PT1012274E - Receptor 4 contendo um domínio de morte (dm4; receptor de morte 4), membro da super-família do ftn e ligação a liart (ap02) - Google Patents

Description

.DEsesxçio

RECEPTOR 4 CONTENDO UM DOMÍNIO DE MORTE (DM4; RECEPTOR DE MORTE 4) , M&M&RO DA DO FNT E A MlHf (AP02)

Domínio da Invenção A presente 'íwmnçà:® tem por objecto um novo elemento da família dos receptores do factor de necrose do tumor. Mais especificamente, tem por objecto moléculas isoladas de ácidas nucleicos que codificam o receptor 4 humano que contém um domínio de morte, algumas vezes referido aqui como "DM4". Também tem por objecto polipéptidos de DM4, assim como, vectores, células hospedeiras e processos recombinantes para a produção dos mesmos. A presente invenção tem ainda por objecto processos de rastreio para identificar agonistas e antagonistas da actividade de DM4.

Antecedentes da Invenção

Numerosas acções bloi.bglotr, por exemplo, as que respondem a certos estímulos e processos biológicos naturais, são controladas por factores, tais como, as cítocinas. Muitas cítocinas actuam através de receptores envolvendo o receptor e produzindo una resposta intracelular.

Por exemplo, m factores de necrose ao rumor ·ΒΕΠ alfa e beta são cítocinas, que actuam através dos receptores de FNT para regular numerosos processas BioióigiLocoí, InP-lttiódo a grofecolt contra a infatigio e a indução de choque e de doenças inflamatórias. As moléculas do FNT pertencem a super-família dos "ligandos de FNT" e actuam em conjunto com os seus receptores ou contra-ligandos, a super-família dos "receptores de FNT". Mê agora, fcram identificados nove membros da super-familia dos ligandos de FNT e dez membros da super-família dos receptores de FNT foram caracterizados.

Entre cs ligandos, estão incluídos FNT-a, ' ' r. h:,\oa.: ca™::: (L?'-a, também conhecida por fnT-i" , LT-β (encontrada no heterotrímero complexo FasL, CÍMK( CDlll, Cdd£Lf 4-IBBL, 0X4 OL e o factor de crescimemo do nervo (FCN) . A super-família dos receptores de FNT inclui o receptor de pdSFlíf., o receptor de p75FNT, a proteína relacionada com c receptor de FNT, o antíqénío de FAS ou APO-1, CD40, CD27, CD30, 4-1BB, 0X40, p75 de baixa afinidade e o receptor de FCN (Meager, Bíologícals, 22: 291-295 (1994)).

Muitos membros da super-família dos ligandos do FNT são expressos pelas células T activadas, implicando isso que eles são necessários para as interacções das células T com outros tipos de células subjacentes a ontogenia e as funções das células (Meager, A., supra). Já se ganhou uma considerável visão sobre as funções essenciais de vários membros da família dos receptores de FNT a partir da identificação e criação de mutantes que vão abolir a expressão dessas proteínas. Por exemplo, as mutações de ocorrência natural no antigénio FAS e no seu ligando causam uma doença linfoproliferativa (Watanabe-Fukunaga, R., et ai., Nature 356: 314 t reflectindo talvoss falha da morte programada das células. M mfsçhaíO do iigando CD40 causam um estado de imunodeficiência ligado a X, caracterizado por elevados níveis de imunoglobulina M e baixos níveis de imunoglobulina G no plasma, indicando uma activação defeituosa das células E dependentes das células T ÍAllen, R. C. et al.f Science 259: 990 (1993)). As mutações pretendidas do receptor do factor de crescimerto do nervo de baixa afinidade causam um distúrbio, caracterizada por uma deficiência da inovação sensória das estruturas periféricas (Lee, K. i. et al. r Cell 69: 121 (1992)j. O FNT e a LT-α são capazes de se ligarem aos dois receptores de FNT (os receptores de FNT de 55 e 75 kd) . Um grande número de efeitos biológicos provocados pelo FNT e pela úf-og actuando através dos seus receptores, incluem a necrose htgtõrrlglpâ de tumores transplantados, a citotoxi-cidade, um papel na choque endotóxico, inflamação, imuno-regulação, proliferação e respostas antiviraís, assim como, protecção contra os efeitos prejudiciais da radiação por ionização. O FNT e a LT-a estão envolvidos na patogenese de uma vasta gama de doenças, incluindo o choque endotóxico, a malária cerebral, tumores, doenças auto-imunes, SIDA e rejeição de enxertos pelo hospedeiro (Beutler, B. e Von Huffel, C., Science 264: 667-668 (1994)). As mutações no receptor p55 causam uma susceptibilidade acrescida para infecções microbianas. Âiéai disso, foi referenciado um: domínio de cerca de 80 aminoáeidás próximo da terminação C do R-l de FNT Cp55> e Fas, como o "domínio de morte", ot é responsável pelos sinais de fruucdtçio para a morte programada das Células (Tartaglia et ii,, Cell 74: 845 (1993)). A apóptose ou morte programada das células é um pvQC&mo fisiológico essencial paru o normal desenvolvimento e a íiiimmôBC&sé dos organismos multicelulares (H. Steller, Science 267: 1445-1449 (1995)). Alterações da apóptose contribuem para a patogénese de várias doenças humanas ibdlsindb c cancro, distúrbios neurodegenerativos e síndroma de iks-o* deficiência adquirida (C.B. Thompson, 'Scieãm 267·. 1456- 1462 (1995)). Recentemente, tem-se focado msit Issifía atenção na transdução ao sinal s na função biológica dos dois receptores do domínio da morte da superfície das células, e R-l de FNT ÍJ. L. Cieveland et ai.,

Ceíi 81: 479-482 (1995); A. Fraser, et ai., Cell 85: 781— 784 (1996); S. Nagata et al., Science 261: 1449-56 (19 95) ) . PiSiÈms são membros da família dos receptores de FNT g·® também incluem R-2 de FNT, R-FCN de baixa afinidade, CD40 e CD30, entre outros (C. A. Smith et ai., Science 248: 1019-23 (1990); M. Tewari et ai., em Modular Texts in tiole-miar and Cell Biology M. Purton, Heldin, Cari, Ed. (Chapman and Hall, London, 1995) . Embora os membros da família sejam definidos pela presença de repetições ricas em cisteína nos seus domínios extra-celulares, Fas/APO-1 e R-l de FNT também partilham uma região de homologia intracelular, apropriadamente designada por "domínio da morte", que está rtnleçíúçnádis, de uma forma distante, com o gene suicida reaper de SttSbpáiiç., ÍP, Golsteín, et ai., Cell 81: 185-186 ( ; K. White et ai., Science 264: 677-83 (1994)).

Este domínio de morte partilhado sugere que ambos os receptores interagem com um conjunto relacionado de moléculas de transdução do sinal que, até recentemente, permaneciam não identificadas. A bdfdvíunXo de Fas/APO-1 recruta a uatlécitla do adaptador contendo o domínio de morte fAPD/MORTX (A. M. Chinnaíyan et alCell 81: 505-12 (1995); th P . :B οΐύΐΐϊ et al.f J. Bíol CmM 270: 7795-8 (1995); F. C. Kl ccCiMl et al., EMBO 14: MC) mm cl 1' ' :> que, por sua vez, se liga e pféisu mcBlmimm activa FiUt.fCiíç/iNd vCH X ,· um k mqbrb da família de XCu /CEd-3 âm proteases ptfm 1i'í í. ÍV m (M. Muzío et al., Cell 85: 817-827 (1996); Μ. Ρ. Eoidin et al., Cell 85: 803-815 (1996)) . Embora o papel central de Fas/APO-1 seja alavancar a morte da célula, R-l de FNT pode assinalar um conjunto de diversas actividades biológicas, muitas delas caracterizadas pela sua capacidade para activar NF-kB (L.

Tartagiia et al., Immunol Today 13: 151-3 (1992) j. De acordo com isto, R-l de FNT recruta a molécula adaptadora muitivalente TRADD, que, tal como FADD, também contém um domínio de morte (H. Hsu et al., Cell 31: 495-504 (1995); H. Hsu, et ai., Cell 84: 299-308 (1996) j. Através das suas associações com um certo número de moléculas de sinalização, incluindo FADD, TRAF2 e RIP, TRADD pode assinalar tanto a apóptose como a activação de NF-kB (H. Hsu et al., Cell 84: 299-308 (1996); H. Hsu, et ai.,

Immunity 4:387-396 (1996)).

Recentemente, descobriu-se um novo ligando de FNT que induz a apóptose. S. R. Wiley et al. (Immunity 3: 673-682 (1995)) designando a molécula por "ligando que induz a apóptose relacionada com o FNT" ou, simplesmente, >vf na terminologia inglesa. A molécula foi também designada por "ligando de Apo-2" ou "LApo-2". " R. M. Pitt et ai., J. Biol. Chem. 271: 12687-12690 (1996). Esta molécula está também descrita no pedido de patente provisional co-pendente, norte-americano N°. 60/013.405, correspondente à patente de invenção WO 31/33333h Por t a molécula será então aqui referida como LIART.

Ao contrário do ligando de FAS, cujo os transcriptos parecem estar largamente restritos às células T estimuladas, detectam-se níveis significativos de LIMil em muitos tecidos humanos (por exemplo, baço, pulmões, próstata, timo, ovários, intestino delgado, cólon, linfocitos do sangue periférico, placenta, rim) e é transcripto sob o ponto de vista constitutivo por algumas linhas de células. Tem,-se demonstrado que LIART actua independentemente do ligando de Fas (Wiley et al., supra). Também tem sido demonstrado que LIART activa rapidamente a apóptose, dentro de um intervalo de tempo que é semelhante â sinalização de morte por Fas/LApo-1, mas muito mais rápida do que a apóptose induzida por FNT. S. A. Marsters et al., Current Biology 6: 750-752 (1996). Todo o trabalho até à data sugere que o receptor para LIART não é um dos muitos receptores do FNT.

Os efeitos dos ligandos da família de FNT e dos receptores da família de FNT são variados e influenciam numercsas funções, tanto normais ct» anormais, ncs processos biológicos do sistema dos mamíferos. Há uma necessidade clara, por isso, de identificar e caracterizar esses receptores e ligandos que influenciam a actividade biológica, tanto normalmente como em estados de doença. Em particular, há uma necessidade de isolar e caracterizar o receptor para o ligando de LIART recentemente descoberto. 'Sveaâzàm é&- Immmpàio A presênte invenção tem por objecto moléculas de ácido nucleico isoladas, compreendendo sequências de ácidos nucleicos que codificam a sequência de aminoácidos mostrada na fig. 1 (SEQ ID N°. 2) ou a sequência de aminoácidos codificada pelo clone de ADNc depositado na ATCC ocm o N°. de depósito 97853, em 21 de Janeiro de 1997. A presente também tem per objecto vectores e células hospedeiras para a çsoprtrtãb recombinante das de ácidos nucleicos aqui descritas, assim como os processos de produzir esses vectores e essas células nospedeiras e para a sua utiiitógld para a produçãs de polipéptidos de ou péptidos de DM4, por meio de técnicas xxaxcúxina:ntea* A presente invenção tem ainda por objecto um polipéptído de DM4 isolado com uma sequência de aminoácidos codificada por um polinucleótido aqui descrito. A presente invenção também tem por objecto ensaios de diagnóstico, tal como, ensaios quantitativos e ensaios de diagnóstico para a detecção dos níveis da proteína do DM4. Assim, por exemplo, um ensaio de diagnóstico de acordo com a presente invenção para detectar a sobre-expressão de DM4 ou de uma sua forma solúvel, comparando com as amostras de controlo de tecido normal, pode ser utilizado para detectar a presença de tumores.

Os ligandos da família do factor de necrose de tumor (FNT) são conhecidos por estarem entre as citocinas mais pleiotrópicas, induzindo um grande número de respostas celulares, incluindo citotoxicidade, actividade anti-viral, actividades irnuno-reguladoras e a regulação transcricional ds vários genes. A resposta celular aos ligandos da família dos FNT inclui não apenas as respostas fisiológicas normais, mas também doenças associadas com o aumento da apóptose ou a inibiçao da apóptose. á apóptose - norte programada das células - ê um mecanismo fisiológico envolvido na eliminação dos linfócitos T periféricos do sistema imunitário e a sua oe ?reou '.ação pode Levar a um certo número de íM-ferraxes çiscestos patogênlcos. As doenças associadas com o apoptose incluem cancros, auto-imunes, infecções xúõxíAí inflama-ções, enxertos versus doença do hospedeiro, rejeição aguda de enxertos e rejeição crónica de enxertos. As doenças associadas com um aumento da apóptose incluem a SIDA, doenças neurodegenerativas, sindrcmas mieiodisplásicos, traumas isquémicos, choque séptico, doenças do fígado induzidas por toxinas, caquexia e anorexia.

Assim, a presente invenção tem ainda por objecto um processo para aumentar a apoptose induzida por um ligando da família dos FNT, que envolve a administração a uma célula que expressa o polipéptido de DR4 urra quantidade efectiva de um agonista capaz de aumentar a sinalização mediada por DM4. Freferencialmente, aumenta-se a sinalização mediada por DM4 para tratar uma doença em é evidente a diminuição da apoptose.

Num outro aspecto, a presente invenção tem ainda por objecto um processo para inibir a apóptose induzida por um ligando da família do FNT, o que envolve a administração a uma célula que expressa o polipéptido de DM4, de uma quantidade de um agonista capaz de diminuir a sinalização mediada por DM4. Preferencialmente, diminui-se a sinalização mediada por DM4 para tratar uma doença em que se verificou que a apóptose estava aumentada.

Quando um qualquer candidato a "agonista" ou a "antagonista" áã presente invenção pode aumentar ou inibir a apóptose, pode-se fazer a respectiva determinação utilizando ensaios de resposta celular do receptor/ligando da família do FNT, conhecidos na técnica, incluindo os descrites com mais detalhe a seguir. Assim, num outro aspecto, descreve-se um processo de avaliação para determinar se mm agonista candidato m ί,ίν» antagonista candidato é capaz de aumentar ou de inibir uma resposta celular s um ligando da família do FNT. 0 processo envolve o contacto das células que expressam o polipéptido DM4 com um composto candidato e um Ligando da família dos FNT, ensaiando uma resposta celular e comparando a resposta celular com urra resposta celular padrão, sendo o padrão ensaiado quando o contacto & feito com c ligando na ausênc.is do composto candidato, em que um aumento da resposta celular em relação ao padrão, indica que o composto candidato é um agonista da via de sinalização do lígandc/receptor e uma diminuição da resposta celular comparada com o padrão, indica que o composto candidato é um antagonista da via de sinalização do ligando/receptor. Pela presente invenção, pode fazer-se contactar uma célula que expressa o polipéptido de DM4 com um qualquer dos ligandos da família dos FNL, administrado quer endogenamente quer exogenamente.

Breve Descrição das Figuras - A figura 1 mostra a sequência de nucleótidos e a sequência de aminoácido deduzida de DM4. É previsível que os aminoácidos 1-23 constituam o péptido de sinal, os amincácidos 24-238 constituem o domínio extracelular, os aminoácidos 239-264 constituem o domínio da transmembrana e os aminoaciaos 265-468 constituem c domínio intrace-lular do qual os aminoácidos 379-422 constituem o domínio de morte. A figura 2 mostra as regiões de semelhança entre as sequências de aminoácidos de DM4, do receptor 1 do factor iuMm,:··;: de necrose do tumor (SEQ ID mí; 3) , lOÇotcLo® Fas humãO® (SEQ ID NO: i : e o receptor 3 contendo o domínio de morte (DM5) (SEQ ID dCc 5). de A figura 3 mostra uma análise do s-squér aminoácidos de DM4. Regiões alfa, beta e de hidrofilicidade e hidrofobícidade; regiões anfipáticas; regiões flexíveis; índice antigénico e probabilidade da superficie sàe tudo parâmetros mostrados. No gráfico "índice antigénico * Jameson-Wclf" os resíduos de aminoácidos 35-92, 114-160, 169-210, 267-298, 330-364, 391-404 e 418-465 na figura l, correspondem às regiões altamente antigénicas mostiadas, da proteína de DM4. A figura 4 mostra as sequências de nucleótidos de fragmentos de ácidos nucleicos relacionados HTOIY07R (SEQ ID NO:6) e HTXEY80R (SEQ ID NO:?).

As figuras 5A e 5B mostram a capacidade de DM4 para induzir a apóptose nas linhas de células MCF7 e 293. A figura 5C mostra a capacidade dos inibidores da protease da morte, CrmA e z-VAD-fmk, para inibir a acyão apoptótica de DM4. A figura 6A mostra a capacidade de uma fusão de DM4-Fc extracelular,solúvel para bloquear a capacidade de indução apoptótica de LIART. A figura 6B mostra a incapacidade de uma fusão de DM4-Fc extracelular, o! ovni para bloquear a capacidade de indução apoptótica de FNTa.

Descrição Detalhada dos Enquadramentos Preferidos A presente invenção tem por obléPto moléculas isoladas de ácidos nucleicos, compreendendo uma sequência de ácidos nucleicos que codifica o polipéptido de DM4 cuja sequência de aminoácidos se mostra na figUTd I (SEQ ID NO: 2) ou u;n fragmento do stàip-èptiílls·, O polipéptído de DM4 da presente invenção partilha uma homologia da sequência com R-l de FNT humano, DM3 e o ligando de Las (figura 2). A sequência de nucleótidos mostiaàa na figura 1 (SEQ ID NO: 1) foi obtida sequenciando clones ae ADNc, tal como, HCUDS60, que foi depositado em 21 de Janeiro de 1997, na American Type Culture Collection, .12301 Park Lawn Drive, Rockville, Maryland 20852 e a que foi dado o número de acesso 97853. O clone depositado estava contido no plasmido pBK (Stratagene, LaJolla, CA}.

Moléculas de Ácidos Nucleicos Ά menos rps seja indicado de outra forma, todas as sequências de nucleótidos determinadas pela sequenciação de uma molécula de ADN, foram aqui determinadas utilizando um sequenciador automático de ADN (tal oomo o modelo 373 da Applied Biosystems, Inc.) e todas as sequências de amino-ácidos dos polipeptidos codificados pelas moléculas de ADN aqui determinadas, foram previstos por tradução de uma sequência de ADN determinada tal como antes. Por isso, tal como é sabido na técnica para qualquer sequência de ADN determinada por esta abordagem automatizada, qualquer sequência de nucleótidos aqui determinada pode conter alguns erros. As sequências de nucleótidos determinadas por um processo automático são normalmente menos cerca de 90 % idênticas, mais . ' n pelo menos cerca de 95 % até pelo menos cerca de 99,9 % idênticas a sequência de nucleótidos actual da molécula de ADN sequenciada. A sequência actual pode ser determinada mais precisamente por meio de outras abordagens incluindo processos manuais de sequenciação de âDS bem conhecidos n& técnica. TsxnM® como e sabido na técnica, ama ir·.·:· ou:;.. 2·..· ou eliminação ròmplad numa determinada sequência de nucleótidos comparada com a sequência actual, vai causar uma deslocação dum fragmento na translação da sequência de nucleótídos, de tal maneira que a previsível sequência de aminoãcidos codificada por determinada sequência de nucleótídos, será completamente diferente da sequência de aminoãcidos actualmente codificada pela molécula de ADN sequenciada, começando no ponto dessa inserção ou eliminação.

Por polipéptido ou proteína "isolados" entende-se um polipéptído ou uma proteína retirada do seu ambiente natural. Por exemplo, os polipéptidos e as proteínas produzidos por recombinação, expressos nas células hospedeiras, são considerados isolados para os fins da presente invenção quando são polipéptidos naturais ou recombinantes qhc tenham sido substancialmente purificados por qualquer técnica apropriada tal como, por exemplo, o processo de purificação numa única etapa descrito em Smith e Johnson, Gene 67: 31-4C (1988).

Utilizando a informação dada aqui, tal como a sequência de ácidos nucleicos estabelecida na fig. 1, uma molécula de ácidos nucleicos da presente invenção que codifica um polipéptido de DM4, pode obter-se utilizando processos de clonagem e avaliação normalizados, tal ccmo os da clonagem de ADNcs utilizando ARNm como material inicial. Ilustrativo da presente invenção, o gene da presente invenção tem sido identificado em bibliotecas de ADNc dos seguintes tecidos: células amnióticas, coração, cancro do fígado, rim, leucócitos, células T activadas, células K562 isís PMA, células W138, cêlúl^fà Th2, amígdalas humanas e pele ccr de couro com falta de CD34 (sangue do cordão). 0 gene de DM4 . um de leitura aberta que codifica ume proteína de cerca de 445 resíduos de aminoãcidos eufo codão de iniciação está na posição 19-21 da sequência de nucleótidos mostrada na figura 1 (SEQ ID NO: 1), com uma sequência líder de cerca de 23 resíduos de aminoácidos (isto é, um comprimento total da proteína de 468 aminoácidos) e um peso molecular deduzido de 50 kDa. Dos membros conhecidos da família de receptores de FNT, o polipéptido de DMÇ da presente invenção partilha o mais alto grau de homología com o R de FNT1 humano e os polípéptidos de DM3 mostrados na figura 2, incluindo uma significativa homología da sequência em relação aos múltiplos domínios ricos em cisteína.

Para além da homología da sequência exibida entre DM4 e outros receptores contendo o domínio de morte, DM4 tem mostrado que se ligava a I.IART e que induz a apoptose quando expresso de forma transiente. As células MCF7 do carcinoma humano da mama e as células 293 foram cransfectadas de forma transiente com una estrutura que expressa DM4, tal como descrito no exemplo 5. Como se vê nas figuras 5A e 5B, urra porção substancial das células transfeetadas sofre as alterações morfológicas características de apoptose. Como já se antecipou, a eliminação do domínio de morte aboliu a capacidade de DM4 para aproveitar a via de morte. Como se pode ver na figura 5C, a apoptose induzida por DM4 foi bloqueada de forma eficiente por inibidores de proteases do domínio de morte, incluindo z-VAD-fmk, um inibidor de caspase de largo espectro, irreversível e CrrnA, um virtJj» de vacínía codificado por serpina que inibe preferencialmente as v:v::í,ps:apicais tais como FLX££IM&:CH~'l Duíis; apoptose i nduz ida por R de FNT-1, CD-95 ae DM3 está atenuada por estes mesmos irõiMdvaunsç é provável :-:Ç: v:; A-cC::h-vò.-c-èC c:·: dó do dcol íuio :Í::V OÇ Λ -'.Ο í sejam v ich çví na sua natureza.

Para determinar se DM4 era capaz de se ligar a LIART, o domínio de ligação do ligando extracelular ae DM4 foi expresso cm® a região Fc de IgG (DM4-Fc) humana. LIART liga-se raiaçiirwsaliiP a DM4-Fc mas não aos domínios extracalálaraa correspondentes do 1 de FNT-1 ou C3-95, também expresso como fusões de Fc, dados não mostrados. Adicionalmente, DM.4»-:fc não se liga nem a FNT alfa nem ao ligando Faz, nas condições em que ambos estes ligandos se ligam aos seus receptores de cognatos. 1 capacidade de LIART para induzir a apoptose nas células MCF7 foi especificamente bloqueada por DM4-Fc mas não foi influenciada por R de FNT-l-Fc, CD95-Fc ou apenas Fc (Figura 6A). Além disso, conforme se esperava, a apoptose induzida por FNT alfa foi inibida por FNT-l-Fc mas não por DM4-Fc, CD95-Fc 3 Fc isoladamente (Figura 6B) .

Considerados em conjunto, os dados descritos antes indicam que DM4 é um domínio de morte contendo um receptor com a capacidade para Induzir a apoptose e é um receptor para LIART, um ligando conhecido que induz a apoptose.

Tal como indicado, a presente invenção t.òord>:s lots por objecto as formas maduras da proteína DM4 da presente De acordo com a hipótese de sinal, as proteínas segregadas poç células de mamíferos têm uma sequência de sinal ou uma sequência líder secretora, que è eMlúúic a partir da proteína maaura logo que se exporta da cadeia da proteína de crescimento çççbdo o i:0dicdtlo; oodlzpd.iMd.cò rugoso ê do. A maior parte dor células de CsColio :o:os e mesmo as células do insectos dilcdn: as proteínas segregadas com. a mesma especi fieida.de. Contudo, dalgcds casos, a clivagem ae uma proteína segregada Mó é completamente uniforme, o que resulta em duas ou mais espécies maduras na proteína. Além disso, sabe-se desde hâ muito tempo que a especificidade da clivagem de uma proteína segregada é em última analise determinada pela estrutura primária da proteína completa, isto é, inerente à sequência de aminoácídos do polipéptido. Por isso, a presente IavAíuúíí; tem por objecto uma sequência de nucleótídos que eodlfioâ o polipéptido de DM4 maduro, contendo a sequência de aminoácídos codificada pelo clone de ADNc contido no hospedeiro identificado com o número de depósito na ATCC 97853 e, tal como se mostra na figura 1 (SEQ ID NO: 2) . Por proteína de DM4 madura com a sequência de aminoácídos codificada pelos clones de ADNc contidos no hospedeiro identificado com o número de depósito na ATCC 97853, entende-se as formas maduras da proteína de DM4 produzida por expressão numa célula de mamíferos (por exemplo, células de COS, tal como se descreve a seguir) do fragmento completo de leitura aberta codificado pela sequência de ADN humano do clone contido no vector no hospedeiro depositado. Tal como se indica a seguir, o DM4 maduro comportando a sequência de aminoácídos codificada pelo clone de ADNc com o número de depósito na ALCC 97853, pode ou não diferir da prevista proteína de DM4 "madura" mostrada na figura 1 (aminoácidos desde cerca de 24 até próximo de 468) consoante a precisão do sitio de clivagem previsto com base na análise do computador.

Estão disponíveis processos para prever se uma proteína tem um líder Ai-iCAfppr, assim corno, o pAUti de clyy&sfm. para essa sequência líder. P<v;: exemplo, os von Heínje IfeulêÍA Acíds Res. 14: 4 683-4 690 ΠΑΙΑΐΠ p-suúuu ser utJlizados. A precisão para prever os pontos de clivagem do proteínas secretoras conhecidas de para cada um destes processos, está no intervalo de cerca de 75-80 %. von Heinje, supra. Contudo, os dois processos não produzem sempre os mesmos pontos de clivagem. para uma dada proteína.

No presente caso, a sequência de aminoácidos prevista do polipéptido de DM4 completo da presente invenção foi analisada por um programa de computador ("PSORT"). (Ver, e, Nakai e M. Ksnehisa, Genomics 14: 897-911 i 13B2;?)) que é um sistema pericial para prever a localização celular de uma proteína com base na sequência de aminoácidos. Como parte desta previsão computacional da localização, incorporam-se aqui os processos de McGeoch e de von Heinje. A analise por meio do programa de previsão P50RT prevê os sítios de clivagem entre os aminoácidos 23 e 24 na figura 1 (SEQ ID NO: 2). Depois, as sequências de aminoácidos completas foram ainda analisadas por meio de ínspecção visual, aplicando uma forma simples da regra (-1, -3) de von Heinje. von Heinje, supra. Assim, a sequência líder para a proteína DM4 previsivelmente consiste nos resíduos de aminoácidos 1-21, sublinhados na figura I (SEQ ID EOt 2), embora a proteína madura DM4 prevista consista nos resíduos 24-468.

Tal como se indicou, as moléculas » ácido ivociniceda presente íuvçaçic, podem estar sob a forma de ARN, tal como, ARNm ou sob a ferree de ADN, incluindo, por excopia> ADNc e ADN geodaiLié obtido por oloceges; ou erc-doeido por síntese. O ADN pode ser de estrutura tellcoldãíi coo j. a o— de estrutura helicoidal simples. 0 ADN do z&zzntnzm helicoidal simples pode ser a cctrco.u:Vs de cociillceçso,. dsK;:bd;s conhecido como a odorei oca do oo a^tid-o (sçAÇpsd ou paralela ou pode ser a estrutura helicoidal de não codificação, também referida como a estrutura de sentido contrario (anti-sense) ou anti-paralela. -...viuguças de ácido nucleico "isoladas" entende-se urra molécula de ácido nucleico, ADN ou AEN, que tenha sido retirada do seu ambiente original. Por exemplo, as moléculas de ADN recombinante contidas num vector são consideradas isoladas para os fins da presente invenção. Outros exemplos de moléculas de ADN isoladas incluem moléculas de ADN reccmbinante mantidas nas células hospedeiras heterólogas ou moléculas de ADN purificadas (parcialmente ou totalmente) em solução. As moléculas de ARN isoladas incluídas nos transcriptos ae ARN in vivo ou in vitro dos moléculas de ADN da presente invenção. As moléculas de ácido nucleico isoladas, de acordo com a presente invenção, incluem ainda essas moléculas produzidas por síntese.

As moléculas de ácido nucleico isoladas da presente invenção incluem moléculas de ADN de DM4, que compreendem um fragmento de leitura aberta (FLA) mostrado na fig. 1 (SEQ ID NO: 1) e incluem ainda as moléculas de k%Bt que compreendem uma sequência substancialmunte diferente de toda Cíu parte da FLA cujo codão ae iniciação está na posição 19-21 da sequência de nculeótidos mostrada na fig. 1 (SEQ ID NO: 1) mas que, devido à degenerescência do código qúréc :.00, ainda codifica a proteína do polipéptido de DM4 ou a um seu fragmento. Obviamente, o código genético é bum conhecido na técnica. Assim, será uma rotina para um especialista na matéria gerar essas variantes doronorodus, Núsí outro aspecto, a presente invenção tem por objecto moléculas isoladas de ácido nucleico, que codificam o polipéptido de DM4 comportando uma sequência de aminoácidos codificada pelo clone de ADNc contido no plasmido depositado na ATCC com o número de depósito 97853, em 21 de Janeiro de 1997. Preferencialmente, estas moléculas de ácido nucleico irão codificar o polipéptido maduro ocodificado pelo clone de ADNc depositado, descrito antes. A presente invenção tem ainda por objecto uma molécula de ácido nucleico isolada comportando a sequência de nucleótidos mostrada na figura i ÍSEQ Ιδ NO: 'Π ou a sequência de nucleótidos do ADNc de contida no clone depositado descrito antes ou uma molécula ae ácido nucleico comportando uma sequência complementar das sequências anteriores. Essas moléculas isoladas e os seus fragmentos são úteis como sondas para o mapeamento dos genes por meio da hibridação in situ com o gene de DM4 em tecido humano, por meio de análise de Northern,de transferência para uma matriz imobilizada (ADN/ARNm). A presente invenção tem ainda por objecto fragmentos das moléculas de ácido nucleico isoladas aqui descritas. Por um fragmento de uma molécula de ADN isolada com a sequência de nucleótidos mostrada na figura 1 ÉEE-Çí ID NC: lú entende-se os fragmentos de ADN com pelo menos 20 pb e, mais preferencialmente, peio menos 30 pb de comprimento, que sáo úteis como sondas de ADN conforme discutido antes, obviamente que fragmentos de ADN maiores, com 50-1500 pb de comprimento, são também úteis como sondas de ADN de acordo com a presente . . s dado que são fragmentos de ADN que correspondem á maior parte, se não a toda, a aecarincdA de nucleótidos que se mostra na fig. 1 (SEQ ID NO: 1) . Por um fragmento com pelo serias 29 pp de comprimento, por exemplo, entende-se Ioddoddis;PD?.:; mv inclDem 20 ou mais bases da sequEaieiD de nucleótidos da fig. 1.

Os fragmentos de ácido nucleíco preferidos da presente invenção incluem moléculas de ácidos nucleicos que codificam: asu polipèívtido que compreende o domínio extracelular de DM4 òouõõduos de sminsâcid-as desde cerca de 24 até cerca de 238 na figura 1 tõEm ID NO:2) ) ; um polipéptido que compreende um domínio da transmembrana de DM4 (resíduos de aminoácidos desde cerca de 239 até cerca de 264 na figura 1 (SEQ ID NO: 2)); um polipéptido que compreende o domínio intracelular de DM4 (resíduos de aminoácidos desde cerca de 379 até cerca íl* 422 na figura 1 (SEQ ID NO: 2)). Dado que a localização destes domínios foi prevista por computação gráfica, um especialista na matéria compreenderá que os resíduos de aminoácidos que constituem estes domínios podem variar ligeiramente (por exemplo, cerca de 1 a 15 resíduos) consoante os critérios utilizados para definir cada domínio.

Os fragmentos de ácidos nucleicos preferidos da presente invenção codificam um polipéptido de DM4 de comprimento completo a que faltam os nucleótidos que codificam a metionina de terminal amino (nucleótidos 19-21 na SEQ ID NO: 1(:1 dado que se sabe que a metionina ê. clivada naturalmente e que essas sequências podem ser úteis em engenharia genética nos vectores de expressão de DM4. Os polipéptidos codificados por esses polinucleótídos étti» todos contemplados na presente invenção.

Os fragmentos de ácidos nucleicos preferidos da presente invenção incluem ainda moléculas de ácidos nucleicos que codificam as porções que se ligam ao epítopo da pbatúiaá de DM4. Em particular, esses fragmentos de ácidos nucleicos da presente invenção inclaé:"' moléculas de ácidos nucleicos que codificam: um polipéptido que compreende os resíduos de aminoácidos desde cerca de 35 até cerca de 920 na figura 1 (SEQ ID NO: 2); um polipéptido que compreende os resíduos de aminoácidos desde cerca de 114 até cerca de 160 na figura 1 (SEQ ID NO: 2); um polipéptido que compreende os resíduos de aminoácidos desde cerca de 169 até cerca de 2 40 na figura 1 (SEQ ID NO: 2) m, um pclipéptido que compreende os resíduos de aminoácidos desde cerca de 267 até cerca de 298 na figura 1 (SEQ ID NO: 2); um polipéptido que compreende os resíduos de aminoácidos desde cerca de 330 até cerca de 364 na figura 1 (SEQ ID NO: 2); um. polipéptido que compreende os resíduos de aminoácidos desde cerca de 391 até cerca de 404 na figura 1 (SEQ ID 00·: 2) ; e um poiipéptido que compreende os resíduos de aminoácidos desde cerca de 418 ate cerca de 485 na figura 1 (SEQ ID NO: 2) . Os requerentes determinaram que os fragmentos de polipéptidos anteriores são regiões antigénicas da proteína de DM4. Os processos para a determinação, para das porções que se ligam ao epítopo da proteína de DM4, estão descritos com detalhe a seguir.

Além disso, a presente invenção tem por objecto moléculas de ácidos nucleicos que têm sequências de nucleótídos relacionadas com porções extensas da SEQ ID MO: 1, tal como se segue: HTQIY07R (SEQ ID e HTXEY8QR (SEQ ID $Oí?) que estão ambas indicadas na figura 4.

Além disso, a presente invenção inclui um polínucleótido que compreende qualquer porção ÚM pelo menos cerca de 30 nucleótídos, preferencialmente, pelo utínos cerca do 50 ma:du;ddidòa de SEQ IS liou 1, do foridoo 365 a 1,424.

Num outero aspecto, a presente invenção tem por objecto uma molécula de ácido nucleico isolada, que compreende polinucleótido, que híbrida, em condições de hibridação severas, com uma porçics do polinucleótido mis® molécula de ácido nucleico da presente invenção descrita antes, por exemplo, os odonot: c!h ADNc depositados na ATCC com a número de depósito 97853. Por "condições ae hibridacdc· severas'' entende-se a incubação durante a noite, a 42 mp, numa solução que compreende: formamida a 50 , 5 x SSC (NaCl 150 citrato tri- sódico Is cib , fosfato de sódio 50 mM (a pH 7,6), 5 x de solução de Denhardt, sulfato de dextrano a 10 % e 20 g/mL de ADN de esperma de salmão cortado e desnaturado, seguido da lavagem dos filtros em 0,1 x SSC, a cerca de 65 " C.

Por um polinucleótido que híbrida com uma "porção" de um polinucleótido, entende-se um polinucleótido (quer ADN, quer ARN), que híbrida com pelo menos cerca de 15 nucleótidos (nt) e, mais preferencialmente, com pelo menos cerca de 20 nt, ainda mais preferencialmente, com pelo menos cerca de 30 nt e, ainda mais preferencialmente, pelo menos cerca de 30-70 de Dolinucleótidos de referência. Eles são úteis como sondas de diagnóstico e iniciadores, conforme se discutiu antes e em mais detalhe a seguir.

Por uma porção de um polinucleótido de "pelo menos 20 nt de comprimento", por exemplo, entende-se 20 ou mais nucleótidos contíguos da sequência de nucleótidos do ;>:···: I ÚSi I! V f-il ?! 000 ): ·.$. (pQT OXOUp J ' , O M2&' depositado ou a sequência de conforme se

ss fig. 1 2 (SEQ JB

Buo 3).

Obviamente, um polinucleótido que híbrida apenas com uma sequência de poli A (tal como, por exemplo, o tracto de poli A do terminal 3' do ADNc de mostrado nõ figura 1 (SEQ ID NO: 1)? ou com uma extensão complementar de resíduos de T (ou de U), não estaria incluído num polinucleótido da presente invenção utilizado para hibridar com uma porção de um ácido r.ucleico da presente invenção, dado que esse polinucleótido iria hibridar com qualquer molécula de ácido nucleieo contendo a extensão de poli A do seu complemento (por exemplo, praticamente qualquer clone de ADNc de estrutura helicoidal dupla).

Tal como se indicou, as moléculas de ácido nucleieo da presente invenção que codificam um polipéptido de DM4, podem incluir, mas não se limitam, a sequências de codificação do polipéptido maduro, por ele próprio; a sequência de codificação para o polipéptido maduro e as sequências adicionais, tais como as que codificam uma sequência líder ou segregadora, tais como, sequências de pré- ou pró- ou pré-pró- proteína ; a sequência de codificação do polipéptido maduro com ou sem as sequências de codificação adicionais mencionadas õntes, em conjunto com sequências adicionais, não codificantes, incluindo, por exemplo, mas não se limitando, a intrões e sequências de 3' e 5' não codificantes, fái como, as sequências não traduzidas, as transcriptas que desempenham um papel na transcrição, fragmentação incluindo o tratamento de ARNm e de sinais de por exemplo, - ligação de ribossoma e estabilidade de ARNm sequências de fíddi.fitâÇriía; adicionais que codificam para amínoácídos adicionais, tal como as que providenciam funcionalidades adicionais. Assim, por exemplo, o polipéptido pode fundir-se com omo sequência marcadora tal como um péptído, que facilita a purificação do polipéptido fundido. Em certos enquadra- mentos preferidos deste aspecto da presente invenção, a sequência, marcadora è um péptido de hexa-hístidina, tal como um marcador providenciado per um vector pQE (Qíagen, Inc.), entre outros, mu.it.vs dos quais estão comercialmente disponíveis. Tal como descrito em Gentz et aí., Proc. Natl. Acad. Sei. EUA 86: 821-824 fX-tiP}, por exemplo, a hexa-histidina providencia uma purificação conveniente da proteína de fusão. 0 marcador "HA" corresponde a um epítopo derivado da proteína da hemaglutinina da gripe, que já foi descrita, por exemplo, por Wilson et al,, Cell 37: 767-778 nie-í}, A presente invenção tem ainda por objecto variantes das moléculas de ácidos nucleicos da presente invenção que codificam para fragmentos, análogos cu derivados do polipéptido de DM4. As variantes podem ocorrer naturalmente, tal como uma variante alélica. Por uma "variante alélica" entende-se uma das várias formas alternativas de um gene, que ocupa um dado local num cromossoma de um organismo. Genes II, Lewin, B., ed., John Wíley & Sons, New York (1985) . As variantes de ocorrência não natural podem ser produzidas utilizando técnicas de mutagénese conhecidas na técnica.

Essas variantes incluem as produzidas por substituições, eliminações ou adições de nucleótidos, que podem envolver um ou mais nucleótidos. As variantes podem ser alteradas nas regiões de codificação ou de não codificação ou em ambas. As alterações nas regiões de codificação podem produzir substituições, eliminações ou êãiçòêã de amínoácidos conser-vadoras ou não conservadoras,

Outros enquadramentos da presente invenção incluem isoladas de ácidos nucleicos, que são pelo menos 90 % idênticas e mais preferencialmente pelo menos 95 %, 96 %, 97 %, 98 % ou 99 % idênticas a !a) uma sequência de nucleótidos, que codifica o polipéptido completo de DM4, que comporta a sequência de aminoácidos na fig. 1 (SEQ ID NO: 2), incluindo a a sequência ( : prevista; (fe; uma sequência de nucleótidos, que codifica todo o comprimento áú. polipéptido de DM4, que comporta a sequência de aminoácidos completa na figura 1 (SEQ ID NO: 2), incluindo a a sequência lider prevista mas a que falta a metionina do terminal ámlnc;; (c) uma sequência de nucleótidos, que codifica o polipéptido maduro de DM4 (polipéptido de comprimento completo com a sequência lider eliminada) que comporta a sequência de aminoácidos nas posições próximas de 24 âtá as próximas de 468 na figura 1 (SEQ ID NO: 2); (d) uma sequência de nucleótidos, que codifica o polipkptido de comprimento completo de DM4, que comporta a sequência completa de aminoácidos incluindo a sequência líder codificada pelo clone de ADNc depositado na ATCC com o número de depósito 97853; (e) uma sequência de nucleótidos, que codifica o polipéptido de comprimento completo de DM4, que comporta a sequência de aminoácidos incluindo a sequência líder mas a que falta a metionina do terminal amino codificada pelo clone de ADNc depositado na ATCC com o número de depósito 97853; (f) uma sequência de nucleótidos, que codifica c polipéptido maduro de DM4, que comporta as sequências de aminoácidos codificadas pelo clone de ADNc depositado na ATCC com o número de depósito 97853; (g) urra sequência de nucleótidos, que codifica c domínio da transmembrana de DM4; (h) uma sequência de nucleótidos que codifica o domínio da transmembrana de DM4, (í) uma sequência de AkCÍoòHíòçç que codifica o domínio intracelular de DM4; (1) uma sequência de nucleótidos que codifica o domínio de morte DMl? ou (k) uma sequência de nucleótidos complementar de qualquer uma das sequências de nucleótidos nas alíneas (a), (b) , (c), (d), (e), (f), (g} , (h) , (i) ou (j) anteriores.

For um poiinucieótido comportando uma sequência ae nucleótido pelo menos, por exemplo, 95 % "idêntica" a uma sequência de nucleótidos de referência que codifica um polipéptido de DM4, entende-se que a sequência de nucleótidos do poiinucieótido i idêntica à sequência de referência, excepto no facto da sequência de polinucleótidos poder incluir âté cinco pontos de mutações por cada cem nucleótidos da sequência de nucleótidos de referência, que codifica o polipéptido de DM4. For outras palavras, para se obter um poiinucieótido comportando uma sequência de nucleótidos pelo menos 95 % idêntica a urra sequência de nucleótidos de referência, até 5 % dos nucleótidos na sequência de referência podem sei eliminados ou substituídos por outros nucleótidos ou um certo número de nucleótidos ate 5 % dos nucleótidos totais na sequência de referência, podem ser inseridos na sequência de referência. Estas mutações da sequência de referência podem ocorrer nas posições terminais 5 ou 3 da sequência de nucleótidos de referência ou em qualuqer parte entre estas duas posições terminais, dispersas quer individualmente entre os nucleótidos na sequência de referência ou em um ou mais grupos contíguos dentro da sequência de referência.

Como uma matéria prática, se qualquer molécula particular de ácido nucleico á pelo menos 90 1* 5 %, 96 t., 97 %, 18 I ou 99 idêntica por exemplo, o de sequencií étiúm mostrada na figura 1 ou à sequência de nucieótiaos do de ADNc pode ser determinada de urra forma convencional utilizando programas de conhecidos, fui como o programa

Bestfit (Wisconsin Sequerice Analysis Package, Versão 8 para Unix, Genetics Computer Group, University Research Park, 575 Science Drive, Madison, WI 53711}. 0 Bestfit utiliza o algoritmo de homologia local de Smith and Waterman, Advances in Applied Mathematics 2: 482-489 (1981), para encontrar o melhor segmento de homologia entre duas sequências. Quando se utiliza o Bestfit ou qualquer outro programa de de sequências para determinar se uma sequência particular é, por exemplo, 95 % idêntica a ama sequência de referência, de acordo com a presente invenção, os parâmetros são estabelecidos, obviamente, de tal modo que a percentagem de identidade è calculada em relação ao comprimento completo da sequência de nucleótidos de referência e essas falhas na homologia até 5 I Tíú número total de nucleótidos na sequência de referência são permitidas. 0 presente pedido de patente de invenção tem por objecto moléculas de ácido nucleico pelo menos 90 , 95 %, 9 6 %, 9 7 %, 98 % ou 99 % idênticas à sequência de áridos nucleicos mostrada na figura i (SEQ ID NO: 1) ou a sequência de ácidos nucleicos dos ADNcs depositados, independentemente do facto de eles codificarem um polipéptido que tem actividade de DM4. Isto deve-se ao facto de quando uma molécula particular de ácido nucleico não codifica um polipéptido que tem actividade de DM4, um especialista na matéria saberá ainda como utilizar a molécula de ácido nucleico, por exemplo, como uma sonda de hibridaçâo ou como um iniciador de uma reacção em cadeia de polímerase (RCP) . As utilizações das mrtÍioõIõo de nucleicos da presente iaverçdo, que não codificam um polipéptido que tem um actividade de DM4, incluem, inter alia: fi j o isolamento do gene de DM4 ou das suas variantes siélicas numa biblioteca de ADNc; (2) o · ir: dor-V: in situ (por exemplo, 'ditdH*'; extensões cromossómicas de metafase para providenciar una localização cromossómíca precisa do gene de DM4, conforme descrito em Ver ma et al., Human Chromosomes: A Mã.nuãá of CmCínimi&C, lêiqMC)C Press, New York (1988); e (3} análise de transferência psra uma matriz imobilizada de Northern (ADN/ARNm) para detectar a expressão de MM de DM4 em tecidos específicos,

Preferidas, contudo, são as moléculas de ácidos nucleicos que têm sequências pelo menos 1D %, 95 %, 96 %, 97 %r 99 | 0¾ cg % idênticas a sequência de ácidos nucleicos mostrada na figura 1 (SEQ ID aod h) ou a sequência de ácidos nucleicos dos ADNcs depositados que, de facto, codificam um polipéptido que tem actividade da proteína DM4. Por "um polipéptido que tem a actividade de DM4" entende-se polipéptidos que exibem uma actividade semelhante mas não necessariamente idêntica a uma actividade da proteína de DM4 da presente invenção (quer a proteína de comprimento completo ou, preferencialmente, a proteína madura) conforme se mede num ensaio biológico particular. Por exemplo, a actividade da proteína DM4 pode ser medida utilizando os ensaios de morte de células realizado essencialmente conforme descrito previamente (A. M. Chinnaíyan, et al., Cell 81: 505-12 (1995); M. P. Boldin, et al., J Biol Chem 270: 7795-8 (1995) ; F. C. Kischkel, et al., EMBO 14: 5579-5588 ( 1995) ; A. M.

Chinnaíyan, et ui,., J Biol Chem 271: 4961-4965 (1996)) ou conforme estabelecido no exemplo 5 a seguir. Nas células MCF7, os plasmidos que codificam DM4 de comprimento completo ou um candidato a domínio de norte contendo receptores, são co-transfectadcs com a estrutura relatora de pLantern codificando uma proteína fluorescente Os liúaímm das células transfectadas com DM4 vão uma morfologia apoptótica conforme pode ser analisado por meio da coloração por DAPI. Semelhante I apóptose induzida por é de FNT-1 e Fas/APO-1 (M. Muzío, et al., &y.I 85: 817-827 (1996); m. P. Boldín, e al., Cell 85: 803-815 (1996); M. Tewari, et al., J Biol Chem 270: 3255-60 >> a apóptose induzida por DM4 é bloqueada pelos inibidores das proteases semelhantes a ICE, e z-VAD-fmk.

Obviamente, devido a degenerescência do código genético, um especialista na matéria reconhecera imediatamente que um grande número de moléculas de ácido nucleico tem uma sequência pelo menos 90 %-f 95 %, 96 %, 97 %, 98 % ou 99 % idêntica a sequência de ácidos nucleicos do ADNc depositado ou à sequência de ácidos nucleicos mostradas na figura 1 (SEQ ID «Ou 1) que vão codificar um polipéptido "com actividade da proteína de DM4". De facto, dado que as variantes degeneradas destas sequências de nucleótidos codificam todas o mesmo polipéptido, estará bem claro para um técnico da matéria, mesmo sem a realização do ensaio de comparação descrito antes. E ainda reconhecido na técnica que, para essas moléculas de ácidos nucleicos que não são variantes degeneradas, um número razoável entre elas vai também codificar um polipéptido que tem actividade da proteína DM4. Isto verifica-se porque um técnico da matéria está completamente dentro das substituições de aminoácidos que são menos prováveis ou que é provável que afectem significativamente a função da proteína (por exemplo, substituindo um aminoácido alifátíco por um segundo aminoácido alifático).

Por exemplo, as indicações respeitantes à forma de produzir renotípicamente substituições de aminoácidos silenciosas soo o ponto de vista do fenotipo, são dadas em poiuos, J. U. to al., "Decíphering the Message in Proteín οοΐρρρρρρ; Tolerance to om.itõ Acíd Substitutíons", Science 247: 1306-1310 illord}., em que os autores indicam que as proteínas são surpreendentemente tolerantes às substituições dos aminoáeidos.

Ensaios de Polinucleótidos A presente invenção também tem por objecto a utilização dos polinucleótidos de DM1 para detectar polinucleótidos complementares, tais como, por exemplo, como um reagente de diagnóstico. A detecção de uma forma mutada de DM4 associada com uma disfunção fornecerá uma ferramenta de diagnóstico que pode adicionar ou definir um diagnóstico de uma doença ou de uma susceptibilidade para uma doença, que resulta da sub-expressão ou da sobre-expressão da expressão alterada de DM4 ou de uma sua forma solúvel, tal como, por exemplo, tumores ou doenças auto-imunes.

Os indivíduos que comportam mutações no gene de DM4 podem ser detectados ao nível do ADN por uma variedade de técnicas, Os ácidos nucleiccs para diagnóstico podem ser obtidos de células de pacientes, tais como, células de sangue, urina, saliva, biópsia de tecido e material de autópsia. 0 ADN genómico pode ser utilizado directamente para a detecção ou pode ser amplificado enzimaticamente utilizando RCP antes da análise. (Saíki et ai., Màtuz® 324: 163-166 (1986)). Pode-se também utilizar ARN ou ADMc da mesma forma. Como exemplo, os iniciadores de RCP complementares do ácido nucleico que codificam DM4 podem ser utilizados para identificar e analisar as expressões <rs as mutações de DM4. Por exemplo, as eliminações e as inserções podem ser detectadas por meio de uma alteração da dimensão do produto amplificado em comparação com o genótipo normal, Podem-se identificar as ÇiÇfasçóés pontuais por hibridação do ADN amplificado com ο AKN 'ά·$ DM4 marcado com rádio ou, alternativamente, sequências de ACN de sentido oposto de DM4 marcadas com rádio. As sequências perfeitamente emparelhadas podem distinguir-se das sequências duplas desemparelhadas por digestão de RNase A ou pelas diferenças nas temperaturas de fusão.

As diferenças da» sequências entre »a de

referência e os genes com mutações podem também ser reveladas por sequenciaçâo dírecta do ADN. Além disso, podem utilizar-se segmentos de ABN clonados como sondas para detectar segmentos específicos de ADN. A sensibilidade desses processos pode ser muitíssimo melhorada pela utilizaçlo apropriada de RCP ou de outros processos de amplificação. Por exemplo, utiliza-se um iniciador de sequenciaçâo com um produto de RCP de estrutura helicoidal dupla ou uma molécula matriz com uma estrutura helicoidal simples, gerada por uma RCP modificada. 4 determi-nação da sequência realiza-se por processos convencionais com nucleótidos marcados com rádio ou por processos automáticos de sequenciaçâo com marcadores fluorescentes.

Myers et 0 ensaio genético com base nas diferenças das sequências de ADN pode ser feito por detecção da aiteração na mobilidade electroforética de fragmentos de ADN em géis, com ou sem agentes do âeqnap-íj-açân,. Podem visualizar-se eliminações e as inserções em sequências pequenas por electroforese em gel de elevada r&àdiuçfe, Os fragmentos de ADN das diferentes sequências podem distinguir-se nos géis de gradientes de formamida de desnaturação, em que as mobilidades dos diferentes fragmentos de ADN estão retardadas no gel em diferentes posições de acordo com as sus» temperaturas de fujii» especificas ou com as temperaturas de fusão parciais (ver, por exemplo, Myers et ».L,· Science 230: 1242 (1985)) .

As alterações da sequência em localizações especificas podem também ser reveladas por ensaios de protecção da nuciease, tais como protecção de RNase e de SI ou o processo de clivagem química (por exemplo, Cotton et al.r Proc. SstJL Acad. E... USA 85: 4397-4401 (1985) ) .

Assim, a detecção de uma sequência de ADN especifica, pode ser conseguida por processos tais como hibridação, protecção de RNase, clivagem química, sequenciação directa do ADN ou a utilização de enzimas de restrição (por exemplo, polimorfismos compridos de fragmentos de restrição ("PCFR") e transferência para uma matriz imobilizada (ADN/ADN) de Southern do ADN genómico.

Para além da electroforese em gel mais convencional e da sequênciação de ADN, também se podem detectar as mutações por análise id situ.

Ensaios dos cromossomas

As sequências da presente invenção são também validas para a identificação de cromossomas. A sequência é especif icamente visada e pode hibridar com uisa localização particular num cromossoma individual humano. O mapeamento dos ADNs no que respeita aos cromossomas, ae acordo com a presente EovpHçian é um primeiro passo iinpattsotv na correi a çá::· dessas sequências com cs genes associados com a doença.

Em certos enquadramentos preferidos, sob este ponto de vista, o ADNc aqui descrito é utilizado para clonar EDN genómico de um gene do ΪΜ4. Isto pode ser conseguido utilizando uma variedade d-a técnicas e bibliotecas bem conhecidas, que normalmente estão disponíveis comercialmente. O ADN genómico é utilizado para o utilizando técnicas lipsiMuív de cromossomas in situ, bem conhecidas para este fim.

Além disso, as sequências podem ser mapeadas no que respeita aos cromossomas preparando Iniciadores de RCP (preferencialmente de 15-25 pb) a partie do Mlôem A análise por coaputador da região 3' não traduzida do gene é utilizada para seleccionar rapidamente iniciadores que não medem mais do que un exão no ADN genómico, complicando assim o processo de amplificação. Estes iniciadores são então utilizados para a avaliação por RCP de híbridos de células somáticas contendo cromossomas individuais humanos. A hibridação por fluorescência in situ ("FISH") de un clone de ADNc com uma dispersão cromossómica em metáfase pode ser utilizada para providenciar uma localização precisa numa etapa. Esta técnica pode ser utilizada com ADNc tão curto quanto 50 ou 60. Para uma revisão desta t:écrd.ça., ver Verma e tal., Human

Chromosomes: a Manual of Basic Techniques, Pergamon Press, New York (1988).

Logo que uma sequência tenha sido rnapeada até a uma localização cromossómica precisa, ai,.' física da sequência no cromossoma pode ser correlacionada com os dados do mapa genético. Esses dados encontram-se, por exemplo, em V. RcKusick. Mendelian Inheritance in Man, disponível em linha através da Johns . .'i-iã University, Welch Medicai Library. A · 'ti entre os genes e as doenças tem vindo a ser mapeada com 3 mesma região êssiCjsMlêa são cutlc identificadas cfrçyèç da análise de ligação (co-herança de genes fisicamente adjacentes),

Em seguida, é necessário determinar as diferenças no ADNc ou na sequência genómica entre indivíduos afectados e não afectados. Se se observa uma mutação nalgum ou em todos os indivíduos afectados, mas não se observa em nenhum dos indivíduos normais, então a é o agente causador da doença.

Vectores e fiMltíXá** Hospedeiras A presente Idvefsçfe também tem por objecto vectcres que incluem moléculas de ADN da presente invenção, células hospe-deiras que são tratadas por engenharia genética com os vectores da presente Invenção e a produção de polipéptidos da presente invenção por meio de técnicas recombinantes.

As células hospedeiras podem ser alteradas por engenharia genética para incorporar moléculas de ácidos nucleicos e expressar os polipéptidos da presente invenção. Os polinucleótidos podem ser introduzidos isoladamente ou com outros polinucleótidos. Esses outros polinucleótidos podem ser introduzidos independentemente, co-introduzidos ou intro-duzidos em conjunto com os polinucleótidos da presente invenção.

De acordo com este aspecto da presente invenção, o vector pode ser, por exemplo, um vector de piasmido, um vector de fago de estrutura hullhcidal simples ou dupla, um ARN de estrutura helicoidal simples ou dupla ou um vector virai de ADN. Esses vectores podem ser introduzidos nas células como polinucleótidos, preferencialmente ADN, por meio de técnicas bem vohífhõidhsí para a introdução de ADN e de ARN nas célul .as. 3s vectores Mmúio podem «ev eficazes na repiicação ou defeituosos na rvpllOfáelo, Neste último caso, a propagação virai geralmente ocorre apenas nas células hospeaeiras complementares.

Entre os vários vectores, preferem-se, em certos aspectos, aqueles que servem para a expressão de polinucieótiaos e polipéptidos da presente invenção. Geralmente, esses vectores compreendem regiões de controlo activas em cis, efectivas para a expressão num hospedeiro ligado operacionaimente ao politucltltid:;: a ser expresso. Os factores de actuação "trans" apropria os, são fornecidos quer pelo hospedeiro ou sâo fornecidos por um vector complementar ou fornecidos pelo próprio vector após introdução no hospedeiro.

Pode utilizar-se uma grande variedade de vectores de expressão para expressar um polipéptido da presente invenção. Esses vectores incluem vectores cromossómicos, epissómicos e derivados de vírus, por exemplo, vectores derivados de plasmidos bacterianos, de bacteriófagos, de epissomas de fungos, de elementos cromossómicos de fungos, de vírus, tais como, baculovírus, vírus papova, tais como SV40, vírus de vaccínia, adenovírus, poxvírus de aves, vírus pseudorrábico e retrovírus e vectores derivados da combinação dos anteriores, tais como aqueles d que derivam de plasmidos e elementos genéticos tais como, cosmidos e fagemidos, podendo todos eles ser utilizados para a expressão de acordo com este aspecto da presente invenção. Geralmente, qualquer tsstar aptOprladv para manter, propagar ou expressar polinucleótidos para expassai: um polipéptido nua hospedeiro, pode ser utilizado para a expressão aqui contemplada. A sequência de ADN no vector de expressão está ligada operacionaimente à sequência ou às sequências de incluindo controlo de expressão apropriadas, incluindo, por exemplo, um promctor para dirigir a transcrição de ARNm. Representantes desses promotores incluem o promotor de fago lambda PL, os promotores lac, trp e tac de E. coli, os promotores SViP precoces e tardios e os promotores de LTRs retrovirais, para enumerar agwms alguns dos bem conhecidos. Em geral, as estruturas de expressão deverão conter sítios para a transcrição, a iniciação e a terminação o·, na região trans-crita, um sitio de ligação do ribossoma para a tradução. A porção de codificação dos transcriptos maduros expressa pelas estruturas incluirá uma iniciação da tradução AUG no inicio e um eodão de terminação (UAA, UGA ou UAG) apropriadamente posicionado na extremidade do polipéptido a ser traduzido.

Além disso, as estruturas podem conter regiões de controlo, que regulam, assim como controlam a expressão. Geralmente, essas regiões vâ-ô operar por transcrição do controlo, tal corno sítios de ligação do repressor e pctenciadores, entre outros.

Os vectores para a propagação e a expressão geralmente incluirão marcadores seleccionaveis. Esses marcadores também podem ser apropriados para a amplificação ou os vectores podem conter marcadores adicionais para este fim. A este respeito, os vectores de expressão orprêsp preferencialmente, um cu; mais genes de marcadores seleccionáveis para providenciar um traço fenotípíco para a selecçâo ae células hospedeiras transformadas. Da rcocvirru;'?;;: praíaDiiSDa incluem, a di-DnArmloDíaDoa aaDDrLaaa ou a resistência à mmmicinx para culturas de díI-ccIod; eucarióticas e genes ae resistência a tetraciclina ou è ampícílína para a aditara ae E, mii e outras bactérias. 0 vector que contém a sequência de ADN apropriada, tal como se descrever; noutro sitio aqui, assim como um promotor apropriado e outras sequências de controlo apropriadas, podem ser introduzidos nus; hospedeiro apropriado utilizando uma variedade de técnicas bem conhecidas apropriadas para a expressão de um polipéptido desejado. Exemplos representati-vos de hospedeiros apropriados .: células bacterianas, V- g. x -g orno células de E. coli, Streptomyces e Salmone 113 typhimuríum; células de fungos, tal como, células de levedura; células de insectos, tais corno cé lulas S2 de Drosophila e células Sf9 de Spodoptera; células de animais, tais como, células de OHC, COS e células do melanoma de Bowes; e células de plantas. Os hospedeiros para uma grande variedade de estruturas de expressão são bem conhecidos e os especialistas na matéria estarão habilitados com a presente memória descritiva, para seleccionaram facilmente um hospedeiro para expressar um polipéptido de acordo com este aspecto da presente invenção.

Entre os vectores preferidos para serem utilizados em bactérias estão pQE70, pQE60 e pQE-9, disponíveis na Qiagen; vectores de pBS, vectores de Phagescript, vectores de BIttmcblpt f ρΝΗΙβε, pnHilm:, plsilêlp disponíveis na Stratagene; e ptrc99a, pKK223-3, pKK233-3, pDR4540, pRITS, disponíveis na PPlOBiMâl Entre os vectores eucaricticos preferidos estão pWLNEO, pbVbCMp pOG44, pXTl e pSG, disponíveis ria Stratagene; e pSVK3, pBPV, pMSG e pSvLv disponíveis na Pharmacia. Estes Vántisret são listados apenas a titulo ilustrativo de muitos dos áinpçnilytóíí comercialmente e que são vectores bem conhecidos dos especialistas na matéria. A selecção aos vectores e promotores apropriados para a expressão numa célula hospedeira é um processo bem conhecido e os requisitos técnicos p-art a construção do vecror de expressão, a i tt roduçl·:: do vector co hospedeiro e a expressão no hospedeiro, são rótitiãs; dos técnicos da matéria. A presente invenção também to··; por objecto células hospedeiras contendo as estruturas descritas ances e discutidas antes. A célula hospedeira pode ser uma célula eucaríótica superior, tal como, uma célula de mamífero ou uma célula eucaríótica inferior, tal corno, urra célula de levedura ou a célula hospedeira pode ser uma célula procariótica, tal como, uma eêluiát bacteriana. A introdução da estrutura na célula hospedeira pode ser efectuada por transfecção com fosfato de cálcio, transfecção mediada por DEAE-dextrano, transfecção mediada por lípidos catiónícos, electroporação, transdução, infecção ou outros processos. Esses processos estão descritos em muitos manuais de normalização laboratorial, tal ccmo, Davis et al., Basic Methcds in Molecular Biology (1986). C polipéptido pode ser expresso de uma forma modificada, tal como, uma proteína de fusão e pode incluir não apenas os sinais de secreção mas também regiões funcionais heterólogas adicionais. Assim, por exemplo, pode-se adicionar uma região de aminoácidos adicionais, particuiarmente, aminoácidos carregados, à terminação N do polipéptido para melhorar a estabilidade e a persistência na èèlulã hospedeira, doçootu a purificação ou durante o e armazenagem subse-auentes. c pode também adicionar-se uma região ao polipéptido para facilitar a pui:\.iicãção,

Essas regiões pedem ser eliminadas antes da preparação final do polipéptido. 4 adição de partes de péptido aos polipéptidos para provocar a secreção ou a excreção, para melhorar a estabilidade e para facilitar a purificação, entre outras, são técnicas familiares e de rotina na técnica. Uma proteína de fusão preferida compreende uma região heteróloga da imunoglobulina que é útil para solubilizar proteínas. Por exemplo, a patente de invenção europeia EP-A-0 464 533 (contraparte canadiana 2045869) descreve proteínas de fusão que compreendem varias porções da região constante das moléculas de imunoglobulina em conjunto com outras proteínas humanas ou partes delas. Em muitos casos, a parte Fc numa proteína de fusão, é fortemente vantajosa para ser utilizada na terapia e no diagnóstico e isto resulta, por exemplo, em melhores propriedades farmacocinéticas (patente de invenção europeia EP-A 0232 262). Por outro lado, para algumas utilizações, será desejável ser capaz de eliminar a parte Fc da proteína de fusão à medida que tenha sido expressa, detectada e purificada, de uma forma vantajosa já descrita. Este é o caso quando a porção de Fc prova ser um problema para a utilização em terapia e diagnóstico, por exemplo, quando a proteína de fusão vai ser usada como um antigénio para imunizações. Na descoberta do fármaco, por exemplo, as proteínas humanas, tal como, o receptor de IL-5 humana têm sido fundidas com porções de Fc para fins de ensaios de avaliação de alto rendimento para identificar antagonistas de IL-5 humana. Ver, D. Bennett et ai., Jcumoiti cf fel comité Recognítion, 8: 52-58 (1995) e K. Johanson et ah, The êoc.o;cl of Bíological Chemistry, 270: 9459-9471 (1995).

Os poliptpòiáot de DM4 podem ser recuperados e ρ ui fio oiço a partir de cultcxto de cáiudOít recombinantes, por processos bem conhecidos que incluem a precipitação no seio de sulfato de amónio ou de etanol, extracção por ácidos, a cromatografia de permuta aniónica ou catiónica, a cromatografia em fosfoceiuiose, a cromatografia de interacçâo hidrofóbica, a cromatografia de afinidade, a cromatografia em hidroxilapatite e a cromatografia em leptina. Mais preferencialmente se para a purificação a cromatografia liquida de elevada resolução ("CLER"). Podem utilizar-se tádhisis bem conhecidas para a redobragem das proteínas para regenerar a conformação actíva quando o polipéptido é desnaturado durante o isolamento e/ou a purificação.

Os polipéptidos da presente invenção incluem produtos purificados de forma natural, produtos resultantes de processos de síntese química e produtos produzidos por técnicas rezombinantes a partir de um hospedeiro procaríótico ou eucariótico, incluindo, por exemplo, células de bactérias, de fungos, de plantas superiores, de insectos e de mamíferos. Consoante o hospedeiro utilizado num processo de produção reccmbinante, os polipéptidos da presente invenção podem ser glicosilados ou podem ser não glicosilados. Além disso, os polipéptidos da presente invenção podem também incluir um resíduo inicial de metionina modificada, nalguns casos, como resultado de processos mediados pelo hospedeiro.

Cs poiinucleótidos e os polipéptidos de DM4 podem sei utilizados de acordo com a presente invenção, para uma variedade de aplicações, particularmente aquelas que fazem uso das propriedades químicas e biológicas de DM4. Entre estas, estão as imlicíKjóes em tratamento de tumores, resistência a parasitas, bactérias e vírus, para Icdzcrlr a p-tPlm oclictcc 1 oMulac endoteliaís e certas células hematopoiéticas, para tratar restenose, enxertos versus doenças do hospedeiro, para reguiar respostas antivirais e para prevenir certas doenças auto-imunes após a estimulação de £M4 por um agonista. As aplicações adicionais estão relacionadas com o diagnóstico e com o tratamento de distúrbios de células, tecidos e organismos. Estes aspectos da presente invenção serão discutidos melhor a seguir. A presente invenção tem ainda por objecto um polipéptido de DM4 isolado, comportando a sequência de aminoácidos mostrada na fig. 1 [SEQ ID NO: 2] ou um polipéptido ou um péptido que compreende uma porção das polipéptidos anteriores.

Para melhorar ou alerar as caracteristicas dos polipéptidos de DM4 pode-se utilizar engenharia de proteínas. A tecnologia do ADN recombinante, conhecida pelos especialistas na matéria, pode ser utilizada para criar novas proteínas mutantes ou "muteínas que incluem substituições, eliminações, adições simples ou múltiplas de aminoácidos ou proteínas de fusão, Esses polipéptidos modificados podem mostrar, por exemplo, uma actívidade aumentada ou uma estabilidade aumentada. Além disso, podem ser purificados com rendímantos mais elevados e mostram, uma melhor estabilidade do que os polipéptidos naturais correspondentes, pelo menos sob cerras condições da pttt.li e de armazenagem.

Por exemplo, para muitas proteínas, incluindo o domínio extracelular de uma proteína associada a uma membrana ou as formas maduras de ama proteína segregada, sabe-se na técnica que se pode eliminar um ou mais aminoácidos da terminação N ou da terminação C sem uma perda substancial da função Por exemplo, Ron e tal., J. Biol. Chem., 268: 2984-2988 (1993) relatou proteínas KGF modificadas que têm actividade de ligação a heparína mesmo se estiverem a faltar 3, 8 ou 27 resíduos de aminoácidos de terminação amino. No caso presente, dada que a proteína da presente invenção é um elemento da famlia dos polipéptidos dos receptores contendo o domínio de morte (RCDM) , dos aminoácidos de terminal N até ao resíduo de cisteína na posição 132 na SEQ IC NO: 2, ela pode reter alguma actividade biológica tal como a capacidade para induzir a apoptose. Os polipéptidos que, além disso, ainda contêm eliminações do teminal N incluindo o resíduo de cisteína na posição 132 (C-132) na SEQ ID NO: 2, não é provável que retenham essas actividades biológicas porque este resíduo que está conservado entre os elementos da família, ver figura 2, pode ser necessário para a formação de uma ponte de di-sulfureto para providenciar a estabilidade estrutural que é necessária para a ligação do receptor.

Contudo, mesmo se a eliminação de um ou mais aminoácidos da terminação N de uma proteína resultar na modificação da perda de uma ou mais funções biológicas da proteína, podem ainda ser relidas outras actividades biológicas, Ãssim, a capacidade da proteína encurtada para induzir ç/ov ligar-se a anticorpos que reconhecem o domínio completo ou extracelular da proteína geralmente serão retidos quando menos do que a maioria dos resíduos da proteína do . „ completo ou extracelular são eliminados da terminação N. Se um psslipéptirk':: particular a que faltam resíduos da terminação N d.t uma proteína completa retém essas actividades , pode ser facilmente determinado por processos do rotina aqui descritos e de alguma forma conhecidos na fêc;ricá.

De acordo com isto, a presente invenção ainda tem por objecto polipéptidos em que foram eliminados um cu mais resíduos das terminações amino da sequência de aminoácidos do DM4 mostrado na SEQ ID NC: 2, até ao resíduo C-132 e polinucleótidos que codificam esses polipéptidos. Em particular, a presente invenção tem por objecto polipéptidos que compreendem a sequência de aminoácidos dos resíduos n-468 da SEQ ID NO: 2 em que o símbolo n representa sm numero inteiro no intervalo de 1-132, em que C-132 é o primeira resíduo da terminação N do domínio extracelular do polipéptido de DM4 (mostrado na SEQ ID NO: 2) que se crê quê seja necessário para a actividade de ligação do ligando do receptor {por exemplo, a ligação de LIART) da proteína de DM4. A presente invenção ainda tem por objecto os polínu-cleótidos que codificam estes polipéptidos.

Do mesmo modo, conhecem-se muitos exemplos de muteinas com eliminações no terminal C funcionais sob o ponto de vista biológico. Por exemplo, o interferão gama exibe actividades ate dez vezes mais elevadas eliminando 8-10 resíduos de aminoácidos da terminação carboxi da proteína (Dôbeli et al., J. Biotechnology 7: 199-216 (1988) . No presente caço, dado que a proteína da presente lurbaíngl© é um elemento da família dos polipéptidos dos RCDM, as eliminações de aminoácidos do terminal C até à cisteína na posição 221 (C-221) da SEQ ID NO: 2, podem reter alguma actividade biológica tal como a ligação éú receptor. Não se espera que os polipéptidos que têm ainda eliminações de aminoácidos do terminal V, incluindo C-221 da SEQ ID MO: 2, retenham essas actividades biológicas porque este resíduo ©ttd conservado entre os elementos da família dos RCCM e é necessário para a formação de uma ponte de di-sulfureto para providenciar a estabilidade estrutural que é necessária para a ligação receptor-ligando.

Ccntudo, mesmo se a eliminação de um ou mais aminoácidos da términâpâb C de uma proteína resultar na modificação da perda de uma ou mais funções biológicas da proteína, podem ainda ser retidas outras actividades biológicas. Assim, a capacidade da proteína encurtada para induzir e/ou para se ligar a anticorpos que reconhecem o domínio completo ou extracelular geralmente estará retida quando menos do que a maioria dos resíduo do domínio extracelular ou completo são eliminados da terminação C. Se um polipéptido particular a que faltam resíduos do terminal C de uma proteína completa retem essas actividades imunológicas pode ser facilmente determinado por processos de rotina aqui descritos e outros conhecidos na técnica.

De acordo com isto, a presente invenção tem ainda por objecto polipéptidos que têm um ou mais resíduos da terminação carboxi da sequência de aminoácidos da DM4 mostrada na SEQ ID NO: 2, até C-221 da SEQ ID NO: 2 e polinucleótídos que codificam esses polipéptidos. Em particular, a presente invenção tem ainda por objecto polipéptidos que têm a sequência de aminoácidos dos resíducs i-m de sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 2, em que o símbolo m representa qualquer número inteiro no intervalo de 221-46 8 e o resíduo C-221 é a písdrçib:) do priõmooro resíduo na terminação C do polipéptido completo de Ddd ímcstrado n-c SEQ ID NO: 2·'! crê-se ser necessário para a activídade dm Xi.;prrOu ao receptor ds proteína de DM4. Também rem por oisports polinucleótídos que codificam estes A presente invenção também tem por objecto polípéptídos a que foram eliminados um ou mais amínoácidos de ambos os terminais amino e carboxi, que podem ser descreitos, de uma forma geral, como tendos os resíduos n-m da dEQ ID NO: 2, em que os símbolos nem são números inteiros como se descreveu antes.

Também está incluída uma sequência de nucleótiso que codifica um polípéptido que consiste numa porção de uma sequência de amínoácidos completa de DM4 codificada pelo clone de ADNc contido no depósito n° 97951 da ATCC, cm que esta porção exclui de 1 a cerca de 108 amínoácidos da terminação amino da sequência completa de amínoácidos codificada pelo clone de ADNc da ATCC com o n° de depósito 97853 ou de 1 a cerca de 247 amínoácidos da terminação carboxi ou qualquer combinação das eliminações dos terminais amino e carboxi anteriores da sequência de amínoácidos completa codificada ssle clone de ACNc contido na ALCC com o n° de depósito 97853. Também tem por objecto os polinucleótido s que codificam todas as formas de polipéptidos dos mut antes anteriores com eliminações.

Entre os mutantes de eliminação preferidos dos terminais N e C estão aqueles que compreendem apenas uma ; do domínio e-Xtr&èf 2-JiâX r isto é, dentro dos x -sj j s 24-238, dado que é expectável que qualquer orno das suas pçrçõ·:· o seja solúvel. É sabido da técnica que algumas sequências de de ÍMé pqqtqm voícioi:' sem um efeito essas diferenças na oçqúúdúon;:- estão contempladas, doo-ser recordado que hoderi áreas criticas nas proteínas que determinam a actividade. Essas áreas compreenderão, normalmente, resíduos qu-s fazem o sítio de ligação do ligando ou o domínio de morte cu que formam estruturas terciárias que afectam estes domínios.

Assim, u presente invenção inclui ainda variações da proteína de DM4 que mostram uma actividade substancial da proteína de DM4 ou que incluem regiões de DM4, tal como os fragmentos de proteínas discutidas a seguir. Alguns mutantes incluem eliminações, inserções, d-u-uv iHD·';·:·;, repetições e substituições de vários tipos. Tal como se indicou antes, as normas respeitantes às alterações dos aminoácidos, são provavelmente silenciosas sob o ponto de vista fenotípico e podem ser encontradas em Bowie, J. U. et al. , Science 247: 1306-1310 (1990). Dó particular Interesse, são as substituições dos aminoácidos carregados por outros aminoácidos carregados e com aminoácidos carregados negativamente ou neutros. Estes últimos resultam em proteínas com cargas positivas reduzidas, para melhorar as características da proteína de DML. A prevenção da agregação á altamente desejável. A agregação das proteínas não resulta apenas numa perda de actividade mas pode também ser problemática quando se preparam formulações farmacêuticas, porque podem ser imunogénicas. (Pinckard et al., Clin. Immunol. 2: 331-340 (1967); Robbins et al., Diabetes 36: 838-845 (1987) ; Cleland et al., Crit. Rev. Therapeutic Drug Carríer Systems 10: 307-377 (1993)). A substituição dos aminoácidos pode também alterar a selectivídade da ligação aos receptores da superfície das Cé·.; ui-í S .. ítttabõ e Γ .. ... õíòíòUOf ò-úib 11 d-...·; ·>;: U ; j. U';·· ;C| O·.. v<; curtús Ovíul':o qu-v Uu íipsçtb selectiva de FNT-alfa apenas a um dos dois tipos de receptores de FNT conhecidos. Assim, o receptor de DM4 da presente pode incluir substituições, eliminações ou adições de amínoácídos, quer de mutações naturais ou de manipulação humana, Tal como se indico::, as alterações são preferencialmente de natureza menor, fui como, as substituições conservadoras de aminoácidos, que não afectam significativamente a dobragem ou a actividade da proteína (ver quadro 1). una ου mais QUADRO 1. Substituições Conservadoras de Aminoácidos

Aromático

Fenilalanina Triptofano Tirosina i Leucina | Isoleucína jj: Polar | Glutamina s l Asparagina| [ s Básico i Arginina

Os arainoácidos da proueína de DM4 da presente invenção que são essenciais para a função, podem ser identificados por processos conhecidos nesta técnica, tal corno, a mutagénese dirigida ao sitio ou a mutagénese de avaliação da alanina (Cunningham e Wells, fdimvçí* 244: (1989)). Este último processo introduz mutações apenas de alanina em cada resíduo da molécula, a.:·; moléculas mutantes resultantes são então ensaiadas para pesquisar a sua actividade biológica, tal como, a ligação do receptor ou a actividade prclíferativa in vitro ou in vivo. Os sítios que Mo críticos para a ligação de ligando-receptor, podem também ser determinados por analise estrutural, tal como cristalização, ressonância magnética nuclear ou marcação por foto-afinidade (Smith et al., S. ' Biol. 224: 899-904 (1992) e de Vos et al. Science 255: 306-312 (1992)).

Os polipéptidos da presente invenção são preferencialmente produzidos sob uma forma isolada e preferencialmente são praticamente puros. Uma versão do polipéptido DM4 produzido de forma recombinante pode ser praticamente purificada por um processo numa única etapa, descrito em Smith e Johnson, Gene 67: 31-40 (1988).

Os polipéptidos da presente invenção também incluem o polipéptido codificado pelo ADNc depositado, incluindo o polipéptido líder, maduro, codificada pêlo ADNc depositado menos o líder (isto é, a pre teína madura); o polipéptido da figura I (SEQ ID NO: 2), incluindo 0 líder, o pç 'iipépc-idP da figura 1 (SEQ X 1 NO: 2) menos a merionína ó o terminal amino, c polipépt ido da figura 1 J_ :?} ·:···;:':'··νί o 1 X «ΟΧΡΙρΙχ e:v; x χθό:ΡΡ Χϊ, domínio da transmembrana, o domínio intracelular, 0 domínio de morte, os polipéptidos solúveis que compreendem todo ou parte dos domínios g&étsc&iuisj; e intracelular mas a que falta o domínio da transmembrana, assim como os polípéptidos que são pelo menos 80 % idênticos, masís preferencialmente que são pelo menos 90 f· os 95 % ainda mais preferencíalmente, pelo menos 96 , 97 , 38 % ou 99 % idênticos aos polípéptidos codificados pelos clones de MWs depositados, com os da. figura 1 (SEQ ID NO: 2) e também inciuSTS porções desses polípéptidos com, pelo menos 30 aminoácídos e, mais preferencialmente, pelo menos 50 aminoácidos.

Por um pclipéptido com uma sequência de aminoácidos pelo menos, por exemplo, 95 % "idêntica" a uma sequência de aminoácidos de referência de um polipéptido de DM4, entende-se que a sequência de aminoácidos do polipéptido é idêntica à sequência de referência, excepto no facto da sequência de polipéptido poder incluir até cinco alterações de aminoácidos por cada 100 aminoácidos da sequência de aminoácidos de referência do polipéptido DM4. Por outras palavras, para se obter um polipéptido com uma sequência de aminoácidos pelo menos 95 % idêntica a uma sequência de aminoácidos de referência, pode-se eliminar ou substituir até 5 % dos resíduos de aminoácidos na sequência de referência, com outros aminoácidos ou um certo número de aminoácidos até 5 % do total dos resíduos de aminoácidos na sequência de referência, podem ser inseridos na sequência de referência. Estas alterações da de referência podem ocorrer nas posições terminais amino ou carboxi da sequência de aminoácidos de referência ou em qualquer parte úucpõ estas posiçoss terminais, espalhados entre -resíduos indivíduaImente na sequência de referência ou em um cu mais grupos contíguos dentro da sesuência de

Como matéria prática, se qualquer polipéptido em particular, é pelo menos 90 95 %, 96 , 97 %, 98 % ou 99 % idêntico a, por exemplo, à sequência de aminoácidos mostrada na figura 1 (SEQ ID NC: 2), ou a sequência de aminoácidos codificada pelos clones do ADNc depositado, pode ser determinada de uma forma convencional utilizando programas de computador conhecidos, tal omm o programa Bestfít (Wísconsin Sequence Analysis Package, Version 8 for Orla,, Genetics Computer Group, University Research Park, 575 Science Drive, Madison, WI 53711) . Quando se utiliza o Bestfit ou qualquer outro programa de alinhamento de sequências para determinarse uma sequência particular é, por exemplo, 95 % idêntica a uma sequência de referência, de acordo com ã presente invenção, os parâmetros são estabelecidos de tal modo que obviamente a percentagem de identidade é calculada em relação ao comprimento total da sequência de referência de aminoácidos e que as falhas ou faltas na homologia até 5 % do número total de resíduos de aminoácidos na sequência de referência são permitidas.

Os requerentes descobriram que o polipéptido DM4 é uma proteína aa:® 468 resíduos, que exibe três domínios estruturais principais. O primeiro, o domínio de ligação ao ligando, foi identificado dentro dos resíducs de cerca de 42 até cerca de 238 ar figura I (SEQ ID MC: 2) . O segundo, o domínio da transmembrana, foi identificado dentro dos resíduos de cerca de 239 até cerca de 468 na figura 1 (SEQ ID NO: 2). C terceiro, o domínio intracelular, foi identificado dentro dos resíduos de marca ar 265 até cerca ar 468 ra figura 1 (SEQ ID NO: 2). É i atracara?: a notar que os domínios isi:raé®.acirras incluem cerca de 422. Outros fragmentos arrfrilííl rralradr na id.gara 1 (SEQ ia i:ca 2), i?

(SEQ tó q-ma : ao era r aiatalaé madura dos resíduos de cerca de 24 até cerca de 468 e os polipéptidos solúveis que compreendem todo ou parte dos domínios extracelular e intracelular, mas a que falta e domínio da transmembrana. A presente invenção tem ainda por objecto polipéptidos de DM4 codificados pelo clone de ADNc depositado, incluindo o líder e fragmentos de polipéptidos de DM4 seieccionados da proteína madura, do domínio extracelular, do domínio da transmembrana, do domínio intracelular e do domínio de morte.

Num outro aspecto, a presente invenção tem por objecto um péptido ou um polipéptido que compreende uma porção ligada ao epitopo de um polipéptido aqui descrito. 0 epitopo desta porção de polipéptido é um epitopo imunogénico ou antigénico de um polipéptido da presente invenção. Um "epitopo imunogénico" define-se como uma parte de uma proteína que provoca uma resposta dos anticorpos quando toda a proteína é o imunogénio. Por outro lado, uma região de uma molécula da proteína a qual um anticorpo se pode ligar, define-se como um "epitopo antigénico". 0 número de epítopos imunogénicos de uma proteína é geralmente inferior ao número de epítopos antígénicos. Ver, por exemplo, Geysen et ai., Proc. Natl. Acad. Sei. EUA 81: 3998-4002 (1933).

Como para a selecção de péptidos ou de polipéptidos que se ligam a um epitopo (isto é, que contêm uma região de uma molécula de proteína à qual um anticorpo se pode ligar), é bem conhecido na técnica, que poucos pép-tidot sÍEt;í:i 1 que simulam parte de uma sequência de proteína, são capazes, por rotina, de provocar um anti-soro que reage com a proteína parcialmente simulada. Ver, por exemplo, Sutcliffe, J. G., Shinníck, T. M., Green, N. e Learner, R.A., (1983) Antibodies That React With Predetermined Sites on Proteins, Science 219: 660-666. 0::· péptidos capazes de provocar soros reactivos á proteína, estão frequentemente representados na sequência primária de uma proteína e podem ser caracterizados por um conjunto de regras químicas simples e não estãc confinados às regiões imuno-dominantes das proteínas intactas (isto é, epítopos imunogénicos) nem aos terminais arrdno ou carboxí.

Os péptidos e os poiipéptidos da presente Invenção, que se ligam ao epítopo antigénico, sâo por isso Úteis para produzir anticorpos, incluindo anticorpos monoclonais, que se ligam especificamente a um polipéptido da presente invenção. Ver, por exemplo, Wilson et al.r Cell 37: 767-778 (1984) em 777.

Os péptidos e poiipéptidos da presente invenção, que se ligam ao epítopo antigénico contêm, preferencialmente, uma sequência de pelo menos sete, mais preferencialmente, pelo menos nove e, ainda mais preferencialmente, entre pelo menos cerca de 15 cerca de 30 aminoácidos, contidos dentro da sequência de aminoácidos de um polipéptido da presente invenção.

Exemplos não limitativos de poiipéptidos antígénícos ou de péptidos antigénícos que podem ser utilizados para gerar anticorpos específicos de DM4 incluem: um polipéptido que compreende resíduos de aminoácidos de cerva de 35 até cerca de 92C na figura I (SEQ ID Ml: 2) ; um polipéptido que compreende resíduos de dMíaòádidtM de carva da 114 ata ca·;.a- da lâd ca figara 1 ΜΜρ a- a:l; 2) ; um polipéptido que compreende resíduos de aminoácidos de cerca de 169 ata cerca de 240 na figura ] (na aap TD NC: 2); um polipéptido que compreende resíduos de aminoácidos de cerca de 267 até cerca de 298 na figura 1 (SEQ ID NO: 2), um polipéptido que compreende resíduos de aminoácidos de cerca de 330 até cerca de 364 na figura 1 iddlQ ID NO: 2); uík polipéptido que compreende resíduos de aminoácidos de cerca de 391 até cerca de 404 na figura 1 (SEQ ID NO: 33.? e polipéptido que compreende resíduos de aminoácidos de cerca de 418 até cerca de 465 na figura 1 (SEQ 13 NO: 2). Tal como se indicou antes, os requerentes determinaram que os fragmentos dos polipéptidos anteriores, são regiões antigénicas da proteína de DM4.

Os péptidos e polipéptidos da presente invenção que se ligam ao epítopo podem ser produzidos por quaisquer meios convencionais. Hougthen, R. A., "General Method for the Rapid Soiid-Phase Synthesis of Large Numbers of Peptides: Specificity of Antigen-Antibody Interaction at the Levei ot' Individual Amino Acíds", Proc. Natl. Aead. Sei. FMÂ 82: 5131-5135 (1985). Este processo de "síntese simultânea de múltiplos péptidos (SSMP)", está ainda descrito na patente de invenção norte-americana U.S. NO: 4.631.211 para Hougthen et al. (1986).

Como será evidente para um especialista na matéria, os polipéptidos de DM4 da presente invenção e os seus fragmentos ligados a epítopos descritos antes, podem combinar-se com partes do domínio constante das ímunoglobulinas (IgG), resultando em polipéptidos quiméricos. Estas proteínas de fusão facilitam a purificação e mostram um aumento do iodo de vida ín vivo. Isto foi já mostrado, por díosupio, par-proteínas quiméricas que consistem nos primeiros dois domínios do polipéptaid-0 humano CD4 e noo vários domínios tos tofddos constantes das cadeias pesadas ou leves das de mamíferos (patente de invenção europeia EPA 394.827; Traunecker et al., Método 331: 84-86 (1988)). As proteínas de fusão que têm uma estrutura dimérica Ligada a um di-sulfureto devido a parte de IgG, podem também ser mais eficientes na iigação e na neutralização de outras moléculas do que a proteína raonomérica DM4 ou um fragmento de proteína isolado (Fountoulakis et al., -J Biochem 270: 3958-3964 (1995)).

Ensaios dos Folipéptidos A presente invenção Z&mt-ête tem por objecto ensaios de diagnóstico, tal como ensaios quantitativos e de diagnóstico para a detecção dos níveis da proteína de DM4 ou das suas formas solúveis, em células e tecidos, incluindo a determinação dos níveis normais e anormais. Assim, por exemplo, um ensaio de diagnóstico de acordo com a presente invenção, para detectar a sobre-expressão de DM4 ou da sua forma solúvel, comparado com amostras de tecido normal de controlo, pode ser utilizado para detectar, por exemplo, a presença de tunores. As técnicas de ensaio que podem ser utilizadas para determinar os níveis de uma proteína, tal como, uma proteína de DN4 da presente :ίο:νόη<ηίό ou de uniã sua forma solúvel, numa amostra derivada ífe um hospedeiro, são bem conhecidos dos especialistas na matéria. Esses processos de ensaio incluem ensaios rádio-imunitários, ensaios comparativos da ligação, análise de Western de transferência de anticorpo/proteína para uma matriz imobilizada e ensaios por ELISA. A anál dos níveis da proteína de . numa amostra ocorrer utilizando qualquer processe conhecido na técnica. As técnicas preferidas para o ensaio dos níveis de proteína de DM4 numa amostra biológica, são as técnicas i base de anticorpos. Por exemplo, a dê proteína de DM4 em tecidos pode ser estudada com processos imuno-histológicos clássicos. (Jalkanen, M. et al., J. Cell. Biol. 101: 976-985 (1985); Jalkanen, M. et si *·> J. Cell. Biol. 105: 3087-3096

Outros processos, à base de anticorpos, OtsiS para a detecção da expressão dos genes da proteína de DM4 incluem imuno-ensaios, tais corno, o ensaio imuno-absorvente ligado a enzimas (ELISA) e o rádio-imuno-ensaio (RIA).

Conhecem-se na técnica marcadores apropriados que incluem marcadores de enzirnas, tal como, glicose-oxidase, rádio-isótopos, tal como os marcadores de iodo (I:'% I'”), de carbono (¾), de enxofre (35S), de trítio plíl de índio e de tecnécio (9Sn!Tc) e marcadores fluorescentes, tal como, fluoresceína e rodamina e biotina.

Terapêutica

Os ligantes da família do factor de necrose do tumor (FNT) são conhecidos pçp: estarem entre as citocinas mais pleictrópicas, induzindo un grande número de respostas celulares, incluindo citotoxicidade, actividade antiviral, actividades irnuno-reguladaras e a regulação transcricional de vários genes (Goeddel, D.V. et al., "Tumor Necrosis Factors: Gene Structure and Biologicai Activities", . Quant. Biol. 51: 597-609 (1986), Cold

Sprinq Harbo r; Beutler, B., e Cerami, A,, Aon ú. Rev. Biochem. 57: 505-518 (1988); Çld, L. J. , Sei, i . 258: 59-75 (1988); Fiers, W., FEBS ) / í λ 205: 199-224 i :i99i)). Os ligantes da família dos FNT induzem essas várias respostas celulares por meio da ligação aos receptores da família do FNT, incluindo o DM4 da presente invenção. As células que expressam o polipéptído DM4 e que se crê que tenham uma potente resposta celular aos ligandos de DM4 incluem ciduito amnióticas, leucócitos do sangue periférico, do coração, do cancro do fígado, do rim, cêlulds T actlvadas, tecido correspondendo a células Th2, amígdalas humanas e camadas de células brancas com falta de CD34 (sangue do cordão umbilical). Por "uma resposta celular a um ligando da família do FNT" entende-se qualquer alteração genotípica, fenotípica e/ou morfológica de uma célula, de uma linha de células, de tecido, de cultura de tecido ou de um paciente, que é induzida por um ligando da família do FNT. Tal como indicado, essas respostas celulares incluem não apenas respostas fisiológicas normais aos ligandos da família do FNT, mas também doenças associadas com um aumento da apiptose ou a inibição da apóptose. A apóptose (morte programada das células) é um mecanismo fisiológico envolvido na eliminação de linfócitos T periféricos do sistema imunitário e a sua desregulação pode levar s um certo número de diferentes processos patogénicos (Ameisen, J. C., AIDS 8: 1197-1213 (1994); Krammer, P. H. et a1., Curr. Opin. Immunol. 6: 279-289 (1994)).

As doenças associadas ao aumento da sobrevivência das células ou à inibição da apóptose incluem cancros (tais como, linfornas foliculares, carcinomas com de p53 e tumores dependentes de hormonas, tais como, cancro da mama, cancro da próstata, sarcoma de Kaposi e cancro do ovário); distúrbios auto-imunitários (tais como, j f. ,c eritematoso agudo e artrite reumatóide da glomeruZ _ te relacionada com o sistema imunitário) e itftoçt (tais corno, virts do herpes e adenovírus), inflamação, enxerto doença de t.vjã;pscioit:::o, trbsdddrD aguda de enxerto ® roibintâ;; emXççU:':o. dê enxerto, Doenças associadas com o aumento da apóptose 1 SIDA; distúrbios neurodegenerativos (tais -¾¾ doença de Alzheímer, doença de Parkinson, esclerose lateral âíaiotrdf Ica.f retinite pigmentcsa, degeneração cerebelar}; síndromas mielodisplásicos (tais como, anemia aplásica), tmraMAS isquémícos (tais como os causados pelo enfarte do miocárdio, acidente vascular e traumas de reperíuslc}r doenças do fígado induzidas por toxinas (tais como as causadas pelo álcool:, choque séptico, caquexia e anorexia.

Assim, num aspecto, a presente invenção tem por objecto um processo para aumentar a apoptose induzida por um ligando da família dos FNT, gue envolve a administração a uma célula, que expressa o poiipéptido de DM4, de uma quantidade de ligando, de um seu análogo ou de um agonista de DM capaz de aumentar a sinalização mediadã por DM4. Preferencialmente, a sinalização mediada por DM4 é âumentada para tratar uma doença em que existe uma diminuição da apóptcse ou uma diminuição da citocina e da expressão da molécula de adesão, Um agonista pode incluir formas solúveis de DM4 e anticorpos monoclonais dirigidos contra o poiipéptido de DM4.

Num outro aspecto, a presente invenção tem por objecto um processo para inibir a apoptose, induzido por um ligando da família dos FNT, que envolve a administração a uma célula, que expressa o poiipéptido de DM4, de uma quantidade efectiva de mi antagonista capaz de diminuir a sinalização mediada per DM4. Prefdímínuida para tratar uma doença em que existe um aumento da :S|A>prrrr ou or que hà expressão do NFkB. Um agonista »00 incluir formas solúveis de Ddid e anticorpos monoclonais dirigidos contra o poiipéptido de DM4.

Por "agonista" entende-se compostos sintéticos e de natural, capazes de aumentarem o; de potenciarem a apóptose. £%: "a' - entende-se compostos e de oesrhiruoiq natural, capazes de inibir a apóptose. Pode-se determinar se qualquer sdrsdid&to a "agonista" ou a "antagonista", d& presente pode aumentar ou Inibir a apóptose utilizando ensaios de resposta celular ao receptor/ligando da família do FNT conhecidos na técnica, incluindo aqueles que são descritos com mais detalhe a seguir.

Um desses processos de rastreío envolve a utilização de melanóforos que são transfectados para expressar o receptor do presente invenção. Essas técnicas de rastreío estão descritas na patente de invenção YCT WO £ib/0ldÍ0, publicada em 06 de Fevereiro de 1992. Esse pode ser utilizado, por exemplo, para rastrear um composto que inibe (ou potência.) a activação do polipéptído dc receptor da presente invenção, por meio do contacto das células do melanóforo que codificam o receptor, tanto com um ligando da família do FNT como com um antagonista ;no agonista) candidato. A iafMçâs ou o aumento do sinal gerado pelo ligando indica que o composto é um antagonista cu agonista da via de sinalização do ligando/receptor.

Outras técnicas de rastreío incluem a utilização de células que expressam o receptor (001: exemplo, células de OHC (ovário de hamster chinês) transfectadas) num sistema que mede as alterações extraceluiares ao pb causadas pela eot.ieeeie do receptor, por exemplo, conforme descrito em Science 246: 181-296 (Oufnbuu: de 1989) . Por onemploq pode-se fazer contactar os com uma célula que expressa 0 polipéptído do receptor da presente invenção e uma sogoooh. resposta do mensageiro, por exemple, transdução do sinal ou alterações do pH, que podem sei medidas para determinar se o potencial composto activa ou inibe o receptcr.

Octras técnicas dl* rastreio envolvem a introdução do que codifica o receptor em oócitos de Xenopus, para expressar transientemente o receptor. Os oócitos do receptor podem então por-se em contacto com o ligando do receptor e um compcsto a ser rastreado seguido da detecção da inibição ou da activação de um sinal de cálcio no caso do rastreio de compostos que se pensa que inibem a activação do receptor.

Outra técnica de rastreio envolve a expressão, em células, de uma estrutura em que o receptor está ligado a uma fosfclipase C ou D. Essas células incluem células endoteliais, células do músculo liso, células embrionárias do rim, etc. 0 rastreio pode ser realizado conforme se descreveu aqui antes, por meio da detecção da activação do receptor ou da inibição da àctivação do receptor a partir do sinal de fosfolipase.

Outro processo envolve o rastreio de compostos que inibem a activação do polipéptido do receptor dos antagonistas da presente invenção, por meio da determinação da inibição da ligação do ligando marcado àâ células que têm o receptor na sua superfície. Esse processo envolve a transfecção de uma célula eucariótica com ADN, que codifica o receptor, de tal modo que a célula expressa o receptor na sua superfície e contacta a célula com um composto na presença de uma forma marcada de um ligando conhecido. C ligando pode ser marcado, por exemplo, por radioactividade, A quantidade de ligando marcado ligado aos; receptores é medida, por exemplo, medindo a radioactividade dos receptores. Se o composco se liga ao receptor conforme determinado por uma redução do ligando marcado que se liga aos receptores, a ligação do ligando marcado òos receptores está inibida.

Cutrc-s ensaios de rastreio para os agonistas e os antagonistas da presente invenção, t&tid descritos em

Tartagiia, L. A. e Goeddel, D. V., J. Biol. Chem. 267: 4304-4307 (1992).

Assim, num óbito aspecto, descreve-se um processo de rastreio para determinar se um agonista ou um antagonista candidato é capaz de aumentar ou de inibir uma resposta celular o -m ligando da l ^. ... FNT. O processo envolve o contacto das células que expressam o polipéptido de DM4 com um composto candidato como um ligando da família do FNT, ensaiando uma resposta celular e comparando a resposta celular a uma resposta celular padrão, sendo o padrão analisado quando se faz o contacto com o ligando na ausência do composto candidato, em que um aumento da resposta celular em relação ao padrão, indica que o composto candidato é um agonista da via de sinalização do ligando/receptor e uma diminuição da resposta celular comparada com a do padrão, indica que o composto candidato é tts antagonista da via de sinalização do ligando/receptor. Por "análise de uma resposta celular" entende-se a medição qualitativa ou quantitativa de uma resposta celular a um composto candidato e/ou um ligando da família do FNT (por exemplo, determinação ou de um aumento ou de uma diminuição na proliferação das bdldXtó T ou na mçooáçdo de tiMmiííU tritiada . De acordo com a presente ΐΑοοηόΑο, uma célula que expressa o polipéptido de DM4 poae ser contactada com um IXgatòks da família ao FNT administrado quer endogenamente, quer exogenamente.

Agonísta, de acordo com a presente invenção, imolai compostos sintéticos e de ocorrência natural, tâl como, por exemplo, fragmentos de péptidos de ligando da família do FNT, factor do crescimento da transformação, neuro-transmíssores (tais glutamato, dopainina, N-metil-D- aspartato), supressores de tumor ípSl)).? células T oitollt isos: e antimetabolitos. Os agonistas preferidos incluem fármacos tais como, por exemplo, cisplatina, doxorubicina, bleomicina, arabinó-sído de citosina, mostarda de azoto, metotrexato e vincrístina. Outros incluem péptidos de etanol e de amilóíde. (Science 267: 1457-1458 (1995)). Outros agonistas preferidos incluem anticorpos policlonais e monoclonais dirigidos contra o polipéptido de DM4 ou um seu fragmento. Esses anticorpos de agonistas dirigidos contra un receptor da família ao FNT estão descritos em Tartaglia, L. A., et al., Proc. Msá.1. Acad. Sei. EUA 88: 9292-9296 (1591); e Tartaglia, L. A. e Goeddel, D. V., J. Biol. Chem. 267 (7): 4304-4307 (1992). Ver também, o pedido de patente de invenção PCT WO 94/09137.

Antagonista, de acordo com a presente invenção, inclui compostos sintéticos e de ocorrência natural, tal corno, por exemplo, o ligando CD40, aminoácidos neutros, zinco, estrogénio, androgénios, genes virais (tais como oácriÍcrlrPb EIB, baculovírus p35 e IAP, rm de vacas crmA, vírus de Epstein-Barr BHRF1, LMP-1, vírus da febre suína africana LMW5-HL, e virais do herpes yl 343};, iníbidores de calpaína, inibídores ae cisteína protease e promotores de tumor (tais coo-tç PMA, fenobarbital e alfa-hexaclorociclo-hexano),

Outros antagonistas potenciais incluem moléculas de sentido inverso (anti-paralelas) . A tecnologia dai sentido inverso (anti-sense ou anti-paralela) pode sei utilizada para controlar a expressão dos genes através do ADN ou do ARN anti-paralelo ou através da íetfSâçâa ae hélices triplas. As têtitict;;; de sentido inverso estão discutidas, por exemplo, em Okano, J, llmjroeien„ 56: 5 60 (1991) ;

Olígodeoxynucleotídes as Antisense Inhibitors of Gene ãxpMés&iorsjf CRC Friem, iode Raton, FL (1988) . R formação de hélices triplas discute-se, por exemplo, em Lee et al. f iloeieic ileeax 6: 3073 (1979); Cooney et al.r Science 241: 456 Íl3Z%} ? e Dervan et al., Science 251: 1360 (1991). Os processos baseiam-se na ligação de um poilritólsétidô a um ADN ou a um ARN complementar.

Por exemplo, a porção de codificação de 5' de um polinucleótido que codifica o polipéptido maduro da presente invenção, pode sei utilizada para desenhar um oligonucleótido de ARN de sentido inverso, com desde cerca de 10 até cerca de 40 pares de bases de comprimento. Gesenha-se um oligonucleó-tido de ADN para ser complementar de uma região do gene envolvido na transcrição, prevenindo assim a transcrição e a produção do receptor. O oligonucleótido de ARN de sentido inverso hibrida com o ARNm in vivo e bloqueia a tradução da molécula de ARNm no polipéptido do receptor. Os oligonucleótidos descritos antes podem tarabém ser libertados para as células de tal modo que o ARN ou g ADN anti-paralelo pode ser expresso in vivo para inibir a produção do receptor.

Outros antagonistas, de acordo com a presente invenção, incluem formas solúveis de DM4, isto é, fragmentos de DM4 que incluem o domínio de do ligando da região extraceiular do receptor de , . completo. Essas fof&âs solúveis do receptor, que ser sintéticas ou de ocorrência natural, antagonizam a sinalização mediada por DM4 competindo com DM4 da superfície das células para a ligação aos lígandos da família do FNT. Assim, as formas solúveis do receptor que incluem o domínio de ligação do ligando, são citocinas novas capazes de inibir a apóptose induzida pelos lígandos da família úê FNT. Estes são preferencialmente expressos como dímeros ou trímeros, dadz que estes se t<te mostrado como sendo superiores às formas monoméricas do receptor SíOlévti,. como antagonistas, por exemplo, fusões da família do receptor de FNT com IgG-Fc. Outras dessas citocinas são conhecidas na técnica e incluem Fas B (una forma solúvel do receptar Fas de rato), que actua fisiologicamente para limitar a apóptose induzida pelo ligando de Fas (Hughes, D. P. e Crispe, I. N., J, Exp. Med. 182: 1395-1401 (1995)).

As experiências estabelecidas no exemplo 5 demonstram que DM4 ê uma molécula contendo o domínio de morte capaz de provocar a apoptose que é importante na regulação do sistema imunitário. Alem disso, as experiências estabelecidas a seguir demonstram que a apoptose induzida por DM4 foi bloqueada pelos inibidores do proteases tal como ICE, Cma e z-VAD-fmk. Assim, os inibidores de proteases tal como ICE, FADD-DN e FLICE-Ft/úACúXA' x. >: podem ser utilizados como antagonistas da actividade de DM4. O termo "anticorpo" (Ac) ou "anticorpo (Acm), tal como se utiliza aqui, é suposto incluir moléculas intactas, assim como os seus fragmentos (tais como, por exemplo, fragmentos de Fab e f faêi )2), que são capazes de se ligar a um antigénio. Os fragmentos de Fab e F(abf/2 a que falta o fragmento Fc do anticorpo Intacto, desaparecem mais rapidamente da circulação e podem ter menos ligação ao tecido não especifico de um anticorpo intacto (1983)). et al., J. Nucl 24: 316-325

Os anticorpos de acordo com a presente invenção podem ser preparados por de uma da variedade de processos utilizando os imunogénios de DM4 da presente invenção. Tal como se indicou, esses imunogénios de Dhm incluem o polípéptído de DM4 de comprimento completo (que pode ou não incluir a sequência líder) e fragmentos do polipéptido de DM4, tal como o domínio de ligação do ligando, o domínio da transmembrana, c domínio intracelular e o domínio de morte.

As proteínas e outros compostos que se ligam aos domínios de DM4 são também agonistas e antagonistas candidatos, de acordo com a presente invenção. Esses compostos de ligação podem ser "capturados" utilizando o sistema híbrido de dois fungos (Fields e Song, Nature 340: 245-246 (1989)). Uma versão modificada do sistema híbrido de dois fungos foi descrita por Roger Brent e os seus colegas (Gyuris, J. et al., Cell 75: 791-803 (1993); Zervos, A. S. et % 1 * .,· Cell 72: 223-232 (1993)),

Preferencialmente, utiliza-se o sistema híbrido de dois fungos de acordo com a presente invenção para capturar compostos que se ligam quer ao domínio de ligação do ligando de DM4, quer ao domínio intracelular de DM4. Esses compostos são Sons candidatos a agonistas e a antagonistas do presente invenção.

Por um "ligando da família do FNT" entende-se ligandos de ocorrência natural, recombinantes e sintéticos, que tãõ capazes de se ligarem a um membro da família dos receptores de FNT a induzir a via de sinalização dt ligando/receptor. Os membros da família do FNT incluem, mas não se limitam, a ligandos de DM4, incluindo LIART, FNT-a, linfotoxina-a (LT-α, conhecida como FNT- -β), LT-β (encontrado no heterotrímero complexo ΙΙ-α2-β), Fasr, cD40, cDz/, cD3u, 4-1BB, 0X40 e factor de crescimento nervo (FCN). âpldcsçèss t-:-u:dp§tilss.s representativas aa presente invenção são descritas com mais detalhe a seguir. 0 estado de imunodeficíência que define a SIDA & s&su. ui em relação a uma diminuição do número e da função dos iiníViVVtvV: T de CD4". Recentes relatórios estimam que a perda diária das sêlnl&s: T de CD4+ está entre 3,5 X 10' e 2 X 1G9 células (Wei X. et *1,., Nature 373: 117-122 (1995)). Crê-se que uma causa da diminuição das células T de CD4+ no estabelecimento da i:vz@cçl© por VIH, seja a apóptose induzida por VIH. Na verdade, a morte apoptótica das células induzida por VIH, foi demonstrada não só ;r· vitro mas também, e o que é mais importante, em indivíduos infectados (Ameisen, J. C., AIDS 8: 1197-1213 (1994); Finkel, T. H., e Banda, N. K., Curr. Opin. Immunol. 6: 605-615 (1995); Muro-Cacho, C. A. et al., J. Immunol. 154: 5555-5566 (1995)). Alêm disso, a apóptose e a diminuição dos linfócitos T de CDi* está fortemente correi a-cionada em diferentes modelos de animais , com a SIDA (©.©©©©«, T., et ar., V m©'© 373: 441-444 (1995); Gougeon, M. L., et ai., AIDS Res. Hum. Retrovir uses 9: 553-563 ilfvlí) e não se observou apóptose nesses modelos

ae animais em que a replicação virai não resultou em SIDA (Gougeon, y* L. et al., AIDS Res. Hum. Retroviruses 9: 553-563 (1993)). Outros dados inmcam que iinívoif ©;% T não infectados mts LnloMd©© mi activados a partir ae :;Vuλvid,lúíectAdót com VIH cvvdcv apóptose aepois de encontrarem c ligâns© da f©:;;©©©.© ao FNT F:©:©©. otl Ιίνννηόα linhas de aélivlas! monoclticas que resultam na morte, no seguimento d© infecção por VIH, tem-se demonstrado que a l©f©cpd© das células dvd? com ¥IB, resulta ra expressão de mvo de FasL e que FasL medeia a apóptose induzida por VIM (Badiey, A. D. et al., J. Vi rol. 70: 199-206 (1996)). Além disso, o ligando da família do FNT foi detectável em macrófagos não infectados e a sua expressão foi sobrerregu) Lada no seguiment o da infecção por VIH, resultando na morte selectiva de linfócitos T CD4 não infectados (Badiey, A. D. st al., J· Vizol* 70: 199-206 (1996)) . Assim, por meio da presente invenção, provídencia-se para tratar indivíduos positivos ao VIH, que envolve a administração de um antagonista da presente invenção para reduzir a morte selectiva de linfócitos T de CD4. Os modos de administração e as dosagens estão discutidos em detalhe a seguir.

Na rejeição de um alo-enxerto, o sistema imunitário do animal receptor não foi previamente iniciado para responder porque o sistema imunittrio, na sua maior parte, ê apenas desencadeado por antigénios ambientais. Os tecidos de outros membros ou das mesmas espécies não têm sido apresentados da mesma maneira que, por exemplo, os vírus e as bactérias se têm apresentado. No caso de rejeição dos aio-enxertos, os regimes imunossupressores são desenhados de forma a prevenir que o sistema imunitário atinja o estado de efector. Contudo, o perfil imunitdrio da rejeição ao xeno-enxerto pode simular a recorrência da doença mais do que a rejeição do alo-enxerto. No caso de recorrência da doença, o sistema imunitário já tinha sido activado, como ee pode por em evidência pela destruição das células de isletos originais. Por isso, na da doença, o sistema imunitário está no estado de efector. Os agonístas da presente invenção são capazes de suprimir a resposta iPdhi/târt.íi:· tanto aos alo-enxertos como aos xeno-enxertos, porque os linfócitos activados e diferenciados nas células efectoras vãa expressar o polipéptido de DM4 e assim sáo susceptíveis em r&Tavio aos compostos que aumentam a apóptose. Assim, a presente invenção tem ainda por objecto um processo para a criação de tecidos imunitários privilegiados. 0 antagonista da presente invenção pode ainda ser utilizado no tratamento da doença ir. flamaTorλ do intestino.

Os antagonistas de podem ser úteis para o tratamento de doenças inflamatórias, tais como, artrite reumatóide, osteoartrite, psorise, ásbtioedá e doença inflamatória de intestino.

Modos de MmiMâ$t£ãçâú 0 agonista ou os antagonistas descritos aqui podem ser administrados ín vitro, ex vivo ou in vivo as células que expressam o receptor da presente invenqão. Por administração de uma "quantidade efectiva" de um agonista ou de um antagonista da presente invenção, entende-se uma quantidade do composto que è suficiente para aumentar ou inibir uma resposta celular a um ligando da família dos FNT e incluindo os polipéptidos. Em particular, por de uma "quantidade efectiva" de um agonista ou de antagonistas entende-se uma quantidade efectiva para aumentar ou inibir a apóptose mediada por DM4. Obviamente, quando é desejável que a apóptose seja aumentada, pode-se co-administrar um agonista de acordo com a presente invenção com um ligando da família do FNT. Um especialista na matéria entenderá que as quantidades efectivas de um agonista ou de um antagonista podem ser determinadas empiricamente e podem ser utilizadas na forma pura ou sob a rbrtbí de um sal, um éster ou um pró-fármaco aceitáveis sob o ponto de vista farmacêutico. 0 agonista ou o antagonista podem ser administrados em composições,, em combinação com um ou mais excipientes aceitáveis sob o ponto de vista farmacêutico.

Deve entender-se que, quando administrados a um paciente humano, a utilização diária total dos compostos e das composições da presente invenção, será seguida pelo médico assistente dentro do âmbito da decisão médica. 0 nível da dose efectiva específica, sob o ponto de vista para qualquer paciente em particular, dependera de factores bem conhecidos na medicina.

Gomo uma proposta genérica, a quantidade efectiva total do ponto de vista farmacêutico, do polipéptído de DM4, administrado parentericamente, por dose, estará no intervalo de cerca de 1 pg/kg/dia até cerca de 10 mg/kg/dia do peso do corpo do paciente, embora, tal como m fez nctar anres, isto esteja sujeito a uma decisão terapêutica. Mais preferenciai-mente, esta dose é de peio menos 0,01 mg/kg/dia e, mais preferencialmente, para seres humanos, deve estar entre cerca de 0,01 e 1 mg/kg/dia para a hormona. Se forem dados continuamente, os agonistas ou os ar-tagonistas de Piás são normalmente administrados numa dose de cerca de 1 pg/kg/hora até cerca de 50 Hf/tq/.Pvra., quer por meio de 1-4 itifttvçôt* por dia í.tii por infusões subcutâneas continuas, por exemplo, utilizando uma mini-bomba. Também se pode atilitat a solução do saco intravenoso. A dosagem pode também ser arranjada de uma forma específica para o paciente para providenciar uma concentração pré-determinada de um agonista ou de um antagonista no sangue, ctattúcvdu determinado pela técnica de RIA. Assim, a dosagem para um paciente pode sei ajustada de modo a regular a entrada nos níveis de sangue, conforme medido por RIA, por ordem de 50 até 1.000 ng/mL, preferencialmente, 150 até 500 ng/mL.

As composições farmacêuticas são dadas incluindo um agonista ou um antagonista e um veiculo ou u.® exçipiente, aceitáveis sob o ponto de vista farmacêutico, que podem ser administrados oralmente, rectalmente, parentericamente, intracisternalmente, intravaginalmente, intraper.itonialmente, topicamente (sob a forma de pós, pomadas, gotas ou adesivos transdérmicos), bucalmente ou sob a forma de um aerossol oral ou nasal. É importante notar que, por co-administração de um agonista e de um ligando da família dos FNT os efeitos clínicos colaterais podem ser reduzidos, utilizando doses mais baixas tanto do ligando como do agonista. Deve entender-se que o agonista pode ser "co-administrado" quer antes, quer depois ou simultaneamente com o ligando da família do FNT, consoante as exigências de uma aplicação terapêutica em particular. Por "veículo aceitável sob o ponto de vista farmacêutico", entende-se uma carga não tóxica, sólida, semi-sólida ou líquida, um diluente, um material de encapsuiação ou um auxiliar de formulação de qualquer tipo. C termo "parentérico", tal como se utiliza aqui, refere-se aos modos de administração que incluem a administração intravenosa, intramuscular, intraperito-neal, intra-esternal, subcutânea e intra-articular % por infusão.

As farmacêuticas da presente Urturpã® paru inpscpáo prrs\rrtsrti:r« podem compreender soluções, dispersões, ourptcrPa®·? ou emulsões aquosas esterilizadas ou não aquosas, ausifcuwir sob o ponto de vista rummauêaiic:®, assim como, pós esterilizados para reconstituir soo a forma de soluções ou dispersões esterilizadas, injectáveis, para reconstituição imediatamente antes da sua utilização.

Furã além dos solúveis de DM4, o polipéptido de DM4 contendo a região ím p&M ser utilizado, quando apropriado, sob a forma solubilizada, incluindo detergentes, tais coxo, CHAPS ou NP-40, com um tampão.

Expressão e Purificação em E. coli A sequência de ADN que codifica a proteína de DM4 madura no clone de ADNc depositado (ATCC NO: 97853) é amplificada utilizando iniciadores de oligonucleótidos na RCP, específicos para as sequências de terminal amíno da proteína de DM4 e específicas das sequências 3r do vector com o gene. Adicionam-se mais nucleótidos contendo sítios de restrição para facilitar as clonagens com as sequências 5' e V, respectivamente.

Os iniciadores que se seguem são utilizados para a expressão do domínio extracelular de DM4 em E. coli: o iniciador 5* tem a sequência 51-GCGGCAT- GCATGATCAATCAATfGGCAC-3' (SEQ ID NO: contém o titi» d©

Sphl sublinhado. O iniciador de 3' 5!tttAA?t;7TTrsA7''· TATGTCCATTGCCTG-3 ’ (SEQ ID NO: e cntits-s. o sítio de nino!: I sublinhado. O meio© é pQEoE-.

Os sítios de mBtzmãú: são convenientes para a restrição .... . da no vector de expressão bacteriana pEE&o;, e sâo utilizados para © mormo-m bacteriana nestes st ts- b (Qtsges, inc. 9259 Eton , Chatsworth, CA, 91311). pQBEO codifica a resistência ao antibiótico ampicilina ("Amp") e contém uma origem bacteriana de replicação ("ori"), um promotor indutível de IPTG e um sítio de ligação do ribossoma ("SLR"). 0 ADN de DM4 amplificado e o vector pQE60, são ambos digeridos com Sphl e HindIII e os ADNs digeridos sã3 então ligados em conjunto. A inserção do ADN da proieina de DDCR nos locais do vector pQE6Q, coloca a região de codificação da proteína de DM4 a j usante e ligada operacionaimente ao promotor indutível do IPTG do vecror e na mesma zona com uma da AUG apropriadamente posicionada para a tradução da proteína de DM4. A mistura de ligação é transformada nas células de E. coli concorrentes utilizando processos padrão. Esses processos estão descritos em Sambrook et al., Molecular Cloning: a Laboratory Manual, 2" Ed. ; Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989) . A estirpe ml5/rep4 de E. coli,, contendo múltiplas cópias do plasrnido pREP4, que expressa o repressor lac e confere resistência à canamicina ("rCan"), é utilizada na realização do exemplo ilustrativo aqui descrito. Esta estirpe, que é apenas uma das muitas que são apropriadas para a expressão da proteína de DM4, está disponível comercialmente na Qiagen, supra.

Os transformantes são identificados psi-a sua capacidade de crescer em placas de LB na presença de ampicilina e canamicina. Isola-se o MM 30 plasrnido a partir de colónias resistentes e a identidade do ADN clonado é confirmada por análise de £&sí.ris?â£>»

Os clones que contêm as estruturas desejadas crescem durante a noite ("D/N") em cultura llquídí em meio LB como com complementado tants com ampicilina (100 canamicina (25 ng/d-IP . h cultura D/N é utilizada para inocular uma grande cultura, numa diluição de aproxímadamente 1:100 até 1:250. As células crescem até a uma densidade óptica a 600 rm. entre 0,4 e 0,6. Adiciona-se então o isopropil-B-D-tíogalactopiranósído ("IPTG") até a uma concentração final de 1 ti·? para induzir a transcrição dos promotores sensíveis ao repressor lac, por inactivação do repressor lacl. Em seguida faz-se a incubação das células durante mais 3 a 4 horas. Colhem-se então as células por centrifugação e abrem-se por processos normalizados. Os corpos de inclusão são purificados a partir das células abertas utilizando técnicas de recolha de rotina e solubiliza-se a proteína a partir dos corpos de inclusão em ureia 8 Μ. A soluçlt de ureia 8 M contendo a proteína solubílizada, é passada numa coluna PD-10 em solução salina tampcnada com fosfato ("STF"), duas vezes, eliminando-se assim a ureia, permutando o tampão e redobrando a proteína. Purifica-se a proteína por mais vs.mt etapa de cromatografia para eliminar a endotoxina. Depois, filtra-se em meio esterilizado. A preparação da proteína filtrada em meio esterilizado ê armazenada no seio de 2 X STF a uma concentração de 95 μ/mL. 2: Expressão e Células de Mstmi feros A maior paute dos vectores utilizados para a expressão de urra dada sequência oe em células ae mamíferos comporta a origem de repiicação 6v4G.. liado permite a repiicação cio vector até a um. número elevado de cópias um cèlui-it (por uiUMpuo células :!« COS) que expressam o antigénio T requerido para a iuldirpíá-c da síntese do ADN virai. Pode-se utilizar para este Sim qualquer outra linha de células de mamíferos.

Um vector de expressão típico, em mamíferos, cóút.à& o elemento promotor, que medeia a iniciação da êtáTísmrioâo de ARNm, a sequência de codificação da proteína e os sinais necessários para a terminação da transcrição e a poliadenilação do transcripto. Os elementos adicionais incluem melhoradores, sequências de Kozak e sequências de intvtrtBnçio flanqueadas pelos sitios dadores e receptores para a segmentação de ARNm. Pode-se conseguir uma transcrição altamente eficiente com os promotores precoces e tardios de SV40, as repetições de terminais longos (RTLs), de retrovirus, por exemplo, VSR, VI de HTL, HIVI e o promotor precoce do citomegalovírus (CMV). Contudo, podem utilizar-se sinais celulares (por exemplo, o promotor de actina humana). Os vectores de expressão apropriados para serem utilizados na prática da presente invenção, incluem, por exemplo, vectores, tais como, pSVL e pMSG (Pharmacia, Uppsala, Suécia), pRSVcat (ATCC NO: 37152), pSV2dhfr (ATCC NO: 37146) e pBCl2MI (ATCC NO: 67109). As células dos hospedeiros em mamífercs que podem ser utilizadas incluem Hela 293 humana, células H9 e de Jurkat, células NIH3T3 e C127 de rato, Cos 1, Cos 7 e células CV1 de macaco verde africano, células QC1-3 de coelho, células L de rato e células de ovário de hamster chinês (OHC).

Alternativamente, o gene de Interesse pode ser expresso em linhas de células estáveis, que contêm o gene integrado num cromossoma. A co-transfecção com um marcador seleccíonável, tal como, dhfr, gpt, bôsícíísío higromicina, permite a identificação e o isolamento das ti 11.Im transfectadas. 0 gene transfecfado pode também ser amplificado para expressar grandes quantidades da proteína codificada. A di-hidrofoiato redutase rpPFiR) é um marcador útil para desenvolver as linhas de células que comportam várias centenas ou mesmo vários milhares de cópias do gene de interesse. Utilizando este marcador, as células de mamífero crescem em quantidades crescentes de raetotrexato para selecção e seleccionam-se as células com a resistência ãtós elevada. Outro marcador de selecção útil é a enzima glutamina sintase (GS) (feiphy et ai., Biochem. J. 227: 277-279 (1991); Bebbington ®t al.,

Bt&fTeçhJSiú ogy 10: 169-175 (1992)). Utilizando estes marcadores, As células de mamífero crescem meio selectivo e seleccionam-se as células com a resistência mais elevada. Estas linhas de células contêm os genes amplificados integrados num cromossoma. As células de ovário de hamster chinês (OHC) são muitas vezes utilizadas para a produção de proteínas.

Os vectores de expressão pCl e pC4 contêm o promotor forte (RTL) do vírus do sarcoma de Rous (Cullen et al., Molecular and Cellular Biology 5: 438-447 (Máxço de 1985)), mais um fragmenta do melhorador de CMV (Boshart et al., Cell 42: 521-530 (1985)). Múltiplos sítios de clonagem, por exemplo, como os sítios de clivagem das enzimas de restrição BamHI, Xbal e Asp718, facilitam a clonagem do gene de interesse. Os vectores contêm, além disso, o intrão 3a poliadenilação o o sinal de térMuagi:::) do gene de do rato.

e Expressão s células de OHC

O vector pC4 é zt i 1:(para a expressão do polipéptido de DM4. O plasmido pC4 é \*m derivado do piasmido pSV2-dhfr hvò-Mmo de acesso na ATCC 37146) . O plasmido contém o gene DHFR de rato sob controlo do promotor precoce de SV40. As células de ovário de hamster chinês ou outras células que não têm actividade dê di-hidrofolato, que sáo transfectadas com estes plasmidos, podem ser seleccionadas fazendo crescer as ôé!«l.&-è num meio selectivo (MEM alfa menos, Life Technologies), complementado com o agente quimioterapêutico metotrexato (MTX). A amplificação dos genes de DHFR em células resistentes a metotrexato iífhlj tem sido bem documentada (ver, por exemplo, Alt, F. W., Kellems, R. M., Bertino, J. R., e Schímke, R. T., J. Bíol. Chem. 253: 1357-1370 (1978); Hamlín, J. L. e Ma, C., Biochem. et Bíophys. Acta 1097: 107-143 (1990); Page, M. J. e Sydenham, Μ. A. 1991, Biotechnology 9: 64-68 (1991)). As células que crescem em concentrações crescentes de MTX desenvolvem resistência ao fármaco pela sobre-produção da enzima alvo, DHFR, como resultado da amplificação do gene de DHFR. Se um segundo gene está ligado ao gene de DHFR, ele é normalmente co-amplifiçado e sobre-expresso. Sabe-se na técnica que esta abordagem pode ser utilizada para desenvolver linhas de células que comportam mais do que 1.000 cópias dos genes amplificados. Em seguida, quando o metotrexato desaparece, obtêm-se linhas de células que contêm o gene amplificado integrado em um ou mais dos cromossomas da célula hospedeira. O plasmido pC4 contém, para a expressão do gene de interesse, o promotor forte de repetição terminal longa (RTL) ao vírus do sarcoma de Rous :11 et al., Molecular and CellãláC Bieiocy 5: 438-447 (Março de 5 , mais c::s isolado do melhorador do gene precoce imediato dc citomegalovirus (CMV) humano íSoshsrt et ai., Cell 11; 521-530 (1985)). A jusante do promotor estão os gsqulhtss: únicos sítios ae cl.|.mf€S da enzima de ro::ú:.riráo que permitem a integração dos genes: BamHI,

Xbal e Asp718. Para além destes sítios de clonagem, o plasmido contém o intrão d* m o sítio de políadenilação do gene dá pré-pró-insulína de rato. Podem utilizar-se, para a expressão, outr&s promotores altamente eficientes, p3r exemplo, c promotor de β-actina humana, os promotores precoces e tardios de SV40 ou as repetições de terminal longo de outros retrovírus, por exemplo, TXM e VI de HTL. Os sistemas de expressão de genes Tet-Off e ?et-On da Clontech e sistemas similares podem ser utilizados para expressar o polipéptido de DM4, de uma forma regulada, em células de mamíferos (Gossen, M., & Bujard, H., Proc.

Natl. Acad. Sei. USA 89: 5547-5551 (1992). Para a políadenilação de ARNm, podem utílizar-se também outros sinais, por exemplo, dos genes da hormona do crescimento humano ou dos genes da globina. As linhas de células estáveis que comportam um gene de interesse integrado nos cromossomas, podem também ser seleccionadas após co-trar.sfecção com um marcador seleccionável, tal como, gpt, G418 ou higromicina. É vantajo-so utilizar mais do que um marcador seleccionável no principio, por exemplo, G418 mais metotrexâto. 0 plasmido pC4 é digerido com a enzima de restrição BartiHI e depois é desfosforilado utilizando fosfatos de intestino de bezerro por processos conhecidos na técnica. 0 vector é então isolado a partir de um gel de agarose a 1 %. A sequência de ADN gnç codifica o polipéptido completo é amplificada utilizando iniciadores de oligonucleótidos para RCP, correspondendo às sequências :;r e 3' da pdrçáo desejada do gene. 0 iniciador 5' contendo o sítio de BamHI sublinhado, uma sequência de Kozak e um codâo inicial de AUG, tem a seguinte sequência: 5' GCGGGATCCGCCATCATGGCGCCACCACCAGCTAGA 3' (SEQ ID NO: 10). O iniciador de/S contendo o sitio site, tem a

seguinte sequência: &<. GCGGGATCCTCACTCCAAGGACACOGCAGAGCC 3' {SEQ ID NO: 11) . O fragmento amplificado é digerido com a endonuclease BamHI e depois á purificado num gel de agarose a 1 %. O fragmento isolado e o vector desfosforilado, são então ligados com ligase de ADN de T4. As células HB 101 ou XL-1 Blue de £, coli são então transformadas e identificam-se as bactérias que contêm o fragmento inserido no piasmido pC4 utilizando, por exemplo, as análises de restrição de enzimas.

As células de ovário de hamster chinês a que falta um gene de DHFR activo, são utilizadas para a tranfecçao. Faz-se a co-transfecção de 5 pg do piasmido de expressão pC4 com 0,5 pg do piasmido pSV-neo utilizando o processo da lipofectina (Felgner et al., supra). O piasmido pSV2-neo contém um marcador seleccionável dominante, o gene neo de Tn5, que codifica una enzima que confere resistência a um grupo de antibióticos incluindo G418. As células são então semeadas em meio MEM alfa menos, complementado com 3 mg/mL de G418. Passados 2 dias, as células são tripsínízadas e semeadas em placas de clonagem de hibridorna (Greiner, Alemanha) em meio MEM alfa menos complementado com 10, 25 ou 50 ng/mL de metotrexato mais i mg/mL uo G418. Passados cerca de 10-14 dias, os clon.es isolados são tripsíní zados e sopoiu semeados em placas ae Petrí de 6 microtubos um frascos de 10 mL, utiiiuàndu diferentes concentrações du metotrexato (50 ndf 100 , 200 nM, 400 soíf 800 nM) . Os clones que crescem nas :cdnuuftttuçiSuu mais uiturtdUiU de mstuuuçn?:g:5;;:ÇÍif são estão transferidos para placas ae 6 microtubos contendo concentrações ainda mais elevadas de metotrexato (1 pM, 2 pM, 5 pM, 10 mM, 20 mMÍ . Repete-se o mesmo processo até se obterem clones que crescem a uma concentração de 100-200 μΜ. Analisa-se a expressão do produto ae gene desejado, por exemplo, por EGPA-SDS, análise de transferência do ántiaerpq/protelTsã para uma matriz imoilizada (Western) e por CLER de fase inversa.

I

Clonagem e Expressão do domínio Extracelular Solúvel de WÊ4::-Êtim de Expressão de Baculovíms A sequência de ADNc \; . ~ codifica c domínio extracelular solúvel da prccema de DM4 no clone depositado (n° de ATCC 97853) é amplificada utilizando iniciadores de oligonucleótidos de RCP que correspondem as sequências 5' e 3' do gene. 0 iniciador 5' para DM4 £·» a sequência 5' GCGGGATCCGCCATCATGGCGCCACGACCAGCTAGA 3' (SEQ ID NO: 10), contendo o sítio de restrição de enzima BamHI sublinhado. Inserido num vector de expressão, lai como se descreve a seguir, a extremidade 5' do fragmento amplificado que codifica DM4, origina um péptido de sinal de clivagem eficiente. Um sinal eficiente para a iniciação da tradução nas cdMIsã euçsiIccícác, conforme descrito por Kozak, J. o Biol. 196: 947-950 f está O irdei/Cdor para Mi tem a sequência 5'- nCGGGdTClTCAITIliTGlc 1 IciGCCIG -3' (SEQ ID NO: 12), contendo c. restrição de BamHI sublinhada seguida de nucleótidos complementares â sequência de nucieótidos de na figura i, seguido de um codáo de paragem. 0 fragmento amplificado é isolado a partir de um gei de agarose a 1 %, utilizando um kit disponível comercialmente ("Geneclean", BIO 101 Inc., La Jolla, Ca.). O fragmento é então digerido com BamHI e Asp718 e é novamente purificado em gel de agarose a 1 %. 0 vecror pâ2 é utilizado para expressar a proteína de DM4 no sistema de expressão de baculovírus, utilizando processos normalizados, tais como os descritos em Summers et al. r A Mãk&ãl of Methúds for Baculovírus Vectors and Insect Ce 11 Ckltum Procedures. Texas Agriculture Experimental Statíon Rulletin No. 1555 íilSli.. Este ¥#£fc0r de expressão contém o promotor forte de poli-hedron do ilru® de poli-hedrose nuclear californica Autograph (ACMNPV) seguido dos sítios de restrição convenientes. Para uma selecção fácil do vírus recombinante, insere-se o gene de beta-galactosidase de E. coli na mesma orientação que o o promotor de poli-hedron e & seguido pelo sinal de poliadenilação do gene de poli-hedron. As sequências de poli-hedron são flanqueadas de ambas os lados poi sequências virais para a recombinação de homólogos mediada por células com o ADN virai de tipo selvagem para gerar vírus viáveis que expressam o polinucleótido clonado.

Podem utilizar-se muitos outros vectores ie ittccladbnPí em lugar de pA2, tais como pAc373, pVL941 e pAcIMl desde que, como u ci evidente para os especialistas na matéria, essa providencie sinais para transcrição, tradução, tráfego « similares, localizados apropriadamente, ts.is como numa secção da 1111 e num péptido de sinal, tiyniorltíi necessário. Esses vectores estão descritos em et ai., Vlrolcgy 170: 31-39, entre outros. 0 plasmido é digerido com as enzimas de restrição Bam SI e depois é desfosforilado utilizando fosfatase intestinal de bovino, utilizando os processos de rotina conhecidos na técnica. 0 ADN é então isolado do gel de agarese a I % utilizando um kit disponível comercialmente ("Geneclean", BIO 101 Inc., La Jcõdux, Ca.). G fragmento e o plasmido desfosforilado, são ligados em conjunto com ligase CM ADN de T4. As células HB101 de E. coli são transformadas com a mistura de ligação e espalhadas nas placas de cultura, identificam-se as bactérias que contêm o plasmido ctm o gene de DDCR humano por digestão do ADN de colónias individuais utilizando BarnHI e depois analisando o produto da digestão por meio de electroforese em gel. Esta sequência dos fragmentos cloaados é confirmada pela sequenciação do ADW. Este plasmido e aqui designado por pBac DM4.

Faz-se a co-transfecção de 5 pg do plasmido pBac DM4 com 1,0 pg de ADN de um baculovírus linearizado, disponível comercialmente, ("ADN de baculovírus BaculoGold™", Pharmingen, San Diego, CA.), utilizando o processo da lipofectina descrito por Felgner et al., Proc. Natl. Acad. Sei. EUA 84: 7413-7417 (1987). Mistura-se I pg do ACN do vírus e 5 pg do plasmido pBac Giil num microtubo esterilizado de urra placa de míerolitros contendo 50 pL de meio de Grace isento de soro (Life Technologies Inc., Gtót.!»ra.fePr-g* MD). Depois adiciona-se 10 p.L de Lipofectina pius, 90 míerolitros de meio de Grace, mistura-se e incuba-se durante 15 minutos à temperatura ambiente. Depois a mistura de transfeeção é adicionada, gota a gota, às células de insectos Sf9 (ATCC CRL IVlJhf semeadas numa picos de cultura de tecidos de 35 mm com 1 mL de meio de Grace sem soro. A placa á agitada e mistura-se novamente com a solução recentemente adicionada. A placa é então incubada durante 5 horas, a 27 °C. Passadas 5 horas, a solução de transfecção # retirada da placa e adiciona-se 1 mL de meio de insectos de Grace, complementado com soro bovino fetal a 10 %. Volta a por-se a placa num incubador e a cultura continua a 27 °C, durante 4 dias.

Passados 4 dias, recolhe-se o sobrenadante e realiza-se um ensaio da placa, conforme descrita por Summers e Smith, citadcs antes. Utiliza-se um gel de agarose com "Blue Gal" (Life Technologies Inc., Gaithersburg, MD) para permitir uma fácil identificação e o isolamento dos clones que expressam gal, que produzem placas coradas de azul. (Pode-se encontrar uma descrição detalhada de um "ensaio de placa" deste tipo, no guia do utilizador para as culturas de células de insectos e baculovirologia distribuído por Life Technologies Inc., Gaithersburg, MD, paginas 9-10) . & aqui por V-DM4.

Quatro dias depois da diluição em série, adiciona-se o vírus às células. Depois de uma incubação apropriada, as placas coradas de azul são picadas com a ponta de uma micropipeta de Eppendorf. O agar ccntendo os vírus recombinantes é então novamente suspenso num tubo de Eppendorf contendo 200 pL de meio de Grace. Retira-se o agar por meio de uma centrifugação breve e utiliza-se o sobrenadante contendo o baculovírus recombinante para infectar as células Sf9 semeadas em placas de 35 mm. Quatro dias mais tarde, os sobrenadantes dos pratos destas tuitbrèo são colhidos e aepois são armazenados a 4 °C. Um clone contendo o DM4 inserido apropriadamente ê idSdlfiribáãd por análise do ADN iOdldiEdO o mapeamento ae restrição e a sequenciação. É

Faz-se crescer células Sf 9 em meio de Grace complementado com SBF a 10 I inactivado pelo calor. As células são infectadas com o baculovírus recombínante V-DM4 com uma multiplicidade de infecção ύύύΚύ'ύ de cerca de 2 (cerca de 1 até cerca de 3). Seis horas mais tarde, o meio é eliminado e é substituído por meio SF900 II menos metionina e cisterna (disponível na Life Technologies Inc., Gaíthersburg, MD). 42 horas mais tarde, adiciona-se 5 pCi de -^S-metionina e 5 pCi de 35a~cisteína (disponíveis na , ... As células são

Amersham) depois Incubadas durante 16 horas e depois são colhidas por centrifugaçâ faz-se a respectiva lise e visualizam-se as proteínas marcadaç por EGPA-SDS seguida de autoradiografia.

Exemplo 4

Distribuição ao Tecido da Expressão do Gene de DM4

Realizou-se a analise de transferência de ADN/ARNm para uma matriz imobilizada (Northern) para examinar a expressão do gene DM4 (ATCC No. 97853) em tecidos humanos, utilizando os processos descritos, entre outros, por Sambrook et al., citado antes. Marcou-se uma sonda de ADNc contendo toda a sequência de nucleótidos da proteína de DM4 (SEQ ID NO: 15 com 32P, utilizando o sistema de de ADN com redíprime™ ?Α;ϊαrcfam Life Science) , de acorda com as instruções do fabricante. Depois da marcaçao, purificou-se a sonda ot.·! il uma coluna AHAOdA SPIN-100xM (Clontech Laboratories, Iiaav t Se acordo com o número PT1200-1 do protocolo do fabricante. A sonda marcada, purificada, foi ontSo utilizada para examinar vários tecidos humanos quanto ao ARNm de DM4.

As manchas ae Northern em múldip-lc:* tecidos CtfSfú# contendo vários tecidos humanos (H) ou tecidos do sistema imunitário humano (IM), Foram obtidas da Clontech e foram nxutincmac com sondas marcadas, utilizando a solução de hmiidiçâo í:••l/b''" (Clontech) , de nmordd com o número PT1190-1 do protocolo do fabricante. No seguimento da hibrid&çâo e da lavagem, montaram-se as manchas e expôs-se o filme a -70 sCf durante a noite e revelaram-se os filmes de acorao com processos padrão. Detectou-se a expressão de DM4 cm tecido enriquecidos com lirréoitòr incluindo células oir·. 1 5 c i c r s, no coração, cancro do fígado, rim, leucócitos do sangue periférico, células T aotivadas, células K562 plus PMA, W 138 cenç, Th2, amígdalas humanas e cordão umbilical com falta de CD34. Pode-se verificar que DM4 desempenha um papel na homeostase de linfócitos.

.Ssassplo S

Apóptose Induzida por IM4 A sobre-expressão de Fas/APO-1 e R de FNT-1 em células de mamíferos simula a activação do receptor (M. Muzio et al., Cell 85: 817-827 (1996); Μ. P. Boldin et al., Cell 85: 803-815 (1996)). Assim, utilizou-se este sistema para estudar 0 papel funcional de DM4. A expressão transiente de DM4 em células humanas MCF7 do carsinoraa da mama e células 293 do rlís embriónico humano :Ladb;airtiíí uma rápida apóptose.

Os ensaios de morte das células foram realizados prâticomênto como foi descrito antes (A. M. Chitipndprm et a?., Cell 81: 505-12 (1995); M. . Boldin, et al., J ãiúl Clim 21(k "7 31 - :·; (1995); E'. C, Kischkel, 1·,, IMíi? 14: 5579-5588 (1995); Λ. M. Chinnaiyan, et al. , J

Chem 271: 4961-4965 (1996)). Em resumo, fez-se a transfecção estável de linhas de células clonais do carcinoma da mama humana MCF-7 quer apenas com vector ou com uma estrutura de expressão ae CrmA (li, Tewari, et aí?., J. Biol CieSS 270, 3255-60 (IBAS) 1# que foram transfectadas de forma transiente com pClht-Dvi·" galactosidase (ou pCMV-DM4-galactosidase (a que falta o domínio de morte) ) na presença de um excesso de 10 vezes das estruturas de expressão de pcADN3 que codificam as proteínas indicadas, utilizando a lipofectamína (GIBCG-BRL) . Transfectaram-se do mesmo modo células 293 utilizando o processo do , Adiciona-se as células o inibidor da família dos ICE z-VAD-fmk (Enzyme Systems Products. Dublin, CA) e fixa-se e cora-se com X-Gal como foi previamente aescrito (A. M. Chinnaiyan, et al., Cell) 81, 505-12 (1995); Μ. P. Boldin, et al., J Biol Chem 270, 7795-8 (1995); F. C. Kischkel, e al., EMBC 14, 5579-5588 (1995)).

As células exibiram alterações morfológicas típicas das células que sofrem apoptose, tornando-se arredondadas, condensadas e destacando-se do prato. Do mesmo modo que com o R de FNT-1 e com Faz/APO-1 (M. Muzio, et al., Cell 85, 817-827 (1996); Μ. P. Boldin, et al., Cell 85, 803-815 (1996); M. Tewari, et al., J Biol Chem 270, 3255-60 (1995)j, a apoptose induzida por DM4 foi bloqueada pelos inibidores de proteases semelhantes a ICE, CrmA e z-VAD-fmk.

Será claro que a presente invenção pode ser praticada de faxfeâ diferentes da que esta descrita em forma particular na descrição e nos exemplos anteriores. REQUERENTE: Ni, Jían

Rosen, Craig A. Pan, James G. Gentz, Reíner L. Dixit, Vishva M. TÍTULO DA XNVENÇ&O i Receptor 4 Contendo o Domínio de Morte ENDEREÇO PARA CORRESPONDÊNCIA: (A) ENDEREÇO: Human Genome Sciences, Inc. (B) RUA: 9410 Key West Avenue (C) CIDADE: Rockville

(D) ESTADO: MD

(E) PAÍS: EUA (F) CÓDIGO POSTAL: 20 8 5 0 FORMA LIGÍVEL EM COMPUTADOR: (A) TIPO DE MEIO: Floppy disk

(B) COMPUTADOR: Compatível com IBM PC

(C) SISTEKA OMRjTflvO; PC-DOS/MS-DOS u'0 SOFTWARE: Patentln Release #1.C,

Versão #1.30

m NÚMERO DO PEDIDO DE PATENTE DE mvEoçõô:· as (B) DATA DE REGISTO: 28 de Janeiro de i 9 9 7 (C) CLASSIFICAÇÃO: (A) NOME: BROOKES, ANDERS A. (B) NÚMERO DE REGISTO: 36.373 (C) REFERÊNCIA/NÚMERO DE ETIQUETA: PF355 i L:H:IN FURIClçAO JulHo ALíARLãOíN gAvAÇuLá : (A) TELEFONE: (301) 309-8504 (B) TELEFAX: (301) 309-8512 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID N°. 1:

OÀRÃwEEl.Sf1CAS OA OEÇÚêÚC’íÃT (A) COMPRIMENTO: 2152 pares de bases (B) TIPO: Ácido Nucleico (C) ESTRUTURA HELICOIDAL: simples (D) TOPOLOGIA: Linear

ÃVi NOME/CHAVE: CDS (E) LOCALIZAÇÃO: 19..1422 (xi: descrição m mmÈmiHt seq id n°. 1:

TTCGGGCACG AGGGCA3G ATG GCG CCA CCA GGÃ. GCT AGA GTA CAT CTA GGT

Μ'. TM MT MC M TM T.;M CMT. T:M

GCG TTC CTG GCA GCG ACT CCG CCC GGG AGC GCA GCG AGI GGG KCA

Ala Fen Leu Ala Vai Tre Prc Asn Pro Gli Ser .ala. Ale Ser Gli Tre 15 23 35

CAC GCG. MCCC CCC CC1. CTC COT ATT OCO· .. C .: CAG 'CGT TC . COT: GlGG

Glu Ai a Ala Ala Ala Ire Pro Ser Lia Vai Trp Gli Ser Ser Ala Gli 30 35 40 AGG ATT GAA CCA CGA GSC GGG GGC CGA GGA GCG CTC CCT ACC TCC ATG Arg 11 e Glu Prc Arg Gil Gli Gli Arg Gli Ala Lm Pro Tre Ser Met 45 50 55

GGA CAG CAC GGA ITT; AGT GCC CGG GCC CGG GCA ·. . CSC CCT MA CCA

Gli Gin His Gii Pro Ser Ala Arg Ala Arg Aia M* Arg Aís Aí* SM E3 65 70 75

CCC AGG SCG GCG CGG GAA GCC EGC CCT CGG CTC CGG GTC CAC AAG ACC

Pro Arg Pro Ala Arg Glu Aia Ser Ms; AçA Leu Arg Vai His Lis Tre

80 85 9C

TTC AAG TST GTC GTC GTC GGG GTC CTG CTG CAG GTC GTA CCT AGC TCA

Fen Lis Fen Vai vai Vai Gli Vai Leu Leu Gin V«i Vai M& Ber Ser 35 100 135 GCT GCA ACC ATC AAA CTT CAT GAT CAA TCA ATT GGC ACA CAG CAA TGG Ala Ala Tre Ile Lis Leu His Asp Gin Ser Ile Gli Tre Gin Gin Trp H0 115 120 GAA CAT AGC CGT TTG GGA GAG TIG TGT CCA CCA GGA TCT CAT AGA TCA Glu Eis Ser Ero Leu Gli Glu Leu Cis Pro Pro Gli Ser His Arg Ser 125 130 135

GAA CGT CCT GGA GCC TGT MCI CGG TGC ACA GAG GGT GTG GGT TAC ACC

Glu Arq M* Gli Ale cis Asn Arg Cis Tre Glu Gli Vai Gil Tir Tre 14C 143 i50 Ml

MT MT ITT AM AM CCT CTC CC*- rso CCA TGT ACA GCS TGT AAA

Asn Má Ser Asn Asn Leu Fen Ais; cis ICC Pro Cis Tre Ale Cis Lis HO 165 170 i 6 0 105 CCA CAC CAA CAA GAG AGA AGT CCC TGC ACC ACG MT AGG AAC ACA GCA Ser M« Glu Glu Glu Arg Ser Pro Vis Tre Tre Tre Arg Asn Tre Ala 175

GCT GAG

TGC M CCA GGA ACT TTC CGG AAT GAC MZ TCT

Cis Gin Cis Lis Prc Gli ire Fen Άϊ'ϊ te Asp Asn Ser Ala iOO.42 Met 195 :3-0 0 .«λ.:.; a: -0.0..:0 -0.0-:· v·:··:·

033" Ο'Ο'Ο .3-30 2:3:3 TG3 3410 -233 3300 GAG TGT GTC CAC 33:3: GAA 2:-233 TOOO A.sp SOO;: A:;':? 3 2-:3 Jtç G«r Asp lie Glu Cis Vai Hís Lis G:u Ser Gll 220 225 230 235

AM GGA. 03:,2 3,003 00:3;. 003 OvG 0302 ίΐ'ΟΟ .3202 222 GTT GTT CCG A.íO Glí Hís Asn Ile Trp Vai lie Leu V*l Vsl Tre Leu 'Cal Vai Pro

240 245 250 2 22 : 0204 2200 OTOOO 332 00201 0232 323 GTC TGT TGT TGC ATC GGC TCA GGT 0-Í442 Leu :,-3:34 00:4 2 34.0:3 Vai Leu Ile Vai Cis Cis Cis I 1 e Gli Ser Gli 255 263 265 TGT GGA GGG GAC CCC AAG TGC ATG GAC 2.22 GTG TGT TTC TGG CGC TTG Cis Gli Gli Asp Pro Lis Cis Met Asp Arg Vai Cis Fen Trp Sí 23' Leu 270 275 2 R 0 3233 3-3-3- C3-:% CGA :322 CCT GGG GCT GAG GAC AAT GCT CAC AAC GAG AOr 40.4 44 2:.:344 0:434 ArCf Glí Pl'0 Glí Ala Glu Asp Asn Ala Hís Asn Glu Lie 285 290 295 10220 :3233 voo: :Í22 3302 GAG CRG 02.0 ATG

Leu Ser Asn 0:0:4 Asp Ser Leu Ser Tre Fen Vai Ser Glu Gin Gin Met 3 0C 3 0 5 310 0:15 :3:00, 3033 23:0 G3:0 0333 OVOO- -00.3 TTG 3033 0:323 GTC AC” TCC 0:0:3. 2.0,: :3.4:2- :2234 ::::2 43 ϊτν 3:,04: AsP Οι-,:, 2 404-: Oi 2 OOsO Tre OOor Pro 020 330 330

CTG ATG CTS "'"C x-TT GAC AAG TTT GCA AAC ATC GTG CCC ITT CAC TCC :;.βϊί. Met Fen Asp L.í s Cte Ai a Asn Ile Vai Pro Fen Asp Ser 365 37Q 375 1:¾¾ SC CT;C :'te ATI tel IA·:· CTG Ie CTC ACG ASA AAG GAG ATC GAT T;ffc Ate δ1:& ter mt Arg Gin Leu Asp Leu Tre Lis As» Glu lie jlsip 383 385 390 395

Ite MA 1:CT GGT KL GCA GGC CCA GGG GAT GCC TTG TAT GCA ATG 73·;: tei Arg Ala Gl.i. Tre .«U Gli Pro Glí Asp; Ale Leu Tir .te; Ae-r :1-:1¾ Ite ASA TGG GTC teU tel Trp AiSl 415 •te: ilft 1299 ..SC A.S.S ACT GGA CGG M.C GCC TCG ATC CAC ACC :SS Lis Tre llll Arg Asn Ala Ser Ile 111* Tre 420 425 Í347 CTG CTG GAT GCC TTG GAG AGG AIG GAA GAG AGA CAT GCA AM GAG MS Leu te;. Asp Ala Leu Glu Arg Met Glu Glu .¾¾ His Aia Lis Glu Lis 430 435 440 1335 ATT CAG GAC CTC TTG GTG GAC TCT GGA AAG TTC ATC TAC TTA GAA GAT Ile Gin Asp Leu Leu Sis;; Asp Ser Gli Lis Fen Ile Tir Leu Glu Asp 445 450 455

GGC ASA GGC TCF GCC GTG TCC TTG GXG IteíitetevC ITTTTACCAG

Gli Ire Gli Ser Ala Vai Ser Leu Glu i 6 0 465

AGGTTTCCTC AGGCTGÃCGC TCGTltetel GTGTGCCATC TTAGGTGTTAteLtetelC CGGTGGATCC GCCCGTCTTTícivrccc;:';·:·;? ·:x ·Μν·::.·'·,···:·\;·ν···· TCCGACAGAC caaOteSCÍÓ':. GGAGTTAATA CATATTAGGT ttttTTTTTT TTTAACATGT CACGTGTATT GGCTCCTGCC TGTAATCCCA TCACTTTGGG ACTTGAGGTC CGAAGTTCCA AGACGAGCCC TGAACCAACA TAíl;te:Aíí.AK rtelltete Itetelltel ITteltellT CTAACTACGG GAGGTCTGAG GCCAGGAGAA TCCACTTGAA ACTGCAbATT ’ΐ\:''ί· G 1'vG·:Gv!iG;'" '·'::GxGA?v!-.-"G''G iffiGAteRà ATteLTlTIllL ItelteTteri ilCCílteCTte. mcmsz· tct teiteteCT MteLteiTí; tstttctcts TlTillíteini: Itelteltel 111/:11111711:1 rTlTlTlTGw llltelteteC ΟΙϊίΙΤΐΙΙΙΙΤΙΤ TlteAlltell liil

Ml 11¾¾ Itelltelltel .¾¾¾¾¾¾¾¾¾¾

·' 'a ':· ou ;>.::··-Αρ· :g; pa ·;:· ν'νρ >' ::··-';0. ον ;·\56 ·'-·;' Í0::;Á;;,v' -¾ > (A) COMPRIMENTO: 468 aminoácidos 05 TIPO: aminoácido (D) TOPOLOGIA: linear (iij TIPO CE MOLÉCULA: proteína (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID N°. 2:

Met Ala ítí:·· Pro Pro Ala Arg Vai His lo:l; Gli Aia Fen Leu Ala Vai 1 ... iO 15

Tre Pro Asn Pro Glí Ser Ala Ala Ser Gli Tre Giu Ala Ala Ala Ala 20 15 30

Tre Pio Ser Lis Vai Trp Gli Ser Ser Ala Gli Arg Ile Glu Pro Arg 35 40 45

Gli Gli Gli Arg Gli Ala Leu Pro Tre Ser Mer. Gli Gin His Gli tro 50 55 60

Ser Ala Arç Ais Arg Ala Glí Arg Ala Pro Gli Fro Arg Pro Ala Arg 63 70 75 80

Glu Ala Ser Pro Arg Leu Arg Vai Eis Lis Tre Fen Lis fen Vai Vai 05 90 95

AiV Ser Glu Alg Lro Gli Ala 135 130

ras ιιθ,η nsa ajj, nrg aji 0,::1¾¾ ~ T [f-r-χ ;j;?w ~ T oz£ ειε οτι εεε o-ia ηχ3 υχ3 isc k··^ sâi; uxg «'ja ias "«a usj saj, ~ a hk Ias εεε ;χγ T¥á ηθχ asa na: QSã SH: ?:ã ΤΕΛ na? aaj, χ:χ.;·:. τβλ neq; s ; ........ ... ... ...,_ :: :-y χχ ·:-: ::· ^.;:::· ^

Asp Lis ten 370

Ai a Asn lie Vai Prc Fen Asp Ser Trp Aso Gin 375

Leu Aél 38 0

Arg Gin Leu Asp Aw Tre Lis Asn Gin 1L s: Asp LA; 1 Vai AxA 385 390 395 ire Ala Clii Α:;··ν· nii Asp Ala Leu Tir Ale Met Leu Me. Lis 405 413 415

Asn Lis Tre Gli Ar-s Asn Ala Ser 11 e His ire Leu Leu Asp 420 .íps 4 30

Glu Arg Αχ;: Glu Glu Arg Bis Ala Lis Glu Lis Ile Gin Asp 435 440 445

Vai Asp Ser Gli Lis Fen Ile Tir Leu Glu Asp Gli. Tre Gli 450 455

Vai Ser Asn A;Vj 465 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID N°, 3: ÍÃJ COMPRIMENTO: 669 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) ESTRUTURA HELICOIDAL: simples CP;i TOPOLOGIA; linear

Trp Vai

Ala Leu

Leu Leu

Ser Ala 4 60

Arg Leu Ser Ser Lis Ser Vai Asn Aia Gin Vai Tre Asp ile Asn Ser 20 25 30 L:;.s GUI lAV Glu a-çn Arg pis Tre GGvG Tre Trv GAl Glu OAs νΟη 1.00: 35 40 45 ép Gin III Asn lis Hís Asp Glí Gin Fen Cis HIs Lis Pro Cis ?ro 50 AS 60

no 0 00 GOAv Aiv: Lis AO. n Arg Asp Cís Tre Vai Asn OOli. Asp I: Pro 65 71 15 8 C

Lis Cis Arg Ara Cis Arg Iaaè ãls Asp

Leu Glu Vai Glu Ile Asn Cis Tre Arg Tre Gin Asn Tre Lis Cis Arg 1i 5 120 i25

Cis Lis Pro Asn Fen Fen Cis Asn Ser Tre Vai Cis Glu His Cis Asp 130 13Ό 140

Ouro C;;v OOrs Lio Cis GOLu His Gli Ile Ile Lis Glu Cis Tre Leu Tre 145 150 155 160

Gvr Asn Tre Lis Cis Lis Glu Glu Gli Οντ Arv Sei Asn Leu Gli Trp 165 170 175 :0*v Οηηη GG«G. ΟΑν Gnu Osv Lis 0010 I e ire Gvuí Ile Aia Gli 0005 230 240 93 'Τ';.'··:: Ai;; S-ííí:· Gin Vai Lis 31.1 Fen VAI Arg Lis Asa 11 i Vãl Asn Glu 250 245 5,s" Sl.5.·; He Lis Ai:; Asp -Asn Vai Gin Asp Tre A. As Glu

2 65 HO

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Arg Ai::;. Trp Ris Gin Leu Hís Gli 1..1:5:: .1. 283 285

Ire Leu Ala Ã:.'í.Lis lie Gin Tre Ile II.i Leu Lis Asp lie Tre 0'·;;; 305 310 315 320

Asp Ser Glu Asn Ser Asn Fen Arg Asn Glu Ile Gin Ser Leu Vai Met 325 330 335

Leu Gli Ile Trp Tre Leu Teu Pro Leu Vai Lei: Tre Ser Vai Ala Arg 340 345 353

Leu Ser Ser Lis Ser Vai Asn AIa Gin Vai. Tre Kwp Ile Asn Ser Lis 355 360 365

Gli Leu Glu Leu Arg Lis Tre Vai Tre Tre Vai Glu Tre Glu Asn Leu 370 375 380

Glu Gli Leu His Eis Asp Gli Gin Fen Cis His Lis Pro Cis Pro Pro 385 ;;9V ".·.'.··: 4 00

Gli Glu Arg Lis AIv Arg Asp Cis Tre Vai Asn Gli Ai;; Glu Pro Asp 405 . !I: 415

Prc C:J.i TI;.:; viv ftli Ais 13.0 Tír ire Asp Lis Ala Hís Fen 420 425 94

Lis Prc Fen Fen Cis Asn Ser Ire Vai Cís Glu His 465 470 475

Cis Asp Fro 480

Cis Leu Leu Leu Leu Pro 11 e Pro Leu ile vai W1 Lis 515 520 525

Vai. Gin Lis ire Cis Ar; Lis His Arg Lis Glu Asn Gin 550 535 340

Glu Ser Pro Tre Leu Asn Pro Glu Tr e Vai Ala Ile Asn 545 550 555

Vai Asp Leu Ser Lis Tir Ile Tre Tre Ile Ala Gii Vai 565 570

Ser Gin Vai Lis Gli Fen Vai Arg úis Asn Gli Vai Asn

Ile Asp Glu Ile Lis Asn Asp Asn Vai Gin Asp Ire Ai 595 600 605

Vai Gin Leu Leu Ar/p Asn Irp Hi.s Gin Leu Lis Gli Lis 610 615 620

Tre Leu ile Lrs Asp Leu Lis Lis Aia Asn

Ar; Lis Glu Gli Ser Hrs Leu Ser Asp 560 . Met Tre Leu 575 Glu Ala Lis i Glu Gin Lis Lis Glu Ala Cis ire Leu 625

63G 635 640 .···' ··>. >·· ·\ -'v w λν >·; ·<> : : ·ν. ,·.ν.·.χ %χ i UrUar Τη·η>Α (A) COMPRIMENTO: 909 aminoácidos (B) TIPO: sssinDáAilfe (C) ESTRUTURA HELICOIDAL: simples 00) TOPOLOGIA: linear

Ο λ "L v aa Pro Asp Leu Leu Pro Leu Vai Leu Leu Gru

Lsà. Pro S i s 30

Lii'U Vsl Glí lie T.i. r Pro Ser G1L vai 11 e 20 25

Leu Gli Asp P.rg Glu Lis Arg Asp Ser Vai Cís Pro Gin Gli Lis Tir 35 40 45 I 1 e His raas Gin Asn Asn Ser Ile Cis Cis Tre Lis Cis ;íns? Lis Gli 50 55 60

Ire Tir Leu Tir Asn Asp Cis Pro Gli Pro Gli Asp Tre Asp Cis Arg 65 73 05 80 PL;::, Cis Glu Ser Gli Ser Fen Tre Ala Ser Glu Asn His Leu Arg Eis 85 90 95

Ser Ser A;s Tre Vai Aaa:> Arg Asp Tre Vai Cis Gli Cis Arg Lis Asn 115 05 125 rre Vi:A. His Leu Kea Cis Gin Glu Lis 160 150 96

Asn Tre Vai Cís Ire Cis BLs .1.1¾ Glí Fen ?en Leu All Glu Arr 65 170 ΙΟΙ

Ire Cis Ser Asn Cis Lis Lis Ser Isu :1.1¾ Cis Tre Lis; Leu 180 735 190 lAL Ler íLii Lie 111 Leu 1¾¾ Tir Arg Tír Gin Arg Trp Lis Ser Lis 225 230 235 240 1 .ir

Lei Cís Glí Lis Ser Lisls Pro Glu Lis 1.1:,; Lii 245 250 255

Leu Glu Gli Tre Tre Tre Lis Pro Leu Ala Pro Asn Pro Ser Fen Ser

260 265 27C

Pro Tre Pro Gli Fen Tre Pio Tre Leu Gli Fen Ser Pro %! Pro Ser 275 280 285

Ser Tre Fen Tre Ser Ser Ser Tre Tir Tre Pro Gli Asp Cis Pro 1¾¾ 290 295 300

Fen Ala Ala Ero Ar;;? Arg Glu 'Ari Ala Ero Pro Tir Gin Gli Ala Asp 305 310 315 320

Pro lie Leu Ala Tre Ala Leu Aia Ser Asp Pro ile Fro Asn Pro Ler 325 ?:3C 335

Tre Glu Asp ler Ale Hís Lis Pro Air Ser Leu A.ep Tre Asp .ο··: U eie: 3r;9

Arg ;.·· Air Lai Gli'i Asn Gli Arg Crs Leu Arg Glu Ma Gin Tír Ser 383 390 395 400

Met Leu Ala Tre Trp Are Arg Arg Tre Pro Arg Aeg 1.1¾ Ala Tre Leu 405 410 415

lie Gli Leu Vai Pro Hís leira Gli .1 aArg Alo Lis Arg Arja Ser vai 465 490 495

Cis Pro Gin Gli Lis Tir I1e Hís Pro Gin Asn Asn Ser 11c Cis Cis seo 505 510

Iro Lis Cis Hís Lis Gli Ire Tir Len Tír Asn Asp Cis Prc Gli Prc 515 520 525

Cis Arg Glu Ara Glu Ser Gli Fen Tre Ala soo 535 540

Ser G.A; Asn Kis Lare Arg Eis Cis Leu Ser Cis Ser Lis Cis Arg IA 54 5 5 50 «s Si

98

Hís Leu Ser Cis Gin Glu Lis Gin Asm Tre Vai Lia Tre Sis Vir ALO 615 623

í:. 11- CAAí: Lis Leu Cis Leu Pro Gin ~ le Glu AAL 645 650 655 Ái Ti* Glu Asp Ser r : T Tre Tre Vai lãá Leu Pro Leu ALs* 660 665 670 Aís* Gli Leu ,x : Leu Leu Ser Leu Leu Fen 11 e Gli Leu Met 675 683 683

Ser Tre Pro Gin Lis Glu G1I Glu Leu Glu Gli Tre Tre Lre Lis Pro

Ala Pro Asn Pro Ser Fen Ser Prc Tre Pro Gli Fen Tre Pro Tre 725 730 733

Gli Fen Ser Pro Vai Pro Ser Ser Tre Fen Tre Ser Ser Ser Tre 740 745 753

Tre Pro Gli Asp Cis Fro Asn Fen Aia Ala Pro AVã Arg Glu Vai 'M 76% 765

Ala Pre Tis Gin Gli Aia Asp Pro lie Leu Ala Tre Ala A-%* Aia 780

Ser A:í::v· Pro j. 1 e Pro Asn Prc Leu Gin Tis Trp Glu Asp Ser Alá Hís T 90

Tre Asa Asp Pro 810

Tre Lãa Tír A7* 815

99

Leu Ksq Glu Ala Gin Tir Ser Met Leu Ala Ire Grp Arg Ang Ar9 853 MM 860 865 :MM 875 880

Asp Met AííP IM:M Leu Gli Cis Leu Glu Asp riu Glu Glu Ala Leu Cis 883 890 895

Gli pro Ale Ala Leu Lro Pro Aia ?ro Ser Leu Leu Arg 9 00 3 0: 5 (2) IPíitsAMâGMO PARA A SEQ ID N°. 5: (A) COMPRIMENTO: 833 aminoácídos (B) TIPO: aminoãcido (C) ESTRUTURA HELICOIDAL: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ií) TIPO DE MOLÉCULA: proteína U.U DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID N°. 5:

Met ala Gin Arg Prc Arcr Gli Cl3 Aid. Ala Val Ala -Cl a Ala Leu Leu 1 5 10 15 Leu Vai Leu Leu Ala MM A la Gin Gli Gli Tre Arg Ser Pro M;-g 20 25 30 íeíp Cis AI a Gli Asp Fen ;lò s ±J-LS Tle Gii Leu Fen Cis Cis 35 4G 4:5 Arg LM Cis Pro Ala Gl.ij MM: MM.. Lis Ala Pro T r ^ Pro SO 60 LIS Gii Asn Ser 1 r θ Cis Leu vai M.í: Pro Gin Asp Tre Fen Ala 65 73 "7 cs 80 l ·:· >,· Glu Asn LM ;Mí: Asn S e i Glu Ll a Are Gin Ala Cís Asp 8 a 9G 95 D la Gin 11 a Ser Gin Val LM; M.a Asn Cis Ser Ai a vM •Cl a Asp 105 d -.1 o 'ire A r ç M _L S Gli Cis Lis Pro G7 4 Trp Fen Ci 1 Ma C ;i .1 1'Ll ii 5 120 L25 Cis Vai Ser Ser Lia;: Pro Fen Cir Cis Gin Pro Cis Asn 13C 135 140 GLL Ala Arg His Tre A.rg Leu Leu Cis Ser Arg Arg Asp Tre 145 159 T>:, 160 Asp Cis Glí Tre Cis Pro íli 3. Fen i à V. Cl CL His c Asp Glí Γ ·: :·:· 155 113 IS c Ví:.· Se- Cis Pro MíA Ser Tre iirT Gli Ser Cis Pro Arg í»1S Λi a 180 195 190 vai Cis cu Trp Arg Gin fel. Fen Trp Vai Gin Vúi Leu ueu Ala 195 200 205 :.-0:.: vai Cal Pro Leu Leu Leu Ci.; i Ala Tre Leu Tre Ti';: 31.0 215 220 Srií His Cis Trp Pro His Lis Pro Leu Val ire Aió Asp Glu PA a Gli 230 i35 240 iv:.:· v Glu Ai a Leu Tre Pro Pro Pro Ala Tre His Pro Asp 245 250 255 Ala His Ire Leu Ala Pro Pro Asp Ser Ser Glu Li:, Ile Cís 260 2 65 270 Tre 71; 1 Gin Leu vai T-i i Asn Ser Trp Tre Pro Glí Tir Pro Glu Tre 275 L00 285 Gin Glu Ala Leu Cis Gin lAl Tre Trp Ser Trp A.sp 1-1 £0 Leu Pro 290 295 3C0 Ser Aílf Ala Gli Pro Ala Ai a A.la Pro Tre leu Ser Pro Glu Ser 305 310 315 320 Pro T l a Gli Ser Pro Ai a Met Met Leu Gin Pro Gli Pro CM π Tir 325 330 335 Asp Val Met Asp Ala Val Pro Ala Arg Trp Lis Glu Fen Val Arg 343 345 350 õps Leu Gli Leu Arg Glu Ala Glu ile Glu Ala Val Glu Yii: i Glu Ile i;;:s 360 365 Arg Fen Arg Asp Gin Gin Tir Glu Met Leu Lis Arg Trp Arg Gin 373 375 380 51::: Gin Pro Ala Ti ϊ Leu Gli >>.T a y.v. 4 Tir A?a Ala Leu Glu Arg :s<a: 390 395 400 3'i.i Leu Asp G1 i. l:i.a Val Asp Ϊ.Α·;; Argi Ser Arg Leu Gin Arg Glí 405 410 415 Cís Αί'ίϊ i Cis Pro Ala rli i Pir Leu M:.;: Ale aro Cl

Pro Cís Gli Asn Ser Tre Cis Leu Vai Cís Frc Gin Asp Tre Pen Ala 485 490 095

Ala Tos Glu Asn Kís His Asn Ser CIu cis ALO: Arg Cis cis Ais Cís 505 5iS Asp Glu Ala Ser Gin Vai Ala Leu Cli Asn Cis Ser Ala Vai ATa Asp 515 52C 525 To;:; AAs Cis Lii Cis Lis Pro Gli Trp Fen Vai Glu Cís Gin iCií Lao 530 535 540 Cis. Cis vai Ser Las Ser Pro Fen Tir Cís Gin Pro Cis Leu Asp Cis 545 550 555 563 Gli Ais Leu His Arg His Tre Arg Leu Leu Cis Ser Arg Arg Asp Tre 565 SLD 57 5 Asp Cis Gli Tre Cis Leu Pro Gli Fen Tir Giu His Gli Asp Gli Cis 580 585 590 Vai Ser Cis Pro Tre Ser Tre Aac Gli Ser Cís Pro Glu Arg Cis Ala 595 600 605 Ala Vai Cis Gli Trp Arg Gin Met Fen Trp Vaí Gin Vai Leu Ala Ala 610 615 620

Llu Vsl Vai Pro Leu Leu isi Gli Ala Tre Las Ass· 625 630 635 640 èr« ale OL s TAL ΡΑΑ: í: i ii Air Arp Lac Vci a···:·* Ala Aso Glu Ala Gli 645 650 go5 t Glu Ala Css Tre pro Prc Pro Ais Tre His Leu Ser Pro 660 665 6/0 Ser Ais His Tre Lao; Leu Aaa Pio Prc Asp Ser Ser CL:> i,ϊ s Hl Ai;; 675 685

Trp 105

Leu Cis Pro Gin Vai Tre Trp Ser Trp Asp Gin Leu l::** 111:1 "51 72:1

Ser Arg Ale lei Gli Pro Ala .11 a Ala Pro 1::-0 l*s; Ser A::--* A;; l.:** 725 130 735

Pro Mã Ali Ser Ero Ala Met Met Leu 1:.:,0 pro 1-1:5 7 4 5

Asp Vai Met Asp Ala 51::7.. Pro Ala Arg Arg Trp Lis lia Fen lei. An lii; 7 60 7 65

Tre Lee Glí Leu Arg Glu Ala Glu lie 51,1 11« 1 77 3 '.'75 7 8C!

Glí Arg Fen Arg Asp Gin Cln Tír Glu Met Leu Lis Arg Trp lei Gin

785 790 7is 8QC

Glu Glu Pro 11* Gli Leu Gli Aia Vai Tir 11* lie Leu Glu 1*1 Alt 805 810 815

Gli Leu Asp Glí Cis Vai Glu Asp Leu Arg Ser Arg Leu Gin Arg Gli 820 825 830 (2) INFORMAÇÃO 11*7* A SEQ ID N°, 6: (A) COMPRIMENTO: 426 pares de bases (B) TIPO: ácido rmcleíco ilO ESTROTU&A HELICOIDAL: simples (2) FMà A SEQ ID N° . 7: (A) COMPRIMENTO: 339 pares de bases (B) TIPO: ácido nucieico (C) ESTRUTURA- HELICOIDAL: simples (Dj TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genófflico) (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID N°. 7:

TGGGGCTGÃG a»®S ACNACGAGAS TCCGAGCAAC OIWAAOR

AGCCCCCAGG G3AGGCACAG TGTCTCCTGG TGAGTTGGGG ACAGGCCCTT CARACTERÍSTICAS DA ΙΐϊίΙϊόΝΟΠΟ (A) COMPRIMENTO: 28 pares de bases (3) TIPC: ácido nucieico (C) ESTRUTURA HELICOIDAL: simples (D) TOPOLOGIA: linear TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómíco) OSOCalgAD DA SEQUÊNCIA: SEQ ID N°. 8: (2) INFORMAÇÃO CARA A SEQ ID N°. 9:

(10 COMPRIMENTO: 36 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleíeo (C) ESTRUTURA HELICOIDAL: simples (D) TOPOLOGIA: linear 01'iQ TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico) í&i 5 DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID N°. 9:

GCGGGATCCG CCATCATGGC GCCACCACCA GCTAGA (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID N°. 10:

(A) COMPRIMENTO: 33 pares de bases (B) TIPC: ácido nucieico (C) ESTRUTURA HELICOIDAL: simples ÍO: TldiOlOQXA: linear lÃCULA:: ADN (genómico) DA SEQUÊNCIA: SEQ ID N°. 10: AGA GCC 33 (2) PARA A SEQ ID N°. 11: (xi) (A) COMPRIMENTO: 29 pares de bases (B} TIPO: ácido nucleíco (C) EãTKOlTdOa HELICOIDAL: simples (D) TOPOLOGIA: linear

(ίί) (xi) GCGGGATCCT TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico) DEdAKlCilO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID N°. 11; CAATTATGTC CATTGCCTG 29

Lisboa, 2 de Agosto de 2007

Claims (11)

1. Molécula de ácido nucleico caracterizada pelo facto de compreender uma sequência de nucleótidos seleccionada no grupo que consiste em: (a) uma sequência de nucleótidos que codifica o polipéptido do DM4, de comprimento completo, que compreende a sequência de aminoácidos completa da SEQ ID N°. 2, incluindo a sequência líder prevista; (b) uma sequência de nucleótidos que codifica o polipéptido do DM4, de comprimento completo, que compreende a sequência de aminoácidos completa da SEQ ID N°. 2, incluindo a sequência líder prevista, mas a que falta a metionina do terminal amíno; (c) uma sequência de nucleótidos que codifica o polipéptido de DM4 maduro (polipéptido de comprimento completo com a sequência líder eliminada) que compreende a sequência de aminoácidos nas posições próximas de 24 até às próximas de 468 da SEQ ID N0. 2; (d) uma sequência de nucleótidos que codifica o polipéptido do DM4, de comprimento completo, que compreende a sequência de aminoácidos, incluindo a sequência líder codificada pelo clone do contido no depósito n° 97853 da ATCC; (e) uma sequência de nucleótidos que codifica o polipéptido do DM4, de comprimento completo, que compreende a sequência completa de aminoácidos, incluindo a sequência líder mas a que falta a 2 metionina do terminai amino codificada peio eione do ADNc contido no depósito n° 97853 da ATCG; ti) " .equência de nucleótídos que &oái£ks-a o poli- pèptlA maduro do DM4, que compreende a sequência de amittátidovi codificada pelo clone do ADNc contido no depósito n° 97833 da ATCC; (q) uma sequência de nucleótídos que codifica o domínio extracelular do DM4, que compreende a sequência de amínoácidos nas posições próximas de 24 até às próximas de 238 da SEQ ID N°. 2 ou conforme codificadas pelo clone do depósito n° 97853 da ATCC; (h) uma sequência de nucleótídos que codifica o domínio da trançrnembrana do DM4, que compreende a sequência de amínoácidos nas posições próximas de 239 «fé as próximas de 264 da SEQ ID N°. 2 ou conforme codificadas pelo clone do depósito n° 97853 da ATCC; (i) uma sequência de nucleótídos que codifica o domínio intracelular do DM4, que compreende a sequência de amínoácidos nas posíçoes próximas de 265 até -Is próximas de 468 da SEQ ID N°. 2 ou conforme codificadas pelo clone do depósito n° 97853 da ATCC; uma sequência de ácidos nucleicos que compreende a sequência et 'v: : 1 - X t de nucleótídos tt SEQ ID N°. 1 et c cktet é e éo depósito 17te ; da ATCC; / (k) uma sequência de ácidos nueleicos que compreende a sequência de nucleótidos da SEQ ID N°. 1 que codifica o polipéptido do DM4 que comporta a sequência de nas 2 a 468 da SEQ ID 2; uma sequência de ácidos m icle. icos que compreende a sequência de nucleótidos da SEQ ID M°. 1 que codifica o domínio extracelular do polipéptido do DM4 que comporta a sequência de aminoácidos desde cerca de 24 até cerca de 238 da SEQ ID N°. 2; (m) uma sequência de nucleótidos que codifica um polipéptido que compreende a sequência de aminoácidos dos resíduos n a 468 da SEQ ID N°. 2, em que c símbolo n representa um número inteiro no intervalo de 1 a 132; (n) uma sequência de nucleótidos que codifica um polipéptido que compreende a sequência de aminoácidos dos resíduos 1 a m da SEQ ID N°. 2, em que o símbolo m representa um número inteiro no intervalo de 221 a 468; (o) uma sequência de nucleótidos que codifica pííliplípf I,dí5 qm compreende a sequência de aminoácidos que consiste nos resíduos n a m da SEQ ID N°. 2, em que os símbolos nem roptosoqtoíit números inteiros, rol como definido antes para (m) e para d'Q , (p) orna sequência de nucleótidos quo codifica « ;p;S:Í::ipépii.dd que consiste romo porção da sequência completa dio aminoácidos de DM4 codificada pelo 4 clone de ADNc do depósito n° 97853 da ATCC, em que a referida porção exclui de 1 a cerca de 131 aminoácidos da terminação amino da referida sequência completa de codificada pelo clone de ADNc contido no depósito n° 97853 da ATCC; uma sequência de nucleótidos que codifica um polipéptido que consiste numa porção da sequência completa de aminoácidos de DM4 codificada pelo clone de ADNc contido no depósito n° 97853 da ATCC, em que a referida porção exclui de 1 a cerca de 249 aminoácidos da terminação carboxi da referida sequência completa de aminoácidoç codificada pelo clone de ADNc contido no depósito n° 97853 da ATCC; (r) una sequência de nucleótidos que codifica um polipéptido que consiste numa porção da sequência completa de aminoácidos de DM4 codificada pelo clone de ADNc contido no depósito n° 97853 da ATCC, em que a referida porção Inclui uma combinação de qualquer uma das eliminações do terminal amino ou do terminal carboxi nas (p) e (q) anteriores; ίο. «ms sequência de nDclcétiPoJ que -g pelo menos 95 % idêntica a uma sequência de nucleótidos conforme foi definido por (a) a fr) e que codifica um pgHipéptldo que tem actividade da prbtsi.Pé de DM4; (i) uma sequência de nucleótidos que é pelo menos 95 % idêntica a uma sequência de aminoácidos de um polipéptido codificado por uma sequência de de qualquer uma das (a) a irj e que codifica um polipeptido que tem actividade da proteína de DM4; (u) uma sequência de nucleótidos que codifica um çoiipépci.dó de DM4 que é, Ubcupto para pelo menos uma substituição conservadoia de aminoácído, um polipéptído codificado pela sequência de nucleótidos de qualquer uma das (a) a (r); e (v) uma sequência de nucleótidos que híbrida, em condições de hibridação severas, com uma sequência de nucleótidos conforme definido por bl;· is em que a referida sequência de nucleótidos que híbrida, não híbrida em condições de hibridação severas com um polinucleótido que tem uma sequência de nucleótidos que consiste apenas em resíduos A ou em apenas resíduos T; e em que a referida sequência de nucleótidos codifica um polipeptido que e capaz de se ligar a ligandos que induzem a apoptose relacionada com o FNT JLIART; TRAIL na língua inglesa) ou a estrutura helicoidal complementar desse polinucleó-tido. Molécula de ácido nucleicc, caracterizada pelo facto de compreender um polinucleótido que codifica a sequência de aminoácidos de uma porção do poiípéptido de DM4 ligado a um epítopo e que comporta ura sequência de aminoácidos conforme definido em uma. uu^Idas (a) a íij e (k) a (r) da usivlndlcuulu 1, cum a condicão de que a referida purgio que se liga a um epítopo nJo esteja contida na seguinte sPsuPtPmis de aminoácidos: 3 Os a os 3*1; Glr. Vai Leu Ser Leu Ç> 4. d. Ser Gli Pro Asp 'd·:· 1 .! Ser Ser Ala 5¾¾ Ser Glu Leu Sei Pro Asn Ser Ser Gli cís Leu 20 25 33 OU Uk Ui! iiU: Pro Ala Leu Met Leu Fen Fen Rsp LlS Fen LL-v; 35 40 45 k.sn XI e .ui Pr o Fen Sn; Ser Trp ASP Gin L>:n> O'. ÍOÇ :.%Vv.v; 1·ϊϊ. Asp Leu Tre Lis Asn Gin Ile . ...... ... . · Vai Vai Arç Alâ Gli Tre Ala Gli Fí:v vo: Gli Asp Ala Lei Tir Bet •ÇdsVó Met Lis Trp V.;.. SiíO LL.s ·'-··.·:· ell m. é> Arg Asn AU Ser Ile Sis Tre Leu e Asp Ala Leu Glu Arg e Glu 100 105 110 Glu Um HiS Ala Lis Glu Lis lie Gin Asp Leu Vai Asp Ser su 115 120 125 Lis Fen Ile Ur Leu Glu Aso C-li Tre Gli ísi» Viii Ser Leu Glu 130 135 Ui! Molécula de ácido nucleico, de acordo com a reivindicação 2, caracterizada pelo facto de codificar uma porção de um polipéptido de Dké que se liga a um epílopo em que a sequência de aminoácidos da referida porção se selecciona no grupo que consiste em: um polipéptido que compreende os resíduos de aminoácidos desde cerca do 35 até cerca do 92 da SEQ ID NO. 2, um polipéptido que compreende os resíduos de aminoácidos desde cerca do 114 ate cerca do i60 da SEQ ID NO. 2, um polipéptido que compreende os resíduos de aminoácidos desde cerca do 160 até cerca de 240 da SEQ 13 BCú L, um polipéptido que compreende os resíduos de aminoácidos desde cerca do 267 «té cerca do 298 da SEQ IS NO. 2 e um poé.ípéptldé que Oététtíttiit;·* os rmiÉwúB é©; aminoácidos desde cerca do 330 até cerco do 364 da BBQ ID NO. 2. 4. ikdoécitla de ácido nucleico de acordo com uma qualquer das reivindicações i a 3, caracrerizada pelo facto de ser ADN ou ARN. íiv Processo para produzir uss vector, caracterizado peio facto de compreender a inserção, no vector, de uma molécula de ácido nucleico, de acordo com uma qualquer das reivindicações 7 a 4. 6. caracterizado pele facto de compreender a de ácido nucleico, de acordo com mm qualquer das reivindicações 1 a 4 ou produzida pelo processo de acordo com a reivindicação 5.
2. 7. Processo de produção de uma célula hospedeira, caracterizado pelo facto de compreender a introdução do vector, de acordo com a reivindicação 6, numa célula hospedeira.
3. 8. Célula hospedeira, caracterizada pelo facto de compreender a molécula de ácido nucleico de acordo com uma qualquer das reividícações até 4 ou o vector de acordo com a reivindicação 6 ou produzida de acordo com o processo da reivindicação 7.
4. 9. Processo para a produção de um polipéptido de DM4, caracterizado pelo facto de compreender a cultura da célula hospedeira, de acordo com a reivindicação 8, em condições tais que o referido polipéptido é expresso e se recupera o referido polipéptido.
5. 10. Polipéptido, caracterizado tõílt facto de comportar a sequência de aminoácidos codi ficada pela molécula de á-oiéo ndõlsíiéõ.!. de acordo som a veititdivtéâo 1 ou que se pode obter por meio ao processo do acordo com a 9 8
6. 11. Pclipéptido caracterizado pelo facto de compreender porção da proteína de DM4 produzida por um epítopo, em que a referida porção é codificada pela molécula de ácido nucleico de acordo com a reivindicação 2 ou 3.
7. 12. Anticorpo, caracterizado pelo facto de se ligar especificamente ao polipéptido de acordo com a reivindicação 10 ou 11. li. isoléccia anti-paralela (antisense) caracterizada pelo facto de ser capaz de controlar a expressão do polipéptido de acordo com a reivindicação 10 ou 11, hibrídando especificamente a referida molécula anti-paralela com a molécula de ácido nucleico de acordo com uma qualquer das reivindicações I a 4.
8. 14. Agonista do polipéptido de acordo com as reivindicações 10 ou 11, caracterizado pelo facto de ser um anticorpo de acordo com a reivindicação 12, capaz de aumentar a actividade apoptoica do referido polipéptido.
9. 15. Composição farmacêutica, caracterizada pelo facto de compreender o polipéptido de acordo com a reivindicação 10 ou 11, o anticorpo de acordo com a reivindicação 12, o agonista de acordo com a reivindicação 14 ou c antagonista de acordo com a reivindicação 13 e, eventualmente, um veículo aceitável sob o ponto de vista
10. 16. Composição de diagnóstico caracterizada pelo facto de ca&ptw&d&á a molécula ácido nucleico de acordo com uma. qualquer das reivindicações i a 4 ou um anticorpo de 12. acordo com a
11. 17. Processo para rastrear um antagonista du un ãgonista do polipéptido de acordo com as reivindicações 10 ou 11, caracterizado paio facto de ooopooendor a cultura da ciidd.o. hospedeira de acordo cors a reivindicação 8, em condições tais que c referido polipéptido i expresso, fazendo contactar a referida célula hospedeira com uso composto candidato e um ligando com o referido polipéptido, ensaiando uma resposta celular e , '0.3 a resposta ensaiada com uma resposta celular quando a referida célula hospedeira contacta apenas com o referido ligando. Lisboa, 2 de Agosto de 2007