamida ("SDS-PAGE"), usando una concentración de gel del 12% p/v y un voltaje constante de 100 V, durante 120 minutos. Después de la electroforesis, el gel se sumerge en tampón de transferencia Tris-HCl 25 mM (pH 9,5), metanol al 20%, y SDS al 0,02% v/v durante 5 minutos. Después de este tiempo, el contenido de proteína del gel se transfiere a una membrana de difluoruro de polivinilideno ("membrana de PVDF"); tamaño de poros 0,45 \mum; Millipore, Japan) prehumedecida en tampón de transferencia, usando un aparato de transferencia (KS-8451; Marysol) en condiciones de voltaje constante de 10 V, a 4ºC, durante 14 horas.
Después de este tiempo, la membrana de PDVF se lava con tampón de lavado NaCl 25 mM, tampón borato sódico 10 mM (pH 8,0), y después se tiñe en una solución de tinción (metanol al 50% v/v, ácido acético al 20% v/v y azul brillante de Coomassie al 0,05% p/v) durante 5 minutos para localizar las bandas de proteína. Después, la membrana de PDVF se destiñe con metanol acuoso al 90% v/v y las bandas que corresponden a la cadena pesada, la banda con la menor movilidad, y la cadena ligera, la banda con mayor movilidad previamente localizadas en la membrana de PDVF se escinden y se lavan con agua desionizada.
La secuencia de aminoácidos N-terminal de las cadenas pesada y ligera se determinan por el método automático de Edman (Edman, P., et al., (1967), Eur. J. Biochem., 1, 80) usando un secuenciador de proteínas en fase gaseosa (PPSQ-10; Shimadzu Seisakusyo, K.K.).
Se determina que la secuencia de aminoácidos N-terminal de la banda correspondiente a la cadena pesada es:
Glu-Val-Met-Leu-Val-Glu-Ser-Gly-Gly-Gly-Leu-Val-Lys-Pro-Gly-Gly-Ser-Leu-Lys-Leu (SEC ID Nº: 4 de la lista de secuencias);
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y que la de la banda correspondiente a la cadena ligera es:
Asp-Ile-Val-Met-Thr-Gln-Ser-His-Lys-Phe-Met-Ser-Thr-Ser-Val-Gly-Asp-Arg-Val-Ser (SEC ID Nº: 5 de la lista de secuencias).
La comparación de estas secuencias de aminoácidos con la base de datos de la secuencia de aminoácidos de anticuerpos producidos por Kabat et al. (Kabat E.A., et al., (1991), en "Sequences of Proteins of Immunological Interest Vol. II", U.S. Department of Health and Human Services) reveló que la cadena pesada (cadena \gamma1) y la cadena ligera (cadena \kappa) de TRA-8 pertenecían a los subtipos 3d y 1, respectivamente.
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(2) Clonación de ADNc
Basándose en los descubrimientos anteriores, se sintetizan cebadores oligonucleotídicos que sería de esperar que hibridaran con partes de las regiones 5' no traducidas y los extremos de las regiones 3' traducidas de los genes pertenecientes a estos subtipos de ratón. Después, se clonan ADNc que codifican las cadenas pesada y ligera de TRA-8 por la siguiente combinación de transcripción inversa y PCR (RT-PCR):
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a) Plantilla
Se extrae el ARN total del hibridoma de TRA-8 (ATCC Nº PTA-1428) usando reactivo TRIzol (GIBCO BRL). La plantilla para la reacción PCR usó ADNc que se obtiene usando el kit de síntesis de ADNc de primera cadena (Amersham Pharmacia Biotech) de acuerdo con el manual de instrucciones proporcionado con el kit.
b) Cebadores de PCR
Para la PCR se sintetizan los siguientes cebadores oligonucleotídicos:
5'-cagcactgaa cacggacccc-3'
(H5NCS1: SEC ID Nº: 6 de la lista de secuencias);
5'-aaaggtaatt tattgagaag-3'
(H5NCS2: SEC ID Nº: 7 de la lista de secuencias);
5'-cctcaccatg aacttcgggc-3'
(H5SS1: SEC ID Nº: 8 de la lista de secuencias);
5'-ctgttgtatgg cacatgagac-3'
(H5SS2: SEC ID Nº: 9 de la lista de secuencias);
5'-gaagtgatgc tggtggagtc-3'
(H5CS1: SEC ID Nº: 10 de la lista de secuencias);
5'-agtgtgaagt gatgctggtg-3'
(H5CS2: SEC ID Nº: 11 de la lista de secuencias);
5'-tttaccagga gagtgggaga g-3'
(H3CR: SEC ID Nº: 12 de la lista de secuencias);
5'-tgcagagaca gtgaccagag-3'
(H3VR: SEC ID Nº: 13 de la lista de secuencias);
5'-tgttcaggac cagcatgggc-3'
(L5NCS1: SEC ID Nº: 14 de la lista de secuencias);
5'-aagacatttt ggattctaac-3'
(L5NCS2: SEC ID Nº: 15 de la lista de secuencias);
5'-tatcatgaag tctttgtatg-3'
(L5SS1: SEC ID Nº: 16 de la lista de secuencias);
5'-gatggagaca cattctcagg-3'
(L5SS2: SEC ID Nº: 17 de la lista de secuencias);
5'-gacattgtga tgacccagtc-3'
(L5CS: SEC ID Nº: 18 de la lista de secuencias);
5'-ttaacactca ttcctgttga-3'
(L3CR: SEC ID Nº: 19 de la lista de secuencias); y
5'-gactgggtca tcacaatgtc-3'
(LCSR: SEC ID Nº: 20 de la lista de secuencias).
A menos que se especifique otra cosa, todos los oligonucleótidos de estos ejemplos se sintetizan por Pharmacia Biotech. Todos los oligonucleótidos se almacenan a -20ºC después de disolverse en agua destilada.
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c) Reacción PCR
Composición de la solución de reacción PCR:
\quad
ADNc de plantilla, 5 \mul de reacción total de 33 \mul
\quad
cebador 1, 10 pmol;
\quad
cebador 2, 10 pmol;
\quad
tampón de PCR concentrado 10 x (proporcionado con el kit), 10 \mul;
\quad
dNTP (2,5 mM cada uno), 4 \mul; y
\quad
Taq polimerasa (Promega), 5 unidades.
Se añade agua destilada estéril a la solución a un volumen total de 100 \mul. A menos que se especifique otra cosa, los dNTP son una mezcla equimolar de dATP, dCTP, dGTP y dTTP (cada uno a una concentración de 2,5 mM).
La reacción PCR se realiza como se indica a continuación. Primero, la solución se calienta a 94ºC durante 2 minutos, después de lo cual se repite un ciclo de calentamiento a 94ºC durante 30 segundos, 52ºC durante 1 minuto y 72ºC durante 3 minutos, 40 veces. Después de finalizar este procedimiento, la solución de reacción se calienta a 72ºC durante 10 minutos.
Los fragmentos de ADN amplificados obtenidos de esta manera se separan en un gel de agarosa al 1% que contiene 0,25 \mug/ml de bromuro de etidio. Las bandas que se ha determinado que contienen los fragmentos de ADN deseado se cortan usando una cuchilla de afeitar y el ADN se recupera usando el kit Gene Clean (BIO101). El fragmento de ADN se clona usando el vector pGEM-T Easy (Promega). Esto se realiza de la siguiente manera.
\newpage
El fragmento de ADN recuperado de la solución de reacción PCR, junto con 50 ng de vector pGEM-T Easy (proporcionado con el kit), se mezcla con 1 \mul de tampón de reacción de ligasa 10 X (Tris-HCl 6 mM (pH 7,5), cloruro de magnesio 6 mM, cloruro sódico 5 mM, \beta-mercaptoetanol 7 mM, ATP 0,1 mM, DTT 2 mM, espermidina 1 mM y 0,1 mg/ml de albúmina de suero bovino), al que se le han añadido 4 unidades de ADN ligasa de T4 (1 \mul). El volumen total de la mezcla se ajusta a 10 \mul con agua desionizada estéril y la solución de ligasa resultante se incuba a 14ºC durante 15 horas. Después de este período de tiempo, se añaden 2 \mul de la solución de reacción de ligasa a 50 \mul de la cepa de E. coli competente JM109 (proporcionada con el kit y que se ha hecho competente de acuerdo con el manual de instrucciones) a la que se habían añadido 2 \mul de \beta-mercaptoetanol 0,5 M, y la mezcla resultante se mantiene en hielo durante 30 minutos, después a 42ºC durante 30 segundos y de nuevo en hielo durante 5 minutos. A continuación, se añaden al cultivo 500 \mul de medio que contiene triptona al 2% v/v, extracto de levadura al 0,5% p/v, cloruro sódico al 0,05% p/v, cloruro potásico 2,5 mM, cloruro de magnesio 1 mM y glucosa 20 mM (denominado en lo sucesivo medio "SOC") y la mezcla se incuba durante 1 hora a 37ºC con agitación. Después de este tiempo, el cultivo se propaga en una placa de agar con caldo L (triptona al 1% v/v, extracto de levadura al 0,5% p/v, cloruro sódico al 0,5% p/v, glucosa al 0,1% p/v y bacto-agar al 0,6% p/v (Difco)), que contiene 100 \mug/ml. Se seleccionan colonias resistentes a ampicilina que aparecen en la placa, se raspan con un asa de trasferencia de platino, y se cultivan en medio de caldo L que contiene 100 \mug/ml de ampicilina a 37ºC, durante una noche, con agitación a 200 r.p.m. Después de la incubación, las células se recogen por centrifugación, y a partir de ellas se prepara el ADN plasmídico por el método de álcali. El plásmido obtenido se denomina plásmido pH62 en el caso de la cadena pesada de TRA-8 o pL28 en el caso de la cadena ligera de TRA-8. Las cepas de E. coli transformantes que llevan este plásmido, denominadas E. coli JM109/pH62 y E. coli JM109/pL28 se depositaron en el International Patent Organism Depositary, National Institute of Advanced Industrial Science and Technology, 1-1, Higashi 1 chome Tsukuba-shi, Ibaraki-ken, 305-5466, Japón, el 20 de abril de 2001, de acuerdo con el tratado de Budapest para el depósito de microorganismos, y recibieron los números de acceso FERM BP-7560 y FERM BP-7561, respectivamente. Las secuencias de nucleótidos de estos ADN que codifican la cadena pesada y la cadena ligera de TRA-8 se confirman por el método didesoxi (Sanger, F. S., et al., (1977), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 74:5463-5467) usando el analizador de ADN 3700 (ABI PRISM; Perkin Elmer Applied Biosystems, Japan).
Las secuencias de nucleótidos de las cadenas pesada y ligera de TRA-8 se presentan como la SEC ID Nº: 21 y Nº: 22 de la lista de secuencias, respectivamente. Las secuencias de aminoácidos de las cadenas pesada y ligera de TRA-8 se presentan como SEC ID Nº: 23 y Nº: 24 de la lista de secuencias respectivamente. Las secuencias de aminoácidos N-terminales de las cadenas pesada y ligera de TRA-8 establecidas anteriormente se emparejaban perfectamente. Además, cuando las secuencias de aminoácidos de las cadenas pesada y ligera se comparan con la base de datos de secuencias de aminoácidos de anticuerpos se establece que, para la cadena pesada, los nucleótidos nº 58 a 414 en la SEC ID Nº: 21 constituían la región variable, mientras que los nucleótidos nº 415 a 1392 en la SEC ID Nº: 21 constituían la región constante. Para la cadena ligera, los nucleótidos nº 64 a 387 en la SEC ID Nº: 22 constituían la región variable mientras que los nucleótidos nº 388 a 702 en la SEC ID Nº: 22 constituían la región constante. Las localizaciones y secuencias de las CDR también se esclarecen comparando las homologías con la base de datos. Las secuencias de aminoácidos de CDR1, CDR2 y CDR3 de la cadena pesada de TRA-8 se muestran en las SEC ID Nº: 25 Nº: 26 y Nº: 27 respectivamente. Las secuencias de aminoácidos de la CDR1, CDR2 y CDR3 de la cadena ligera de TRA-8 se muestran en las SEC ID Nº: 28, Nº: 29 y Nº: 30 respectivamente.
Ejemplo 17 Diseño de una versión humanizada del anticuerpo TRA-8 (1) Modelado molecular de una región variable de TRA-8
El modelado molecular de la región variable de TRA-8 se realiza por el método conocido generalmente como modelado de homología (Methods in Enzymology, 203, 121-153, (1991)). Las secuencias primarias de regiones variables de inmunoglobulina humana registradas en el banco de datos de proteínas (Nuc. Acid Res. 28, 235-242 (2000)), para las que están disponibles las estructuras tridimensionales obtenidas por cristalografía de rayos x, se comparan con las regiones flanqueantes de TRA-8 determinadas anteriormente. Como resultado, se seleccionan 1NCD y 1HIL como los que tienen las máximas homologías de secuencia con las regiones flanqueantes para las cadenas ligera y pesada de TRA-8, respectivamente. Se generan estructuras tridimensionales de las regiones flanqueantes combinando las coordenadas de 1NCD y 1HIL que corresponden a las cadenas ligera y pesada de TRA-8, para obtener el "modelo flanqueante". Usando la clasificación definida por Chotia et al., las CDR de TRA-8 se clasifican como se indica a continuación: CDRL_{1}, CDRL_{2}, CDRH_{1} y CDRH_{2} pertenecen a las clases canónicas 2, 1, 1, 3, respectivamente, mientras que CDRL_{3} no pertenece a ninguna clase canónica específica. Los bucles de CDR de CDRL_{1}, CDRL_{2}, CDRH_{1} y CDRH_{2} se fijan a las conformaciones intrínsecas a sus clases canónicas respectivas, y se integran en el modelo flanqueante. A CDRL_{3} se le asigna la conformación del agrupamiento 8A, de acuerdo con la clasificación de Thornton et al. (J. Mol. Biol., 263, 800-815, (1996)) y CDRH_{3} se clasifica en k(8)C usando la regla H3 (FEBS Letter 455, 188-197 (1999)). Después se integran conformaciones representativas para CDRL_{3} y CDRH_{3} en el modelo flanqueante.
Finalmente, se realizan cálculos de energía para eliminar contactos interatómicos desfavorables, para obtener un modelo molecular probable de la región variable de TRA-8 en términos de energía. El procedimiento anterior se realiza usando el sistema de modelado molecular común disponible en el mercado ABM (Oxford Molecular Limited, Inc.). Para el modelo molecular obtenido, la precisión de la estructura se evalúa adicionalmente usando el software PROCHECK (J. Appl. Cryst. (1993), 26, 283-291).
(2) Diseño de las secuencias de aminoácidos para TRA-8 humanizado
La construcción de anticuerpos TRA-8 humanizados se realiza por el método conocido generalmente como injerto de CDR (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86, 10029-10033 (1989)). El anticuerpo aceptor se elige basándose en la homología de aminoácidos en la región flanqueante. Las secuencias de la región flanqueante en TRA-8 se comparan con todas las secuencias flanqueantes humanas en la base de datos Kabat de secuencias de aminoácidos de anticuerpos (Nuc. Acid Res. 29, 205-206 (2001)). Como resultado, se selecciona el anticuerpo mAB58'CL como aceptor debido a la máxima homología de secuencia del 80% para la región flanqueante. Los restos aminoacídicos en la región flanqueante para mAB58'CL están alineados con los de TRA-8 y se identifican las posiciones en las que se usan diferentes aminoácidos. La localización de estos restos se analiza usando el modelo tridimensional de TRA-8 construido anteriormente y los restos donadores que deberían injertarse en el aceptor se eligen por los criterios proporcionados por Queen et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86, 10029-10033 (1989)). Las secuencias de TRA-8 humanizadas se construyen como se describe en el siguiente ejemplo transfiriendo varios restos del donador en un anticuerpo aceptor, mAb58'CL.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo 18 Construcción de un vector de expresión para la cadena pesada del anticuerpo humanizado (1) Construcción de plásmido que lleva el ADN de la región variable de cadena pesada de TRA-8 humanizado
Para determinar la actividad de TRA-8 humanizado, se construye el plásmido que lleva la cadena pesada de TRA-8 humanizado como se indica a continuación. Sin embargo, debe apreciarse que la humanización de TRA-8 no se limita a estos ejemplos.
Como se muestra en la SEC ID Nº: 31 de la lista de secuencias, la humanización de las secuencias de aminoácidos de la cadena pesada del anticuerpo de ratón anti-DR5 humano TRA-8 supuso el reemplazo del 13º aminoácido (lisina), el 19º aminoácido (lisina), el 40º aminoácido (treonina), el 42º aminoácido (ácido glutámico), el 44º aminoácido (arginina), el 84º aminoácido (serina), el 88º aminoácido (serina), el 93º aminoácido (metionina), el 114º aminoácido (treonina) y el 115º aminoácido (leucina) por glutamina, arginina, alanina, glicina, glicina, asparagina, alanina, valina, leucina y valina, respectivamente.
El plásmido que lleva el ADN que codifica la región variable de cadena pesada de TRA-8 humanizado (SEC ID Nº: 31 de la lista de secuencias) se construye como se indica a continuación.
Se usa PCR para construir las siguientes secuencias de ADN, incluyendo cada una de ellas lo descrito anteriormente:
Se sintetizan los siguientes 12 oligonucleótidos:
5' - ttggataagc ttggcttgac ctcaccatgg gatggagctg tatcatcctc ttcttggtag caacagctac
{}\hskip0,5cm aggtgtccac -3' (A; SEC ID Nº: 32);
5' - tctgaagtaa tgctggtgga gtctggggga ggcttagtac agcctggagg gtccctgaga ctctcctgtg
{}\hskip0,5cm cagcctctgg -3' (B; SEC ID Nº: 33);
5' - attcactttc agtagttatg taatgtcttg ggttcggcag gcaccaggga agggtctgga gtgggttgca
{}\hskip0,5cm accattagta -3' (C; SEC ID Nº: 34);
5' - gtggtggtag ttacacctac tatccagaca gtgtgaaggg ccgattcacc atctccagag acaatgccaa
{}\hskip0,5cm gaacaccctg -3' (D; SEC ID Nº: 35);
5' - tatctgcaaa tgaacagtct gagagcagag gacacggctg tttattactg tgcaagaagg ggtgactcta
{}\hskip0,5cm tgattaxgac -3' (E; SEC ID Nº: 36);
5' - ggactactgg ggccaaggga ccctggtcac agtctcctca gcctc cacc aagggcccat cggtc -3' (F; SEC ID Nº: 37);
5' - ctaccaagaa gaggatgata cagctccatc ccatggtgag gtcaagccaa gcttatccaa -3' (G; SEC ID Nº: 38);
5' - tctcagggac cctccaggct gtactaagcc tcccccagac tccaccagca ttacttcaga gtggacacct
{}\hskip0,5cm gtagctgttg -3' (H; SEC ID Nº: 39);
5' - tccagaccct tccctggtgc ctgccgaacc caagacatta cataactact gaaagtgaat ccagaggctg
{}\hskip0,5cm cacaggagag -3' (I; SEC ID Nº: 40);
5' - ctctggagat ggtgaatcgg cccttcacac tgtctggata gtaggtgtaa ctaccaccac tactaatggt
{}\hskip0,5cm tgcaacccac -3' (J; SEC ID Nº: 41);
5' - ccttcttgca cagtaataaa cagccgtgtc ctctgctctc agactgttca tttgcagata cagggtgttc
{}\hskip0,5cm ttggcattgt -3' (K; SEC ID Nº: 42); y
5' - gaccgatggg cccttggtgg aggctgagga gactgtgacc agggtccctt ggccccagta gtccgtcgta
{}\hskip0,5cm atcatagagt cacc -3' (L; SEC ID Nº: 43). 
\vskip1.000000\baselineskip
Los 2 siguientes cebadores de PCR se sintetizan como se ha descrito anteriormente:
5' - ttggataagc ttggcttgac -3' (P1; SEC ID Nº: 44); y
5' - gaccgatggg cccttggtgg a -3' (P2; SEC ID Nº: 45).
La síntesis de ADN que codifica una cadena polipeptídica que comprende una secuencia señal de secreción, una región variable de la cadena pesada de TRA-8 humanizado y los 8 restos aminoacídicos del extremo N de la región CH1 de IgG se realiza usando una combinación de PCR respectivamente.
El fragmento de ADN se prepara como se indica a continuación.
Composición de la solución de reacción PCR:
\quad
oligonucleótido A, 10 pmol;
\quad
oligonucleótido B, 10 pmol;
\quad
oligonucleótido C, 10 pmol;
\quad
oligonucleótido D, 10 pmol;
\quad
oligonucleótido E, 10 pmol;
\quad
oligonucleótido F, 10 pmol;
\quad
oligonucleótido G, 10 pmol;
\quad
oligonucleótido H, 10 pmol;
\quad
oligonucleótido I, 10 pmol;
\quad
oligonucleótido J, 10 pmol;
\quad
oligonucleótido K, 10 pmol;
\quad
oligonucleótido L, 10 pmol;
\quad
cebador oligonucleotídico P1, 2 \muM;
\quad
cebador oligonucleotídico P2, 2 \muM;
\quad
tampón Pyrobest II 10 X, 10 \mul;
\quad
mezcla de dNTP, 8 \mul;
\quad
ADN polimerasa Pyrobest 0,5 \mul; y
\quad
Agua redestilada a un volumen final de 50 \mul.
La reacción PCR se realiza como se indica a continuación. Primero, la solución se calienta a 94ºC durante 5 minutos, después de lo cual se repite un ciclo de calentamiento a 98ºC durante 10 segundos, 55ºC durante 30 segundos y 72ºC durante 1 minuto, 7 veces. Después de finalizar este procedimiento, la solución de reacción se calienta a 72ºC durante 15 minutos.
Se añade un volumen igual de fenol-cloroformo (fenol al 50% v/v saturado con agua, cloroformo al 48% v/v, y alcohol isoamílico al 2% v/v) a 200 \mul de cada uno de los productos de PCR y se mezcla vigorosamente durante 1 minuto. Después de este tiempo, la mezcla se centrífuga a 10.000 X g y la capa acuosa se recupera y se mezcla con un volumen igual de cloroformo-alcohol isoamílico (cloroformo al 96% v/v y alcohol isoamílico al 4% v/v) que de nuevo se agita vigorosamente a 10.000 X g y se recupera la capa acuosa. La serie de etapas indicadas en este párrafo se denomina en lo sucesivo "extracción con fenol").
Después se realiza una precipitación con etanol en la capa acuosa recuperada. Como se usa y se menciona en este documento, la "precipitación con etanol" consiste en la adición, con mezcla, de un décimo del volumen de acetato sódico 3 M (pH 5,2) y 2,5 volúmenes de etanol al 100% a la solución a tratar y la congelación de la mezcla usando hielo seco. La mezcla resultante después se centrifuga a 10.000 X g para recuperar el ADN como un precipitado.
Después de la extracción con fenol y la precipitación con etanol, el ADN precipitado resultante se seca al vacío, se disuelve en un mínimo de agua redestilada y se separa por electroforesis en gel de agarosa al 3%. Después de la electroforesis, el gel se tiñe con una solución acuosa a una concentración de 1 \mug/ml de bromuro de etidio para permitir la detección del ADN con luz ultravioleta. La banda de ADN correspondiente al ADN de TRA-8 humanizado se corta usando una cuchilla de afeitar y se eluye del gel usando el kit Geneclean Spin (BIO 101, CA, USA). Después de la extracción con fenol, el ADN eluido se concentra por centrifugación a 7.500 X g, seguido de precipitación con etanol y finalmente se disuelve en 5 \mul de agua destilada.
Cada ADN extraído resultante se clona usando el vector pGEM-T Easy (Promega) como se indica a continuación:
\quad
El fragmento de ADN recuperado de la reacción PCR, 5 \mul;
\quad
Tampón de Taq polimerasa 10 X, 1 \mul;
\quad
mezcla de dNTP, 1 \mul;
\quad
Taq polimerasa (5 unidades/ml), 1 \mul; y
\quad
agua redestilada hasta un volumen final de 10 \mul.
Después de que cada solución anterior se ha hecho reaccionar a 70ºC durante 3 minutos, cada solución de ADN y vector pGEM-T Easy se ligan usando un kit de ligamiento de ADN versión 2.0 (Takara Shuzo Co., Ltd.) usando el protocolo del fabricante.
Después de 4 horas de incubación a 15ºC, se mezclan 2 \mul de la solución de reacción incubada con 100 \mul de la cepa de E. coli competente JM109 a una densidad celular de 1-2 x 10^{9} células/ml (Takara Shuzo Co., Ltd.) y la mezcla se mantiene en hielo durante 30 minutos y después a 42ºC durante 30 segundos y de nuevo en hielo durante 1 minuto. Después, se añaden 500 \mul de medio SOC (triptona al 2% v/v, extracto de levadura al 0,5% p/v, cloruro sódico al 0,05% p/v, cloruro potásico 2,5 mM p/v, cloruro de magnesio 1 mM y glucosa 20 mM), que se incuba durante 1 hora más, con agitación. Después se aíslan las cepas transformantes y se prepara ADN plasmídico a partir de las cepas como se describe en "Molecular Cloning A Laboratory Manual". Las secuencias de nucleótidos de estos ADN que codifican la cadena pesada de TRA-8 humanizado se confirman por el método didesoxi (Sanger, F. S., et al., (1977), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 74:5463-5467) usando el analizador de ADN 3700 (ABI PRISM; Perkin Elmer Applied Biosystems, Japan).
Los plásmidos resultantes se denominan pHB14 (el plásmido que lleva ADNc que codifica la cadena pesada de TRA-8 humanizado). La cepa de E. coli transformante que lleva este plásmido, denominada E. coli JM109/pHB14 se depositó en el International Patent Organism Depositary, National Institute of Advanced Industrial Science and Technology, 1-1, Higashi 1 chome Tsukuba-shi, Ibaraki-ken, 305-5466, Japón, el 20 de abril de 2001, de acuerdo con el tratado de Budapest para el depósito de microorganismos, y se le asignó el número de acceso FERM BP-7556.
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(2) Construcción de plásmidos de expresión que llevan el ADN de región variable de cadena pesada de TRA-8 humanizado
Se construyen vectores de expresión recombinantes para células animales insertando el ADN que codifica la cadena pesada de TRA-8 humanizado (clonado anteriormente) como se indica a continuación.
Un \mug de plásmido pSRHHH3 (solicitud de patente europea EP 0-909-816-A1) que lleva la región variable de cadena pesada del anticuerpo monoclonal anti-Fas humanizado HFE7A y ADN genómico de la región constante de IgG1 humana, un vector de expresión para células de mamífero, se digiere con las enzimas de restricción Hind III y ApaI y se separa por electroforesis en gel de agarosa al 3%. Después de la electroforesis, el gel se tiñe con 1 \mug/ml de solución acuosa de bromuro de etidio para permitir la detección del ADN con luz ultravioleta. Las bandas de ADN del vector que contienen ADN genómico de región constante de IgG1 humana sin la región variable de cadena pesada de HFE7A humanizado se cortan usando una cuchilla de afeitar y se eluyen del gel usando el kit Geneclean Spin (BIO 101, CA, USA). Después de la extracción con fenol, el ADN eluído se concentra por centrifugación a 7.500 X g, seguido de precipitación con etanol, y finalmente se disuelve en 5 \mul de agua destilada y después se desfosforila usando CIP. El plásmido desfosforilado digerido resultante (100 ng) se liga con 1 \mug del fragmento de ADN de pHB14 que contiene el ADN que codifica la región variable de cadena pesada de TRA-8 humanizado, que también se había digerido con Hind III y ApaI, usando un kit de ligamiento de ADN versión 2.0 (Takara Shuzo Co., Ltd.). La mezcla de ligamiento después se usa para transformar E. coli JM109, que posteriormente se cultiva en placas de agar LB que contienen 50 \mug/ml de ampicilina.
Los transformantes obtenidos por este método se cultivan en 2 ml de medio LB líquido que contiene 50 \mug/ml de ampicilina a 37ºC durante una noche y posteriormente se extrae el ADN plasmídico del cultivo resultante por el método de SDS-alcalino.
El ADN plasmídico extraído se digiere con Hind III y ApaI y se somete a electroforesis en gel de agarosa al 3% p/v para confirmar la presencia o ausencia del inserto del ADN que codifica la región variable de cadena pesada de TRA-8 humanizado. La inserción y orientación del fragmento de ADN deseado en el vector se confirma por secuenciación de ADN usando un analizador de la secuencia del gen (ABI Prism 3700 DNA Analyzer; Applied Biosystems). El plásmido de expresión resultante que lleva ADNc que codifica la cadena pesada de TRA-8 humanizado se denomina pHB14-1.
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Ejemplo 19 Construcción de un vector de expresión para la cadena ligera del anticuerpo humanizado (1) Construcción de vectores para las cadenas ligeras de versiones humanizadas del anticuerpo TRA-8
Como se muestra en la SEC ID Nº:46 de la lista de secuencias, en la humanización de la secuencia de aminoácidos de la cadena ligera del anticuerpo de ratón anti-DR5 humano TRA-8, el 8º aminoácido (histidina), 9º aminoácido (lisina), 10º aminoácido (fenilalanina), 11º aminoácido (metionina), 13º aminoácido (treonina), 20º aminoácido (serina), 42º aminoácido (glutamina), 43º aminoácido (serina), 60º aminoácido (ácido aspártico), 63º aminoácido (treonina), 77º aminoácido (asparagina), 78º aminoácido (valina), 80º aminoácido (serina), 83º aminoácido (leucina), 85º aminoácido (ácido aspártico), 87º aminoácido (fenilalanina), 99º aminoácido (glicina), 103º aminoácido (leucina) y 108º aminoácido (alanina) del extremo N de la secuencia de aminoácidos de la cadena ligera de TRA-8 se reemplazan por prolina, serina, serina, leucina, alanina, treonina, lisina, alanina, serina, serina, serina, leucina, prolina, fenilalanina, treonina, tirosina, glutamina, valina y treonina, respectivamente. La secuencia resultante se denomina LM2.
Se construyen plásmidos de expresión que llevan este tipo de secuencias de aminoácidos de cadena ligera humanizada del anticuerpo anti-DR5 humano TRA-8 como se indica a continuación.
\vskip1.000000\baselineskip
1) Síntesis de cebadores para preparar las regiones variable y constante de la cadena ligera de TRA-8 humanizado
Se sintetizan ADN que codifican las cadenas polipeptídicas de LM2 (SEC ID Nº: 46 de la lista de secuencias), siendo cada una de ellas una fusión de la región variable de la cadena ligera del anticuerpo anti-DR5 humanizado TRA-8 y la región constante de la cadena ligera de Ig humana (cadena \kappa), respectivamente, usando combinaciones de PCR.
Además de 7AL1P (SEC ID Nº: 47) y 7ALCN (SEC ID Nº: 48), se sintetizan los siguientes cebadores oligonucleotídicos para la PCR:
5' - gtcccccaca gatgcagaca aagaacttgg agattgggtc atcacaatgt caccagtgga -3' (HKSPR11; SEC ID Nº: 49);
5' - ccaagttctt tgtctgcatc agtaggagac agggtcacca tcacctgc -3' (HKCDF11; SEC ID Nº: 50);
5' - agtgtgccgg gtggatgccc agtaaatcag tagtttagga gctttccctg gtttctg -3' (HKCDR12; SEC ID Nº: 51);
5' - tgggcatcca cccggcacac tggggtccca agcaggttta gtggcagt - 3' (HKCDF22; SEC ID Nº: 52);
5' - ataactacta tattgctgac agtaataggt tgcaaaatcc tccggctgca gactagagatggt- 3' (HKCDR22; SEC ID Nº: 53); y
5' - cagcaatata gcagctatcg gacgttcggt caaggcacca aggtggaaat caaacggactgtg -3' (HKCFR12; SEC ID Nº: 54).
2) Construcción del plásmido pCR3.1/M2-1 (clonación de la cadena ligera de TRA-8 humanizado)
Se prepara el fragmento LM2-ADN como se define en la SEC ID Nº: 55 de la lista de secuencias que codifica la secuencia de aminoácidos definida en la SEC ID Nº: 46, realizando una PCR de 2 etapas, se inserta en un vector plasmídico y se clona en E. coli.
\vskip1.000000\baselineskip
a) Primera etapa de PCR
Se prepara el fragmento LM2-F1-ADN que codifica una secuencia señal de secreción y una parte de la región FRL_{1} con un sitio de escisión de enzima de restricción Hind III añadido en el extremo 5' en las siguientes condiciones. Los plásmidos de plantilla, pHSGHM17 y pSRPDHH se obtienen por la siguiente descripción en una solicitud de patente europea EP 0 909 816 A1.
Composición de la solución de reacción:
\quad
ADN plasmídico de pHSGHM17 (solicitud de patente europea EP 0 909 816 A1), 25 ng
\quad
cebador oligonucleotídico 7AL1P, 50 pmol
\quad
cebador oligonucleotídico HKSPR11, 50 pmol
\quad
cóctel de dNTP, 5 \mul
\quad
tampón de PCR 10x, 5 \mul
\quad
ADN polimerasa ampliTaq (PerkinElmer), 2,5 unidades.
La solución de reacción que tiene la composición anterior se ajusta a un volumen final de 50 \mul añadiendo agua redestilada y se usa en la PCR.
Condiciones térmicas de PCR: Calentamiento a 94ºC durante 2 minutos, después de lo cual se realiza un ciclo térmico de 94ºC durante 1 minuto, 55ºC durante 1 minuto y 72ºC durante 2 minutos, repetido 30 veces, seguido de calentamiento a 72ºC durante 10 minutos.
El fragmento LM2-F2-ADN que codifica una parte de FRL_{1}, CDRL_{1}, FRL_{2} y CDRL_{2} se prepara en las siguientes condiciones.
Composición de la solución de reacción:
\quad
ADN del plásmido pL28, 25 ng
\quad
cebador oligonucleotídico HKCDF11, 50 pmol
\quad
cebador oligonucleotídico HKCDR12, 50 pmol
\quad
cóctel de dNTP, 5 \mul
\quad
tampón de PCR 10x, 5 \mul
\quad
ADN polimerasa ampliTaq, 2,5 unidades.
La solución de reacción que tiene la composición anterior se ajusta a un volumen final de 50 \mul añadiendo agua redestilada y se usa en la PCR.
Condiciones térmicas de PCR: Calentamiento a 94ºC durante 2 minutos, después de lo cual se realiza un ciclo térmico de 94ºC durante 1 minuto, 55ºC durante 1 minuto y 72ºC durante 2 minutos, repetido 30 veces, seguido de calentamiento a 72ºC durante 10 minutos.
El fragmento LM2-F3-ADN que codifica CDRL_{2}, FRL_{3} y una parte de CDRL_{3} se prepara en las siguientes condiciones.
Composición de la solución de reacción:
\quad
ADN del plásmido pSRPDHH (solicitud de patente europea EP 0 909 816 A1), 25 ng
\quad
cebador oligonucleotídico HKCDF22, 50 pmol
\quad
cebador oligonucleotídico HKCDR22, 50 pmol
\quad
cóctel de dNTP, 5 \mul
\quad
tampón de PCR 10x, 5 \mul
\quad
ADN polimerasa ampliTaq, 2,5 unidades.
La solución de reacción que tiene la composición anterior se ajusta a un volumen final de 50 \mul añadiendo agua redestilada y se usa en la PCR.
Condiciones térmicas de PCR: Calentamiento a 94ºC durante 2 minutos, después de lo cual se realiza un ciclo térmico de 94ºC durante 1 minuto, 55ºC durante 1 minuto y 72ºC durante 2 minutos, repetido 30 veces, seguido de calentamiento a 72ºC durante 10 minutos.
El fragmento LM2-F4-ADN que codifica CDRL_{3}, FRL_{4} y la región constante con un sitio de escisión de enzima de restricción EcoR I añadido en el extremo 3' se prepara en las siguientes condiciones.
Composición de la solución de reacción:
\quad
ADN del plásmido pSRPDHH, 25 ng
\quad
cebador oligonucleotídico HKCF12, 50 pmol
\quad
cebador oligonucleotídico 7ALCN, 50 pmol
\quad
cóctel de dNTP, 5 \mul
\quad
tampón de PCR 10x, 5 \mul
\quad
ADN polimerasa ampliTaq, 2,5 unidades.
La solución de reacción que tiene la composición anterior se ajusta a un volumen final de 50 \mul añadiendo agua redestilada y se usa en la PCR.
Condiciones térmicas de la PCR: Calentamiento a 94ºC durante 2 minutos, después de lo cual se realiza un ciclo térmico de 94ºC durante 1 minuto, 55ºC durante 1 minuto y 72ºC durante 2 minutos, repetido 30 veces, seguido de calentamiento a 72ºC durante 10 minutos.
Los fragmentos de ADN amplificados después de la PCR se separan por electroforesis en gel de poliacrilamida al 5%. El gel después de la electrofóresis se tiñe con 1 \mug/ml de bromuro de etidio para detectar el ADN producido con luz ultravioleta. Las bandas de ADN respectivas detectadas de esta manera se escinden con una cuchilla de afeitar.
\vskip1.000000\baselineskip
b) Segunda etapa de PCR
Se prepara LM2-ADN en el que se fusionan los fragmentos LM2-F1-ADN, LM2-F2-ADN, LM2-F3-ADN y LM2-F4-ADN descritos anteriormente en las siguientes condiciones.
Composición de la solución de reacción:
\quad
fragmento de gel de LM2-F1-ADN preparado en la primera etapa de la PCR,
\quad
fragmento de gel de LM2-F2-ADN preparado en la primera etapa de la PCR,
\quad
fragmento de gel de LM2-F3-ADN preparado en la primera etapa de la PCR,
\quad
fragmento de gel de LM2-F4-ADN preparado en la primera etapa de la PCR,
\quad
cebador oligonucleotídico 7AL1P, 50 pmol
\quad
cebador oligonucleotídico 7ALCN, 50 pmol
\quad
cóctel de dNTP, 5,0 \mul
\quad
tampón de PCR 10x, 5,0 \mul
\quad
ADN polimerasa ampliTaq, 2,5 unidades.
La solución de reacción que tiene la composición anterior se ajusta a un volumen final de 50 \mul añadiendo agua redestilada y se usa en la PCR.
Condiciones térmicas de la PCR: Calentamiento a 94ºC durante 2 minutos, después de lo cual se realiza un ciclo térmico de 94ºC durante 1 minuto, 55ºC durante 1 minuto y 72ºC durante 2 minutos, repetido 30 veces, seguido de calentamiento a 72ºC durante 10 minutos.
El fragmento LM2-ADN preparado de esta manera se inserta en el plásmido pCR3.1DNA usando el kit de clonación Eukaryotic TA (Invitrogen) siguiendo el protocolo del fabricante y se introduce en la cepa de E. coli competente TOP10F' contenida en el kit. Las secuencias de nucleótidos de estos ADN que codifican la cadena ligera de TRA-8 humanizado se confirman por el método didesoxi (Sanger, F.S., et al., (1977), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 74:5463-5467) usando el analizador de ADN 3700 (ABI PRISM; Perkin Elmer Applied Biosystems, Japan).
Los plásmidos resultantes se denominan pCR3.1/M2-1 (el plásmido que lleva el ADNc que codifica la región variable de cadena ligera de TRA-8 humanizado y una región constante de cadena ligera de Ig humana).
El plásmido obtenido pCR3.1/M2-1 que contiene el fragmento LM2-ADN se digiere con las enzimas de restricción Hind III y EcoR I.
Un \mug de ADN del plásmido de clonación pHSG399 se digiere con las enzimas de restricción Hind III y EcoR I y después se desfosforila con CIP. El ADN de pHSG399 desfosforilado resultante y el fragmento LM2-ADN, que se han digerido con las enzimas de restricción Hind III y EcoR I, se ligan usando el kit de ligamiento de ADN versión 2.0 (Takara Syuzo, Co. Ltd.). Después se transforma la cepa de E. coli DH5\alpha con el ADN ligado y se propaga en medio de agar LB que contiene IPTG 0,1 mM, X-Gal al 0,1% y 50 \mug/ml de cloranfenicol (concentraciones finales). Los transformantes blancos obtenidos se cultivan en medio LB líquido que contiene 50 \mug/ml de cloranfenicol y el ADN plasmídico se extrae del cultivo resultante de acuerdo con el método de SDS-alcalino. El ADN plasmídico extraído se digiere con Hind III y EcoR I y después se selecciona un clon que lleva el fragmento LM2-ADN por electroforesis en gel de agarosa al 1%.
Como resultado del procedimiento anterior, se obtiene el plásmido pHSG/M2-1-4 que lleva un fragmento de fusión de la región variable de la cadena ligera de TRA-8 LM2 humanizado y la región constante de la cadena \kappa de Ig humana. La cepa de E. coli transformante que lleva este plásmido, denominada E. coli DH5\alpha/pHSG/M2-1-4 se depositó en International Patent Organism Depositary, National Institute of Advanced Industrial Science and Technology, 1-1, Higashi 1 chome Tsukuba-shi, Ibaraki-ken, 305-5466, Japón, el 20 de abril de 2001, de acuerdo con el tratado de Budapest para el depósito de microorganismos, y se le asignó el número de acceso FERM BP-7563.
\vskip1.000000\baselineskip
3) Construcción del plásmido pSR/M2-1 (plásmido de expresión para la cadena ligera de TRA-8 LM2 humanizado)
El plásmido pHSG/M2-1-4 obtenido que lleva un fragmento de fusión de la región variable de la cadena ligera de TRA-8 LM2 humanizado y la región constante de la cadena \kappa de Ig humana se digiere con las enzimas de restricción Hind III y EcoR I.
Un \mug del ADN del plásmido de clonación pSRPDHH (solicitud de patente europea EP 0-909-816-A1) se digiere con las enzimas de restricción Hind III y EcoR I y después se desfosforila con CIP. El fragmento de ADN de pSRPDHH desfosforilado resultante y el fragmento de ADN Hind III-EcoR I obtenido a partir de pHSG/M2-1-4 se ligan usando el kit de ligamiento de ADN versión 2.0 (Takara Syuzo, Co. Ltd.). Después se transforma la cepa de E. coli DH5\alpha con el ADN ligado y se propaga en agar LB. Los transformantes obtenidos se cultivan en medio LB líquido que contiene 100 \mug/ml de ampicilina y se extrae el ADN plasmídico a partir del cultivo resultante de acuerdo con el método de SDS-alcalino. La inserción y orientación del fragmento de ADN deseado en el vector pSRPDHH se confirma por secuenciación de ADN usando un analizador de la secuencia del gen (ABI Prism 3700 DNA Analyzer; Applied Biosystems).
El plásmido de expresión resultante que lleva el ADNc que codifica la cadena ligera de TRA-8 humanizado se denomina pSR/M2-1.
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Ejemplo 20 Producción de anticuerpo humanizado
Se realiza una transfección de células COS-7, es decir, una línea celular derivada de riñón de mono, con los plásmidos de expresión para la cadena pesada de TRA-8 humanizado y la cadena ligera de TRA-8 humanizado obtenidas anteriormente por métodos de reactivo de transfección FUGENE6 (Boehringer Mannheim Biochemica) de acuerdo con el manual de instrucciones proporcionado con el kit.
Se cultivan células COS-7 (colección americana de cultivos tipo nº CRL-1651) hasta la semiconfluencia (3 x 10^{6} células/placa) en una placa de cultivo (área de cultivo: 57 cm^{2}; Sumitomo Bakelite) que contiene medio de Eagle modificado por Dulbecco (denominado en lo sucesivo "D-MEM"; Gibco BRL) suplementado con suero bovino fetal al 10% (abreviado en lo sucesivo como "FCS"; Moregate).
Mientras tanto, se mezclan 10 \mug/placa (5 placas en total) del ADN del plásmido de expresión de cadena pesada de DR5 humanizado (pHA15-1) y 10 \mug/placa del ADN del plásmido de expresión de cadena ligera de DR5 humanizado preparado por el método de SDS-alcalino y centrifugación en gradiente de densidad de cloruro de cesio, y después se precipitan con etanol seguido de suspensión en 5 \mu/placa de dH_{2}O.
Después se mezclan 15 \mul/placa de reactivo de transfección FUGENE6 con 180 \mul/placa de D-MEM sin FCS, esta solución de FUGENE (185 \mul/placa) se mezcla con 5 \mul/placa de solución de ADN que contiene 10 \mug/placa del ADN del plásmido de expresión de cadena pesada de DR5 humanizado y 10 \mug/placa del ADN del plásmido de expresión de cadena ligera de DR5 humanizado. Después de 15 minutos de incubación a temperatura ambiente, se añade la suspensión de plásmido obtenida (200 \mul) a las placas COS-7 preparadas previamente. Después de incubar en CO_{2} al 5% a 37ºC durante 24 horas, el medio de cultivo se cambia por D-MEM sin FCS. Después de incubar en CO_{2} al 5% a 37ºC durante 72 horas, se recupera el sobrenadante de cultivo para purificar los productos de expresión en los fluidos sobrenadantes. Por el método descrito anteriormente, se transfectan células CO-7 con cada una de las siguientes combinaciones de plásmidos:
(A): sin ADN plasmídico
(B): cotransfección de pHB14-1 y pSR/M2-1
El cultivo después se centrifuga (1.000 r.p.m, 5 minutos) y se recoge el sobrenadante. El sobrenadante se centrifuga de nuevo (9.800 r.p.m, 15 minutos) y se filtra con un filtro de 0,45 \mum (ADVANTEC TOYO DISMIC-25cs, Nº de Cat 25CS045 AS). La purificación de IgG a partir de los filtrados se consigue usando cromatografía de afinidad en proteína G-POROS (Applied Biosystems) en las siguientes condiciones:
HPLC: BioCAD 700E (Applied Biosystems)
columna: Cartucho sensor de proteína G-ID (tamaño de la columna: 2,1 mm DI x 30 mm LD, volumen del lecho: 0,1 ml; Nº de Cat 2-1002-00, Applied Biosystems)
tampón de elución: glicina-HCl 0,1 M (pH 2,5)
tampón de neutralización: Tris-HCl 1 M (pH 8,5)
detección: 280 nm
caudal: 1 ml/min
tamaño de fracción: 0,5 ml/0,5 minutos
tubo de fracción: microtubo de polipropileno de 1,5 ml
temperatura: 4ºC
Después de haber aplicado todos los filtrados a la columna, se usan 30 ml de PBS (Sigma Nº de Cat 1000-3) para lavar la columna. Cuando se aplica el tampón de elución, empieza el colector de fracciones. Cada microtubo de fracción previamente contenía 55 \mul de NaCl 1 M, 110 \mul de tampón de neutralización y 74 \mul de albúmina de suero bovino a 2 mg/ml (Sigma, Nº de Cat A-7030) en PBS. Las fracciones del nº 8 al nº 10 se recogen y se dializan frente a 1 litro de PBS (pH 7,5) a 4ºC durante 1 día usando Slide-A lyzer (Pierce, Nº de Cat 66450). El tampón de diálisis se cambia dos veces.
La verificación de la expresión de los anticuerpos humanizados y el ensayo cuantitativo de los productos de expresión en los fluidos sobrenadantes de cultivo preparados se realiza por ELISA con un anticuerpo contra IgG anti-humana.
A cada pocillo de una placa de 96 pocillos (MaxiSorp, Nunc) se le añaden 100 \mul de anticuerpo policlonal específico de Fc de IgG de cabra anti-humana (Kappel) disuelto a la concentración final de 0,5 \mug/ml en tampón de adsorción (hidrogenocarbonato sódico 0,05 M, azida sódica al 0,02%, pH 9,6) y la placa se incuba a 37ºC durante 2 horas para provocar la adsorción del anticuerpo. Después, la placa se lava con 350 \mul de PBS(-) que contiene Tween-20 al 0,05% (BioRad) (denominado en lo sucesivo "PBS-T") cinco veces. Después del lavado, a los pocillos se les añade el sobrenadante de cultivo diluido con D-MEM que contiene FCS al 10% y se incuban a 37ºC durante 2 horas. Después de lavar de nuevo con PBS-T, se añaden 100 \mul de anticuerpo policlonal específico de Fc de IgG de cabra anti-humana marcado con fosfatasa alcalina (Jackson Immuno Research Lab.) diluido 10.000 veces con PBS-T a cada pocillo y se incuban a 37ºC durante 2 horas. Después de lavar de nuevo con PBS-T, se añade una solución de sustrato de p-nitrofenil fosfato obtenido a partir del kit de sustrato de fosfatasa alcalina (BioRad) de acuerdo con el manual de instrucciones proporcionado con el kit. Después de incubar a 37ºC durante 0,5 a 1 hora, se mide la absorbancia a 405 nm. En los presentes experimentos se usa inmunoglobulina G de plasma humano de subclase 1 (IgG1) (Biopure AG) diluida con D-MEM que contiene FCS al 10% a ciertas concentraciones como muestras de referencia de concentración de los anticuerpos contra DR5 humanizado contenidos en los fluidos sobrenadantes de cultivo.
Como resultado, los productos de expresión y purificados en el sobrenadante de cultivo se detectan específicamente con el anticuerpo anti-IgG humana. La cantidad de anticuerpo para IgG humana es 8,96 \mug (800 \mul).
Ejemplo 21 Actividad inductora de la apoptosis de anticuerpo humanizado
Se usan células Jurkat (ATCC Nº TIB-152) para examinar la actividad inductora de la apoptosis del anticuerpo TRA-8 humanizado purificado.
Se distribuyen células Jurkat cultivadas en medio RPMI1640 con FCS al 10% (Gibco BRL) a 37ºC durante 3 días en presencia de CO_{2} al 5% en cada pocillo de una microplaca de 96 pocillos (Sumitomo Bakelite) a 50 \mul por pocillo. El TRA-8 humanizado preparado en el ejemplo 20 se ajusta para tener una concentración del producto final de interés de 100 ng/ml con medio RPMI1640 que contiene FCS al 10% estimando sus concentraciones en los fluidos de acuerdo con el método descrito en el ejemplo 20. Cada una de las soluciones de los productos de expresión ajustados de esta manera a 100 ng/ml se usa para producir diluciones seriadas repitiendo la dilución seriada a la mitad con RPMI1640 que contiene FCS al 10%. Cada una de las soluciones de TRA-8 humanizado diluidas se añade a cada pocillo a 50 \mul por pocillo. Después de dejar reaccionar a 37ºC durante 12 horas, se añaden 50 \mul de PMS (fenacina metosulfato; Sigma Chemical Co.) 25 \muM que contiene 1 mg/ml de XTT (sal interna de 2,3-bis[2-metoxi-4-nitro-5-sulfofenil]-2H-tetrazolio-5-carboxanilida; Sigma Chemical Co.) (concentraciones finales de 250 \mug/ml para XTT y 5 \muM para PMS). Después de incubar durante 3 horas, se mide la absorbancia a 450 nm de cada pocillo para calcular la viabilidad celular usando la capacidad de reducción de las mitocondrias como índice.
La viabilidad de las células en cada pocillo se calcula de acuerdo con la siguiente fórmula:
Viabilidad (%) = 100 x (a-b) / (c-b)
donde "a" es la medición de un pocillo de ensayo, "b" es la medición de un pocillo sin células y "c" es la medición de un pocillo sin anticuerpo añadido.
Como resultado, se demuestra que el producto de expresión preparado en el ejemplo 20 (TRA-8 humanizado) induce la apoptosis en células de la línea de células de linfoma T que expresan el antígeno DR5 humano.
Ejemplo 22 Reactividad de TRA-8 con diversas moléculas de DR5
Para determinar la reactividad de TRA-8 con diversas moléculas de DR5, se examina la reactividad de TRA-8 usando linfocitos activados como se indica a continuación.
En primer lugar, se toman muestras de sangre periférica de un humano (30 ml), tití (3 ml) y mono cynomolgus (20 ml). Las muestras de sangre tenían 1 ml de heparina (Novoheparin; Novo) que se había añadido y las muestras después se estratifican lentamente en un volumen igual de solución de Ficoll-Paque PLUS ((Amersham Pharmacia Biotech.), gravedad específica: 1,077 para todas las muestras excepto las de mono cynomolgus que tenían una gravedad específica de 1,072) y se centrifugan a 1.700 r.p.m. durante 30 minutos para obtener una fracción de células mononucleares de sangre periférica. Esta fracción de células mononucleares se lava dos veces con solución salina equilibrada de Hank y después se suspende en medio RPMI 1640 con FCS al 10% v/v a una densidad celular de 1 x 10^{6} células/ml. Se añade fitohemaglutinina-P (PHA-P, Sigma Chemicals, Co.) a la suspensión resultante a una concentración final de 5 \mug/ml y la muestra se incuba a 37ºC con CO_{2} al 5% v/v durante 24 horas. Después de este tiempo, las células se recuperan por centrifugación, se lavan y se resuspenden en medio RPMI 1640 que contiene FCS al 10% v/v. Después, para activar las células recuperadas, se añade interleuquina-2 (Amersham Pharmacia Biotech.) a la suspensión a una concentración final de 10 unidades/ml y esto se incuba a 37ºC con un 5% v/v de CO_{2} durante 72 horas.
Una cantidad de la preparación activada que se ha calculado que contiene 1 x 10^{6} linfocitos activados se pone en un tubo de ensayo y se suspende en 50 \mul de TRA-8 a 0,5, 1, 5 ó 10 \mug/ml en PBS o 50 \mul de PBS sola. La suspensión resultante se deja en reposo en hielo durante 1 hora, después de lo cual las células se lavan 3 veces con alícuotas de 500 \mul de PBS y después se suspenden en 50 \mul de anticuerpo anti-IgG de ratón marcado con FITC a 20 \mug/ml (Bioresource) en PBS. Usando las células suspendidas en 500 \mul de PBS como controles, se miden las intensidades de fluorescencia usando un citómetro de flujo (FACSCalibur; Becton Dickinson).
Se obtienen las distribuciones de los números de células por intensidad de fluorescencia y se calculan las proporciones de la cantidad de células teñidas con respecto a la de las células totales. Además, cada valor de Kd se calcula usando la concentración de TRA-8 y las proporciones de la cantidad de las células teñidas con respecto a la de las células totales. Todas las frecuencias de reactividad con linfocitos activados de humano, tití y mono cynomolgus son casi iguales. Por consiguiente, TRA-8 puede unirse a una amplia serie de DR5 de primate incluyendo seres humanos contra los que se preparó originalmente TRA-8.
Ejemplo 23 Estudio de aumento a escala de la dosis de TRA-8 en titíes
Se realiza un estudio de toxicidad preliminar de aumento de la dosis de TRA-8 usando 1 tití macho y 1 tití hembra. Se realizan tres series de dosificaciones intravenosas individuales, que se separan por un período de eliminación de 7 días. La dosis de TRA-8 se fija a 50, 250 y 1250 \mug/cuerpo. Cuarenta y ocho horas después de cada tratamiento, se recoge sangre de la vena femoral y se prepara el plasma. Se miden las actividades aspartato aminotransferasa y alanina aminotransferasa en el plasma usando un analizador (FUJI DRI-CHEM: Fuji Film Medical Co., Ltd.). Todas las muestras de sangre se recogen sin anestesia. Como resultado, no se detectan pruebas indicadoras de lesión hepática en el examen bioquímico del plasma después de cada tratamiento.
Ejemplo 24 Estudios farmacológicos in vitro e in vivo de TRA-8 contra células cancerosas
Para determinar si TRA-8 tiene eficacia terapéutica en la terapia anticancerosa, se examina la actividad de TRA-8 de destrucción in vitro usando diversas líneas de células cancerosas como se indica a continuación.
Diversas células cancerosas (2-8 x 10^{3} células 50 \mul) cultivadas en medio RPMI1640 (en el caso de Jurkat), medio DMEM (en el caso de HCT-116), MEM-R (en el caso de WiDr) o DMEM-F12 (en el caso de COL2-Jck) obtenidas en Gibco BRL con FCS al 10% (Gibco BRL a 37ºC en presencia de CO_{2} al 5% se distribuyen en cada pocillo de una microplaca de 96 pocillos (Sumitomo Bakelite). El anticuerpo TRA-8 se ajusta para tener la concentración del producto final de interés de 100 ng/ml con medio que contiene FCS al 10%. La solución de TRA-8 (100 ng/ml) se usa para producir diluciones seriadas repitiendo la dilución seriada a la mitad con medio que contiene FCS al 10%. Cada una de las soluciones de TRA-8 diluidas se añade a cada pocillo a 50 \mul por pocillo y se incuba a 37ºC. Después de dejar reaccionar a 37ºC durante 72 horas, se añaden 50 \mul de PMS (fenacina metosulfato; Sigma Chemical Co.) 25 \muM que contiene 1 mg/ml de XTT (concentraciones finales de 250 \mug/ml para XTT y 5 \muM para PMS). Después de incubar durante 3 horas, se mide la absorbancia a 450 nm de cada pocillo para calcular la viabilidad celular usando la capacidad de reducción de las mitocondrias como índice.
La viabilidad de las células en cada pocillo se calcula de acuerdo con la siguiente fórmula:
Viabilidad (%) = 100 x (a-b) / (c-b)
donde "a" es la medición de un pocillo de ensayo, "b" es la medición de un pocillo sin células y "c" es la medición de un pocillo sin anticuerpo añadido.
Los resultados se muestran en la tabla 3 presentada a continuación.
TABLA 3
4
Diversas líneas de células cancerosas inducen fuertemente la apoptosis por TRA-8 en las condiciones in vitro.
Además, se determina el efecto antitumoral in vivo de TRA-8 en ratones desnudos en los que se habían trasplantado células WiDr, porque TRA-8 no presenta reacción cruzada con DR5 murino.
Se administra anticuerpo anti-DR5 humano TRA-8 a ratones desnudos que llevan xenoinjertos humanos que expresan la molécula de DR5 humana. Los ratones usados eran ratones nude/nude BALb/c de 6 semanas de edad (hembra, de Clea Japan Inc.) a los que se habían trasplantado líneas de células cancerosas de colon humano WiDr (5 mm^{3}). Un día después del trasplante del tumor, estos ratones trasplantados se tratan diariamente con la inyección intraarticular de TRA-8 (5 \mug/cuerpo) hasta 14 veces. El crecimiento del tumor WiDr se determina diariamente por el tamaño de la masa tumoral. Los resultados se muestran en la tabla 4 presentada a continuación.
TABLA 4
5
En este modelo, aunque todos los animales no tratados presentaron un crecimiento tumoral visible, el crecimiento tumoral en los animales tratados con TRA-8 se inhibe como se demuestra por el tamaño del tumor. Este resultado indicó que TRA-8 es eficaz en la eliminación de las células tumorales in vivo.
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Ejemplo 25 Estudio de combinación de TRA-8
Se obtiene la línea de células cancerosas de próstata humana PC-3 de la colección americana de cultivos de tejidos (ATCC) y se mantiene en mezcla nutriente F-12K (21127-022, Gibco BRL) que contiene suero bovino fetal al 10% (FBS, Hyclone), L-glutamina al 1% 200 mM (25030-149, Gibco BRL) y solución de penicilina y estreptomicina al 0,5% (P-7539, Sigma). En el siguiente experimento se usa medio RPMI1640 (MED-008, IWAKI) suplementado con FBS al 10% y solución de penicilina y estreptomicina al 0,5%. Se recogen células PC-3 en crecimiento exponencial por tripsinización y se lavan dos veces con medio limpio. Las células después se cuentan, se resuspenden en medio limpio a una densidad de 5 x 10^{4} células/ml y se distribuyen por triplicado en placas de 96 pocillos de fondo plano (3598, Corning-Coster) en un volumen total de 100 \mul/pocillo un día antes del inicio del experimento. Un fármaco anticanceroso representativo, Paclitaxel (8169-18611, Wako) disuelto en dimetilsulfóxido (10 mg/ml) se diluye en medio limpio y después se añade a las placas de 96 pocillos que contienen las células a 50 \mul/pocillo. Las concentraciones finales de dimetilsulfóxido son menores del 0,1%. Después de la incubación durante 24 horas a 37ºC en una atmósfera con un 5% de CO_{2}, se añade TRA-8 diluido en medio limpio a los pocillos. Después de la incubación durante 24 horas más, se añaden 50 \mul de medio esencial mínimo (11095-098, Gibco BRL) que contiene 1 mg/ml de XTT y una concentración 25 mM de PMS a los pocillos y las placas se incuban durante 6 horas. Después se mide la DO450 por SPECTRA MAX 250 (Molecular Devices) y la viabilidad celular se calcula como se indica a
continuación.
\quad
Viabilidad celular (%) = (DO450 para el pocillo que contiene células tratadas con Taxol y/o TRA-8 (agente(s)) - DO450 para el pocillo que no contiene ni las células ni agente) x 100 / (DO450 para el pocillo que contiene células sin agente - DO450 para el pocillo que no contiene ni células ni agente).
El resultado del ensayo anterior para TRA-8 combinado con un fármaco anticanceroso representativo, Paclitaxel, se proporciona a continuación. El Paclitaxel redujo la viabilidad celular de las células PC-3 pero más del 40% de las señales que indicaban células cancerosas viables aún permanecían a concentraciones de hasta 200 nM. Notablemente, la adición de 0,1 ng/ml de TRA-8 redujo en gran medida la viabilidad celular de las células cancerosas, hasta un 10%, aunque no se observa reducción en la viabilidad celular después de una sola aplicación de TRA-8 a esta concentración. Este resultado indica claramente que TRA-8 presentaba actividad anticancerosa sinérgicamente cuando se combinaba con otros fármacos anticancerosos.
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Ejemplo 26 Análisis de otros anticuerpos de tipo humanizado de TRA-8 (1) Diseño de anticuerpos humanizados
La construcción de una versión humanizada de TRA-8 se realiza por el método conocido generalmente como injerto de CDR. Como aceptor se usa el anticuerpo mAB58'CL como se describe en el ejemplo de referencia 2 y las regiones CDR del anticuerpo TRA-8 se injertan en el aceptor. En la región flanqueante, se injertan en el aceptor algunos aminoácidos procedentes de TRA-8 o secuencias consenso humanas por los criterios proporcionados por Queen et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86, 10029-10033, 1989)) y se construyen secuencias de TRA-8 humanizadas como se describe más adelante en el presente documento.
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(2) Construcción de un plásmido que lleva ADN de región variable de cadena pesada de otros tipos de TRA-8 humanizado o de ratón
Como se muestra en la SEC ID Nº: 56 de la lista de secuencias, la humanización de tipo H1 de las secuencias de aminoácidos de la cadena pesada del anticuerpo anti-DR5 humano de ratón TRA-8 implicaba el reemplazo del 3º aminoácido (metionina), el 13º aminoácido (lisina), el 19º aminoácido (lisina), el 40º aminoácido (treonina), el 42º aminoácido (ácido glutámico), el 44º aminoácido (arginina), el 84º aminoácido (serina), el 88º aminoácido (serina), el 93º aminoácido (metionina), el 114º aminoácido (treonina) y el 115º aminoácido (leucina) con glutamina, glutamina, arginina, alanina, glicina, glicina, asparagina, alanina, valina, leucina y valina, respectivamente.
Como se muestra en la SEC ID Nº: 59 de la lista de secuencias, la humanización de tipo H3 de las secuencias de aminoácidos de la cadena pesada del anticuerpo de ratón anti-DR5 humano TRA-8 implicaba el reemplazo del 13º aminoácido (lisina), el 19º aminoácido (lisina), el 40º aminoácido (treonina), el 42º aminoácido (ácido glutámico), el 44º aminoácido (arginina), el 88º aminoácido (serina), el 93º aminoácido (metionina), el 114º aminoácido (treonina) y el 115º aminoácido (leucina) por glutamina, arginina, alanina, glicina, glicina, alanina, valina, leucina y valina, respectivamente.
Como se muestra en la SEC ID Nº: 60 de la lista de secuencias, la humanización de tipo H4 de las secuencias de aminoácidos de la cadena pesada del anticuerpo de ratón anti-DR5 humano TRA-8 implicaba el reemplazo del 13º aminoácido (lisina), el 19º aminoácido (lisina), el 88º aminoácido (serina), el 93º aminoácido (metionina), el 114º aminoácido (treonina) y el 115º aminoácido (leucina) por glutamina, arginina, alanina, valina, leucina y valina, respectivamente.
Como se muestra en la SEC ID Nº: 61 de la lista de secuencias, el plásmido que lleva el ADN de la región variable de cadena pesada de TRA-8 quimérico se denomina "tipo M". Además, el TRA-8 humanizado descrito en el ejemplo 17 y 18 se denomina "tipo H2".
Los plásmidos que llevan el ADN que codifica la región variable de cadena pesada de TRA-8 humanizado o quimérico se construyen como se indica a continuación.
Se usa PCR para construir las siguientes secuencias de ADN, comprendiendo cada una de ellas lo que se ha descrito anteriormente:
Se sintetizan los siguientes 24 oligonucleótidos:
5' - ttggataagc ttggcttgac ctcaccatgg gatggagctg tatcatcctc ttcttggtag caacagctac
{}\hskip0,5cm aggtgtccac -3' (A; SEC ID Nº: 32);
5' - tctgaagtaa tgctggtgga gtctggggga ggcttagtac agcctggagg gtccctgaga ctctcctgtg
{}\hskip0,5cm cagcctctgg -3' (B; SEC ID Nº: 33);
5' - tctgaagtac agctggtgga gtctggggga ggcttagtac agcctggagg gtccctgaga ctctcctgtg
{}\hskip0,5cm cagcctctgg -3' (B2; SEC ID Nº: 57);
5' - tctgaagtaa tgctggtgga gtctggggga ggcttagtaa agcctggagg gtccctgaaa ctctcctgtg
{}\hskip0,5cm cagcctctgg -3' (B3; SEC ID Nº: 66);
5' - attcactttc agtagttatg taatgtcttg ggttcggcag gcaccaggga agggtctgga gtgggttgca
{}\hskip0,5cm accattagta -3' (C; SEC ID Nº: 34);
5' - attcactttc agtagttatg taatgtcttg ggttcggcag actccagaga agaggctgga gtgggttgca
{}\hskip0,5cm accattagta -3' (C2; SEC ID Nº: 64);
5' - gtggtggtag ttacacctac tatccagaca gtgtgaaggg ccgattcacc atctccagag acaatgccaa
{}\hskip0,5cm gaacaccctg -3' (D; SEC ID Nº: 35);
5' - tatctgcaaa tgaacagtct gagagcagag gacacggctg tttattactg tgcaagaagg ggtgactcta
{}\hskip0,5cm tgattacgac -3' (E; SEC ID Nº: 36);
5' - tatctgcaaa tgagcagtct gagagcagag gacacggctg tttattactg tgcaagaagg ggtgactcta
{}\hskip0,5cm tgattacgac -3' (E2; SEC ID Nº: 62);
5' - tatctgcaaa tgagcagtct gagatctgag gacacggcta tgtattactg tgcaagaagg ggtgactcta
{}\hskip0,5cm tgattacgac -3' (E3; SEC ID Nº: 67);
5' - ggactactgg ggccaaggga ccctggtcac agtctcctca gcctccacc aagggcccat cggtc -3' (F; SEC ID Nº: 37);
5' - ggactactgg ggccaaggga ccactctcac agtctcctca gcctccacc aagggcccat cggtc -3' (F2; SEC ID Nº: 68);
5' - ctaccaagaa gaggatgata cagctccatc ccatggtgag gtcaagccaa gcttatccaa -3' (G; SEC ID Nº: 38);
5' - tctcagggac cctccaggct gtactaagcc tcccccagac tccaccagca ttacttcaga gtggacacct
{}\hskip0,5cm gtagctgttg -3' (H; SEC ID Nº: 39);
5' - tctcagggac cctccaggct gtactaagcc tcccccagac tccaccagct gtacttcaga gtggacacct
{}\hskip0,5cm gtagctgttg -3' (H2; SEC ID Nº: 58);
5' - tttcagggac cctccaggct ttactaagcc tcccccagac tccaccagca ttacttcaga gtggacacct
{}\hskip0,5cm gtagctgttg -3' (H3; SEC ID Nº: 69);
5' - tccagaccct tccctggtgc ctgccgaacc caagacatta cataactact gaaagtgaat ccagaggctg
{}\hskip0,5cm cacaggagag -3' (I; SEC ID Nº: 40);
5' - tccagcctct tctctggagt ctgccgaacc caagacatta cataactact gaaagtgaat ccagaggctg
{}\hskip0,5cm cacaggagag -3' (I2; SEC ID Nº: 65);
5' - ctctggagat ggtgaatcgg cccttcacac tgtctggata gtaggtgtaa ctaccaccac tactaatggt
{}\hskip0,5cm tgcaacccac -3' (J; SEC ID Nº: 41);
5' - ccttcttgca cagtaataaa cagccgtgtc ctctgctctc agactgttca tttgcagata cagggtgttc
{}\hskip0,5cm ttggcattgt -3' (K; SEC ID Nº: 42);
5' - ccttcttgca cagtaataaa cagccgtgtc ctctgctctc agactgttca tttgcagata cagggtgttc
{}\hskip0,5cm ttggcattgt -3' (K2; SEC ID Nº: 63);
5' - cctcttgca cagtaataca tagccgtgtc ctcagatctc agactgctca tttgcagata cagggtgttc
{}\hskip0,5cm ttggcattgt -3' (K3; SEC ID Nº: 70);
5' - gaccgatggg cccttggtgg aggctgagga gactgtgacc agggtccctt ggccccagta gtccgtcgta
{}\hskip0,5cm atcatagagt cacc -3' (L; SEC ID Nº: 43) y
5' - gaccgatggg cccttggtgg aggctgagga gactgtgaga gtggtccctt ggccccagta gtccgtcgta
{}\hskip0,5cm atcatagagt cacc -3' (L2; SEC ID Nº: 71). 
\vskip1.000000\baselineskip
Se sintetizan los 2 siguientes cebadores de PCR como se ha descrito anteriormente:
5' - ttggataagc ttggcttgac -3' (P1; SEC ID Nº: 44); y
5' - gaccgatggg cccttggtgg a -3' (P2; SEC ID Nº: 45).
Se realiza la síntesis de ADN de tipo H1 que codifica una cadena polipeptídica que comprende una secuencia señal de secreción, una región variable de la cadena pesada de TRA-8 humanizado y los 8 restos aminoacídicos del extremo N de la región CH1 de IgG usando una combinación de PCR respectivamente.
El fragmento de ADN de tipo H1 se prepara como se indica a continuación.
\newpage
Composición de la solución de reacción PCR:
\quad
oligonucleótido A, 10 pmol;
\quad
oligonucleótido B2, 10 pmol;
\quad
oligonucleótido C, 10 pmol;
\quad
oligonucleótido D, 10 pmol;
\quad
oligonucleótido E, 10 pmol;
\quad
oligonucleótido F, 10 pmol;
\quad
oligonucleótido G, 10 pmol;
\quad
oligonucleótido H2, 10 pmol;
\quad
oligonucleótido I, 10 pmol;
\quad
oligonucleótido J, 10 pmol;
\quad
oligonucleótido K, 10 pmol;
\quad
oligonucleótido L, 10 pmol;
\quad
cebador oligonucleótido P1, 2 \muM;
\quad
cebador oligonucleótido P2, 2 \muM;
\quad
tampón Pyrobest II 10 X, 10 \mul;
\quad
mezcla de dNTP, 8 \mul;
\quad
ADN polimerasa Pyrobest, 0,5 \mul; y
\quad
agua redestilada hasta un volumen final de 50 \mul.
La reacción PCR se realiza como se indica a continuación. La solución primero se calienta a 94ºC durante 5 minutos, después de lo cual se repite 7 veces un ciclo de calentamiento a 98ºC durante 10 segundos, 55ºC durante 30 segundos y 72ºC durante 1 minuto. Después de finalizar este procedimiento, la solución de reacción se calienta a 72ºC durante 15 minutos.
Después de la extracción con fenol y precipitación con etanol, el precipitado de ADN resultante se seca al vacío, se disuelve en un mínimo de agua redestilada y se separa por electroforesis en gel de agarosa al 3%. Después de la electroforesis, el gel se tiñe con una solución acuosa de 1 \mug/ml de bromuro de etidio para permitir la detección de ADN con luz ultravioleta. Las bandas de ADN correspondientes al ADN de tipo H1 se cortan usando una cuchilla de afeitar y se eluyen del gel usando el kit Geneclean Spin (BIO 101, CA, USA). Después de la extracción con fenol, el ADN eluido después se concentra por centrifugación a 7.500 X g, seguido de precipitación con etanol, y finalmente se disuelve en 5 \mul de agua destilada.
Se realiza la síntesis del ADN de tipo H3 que codifica una cadena polipeptídica que comprende una secuencia señal de secreción, una región variable de la cadena pesada de TRA-8 humanizado y los 8 restos aminoacídicos del extremo N de la región CH1 de IgG usando una combinación de PCR respectivamente.
El fragmento de ADN de tipo H3 se prepara como se indica a continuación.
Composición de la solución de reacción PCR:
\quad
oligonucleótido A, 10 pmol;
\quad
oligonucleótido B, 10 pmol;
\quad
oligonucleótido C, 10 pmol;
\quad
oligonucleótido D, 10 pmol;
\quad
oligonucleótido E2, 10 pmol;
\quad
oligonucleótido F, 10 pmol;
\quad
oligonucleótido G, 10 pmol;
\quad
oligonucleótido H, 10 pmol;
\quad
oligonucleótido I, 10 pmol;
\quad
oligonucleótido J, 10 pmol;
\quad
oligonucleótido K2, 10 pmol;
\quad
oligonucleótido L, 10 pmol;
\quad
cebador oligonucleótido P1, 2 \muM;
\quad
cebador oligonucleótido P2, 2 \muM;
\quad
tampón Pyrobest II 10 X, 10 \mul;
\quad
mezcla de dNTP, 8 \mul;
\quad
ADN polimerasa Pyrobest 0,5 \mul; y
\quad
agua redestilada hasta un volumen final de 50 \mul.
La reacción PCR se realiza como se indica a continuación. La solución primero se calienta a 94ºC durante 5 minutos, después de lo cual se repite 7 veces un ciclo de calentamiento a 98ºC durante 10 segundos, 55ºC durante 30 segundos y 72ºC durante 1 minuto. Después de finalizar este procedimiento, la solución de reacción se calienta a 72ºC durante 15 minutos.
Después de la extracción con fenol y precipitación con etanol, el precipitado de ADN resultante se seca al vacío, se disuelve en un mínimo de agua redestilada y se separa por electroforesis en gel de agarosa al 3%. Después de la electroforesis, el gel se tiñe con una solución acuosa de 1 \mug/ml de bromuro de etidio para permitir la detección de ADN con luz ultravioleta. Las bandas de ADN correspondientes al ADN de tipo H3 se cortan usando una cuchilla de afeitar y se eluyen del gel usando el kit Geneclean Spin. Después de la extracción con fenol, el ADN eluído después se concentra por centrifugación a 7.500 X g, seguido de precipitación con etanol, y finalmente se disuelve en 5 \mul de agua destilada.
Se realiza la síntesis de ADN de tipo H4 que codifica una cadena polipeptídica que comprende una secuencia señal de secreción, una región variable de la cadena pesada de TRA-8 humanizado y los 8 restos aminoacídicos del extremo N de la región CH1 de IgG usando una combinación de PCR respectivamente.
El fragmento de ADN de tipo H4 se prepara como se indica a continuación.
Composición de la solución de reacción PCR:
\quad
oligonucleótido A, 10 pmol;
\quad
oligonucleótido B, 10 pmol;
\quad
oligonucleótido C2, 10 pmol;
\quad
oligonucleótido D, 10 pmol;
\quad
oligonucleótido E2, 10 pmol;
\quad
oligonucleótido F, 10 pmol;
\quad
oligonucleótido G, 10 pmol;
\quad
oligonucleótido H, 10 pmol;
\quad
oligonucleótido I2, 10 pmol;
\quad
oligonucleótido J, 10 pmol;
\quad
oligonucleótido K2, 10 pmol;
\quad
oligonucleótido L, 10 pmol;
\quad
cebador oligonucleótido P1, 2 \muM;
\quad
cebador oligonucleótido P2, 2 \muM;
\quad
tampón Pyrobest II 10 X, 10 \mul;
\quad
mezcla de dNTP, 8 \mul;
\quad
ADN polimerasa Pyrobest 0,5 \mul; y
\quad
agua redestilada hasta un volumen final de 50 \mul.
La reacción PCR se realiza como se indica a continuación. La solución primero se calienta a 94ºC durante 5 minutos, después de lo cual se repite 7 veces un ciclo de calentamiento a 98ºC durante 10 segundos, 55ºC durante 30 segundos y 72ºC durante 1 minuto. Después de finalizar este procedimiento, la solución de reacción se calienta a 72ºC durante 15 minutos.
Después de la extracción con fenol y precipitación con etanol, el precipitado de ADN resultante se seca al vacío, se disuelve en un mínimo de agua redestilada y se separa por electroforesis en gel de agarosa al 3%. Después de la electroforesis, el gel se tiñe con una solución acuosa de 1 \mug/ml de bromuro de etidio para permitir la detección de ADN con luz ultravioleta. Las bandas de ADN correspondientes al ADN de tipo H4 se cortan usando una cuchilla de afeitar y se eluyen del gel usando el kit Geneclean Spin. Después de la extracción con fenol, el ADN eluído después se concentra por centrifugación a 7.500 X g, seguido de precipitación con etanol, y finalmente se disuelve en 5 \mul de agua destilada.
Se realiza la síntesis de ADN de tipo M que codifica una cadena polipeptídica que comprende una secuencia señal de secreción, una región variable de la cadena pesada de TRA-8 quimérico y los 8 restos aminoacídicos del extremo N de la región CH1 de IgG usando una combinación de PCR respectivamente.
El fragmento de ADN de tipo M se prepara como se indica a continuación.
Composición de la solución de reacción PCR:
\quad
oligonucleótido A, 10 pmol;
\quad
oligonucleótido B3, 10 pmol;
\quad
oligonucleótido C2, 10 pmol;
\quad
oligonucleótido D, 10 pmol;
\quad
oligonucleótido E3, 10 pmol;
\quad
oligonucleótido F2, 10 pmol;
\quad
oligonucleótido G, 10 pmol;
\quad
oligonucleótido H3, 10 pmol;
\quad
oligonucleótido I2, 10 pmol;
\quad
oligonucleótido J, 10 pmol;
\quad
oligonucleótido K3, 10 pmol;
\quad
oligonucleótido L2, 10 pmol;
\quad
cebador oligonucleótido P1, 2 \muM;
\quad
cebador oligonucleótido P2, 2 \muM;
\quad
tampón Pyrobest II 10 X, 10 \mul;
\quad
mezcla de dNTP, 8 \mul;
\quad
ADN polimerasa Pyrobest 0,5 \mul; y
\quad
agua redestilada hasta un volumen final de 50 \mul.
La reacción PCR se realiza como se indica a continuación. La solución primero se calienta a 94ºC durante 5 minutos, después de lo cual se repite 7 veces un ciclo de calentamiento a 98ºC durante 10 segundos, 55ºC durante 30 segundos y 72ºC durante 1 minuto. Después de finalizar este procedimiento, la solución de reacción se calienta a 72ºC durante 15 minutos.
Después de la extracción con fenol y precipitación con etanol, el precipitado de ADN resultante se seca al vacío, se disuelve en un mínimo de agua redestilada y se separa por electroforesis en gel de agarosa al 3%. Después de la electroforesis, el gel se tiñe con una solución acuosa de 1 \mug/ml de bromuro de etidio para permitir la detección de ADN con luz ultravioleta. Las bandas de ADN correspondientes al ADN de tipo M se cortan usando una cuchilla de afeitar y se eluyen del gel usando el kit Geneclean Spin. Después de la extracción con fenol, el ADN eluido después se concentra por centrifugación a 7.500 X g, seguido de precipitación con etanol, y finalmente se disuelve en 5 \mul de agua destilada.
Los ADN extraídos resultantes (de tipo H1, de tipo H3, de tipo H4 y de tipo M) se clonan usando el vector pGEM-T Easy (Promega) como se indica a continuación:
\quad
El fragmento de ADN recuperado de la reacción PCR (H1, H3, H4 o M), 5 \mul;
\quad
Tampón de Taq polimerasa 10 X, 1 \mul
\quad
mezcla de dNTP, 1 \mul;
\quad
Taq polimerasa (5 unidades/ml), 1 \mul; y
\quad
agua redestilada hasta un volumen final de 10 \mul.
Después de dejar reaccionar cada solución anterior a 70ºC durante 30 minutos, cada solución de ADN y el vector pGEM-T Easy se ligan usando el kit de ligamiento de ADN versión 2.0 (Takara Shuzo Co., Ltd.) usando el protocolo del fabricante.
Después de 4 horas de incubación a 15ºC, se mezclan 2 \mul de la solución de reacción incubada con 100 \mul de la cepa de E. coli competente JM109 a una densidad celular de 1-2 x 10^{9} células/ml (Takara Shuzo Co., Ltd.) y la mezcla se mantiene en hielo durante 30 minutos y después a 42ºC durante 30 segundos y de nuevo en hielo durante 1 minuto. Después, se añaden 500 \mul de medio SOC (triptona al 2% v/v, extracto de levadura al 0,5% p/v, cloruro sódico al 0,05% p/v, cloruro potásico 2,5 mM p/v, cloruro de magnesio 1 mM y glucosa 20 mM) a la mezcla, que se incuba durante 1 hora más con agitación. Después se aíslan las cepas transformantes y se prepara ADN plasmídico a partir de las cepas como se describe en "Molecular Cloning: A Laboratory Manual". La secuencia de nucleótidos de este ADN que codifica la cadena pesada de TRA-8 humanizado o de ratón se confirma por el método didesoxi, respectivamente (Sanger, F.S., et al., (1977), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 74:5463-5467) usando el analizador de ADN 3700 (ABI PRISM; Perkin Elmer Applied Biosystems, Japan).
El plásmido resultante se denomina pHA15 (el plásmido que lleva ADNc que codifica la cadena pesada de tipo H1 de TRA-8 humanizado), pHC10 (el plásmido que lleva el ADNc que codifica la cadena pesada de tipo H3 de TRA-8 humanizado), pHD21 (el plásmido que lleva el ADNc que codifica la cadena pesada de tipo H4 de TRA-8 humanizado) y pM11 (el plásmido que lleva el ADNc que codifica la cadena pesada de TRA-8 quimérico). Las cepas de E. coli transformantes que llevan este plásmido, denominadas E. coli JM109/pHA15, E. coli JM109/pHC10, E. coli JM109/pHD21 y E. coli JM109/pM11 se depositaron en International Patent Organism Depositary, National Institute of Advanced Industrial Science and Technology, 1-1, Higashi 1 chome Tsukuba-shi, Ibaraki-ken, 305-5466, Japón, el 20 de abril de 2001 de acuerdo con el tratado de Budapest para el depósito de microorganismos, y recibieron los números de acceso FERM BP-7555, FERM BP-7557, FERM BP-7558 y FERM BP-7559, respectivamente.
\vskip1.000000\baselineskip
(3) Construcción de plásmidos de expresión que llevan el ADN de la región variable de la cadena pesada de varios tipos de TRA-8 humanizado o de ratón
Se construye un vector de expresión recombinante para células animales insertando el ADN que codifica la cadena pesada de TRA-8 humanizado de tipo H1, de tipo H3 y de tipo H4 o TRA-8 quimérico de tipo M (clonado anteriormente) como se indica a continuación.
Un \mug de plásmido pSRHHH3 (solicitud de patente europea EP 0 909 816 A1) que lleva la región variable de cadena pesada del anticuerpo monoclonal anti-Fas humanizado HFE7A y el ADN genómico de región constante de IgG1 humana, un vector de expresión para células de mamífero, se digiere con las enzimas de restricción Hind III y ApaI y se separa por electroforesis en gel de agarosa al 3%. Después de la electroforesis, el gel se tiñe con una solución acuosa a 1 \mug/ml de bromuro de etidio para permitir la detección del ADN con luz ultravioleta. Las bandas de ADN del vector que contienen ADN genómico de región constante de IgG1 humana sin la región variable de cadena pesada de HFE7A humanizado se cortan usando una cuchilla de afeitar y se eluyen del gel usando el kit Geneclean Spin. Después de la extracción con fenol, el ADN eluido se concentra por centrifugación a 7.500 X g, seguido de precipitación con etanol, y finalmente se disuelve en 5 \mul de agua destilada y después se desfosforila usando CIP. El plásmido desfosforilado digerido resultante (100 ng) se liga con 1 \mug del fragmento de ADN de pHA15, pHC10, pHD21 o pM11 que contiene el ADN que codifica la región variable de cadena pesada de TRA-8 humanizado o quimérico, que también se había digerido con Hind III y ApaI, usando un kit de ligamiento de ADN versión 2.0 (Takara Shuzo Co., Ltd.). La mezcla de ligamiento después se usa para transformar E. coli JM109, que después se cultiva en placas de agar LB que contienen 50 \mug/ml de ampicilina.
Los transformantes obtenidos por este método se cultivan en 2 ml de medio LB líquido que contiene 50 \mug/ml de ampicilina a 37ºC durante una noche y posteriormente el ADN plasmídico se extrae del cultivo resultante por el método de SDS-alcalino.
El ADN del plásmido extraído se digiere con Hind III y ApaI y se somete a electroforesis en gel de agarosa al 3% p/v para confirmar la presencia o ausencia del inserto del ADN que codifica la región variable de cadena pesada de TRA-8 humanizado o quimérico. La inserción y orientación del fragmento de ADN deseado en el vector se confirma por secuenciación de ADN usando un analizador de secuencias génicas (ABI Prism 3700 DNA Analyzer; Applied Biosystems). Los plásmidos de expresión resultantes que llevan ADNc que codifica la cadena pesada de TRA-8 humanizado o quimérico se denominaron pHA15-1, pHC10-3, pHD21-1 y pM11-1 respectivamente.
\vskip1.000000\baselineskip
(4) Construcción de vectores para las cadenas ligeras humanizadas (4.1) Construcción de un vector de expresión para la cadena ligera del anticuerpo humanizado (tipo LM1)
Como se muestra en la SEC ID Nº: 72 de la lista de secuencias, otra humanización (de tipo LM1) de las secuencias de aminoácidos de la cadena ligera del anticuerpo de ratón anti-DR5 humano TRA-8 implicaba el reemplazo del 3º aminoácido (valina), 8º aminoácido (histidina), 9º aminoácido (lisina), 10º aminoácido (fenilalanina), 11º aminoácido (metionina), 13º aminoácido (treonina), 20º aminoácido (serina), 42º aminoácido (glutamina), 43º aminoácido (serina), 60º aminoácido (ácido aspártico), 63º aminoácido (treonina), 77º aminoácido (asparagina), 78º aminoácido (valina), 80º aminoácido (serina), 83º aminoácido (leucina), 85º aminoácido (ácido aspártico), 87º aminoácido (fenilalanina) y 99º aminoácido (glicina), 103º aminoácido (leucina) y 108º aminoácido (alanina) del extremo N de la secuencia de aminoácidos de la cadena ligera de TRA-8 por glutamina, prolina, serina, serina, leucina, alanina, treonina, lisina, alanina, serina, serina, serina, leucina, prolina, fenilalanina, treonina, tirosina, glutamina, valina y treonina respectivamente. La secuencia resultante se denomina LM1.
Los plásmidos de expresión que llevan este tipo de secuencias de aminoácidos de cadena ligera humanizada del anticuerpo anti-DR5 humano TRA-8 (de tipo LM1, SEC ID Nº: 72 de la lista de secuencias) se construyen como se indica a continuación.
\vskip1.000000\baselineskip
1) Síntesis de cebadores para preparar las regiones variable y constante de la cadena ligera de TRA-8 humanizado (tipo LM1)
Se sintetizan respectivamente ADN que codifican la cadena polipeptídica de LM1 (SEC ID Nº: 72 de la lista de secuencias), siendo cada uno una fusión de la región variable de la cadena ligera del anticuerpo humanizado anti-DR5 TRA-8 (de tipo LM1) y la región constante de la cadena ligera de Ig humana (cadena \kappa) usando combinaciones de PCR.
Además de 7AL1P (SEC ID Nº: 47) y 7ALCN (SEC ID Nº: 48), HKCDF11 (SEC ID Nº: 50), HKCDR12 (SEC ID Nº: 51), HKCDF22 (SEC ID Nº: 52), HKCDR22 (SEC ID Nº: 53) y HKCF12 (SEC ID Nº: 54), se sintetizan los siguientes cebadores oligonucleotídicos para la PCR:
5' - gtcccccaca gatgcagaca aagaacttgg agattgggtc atctgaatgt caccagtgga -3'
(HKSPR12; SEC ID Nº: 77);
\vskip1.000000\baselineskip
2) Construcción del plásmido pCR3.1/LM1-2 (clonación de cadena ligera de TRA-8 humanizado de tipo LM1)
El fragmento LM1-ADN que codifica la secuencia de aminoácidos definida en la SEC ID Nº: 72 se prepara realizando una PCR de 2 etapas, se inserta en un vector plasmídico y se clona en E. coli.
\vskip1.000000\baselineskip
a) Primera etapa de PCR
Se prepara el fragmento LM1-F1-ADN que codifica una secuencia señal de secreción y una parte de la región FRL_{1} con un sitio de escisión de enzima de restricción Hind III añadido en el extremo 5' en las siguientes condiciones. Los plásmidos de plantilla, pHSGHM17 y pSRPDHH se obtienen siguiendo la descripción de la solicitud de patente europea EP 0 909 816 A1.
Composición de la solución de reacción:
\quad
ADN de plásmido pHSGHM17, 25 ng
\quad
cebador oligonucleotídico 7AL1P, 50 pmol
\quad
cebador oligonucleotídico HKSPR12, 50 pmol
\quad
cóctel de dNTP, 5 \mul
\quad
tampón de PCR 10x 5 \mul
\quad
ADN polimerasa ampliTaq (PerkinElmer), 2,5 unidades.
La solución de reacción que tiene la composición anterior se ajusta a un volumen final de 50 \mul añadiendo agua redestilada y se usa en la PCR.
Condiciones térmicas de PCR: Calentamiento a 94ºC durante 2 minutos, después de lo cual se realiza un ciclo térmico de 94ºC durante 1 minuto, 55ºC durante 1 minuto y 72ºC durante 2 minutos, repetido 30 veces, seguido de calentamiento a 72ºC durante 10 minutos.
El fragmento LM1-F2-ADN que codifica una parte de FRL_{1}, CDRL_{1}, FRL_{2} y CDRL_{2} se prepara en las siguientes condiciones.
Composición de la solución de reacción:
\quad
ADN del plásmido pL28, 25 ng
\quad
cebador oligonucleotídico HKCDF11, 50 pmol
\quad
cebador oligonucleotídico HKCDR12, 50 pmol
\quad
cóctel de dNTP, 5 \mul
\quad
tampón de PCR 10x, 5 \mul
\quad
ADN polimerasa ampliTaq, 2,5 unidades.
La solución de reacción que tiene la composición anterior se ajusta a un volumen final de 50 \mul añadiendo agua redestilada y se usa en la PCR.
Condiciones térmicas de la PCR: Calentamiento a 94ºC durante 2 minutos, después de lo cual se realiza un ciclo térmico de 94ºC durante 1 minuto, 55ºC durante 1 minuto y 72ºC durante 2 minutos, repetido 30 veces, seguido de calentamiento a 72ºC durante 10 minutos.
El fragmento LM1-F3-ADN que codifica CDRL_{2}, FRL_{3} y una parte de CDRL_{3} se prepara en las siguientes condiciones.
Composición de la solución de reacción:
\quad
ADN del plásmido pSRPDHH, 25 ng
\quad
cebador oligonucleotídico HKCDF22, 50 pmol
\quad
cebador oligonucleotídico HKCDR22, 50 pmol
\quad
cóctel de dNTP, 5 \mul
\quad
tampón de PCR 10x, 5 \mul
\quad
ADN polimerasa ampliTaq, 2,5 unidades.
La solución de reacción que tiene la composición anterior se ajusta a un volumen final de 50 \mul añadiendo agua redestilada y se usa en la PCR.
Condiciones térmicas de PCR: Calentamiento a 94ºC durante 2 minutos, después de lo cual se realiza un ciclo térmico de 94ºC durante 1 minuto, 55ºC durante 1 minuto y 72ºC durante 2 minutos, repetido 30 veces, seguido de calentamiento a 72ºC durante 10 minutos.
El fragmento LM1-F4-ADN que codifica CDRL_{3}, FRL_{4} y la región constante con un sitio de escisión de enzima de restricción EcoR I añadido en el extremo 3' se prepara en las siguientes condiciones.
Composición de la solución de reacción:
\quad
ADN del plásmido pSRPDHH, 25 ng
\quad
cebador oligonucleotídico HKCF12, 50 pmol
\quad
cebador oligonucleotídico 7ALCN, 50 pmol
\quad
cóctel de dNTP, 5 \mul
\quad
tampón de PCR 10x, 5 \mul
\quad
ADN polimerasa ampliTaq, 2,5 unidades.
La solución de reacción que tiene la composición anterior se ajusta a un volumen final de 50 \mul añadiendo agua redestilada y se usa en la PCR.
Condiciones térmicas de la PCR: Calentamiento a 94ºC durante 2 minutos, después de lo cual se realiza un ciclo térmico de 94ºC durante 1 minuto, 55ºC durante 1 minuto y 72ºC durante 2 minutos, repetido 30 veces, seguido de calentamiento a 72ºC durante 10 minutos.
Los fragmentos de ADN amplificados después de la PCR se separan por electroforesis en gel de poliacrilamida al 5%. El gel después de la electrofóresis se tiñe con 1 \mug/ml de bromuro de etidio para detectar el ADN producido con luz UV. Las bandas de ADN respectivas detectadas de esta manera se escinden con una cuchilla.
\vskip1.000000\baselineskip
b) Segunda etapa de PCR
LM1-ADN en el que se fusionan los fragmentos LM1-F1-ADN, LM1-F2-ADN, LM1-F3-ADN y LM1-F4-ADN se prepara en las siguientes condiciones.
Composición de la solución de reacción:
\quad
Fragmento de gel de LM1-F1-ADN preparado en la primera etapa de PCR,
\quad
Fragmento de gel de LM1-F2-ADN preparado en la primera etapa de PCR,
\quad
Fragmento de gel de LM1-F3-ADN preparado en la primera etapa de PCR,
\quad
Fragmento de gel de LM1-F4-ADN preparado en la primera etapa de PCR
\quad
cebador oligonucleotídico 7AL1P, 50 pmol
\quad
cebador oligonucleotídico 7ALCN, 50 pmol
\quad
cóctel de dNTP, 5,0 \mul
\quad
tampón de PCR 10x, 5,0 \mul
\quad
ADN polimerasa ampliTaq, 2,5 unidades.
La solución de reacción que tiene la composición anterior se ajusta a un volumen final de 50 \mul añadiendo agua redestilada y se usa en la PCR.
Condiciones térmicas de la PCR: Calentamiento a 94ºC durante 2 minutos, después de lo cual se realiza un ciclo térmico de 94ºC durante 1 minuto, 55ºC durante 1 minuto y 72ºC durante 2 minutos, repetido 30 veces, seguido de calentamiento a 72ºC durante 10 minutos.
El fragmento LM1-ADN preparado de esta manera se inserta en el plásmido pCR3.1DNA usando el kit de clonación Eukaryotic TA (Invitrogen) siguiendo el protocolo del fabricante y se introduce en la cepa de E. coli competente TOP10F' contenida en el kit. Las secuencias de nucleótidos de estos ADN que codifican la cadena ligera de TRA-8 humanizado (tipo LM1) se confirman por el método didesoxi (Sanger, F.S., et al., (1977), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 74:5463-5467) usando el analizador de ADN 3700 (ABI PRISM; Perkin Elmer Applied Biosystems, Japan).
Los plásmidos resultantes se denominan pCR3.1/LM1-2 (el plásmido que lleva el ADNc que codifica la región variable de cadena ligera de TRA-8 humanizado (tipo LM1) y una región constante de cadena ligera de Ig humana).
El plásmido pCR3.1/LM1-2 obtenido que contiene el fragmento LM1-ADN se digiere con las enzimas de restricción Hind III y EcoR I.
Un \mug de ADN del plásmido de clonación pHSG399 se digiere con las enzimas de restricción Hind III y EcoR I y después se desfosforila con CIP. El ADN de pHSG399 desfosforilado resultante y el fragmento LM1-ADN, que se había digerido con las enzimas de restricción Hind III y Eco RI, se ligan usando el kit de ligamiento de ADN versión 2.0 (Takara Syuzo, Co. Ltd.). Después, la cepa de E. coli DH5\alpha se transforma con el ADN ligado y se propaga en medio de agar LB que contiene IPTG 0,1 mM, X-Gal al 0,1% y 50 \mug/ml de cloranfenicol (concentraciones finales). Los transformantes blancos obtenidos se cultivan en medio LB líquido que contiene 50 \mug/ml de cloranfenicol y el ADN plasmídico se extrae del cultivo resultante de acuerdo con el método de SDS-alcalino. El ADN plasmídico extraído se digiere con Hind III y EcoR I y después se selecciona un clon que lleva el fragmento LM1-ADN por electroforesis en gel de agarosa al 1%.
Como resultado del procedimiento anterior, se obtiene el plásmido pHSG/M1-2-2 que lleva un fragmento de fusión de la región variable de la cadena ligera de TRA-8 LM1 humanizado y la región constante de la cadena \kappa de Ig humana. La cepa de E. coli transformante que lleva estos plásmidos, denominada E. coli DH5\alpha/pHSG/M1-2-2 se depositó en International Patent Organism Depositary, National Institute of Advanced Industrial Science and Technology, 1-1, Higashi 1 chome Tsukuba-shi, Ibaraki-ken, 305-5466, Japón, el 20 de abril de 2001, de acuerdo con el tratado de Budapest para el depósito de microorganismos, y se le asignó el número de acceso FERM BP-7562.
\vskip1.000000\baselineskip
3) Construcción del plásmido pSR/LM1-2 (plásmido de expresión para la cadena ligera de TRA-8 LM1 humanizado)
El plásmido obtenido pHSG/M1-2-2 que lleva un fragmento de fusión de la región variable de la cadena ligera de TRA-8 LM1 humanizado y la región constante de la cadena \kappa de Ig humana se digiere con las enzimas de restricción Hind III y EcoR I.
Un \mug del ADN del plásmido de clonación pSRPDHH (solicitud de patente europea EP 0 909 816 A1) se digiere con las enzimas de restricción Hind III y EcoR I y después se desfosforila con CIP. El ADN de pSRPDHH desfosforilado resultante y el fragmento de ADN Hind III-EcoR I obtenido a partir pHSG/M1-2-2 se ligan usando el kit de ligamiento de ADN versión 2.0 (Takara Syuzo, Co. Ltd.). Después, la cepa de E. coli DH5\alpha se transforma con el ADN ligado y se propaga en agar LB. Los transformantes obtenidos se cultivan en medio LB líquido que contiene 100 \mug/ml de ampicilina y el ADN plasmídico se extrae del cultivo resultante de acuerdo con el método de SDS-alcalino. La inserción y orientación del fragmento de ADN deseado en el vector pSRPDHH se confirma por secuenciación de ADN usando un analizador de secuencias génicas.
El plásmido de expresión resultante que lleva el ADNc que codifica la cadena ligera de TRA-8 LM1 humanizado se denomina pSR/LM1-2.
\vskip1.000000\baselineskip
(4.2) Construcción de un vector de expresión para la cadena ligera del anticuerpo humanizado (tipo LM3)
Como se muestra en la SEC ID Nº: 73 de la lista de secuencias, otra humanización (tipo LM3) de las secuencias de aminoácidos de la cadena ligera del anticuerpo de ratón anti-DR5 humano TRA-8 implicaba el reemplazo del 8º aminoácido (histidina), 9º aminoácido (lisina), 10º aminoácido (fenilalanina), 11º aminoácido (metionina), 13º aminoácido (treonina), 20º aminoácido (serina), 42º aminoácido (glutamina), 43º aminoácido (serina), 77º aminoácido (asparagina), 78º aminoácido (valina), 80º aminoácido (serina), 83º aminoácido (leucina), 85º aminoácido (ácido aspártico), 87º aminoácido (fenilalanina), 99º aminoácido (glicina), 103º aminoácido (leucina) y 108º aminoácido (alanina) del extremo N de la secuencia de aminoácidos de la cadena ligera de TRA-8 por prolina, serina, serina, leucina, alanina, treonina, lisina, alanina, serina, leucina, prolina, fenilalanina, treonina, tirosina, glutamina, valina y treonina, respectivamente. La secuencia resultante se denomina LM3.
Se construyen plásmidos de expresión que llevan este tipo de secuencias de aminoácidos de cadena ligera humanizada del anticuerpo anti-DR5 humano TRA-8 (tipo LM3, SEC ID Nº: 73 de la lista de secuencias) como se indica a continuación.
\vskip1.000000\baselineskip
1) Síntesis de cebadores para preparar las regiones variable y constante de la cadena ligera de TRA-8 LM3 humanizado
Se sintetizan respectivamente ADN que codifican la cadena polipeptídica de LM3 (SEC ID Nº: 73 de la lista de secuencias), cada uno de los cuales es una fusión de la región variable de la cadena ligera del anticuerpo anti-DR5 humanizado TRA-8 y la región constante de la cadena ligera de Ig humana (cadena \kappa), usando combinaciones de PCR.
Además de 7AL1P (SEC ID Nº: 47) y 7ALCN (SEC ID Nº: 48), se sintetizan los siguientes cebadores oligonucleotídicos para la PCR:
5' - atctagttct cagagatgga gacagacaca atcctgctat gggtgctgct gctctgggtt ccagg -3' (MOD1F1; SEC ID Nº: 78);
5' - cagcacccat agcaggattg tgtctgtctc catctctgag aactagatga gaggatgctt cttaagctt -3' (MOD1R1; SEC ID Nº: 79);
5' - ctccactggt gacattgtga tgacccaatc tccaagttct ttgtctgcat ctgtggggga cagggtc -3' (MOD1F22; SEC ID Nº: 80);
5' - acttggagat tgggtcatca caatgtcacc agtggagcct ggaacccaga gcag-3' (MOD1R22; SEC ID Nº: 81);
5' - accatcacct gcaaggccag tcaggatgtg ggtactgctg tagcctggta ccaacagaaa ccaggaa -3' (MOD1F3; SEC ID Nº: 82);
5' - tacagcagta cccacatcct gactggcctt gcaggtgatg gtgaccctgt cccccacaga tgcagacaaa ga -3' (MOD1R3; SEC ID Nº: 83);
5' - aagcacccaa actcctcatc tattgggcat ccacccggca cactggggtc ccagataggt ttacaggcag t -3' (MOD1F42; SEC ID Nº: 84);
5' - cccagtgtgc cgggtggatg cccaatagat gaggagtttg ggtgcttttc ctggtttctg ttggtaccag gc -3' (MOD1R4; SEC ID Nº: 85);
5' - gggtctggga cagacttcac cctcaccatc tctagtctgc agccggagga ttttgcaacc tat -3' (MOD1F5; SEC ID Nº: 86);
5' - actagagatg gtgagggtga agtctgtccc agacccactg cctgtaaacc tatctgggac -3' (MOD1R52; SEC ID Nº: 87);
5' - tactgtcagc aatatagcag ctatcggacg ttcggtcaag gcaccaaggt ggaaatc -3' (MOD1F6; SEC ID Nº: 88);
5' - cgtccgatag ctgctatatt gctgacagta ataggttgca aaatcctccg gctgcac -3' (MOD1R6; SEC ID Nº: 89);
5' - aaacggactg tggctgcacc atctgtcttc atcttcccgc catctgatga g -3' (MOD1F7; SEC ID Nº: 90);
5' - gaagatgaag acagatggtg cagccacagt ccgtttgatt tccaccttgg tgccttgacc gaa -3' (MOD1R7; SEC ID Nº: 91); y
5' - agatttcaac tgctcatcag atggcgggaa (LR17; SEC ID Nº: 101).
2) Construcción del plásmido pCR3.1/LM3-3-44 (clonación de cadena ligera de TRA-8 humanizado de tipo LM3)
Se prepara el fragmento LM3-ADN que codifica la secuencia de aminoácidos definida en la SEC ID Nº: 73 realizando una PCR de 2 etapas, se inserta en un vector plasmídico y se clona en E. coli.
\vskip1.000000\baselineskip
a) Primera etapa de PCR
Se prepara el fragmento LM3-F31B-ADN que codifica una región de secuencia señal de secreción con un sitio de escisión de enzima de restricción Hind III añadido en el extremo 5', FRL_{1}, CDRL_{1}, FRL_{2}, CDRL_{2}, FRL_{3}, CDRL_{3}, FRL_{4} y una parte de la región constante en las siguientes condiciones.
Composición de la solución de reacción:
\quad
cebador oligonucleotídico MOD1F1, 5 pmol
\quad
cebador oligonucleotídico MOD1R1, 5 pmol
\quad
cebador oligonucleotídico MOD1F22, 5 pmol
\quad
cebador oligonucleotídico MOD1R22, 5 pmol
\quad
cebador oligonucleotídico MOD1F3, 5 pmol
\quad
cebador oligonucleotídico MOD1R3, 5 pmol
\quad
cebador oligonucleotídico MOD1F42, 5 pmol
\quad
cebador oligonucleotídico MOD1R4, 5 pmol
\quad
cebador oligonucleotídico MOD1F5, 5 pmol
\quad
cebador oligonucleotídico MOD1R52, 5 pmol
\quad
cebador oligonucleotídico MOD1F6, 5 pmol
\quad
cebador oligonucleotídico MOD1R6, 5 pmol
\quad
cebador oligonucleotídico MOD1F7, 5 pmol
\quad
cebador oligonucleotídico MOD1R7, 5 pmol
\quad
cebador oligonucleotídico 7AL1P, 50 pmol
\quad
cebador oligonucleotídico LR17, 50 pmol
\quad
cóctel de dNTP, 5 \mul
\quad
tampón de PCR 10x 5 \mul
\quad
ADN polimerasa ampliTaq, 2,5 unidades.
La solución de reacción que tiene la composición anterior se ajusta a un volumen final de 50 \mul añadiendo agua redestilada y se usa en la PCR.
Condiciones térmicas de PCR: Calentamiento a 94ºC durante 2 minutos, después de lo cual se realiza un ciclo térmico de 94ºC durante 1 minuto, 55ºC durante 1 minuto y 72ºC durante 2 minutos, repetido 30 veces, seguido por calentamiento a 72ºC durante 10 minutos.
Se prepara el fragmento LM3-F31C-ADN que codifica una parte de la región constante con un sitio de escisión de enzima de restricción EcoR I añadido en el extremo 3' en las siguientes condiciones.
El plásmido de plantilla, pSRPDHH, se obtiene siguiendo la descripción de la solicitud de patente europea EP 0 909 816 A1.
Composición de la solución de reacción:
\quad
ADN del plásmido pSRPDHH, 25 ng
\quad
cebador oligonucleotídico MOD1F7, 50 pmol
\quad
cebador oligonucleotídico 7ALCN, 50 pmol
\quad
cóctel de dNTP, 5 \mul
\quad
tampón de PCR 10x 5 \mul
\quad
ADN polimerasa ampliTaq, 2,5 unidades.
La solución de reacción que tiene la composición anterior se ajusta a un volumen final de 50 \mul añadiendo agua redestilada y se usa en la PCR.
Condiciones térmicas de PCR: Calentamiento a 94ºC durante 2 minutos, después de lo cual se realiza un ciclo térmico de 94ºC durante 1 minuto, 55ºC durante 1 minuto y 72ºC durante 2 minutos, repetido 30 veces, seguido de calentamiento a 72ºC durante 10 minutos.
Los fragmentos de ADN amplificados después de la PCR se separan por electroforesis en gel de poliacrilamida al 5%. El gel después de la electroforesis se tiñe con 1 \mug/ml de bromuro de etidio para detectar el ADN producido con luz UV. Las bandas de ADN respectivas detectadas de esta manera se escinden con una cuchilla.
\vskip1.000000\baselineskip
b) Segunda etapa de PCR
Se prepara LM3-ADN en el que se fusionan los fragmentos LM3-F31B-ADN y LM3-F31C-ADN descritos anteriormente en las siguientes condiciones.
Composición de la solución de reacción:
\quad
fragmento de gel de LM3-F31B-ADN preparado en la primera etapa de PCR,
\quad
fragmento de gel de LM3-F31C-ADN preparado en la primera etapa de PCR,
\quad
cebador oligonucleotídico 7AL1P, 50 pmol
\quad
cebador oligonucleotídico 7ALCN, 50 pmol
\quad
cóctel de dNTP, 5,0 \mul
\quad
tampón de PCR 10x, 5,0 \mul
\quad
ADN polimerasa ampliTaq, 2,5 unidades.
La solución de reacción que tiene la composición anterior se ajusta a un volumen final de 50 \mul añadiendo agua redestilada y se usa en la PCR.
Condiciones térmicas de PCR: Calentamiento a 94ºC durante 2 minutos, después de lo cual se realiza un ciclo térmico de 94ºC durante 1 minuto, 55ºC durante 1 minuto y 72ºC durante 2 minutos, repetido 30 veces, seguido de calentamiento a 72ºC durante 10 minutos.
El fragmento LM3-ADN preparado de esta manera se inserta en el plásmido pCR3.1DNA usando el kit de clonación Eukaryotic TA (Invitrogen) siguiendo el protocolo del fabricante y se introduce en las células E. coli competentes TOP10F' contenidas en el kit. Las secuencias de nucleótidos de estos ADN que codifican la cadena ligera de TRA-8 LM3 humanizado se confirman por el método didesoxi (Sanger, F.S., et al., (1977), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 74:5463-5467) usando el analizador de ADN 3700 (ABI PRISM; Perkin Elmer Applied Biosystems, Japan).
Los plásmidos resultantes se denominan pCR3.1/LM3-3-44 (el plásmido que lleva ADNc que codifica la región variable de cadena ligera de TRA-8 LM3 humanizado y la región constante de la cadena ligera de Ig humana).
El plásmido obtenido pCR3.1/LM3-3-44 que contiene el fragmento LM3-ADN se digiere con las enzimas de restricción Hind III y EcoR I.
Un \mug del ADN del plásmido de clonación pHSG399 se digiere con las enzimas de restricción Hind III y EcoR I y después se desfosforila con CIP. El ADN de pHSG399 desfosforilado resultante y el fragmento LM3-ADN, que se habían digerido con las enzimas de restricción Hind III y Eco R I, se ligan usando el kit de ligamiento de ADN versión 2.0 (Takara Syuzo, Co. Ltd.). Después, la cepa de E. coli DH5\alpha se transforma con el ADN ligado y se propaga en medio de agar LB que contiene IPTG 0,1 mM, X-Gal al 0,1% y 50 \mug/ml de cloranfenicol (concentraciones finales). Los transformantes blancos obtenidos se cultivan en medio LB líquido que contiene 50 \mug/ml de cloranfenicol y el ADN plasmídico se extrae del cultivo resultante de acuerdo con el método de SDS-alcalino. El ADN plasmídico extraído se digiere con Hind III y EcoR I y después se selecciona un clon que lleva el fragmento LM3-ADN por electroforesis en gel de agarosa al 1%.
Como resultado del procedimiento anterior, se obtiene el plásmido pHSG/M3-3-22 que lleva un fragmento de fusión de la región variable de la cadena ligera de TRA-8 LM3 humanizado y la región constante de la cadena \kappa de Ig humana. La cepa de E. coli transformante que lleva este plásmido, denominada E. coli DH5\alpha/pHSG/M3-3-22 se depositó en International Patent Organism Depositary, National Institute of Advanced Industrial Science and Technology, 1-1, Higashi 1 chome Tsukuba-shi, Ibaraki-ken, 305-5466, en Japón, el 20 de abril de 2001, de acuerdo con el tratado de Budapest para el depósito de microorganismos, y se le asignó el número de acceso FERM BP-7564.
\vskip1.000000\baselineskip
3) Construcción del plásmido pSR/LM3-3-44-10 (plásmido de expresión para la cadena ligera de TRA-8 de LM3 humanizado)
El plásmido pHSG/M3-3-22 obtenido que lleva un fragmento de fusión de la región variable de la cadena ligera de TRA-8 LM3 humanizado y la región constante de la cadena \kappa de Ig humana se digiere con las enzimas de restricción Hind III y EcoR I.
Un \mug del ADN del plásmido de clonación pSRPDHH (solicitud de patente europea EP 0 909 816 A1) se digiere con las enzimas de restricción Hind III y EcoR I y después se desfosforila con CIP. El ADN de pSRPDHH desfosforilado y el fragmento de ADN Hind III-EcoR I obtenido a partir de pHSG/M3-3-22 se ligan usando el kit de ligamiento de ADN versión 2.0 (Takara Syuzo, Co. Ltd.). Después, la cepa de E. coli DH5\alpha se transforma con el ADN ligado y se propaga en agar LB. Los transformantes obtenidos se cultivan en medio LB líquido que contiene 100 \mug/ml de ampicilina y se extrae el ADN plasmídico del cultivo resultante de acuerdo con el método de SDS-alcalino. La inserción y orientación del fragmento de ADN deseado en el vector pSRPDHH se confirma por secuenciación de ADN usando un analizador de secuencias génicas (ABI Prism 3700 DNA Analyzer; Applied Biosystems).
El plásmido de expresión resultante que lleva el ADNc que codifica la cadena ligera de TRA-8 LM3 humanizado se denomina pSR/LM3-3-44-10.
\vskip1.000000\baselineskip
(4.3) Construcción de un vector de expresión para la cadena ligera del anticuerpo humanizado (tipo LM4)
Como se muestra en la SEC ID Nº: 74 de la lista de secuencias, otra humanización (tipo LM4) de las secuencias de aminoácidos de la cadena ligera del anticuerpo de ratón anti-DR5 humano TRA-8 implicaba el reemplazo del 8º aminoácido (histidina), 9º aminoácido (lisina), 10º aminoácido (fenilalanina), 11º aminoácido (metionina), 13º aminoácido (treonina), 20º aminoácido (serina), 42º aminoácido (glutamina), 43º aminoácido (serina), 77º aminoácido (asparagina), 78º aminoácido (valina), 80º aminoácido (serina), 83º aminoácido (leucina), 85º aminoácido (ácido aspártico), 99º aminoácido (glicina), 103º aminoácido (leucina) y 108º aminoácido (alanina) del extremo N de la secuencia de aminoácidos de la cadena ligera de TRA-8 por prolina, serina, serina, leucina, alanina, treonina, lisina, alanina, serina, leucina, prolina, fenilalanina, treonina, glutamina, valina y treonina respectivamente. La secuencia resultante se denomina LM4.
Se construyen plásmidos de expresión que llevan este tipo de secuencias de aminoácidos de cadena ligera humanizada del anticuerpo anti-DR5 humano TRA-8 (tipo LM4) (SEC ID Nº: 74 de la lista de secuencias) como se indica a continuación.
\vskip1.000000\baselineskip
1) Síntesis de cebadores para preparar las regiones variable y constante de la cadena ligera de TRA-8 LM4 humanizado
Se sintetizan respectivamente ADN que codifican la cadena polipeptídica de LM4 (SEC ID Nº: 74 de la lista de secuencias), siendo cada uno de ellos una fusión de la región variable de la cadena ligera del anticuerpo anti-DR5 humanizado TRA-8 y la región constante de la cadena ligera de Ig humana (cadena \kappa), usando combinaciones de PCR.
Además de 7ALIP (SEC ID Nº: 47), 7ALCN (SEC ID Nº: 48), MOD1F1 (SEC ID Nº: 78), MOD1R1 (SEC ID Nº: 79), MOD1F22 (SEC ID Nº: 80), MOD1R22 (SEC ID Nº: 81), MOD1F3 (SEC ID Nº: 82), MOD1R3 (SEC ID Nº: 83), MOD1F42 (SEC ID Nº: 84), MOD1R4 (SEC ID Nº: 85), MOD1F5 (SEC ID Nº: 86), MOD1R52 (SEC ID Nº: 87), MOD1F7 (SEC ID Nº: 90), MOD1R7 (SEC ID Nº: 91) y LR17 (SEC ID Nº: 101), se sintetizan los siguientes cebadores oligonucleotídicos para la PCR:
\dotable{\tabskip\tabcolsep#\hfil\+#\hfil\tabskip0ptplus1fil\dddarstrut\cr}{
 5' - ttctgtcagc aatatagcag ctatcggacg ttcggtcaag gcaccaaggt ggaaatc
-3' \+ (MOD1F62; SEC ID Nº: 92)\cr \+\cr  5' - cgtccgatag ctgctatatt
gctgacagaa ataggttgca aaatcctccg gctgcag -3'  \+ (MOD1R62; SEC ID
Nº:
93).\cr}
\vskip1.000000\baselineskip
2) Construcción del plásmido pCR3.1/LM4-5-3 (clonación de cadena ligera de TRA-8 humanizado de tipo LM4)
Se prepara el fragmento LM4-ADN que codifica la secuencia de aminoácidos definida en la SEC ID Nº: 74 realizando una PCR de 2 etapas, se inserta en un vector plasmídico y se clona en E. coli.
\vskip1.000000\baselineskip
a) Primera etapa de PCR
Se prepara un fragmento LM4-F41B-ADN que codifica una región de secuencia señal de secreción con un sitio de escisión de enzima de restricción Hind III añadido en el extremo 5', FRL_{1}, CDRL_{1}, FRL_{2}, CDRL_{2}, FRL_{3}, CDRL_{3}, FRL_{4} y una parte de la región constante en las siguientes condiciones.
Composición de la solución de reacción:
\quad
cebador oligonucleotídico MOD1F1, 5 pmol
\quad
cebador oligonucleotídico MOD1R1, 5 pmol
\quad
cebador oligonucleotídico MOD1F22, 5 pmol
\quad
cebador oligonucleotídico MOD1R22, 5 pmol
\quad
cebador oligonucleotídico MOD1F3, 5 pmol
\quad
cebador oligonucleotídico MOD1R3, 5 pmol
\quad
cebador oligonucleotídico MOD1F42, 5 pmol
\quad
cebador oligonucleotídico MOD1R4, 5 pmol
\quad
cebador oligonucleotídico MOD1F5, 5 pmol
\quad
cebador oligonucleotídico MOD1R52, 5 pmol
\quad
cebador oligonucleotídico MOD1F62, 5 pmol
\quad
cebador oligonucleotídico MOD1R62, 5 pmol
\quad
cebador oligonucleotídico MOD1F7, 50 pmol
\quad
cebador oligonucleotídico MOD1R7, 5 pmol
\quad
cebador oligonucleotídico 7ALIP, 50 pmol
\quad
cebador oligonucleotídico LR17, 50 pmol
\quad
cóctel de dNTP, 5 \mul
\quad
tampón de PCR 10x, 5 \mul
\quad
ADN polimerasa ampliTaq, 2,5 unidades.
La solución de reacción que tiene la composición anterior se ajusta a un volumen final de 50 \mul añadiendo agua redestilada y se usa en la PCR.
Condiciones térmicas de PCR: Calentamiento a 94ºC durante 2 minutos, después de lo cual se realiza un ciclo térmico de 94ºC durante 1 minuto, 55ºC durante 1 minuto y 72ºC durante 2 minutos, repetido 30 veces, seguido de calentamiento a 72ºC durante 10 minutos.
Se prepara el fragmento LM4-F41C-ADN que codifica una parte de la región constante con un sitio de escisión de enzima de restricción EcoR I añadido en el extremo 3' en las siguientes condiciones.
El plásmido de plantilla, pSRPDHH, se obtiene siguiendo la descripción de la solicitud de patente europea EP 0 909 816 A1.
Composición de la solución de reacción:
\quad
ADN del plásmido pSRPDHH, 25 ng
\quad
cebador oligonucleotídico MOD1F7, 50 pmol
\quad
cebador oligonucleotídico 7ALCN, 50 pmol
\quad
cóctel de dNTP, 5 \mul
\quad
tampón de PCR 10x, 5 \mul
\quad
ADN polimerasa ampliTaq, 2,5 unidades.
La solución de reacción que tiene la composición anterior se ajusta a un volumen final de 50 \mul añadiendo agua redestilada y se usa en la PCR.
Condiciones térmicas de PCR: Calentamiento a 94ºC durante 2 minutos, después de lo cual se realiza un ciclo térmico de 94ºC durante 1 minuto, 55ºC durante 1 minuto y 72ºC durante 2 minutos, repetido 30 veces, seguido de calentamiento a 72ºC durante 10 minutos.
Los fragmentos de ADN amplificados después de la PCR se separan por electroforesis en gel de poliacrilamida al 5%. El gel después de la electroforesis se tiñe con 1 \mug/ml de bromuro de etidio para detectar el ADN producido con luz UV. Las bandas de ADN respectivas detectadas de esta manera se escinden con una cuchilla.
\vskip1.000000\baselineskip
b) Segunda etapa de PCR
Se prepara LM4-ADN en el que se fusionan los fragmentos LM4-F41B-ADN y LM4-F41C-ADN descritos anteriormente en las siguientes condiciones.
Composición de la solución de reacción:
\quad
fragmento de gel de LM4-F41B-ADN preparado en la primera etapa de PCR,
\quad
fragmento de gel de LM4-F41C-ADN preparado en la primera etapa de PCR,
\quad
cebador oligonucleotídico 7AL1P, 50 pmol
\quad
cebador oligonucleotídico 7ALCN, 50 pmol
\quad
cóctel de dNTP, 5,0 \mul
\quad
tampón de PCR 10x, 5,0 \mul
\quad
ADN polimerasa ampliTaq, 2,5 unidades.
La solución de reacción que tiene la composición anterior se ajusta a un volumen final de 50 \mul añadiendo agua redestilada y se usa en la PCR.
Condiciones térmicas de PCR: Calentamiento a 94ºC durante 2 minutos, después de lo cual se realiza un ciclo térmico de 94ºC durante 1 minuto, 55ºC durante 1 minuto y 72ºC durante 2 minutos, repetido 30 veces, seguido de calentamiento a 72ºC durante 10 minutos.
El fragmento LM4-ADN preparado de esta manera se inserta en el plásmido pCR3.1DNA usando el kit de clonación Eukaryotic TA (Invitrogen) siguiendo el protocolo del fabricante y se introduce en la cepa de E. coli competente TOP10F' contenida en el kit. Las secuencias de nucleótidos de estos ADN que codifican la cadena ligera de TRA-8 LM4 humanizado se confirman por el método didesoxi (Sanger, F.S., et al., (1977), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 74:5463-5467) usando el analizador de ADN 3700 (ABI PRISM; Perkin Elmer Applied Biosystems, Japan).
Los plásmidos resultantes se denominan pCR3.1/LM4-5-3 (el plásmido que lleva ADNc que codifica la región variable de cadena ligera de TRA-8 LM4 humanizado y una región constante de cadena ligera de Ig humana).
El plásmido obtenido pCR3.1/LM4-5-3 que contiene el fragmento LM4-ADN se digiere con las enzimas de restricción Hind III y EcoR I.
Un \mug del ADN del plásmido de clonación pHSG399 se digiere con las enzimas de restricción Hind III y EcoR I y después se desfosforila con CIP. El ADN de pHSG399 desfosforilado resultante y el fragmento LM4-ADN, que se habían digerido con las enzimas de restricción Hind III y EcoR I, se ligan usando el kit de ligamiento de ADN versión 2.0 (Takara Syuzo, Co. Ltd.). Después, la cepa de E. coli DH5\alpha se transforma con el ADN ligado y se propaga en medio de agar LB que contiene IPTG 0,1 mM, X-Gal al 0,1% y 50 \mug/ml de cloranfenicol (concentraciones finales). Los transformantes blancos obtenidos se cultivan en medio LB líquido que contiene 50 \mug/ml de cloranfenicol y el ADN plasmídico se extrae del cultivo resultante de acuerdo con el método de SDS-alcalino. El ADN plasmídico extraído se digiere con Hind III y EcoR I y después se selecciona un clon que lleva el fragmento LM4-ADN por electroforesis en gel de agarosa al 1%.
Como resultado del procedimiento anterior, se obtiene el plásmido pHSG/M4-5-3-1 que lleva un fragmento de fusión de la región variable de la cadena ligera de TRA-8 LM4 humanizado y la región constante de la cadena \kappa de Ig humana. La cepa de E. coli transformante que lleva este plásmido, denominada E. coli DH5\alpha/pHSG/M4-5-3-1 se depositó en International Patent Organism Depositary, National Institute of Advanced Industrial Science and Technology, 1-1, Higashi 1 chome Tsukuba-shi, Ibaraki-ken, 305-5466, Japón, el 20 de abril de 2001, de acuerdo con el tratado de Budapest para el depósito de microorganismos, y se le asignó el número de acceso FERM BP-7565.
\vskip1.000000\baselineskip
3) Construcción del plásmido pSR/LM4-5-3-3 (plásmido de expresión para la cadena ligera de TRA-8 LM4 humanizado)
El plásmido pHSG/M4-5-3-1 obtenido que lleva un fragmento de fusión de la región variable de la cadena ligera de TRA-8 LM4 humanizado y la región constante de la cadena \kappa de Ig humana se digiere con las enzimas de restricción Hind III y EcoR I.
Un \mug del ADN del plásmido de clonación pSRPDHH (solicitud de patente europea EP 0 909 816 A1) se digiere con las enzimas de restricción Hind III y EcoR I y después se desfosforila con CIP. El ADN de pSRPDHH desfosforilado resultante y el fragmento de ADN Hind III-EcoR I obtenido a partir pHSG/M4-5-3-1 se ligan usando el kit de ligamiento de ADN versión 2.0 (Takara Syuzo, Co. Ltd.). Después, la cepa de E. coli DH5\alpha se transforma con el ADN ligado y se propaga en agar LB. Los transformantes obtenidos se cultivan en medio LB líquido que contiene 100 \mug/ml de ampicilina y el ADN plasmídico se extrae del cultivo resultante de acuerdo con el método de SDS-alcalino. La inserción y orientación del fragmento de ADN deseado en el vector pSRPDHH se confirma por secuenciación de ADN usando un analizador de la secuencia génica.
El plásmido de expresión resultante que lleva ADNc que codifica la cadena ligera de TRA-8 LM4 humanizado se denomina pSR/LM4-5-3-3.
\vskip1.000000\baselineskip
(4.4) Construcción de un vector de expresión para la cadena ligera del anticuerpo humanizado (tipo LM5)
Como se muestra en la SEC ID Nº: 75 de la lista de secuencias, otra humanización (tipo LM5) de las secuencias de aminoácidos de la cadena ligera del anticuerpo de ratón anti-DR5 humano TRA-8 implicaba el reemplazo del 8º aminoácido (histidina), 9º aminoácido (lisina), 10º aminoácido (fenilalanina), 11º aminoácido (metionina), 13º aminoácido (treonina), 20º aminoácido (serina), 42º aminoácido (glutamina), 43º aminoácido (serina), 77º aminoácido (asparagina), 78º aminoácido (valina), 80º aminoácido (serina), 83º aminoácido (leucina), 103º aminoácido (leucina) y 108º aminoácido (alanina) del extremo N de la secuencia de aminoácidos de la cadena ligera de TRA-8 por prolina, serina, serina, leucina, alanina, treonina, lisina, alanina, serina, leucina, prolina, fenilalanina, valina y treonina, respectivamente. La secuencia resultante se denomina LM5.
Se construyen plásmidos de expresión que llevan este tipo de secuencias de aminoácidos de cadena ligera humanizada del anticuerpo anti-DR5 humano TRA-8 (tipo LM5, SEC ID Nº: 75 de la lista de secuencias) como se indica a continuación.
\vskip1.000000\baselineskip
1) Síntesis de cebadores para preparar las regiones variable y constante de la cadena ligera de TRA-8 LM5 humanizado
Se sintetizan ADN que codifican la cadena polipeptídica de LM5 (SEC ID Nº: 75 de la lista de secuencias), cada uno de los cuales es una fusión de la región variable de la cadena ligera del anticuerpo anti-DR5 humanizado TRA-8 y la región constante de la cadena ligera de Ig humana (cadena \kappa), usando combinaciones de PCR.
Además de 7ALIP (SEC ID Nº: 47), 7ALCN (SEC ID Nº: 48), MOD1F1 (SEC ID Nº: 78), MOD1R1 (SEC ID Nº: 79), MOD1F22 (SEC ID Nº: 80), MOD1R22 (SEC ID Nº: 81), MOD1F3 (SEC ID Nº: 82), MOD1R3 (SEC ID Nº: 83), MOD1F42 (SEC ID Nº: 84), MOD1R4 (SEC ID Nº: 85), MOD1R52 (SEC ID Nº: 87), MOD1F7 (SEC ID Nº: 90) y LR17 (SEC ID Nº: 101), se sintetizan los siguientes cebadores oligonucleotídicos para la PCR:
\dotable{\tabskip\tabcolsep#\hfil\+#\hfil\tabskip0ptplus1fil\dddarstrut\cr}{
 5' - gggtctggga cagacttcac cctcaccatc tctagtctgc agccggagga
ttttgcagat tat -3' \+ (MOD1F52; SEC ID Nº: 94)\cr \+\cr  5' -
ttctgtcagc aatatagcag ctatcggacg ttcggtggag gcaccaaggt ggaaatc -3' 
\+ (MOD1F63; SEC ID Nº: 95)\cr \+\cr  5' - cgtccgatag ctgctatatt
gctgacagaa ataatctgca aaatcctccg gctgcag -3'  \+ (MOD1R63; SEC ID
Nº: 96)\cr \+\cr  5' - gaagatgaag acagatggtg cagccacagt ccgtttgatt
tccaccttgg tgcctccacc gaa-3'  \+ (MOD1R72; SEC ID
Nº:
102).\cr}
\vskip1.000000\baselineskip
2) Construcción del plásmido pCR3.1/LM5-3-42 (clonación de cadena ligera de TRA-8 humanizado de tipo LM5)
Se prepara el fragmento LM5-ADN que codifica la secuencia de aminoácidos definida en la SEC ID Nº: 75 realizando una PCR de 2 etapas, se inserta en un vector plasmídico y se clona en E. coli.
\vskip1.000000\baselineskip
a) Primera etapa de PCR
Se prepara el fragmento LM5-F51B-ADN que codifica una región de secuencia señal de secreción con un sitio de escisión de enzima de restricción Hind III añadido en el extremo 5', FRL_{1}, CDRL_{1}, FRL_{2}, CDRL_{2}, FRL_{3}, CDRL_{3}, FRL_{4} y una parte de la región constante en las siguientes condiciones.
Composición de la solución de reacción:
\quad
cebador oligonucleotídico MOD1F1, 5 pmol
\quad
cebador oligonucleotídico MOD1R1, 5 pmol
\quad
cebador oligonucleotídico MOD1F22, 5 pmol
\quad
cebador oligonucleotídico MOD1R22, 5 pmol
\quad
cebador oligonucleotídico MOD1F3, 5 pmol
\quad
cebador oligonucleotídico MOD1R3, 5 pmol
\quad
cebador oligonucleotídico MOD1F42, 5 pmol
\quad
cebador oligonucleotídico MOD1R4, 5 pmol
\quad
cebador oligonucleotídico MOD1F52, 5 pmol
\quad
cebador oligonucleotídico MOD1R52, 5 pmol
\quad
cebador oligonucleotídico MOD1F63, 5 pmol
\quad
cebador oligonucleotídico MOD1R63, 5 pmol
\quad
cebador oligonucleotídico MOD1F7, 50 pmol
\quad
cebador oligonucleotídico MOD1R72, 5 pmol
\quad
cebador oligonucleotídico 7ALIP, 50 pmol
\quad
cebador oligonucleotídico LR17, 50 pmol
\quad
cóctel de dNTP, 5 \mul
\quad
tampón de PCR 10x, 5 \mul
\quad
ADN polimerasa ampliTaq, 2,5 unidades.
La solución de reacción que tiene la composición anterior se ajusta a un volumen final de 50 \mul añadiendo agua redestilada y se usa en la PCR.
Condiciones térmicas de PCR: Calentamiento a 94ºC durante 2 minutos, después de lo cual se realiza un ciclo térmico de 94ºC durante 1 minuto, 55ºC durante 1 minuto y 72ºC durante 2 minutos, repetido 30 veces, seguido de calentamiento a 72ºC durante 10 minutos.
Se prepara el fragmento LM5-F51C-ADN que codifica una parte de la región constante con un sitio de escisión de enzima de restricción EcoR I añadido en el extremo 3' en las siguientes condiciones. El plásmido de plantilla, pSRPDHH, se obtiene siguiendo la descripción de la solicitud de patente europea EP 0 909 816 A1.
Composición de la solución de reacción:
\quad
ADN del plásmido pSRPDHH, 25 ng
\quad
cebador oligonucleotídico MOD1F7, 50 pmol
\quad
cebador oligonucleotídico 7ALCN, 50 pmol
\quad
cóctel de dNTP, 5 \mul
\quad
tampón de PCR 10x, 5 \mul
\quad
ADN polimerasa ampliTaq, 2,5 unidades.
La solución de reacción que tiene la composición anterior se ajusta a un volumen final de 50 \mul añadiendo agua redestilada y se usa en la PCR.
Condiciones térmicas de PCR: Calentamiento a 94ºC durante 2 minutos, después de lo cual se realiza un ciclo térmico de 94ºC durante 1 minuto, 55ºC durante 1 minuto y 72ºC durante 2 minutos, repetido 30 veces, seguido de calentamiento a 72ºC durante 10 minutos.
Los fragmentos de ADN amplificados después de la PCR se separan por electroforesis en gel de poliacrilamida al 5%. El gel después de la electroforesis se tiñe con 1 \mug/ml de bromuro de etidio para detectar el ADN producido con luz UV. Las bandas de ADN respectivas detectadas de esta manera se escinden con una cuchilla de afeitar.
\vskip1.000000\baselineskip
b) Segunda etapa de PCR
Se prepara LM5-ADN en el que se fusionan los fragmentos LM5-F51B-ADN y LM5-F51C-ADN descritos anteriormente en las siguientes condiciones.
Composición de la solución de reacción:
\quad
fragmento de gel de LM5-F51B-ADN preparado en la primera etapa de PCR,
\quad
fragmento de gel de LM5-F51C-ADN preparado en la primera etapa de PCR,
\quad
cebador oligonucleotídico 7AL1P, 50 pmol
\quad
cebador oligonucleotídico 7ALCN, 50 pmol
\quad
cóctel de dNTP, 5,0 \mul
\quad
tampón de PCR 10x, 5,0 \mul
\quad
ADN polimerasa ampliTaq, 2,5 unidades.
La solución de reacción que tiene la composición anterior se ajusta a un volumen final de 50 \mul añadiendo agua redestilada y se usa en la PCR.
Condiciones térmicas de PCR: Calentamiento a 94ºC durante 2 minutos, después de lo cual se realiza un ciclo térmico de 94ºC durante 1 minuto, 55ºC durante 1 minuto y 72ºC durante 2 minutos, repetido 30 veces, seguido de calentamiento a 72ºC durante 10 minutos.
El fragmento LM5-ADN preparado de esta manera se inserta en el plásmido pCR3.1DNA usando el kit de clonación Eukaryotic TA (Invitrogen) siguiendo el protocolo del fabricante y se introduce en la cepa de E. coli competente TOP10F' contenida en el kit. Las secuencias de nucleótidos de estos ADN que codifican la cadena ligera de TRA-8 LM5 humanizado se confirman por el método didesoxi (Sanger, F. S., et al., (1977), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 74:5463-5467) usando un analizador de ADN.
El plásmido resultante se denomina pCR3.1/LM5-3-42 (el plásmido que lleva ADNc que codifica la región variable de cadena ligera de TRA-8 LM5 humanizado y la región constante de cadena ligera de Ig humana).
El plásmido obtenido pCR3.1/LM5-3-42 que contiene el fragmento LM5-ADN se digiere con las enzimas de restricción Hind III y EcoR I.
Un \mug del ADN del plásmido de clonación pHSG399 se digiere con las enzimas de restricción Hind III y EcoR I y después se desfosforila con CIP. El ADN de pHSG399 desfosforilado resultante y el fragmento LM5-ADN, que se habían digerido con las enzimas de restricción Hind III y EcoR I, se ligan usando el kit de ligamiento de ADN versión 2.0 (Takara Syuzo, Co. Ltd.). Después, la cepa de E. coli DH5\alpha se transforma con el ADN ligado y se propaga en medio de agar LB que contiene IPTG 0,1 mM, X-Gal al 0,1% y 50 \mug/ml de cloranfenicol (concentraciones finales). Los transformantes blancos obtenidos se cultivan en medio LB líquido que contiene 50 \mug/ml de cloranfenicol y el ADN plasmídico se extrae del cultivo resultante de acuerdo con el método de SDS-alcalino. El ADN plasmídico extraído se digiere con Hind III y EcoR I y después se selecciona un clon que lleva el fragmento LM5-ADN por electroforesis en gel de agarosa al 1%.
Como resultado del procedimiento anterior, se obtiene el plásmido pHSG/M5-3-27 que lleva un fragmento de fusión de la región variable de la cadena ligera de TRA-8 LM5 humanizado y la región constante de la cadena \kappa de Ig humana.
\vskip1.000000\baselineskip
3) Construcción del plásmido pSR/LM5-3-27-1 (plásmido de expresión para la cadena ligera de TRA-8 LM5 humanizado)
El plásmido pHSG/M5-3-27 obtenido que lleva un fragmento de fusión de la región variable de la cadena ligera de TRA-8 LM5 humanizado y la región constante de la cadena \kappa de Ig humana se digiere con las enzimas de restricción Hind III y EcoR I.
Un \mug del ADN del plásmido de clonación pSRPDHH (solicitud de patente europea EP 0 909 816 A1) se digiere con las enzimas de restricción Hind III y EcoR I y después se desfosforila con CIP. El ADN de pSRPDHH desfosforilado resultante y el fragmento de ADN Hind III-EcoR I obtenido a partir pHSG/M5-3-27 se ligan usando el kit de ligamiento de ADN versión 2.0 (Takara Syuzo, Co. Ltd.). Después, la cepa de E. coli DH5\alpha se transforma con el ADN ligado y se propaga en agar LB. Los transformantes obtenidos se cultivan en medio LB líquido que contiene 100 \mug/ml de ampicilina y el ADN plasmídico se extrae del cultivo resultante de acuerdo con el método de SDS-alcalino. La inserción y orientación del fragmento de ADN deseado en el vector pSRPDHH se confirma por secuenciación de ADN usando un analizador de la secuencia génica (ABI Prism 3700 DNA Analyzer; Applied Biosystems).
El plásmido de expresión resultante que lleva ADNc que codifica la cadena ligera de TRA-8 LM5 humanizado se denomina pSR/LM5-3-27-1.
\vskip1.000000\baselineskip
(4.5) Construcción de un vector de expresión para la cadena ligera del anticuerpo humanizado (tipo quimérico)
La secuencia mostrada en la SEC ID Nº: 76 de la lista de secuencias, la secuencia de aminoácidos de la cadena ligera de TRA-8 de tipo quimérico, se denomina LM6.
Se construyen plásmidos de expresión que llevan este tipo de secuencias de aminoácidos de cadena ligera humanizada del anticuerpo anti-DR5 humano TRA-8 (tipo LM6) (SEC ID Nº: 75 de la lista de secuencias) como se indica a continuación.
\vskip1.000000\baselineskip
1) Síntesis de cebadores para preparar las regiones variable y constante de la cadena ligera de TRA-8 LM6 humanizado
Se sintetiza ADN que codifica la cadena polipeptídica de LM6 (SEC ID Nº: 75 de la lista de secuencias), siendo cada uno una fusión de la región variable de la cadena ligera del anticuerpo de ratón anti-DR5 TRA-8 (tipo LM6) y la región constante de la cadena ligera de Ig humana (cadena \kappa), usando combinaciones de PCR.
\global\parskip0.950000\baselineskip
Además de 7ALIP (SEC ID Nº: 47) y 7ALCN (SEC ID Nº: 48), se sintetizan los siguientes cebadores oligonucleotídicos para la PCR:
5' - tgatgtggac atgaatttgt gagactgggt catcacaatg tcaccagtgg a -3' (HKSPR13; SEC ID Nº: 97);
5' - tgggttccag gctccactgg tgacattgtg atgacccagt ctcacaaatt c -3' (MVF11; SEC ID Nº: 98);
5' - aagacagatg gtgcagccac agcccgtttg atttccagct tggtgcctc - 3' (MVR11; SEC ID Nº: 99); y
5' - aagctggaaa tcaaacgggc tgtggctgca ccatctgtct tcatc - 3' (MCF11; SEC ID Nº: 100). 
\vskip1.000000\baselineskip
2) Construcción del plásmido pCR3.1/LM6-1-16 (clonación de cadena ligera de TRA-8 humanizado de tipo LM6)
Se prepara el fragmento LM6-ADN que codifica la secuencia de aminoácidos definida en la SEC ID Nº: 75 realizando PCR de 2 etapas, se inserta en un vector plasmídico y se clona en E. coli.
\vskip1.000000\baselineskip
a) Primera etapa de PCR
Se prepara el fragmento LM6-F1-ADN que codifica una secuencia señal de secreción y una parte de la región FRL_{1} con un sitio de escisión de enzima de restricción Hind III añadido en el extremo 5' en las siguientes condiciones. Los plásmidos de plantilla, pHSGHM17 y pSRPDHH, se obtienen siguiendo la descripción de la solicitud de patente europea EP 0 909 816 A1.
Composición de la solución de reacción:
\quad
ADN de plásmido pHSGHM17, 25 ng
\quad
cebador oligonucleotídico 7AL1P, 50 pmol
\quad
cebador oligonucleotídico HKSPR13, 50 pmol
\quad
cóctel de dNTP, 5 \mul
\quad
tampón de PCR 10x, 5 \mul
\quad
ADN polimerasa ampliTaq (PerkinElmer), 2,5 unidades.
La solución de reacción que tiene la composición anterior se ajusta a un volumen final de 50 \mul añadiendo agua redestilada y se usa en la PCR.
Condiciones térmicas de PCR: Calentamiento a 94ºC durante 2 minutos, después de lo cual se realiza un ciclo térmico de 94ºC durante 1 minuto, 55ºC durante 1 minuto y 72ºC durante 2 minutos, repetido 30 veces, seguido de calentamiento a 72ºC durante 10 minutos.
El fragmento LM6-F2-ADN que codifica una parte de FRL_{1}, CDRL_{1}, FRL_{2}, CDRL_{2}, FRL_{3}, CDRL_{3}, FRL_{4} y una parte de la región constante se prepara en las siguientes condiciones.
Composición de la solución de reacción:
\quad
ADN de plásmido pL28, 25 ng
\quad
cebador oligonucleotídico MVF11, 50 pmol
\quad
cebador oligonucleotídico MVR12, 50 pmol
\quad
cóctel de dNTP, 5 \mul
\quad
tampón de PCR 10x, 5 \mul
\quad
ADN polimerasa ampliTaq (PerkinElmer), 2,5 unidades.
La solución de reacción que tiene la composición anterior se ajusta a un volumen final de 50 \mul añadiendo agua redestilada y se usa en la PCR.
Condiciones térmicas de PCR: Calentamiento a 94ºC durante 2 minutos, después de lo cual se realiza un ciclo térmico de 94ºC durante 1 minuto, 55ºC durante 1 minuto y 72ºC durante 2 minutos, repetido 30 veces, seguido por calentamiento a 72ºC durante 10 minutos.
\global\parskip1.000000\baselineskip
El fragmento LM6-F3-ADN que codifica una parte de FRL_{4} y la región constante con un sitio de escisión de enzima de restricción EcoR I añadido en el extremo 3' se prepara en las siguientes condiciones.
Composición de la solución de reacción:
\quad
ADN de plásmido pSRPDHH, 25 ng
\quad
cebador oligonucleotídico MCF11, 50 pmol
\quad
cebador oligonucleotídico 7ALCN, 50 pmol
\quad
cóctel de dNTP, 5 \mul
\quad
tampón de PCR 10x, 5 \mul
\quad
ADN polimerasa ampliTaq (PerkinElmer), 2,5 unidades.
La solución de reacción que tiene la composición anterior se ajusta a un volumen final de 50 \mul añadiendo agua redestilada y se usa en la PCR.
Condiciones térmicas de PCR: Calentamiento a 94ºC durante 2 minutos, después de lo cual se realiza un ciclo térmico de 94ºC durante 1 minuto, 55ºC durante 1 minuto y 72ºC durante 2 minutos, repetido 30 veces, seguido de calentamiento a 72ºC durante 10 minutos.
Los fragmentos de ADN amplificados después de la PCR se separan por electroforesis en gel de poliacrilamida al 5%. El gel, después de la electroforesis, se tiñe con 1 \mug/ml de bromuro de etidio para detectar el ADN producido con luz UV. Las bandas de ADN respectivas detectadas de esta manera se escinden con una cuchilla de afeitar.
\vskip1.000000\baselineskip
b) Segunda etapa de PCR
Se prepara LM6-ADN en el que se fusionan los fragmentos LM6-F1-ADN, LM6-F2-ADN y LM6-F3-ADN descritos anteriormente en las siguientes condiciones.
Composición de la solución de reacción:
\quad
fragmento de gel de LM6-F1-ADN preparado en la primera etapa de PCR,
\quad
fragmento de gel de LM6-F2-ADN preparado en la primera etapa de PCR,
\quad
fragmento de gel de LM6-F3-ADN preparado en la primera etapa de PCR,
\quad
cebador oligonucleotídico 7AL1P, 50 pmol
\quad
cebador oligonucleotídico 7ALCN, 50 pmol
\quad
cóctel de dNTP, 5,0 \mul
\quad
tampón de PCR 10x, 5,0 \mul
\quad
ADN polimerasa ampliTaq, 2,5 unidades.
La solución de reacción que tiene la composición anterior se ajusta a un volumen final de 50 \mul añadiendo agua redestilada y se usa en la PCR.
Condiciones térmicas de PCR: Calentamiento a 94ºC durante 2 minutos, después de lo cual se realiza un ciclo térmico de 94ºC durante 1 minuto, 55ºC durante 1 minuto y 72ºC durante 2 minutos, repetido 30 veces, seguido de calentamiento a 72ºC durante 10 minutos.
El fragmento LM6-ADN preparado de esta manera se inserta en el plásmido pCR3.1DNA usando el kit de clonación Eukaryotic TA (Invitrogen) siguiendo el protocolo del fabricante y se introduce en la cepa de E. coli competente TOP10F' contenida en el kit. Las secuencias de nucleótidos de estos ADN que codifican la cadena ligera de TRA-8 humanizado se confirman por el método didesoxi usando un analizador de ADN.
Los plásmidos resultantes se denominan pCR3.1/LM6-1-16 (el plásmido que lleva ADNc que codifica la región variable de cadena ligera de TRA-8 de ratón y una región constante de cadena ligera de Ig humana).
El plásmido pCR3.1/LM6-1-16 obtenido que contiene el fragmento LM6-ADN se digiere con las enzimas de restricción Hind III y EcoR I.
Un \mug del ADN del plásmido de clonación pHSG399 se digiere con las enzimas de restricción Hind III y EcoR I y después se desfosforila con CIP. El ADN de pHSG399 desfosforilado resultante y el fragmento LM6-ADN, que se habían digerido con las enzimas de restricción Hind III y Eco R I, se ligan usando el kit de ligamiento de ADN versión 2.0 (Takara Syuzo, Co. Ltd.). Después, la cepa de E. coli DH5\alpha se transforma con el ADN ligado y se propaga en medio de agar LB que contiene IPTG 0,1 mM, X-Gal al 0,1% y 50 \mug/ml de cloranfenicol (concentraciones finales). Los transformantes blancos obtenidos se cultivan en medio LB líquido que contiene 50 \mug/ml de cloranfenicol y el ADN plasmídico se extrae del cultivo resultante de acuerdo con el método de SDS-alcalino. El ADN plasmídico extraído se digiere con Hind III y EcoR I y después se selecciona un clon que lleva el fragmento LM6-ADN por electroforesis en gel de agarosa al 1%.
Como resultado del procedimiento anterior, se obtiene el plásmido pHSG/M6-1-4-1 que lleva un fragmento de fusión de la región variable de la cadena ligera de TRA-8 de ratón y la región constante de la cadena \kappa de Ig humana. La cepa de E. coli transformante que lleva este plásmido, denominada E. coli DH5\alpha/pHSG/M6-1-4-1 se depositó en International Patent Organism Depositary, National Institute of Advanced Industrial Science and Technology, 1-1, Higashi 1 chome Tsukuba-shi, Ibaraki-ken, 305-5466, en Japón, el 20 de abril de 2001, de acuerdo con el tratado de Budapest para el depósito de microorganismos, y se le asignó el número de acceso FERM BP-7566.
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3) Construcción del plásmido pSR/LM6-1-4-6 (plásmido de expresión para la cadena ligera de TRA-8 LM6 de tipo quimérico)
El plásmido pHSG/LM6-1-4-1 obtenido que lleva un fragmento de fusión de la región variable de la cadena ligera de TRA-8 de ratón y la región constante de la cadena \kappa de Ig humana se digiere con las enzimas de restricción Hind III y EcoR I.
Un \mug del ADN del plásmido de clonación pSRPDHH se digiere con las enzimas de restricción Hind III y EcoR I y después se desfosforila con CIP. El ADN de pSRPDHH desfosforilado resultante y el fragmento de ADN Hind III-EcoR I obtenido a partir pHSG/LM6-1-4-1 se ligan usando el kit de ligamiento de ADN versión 2.0 (Takara Syuzo, Co. Ltd.). Después, la cepa de E. coli DH5\alpha se transforma con el ADN ligado y se propaga en agar LB. Los transformantes obtenidos se cultivan en medio LB líquido que contiene 100 \mug/ml de ampicilina y el ADN plasmídico se extrae del cultivo resultante de acuerdo con el método de SDS alcalino. La inserción y orientación del fragmento de ADN deseado en el vector se confirma por secuenciación de ADN usando un analizador de la secuencia génica.
El plásmido de expresión resultante que lleva ADNc que codifica la cadena ligera de TRA-8 (tipo quimérico) se denomina pSR/LM6-1-4-6.
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(5) Producción de anticuerpo TRA-8 quimérico o humanizado de varios tipos
Se realiza transfección de células COS-7 por métodos de reactivo de transfección FUGENE6 (Boehringer Mannheim Biochemical) de acuerdo con el manual de instrucciones proporcionado con el kit.
Se cultivan células COS-7 (colección americana de cultivos tipo Nº CRL-1651) hasta la semiconfluencia (3 x 10^{6} células/placa) en un aplaca de cultivo (área de cultivo: 57 cm^{2}; Sumitomo Bakelite) que contiene medio de Eagle modificado por Dulbecco (denominado en lo sucesivo "D-MEM"; Gibco BRL) suplementado con suero bovino fetal al 10% (abreviado en lo sucesivo "FCS"; Moregate).
Mientras tanto, se mezclan 10 \mug/placa (5 placas en total) del ADN del plásmido de expresión de cadena pesada de DR5 humanizado (pHA15-1) y 10 \mug/placa del ADN del plásmido de expresión de cadena ligera de DR5 humanizado preparado por el método de SDS-alcalino y centrifugación en gradiente de densidad de cloruro de cesio, y después se precipitan con etanol seguido de suspensión en 5 \mul/placa de dH_{2}O.
Después se mezclan 15 \mul/placa de reactivo de transfección FUGENE6 con 180 \mul/placa de D-MEM sin FCS, y esta solución de FUGENE (185 \mul/placa) se mezcla con 5 \mul/placa de solución de ADN que contiene 10 \mug/placa del ADN del plásmido de expresión de cadena pesada de DR5 humanizado y 10 \mug/placa del ADN del plásmido de expresión de cadena ligera de DR5 humanizado. Después de 15 minutos de incubación a temperatura ambiente, la suspensión de plásmido obtenida (200 \mul) se añade a las placas COS-7 preparadas previamente. Después de incubar en CO_{2} al 5% a 37ºC durante 24 horas, el medio de cultivo se cambia por D-MEM sin FCS. Después de incubar en CO_{2} al 5% a 37ºC durante 72 horas, se recupera el sobrenadante de cultivo para purificar los productos de expresión en los fluidos sobrenadantes. Por el método descrito anteriormente, se transfectan células CO-7 con cada una de las siguientes combinaciones de plásmidos:
(A): cotransfección de pHA15-1 y pSR/LM1-2 (H1L1)
(B): cotransfección de pHB14-1 y pSR/M2-1 (H2L2)
(C): cotransfección de pHB14-1 y pSR/LM3-3-44-10 (H2L3)
(D): cotransfección de pHB14-1 y pSR/LM4-5-3-3 (H2L4)
(E): cotransfección de pHC10-3 y pSR/M2-1 (H3L2)
(F): cotransfección de pHC10-3 y pSR/LM3-3-44-10 (H3L3)
(G): cotransfección de pHC10-3 y pSR/LM4-5-3-3 (H3L4)
(H): cotransfección de pHD21-1 y pSR/LM5-3-27-1 (H4L5)
(I): cotransfección de pM11-1 y pSR/LM6-1-4-6 (Quimera)
El cultivo después se centrifuga (3.500 r.p.m, 15 minutos) y se recoge el sobrenadante. El sobrenadante se filtra con un filtro de 0,45 \mum (ADVANTEC TOYO DISMIC-25cs, Nº de Cat 25CS045 AS). La purificación de IgG a partir de los filtrados se consigue usando cromatografía de afinidad con proteína G-POROS (Applied Biosystems) en las siguientes condiciones:
\quad
HPLC: BioCAD 700E (Applied Biosystems)
\quad
columna: Cartucho sensor de proteína G-ID (tamaño de la columna: 2,1 mm DI x 30 mm LD, volumen del lecho: 0,1 ml; Applied Biosystems)
\quad
tampón de elución: glicina-HCl 0,1 M (pH 2,5)
\quad
tampón de neutralización: Tris-HCl 1 M (pH 8,5)
\quad
detección: 280 nm
\quad
caudal: 1 ml/min
\quad
tamaño de fracción: 0,5 ml/0,5 minutos
\quad
tubo de fracción: microtubo de polipropileno de 1,5 ml
\quad
temperatura: 4ºC
Después de aplicar todos los filtrados a la columna, se usan 50 ml de PBS (Sigma Nº de Cat 1000-3) para lavar la columna. Cuando se aplica el tampón de elución, empieza el colector de fracciones. Cada microtubo de fracciones previamente contenía 55 \mul de NaCl 1 M, 110 \mul de tampón de neutralización y 74 \mul de albúmina de suero bovino a una concentración de 2 mg/ml (Sigma Nº de Cat A-7030) en PBS. Se recogen las fracciones de nº 7 a nº 8.
La verificación de la expresión de los anticuerpos humanizados y el ensayo cuantitativo de los productos de expresión en los fluidos sobrenadantes de cultivo preparados se realiza por ELISA con un anticuerpo contra IgG anti-humana.
A cada pocillo de una placa de 96 pocillos (MaxiSorp, Nunc), se le añaden 100 \mul de anticuerpo policlonal específico de Fc de IgG de cabra anti-humana (Kappel) disuelto a la concentración final de 0,5 \mug/ml en tampón de adsorción (hidrogenocarbonato sódico 0,05 M, azida sódica al 0,02%, pH 9,6) y la placa se incuba a 37ºC durante 2 horas para producir la adsorción del anticuerpo. Después, la placa se lava con 350 \mul de PBS-T cinco veces. Después del lavado, a los pocillos se les añade el sobrenadante de cultivo diluido con D-MEM que contiene FCS al 10% y se incuban a 37ºC durante 2 horas. Después de lavar de nuevo con PBS-T, se añaden a cada pocillo 100 \mul de anticuerpo policlonal específico de Fc de IgG de cabra anti-humana marcado con fosfatasa alcalina (Jackson Immuno Research Lab.) diluido 10.000 veces con PBS-T y se incuban a 37ºC durante 2 horas. Después de lavar de nuevo con PBS-T, se añade una solución de sustrato de p-nitrofenil fosfato obtenida del kit de sustrato de fosfatasa alcalina (BioRad) de acuerdo con el manual de instrucciones proporcionado con el kit. Después de incubar a 37ºC durante 0,5 a 1 hora, se mide la absorbancia a 405 nm. En los presentes experimentos, se usa inmunoglobulina de plasma humano de subclase 1 (IgG1) (Biopure AG) diluida con D-MEM que contiene FCS al 10% a ciertas concentraciones como muestras de referencia
de concentración de los anticuerpos contra DR5 humanizados contenidos en los fluidos sobrenadantes de cultivo.
Como resultado, la expresión y los productos purificados en el sobrenadante de cultivo se detectan específicamente con el anticuerpo anti-IgG humana. La concentración final de anticuerpo de IgG humana es 44,03 \mug/ml (H1L1), 39,8 \mug/ml (H2L2), 26,7 \mug/ml (H2L3), 41,0 \mug/ml (H2L4), 39,3 \mug/ml (H3L2), 24,7 \mug/ml (H3L3), 21,5 \mug/ml (H3L4), 16,7 \mug/ml (H4L5) y 18,3 \mug/ml (quimera), respectivamente.
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(6) Actividad inductora de la apoptosis de anticuerpos humanizados de varios tipos o anticuerpo quimérico
Se usan células Jurkat (ATCC Nº TIB-152) para examinar la actividad inductora de la apoptosis del anticuerpo TRA-8 humanizado purificado.
Se distribuyen células Jurkat cultivadas en medio RPMI1640 con FCS al 10% (Gibco BRL) a 37ºC durante 3 días en presencia de CO_{2} al 5% en cada pocillo de una microplaca de 96 pocillos (Sumitomo Bakelite) a 50 \mul por pocillo. El TRA-8 humanizado preparado en este ejemplo 26 se ajusta para tener la concentración del producto final de interés de 100 ng/ml con medio RPMI1640 que contiene FCS al 10% estimando sus concentraciones en los fluidos de acuerdo con el método descrito en el ejemplo 26. Cada una de las soluciones de los productos de expresión ajustados de esta manera a 100 ng/ml se usa para producir diluciones seriadas repitiendo la dilución seriada de dos veces con RPMI1640 que contiene FCS al 10%. Cada una de las soluciones de TRA-8 humanizado diluidas (H1L1, H2L2, H2L3, H2L4, H3L3, H3L4 o H4L5) se añade a cada pocillo a 50 \mul por pocillo. Después de dejar reaccionar a 37ºC durante 12 horas, se añaden 50 \mul de PMS 25 \muM que contiene 1 mg/ml de XTT (concentraciones finales de 250 \mug/ml en el caso de XTT y 5 \muM en el caso de PMS). Después de incubar durante 3 horas, se mide la absorbancia a 450 nm de cada pocillo para calcular la viabilidad celular usando la capacidad de reducción de las mitocondrias como índice.
La viabilidad de las células en cada pocillo se calcula de acuerdo con la siguiente fórmula:
Viabilidad (%) = 100 x (a-b) / (c-b)
en la que "a" es la medición de un pocillo de ensayo, "b" es la medición de un pocillo sin células y "c" es la medición de un pocillo sin anticuerpo añadido.
Como resultado, se demuestra que los anticuerpos humanizados ensayados inducen la apoptosis en células de la línea celular de linfoma T que expresa el antígeno DR5 humano.
Además, se examina la actividad inductora de la apoptosis de TRA-8 humanizado con respecto a PC-3 añadiendo taxol de acuerdo con el método descrito en el ejemplo 25.
Se obtiene la línea celular de cáncer de próstata humano PC-3 (ATCC Nº CRL-1435) de la colección americana de cultivo de tejidos (ATCC) y se mantiene en mezcla nutriente F-12K (21127-022, Gibco BRL) que contiene suero bovino fetal al 10% (FBS, Hyclone), L-glutamina al 1%-200 mM (25030-149, Gibco BRL) y solución de penicilina y estreptomicina al 0,5% (P-7539, Sigma). En el siguiente experimento se usa medio RPMI1640 (MED-008, IWAKI) suplementado con FBS al 10% y solución de penicilina y estreptomicina al 0,5%. Se recogen células PC-3 en crecimiento exponencial por tripsinización y se lavan dos veces con medio limpio. Después, las células se cuentan, se resuspenden en medio limpio a una densidad de 5 x 10^{4} células/ml y se distribuyen por triplicado en placas de 96 pocillos de fondo plano (3598, Corning-Coster) en un volumen total de 100 \mul/pocillo un día antes de empezar el experimento. Un fármaco anticanceroso representativo, Paclitaxel (169-18611, Wako) disuelto en dimetilsulfóxido (10 mg/ml) se diluye en medio limpio y después se añade a las placas de 96 pocillos que contienen las células a 50 \mul/pocillo. Las concentraciones finales de dimetilsulfóxido son menores del 0,1%. Después de la incubación durante 24 horas a 37ºC en una atmósfera con un 5% de CO_{2}, se añade anticuerpo TRA-8 humanizado (H1L1, H2L2, H2L3, H2L4, H3L3, H3L4 o H4L5) diluido en medio limpio a los pocillos. Después de la incubación durante 24 horas más, se añaden 50 \mul de medio esencial mínimo (11095-098, Gibco BRL) que contiene 1 mg/ml de XTT y una concentración 25 mM de PMS a los pocillos y las placas se incuban durante 6 horas. Después se mide la DO450 por ARVO HTS 1420 Multilabel Counter (Wallac Berthold) y se calcula la viabilidad celular como se indica a continuación.
\quad
Viabilidad celular (%) = (DO450 para el pocillo que contiene células tratadas con Taxol y TRA-8 humanizado (agente(s)) - DO450 para el pocillo que no contiene ni células ni agente) x 100/(DO450 para el pocillo que contiene células sin agente - DO450 para el pocillo que no contiene ni células ni agente).
Como resultado, se demuestra que los anticuerpos humanizados inducen la apoptosis en células de cáncer de próstata humano que expresan el antígeno DR5 humano.
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Bibliografía
1. Wiley SR, Schooley K, Smolak PJ, Din WS, Huang CP, Nicholl JK, Sutherland GR, Smith TD, Rauch C, Smith CA, et al. Immunity 1995 Dec; 3(6): 673-82
2. Pan G, O'Rourke K, Chinnaiyan AM, Gentz R, Ebner R, Ni J, Dixit VM Science 1997 Apr 4; 276(5309): 111-3
3. Walczak H, Degli-Esposti MA, Johnson RS, Smolak PJ, Waugh JY, Boiani N, Timour MS, Gerhart MJ, Schooley KA, Smith CA, Goodwin RG, Rauch CT. EMBO J 1997 Sep 1; 16(17): 5386-97
4. MacFarlane M, Ahmad M, Srinivasula SM, Fernandes-Alnemri T, Cohen GM, Alnemri ES. J Biol Chem 1997 Oct 10; 272(41): 25417-20.
5. Degli-Esposti MA, Dougall WC, Smolak PJ, Waugh N, Smith CA, Goodwin RG. Immunity 1997 Dec; 7(6): 813-20
6. Chaudhary PM, Eby M, Jasmin A, Bookwalter A, Murray J, Hood L. Immunity 1997 Dec; 7(6): 821-30
7. Schneider P, Thome M, Burns K, Bodmer JL, Hofmann K, Kataoka T, Holler N, Tschopp J. Immunity 1997 Dec; 7(6): 831-6
8. Degli-Esposti MA, Smolak PJ, Walczak H, Waugh J, Huang CP, DuBose RF, Goodwin RG, Smith CA. J Exp Med 1997 Oct 6; 186(7): 1165- 70
9. Sheridan JP, Marsters SA, Pitti RM, Gurney A, Skubatch M, Baldwin D, Ramakrishnan L, Gray CL, Baker K, Wood WI, Goddard AD, Godowski P, Ashkenazi A. Science 1997 Aug 8; 277(5327): 818-21
10. Pan G, Ni J, Wei YF, Yu G, Gentz R, Dixit VM. Science 1997 Aug 8; 277(5327): 815-818
11. Marsters SA, Sheridan JP, Pitti RM, Huang A, Skubatch M, Baldwin D, Yuan J, Gurney A, Goddard AD, Godowski P, Ashkenazi A. Curr Biol 1997 Dec 1; 7(12): 1003-6
12. Emery JG, McDonnell P, Burke MB, Deen KC, Lyn S, Silverman C, Dul E, Appelbaum ER, Eichman C, DiPrinzio R, Dodds RA, James IE, Rosenberg M, Lee JC, Young PR. J Biol Chem 1998 Jun 5; 273(23): 14363-7
13. Walczak H, Miller RE, Ariail K, Gliniak B, Griffith TS, Kubin M, Chin W, Jones J, Woodward A, Le T, Smith C, Smolak P, Goodwin RG, Rauch CT, Schuh JC, Lynch DH. Nat Med 1999 Feb; 5(2): 157-63
14. Gazitt Y. Leukemia 1999 Nov; 13(11): 1817-24
15. Rieger J, Naumann U, Glaser T, Ashkenazi A, Weller M. FEBS Lett 1998 May 1; 427(1): 124-8
16. Jeremias I, Herr I, Boehler T, Debatin KM. Eur J Immunol 1998 Jan; 28(1): 143-52
17. Martinez-Lorenzo MJ, Alava MA, Gamen S, Kim KJ, Chuntharapai A, Pineiro A, Naval J, Anel A. Eur J Immunol 1998 Sep; 28(9): 2714-25
18. Phillips TA, Ni J, Pan G, Ruben SM, Wei YF, Pace JL, Hunt JS. J Immunol 1999 May 15; 162(10): 6053-9
19. Kayagaki N, Yamaguchi N, Nakayama M, Takeda K, Akiba H, Tsutsui H, Okamura H, Nakanishi K, Okumura K, Yagita H. J Immunol 1999 Aug 15; 163(4): 1906-13
20. Johnsen AC, Haux J, Steinkjer B, Nonstad U, Egeberg K, Sundan A, Ashkenazi A, Espevik T. Cytokine 1999 Sep; 11(9): 664-72
21. Zamai L, Ahmad M, Bennett IM, Azzoni L, Alnemri ES, Perussia B. J Exp Med 1998 Dec 21; 188(12): 2375-80
22. Fanger NA, Maliszewski CR, Schooley K, Griffith TS. J Exp Med 1999 Oct 18; 190(8): 1155-64
23. Griffith TS, Wiley SR, Kubin MZ, Sedger LM, Maliszewski CR, Fanger NA. J Exp Med 1999 Apr 19; 189(8): 1343-54
24. Griffith TS, Rauch CT, Smolak PJ, Waugh JY, Boiani N, Lynch DH, Smith CA, Goodwin RG, Kubin MZ. J. Immunology 1999 162: 2597-2605
25. Albani S and Carson DA, 1997 Arthritis and allied conditions, a textbook of rheumatology, 13^{th} edition, volume 2, 979-992.
26. Fujisawa K, Asahara H, Okamoto K, Aono H, Hasunuma T, Kobata T, Iwakura Y, Yonehara S, Sumida T, and Nishioka K. J. Clin. Invest. 1996 98(2): 271-278
27. Zhang H, Yang Y, Horton JL, Samoilova EB, Judge TA, Turka LA, Wilson JM, and Chen Y. 1997 J. Clin. Invest. 100(8): 1951-1957.
28. Roth W, Isenmann S, Naumann U, Kugler S, Bahr M, Dichgans J, Ashkenazi A, Weller M. Locoregional. Biochem Biophys Res Commun 1999 Nov 19; 265(2): 479-83
29. Chinnaiyan AM, Prasad U, Shankar S, Hamstra DA, Shanaiah M, Chenevert TL, Ross BD, Rehemtulla A. Proc. Natl. Acad. Sci. 2000 Feb 15; 97(4): 1754-1759
30. Arai T, Akiyama Y, Okabe S, Saito K, Iwai T, Yuasa Y. Cancer Lett 1998 Nov 27; 133(2): 197-204
\newpage
31. Lee SH, Shin MS, Kim HS, Lee HK, Park WS, Kim SY, Lee JH, Han SY, Park JY, Oh RR, Jang JJ, Han JY, Lee JY, Yoo NJ. Cancer Res 1999 Nov 15; 59(22): 5683-5686
32. Pai SI, Wu GS, Ozoren N, Wu L, Jen J, Sidransky D, El-Deiry WS. 1998 Cancer Res Aug 15; 58(16): 3513-3518
33. Maniatis et al., 1982, Molecular Cloning, a Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harber, NY
34. Schroff et al., 1985 Cancer Res., 45, 879-885.
35. Yelton, D. E., et al., 1978 Current Topics in Microbiology and Immunology, 81,1-7
36. Kohler, G., et al, 1976 European J. Immunology, 6, 511-519
37. Shulman, M., et al., 1978 Nature, 276. 269-270
38. Kearney, J. F., et al, 1979 J. Immunology, 123, 1548-1550
39. Horibata, K. and Harris, A. W., 1975 Nature, 256, 495-497
40. Sheridan JP, Marsters SA, Pitti RM, Gurney A, Skubatch M, Baldwin D, Ramakrishinan, Gray CL, Baker K, Wood WI, Goddard AD, Godowski P, and Ashkenazi A, 1997 Science, 277, 818-821.
41. Cheng J et al., 1994 Science, 263, 1759-1762
42. Bendele AM et al., 1999 Clin Exp Rheumatol, 17(5): 553-560
43. Sheridan JP, Marsters AS, Pitti RM, Gurney A, Skubatch M, Baldwin D, Ramakrishnan L, Gray CJ, Baker K, Wood WI, Goddard AD, Godowski P, and Ashkenazi A. 1997 Science, 277, 818-821.
44. Schneider P, Thome M, Burns K, Bodmer JL, Hofmann K, Kataoka T, Holler N, Tschopp J., 1997 Immunity Dec; 7(6): 831-836.
45. Kennedy NJ, Kataoka T, Tschopp J, and Budd RC. 1999 J. Exp. Med. 1891-1896.
46. Miiler-Ladner U, Gay RE, and Gay S, 1997 Arthritis and allied conditions, a textbook of rheumatology, 13^{th} edition, Volume 1, 243-254.
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<110> The UAB Research Foundation
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<120> UN ANTICUERPO SELECTIVO POR UN RECEPTOR DE LIGANDO INDUCTOR DE LA APOPTOSIS RELACIONADA CON EL FACTOR DE NECROSIS TUMORAL Y USOS DEL MISMO
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<130> UAB-17552/22
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<160> 102
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<170> PatentIn version 3.0
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<210> 1
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<211> 25
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<212> ADN
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<213> construcción sintética
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<400> 1
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<210> 2
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<211> 22
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<212> ADN
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<213> construcción sintética
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<400> 2
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<210> 3
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<211> 24
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<212> ADN
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<213> construcción sintética
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<400> 3
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<210> 4
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<211> 20
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<212> PRT
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<213> Mus musculus 
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<400> 4
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<210> 5
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<211> 20
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<212> PRT
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<213> Mus musculus 
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<400> 5
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<210> 6
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<211> 20
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<212> ADN
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<213> construcción sintética
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<400> 6
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<210> 7
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<211> 20
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<212> ADN
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<213> construcción sintética
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\hskip1cm12 
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<213> construcción sintética
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<212> ADN
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<213> construcción sintética
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 61
\hskip1cm69 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 62
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 80
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> construcción sintética
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 62
\hskip1cm70 
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<210> 63
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<211> 80
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<212> ADN
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<213> construcción sintética
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<400> 63
\hskip1cm71 
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<210> 64
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<211> 80
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<212> ADN
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<213> construcción sintética
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 64
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\hskip1cm72 
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<210> 65
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<211> 80
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<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> construcción sintética
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<400> 65
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<211> 80
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<212> ADN
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<213> construcción sintética
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<400> 66
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\hskip1cm74 
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<210> 67
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<211> 80
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<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> construcción sintética
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 67
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<210> 68
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<211> 64
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<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> construcción sintética
\vskip1.000000\baselineskip
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<400> 68
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\hskip1cm76 
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<210> 69
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<211> 80
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<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> construcción sintética
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\hskip1cm77 
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<210> 70
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<212> ADN
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<213> construcción sintética
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<400> 70
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\hskip1cm78 
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<210> 71
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<211> 70
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<212> ADN
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<213> construcción sintética
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 71
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm79 
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<210> 72
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<211> 212
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> construcción sintética
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 72
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\hskip1cm80 
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<210> 73
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<211> 213
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<212> PRT
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<213> construcción sintética
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 73
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\hskip1cm81 
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\vskip0.400000\baselineskip
<210> 74
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<211> 213
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<212> PRT
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<213> construcción sintética
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 74
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\hskip1cm82 
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<210> 75
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<211> 213
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<212> PRT
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<213> construcción sintética
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 75
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm83 
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\vskip0.400000\baselineskip
<210> 76
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<211> 213
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<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> construcción sintética
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 76
\hskip1cm84 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 77
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<211> 60
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> construcción sintética
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 77
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<210> 78
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<211> 65
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<212> ADN
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<213> construcción sintética
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 78
\hskip1cm86 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 79
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<211> 69
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<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> construcción sintética
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 79
\hskip1cm87 
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<210> 80
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<211> 67
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<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> construcción sintética
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 80
\hskip1cm88 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 81
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<211> 54
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<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> construcción sintética
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<400> 81
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<210> 82
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<211> 67
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<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> construcción sintética
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 82
\hskip1cm90 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 83
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 72
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> construcción sintética
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 83
\hskip1cm91 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 84
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<211> 71
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> construcción sintética
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 84
\hskip1cm92 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 85
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 72
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<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> construcción sintética
\vskip1.000000\baselineskip
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<400> 85
\hskip1cm93 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 86
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 63
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> construcción sintética
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 86
\hskip1cm94 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 87
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 60
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> construcción sintética
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 87
\hskip1cm95 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 88
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<211> 57
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> construcción sintética
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 88
\hskip1cm96 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 89
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<211> 57
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> construcción sintética
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 89
\hskip1cm97 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 90
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 51
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> construcción sintética
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 90
\hskip1cm98 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 91
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 63
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> construcción sintética
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 91
\hskip1cm99 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 92
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 57
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> construcción sintética
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 92
\hskip1cm100 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 93
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 57
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> construcción sintética
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 93
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm101 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 94
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 63
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> construcción sintética
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 94
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm102 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 95
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 57
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> construcción sintética
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 95
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm103 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 96
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<211> 57
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> construcción sintética
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 96
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm104 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 97
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 51
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> construcción sintética
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 97
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm105 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 98
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 51
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> construcción sintética
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 98
\hskip1cm106 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 99
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 49
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> construcción sintética
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 99
\hskip1cm107 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 100
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 45
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> construcción sintética
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 100
\hskip1cm108 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 101
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 30
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> construcción sintética
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 101
\hskip1cm109 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 102
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 63
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> construcción sintética
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 102
\hskip1cm110

Claims (34)

1. Anticuerpo purificado que se une específicamente a un receptor DR5 de TRAIL, donde dicho anticuerpo tiene actividad inductora de la apoptosis en ausencia de entrecruzamiento secundario y donde el anticuerpo no se une al receptor de TRAIL DR4, DcR1 o DcR2, que comprende una cadena pesada y una cadena ligera donde
a)
la cadena pesada comprende una región variable que comprende las CDR de un anticuerpo monoclonal producido por el hibridoma de ratón-ratón TRA-8 que tiene el número de acceso de la ATCC PTA-1428; y
b)
la cadena ligera comprende una región variable que comprende las CDR del anticuerpo monoclonal producido por TRA-8;
donde en las CDR puede añadirse, omitirse o sustituirse un residuo.
2. Anticuerpo purificado de la reivindicación 1, donde dicho anticuerpo es un anticuerpo monoclonal.
3. Anticuerpo purificado de la reivindicación 1, donde el DR5 es DR5 humano.
4. Anticuerpo de la reivindicación 1 que es un anticuerpo monoclonal producido por el hibridoma de ratón-ratón TRA-8 que tiene el número de acceso de la ATCC PTA-1428.
5. Anticuerpo de la reivindicación 1 que es una versión humanizada de un anticuerpo monoclonal producido por el hibridoma de ratón-ratón TRA-8 que tiene el número de acceso de la ATCC PTA-1428.
6. Anticuerpo de la reivindicación 1, donde el anticuerpo comprende:
(a)
una cadena pesada, donde la cadena pesada comprende una región variable seleccionada del grupo consistente en los residuos aminoacídicos 1-119 de la SEC ID Nº:31 o un equivalente funcional de los mismos; residuos aminoacídicos 1-119 de la SEC ID Nº:56 o un equivalente funcional de los mismos; residuos aminoacídicos 1-119 de la SEC ID Nº:59 o un equivalente funcional de los mismos; residuos aminoacídicos 1-119 de la SEC ID Nº:60 o un equivalente funcional de los mismos; y residuos aminoacídicos 1-119 de la SEC ID Nº:61 o un equivalente funcional de los mismos, y
(b)
una cadena ligera, donde la cadena ligera comprende una región variable seleccionada del grupo que consiste en los residuos aminoacídicos 1-108 de la SEC ID Nº:46 o un equivalente funcional de los mismos; residuos aminoacídicos 1-108 de la SEC ID Nº:72 o un equivalente funcional de los mismos; residuos aminoacídicos 1-108 de la SEC ID Nº:73 o una equivalente funcional de los mismos; residuos aminoacídicos 1-108 de la SEC ID Nº:74 o un equivalente funcional de los mismos; residuos aminoacídicos 1-108 de la SEC ID Nº:75 o un equivalente funcional de los mismos; y residuos aminoacídicos 1-108 de la SEC ID Nº:76 o un equivalente funcional de los mismos.
7. Anticuerpo de la reivindicación 6, en el que la cadena pesada comprende una región constante de una cadena pesada de inmunoglobulina humana G1, donde dicha cadena ligera comprende una región constante de una cadena ligera kappa de inmunoglobulina humana.
8. Anticuerpo purificado de la reivindicación 1, donde el anticuerpo comprende:
(a)
una cadena pesada, donde la cadena pesada comprende una región variable seleccionada del grupo que consiste en una región variable codificada por la secuencia de nucleótidos del inserto de un vector llevado por E. coli JM109/pHB14 (FERM BP-7556) o un equivalente funcional de la misma; una región variable codificada por la secuencia de nucleótidos del inserto de un vector llevado por E. coli JM109/pHA15 (FERM BP-7555) o un equivalente funcional de la misma; una región variable codificada por la secuencia de nucleótidos del inserto de un vector llevado por E. coli JM109/pHC10 (FERM BP-7557) o un equivalente funcional de la misma; una región variable codificada por la secuencia de nucleótidos del inserto de un vector llevado por E. coli JM109/pHD21 (FERM BP-7558) o un equivalente funcional de la misma; y una región variable codificada por la secuencia de nucleótidos del inserto de un vector llevado por E. coli JM109/pHM11 (FERM BP-7559) o un equivalente funcional de la misma; y
(b)
una cadena ligera, donde la cadena ligera comprende una región variable unida a una región constante seleccionada del grupo que consiste en una región variable unida a una región constante codificada por la secuencia de nucleótidos del inserto de un vector llevado por E. coli DH5\alpha/pHSG/M2-1-4 (FERM BP-7563) o un equivalente funcional de la misma; una región variable unida a una región constante codificada por la secuencia de nucleótidos del inserto de un vector llevado por E. coli DH5\alpha/pHSG/M1-2-2 (FERM BP-7562) o un equivalente funcional de la misma; una región variable unida a una región constante codificada por la secuencia de nucleótidos del inserto de un vector llevado por E. coli DH5\alpha/pHSG/M3-3-22 (FERM BP-7564) o un equivalente funcional de la misma; una región variable unida a una región constante codificada por la secuencia de nucleótidos del inserto de un vector llevado por E. coli DH5\alpha/pHSG/M4-5-3-1 (FERM BP-7565) o un equivalente funcional de la misma; y una región variable unida a una región constante codificada por la secuencia de nucleótidos del inserto de un vector llevado por E. coli DH5\alpha/pHSG/M6-1-4-1 (FERM BP-7566) o un equivalente funcional de la misma.
9. Anticuerpo purificado de la reivindicación 8, donde la cadena pesada comprende una región constante de una cadena pesada de inmunoglobulina G1 humana, donde la cadena ligera comprende una región constante de una cadena ligera kappa de inmunoglobulina humana.
10. Anticuerpo purificado de la reivindicación 1, donde el anticuerpo comprende:
(a)
una inmunoglobulina de cadena pesada, donde la cadena pesada comprende una región variable que tiene la fórmula general: región flanqueante 1-CDR1-región flanqueante 2-CDR2-región flanqueante 3-CDR3-región flanqueante 4, consistiendo la CDR1 en los residuos aminoacídicos 1-5 de la SEC ID Nº:25, consistiendo la CDR2 en los residuos aminoacídicos 1-17 de la SEC ID Nº:26, y consistiendo la CDR3 en los residuos aminoacídicos 1-10 de la SEC ID Nº:27; y
(b)
una inmunoglobulina de cadena ligera, donde la cadena ligera comprende una región variable que tiene la fórmula general: región flanqueante 5-CDR4-región flanqueante 6-CDR5-región flanqueante 7-CDR6-región flanqueante 8, consistiendo la CDR4 en los residuos aminoacídicos 1-11 de la SEC ID Nº:28, consistiendo la CDR5 en los residuos aminoacídicos 1-7 de la SEC ID Nº:29, y consistiendo la CDR6 en los residuos aminoacídicos 1-8 de la SEC ID Nº:30.
11. Método in vitro de inducción selectiva de apoptosis en células diana que expresan DR5, que comprende la etapa de poner en contacto las células diana con una cantidad terapéutica del anticuerpo de la reivindicación 1.
12. Método de la reivindicación 11, donde las células diana que expresan DR5 son células cancerosas.
13. Método de la reivindicación 11, donde las células diana que expresan DR5 son células sinoviales inflamatorias.
14. Método de la reivindicación 11, donde las células diana que expresan DR5 son células B o células T activadas.
15. Método de la reivindicación 14, donde las células T o células B activadas son linfocitos activados.
16. Composición que comprende una cantidad farmacéuticamente eficaz del anticuerpo de la reivindicación 1 y un portador farmacéuticamente aceptable.
17. Kit comercial para inducir la apoptosis que comprende un anticuerpo de la reivindicación 5 en un recipiente.
18. Uso del anticuerpo de la reivindicación 1 para preparar un agente terapéutico para la muerte celular selectiva de células diana o desreguladas.
19. Uso de una cantidad terapéutica de un primer anticuerpo de acuerdo con la reivindicación 1 para preparar una composición para tratar a un sujeto con una enfermedad relacionada con la apoptosis.
20. Uso del anticuerpo de la reivindicación 1 para preparar una composición para tratar un sujeto con cáncer, donde la composición está en una forma a administrar al sujeto, donde el anticuerpo induce selectivamente la apoptosis de células cancerosas.
21. Uso de la reivindicación 20, donde la composición comprende además un segundo anticuerpo que potencia la muerte celular de células cancerosas.
22. Uso de la reivindicación 20, donde la composición comprende además un agente terapéutico.
23. Uso de la reivindicación 22, donde el agente terapéutico es un agente quimioterapéutico.
24. Uso de la reivindicación 23, donde el agente terapéutico se selecciona del grupo consistente en bleomicina, carboplatino, clorambucilo, cisplatino, colchicina, ciclofosfamida, daunorrubicina, actinomicina, dietilestilbestrol, doxorubicina, etopósido, 5-fluorouracilo, floxuridina, melfalán, metotrexato, mitomicina, 6-mercaptopurina, paclitaxel, tenipósido, 6-tioguanina, vincristina y vinblastina.
25. Uso del anticuerpo de la reivindicación 1 para preparar una composición para tratar un sujeto que tiene una enfermedad inflamatoria o una enfermedad autoinmune, donde la composición está en una forma a ser administrar al sujeto, donde la cantidad farmacéuticamente eficaz del anticuerpo induce selectivamente la apoptosis de células diana que tienen receptores de DR5.
26. Uso de la reivindicación 25, donde las células diana son células T o células B activadas.
27. Uso de la reivindicación 26, donde las células T o células B activadas son linfocitos activados.
28. Uso de la reivindicación 25, donde las células diana son células sinoviales inflamatorias.
29. Uso de la reivindicación 25, que comprende además administrar al sujeto una cantidad farmacéuticamente eficaz de un segundo anticuerpo que potencia la muerte celular de las células diana.
30. Uso de la reivindicación 25, que comprende además administrar al sujeto una cantidad farmacéuticamente eficaz de un agente terapéutico.
31. Uso de la reivindicación 30, donde el agente terapéutico es una bisindolilmaleimida o metotrexato.
32. Uso de la reivindicación 25, donde la enfermedad inflamatoria o la enfermedad autoinmune es artritis reumatoide.
33. Uso del anticuerpo de la reivindicación 5 para preparar una composición para tratar selectivamente un cáncer en un sujeto por inducción de apoptosis de células cancerosas.
34. Uso del anticuerpo de la reivindicación 5 para preparar una composición para tratar una enfermedad autoinmune en un sujeto, donde el anticuerpo induce selectivamente la apoptosis de células diana.
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WO (1) WO2001083560A1 (es)
ZA (1) ZA200209230B (es)

Families Citing this family (85)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7528239B1 (en) 1997-02-13 2009-05-05 Immunex Corporation Receptor that binds trail
JP4330180B2 (ja) 1997-03-17 2009-09-16 ヒューマン ジノーム サイエンシーズ， インコーポレイテッド 死ドメイン含有レセプター５
US6872568B1 (en) 1997-03-17 2005-03-29 Human Genome Sciences, Inc. Death domain containing receptor 5 antibodies
JP2002543151A (ja) * 1999-05-04 2002-12-17 ヒューマン ジノーム サイエンシーズ， インコーポレイテッド 死ドメイン含有レセプター５
TWI318983B (en) 2000-05-02 2010-01-01 Uab Research Foundation An antibody selective for a tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand receptor and uses thereof
US7279160B2 (en) 2000-05-02 2007-10-09 The Uab Research Foundation Combinations of DR5 antibodies and other therapeutic agents
US7476383B2 (en) 2000-05-02 2009-01-13 The Uab Research Foundation Antibody selective for DR4 and uses thereof
US20030228309A1 (en) * 2000-11-08 2003-12-11 Theodora Salcedo Antibodies that immunospecifically bind to TRAIL receptors
US20060062786A1 (en) * 2000-11-08 2006-03-23 Human Genome Sciences, Inc. Antibodies that immunospecifically bind to TRAIL receptors
AU2003222427B8 (en) 2000-11-17 2010-04-29 Vascular Biogenics Ltd. Promoters exhibiting endothelial cell specificity and methods of using same
US8071740B2 (en) 2000-11-17 2011-12-06 Vascular Biogenics Ltd. Promoters exhibiting endothelial cell specificity and methods of using same for regulation of angiogenesis
US7115717B2 (en) 2001-05-18 2006-10-03 Kirin Beer Kabushiki Kaisha Anti-TRAIL-R antibodies
US20050214209A1 (en) * 2001-05-25 2005-09-29 Human Genome Sciences, Inc. Antibodies that immunospecifically bind to TRAIL receptors
US20090226429A1 (en) * 2001-05-25 2009-09-10 Human Genome Sciences, Inc. Antibodies That Immunospecifically Bind to TRAIL Receptors
US20050129616A1 (en) * 2001-05-25 2005-06-16 Human Genome Sciences, Inc. Antibodies that immunospecifically bind to TRAIL receptors
US7361341B2 (en) 2001-05-25 2008-04-22 Human Genome Sciences, Inc. Methods of treating cancer using antibodies that immunospecifically bind to trail receptors
US7348003B2 (en) 2001-05-25 2008-03-25 Human Genome Sciences, Inc. Methods of treating cancer using antibodies that immunospecifically bind to TRAIL receptors
US7064189B2 (en) 2001-05-25 2006-06-20 Human Genome Sciences, Inc. Antibodies that immunospecifically bind to trail receptors
CN100506284C (zh) 2001-10-19 2009-07-01 脉管生物生长有限公司 多核苷酸构建体、药物组合物以及靶向的下调血管生成和抗癌的治疗方法
IL161686A0 (en) * 2001-11-01 2004-09-27 Uab Research Foundation Combinations of antibodies selective for a tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand receptor and other therapeutic agents
ES2357225T3 (es) * 2001-11-01 2011-04-20 Uab Research Foundation Combinaciones de anticuerpos anti-dr5 y anticuerpos anti-dr4 y otros agentes terapéuticos.
AU2002361784A1 (en) * 2001-12-20 2003-07-09 Human Genome Sciences, Inc. Antibodies that immunospecifically bind to trail receptors
US20050069549A1 (en) 2002-01-14 2005-03-31 William Herman Targeted ligands
DE10210427A1 (de) * 2002-03-09 2003-10-09 Hans Konrad Mueller-Hermelink Humaner monoklonaler Antikörper
EP1521776A2 (en) * 2002-07-04 2005-04-13 Oncomab Gmbh Neoplasm specific antibodies and uses thereof
KR20090046973A (ko) * 2002-11-27 2009-05-11 아이알엠 엘엘씨 암세포에서 세포자멸사를 유도하기 위한 방법 및 조성물
AU2008201431B2 (en) * 2002-11-27 2011-11-24 Irm, Llc Methods and compositions for inducing Apoptosis in cancer cells
DE10311248A1 (de) 2003-03-14 2004-09-30 Müller-Hermelink, Hans Konrad, Prof. Dr. Humaner monoklonaler Antikörper
EP1531162A1 (en) 2003-11-14 2005-05-18 Heinz Vollmers Adenocarcinoma specific antibody SAM-6, and uses thereof
DE10353175A1 (de) 2003-11-14 2005-06-16 Müller-Hermelink, Hans Konrad, Prof. Dr. Humaner monoklonaler Antikörper mit fettsenkender Wirkung
KR20060132006A (ko) 2004-03-23 2006-12-20 비오겐 아이덱 엠에이 아이엔씨. 수용체 커플링제 및 이의 치료적 용도
CN100427505C (zh) * 2004-08-19 2008-10-22 中国医学科学院基础医学研究所 抗人肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体的受体dr5单克隆抗体（ad5-10）及其制法与用途
BRPI0519008A2 (pt) * 2004-12-13 2008-12-23 Evogenix Ltd proteÍnas variantes de osteoprotegerina
JP5562521B2 (ja) 2005-02-02 2014-07-30 ザ ユーエービー リサーチ ファンデーション アポトーシス誘導デスレセプターアゴニストに対する抵抗性を低減することに関する薬剤及び方法
US8029783B2 (en) 2005-02-02 2011-10-04 Genentech, Inc. DR5 antibodies and articles of manufacture containing same
JP5004154B2 (ja) * 2005-04-06 2012-08-22 一般財団法人化学及血清療法研究所 組換え抗ボツリヌス神経毒素抗体
EP1907001B1 (en) 2005-06-17 2015-07-15 Merck Sharp & Dohme Corp. Ilt3 binding molecules and uses therefor
PE20071101A1 (es) * 2005-08-31 2007-12-21 Amgen Inc Polipeptidos y anticuerpos
UA97096C2 (ru) * 2005-08-31 2012-01-10 Емджен Інк. Выделенное антитело, которое специфически связывает рецептор-2 trail (tr-2)
US8168181B2 (en) 2006-02-13 2012-05-01 Alethia Biotherapeutics, Inc. Methods of impairing osteoclast differentiation using antibodies that bind siglec-15
AU2007250735A1 (en) 2006-05-16 2007-11-22 Daiichi Sankyo Company, Limited Method for high-level secretory production of protein
CA2655903A1 (en) * 2006-06-19 2008-08-07 Tolerx, Inc. Ilt3 binding molecules and uses therefor
KR100847010B1 (ko) * 2006-07-05 2008-07-17 아주대학교산학협력단 세포사멸 수용체 5 (ｄｒ5)에 특이적으로 결합하는 항체 및이를 포함하는 암 예방 또는 치료용 조성물
KR100804126B1 (ko) 2007-02-09 2008-02-19 아주대학교산학협력단 종양 괴사 인자―관련 세포사멸―유도 리간드의 수용체에특이적으로 결합하는 1가의 인간 단일클론 항체 및 그의항원결합 단편
AR066913A1 (es) * 2007-06-08 2009-09-23 Irm Llc Metodos y composiciones para inducir la apoptosis en celulas cancerosas
CA2695991A1 (en) * 2007-08-09 2009-02-12 Daiichi Sankyo Company, Limited Immunoliposome inducing apoptosis into cell expressing death domain-containing receptor
ES2537806T5 (es) 2007-10-31 2018-10-09 Daiichi Sankyo Company, Limited Método para la secreción y producción de alto nivel de proteína
WO2010047509A2 (ko) * 2008-10-24 2010-04-29 아주대학교 산학협력단 친화도와 안정성이 향상된 항 ｄｒ5 항체, 및 이를 포함하는 암 예방 또는 치료용 조성물
JP2013505944A (ja) * 2009-09-24 2013-02-21 シアトル ジェネティックス， インコーポレイテッド Ｄｒ５リガンド薬物結合体
EP2492281B1 (en) * 2009-10-19 2018-04-11 HanAll Biopharma Co., Ltd. Modified human tumor necrosis factor receptor-1 polypeptide or fragment thereof, and method for preparing same
CA2780130A1 (en) 2009-11-05 2011-05-12 The Uab Research Foundation Treating basal-like genotype cancers
US9238069B2 (en) 2009-12-16 2016-01-19 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Method of sensitizing cancer cells to the cytotoxic effects of death receptor ligands in cancer treatment
US9120855B2 (en) 2010-02-10 2015-09-01 Novartis Ag Biologic compounds directed against death receptor 5
US9284350B2 (en) 2010-02-12 2016-03-15 Pharmascience Inc. IAP BIR domain binding compounds
US8703712B2 (en) 2010-03-18 2014-04-22 The Uab Research Foundation Targeting cancer stem cells with DR5 agonists
PH12013500845A1 (en) * 2010-10-29 2013-06-24 Daiichi Sankyo Co Ltd Novel anti-dr5 antibody
CN103561771B (zh) 2011-03-17 2019-01-04 伯明翰大学 重新定向的免疫治疗
EP2704735A1 (en) * 2011-05-03 2014-03-12 Genentech, Inc. Vascular disruption agents and uses thereof
HK1210192A1 (en) 2012-07-19 2016-04-15 Alethia Biotherapeutics Inc. Anti-siglec-15 antibodies
NZ630363A (en) * 2012-07-25 2018-09-28 Celldex Therapeutics Inc Anti-kit antibodies and uses thereof
CN103074425B (zh) * 2012-12-29 2014-01-01 深圳市第三人民医院 Cd263基因的用途
WO2015051159A1 (en) * 2013-10-02 2015-04-09 The Rockefeller University Amyloid protofibril antibodies and methods of use thereof
CN104710533A (zh) * 2013-12-12 2015-06-17 中国科学院深圳先进技术研究院 sDR5-Fc融合蛋白及其用途
IL308212A (en) 2015-01-20 2024-01-01 Igm Biosciences Inc Tumor necrosis factor-α receptor binding molecules and their uses
RU2017129236A (ru) 2015-01-26 2019-03-07 Макродженикс, Инк. Мультивалентные молекулы, содержащие dr5-связывающие домены
CN105061604B (zh) * 2015-08-19 2018-03-16 河南大学 sDR5‑Fc融合蛋白突变体及其应用
CN109195626B (zh) 2015-10-30 2022-09-13 银河生物技术有限责任公司 结合死亡受体4和死亡受体5的抗体
CN109476737A (zh) 2015-12-01 2019-03-15 根马布有限公司 抗dr5抗体及其使用方法
CN106924735A (zh) * 2015-12-29 2017-07-07 上海交通大学医学院附属瑞金医院 多巴胺1类受体激动剂在制备肿瘤治疗药物中的用途
US10849912B2 (en) 2016-02-09 2020-12-01 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Method of sensitizing cancer cells to the cytotoxic effects of apoptosis inducing ligands in cancer treatment
CA3015619A1 (en) 2016-03-01 2017-09-08 Yissum Research Development Company Of The Hebrew University Of Jerusalem Ltd. Antibodies specific to human poliovirus receptor (pvr)
KR101926166B1 (ko) * 2016-05-24 2018-12-06 재단법인 아산사회복지재단 수용체 시너지 활성을 이용한 nk 세포의 활성도 검사 방법 및 이를 이용한 nk 세포의 활성도가 관련된 질환의 진단 방법
US11680101B2 (en) 2017-01-27 2023-06-20 Kymab Limited Anti-OPG antibodies
KR101926834B1 (ko) * 2017-03-21 2018-12-07 동아에스티 주식회사 항-dr5 항체 및 그의 용도
EP3635005A1 (en) 2017-06-07 2020-04-15 Genmab B.V. Therapeutic antibodies based on mutated igg hexamers
KR101951025B1 (ko) 2017-08-17 2019-02-21 서울대학교산학협력단 세포사멸 수용체 저해제를 유효성분으로 포함하는 cx3cl1 케모카인 과발현으로 인한 질환 예방 또는 치료용 조성물
EP3684409A4 (en) * 2017-09-22 2021-06-23 Immunogen, Inc. SEPARATION OF TRIPLE LIGHT CHAIN ANTIBODIES USING CATION EXCHANGE CHROMATOGRAPHY
WO2019100194A1 (zh) * 2017-11-21 2019-05-31 深圳先进技术研究院 抗dr5的抗体及其制备方法和应用
WO2019100193A1 (zh) * 2017-11-21 2019-05-31 深圳先进技术研究院 抗dr5的抗体及其制备方法和应用
CN108251443A (zh) * 2018-01-23 2018-07-06 深圳市人民医院 一种tnfrsf10c重组质粒、制备方法及其应用
US12018045B2 (en) 2018-03-06 2024-06-25 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services 17-beta-hydroxywithanolides and use thereof in treating cancer
CN117126279A (zh) 2018-03-20 2023-11-28 鸿运华宁（杭州）生物医药有限公司 Gipr抗体及其与glp-1的融合蛋白质，以及其药物组合物和应用
EP3897851A2 (en) 2018-12-17 2021-10-27 Revitope Limited Twin immune cell engager
EP4041392A1 (en) 2019-10-08 2022-08-17 Nectin Therapeutics Ltd. Antibodies against the poliovirus receptor (pvr) and uses thereof
EP4277706A1 (en) 2021-01-15 2023-11-22 Stichting Het Nederlands Kanker Instituut- Antoni van Leeuwenhoek Ziekenhuis Inducers of senescence, in combination with a selective death receptor 5 (dr5) agonist, for use in a method of treating cancer

Family Cites Families (42)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4816567A (en) * 1983-04-08 1989-03-28 Genentech, Inc. Recombinant immunoglobin preparations
IL162181A (en) 1988-12-28 2006-04-10 Pdl Biopharma Inc A method of producing humanized immunoglubulin, and polynucleotides encoding the same
GB9028123D0 (en) * 1990-12-28 1991-02-13 Erba Carlo Spa Monoclonal antibodies against human tumor necrosis factor alpha
US6812327B1 (en) 1996-10-25 2004-11-02 Human Genome Sciences, Inc. Neutrokine-alpha polypeptides
US6433147B1 (en) * 1997-01-28 2002-08-13 Human Genome Sciences, Inc. Death domain containing receptor-4
PT1012274E (pt) 1997-01-28 2007-08-14 Craig A Rosen Receptor 4 contendo um domínio de morte (dm4; receptor de morte 4), membro da super-família do ftn e ligação a liart (ap02)
US6072047A (en) * 1997-02-13 2000-06-06 Immunex Corporation Receptor that binds trail
US6313269B1 (en) * 1997-03-14 2001-11-06 Smithkline Beecham Corporation Tumor necrosis factor related receptor, TR6
JP4330180B2 (ja) 1997-03-17 2009-09-16 ヒューマン ジノーム サイエンシーズ， インコーポレイテッド 死ドメイン含有レセプター５
US6872568B1 (en) * 1997-03-17 2005-03-29 Human Genome Sciences, Inc. Death domain containing receptor 5 antibodies
IL123888A0 (en) 1997-04-01 1998-10-30 Sankyo Co Anti-fas antibodies
AU7126498A (en) 1997-04-16 1998-11-11 Millennium Pharmaceuticals, Inc. Tumor necrosis factor receptor related proteins tango-63d and tango-63e
US6342369B1 (en) * 1997-05-15 2002-01-29 Genentech, Inc. Apo-2-receptor
ES2293682T5 (es) 1997-05-15 2011-11-17 Genentech, Inc. Anticuerpo anti-apo2.
AU8400398A (en) 1997-07-11 1999-02-08 Trustees Of The University Of Pennsylvania, The Nucleic acid encoding a novel chemotherapy-induced protein, and methods of use
EP0998561A4 (en) * 1997-07-15 2004-08-18 Immunex Corp RECEPTOR DES TRAIL PROTEIN
AU3710597A (en) 1997-08-06 1999-03-01 Laboratorio Medinfar-Produtos Farmaceuticos, Lda Dna integration into "mycobacterium spp." genome by trans-complementation using a site-specific integration system
ATE233887T1 (de) * 1997-08-13 2003-03-15 Sortech Ag Sorptionsspeicher, anordnung und verfahren zur speicherung von wärme
CA2301202A1 (en) * 1997-08-15 1999-02-25 Idun Pharmaceuticals, Inc. Trail receptors, nucleic acids encoding the same, and methods of use thereof
WO1999011791A2 (en) 1997-09-05 1999-03-11 University Of Washington Tumor necrosis factor family receptors and ligands, encoding nucleic acids and related binding agents
CA2301173C (en) 1997-09-12 2015-04-14 Biogen, Inc. Cysteine rich receptors-train
US7105640B2 (en) * 1997-10-17 2006-09-12 Genentech, Inc. Anti-pro792 antibodies
AU2338299A (en) 1998-01-26 1999-08-09 Genentech Inc. Antibodies to death receptor 4 (dr4) and uses thereof
US20040120947A1 (en) 1998-01-26 2004-06-24 Genentech, Inc. DR4 antibodies and uses thereof
US6252050B1 (en) * 1998-06-12 2001-06-26 Genentech, Inc. Method for making monoclonal antibodies and cross-reactive antibodies obtainable by the method
CA2365913C (en) * 1999-04-12 2015-03-03 Genentech, Inc. Tumor necrosis factor receptor homologs and nucleic acids encoding the same
JP2002543151A (ja) 1999-05-04 2002-12-17 ヒューマン ジノーム サイエンシーズ， インコーポレイテッド 死ドメイン含有レセプター５
CA2373063A1 (en) 1999-05-06 2000-11-16 Jian Ni Death domain containing receptor 4
EP1181319B1 (en) 1999-05-28 2009-04-22 Genentech, Inc. Chimeric dr4 antibodies and uses thereof
ATE330972T1 (de) 1999-06-09 2006-07-15 Genentech Inc Apo-2l rezeptor-agonist und cpt-11 synergie- effekt
US6294546B1 (en) 1999-08-30 2001-09-25 The Broad Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Uses of diterpenoid triepoxides as an anti-proliferative agent
CA2384762A1 (en) 1999-09-15 2001-03-22 Genentech, Inc. Apo-2 receptor antibodies
JP2003531588A (ja) 2000-04-11 2003-10-28 ジェネンテック・インコーポレーテッド 多価抗体とその用途
US7476383B2 (en) * 2000-05-02 2009-01-13 The Uab Research Foundation Antibody selective for DR4 and uses thereof
TWI318983B (en) 2000-05-02 2010-01-01 Uab Research Foundation An antibody selective for a tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand receptor and uses thereof
US7279160B2 (en) * 2000-05-02 2007-10-09 The Uab Research Foundation Combinations of DR5 antibodies and other therapeutic agents
WO2002079377A2 (en) 2000-11-08 2002-10-10 Human Genome Sciences, Inc. Antibodies that immunospecifically bind to trail receptors
US20030228309A1 (en) * 2000-11-08 2003-12-11 Theodora Salcedo Antibodies that immunospecifically bind to TRAIL receptors
US6965023B2 (en) * 2000-11-17 2005-11-15 The Burnham Institute Death domain proteins
EP1409544B1 (en) 2001-07-03 2009-06-17 Genentech, Inc. Human dr4 antibodies and uses thereof
ES2357225T3 (es) 2001-11-01 2011-04-20 Uab Research Foundation Combinaciones de anticuerpos anti-dr5 y anticuerpos anti-dr4 y otros agentes terapéuticos.
IL161686A0 (en) 2001-11-01 2004-09-27 Uab Research Foundation Combinations of antibodies selective for a tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand receptor and other therapeutic agents

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